ES2281094T3

ES2281094T3 - Preparaciones de virus del herpes equino de proteccion cruzada y procedimiento de fabricacion y uso de las mismas.

Info

Publication number: ES2281094T3
Application number: ES97911582T
Authority: ES
Inventors: Joseph Macek; Karen K. Brown; Bobby O. Moore
Original assignee: Bayer Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1996-08-16
Filing date: 1997-08-05
Publication date: 2007-09-16
Anticipated expiration: 2017-08-05
Also published as: JP2000516622A; EP0929315B1; CA2263201A1; EP0929315A2; US5853715A; DK0929315T3; NZ334154A; DE69737198D1; WO1998006427A2; WO1998006427A3; AU4891297A; DE69737198T2; CA2263201C; ATE350058T1; CN1228029A; AU714418B2; BR9711138A

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UNA VACUNA CONTRA EL HERPES-VIRUS DE LOS EQUIDOS (EHV-1) QUE ASEGURA UNA PROTECCION CONTRA LAS ENFERMEDADES ASOCIADAS A LOS VIRUS EHV-1 Y EHV-4, ASI COMO PROCEDIMIENTOS DE PREPARADO Y USO DE DICHAS COMPOSICIONES.

Description

Preparaciones de virus del herpes equino de protección cruzada, y procedimiento de fabricación y uso de las mismas.

Esta invención se refiere al descubrimiento de una preparación de virus del herpes equino que protege frente al aborto y la enfermedad respiratoria provocada por el virus del herpes equino de tipo 1 y la enfermedad respiratoria provocada por el virus del herpes equino de tipo 4. Más específicamente, esta invención se refiere a una vacuna eficaz, y procedimientos de fabricación y uso de la misma.

Antecedentes de la invención

El aborto equino y la rinoneumonitis equina son enfermedades comúnmente reconocidas atribuidas al virus del herpes equino de tipo 1 (VHE-1) y 2. El virus del herpes equino de tipo 2 se denomina ahora VHE-4 ya que se ha determinado que la estructura molecular es significativamente diferente del VHE-1. El VHE-1 es principalmente responsable de provocar la enfermedad respiratoria. Las pérdidas económicas consecuencia de la enfermedad respiratoria producida por cualquier subtipo del VHE en caballos jóvenes resultan de la incapacidad o capacidad afectada para rendir en una competición. Las pérdidas económicas resultantes de la infección de yeguas preñadas se deben al aborto. También se ha asociado un síndrome del sistema nervioso central con el VHE-1, avanzando tal enfermedad desde una parálisis ascendente hasta la parálisis completa y, en algunos casos, hasta la muerte.

Debido a la falta de homología entre el VHE-1 y el VHE-4, se ha propuesto que sólo una vacuna del virus del herpes equino que contenga tanto el subtipo VHE-1 como el VHE-4 protegerá del aborto y las diversas formas de enfermedad respiratoria. De hecho, la patente de los EE.UU. número 4.083.958 describe una vacuna del virus del herpes equino que protege sólo frente al aborto y la enfermedad respiratoria provocada por el VHE-1. No reivindica proteger frente a la enfermedad respiratoria provocada por el VHE-4. La patente de los EE.UU. número 5.084.271 menciona que la exposición de potros al VHE-1, tanto vivo como inactivado, produce una respuesta de anticuerpos sólo frente al VHE-1. La exposición de potros al VHE-1, tanto vivo como inactivado, produce una respuesta de anticuerpos sólo frente al VHE-1. La exposición de potros al VHE-4 produce una respuesta serológica tanto frente al VHE-1 como al VHE-4. Sin embargo, no se mostró ninguna protección real frente a la
exposición.

Esta última patente reivindica que una vacuna eficaz debe contener VHE-4 solo o una combinación de VHE-1 y VHE-4. Por tanto, no se esperaría que una vacuna del VHE-1 monovalente proteja frente a síndromes respiratorios del VHE-1 y VHE-4 así como del aborto provocado por el VHE-1.

