DE2415353C2 - - Google Patents

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DE2415353C2
DE2415353C2 DE19742415353 DE2415353A DE2415353C2 DE 2415353 C2 DE2415353 C2 DE 2415353C2 DE 19742415353 DE19742415353 DE 19742415353 DE 2415353 A DE2415353 A DE 2415353A DE 2415353 C2 DE2415353 C2 DE 2415353C2
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    • Y10S424/821—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving temperature-sensitive mutant virus

Description

Die Erfindung ist durch die Ansprüche 1 und 4 definiert; die Ansprüche 2 und 3 nennen Ausgestaltungen des Verfahrens nach Anspruch 1.
Die in vitro-Replikation von temperaturempfindlichen Mutantenstämmen wird bei nicht zulässigen Temperaturen, d. h. oberhalb der "cut-off"-Temperatur (Temperatur, bei der die Infektiosität deutlich vermindert wird) erschwert. Obwohl die in vitro-Ergebnisse nicht unbedingt auf in vivo-Abläufe schließen lassen, so gibt es in der Literatur doch einige Hinweise, daß temperaturempfindliche Mutanten sich in vivo anders verhalten, als Virus-Wildstämme; vgl. B. R. Murphy, E. G. Chalhub, S. R. Nusinoff und R. M. Chanock, J. of Inf. Dis., Bd. 126 Nr. 2 (1972), S. 170 bis 178. Diese Erscheinung wurde bei der Entwicklung einiger Lebendvirus-Impfstoffe gegen Erkrankungen der Atmungswege angewendet. Bei den optimalen temperaturempfindlichen Bedingungen sollte eine temperaturempfindliche Mutante mit einer "cut-off"-Temperatur im Bereich der normalen Körpertemperatur in der Lage sein, sich in den Schleimhäuten des oberen Atmungstraktes zu vermehren, wo die Temperatur einige Grad Celsius niedriger ist, als im unteren Atmungstrakt und im Körper. Demgemäß sollte die Replikation dieser Viren im unteren Atmungstrakt und im Körper teilweise oder vollständig gehemmt werden. Diese theoretischen Überlegungen konnten zumindest für einige in Atmungsorganen auftretende Viren durch Untersuchungen an Labortieren und am Menschen bestätigt werden; vgl. N. Zygraich, M. Lobmann und C. Huygelen, J. Hyg. Camb., Bd. 70 (1972), S. 229 bis 234.
Es gab aber bisher in der Literatur noch keine Hinweise, daß sich diese Ergebnisse auch auf andere Viren, insbesondere Herpesviren, z. B. Herpes simplex Typ 2-Viren, anwenden lassen. Dies war auch nicht zu erwarten, da sich auf so speziellen Gebieten der Virologie im allgemeinen keine sicheren Vorhersagen machen lassen.
Es ist bekannt, daß einige Herpesviren, z. B. Herpes simplex Typ 2-Viren, eine verzögerte Erkrankung verursachen und nach der Genesung des Patienten von der ursprünglichen Krankheit für eine unbestimmte Zeitdauer im Organismus verbleiben können. Ferner ist es bekannt, daß die durch Herpesviren induzierte Immunität nur gering und von kurzer Dauer ist. Deshalb treten bei der Entwicklung von Herpesviren-Impfstoffen zwei Hauptschwierigkeiten auf, die die Wirksamkeit und die Unschädlichkeit betreffen. In bezug auf die Wirksamkeit ist festzustellen, daß die natürliche Krankheit im Organismus nur einen geringen Schutz gegen erneute Infektionen bietet. Die Unschädlichkeit ist deswegen fraglich, weil die latenten Viren ein Wiederauftreten der Erkrankung hervorrufen können.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, die vorgenannten Schwierigkeiten zu beseitigen und aus pathogenen Stämmen von Herpes simplex Typ 2-Viren erhältliche, temperaturempfindliche und im wesentlichen nicht pathogene Stämme von Herpes simplex Typ 2-Viren zur Verfügung zu stellen, bei denen die Wirksamkeit und die Unschädlichkeit keine Probleme bieten. Diese Aufgabe wird gemäß Anspruch 1 gelöst.
Als Ausgangsviren können im erfindungsgemäßen Verfahren von Patienten isolierte Wildstämme von Herpes simplex Typ 2-Viren verwendet werden. Ferner können Stämme von Herpes simplex Typ 2-Viren verwendet werden, die nach einer Reihe von Passagen durch Gewebekulturen, beispielsweise primäre Kaninchennierenzellen, erhalten wurden.
