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Diese
Erfindung betrifft die Entdeckung eines Präparates des equinen Herpesvirus,
wobei das Präparat
gegen Fehlgeburten und Atemwegserkrankungen schützt, die durch das equine Herpesvirus
des Typ 1 hervorgerufen werden, und gegen Atemwegserkrankungen,
die durch das equine Herpesvirus des Typ 4 hervorgerufen werden.
Noch spezifischer betrifft diese Erfindung eine wirksame Vakzine
und Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Equine
Fehlgeburten und equine Rhinopneumonitis sind häufig anzutreffende Erkrankungen,
die den equinen Herpesvirus-Typen 1 (EHV-1) und 2 zugeordnet werden.
Das equine Herpesvirus Typ 2 wird nun EHV-4 benannt, da herausgefunden
wurde, dass sich die molekulare Struktur signifikant von EHV-1 unterscheidet.
EHV-1 ist hauptsächlich
der Auslöser
für Atemwegserkrankungen.
Die durch Atemwegserkrankungen hervorgerufenen wirtschaftlichen
Verluste, die von beiden EHV-Subtypen
bei jungen Pferden verursacht werden, sind das Ergebnis der Unfähigkeit
oder der verringerten Fähigkeit,
bei Wettbewerben gute Resultate zu erzielen. Die wirtschaftlichen
Verluste, die durch eine Infektion von trächtigen Stuten entstehen, gehen
auf Fehlgeburten zurück.
Ebenso wurde ein Syndrom des Zentralnervensystems mit EHV-1 assoziiert,
wobei diese Erkrankung von aufsteigender Lähmung bis zu vollständiger Lähmung führt und,
in einigen Fällen,
zum Tod.
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Aufgrund
der fehlenden Homologie zwischen EHV-1 und EHV-4 wurde vorgeschlagen,
es könne
nur eine Vakzine gegen das equine Herpesvirus vor Fehlgeburten und
den verschiedenen Formen der Atemwegserkrankungen schützen, die
sowohl die Subtypen EHV-1 als auch EHV-4 enthielt. Tatsächlich wird
im US-Patent Nr. 4.083.958 eine Vakzine gegen ein equines Herpesvirus
beschrieben, die nur vor durch EHV-1 ausgelösten Fehlgeburten und Atemwegserkrankungen
schützt.
Sie beansprucht für
sich nicht die Fähigkeit, gegen
durch EHV-4 ausgelöste
Atemwegserkrankungen zu schützen.
Im US-Patent Nr. 5.084.271 wird festgestellt, dass ein Aussetzen
von Fohlen gegenüber
EHV-1, egal ob lebend oder inaktiviert, nur gegen EHV-1 eine Antikörper-Reaktion
herbeiführt.
Ein Aussetzen von Fohlen gegenüber
EHV-1, egal ob lebend oder inaktiviert, führt zu einer Antikörper-Reaktion
nur gegen EHV-1 alleine. Ein Aussetzen von Fohlen gegenüber EHV-4
führt zu
einer serologischen Reaktion gegenüber sowohl EHV-1 als auch EHV-4.
Es wurde jedoch kein tatsächlicher
Schutz gegen Exposition gezeigt.
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Letzteres
Patent beansprucht, dass eine wirksame Vakzine EHV-4 alleine oder
eine Kombination aus EHV-1 und EHV-4 enthalten muss. Von einer einwertigen
EHV-1-Vakzine würde daher
nicht erwartet werden, dass sie gegen mit EHV-1 und EHV-4 assoziierte
Atemwegssyndrome sowie gegen durch EHV-1 ausgelöste Fehlgeburten schützt.
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N.
Edington et al., One way protection between equid herpesvirus 1
and 4 in vivo, RESEARCH IN VETERINARY SCIENCE, Band 48, Nr. 2, 235-239
(März 1990),
offenbaren einen abgeschwächten EHV-1-Stamm,
der einen einseitigen Schutz gegen eine spätere EHV-4-Exposition bereitstellt.
