DE2555169C2

DE2555169C2 -

Info

Publication number: DE2555169C2
Application number: DE2555169A
Authority: DE
Inventors: Philip Joseph Harleysville Pa. Us Provost; Oswald Ludwig Telford Pa. Us Ittensohn; Maurice Ralph Lafayette Hill Pa. Us Hilleman
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1974-12-09
Filing date: 1975-12-08
Publication date: 1987-08-13
Also published as: MY8100308A; FR2293944B1; KE3110A; BE836390A; DE2555169A1; FR2293944A1; US4029764A; NL189050C; HK4081A; JPS5182720A; GB1508878A; CY1104A; JPS6335612B2; NL7513816A

Description

Die Erfindung betrifft Hepatitis-A-Antigen (das Antigen der infektiösen Hepatitis) sowie ein Verfahren zur Herstellung desselben und die Verwendung desselben zur Herstellung von Impfstoff gegen Hepatitis A.

Hepatitis A ist eine Leberkrankheit, die zwar gewöhnlich nicht tödlich verläuft, aber zu einer vielwöchigen schwächenden Er krankung führen kann. Gewöhnlich verbreiten sie sich durch die di rekte Berührung mit infizierten Personen oder durch infizier tes Trinkwasser oder infizierte Nahrungsmittel. Die Untersu chung der Hepatitis A ist bisher dadurch behindert worden, daß es keine einfache spezifische Analysenmethode auf Anti körper gegen Hepatitis-A-Virus gab. Es war bisher nicht mög lich, eine solche Analysenmethode zu entwickeln, weil keine Präparate zur Verfügung standen, die Hepatitis-A-Antigen in solchen Mengen enthielten, wie sie für die Durchführung der Komplementfixierung, der Bindung von Immunkörpern und anderer serologischer Analysen erforderlich sind. Die einzigen bisher zur Verfügung stehenden Prüfmethoden waren die Neutralisations untersuchung bei Seidenäffchen (Provost und Mitarbeiter, "Proc. Soc. Exp. Biol. Med.", Band 142, 1973, Seite 1257) und die immunologische Elektronenmikroskopie (Feinstone und Mitarbei ter, "Science" vom 8. November 1973) von Fäkalextrakten. Diese Methoden waren umständlich und kostspielig und für Routine untersuchungen nicht anwendbar.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine prakti sche Methode zur Gewinnung von Hepatitis-A-Antigen in genügen den Mengen für die Verwendung bei der Untersuchung auf Hepati tis A zur Verfügung zu stellen. Eine weitere Aufgabe der Er findung ist es, einen Impfstoff gegen Hepatitis A zur Verfü gung zu stellen.

Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert.

Das Hepatitis-A-Antigen (das Antigen der infektiösen Hepatitis) gemäß der Erfindung wird aus der Leber eines nicht-menschli chen Primaten, z. B. eines Seidenäffchens, wie Saguinus mystax, gewonnen, das intravenös mit Hepatitis-A-Virus infiziert wor den ist. Sodann wird die Leber des Primaten zu einem Zeit punkt, zu dem der Serumspiegel an Glutamat-Oxaloacetat-Trans aminaseenzym und an Isocitronensäure-Dehydrogenaseenzym erhöht ist, was gewöhnlich etwa 14 bis 40 Tage nach der Impfung der Fall ist, entfernt. Die Leber wird mit physiologischer Koch salzlösung bei einem pH-Wert von 6,0 bis 7,8, z. B. einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung, die 0,005 molar an Natriumphosphat und 0,143 molar an Kochsalz ist und einen pH-Wert von 7,2 aufweist, perfundiert. Dann wird die Leber, z. B. durch Mahlen, zerkleinert, um die subzellulären Bestand teile in Freiheit zu setzen, und mit physiologischer Kochsalz lösung zu einer 10gewichtsprozentigen Suspension gemischt. Das Antigen besteht aus der überstehenden Flüssigkeit, die man nach dem Klären durch Zentrifugieren mit geringer Geschwindig keit, z. B. etwa 1000 bius 2000 U/min, für einen kurzen Zeit raum, z. B. etwa 5 bis 15 Minuten, erhält. In dieser Form ist das Antigen für die Durchführung der Analysen auf Hepatitis-A- Antikörper durch Komplementfixierung und Immunkörperbindung anwendbar. Das Antigen enthält in dieser Form etwa 10⁹ Hepati tis-A-Virusteilchen je cm³ von einer Größe von 27 mµ.

