DE2517550C3 - Verfahren zum Herstellen eines Lebend-Impfstoffs zum Immunisieren von fleischfressenden Tieren gegen Staupe - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen eines Lebend-Impfstoffs zum Immunisieren von fleischfressenden Tieren gegen Staupe aus einem durch mehrere aufeinanderfolgende Passagen aus Nierenzellkulturgewebe von Primaten erhaltenen attenuierten Staupevirus.

£s ist üblich, zum Herstellen von Lebend-Impfstoffen gegen Staupe Staupeviren auf Gewebekulturen von Organen zu attenuieren und zu züchten. In dem Lehrbuch »Mikrobiologie und allgemeine Seuchenlehre« von Rolle und Mayr, Stuttgart 1966, Seite 552 werden zur Züchtung des Staupevirus Zellkulturen von Hundenieren oder Frettchennieren oder Hühnerembryofibroplastenkulturen genannt Die derzeit im Handel befindlichen Impfstoffe werden auf diese Weise hergestellt

In der Monographie »Virologische Arbeitsmethoden« von Mayr, Bachmann, Bibrack und Wittmann, Stuttgart 1974, ist auf Seite .263 ff als zur Züchtung von Staupeviren geeignetes Gewebe die Zellinie 58 Vero (Affe) angegeben. Im Arch. Ges. Virusforschung 17 (1965), Seite 183-202 und Arch. Ges. Virusforschung 22 (1967), Seite 364—380 werden noch Primärkulturen des Nierengewebes von Rhesusaffen und Tamarinen sowie überimpfte Linien von Rhesusaffen und gelbgrünen Meerkatzen genannt

Die bekannten Herstellungsverfahren für Lebendimpfstoffe gegen Staupe liefern zwar gut wirksame Impfstoffe, haben jedoch gewisse Nachteile. So können die mittels einer Kultur des Nierengewebes junger Hunde hergestellten Impfstoffe mit für Pelztiere pathogenen Viren, beispielsweise Häpatit- oder Tollwutviren kontaminiert sein. Die auf einer Hühnerembryo-Gewebekultur hergestellten Impfstoffe entsprechen nicht mit genügender Gleichmäßigkeit den Anforderungen an das Eigenschaftsspektrum.

Die Ausbeute an Impfstoff aus einer Kultur ist bei dem bekannten Verfahren gering, so daß für eine Impfstoffserie Virusernten aus vielen Kulturen eingebracht werden müssen, was nochmals die Gleichmäßigkeit der Eigenschaften beeinträchtigt und zu einem großen Aufwand an biologischen Kontrollen zwingt

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung eines Lebend-Impfstoffs zum Immunisieren von fleischfressenden Tieren gegen s Staupe, bei dem ein Impfstoff ohne schädliche Eigenschaften bei guter Ausbeute und gleichförmigem Eigenschaftsspektrum erhalten werden kann.

Zur Lösung dieser Aufgabe wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, daß man das Staupevirus des Stammes Rockborn an eine Primärkultur des Nierengewebes der gelbgrünen Meerkatzen durch 8 bis 10 Passagen bei einer Temperatur von 34° C ± 0,2⁰C bis zur Erzielung einer Inkubationszeit der Virusentwicklung von 4 bis 5 Tagen adaptiert, das adaptierte Virus in der Zellkultur weiterzüchtet und konfektioniert

Bei einem solchen Herstellungsverfahren wird ein Impfstoff erhalten, der keine für fleischfressende Tiere pathogenen Viren enthält Eine hohe Im.riunogenität des Impfstoffs ist gewährleistet durch die Adaptationsbedingungen, darunter das sehr enge Temperaturintervall, in dem die attenuierenden Eigenschaften des Stammes, seine hohe immunologische Effektivität und seine niedrige Reaktogenität vollständig aufrechterhalten werden. Der Impfstoff wird in guter Gleichförmigkeit bei guter Ausbeute erhalten, nämlich von 100 000 bis zu 2 Millionen Impfdosen in einer Serie, wobei die Wirtschaftlichkeit der Herstellung besonders gut ist, wenn die Abfälle der Fertigung von Poliomyelitispräparaten verwertet werden.

jo Es kann zweckmäßig sein, einen auf die erfindungsgemäße Weise adaptierten und attenuierten Virus als Impfvirus zu verwenden und auf eine Kultur der Nierengewebezellen der gelbgrünen Meerkatzen zu züchten.

