KR20100101216A - 약독화된 닭전염성 기관지염 바이러스 및 이를 포함하는 닭전염성 기관지염 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 약독화된 닭전염성 기관지염 바이러스 및 이를 포함하는 닭전염성 기관지염 백신에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 국내사육 닭에서 분리된 닭전염성 기관지염 바이러스 야외분리주의 독력을 약화시킨 약독화된 닭전염성 기관지염 바이러스 및 이를 포함하는 닭전염성 기관지염 백신에 관한 것이다. 본 발명의 약독화된 닭전염성 기관지염 바이러스는 닭에서의 독력이 없으면서도 호흡기형 닭전염성 기관지염 바이러스뿐만 아니라 신장형 닭전염성 기관지염 바이러스에 대해서도 탁월한 예방 효과를 나타내므로, 호흡기형 뿐만 아니라 신장형 닭전염성 기관지염 백신으로도 유용하게 사용할 수 있다.

닭전염성 기관지염, 닭전염성 기관지염 바이러스, 한국 호흡기형, 백신

Description

약독화된 닭전염성 기관지염 바이러스 및 이를 포함하는 닭전염성 기관지염 백신{Attenuated Avian Infectious Bronchitis Virus and Vaccine for Avian Infectious Bronchitis Comprising the Same}

본 발명은 닭의 악성 전염병인 닭전염성 기관지염(infectious bronchitis; 이하, "IB"라 함)을 예방할 수 있는 약독화된 닭전염성 기관지염 바이러스(infectious bronchitis virus; 이하, "IBV"라 함) 및 이를 포함하는 닭전염성 기관지염 백신에 관한 것이다.

IB는 닭의 급성 호흡기성 전염병으로 양계산업이 있는 대부분의 국가에서 발생하고 있다. 이 질병은 계육(닭고기) 판매를 목적으로 하는 육계(broiler)의 경우 어린 연령에 감염시 심한 호흡기 증상, 신장염과 성장 지연에 따른 증체율 저하를, 계란 판매를 목적으로 하는 산란계(layer)의 경우 심한 산란율 저하와 비정상 기형란 발생 증가 등을 유발하여 양계의 생산성을 크게 악화시킨다.

이 질병을 일으키는 병원체는 코로나비리데(Coronaviridae) 코로나바이러 스(coronavirus) 그룹 3(group 3)에 속하는 IBV이다. IBV는 1936년 Beach & Schalm에 의해 처음으로 보고되었으며, 1960년대까지 매사추세츠 혈청형(이하, "Mass형"이라 함)만이 존재하는 것으로 알려졌다. 그 이후부터 현재까지 지속적으로 IBV의 새로운 혈청형(serotype)이 존재한다는 것이 여러 국가들에서 보고되고 있다. IBV의 다양한 혈청형 출현은 야외 바이러스들간 유전자 재조합, 바이러스 유전자내 자체 돌연변이 등을 통해 지속적으로 유전적 변이가 일어나고 있음을 의미한다. IBV는 현재 전 세계적으로 수십개 이상의 다양한 혈청형이 존재하고 있는 것으로 추정되고 있으며, IBV의 혈청형 분포는 지역이나 국가 상황에 따라 다양하다. 특히, IBV는 혈청형간에 상호 교차 방어가 거의 이루어지지 않기 때문에, 닭의 피해 예방을 위해 백신을 사용하여야 할 경우 야외 농장에서 유행하는 바이러스와 동일한 바이러스 혈청형으로 제조한 백신을 사용하여야만 올바른 예방 효과를 기대할 수 있다.

한편, 국내 IBV 유행 상황을 살펴보면, 1986년 국내 산란계 농장에서 심한 호흡기 증상과 기형란 발생 및 산란율 저하 등을 유발하는 한국 호흡기형 IB가 처음으로 확인되었고, 1991년 어린 닭에서 신장염을 동반한 높은 폐사율과 산란계에서의 산란저하 피해를 유발하는 한국 신장형 IB가 국내에 처음으로 출현하였다. 그 후 국내 양계농장에서 한국 호흡기형 IB와 한국 신장형 IB가 동시에 발생하여 왔다. 최근 이 등(2008)의 연구결과에 의하면 한국호흡기형(이하, "K-Ⅰ형"이라 함), 한국 신장형(이하, "K-Ⅱ형"이라 함) 및 장친화유사형(이하, "K-Ⅲ형"이라 함)이 국내 양계 농장에서 유행하고 있고 있는 것으로 파악되고 있다.

국내의 경우 1980년대 후반부터 현재까지 닭에서의 IB 발생 피해에 예방하기 위하여 IBV 백신 접종을 지속적으로 실시하여 왔다. IB 발생이 처음 확인된 직후인 1980년대 후반부터 지금까지 Mass형 IBV 예방 백신(예, H120주)이 생독 및 사독 백신 형태로 사용되고 있으며, K-Ⅱ형 IB 발생이 확인된 이후인 1997년부터는 K-Ⅱa형 IBV 분리주인 KM91주를 이용한 사독 백신이 개발되어 Mass형 백신과 함께 사용되기 시작하였다. 최근에는 KM91주와 유전형이 동일한 K2주를 이용한 K-Ⅱ형 생독 및 사독 백신이 개발되어 사용되고 있다. 그러나, 이와 같은 지속적인 백신 접종에도 불구하고 양계농장에서 IB에 의한 피해는 여전히 심각하게 발생하고 있는 실정이다.