Dieses Virus induzierte jedoch keine zytotoxische T-Lymphozyten-Aktivität gegen
EHV-1. Die Vakzine der vorliegenden Erfindung stellt Schutz sowohl
vor EHV-1 als auch vor EHV-4 bereit.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung umfasst einen Stamm des Subtypus 1 des equinen
Herpesvirus (EHV-1), der hierin als AB69 bezeichnet wird, oder ein Äquivalent
desselben, der/das bei der Herstellung von Antigenen zur Induktion
einer schützenden
Immunreaktion gegen EHV-1 und EHV-4 von Nutzen ist. Die Erfindung
umfasst ebenfalls ein Präparat,
wie z.B. eine einwertige Vakzine, die den AB69 enthält, das
verwendet werden kann, um entweder junge Fohlen, ausgewachsene Pferde
oder trächtige
Stuten zu impfen, um einen Schutz gegen Atemwegserkrankungen bereitzustellen,
die entweder durch EHV-1 oder EHV-4 hervorgerufen werden, und ebenso,
um einen Schutz gegen durch EHV-1 ausgelöste Fehlgeburten bereitzustellen.
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Weiters
umfasst die Erfindung das Verfahren zur Herstellung des Präparats und
zur Verwendung desselben zum Schutz von Pferden. Es wird davon ausgegangen,
dass Vakzinenpräparate
dieser Erfindung ebenso Schutz vor dem Auftreten von Erkrankungen
des Zentralnervensystems bieten können, die durch EHV-1 hervorgerufen
werden.
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In
der vorliegenden Ausführungsform
umfasst die Erfindung das Verfahren zur Herstellung einer solchen
einwertigen EHV-1-Vakzine durch Vermehren des Stamms AB69 oder eines Äquivalents
desselben in einer kontinuierlichen Zellkultur, Ernten und Reinigen
der verbleibenden Zellbruchstücke
vom Virus-Überstand, Konzentrieren,
chemisches Inaktivieren und Versetzen mit Adjuvans, wie hierin unten
stehend ausführlicher beschrieben.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Wie
oben stehend dargelegt, betrifft die vorliegende Erfindung ein EHV-1-Virus,
das, wenn es zu einem Präparat,
wie etwa einer Vakzine, verarbeitet wird und Pferden parenteral
verabreicht wird, den Schutz aller Pferde vor den mit EHV-1 und
EHV-4 assoziierten Erkrankungen bietet. Genauer gesagt bietet die
offenbarte EHV-1-Vakzine
trächtigen
Stuten Schutz vor Fehlgeburten, die durch EHV-1 hervorgerufen werden,
sie schützt
Pferde vor entweder durch EHV-1 oder EHV-4 hervorgerufene Atemwegserkrankungen
und reduziert das Auftreten von durch EHV-1 hervorgerufenen Erkrankungen
des Zentralnervensystems. Der für
die Herstellung dieser Vakzine nützliche
EHV-1-Virusstamm wurde aus dem infizierten Lungengewebe eines fehlgeborenen
Fötus während einer
Expositionsstudie isoliert. Das Isolat, das die Bezeichnung AB69
erhielt, wurde bei der ATCC unter der Zugriffsnummer VR-2581 hinterlegt.
Das Virus wurde zwei Mal auf einer equinen Hautzelllinie passagiert,
um eine Hauptsaat zu erhalten. Das Virus kann auf anfälligen Zelllinien
gezüchtet
werden, die das Virus in einem Ausmaß wirksam replizieren, das
ausreicht, um eine ausreichende Menge (antigene Masse) bereitzustellen,
die immunogen genügt,
um einen Schutz gegen EHV-1 und EHV-4 bereitzustellen. Nun folgt
eine nicht einschränken de,
sondern illustrative Beschreibung eines Verfahrens zur Replikation
des Virus und zur Herstellung einer Vakzine damit.
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Das
Verfahren umfasst die folgenden Schritte: 1) das Infizieren einer
anfälligen
Zelllinie mit einem EHV-1-Virus; 2) das Wachsenlassen des EHV-1-Virus
in einem wachstumsfördernden
Medium, bis eine signifikante zytopathische Wirkung (CPE) erzeugt
wird; 3) das Ernten des wachstumsfördernden Mediums, welches das
EHV-1-Virus, tote
Zellen, Zellbruchstücke
und infizierte Zellen enthält,
um ein Erntematerial zu erhalten; 4) das Inaktivieren des Erntematerials
mit einem geeigneten Inaktivierungsmittel; und 5) das Versetzen des
inaktivierten Erntematerials mit einem Adjuvans. Die anfällige Zelllinie
ist vorzugsweise equinen Ursprungs, noch bevorzugter eine dermale
Equidae-Zelllinie, eine Equidae-Nierenzelllinie oder eine fötale Equidae-Lungenzelllinie.
