DE2713371A1 - Impfstoff gegen die rhinotracheitis der katze und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Impfstoff gegen die rhinotracheitis der katze und verfahren zu seiner herstellung

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DE2713371A1 DE19772713371 DE2713371A DE2713371A1 DE 2713371 A1 DE2713371 A1 DE 2713371A1 DE 19772713371 DE19772713371 DE 19772713371 DE 2713371 A DE2713371 A DE 2713371A DE 2713371 A1 DE2713371 A1 DE 2713371A1
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Description

H Impfstoff gegen die Rhinotracheitis der Katze und Ver
fahren zu seiner Herstellung
Die Rhinotracheitis der Katze ist eine fieberhafte, hochkontagiöse Viruskrankheit, die plötzlich auftritt und durch Conjunctivitis, Tränen- und Nasenausfluß verbunden mit Schnupfen und Niesen und krankhaften Veränderungen des oberen Respirationstraktes charakterisiert ist. Die Krankheit wurde erstmals von Crandell und Maurer, Proc. Soc. Exptl. Biol. &Med., Bd. 97 (1958), S. 487 bis 490, beschrieben.
Das Virus gehört aufgrund seiner Struktur, seiner chemischphysikalischen und biologischen Eigenschaften in die Herpesgruppe. Es ist für etwa 40 % der Infektionen des oberen Respirationstraktes von Katzen verantwortlich.
Ein Impfstoff gegen Rhinotracheitis (nachstehend kurz mit
bezeichnet FVR, d.h. feline viral rhinotracheitis/!wurde von Bittle und
Rubic, Am. J. Vet. Res., Bd. 36 (1975), S. 89 bis 91 und
Scott, Feline Practice, Jan.-Feb. 1975, Seiten 17 bis 22 beschrieben.
L 709841/0752
Dieser Impfstoff wird durch 81malige Reihenpassage eines virulenten FVR-Virus in primärer feliner Nierenzellkultur und 17malige Passage in feliner diploider Zungenzellkultur erhalten. Ferner ist in der DT-OS 25 12 903 ein FVR-Impfstoff aus einem virulenten FVR-Virus durch Reihenpassage in Katzenzellkulturen beschrieben.
Die bekannten Impfstoffe werden intramuskulär bei der normalen Körpertemperatur der Katze (39 C) gegeben. Bei dieser Temperatur erfolgt keine Vermehrung des Virus und der Impfstoff verhält sich praktisch als inaktivierter Impfstoff bzw. Tot-Impfstoff. Während der Injektion des Impfstoffes muß der Respirationstrakt der Katze gegen Infektion durch das Virus geschützt werden. Die bekannten Impfstoffe haben ferner den Nachteil, daß zur Bewirkung einer Immunität mehrere Impfungen erforderlich sind, und daß trächtige Katzen nicht geimpft werden sollen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Impfstoff die
gegen/Rhinotracheitis der Katze (FVR) zu schaffen, der intranasal, beispielsweise durch Eintropfen oder Sprühen einer Impfstofflösung in die Nasenlöcher, intraocular durch Eintropfen der Impfstofflösung in die Augen und den nasalen Tränenkanal und damit in die Nase und den Rachenraum oder durch Injektion gegeben werden kann, und der einen sicheren und wirksamen Schutz gegen die Erkrankung bietet. Ferner soll der Impfstoff auch zur Impfung von trächtigen Katzen ohne Gefahr eines Aborts oder teratogener Wirkungen geeignet
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Γ
sein. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.
Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
5
Der Impfstoff der Erfindung wird durch Bestrahlung eines FVR-Virus mit UV-Licht hergestellt, das seinerseits einer Behandlung mit chemischen mutagenen Mitteln unterworfen worden ist. Vorzugsweise wird ein FVR-Virus mit UV-Licht be- strahlt, der einer mutagenen Behandlung mit 5-Fluoruracil,
/oder/
5-Fluordesoxyuridin und / Bromdesoxyuridin unterworfen worden ist, so daß sich das Virus zwar gut bei 30 +. 20C, jedoch nicht so gut bei 370C vermehrt.