전술한 바와 같이 IBV는 기존 유행 바이러스로부터 자체 돌연변이 또는 바이러스간 유전자 재조합 등을 통해 항원적으로 변이된 변이주가 출현할 수 있으며, 이러한 변이형 바이러스의 경우 기존 바이러스와 항원적 차이로 인해 교차방어가 효과적으로 이루어지지 않는 상황을 초래하기도 한다. 다시 말해, 최근 백신 접종에도 불구하고 피해가 발생하는 원인으로는 현재 국내에서 유행하는 IBV가 종래의 백신 바이러스와 항원성에 차이가 있다는 점을 들 수 있다. 따라서, 국내 유행하는 IBV에 대한 특이성이 높은 새로운 백신의 개발이 요구되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래 IBV 백신의 문제점을 개선하기 위해 안출된 것으로서, 국내 유행하는 한국 호흡기형 IBV 야외 분리주를 선발한 후 닭에서의 독력을 약화시킨 신규한 IBV 스트레인(strain) 및 상기 약독화된 IBV 스트레인을 포함하는 IB 예방용 백신을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 닭에서의 IB를 예방할 수 있는 약독화된 IBV 스트레인을 제공한다.

본 발명의 약독화된 IBV 스트레인은 IBV 바이러스의 중화능 및 혈청형 등을 결정짓는 주요 단백질인 S1 단백질의 초가변 부위(hypervariable region, HVR)에 돌연변이가 발생한 것을 특징으로 한다. 상기 돌연변이 S1 단백질은 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 또한 상기 돌연변이 S1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 포함하는 것이 바람직하지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 돌연변이 S1 단백질은 IBV 야외분리주를 종란에서 40대 이상, 바람직하게는 50대 이상, 보다 바람직하게는 60대 이상, 특히 바람직하게는 80대 이상을 계대배양하여 닭에 대한 독력을 약화시킴으로써 작성될 수 있으며, 상기 S1 단백질의 56번째 아미노산이 세린(S)에서 티로신(Y)으로 변이되어, 원종인 IBV 야외분리주의 독성은 상실되고 바이러스의 증식성은 그대로 유지하고 있는 것을 특징으로 한다(도 3 참조). 상기 계대 배양 횟수에는 특별한 제한은 없지만, 야외분리주 바이러스 스트레인이 원하는 약독화 정도를 달성할 수 있는 시간 및 비용적인 측면을 고려할 때, 100대 이내의 횟수로 계대 배양을 하는 것이 바람직하다. 한 바람직한 구현예에서, 본 발명자들은 상기와 같은 특성을 갖는 약독화된 IBV 스트레인을 "IBV AVR1/08 스트레인"이라 명명하고, 2009년 2월 17일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 11467BP). 본 발명의 한 바람직한 구현예에 따르면, IBV S1의 초가변 부위 핵산 염기서열을 기초로 계통분류학적 분석(phylogenetic analysis)을 실시하여 IBV 유전형을 분석한 결과, 상기 IBV AVR1/08 스트레인은 K-Ⅱa 유전형에 속하는 한국 호흡기형 IBV인 것으로 확인되었다(도 4 참조). 또한, 상기 IBV AVR1/08 스트레인의 계대수별 바이러스 증식 역가를 측정한 결과, 47대 이상 계대하였을 때 그 이전 계대수에서 보다 최소 10배 이상 증식성이 향상된 것으로 나타났다(도 5 참조).

본 발명의 IBV 약독주 AVR1/08 스트레인은 닭에서 병원성을 나타내지 않지만 증식성은 그대로 갖고 있으며, 국내 사육 닭에서 호흡기형 IB 뿐만 아니라 신장형 IB에 대하여도 탁월한 예방 효과를 나타낸다. 본 발명의 약독화된 IBV 스트레인의 증식 방법, 계란내 접종과정, 배양 조건, 백신제조 방법 및 제조시약 등은 종래 당 업계에 통상적으로 알려져 있는 임의의 방법을 제한없이 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 약독화된 IBV 스트레인을 포함하는 IB 예방용 백신을 제공한다.

상기 약독화된 IBV 스트레인은 S1 단백질의 초가변 부위에 돌연변이가 발생한 것으로서, 상기 돌연변이 S1 단백질은 56번째 아미노산이 세린(S)에서 티로신(Y)으로 변이된 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 약독화된 IBV 스트레인은 IBV AVR1/08 스트레인(기탁번호: KCTC 11467BP)이다. 본 발명의 IB 예방용 백신은 조류, 바람직하게는 닭에서 병원성을 나타내지 않으며, 호흡기형 IB 뿐만 아니라 신장형 IB에 대하여도 탁월한 예방 효과를 나타낸다. 본 발명의 IB 예방용 백신은 상기 약독화된 IBV 비리온(virion) 입자를 사용하여 제조하는 생독 및 사독 예방 백신뿐만 아니라, 상기 약독화된 IBV의 유전자를 사용하여 생산한 IBV 서브유니트(subunit) 백신, 벡터(vector) 백신, 키메라(chimera) 백신, DNA 백신 등과 같은 다양한 형태로 제조될 수 있으므로, 그 활용도가 매우 넓다.