Diese Zelllinie wird verwendet, um den EHV-1-Stamm zu hohen Titern
zu züchten.
Die Zelllinie kann in Roux-Flaschen, in sich drehenden Flaschen
oder in Bioreaktoren als Suspensionskultur oder auf Mikroträger-Perlen
unter Verwendung eines beliebigen Mediums und Serums, das ein schnelles
Wachstum der Zellen fördert,
gezüchtet
werden. Die bevorzugten Medien sind Earle-Medium oder „Hank's Minimal Essential"-Medium (MEME bzw.
MEMH), wobei Glutamin und nicht essentielle Aminosäuren zugesetzt
sind. Die für
das Zellwachstum bevorzugten Sera sind fötales Pferde-, fötales Rinder-
oder Kalbserum. Die Zelllinie wird bis zur Konfluenz gezüchtet und
anschließend
mit dem EHV-1-Virus mit einer Infektionsmultiplizität (MOI)
infiziert, von der gezeigt wurde, dass sie maximale Ausbeute an
infektiösen
Viruspartikeln von Virus pro Millimeter des Mediums produziert.
Vorzugsweise liegt diese MOI zwischen 0,0001 und 1,0. Die infizierte
Zelllinie wird wachsen gelassen, bis die Zellen eine signifikante
zytopathische Wirkung (CPE) zeigen. Eine signifikante CPE wird als
eine > 80 % Zerstörung der
Zellen definiert, wie dies mikroskopisch durch tote Zellen sichtbar
wird, die sich von der Oberfläche
des Zuchtgefäßes der
Mikroträger-Perlen
ablösen.
Das Medium, das infizierte Zellen, tote Zellen, Zellbruchstücke und
EHV-1 enthält,
wird durch Entfernen aus den Gefäßen, in
denen es gezüchtet wird,
und durch Transferieren desselben in Lagergefäße, wie z.B. Tanks oder Beutel,
geerntet. Dieses Erntematerial wird durch Filtration oder Zentrifugierung
gereinigt, um die Zellen und Zellbruchstücke zu entfernen, wonach die Überstands flüssigkeiten
mittels Ultrafiltration, Ultrazentrifugierung oder Säulenchromatographie konzentriert
werden. Die konzentrierten Flüssigkeiten
werden durch das Hinzufügen
eines beliebigen Inaktivierungsmittels inaktiviert, das die Antigenität des Virus
erhält.
Die bevorzugten Inaktivierungsmittel sind β-Propriolacton, Formalin und
binäres
Ethylenimin. Konservierungsmittel, wie z.B. Thimerosal, kann zu
den inaktivierten Flüssigkeiten
hinzugefügt
werden. Nach der Inaktivierung wird das inaktivierte Material mit
einem Adjuvans versetzt. Es kann eine beliebige Anzahl an Adjuvanzien
verwendet werden, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf,
Folgende: Carbopol 934P®, Havlogen®, PolygenTM, Blockcopolymere, Polymere, Öle, Aluminiumsalze,
wie z.B. Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat, Zytokine, Immunmodulatoren
und Kombinationen daraus. Nach dem Versetzen mit einem Adjuvans
können
Stabilisatoren, wie z.B. Glycerin/EDTA, hinzugefügt werden, um die Antigen-Stabilität zu verbessern.
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Wie
von einem Fachmann erkannt werden würde, können Derivate davon, einschließlich Untereinheiten,
durch Verfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, wie
beispielsweise Extraktion aus dem Virus, erhalten werden, wenn das
Virus einmal, wie zuvor beschrieben, vermehrt werden kann. Zusätzlich dazu können die
schützenden
Antigene auf molekularer Ebene identifiziert werden und unter Verwendung
von Rekombinationsverfahren reproduziert und exprimiert werden.
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Die
Erfindung soll durch die folgenden Beispiele, in denen alle Teile
und Prozentsätze,
falls nicht anders angegeben, das Gewicht betreffen, weiter veranschaulicht
werden, jedoch dadurch nicht eingeschränkt werden.
