KR102038364B1 - 소 로타바이러스 감염증 예방용 약독화 혼합생백신 조성물 - Google Patents

소 로타바이러스 감염증 예방용 약독화 혼합생백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 소 로타바이러스(Bovine Rotavirus, BRV) 감염증 예방용 약독화 혼합생백신 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 국내에서 다발하고 있는 소 로타바이러스 분리주들의 약독화주를 이용하여 G5, G6, G8, P[1], P[7]의 유전형 조합이 있는 소 로타바이러스로부터의 감염증을 예방하는 약독화 혼합생백신 조성물 및 이를 포함하는 백신을 제공한다.

Description

소 로타바이러스 감염증 예방용 약독화 혼합생백신 조성물{MIXED LIVE ATTENUATED VACCINE COMPOSITION FOR PROTECTING BOVINE ROTAVIRUS INFECTION}
본 발명은 소 로타바이러스(Bovine Rotavirus; BRV) 감염증의 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.
로타바이러스는 VP6 캡시드 단백질에 대한 항체의 반응성에 따라 A-H까지 8개의 혈청군(serogroup)으로 분류된다. 이 중에서 인간과 동물에 심각한 설사를 일으키는 것은 혈청군 A 로타바이러스(이하, "로타바이러스"로 칭함)이다.
로타바이러스는 3개의 캡시드 층으로 구성된 바이러스 입자 내에 11개의 분절화된 이중쇄의 RNA 유전체를 가지고 있다. 최근 로타바이러스의 11개 유전체인 VP7, VP4, VP6, VP1, VP2, VP3, NSP1, NSP3, NSP4, NSP5에 대한 유전형(genotype)을 Gx-P[x]-Ix-Rx-Cx-Mx-Ax-Nx-Tx-Ex-Hx로 표기하기로 결정하였다. 이러한 유전형 중에서 특히 로타바이러스 중화항원으로 작용하고 있는 바이러스 캡시드의 가장 겉층에 있는 VP7에 대한 G 유전형이 35개, VP4에 대한 P 유전형이 50개 보고되었으며, 이 외에 I 유전형은 26개, R 유전형은 21개, C 유전형은 19개, M 유전형은 19개, A 유전형은 30개, N 유전형은 21개, T 유전형은 21개, E 유전형은 27개, H 유전형은 21개가 보고되었다.
소 로타바이러스는 송아지 소장의 융모상피세포에 증식하여 상피세포의 탈락을 일으키며, 이에 따라 융모는 위축 및 융합되고 음와는 증식한다. 이러한 결과로, 소 로타바이러스에 감염된 송아지에서 심한 식욕저하, 구토 및 설사가 발생하여, 심한 증례의 경우에는 폐사하게 된다.
소 로타바이러스 감염증은 소를 사육하고 있는 모든 나라에서 발생하여 막대한 경제적 피해를 일으키고 있는 것으로 추정되고 있다. 구체적으로, 뉴질랜드는 57%, 브라질 49.2%, 중국 42.1%, 독일 37.8%, 아일랜드 33.1%, 아르헨티나에서는 30%의 발생률이 보고되었다.
국내에서도 로타바이러스 백신이 시판되고 있어, 축우농가에서 소 로타바이러스 백신을 투여하고 있음에도 불구하고 소 로타바이러스 감염증이 문제되고 있다. 즉, 국내 사육중인 송아지 설사분변에서 소 로타바이러스 감염증을 검사한 결과 64.3%로 높게 검출된 것이 이를 증명하고 있다.
로타바이러스 감염증 예방을 위한 백신 개발은 로타바이러스의 중화항원으로 작용하고 있는 캡시드 가장 겉층의 VP7 및 VP4 단백질의 유전형의 발생분포에 의해 결정된다. 소 로타바이러스의 VP7단백질에 대한 G 유전형은 최소 12개(G1-G6, G8, G10-G12, G15, G21)가 보고되었지만, 세계적으로는 G6(56.7%), G10(20.6%), G8(3.5%)의 순서로 다발하고 있다. 하지만 지역별, 대륙별로 다발하는 G 유전형은 상이하다. 예를 들면, 미국 및 캐나다에서는 G6(55.39%) 및 G10(14.22%) 유전형이 압도적으로 많은 반면, 일본의 경우에는 G6 및 G10 외에도 G8 유전형이 상당히 많은 부분을 차지하고 있다.
소 로타바이러스의 VP4 단백질에 대한 P 유전형도 최소 10개(P[1], P[3], P[5], P[7], P[10], P[11], P[14], P[21], P[29], P[33])가 보고되었다. 이 중에서 세계적으로 다발하고 있는 유전형은 P[5](25.9%), P[11](21.5%), P[1](2.15%) 유전형인 것으로 보고되었다. VP4 단백질에 대한 P 유전형도 지역별 및 대륙별로 상이한데, 미국과 캐나다는 P[5]와 P[11] 유전형이 우세하지만, 유럽과 아시아는 P[5], P[11] 외에 P[1] 유전형도 상당히 높다고 알려져 있다.
특히 주목하여야 할 것은, 시대별로 G 및 P 유전형이 변화하고 있다는 것이다. 즉, 브라질의 경우 1994-1995년도에는 G6, G10, P[1], P[11] 유전형들이 우세하였지만, 2000-2001년도에는 G10 유전형은 사라지고 G8 유전형이 신규 출현하여 G6와 G8 유전형이 우세한 유전형으로, P 유전형에서는 P[1]과 P[11] 외에 P[5] 유전형이 우세 유전형인 것으로 알려졌다. 가까운 일본의 경우에도 1983-1991년도에는 G 유전형으로는 G6, G10 유전형이 그리고 P 유전형으로는 P[5], P[11], P[1] 유전형 순서로 우세하였지만, 1995-2000년도에는 G6 유전형 다음으로 G8 유전형이 우세주로 출현하였고, P 유전형으로는 P[5], P[11] 다음으로 P[29] 유전형이 우세주로 출현하였다. 이는 특정 시점의 주요 G 및 P 유전형을 보이는 로타바이러스가 이에 대한 맞춤형 백신에 의해 감소되는 반면, 이러한 백신에 의해 방어가 되지 않는 소수의 G 및 P 유전형을 보이는 로타바이러스는 증가되기 때문인 것으로 추정된다.
국내 송아지 설사분변에서 분리한 소 로타바이러스 113주에 대한 G 및 P 유전형 조합을 보고한 문헌을 분석한 결과, 가장 다발하는 G 유전형은 G8(49.6%), G6(26.5%), G5(23.9%) 유전형 순이었으며, P 유전형으로는 P[7] 유전형이 82.3%로 가장 많았고, 그 다음으로 P[5] 유전형이 15.0%, P[1] 유전형이 2.7%가 보고되었다.
이를 G 및 P 유전형 조합으로 보면, G8P[7] 유전형조합이 46.9%로 가장 많고, G5P[7] 유전형 조합이 20.4%, G6P[7] 유전형 조합이 15.0%, G6P[5] 유전형 조합이 11.5%, G8P[5] 유전형 조합 및 G5P[1] 유전형 조합이 각각 2.7%, G5P[5] 유전형 조합이 0.9% 순서였다.
즉, 국내에서 가장 많이 발생하고 있는 소 로타바이러스 G 유전형은 G8, G6, G5 유전형 순이며, P 유전형은 P[7], P[5], P[1] 유전형 순이었다. 특히, 국내 분리주의 소 로타바이러스 G 유전형 중에서 돼지의 G 유전형으로 알려진 G5 유전형이 세 번째로 다발하고, 소 로타바이러스 P 유전형 중에서 돼지의 P 유전형으로 알려진 P[7]이 가장 많이 발생하고 있었다. 이는 국내 소 로타바이러스들은 소와 돼지의 로타바이러스 혼합감염에 의한 재배열 바이러스가 우세하다는 것을 의미한다.
그러나 현재 국내에서 사용되고 있는 소 로타바이러스 백신은 국내에서 개발한 678 백신주(G10P[11] 유전형 조합)와 P44 백신주(G6P[x]로서 P 유전형은 규명되지 않았음)가 혼합된 불활화 또는 약독화 생건조혼합백신이다.
또한 외국에서 수입한 백신으로는 G6 및 G10 혼합백신과 G6, G8, G10 혼합백신이 있다.
국내에서 제작 및 판매하고 있는 G10P[1]과 G6P[x] 유전형 조합으로 구성된 백신으로는 상기 제시한 국내에서 발생하고 있는 G8, G5, P[7], P[1], P[5] 유전형을 가지고 있는 소 로타바이러스를 예방하는데 한계가 있음을 알 수 있다. 또한 외국계 수입 백신의 G6, G8, G10, P[11], P[5], P[1] 유전형 조합으로는 국내에서 발생하고 있는 G5, P[7] 유전형을 보이는 소 로타바이러스 감염증을 예방하는데 한계가 있다.
