CN1228029A - 交叉保护性马疱疹病毒制品及其制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本文公开了一种EHV－1疫苗以及该疫苗的制备和使用方法，该疫苗对与EHV－1和EHV－4有关的疾病提供保护作用。
Description
本发明涉及一种马疱疹病毒制品，该制品能对由1型马疱疹病毒引起的流产和呼吸疾病以及由4型马疱疹病毒引起的呼吸疾病提供保护作用。更为具体地说，本发明涉及一种有效的疫苗及其制备和使用方法。
发明背景
马的流产和马鼻肺炎是由于1型马疱疹病毒(EHV-1)和2型马疱疹病毒引起的常见病。目前由于已确定2型马疱疹病毒的分子结构与EHV-1存在显著性差别而将其命名为EHV-4。EHV-1是造成呼吸疾病的主要原因。由于幼马的各种亚型的EHV而引起了呼吸疾病，其结果使这些马参于竞争的能力丧失或受到削弱，从而造成了经济上的损失。怀孕母马的感染所造成的经济损失的原因在于其流产。中枢神经系统综合征也与EHV-1有关，这种疾病的发展是由逐步的瘫痪变为完全瘫痪，而且在某些情况下导致死亡。
由于EHV-1和EHV-4之间缺乏同源性，因此有人提议只有含有EHV-1和EHV-4亚型的马疱疹病毒疫苗才可防止流产和各类呼吸疾病。事实上，美国专利4,083,958描述了一种仅对由EHV-1引起的流产和呼吸疾病有保护作用的马疱疹病毒疫苗。它没有声明对由EHV-4引起的呼吸疾病具有保护作用。美国专利5,084,271报导，如果使马驹接受EHV-1，不管该EHV-1是活的还是被灭活的，都会产生一种仅对EHV-1有反应的抗体。如果使马驹接受EHV-4，则对EHV-1和EHV-4都产生血清应答。但是，它没有表明对于攻击具有实际上的保护作用。后者的专利要求一种有效的疫苗必须是单独含有EHV-4或同时含有EHV-1和EHV-4。因此，可以预期单价的EHV-1疫苗对于EHV-1和EHV-4呼吸综合症以及由EHV-1引起的流产没有保护作用。
发明概述
本发明包括一种被命名为AB69的亚型1马疱疹病毒(EHV-1)株或它的等效株，该株可用于制备能诱导产生对EHV-1和EHV-4具有保护性免疫反应的抗原。本发明还包括制备一种含有AB69的单价疫苗，该疫苗可用于对年幼的马驹、成年马或怀孕母马进行接种以提供对由于EHV-1或EHV-4引起的呼吸疾病的保护作用，以及提供对由于EHV-1引起的流产的保护作用。
本发明进一步包括一种制备和使用该制品对马进行保护的方法。可以预想本发明的疫苗制品还能提供对由EHV-1引起的中枢神经系统疾病的保护作用。
在本发明实施方式中，本发明包括制备这种单价EHV-1疫苗的方法，该方法通过下列步骤进行：在连续的细胞培养物上繁殖AB69株或其等效株、收集并通过除去病毒上清中的细胞碎片而进行纯化、浓缩、化学方法灭活和使用佐剂，下文对此进行更为全面地描述。
发明详述
如上所述，本发明涉及一种EHV-1病毒，如果将这种病毒制成某种制品如疫苗并用它对马进行非肠道给药，则会给所有马提供对与EHV-1和EHV-4有关的疾病的保护作用。更为具体地说，所公开的EHV-1疫苗保护怀孕母马免于由EHV-1引起的流产，保护马免于由EHV-1或EHV-4引起的呼吸疾病，并且降低由EHV-1引起的中枢神经系统疾病的发病率。用于制备这种疫苗的EHV-1病毒株是在攻击研究过程中从被感染的流产胎的肺组织分离出来的。已将命名为AB69的该分离物保藏于ATCC，保藏号为＿＿。使该病毒在马的皮肤细胞系上传代两次而建立一种主接种物。该病毒可在允许其复制到足够水平的敏感细胞系中生长，以提供免疫致敏足够的抗原物质，从而产生对EHV-1和EHV-4的保护作用。以下对复制病毒及以其制备疫苗的方法进行非限制性地和例证性地描述。
