DE2456636A1

DE2456636A1 - Influenza-vakzine und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2456636A1
Application number: DE19742456636
Authority: DE
Inventors: Abraham Seftel Beare; David Mccahon; David Arthur John Tyrrell
Original assignee: National Research Development Corp UK; Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: National Research Development Corp UK; Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1973-11-29
Filing date: 1974-11-29
Publication date: 1975-06-05
Also published as: JPS5094115A; AU7587674A; IE40221B1; AU498810B2; ES432385A1; CS199569B2; US3991179A; AT331980B; CH616959A5; DK618274A; SE7414918L; NL7415614A; PL97723B1; BE822736A; FR2253535A1; IE40221L; CA1044138A; ATA953774A; ZA747602B; HU173548B

Description

DR. BERG DIPL.-1NG. STAPF

PATEMTANWXf-TE β MÜNCHEN SO. MAUERKIRCHEKSTR. 4h

Anwaltsakte 25 587 29. NOV, 197*»

Be/Ro .■■■:■·■

The Wellcome Foundation Ltd. London/England

National Research Development C orporat ion

London/England

"Influenza-Vakzine und Verfahren zu ihrer Herstellung"

Die vorliegende Erfindung betrifft Influenza-Vakzine und im besonderen von zwei unterschiedlichen Virusstämmen abstammende Influenza-Rekombinationsvakzine sowie Verfahren zu ihrer Herstellung ■.

Case Kr. X 133 -2-

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Influenza ist eine Viruserkrankung der oberen Atemwege, die sich, als solche in Form von Fieber, Kopfschmerzen, Halsentzündungen, Muskelschmerzen und Müdigkeit äußert. ÜngMch vielen Virus erkrankungen verleiht die Influenza dem Patienten nur temporär spezifische Immunität und es kann daher die Erkrankung, sofern sie epidemisch auftritt, durch Ansteckung wiederholt erworben werden. Es wird daher neuerdings die Influenza-Vakzinierung durchgeführt, um gegen einen vorherrschenden Stamm des Influenza-Virus aktive Immunität zu verleihen und damit die Influenza-Ansteckung während Epidemien zu vermeiden oder einzuschränken.

In den 40er Jahren dieses Jahrhunderts wurden inaktivierte Influenza-Vakzine erfolgreich verwendet, um merklich das Auftreten der Erkrankung zu verringern; derartige Vakzine leiden jedoch an dem lachteil, daß sich der abgetötete Virus in dem Wirt nicht vermehren kann. Es ist daher eine relativ hohe Menge an Inoculum erforderlich und es muß entsprechend eine große Menge an antigenem Material hergestellt, geprüft und verteilt werden. Dieses Problem ist bei Influenza-Vakzinen deshalb besonders akut, weil die zur Herstellung des Vakzins erforderliche Zeit dessen Verfügbarkeit gut verhindern kann bis die Epidemie vorüber ist, selbst wenn mit der Herstellung unmittelbar nach Ausbruch begonnen wurde. Weiterhin schränkt die ünvor-

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sehbarkeit einer gewissen antigenen Variation irgendeines zukünftigen Influenza-Stammes den Wert einer Torzeitigen Herstellung und Lagerung in großem umfang ein_? und es ist daher eine schnelle Anpassung an. die neuen, in der gesamten /Welt auftretenden epidemischen Formen erforderlich.

Es wurden daher lebende abgeschwächte'Influenza-Vakzine vorgeschlagen, bei denen der Virusstamm Passagen durch eine Vielzahl von Zeilsystemen durchlaufen hat, bis er 3eine Fähigkeit zur Bildung der Erkrankung verloren hat, während er seine immunigene Eigenschaft* noch vollständig beibehalten hat. Nach dem man den Wirt geimpft hat, vermehrt sich der Virus in gewissem Ausmaß so, daß nur eine geringe Anfangsimpfmenge mit entsprechenden Einsparungen an Zeit und Arbeit bei der Herstellung erforderlich ist. Bei diesen Vakzinen ist es jedoch von Bedeutung, daß die abgeschwächten Stämme unschädlich sind, und daß die Infektion von krankheitsanfälligen Kontaktpersonen gering ist.

Die Verwendung der genetischen Rekombination zwischen verschiedenen Influenza-Stämmen zur Bildung eines verbesserten antigenen Materials mit den vorteilhaften Eigenschaften jedes Stammes in inaktivierten oder lebenden Vakzinen ist bereits bekannt. Beispielsweise wurden.hybride Stämme» die von einem abgeschwächten und einem virulenten Stamm

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hervorgegangen sind, beschrieben und untersucht, wobei jedoch keine der erhaltenen Eekombinationsvarianten für praktische Zwecke annehmbar waren. Es wurde angenommen, daß es vorteilhaft ist, einen durch Passagen auf einer Vielzahl von Zellsystemen, einschließlich der von verschiedenen Säugern abgeschwächten Influenza-Stamm zu verwenden, wobei jedoch die Eigenschaften der erhaltenen Stämme im Hinblick auf die Vorgeschichte dieses abgeschwächten Parentalstammes aus Sicherheitsgründen als ungeeignet angesehen werden müssen.

Es wurde nunmehr gefunden, daß zufriedenstellende und annehmbare Rekombinations-Influenzastämme hergestellt werden können aus der Kombination eines "über-abgeschwächten" Influenza-A-Parentalstammes, im besonderen des A-2-Typs mit einem virulenten Influenza-A-Parentalstamm, wobei die ausgewählten fiekombinationsstämme die Wuchseigenschaften des über-abgeschwächten Stammes, gekuppelt mit den antigenen Eigenschaften des virulenten Stammes, aufweisen. Den verwendeten über-abgeschwächten Stamm erhält man ausschließlich über Passagen in Hühnereikulturen und er weist eine relativ hohe Ausbeute an Virus in Hühnereiern und eine erhöhte Kapazität zur Plaquebildung auf Kalbsnierenzellen auf. Der virulente Influenza-A-Stamm weist andererseits eine relativ geringe Kulturausbeute an Virus auf, während er im wesentlichen frei ist an verunreinigenden Säugerviren.