이러한 이유로 국내에서 소 로타바이러스 백신이 판매되고 있지만, 이러한 시판 백신의 G 및 P 유전형이 야외 축우농가에서 발생하고 있는 G 및 P 유전형과 상이하므로, 완벽한 예방을 할 수 없어 국내 사육중인 송아지에서 소 로타바이러스가 높은 비율로 발생하고 있는 문제점이 꾸준히 발생하고 있었다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명 의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
대한민국 공개특허 제10-2014-0030100호 (2014.03.11. 공개)
본 발명은 국내 축우농가에서 발생하고 있는 소 로타바이러스 감염증을 효과적으로 제어하기 위하여 소 로타바이러스 G 및 P 유전형과 일치하는 맞춤형 백신을 개발 및 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 국내 축우농가에서 발생하고 있는 소 로타바이러스와 그 유전형이 일치하도록, 국내 축우농가의 송아지의 설사분변에서 분리한 소 로타바이러스의 G 및 P 유전형 조합 중에서 다발하는 유전형 조합을 보이는 소 로타바이러스를 백신 원주로 사용하여, 이를 원숭이 신장세포인 MA104 세포에서 80대 연속계대배양을 통해 약독화된 생백신이 국내 실정에 적합하고 효과적인 백신 조성물을 제공할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 양태는 소 로타바이러스주 KJ11의 약독화주, KJ19-2의 약독화주 및 KJ44의 약독화주를 포함하는 소 로타바이러스 감염증 예방용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 소 로타바이러스주 KJ11의 약독화주는 KJ11V-80(수탁번호: KCTC 13432BP)이고, 상기 소 로타바이러스주 KJ19-2의 약독화주는 KJ19-2V-80(수탁번호: KCTC 13433BP)이며, 상기 소 로타바이러스주 KJ44의 약독화주는 KJ44V-80(수탁번호: KCTC 13434BP)일 수 있다.
본 발명의 일 양태는 상기 소 로타바이러스 감염증 예방용 백신 조성물을 포함하는 소 로타바이러스 감염증 예방용 생백신을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 생백신은 백신보호제, 면역 강화제 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 백신보호제는 락토오스 포스페이트 글루타메이트 젤라틴 혼합물일 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태는 상기 소 로타바이러스 감염증 예방용 백신 조성물을 포함하는 소 로타바이러스 감염증 예방용 불활화 백신을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 불활화는 바이러스주에 포르말린을 첨가함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 양태는 상기 생백신 또는 상기 불활화 백신의 면역 유효량을 소에게 경구 또는 주사 투여하는 단계를 포함하는 소에서 소 로타바이러스 감염증에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 일 양태는 상기 생백신 또는 상기 불활화 백신을 임신 후기의 모우에게 경구 또는 주사 투여하는 단계; 및 상기 모우로부터 분만된 송아지에게 상기 모우의 초유를 수유하는 단계를 포함하는 소에서 소 로타바이러스 감염증에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 백신은 로타바이러스 G 및 P 유전형인 G5, G6, G8, P[1], P[7]의 유전형 조합이 있는 각각의 소 로타바이러스로부터의 감염을 예방할 수 있다.
본 발명에 따른 백신은 소, 특히 송아지에 접종 시 분변 및 혈액 내에 각각의 바이러스에 대한 항체를 생산할 수 있으며, 상술한 유전형을 보이는 바이러스에 감염 시 설사를 예방할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 백신은 송아지에 경구 접종 시 상술한 유전형을 보이는 바이러스에 감염 시 장관계 병변을 완화시킬 수 있으며, 상술한 유전형을 보이는 바이러스에 감염 시 분변을 통한 바이러스의 배출을 감소시킬 수 있다.
본 발명에 따른 백신은 임신한 모우에 근육 주사 접종 후 태어난 신생 송아지는 어미 소로부터 초유를 통해 상술한 효과를 볼 수 있다.
도 1은 소 로타바이러스 백신 원주인 KJ11주(a), KJ19-2주(b) 및 KJ44주(c)의 각 계대주[초대 분리주(KJ11, KJ19-2, KJ44), 20대 계대주(KJ11V-20, KJ19-2V-20, KJ44V-20), 40대 계대주(KJ11V-40, KJ19-2V-40, KJ44V-40), 60대 계대주(KJ11V-60, KJ19-2V-60, KJ44V-60) 및 80대 계대주(KJ11V-80, KJ19-2V-80, KJ44V-80)]에 의해 감염된 MA104 세포에서 나타나는 세포 변성 효과를 나타낸다.
도 2는 소 로타바이러스 백신 원주인 KJ11주(a), KJ19-2주(b) 및 KJ44주(c)의 각 계대주[초대 분리주(KJ11, KJ19-2, KJ44), 20대 계대주(KJ11V-20, KJ19-2V-20, KJ44V-20), 40대 계대주(KJ11V-40, KJ19-2V-40, KJ44V-40), 60대 계대주(KJ11V-60, KJ19-2V-60, KJ44V-60) 및 80대 계대주(KJ11V-80, KJ19-2V-80, KJ44V-80)]의 전자현미경적 관찰 결과를 나타낸다.
도 3은 소 로타바이러스 백신 원주인 KJ11주(a), KJ19-2주(b) 및 KJ44주(c)의 각 계대주[초대 분리주(KJ11, KJ19-2, KJ44), 20대 계대주(KJ11V-20, KJ19-2V-20, KJ44V-20), 40대 계대주(KJ11V-40, KJ19-2V-40, KJ44V-40), 60대 계대주(KJ11V-60, KJ19-2V-60, KJ44V-60) 및 80대 계대주(KJ11V-80, KJ19-2V-80, KJ44V-80)]가 감염된 MA104 세포에 대한 면역형광검사 후 공초점 현미경적 관찰 결과를 나타낸다.
도 4는 소 로타바이러스 백신 원주인 KJ11주, KJ19-2주 및 KJ44주의 각 계대주[초대 분리주(KJ11, KJ19-2, KJ44), 20대 계대주(KJ11V-20, KJ19-2V-20, KJ44V-20), 40대 계대주(KJ11V-40, KJ19-2V-40, KJ44V-40), 60대 계대주(KJ11V-60, KJ19-2V-60, KJ44V-60) 및 80대 계대주(KJ11V-80, KJ19-2V-80, KJ44V-80)]가 감염된 MA104 세포에서 바이러스 RNA를 추출한 것의 PAGE-패턴을 나타낸다.
도 5a 내지 5k는 소 로타바이러스 백신 원주인 KJ11주, KJ19-2주 및 KJ44주의 각 계대주[초대 분리주(KJ11, KJ19-2, KJ44), 20대 계대주(KJ11V-20, KJ19-2V-20, KJ44V-20), 40대 계대주(KJ11V-40, KJ19-2V-40, KJ44V-40), 60대 계대주(KJ11V-60, KJ19-2V-60, KJ44V-60) 및 80대 계대주(KJ11V-80, KJ19-2V-80, KJ44V-80)]의 11개 유전자(VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5) 전체 염기서열에 대한 계통학적 분석 결과를 나타낸다.
도 6 내지 도 8은 각각 소 로타바이러스 백신 원주인 KJ11주(도 6), KJ19-2주(도 7) 및 KJ44주(도 8)의 각 계대주[초대 분리주(KJ11, KJ19-2, KJ44), 20대 계대주(KJ11V-20, KJ19-2V-20, KJ44V-20), 40대 계대주(KJ11V-40, KJ19-2V-40, KJ44V-40), 60대 계대주(KJ11V-60, KJ19-2V-60, KJ44V-60) 및 80대 계대주(KJ11V-80, KJ19-2V-80, KJ44V-80)]의 11개 유전자 시퀀싱 결과 중, 계대배양 결과 치환된 아미노산 서열(적색 글자로 표시됨)의 종류 및 위치를 나타낸다.
도 9는 송아지에 본 발명에 따른 소 로타바이러스 약독화 생백신주(KJ11V-80, KJ19-2V-80 또는 KJ44V-80) 각각을 구강 투여 후 2주 후에 각각의 백신주의 초대 병원성 주(KJ11, KJ19-2 또는 KJ44)를 공격접종 한 후 유도된 혈중 중화항체가를 검사하기 위해 백신 접종 전, 백신접종 후 7일, 14일(공격접종 당일), 21일(공격접종 후 7일), 28일(공격접종 14일)에 각각의 송아지에서 혈액을 채취하여 혈청을 분리한 후 측정한 혈청중화항체가를 나타낸다.
도 10은 송아지에 본 발명에 따른 소 로타바이러스 약독화 생백신주인 KJ11V-80주(a), KJ19-2V-80주(b) 또는 KJ44V-80주(c)를 투여하기 전, 상기 생백신주 접종 후 7일, 14일(공격접종일), 21일(공격접종 후 7일), 28일(공격접종 14일)에 각각의 송아지에서 혈액을 채취하여 혈청을 분리한 후 ELISA방법을 통해 확인한 혈청 내의 IgM, IgA 및 IgG 항체가를 나타낸다.
도 11은 송아지에 본 발명에 따른 소 로타바이러스 약독화 생백신주인 KJ11V-80주(a), KJ19-2V-80주(b) 또는 KJ44V-80주(c)를 투여하기 전, 상기 생백신주 접종 후 7일, 14일(공격접종일), 21일(공격접종 후 7일), 28일(공격접종 14일)에 각각의 송아지의 분변을 채취하여 ELISA방법을 통해 확인한 분변 내의 IgM, IgA 및 IgG 항체가를 나타낸다.