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BEISPIELE
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BEISPIEL 1
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Eine
dermale Equidae-Zelllinie wird in 1750 cm2 großen, sich
drehenden Flaschen unter Verwendung von MEME + 10 % fötalem Kalbserum
auf etwa 90 % Konfluenz wachsen gelassen. Die konfluenten Zellen wurden
mit einem AB69 genannten EHV-1-Stamm
infiziert und in (MEME) transferiert, das nicht essentielle Aminosäuren, Glutamin,
Neomycin-Sulfat und (Polymyxin B) enthält. Die infizierten Zellkulturen
wurden bei 37 °C
drei bis sechs Tage lang inkubiert oder bis sich 90-95 % CPE eingestellt
hatte, wonach die Zellen und Fluide aseptisch in einen einzelnen
Behälter
geerntet wurden. Die Ernte wurden anschließend durch Filtration durch einen
5-μ-Filter
geklärt
und durch Ultrafiltration durch eine 100.000-MW-Kartusche fünffach konzentriert.
Die konzentrierten Fluide wurden durch das Anpassen des pH auf zwischen
8,0 bis 8,3, durch Hinzufügen
von β-Propiolacton
bis zu einer Endkonzentration von zwischen 0,05 und 0,15 % und durch
Inkubieren bei 37 °C für eine Zeitspanne
von drei bis sechs Stunden inaktiviert, während der pH mit 10 N NaOH
zwischen 6,8 und 7,2 kontrolliert wurde. Die letzte Inkubationsperiode
hydrolysierte das β-Propiolacton.
Nachdem die Inaktivierung vollständig
vollzogen war, wurden die Fluide durch die Zugabe von Havlogen® mit
einem Adjuvans versetzt, und Thimerosal wurde als Konservierungsmittel
hinzugefügt,
um die Vakzinenproduktion abzuschließen. Die durch dieses Verfahren
hergestellte Vakzine wurde EHV-1-MHD-91-001 bezeichnet.
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Es
wurde eine Impfungs/Expositionsstudie durchgeführt, um zu bestimmen, ob die EHV-1-MHD-91-001-Vakzine
trächtige
Stuten vor EHV-1-Atemwegserkrankungen und durch das equine Herpesvirus
hervorgerufenen Fehlgeburten schützen
konnte. Während
dieser Studie wurden fünfundvierzig
Stuten im zweiten Trimester der Trächtigkeit (der Durchschnitt
lag beim 5. Monat der Trächtigkeit)
in zwei Gruppen geteilt. Eine Gruppe, zu der 22 trächtige Stuten
gehörten,
wurde als nichtgeimpfte Kontrollgruppe bezeichnet. Die zweite Gruppe,
bestehend aus 23 Stuten, wurde während
des 5., 7. und 9. Monats der Trächtigkeit
mit 2,0 ml EHV-1-MHD-91-001 geimpft. Für den Atemwegs-Expositionstest
bestand die Impfgruppe aus 22 Stuten, da eine Stute nach dem Expositionstest
starb, nachdem sie ausgerutscht war und sich den Rücken gebrochen hatte.
Für den
Fehlgeburts-Expositionstest bestand die Impfgruppe am Ende der Testperiode
aus nur 19 trächtigen
Stuten (eine Stute erlitt in der Anfangsphase der Studie eine Fehlgeburt,
eine Stute starb nach dem Expositionstest, nachdem sie ausgerutscht
war und sich den Rücken
gebrochen hatte, und zwei Stuten, von denen bekannt war, dass sie
am Anfang des Versuchs frei waren, wurden am ersten Tag der Impfung
nach dem Zufallsprinzip der Impfgruppe zugeordnet).
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Alle
Stuten wurden getestet (unabhängig
davon, ob sie trächtig
waren oder nicht, da die nicht trächtigen Stuten immer noch für den Atemwegs-Expositionstest
verwendet werden konnten). Die Stuten wurden vor der Exposition
mit Rompun®,
erhältlich
bei der Bayer Corporation, ruhig gestellt. Jede Stute wurde anschließend mit
früh passagiertem
AB69 in einer Dosierungsrate von etwa 105,0 TCID50 getestet. Diese Exposition erfolgte intranasal
unter Verwendung eines Zerstäubers,
der ein feines Aerosol produzierte, das den Virus in die Lungen
drängte.
Vom Testvirus und Testverfahren ist von vorherigen Expositions-Titrationsstudien
bekannt, dass sie zu Fehlgeburten und Atemwegserkrankungen bei trächtigen
Stuten geführt.