该方法包括以下步骤：1)用EHV-1病毒感染敏感细胞系；2)使所述的EHV-1病毒在支持生长的培养基中进行生长直至产生显著的细胞病变效应(CPE)；3)收集所述的含有所述EHV-1病毒、死细胞、细胞碎片和被感染细胞的支持生长的培养基而得到收集物质；4)采用合适的灭活剂对所述的收集物质进行灭活；和5)在所述的被灭活的收集物质中加入佐剂。该敏感细胞系优选来源于马，更优选来源于马皮肤细胞系、马肾细胞系或马胎的肺细胞系。将该细胞系用于使EHV-1株生长至高滴度。可使该细胞系作为一种悬浮培养物在扁瓶、滚瓶或生物反应器中或在微载体珠上生长，使用有助于细胞快速生长的任何培养基和血清。优选的培养基为加有谷氨酰胺和非必需氨基酸的Earle’s或Hank’s极限必需培养基(分别为MEME和MEMH)。优选的用于细胞生长的血清为胎马、胎牛或牛犊的血清。使该细胞系生长至汇合，接着用EHV-1病毒感染该细胞系，所用感染复数(MOI)为在每毫升的培养基中产生最大的感染病毒粒子产量。优选的MOI介于0.0001到0.1之间。使被感染的细胞系生长至这些细胞显示出显著的细胞病变效应(CPE)。将显著的CPE定义为＞80％的细胞被破坏，在显微镜下可见死亡细胞从微载体珠生长容器的表面脱落。通过以下方法收集含有被感染细胞、死亡细胞、细胞碎片和EHV-1的培养基：将该培养基从其生长的容器中移出，并将其转移到储存罐如水箱或袋中。通过过滤或离心除去细胞和细胞碎片而将该收集物质纯化，接着通过超滤、超速离心分离或柱色谱法将上清液浓缩。通过向该浓缩的液体中加入保持病毒抗原性的任何灭活剂而将其灭活。优选的灭活剂为β-丙内酯、福尔马林或二元氮丙啶。可向该被灭活的液体中加入防腐剂如乙基汞硫代水杨酸钠。在灭活之后，向该被灭活的物质中加入佐剂。可用任何数量的佐剂，它包括但不限于Carbopol 934P、Havlogen、PolygenTM、嵌段共聚物、聚合物、油、铝盐如氢氧化铝和磷酸铝、细胞因子、免疫调节剂以及它们的组合物。在加入佐剂之后，可以加入稳定剂如甘油/EDTA以改善抗原的稳定性。
本领域技术人员认识到：一旦病毒可以如上所述进行繁殖，则可以通过本领域中公知的方法如从病毒中提取而获得它们的包括亚单位的衍生物。而且，可以在分子水平鉴定该保护性抗原并采用重组技术来对该抗原进行复制和表达。
通过以下实施例来对本发明进行进一步地解释，但这并不意味着本发明限于这些实施例，其中除非特别说明，所有的份数和百分数都以重量计。
实施例
实施例1
在1750cm2的滚瓶中采用MEME+10％的胎牛血清使马的皮肤细胞系生长至大约有90％发生汇合。用命名为AB69的EHV-1株感染汇合细胞并将其转移到含有非必需氨基酸、谷氨酰胺、硫酸新霉素和(多粘菌素)的(MEME)中。将被感染的细胞培养物在37℃下培养三至六天或直至产生90-95％的CPE，接着将这些细胞和液体在无菌条件下收集到单一容器中。然后通过5μ滤器过滤使该收集物质澄清，并通过100,000MW柱体超滤而浓缩五倍。通过以下步骤对被浓缩的液体进行灭活：将pH调整至8.0至8.3，加入β-丙内酯至终浓度在0.05％到0.15％之间，并在37℃下温育三至六小时，在此期间用10N的NaOH调节pH在6.8到7.2之间。后一温育使β-丙内酯发生水解。在灭活结束后，向该液体中加入佐剂Havlogen，加入乙基汞硫代水杨酸钠作为防腐剂而完成疫苗的生产。将这种方法生产的疫苗命名为EHV-1 MHD 91-001。
进行疫苗接种/攻击研究以确定EHV-1 MHD 91-001是否能保护怀孕母马免于EHV-1呼吸疾病和由马疱疹病毒引起的流产。在这项研究中，将45只处在第二个三月怀孕期(平均在怀孕的第5个月)的母马分成两组。将有22只怀孕母马的组命名为非疫苗接种对照组。对有23只怀孕母马的第二组用2.0ml的EHV-1 MHD-91-001在其怀孕的第5、7和9个月进行疫苗接种。就呼吸攻击而言，由于有一只母马经过攻击在其背脊脱臼和断裂之后而死亡，因而疫苗接种组只有22只母马。就流产攻击而言，在该攻击期的末期疫苗接种组仅有19只怀孕母马(一只母马在该研究的早期流产，该母马被攻击后在其背脊脱臼和断裂之后而死亡，而已知有两只母马在该试验开始时是开放的，它们是在疫苗接种的第一天被随机指定为疫苗接种组的)。