본 발명의 약독화된 IBV 스트레인의 배양 및 증식은 조류, 바람직하게는 닭의 개체 또는 세포에서 수행할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 계란의 장요막강(allantoic cavity) 내에 상기 약독화된 IBV를 접종한 후 부란기에서 배양함으로써 바이러스를 증식시킬 수 있다.

본 발명의 IB 예방용 백신을 제조하기 위하여, 상기 약독화된 IBV 바이러스는 화학적 처리(예를 들면, 포르말린 또는 포름알데히드, β-프로피오락톤, 에틸렌이민, 바이너리 에틸렌이민(BEI)) 및/또는 열처리를 수행할 수도 있으며, 브로모에틸아민(BEA)을 사용하기 직전에 형성된 에틸아민을 작용시켜 불활성화하는 것이 바 람직하다. 바이러스 입자는 종래의 농축 기술, 특히 한외여과(ultrafiltration)에 의해 농축한 후, 선택적으로 종래의 정제 수단, 특히 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 존재 하의 겔 여과법 또는 선택적 침전법에 의해 정제될 수 있으며, 사전 농축과정 없이 정제를 행할 수도 있다.

본 발명의 IB 예방용 백신을 제조하기 위하여, 상기 약독화된 IBV 입자는 그 자체로 사용할 수도 있지만, 수의학적으로 수용가능한 매개체 또는 부형제 내에 장입할 수 있고, 선택적으로 아주번트(adjuvant)로 보충할 수 있다. 이를 위하여, 아주번트로서 수산화알루미늄을 사용하거나, 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체, 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 중합체 등을 사용할 수 있고, 백신을 오일-인-워터(oil-in-water) 에멀젼 형태로 제형화할 수 있다.

상기 오일-인-워터 에멀젼은 특히 액체 파라핀 경유(유럽 약전 타입); 스쿠알란, 스쿠알렌과 같은 이소프레노이드 오일; 이소부텐 또는 데센의 존재 하에 알켄의 올리고머화로 얻어지는 오일; 선형 알킬기를 함유하는 산 또는 알코올의 에스테르, 특히 식물유, 에틸올레에이트, 프로필렌 글리콜 디(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴트리(카프릴레이트/카프레이트), 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지형 지방산 알코올 또는 산의 에스테르, 특히 이소스테아르산의 에스테르 등을 기본으로 할 수 있다. 에멀젼을 형성하기 위해 상기 오일은 유화제와 혼합하여 사용된다. 바람직한 유화제로는 비이온성 계면활성제, 특히 소르비탄, 만나이드, 글리세롤, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜의 에스테르, 및 선택적으로 에톡시화되어 있는 올레산, 이소스테아르산, 리신올레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르, 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체 등이 있다.

상기 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체는 특히 당 또는 폴리알코올의 폴리알케닐 에테르로 가교결합되어 있다. 이들 화합물은 카보머(carbomer)라는 명칭으로 알려져 있다. 또한, 상기 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체 중에서 말레산 무수물과 에틸렌의 공중합체로는 선형 또는 예를 들면 디비닐 에테르와 가교결합된 EMA^(R) 공중합체(Monsanto사)가 사용될 수 있다. 최종 백신 조성물에서의 중합체 농도는 0.01% 내지 1.5% W/V, 보다 구체적으로는 0.05% 내지 1% W/V, 바람직하게는 0.1% 내지 0.4% W/V일 수 있다.

본 발명의 IB 예방용 백신은 또한 수의학적으로 수용가능한 매개체 또는 부형제 및 바람직하게는 아주번트, 특히 전술한 것 중 하나에 들어있는 본 발명의 약독화된 IBV 스트레인 및 그 등가물을 포함하고, 선택적으로는 적어도 하나의 다른 공지된 약독화된 IBV 스트레인을 포함할 수 있다. 상기 다른 공지된 약독화된 IBV 스트레인으로는 특별히 제한되지 않지만, Mass형 IBV 분리주인 H120주, K-Ⅱ형 IBV 분리주인 KM91주 또는 K2주를 예시할 수 있다. 본 발명에 따른 백신은 사용 직전에 약독화된 생 백신, 불활성화 백신, 서브유닛 백신, 재조합 백신 또는 폴리뉴클레오티드 백신의 형태일 수 있는 다른 적어도 하나의 다른 공지된 약독화된 IBV 스트레인과 혼합될 수 있다.