Wie bereits erwähnt, wird die Bildung eines temperaturempfindlichen und im wesentlichen nicht pathogenen Stammes von Herpes simplex Typ 2-Viren dadurch induziert, daß man den pathogenen Stamm mit salpetriger Säure behandelt und anschließend den gebildeten temperaturempfindlichen Mutantenstamm isoliert. Die salpetrige Säure wird in einem Essigsäurepuffer eingesetzt. Die Konzentration von salpetriger Säure und Acetationen im Reaktionsmedium beträgt 1 n bzw. 0,25 n. Die Kontaktzeit beträgt 1 bis 15 Minuten. Eine bevorzugte Ausgestaltung ist Gegenstand des Anspruchs 2.
Die so gebildeten temperaturempfindlichen Stämme werden anschließend zweckmäßig in Hühnerembryofibroblasten, Menschenembryofibroblasten oder primären Kaninchennieren-Zellkulturen mindestens einmal kloniert. Beispielsweise wird die Klonbildung zweimal in primären Kaninchennieren-Zellkulturen aus spezifisch pathogenfreien Kolonien durchgeführt, wobei eine 6tägige Inkubationsdauer bei Temperaturen zwischen 30 und 37°C (±1°C), beispielsweise bei 35°C, eingehalten wird.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten temperaturempfindlichen Stämme von Herpes simplex Typ 2-Viren eignen sich insbesondere zur Herstellung von Impfstoffen. Dazu werden die Stämme bei Temperaturen von höchstens 37°C (±1°C) und vorzugsweise bei 35°C (±1°C) auf primäre Kanichennieren-Zellkulturen überimpft und bei den vorgenannten Temperaturen solange inkubiert, bis ein ausreichendes Wachstum der Viren erreicht ist. Anschließend wird das erhaltene Virusmaterial geerntet.
Die Impfstoffe eignen sich zur Bekämpfung von durch Herpes simplex Typ 2-Viren hervorgerufenen extanthematösen Viruserkrankungen. Eine wirksame Dosis von temperaturempfindlichen und im wesentlichen nicht pathogenen Stämmen des für die exanthematöse Erkrankung verantwortlichen Virus wird auf kaltem Verabreichungsweg dem entsprechenden Organismus verabfolgt. Unter kaltem Verabreichungsweg sind Wege zu verstehen, bei denen die Impfstoffe nicht der normalen Körpertemperatur ausgesetzt sind. Bevorzugt wird die intradermale Verabreichung, beispielsweise die Skarifikation.
Es wurde festgestellt, daß bei dieser Art der Verimpfung das Wachstum des Impfstoff-Virus auf die kalten Körperregionen beschränkt ist und ein Schutz in Abwesenheit von feststellbaren humoralen sero-neutraliserenden Antikörpern erreicht wird.
Trotzdem wird aber durch dieses Impfverfahren der ganze geimpfte Organismus in breitem Umfang geschützt. Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß durch diese intradermale Impfung der geimpfte Organismus gegen Reinfektionen auf peripherem, zentripetalem Wege oder an völlig verschiedenen und wärmeren Körperstellen, z. B. im Gehirn geschützt ist. Der Herpes simplex Typ 2-Virus-Impfstoff wird auf kaltem Wege, vorzugsweise intradermal, in geeigneten Dosen, d. h. mindestens 10³×TCID50 (TCID: tissue culture infectious dose) verwendet.
Für Impfzwecke wird das Virusmaterial vorzugsweise in gefriergetrockneter Form aufbewahrt. Daraus wird zur Herstellung von parenteral verabreichbaren Präparaten durch Zusatz von Wasser, üblichen Verdünnungsmitteln und/oder Hilfsstoffen ein Impfstoff hergestellt.
In den folgenden Beispielen ist die Erfindung unter Verwendung eines Wildstammes des Herpes simplex Typ 2-Virus als Ausgangsstamm erläutert. Zwei temperaturempfindliche Mutantenstämme des Herpes simplex Typ 2-Virus wurden aus diesem Wildstamm nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten. Diese Mutantenstämme erhielten die Bezeichnung "Herpes 2 ts 1" (ts bedeutet temperaturempfindlich) und "Herpes 2-42082". Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch nicht auf die vorgenannten Stämme beschränkt, sondern es läßt sich auf alle Stämme des Herpes simplex Typ 2-Virus anwenden.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Aus Nieren von drei sechswöchigen Kaninchen (aus einem spezifisch pathogenfreien Bestand) werden unter Verwendung eines Wuchsmediums, das aus mit 0,5 Prozent Lactalbuminhydrolysat und 10 Prozent Kälberserum ergänzter Hankscher Lösung besteht, primäre Kaninchennieren-Zellkulturen hergestellt.