对所有的母马攻击(不管它们是否怀孕，没有怀孕的母马仍可被用于呼吸攻击)。在攻击前用购自Bayer公司的Rompun给这些母马服用以镇静。接着用早期传代AB69以大约105.0TCID50的剂量率对每一只母马进行攻击。采用一种喷雾器将该攻击物带入鼻内，该喷雾器可产生将这些病毒推入肺中的微细气雾剂。在以前的攻击效价研究中已证实这些攻击病毒和攻击过程可在怀孕母马上产生流产和呼吸疾病。
经过攻击，将所有的母马置于封闭的围栏中，其中可见它们具有呼吸疾病和流产的迹象。为了检测对于呼吸疾病的保护作用，在母马被攻击后对其进行11天的观察和取样。每天对所有母马进行攻击后的观察，包括对呼吸疾病的临床症状进行评估和打分，这些临床症状包括鼻排泄物(流出物)和升高的直肠温度。而且每天要进行血液取样。测定白细胞计数并尝试在每天的血样本中分离得到的暗黄色层上进行病毒的分离。同时，在每一个检测日，用置于输送介质中的拭子对每一只母马的鼻通道进行拭抹而尝试进行后者的病毒分离。为检测对流产的保护作用，以EHV-1为指标对所有的活马驹、死马驹和流产的胎进行分析。收集血样品和尸检组织样品以尝试进行病毒的分离。呼吸评估的结果如表1a、1b和1c所示。流产评估的结果如表2所示。
如表1a所示，接种疫苗的母马与没有接种疫苗的对照母马相比，显示出鼻流出物中排出的病毒减少了96.1％。在EHV-1气雾剂攻击接种之后，从接种疫苗者收集的鼻拭子上回收EHV-1病毒时，在242个中只有2个(9.826％)有病毒。同时，从没有接种疫苗的对照母马收集得到的拭子中回收EHV-1病毒时，在242个有51个(21.07％)有病毒。
如表1b所示，在攻击后的第二天的观察中，接种疫苗的母马在被攻击后的温度反应明显小于对照母马。在该天，所有的被接种者表现出正常的直肠温度(98.0-100.9℃)，而22只没有接种疫苗的对照母马中，有13只(59.09％)直肠温度升高(大于或等于101℃)。
在没有接种疫苗的对照母马中EHV-1呼吸疾病的严重性进一步地由它们被攻击后的鼻分泌物评分来表示。如表1c所示，如果个体每天的鼻流出物得分大于或等于4，则表示呼吸疾病的程度显著。22只接种疫苗的母马中的2只(9.09％)和22只没有接种疫苗的对照母马中的9只(40.09％)达到了这种疾病程度。接种疫苗的母马与对照母马相比，呼吸疾病的差别具有统计学意义上的显著性(p＜0.03)。
在没有接种疫苗的对照母马中EHV-1呼吸疾病的严重性进一步地由它们被攻击后所显示的白细胞计数(WBC)的趋势来表示，所述的白细胞计数(WBC)未列出。在被攻击后的第2到第5天之间，没有接种疫苗的对照母马比接种疫苗的母马表现出更显著地降低它们的平均WBCs。
总之，与没有接种疫苗的母马相比，仅含有一种EHV-1株的EHV-1单价疫苗在攻击后表现出对EHV-1诱导的呼吸疾病具有显著的保护作用。
表1a EHV-1呼吸疾病-从鼻拭子中进行的病毒分离
| 攻击后的天数攻击后的观察日内的病毒排放数 | |||||||||||||||
| 组 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 攻击后的天数/总天数 |
| 接种疫苗者 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2/242* |
| 对照组 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8 | 7 | 7 | 12 | 6 | 6 | 4 | 0 | 1 | 0 | 51/242* |
*可观察的数目
表1b EHV-1呼吸疾病-温度高于101°F
| 攻击后的天数每天温度高于101°F的母马数目 | |||||||||||||||
| 组 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 攻击后天数/在第2*天的总数 |
| 接种疫苗者 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0/22 |
| 对照组 | 0 | 0 | 0 | 0 | 13 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 13/22 |