Zur Behandlung mit den chemischen Mutagenen kann jedes virulente FVR-Virus eingesetzt werden. Das Virus kann mit Hilfe einer ' geeigneten Virtszellenkultur isoliert und in bekannten Medien vermehrt und aufbewahrt werden. Geeignete Wirtszellenkulturen sind alle Zellen der Gattung felldae, wie Nieren, Zunge, Trachea, Nasenmuschel, Tonsillen und Lunge. Bevorzugt sind feline Nierenzellen. Das Virus wird nach einer Vorbehandlung der Substratzellen mit 5-Fluoruracil, 5-Fluordesoxyuridin, Bromdesoxyuridin oder einem anderen bekannten DNA-Inhibitor alt chemischen Mutagenen (DNA-Inhibitoren) unterworfen. Vor zugsweise wird zur Mutation des Virus ein Gemisch von 5-Fluoruracil, 5-Fluordesoxyuridin und Bromdesoxyuridin verwendet. Sodann werden die Viruskulturen bei 30 £ 20C, vorzugsweise bei 310Cj einer KLonierung unterworfen, um das Virus zu
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reinigen. Diejenigen Viren, die sich bei dieser Temperatur gut vermehren, werden zur wiederholten Behandlung eingesetzt. Die Mutationsbehandlung wird 12 bis 36 Stunden, vorzugsweise 24 Stunden^wiederholt.
Das nach der Mutationsbehandlung erhaltene Virus, das bei der American Type Culture Collection unter der Nr. VR 814 hinterlegt wurde, wird sodann mit UV-Licht bestrahlt, bis etwa 90 bis 99 %, vorzugsweise 95 bis 99 # und insbesondere etwa 99 % der Viruspopulation abgetötet sind. Vor der
Impfung von Katzen wird der Rest des mit UV-Licht behandelten Virusmaterials bei 310C nochmals einer Klonierung unterworfen./
/Vorzugsweise werden die geklönten Viren 1 bis 12 mal, vorzugsweise 10 bis 12 mal einer Reihenpassage bei 30 +. 20C
Ϊ5 unterworfen. Jeder VirusfcLon kann auch mehrmals, vorzugsweise ein weiteres Mal mit UV-Licht bestrahlt und vor der letzten Passage und bzw. oder vor der Impfung geklont werden.
Obwohl die Vermehrung des Virus (sowohl des chemisch mutierten als auch des mit UV-behandelten Virus) bei 310C optimal ist, kann das Virus auch bei Temperaturen bis zu etwa 37°C vermehrt werden. Die Vermehrung des Virus ist unter natürlichen Bedingungen bei 39°C gehemmt. Vorzugsweise wird die Ver-
25 mehrting des Virus bei 30 £ 2°C durchgeführt.
Zur Herstellung des modifizierten Virus wird ein aus einer 3 Monate alten Katze isoliertes FVR-Virus verwendet. Das Virus
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wurde
/ während einer Routineuntersuchung von Infektionen des Oberen Respirationstrakts isoliert und wurde dem Rachenraum einer Katze entnommen, die keine klinischen Symptome von Erkrankungen des oberen Rachenraums zeigte. Zur Feststellung, ot> das Virus gegenüber empfindlichen Tieren infektiös ist, wurde es einer Passage in felinen Nierenzellen (NLFK-I) unterworfen und sodann intranasal zwei spezifisch pathogenfreien Katzen verimpft. 3 bis 8 Tage nach der Impfung wurde Anorexie, Pyrexie, Schwierigkeiten bei der Atmung und Trägheit beobachtet. Diese Symptome sind ein Indiz dafür, daß das Virus gegenüber empfänglichen Katzen infektiös ist und keine natürlich vorkommende avirulente Variante darstellt.
Als Wirtszellen zur Isolierung und für sämtliche weiteren Untersuchungen wird eine stabile, serienmäßig subkultivierbare feline Nierenzellinie verwendet, die als NLFK-1 bezeichnet wird. Zur Zellvermehrung und als Erhaltungsmedium für das Virenwachstum wird isotonische, gepufferte Salzlösung nach Hanks mit Lactalbumin (HAL-Medium) verwendet. Das Medium wird mit 10 % foetalem Kälberserum für das Zellwachstum und mit 2 % für die Erhaltung ergänzt.
Die Behandlung des FVR mit chemischen Mutagenen wird nach den von Pringle u. Mitarb.; Virology, Bd. 55 (1973), S. 495 bis 505 beschriebenen Methoden durchgeführt. Eine Einschicht von NLFK-1 Zellen wird 18 Stunden vor der Virusinfektion mit ^Fluoruracil (10^ug/ml) in serumfreiem HAL-Medium behandelt.