Zweckmäßigerweise wird zur Stabilisierung der Virusernte die virushaltige Flüssigkeit in Gegenwart von 44 bis 54Gew-% Sorbit und 1,4 bis l,6Gew.-% Gelatose lyophylisiert

Die Erfindung wird nachfolgend durch Beschreibung

von Ausführungsbeispielen weiter erläutert

Eine Primärkultur des Nierengewebes der gelbgrünen Meerkatzen wird z. B. mittels eines Impfvirus in einer Menge von 3 bis 6 ml angesteckt. Nach der Adsorption des Virus während einer Stunde bei einer Temperatur von 33,8 bis 34,2° C bringt man in die Kulturgefäße 300 ml Unterstützungsmedium ein, welches aus 04% Laktalbuminhydrolysat auf Erle-Lösung (pH - 74) und 5% Aminopeptid besteht Nach dem Auftreten der ersten Kennzeichen der Virusvermehrung, die in einer Verwischung des Zellenbildes und der Zellengrenzen zum Ausdruck kommt, entfernt man zur Entfernung des Interferons, das die weitere Vermehrung des Virus verhindern würde, die erste Portion des Unterstützungsmediums und ersetzt sie durch frisches Medium der gleichen Zusammensetzung in einer Menge von 500 ml. Nach dem Auftreten degenerativer Veränderungen in 30 bis 40% der Zellen zieht man das virushaltige Medium ab, friert ein und gießt in die Kulturgefäße eine neue Portion desselben Mediums in gleicher Menge ein. Die virushaltige Flüssigkeit wird nach Ablauf von 2 bis 3 Tagen in Abhängigkeit von der Entwicklung der zytopathologischen Veränderungen in den Zellen nochmals gesammelt. Das Sammeln des virushaltigen Mediums und das Ersetzen desselben durch eine frische Portion führt man durch, bis alle 100% der Zellen durch zytopathologische Veränderungen erfaßt sind. Gewöhnlich führt man nochmalige Sammlungen 3 bis 5 Male durch.

Jede einzeln gewonnene virushaltige Flüssigkeit bewahrt man in gefrorenem Zustand bei einer Temperatur von —20⁰C bis —30°C auf, bis Kontrollprüfungen auf Sterilität und den Gehalt an für die fleischfressenden Tiere pathogenen Kontaminatenviren durchgeführt werden. Wenn diese Kontrollprüfungen, die z. B. an neugeborenen und ausgewachsenen weißen Mäusen, Meerschweinchen oder Kaninchen durchgeführt werden, ohne Befund bleiben, werden die einzelnen gesammelten Mengen der virushaltigen ία Flüssigkeit aufgetaut und in einem Behälter vereinigt Aus der erhaltenen Flüssigkeitsmenge entfernt man den Zellendetritus, beispielsweise durch Schleudern.

Der von dem Detritus-befreiten virushaltigen Flüssigkeit gibt man zur Stabilisierung des Virus 4,5 bis 5,5 Gewichtsprozent Sorbit und 1,4 bis 1,6 Gewichtsprozent Gelatose zu. Nach innigem Verrühren wird das Präparat in Flakons abgefüllt und in diesen bei einer Temperatur von —60⁰C eingefroren.

Nach dem Eicfrieren bringt man die Flakons in einen Sublimator ein ond führt die lyophile Trocknung durch. Das getrocknete Präparat weist eine Restfeuchtigkeit von 3 bis 5% auf.

Das erhaltene Präparat wird in Versuchen an Meerschweinchen auf Sterilität, Yirustiter und Unschäd- 2s Iichkeit geprüft Bei negativen Prüfergebnissen auf Sterilität und Unschädlichkeit und einem positiven Prüfergebnis auf den Virusgehalt ist der Impfstoff zur prophylaktischen Immunisierung von Pelztieren und Hunden fertig.

Zur Erzielung guter Resultate bei der Immunisierung von Pelztieren soll eine mittlere Dosis mindestens 1000 plättchenbildendc- Einheiten des Stammes enthalten. Gewöhnlich wird der Impfstoff mit einem Virusgehalt von mindestens 3000 Einheiten in einer Dosis hergestellt Die Gebrauchsdauer des lyophilisierten Präparates beträgt 1 Jahr, wenn es bei einer Temperatur von nicht über 4°C aufbewahrt wird. Bei der Aufbewahrung des Präparates bei einer Temperatur von —20⁰C kann die Gebrauchsdauer verlängert werden, wenn nach dem Umtitrieren ein Virusgehalt von mindestens 1000 Einheiten festgestellt wird.