*在攻击后的第2天和第3天升高的温度作为临床症状的指标
表1c EHV-1呼吸疾病-鼻流出物得分＞4
| 攻击后的天数每天鼻排出物得分＞4的母马数目 | |||||||||||||||
| 组 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | ＞4*的数目/母马总数 |
| 接种疫苗者 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2/22 |
| 对照组 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 3 | 2 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 8/22 |
鼻排出物得分大于或等于4的不同母马数目代表具有显著的疾病临床症状。
在对呼吸观察结束后继续观察攻击后的流产。如前所述，将母马随机地置于围栏内，每个围栏内有两只母马。围栏配偶的选择是根据相容性进行的。每天在早上和晚上观察这些母马的怀驹症状。不管母马怀的是活驹、死驹还是流产的胎，都着手进行以下的步骤：
1)如果母马分娩有困难，则让农场兽医帮助分娩。本研究中有一只母马需要帮助。
2)活马驹-发现活马驹时，立即收集血样品以进行棕黄色层病毒分离的研究，如果需要，当由于EHV-1而引起新生驹死亡时，进行血清学研究。
3)流产的胎和死驹-立即将所有流产的胎和死驹放置在尸检室冷藏库以阻止其自溶。由农场兽医进行所有死后的检查而研究工作人员则负责该项目。尸检包括：a)肉眼观察马驹的器官以获得总体病理学证据；b)收集血样品以进行血清学和病毒分离研究；和c)从胸腺、肺、心脏、肝脏、肾和脾中收集组织样品，将这些样品置于各个含有10％缓冲的福尔马林的容器中以进行组织病理学研究，或在含有5X浓度的新霉素和多链丝霉素B的MEME中以进行病毒分离。
母马分娩的总结如表2a和2b所示。表2a和2b包括以下源自每只接种疫苗的和没有接种疫苗的怀孕母马的信息：1)母马数；2)母马日历上的怀驹日期；3)攻击后发生分娩的日期；4)每只受试母马所经历的分娩类型；5)分娩期胎儿的健康状况；6)胎儿死亡的可能原因和/或造成胎儿死亡的感染性病毒。在该表的底部列出了每个受试组被攻击后的范围和平均分娩天数。
19只中的16只即84.21％的怀孕的接种疫苗的母马在被EHV-1攻击后分娩出正常健康的胎儿。一只接种疫苗的母马在尝试以背部横产式分娩临近足月的胎儿期间发生了问题。在采用机械辅助分娩的过程中胎儿发生死亡。在病毒分离研究中发现该难产胎儿EHV-1攻击病毒培养为阴性。该马驹的死亡既不是由于疫苗也不是由于EHV-1攻击病毒。已发现在攻击后有两个接种疫苗的母马的胎儿EHV-1病毒为阳性。就没有被疫苗病毒接种的对照母马而言，22只中的15只(68.20％)分娩出正常健康的马驹。所有15只正常的马驹培养不出EHV-1攻击病毒。但是，在没有接种疫苗的对照组中的所有7个流产或死亡的胎儿的组织上分离出了EHV-1病毒。因此，接种疫苗者与没有接种疫苗的对照母马相比，被EHV-1感染的胎儿和新生幼马的发生率减少了67％。这就清楚地证明了EHV-1单价疫苗的功效涉及保护怀孕的母马免于流产。
这表明与没有接种疫苗的对照母马相比，单价EHV-1疫苗有效减少了由于被接种的母马身上的EHV-1引起的呼吸疾病。而且，在采用EHV-1作为攻击病毒进行疫苗接种/攻击研究中，与没有接种疫苗的对照母马相比，单价EHV-1疫苗有效减少了接种疫苗的母马的新生幼马的流产和死亡。
表2a 19只接种EHV-1单价疫苗的怀孕母马在被亚型1
EHV-1病毒进行鼻内攻击接种后的分娩总结
| 母马号 怀驹日期 攻击后的 分娩的类 马驹分娩 死亡的原天数 型 的状况 因 | |||||
| 804 | 3-4-92 | 16 | 异常 | 死亡 | 难产 |
| 814 | 3-12-92 | 24 | 流产 | 死亡 | EHV-1 |
