DE69737198T2 - Sich gegenseitig schützende herpesviruszusammensetzung und verfahren zur deren herstellung und verwendung - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung betrifft die Entdeckung eines Präparates des equinen Herpesvirus, wobei das Präparat gegen Fehlgeburten und Atemwegserkrankungen schützt, die durch das equine Herpesvirus des Typ 1 hervorgerufen werden, und gegen Atemwegserkrankungen, die durch das equine Herpesvirus des Typ 4 hervorgerufen werden. Noch spezifischer betrifft diese Erfindung eine wirksame Vakzine und Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Equine Fehlgeburten und equine Rhinopneumonitis sind häufig anzutreffende Erkrankungen, die den equinen Herpesvirus-Typen 1 (EHV-1) und 2 zugeordnet werden. Das equine Herpesvirus Typ 2 wird nun EHV-4 benannt, da herausgefunden wurde, dass sich die molekulare Struktur signifikant von EHV-1 unterscheidet. EHV-1 ist hauptsächlich der Auslöser für Atemwegserkrankungen. Die durch Atemwegserkrankungen hervorgerufenen wirtschaftlichen Verluste, die von beiden EHV-Subtypen bei jungen Pferden verursacht werden, sind das Ergebnis der Unfähigkeit oder der verringerten Fähigkeit, bei Wettbewerben gute Resultate zu erzielen. Die wirtschaftlichen Verluste, die durch eine Infektion von trächtigen Stuten entstehen, gehen auf Fehlgeburten zurück. Ebenso wurde ein Syndrom des Zentralnervensystems mit EHV-1 assoziiert, wobei diese Erkrankung von aufsteigender Lähmung bis zu vollständiger Lähmung führt und, in einigen Fällen, zum Tod.
  • Aufgrund der fehlenden Homologie zwischen EHV-1 und EHV-4 wurde vorgeschlagen, es könne nur eine Vakzine gegen das equine Herpesvirus vor Fehlgeburten und den verschiedenen Formen der Atemwegserkrankungen schützen, die sowohl die Subtypen EHV-1 als auch EHV-4 enthielt. Tatsächlich wird im US-Patent Nr. 4.083.958 eine Vakzine gegen ein equines Herpesvirus beschrieben, die nur vor durch EHV-1 ausgelösten Fehlgeburten und Atemwegserkrankungen schützt. Sie beansprucht für sich nicht die Fähigkeit, gegen durch EHV-4 ausgelöste Atemwegserkrankungen zu schützen. Im US-Patent Nr. 5.084.271 wird festgestellt, dass ein Aussetzen von Fohlen gegenüber EHV-1, egal ob lebend oder inaktiviert, nur gegen EHV-1 eine Antikörper-Reaktion herbeiführt. Ein Aussetzen von Fohlen gegenüber EHV-1, egal ob lebend oder inaktiviert, führt zu einer Antikörper-Reaktion nur gegen EHV-1 alleine. Ein Aussetzen von Fohlen gegenüber EHV-4 führt zu einer serologischen Reaktion gegenüber sowohl EHV-1 als auch EHV-4. Es wurde jedoch kein tatsächlicher Schutz gegen Exposition gezeigt.
  • Letzteres Patent beansprucht, dass eine wirksame Vakzine EHV-4 alleine oder eine Kombination aus EHV-1 und EHV-4 enthalten muss. Von einer einwertigen EHV-1-Vakzine würde daher nicht erwartet werden, dass sie gegen mit EHV-1 und EHV-4 assoziierte Atemwegssyndrome sowie gegen durch EHV-1 ausgelöste Fehlgeburten schützt.
  • N. Edington et al., One way protection between equid herpesvirus 1 and 4 in vivo, RESEARCH IN VETERINARY SCIENCE, Band 48, Nr. 2, 235-239 (März 1990), offenbaren einen abgeschwächten EHV-1-Stamm, der einen einseitigen Schutz gegen eine spätere EHV-4-Exposition bereitstellt. Dieses Virus induzierte jedoch keine zytotoxische T-Lymphozyten-Aktivität gegen EHV-1. Die Vakzine der vorliegenden Erfindung stellt Schutz sowohl vor EHV-1 als auch vor EHV-4 bereit.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung umfasst einen Stamm des Subtypus 1 des equinen Herpesvirus (EHV-1), der hierin als AB69 bezeichnet wird, oder ein Äquivalent desselben, der/das bei der Herstellung von Antigenen zur Induktion einer schützenden Immunreaktion gegen EHV-1 und EHV-4 von Nutzen ist. Die Erfindung umfasst ebenfalls ein Präparat, wie z.B. eine einwertige Vakzine, die den AB69 enthält, das verwendet werden kann, um entweder junge Fohlen, ausgewachsene Pferde oder trächtige Stuten zu impfen, um einen Schutz gegen Atemwegserkrankungen bereitzustellen, die entweder durch EHV-1 oder EHV-4 hervorgerufen werden, und ebenso, um einen Schutz gegen durch EHV-1 ausgelöste Fehlgeburten bereitzustellen.