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Nach der 18stündigen Behandlung wird die Einschichtkultur mit serumfreiem HAL-Medium gewaschen. Sodann werden 10 Viruspartikel eine Stunde bei 37° C adsorbieren gelassen. Hierauf werden die Zellen mit HAL-serumfreiem Medium mit 10 y/ml 5-
\ und 5y/ml BroKidesoxyuridin/ Fluoruracil, 10 y/ml 5-FluordesoxyuridinYversetzt und 24 Stunden bei 37° C inkubiert. Die Einschichtkultur wird dann durch rasches abwechselndes Einfrieren und Auftauen aufgebrochen und das gesamte Verfahren wiederholt. Nach jeder Behandlung mit den DNA-Inhibitoren werden die Virus suspensionen bei 310C einer Klonierung in Kulturschalen mit 24 Löchern unterworfen. Nur diejenigen Klone, die sich bei 310C gut vermehren, werden zur wiederholten Behandlung eingesetzt. Das Virusmaterial wird nur dann geerntet, wenn nach 7tägiger Inkubation ein Klon feststeller ist. Sämtliche isolierten Klone werden bei 31°C in NLFK-1-Zellen in Milchverdünnungsflaschen gezüchtet.
Titrationen zur Feststellung irgendwelcher temperaturempfindlicher Eigenschaften (TS-Eigenschaften) werden bei 310C und 370C durchgeführt. Nach der ersten mutagenen Behandlung werden keine TS-Eigenschaften festgestellt, und die mutagene Behandlung wird an einem Klon wiederholt. Ein Klon, der sehr geringe TS-Unterschiede zeigt, wird von jedem dor vier nachfolgenden Klonierverfahren ausgewählt und einer weiteren Behandlung unterworfen. Von der ersten Behandlung werden 30 Klone, von der zweiten Behandlung 25 Klone, von der dritten Behandlung 50 Klone und von der vierten Behandlung 15 Klone erhalten.
Das geklonte Virusmaterial der vierten mutagenen Behandlung wird an empfänglichen, spezifisch pathogenfreien Katzen
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untersucht. Jede Katze erhält etwa 0,25 ml (1O5'0 bis 1O8'0
Virussuspension in jedes Nasenloch sowie einen Tropfen der Virussuspension in Jedes Auge. 3 Tage nach der Impfung sind Rachenabstriche positiv für FVR. Dieses Virusmaterial wurde bei der American Type Culture Collection unter der Nr. VR 814 hinterlegt.
Das aus dem 15. Klon der vierten Behandlung mit dem DNA-Inhibitor erhaltene Virusmaterial wird sodann mit einer UV-Lampe (Sterilamp) bestrahlt. Zu diesem Zweck wird das Virusmaterial mit einer Flüssigkeitshöhe von 5 mm in einer Schale in einem Abstand von 15 cm von der Lichtquelle bestrahlt. Während der Bestrahlung wird die Virussuspension mittels eines Magnetstabes mit etwa 50 U/min gerührt. Proben werden in Zeitabständen von 3 Minuten entnommen. Das UV-Licht ist besonders letal gegenüber dem FVR-Virus und innerhalb 8 Minuten vermindert sich der Virusgehalt um etwa 99 %- Nach Abtötung von 99 % der Viruspopulation werden Klone des mit UV-Licht behandelten Virusmaterials, die sich bei 310C vermehren, hergestellt. Obwohl sich alle diese Klone für die weitere Verwendung eignen, wird ein Klon mit einem Virustiter von 107*50 TCID50 bei 31°C und 1O6'^3 TCID50 bei 370C erneut mit UV-Licht bestrahlt, und es werden bei 310C Klone entnommen. Ein Klon mit einem Virustiter von 10 ' TCID50
bei 310C und 106'68 TCID50 bei 37°C (es können auch andere Klone verwendet werden) wird für die weitere Untersuchung ausgewählt und vor dem Verimpfen bei 310C Reihenpassagen unterworfen.
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Das auf die vorstehend beschriebene Weise isolierte Virusmaterial kann unmittelbar zum Impfen von Katzen verwendet werden. Vorzugsweise wird es gefriergetrocknet, zweckmäßig in Kombination mit einem üblichen Stabilisator. Das gefriergetrocknete Produkt wird vor dem Verimpfen mit sterilem Wasser oder einem anderen geeigneten Verdünnungsmittel versetzt.
Das auf die vorstehend beschriebene Weise modifizierte FVR-Virusmaterial (FVR_) wird bei allen Versuchen bei 310C vermehrt. Für Stationärkulturen werden Roux-Flaschen und Povitsky-Flaschen und zur Massenvermehrung 10 Liter fassende Roller-Flaschen verwendet. Eine Einschicht-NLFK-1-Zellkultur läßt man in allen Kulturgefäßen vor dem Beimpfen mit dem FVRjjj-Virusmateriel auswachsen. Obwohl zum Zellwachstum ein
Zusatz von 10 % foetales Kälberserum (geprüft auf Freiheit von BVD-Virus) verwendet wurde, wächst die NLFK-1 Zellinie auch sehr gut bei vermindertem Serumgehalt und in Medien mit bis zu etwa 10 ?6 anderen homologen oder heterologen Seren. Das FVR_-Virusmaterial vermehrt sich gut in den NLFK-1-Zellen in Gegenwart von 2 % foetalem Kälberserum. Das Virusmaterial wird geerntet, sobald die cytopathlschen Veränderungen ein maximales Viruswachstum anzeigen. Das bei dieser Ernte erhaltene Virusmaterial wurde bei der American Type Culture Collection unter der Nr. VR 815 hinterlegt. Dieses Virusmaterial wird auf die nachstehend beschriebene Weise als Impfstoff bei Katzen eingesetzt.