본 발명의 백신에 있어서, 선택적으로 추출 전 또는 추출 후에 불활성화하면서 바이러스로부터 캡시드를 추출함으로써 서브유닛 백신을 제조할 수 있다. 따라 서, 본 발명의 백신은 유일한 활성 성분 또는 그 외의 것으로서, 주로 캡시드 단백질 및 선택적으로 아단편(subfragment)을 함유하는 추출 산물, 선택적으로 불활성화되고, 본 발명에 따른 약독화된 IBV 스트레인 또는 그 등가물로부터 제조되고, 선택적으로 다른 공지된 약독화된 IBV 스트레인으로부터 제조된 추출 산물을 포함할 수 있다. 이들 서브유닛 백신은 예를 들면 전술한 바와 같은 아주번트로 보충하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약독화된 IBV 스트레인은 조류, 특히 닭에서의 독력이 없으면서도 호흡기형 IBV 뿐만 아니라 신장형 IBV에 대해서도 탁월한 예방 효과를 나타내며, 닭에서의 역계대후에도 병원성이 회복되지 않기 때문에 생독 백신용으로 사용하기에도 적합하다. 또한, 사독 백신의 경우 일반적으로 생독 백신을 접종한 닭에서 보강접종용으로 사용하기 때문에, 본 발명의 약독화된 IBV 스트레인은 사독 백신용으로도 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 내용을 한정하기 위한 것은 아니다. 따라서, 당 업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 과정 또한 본 발명의 범주에 포함된다.

실시예 1. 호흡기형 IBV D85/06 스트레인의 분리 및 동정

한국 호흡기형 IBV 야외분리주 D85/06 스트레인은 2006년 IB 백신 예방 접종을 실시했던 경기도의 한 양계장에서 약한 호흡기 증상과 흰색 설사를 나타내며 폐사한 80일령의 토종닭으로부터 분리하였다(이 등, Avian Diseases, 2008, 52, 332-337). 보다 구체적으로, 폐사 닭의 맹장편도(cecal tonsil) 조직에 최종 농도가 10%(w/v)가 되도록 0.01M PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4) 용액을 첨가하여 유제하였다. 유제한 조직을 원심분리기에서 1,500g에서 30분간 원심분리한 후, 원심 상층액을 일회용 0.45㎛ 여과기로 여과하여 바이러스 분리용 접종 시료를 준비하였다. 그 후, 10일령 특정병원체부재(specific pathogen free, 이하 "SPF"라 약칭함) 종란의 장요막강 내로 계란당 0.1㎖씩 접종 시료를 접종한 후, 37℃ 부란기에 넣고 5일간 배양하였다. 접종후 24시간 이내에 계태아(chicken embryo)가 폐사한 경우 접종 실수로 판단하여 제외하였다. 그 후 종란을 부란기에서 꺼내어 4℃에서 4시간 동안 냉각사(chilling)시켰고, 종란의 난각을 제거한 다음 장요막강액을 무균적으로 채취하여 바이러스 동정용 시료로 사용하였다. 접종 시료를 접종한 계란의 장요막강액을 무균적으로 채취하여 이 등(Avian Diseases, 2008)이 사용한 역전사 중합효소연쇄반응법(reverse transcriptase polymerase chain reaction, 이하 "RT-PCR법"이라 약칭함)으로 검사한 결과 IBV로 동정되었다.

상기한 RT-PCR에 의해 증폭된 핵산 산물을 사용하여 유전자 염기서열 분석을 실시하였고, 염기서열 결과중 IBV S1의 초가변 부위 핵산 염기서열을 기초로 계통 분류학적 분석(phylogenetic analysis)을 실시하여 IBV 유전형을 분석하였다. 그 결과, IBV D85/06 스트레인은 이 등(Avian Diseases, 2008)이 보고한 바와 같이 계통분류학적 방법과 분류기준에 따라 K-Ⅱa 유전형에 속하는 한국 호흡기형 IBV인 것으로 확인되었다(도 4).

실시예 2. 한국 호흡기형 IBV AVR1/08 백신 스트레인의 작성

IBV의 백신 스트레인은 상기 D85/06 스트레인을 실시예 1의 방법에 따라 9일령 내지 11일령의 SPF 종란에 연속으로 계대하여 바이러스 독력을 순화시킴으로서 작성되었다. 구체적으로, 한국 호흡기형 IBV D85/06 스트레인을 9일 내지 11일령의 SPF 종란에 접종하고, 48시간 후에 종란의 장요막강액을 채독한 후, 채독한 바이러스액을 동일한 방법으로 다시 새로운 SPF 종란에 접종하는 방법으로 IBV를 반복 계대하였다. 각 IBV 스트레인은 종란에서 매 10대 계대할 때마다 접종 종란의 장요막강액을 RT-PCR법으로 검사하여 IBV의 존재 여부를 조사하였고, PBS 완충용액으로 10단계 희석한 바이러스액을 상기와 동일한 방법으로 희석액당 최소 5개 종란에 접종하여 일주일 동안 배양한 후, 종란 계태아의 IBV 감염 여부를 판독하여 감염 역가를 측정하였다. 본 발명자들은 IBV D85/06 스트레인을 SPF 종란에서 80대 이상 연속 계대하여 약독주를 작성하였고, 이를 "IBV AVR1/08 스트레인"으로 명명하였다. 작성된 IBV AVR1/08 스트레인을 종란에 접종한 후 바이러스가 다량 함유된 장요막강액을 채독하여 바이러스 증식성을 조사한 결과, SPF 종란에서 채독된 IBV AVR1/08 스트레인은 최소 10^7.0 EID₅₀(embryo infective dose 50)의 증식성을 나타내었다. 상기 EID₅₀은 종란 계태아의 50%를 감염시키는 바이러스액 희석 배수의 역수를 나타낸 것으로서, Reed & Muench의 방법에 따라 산출하였다(Reed LJ, Muench H., American J Hyg, 1938, 27, 493-497). 본 발명자들은 상기 IBV AVR1/08 스트레인을 2009년 2월 17일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 11467BP).