Unter Verwendung eines Erhaltungsmediums, das aus mit 2 Prozent Agamma-Kälberserum ergänztem Eagle-Medium besteht, werden in den vorgenannten primären Kaninchennieren-Gewebezellen mit dem Herpes simplex Typ 2-Wildstamm zwei Passagen durchgeführt. Nach der letzten Passage erhält man als Überstand eine Virussuspension mit 105,5×TCID50/ml.
1 ml dieser Virussuspension wird mit einem Gemisch aus 0,5 ml einer 4 m wäßrigen Natriumnitritlösung und 0,5 ml eines 1 m Essigsäure/Natriumacetat-Puffers gelöst, wobei der endgültige pH-Wert 4,6 beträgt. Zur Herstellung dieses Puffers wurde 1 Volumteil einer Essigsäurelösung, die durch Auffüllen von 6 g Eisessig mit destilliertem Wasser auf 100 ml erhalten wurde, mit 3 Volumteilen einer Lösung von 13,6 g Natriumacetat-trihydrat in destilliertem Wasser (Gesamtvolumen 100 ml) vermischt, wobei vorher beide Lösungen 30 Minuten bei 121°C sterilisiert wurden.
Das erhaltene Gemisch wird 3 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Anschließend wird unter Rühren 1 n Natriumhydroxidlösung tropfenweise bis zu einem pH-Wert von 7,5 (±0,5) zugesetzt. Dadurch wird die Reaktion gestoppt. Durch die Einstellung des pH-Wertes ergibt sich eine Farbänderung des in der Virussuspension vorhandenen Phenolrot-Indikators.
Unmittelbar danach wird das Medium 5 Stunden bei 4°C (±1°C) gegen einen Kochsalz enthaltenden Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2 bis 7,4 zur Entfernung der Nitritionen dialysiert, wobei die Dialyseflüssigkeit mehrmals erneuert wird. Der dabei verwendete Puffer wird folgendermaßen hergestellt:
8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na₂HPO₄ und 0,2 g KH₂PO₄ werden mit destilliertem Wasser auf 800 ml aufgefüllt und mit einer Lösung von 0,1 mg MgCl₂ · 6H₂O in 100 ml destilliertem Wasser und anschließend mit einer Lösung von 0,1 g CaCl₂ in 100 ml destilliertem Wasser versetzt. Die erhaltene Lösung (Gesamtvolumen 1000 ml) wird durch Filtration sterilisiert. Ein Teil der dialysierten Probe wird titriert, während der Rest bei -70°C aufbewahrt wird. Die Titration wird nach dem Röhrchen-Endpunkt-Verdünnungsverfahren nach 7tägiger Inkubation in primären Kaninchennieren-Gewebekulturen bei der nichtzulässigen Temperatur von 38,5°C (±1°C) unter Verwendung von zwei Röhrchen pro Verdünnung durchgeführt.
Die bei -70°C aufbewahrte Probe wird bis zu einem Gehalt von 1 TCID50/0,2 ml verdünnt. Jeweils 0,1 ml dieser verdünnten Probe werden auf 24 primäre Kaninchennieren-Gewebekulturen in Röhrchen überimpft. Die Röhrchen werden bei der zulässigen Temperatur von 35°C (±1°C) inkubiert. Nach verschiedenen Inkubationszeiten von 4 bis 10 Tagen zeigen 16 beimpfte Röhrchen eine typische cytopathogene Herpes-Wirkung. Diese Röhrchen werden mit 1 bis 16 bezeichnet und bei -70°C aufbewahrt. Bei der zulässigen Temperatur von 35°C sowie bei der nicht-zulässigen Temperatur von 39°C werden diese 16 positiven Proben einer parallelen Titration unterworfen. Proben, bei denen sich beim Vergleich der Titrationen bei der zulässigen und bei der nicht-zulässigen Temperatur ein signifikanter Titerunterschied ergibt, werden durch Endverdünnungspassagen weiter der Klonbildung unterworfen.