본 발명은 국내 축우농가 송아지에서 다발하고 있는 소 로타바이러스의 G 및 P 유전형 조합을 보이는 소 로타바이러스를 맞춤형으로 예방하기 위한 백신의 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 국내 소 로타바이러스 분리주들의 G 및 P 유전형 분포조사 결과를 바탕으로 국내에서 호발하고 있는 G5, G6, G8, P[1] 및 P[7]의 유전형의 조합을 보이는 소 로타바이러스의 감염증을 예방하기 위한 백신 조성물 및 이를 포함하는 소 로타바이러스 감염증 예방용 백신에 관한 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 G5, G6, G8, P[1], P[7] 유전형 및/또는 이들의 유전형 조합을 포함하는 소 로타바이러스의 예방용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "로타바이러스"는　Reoviridae에 속하며 11개 단편 이중 가닥 RNA를 게놈으로 갖고 6개의 구조 단백질과 6개의 비구조 단백질을 암호화 하고 있다. 2개의 외피 캡시드 단백질인 VP4와 VP7은 개별적으로 약독화 항체를 끌어내어 면역을 유도하며 P(단백질 분해효소 민감성)와 G(당단백질) 두 개의 항원형(serotype)으로 구분할 수 있다. 바이러스 분자 표면 있는 VP4는 세포와 결합하는 수용체와 세포에 침입을 포함한 바이러스와 세포간의 상호작용에 있어서 중요한 기능을 한다. VP4를 트립신 처리하면 특이적으로 VP5와 VP8로 나뉘며 VP8은 바이러스의 혈구응집소(hemagglutin)를 포함하며 VP5는 내부에 소수성(hydrophobic) 부분을 가지고 있어 바이러스가 세포에 침투할 수 있는 능력이 있다.　
본 발명에서 용어 "약독화(attenuated)"는 독성 있는 균주가 변형 전보다 덜 독성 있는 균주거나 약한 병원균이 되는 방식으로 변형되는 것을 의미하며, 이러한 균주는 숙주 안에서 여전히 복제 분열될 수 있는 동안, 임상적 질병을 유발할 수 있는 능력이 현저히 감소된 것을 말한다. 본 발명의　약독화된 균주는 바람직하게, 독성 또는 병원성이 백신용으로 투여를 허용할 수 있을 정도로 감소된 균주이며, 더욱 바람직하게는 균주가 숙주 내에서 여전히 복제할 수 있으면서도 임상적 질병을 유발할 수 없는 정도까지　약독화시키는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 "로타바이러스 감염증"은 설사, 구토, 분변을 통한 바이러스 배출, 소장의 병변 유발을 포함한다.
본 발명에서 용어 "예방"은 소 로타바이러스 감염증에 의해 발생하는 설사, 구토, 분변을 통한 바이러스 배출, 소장의 병변 유발을 완화 및/또는 방지를 포함하는 개념이다.
본 발명에서 용어 "백신”은 동물에서 면역학적 반응을 유도하는 적어도 하나의 면역학적으로 활성인 성분을 함유하는 약학적 조성물을 의미한다. 백신의 면역학적으로 활성인 성분은 살아있는 바이러스 또는 죽은 바이러스의 적절한 요소를 함유할 수 있고(서브유닛 백신), 이에 의해 이들 요소는 전체 바이러스 또는 이의 성장 배양물을 파괴하고, 이어서 원하는 구조물(들)을 수득하는 정제 단계에 의해, 또는 제한되는 것은 아니지만 박테리아, 곤충, 포유동물 또는 다른 종과 같은 적절한 시스템의 적절한 조작에 의해 유도된 합성과정 및 이어서 단리 및 정제과정에 의해, 또는 적절한 약학적 조성물을 사용하여 유전자 물질의 직접적인 혼입에 의한 백신을 필요로하는 동물에서 상기 합성 과정의 유도에 의해 (폴리뉴클레오타이드 백신화) 제조된다. 백신은 상기 기술된 요소의 하나 또는 동시에 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 로타바이러스 감염증 예방용 백신 조성물을 포함하는 소 로타바이러스 감염증 예방용 불활화 백신을 제공한다. 불활화 백신 조성물 죽은 바이러스 또는 이의 활성 성분을 포함하는 백신을 의미하는 것으로, 상기 백신은 당업계에 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 바이러스가 높은 역가로 증식 되면, 바이러스를 수득한 후 이들을 포르말린, 베타프로프리오락톤 (BPL), 이성분 에틸렌이민 (BEI) 또는 감마선으로 처리하거나, 통상의 기술자에게 공지된 기타 방법에 의해 비활성화시킬 수 있다. 바람직하게는, 최종농도 0.1% 포르말린에서 불활화한 것일 수 있다.
본 발명의 백신은 당업계에 알려진 임의의 형태, 예를 들면, 액제 및 주사제의 형태 또는 현탁액에 적합한 고체 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 제제는 또한 리포좀이나 가용 유리 내로 유화 또는 캡슐화되거나 에어로졸이나 스프레이 형태로도 제조될 수 있다. 이들은 경피(transdermal) 패치에 함유시킬 수도 있다.
본 발명에 따른 백신은 필요에 따라, 약학적으로 허용되는 백신보호제, 면역강화제, 희석제, 흡수촉진제 등을 포함할 수 있다. 상기 백신보호제는, 예컨대, 락토오스 포스페이트 글루타메이트 젤라틴 혼합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역강화제는, 예컨대, 수산화 알루미늄, 광유 또는 다른 오일 또는 백신에 첨가되거나 이러한 추가의 성분에 의해 각각의 유도 후 신체에 의해 발생되는 보조 분자, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만 인터페론, 인터류킨 또는 성장인자를 포함한, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 백신이 액제 또는 주사제의 경우, 필요시 프로필렌 글리콜 및 용혈 현상을 방지하는데 충분한 양(예: 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다.
이때, "약학적으로 허용 가능한" 이란 생리학적으로 허용되고 소에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성인 것을 의미한다.
상기 백신은 경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 등의 투여경로를 통해 투여될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 예컨대, 경구 또는 근육 투여경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명은 생백신 또는 불활화 백신의 면역 유효량을 소에게 경구 또는 주사 투여하는 단계를 포함하는 소에서 소 로타바이러스 감염증에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명에서의 용어 "보호"는 감염된 숙주가 통상적으로 나타내는 임상적 징후의 감소 또는 부재, 보다 신속한 회복 시간 또는 보다 낮아진 지속시간 또는 감염된 숙주의 조직 또는 체액 또는 배설물에서 보다 낮은 바이러스 역가에 의해 입증된다.
본 발명에서의 용어 "유효량"은 면역 반응을 유도하여 소에서 유행성설사병 바이러스 감염의 빈도수 또는 이의 중증도를 감소시킬 수 있는 백신의 양을 의미하며, 당업계의 통상의 기술자라면 그의 상식에 기초하여 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 유효량은 상기 생백신 조성물을 포함하는 백신일 경우 바이러스주를 1일당 1X104 내지 1X107TCID50/ml, 바람직하게는 1일당 1X105 내지 1X106TCID50/ml 범위일 수 있다.
또한, 본 발명은 약독화 균주를 제공한다.
본 발명의 약독화 균주는 소 로타바이러스주 KJ11의 약독화주 KJ11V-80(수탁번호 : KCTC 13432BP), 소 로타바이러스주 KJ19-2의 약독화주 KJ19-2V-80(수탁번호 : KCTC 13433BP) 및 소 로타바이러스주 KJ44의 약독화주 KJ44V-80(수탁번호 : KCTC 13434BP) 중 적어도 하나를 포함하는 것으로서, 구체적인 예를 들면, 소 로타바이러스주 KJ11의 약독화주 KJ11V-80(수탁번호 : KCTC 13432BP), 소 로타바이러스주 KJ19-2의 약독화주 KJ19-2V-80(수탁번호 : KCTC 13433BP) 및 소 로타바이러스주 KJ44의 약독화주 KJ44V-80(수탁번호 : KCTC 13434BP)로 이루어진 혼합 균주일 수 있다.
이하 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
상기 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 바와 같이, 발명자들의 선행연구를 통해 국내 송아지 설사분변에서 분리된 소 로타바이러스 113주에 대한 11개 유전체의 염기서열 분석을 통해 G 및 P 유전형이 결정되었으며, 이 중에서 대표적으로 다발하는 유전형을 보이는 KJ11주(G8P[7] 유전형 조합), KJ19-2주(G6P[7] 유전형 조합) 및 KJ44주(G5P[1] 유전형 조합)를 백신 원주로 선정하여 3가의 약독화 혼합생백신 개발의 활용가능성을 아래와 같이 수행하였다.
실시예1 . 소 로타바이러스 주 분리
국내 축우농가에서 채취한 송아지 설사분변을 PBS(pH 7.2)에 10%(무게부피백분율, weight/volume%, W/V%)로 혼합한 후 4 ℃ 원심분리기에서 3,000 x g에서 30분간 원심분리하였다. 상층액은 0.2 ㎛ 필터로 여과한 후, -80 ℃에 보관하여 바이러스 분리에 이용하였다.
