KR101073991B1 - 국내사육 닭에서 유행하는 신규한 ｂ형 조류메타뉴모바이러스 ｓｃ1509주 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 닭에 감염 시 호흡기 기능 장애와 산란 피해를 유발하는 조류메타뉴모바이러스(Avian metapneumovirus; 이하 “AMPV”라 함)를 국내 사육 닭에서 분리한 조류메타뉴모바이러스 SC1509주 및 상기 SC1509 또는 그 등가물을 포함하는 조류메타뉴모바이러스 감염증 예방용 백신에 관한 것이다.

조류메타뉴모바이러스, 백신, 호흡기 장애

Description

국내사육 닭에서 유행하는 신규한 Ｂ형 조류메타뉴모바이러스 ＳＣ1509주 및 이의 용도{Avian metapneumovirus type B SC1509 strain isolated from chicken in Korea and the use thereof}

본 발명은 닭에 감염 시 호흡기 기능 장애와 산란 피해를 유발하는 조류메타뉴모바이러스(Avian metapneumovirus; 이하 “AMPV”라 함)를 국내 사육 닭에서 분리한 조류메타뉴모바이러스 SC1509주 및 상기 SC1509 또는 그 등가물을 포함하는 조류메타뉴모바이러스 감염증 예방용 백신에 관한 것이다.

AMPV 감염증은 닭에서 호흡기 증상, 두부종창증(swollen head syndrome), 산란중인 닭에서의 산란저하 및 비정상 탈색란 생산 등을 유발하는 닭의 호흡기성 바이러스성 전염병으로 양계산업이 있는 대부분의 국가들에서 발생하고 있다.

이 질병을 일으키는 병원체는 파라믹소비리데속(Family Paramyxoviridae) 메타뉴모바이러스과(Genus metapneumovirus)에 속하는 AMPV이다. AMPV는 단일 혈청형(single serotype)만 존재하고 있으며, G 단백질 유전자 염기서열을 기초로 4개 의 유전형(A, B, C 및 D)이 존재하고 있을 것으로 보고되었다. 모든 유전형이 발병하는 칠면조와 달리, 닭의 경우 A 및 B 유전형만이 질병 피해를 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다.

1980년 Buys와 DuPreez는 남아프리카공화국의 칠면조에서 AMPV 감염에 의한 급성 호흡기 증상 사례를 처음으로 보고하였다. 그 이후 1985년 프랑스, 영국 등 유럽에서도 이 질병의 발생이 보고되었으며, 이후 유럽이외의 국가인 이스라엘(1988), 캐나다(1988), 일본(1990), 모로코(1990), 멕시코(1991), 브라질(1992) 및 미국(1997)에서 발생이 보고되었다. 국내의 경우, Lee 등이 2007년 재래시장의 꿩(pheasant)에서 처음으로 C형 AMPV를 분리하여 보고하였다. 그러나, 아직까지 국내에서는 닭에서 질병 피해를 유발하는 유전형인 A 및 B형 AMPV 분리에 성공한 사례가 없었다. 다만, 1992년 두부종창증과 산란저하를 경험한 8개 종계장 12개 계군(flocks) 중 9개 계군에서 높은 역가의 AMPV 항체가 검출된 보고사례(김 등, 1992)가 있어 혈청학적으로만 국내사육 닭에 AMPV가 존재하고 있음이 알려졌다.

국내사육 닭에서의 AMPV 감염으로 의심되는 피해는 1990년대 초부터 보고가 있었다. 그래서 많은 국내 연구자들이 바이러스를 분리하고자 시도하였으나 닭에서 AMPV 분리에 성공한 사례는 없었다. 그러한 주요 원인 중 하나는 감염 닭의 호흡기 상기도(upper respiratory tract: 비강 및 기관 상부)에서 감염 초기에만 바이러스가 존재하다가 임상증상을 나타내는 단계에 이르면 숙주 동물에서 바이러스가 대부분 제거되기 때문이다. 또한 AMPV는 닭 또는 칠면조 종란의 난황 내 접종법이나 닭이나 칠면조의 기관링 배양법(Tracheal Organ Culture, 이하 “TOC 배양법”이라 함)으로 일단 맹목 계대한 다음 감수성 세포에서 연속 계대하여 바이러스를 분리하는 방법을 주로 사용하고 있으나, 이 방법은 바이러스를 분리하는 데 시간이 많이 걸리고 바이러스 분리 성공률이 매우 낮다.