Zur Bestätigung der Identität des Virusmaterials werden Unter-
■ Buchungen über die Vermehrung in felinen zellenfcultüren mit _j
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Γ "I
typischen cytopathischen Veränderungen, "begleitet von Einschlußkörpern des Typs A, fehlendem Wachstum in Zellen anderer Tier-Arten (Wirtsspezifität), Färbung mit fluoreszierenden Antikörpern, Inaktivierung mit organischen Lösungsmitteln, Wachstumshemmung durch Inhibitoren der DNA-Synthese und Neutralisation mit spezifischem Antiserum durchgeführt.
Die Wirtsspezifität des FVR-Virus wurde von Andrews u.Mitarb., Viruses of Vertebrates, 1972, S. 3^8 bis 3^9 nachgewiesen.
Das FVR^-Virus hat ebenfalls eine Wirtszellenspezifität für Katzen und primäre Zelltypen im Vergleich mit verschiedenen Zelltypen von Kaninchen, Hunden, Rindern, Pferden, Mäusen, Affen und Menschen. Die beim FVR-Virus aufgetretene Mutation, die zur Bildung des FVRjn-VIrUS führt, hat nicht die Wirtsspe-
zifität geändert, sondern die Virulenz des Virus bezüglich des natürlichen Infektionswegs. Ein vollvirulentes FVR-Virus ruft keine Art von Erkrankung in empfänglichen Katzen hervor, wenn es intramuskulär oder intravenös verabreicht wird. Der Respirationstrakt muß jedoch während der Injektion ausreichend geschützt werden. Eine intravenöse Impfung von 10''"^ TCIDc0 eines virulenten FVR-Virus ruft zwar keine Erkrankung hervor, doch stimuliert sie bei einer Injektion einen hohen Titer von humoralen Antikörpern. Eine intramuskuläre Injektion des gleichen Virus erzeugt nur eine schwache humo-
25 rale Reaktion bei einmaliger Gabe.
Zur Identifizierung des FVR_-Virus wurde ein fluoreszierender Antikörper verwendet, der vom National Animal Disease
L_ Laboratory bezogen wurde. Eine spezifische Färbung wurde _j
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bei mit FVR -Virus infizierten Zellen, jedoch nicht bei mit Calicivirus infizierten Zellen beobachtet.
Eine 20prozentige Konzentration von Diäthyläther verursacht innerhalb 18 Stunden eine vollständige Inaktivierung des FVRjn-VIrUS. Zum Vergleich wird ein virulentes FVR-Virus verwendet. Eine 50prozentige Chloroformkonzentration inaktiviert innerhalb 30 Minuten das FVR^-Virus vollständig. Diese Versuche zeigen, daß das FVR1n-Virus ein essentielles, mit organisehen Lösungsmitteln extrahierbares Lipid enthält, das identisch ist mit dem des nicht-modifizierten FVR-Virus.
Desoxycholsäure, die bekanntlich die DNA-Synthese hemmt, hemmt spezifisch in gleichem Ausmaß das FVR- und FVR-Virus. 15
In Kaninchen hergestelltes Antiserum gegen einen sicher identifizierten Stamm von FVR-Virus hemmt spezifisch das FVRjn- Virus. Dieses Anti serum verursacht keine Hemmung eines Calicivirus-Stammes, der sicher virulent für Katzen ist. 20
Stabilitätsuntersuchungen unter forcierten Bedingungen wurden an gefriergetrockneten FVRjn-Viren durchgeführt. Zu diesem Zweck werden die FVR^-Viren mit einer Stabilisatorlösung versetzt und 1, 2 und 3 Wochen bei 370C inkubiert. Die Stabilisatorlösung hat folgende Zusammensetzung:
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1 Lösung A
Durch Pankreasenzym verdaubares Casein
(Typ M) 40 g
Gelatine (Knox 250 A) 40 g
destilliertes Wasser auf 1000 ml
Lösung B
Sucrose 150 g
destilliertes Wasser auf 1000 ml.
Die Lösungen A und B werden Im Volumenverhältnis 1:1 miteinander vermischt und/einer Suspension des Vlrusmaterlals bis zu einer Volumenkonzentration von 33 1/3 % gegeben.