실시예 3. IBV AVR1/08 백신 스트레인의 증식 배양 및 역가 측정

IBV AVR1/08 스트레인의 증식은 IBV AVR1/08 접종액을 9 내지 11일령 SPF 종란의 장요막강 내로 계란당 0.1㎖씩 접종한 후, 37℃ 부란기에서 넣고 5일간 배양하였다. 접종 2일후 종란을 부란기에서 꺼내어 4℃에서 4시간 동안 방치하여 냉각사시켰다. 그 후 종란의 난각을 제거한 후 장요막강액을 무균적으로 채취함으로서 바이러스를 증식시켰다. 종란내 바이러스 증식 여부는 이 등(Avian Diseases, 2008)이 사용한 RT-PCR법을 실시하여 IBV 특이 유전자가 증폭되는지 여부로 판정하였다. 이 후, SPF 종란을 사용하여 실시예 2에 기재된 방법에 따라 IBV의 감염 역가를 측정하였으며, 바이러스의 감염 역가는 EID₅₀으로 나타내었다.

그 결과, SPF 종란내 바이러스 증식 역가를 측정하였을 때 백신 스트레인인 IBV AVR1/08 스트레인(10^7.8 EID₅₀)은 약독화 이전 단계인 IBV 야외분리주 D85/06 스 트레인(10^6.5 EID₅₀)에 비해 최소 10배 이상 증식성이 향상되었음을 확인하였다(도 5).

실시예 4. IBV AVR1/08 스트레인의 S1 단백질 변이 여부 분석

IBV AVR1/08 스트레인의 돌연변이 여부를 분석하기 위하여, 바이러스의 중화능 및 혈청형 등을 결정짓는 주요 부위인 IBV의 S1 단백질 초가변 부위 유전자를 증폭하여 염기서열을 분석하였다. 구체적으로, IBV 야외분리주 D85/06 스트레인 및 IBV 백신주 AVR1/08 스트레인으로부터 각각 IBV 게놈을 이 등(Avian diseases, 2008)이 실시한 방법에 따라 추출하여 RT-PCR 방법에 의해 S1 단백질의 HVR 부위 약 640 bp를 증폭시켰다. RT-PCR을 위한 프라이머 세트로는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 사용하였다. IBV S1 단백질 유전자의 핵산 염기서열은 자동염기서열분석기(ABI 377, USA)를 사용하여 RT-PCR 증폭산물로부터 직접 분석하였으며, IBV 야외분리주 D85/06 스트레인 및 IBV 백신주 AVR1/08 스트레인의 S1 단백질의 돌연변이 여부를 조사한 결과를 도 3에 나타내었다.

그 결과, 본 발명의 IBV AVR1/08 스트레인의 S1 단백질의 핵산 염기서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되며(도 1 및 도 2), IBV 야외분리주 D85/06 스트레인을 SPF 종란에서 계대한 IBV의 S1 단백질의 돌연변이 부위 근처에서의 아미노산 서열은 각각 서열번호 5(3대, 13대, 23대 및 33대 계대) 및 서열번호 6(43대, 53대, 74대, 83대 및 93대 계대)으로 기재되는 것으로 나타났 다. 즉, IBV 야외분리주 D85/06 스트레인을 SPF 종란에서 40대 이상 계대하였을 때, 56번째 아미노산이 세린(S)에서 티로신(Y)으로 변이되었음을 확인하였다. 이로부터, IBV AVR1/08 스트레인은 원종인 IBV D85/06 스트레인의 S1 단백질 56번째 아미노산에서 돌연변이가 일어난 바이러스라는 것을 알 수 있다.

다음으로, 본 발명의 IBV 약독주 AVR1/08 스트레인의 백신으로서의 효능을 평가하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

실험예 1. IBV AVR1/08 스트레인의 닭에 대한 병원성 측정

3일 내지 5일령 SPF 닭에서 IBV 약독주 AVR1/08 스트레인의 닭에 대한 병원성 조사를 실시하였다. 바이러스 군당 1일령 병아리 10수씩 사용하였으며, 병아리 1수당 10^4.5 EID₅₀ 씩 바이러스를 점안 접종법(eye drop)으로 공격 접종하였다. 양성 대조군으로는 IBV 야외분리주 D85/06 스트레인을 동일한 방법으로 접종하였고, 음성 대조군으로는 1일령 SPF 병아리 10수를 PBS 완충용액을 동일한 방법으로 접종하였다. 임상증상이나 폐사율을 인공감염후 14일 동안 관찰하였으며, 공격 접종후 14일 동안 닭에서 호흡기 증상과 폐사가 없을 경우 비병원성 IBV으로 판정하였다. 닭에 대한 IBV의 병원성 조사 결과를 하기 표 1에 요약하였다.