Auf diese Weise wird aus den positiven Röhrchen bei 10⁴facher Verdünnung der Probe Nr. 4 (5tägige Inkubation) eine Suspension eines Virusstammes erhalten, der als "Herpes 2 ts 1" bezeichnet wird.
Beispiel 2
Der gemäß Beispiel 1 erhaltene "Herpes 2 ts 1" Virusstamm wird einer Passage an primären Kaninchennieren-Gewebezellen unterworfen. Der Überstand ergibt eine Virussuspension mit 105,3×TCID50/ml.
1 ml dieser Virussuspension wird mit 0,5 ml der in Beispiel 1 verwendeten Natriumnitritlösung und 0,5 ml des 1 m Acetatpuffers vermischt, wobei der endgültige pH-Wert 4,2 beträgt. Dieses Gemisch wird 8 Minuten bei Raumtemperatur zur Umsetzung gebracht und anschließend unter Rühren tropfenweise mit 1 n Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 7,5 (±0,5) gebracht. Dadurch wird die Reaktion beendet. Auf Grund des in der Virussuspension enthaltenen Phenolrot-Indikators ergibt sich bei der pH-Einstellung eine Farbänderung.
Unmittelbar danach wird das Medium 5 Stunden bei +4°C (±1°C) gegen die in Beispiel 1 verwendete verschiedene Salze enthaltende, Phosphatpufferlösung dialysiert, wobei die Dialyseflüssigkeit mehrmals erneuert wird. Ein Teil der dialysierten Probe wird titriert, während der Rest bei -70°C aufbewahrt wird. Gemäß Beispiel 1 wird nach 7tägiger Inkubation in primären Kaninchennieren-Gewebezellen bei der nicht zulässigen Temperatur von 38°C (±1°C) unter Verwendung von zwei Röhrchen pro Test die Titration nach dem Röhrchen-Endpunkt-Verdünnungsverfahren durchgeführt.
Die bei -70°C aufbewahrte Probe wird bis zu einem Gehalt von 1 TCID50/0,2 ml verdünnt. Jeweils 0,1 ml dieser verdünnten Probe werden auf 17 Röhrchen mit primären Kaninchennieren-Gewebezellen überimpft. Die Röhrchen werden bei der zulässigen Temperatur von 35°C (±1°C) inkubiert. Nach verschiedenen Inkubationszeiten von 4 bis 10 Tagen zeigen 12 beimpfte Röhrchen eine typische cytopathogene Herpeswirkung. Diese Röhrchen werden mit 1 bis 12 bezeichnet und bei -70°C aufbewahrt. Sodann werden von diesen 12 positiven Proben parallele Titrationen bei der zulässigen Temperatur von 35°C und der nicht-zulässigen Temperatur von 39°C durchgeführt. Proben, bei denen sich ein signifikanter Titerunterschied zwischen der Titration bei der zulässigen und der bei der nicht-zulässigen Temperatur ergibt, werden durch Endverdünnungspassagen der weiteren Klonbildung unterworfen.
Auf diese Weise erhält man aus den positiven Röhrchen der Probe Nr. 7 bei 10-4-facher Verdünnung eine Suspension eines Stammes, der mit "Herpes 2-42082" bezeichnet wird.
Beispiel 3 Temperaturempfindlichkeit von "Herpes 2 ts 1" und "Herpes 2-42082"
Das Viruswachstum bei verschiedenen Temperaturen wird durch Titration bestimmt. Die in Tabelle I zusammengestellten Ergebnisse zeigen, daß die "cut-off"-Temperatur (Temperatur, bei der die Infektiosität um mindestens 2 Zehnerpotenzen herabgesetzt ist) bei 38,5°C (±0,5°C) liegt. Der Ausbeuteunterschied zwischen den Stämmen "Herpes 2 ts 1", "Herpes 2-42082" und dem Wildstamm ergibt sich aus Tabelle I.