Die antigenhaltige geklärte überstehende Flüssigkeit kann nach Dichtegradientmethoden, wie der isopyknischen und/oder der Geschwin digkeitszonenmethode (rate zonal method) gereinigt und fraktioniert werden. Die isopyknische oder zonale Trennung nach dem Dichte gradientenverfahren kann in an sich bekannten Medien, wie z. B. Caesium chlorid, Natriumbromid, Natriumtartrat, Saccharose oder ande ren Stoffen ähnlicher Art, durchgeführt werden. Die bei der Trennung erhaltenen verschiedenen Fraktionen werden mit Hepa titis-A-Antikörper auf Hepatitis-A-Antigen analysiert, und Fraktionen, die die maximale Menge an Hepatitis-A-Antigen enthalten, werden ausgewählt. Wenn die Trennung nach der Auf triebsdichte unter Verwendung von CsCl als Medium erfolgt, wird das Hepatitis-A-Antigen in maximaler Menge aus der Frak tion mit einer Auftriebsdichte von etwa 1,32 bis 1,36 g/cm³ gewonnen. In dieser Form enthält das Antigen etwa 10 ⁹ Hepati tis-A-Virusteilchen je cm³ von einer Größe von 27 mµ.

Das Antigen gemäß der Erfindung ist für die immunologische Analyse auf Hepatitis-A-Antikörper verwendbar. Diese Analyse ist im einzelnen in den prioritätsgleichen Schutzrechten DE-PS 25 55 188 und DE-OS 25 60 402 beschrieben.

Das Hepatitis-A-Antigen läßt sich in jeder beliebigen Form, gleich ob es aus Lebergewebe oder anderem Gewebe gewonnen wor den ist, für die Verwendung als Impfstoff gegen Hepatitis-A- Virus inaktivieren oder schwächen. Die Inaktivierung des Infi ziervermögens kann durch Behandeln mit Formalin erfolgen. Die Menge des Formalins muß ausreichen, um das Infiziervermögen des Antigens zu inaktivieren, das Immunkörpererzeugungsvermö gen jedoch zu erhalten, so daß das Material als Impfstoff wirksam ist. In typischer Weise wird Formalin, d. h. 37prozen tige Formaldehydlösung, mit etwa 1000 bis 10 000 Teilen Anti genpräparat verdünnt und etwa 2 Stunden bis 30 Tage bei Tempe raturen von etwa 4 bis 60°C gerührt; vorzugsweise wird das Formalin mit etwa 2000 bis 6000 Teilen des Viruspräparats für einen Zeitraum von etwa 2 bis 6 Tagen bei 20 bis 45°C ge rührt. Besonders bevorzugt wird die Durchführung dieses Ver fahrens für einen Zeitraum von 3 Tagen bei etwa 37°C.

Der Impfstoff gemäß der Erfindung kann zum Immunisieren von für Hepatitis-A-Virus empfänglichen Säugetierarten, wie z. B. Seidenäffchen und Schimpansen, verwendet werden.

Beispiel 1 Isolierung des Antigens

Menschliches Hepatitis-A-Virus wird zum intravenösen Impfen eines Seidenäffchens S. mystax nach dem Verfahren von Nascoli und Mitarbeitern, "Proc. Soc. Exp. Biol. Med.", Band 142 (1973), Seite 276, verwendet. 27 Tage nach der Beimpfung mit dem Virus wird die Leber entfernt. Zu diesem Zeitpunkt ist der Serumspiegel an Glutamat-Oxaloacetat-Transaminaseenzym und an Isocitronensäure-Dehydrogenaseenzym erhöht. Die Leber wird mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,2) perfundiert, mit einer Schere zerkleinert und im Mörser mit sterilem Aluminium oxid vermahlen und zu phosphatgepufferter Kochsalzlösung in solcher Menge zugesetzt, daß man eine 10gewichtsprozentige Suspension in der phosphatgepufferten Kochsalzlösung erhält. Das Antigen besteht aus 350 cm³ überstehender Flüssigkeit, die nach Klärung durch 10 Minuten langes Zentrifugieren mit 1500 U/min erhalten worden ist. In diesem Stadium enthält das Anti gen mehr als 10⁹ Hepatitis-A-Virusteilchen je cm³ von einer Größe von 27 mµ. Das geklärte Antigen wird dann in ein Caesiumchlorid-Dichtegradientenrohr eingebracht, dessen Inhalt Dichten von 1,1 bis 1,4 g/cm³ umfaßt, und Antigen mit einer Auftriebsdichte von 1,32 bis 1,36 g/cm³ wird für die Verwen dung bei der in den obengenannten Patentanmeldungen beschriebe nen Analyse auf Hepatitis A abgetrennt. Dieses Antigen enthält etwa 10⁹ Hepatitis-A-Virusteilchen je cm³ von einer Größe von 27 mµ.