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Unter der für den ersten Stamm erforderlichen "Über-Abschwächung" ist zu verstehen, daß die Anzahl der Passagen zur Abschwächung wesentlich größer ist,als sie normalerweise zur Entfernung der Pathogenitat erforderlich ist. Die abgeschwächte virale Komponente behält jedoch nach diesen zahlreichen Passagen ihre Antigenwirkung, d.h. sowohl ihr Hämagglutinin-(H)-Antigen, als auch ihr Neuraminidase-(N)-Antigen bei, so daß seine immunogene Fähigkeit nicht beeinträchtigt wird. Derartige Stämme bilden praktisch keine Symptome oder Nebenwirkungen, wenn sie empfindlichen Personen,- wie Kindern, verabfolgt werden und es kann von ihnen eine auf einer zweckmäßigen Untersuchung beruhende Sicherheitsleistung erwartet werden. Es kann vorgezogen werden, einen Stamm, z.B. einen A-2-Stamm zu verwenden, der vor 10 oder sogar 20 Jahren isoliert wurde, so daß ein ausreichender antigener Unterschied zwischen diesem und dem neuerdings auftretenden virulenten Stamm vorliegen kann, und daß die Sicherheit des Stammes als fest angesehen werden kann. Tatsächlich sollte ein Unterschied von wenigstens 1 Einheit zwischen den Hämagglut inin-Antikor perarten der beiden Parenta1stamme, z.B. H₂ und H, vorliegen, wobei die höhere Zahl dem neueren virulenten Stamm entspricht.

Solche abgeschwächte Stämme können beispielsweise durch Eipassagen, wie in der Japanischen Patentschrift Nr.

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310.662 beschrieben, erhalten werden. In dieser Patentschrift ist im besonderen die Herstellung des A/OKÜDA/57 (HgN₂)-Stammes, der von einem Stamm des A-2-Typs abstammt, der isoliert wurde in Osaka, Japan, während seines epidemischen Auftretens 1957 und der nach dem hier beschriebenen Verfahren abgeschwächt wurde, und es ist zusätzlich ein weiterer Stamm des A-2-Typs, der A/KINUGASA/57-Stamm beschrieben. Ein weiterer Stamm, der geeignet sein kann, ist der A'2/JAPAN/505/57-Stamm, der in der "American Type Culture Collection" (ATCC) unter der Hummer Vß-100 hinterlegt ist.

Der Okuda-Stamm, der der zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugte abgeschwächte Virusstamm ist, kann auch von der Weltgesundheitsorganisation, World Influenza Centre, National Institute of Medical Research, Mill Hill, erhalten werden, wo dieser Stamm nach 280 Eierpassagen hinterlegt und der Öffentlichkeit zugänglich ist.

Der andere für die Rekombination nach der vorliegenden Erfindung erforderliche Stamm kann ausgewählt werden aus einer Anzahl Influenza-Virusstammen des Α-Typs, die ihre Virulenz bei Menschen beibehalten haben und die nur in Eiern oder anderen von den Kontrollbehörden, beispielsweise dem National Institute for Biological Standards, Holly Hill, Hampstead, genehmigten Kulturen gezüchtet

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wurden. Es wird jedoch, "bevorzugt, daß man einen solchen Stamm auswählt, der vor ziemlich kurzer Zeit vor der Herstellung des Rekombinationsvakzins isoliert wurde. Die Wahrscheinlichkeit, daß das Vakzin die gewünschte Immunität gegen die Infektion mit einem zukünftigen Stamm liefert, wird, dann im Hinblick auf die antigene Ähnlichkeit zwischen diesen Stämmen entsprechend verbessert.

So wurde beispielsweise zum Zeitpunkt des Prioritätdatums der vorliegenden Anmeldung erfolgreich als virulenter Stamm der A/ENGLAIID/42/72(H₅K₂)-Virus verwendet. Danach wurde der A/ltKWLAHD/4/74(H₅N₂)-Virus isoliert und es wurde festgestellt, daß er besonders zum Einbringen in eine Rekombinations-Influenzavakzin geeignet ist. Diese beiden Stämme wurden bei der oben angegebenen internationalen Organisation des Hational Institute of Medical Research in Mill Hill hinterlegt und stehen nunmehr der Öffentlichkeit zur Verfügung.

Die vorliegende Erfindung betrifft demgemäß in einer Hinsicht einen Rekombinations-Influenzavirusstamm, der abstammt von a) einem über-abgeachwäöhten Influenza-AStamm ·, vorzugsweise einem A-2-Stamm, wie dem A/ÖKÖDA/57-Stamm, den man"JurchJPassagen ausschließlich in Hühnereikulturen erhält, wobei er eine relativ hohe Ausbeute an Viren in solchen Kulturen beibehält und eine erhöhte Ka-

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pazität hinsichtlich Plaque bildung auf Kalbsnierenzellen aufweist und b) einem virulenten Influenza-A-Stamm, der nur eine relativ geringe Kulturausbeute des Virus aufweist und im wesentlichen frei von verunreinigenden Säugerviren ist.