Tabelle I
Beispiel 4 Vergleich der Neuropathogenität, Antigenität und Immunogenität von Wildstamm und "Herpes 2 ts 1" (Versuche an Kaninchen) (a) Übertragung von "Herpes 2 ts 1" auf intradermalem und intramuskulärem Wege
In diesem Versuch werden 30 Kaninchen verwendet. Diese Tiere werden in Gruppen von jeweils 5 Tieren eingeteilt. Gruppe I erhält 1 ml (105,5×TCID50) von "Herpes 2 ts 1" auf intradermalem Wege an verschiedenen Stellen der ventralen Region. Der Gruppe II wird der gleiche Impfstoff intramuskulär in die rechte Hinterpfote verabfolgt. Die Gruppen III und IV erhalten den Wildstamm auf intradermalem und auf intramuskulärem Wege. Die Gruppen V und VI sind Kontrollgruppen, denen kein Impfstoff verabfolgt wird.
An den 35 Tagen, die der Impfung folgen, werden die Symptome täglich festgestellt. Je nach der Schwere der Nervensymptome (Paresen bis Paralyse) wird anhand einer Bewertungsskala von 0 bis 3 gewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt. Bei keinem der mit der temperaturempfindlichen Mutante beimpften Kaninchen werden Symptome festgestellt.
In Gruppe III bleiben 2 Tiere frei von Symptomen. Die anderen 3 Tiere zeigen verschiedene Grade von Nervensymptomen. Eines davon (Nr. 24) wird am 12. Tag nach der Impfung getötet. Alle Tiere der Gruppe 4 (intramuskuläre Gabe von Wildstamm) zeigen nach 7- bis 8tägiger Inkubation ausgeprägte Nervensymptome. Zwei dieser Tiere (Nr. 26 und 28) werden getötet. Eines stirbt am 9. Tag nach der Impfung. Ein weiteres Tier zeigt vorübergehende Symptome, geht aber am 33. Tag nach der Impfung ein, da es bei einer Herzpunktur verblutete.
Tabelle II
(b) Impfung mit dem Wildstamm
Allen überlebenden Tieren wird am 35. Tag in die rechte Hinterpfote intramuskulär 1 ml des Wildstammes mit 105,5×TCID50 verabfolgt. Die Symptome werden an den 19 Tagen nach der Injektion täglich beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.
Tabelle III
Bei den Tieren der Gruppe I werden keine Symptome beobachtet. (Ein Tier geht nach Herzpunktur am 11. Tag ein.) 4 von 5 Tieren der Gruppe II zeigen gewisse Nervenstörungen.
3 der 4 verbleibenden Tiere von Gruppe III bleiben frei von Symptomen. Ein Tier zeigt eine vorübergehende Parese der Hinterbeine. Von den Tieren der Gruppe IV überlebt nur eines (Nr. 27). Dieses Tier litt während der 5 Wochen nach der ersten Impfung an einer Parese der rechten Hinterpfote. 9 Tage nach der zweiten Impfung weist es die gleichen Symptome auf und geht am 10. Tag ein.
Nur bei einem Tier der 10 Kontrollkaninchen treten keine Nervensymptome auf. Alle anderen Tiere leiden an verschieden starken Paresen und Paralyse. 4 dieser Tiere gehen zwischen dem 10. und 15. Tag nach der Impfung ein.
(c) Virus-Reisolation
Aus einigen Tieren, die nach der zweiten Impfung eingingen oder getötet wurden, werden die Viren wiedergewonnen. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.
Tabelle IV
Aus dem Gehirn von Tieren, die vorher mit "Herpes 2 ts 1" beimpft waren, lassen sich keine Viren gewinnen. Bei allen 4 Kontrolltieren werden Virustiter von 101,7 bis 103,5×TCID50 festgestellt.
(d) Serologische Befunde
An folgenden Tagen nach der zweiten Impfung wird Serum gewonnen: 0, 11, 19 und 32. Die Ergebnisse der Serum-Neutralisationsversuche (SN) sind in Tabelle V zusammengestellt.
Tabelle V
SN-Titer bei Kaninchen nach der zweiten Impfung mit Wildstamm
Bei den mit "Herpes 2 ts 1" inokulierten Tieren lassen sich 35 Tage danach keine Antikörper feststellen. Alle 4 Tiere der Gruppe III, die den Wildstamm erhalten hatten, weisen Antikörper auf. Nach der zweiten Impfung entwickeln alle Tiere SN-Anitkörper. Das geometrische Mittel der SN-Titer der Tiere in den Gruppen I und II (mit dem temperaturempfindlichen Stamm vorimmunisiert) und das entsprechende Mittel der Kontrolltiere sind einander ähnlich.