병원성 실험 결과, IBV AVR1/08 스트레인을 접종한 닭은 관찰기간 동안 모든 개체에서 호흡기 증상이나 폐사가 나타나지 않았으며, 관찰기간이 경과한 후 부검 소견을 조사하였을 때 호흡기 점막 병변 등과 같은 IB의 특징적인 병변이 관찰되지 않았다. 반면, IBV 야외분리주 D85/06 스트레인을 접종한 닭의 경우 공격접종 5일째부터 30%(3/10)에서 호흡기 증상이 관찰되었다. 그러나, 음성 대조군 닭 10수는 14일간의 관찰기간 동안 어떠한 임상 증상을 나타내지 않았다. 상기 결과는 IBV 야외분리주인 D85/06 스트레인에 비해 IBV AVR1/08 스트레인의 독력이 약화되어 있다는 것을 나타내는 것으로서, IBV AVR1/08 스트레인은 닭에 대해 비병원성 IBV임을 보여준다.

또한, 인공감염 14일째 모든 실험 닭을 안락사시킨 후 기관(trachea)과 신장(kidney) 조직시료를 채취하여 실시예 1의 방법에 따라 바이러스 재분리 여부를 조사한 결과, IBV AVR1/08 스트레인과 IBV D85/06 스트레인의 재분리율은 기관의 경우 각각 30%, 60%, 신장의 경우 10%, 40%였다. 이에 대해, 대조군 닭들에서의 기관 및 신장에서의 바이러스 재분리율은 모두 0%였다.

IBV AVR1/08 스트레인의 닭에 대한 병원성 조사

군	접종수수	폐사	호흡기 증상	신장염/ 요산침착	바이러스 분리*
					기관	신장
AVR1/08 접종군	10	0/10**	0/10	0/10	3/10	1/10
D85/06 접종군	10	0/10	3/10	0/10	6/10	4/10
대조군	10	0/10	0/10	0/10	0/10	0/10

* 공격접종 2주후 검사결과

** 양성수수/검사수수

실험예 2. IBV AVR1/08 스트레인의 한국 호흡기형 IB에 대한 방어 효능 평가

IBV AVR1/08 스트레인으로 면역시킨 닭을 대상으로 최근 국내 유행하는 IBV에 대한 방어 효능을 측정하였다. 본 발명의 IBV AVR1/08 스트레인을 수당 10^3.5 EID₅₀씩 8수의 3주령 SPF 닭에 점안으로 접종하였다. 방어 효능을 비교 평가하기 위하여, 종래 IBV 호흡기형 백신 바이러스인 H120 스트레인으로 동일한 방법으로 면역한 군을 백신 대조군으로 사용하였다. 음성 대조군은 3주령 SPF 닭 16수에 PBS 용액을 동일한 방법으로 접종한 것을 사용하였다. 면역후 3주가 경과한 시점에서 대조군 닭 8수를 제외한 모든 실험 닭에 한국 호흡기형 야외분리주 IBV D85/06 스트레인을 수당 10^4.5 EID₅₀씩 점안 접종한 후 5일간 임상증상 및 폐사여부를 관찰하였다. 접종 5일째에 닭을 모두 안락사시킨 후 부검하여 병변을 관찰하였고, 바이러스 분리를 위하여 기관 및 신장 조직시료를 무균적으로 채취하였다. 장기로부터의 바이러스 분리 검사는 실시예 1의 방법에 의한 종란내 접종법으로 실시하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

IBV AVR1/08 스트레인의 한국 호흡기형 IBV에 대한 방어 효능 실험 결과, 본 발명의 IBV AVR1/08 스트레인으로 면역한 군의 경우 기관과 신장에서 모두 0%(0/8) 및 0%(0/8)의 바이러스 재분리율을 보인 반면, 현재 국내에서 사용중인 호흡기형 IB 백신인 H120 스트레인으로 면역한 경우에는 기관과 신장에서 각각 37.5%(3/8)의 바이러스 재분리율을 보였다. 비면역 공격접종 대조군 닭의 경우 기관과 신장에서의 바이러스 재분리율은 각각 100%(8/8) 및 75%(6/8)였다. 비면역 비공격접종 대조군 닭에서는 모두 바이러스가 분리되지 않았다. 상기 결과로부터, 본 발명의 AVR1/08 스트레인은 한국 호흡기형 IBV에 대해 방어 효과가 매우 탁월함을 확인하였다.

IBV AVR1/08 스트레인으로 면역시킨 닭에서의 한국호흡기형 IBV 방어 효능 실험 결과

백신군	공격바이러스	접종수수	바이러스 재분리
			기관	신장
AVR1/08 백신군	D85/06	8	0/8*	0/8
H120 접종군(백신대조군)	D85/06	8	3/8	3/8
음성 대조군 1	D85/06	8	8/8	7/8
음성 대조군 2	-	8	0/8	0/8