Die Ergebnisse der Stabilitätsuntersuchungen sind in Tabelle I zusammengefaßt.
Tabelle I Virustiter, TCID50/ml Versuch Sj^g 1 Woche 2 Wochen 3 Wochen
106' 32 106' 24 105' 69 105f 76
106' 32 105» 69 105' 30 105' 40
Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß das FVRn-VIrUs in Gegenwart einer Stabilisatorlösung mindestens 3 Wochen unter den forcierten Bedingungen des Stabilitätetests aktiv bleibt. Dies entspricht etwa 2 Jahren bei KUhlschranktemperatur. Es können auch andere Volumenverhältnisse von FVR^-Virussuspension und Stabilisatorlösung verwendet werden, sofern der Virustiter im Bereich von etwa 105f0 bis 108>0 TCID50 bleibt.
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.16-
Mit dem FVRjn-Virus enthaltenden Impfstoff der Erfindung
werden spezifisch pathogenfreie und normal gezüchtete Katzen geimpft. Sodann werden die Katzen mit virulentem Virus belastet. Sämtlichen Katzen wird in Jedes Nasenloch etwa
0,25 ml Virussuspension (1O5'0 bis 1O8'0 TCID^/Dosis) eingetropft. Dabei wird der Kopf der Tiere so gehalten, daß die Nase nach oben zeigt. Es kann auch ein Tropfen des Impfstoffes in jedes Auge eingeträufelt und der
Rest in die Nasenlöcher getropft werden. 10
Die Antikörpertiter werden durch Mikrotiter-Methoden bestimmt. Serumverdünnungen werden in zweifacher Abstufung durchgeführt, mit 50 TCID(J0 virulentem Virus vermischt, 1 Stunde inkubiert und mit einer ausreichenden Menge NLFK-1 Zellen vermischt. Sodann werden 8 Vertiefungen in einer 96 Vertiefungen enthaltenden Mikrotiterplatte zu beschickt. Die Zell-Antikörper-Virus-Titrationen werden 6 Tage bei 370C inkubiert und täglich unter einem umgekehrten Mikroskop beobachtet. Ferner werden andere virologische Methoden zur Inkubation und Bestimmung der Antikörpertiter angewendet.
3 Wochen nach der Impfung werden die Tiere einem Aerosol des virulenten Virus ausgesetzt. Das Aerosol wird mittels eines DeVilbiss-Atomisiergerä-b mit Preßluft hergestellt. Das
Aerosol wird gegen das Gesicht des Tieres gerichtet. Es ent-
7 3
hält 10" TCIDc0 virulentes Virus. Zur Kontrolle werden nicht geimpfte Tiere in gleicher Weise behandelt. Zur Erkennung klinischer Symptome werden die Tiere
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Γ I
täglich untersucht. 3 Tage nach der Belastung werden aus dem Rachenraum zur Isolierung von Viren Abstriche entnommen.
Das aus der zweiten Behandlung mit UV-Licht erhaltene FVRn-Virusmaterial wird vor der Reihenpassage zwei spezifisch pathogenfreien Katzen intranasal verimpft. Obwohl diese Tiere während 1 bis A Tagen die Symptome einer Pyrexie zeigten, konnten keine anderen Symptome von FVR beobachtet werden.
Das Virusmaterial der Reihenpassage 10 wird vier 3 Wochen alten Katzen intranasal verimpft, über einen Zeitraum von 9 Wochen konnten bei keinem der Tiere klinische Symptome beobachtet werden. Obwohl die vier jungen Katzen erhebliche Antikörpertiter aufweisen, die vermutlich vom Muttertier herrührten, wurden diese Titer nach intranasaler Verimpfung um einen Faktor von 2 bis A erhöht.
Spezifisch pathogenfreie Katzen wurden auf ihre Reaktion nach intranasaler Verimpfung des Virusmaterials der Passage 10 untersucht. Diese Tiere waren 12 Wochen alt und hatten einen Serum-Antikörpertiter von 0:2.. In jedes Nasenloch wurden 0,25 ml FVRn-Virussuspension sowie in jedes Auge ein Tropfen eingeträufelt. Die Serum-Antikörperreaktionen reichten von 1:5 bis 1:25 nach der Impfung. Nach der Impfung oder der Nachbelastung konnten keine klinischen Symptome beobachtet werden. Die spezifisch pathogenfreien Tiere sind sehr empfänglich gegen FVR-Infektion und sie werden nach intranasaler Impfung mit FVRn-Virus ausreichend geschützt. Die Er-
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gebnlsse dieser Untersuchungen sind in Tabelle II zusammengefaßt.