| 837 | 3-27-92 | 39 | 流产 | 死亡 | EHV-1 |
| 798 | 3-31-92 | 43 | 正常 | 存活 | N/A |
| 832 | 4-5-92 | 48 | 正常 | 存活 | N/A |
| 860 | 4-10-92 | 53 | 正常 | 存活 | N/A |
| 833 | 4-11-92 | 54 | 正常 | 存活 | N/A |
| 818 | 4-13-92 | 56 | 正常 | 存活 | N/A |
| 803 | 4-14-92 | 57 | 正常 | 存活 | N/A |
| 807 | 4-16-92 | 59 | 正常 | 存活 | N/A |
| 835 | 4-18-92 | 61 | 正常 | 存活 | N/A |
| 824 | 4-19-92 | 62 | 正常 | 存活 | N/A |
| 812 | 4/25/92 | 68 | 正常 | 存活 | N/A |
| 862 | 4/27/92 | 70 | 正常 | 存活 | N/A |
| 815 | 4/29/92 | 72 | 正常 | 存活 | N/A |
| 799 | 5-4-92 | 77 | 正常 | 存活 | N/A |
| 813 | 5-5-92 | 78 | 正常 | 存活 | N/A |
| 834 | 5-7-92 | 80 | 正常 | 存活 | N/A |
| 826 | 5-14-92 | 87 | 正常 | 存活 | N/A |
攻击后怀驹的平均天数为58，其范围变化为从16到87天。由于EHV-1引起的流产/死亡为2/19或10.5％。
正常马驹：16/19(84.2％)
表2b 22只没有接种疫苗的对照母马在被亚型1 EHV-1
病毒进行鼻内攻击接种后的分娩总结
| 母马号 怀驹日期 攻击后的 分娩的类 马驹分娩 死亡的原天数 型 的状况 因 | |||||
| 830 | 3-8-92 | 20 | 流产 | 死亡 | EHV-1 |
| 845 | 3-14-92 | 26 | 流产 | 死亡 | EHV-1 |
| 831 | 3-15-92 | 27 | 流产 | 死亡 | EHV-1 |
| 817 | 4-3-92 | 46 | 正常 | 存活 | N/A |
| 825 | 4-4-92 | 47 | 正常 | 存活 | N/A |
| 819 | 4-9-92 | 52 | 正常 | 存活 | N/A |
| 741 | 4-10-92 | 53 | 正常 | 存活 | N/A |
| 801 | 4-10-92 | 53 | 正常 | 存活 | N/A |
| 838 | 4-10-92 | 53 | 正常 | 存活 | N/A |
| 796 | 4-11-92 | 54 | 流产 | 死亡 | EHV-1 |
| 809 | 4-11-92 | 54 | 正常 | 存活 | N/A |
| 752 | 4-12-92 | 55 | 流产 | 死亡 | EHV-1 |
| 822 | 4-12-92 | 55 | 正常 | 存活 | N/A |
| 861 | 4-13-92 | 56 | 正常 | 存活 | N/A |
| 802 | 4-15-92 | 58 | 流产 | 死亡 | EHV-1 |
| 836 | 4-20-92 | 63 | 正常 | 存活 | N/A |
| 811 | 4-23-92 | 67 | 正常 | 存活 | N/A |
| 858 | 4-26-92 | 69 | 正常 | 存活 | N/A |
| 842 | 5-1-92 | 77 | 正常 | 存活 | N/A |
| 828 | 5-4-92 | 74 | 流产 | 死亡 | EHV-1 |
| 859 | 5-13-92 | 86 | 正常 | 存活 | N/A |
| 857 | 5-15-92 | 88 | 正常 | 存活 | N/A |
攻击后怀驹的平均天数为56，其范围变化为从20到83天。由于EHV-1引起的流产/死亡为7/22(31.8％)。