N- Edington et al.: "One way protection between equid herpesvirus 1 and 4 in vivo", Research in veterinary science, vol. 48, nº 2, marzo de 1990, páginas 235-239, describe una cepa del VHE-1 atenuada que proporciona protección unilateral frente a una exposición al VHE-4 posterior. Sin embargo, este virus no indujo una actividad de linfocitos T citotóxicos frente al VHE-1. La vacuna de la presente invención proporciona protección tanto frente al VHE-1 como al VHE-4.

Sumario de la invención

La presente invención abarca una cepa del virus del herpes equino de tipo 1 (VHE-1) denominada en el presente documento como AB69 o un equivalente de la misma que es útil en la preparación de antígenos para la inducción de una respuesta inmunitaria protectora frente al VHE-1 o al VHE-4. La presente invención también abarca una preparación tal como una vacuna monovalente que contiene AB69 que puede usarse para vacunar o bien potros jóvenes, equinos adultos o bien yeguas preñadas para proporcionar protección frente a la enfermedad respiratoria provocada o bien por el VHE-1 o bien por el VHE-4 y además, proporcionar protección frente al aborto debido al
VHE-1.

La invención abarca adicionalmente el procedimiento de fabricación de la preparación y uso de la misma para proteger caballos. Se prevé que las preparaciones de vacuna de esta invención también puedan proporcionar protección frente a incidencias de enfermedad del sistema nervioso central provocada por el VHE-1.

En la presente realización, la invención abarca el procedimiento de preparación de una vacuna del VHE-1 monovalente de este tipo propagando la cepa AB69 o un equivalente de la misma en un cultivo celular continuo, recogiendo y purificando los residuos celulares eliminados del sobrenadante de virus, concentrando, inactivando químicamente y añadiendo adyuvantes tal como se describe con más detalle a continuación en el presente documento.

Descripción detallada de la invención

Tal como se expuso anteriormente, la presente invención se refiere a un virus VHE-1 que, cuando se fabrica en una preparación tal como una vacuna y se administra por vía parenteral a caballos, proporciona protección de todos los caballos frente a enfermedades asociadas con el VHE-1 y VHE-4. Más específicamente, la vacuna del VHE-1 descrita proporciona protección a yeguas preñadas frente al aborto provocado por el VHE-1, protege a caballos de la enfermedad respiratoria provocada o bien por el VHE-1 o bien por el VHE-4, y reduce la incidencia de enfermedad del sistema nervioso central provocada por el VHE-1. La cepa del virus VHE-1 útil para la preparación de esta vacuna se aisló del tejido pulmonar infectado de un feto abortado durante un estudio de exposición. El aislado, denominado AB69, se depositó en la ATCC con el número de registro VR-2581. Se hizo pasar dos veces el virus en una línea de células dérmicas equinas para establecer una cepa madre. Puede hacerse crecer el virus en líneas de células susceptibles que replican eficazmente el virus hasta un nivel suficiente como para proporcionar una cantidad suficiente (masa antigénica) como para ser inmunogénicamente suficiente para proporcionar protección frente al VHE-1 y el VHE-4. Lo que sigue es una descripción no limitante, sino ilustrativa, de un procedimiento de replicación del virus y fabricación de una vacuna con el mismo.