Tabelle II nach der Fieber klinische Symptome nach.der
Serum-Antikörperreaktion Impfung Nasenausfluß nach der Belastung
Kat vor der 1:8 Niesen Impfung Negativ\
ze Impfung 1*8 Conjunctivitis Negativ Negativ
1 <1: 2 • 1:12 Negativ Negativ
2 <1*2 1:5 Negativ' Negativ
3 <l:2 Negativ F, ND, S
4 <l:2 F, ND, S
5 <1:2 F, ND, S
6 <1 :2 F,' ND, C, S
7 <1ί2
8 <1.:2
im.: F =
ND =
S «
C =
Zum Nachweis der Booster-Wirkung einer zweiten intranasalen Impfung wird fünf empfänglichen Tieren eine Dosis iuid einen Monat später eine weitere Dosis gegeben. Nach der zweiten intranasalen Impfung wird ein deutlicher Booster-Effekt beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.
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Tabelle III Serum-Antikörperreaktion nach zwei intranasalen
1- Impfungen
1:56 Negativ
1:32 Negativ
1:28 Negativ
1:48 Negativ
Katze vor der nach der nach der u-n «<·,.*«. q,™.«+«™« Impfung Impfung 1 Impfung 2 Μ·*»*««*· Symptome
1 1:3 1:12
3 <1.:2 1 :'5
4 <1:2 1:5
Vierzehn etwa 12 Wochen alte pathogenfreie Katzen werden intranasal mit dem Impfstoff der FVR^-Passage 11 geimpft. Sämtliche Tiere hatten eine Serum-Antikörper-Reaktion von <1:2. FVRn wird auf 1O5'0 TCID50/Tier eingestellt. Bei allen Tieren beträgt die Serum-Antikörper-Reaktion nach der Impfung 1:8 bis 1:24. Keines der Tiere zeigte klinische Symptome der Krankheit.
Drei 6 Wochen alte Katzen und das Muttertier werden ebenfalls intranasal mit dem Impfstoff der FVR^-Passage 11 geimpft.
Die Kätzchen und das Muttertier waren empfindlich gegen FVR (Serum-Antikörper-Reaktion <Ί:2). 3 Wochen nach der Impfung hatten sämtliche Tiere einen Serum-Antikörpertiter von 1:20 oder größer. Obwohl das Muttertier nicht als seronegatives Tier ausgewählt wurde, zeigt das Ergebnis, daß FVR^-Virus 6 Wochen alte empfindliche Kätzchen vollständig immunisiert, ohne daß ungünstige Nebenwirkungen beobachtet werden.
709841/0752
FUnf Rückpassagen des Virusmaterials von FVR^-Passage 11 in vollständig empfänglichen pathogenfreien Tieren zeigten in keinem Fall eine Reversion der Virulenz. Den Tieren werden etwa 10 '5 TCID^/Tier jeder Rückpassage verimpft. Klinische Symptome sowie Pyrexie konnten nicht beobachtet werden. Das Virusmaterial wird intranasal und in die Augen von jeweils 2 Tieren bei jeder Passage gegeben.
Die Erfindung betrifft ferner eine Impfstoffkombination aus dem FVR^-Virusmaterial enthaltenden Impfstoff der Erfindung sowie einem natürlich vorkommenden modifizierten Calicivirus, das Immunität erzeugt.
Das eingesetzte Calicivirus wurde aus dem Nasen-Rachenraum einer 6 Monate alten Katze isoliert und kultiviert und ruft keine Krankheitserscheinungen in empfänglichen Tieren hervor. Die Untersuchungen zur Bestätigung der Identität des Virus betrafen die rasche Vermehrung in felinen Zellkulturen mit für Calicivirus typischen cytopathisehen Veränderungen und der Abwesenheit von Einschlußkörpern in gefärbten Präparaten, keiner Inaktivierung durch organische Lösungsmittel und Neutralisation durch spezifisches Antiserum.
Der FVR^-Virus enthaltende Impfstoff und der Calicivirus enthaltende Impfstoff werden mit dem Stabilisator in folgenden Mengen vereinigt:
09841/O7S2
k ,0 g
4 »0 g
100 ml
15 ,0 Z
100 ml
0,25 ml FVH1n-Virussuspension
0,25 ml Calicivirus-Suspension 0,50 ml Stabilisatorlösung.
Je 0,25 ml der Virensuspensionen enthalten jeweils
6 *> 10 1^ TCIDcq oder mehr. Die Stabilisatorlösung hat folgende
Zusammens etzung:
Lösung A
Durch Pancreasenzym verdaubares Casein (Typ A)
Gelatine (Knox 250 A) destilliertes Wasser auf
Lösung B Sucrose destilliertes Wasser auf
Zur Herstellung der Stabilisatorlösung werden die Lösungen A und B in gleichem Volumenverhältnis miteinander vermischt. Der pH-Wert wird auf 7,0 eingestellt.