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Nach
der Exposition wurden alle Stuten in eingezäunte Bereiche gebracht, wo
sie auf Anzeichen für Atemwegswegserkrankungen
und Fehlgeburten beobachtet werden konnten. Um den Schutz vor Atemwegserkrankungen
zu bestimmen, wurden die Stuten beobachtet, und täglich für eine Zeitspanne
von 11 Tagen nach dem Exposition wurden Proben genommen. Die tägliche Beobachtung
aller Stuten nach der Exposition umfasste eine Evaluierung und Bewertung
der klinischen Symptome von Atemwegserkrankungen, umfassend unter
anderem das Nasensekret (Exsudat) und eine erhöhte rektale Temperatur. Zusätzlich wurden täglich Blutproben
genommen. Die Zählungen
der weißen
Blutkörperchen
wurden gemessen, und es wurde der Versuch einer Virus-Isolation
aus den von den täglichen
Blutproben getrennten Buffy Coats unternommen. Ebenso wurde bei
jeder Stute an jedem Testtag ein Abstrich der Nasengänge durchgeführt, wobei
die Abstriche für
spätere
Virus-Isolationsversuche in Transportmedium platziert wurden. Um
den Schutz vor Fehlgeburten zu bestimmen, wurden alle lebenden Fohlen,
toten Fohlen und fehlgeborenen Föten
auf Anzeichen einer EHV-1-Infektion analysiert. Es wurden Blutproben
und Nekropsie-Gewebeproben für
Virus-Isolationsversuche gesammelt. Die Ergebnisse der Atmungs-Evaluierung sind
in den Tabellen 1a, 1b und 1c dargestellt. Die Ergebnisse der Fehlgeburten-Evaluierung
sind in Tabelle 2 dargestellt.
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Wie
in Tabelle 1a dargestellt, zeigten die geimpften Stuten eine Reduktion
von 96,1 der Virenabgabe aus dem Nasensekret im Vergleich zu den
nicht geimpften Kontrollstuten. Nach der EHV-1-Aerosol-Exposition-Impfung
wurde das EHV-1-Virus aus den Nasenabstrichen, die von den geimpften
Tieren erhalten wurden, bei nur 2 von 242 (9,826 %) der Isolationsversuche
gewonnen, wohingegen das EHV-1-Virus bei 51 von 242 (21,07 %) der
Abstriche von den nicht geimpften Kontrollstuten gewonnen wurde.
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Wie
in Tabelle 1b gezeigt wird, war die Temperatur-Reaktion der geimpften
Stuten nach der Exposition signifikant geringer als jene der Kontrollstuten
am z. Beobachtungstag nach der Exposition. An diesem Tag zeigten
alle der geimpften Tiere normale rektale Temperaturen 36,7°C-38,3°C (= 98,0-100,9°F), und 13
von 22 (59,09 %) der nicht geimpften Kontrollstuten zeigten eine
erhöhte
rektale Temperatur 38,3°C
(= 101 °F
oder höher).
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Der
Schweregrad der EHV-1-Atemwegserkrankung bei den nicht geimpften
Kontrollstuten zeigte sich weiters in den Werten der Nasenexsudate
nach der Exposition. Wie in Tabelle 1c angeführt, deuten einzelne tägliche Nasenexsudat-Werte,
die höher
als 4 oder gleich 4 sind, auf eine Atemwegserkrankung in einem signifikanten
Ausmaß hin.
Zwei von 22 der geimpften Stuten (9,09 %) und 9 von 22 (40,09 %)
der nicht geimpften Kontrollstuten entwickelten eine Erkrankung
dieses Ausmaßes.
Dieser Unterschied zwischen der Atemwegserkrankung bei den geimpften
Stuten im Vergleich zu den Kontrollstuten ist statistisch signifikant
(p < 0,03).
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Der
Schweregrad der EHV-1-Atemwegserkrankung bei den nicht geimpften
Kontrollstuten zeigte sich weiters durch die in ihrer Zählung der
weißen
Blutkörperchen
(WBC) nach der Exposition dargestellten Tendenzen, die nicht gezeigt
werden. Zwischen Tag 2 und Tag 5 nach der Exposition zeigten die
nicht geimpften Kontrollstuten eine ausgeprägtere Abnahme ihrer mittleren
WBC-Werte als die geimpften Stuten.
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Zusammenfassend
kann gesagt werden, dass die einwertige EHV-1-Vakzine, die nur einen EHV-1-Stamm
enthielt, im Vergleich zu nicht geimpften Kontrollstuten nach der
Exposition einen signifikanten Schutz vor der durch EHV-1 induzierten
Atemwegserkrankung zeigte.