  • Weiters umfasst die Erfindung das Verfahren zur Herstellung des Präparats und zur Verwendung desselben zum Schutz von Pferden. Es wird davon ausgegangen, dass Vakzinenpräparate dieser Erfindung ebenso Schutz vor dem Auftreten von Erkrankungen des Zentralnervensystems bieten können, die durch EHV-1 hervorgerufen werden.
  • In der vorliegenden Ausführungsform umfasst die Erfindung das Verfahren zur Herstellung einer solchen einwertigen EHV-1-Vakzine durch Vermehren des Stamms AB69 oder eines Äquivalents desselben in einer kontinuierlichen Zellkultur, Ernten und Reinigen der verbleibenden Zellbruchstücke vom Virus-Überstand, Konzentrieren, chemisches Inaktivieren und Versetzen mit Adjuvans, wie hierin unten stehend ausführlicher beschrieben.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Wie oben stehend dargelegt, betrifft die vorliegende Erfindung ein EHV-1-Virus, das, wenn es zu einem Präparat, wie etwa einer Vakzine, verarbeitet wird und Pferden parenteral verabreicht wird, den Schutz aller Pferde vor den mit EHV-1 und EHV-4 assoziierten Erkrankungen bietet. Genauer gesagt bietet die offenbarte EHV-1-Vakzine trächtigen Stuten Schutz vor Fehlgeburten, die durch EHV-1 hervorgerufen werden, sie schützt Pferde vor entweder durch EHV-1 oder EHV-4 hervorgerufene Atemwegserkrankungen und reduziert das Auftreten von durch EHV-1 hervorgerufenen Erkrankungen des Zentralnervensystems. Der für die Herstellung dieser Vakzine nützliche EHV-1-Virusstamm wurde aus dem infizierten Lungengewebe eines fehlgeborenen Fötus während einer Expositionsstudie isoliert. Das Isolat, das die Bezeichnung AB69 erhielt, wurde bei der ATCC unter der Zugriffsnummer VR-2581 hinterlegt. Das Virus wurde zwei Mal auf einer equinen Hautzelllinie passagiert, um eine Hauptsaat zu erhalten. Das Virus kann auf anfälligen Zelllinien gezüchtet werden, die das Virus in einem Ausmaß wirksam replizieren, das ausreicht, um eine ausreichende Menge (antigene Masse) bereitzustellen, die immunogen genügt, um einen Schutz gegen EHV-1 und EHV-4 bereitzustellen. Nun folgt eine nicht einschränken de, sondern illustrative Beschreibung eines Verfahrens zur Replikation des Virus und zur Herstellung einer Vakzine damit.
  • Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: 1) das Infizieren einer anfälligen Zelllinie mit einem EHV-1-Virus; 2) das Wachsenlassen des EHV-1-Virus in einem wachstumsfördernden Medium, bis eine signifikante zytopathische Wirkung (CPE) erzeugt wird; 3) das Ernten des wachstumsfördernden Mediums, welches das EHV-1-Virus, tote Zellen, Zellbruchstücke und infizierte Zellen enthält, um ein Erntematerial zu erhalten; 4) das Inaktivieren des Erntematerials mit einem geeigneten Inaktivierungsmittel; und 5) das Versetzen des inaktivierten Erntematerials mit einem Adjuvans. Die anfällige Zelllinie ist vorzugsweise equinen Ursprungs, noch bevorzugter eine dermale Equidae-Zelllinie, eine Equidae-Nierenzelllinie oder eine fötale Equidae-Lungenzelllinie. Diese Zelllinie wird verwendet, um den EHV-1-Stamm zu hohen Titern zu züchten. Die Zelllinie kann in Roux-Flaschen, in sich drehenden Flaschen oder in Bioreaktoren als Suspensionskultur oder auf Mikroträger-Perlen unter Verwendung eines beliebigen Mediums und Serums, das ein schnelles Wachstum der Zellen fördert, gezüchtet werden. Die bevorzugten Medien sind Earle-Medium oder „Hank's Minimal Essential"-Medium (MEME bzw. MEMH), wobei Glutamin und nicht essentielle Aminosäuren zugesetzt sind. Die für das Zellwachstum bevorzugten Sera sind fötales Pferde-, fötales Rinder- oder Kalbserum. Die Zelllinie wird bis zur Konfluenz gezüchtet und anschließend mit dem EHV-1-Virus mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) infiziert, von der gezeigt wurde, dass sie maximale Ausbeute an infektiösen Viruspartikeln von Virus pro Millimeter des Mediums produziert. Vorzugsweise liegt diese MOI zwischen 0,0001 und 1,0. Die infizierte