Stabilitätsuntersuchungen unter forcierten Bedingungen wurden an gefriergetrockneten Proben des Kombinationsimpfstoffes durchgeführt. Die Proben werden 1 Woche bzw. 2 Wochen bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation werden die Proben mit Wasser versetzt und in NLFK-1-Zellen titriert. Es kön nen auch andere Mengenverhältnisse von FVRn-Virus, Calicivirus und Stabilisator verwendet werden, sofern der Virustiter im Bereich von etwa 1O5'0 bis 1O8'0 TCID50 bleibt.
709841/0752
Der lyophilisierte Impfstoff wird mit sterilem Verdünnungsmittel auf 0,5 ml versetzt und sämtliche Katzen werden mit etwa 0,25 ml Virussuspension in Jedes Nasenloch geimpft. Ein Tropfen der Virussuspension wird häufig in jedes Auge eingeträufelt, um die Sicherheit des Impfstoffes zu unter suchen und Reizungen der Schleimhäute zu erkennen. Beim Verimpfen wird der Kopf der Tiere mit der Nase nach oben gehalten.
Katzen werden mit 0,5 ml der 1 : 1-Kombination von FVR1n- und
Calicivirus-Suspension geimpft. Die FVR1n-Virussuspension hat
einen Titer von 10''"^ TCID50 und die Calicivirus-Suspension
8 6
einen Titer von 10 ' TCID1-Q. Sämtlichen Tieren wurden vor der Impfung Blutproben entnommen und das Serum von jeder Tiergruppe gepoolt. Jede Tiergruppe besteht aus mindestens fünf Tieren. Die Ergebnisse der Serum-Neutralisationsversuche sind in Tabelle IV zusammengefaßt.
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Ul
Tabelle
Gruppe
A B C D E F G H I J
Serum-Neutralisation vor
der Imüfune (Durchschnitt) 		FVR-Virus Serum-Neutralisation
4 Wochen nach der Inmfun* 		FVR-Virus
Zahl der
Katzen pro 		Calicivirus Calicivirus
Gruppe 1:'32 1·128
5 1^96 1*16 >U256 Ij48
5 1:56 1*40 7 1^256 . 1*192
5 Ü64 1*8 ^Ii256 1^48
7 UlB Ii24 > 1:256 If64
6 1/56 US >U256 1 1?56
5 1<96 1>28 > 1*256 1:96
5 1:32 1*32 1:256 1:56
5 1448 U24 71:256; 1*64
5 l/*40 1:14 1:256 1*48
5 1*24 >1*256
ro co
Die Impfstoffkombination beeinflußt die Serum-Neutralisations titer sehr stark ohne irgendwelche Anzeichen einer Interferenz bei intranasaler Verabfolgung. Sämtliche Tiere werden sorgfältig auf Anzeichen einer Infektion des oberen
5 Respirationstrakts nach der Impfung beobachtet. Es
konnten keine Symptome festgestellt werden. Eine identische
Kontrollgruppe von Katzen, die in einem dem Stallgang gegenüber
liegenden Käfigen lebten, zeigte keine Infektion des oberen
Respirationstrakts während dieses Zeitraumes. 10
31 in einer Kolonie gezogene Katzen in einem Alter von 2 Wochen bis 5 Monaten werden mit dem Kombinationsimpfstoff geimpft. Der Impfstoff enthält 1O6'0 TCID50 Jedes Virus/ Dosis. Mit Ausnahme eines Falles konnte in sämtlichen anderen Fällen ein signifikanter Anstieg des Serum«Neutralisations titers beobachtet werden.
Die abortigene Wirkung der Impfstoffkombination der Erfindung wird an vier spezifisch pathogenfreien trächtigen Katzen untersucht. Die Katzen waren etwa 30 Tage trächtig. Es wurde ihnen eine volle Dosis des Impfstoffes (10 ' TCIDc0 Jedes Virus) intranasal verimpft. Vor der Impfung enthielten die Katzen keine Antikörper gegen die Viren. Sämtliche Katzen entwickelten signifikante Antikörpertiter vor dem Werfen.
Jedes Muttertier gebar normale Kätzchen, die während der Untersuchungen auch normal blieben. Es 1st ersichtlich, daß die Impfstoffkombination der Erfindung somit auch an trächtige Katzen sicher verabfolgt werden kann.