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Eine
Beobachtung bezüglich
Fehlgeburten nach der Exposition wurde weitergeführt, nachdem die Beobachtungen
der Atemwege abgeschlossen waren. Wie bereits zuvor erwähnt, wurden
die Stuten nach dem Zufallsprinzip in eingezäunte Bereiche gebracht, und
zwar zwei Stuten pro Bereich. Die Auswahl der Gefährten pro
Bereich basierte auf ihrer Kompatibilität. Die Stuten wurden täglich in
der Früh
und am Abend auf Anzeichen einer Geburt beobachtet. Brachte eine
Stute ein lebendes oder totes Fohlen und/oder einen fehlgeborenen
Fötus auf
die Welt, so wurde das folgende Verfahren initiiert.
- 1) Falls die fohlende Stute eine schwierige Geburt hatte, so
half der Tierarzt des landwirtschaftlichen Betriebs bei der Geburt.
Bei einer Stute in der Studie war Unterstützung erforderlich.
- 2) Lebende Fohlen – Nach
der Entdeckung eines lebenden Fohlens wurden sofort Blutproben für Buffy-Coat-Virus-Isolationsstudien
gesammelt und, falls notwendig, für serologische Studien im Fall
des Todes eines neugeborenen Fohlens aufgrund EHV-1.
- 3) Fehlgeborene Föten
und tote Fohlen – Alle
fehlgeborenen Föten
und toten Fohlen wurden sofort im Nekropsie-Gefrierraum platziert,
um eine Autolyse zu verhindern. Alle Post-Mortem-Untersuchungen
erfolgten durch den Tierarzt des landwirtschaftlichen Betriebs und
durch Forschungsarbeiter, die für
die Leitung des Projekts verantwortlich waren. Alle Nekropsie-Untersuchungen
umfassten folgende Schritte: a) visuelle Untersuchungen der Organe
des Fohlens auf Beweise für
schwerwiegende Pathologien; b) das Sammeln von Blutproben für serologische
und Virus-Isolationsstudien; und c) das Sammeln von Gewebeproben
aus dem Thymus, den Lungen, dem Herz, der Leber, den Nieren und
der Milz, die in einzelnen Behältern
platziert wurden, die entweder 10 gepuffertes Formalin für histopathologische
Studien oder MEME, enthaltend eine 5X-Konzentration an Neomycin
und Polymycin B, für
Virus-Isolationen.
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Die
Zusammenfassung der Geburten der Stuten ist in den Tabellen 2a und
2b dargestellt.
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Die
Tabellen 2a und 2b umfassen die folgenden Informationen einer jeden
geimpften und nicht geimpften trächtigen
Stute: (1) die Nummer der Stute; (2) das Kalenderdatum des Fohlens
der Stute; (3) den Tag nach der Exposition, an dem es zur Geburt
kam; (4) die Art der Geburt einer jeden Test-Stute; (5) den Gesundheitsstatus
des Fohlens nach der Geburt; und (6) die potentielle Ursache des
Todes des Fötus
und/oder das infektiöse
Virus, das zum Tod des neugeborenen Fohlens beitrug. Am Ende der
Tabellen werden die Bandbreite nach der Exposition und die durchschnittlichen
Geburtstage einer jeden Testgruppe aufgelistet.
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Sechzehn
der neunzehn trächtigen
geimpften Stuten, was 84,21 % entspricht, brachten nach der EHV-1-Exposition
normale, gesunde Fohlen zur Welt. Eine geimpfte trächtige Stute
litt unter Problemen während
eines Geburtsversuchs eines fast ausgetragenen Fötus in dorsaler transversaler
Lage. Der Fötus
starb während
einer mechanisch unterstützten
Geburt. Im Rahmen viraler Isolationsstudien wurde herausgefunden, dass
dieses Dystokie-Neugeborene kulturnegativ bezüglich des EHV-1-Immunitätstest-Virus
war. Der Tod dieses Fohlens war weder auf die Impfung noch auf das
EHV-1-Immunitätstest-Virus
zurückzuführen. Von
zwei Föten
von geimpften Stuten wurde herausgefunden, dass sie nach der Exposition
positiv auf bezüglich
des EHV-1-Virus waren. Von den nicht geimpften Kontrollstuten gebaren
15 von 22 (68,20 %) normale, gesunde Fohlen. Alle 15 normalen Fohlen
zeigten Kulturen, die frei vom EHV-1-Immunitätstestvirus waren. Das EHV-1-Virus
wurde jedoch aus den Geweben von allen 7 der fehlgeborenen oder
toten neugeborenen Fohlen in der nicht geimpften Kontrollgruppe
isoliert. Daher zeigten die geimpften Tiere eine Reduktion von 67
% des Auftretens von EHV-1-infizierten Föten und neugeborenen Tieren
im Vergleich zu den nicht geimpften Kontrollstuten. Dies zeigt klar
und deutlich die Wirksamkeit der einwertigen EHV-1-Vakzine in Verbindung
mit dem Schutz trächtiger
Stuten vor Fehlgeburten.