El procedimiento comprende las etapas de 1) infectar una línea de células susceptibles con un virus VHE-1; 2) permitir a dicho virus VHE-1 crecer en un medio de apoyo del crecimiento hasta que se produce un efecto citopático (ECP) significativo; 3) recoger dicho medio de apoyo del crecimiento que contiene dicho virus VHE-1, células muertas, residuos celulares y células infectadas para producir un material recogido; 4) inactivar dicho material recogido con un agente de inactivación adecuado; y 5) añadir adyuvantes a dicho material recogido inactivado. La línea de células susceptibles es preferiblemente de origen equino, más preferiblemente una línea de células dérmicas equinas, una línea de células renales equinas o una línea de células pulmonares equinas fetales. Esta línea celular se usa para hacer crecer la cepa del VHE-1 hasta una alta titulación. Puede hacerse crecer la línea celular en botellas de Roux, frascos rotatorios o biorreactores como un cultivo en suspensión o en perlas microportadoras usando cualquier medio y suero que apoya el rápido crecimiento de las células. Los medios preferidos son los medios esenciales mínimos de Earle o de Hank (MEME y MEMH, respectivamente) con glutamina y aminoácidos no esenciales añadidos. Los sueros preferidos para el crecimiento celular son el suero de ternero, bovino fetal o equino fetal. Se hace crecer la línea celular hasta la confluencia y luego se infecta con el virus VHE-1 con una multiplicidad de infección (MOI) que se de muestra que produce rendimientos máximos de partículas de virus infecciosas por mililitro de medio. Preferiblemente, esta MOI es de entre 0,0001 y 1,0. Se deja crecer la línea celular infectada hasta que las células muestran un efecto citopático (ECP) significativo. Un ECP se define como destrucción >80% de las células según se visualiza microscópicamente mediante células muertas que abandonan la superficie del vaso de crecimiento de las perlas microportadoras. Se recoge el medio que contiene las células infectadas, células muertas, residuos celulares y VHE-1 eliminándolo de los vasos en los que se hace crecer y transfiriéndolo a vasos de mantenimiento tales como tanques o bolsas. Se purifica este material recogido mediante filtración o centrifugación para eliminar las células y residuos celulares tras lo cual se concentran los fluidos de sobrenadante mediante ultrafiltración, ultracentrifugación o cromatografía en columna. Se inactivan los fluidos concentrados mediante adición de cualquier agente de inactivación que conservará la antigenicidad del virus. Los agentes de inactivación preferidos son beta-propiolactona, formalina o etilenimina binaria. Pueden añadirse conservantes tales como timerosal a los fluidos inactivados. Tras la inactivación, se añaden adyuvantes al material inactivado. Puede usarse cualquier número de adyuvantes incluyendo, pero sin limitarse a: Carbopol 934P®, Havlogen®, Polygen^{TM}, copolímeros en bloque, polímeros, aceites, sales de aluminio tales como hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, citocinas e inmunomoduladores y combinaciones de los mismos. Tras añadir adyuvantes, pueden añadirse estabilizantes tales como glicerol/EDTA para mejorar la estabilidad del
antígeno.

Tal como constatarán los expertos en la técnica, una vez que el virus pueda propagarse tal como se describió anteriormente, pueden obtenerse derivados del mismo incluyendo subunidades mediante medios conocidos en la técnica tales como extracción del virus. Adicionalmente, pueden identificarse los antígenos protectores a nivel molecular y reproducirse y expresarse usando tecnología recombinante.

La invención se ilustra más a fondo, pero no se pretende que se limite por los siguientes ejemplos, en los que todas las partes y porcentajes son en peso a menos que se especifique de otro modo.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Se hace crecer una línea de células dérmicas equinas hasta aproximadamente el 90% de confluencia en frascos rotatorios de 1750 cm^{2} usando MEME + suero de ternero fetal al 10%. Se infectaron las células confluyentes con una cepa del VHE-1 denominada AB69, y se transfirieron a (MEME) que contenía aminoácidos no esenciales, glutamina, sulfato de neomicina y (polimixina B). Se incubaron los cultivos de células infectadas a 37ºC durante de tres a seis días o hasta que hubo un ECP del 90-95% tras lo cual se recogieron asépticamente las células y fluidos en un único recipiente. Entonces se aclaró lo recogido mediante filtración a través de un filtro de 5 \mu y se concentró cinco veces usando ultrafiltración a través de un cartucho de 100.000 de PM. Se inactivaron los fluidos concentrados ajustando el pH hasta entre 8,0 y 8,3, añadiendo beta-propiolactona hasta una concentración final de entre el 0,05 y el 0,15% e incubando a 37ºC durante de tres a seis horas mientras se controlaba el pH entre 6,8 y 7,2 con NaOH 10 N. Este último periodo de incubación hidrolizó la beta-propiolactona. Tras completarse la inactivación, se añadieron adyuvantes a los fluidos mediante la adición de Havlogen®, y se añadió timerosal como conservante para completar la producción de vacuna. La vacuna producida mediante este procedimiento se denominó EHV-1 MHD
91-001.