Zelllinie wird wachsen gelassen, bis die Zellen eine signifikante zytopathische Wirkung (CPE) zeigen. Eine signifikante CPE wird als eine > 80 % Zerstörung der Zellen definiert, wie dies mikroskopisch durch tote Zellen sichtbar wird, die sich von der Oberfläche des Zuchtgefäßes der Mikroträger-Perlen ablösen. Das Medium, das infizierte Zellen, tote Zellen, Zellbruchstücke und EHV-1 enthält, wird durch Entfernen aus den Gefäßen, in denen es gezüchtet wird, und durch Transferieren desselben in Lagergefäße, wie z.B. Tanks oder Beutel, geerntet. Dieses Erntematerial wird durch Filtration oder Zentrifugierung gereinigt, um die Zellen und Zellbruchstücke zu entfernen, wonach die Überstands flüssigkeiten mittels Ultrafiltration, Ultrazentrifugierung oder Säulenchromatographie konzentriert werden. Die konzentrierten Flüssigkeiten werden durch das Hinzufügen eines beliebigen Inaktivierungsmittels inaktiviert, das die Antigenität des Virus erhält. Die bevorzugten Inaktivierungsmittel sind β-Propriolacton, Formalin und binäres Ethylenimin. Konservierungsmittel, wie z.B. Thimerosal, kann zu den inaktivierten Flüssigkeiten hinzugefügt werden. Nach der Inaktivierung wird das inaktivierte Material mit einem Adjuvans versetzt. Es kann eine beliebige Anzahl an Adjuvanzien verwendet werden, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, Folgende: Carbopol 934P®, Havlogen®, PolygenTM, Blockcopolymere, Polymere, Öle, Aluminiumsalze, wie z.B. Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat, Zytokine, Immunmodulatoren und Kombinationen daraus. Nach dem Versetzen mit einem Adjuvans können Stabilisatoren, wie z.B. Glycerin/EDTA, hinzugefügt werden, um die Antigen-Stabilität zu verbessern.
  • Wie von einem Fachmann erkannt werden würde, können Derivate davon, einschließlich Untereinheiten, durch Verfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, wie beispielsweise Extraktion aus dem Virus, erhalten werden, wenn das Virus einmal, wie zuvor beschrieben, vermehrt werden kann. Zusätzlich dazu können die schützenden Antigene auf molekularer Ebene identifiziert werden und unter Verwendung von Rekombinationsverfahren reproduziert und exprimiert werden.
  • Die Erfindung soll durch die folgenden Beispiele, in denen alle Teile und Prozentsätze, falls nicht anders angegeben, das Gewicht betreffen, weiter veranschaulicht werden, jedoch dadurch nicht eingeschränkt werden.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1
  • Eine dermale Equidae-Zelllinie wird in 1750 cm2 großen, sich drehenden Flaschen unter Verwendung von MEME + 10 % fötalem Kalbserum auf etwa 90 % Konfluenz wachsen gelassen. Die konfluenten Zellen wurden mit einem AB69 genannten EHV-1-Stamm infiziert und in (MEME) transferiert, das nicht essentielle Aminosäuren, Glutamin, Neomycin-Sulfat und (Polymyxin B) enthält. Die infizierten Zellkulturen wurden bei 37 °C drei bis sechs Tage lang inkubiert oder bis sich 90-95 % CPE eingestellt hatte, wonach die Zellen und Fluide aseptisch in einen einzelnen Behälter geerntet wurden. Die Ernte wurden anschließend durch Filtration durch einen 5-μ-Filter geklärt und durch Ultrafiltration durch eine 100.000-MW-Kartusche fünffach konzentriert. Die konzentrierten Fluide wurden durch das Anpassen des pH auf zwischen 8,0 bis 8,3, durch Hinzufügen von β-Propiolacton bis zu einer Endkonzentration von zwischen 0,05 und 0,15 % und durch Inkubieren bei 37 °C für eine Zeitspanne von drei bis sechs Stunden inaktiviert, während der pH mit 10 N NaOH zwischen 6,8 und 7,2 kontrolliert wurde. Die letzte Inkubationsperiode hydrolysierte das β-Propiolacton. Nachdem die Inaktivierung vollständig vollzogen war, wurden die Fluide durch die Zugabe von Havlogen® mit einem Adjuvans versetzt, und Thimerosal wurde als Konservierungsmittel hinzugefügt, um die Vakzinenproduktion abzuschließen. Die durch dieses Verfahren hergestellte Vakzine wurde EHV-1-MHD-91-001 bezeichnet.