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Die Impfstoffkombination der Erfindung wurde vier 2 Wochen alten Kätzchen, die von spezifisch pathogenfrelen ungelmpften Katzen geworfen worden waren, verimpft. Die Kätzchen hatten gegen keines der Viren Antikörper entwickelt, 3 Wochen nach der Impfung hatte sich jedoch gegen beide Viren einen ausreichend schützender Antlkörpertlter gebildet. Somit kann die Impfstoffkombination der Erfindung auch sehr jungen Kätzchen sicher verimpft werden.
7098A1/O752

Claims (15)

  1. n Impfstoff gegen die Rhinotracheitis der Katze und Verfahren zu seiner Herstellung "
    Priorität: 30. 3- 1976, V.St.A., Nr. 671 79?-
    15
    Patentansprüche
    20
    25
    1} Impfstoff gegen die Rhinotracheitis der Katze, gekennzeichnet durch einen Gehalt an sich bei 30 +. 2°C, jedoch nicht bei 39°C, gut vermehrenden modifizierten Rhinotracheitis-Viren, hergestellt durch Bestrahlung der mit chemischen Mutagenen vorbehandelten felinen Rhinotracheitis Viren mit UV-Licht, bis etwa 90 bis 99 % der Viruspopulation abgetötet sind, und Isolieren der noch vermehrungsfähigen Viren.
  2. 2. Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die felinen Rhinotracheitis Viren mit UV-Licht bestrahlt worden sind, bis 95 bi3 99 % der Viruspopulation abgetötet sind. 709841/0752 _,
    ORIGINAL INSPECTED
    271337
  3. 3. Impfstoff nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die felinen Rhinotracheitis Viren mit UV-Licht bestrahlt worden sind, bis etwa 99 % der Viruspopulation abgetötet sind und das noch vermehrungsfähige Virusmaterial anschließend mindestens einer Passage bei 30 +, 20C in Zellen der Gattung felidae unterworfen worden ist.
  4. 4. Impfstoff nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß
    worden sind die felinen Rhinotracheitis Viren mit UV-Licht bestrahlt/und das noch vermehrungsfähige Virus bei 30 +, 20C Passagen in felinen Nierenzellen in einem Medium unterworfen worden ist, das 2 bis 10 % homologes oder heterologes Serum enthält.
  5. 5. Impfstoff nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das mit UV-Licht bestrahlte, noch vermehrungsfähige Virus 10 bis 12 Passagen bei 310C in felinen Nierenzellen einer Zelllinie in einem Medium unterworfen worden ist, das 2 bis 10 S* foetales Kälberserum enthält.
  6. 6. Impfstoff nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das modifizierte Virus das feline Rhinotracheitis Virus ATCC Nr. VR 814 ist.
  7. 7- Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Virus-Titer 1O5'0 bis 1O8'0 TCID50 pro Dosis beträgt.
  8. 8. Impfstoff nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen zusätzlichen Gehalt an einem felinen Calicivirus-Impfstamm.
    L 709841/0752 -1
    -3~ 271337!
  9. 9. Impfstoff nach Anspruch 8, gekennzeichnet durch einen Gehalt an dem modifizierten felinen Rhinotracheitis Virus und dem felinen Calicivirus im Mengenverhältnis 1:1.
  10. 10. Verfahren zur Herstellung des Impfstoffs nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man feline Rhinotracheitis Viren, die mit chemischen Mutagenen derart vorbehandelt worden sind, daß die Viren sich bei 30 +. 20C, Jedoch nicht bei 39°Cy gut vermehren, mit UV-Licht bestrahlt, bis etwa 90 bis 99 % der Viruspopulation abgetötet sind, und die noch vermehrungsfähigen Viren isoliert.
  11. ■11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die felinen Rhinotracheitis Viren mit UV-Licht bestrahlt, bis 95 bis 99 % der Viruspopulation abgetötet sind.
  12. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die felinen Rhinotracheitis Viren mit UV-Licht bestrahlt, bis etwa 99 % der Viruspopulation abgetötet sind, und das noch vermehrungsfähige Virusmaterial anschließend mindestens einer Passage bei 30 +. 20C in Zellen der Gattung felidae unterwirft.
  13. 13· Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man das mit UV-Licht bestrahlte, noch vermehrungsfähige Virusmaterial bei 30 £ 20C Passagen in felinen Nierenzellen in einem Medium unterwirft, das 2 bis 10 JS homologes oder heterologes Serum enthält.
    709841/0752
  14. 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man das mit UV-Licht bestrahlte, noch vermehrungsfähige Virusmaterial 10 bis 12 Passagen bei 310C in felinen Nierenzellen einer Zellinie in einem Medium unterwirft, das 2 bis 10 % foetales Kälberserum enthält.
  15. 15. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man den Impfstoff zusätzlich mit einem felinen
    Calicivirus-Impfstamm versetzt. 10
    709841/0752
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