Se realizó un estudio de vacunación/exposición para determinar si la vacuna EHV-1 MHD 91-001 podía proteger a yeguas preñadas frente a la enfermedad respiratoria del VHE-1 y frente al aborto provocado por el virus del herpes equino. Durante este estudio, se separaron cuarenta y cinco yeguas en el segundo trimestre de embarazo (el promedio fue el 5º mes de embarazo) en dos grupos. Un grupo que contenía 22 yeguas preñadas se denominó controles no vacunados. El segundo grupo de 23 yeguas se vacunó con 2,0 ml de EHV-1 MHD 91-001 durante el 5º, 7º y 9º mes de embarazo. Para la exposición respiratoria, el grupo vacunado contenía 22 yeguas ya que una yegua murió tras la exposición al caer y romperse el cuello. Para la exposición al aborto, el grupo vacunado sólo contenía 19 yeguas preñadas al final del periodo de exposición (una yegua abortó pronto en el estudio, una yegua murió tras la exposición al caer y romperse el cuello y dos yeguas que se sabía que no estaban preñadas al comienzo del ensayo se asignaron aleatoriamente al grupo vacunado el primer día de la vacunación).

Se expusieron todas las yeguas (tanto si estaban preñadas como si no ya que las yeguas no preñadas todavía podían usarse para la exposición respiratoria). Se sedaron las yeguas con Rompun®, disponible de Bayer Corporation, antes de la exposición. Se expuso cada yegua con AB69 de paso temprano a una tasa de dosis de aproximadamente 10^{5,0} DICT_{50}. Se administró esta exposición por vía intranasal utilizando un nebulizador que producía un aerosol fino que forzó el virus dentro de los pulmones. Se ha demostrado que el procedimiento y el virus de exposición producen aborto y enfermedad respiratoria en yeguas preñadas en estudios de titulación de exposición
anteriores.

Tras la exposición, se colocaron todas las yeguas en corrales cerrados en los que se observaron para detectar signos de enfermedad respiratoria y aborto. Con el fin de determinar la protección frente a la enfermedad respiratoria, se observaron las yeguas y se tomaron muestras diarias durante 11 días tras la exposición. La observación diaria tras la exposición de todas las yeguas incluyó la evaluación y puntuación de los signos clínicos de enfermedad respiratoria incluyendo rinorrea (exudado) y aumento de la temperatura rectal. Adicionalmente, se extrajeron muestras de sangre diariamente. Se midió el recuento de leucocitos y se intentó aislar el virus de las capas leucocíticas separadas de las muestras de sangre diarias. Además, en cada día de prueba, se tomaron muestras con hisopos de los conductos nasales de cada yegua, colocando los hisopos en medio de transporte para intentos posteriores de aislamiento del virus. Con el fin de determinar la protección frente al aborto, se analizaron todos los potros vivos, potros muertos y fetos abortados para detectar indicaciones de infección del VHE-1. Se recogieron muestras de sangre y tejido de necropsia para intentos de aislamiento del virus. Los resultados de la evaluación respiratoria se muestran en las tablas 1a, 1b y 1c. Los resultados de la evaluación del aborto se muestran en la
tabla 2.

Tal como se muestra en la tabla 1a, las yeguas vacunadas mostraron una reducción del 96,1% de emisión del virus a partir de exudados nasales comparado con yeguas control no vacunadas. Tras la inoculación por exposición a aerosol del VHE-1, se recuperó virus VHE-1 de hisopos nasales recogidos de las vacunadas en tan sólo 2 de 242 (9,826%) de los intentos de aislamiento, mientras que se recuperó virus VHE-1 de 51 de 242 (21,07%) de los hisopos recogidos de yeguas control no vacunadas.

Tal como se demuestra en la tabla 1b, la respuesta de temperatura de las yeguas vacunadas tras la exposición fue significativamente inferior a la de las yeguas control en el día 2 de observación tras la exposición. Este día, todas las vacunadas presentaron temperaturas rectales normales (98,0-100,9ºC) y 13 de las 22 (59,09%) yeguas control no vacunadas presentaron temperaturas rectales aumentadas (101ºC o superior).

La gravedad de la enfermedad respiratoria del VHE-1 en las yeguas control no vacunadas se indicó adicionalmente mediante las puntuaciones de exudado nasal tras la exposición. Tal como se observa en la tabla 1c, las puntuaciones de exudado nasal diarias individuales superiores o iguales a 4 son indicativas de un nivel significativo de enfermedad respiratoria. Dos de las 22 yeguas vacunadas (9,09%) y 9 de las 22 (40,09%) yeguas control no vacunadas desarrollaron este nivel de enfermedad. Esta diferencia entre la enfermedad respiratoria de las yeguas vacunadas comparado con las yeguas control es estadísticamente significativa (p<0,03).