최근 국내 사육중인 닭(특히 종계 및 산란계) 농장에서 AMPV 감염에 의한 피해 사례가 빈번하게 발생하고 있어, 양계 농장에서 이 질병에 의한 피해 예방을 위하여 백신 접종이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 AMPV 발생 피해를 겪고 있는 산란계 농장의 발생 초기에 폐사계로부터 호흡기 상기도 시료를 채취하였으며, 이를 닭 계태아유래 TOC 배양법을 사용하여 AMPV를 분리하는 데 성공하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 국내사육 닭에서 유행하는 신규한 B형 조류메타뉴모바이러스 SC1509주 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 기탁번호 KCTC 11576BP의 조류메타뉴모바이러스 SC1509주를 제공한다.

또한 본 발명에서는 기탁번호 KCTC 11576BP의 조류메타뉴모바이러스 SC1509주를 포함하는 조류메타뉴모바이러스감염증 예방용 백신을 제공한다.

본 발명에서는 국내 사육 닭 농장으로부터 닭에서 호흡기 증상과 산란 피해를 유발하는 B형 AMPV를 분리하는데 성공하였고, 이를 이용하여 제조한 조류메타뉴모바이러스 감염증 예방용 백신을 접종한 닭에서 야외 강독 바이러스에 대한 방어효능을 보였다.

본 발명에서는 AMPV 발생 피해를 겪고 있는 산란계 농장의 발생 초기에 폐사계로부터 호흡기 상기도 시료를 채취하였으며, 이를 닭 계태아유래 TOC 배양법을 사용하여 AMPV를 분리하였다. 또한, 분리한 바이러스가 국내 사육 닭에서 피해를 입히는 B형 유전형을 가진 국내분리주임을 확인하였으며, 분리된 AMPV의 증식성, 병원성 및 면역원성 등의 특성을 조사하였다.

본 발명에 있어서, 상기 AMPV는 특별히 제한되는 것은 아니지만, B형 AMPV SC1509주인 것이 바람직하다. 본 발명의 한 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 AMPV는 닭에서 심한 호흡기 증상과 산란저하와 이상란(탈색란) 피해를 유발하는 바이러스로, 바람직하게는 최근 국내에서 유행하는 AMPV 감염증 예방용 생독 및/또는 사독 예방 백신으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 AMPV는 서열번호 6의 핵산 염기서열 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 G 단백질을 가지며, 최근 국내에 유행하는 AMPV인 것으로 동정된다. 한 바람직한 구현예에서, 본 발명자들은 본 발명의 AMPV를 AMPV "SC1509주"라 명명하였고, 2009년 10월 15일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 2009년 10월 20일자로 기탁번호 KCTC 11576BP를 부여받았다.

본 발명의 한 바람직한 구현예에 따르면, AMPV G 단백질의 핵산 염기서열을 기초로 종래의 바이러스들과 비교분석 및 계통분류학적 분석(phylogenetic analysis)을 실시하여 본 발명의 AMPV의 유전형을 분석한 결과, 신규한 AMPV SC1509주는 B형 유전형에 속하는 AMPV 국내분리주인 것으로 확인되었다.

본 발명의 AMPV SC1509주의 증식 방법, 계란 내 접종과정, 배양 조건, 백신제조 방법 및 제조시약 등은 당업계에 통상적으로 알려져 있는 임의의 방법을 제한 없이 이용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 의한 신규 AMPV SC1509주의 배양 및 증식은 TOC 배양법, 계태아섬유아 세포(이하 "CEF 세포"라 함), 아프리카푸른원숭이신장 세포(이하 “Vero 세포”라 함) 또는 메추리섬유아세포(이하 “QT-35 세포"라 함) 등에서 수행할 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, Vero 세포 단층에 상기 AMPV를 접종한 후 37℃에서 5% CO₂가 공급되는 배양기에서 배양함으로써 바이러스를 증식시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 AMPV SC1509주는 닭에서 병원성을 가지며, 생독 및 사독 백신 형태로 사용될 경우 국내 사육 닭에서 AMPV 감염증에 대해 예방 효과를 나타낸다.