Vor der Rekombination der virulenten und der abgeschwächten Stämme kann es in manchen Fällen angezeigt sein, sie einer Klonbildung zu unterwerfen, so daß jeder Stamm aus einem einzigen Ausgangsviruspartikel hervorgegangen ist. Da es darüberhinaus üblich ist, die deponierten Stämme in lyophilisierter Form zu lagern, ist es eine weitere Voraussetzung, daß jeder Virusstamm in diesem Falle in einem geeigneten Medium rekonstituiert werden muß, wie einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung und Tryptosephosphatbrühe, wünschenswerterweise in Gegenwart von Antibiotika, um alle Bakterien, die vorhanden sein können, abzutöten. Nach der Impfung in die Allantοin-Eihaut, wünschenswerterweise von spezifischen pathogenfreien (SPF)-Eiern und Bebrüten, kann die Allantoinflüssigkeit extrahiert und bis zum Bedarf bei niederen Temperaturen gelagert werden.

Um die Rekombination zweier Stämme zufriedenstellend zu erreichen, ist es notwendig, daß der unterschied zwischen ihren Virusbildungskapazitäten in Hühnereiern nicht zu

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groß ist. Der hohe Ausbeute liefernde abgeschwächte Virus wird daher mit ultraviolettem Licht oder Gammastrahlung bestrahlt oder er wird auch erhitzt, um eine etwa 99$ige Inaktivierung der Gesamtvirusinfektivitat zu erzielen und damit seine Ausbeutekapazität mit der des relativ geringe Ausbeute liefernden virulenten Virusstammes in Einklang zu bringen. Dies und das nachfolgende Rekombinationsverfahren, bei dem man die Proben der Virusstämme zusammen in einer einzigen Eikultur züchtet, ist im Postgraduate Medical Journal (1973) 49, 195-199 beschrieben.

Es ist darauf hinzuweisen, daß, wenn die gleichen Virusstämme wenn sie auf der gleichen Art von Zellen unter ähnlichen Bedingungen, jedoch in getrennten Kulturen, zur Rekombination gebracht werden, nicht in einer vollständig reproduzierbaren Weise rekombinieren, und daß leichte unterschiede hinsichtlich der Eigenschaften, beispielsweise hinsichtlich der Virusbildungskapazität, auftreten können. Es gibt jedoch nur eine sehr begrenzte Zahl möglicher Rekombinationen und durch unter annehmbaren Bedingungen geführte Prüfungen oder Versuche kann ein Virusstamm gebildet werden, der den Erfordernissen der vorliegenden Erfindung entspricht . Es wurde vorteilhafterweise festgestellt, daß, wenn der bevorzugte Okuda-Stamm als der abgeschwächte Parentalvirusstamm verwendet wird, nahezu alle

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möglichen fiekombinationsprodukte für die Durchführung dieser Erfindung geeignet sind.

Es wird demgemäß bei dem verwendeten bevorzugten Verfahren zur Herstellung der Rekomb!nationsprodukte der vorliegenden Erfindung, der abgeschwächte Parentalstamm mit ultraviolettem Licht bestrahlt und dann wird die Eekombination mit dem virulenten Parentalstamm durch gleichzeitige Impfung in Eihautkulturen der Allantoishaut (allantoison-shell (AOS)-Kulturen) von 10 Tage alten SPi¹ -Eiern bewirkt. Nach Bebrüten gibt man zu jeder Kultur ein Hyperimmunserum, vorzugsweise Kaninchen- oder Frettchenserum, das gegen einen hochgereinigten Virus hergestellt ist,
dessen Hämagglutinin antigen mit dem abgeschwächten Parentalstamm eng verwandt oder identisch ist. Auf diese
Weise kann die Virusausbeute des abgeschwächten Parentalstammes so verringert werden, daß nur sehr wenig von dem Parentalstamm nach der Rekombination verbleibt. Weil die virusbildende Kapazität des virulenten Parentalstammes
relativ gering ist, besteht keine Notwendigkeit, diesen
Virus in ähnlicher Weise zu unterdrücken.

Kulturen, die nach weiterer Bebrütung Hämagglutination
aufweisen, werden abgenommen und Portionen entnommen für Hämagglutinin- und Neuraminidase-Inhibierungsuntersuchungen zur Auswahl derjenigen fiekombinationsprodukte, die die

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antigene Komposition des virulenten Influensa-A-Parentalstammes aufweisen und damit in Vakzinen potentiell wirksam sind. Die so ausgewählten Kulturen werden dann abgenommen und in Klonkultur genommen, um die verbliebenen Parentalviren zu entfernen und solche angetroffenen Rekombinationsprodukte, die für die weitere Untersuchung nicht geeignet sind, werden verworfen. Die Klonbildung wird mittels dem G-renzverdünnungsverfahren durchgeführt, wie es im Postgraduate Medical Journal (siehe oben), beschrieben ist. Jeder ausgewählte Rekombinationsstamm kann dann über Passagen in einer geeigneten Eikultur, wie SPF-Eiern oder davon abstammenden AOS-Kulturen, über etwa ein oder zwei Passagen genommen werden, um seine Ausbeute zu erhöhen und einen sterilen, in SPi¹-Eiern hergestellten antibiotikafreien Ansatz zur Prüfung in Testpersonen zu gewinnen. Diese Untersuchungen dienen der Prüfung, ob der Rekombinationsstamm genetisch stabil ist und sich nach Impfung im Menschen zur Immunisierung eignet.

Die vorliegende Erfindung schafft daher in weiterer Hinsicht ein Verfahren zur Herstellung eines Rekombinations-Influenzastammes, wie vorausgehend definiert, das darin besteht, daß man den über-abgeschwächten Parentalstamm inaktiviert, um seine Anfangsinfektivität wesentlich zu reduzieren, diesen Stamm zusammen mit den virulenten Parent alstämmen in eine einzige Kultur impft, die Kultur ' -12-

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bebrütet und dann eine Klonzüohtung durchführt, um die Parentalstamme zu entfernen und den gewünschten Rekombinationsstamm zu isolieren. Die Unterdrückung des abgeschwächten Parentalstammes kann zweckmäßigerweise durch Zugabe eines geeigneten Hyperimmunserums zu der Kultur erreicht werden. Es werden dann geeignete Rekombinationsstamme ausgewählt, wozu man die so erhaltenen Kulturen hinsichtlich ihrer Hämagglutinations- und antigenen Eigenschaften durch Routineuntersuchungen überprüft und es wird dann das gewünschte Rekombinationsprodukt durch Klonzüchtung isoliert.