La gravedad de la enfermedad respiratoria del VHE-1 en las yeguas control no vacunadas se indicó adicionalmente mediante las tendencias mostradas en sus recuentos leucocíticos (WBC) tras la exposición, que no se muestra. Entre el día 2 y el día 5 tras la exposición, las yeguas control no vacunadas mostraron una depresión más pronunciada de sus WBC medias que las yeguas vacunadas.

En resumen, la vacuna monovalente del VHE-1 que contenía sólo una cepa del VHE-1 mostró una protección significativa frente a la enfermedad respiratoria inducida por el VHE-1 comparado con yeguas control no vacunadas tras la exposición.

1

2

Se continuó la observación del aborto tras la exposición tras completar las observaciones respiratorias. Tal como se mencionó previamente, se colocaron aleatoriamente las yeguas en corrales con dos yeguas por corral. La selección de los compañeros de corral se basó en la compatibilidad. Se observaron las yeguas diariamente por la mañana y por la noche para detectar cualquier signo de potros. Siempre que una yegua paría un potro vivo o muerto y/o un feto abortado, se iniciaba el siguiente procedimiento.

1): En el caso de que la yegua que estaba pariendo tuviese un parto difícil, el veterinario de la granja ayudaba en el parto. Una yegua del estudio requirió asistencia.

2): Potros vivos - Cuando se descubría un potro vivo, se recogían inmediatamente muestras de sangre para estudios de aislamiento de virus de la capa leucocítica, y si era necesario, para estudios serológicos en el caso de una muerte neonatal debida al VHE-1.

3): Fetos abortados y potros muertos - Todos los fetos abortados y potros muertos se colocaron inmediatamente en la nevera de la sala de necropsia para impedir la autolisis. Todas autopsias las realizó el veterinario de la granja y el personal de investigación a cargo del proyecto. Todas las exploraciones de necropsia incluían lo siguiente: a) observaciones visuales de los órganos del potro para detectar pruebas de patología macroscópicas, b) recogida de muestras de sangre para estudios de aislamiento de virus y serológicos; y c) recogida de muestras de tejido del timo, pulmones, corazón, hígado, riñón y bazo que se colocaron en recipientes individuales que contenían o bien formalina tamponada al 10% para estudios de histopatología o bien MEME que contenía una concentración 5X de neomicina y polimicina B para aislamientos de virus.

El resumen del parto de las yeguas se muestra en las tablas 2a y 2b. Las tablas 2a y 2b incluyen la siguiente información de cada yegua preñada vacunada y no vacunada: 1) número de yegua; (2) fecha de parto de la yegua; (3) día tras la exposición en el que se produjo el parto; (4) tipo de parto experimentado por cada yegua de prueba; (5) estado de salud de los potros en el parto; y (6) causa posible de la muerte fetal y/o el virus infeccioso que contribuyó a la muerte del recién nacido. En la parte inferior de las tablas, se enumeran los intervalos y medias de los días de parto tras la exposición para cada grupo de prueba.

Dieciséis de las diecinueve yeguas vacunadas que igualaban el 84,21%, parieron potros sanos normales tras la exposición al VHE-1. Una yegua preñada vacunada tuvo problemas durante el intento de parto de un feto cercano al término en presentación transversal dorsal. El feto murió durante el parto asistido mecánicamente. Se descubrió que este recién nacido con distocia era negativo al cultivo en estudios de aislamiento viral para el virus de exposición VHE-1. Esta muerte del potro no se debió ni a la vacuna ni al virus de exposición VHE-1. Se descubrió que dos fetos de las yeguas vacunadas eran positivos para el virus VEH-1 tras la exposición. Para las yeguas control no vacunadas, 15 de 22 (68,20%) parieron potros sanos normales. Los 15 potros normales estaban libres de virus de exposición VHE-1 en el cultivo. Sin embargo, se aisló el virus VHE-1 de los tejidos de los 7 recién nacidos abortados o muertos en el grupo de control no vacunado. Por lo tanto, los vacunados mostraron una reducción del 67% en la incidencia de fetos y recién nacidos infectados con el VHE-1 comparado con yeguas control no vacunadas. Esto demuestra claramente la eficacia de la vacuna monovalente del VHE-1 con respecto a la protección de yeguas preñadas frente al aborto.