본 발명에 의한 신규 B형 AMPV SC1509주는 닭에서 AMPV 감염여부를 진단할 수 있는 다양한 항원 및 항체 검사방법을 개발하는 데에도 활용이 가능하며, 유전자 재조합기법을 이용한 서브유닛(Subunit) 백신, 벡터(Vector) 백신, 키메라(chimera) 백신 또는 DNA 백신 등 다양한 형태의 예방백신을 개발하는 데 활용이 가능하므로 그 활용도가 매우 넓다.

따라서, 본 발명은 AMPV SC1509주 및 그 등가물을 포함하는 조류메타뉴모바이러스 감염증 예방용 백신에 관한 것이다. 본 발명에 의한 백신은 사용 직전에 약 독화된 생독 백신, 불활화 사독 백신, 서브유닛 백신, 재조합 백신 또는 폴리뉴클레오티드 백신의 형태일 수 있다.

본 발명에 의한 신규 AMPV를 사용하여 예방용 백신을 제조하기 위하여, 상기 AMPV SC1509주는 화학적 처리 및/또는 열처리를 수행할 수도 있으며, 브로모에틸아민(BEA)을 사용하기 직전에 형성된 에틸아민을 작용시켜 불활성화하는 것이 바람직하다. 상기 화학적 처리 방법은 예를 들면, 포르말린 또는 포름알데히드, β-프로피오락톤, 에틸렌이민 또는 바이너리 에틸렌이민(BEI) 등을 처리하여 수행될 수 있다. 획득한 바이러스 입자는 당업계에서 통상적으로 사용되는 농축 기술, 특히 한외여과(ultrafiltration)에 의해 농축한 후, 선택적으로 종래의 정제 수단, 특히 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 존재 하의 겔 여과법 또는 선택적 침전법에 의해 정제될 수 있으며, 사전 농축과정 없이 정제할 수도 있다.

본 발명에 의한 AMPV 예방용 백신을 제조하기 위하여, 상기 AMPV 입자는 그 자체로 사용할 수도 있지만, 수의학적으로 수용 가능한 매개체 내에 장입할 수 있고, 부형제로서 선택적으로 어쥬번트(adjuvant)를 보충할 수 있다. 상기 매개체로는 아데노바이러스, 허피스바이러스, 폭스바이러스 등과 같은 전달매개체를 사용할 수 있으나 이에만 한정되는 것은 아니다. 또한 어쥬번트로서 수산화알루미늄을 사용하거나, 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체, 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 중합체 등을 사용할 수 있고, 백신을 O/W(oil-in-water) 에멀젼 형태로 제형화할 수 있다. 상기 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체는 특히 당 또는 폴리알코올의 폴리알케닐 에테르로 가교결합되어 있다. 이들 화합물은 카보머(carbomer)라는 명 칭으로 알려져 있다. 또한, 상기 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체 중에서 말레산 무수물과 에틸렌의 공중합체로는 선형 또는 예를 들면 디비닐 에테르와 가교결합된 EMA^(R) 공중합체(Monsanto사)가 사용될 수 있다. 최종 백신 조성물에서의 중합체 농도는 0.01% 내지 1.5%(w/v), 보다 구체적으로는 0.05% 내지 1%(w/v), 바람직하게는 0.1% 내지 0.4%(w/v)일 수 있다.

상기 O/W 에멀젼은 특히 액체 파라핀 경유(유럽 약전 타입); 스쿠알란, 스쿠알렌과 같은 이소프레노이드 오일; 이소부텐 또는 데센의 존재 하에 알켄의 올리고머화로 얻어지는 오일; 선형 알킬기를 함유하는 산 또는 알코올의 에스테르, 특히 식물유, 에틸올레이트, 프로필렌글리콜 디(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴트리(카프릴레이트/카프레이트), 프로필렌글리콜 디올레이트; 분지형 지방산 알코올 또는 산의 에스테르, 특히 이소스테아르산의 에스테르 등을 기본으로 할 수 있다. 에멀젼을 형성하기 위해 상기 오일은 유화제와 혼합하여 사용된다. 바람직한 유화제로는 비이온성 계면활성제, 특히 소르비탄, 만나이드, 글리세롤, 폴리글리세롤 또는 프로필렌 글리콜의 에스테르; 및 선택적으로 에톡시화되어 있는 올레산, 이소스테아르산, 리신올레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르, 또는 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체 등을 들 수 있다.