Beispiel 5 Unschädlichkeit und Immunogenität von "Herpes 2-42082" bei intramuskulärer und intradermaler Verabreichung
Fünf Gruppen von jeweils 20 Mäusen wurden verwendet, um die Immunisierung nach Impfung mit einer temperaturempfindlichen Mutante zu untersuchen. Die erste Gruppe erhält 105,5×TCID50 von "Herpes 2-42082" auf intramuskulärem Wege. Die zweite Gruppe erhält 104,5×TCID50 desselben Virusstammes. Den nächsten beiden Gruppen werden 105,5× bzw. 104,5×TCID50 intradermal gegeben. Die fünfte Gruppe dient als Kontrollgruppe. In der Gruppe I geht ein Tier ein. In den Gruppen III und IV beträgt die Mortalität 4 bzw. 3 Tiere.
14 Tage nach der Impfung werden zwei Mäuse einer jeden Gruppe entblutet. Die SN-Tiere liegen unter der feststellbaren Konzentration (<4). 14 Tage nach der ersten Impfung erhalten alle Tiere eine zweite infizierende Dosis des Wildstammes, wobei jeweils die Hälfte der verbleibenden Tiere intracerebral 104,5×TCID50 und die andere Hälfte 105,5×TCID50 intradermal erhält. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengestellt.
Tabelle VI
Alle Kontrollmäuse gehen nach der infizierenden zweiten Impfung ein. Alle intradermal immunisierten Mäuse sind gegen die Infektion geschützt. Die Tiere, die den temperaturempfindlichen Stamm auf intramuskulärem Wege erhalten haben, weisen einen Teilschutz auf. 5 von 9 bzw. eines von 9 Tieren überleben die intracerebrale infizierende zweite Impfung bei den Gruppen I bzw. II. Nach intradermaler zweiter Impfung zeigen die Tiere der gleichen Gruppen eine höhere Widerstandsfähigkeit, nämlich 6 von 8, bzw. 7 von 7 Tieren.
Beispiel 6
Die am Ende von Beispiel 2 erhaltene Suspension des Stammes "Herpes 2-42082" wird in Glasampullen abgefüllt, wobei 10³ bis 10⁵×TCID50/pro Ampulle enthalten sind. Der Ampulleninhalt wird gefriergetrocknet. Anschließend werden die Ampullen verschlossen. Die so erhaltenen Ampullen stellen Einzeldosen für Impfstoffe dar. Nach Zusatz von Wasser werden diese Impfstoffe intradermal, d. h. durch Skarifikation, verabfolgt.

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung von temperaturempfindlichen und im wesentlichen nicht pathogenen Stämmen von Herpes simplex Typ 2-Viren aus pathogenen Stämmen von Herpes simplex Typ 2-Viren, dadurch gekennzeichnet, daß man einen pathogenen Stamm von Herpes simplex Typ 2-Viren 1 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur und bei einem pH-Wert von 4 bis 5 in einer 1-n-Lösung von salpetriger Säure in 0,25 n Acetatpuffer behandelt und eine hiernach gewonnene Virusprobe auf eine übliche Gewebekultur überimpft und bei 35±1°C inkubiert, Proben selektioniert und einer parallelen Titration bei 35°C sowie bei 39°C unterwirft und schließlich die Proben, bei denen sich beim Vergleich der beiden Titrationen ein Titerunterschied von mindestens 2 Zehnerpotenzen ergibt, weiterkloniert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den pathogenen Stamm zunächst bei einem pH-Wert von 4,6 (±0,1) und einer Kontaktzeit von 3 Minuten (±0,1) behandelt, Proben mit signifikantem Titerunterschied isoliert und bei einem pH-Wert von 4,2 (±0,1) 8 Minuten (±1) behandelt und Proben mit einem Titerunterschied von mindestens 2 Zehnerpotenzen weiterkloniert.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die temperaturempfindliche Mutante mindestens einmal in primären Kaninchennieren-Zellkulturen kloniert und isoliert.
4. Verwendung der nach den Ansprüchen 1 bis 3 erhaltenen temperaturempfindlichen und im wesentlichen nicht pathogenen Stämme von Herpes simplex Typ 2-Viren zur Herstellung von Herpes simplex Typ 2-Virus-Impfstoffen.
DE2415353A 1973-03-30 1974-03-29 Verfahren zur herstellung von temperaturempfindlichen, nicht pathogenen mutanten von herpes simplex typ 2-viren und ihre verwendung zur herstellung von vaccinen Granted DE2415353A1 (de)

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