Esto demostró que la vacuna del VHE-1 monovalente efectuó una reducción en la enfermedad respiratoria provocada por el VHE-1 en yeguas vacunadas comparado con yeguas control no vacunadas. Además, la vacuna del VHE-1 monovalente efectuó una reducción en el aborto o muerte en recién nacidos de yeguas preñadas vacunadas comparado con yeguas preñadas control no vacunadas en un estudio de vacunación/exposición usando el VHE-1 como virus de exposición.

TABLA 2a Resumen de partos para 19 yeguas preñadas vacunadas con monovalente del EHV-1 tras la inoculación por exposición intranasal con virus VHE-1 de subtipo 1

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La media de días tras la exposición para el parto fue de 58, el intervalo varió desde 16 hasta 87 días. Los abortos/muertes debidos al VHE-1 fueron 2/19 o el 10,5%.

Potros normales: 16/19 (84,2%).

TABLA 2b Resumen de partos para 22 yeguas control no vacunadas tras la inoculación por exposición intranasal con virus VHE-1 de subtipo 1

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6

La media de días tras la exposición para el parto fue 56, el intervalo varió desde 20 hasta 83 días. Los abortos/muertes debidas al VHE-1 fueron 7/22 (31,8%).

Potros normales: 15/22 (68,2%).

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Ejemplo 2

Se probó EHV-1 MHD 91-001 en serie tal como se describió en el ejemplo 1 en un estudio de vacunación/exposi-
ción para detectar su capacidad de proteger animales recién destetados seronegativos jóvenes frente a la enfermedad respiratoria provocada por VHE-4. Se usaron en este estudio veinte caballos recién destetados no tratados seronegativos para VHE-1 y VHE-4. Se parieron y se mantuvieron aislados todos los caballos, y por tanto no tuvieron exposición previa ni al VHE-4 ni al VHE-1. Un mes antes de la primera vacunación y en el día de la primera vacunación, se sacó sangre a todos los animales recién destetados para confirmar que eran todos seronegativos. Se vacunaron diez de los animales recién destetados con una dosis de 1 ml de una vacuna monovalente del VHE-1 EHV-1 MHD 91-001. Veintiocho días tras la primera vacunación se administró una dosis de refuerzo de 1 ml a los animales recién destetados vacunados. A los catorce días tras el refuerzo se expusieron todos los animales recién destetados con una cepa del VHE-4 heteróloga denominada T446. Se observaron todos los animales recién destetados para detectar signos clínicos de enfermedad respiratoria del VHE-4 durante 11 días tras la exposición. Se expuso cada animal recién destetado con 10^{4,0} DICT_{50} del virus VHE-4 usando el nebulizador descrito
anteriormente.

Se indicaron los signos clínicos de la enfermedad respiratoria mediante la observación de exudados nasales y una temperatura elevada. Se puntuaron los exudados nasales diariamente mediante un único individuo para mantener la coherencia de las observaciones. Se asignaron grados de puntuación de 0 a 6 basándose en la gravedad de la enfermedad. Se determinó que una puntuación de 4 o superior era indicativa de enfermedad respiratoria significativa. Adicionalmente, se sacaron muestras de sangre la para evaluación del recuento de WBC y respuestas de titulaciones serológicas y se tomaron muestras por hisopo nasal para aislamientos de virus.

En las tablas 3a y 3b se muestran los resultados del aislamiento de virus y exudado nasal y en la tabla 4 se enumeran los resultados serológicos. Las respuestas de temperatura fueron significativas así como los recuentos de leucocitos. Esto no es extraño para la enfermedad respiratoria asociada con el VHE-4.

Hubo una diferencia en la emisión del virus tal como se determinó mediante aislamientos de virus a partir de hisopos nasales (tabla 3a). Un número medio de 6,7 controles no vacunados emitieron el virus en sus exudados nasales a lo largo del periodo de 11 días tras la exposición mientras que un número medio de 3,4 vacunados emitieron el virus. Esto fue una reducción del 52% en la emisión del virus.