소 로타바이러스 분리를 위해 6-웰 플레이트에 원숭이 신장세포인 MA104 세포를 10% 소태아 혈청(fetal bovine serum), 1% 항생제(페니실린 100 units/ml, 스트렙토마이신 100 ㎍/ml)가 들어있는 α-MEM 배지에서 단층 배양하였다. 분변상층액은 10 ㎍/ml 농도의 트립신이 포함된 α-MEM 배지와 1:9로 혼합하여 37 ℃에서 30분간 반응시켰다. 혼합액은 10 ㎍/ml 농도의 트립신이 포함된 α-MEM 배지를 이용하여 십진희석한 후, MA104 세포가 단층 배양된 6-웰 플레이트의 각 웰에 300 ㎕씩 접종하였다. 접종 후 1시간 동안 바이러스를 MA104 세포에 흡착시킨 후, 항생제와 트립신 1 ㎍/ml가 포함된 배지 3 ml를 첨가하여 37 ℃ 및 CO2 세포 배양기에서 세포 변성 효과(CPE, Cytopathic effect)가 나타날 때까지 배양하였다. 배양 종료 후, 3회의 동결 및 해동의 반복을 통해 세포를 완벽히 파괴하고 4 ℃, 3,000 x g에서 30분간 원심분리하여 상층액을 수거해 다음의 단독 바이러스주 분리에 사용하였다. 즉, 세포 변성 효과를 보이는 가장 높은 희석배수의 바이러스 상층액을 MA104 세포가 단층 배양된 6-웰 플레이트의 각 웰에 위와 같은 방법으로 접종한 후 겔을 오버레이(overlay)하여 37 ℃에서 2 내지 3일간 배양하였다. 그 후, 각각의 플라크(plaque)를 회수하여 MA104 세포가 단층 배양된 6-웰 플레이트에 접종하였다. 이러한 플라크 분석(plaque assay)을 2회 더 반복하였다.
3번째 플라크 분석에서 수득된 플라크를 MA104 세포가 단층 배양된 6-웰 플레이트에 접종한 후 37 ℃ 및 CO2 세포 배양기에서 세포 변성 효과가 나타날 때까지 배양하였다. 3회의 동결과 해동을 반복한 후 4℃, 3,000 x g에서 30분간 원심분리하였다. 각각의 상층액 200 μl에서 RNA 추출 키트를 이용하여 바이러스 유전체를 추출하였다.
11개 유전자에 대한 염기서열 확인을 위해 다양한 프라이머 쌍(primer pair)을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 여기에 사용된 각각의 프라이머 쌍은 하기 표 1에 제시하였다.
Figure 112018026261415-pat00001
a F: 순방향; R: 역방향 b 5' RACE PCR용 프라이머
c 3' RACE PCR용 프라이머
각각의 증폭산물을 겔에서 추출 후, 각 염기서열을 분석하였다. G와 P 유전형 및 나머지 9개 유전자의 계통학적 분석은 DNAsis MAX DNA 베이직 모듈에서 수행하였다. 이를 통해 분석된 국내 축우농가에서 가장 많이 발생하고 있는 G 및 P 유전형 조합의 소 로타바이러스 분리주 중 G8P[7] 유전형조합을 가진 KJ11주, G6P[7] 유전형 조합을 가진 KJ19-2주, G5P[1] 유전형 조합을 가진 KJ44주를 백신원주로 선정하여, 백신주 개발에 사용하였다.
실시예 2. 세포의 배양 및 바이러스 접종 후 계대배양
백신 원주를 원숭이 신장세포에서 연속계대배양을 하기 위해, 원숭이 신장세포인 MA104 세포를 10% 소태아 혈청, 1% 항생제(페니실린 100units/ml, 스트렙토마이신 100ug/ml)가 들어있는 α-MEM 배지에서 단층 배양하였다(6-웰 플레이트).
KJ11 원주, KJ19-2 원주 및 KJ44 원주 각각을 트립신 10ug/ml이 포함된 배지에 10분의 1로 넣은 후 37℃에서 30분간 활성화 시켰다. 그 후, 96-웰 플레이트에서 트립신 10ug/ml이 포함된 배지를 이용하여 10배수로 계단 희석한 후 희석배수가 낮은 희석액부터 MA104 세포가 단층 배양된 6-웰 플레이트의 각 웰에 접종하였다. 접종 후 1시간 동안 바이러스를 MA104 세포에 흡착시킨 후, 항생제와 트립신 1ug/ml가 포함된 배지를 첨가하여 37℃ 및 CO2 세포 배양기에서 2일간 배양하였다.
배양 종료 후, 3회의 동결과 해동을 반복하여 세포를 완벽히 파괴하였다. 이후 바이러스의 낮은 희석액부터 높은 희석액을 접종한 각 웰 중에서 로타바이러스에 의해 유발된 세포 변성 효과가 있는 가장 높은 희석액을 보이는 웰의 상층액을 이용하여, 상술한 방법에 의해 80회 연속계대배양을 수행하였다.
각각의 분리주는 백신 원주 및 20, 40, 60 및 80계대에 따라 개별적으로 명명되었다. 즉,
1) KJ11 (백신 원주), KJ11V-20 (20계대), KJ11V-40 (40계대), KJ11V-60 (60계대), KJ11V-80 (80계대);
2) KJ19-2 (백신 원주), KJ19-2V-20 (20계대), KJ19-2V-40 (40계대), KJ19-2V-60 (60계대), KJ19-2V-80 (80계대);
3) KJ44 (백신 원주), KJ44V-20 (20계대), KJ44V-40 (40계대), KJ44V-60 (60계대), KJ44V-80 (80계대)
로 명명하였다.
실험예 1. 계대별 바이러스 역가 검사
각각의 백신 원주 및 20, 40, 60 및 80계대 한 각각의 약독주를 트립신 10 μg/ml이 포함된 배지에 10분의 1로 넣은 후 37 ℃에서 30분간 활성화 시켰다. 그 후 96-웰 플레이트에서 트립신 1 μg/ml과 1% 항생제(페니실린 100units/ml, 스트렙토마이신 100 μg/ml)가 들어있는 α-MEM 배지를 이용하여 10배수로 계단 희석한 후 단층의 MA104 세포가 배양된 96-웰 플레이트의 각 웰에 100ul씩 접종한 후 18시간 동안 37 ℃ 및 CO2 세포 배양기에서 배양하였다.
각각의 96-웰 플레이트를 생리식염수(phosphate buffered saline, PBS, pH 7.2)로 수세 후, 80% 냉 아세톤으로 15분간 고정하였다. 이후 PBS로 수세 후, 1차 항체로 로타바이러스 VP6 단백질에 특이적인 단클론 항체로 37 ℃에서 1시간 반응시켰다. 이후 PBS로 수세 후, 2차 항체로는 FITC-공액 항마우스 IgG 항체(FITC-conjugated anti mouse IgG 항체)를 37 ℃에서 1시간 감작시켰다. PBS(pH 8.0)으로 수세 후, 각 웰을 60% 글리세린으로 봉입하고, 도립형광현미경을 이용하여 로타바이러스 양성 세포수를 계산하였다.
각 바이러스주의 계대별 바이러스 역가를 측정한 결과, 하기 표 2에 나타난 바와 같이 각 바이러스주의 계대가 높아질수록 바이러스 역가도 증가하였다.
바이러스주 G 및 P 유전형 계대
1대 20대 40대 60대 80대
KJ11 G8P[7] 2.0*106 5.4*1010 2.3*1011 6.2*1012 2.5*1013
KJ19-2 G6P[7] 1.2*106 3.0*109 6.2*1011 1.1*1012 1.1*1013
KJ44 G5P[1] 1.4*106 4.3*109 2.2*1010 8.6*1011 4.7*1012
실험예 2. 계대별 바이러스에 의한 세포 변성 효과 검사
각각의 백신 원주 및 20, 40, 60 및 80계대 한 각각의 약독주를 상술한 방법을 통해 8-웰 챔버 슬라이드에서 2일간 배양한 후, 10% 중성 포르말린으로 1시간 고정하였다. 이후, 각급 알코올과 자일렌을 통해 탈수 및 중합을 시키고 봉입한 후 바이러스에 의해 발생한 세포 변성 효과를 검사하였다.
실험 결과, 무접종 MA104 세포에 비해 계대별 각 백신주의 감염에 의해 MA104 세포는 탈락, 원형화 등과 같은 전형적인 세포변성효과가 관찰되었다. 각 계대별 백신주에 의해 일어난 세포 변성효과는 모두 동일하였다(도 1 참조).
실험예 3. 계대별 바이러스의 공초점 현미경 사진 촬영
각각의 백신 원주 및 20, 40, 60 및 80계대 한 각각의 약독주를 상술한 방법을 통해 8-웰 챔버 슬라이드에서 18시간 동안 37 ℃, CO2세포 배양기에서 배양하였다. 이후 생리식염수(pH 7.2)로 수세 후, 80% 냉 아세톤으로 15분간 고정하였다. 이후 PBS로 수세 후, 1차 항체로 로타바이러스 VP6 단백질에 특이적인 단클론 항체로 37 ℃에서 1시간 반응시켰다. 이후 PBS로 수세 후, 2차 항체로는 FITC-공액 항마우스 IgG 항체를 37 ℃에서 1시간 감작시켰다. PBS(pH 8.0)로 수세 후, 각 웰에 DAPI가 포합된 봉입액을 분주하고, 공초점 현미경(confocal microscope)으로 양성 세포를 촬영하였다.
각 백신주의 계대별 바이러스의 형태를 전자현미경으로 관찰한 결과, 60-80 nm 크기의 로타바이러스가 확인되었으며, 백신주의 계대화에 따른 바이러스 입자의 변화는 없었다(도 2 참조).