본 발명에 의한 백신 제조에 있어서, 선택적으로 추출 전 또는 추출 후에 불활화하면서 바이러스로부터 캡시드를 추출함으로써 서브유닛 백신을 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 백신은 유일한 활성성분 또는 그 외의 것으로서, 주로 캡시 드 단백질 및 선택적으로 아단편(subfragment)을 함유하는 추출산물, 선택적으로 불활성화되고, 본 발명에 따른 AMPV SC1509주 또는 그 등가물로부터 제조할 수 있다. 이들 서브유닛 백신은 예를 들면 전술한 바와 같은 어쥬번트로 보충하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.

[실시예 1] 야외발생 농장에서의 AMPV 감염증 진단

AMPV 발생으로 의심된 농장의 진단은 역전사효소중합연쇄반응법(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction, 이하 “RT-PCR법”이라 함)으로 실시하였다. 본 발명의 신규한 바이러스 분리를 위한 조류메타뉴모바이러스감염증 발생 농장은 39,000수 사육규모의 29주령의 육용종계(Ross 품종) 사육농장으로, 검체시료 채취당시 산란 피크가 70%에서 정체되었으며, 탈색란이 5% 정도로 증가하고 있었다. 검사시료 채취당시 폐사계의 구강에는 콧물이 섞인 사료내용물이 충만하였으며, 복막염 등 대장균증 부검소견을 나타내었다. 농장 내 증상을 보였던 폐사계 6수에 대하여 호흡기 상기도(부비동) 시료를 채취하였다. 그 후 항생제-항진균제 용 액(antimybiotics-antimycotic solution; GibcoBRL사 제품)을 첨가한 인산완충용액(phosphate-buffered saline, 이하 “PBS"라 함)에 부비동 조직이 10%(w/v)가 되도록 첨가하여 유제하여 원심분리기에 넣고 3,000xg에서 10분간 원심분리하여 상층액을 채취하여 검사시료를 준비하였다.

질병 진단에 사용한 RT-PCR은 Bayon-Auboyer 등(1999)이 사용한 서열번호 2및 3의 프라이머 Nd/Nx를 사용하여 AMPV N 단백질 유전자 일부를 암호화하는 115 bp의 핵산이 증폭되도록 하였다.

명칭	서열	서열번호
역방향 프라이머(Nc)	5'-TTC TTT GAA TTG TTT GAG AAG A-3'	서열번호 1
정방향 프라이머(Nd)	5'-AGC AGG ATG GAG AGC CTC TTT G-3'	서열번호 2
역방향 프라이머(Nx)	5'-CAT GGC CCA ACA TTA TGT T-3'	서열번호 3

상기 폐사계의 부비동 조직유제액으로부터 각각 RNeasy RNA 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 AMPV 전체 게놈 유전자 RNA를 추출하였다. AMPV N 단백질 유전자의 cDNA 합성은 서열번호 1의 역방향 프라이머 Nc (5'-TTC TTT GAA TTG TTT GAG AAG A-3')를 cDNA 합성을 위한 RT 프리믹스 키트(RT primix kit; Bioneer)의 튜브에 첨가하여 제조사의 매뉴얼에 따라 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하였다. 그 다음, 첫 번째 가닥 cDNA, 서열번호 2의 Nd 프라이머 및 서열번호 3의 역방향 프라이머 Nx를 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 위한 PCR 프리믹스 키트(premix kit; Bioneer)의 튜브에 첨가하여 94℃에서 15분간 열처리한 후 94℃에서 20초간 변성, 51℃에서 45초간 어닐링 및 72℃에서 45초간 확장하는 사이클을 PCR 증폭기(PE 9600; Perkin Elmer)에서 30회 반복하여 PCR 증폭을 실시하였고, 마지막으로 72℃ 5분간 DNA 합성을 실시하였다. PCR 증폭산물은 아가로스겔에서 전기영동을 실시하여 115 bp 크기의 핵산이 증폭되는지를 조사하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다. N 단백질 유전자 부위 중 상기 115 bp 크기에 해당하는 부위는 유전형에 관계없이 모든 AMPV에서 공통적으로 검출되는 부위이므로 국제동물보건기구(OIE)가 AMPV 검출을 위하여 추천하는 증폭부위이다.