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Dies
zeigte, dass die einwertige EHV-1-Vakzine im Vergleich zu den nicht
geimpften Kontrollstuten bei geimpften Stuten zu einer Reduktion
der durch EHV-1 ausgelösten
Atemwegserkrankung führte.
Zusätzlich dazu
führte
die einwertige EHV-1-Vakzine in einer Impfungs-/Expositionsstudie
unter Verwendung von EHV-1 als Expositions- Virus zu einer Reduktion der Fehlgeburten
oder der Todesfälle
bei neugeborenen Fohlen von geimpften trächtigen Stuten im Vergleich
zu nicht geimpften trächtigen
Kontrollstuten.
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Tabelle
2a Zusammenfassung der Geburten von 19 mit einwertiger EHV-1-Vakzine
geimpften trächtigen
Stuten nach einer intranasalen Expositions-Inokulation mit dem EHV-1-Virus vom
Subtyp 1
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Die
durchschnittliche Anzahl der Tage für das Fohlen nach der Exposition
lag bei 58, die Bandbreite variierte von 16 bis 87 Tagen. Die Anzahl
der Fehlgeburten/Todesfälle
aufgrund von EHV-1 lag bei 2/19 oder 10,5 %.
Normale Fohlen:
16/19 (84,2 %) Tabelle
2b Zusammenfassung der Geburten von 22 nicht geimpften Kontrollstuten
nach einer intranasalen Expositions-Inokulation mit dem EHV-1-Virus
vom Subtyp 1
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Die
durchschnittliche Anzahl der Tage für das Fohlen nach der Exposition
lag bei 56, die Bandbreite variierte von 20 bis 83 Tagen. Die Anzahl
der Fehlgeburten/Todesfälle
aufgrund von EHV-1 lag bei 7/22 (31,8 %).
Normale Fohlen: 15/22
(68,2 %)
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Beispiel 2
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Serieller
EHV-1-MHD-91-001, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde in einer
Impfungs-/Expositionsstudie auf die Fähigkeit getestet, junge, gerade
entwöhnte
seronegative Fohlen vor der durch EHV-4 hervorgerufenen Atemwegserkrankung
zu schützen.
Zwanzig EHV-1- und EHV-4-seronegative naive, gerade entwöhnte Fohlen
wurden zu dieser Studie herangezogen. Es wurden alle Fohlen geworfen
und isoliert gehalten, daher hatten sie zuvor keine Aussetzung weder
gegenüber
EHV-4 noch gegenüber
EHV-1 erfahren. Einen Monat vor der ersten Impfung sowie am Tag
der ersten Impfung wurden von allen der gerade entwöhnten Fohlen
Blutproben genommen, um zu bestätigen,
dass alle seronegativ waren. Zehn der gerade entwöhnten Fohlen
wurden mit einer 1-ml-Dosis der einwertigen EHV-1-Vakzine EHV-1-MHD-91-001 geimpft. Achtundzwanzig
Tage nach der ersten Impfung wurde den geimpften entwöhnten Fohlen
eine 1-ml-Booster-Dosis verabreicht. Vierzehn Tage nach der Booster-Dosis
wurde bei allen entwöhnten
Fohlen eine Exposition mit einem heterologen EHV-4-Stamm, genannt
T446, durchgeführt.
Alle entwöhnten
Fohlen wurden für
einen Zeitraum von 11 Tagen nach der Exposition auf klinische Symptome
einer EHV-4-Atemwegserkrankung beobachtet. Jedes entwöhnte Fohlen
wurde unter Verwendung des zuvor beschriebenen Zerstäubers intranasal
mit 104,0 TCID50 des EHV-4-Virus getestet.