Der aus dem ausgewählten Rekombinationsstamm hergestellte sterile Ansatz wird aus Testpersonen reisoliert, beispielsweise mittels intranasaler Verabfolgung und Sammeln der nasalen Waschlaugen. Die so erhaltene Virusausbeute kann dann wiederum,Vorzugsweise zweimal, Passagen in Eikulturen durchlaufen und es kann daraus ein Vakzin in einem Verdünnungsmittel, wie einer phosphatgepuffert en Kochsalzlösung, in Gegenwart von Stabilisatoren, vorzugsweise hydrolisierter Gelatine und Sorbitol, hergestellt werden. Das erhaltene Vakzin, das gefriergetrocknet und dann bei Bedarf rekonstituiert werden kann, kann Menschen vorteilhafterweise intranasal verabfolgt werden.

Die vorliegende Erfindung schafft daher in weiterer Hin-

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sieht ein Vakzin, das einen Kekombinations-Influenzastamm, wie vorausgehend definiert, enthält, sowie ein Verfahren zur Herstellung des Vakzins.

Die Erfindung wird nunmehr durch die folgenden Beispiele erläutert, ohne daß sie dadurch eingeschränkt werden sollen.

Beispiel 1

Rekombiaat'loneprodukt von A/OKÜDA/57(H₀N₀) mit A/ENGLAND/

( T) Herstellung der Parentalstamme

(a) Abgeschwächter Virusstamm - A/OKUDAy57(HgNg)

Der 0kuda-A-2~Stamm, der nur mittels Passagen über Ei- kulturen erhalten und zehntausenden von Kindern in Japan in Aerosolform ohne Nebenwirkungen verabfolgt wurde, wurde nach der 280sten Passage mit einem Hämagglutinintitre von 1:1280 in lyophilisierter Form verwendet. Dieser wurde in 1,5 ml eines Gemischs von phosphatgepufferter Kochsalzlösung und 1Obiger Tryptosebrühe und 1500 internationalen Einheiten jeweils von Penicillin und Streptomycin rekonstituiert in die Allantoinhaut von drei 10 Tage alten SPF-Eiern geimpft und bei.-35⁰O 3 Tage bebrütet. Die Allantoinflüssigkeit von einem Ei wurde gesammelt und in kleinen Volumen bei -6O⁰C gelagert. Für den ßekombinationsversuch wurde eine kleine Teilmenge aufgetaut und im Verhältnis

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1:100 in normaler Kochsalzlösung verdünnt und 30 Sekunden mit ultraviolettem Licht bestrahlt, was ausreichend war, um eine etwa 99$ige Inaktivierung der Gesamtvirusinfektivität zu erzielen»

(b) Virulenter Virusstamm - A/ENGLAND/42/73(H₅H₂)

Dieser Stamm wurde als lyophilisierte Probe der Allantoinflüssigkeit über Or. G.C.Schild von dem National Institute of Medioal Research, Mill Hill, erhalten. Der Virusstamm war ein Eiisolat, das drei Passagen in Eiern durchlaufen hatte und einen Hämagglut inint it re von 1s128 aufwies. Das lyophilisierte Material wurde in einem Gemisch von phosphatgepufferter Kochsalzlösung und 1Obiger Tryptosephosphatbrühe mit 1000 internationalen Einheiten, jeweils an Penicillin und Streptomycin, zurückgebildet. 0,2 ml dieses Materials wurde in den Allantoinsack von drei 10 Tage alten SPF-Eiern geimpft und drei Tage bei 35⁰C bebrütet. Die Allantoinflüssigkeit von einem Ei wurde gesammelt und in kleinen Volumen bei -60⁰C gelagert.

(2) Rekombination und Isolierung der Rekombinationsprodukte

Es wurden AOS-Kulturen von 10 Tage alten SPF-Eiern hergestellt und in die Aussparungen eines Hämagglutinationsbehälters dispensiert. 0,03 ml jedes Virus wurden dann jeder Kultur zugegeben; der A-0kuda-Stamm, vor der Bestrahlung verdünnt auf 1:100 und der lebende A-England-Stamm auf 1s30 verdünnt in normaler Kochsalzlösung. Der

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Behälter wurde in einen Kunstst offbeutel gegeben und auf einem Schüttler (etwa 100 Schwingungen/Minute) bei 37 C bebrütet. Nach,4 Stunden Bebrüten wurde Hyperimmun-Kaninchenserum jeder Aussparung auf eine Endverdünnung von 1:3000 zugegeben, um den Aufwuchs des abgeschwächten Parentalsfe.mmes zu unterdrücken und es wurde dann das Bebrüten fortgesetzt. Dieses Serum, das hergestellt wurde gegen den hoch gereinigten A/SIHGAPORE/57(H₂K₂)-Virusstamm, der antigen sehr eng mit dem Okuda-Stamm verwandt ist, wurde einhundertfach in normaler Kochsalzlösung vor Verwendung verdünnt und als besondere Vorsichtsmaßnahme 2 Minuten ultraviolettem Licht ausgesetzt, um alle Fremdstoff e, die vorhanden sein können, zu zerstören. Nach insgesamt 48 Stunden Bebrüten bei 37 C wurde eine 5$ige Suspension roter Blutkörperchen von SPi¹-Küken jeder Vertiefung auf eine Endkonzentration von 0,5$ zugegeben. 22 von 77 Kulturen zeigten Hämagglutination und wurden einzeln als präsumptive Rekombinationsprodukte entnommen. 0,1 ml jedes präsumpt iven Rekombinationsprodukts wurde .in 10Tage alte SPF-Eier geimpft, die bei 37⁰C 3 Tage bebrütet wurden. Nach dieser Zeit wurden die Eier auf das Vorliegen von Hämagglutinin geprüft und der Hämagglutinintyp wurde mittels Hämagglutinin-Inhibierungsuntersuchungen identifiziert. Bei dieser vorbereitenden Untersuchung wurden vier Isoliermaterialien dahingehend identifiziert,' daß sie eine hohe Virusbildungskapazität und die Hämagglutinin-