In einem konkreten Beispiel züchtete man eine Primärkultur der Nierengewebezellen der gelbgrünen Meerkatzen in 65 Matratzenkolben von je 1,51 Fassungsvermögen auf einem Nährmedium, welches gleiche Menge einer Hanks-Lösung und einer Eagle-Lösung enthält, mit 0,5% Laktalbuminhydrolysat, pH - 7,0, mit 5% Normalkuhserum bei einer Temperatur von 37°C. Nach der Erzielung mehrschichtiger Kulturen entfernte man das Medium, wusch die Zellenkulturen mit Erle-Lösung und brachte dann in jeden Matratzenkolben 5 ml Impfvirus des attenuierten Stammes Rockborn, der vorher 8 Mal in Zellenkulturen des Nierengewebes der gelbgrünen Meerkatzen bei einer Temperatur von 34⁰C passiert wurde.

Nach 1 Stunde Adsorption des Virus bei einer Temperatur von 34° C brachte man in jede Kultur 300 ml Nährmedium ein, das aus 0,5 Laktalbuminhydrolysat auf Erle-Lösung, pH - 7,5, mit 5% Aminopeptid besteht Das Inkubieren der angesteckten Kulturen wurde bei einer Temperatur von 34° C durchgeführt. Die ersten morphologischen Veränderungen der Zellen, die auf die Vermehrung des Virus hindeuten, traten am 5. Tag nach der Ansteckung auf.

Dann entfernte man das Nährmedium und goß eine neue Portion des Mediums gleicher Zusammensetzung in einer Menge von 500 ml ein. Das erste Einsammeln des Virus und das Einbringen einer frischen Portion des Nährmediums der genannten Zusammensetzung wurde am 8. Tag, das zweite Einsammeln am 11. Tag, das dritte am 15. Tag und das letzte am 19. Tag vorgenommen. Insgesamt wurden 1151 virushaltige Flüssigkeit eingesammelt, der nach der Entfernung des Zellendetritus Virusstabilisatoren (5% Sorbit und 1,5% Gelatose) zugegeben wurden.

Die virushaltige Flüssigkeit wurde jeweils in einer Menge von 33 ml in Flakons von je 100 ml Fassungsvermögen abgefüllt Insgesamt wurden 2937 Flakons gefüllt, die dann in einen Kühler zum Einfrieren bei einer Temperatur von —65° C eingebracht wurden. Nach dem Einfrieren brachte man die Flakons in einen Sublimator urd führte die lyophile Trocknung des Präparates durch. Jeder Flakon enthielt 100 Virusdosen mit einem Titer von 10³·⁴⁵ ± 0,4 plattenbildende Einheiten/ml. Insgesamt enthielt die Serie 276 300 Impfdosen. Die Kontrollprüfungen verliefen günstig, und der Impfstoff wurde zur Durchführung von Impfungen verwendet

Die Unschädlichkeit und Wirksamkeit des Impfstoffs ergibt sich aus den nachfolgend beschriebenen Anwendungsbeispielen.

Beispiel 1

der Anwendung bei jungen Nerzen und Polarfüchsen zur Prüfung der Unschädlichkeit

Man verwendete den Impfstoff in einer Dosis von jeweils 1 ml vorher in destilliertem Wasser verdünntem Präparat, welches in 1 ml 3000 plattenbildende Einheiten enthält

Es wurden 24 junge Nerze und 12 junge Polarfüchse geimpft Zur Kontrolle ließ man 16 junge Nerze und 3 junge Polarfüchse ungeimpft Die Beobachtungen wurden täglich während 14 Tagen durchgeführt Alle Tiere blieben während des ganzen Versuches klinisch gesund.

Beispiel 2

zur Prüfung der Immunogenität des Präparates bei jungen Polarfüchsen

Drei Polarfüchse wurden mit dem Präparat mit einer Dosis gemäß Beispiel 1 geimpft Nach 50 Tagen wurde die Ansteckung dieser drei Polarfüchse und zweier ungeimpfter Kontrolltiere mit dem Staupevirus vom Stamm Gaujasky mit 1500 letalen Dosen durchgeführt. Die Beobachtung bei allen fünf Tieren wurde täglich durchgeführt. Am 15. Tag nach der Ansteckung verendeten die beiden nichtgeimpften Polarfüchse an der Staupe. Bei den geimpften Polarfüchsen wurden die Beobachtungen eine weitere Woche fortgesetzt. Während der ganzen Beobachtungsdauer von 21 Tagen nach der Ansteckung blieben die geimpften Polarfüchse klinisch gesund.

Beispiel 3

Prüfung der Immunogenität an ausgewachsenen Polarfüchsen

Es wurden 19 Polarfüchse mit einer Dosis gemäß Beispiel 1 geimpft. Nach 21 Tagen wurden alle Polarfüchse und 6 nicht geimpfte Kontrolltiere mit dem Staupevirus vom Stamm Gaujasky mit 1000 letalen Dosen angesteckt. Die Beobachtungen wurden täglich während 21 Tagen durchgeführt. Zwischen dem 14. und 16. Tag verendeten die nichtgeimpften Kontrollpolar-

fuchse an der Staupe, während die 19 geimpften Polarfüchse gesund blieben.