도 1의 결과에서, 폐사계 4번과 6번 개체의 검체시료에서 115 bp 크기의 특이 PCR 증폭산물이 확인되어 AMPV로 최종 진단하였다.

[실시예 2] 감염 닭으로부터 조류메타뉴모바이러스의 분리

실시예 1의 조류 메타뉴모바이러스 양성시료(6번 검체시료)를 이용하여 TOC 배양법을 이용하여 조류 메타뉴모바이러스를 분리하였다. TOC 배양은 Gough 등(1998)의 방법에 준하여 실시하였으며, 19일령 특정병원체부재(Specific pathogen free, 이하 "SPF"라 함) 닭 종란(chicken embryo)의 계태아 기관을 사용하였다. 조직배양에 사용한 배양액은 1x 항생제-항진균제 용액(GibcoBRL사 제품)이 함유된 EMEM(Eagle's minimum essential medium) 배양액을 사용하였다. SPF 종란의 계태아를 부화기에서 꺼낸 다음 계태아의 기관(trachea) 전체를 무균적으로 꺼내어 페트리 디쉬에 놓고 기관외부에 있는 결재조직을 제거하였다. 그 후 날카로운 무균 칼(scapel blade)로 0.6∼0.8 mm 두께로 기관링을 세절하였다. 그런 다음 배양액을 미리 1.0 ml 배양액이 담긴 5 ml 배양튜브(round-bottom tubes, BD Falcon^TM, Belgium)에 튜브당 기관링 5개씩 넣고 37℃가 유지되는 회전배양기에서 약 100 rpm 속도로 회전 배양시켰다. 다음날 배양된 기관링을 현미경으로 관찰하여 기관섬모(cilia) 운동이 활발한 것만 대상으로 바이러스 분리용으로 사용하였다.

전날 미리 배양한 기관조직배양 튜브를 꺼내어 배양액을 제거한 다음 상기 실시예 1에서 준비한 검사 시료를 튜브당 200 μl씩 첨가하여 37℃에서 1시간 감작시켰다. 그 후 접종액은 제거하고 EMEM 배양액 1 ml 첨가하여 37℃가 유지되는 회전배양기에서 약 100 rpm 속도로 회전 배양시켰다. 그 후 매일 기관링을 현미경으로 관찰하여 배양한 기관링의 섬모(cilia) 운동 정도를 관찰하였다. 검사시료를 접종한 튜브의 기관링은 접종 3일째부터 기관섬모의 활력이 현저히 저하되기 시작하였으며 접종 5일째 기관섬모의 운동이 완전히 정지되었다. 접종 후 5일째 TOC 배양액을 채취하여 동일한 방법으로 배양한 TOC에서 추가로 계대하여 배양액을 채취하였다. TOC에서 채취한 배양액을 10진 단계 희석한 다음, 희석액을 튜브당 100μl 희석당 5개 튜브씩 접종한 다음 일주일간 회전배양하면서 기관섬모 운동의 활력을 관찰하였다. 바이러스의 감염 역가는 기관섬모 활동이 중지된 튜브가 절반(50%)이 되는 희석배수의 역수(50% cilia infective dose, 이하 “CID₅₀"이라 함)로 표시하였으며, TCID₅₀은 Reed & Muench (1938)의 방법에 따라 산출하였다. 그 결과 분리바이러스는 최소한 1 ml 당 10^8.5 CID₅₀의 높은 역가를 나타내었다.