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komponente des virulenten A-England-Stammes, wie gewünscht, aufwies. Eines dieser Isolierprodukte wurde nachfolgend verworfen, da Ueuraminidase-Inhibierungsuntersuchungen zeigten, daß dieses Bekombinationsprodukt die Neuraminidasekomponente des abgeschwächten A-Okuda-Parentalstammes und nicht die gewünschte des virulenten A-England-Stammes aufwies.

Jede verbleibende Abnahme dieser so ausgewählten AOS-Kulturen wurde dann dreimal einer Klonkultur unterworfen, um die verbliebenen Parentalviren und die Rekombinationsprodukte zu entfernen, die bei der oben angegebenen Untersuchung für die Durchführung der klinischen üntersuchungsstufe als nicht geeignet festgestellt wurden. Vorausgehend wurde die Viruskultur durch Behandlung in einem Ultraschallbad (Kraftaufwand 80 Kilozyklen/Sekunde) 30 Sekunden einer Desaggregationsbehandlung unterworfen. Die Klonierung wurde dann durch Verdünnen der Kultur in 2- oder 3-fach-Stufen bewirkt und es wurde dann in 10 Tage alte befruchtete (Embryo-)Eier oder AOS-Kulturen geimpft, wozu man ein Minimum von acht Wiederholungs-(ßeplikat-)Kulturen für jede Verdünnung verwendet. Die Grenzverdünnungskione wurden aus Kulturen isoliert, bei denen die verwendete VirusVerdünnung nur etwa 10$ der üeplikate infizierte, was durch positive Hämagglutination bei Prüfung mit roten Blutkörperchen von SPF-Küken festgestellt werden konnte,

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Jeden ausgewählten Klon ließ man dann ein- oder zweimal in 9 12 Tage alten SPi¹-Eiern durch Passagen laufen und
es wurde ein steriler Ansatz von jedem ausgewählten Rekombinationsprodukt in 10 Tage alten SPF-Eiern (ohne die Verwendung von Antibiotika) hergestellt. Dieser Ansatz
wurde dann mittels Hämagglutinin- und Neuramidase-Inhibierungsuntersuchungen zur Prüfung seiner antigenen Zusammensetzung untersucht und bei Eignung klinischen Untersuchungen unterworfen.

Beispiel·2

Rekombinationsprodukt von ä/OKODA/57(H₃N₂) mit A/FINNLAND/

(1) Herstellung von Parentalstämmen

(a) Abgeschwächter Virusstamm - A/OKUDA/57(H₃N₂)

Eine kleine Teilmenge der mit dem Okuda-Stamm von Beispiel (1) (a) geimpften Allantoinflüssigkeit wurde aufgetaut
und zweimal in SPF-Eierη geklont. Sie wurde dann in
1:100 normaler Kochsalzlösung verdünnt und 30 Sekunden mit ultraviolettem Licht bestrahlt.

(b) Virulenter Virusstamm - A/FINNLAND/4/74(H N₂)

Dieser Stamm wurde in Eiern aus einem Hals-(Rachen-)abstrich isoliert, der von Dr. Canteil von den Central Public Health Laboratory, Helsinki, Finnland zur Verfügung gestellt wurde, und der ein Hämagglutinintitre von 1:2560

' -18-

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hatte. Der Virus stamm,, der also eine Passage in Menschen und eine in SPi¹-Eiern durchlaufen hatte, wurde dann zweimal in diesen Eiern geklont. Die Allantoinflüssigkeit von einem Ei wurde ausgewählt und in kleinen Volumen bei -6O⁰C gelagert.

(2) Rekombination und Isolierung der Rekombinationsprodukte

Der A-Okuda-Parentalstamm wurde mit dem A-Finnland-Stamm bei 1:30 Verdünnung in AOS-Kulturen in einem Hämagglutinationsbehälter gemischt und dann wurde der Behälter in einem Kunststoffbeutel auf einem Schüttler bei 36⁰O bebrütet. Wach 1 Stunde wurde jeder Vertiefung Antiserum auf eine Endverdünnung von 1:2000 zugegeben, um das Wachstum des abgeschwächten Parentalstammes zu unterdrücken und es wurde dann das Bebrüten fortgesetzt. Das Antiserum war ein Hyperimmun-Frettchenserum, das gegen A/OKUDA/57 hergestellt und vor Verwendung bestrahlt wurde, wozu man es in einer 1:20 Verdünnung zwei Minuten einer ultravioletten Bestrahlung aussetzt. Fscii 31 Stunden Gesamtbebrütung wurde eine 0,5$ige Suspension roter BiuiKdrperchen von SPF-Küken jeder Vertiefung zugegeben, um die hämagglutinierende Aktivität festzustellen. 19 von 64 Kulturen zeigten Hämagglutination und diese wurden einzeln entnommen. 0,1 ml jedes präsumptiven Rekombinationsprodukts wurde in SPF-Eiern geimpft, die 3 Tage bei 37⁰C bebrütet wurden. Die Eier wurden dann hinsichtlich des