실험예 4. 계대별 바이러스의 형태학적 변화 검사
각각의 백신 원주 및 20, 40, 60 및 80계대 한 각각의 약독주를 상술한 방법을 통해 T-150 플라스크에서 대량 배양 후, 3번의 동결 및 해동을 반복하고, 배양액을 4 ℃ 원심분리기에서 3,000 x g에서 30분간 원심분리하였다. 이후 상층액을 4 ℃ 초고속원심분리기에서 141,000 x g에서 10시간 원심분리하였다. 상층액을 제거 후 침전물을 50 μl의 포스포텅스텐산(phosphotungstic acid, PTA, pH 7.0)으로 음성염색(negative stain)을 한 다음, 탄소가 코팅된 그리드 막 위에 각각 25 μl씩 올려 2분간 인큐베이팅 하였다. 이후 그리드에서 여분의 액을 제거하고 건조 후 전자현미경에서 바이러스를 검경하였다.
면역형광염색을 수행한 결과, 각 계대별 백신주를 접종한 MA104 세포에서 모두 로타바이러스 특이 항체에 대한 형광반응이 세포질에서 관찰되어, 백신주의 계대화에 따른 바이러스 특성의 변화는 없는 것을 확인하였다(도 3 참조).
실험예 5. 계대별 바이러스 전기영동 패턴 분석
각각의 백신 원주 및 20, 40, 60 및 80계대 한 각각의 약독주를 상술한 방법을 통해 T-150 플라스크에서 대량 배양 후, 3번의 동결 및 해동을 반복 한 다음, 배양액을 4 ℃ 원심분리기에서 3,000 x g에서 30분간 원심분리하였다.
각각의 상층액 200 μl에서 RNA 추출 키트를 이용하여 바이러스 유전체를 추출하였다. 각각 추출된 바이러스 유전체를 폴리아크릴아미드 겔에서 16 내지 18시간 동안 전기영동한 후, 겔을 은 염색(silver staining)하고, 겔 상의 PAGE-패턴을 사진 촬영하여 각 계대별 PAGE-패턴의 변화 유무를 검사하였다.
PAGE-패턴을 분석한 결과, 각각의 계대별 백신주들은 로타바이러스의 PAGE 패턴인 4-2-3-2 패턴을 보임을 확인하였다. 또한 각각의 백신주들이 계대를 높여감에도 백신 원주와의 PAGE-패턴의 변화는 관찰되지 않았으며, 특히 연속계대에 따른 유전체의 재배열 양상 또한 관찰되지 않았다. 즉, 계대화에 따른 바이러스 유전체의 크기 변화 등은 없었음을 확인할 수 있었다(도 4 참조).
실험예 6. 계대별 바이러스 11개 유전체 전체 염기서열 및 상동성 분석
각각의 백신 원주 및 20, 40, 60 및 80계대 한 각각의 약독주를 상술한 방법을 통해 T-150 플라스크에서 대량 배양 후, 3번의 동결 및 해동을 반복하고, 배양액을 4 ℃ 원심분리기에서 3,000 x g에서 30분간 원심분리하였다.
각각의 상층액 200 μl에서 RNA 추출 키트를 이용하여 바이러스 유전체를 추출하였다. 각각 추출된 바이러스 유전체의 5' 및 3' 말단 염기서열 확인을 위해 5' 및 3' RACE를 수행하였다. 또한 각각의 유전체의 내부 염기서열 확인을 위해 상기 표 1의 프라이머 쌍을 이용하여 RT-PCR 또는 네스티드 PCR(nested PCR)을 수행하였다.
각각의 증폭산물을 겔에서 추출 후, 각 염기서열을 분석하였다. 백신 원주 및 각 계대별 약독주의 11개 유전체 전체 염기서열의 상동성은 DNAMAN 버전 6.0 프로그램을 이용하여 수행하였으며, 계통학적 분석은 DNAsis MAX DNA 베이직 모듈에서 수행하였다.
상기 11개 유전체 전체 염기서열을 시퀀싱 한 후, 이에 대하여 계통학적 분석을 실시한 결과, 초대 백신 원주 및 각 계대주 간의 계통학적 차이는 관찰되지 않았다. 즉, 연속계대에 따란 대단위 유전체 돌연변이나 혼합감염에 의한 재배열은 없었음을 확인하였다(도 5 참조).
각 백신 원주 및 계대주에서 로타바이러스 RNA을 추출하여, 각각의 11개 유전체 전체 염기서열을 시퀀싱 한 후, 핵산 염기서열을 아미노산 서열로 치환하여 분석을 실시한 결과, 계대가 높아질수록 아미노산 서열의 치환이 증가하는 경향이 있었음을 확인하였다. 이러한 아미노산 서열의 치환이 백신주의 약독화와 관련성이 있는 것으로 추정되었다(도 6 내지 8 참조).
실시예 3. 백신 보호제 조성의 선택
본 발명에 따른 소 로타바이러스 3가 약독화 혼합생백신을 생산하기 위해 필요한 보호제를 기존의 ROCO 백신에서 안정성 및 효능이 입증된 보호제 조성성분에 기초하여 하기 표 3과 같이 조성하였다.
구성성분 함량
트레할로스(Trehalose) 100.00 g
KH2PO4 0.517 g
K2HPO4 0.854 g
나트륨 L-글루타메이트 10 g
젤라틴 5 g
증류수 1,000 ml
실시예 4. 각각의 백신주 및 3가 백신의 제조
각각의 백신주 및 3가 백신의 조성은 기존에 판매되고 있는 ROCO 조성성분에 기초하여, 각각의 백신주들이 105. 0TCID50 이상과 보호제를 함유하도록 하기 표 4와 같이 조성하였다.
Figure 112018026261415-pat00002
실험예 7. 각각의 백신주 및 3가 백신의 안전성 검사
각각의 백신주 및 3가 백신의 각 로트별 안전성을 검사하기 위해, (i) 각 로트별로 체중 15~20 g의 마우스 8마리의 복강에 백신 0.5 ml를 접종하고 7일간, (ii) 각 로트별 체중 300~350 g의 기니피그 2마리의 근육 내 2 ml 및 기니피그 2마리 복강에 2 ml를 접종한 후 7일간, (iii) 각 로트별 체중 100~150 kg(5~6개월령)의 송아지 2마리의 근육에 10 ml를 접종한 후 21일간 임상증상을 관찰하였다.
실험 결과, 하기 표 5 내지 8(표 5: KJ11V-80, 표 6: KJ19-2V-80, 표 7: KJ44V-80, 표 8: 3가 혼합생백신)과 같이, 상기 마우스의 복강, 기니피그의 근육 및 복강, 송아지의 근육에 접종하여 접종부위의 이상 증상 등을 관찰하였으나, 어떠한 임상증상 없이 생존하여 안전성이 확인되었다.
종 로트 번호 접종 방법 동물수 백신량 임상증상
마우스 T316Rota-KJ11-Lot1 복강내 8 0.5 ml 없음
T316Rota-KJ11-Lot2 복강내 8 0.5 ml 없음
T316Rota-KJ11-Lot3 복강내 8 0.5 ml 없음
기니피그 T316Rota-KJ11-Lot1 근육내 2 2 ml 없음
T316Rota-KJ11-Lot2 근육내 2 2 ml 없음
T316Rota-KJ11-Lot3 근육내 2 2 ml 없음
T316Rota-KJ11-Lot1 복강내 2 2 ml 없음
T316Rota-KJ11-Lot2 복강내 2 2 ml 없음
T316Rota-KJ11-Lot3 복강내 2 2 ml 없음
소 T316Rota-KJ11-Lot1 근육내 2 10 ml 없음
T316Rota-KJ11-Lot2 근육내 2 10 ml 없음
T316Rota-KJ11-Lot3 근육내 2 10 ml 없음
종 로트 번호 접종 방법 동물수 백신량 임상증상
마우스 T316Rota-KJ19-2-Lot1 복강내 8 0.5 ml 없음
T316Rota-KJ19-2-Lot2 복강내 8 0.5 ml 없음
T316Rota-KJ19-2-Lot3 복강내 8 0.5 ml 없음
기니피그 T316Rota-KJ19-2-Lot1 근육내 2 2 ml 없음
T316Rota-KJ19-2-Lot2 근육내 2 2 ml 없음
T316Rota-KJ19-2-Lot3 근육내 2 2 ml 없음
T316Rota-KJ19-2-Lot1 복강내 2 2 ml 없음
T316Rota-KJ19-2-Lot2 복강내 2 2 ml 없음
T316Rota-KJ19-2-Lot3 복강내 2 2 ml 없음
소 T316Rota-KJ19-2-Lot1 근육내 2 10 ml 없음
T316Rota-KJ19-2-Lot2 근육내 2 10 ml 없음
T316Rota-KJ19-2-Lot3 근육내 2 10 ml 없음
종 로트 번호 접종 방법 동물수 백신량 임상증상
마우스 T316Rota-KJ44-Lot1 복강내 8 0.5 ml 없음
T316Rota-KJ44-Lot2 복강내 8 0.5 ml 없음
T316Rota-KJ44-Lot3 복강내 8 0.5 ml 없음
기니피그 T316Rota-KJ44-Lot1 근육내 2 2 ml 없음
T316Rota-KJ44-Lot2 근육내 2 2 ml 없음
T316Rota-KJ44-Lot3 근육내 2 2 ml 없음
T316Rota-KJ44-Lot1 복강내 2 2 ml 없음
T316Rota-KJ44-Lot2 복강내 2 2 ml 없음
T316Rota-KJ44-Lot3 복강내 2 2 ml 없음
소 T316Rota-KJ44-Lot1 근육내 2 10 ml 없음
T316Rota-KJ44-Lot2 근육내 2 10 ml 없음
T316Rota-KJ44-Lot3 근육내 2 10 ml 없음
종 로트 번호 접종 방법 동물수 백신량 임상증상
마우스 T3163Rota-Lot1 복강내 8 0.5 ml 없음
T3163Rota-Lot2 복강내 8 0.5 ml 없음
T3163Rota-Lot3 복강내 8 0.5 ml 없음
기니피그 T3163Rota-Lot1 근육내 2 2 ml 없음
T3163Rota-Lot2 근육내 2 2 ml 없음
T3163Rota-Lot3 근육내 2 2 ml 없음
T3163Rota-Lot1 복강내 2 2 ml 없음
T3163Rota-Lot2 복강내 2 2 ml 없음
T3163Rota-Lot3 복강내 2 2 ml 없음
소 T3163Rota-Lot1 근육내 2 10 ml 없음
T3163Rota-Lot2 근육내 2 10 ml 없음
T3163Rota-Lot3 근육내 2 10 ml 없음
실험예 8. 각각의 백신주 및 3가 백신을 투여한 소에서 혈청중화항체가 검사
각각의 백신주 및 3가 백신의 각 로트별 혈청중화항체가를 검사하기 위해 각 로트별로 체중 300~350 g의 8마리 기니피그의 근육 내로 1x105TCID50/2 ml에 해당하는 바이러스 역가를 1 ml(1/2두분)접종하고 2마리 기니피그를 무접종 대조군으로 하였다. 접종 14일후 근육 내로 1x105 TCID50에 해당하는 바이러스 역가를 1 ml(1/2두분)을 2차 접종하고 14일 후에 혈액을 채취하여 혈청중화항체가 검사에 사용하였다.