  • Es wurde eine Impfungs/Expositionsstudie durchgeführt, um zu bestimmen, ob die EHV-1-MHD-91-001-Vakzine trächtige Stuten vor EHV-1-Atemwegserkrankungen und durch das equine Herpesvirus hervorgerufenen Fehlgeburten schützen konnte. Während dieser Studie wurden fünfundvierzig Stuten im zweiten Trimester der Trächtigkeit (der Durchschnitt lag beim 5. Monat der Trächtigkeit) in zwei Gruppen geteilt. Eine Gruppe, zu der 22 trächtige Stuten gehörten, wurde als nichtgeimpfte Kontrollgruppe bezeichnet. Die zweite Gruppe, bestehend aus 23 Stuten, wurde während des 5., 7. und 9. Monats der Trächtigkeit mit 2,0 ml EHV-1-MHD-91-001 geimpft. Für den Atemwegs-Expositionstest bestand die Impfgruppe aus 22 Stuten, da eine Stute nach dem Expositionstest starb, nachdem sie ausgerutscht war und sich den Rücken gebrochen hatte. Für den Fehlgeburts-Expositionstest bestand die Impfgruppe am Ende der Testperiode aus nur 19 trächtigen Stuten (eine Stute erlitt in der Anfangsphase der Studie eine Fehlgeburt, eine Stute starb nach dem Expositionstest, nachdem sie ausgerutscht war und sich den Rücken gebrochen hatte, und zwei Stuten, von denen bekannt war, dass sie am Anfang des Versuchs frei waren, wurden am ersten Tag der Impfung nach dem Zufallsprinzip der Impfgruppe zugeordnet).
  • Alle Stuten wurden getestet (unabhängig davon, ob sie trächtig waren oder nicht, da die nicht trächtigen Stuten immer noch für den Atemwegs-Expositionstest verwendet werden konnten). Die Stuten wurden vor der Exposition mit Rompun®, erhältlich bei der Bayer Corporation, ruhig gestellt. Jede Stute wurde anschließend mit früh passagiertem AB69 in einer Dosierungsrate von etwa 105,0 TCID50 getestet. Diese Exposition erfolgte intranasal unter Verwendung eines Zerstäubers, der ein feines Aerosol produzierte, das den Virus in die Lungen drängte. Vom Testvirus und Testverfahren ist von vorherigen Expositions-Titrationsstudien bekannt, dass sie zu Fehlgeburten und Atemwegserkrankungen bei trächtigen Stuten geführt.
  • Nach der Exposition wurden alle Stuten in eingezäunte Bereiche gebracht, wo sie auf Anzeichen für Atemwegswegserkrankungen und Fehlgeburten beobachtet werden konnten. Um den Schutz vor Atemwegserkrankungen zu bestimmen, wurden die Stuten beobachtet, und täglich für eine Zeitspanne von 11 Tagen nach dem Exposition wurden Proben genommen. Die tägliche Beobachtung aller Stuten nach der Exposition umfasste eine Evaluierung und Bewertung der klinischen Symptome von Atemwegserkrankungen, umfassend unter anderem das Nasensekret (Exsudat) und eine erhöhte rektale Temperatur. Zusätzlich wurden täglich Blutproben genommen. Die Zählungen der weißen Blutkörperchen wurden gemessen, und es wurde der Versuch einer Virus-Isolation aus den von den täglichen Blutproben getrennten Buffy Coats unternommen. Ebenso wurde bei jeder Stute an jedem Testtag ein Abstrich der Nasengänge durchgeführt, wobei die Abstriche für spätere Virus-Isolationsversuche in Transportmedium platziert wurden. Um den Schutz vor Fehlgeburten zu bestimmen, wurden alle lebenden Fohlen, toten Fohlen und fehlgeborenen Föten auf Anzeichen einer EHV-1-Infektion analysiert. Es wurden Blutproben und Nekropsie-Gewebeproben für Virus-Isolationsversuche gesammelt. Die Ergebnisse der Atmungs-Evaluierung sind in den Tabellen 1a, 1b und 1c dargestellt. Die Ergebnisse der Fehlgeburten-Evaluierung sind in Tabelle 2 dargestellt.