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Die
klinischen Symptome der Atemwegserkrankung wurden durch Beobachtung
der Nasenexsudate und einer erhöhten
Temperatur angezeigt. Die Nasenexsudate wurden täglich von einer einzigen Person
bewertet, um eine Beständigkeit
der Beobachtungen beizubehalten. Basierend auf dem Schweregrad der
Erkrankung wurden Bewertungsgrade von 0 bis 6 zugeordnet. Es wurde
festgelegt, dass eine Bewertung von 4 oder darüber als Zeichen einer signifikanten
Atemwegserkrankung anzusehen ist. Zusätzlich wurden Blutproben zur Evaluierung
der WBC-Zählung
und der serologischen Titer-Reaktionen genommen, und es wurden Nasenabstrichproben
für Virus-Isolationen verwendet.
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Die
Ergebnisse der Viren-Isolation und der Nasenexsudate sind in den
Tabellen 3a und 3b dargestellt, während die serologischen Resultate
in Tabelle 4 aufgelistet sind. Die Temperatur-Reaktionen waren signifikant,
so wie auch die Zählung
der weißen
Blutkörperchen.
Dies ist für
eine mit EHV-4 assoziierte Atemwegserkrankung nicht ungewöhnlich.
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Es
gab einen Unterschied bezüglich
der Virenabgabe, wie dies durch Virus-Isolationen aus Nasenabstrichen bestimmt
wurde (Tabelle 3a). Eine durchschnittliche Anzahl von 6,7 nicht
geimpften Kontrolltieren gab während
der Zeitspanne von 11 Tagen nach der Exposition Viren in ihren Nasenexsudaten
ab, während
eine durchschnittliche Anzahl von 3,4 geimpften Tieren Viren abgab.
Dies bedeutete eine Reduktion der Virenabgabe von 52 %.
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Der
Unterschied der Bewertungen der Nasenexsudate zwischen den geimpften
Tieren und den nicht geimpften Kontrolltieren war statistisch signifikant
(Tabelle 3b). Achtzig Prozent der nicht geimpften Kontrolltiere
zeigten Nasenexsudat-Werte von > 4,
was auf eine schwerwiegende Atemwegserkrankung hindeutete, wohingegen
nur 20 % der geimpften Tiere Nasenexsudat-Werte von > 4 aufwiesen. Dies
stellt eine Reduktion der Atemwegserkrankung von 75 % bei den geimpften
Tieren dar. Von noch größerer Bedeutung
ist die Tatsache, dass die geimpften Tiere nur 2 Tage lang Nasenexsudat-Werte
von > 4 aufwiesen,
wohingegen die nicht geimpften Kontrolltiere 10 Tage lang Nasenexsudat-Werte
von > 4 zeigten.
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Tabelle
4 zeigt die serologische Reaktion (Serum-Neutralisierungstiter)
der entwöhnten
Fohlen nach der Impfung, am Tag der Booster-Dosis, am Tag der Exposition
und 14 Tage nach der Exposition. Als Beweis dafür, dass es vor der Exposition
keine Präexposition
sowohl gegenüber
EHV-4 als auch gegenüber
EHV-1 gegeben hatte, blieben die nicht geimpften Kontrolltiere für beide
Virus-Subtypen seronegativ. Alle entwöhnten Fohlen zeigten tatsächlich nach
der Exposition positive serologische Titer für EHV-4. Im Gegensatz zu Berichten
von anderen Wissenschaftlern entwickelten alle außer einem
der geimpften entwöhnten
Fohlen sowohl EHV-1- als auch EHV-4-serumneutralisierende Titer
als Ergebnis entweder der ersten oder der zwei ten Impfung. Dies
bestätigt,
dass diese einwertige EHV-1-Vakzine für die Produktion von serologischen
Reaktionen sowohl gegen EHV-1 als auch gegen EHV-4 wirksam ist.
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Die
allgemeine Abnahme der EHV-1- und EHV-4-Serumneutralisierungstiter
14 Tage nach der Expositions-Inokulation deutet darauf hin, dass
das EHV-4-Testvirus sowohl die EHV-1- als auch die EHV-4-Antikörper neutralisiert,
die durch die einwertige EHV-1-Vakzine entwickelt wurden.
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Zusammenfassend
wurde gezeigt, dass die einwertige EHV-1-Vakzine dieser Erfindung
Schutz gegen eine EHV-4-Belastung der Atemwege bietet und zu einer
serologischen Reaktion sowohl gegen EHV-1 als auch gegen EHV-4 bei
gerade entwöhnten
Fohlen führt,
die gegenüber
keinem der Virus-Subtypen präexponiert
wurden.
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