이후 가검 혈청을 56 ℃에서 30분간 비동화한 후, 0.05 ml의 혈청을 96-웰 마이크로플레이트에서 세포 유지용 배양액으로 2진 희석하였다. 각각의 백신주를 10X 트립신 10 μg/ml이 포함된 배지에 최종 2x102 TCID50/0.1ml이 되도록 넣은 후 37 ℃에서 30분간 활성화시켰다. 그 후 2진 희석한 항체액과 37 ℃에서 60분간 감작시켰다. MA104 세포가 단층 배양된 96-웰 플레이트의 각 웰에 0.1 ml씩 넣은 다음 37 ℃에서 5일간 배양하였다. 매일 현미경으로 관찰하여 세포 변성 효과(cytopathic effect, CPE)에 의한 양성과 음성을 판정하며, 혈청역가는 CPE를 저지한 최고혈청 희석배수의 역수를 역가로 표시하였다.
실험 결과, 3종의 백신주의 약독화 단독생백신을 이용하여 검사한 각각의 백신에 의해 유도된 혈청 내 항체가는 KJ11V-80 백신주는 27.75±0.46배, KJ19-2V-80 백신주는 27.6±0.744배, KJ44V-80 백신주는 28.25±0.46배로 확인되었다.
상기 3종의 백신주가 혼합된 3가의 약독화 혼합생백신 시험백신을 소에 접종 후 생성된 혈중 중화항체가를 각각의 백신주를 이용하여 검사한 결과, KJ11V-80 백신주에 비해 27.87±0.64배, KJ19-2V-80 백신주에 비해 27.75±0.707배, KJ44V-80 백신주에 비해 28±0.53배로 확인되었다.
3종의 백신주의 약독화 단독생백신을 소에 접종 후 생성된 혈중 중화항체가를 기존 국내 ROCO 백신의 조성 바이러스인 소 로타바이러스 44주 및 678주를 이용하여 이용하여 검사한 결과, 각각의 백신주에 대한 중화항체가보다는 낮은 값을 확인하였다. 또한 혼합된 3가의 약독화 혼합생백신 시험백신을 기니피그에 접종 후 생성된 혈중 중화항체가를 기존 국내 ROCO 백신의 조성 바이러스인 소 로타바이러스 44주 및 678주를 이용하여 검사한 결과, 단독 백신보다 높게 관찰되었다.
상기 결과를 통하여, 각각의 단독 백신 시험백신 및 이의 혼합백신에 의해 유도된 중화항체가를 각각의 단독 백신주 및 기존 국내 ROCO백신의 조성 바이러스인 소 로타바이러스 44주 및 678주를 이용한 검사결과치가 모두 농림축산검역본부의 검정기준인 23배를 모두 넘어 각각의 백신주는 약독화 백신주로써 적합함을 확인하였다.
상기 결과를 요약하면, 각각의 단일백신과 혼합백신의 간섭반응을 확인하였을 때 단일백신으로 접종 시 다른 항원에 대한 항체가가 일정수준으로 오르지만 동일 항원보다는 낮은 항체가를 보였다. 반면에 3종의 소 로타바이러스 혼합 백신의 경우 단일로 접종한 결과와 비슷하거나 높은 결과를 보여 3종의 혼합백신이 단일백신보다 더 우수하다는 것을 확인하였다(표 9).
사용된 바이러스주 명 동물 번호 혈청 중화항체가(log2)
실시예의 백신주 시판 백신주
KJ11V-80
(G8P[7])		 KJ19-2V-80
(G6P[7])		 KJ44V-80
(G5P[1])		 44
(G10P[11])		 678
(G6P[x])
KJ11V-80
(G8P[7])		 1 8 4 4 7 5
2 8 5 3 8 3
3 7 5 5 6 4
4 8 4 4 7 5
5 8 3 5 5 4
6 7 6 4 7 4
7 8 3 4 7 5
8 8 5 4 7 4
평균 7.75 4.375 4.125 6.75 4.25
표준편차 0.46291 1.06066 0.64087 0.886405 0.707107
KJ19-2V-80
(G6P[7])		 1 5 7 5 7 3
2 6 7 4 6 3
3 5 8 5 7 4
4 4 9 4 6 5
5 5 7 5 5 3
6 6 7 6 6 3
7 5 8 5 7 4
8 5 8 5 7 3
평균 5.125 7.625 4.875 6.375 3.5
표준편차 0.64087 0.744024 0.64087 0.744024 0.755929
KJ44V-80
(G5P[1])		 1 5 4 8 5 4
2 5 5 8 4 4
3 5 4 8 5 3
4 6 5 9 4 4
5 6 5 8 5 4
6 5 4 8 5 5
7 5 5 9 6 4
8 6 4 8 5 3
평균 5.375 4.5 8.25 4.875 3.875
표준편차 0.517549 0.534522 0.46291 0.64087 0.64087
KJ11V-80, KJ19-2V-80 및 KJ44V-80주가 혼합된 3가 백신 1 8 8 8 7 4
2 7 7 7 7 7
3 8 8 8 7 5
4 9 9 8 6 6
5 8 7 9 8 4
6 8 7 8 7 5
7 8 8 8 8 6
8 7 8 8 7 5
평균 7.875 7.75 8 7.125 5.25
표준편차 0.64087 0.707107 0.534522 0.64087 1.035098
비면역화된 동물의 혈청 1 2 2 2 3 2
SPF1 2 2 2 2 2
실험예 9. 소 로타바이러스 백신 효능 검증을 위한 공격바이러스주의 반수유효량
3개의 백신 원주인 KJ44(G5P[1])주, KJ11(G8P[7])주, KJ19-2(G6P[7])의 바이러스 역가를 검사한 후, 10진 희석하였다.
3개 백신 원주의 농도별 희석액 20 ml 또는 PBS를 초유를 급여하지 않은 신생 2일령의 송아지에 20 ml씩 구강접종한 후 14일간 설사 등 임상증상 유무 및 치사율 등을 검사하였다.
실험 결과, 설사 유발 반수유효량(50% Effective Dose; ED50)은 KJ11 초대 분리주는 3.2x103FFU/ml, KJ19-2 초대 분리주는 1.8x102FFU/ml, KJ44 초대 분리주는 1.8x102FFU/ml로 확인되었다.
실험예 10. 백신주의 송아지에서 안전성 검증
송아지에서 백신 후보주의 안전성을 검사하기 위해, 80대 계대한 각각의 약독화 백신주 KJ11V-80(G8P[7])주, KJ19-2V-80(G6P[7])주 및 KJ44V-80(G5P[1])주를 초유를 급여하지 않은 2일령 송아지에, 공격바이러스주의 ED50-의 100배에 해당하는 바이러스 역가(각각 3.2x105FFU, 1.8x104FFU, 1.8x104FFU)로 구강 접종하였다. 이로부터 14일 경과 후 백신원주인 KJ11, KJ19-2, KJ44주의 ED50 100배에 해당되는 바이러스 역가(각각 3.2x105FFU, 1.8x104FFU, 1.8x104FFU)를 각각 구강으로 공격접종한 후 14일간 사육하였다. 백신 및 공격접종 후 28일간 설사 등 임상증상 유무와 치사율 등을 검사하였다.
실험 결과, 하기 표 10과 같이, 백신접종 후 2주 기간 및 공격접종 2주 기간 동안(총 4주)에 설사 등 어떠한 임상증상도 관찰되지 않아, 백신의 안전성뿐만 아니라 백신에 의해 공격바이러스에 유발되는 설사가 완벽히 예방됨을 알 수 있었다.