Beispiel 2 Elektronenmikroskopie der Leber eines infizierten Seidenäffchens

Kleine Stücken von Seidenäffchenlebergewebe, die von mit Hepatitis-A-Virus infizierten Tieren gewonnen worden sind, werden in 1% Osmiumtetroxid fixiert, reihenweise in Äthanol dehydratisiert und in Epoxyharz eingebettet. Mit einem Mikrotom (III′′) werden unter Verwen dung eines Diamantmessers Schnitte angefertigt. Die Schnitte werden auf Kupferschirmen aufgenommen, mit Uranylacetat ge färbt, mit Bleicitrat nachgefärbt und im Elektronenmikroskop untersucht. Das Virus ähnelt in Größe und Form stark den Enteroviren. Der Durchmesser beträgt 27 mµ. Das Virus ist in dem Cytoplasma enthalten und neigt dazu, sich in kleinen Bläs chen zu lokalisieren, die durch mehrschichtige Membranen ge bunden werden können. Die 27 mµ großen Virusteilchen des Prä parats werden nach verschiedenen Merkmalen als Hepatitis A- Virus identifiziert. Extrakte der Leber sind imstande, eine Infektion mit Hepatitis A auf andere Seidenäffchen zu übertra gen. In der Leber von normalen Seidenäffchen ist das Virus nicht enthalten. Gleiche, 27 mµ große Virusteilchen erhält man aus dem Blut des infizierten Seidenäffchens. Dieses Präpa rat von 27 mµ großen Virusteilchen wird spezifisch durch menschliches Hepatitis-A-Serum von genesenden Patienten, aber nicht durch Serum von Patienten, die noch nicht von der Krank heit befallen worden sind, neutralisiert.

Beispiel 3 Immunologische Elektronenmikroskopie

0,05 ml nach Beispiel 1 hergestelltes Antigen werden mit 0,02 ml einer 1 : 20 Verdünnung von menschlichem Hepatitis A- Serum eines von der Krankheit genesenden Patienten inkubiert. Das Gemisch wird eine Stunde bei 37°C inkubiert und dann 3 Stunden auf 4°C gehalten. Ein Tropfen des Materials wird auf einen mit Kohlenstoff überzogenen Kupferschirm (0,05 mm Maschenweite; 300 Maschen) aufgebracht und 30 Sekunden adsor bieren gelassen. Dann wird der Schirm 2 Minuten mit 2 prozen tiger wäßriger Phosphorwolframsäure mit einem pH-Wert von 6,0 (eingestellt mit 1 n Kalilauge) gefärbt und in einem "Philipps- 300"-Elektronenmikroskop bei 80 kV untersucht. Nach der Reak tion mit dem Hepatitis-A-Antikörper sind charakteristische Höfe von Antikörpermolekülen zu sehen, die die zahlreichen, 27 µ großen Hepatitis A-Virusteilchen umgeben und sie zu einem Immunkomplex binden.

Beispiel 4 Komplementfixierungsanalyse

Nach Beispiel 1 hergestelltes, aber nicht der Auftriebsdichte gradiententrennung mit CsCl unterworfenes Antigen wird 2 Stun den auf 56°C erhitzt. Von diesem Material werden Verdünnungs reihen hergestellt und durch Standard-Blocktitration nach der Mikrotitermethode der Komplementfixierungsanalyse mit Verdün nungsreihen von menschlichem Hepatitis-A-Antikörper unter sucht. Zwei Einheiten des so definierten Antigens werden ver wendet, um anschließend menschliches Serum auf Hepatitis-A- Antikörper zu analysieren. Der so nachgewiesene Hepatitis-A- Antikörper ist spezifisch für von Hepatitis A genesende Pa tienten. Die an Hepatitis B leidenden Patienten zeigen keine Reaktion auf Hepatitis-A-Antikörper. Diese Komplement fixierungsanalyse unter Verwendung von aus der Leber des in fizierten Seidenäffchens gewonnenem rohem Hepatitis-A-Antigen ist für die Diagnose der Infektion von Menschen mit Hepa titis A anwendbar.