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•Hämagglutinintyps mittels Hämagglutinininhibierungs-Untersuchungen auf · Infektivität in AOS-Kultureh -und hinsichtlich des Hämagglutinintitres in Eiernuntersucht. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurden 11 der 19 abgenommenen Kulturen zweimal in AOS-Kulturen und einmal in SPi-Eiern nach dem in Beispiel 1 (2) beschriebenen Verfahren geklont. Ein steriler antibiotikafreier Ansatz von jedem ausgewählten Rekombinationsprodukt wurde in 10 Tage alten SPl-Eiern hergestellt und die Ansätze der Untersuchung der an^lgenen Zusammenseinzvoag geprüft. 8 dieser Ansätze hatten die Antigene von Α/ΡΙΜΙιΑ]Π)/4/74 und diese waren in ihren Wuchseigenschaften A/OKÜDA/57 ähnlich und sie wurden für die Behandlung mittels klinischer Untersuchungen ausgewählt.

Klinische Versuche

Klinische Versuche wurden unter Verwendung der drei ausgewählten Rekombinationsstamme unter den Bezugsnummern ' WRL 55) 65 und 68 von Beispiel 1 und den drei Stämmen WRL 94, 100 und 105 von Beispiel 2 durchgeführt, wobei die entsprechenden virusliefernden Kapazitäten in den Tabellen I bzw. II angegeben sind.

Den ausgewählten Virusstamm ließ man eine Passage in Hühnereiern durchlaufen und verdünnte ihn dann auf einen geeigneten Titre. 1,0 ml Mengen dieses Virus wurden dann

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intranasal jedem einer Anzahl von Versuchspersonen verabfolgt. Die nasalen Waschlaugen wurden am dritten und vierten Tag nach der VirusInokulation gesammelt und sie wurden in die Allantoinhöhle von 11 Tage alten Embryo-Hühnereiern geimpft. Diese wurden nach 2 Tagen Bebrüten bei 53°C auf Virushämagglutinin untersucht. Die vor dem Versuch und 14 Tage nach Bebrüten gesammelten Seren wurden auf hä.Tnagglut inat ions-inhibierende (HAI) -Antikörper mittels Standardverfahren, wie beispielsweise nach dem in Br.Med.J. 1968, iv., 36, 385, beschriebenen Verfahren untersucht.

In den Tabellen III und IV sind die folgenden Werte angegeben: Der verwendete Rekombinationsνirusstamm, die Infektivitätsdosis in E.I.D.-q des Virusinoculums, die Anzahl der Versuchspersonen, der Anfangs-HAI-Titre in dem Serum, die Reaktionen (ausgewiesen durch das Auftreten und die Dauer von Fieberzuständen, Schnupfenzuständen und subjektivem Unbehagen und durch erhöhte Verwendung von Taschentüchern), der Teil der Versuchspersonen, die Virus-Exkretion in den Nasenwaschlaugen 3 und 4 Tage nach Impfung aufwiesen und der Teil von Versuchspersonen, bei denen das Serum (a) ein Ansteigen des HAI-Titres, (b) ein wesentliches Ansteigen des HAI-Titres, d.h. wenigstens einen 4-fachen Anstieg aufwies.

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Weitere Versuche wurden durchgeführt, um die genetische Stabilität der Rekombinationsstämme zu bestimmen. Beispielsweise wurde die erste Nasenwaschlauge einer Versuchsperson, die mit dem WRL 55 Rekombinationsstamm geimpft wurde, 1:5 verdünnt, intranasal 5 Versuchspersonen verabfolgt. Die Ergebnisse zeigen, daß WRL 55 tatsächlich in nur sehr geringen Mengen in Exkretionen auftritt. Die Versuche wurden weiterhin mit WRL 105 und 100 durchgeführt, bei denen das Rekombinationsprodukt aus den Nasenwaschlaugen einer Versuchsperson reisoliert wurde, die vorausgehend mit einem 3-fach geklonten Rekombinationsprodukt geimpft wurde und es wurde dann das isolierte Produkt Passagen in SPl-Eiern durchlaufen lassen, um eine große Vakzinmenge herzustellen. Dieses Vakzin wurde dann bei einer großen Zahl von Versuchspersonen geprüft und die genetische Stabilität des Rekombinationsstammes festgestellt. Dabei ist zu erkennen, daß WRL 105 eine größere genetische Stabilität als WRL 100 aufweist und daher bevorzugt wird.

Tabelle Is -22-

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	Virusstamm	Tabelle I	Heuraminidase	Virusliefernde
Virus- Parental-	A/OKÖDA/57	Ant igene	N₂C1957)	Kapazität (HAö/0,25 ml)
St amme cn ο	A/ENGLAND/42/72	Hämagglut inin	.,(1978)	1000
is> Rekombination ί^* Virusstämme co S)	IS- WEL 55	^H2	N₂(1972)	96
	WRL 68	H₃	N₂(1972)	256
WRL 68		N₂(1972)	512
		512
Η,

HAD = Hämagglutinineinheiten

K)

ro

K)
I

cn σο

CD

co

	A/OKÜDA/57	Tabelle II	Neuramididase	Virusliefernde
	Α/ΕΊΜΙΑ1Π)Α/74	Antigene	N₂(1957)	Kapazität (HAU/O,25 ml)
Virusstamm	WEL 105	Hämagglut inin	N₂C1974)	941
	WRL 100	^H2	' N₂(1974)	445
Virus- Parental- Stämme	WRL 94		N₂(1974)	920
Rekombi- nations-	S	N₂(I974)	1080
Virus - stamme	^H3		993
	H₃