백신주 소 번호 백신접종
(생후 2일째 접종)		 공격접종
(백신접종으로부터 14일 후 접종)
설사 발생 RT-PCR 개시
(지속)		 설사 발생 RT-PCR 개시
(지속)
KJ11
(G8P[7])		 1 없음 1(6) 없음 14(3)
2 없음 1(7) 없음 14(3)
3 없음 1(7) 없음 14(5)
KJ19-2
(G6P[7])		 4 없음 1(7) 없음 14(3)
5 없음 1(6) 없음 14(4)
6 없음 1(6) 없음 14(3)
KJ44 (G5P[1]) 7 없음 1(6) 없음 14(3)
8 없음 1(7) 없음 14(5)
9 없음 1(7) 없음 14(4)
모의 접종 10 없음 없음 없음 없음
11 없음 없음 없음 없음
12 없음 없음 없음 없음
실험예 11. 백신주의 송아지에서 효능 검증
송아지에서 백신 후보주의 안전성을 검사하기 위해, 80대 계대한 각각의 약독화 백신주 KJ11V-80(G8P[7])주, KJ19-2V-80(G6P[7])주 및 KJ44V-80(G5P[1])주를 초유를 급여하지 않은 2일령 송아지에, 공격바이러스주의 ED50-의 100배에 해당하는 바이러스 역가(각각 3.2x105FFU, 1.8x104FFU, 1.8x104FFU)로 구강 접종하였다. 이로부터 14일 경과 후 백신원주인 KJ11, KJ19-2, KJ44주의 ED50 100배에 해당되는 바이러스 역가(각각 3.2x105FFU, 1.8x104FFU, 1.8x104FFU)를 각각 구강으로 공격접종한 후 14일간 사육하였다.
백신 및 공격접종 후 총 28일간에 걸쳐 매일 설사 등 임상증상 유무와 치사율을 검사하였다. 또한, 백신 접종 전 및 백신 및 공격접종 후 총 29일간에 걸쳐 매일 분변을 채취한 후 냉동보관하고, 백신 접종 전 및 백신 및 공격접종 후 매주 채취한 혈액에서 혈청을 분리한 후, 56 ℃에 30분간 비동화 시킨 다음, 냉동보관하였다.
실험이 완료된 28일경에 각각의 실험용 송아지는 안락사 시킨 후, 부검을 통해 육안적인 병변의 유무를 검사하고, 소화기 장기를 채취한 후 10% 중성 포르말린에 고정하였다. 고정된 조직을 이용하여 3 μm 두께의 절편을 제작한 후 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) 염색을 하여 광학현미경으로 병변의 발생 여부를 검사하였다.
실험 결과, KJ11V-80, KJ19-2V-80 및 KJ44V-80을 접종 후 1주까지는 음성대조군과 비교하여 22~ 3 배의 낮은 수준의 항체가를 유지하였으나, 2주 후부터는 모든 동물에서 25~8배 이상의 중화혈청 배수를 보여주었다. 즉, 각각의 백신주에 의해 중화항체가가 유도된 후, 바이러스의 공격접종에 의해 그 역가가 증가(boosting) 되었음을 확인하였다(도 9).
병변 관찰 결과에 대하여, KJ11V-80 백신주의 경우 부검을 통해 소화기의 이상 유무를 육안적으로 검사한 결과, 어떠한 이상도 관찰되지 않았다. 또한, 송아지에 어떠한 백신이나 병원성 바이러스를 접종하지 않은 무투여 무접종군의 송아지를 부검을 통해 채취한 소화기의 병리조직학적 병변 유무를 광학현미경을 통해 검사한 결과 어떠한 이상도 관찰되지 않았다.
송아지에 KJ11 초대 병원성 주를 접종 후 7일경에 부검을 통해 채취한 소화기의 병리조직학적 병변 유무를 광학현미경을 통해 검사한 결과 십이지장, 공장(Jejunum) 및 회장(Ileum)의 융모는 심하게 위축되고 융합되었으며, 음와(crypt)는 심하게 증식되어 있었다. 한편, 송아지에 백신보호제가 포함된 KJ11V-80 약독화 단독 시험백신을 투여 후 2주경에 이의 초대 병원성 주(KJ11)를 공격접종한 다음 14일경(백신접종 후 28일)에 부검을 통해 채취한 소화기의 병리조직학적 병변 유무를 광학현미경을 통해 검사한 결과 십이지장, 공장 및 회장의 융모의 위축 및 융합과 음와의 증식은 현저히 감소되었다(표 11).
백신주 소 번호 안락사 시 DPIb 십이지장 공장 회장
병변 점수c 병변 점수c 병변 점수c
모의
접종a 		1 28 0.2 0 0.2
2 28 0.2 0.2 0.4
3 28 0 0 0.4
강독성
KJ11		 4 7 3.2 3.0 3.8
5 7 3.4 3.6 3.8
6 7 3.4 3.6 3.6
약독화된
KJ11V-80 백신 경구 백신접종 및 공격접종		 7 28 1.8 1.2 2.0
8 28 1.2 1.4 1.8
9 28 1.4 1.4 1.8
a 무혈청 α-MEM으로 접종됨 b DPI:접종 후 경과 일
c 소장의 변화를 평균 융모/음와 (V/C)의 비율과 상피세포의 박리 등급을 더한 것에 따라 점수를 매겼으며, 이들은 하기 기준에 따라 평가됨: V/C 비율, 0 = 정상 (V/C6:1), 1 = 경미함 (V/C = 5.0 ~ 5.9:1), 2 = 중간 (V/C = 4.0 ~ 4.9:1), 3 = 두드러짐 (V/C = 3.0 ~ 3.9:1), 4 = 심각함 (V/C 3.0:1); 및 박리 등급, 0 = 정상 (박리 없음), 1 = 경미함 (융모 상피 끝부분의 입방 약화), 2 = 중간 (상부 융모 상피의 박리), 3 = 두드러짐 (하부 융모 상피의 박리), 4 = 심각함 (음와 상피의 박리).
송아지에 백신보호제가 포함된 KJ19-2V-80 약독화 단독 시험백신 접종 후 이의 초대 병원성 주(KJ19-2)를 공격접종 후 부검을 통해 소화기의 이상 유무를 육안적으로 검사한 결과 어떠한 이상도 관찰되지 않았다.
송아지에 KJ19-2 초대 병원성 주를 접종 후 7일경에 부검을 통해 채취한 소화기의 병리조직학적 병변 유무를 광학현미경을 통해 검사한 결과 십이지장, 공장 및 회장의 융모는 심하게 위축되고 융합되었으며, 음와는 심하게 증식되어 있었다. 한편, 송아지에 백신보호제가 포함된 KJ19-2V-80 약독화 단독 시험백신을 투여 후 2주경에 이의 초대 병원성 주(KJ19-2)를 접종 후 14일경(백신접종 후 28일)에 부검을 통해 채취한 소화기의 병리조직학적 병변 유무를 광학현미경을 통해 검사한 결과 십이지장, 공장 및 회장의 융모의 위축 및 융합과 음와의 증식은 현저히 완화되었다(표 12).
백신주 소 번호 안락사 시 DPIb 십이지장 공장 회장
병변 점수c 병변 점수c 병변 점수c
모의
접종a 		1 28 0.2 0 0.4
2 28 0.4 0.4 0.4
3 28 0 0.2 0.2
강독성
KJ19-2		 4 7 3.4 3.4 3.6
5 7 3.6 3.8 3.8
6 7 3.4 3.4 3.8
약독화된
KJ19-2V-80 백신 접종 및 공격접종		 7 28 1.2 1.2 1.6
8 28 1.4 1.2 2.0
9 28 1.4 1.6 1.8
송아지에 백신보호제가 포함된 KJ44V-80 약독화 단독 시험백신을 접종 후 이의 초대 병원성 주(KJ44)를 공격접종 후 부검을 통해 소화기의 이상 유무를 육안적으로 검사한 결과 어떠한 이상도 관찰되지 않았다.
송아지에 KJ44 초대 병원성 주를 접종 후 7일경에 부검을 통해 채취한 소화기의 병리조직학적 병변 유무를 광학현미경을 통해 검사한 결과 십이지장, 공장 및 회장의 융모는 심하게 위축되고 융합되었으며, 음와는 심하게 증식되어 있었다. 한편, 송아지에 백신보호제가 포함된 KJ44V-80 약독화 단독 백신주를 투여 후 2주경에 이의 초대 병원성 주(KJ44)를 접종 후 14일경(백신접종 후 28일)에 부검을 통해 채취한 소화기의 병리조직학적 병변 유무를 광학현미경을 통해 검사한 결과 십이지장, 공장 및 회장의 융모의 위축 및 융합과 음와의 증식은 현저히 감소되었다(표 13).
백신주 소 번호 안락사 시 DPIb 십이지장 공장 회장
병변 점수c 병변 점수c 병변 점수c
모의
접종a 		1 28 0 0.2 0.2
2 28 0.2 0 0.2
3 28 0.2 0.4 0.4
강독성
KJ44		 4 7 3.4 3.4 3.6
5 7 3.6 3.8 3.8
6 7 3.4 3.4 3.8
약독화된
KJ44V-80 백신 접종 및 공격접종		 7 28 1.2 1.2 1.6
8 28 1.4 1.2 2.0
9 28 1.4 1.6 1.8
이상의 결과로부터, KJ11V-80 약독화 단독 생백신주, KJ19-2V-80 약독화 단독 생백신주, KJ44V-80 약독화 단독 생백신주는 각각의 초대 병원성 원주의 공격접종에 의한 소장의 병변을 예방하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 12. 백신에 의한 공격바이러스의 분변을 통한 바이러스 배출 억제능 검사
백신 접종 전 및 백신 및 공격접종 후 총 29일간에 걸쳐 채취한 분변에서 바이러스 RNA를 추출 한 후, 이를 이용하여 로타바이러스 VP6 유전자에 특이적인 프라이머 쌍으로 RT-PCR을 수행하여, 분변을 통한 바이러스 배출을 검사하였다.