Beispiel 5

Man arbeitet nach Beispiel 1, verwendet jedoch anstelle von S. mystax die folgenden Genera und Spezies: S. nigricollis, S. fuscicollis, S. oedipus, Callithrix jacchus, s. nigricollis, S. fuscicollis, S. oedipus, Callithrix jacchus, C. argentata, Cercopithecus aethiops, Pan troglodytes und Anthropopithecus troglodytes. In jedem Fall wird das erhaltene Antigen mit Erfolg für die in der obengenannten Patentanmeldung be schriebene Hepatitis-A-Analyse verwendet.

Beispiel 6

Der geklärte Extrakt und das Endprodukt des Beispiels 1, beide unter aseptischen Bedingungen hergestellt, werden 72 Stunden bei 37°C mit Formalin (Verdünnung 1 : 4000) behan delt. Überschüssiges restliches Formalin wird mit Natriumbi sulfit neutralisiert. Alle Behandlungen werden unter asepti schen Bedingungen durchgeführt. Das Produkt wird bei 4°C gelagert. Subkutane oder intramuskuläre Injektionen von 4 Dosen zu je 1 ml, die in Zeitabständen von 2 Wochen an Sei denäffchens S. mystax und Meerschweinchen vorgenommen werden, erzeugen in diesen Tieren zirkulierenden Hepatitis A-Antikör per. Die Seidenäffchen werden durch diese Behandlung immun gegen die Infektion von virulenten Dosen von Hepatitis A- Virus.

Claims

1. Hepatitis-A-Antigen enthaltendes Präparat auf der Basis einer auf einen pH-Wert von 6,0-7,8 ge pufferten physiologischen Kochsalzlösung, die das Hepatitis-A-Antigen in einer Konzentration ent hält, die mindestens ausreicht, um bei der sero logischen Immunkörperbindungsanalyse eine meßbare Reaktion mit Hepatitis-A-Antikörpern zu ergeben, erhältlich durch Impfen eines nicht-menschlichen Primaten mit Hepatitis-A-Virus, Entfernen der Leber des infizierten Primaten zu einem Zeitpunkt, zu dem ein erhöhter Serumspiegel an Glutamat- Oxaloacetat-Transaminaseenzym und an Isocitronen säure-Dehydrogenaseenzym besteht, Perfundieren der Leber mit Physiologischer Kochsalzlösung, Zerkleinern der Leber, Herstellen einer etwa 5 bis 25 gewichts prozentigen Lebersuspension durch Zusatz von Koch salzlösung, Klären der Suspension, Versetzen der Suspension mit CsCl-Dichtegradientenlösung und Isolieren des Materials mit einer Auftriebsdichte von etwa 1,32 bis 1,36 g/cm³.

2. Verfahren zur Herstellung des Hepatitis-A-Antigen enthaltenden Präparats nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß man einen nicht-menschlichen Primaten mit Hepatitis-A-Virus impft, sodann zu einem Zeitpunkt, zu dem ein erhöhter Serumspiegel an Glutamat-Oxaloacetat-Transaminaseenzym und an Iso citronensäure-Dehydrogenaseenzym besteht, die Leber des infizierten Primaten entfernt, die Leber mit physiologischer Kochsalzlösung perfundiert, die Le ber zerkleinert und durch Zusatz von Kochsalzlösung eine etwa 5 bis 25 gewichtsprozentige Lebersuspension herstellt, die Suspension klärt, die Suspension mit CsCl-Dichtegradientenlösung versetzt und das Material mit einer Auftriebsdichte von etwa 1,32 bis 1,36 g/cm³ auswählt.

3. Verfahren zum Inaktivieren eines nach Anspruch 2 er haltenen, Hepatitis-A-Antigen enthaltenden Präparats, welches Hepatitis-A-Antigen in einer zur Immunisierung gegen Hepatitis-A-Antigen ausreichenden Menge enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inaktivierung oder Schwächung mit Formalin durchführt.

4. Verwendung des nach Anspruch 3 inaktivierten Hepatitis A-Antigens zusammen mit den üblichen Konfektionsierungs mitteln zum Herstellen eines Impfstoffes gegen Hepa titis A.