  • Wie in Tabelle 1a dargestellt, zeigten die geimpften Stuten eine Reduktion von 96,1 der Virenabgabe aus dem Nasensekret im Vergleich zu den nicht geimpften Kontrollstuten. Nach der EHV-1-Aerosol-Exposition-Impfung wurde das EHV-1-Virus aus den Nasenabstrichen, die von den geimpften Tieren erhalten wurden, bei nur 2 von 242 (9,826 %) der Isolationsversuche gewonnen, wohingegen das EHV-1-Virus bei 51 von 242 (21,07 %) der Abstriche von den nicht geimpften Kontrollstuten gewonnen wurde.
  • Wie in Tabelle 1b gezeigt wird, war die Temperatur-Reaktion der geimpften Stuten nach der Exposition signifikant geringer als jene der Kontrollstuten am z. Beobachtungstag nach der Exposition. An diesem Tag zeigten alle der geimpften Tiere normale rektale Temperaturen 36,7°C-38,3°C (= 98,0-100,9°F), und 13 von 22 (59,09 %) der nicht geimpften Kontrollstuten zeigten eine erhöhte rektale Temperatur 38,3°C (= 101 °F oder höher).
  • Der Schweregrad der EHV-1-Atemwegserkrankung bei den nicht geimpften Kontrollstuten zeigte sich weiters in den Werten der Nasenexsudate nach der Exposition. Wie in Tabelle 1c angeführt, deuten einzelne tägliche Nasenexsudat-Werte, die höher als 4 oder gleich 4 sind, auf eine Atemwegserkrankung in einem signifikanten Ausmaß hin. Zwei von 22 der geimpften Stuten (9,09 %) und 9 von 22 (40,09 %) der nicht geimpften Kontrollstuten entwickelten eine Erkrankung dieses Ausmaßes. Dieser Unterschied zwischen der Atemwegserkrankung bei den geimpften Stuten im Vergleich zu den Kontrollstuten ist statistisch signifikant (p < 0,03).
  • Der Schweregrad der EHV-1-Atemwegserkrankung bei den nicht geimpften Kontrollstuten zeigte sich weiters durch die in ihrer Zählung der weißen Blutkörperchen (WBC) nach der Exposition dargestellten Tendenzen, die nicht gezeigt werden. Zwischen Tag 2 und Tag 5 nach der Exposition zeigten die nicht geimpften Kontrollstuten eine ausgeprägtere Abnahme ihrer mittleren WBC-Werte als die geimpften Stuten.
  • Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die einwertige EHV-1-Vakzine, die nur einen EHV-1-Stamm enthielt, im Vergleich zu nicht geimpften Kontrollstuten nach der Exposition einen signifikanten Schutz vor der durch EHV-1 induzierten Atemwegserkrankung zeigte.
  • Figure 00100001
  • Figure 00110001
  • Figure 00120001
  • Eine Beobachtung bezüglich Fehlgeburten nach der Exposition wurde weitergeführt, nachdem die Beobachtungen der Atemwege abgeschlossen waren. Wie bereits zuvor erwähnt, wurden die Stuten nach dem Zufallsprinzip in eingezäunte Bereiche gebracht, und zwar zwei Stuten pro Bereich. Die Auswahl der Gefährten pro Bereich basierte auf ihrer Kompatibilität. Die Stuten wurden täglich in der Früh und am Abend auf Anzeichen einer Geburt beobachtet. Brachte eine Stute ein lebendes oder totes Fohlen und/oder einen fehlgeborenen Fötus auf die Welt, so wurde das folgende Verfahren initiiert.
    • 1) Falls die fohlende Stute eine schwierige Geburt hatte, so half der Tierarzt des landwirtschaftlichen Betriebs bei der Geburt. Bei einer Stute in der Studie war Unterstützung erforderlich.
    • 2) Lebende Fohlen – Nach der Entdeckung eines lebenden Fohlens wurden sofort Blutproben für Buffy-Coat-Virus-Isolationsstudien gesammelt und, falls notwendig, für serologische Studien im Fall des Todes eines neugeborenen Fohlens aufgrund EHV-1.