Beispiel 4
Prüfung der Immunisierung junger Nerze

In der Periode der Sommerimpfung wurden 5333 junge Silberblaunerze mit einer Dosis nach Beispiel 1 geimpft Während der impfung und der nachfolgenden Woche wurden tägliche Beobachtungen durchgeführt ι η Alle geimpften Tiere blieben gesund.

Beispiel 5

Prüfung der Dauer der durch den Impfstoffin einer Dosis nach Beispiel 1 erzeugten Immunität

a) Man impfte sechs Polarfüchse mit einer Dosis nach Beispiel 1. Neun Monate nach der Impfung wurden diese sechs Polarfüchse und zwei nichtgeimpfte Kontrollpolarfüchse mit 1000 letalen Dosen des hochpathogenen Staupevirus vom Stamm Gaujasky angesteckt Die beiden nichtgeimpften Kontrollpolarfüchse erkrankten und vei endeten am 10. und 1 l.Tag an der Staupe. Bei den sechs geimpften Polarfüchsen wurden keine Merkmale der Erkrankung festgestellt

b) Drei Polarfüchse wurden mit einer Dosis nach Beispiel 1 geimpft Nach 2 Jahren und 3 Monaten wurden diese 3 Polarfüchse und sechs ungeimpfte Kontrollpolarfüchse mit 1000 letalen Dosen des Staupevirus des Stammes Gaujasky infiziert Die sechs ungeimpften Kontrolltiere erkrankten und verendeten am 12. und 13. Tag, während die drei vor 2 Jahren und 3 Monaten geimpften Tiere gesund blieben. Beispiel 6
Prüfung in einer verseuchten Umgebung

In einer Nerzzucht, in der zahlreiche Staupefälle aufgetreten waren, wurde zunächst eine Gruppe von 28 Nerzen mit einer Dosis nach Beispiel 1 geimpft In dieser Gruppe wurden keine Erkrankungen fesgestellt Danach wurden weitere 12 170 Nerze geimpft Darauf wurden keine weiteren Fälle einer Erkrankung der Nerze festgestellt und der Zuchtbetrieb blieb frei von Staupeinfektionen.

Beispiel 7
Prüfung des Impfstoffs an Hunden

In einer Zuchtanstalt in der früher Staupe aufgetreten war, wurden 550 Hunde mit dem vorliegenden Präparat geimpft Die Dosis betrug bei einem Gewicht von bis zu 5 kg 1 ml mit 3000 plattenbildenden Einheiten und bei einem Gewicht von über 6 kg ". inl mit 6000 plattenbildenden Einheiten. In den folgender. Jahren wurden die Impfungen beim hinzugekommenen Jungvieh durchgeführt Die Zuchtanstalt blieb seitdem, nämlich bis jetzt 4 Jahre, frei von Staupe.

Über die Anwendung des Impfstoffs in großem Maßstab kann folgendes mitgeteilt werden:

In 36 in verschiedenen klimatischen Zonen gelegenen Pelztierzuchtbetrieben wurden über 7 Millionen Dosen des Impfstoffs an Nerze, Polarfüchse, Füchse und Zobel während 3 Jahren verabreicht Dabei zeigte sich die Unschädlichkeit, hohe immunologische und epizootologische Wirksamkeit und Wirtschaftlichkeit des Impfstoffs und es gelang, die Staupe in den früher infizierten Betrieben vollständig auszutilgen.

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Herstellen eines Lebend-Impfstoffes zum Immunisieren von fleischfressenden Tieren gegen Staupe aus einem durch mehrere aufeinanderfolgende Passagen aus Nierenzellkulturgewebe von Primaten erhaltenen attenuierten Staupevirus, dadurch gekennzeichnet, daß man das Staupevirus des Stammes Rockborn an eine Primärkultur des Nierengewebes der gelbgrünen Meerkatzen durch 8 bis 10 Passagen bei einer Temperatur von 34° C ± 0,2⁰C bis zur Erzielung einer Inkubationszeit der Virusentwicklung von 4 bis 5 Tagen adaptiert, das adaptierte Virus in der Zellkultur weiterzüchtet und konfektioniert

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der adaptierte, attenuierte Virus auf einer Kultur der Nierengewebezellen der gelbgrünen Meerkatzen gezüchtet wird.

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die virushaltige Flüssigkeit in Gegenwart von 44 bis 5,5 Gew.-% Sorbit und 1,4 bis 1,6 Gew.-% Gelatose lyophylisiert wird.