* 양성수수/검사수수

실험예 3. IBV AVR1/08 스트레인의 한국 신장형 IB에 대한 방어 효능 평가

IBV AVR1/08 스트레인으로 면역시킨 닭에서 최근 국내 유행하는 IBV에 대한 방어 효능을 측정하였다. 본 발명의 IBV AVR1/08 스트레인을 수당 10^3.5 EID₅₀씩 3주령 SPF 닭에 점안으로 접종하였다. 방어 효능을 비교 평가하기 위하여 종래 IBV 호흡기형 백신 바이러스인 H120 스트레인으로 동일한 방법으로 면역한 군을 백신대조군으로 사용하였다. 음성 대조군은 3주령 SPF 닭에 PBS 용액을 동일한 방법으로 접종한 것을 사용하였다. 면역후 3주가 경과한 시점에서 대조군 닭 8수를 제외한 모든 실험 닭에 한국 신장형 야외분리주 IBV Kr/Q43/06(이하, "Q43/06"이라 함) 스트레인(이 등, Avian Diseases 2008)을 수당 10^4.5 EID₅₀씩 점안 접종한 후 5일간 임상증상 및 폐사여부를 관찰하였다. 접종 5일째 닭은 모두 안락사시킨 후 부검하여 병변을 관찰하고 바이러스 분리를 위하여 기관 및 신장 조직시료를 무균적으로 채취하였다. 장기로부터의 바이러스 분리 검사는 실시예 1의 방법에 의한 종란내 접종법으로 실시하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

IBV AVR1/08 스트레인의 한국 신장형 IBV에 대한 방어 효능 실험 결과, 본 발명의 IBV AVR1/08 스트레인으로 면역한 군의 경우 기관과 신장에서 각각 0%(0/9) 및 11.1%(1/9)의 바이러스 재분리율을 보인 반면, 현재 국내에서 사용중인 호흡기형 IB 백신인 H120 스트레인으로 면역한 경우에는 기관과 신장에서 각각 37.5%(3/8)의 바이러스 재분리율을 보였다. 비면역 공격접종 대조군 닭의 경우 기관과 신장에서의 바이러스 재분리율은 각각 100%(6/6) 및 67%(4/6)였다. 비면역 비공격접종 대조군 닭에서는 모두 바이러스가 분리되지 않았다. 상기 결과로부터, 본 발명의 AVR1/08 스트레인은 한국 신장형 IBV에 대해서도 방어 효과가 매우 탁월함을 확인하였다.

IBV AVR1/08 스트레인으로 면역시킨 닭에서의 한국신장형 IBV 방어 효능 실험 결과

백신군	공격바이러스	접종수수	바이러스 재분리
			기관	신장
AVR1/08 백신군	Q43/06	9	0/9*	1/9
H120 접종군(백신대조군)	Q43/06	8	3/8	3/8
음성 대조군 1	Q43/06	6	6/6	4/6
음성 대조군 2	-	8	0/8	0/8

* 양성수수/검사수수

실험예 4. IBV AVR1/08 스트레인에 대한 병원성 회복 여부 시험

3일령 내지 10일령 SPF 닭 최소 3수에 본 발명의 IBV AVR1/08주를 수당 0.1㎖ (10^4.5 EID₅₀)씩 점안 접종하였다. 접종 5일째 닭을 안락사시킨 후 기관을 채취하였다. 이들 조직 시료는 RT-PCR 방법으로 바이러스 존재 여부를 확인하였다. 그 후 기관을 무균적으로 유제한 다음 수당 0.1㎖씩 최소 3수씩 점안 접종하였다. 이러한 방법으로 닭에서 5회 반복 계대하였으며, 최종 5대 계대한 IBV는 실험예 1의 방법에 따라 3내지 5일령 닭에서의 병원성을 조사하였다.

그 결과, 본 발명의 IBV AVR1/08는 닭에서 호흡기 증상과 폐사 등과 같은 임상증상을 나타내지 않았다. 이로부터, 본 발명의 IBV AVR1/08 스트레인이 닭에서 병원성을 회복하지 않는다는 것을 확인하였다.

도 1은 본 발명의 IBV AVR1/08 스트레인의 S1 단백질의 초가변 부위 핵산 염기서열을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 IBV AVR1/08 스트레인의 S1 단백질 초가변 부위 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 3은 IBV 야외분리주인 IBV D85/06 스트레인을 SPF 종란에 연속 계대한 후 S1 단백질의 56번째 아미노산의 변화(세린에서 티로신)가 일어난 것을 나타낸 것이다.

도 4는 IBV의 S1 단백질의 초가변 부위 유전자 염기서열에 기초하여 분석한 계통발생도를 나타낸 것이다.