HAU = Hämagglut inine inhe it en

ro

CD CD CO CD

ι
ro
VJl
ι

R ekomb inat i ons-
Virusstamm

Infaktivi
tät ados ia
E.I.D._CA/

Tabelle III

^V 2

3

Anfangs-HAI-
Titre in
Serum

24

Reaktionen

Exkretion
des Virus

4.
Tag

Anstieg
im HAI-
Titre

4-facher
Anst ieg
im HAI-

cn
ro CD
O)

WRL 55

50
ml

9-3

24

0
0
1

5 keine
1 mild
1 mäßig

3.
Tag

0/5
1/1
0/1

Titre

Ver
such

WRL 55

10 *

Anzahl
der
Versuchs

5
1
0

1

8 keine

1/5
1/1
0/1

4/8

5/5
1/1
0/1

1

WRL 55

ΙΟ⁷'⁵

personen

7

2

4 keine

4/8

1/4

8/8

7/8

2

WRL 55

10⁶·5

/5
7-1

2

0

2 keine
1 mäßig

1/4

0/2
0/1

1/4

cn 3
ο

WRL 65

ίο⁵·⁵

8

3

8
1

11 keine
2 mild

0/2
0/1

1/11
2/2

1/2
1/1

(JS
QO A
NJ ^

WRL 68

₁₀6.5

4

3
1

1

3 keine

1/11
2/2

0/3

7/11
2/2

4/11
2/2

ο 5

WRL 68

ΙΟ⁷*⁶

2

4
2
0

5 keine
3 mild
1 mäßig

0/3

3/5
1/3
0/1

2/3

1/3

*** 6

ΙΟ⁷'⁶

1
1
1

2/5
1/3
0/1

3/5
2/3
1/1

2/5
1/3
0/1

7

cn ο φ

Rekombinat ions-

Infektivi-

7,0

Tabelle IV

15^

6

Anfangs-

>24

•

Reaktionen

Exkretion

(/"irus

Anstieg

^4-facher

Ver

Virusstamm

tätsdosis

Anzahl

\

HAI-Titre

M-

des ^λ

4.

im HAI-

Anstieg

such

E.I.D._5O/

der

in Serum .

3.

Tag

T itre

im HAI- '

ml

Versuchs

^24 ,

3

Tag

1/3

• Titre

personen

4 ,

3 keine.

1/3

1/1

3/3

i/3-

WRL 105 aaa/1

/4

1 mild ^D

1/1

2/3

1/1

0/1

ί

7,5

7 ^

_

3 sehr

2/3

3/3

2/3

N 3

—

mild

0/5

5 sehr

0/5

3/4^x

2/4^x

mild

0/1

9

6

1 mild

0/1

1/2

T/1

1/1 _t

WRL IO5/1/74

9

.2 mäßig

1/2

1/1

2/2

2/2 _i

2

1 NG

0/1

0/3

0/1

O/l '

—

3 keine

0/3

1/2

2/3

1/3

2 sehr

1/2

2/2

mild

0/1

.1 NG ,

0/1

1/1

0/1

WRL i05 aaa/1 WRL IO5/I/74

Dreifach geklöntes Isolat des Rekombinätionsprodukts

Rekombinationsprodukt, reisoliert aus der nasalen laschlauge von b und nach Passagen in SPi¹-Eiern zur Bildung des Vakzinansatzes.

nicht brauchbare Post-Inokulationsserumprobe NG nicht geeignet zur Bewertung

IK5

.cn

CD

CO

ro

VJl

Tabelle IV Fortsetzung

Ver

ο

4

Rekombinat ions-

Infektivi-

Anzahl der

/

VJl

2

/

18,

Anfangs-

>24

Reaktionen

Exkretion

¹

4.
Tag

Anstieg

^4-facher

¹

such

m

Virusstamm

tätsdosis

Versuchs

^λ1Ο

HAI-T it re

-

des Virus

OZ₂

im HAI-

Anstieg

Ε.Ι.Ό._5Ο/
ml

personen

in Serum

3.
Tag

OZ₂

¹V

Titre

im HAI-
Titre

V₂

3

8

^24

2 keine

OZ₂

I

2Z₂

V₂

3

1 sehr

V

OZ₁

V₁

V

V₁

2

mild

0Z₁

OZ₂

I

%

WRL 100 aaa/1

7,3

I

3

2 keine

2Z₂

OZ₁

V₂

2/₂

-

IBV

o/

4/₄

1 keine

1 sehr

1Z₃

2Z₂

%

V₃ ^₃

8

mild

I

2 mild

3Z₃

2Z₂

5 oz

10

4 stark

V₁

OZ₅

OZ₁ o:

WRL 100/1/74

7,3

V₁

V₁ <£

3 keine

2Z₂

3Z₃

2/₂

-

3 sehr

V₁

mild

V₁

3Z₃

1 mild

2/₂

¹M

1 mäßig

V₁

2 stark

2/₂

a. WRL 100 aaa/1: Dreifach geklöntes Isolat des Rekombinationsprodukts.

, WRL IOO/1/74 ϊ Rekombinationsprodukt WRL 100 aaa/1, reisoliert aus nasalen Waschlaugen

ro ' und nach 2-fachen Passagen in SPI¹-Eiern zur Bildung des ^zinansat zes.

"J³ unmittelbar geimpft ohne weitere Passage.

von b., Vakzin

!Tabelle IV ffortsetzung

Ver
such

Rekombi-
nations-

Infektivi-
tätsdosis

7,0

Anzahl der
Versuchs

14

Anfangs-
HAI-T it ie

y24

Reaktionen

Exkretion
des Virus

4.

Anstieg
im HAI-

4-facher
Anst ieg

t

Virus stamm

E.I.D.₅₀/ml

personen

in Serum

-

3.