正常马驹：15/22(68.2％)
实施例2
在接种/攻击研究中，对实施例1所述的一系列EHV-1 MHD 91-001进行试验，试验其保护年幼的血清反应为阴性的刚断奶幼马免于由EHV-4引起的呼吸疾病的能力。本研究中采用了20只EHV-1和EHV-4血清反应阴性的刚断奶的小幼马。所有的马都怀驹并将其保持隔离，这样使这些马先前不接触EHV-4或EHV-1。在第一次接种前的一个月和第一次接种的那天，对所有刚断奶幼马进行放血以确认所有的马都为血清反应阴性。用1ml剂量的EHV-1单价疫苗EGV-1 MHD 91-001对这些幼马中的10只进行疫苗接种。在第一次接种后28天给予这些接种疫苗的刚断奶幼马1ml的加强剂量。在加强免疫14天以后，用异种的被命名为T446的EHV-4株对所有的幼马进行攻击。在攻击后对所有刚断奶幼马的EHV-4呼吸疾病的临床症状进行为期11天的观察。采用前述的喷雾器用104.0TCID50的EHV-4病毒对每只刚断奶幼马进行攻击。
对鼻流出物和升高的温度的观察指示呼吸疾病的临床症状。通过每天对单一个体鼻流出物进行打分以保持观察的连续性。根据疾病的严重性指定记分的等级为0到6。检测出大于或等于4的得分表明具有显著的呼吸疾病的征兆。另外，提取血样品进行WBC计数和血清学效价反应的评估，取出鼻拭子样品进行病毒分离。
病毒分离和鼻流出物的结果如表3a和3b所示，而在表4中列出血清学结果。温度反应与白细胞计数一样都很显著。这种现象在与EHV-4有关的呼吸疾病中不常见。
正如从鼻拭子中通过病毒分离所检测的，病毒排出存在差异(表3a)。平均有6.7个没有接种疫苗的对照母马在攻击后的11天期间内在它们的鼻流出物中排出病毒，而平均有3.4个接种疫苗者排出病毒。这在病毒的排出上减少了52％。
接种疫苗和没有接种疫苗的对照组之间的鼻排出物得分的差异具有统计学意义上的显著性(表3b)。百分之八十的没有接种疫苗的对照组动物表现出鼻流出物得分＞4，这指示为严重的呼吸疾病，而只有20％的接种疫苗的动物表现出鼻流出物的得分＞4。这表明接种疫苗者的呼吸疾病减少了75％。更为重要的是，被接种者仅有2天表现出鼻流出物得分＞4，而没有接种疫苗的对照组则有10天表现出鼻流出物得分＞4。
表4表示了在接种后、加强免疫的当天、在进行攻击的当天和进行攻击后14天刚断奶幼马的血清学反应(血清中和滴度)。作为攻击前未曾预先接触EHV-4或EHV-1感染的证据，未接种的对照组对两种病毒亚型的血清学反应均为阴性。所有的刚断奶幼马在攻击后表现出EHV-4阳性血清滴度。与其它科学家的报告不同的是，在所有的接种疫苗的刚断奶幼马中，除了一个以外，其余在第一次或第二次接种后都产生了对EHV-1和EHV-4的血清中和滴度。这种现象证实EHV-1单价疫苗可以对EHV-1和EHV-4都产生血清反应。
在攻击接种后14天一般发生EHV-1和EHV-4血清中和滴度的降低，这种现象提示EHV-4攻击病毒中和了由单价EHV-1疫苗产生的EHV-1和EHV-4的抗体。
总之，已证明本发明的单价EHV-1疫苗产生了对EHV-4呼吸攻击的保护作用，并且在刚断奶幼马上产生了对EHV-1和EHV-4的血清反应，而这些刚断奶幼马并没有与任何一种病毒亚型预先接触。
表3a EHV-4呼吸疾病-从鼻拭子中分离病毒
| 攻击后的天数攻击后每天排出病毒的刚断奶幼马数目 | |||||||||||||||
| 组 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 分离出病毒的平均动物数 |
| 接种疫苗者 | 0 | 0 | 0 | 5 | 5 | 5 | 3 | 3 | 1 | 4 | 4 | 1 | 2 | 0 | 3.4 |
| 对照组 | 0 | 0 | 0 | 9 | 6 | 6 | 10 | 9 | 9 | 7 | 7 | 3 | 8 | 0 | 6.7 |
接种疫苗者分离出病毒的平均天数＝3.4(30.9％)
没有接种疫苗的对照组分离出病毒的平均天数＝6.7(60.9％)
分离出病毒的平均天数减少了50％。