    • 3) Fehlgeborene Föten und tote Fohlen – Alle fehlgeborenen Föten und toten Fohlen wurden sofort im Nekropsie-Gefrierraum platziert, um eine Autolyse zu verhindern. Alle Post-Mortem-Untersuchungen erfolgten durch den Tierarzt des landwirtschaftlichen Betriebs und durch Forschungsarbeiter, die für die Leitung des Projekts verantwortlich waren. Alle Nekropsie-Untersuchungen umfassten folgende Schritte: a) visuelle Untersuchungen der Organe des Fohlens auf Beweise für schwerwiegende Pathologien; b) das Sammeln von Blutproben für serologische und Virus-Isolationsstudien; und c) das Sammeln von Gewebeproben aus dem Thymus, den Lungen, dem Herz, der Leber, den Nieren und der Milz, die in einzelnen Behältern platziert wurden, die entweder 10 gepuffertes Formalin für histopathologische Studien oder MEME, enthaltend eine 5X-Konzentration an Neomycin und Polymycin B, für Virus-Isolationen.
  • Die Zusammenfassung der Geburten der Stuten ist in den Tabellen 2a und 2b dargestellt.
  • Die Tabellen 2a und 2b umfassen die folgenden Informationen einer jeden geimpften und nicht geimpften trächtigen Stute: (1) die Nummer der Stute; (2) das Kalenderdatum des Fohlens der Stute; (3) den Tag nach der Exposition, an dem es zur Geburt kam; (4) die Art der Geburt einer jeden Test-Stute; (5) den Gesundheitsstatus des Fohlens nach der Geburt; und (6) die potentielle Ursache des Todes des Fötus und/oder das infektiöse Virus, das zum Tod des neugeborenen Fohlens beitrug. Am Ende der Tabellen werden die Bandbreite nach der Exposition und die durchschnittlichen Geburtstage einer jeden Testgruppe aufgelistet.
  • Sechzehn der neunzehn trächtigen geimpften Stuten, was 84,21 % entspricht, brachten nach der EHV-1-Exposition normale, gesunde Fohlen zur Welt. Eine geimpfte trächtige Stute litt unter Problemen während eines Geburtsversuchs eines fast ausgetragenen Fötus in dorsaler transversaler Lage. Der Fötus starb während einer mechanisch unterstützten Geburt. Im Rahmen viraler Isolationsstudien wurde herausgefunden, dass dieses Dystokie-Neugeborene kulturnegativ bezüglich des EHV-1-Immunitätstest-Virus war. Der Tod dieses Fohlens war weder auf die Impfung noch auf das EHV-1-Immunitätstest-Virus zurückzuführen. Von zwei Föten von geimpften Stuten wurde herausgefunden, dass sie nach der Exposition positiv auf bezüglich des EHV-1-Virus waren. Von den nicht geimpften Kontrollstuten gebaren 15 von 22 (68,20 %) normale, gesunde Fohlen. Alle 15 normalen Fohlen zeigten Kulturen, die frei vom EHV-1-Immunitätstestvirus waren. Das EHV-1-Virus wurde jedoch aus den Geweben von allen 7 der fehlgeborenen oder toten neugeborenen Fohlen in der nicht geimpften Kontrollgruppe isoliert. Daher zeigten die geimpften Tiere eine Reduktion von 67 % des Auftretens von EHV-1-infizierten Föten und neugeborenen Tieren im Vergleich zu den nicht geimpften Kontrollstuten. Dies zeigt klar und deutlich die Wirksamkeit der einwertigen EHV-1-Vakzine in Verbindung mit dem Schutz trächtiger Stuten vor Fehlgeburten.
  • Dies zeigte, dass die einwertige EHV-1-Vakzine im Vergleich zu den nicht geimpften Kontrollstuten bei geimpften Stuten zu einer Reduktion der durch EHV-1 ausgelösten Atemwegserkrankung führte. Zusätzlich dazu führte die einwertige EHV-1-Vakzine in einer Impfungs-/Expositionsstudie unter Verwendung von EHV-1 als Expositions- Virus zu einer Reduktion der Fehlgeburten oder der Todesfälle bei neugeborenen Fohlen von geimpften trächtigen Stuten im Vergleich zu nicht geimpften trächtigen Kontrollstuten.
  • Tabelle 2a Zusammenfassung der Geburten von 19 mit einwertiger EHV-1-Vakzine geimpften trächtigen Stuten nach einer intranasalen Expositions-Inokulation mit dem EHV-1-Virus vom Subtyp 1
    Figure 00160001
  • Die durchschnittliche Anzahl der Tage für das Fohlen nach der Exposition lag bei 58, die Bandbreite variierte von 16 bis 87 Tagen. Die Anzahl der Fehlgeburten/Todesfälle aufgrund von EHV-1 lag bei 2/19 oder 10,5 %.