실험예 13. 백신 및 공격접종한 송아지에서 혈청중화항체가 검사
백신 전 및 백신 및 공격접종 후 매주 채취한 비동화된 혈청을 이용하여 혈청중화항체가 검사를 하기와 같이 수행하였다.
각각의 바이러스를 트립신 10ug/ml이 포함된 배지에 최종 200TCID50/0.1ml이 되도록 넣은 후 37℃에 30분간 활성화시켰다. 그 후 각각의 가검 혈청액 0.05ml를 96-웨 마이크로플레이트에서 세포 유지용 배양액으로 2진 희석한 후, 활성화시킨 바이러스 0.05ml와 2진 희석한 항체액 0.05ml를 혼합하여 37℃에서 60분간 반응시키고 MA104 세포가 단층 배양된 96-웰 플레이트의 각 웰에 0.1ml씩 넣어 37℃에서 5일간 배양하였다. 매일 현미경으로 관찰하여 CPE에 의한 양성과 음성을 판정하며, 혈청역가는 CPE를 저지한 최고혈청 희석배수의 역수를 역가로 표시하였다.
실험 결과, 혈중 내 KJ11V-80주에 특이적인 IgM, IgG 및 IgA 항체가 중 IgM은 백신접종 후 2주경부터 관찰된 후 3주 후까지 증가하다가 감소하는 경향을 보인 반면, IgG 항체가는 백신 접종 후 7일경부터 관찰된 후 지속적으로 증가하였다. 하지만 혈중 IgA 항체가는 관찰되지 않았다(도 10의 (a) 참조).
혈중 내 KJ19-2V-80 백신주에 대한 항체가를 ELISA법으로 검사한 결과, 혈중 내 KJ19-2V-80주에 특이적인 IgM, IgG 및 IgA 항체가 중 IgM은 백신접종 후 1주경부터 관찰된 후 2주 후까지 증가되다가 감소하는 경향을 보였지만, IgG 항체가는 백신 접종 후 2주경부터 관찰된 후 지속적으로 증가하였다. 하지만 혈중 IgA 항체가는 백신 접종 후 1주부터 관찰되어 4주까지 약간 증가됨을 확인하였다(도 10의 (b) 참조).
혈중 내 KJ44V-80 백신주에 대한 항체가를 ELISA법으로 검사한 결과, 혈중 내 KJ44V-80주에 특이적인 IgM, IgG 및 IgA 항체가 중 IgM은 백신접종 후 1주경부터 관찰된 후 2주후까지 증가되다가 감소하는 경향을 보였지만, IgG 항체가는 백신 접종 후 1주째부터 관찰된 후 지속적으로 증가하였다. 혈중 IgA 항체가는 백신 접종 후 1주째부터 관찰되어 4주째까지 증가하는 경향을 보였지만, IgG 및 IgM 항체가에 비해서 상대적으로 낮음을 확인하였다(도 10의 (c) 참조).
백신주 접종 및 공격접종에 의해 혈중 내 IgM 및 IgG 항체가가 높게 형성되었으며, 이상의 결과를 통해, 로타바이러스의 혈액을 통한 전파를 차단할 수 있다는 것을 확인하였다.
실험예 14. 백신 및 공격접종한 송아지에서 분변 내 항체가 검사
백신 전 및 백신 및 공격접종 후 매일 채취한 분변 중에서 백신 접종 전 백신 접종 후 1주경 및 2주경, 공격접종 1주경(백신접종 3주경), 공격접종 2주경(백신접종 4주경)의 분변을 선정하여, 하기와 같이 각각의 로타바이러스에 특이적인 분변 내 IgM, IgG 및 IgA의 함량을 ELISA법으로 측정하였다.
즉, 각각의 바이러스 106개를 ELISA용 96-웰 플레이트의 각 웰에 코팅하고 4℃에서 밤새 방치한 후, 1% 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)이 함유된 PBS(pH 7.4)를 넣어 37℃에서 1시간 동안 블로킹 시켰다.
각각의 분변은 PBS로 10배 희석한 후, 4℃ 원심분리기를 통해 원심분리하고 상층액을 수거하였다. 분변 상층액은 다시 1% BSA가 포함된 PBS로 2진 희석한 후, 상술한 ELISA용 96-웰 플레이트의 각 웰에 분주한 후 25℃에서 2시간 감작시켰다.
이후 돼지의 IgM, IgG 및 IgA에 특이적인 퍼옥시다아제-공여된 항체를 각 웰에 분주한 후 ELISA법을 통해 각각의 항체가를 측정하였다.
실험 결과, 분변 내 KJ11V-80 백신주에 대한 항체가 중 KJ11V-80주에 특이적인 IgA가 백신 접종 후 1주부터 관찰된 후 지속적으로 증가되었지만 IgM 및 IgG의 항체가는 분변 내에서 거의 관찰되지 않음을 확인하였다(도 11의 (a) 참조).
KJ19-2V-80 백신주에 대한 항체가를 ELISA법으로 검사한 결과, KJ19-2V-80주에 특이적인 IgA가 백신 접종 후 1주부터 관찰된 후 지속적으로 증가되었지만, IgG의 항체가는 분변 내에서 관찰되지 않았고, IgM은 3주 및 4주에서 약간 관찰되었음을 확인하였다(도 11의 (b) 참조).
KJ44V-80 백신주에 대한 항체가를 ELISA법으로 검사한 결과, KJ44V-80주에 특이적인 IgA가 백신 접종 후 1주부터 관찰된 후 4주째까지 높은 항체가를 유지하였지만, IgM 및 IgG의 항체가는 분변 내에서 거의 관찰되지 않았다(도 11의 (c) 참조).
이상의 결과를 통해, 장관 내 로타바이러스 중화에 중심적인 역할을 하는 분비형 IgA는 각각의 소 로타바이러스 백신주의 구강 접종에 의해 7일경부터 높게 관찰되어, 공격주를 효과적으로 방어할 수 있게 함을 확인하였다.
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이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> MIXED LIVE ATTENUATED VACCINE COMPOSITION FOR PROTECTING BOVINE ROTAVIRUS INFECTION <130> 09010 <160> 52 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GEN-VP1F forward <400> 1 ggctattaaa gctrtacaat ggggaag 27 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GEN-VP1F reverse <400> 2 tcccactggg amacgtctgt atat 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GEN-VP1F forward <400> 3 gaattctact cacagtcaaa t 21 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GEN-VP1F reverse <400> 4 ggtcacatct aagcgctcta atctts 26 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1-5 reverse <400> 5 cgagttcatt cgccgtcaaa tctgcttc 28 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1-3 forward <400> 6 tttcactagg agtcccacca gttgatgc 28 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP2 forward <400> 7 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Claims (10)

  1. 소 로타바이러스주 KJ11의 약독화주 KJ11V-80(수탁번호 : KCTC 13432BP), KJ19-2의 약독화주 KJ19-2V-80(수탁번호 : KCTC 13433BP) 및 KJ44의 약독화주 KJ44V-80(수탁번호 : KCTC 13434BP)를 포함하는 소 로타바이러스 감염증 예방용 백신 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항의 소 로타바이러스 감염증 예방용 백신 조성물을 포함하는 소 로타바이러스 감염증 예방용 생백신.
  4. 제3항에 있어서, 백신보호제, 면역 강화제 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인 소 로타바이러스 감염증 예방용 생백신.
  5. 제4항에 있어서, 상기 백신보호제는 락토오스 포스페이트 글루타메이트 젤라틴 혼합물인 것인 소 로타바이러스 감염증 예방용 생백신.
  6. 제1항의 소 로타바이러스 감염증 예방용 백신 조성물을 포함하는 소 로타바이러스 감염증 예방용 불활화 백신.
  7. 제6항에 있어서, 상기 불활화는 바이러스주에 포르말린을 첨가함으로써 이루어지는 것인 소 로타바이러스 감염증 예방용 불활화　백신.
  8. 제3항의 생백신 또는 제6항의 불활화 백신의 면역 유효량을 소에게 경구 또는 주사 투여하는 단계를 포함하는 소에서 소 로타바이러스 감염증에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는 방법.
  9. 제3항의 생백신 또는 제6항의 불활화 백신을 임신 후기의 모우에게 경구 또는 주사 투여하는 단계; 및
    상기 모우로부터 분만된 송아지에게 상기 모우의 초유를 수유하는 단계를 포함하는 소에서 소 로타바이러스 감염증에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는 방법.
  10. 소 로타바이러스주 KJ11의 약독화주 KJ11V-80(수탁번호 : KCTC 13432BP), 소 로타바이러스주 KJ19-2의 약독화주 KJ19-2V-80(수탁번호 : KCTC 13433BP) 및 소 로타바이러스주 KJ44의 약독화주 KJ44V-80(수탁번호 : KCTC 13434BP)로 이루어진 혼합 균주.
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