表3b EHV-1呼吸疾病-鼻流出物得分＞4
80％的没有接种疫苗的对照组表现出显著的鼻流出物得分，20％的接种疫苗者表现出显著的鼻流出物得分。
| 攻击后的天数每天鼻流出物得分＞4的刚断奶幼马数目 | |||||||||||||||
| 组 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | ＞4*的刚断奶幼马总数 |
| 接种疫苗者 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2/10 |
| 对照组 | 0 | 0 | 0 | 1 | 4 | 1 | 6 | 5 | 3 | 3 | 1 | 2 | 4 | 0 | 8/10 |
表4a & 4b在疫苗接种之前和之后以及在用EHV-4病毒攻击接种之前和之后所收集的对10个接种疫苗者和10个没有接种疫苗的对照的刚断奶幼马所记录的EHV-1和EHV-4血清中和滴度
表4a
| 受试病 疫苗号 V1之前 V2之前 攻击日 攻击后 对照号 V1之前 V2之前 攻击日 攻击后毒 14天 14天 | ||||||||||
| EHV-1 | 1011 | ＜2 | ＜2 | 5 | 4 | 1007 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | ＜2 |
| 1012 | ＜2 | ＜2 | 3 | 3 | 1010 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | |
| 1017 | ＜2 | 8 | 6 | 2 | 1014 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | |
| 1018 | ＜2 | 3 | 9 | 6 | 1015 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | |
| 1021 | ＜2 | ＜2 | 10 | 6 | 1016 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | |
| 1023 | ＜2 | ＜2 | 7 | 6 | 1025 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | |
| 1024 | ＜2 | 3 | 21 | 9 | 1027 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | |
| 1029 | ＜2 | ＜2 | 5 | 3 | 1028 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | |
| 1030 | ＜2 | 2 | 32 | 16 | 1032 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | |
| 1037 | ＜2 | ＜2 | 22 | 10 | 1033 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | |
| GMT | ＜2 | 2 | 9 | 5 | GMT | ＜2 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | |
GMT＝几何平均滴度
V1＝疫苗接种1；V2＝疫苗接种2
表4b
| 受试病 疫苗号 V1之前 V2之前 攻击日 攻击后 对照号 V1之前 V2之前 攻击日 攻击后毒 14天 14天 | ||||||||||
| EHV-4 | 1011 | ＜2 | ＜2 | 32 | 24 | 1007 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | 5 |