La diferencia en las puntuaciones de exudados nasales entre vacunados y controles no vacunados era estadísticamente significativa (tabla 3b). El ochenta por ciento de los animales control no vacunados mostraron puntuaciones de exudados nasales >4 que indican enfermedad respiratoria grave mientras que sólo el 20% de los animales vacunados mostraron puntuaciones de exudados nasales >4. Esto representa una reducción del 75% de la enfermedad respiratoria en los vacunados. Es de incluso mayor importancia el hecho de que los vacunados mostraron sólo 2 días de puntuaciones de exudados nasales >4 mientras que los controles no vacunados mostraron 10 días de puntuaciones de exudados nasales >4.

La tabla 4 muestra la respuesta serológica (titulación de neutralización en suero), de los animales recién destetados tras la vacunación, el día del refuerzo, el día de la exposición y 14 días tras la exposición. Como prueba de que no hubo exposición previa o bien al VHE-4 o bien al VHE-1 antes de la exposición, los controles no vacunados se mantuvieron seronegativos para ambos subtipos del virus. Todos los animales recién destetados mostraron titulaciones serológicas positivas frente al VHE-4 tras la exposición. A diferencia de informes de otros científicos, todos los animales recién destetados vacunados excepto uno desarrollaron titulaciones de neutralización en suero frente al VHE-1 así como frente al VHE-4 como resultado de o bien la primera o bien la segunda vacunación. Esto confirma que esta vacuna monovalente del VHE-1 es eficaz para producir respuestas serológicas tanto frente al VHE-1 como frente al
VHE-4.

El descenso general de las titulaciones de neutralización en suero frente al VHE-1 y al VHE-4 14 días tras la inoculación por exposición sugiere que el virus de exposición VHE-4 es neutralizante frente a los anticuerpos tanto del VHE-1 como del VHE-4 que se desarrollaron mediante la vacuna del VHE-1 monovalente.

En resumen, se ha demostrado que la vacuna del VHE-1 monovalente de esta invención produce protección frente una exposición respiratoria del VHE-4 y produce una respuesta serológica tanto frente al VHE-1 como frente al VHE-4 en caballos recién destetados que no se expusieron previamente a ningún subtipo del virus.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Claims

1. Una vacuna de VHE-1 monovalente que proporciona protección frente a enfermedades asociadas con el VHE-1 y el VHE-4 que comprende un virus VHE-1 representado por la cepa AB69 que se denomina ATCC VR-2581.

2. La vacuna según la reivindicación 1 que proporciona protección frente a la enfermedad respiratoria provocada tanto por VHE-1, VHE-4 como por una combinación de los mismos.

3. Un procedimiento de preparación de una vacuna según la reivindicación 1, que comprende las etapas de

a.: infectar una línea celular susceptible con un virus VHE-1 que comprende un virus VHE-1 representado por la cepa AB69 o su equivalente que se denomina ATCC VR-2581;

b.: dejar crecer dicho virus VHE-1 en un medio de apoyo al crecimiento hasta que se produce un ECP significativo;

c.: recoger dicho medio de apoyo al crecimiento que contiene dicho virus VHE-1, células muertas, residuos celulares y células infectadas para producir un material recogido;

d.: inactivar dicho material recogido con un agente de inactivación adecuado; y

e.: añadir adyuvantes a dicho material recogido inactivado.

4. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicha línea celular es una línea celular equina.

5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicha línea celular equina se selecciona del grupo que consiste en una línea celular dérmica equina, una línea celular renal equina y una línea celular pulmonar fetal equina.

6. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que el agente de inactivación se selecciona del grupo que consiste en beta-propiolactona, formalina y etilenimina binaria.

7. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en Havlogen.RTM, Carbopol 934P.RTM, Polygen.TM, copolímeros en bloque, polímeros, aceites, sales de aluminio, citocinas, inmunomoduladores y combinaciones de los mismos.

8. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que se añade un estabilizante a la vacuna.

9. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que se purifica dicho material recogido antes de la inactivación.

10. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicha purificación comprende filtración, ultrafiltración, cromatografía en columna o combinaciones de las mismas.

11. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que se concentra dicho material recogido antes de la inactivación.