    Normale Fohlen: 16/19 (84,2 %) Tabelle 2b Zusammenfassung der Geburten von 22 nicht geimpften Kontrollstuten nach einer intranasalen Expositions-Inokulation mit dem EHV-1-Virus vom Subtyp 1
    Figure 00170001
  • Die durchschnittliche Anzahl der Tage für das Fohlen nach der Exposition lag bei 56, die Bandbreite variierte von 20 bis 83 Tagen. Die Anzahl der Fehlgeburten/Todesfälle aufgrund von EHV-1 lag bei 7/22 (31,8 %).
    Normale Fohlen: 15/22 (68,2 %)
  • Beispiel 2
  • Serieller EHV-1-MHD-91-001, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde in einer Impfungs-/Expositionsstudie auf die Fähigkeit getestet, junge, gerade entwöhnte seronegative Fohlen vor der durch EHV-4 hervorgerufenen Atemwegserkrankung zu schützen. Zwanzig EHV-1- und EHV-4-seronegative naive, gerade entwöhnte Fohlen wurden zu dieser Studie herangezogen. Es wurden alle Fohlen geworfen und isoliert gehalten, daher hatten sie zuvor keine Aussetzung weder gegenüber EHV-4 noch gegenüber EHV-1 erfahren. Einen Monat vor der ersten Impfung sowie am Tag der ersten Impfung wurden von allen der gerade entwöhnten Fohlen Blutproben genommen, um zu bestätigen, dass alle seronegativ waren. Zehn der gerade entwöhnten Fohlen wurden mit einer 1-ml-Dosis der einwertigen EHV-1-Vakzine EHV-1-MHD-91-001 geimpft. Achtundzwanzig Tage nach der ersten Impfung wurde den geimpften entwöhnten Fohlen eine 1-ml-Booster-Dosis verabreicht. Vierzehn Tage nach der Booster-Dosis wurde bei allen entwöhnten Fohlen eine Exposition mit einem heterologen EHV-4-Stamm, genannt T446, durchgeführt. Alle entwöhnten Fohlen wurden für einen Zeitraum von 11 Tagen nach der Exposition auf klinische Symptome einer EHV-4-Atemwegserkrankung beobachtet. Jedes entwöhnte Fohlen wurde unter Verwendung des zuvor beschriebenen Zerstäubers intranasal mit 104,0 TCID50 des EHV-4-Virus getestet.
  • Die klinischen Symptome der Atemwegserkrankung wurden durch Beobachtung der Nasenexsudate und einer erhöhten Temperatur angezeigt. Die Nasenexsudate wurden täglich von einer einzigen Person bewertet, um eine Beständigkeit der Beobachtungen beizubehalten. Basierend auf dem Schweregrad der Erkrankung wurden Bewertungsgrade von 0 bis 6 zugeordnet. Es wurde festgelegt, dass eine Bewertung von 4 oder darüber als Zeichen einer signifikanten Atemwegserkrankung anzusehen ist. Zusätzlich wurden Blutproben zur Evaluierung der WBC-Zählung und der serologischen Titer-Reaktionen genommen, und es wurden Nasenabstrichproben für Virus-Isolationen verwendet.
  • Die Ergebnisse der Viren-Isolation und der Nasenexsudate sind in den Tabellen 3a und 3b dargestellt, während die serologischen Resultate in Tabelle 4 aufgelistet sind. Die Temperatur-Reaktionen waren signifikant, so wie auch die Zählung der weißen Blutkörperchen. Dies ist für eine mit EHV-4 assoziierte Atemwegserkrankung nicht ungewöhnlich.
  • Es gab einen Unterschied bezüglich der Virenabgabe, wie dies durch Virus-Isolationen aus Nasenabstrichen bestimmt wurde (Tabelle 3a). Eine durchschnittliche Anzahl von 6,7 nicht geimpften Kontrolltieren gab während der Zeitspanne von 11 Tagen nach der Exposition Viren in ihren Nasenexsudaten ab, während eine durchschnittliche Anzahl von 3,4 geimpften Tieren Viren abgab. Dies bedeutete eine Reduktion der Virenabgabe von 52 %.
  • Der Unterschied der Bewertungen der Nasenexsudate zwischen den geimpften Tieren und den nicht geimpften Kontrolltieren war statistisch signifikant (Tabelle 3b). Achtzig Prozent der nicht geimpften Kontrolltiere zeigten Nasenexsudat-Werte von > 4, was auf eine schwerwiegende Atemwegserkrankung hindeutete, wohingegen nur 20 % der geimpften Tiere Nasenexsudat-Werte von > 4 aufwiesen. Dies stellt eine Reduktion der Atemwegserkrankung von 75 % bei den geimpften Tieren dar. Von noch größerer Bedeutung ist die Tatsache, dass die geimpften Tiere nur 2 Tage lang Nasenexsudat-Werte von > 4 aufwiesen, wohingegen die nicht geimpften Kontrolltiere 10 Tage lang Nasenexsudat-Werte von > 4 zeigten.