| 1012 | ＜2 | ＜2 | 7 | 4 | 1010 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | 4 | |
| 1017 | ＜2 | 4 | 13 | 5 | 1014 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | |
| 1018 | ＜2 | 3 | 29 | 14 | 1015 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | 4 | |
| 1021 | ＜2 | 3 | 48 | 12 | 1016 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | 4 | |
| 1023 | ＜2 | 3 | 197 | 6 | 1025 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | 6 | |
| 1024 | ＜2 | 3 | 11 | 11 | 1027 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | 4 | |
| 1029 | ＜2 | ＜2 | 6 | 4 | 1028 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | 2 | |
| 1030 | ＜2 | 2 | 37 | 16 | 1032 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | 6 | |
| 1037 | ＜2 | ＜2 | 15 | 11 | 1033 | ＜2 | ＜2 | ＜2 | 6 | |
| GMT | ＜2 | 2 | 18 | 9 | GMT | ＜2 | ＜2 | ＜2 | 6 | |
GMT＝几何平均滴度
V1＝疫苗接种1；V2＝疫苗接种2
以上描述了本发明，但显然本发明可以有多种方式的改变。不应将这些改变视为脱离了本发明的实质和范围，所有这些改变内容均应视为包括在以下权利要求的范围之内。
Claims (14)
1.一种单价的EHV-1疫苗，对与EHV-1和EHV-4有关的疾病提供保护作用。
2.根据权利要求1的疫苗，提供对EHV-1、EHV-4或它们的组合所造成的呼吸疾病的保护作用。
3.根据权利要求1的疫苗，含有被命名为AB69的EHV-1株或等效株。
4.一种用于制备权利要求1的疫苗的方法，包括以下步骤：
a.用EHV-1病毒感染敏感细胞系；
b.使所述的EHV-1病毒在支持生长的培养基中生长直至产生显著的CPE；
c.收集所述含有EHV-1病毒、死细胞、细胞碎片和被感染细胞的支持生长的培养基以得到收集物质；
d.采用合适的灭活剂使所述的收集物质灭活；并
e.在所述的经灭活的收集物质中加入佐剂。
5.根据权利要求4的方法，其中所述的细胞系为马细胞系。
6.根据权利要求5的方法，其中所述的马细胞系选自马的皮肤细胞系、马的肾细胞系和马胎的肺细胞系。
7.根据权利要求4的方法，其中灭活剂选自β-丙内酯、福尔马林和二元氮丙啶。
8.根据权利要求4的方法，其中佐剂选自Havlogen、Carbopol934P、PolygenTM、嵌段共聚物、聚合物、油、铝盐、细胞因子、免疫调节剂及其组合。
9.根据权利要求4的方法，其中在该疫苗中加入稳定剂。
10.根据权利要求4的方法，其中在灭活之前对所述的收集物质进行纯化。
11.根据权利要求10的方法，其中所述的纯化包括过滤、超滤、柱色谱或它们的组合。
12.根据权利要求4的方法，其中在灭活之前对所说的收集物质进行浓缩。
13.一种用于保护马免于与EHV-1、EHV-4或它们的组合有关的疾病的方法，包括给予马一种权利要求1中所述的疫苗。
14.一种用于保护马免于与EHV-1、EHV-4或它们的组合有关的疾病的方法，包括给予马一种权利要求3中所述的疫苗。
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