도 5는 IBV 야외분리주인 IBV D85/06 스트레인을 SPF 종란에 연속 계대하였을 때 계대별 SPF 종란에서의 증식성을 보여주는 그래프로서, 47대 연속계대 이후 증식성이 최소 10배 이상 증가하였음을 나타낸 것이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(Management : Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries. National Veterinary Research and Quarantine Service(NVRQS)) <120> Attenuated Avian Infectious Bronchitis Virus and Vaccine for Avian Infectious Bronchitis Comprising the Same <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for RT-PCR of S1 gene <400> 1 aggaatggta agttrctrgt wagag 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for RT-PCR of S1 gene <400> 2 gcccagtacc rttrayaaaa taagc 25 <210> 3 <211> 642 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus D85A strain <400> 3 atgttggtga ggccattatt tgtagtgacc attttgtttg cactatgtag tgctaattta 60 tatgacaatg atacttttgt ttactactat caaagtgctt tcagaccatc tgttggttgg 120 catttacatg gaggtgcgta tgcagtagtt aatgtgagta ctgagtataa taatgcaggc 180 tccaacagcg aatgcactgc tggtgctatt tattggagta agaattttag tgcttcttct 240 atagccatga cagcacctag tataggcatg tcgtggtcaa caagagaatt ttgtactgct 300 cactgcaatt tttctaatat tgtagtgttt gttactcatt gctttaaaag cggtataggt 360 aattgccctt taacaggttt aattcaaagt ggcttagttc gtgtatctgc tatgaagata 420 ggaggtagtg gacctagcga cttattttat aatttaacag ttcctgtgac taaatatcct 480 aaatttagat cgtttcaatg tgttaataac catacatctg tgtacttaaa tggtgatctt 540 gtttttactt ctaatgagac ccaagatgtt agtgcagcag gtgtgcattt taaagccggt 600 ggacccataa cttataaagt tatgagagaa gttaaagctc tg 642 <210> 4 <211> 214 <212> PRT <213> Infectious bronchitis virus D85A strain <400> 4 Met Leu Val Arg Pro Leu Phe Val Val Thr Ile Leu Phe Ala Leu Cys 1 5 10 15 Ser Ala Asn Leu Tyr Asp Asn Asp Thr Phe Val Tyr Tyr Tyr Gln Ser 20 25 30 Ala Phe Arg Pro Ser Val Gly Trp His Leu His Gly Gly Ala Tyr Ala 35 40 45 Val Val Asn Val Ser Thr Glu Tyr Asn Asn Ala Gly Ser Asn Ser Glu 50 55 60 Cys Thr Ala Gly Ala Ile Tyr Trp Ser Lys Asn Phe Ser Ala Ser Ser 65 70 75 80 Ile Ala Met Thr Ala Pro Ser Ile Gly Met Ser Trp Ser Thr Arg Glu 85 90 95 Phe Cys Thr Ala His Cys Asn Phe Ser Asn Ile Val Val Phe Val Thr 100 105 110 His Cys Phe Lys Ser Gly Ile Gly Asn Cys Pro Leu Thr Gly Leu Ile 115 120 125 Gln Ser Gly Leu Val Arg Val Ser Ala Met Lys Ile Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Pro Ser Asp Leu Phe Tyr Asn Leu Thr Val Pro Val Thr Lys Tyr Pro 145 150 155 160 Lys Phe Arg Ser Phe Gln Cys Val Asn Asn His Thr Ser Val Tyr Leu 165 170 175 Asn Gly Asp Leu Val Phe Thr Ser Asn Glu Thr Gln Asp Val Ser Ala 180 185 190 Ala Gly Val His Phe Lys Ala Gly Gly Pro Ile Thr Tyr Lys Val Met 195 200 205 Arg Glu Val Lys Ala Leu 210 <210> 5 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> parts of the amino acid sequence of S1 protein <400> 5 His Gly Gly Ala Tyr Ala Val Val Asn Val Ser Thr Glu Ser Asn Asn 1 5 10 15 Ala Gly Ser Asn Ser Glu Cys Thr 20 <210> 6 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> parts of amino acid sequence of S1 protein <400> 6 His Gly Gly Ala Tyr Ala Val Val Asn Val Ser Thr Glu Tyr Asn Asn 1 5 10 15 Ala Gly Ser Asn Ser Glu Cys Thr 20

Claims (11)

1. 닭전염성 기관지염 바이러스 야외분리주를 계대배양하여 닭에 대한 독력을 약화시킴으로써 작성되며, S1 단백질의 초가변 부위가 돌연변이된 것을 특징으로 하는 약독화된 닭전염성 기관지염 바이러스 스트레인.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 돌연변이 S1 단백질은 56번째 아미노산이 세린(S)에서 티로신(Y)으로 변이된 것을 특징으로 하는 약독화된 닭전염성 기관지염 바이러스 스트레인.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 돌연변이 S1 단백질은 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약독화된 닭전염성 기관지염 바이러스 스트레인.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 계대배양은 종란에서 40대 이상 수행되는 것을 특징으로 하는 약독화된 닭전염성 기관지염 바이러스 스트레인.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 계대배양은 종란에서 80대 이상 수행되는 것을 특징으로 하는 약독화된 닭전염성 기관지염 바이러스 스트레인.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 약독화된 닭전염성 기관지염 바이러스 스트레인은 IBV AVR1/08 스트레인(수탁번호: KCTC 11467BP)인 것을 특징으로 하는 약독화된 닭전염성 기관지염 바이러스 스트레인.
7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 따른 약독화된 닭전염성 기관지염 바이러스 스트레인을 포함하는 닭전염성 기관지염 예방용 백신.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 백신은 호흡기형 또는 신장형 닭전염성 기관지염에 대한 예방에 사용되는 것을 특징으로 하는 백신.
9. 청구항 7에 있어서, 상기 백신의 형태는 생독 백신, 사독 백신, 약독화된 닭전염성 기관지염 바이러스 스트레인의 유전자를 사용하여 생산한 서브유니트 백신, 벡터 백신, 키메라 백신 및 DNA 백신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신.
10. 청구항 7 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신은 수의학적으로 수용가능한 매개체 또는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
11. 청구항 10에 있어서, 아주번트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.

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