  • Tabelle 4 zeigt die serologische Reaktion (Serum-Neutralisierungstiter) der entwöhnten Fohlen nach der Impfung, am Tag der Booster-Dosis, am Tag der Exposition und 14 Tage nach der Exposition. Als Beweis dafür, dass es vor der Exposition keine Präexposition sowohl gegenüber EHV-4 als auch gegenüber EHV-1 gegeben hatte, blieben die nicht geimpften Kontrolltiere für beide Virus-Subtypen seronegativ. Alle entwöhnten Fohlen zeigten tatsächlich nach der Exposition positive serologische Titer für EHV-4. Im Gegensatz zu Berichten von anderen Wissenschaftlern entwickelten alle außer einem der geimpften entwöhnten Fohlen sowohl EHV-1- als auch EHV-4-serumneutralisierende Titer als Ergebnis entweder der ersten oder der zwei ten Impfung. Dies bestätigt, dass diese einwertige EHV-1-Vakzine für die Produktion von serologischen Reaktionen sowohl gegen EHV-1 als auch gegen EHV-4 wirksam ist.
  • Die allgemeine Abnahme der EHV-1- und EHV-4-Serumneutralisierungstiter 14 Tage nach der Expositions-Inokulation deutet darauf hin, dass das EHV-4-Testvirus sowohl die EHV-1- als auch die EHV-4-Antikörper neutralisiert, die durch die einwertige EHV-1-Vakzine entwickelt wurden.
  • Zusammenfassend wurde gezeigt, dass die einwertige EHV-1-Vakzine dieser Erfindung Schutz gegen eine EHV-4-Belastung der Atemwege bietet und zu einer serologischen Reaktion sowohl gegen EHV-1 als auch gegen EHV-4 bei gerade entwöhnten Fohlen führt, die gegenüber keinem der Virus-Subtypen präexponiert wurden.
  • Figure 00210001
  • Figure 00220001
  • Figure 00230001

Claims (11)

  1. Einwertige EHV-1-Vakzine, die Schutz gegen Erkrankungen bietet, die mit EHV-1 und EHV-4 zusammenhängen, umfassend ein EHV-1-Virus, das durch Stamm AB69 dargestellt ist, der als ATCC VR-2581 bezeichnet wird.
  2. Vakzine nach Anspruch 1, die Schutz gegen eine Atmungserkrankung bietet, die sowohl durch EHV-1 als auch EHV-4 und ihre Kombination ausgelöst wird.
  3. Verfahren zur Herstellung einer Vakzine nach Anspruch 1, folgende Schritte umfassend: a. das Infizieren einer anfälligen Zelllinie mit einem EHV-1-Virus, das einen durch Stamm AB69 oder sein Äquivalent dargestellten EHV-1-Virus umfasst, der als ATCC VR-2581 bezeichnet wird; b. das Wachsenlassen des EHV-1-Virus in einem wachstumsfördernden Medium, bis ein signifikanter CPE erzeugt wird; c. das Ernten des wachstumsfördernden Mediums, welches das EH-1-Virus, tote Zellen, Zellbruchstücke und infizierte Zellen enthält, um ein Erntematerial zu erhalten; d. das Inaktivieren des Erntematerials mit einem geeigneten Inaktivierungsmittel; und e. das Versetzen des inaktivierten Erntematerials mit Adjuvans.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Zelllinie eine Equidae-Zelllinie ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Equidae-Zelllinie aus der aus einer dermalen Equidae-Zelllinie, einer Equidae-Nierenzelllinie und einer fötalen Equidae-Lungenzelllinie bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Inaktivierungsmittel aus der aus β-Propiolacton, Formalin und binärem Ethylenimin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Adjuvans aus der aus Havlogen.RTM, Carbopol 934P.RTM, Polygen.TM, Blockcopolymeren, Polymeren, Ölen, Aluminiumsalzen, Zytokinen, Immunmodulatoren und Kombination daraus bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 4, worin ein Stabilisator zur Vakzine zugesetzt wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 4, worin das Erntematerial vor der Inaktivierung gereinigt wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, worin die Reinigung das Filtrieren, Ultrafiltrieren, Säulenchromatographieren oder Kombinationen davon umfasst.
  11. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Erntematerial vor der Inaktivierung eingeengt wird.
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