Tag

■'Titre

im HAI-

•

5

■

*=24

13

Tag

0/1

Titre

1

94 aa/1: Doppel geklöntes Isolat des

1

0 keine

0/1

1/8

0/1

WRL94 aa/1

8 keine

1/8

0/5

6/8

4/8

WRL

5 sehr
- mild

1/5

4/5

to

Rekombinationsprodukts.

cn cn-

CQ CO CD

Claims

- 28 Pa tentansprüohe:

1. Bekombinations-Influenzavirusstamm, hervorgegangen aus

(a) einem über-abgeschwächten Influenza-A-Stamm, der ausschließlich Passagen in Hühnereikulturen durchlaufen hatte, eine relativ hohe Ausbeute an Virus in solchen Kulturen aufweist und eine erhöhte Kapazität zur Plaquebildung auf Kalbsnierenzellen aufweist, und

(b) einem virulenten Influenza-A-Stamm, der eine relativ geringe Kulturausbeute des Virus aufweist und im wesentlichen von verunreinigenden Säugerviren frei ist.

2. Rekombinations-Influenzavirusstamm gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der über-abgeschwächte Influenzastamm ein A-2-Stamm ist.

3. Rekombinations-Influenzavirus gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß der virulente Influenzastamm Passagen nur.in.Ei- oder anderen von den.Kontrollbehörden genehmigte Kulturen durchlaufen hat.

4. Rekombinations-Influenzavirusstamm gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der virulente Stamm ein kurz vor dem Zeitpunkt der Rekombination isolierter Stamm ist.

-29-

609823/0872

5. Rekombinations-Influenzavirusstamin. gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß der Unterschied zwischen den Hämagglutinin-Antikörpertypen der Parenta1stamme wenigstens 1 Einheit beträgt.

6. Rekombinations-Influenzavirusstamm gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß der uber-abgeschwächte Stamm eine HpNp antigene Zusammensetzung.hat.

7. Rekombinations-Influenzavirusstamm gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß der uber-abgeschwächte Stamm der A/OKUDA/57-Stamm ist.

8. Rekombinations-Influenzavirusstamm gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß der virulente Stamm eine H-Np antigene Zusammensetzung hat.

9. Rekombinations-Influenzavirusstamm gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß der virulente Stamm der A/ENGLAND/42/72-Stamm ist.

10. Rekombinations-Influenzavirusstamm gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß der virulente Stamm der A/PINNLANDAA^-Stamm ist.

-30-60-3823/0872

11. Rekombinations-Influenzavirusstamm,im wesentlichen wie vorausgehend beschrieben. \

12: Verfahren zur Herstellung eines Kekombinations-Influenzastammes gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man den abgeschwächten Parentalstamm inaktiviert, um seine Anfangsinfektivität wesentlich zu verringern, diesen Stamm zusammen mit dem virulenten Parentalstamm in eine einzige Kultur impft, die Kultur bebrütet und dann einer Klonbehandlung unterwirft, um die Parentalstamme zu entfernen und den gewünschten Rekombinationsstamm isoliert.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch g e kennze-ichnet , daß man den über-abgeschwächten Stamm durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht oder Gammastrahlung oder durch Erhitzen inaktiviert.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 und 13» dadurch gekennzeichnet, daß man ein Hyperimmunserum zugibt, das gegen ein mit dem abgeschwächten Stamm antigen enß verwandtes oder identisches Virus hergestellt ist, um während der Bebrütung diesen Parentalstamm zu unterdrucken.·

15. Verfahren gemäß Anspruch 14» dadurch gekennzeichnet , daß man das Hyperimmunserum

-31-

509823/0872

in normaler Kochsalzlösung verdünnt und mit ultraviolettem Licht zur Entfernung von Verunreinigung bestrahlt.

16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 und 15» da durch gekennzeichnet, daß man als Hyperimmunserum Kaninchen- oder Frettchenserum verwendet.

17· Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12-16, dadurch gekennzeichnet , daß man ein präsumptives Rekombinationsprodukt durch Hämagglutination nach Zugabe von roten Blutkörperchen ^on Küken zu der Kultur feststellt.

18. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch -gekennzeichnet , daß man das Rekombinationsprodukt der gewünschten antigenen Eigenschaft durch Hämagglut inin- und Keuraminidase-Inhibierungsuntersuchungen auswählt.

19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12-18, dadurch gekennzeichnet , daß man die Viruskultur vor der Klonbehandlung ultraschallbehandelt.

20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12-19, dadurch gekennzeichnet, daß man die Klonbehandlung der Kultur mit dem Grenzverdünnungsverfahren durchführt.

■-32-

6Q9823/Ö8?2

2A56636

_ 32 -

21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12-20, dadurch gekennzeichnet, daß man den ausgewählten Klon weitere Passagen in Eiern durchlaufen läßt.

22. Verfahren zur Herstellung eines Bekombinations-

Influenzastammes, im wesentlichen wie" vorausgehend ^I beschrieben.

23. Vakzin mit dem Gehalt eines Hekombinations-Influenzavirusstamms gemäß einem der Ansprüche 1-11, geeignet zur intranasalen Verabfolgung.

24. Vakzin gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet , daß es ein Verdünnungsmittel, wie eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung, enthält.

25. Vakzin gemäß einem der Ansprüche 23 und 24» dadurch gekennzeichnet, daß es einen Stabilisator, wie eine hydr^olysierte Gelatine oder Sorbitol, enthält.

26. Vakzin gemäß einem der Ansprüche 23 - 25, d a durch gekennzeichnet, daß es eine

Infektivitätsdosis von etwa 10^ bis 10⁸ ErD_cn aufweist.

50 9823/0872

27. Verfahren zur Herstellung eines Vakzins gemäß einem, der Ansprüche 23-26, dadurch geken nzeichne. t , daß man die in einem der Ansprüche 12-22 beanspruchten Stufen durchführt.

$£3823/0872