[실시예 3] 분리 바이러스의 AMPV 동정

간접형광항체법(Fluorescent Assay법, 이하 “FA법”이라 함)으로 상기 실시예 2에서 분리한 바이러스로부터 조류 메타뉴모바이러스를 동정하였다. 이를 위하여 분리한 바이러스를 Vero 세포(미국 ATCC사 카탈로그 번호 CCL81)에 접종하여 증식시켰다. Vero 세포는 항생제와 2% 우태아혈청(Fetal bovine serum)이 첨가된 EMEM 배양액으로 각각 약 10⁶ 세포/ml가 되도록 세포수를 조정하여 부유시킨 후 형광항체용 슬라이드글라스가 들어 있는 배양용기 5 ml씩 첨가하여 5% CO₂가 공급되는 배양기에서 배양하였다. 다음날 단층이 형성된 세포배양 용기를 꺼내어 세포가 증식하고 있는 슬라이드위에 조심스럽게 실시예 2의 분리 바이러스를 0.2 ml씩 접종하였다. 그 후 37℃에서 1시간 동안 감작한 다음 접종액을 제거하고 1x 항생제-항진균제 용액과 2% 우태아혈청을 포함하는 EMEM 배양액을 배양 용기당 5ml씩 첨가하고 5% CO₂가 공급되는 배양기에서 배양하였다. 접종 후 5일째부터 배양 용기 내 슬라이드는 형광항체법 검사에 사용하였다. 즉, 감염세포가 있는 슬라이드는 배양용기에서 살짝 꺼내어 0.01 M PBS 용액으로 3회 세척한 후 실온에서 건조시켰다. 그 후 세포고정액(에탄올 80% + 아세톤 20%)이 들어있는 유리용기에 넣고 -20℃에서 10분간 고정시켰다. 그 후 조류 메타뉴모바이러스 특이 단클론항체(항체명 12.2.1)를 1:100으로 희석하여 슬라이드에 방울방울 떨어뜨려 세포가 완전히 잠기게 하였다. 실온에서 1시간 동안 감작한 다음 접종액을 제거하고 PBS 용액으로 3회 세척하였다. 그 후 형광색소(FITC)가 결합된 항-마우스 2차 항체 용액(Sigma사 제품)을 1:100으로 희석하여 슬라이드에 방울방울 떨어뜨려 세포가 완전히 잠기게 하였다. 실온에서 1시간 동안 감작한 다음 접종액을 제거하고 PBS 용액으로 3회 세척하였다.

그 후 슬라이드는 형광현미경용 마운팅 용액(blomeda사 제품)을 점적한 후 커버글라스로 덥은 다음 형광현미경(Olympus사 제품)으로 형광 발색여부를 관찰하였다. 실시예 2의 분리바이러스에 대한 형광항체법 검사결과는 도 2에 나타내었다. 분리바이러스 감염세포의 경우 세포질에서 강한 형광염색이 관찰되었다. 그러나 대조 세포는 세포내 어떠한 형광염색도 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 본 발명자들이 분리한 바이러스가 조류 메타뉴모바이러스임을 나타내는 결과이다.

이러한 결과를 근거로 그래서 본 발명자들은 상기 분리된 AMPV를 "SC1509"주로 명명하였다. 본 발명자들은 상기 AMPV SC1509주를 2009년 1O월 15일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 2009년 10월 20일자로 기탁번호 KCTC 11576BP를 부여받았다.

[실시예 4] AMPV SC1509주의 유전형 확인 및 계통분석

본 발명의 AMPV SC1509주의 유전형 분석은 바이러스 G 단백질 유전자의 염기서열 분석을 통하여 실시하였다. 이를 위하여 서열번호 4 및 5에서 기재된 염기서열을 가진 프라이머 Gf1/Gr2를 사용한 RT-PCR법으로 AMPV G 단백질 유전자 1,245 bp의 핵산을 증폭하였다.

명칭	서열	서열번호
정방향 프라이머(Gf1)	5'-ATG GGG TCA GAG CTC TAC ATC-3'	서열번호 4
역방향 프라이머(Gr1)	5'-TTA TTG ACT AGT ACA GCA CCA C-3'	서열번호 5

본 발명의 AMPV SC1509주를 증식한 바이러스액으로부터 각각 RNeasy RNA 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 AMPV 전체 게놈 유전자 RNA를 추출하였다. AMPV G단백질 유전자의 cDNA 합성은 서열번호 5의 역방향 프라이머 Gr1을 cDNA 합성을 위한 RT 프리믹스 키트(RT primix kit; Bioneer)의 튜브에 첨가하여 제조사의 매뉴얼에 따라 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하였다. 그 다음, 첫 번째 가닥 cDNA, 서열번호 4의 Gf1 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머 Gr1을 중합효소연쇄반응(PCR)을 위한 PCR 프리믹스 키트(Bioneer)의 튜브에 첨가하여 95℃에서 15분간 열처리한 후 95℃에서 60초간 변성, 58℃에서 60초간 어닐링 및 72℃에서 90초간 확장하는 사이클을 PCR 증폭기(PE 9600; Perkin Elmer)에서 35회 반복하여 PCR 증폭을 실시하였고, 마지막으로 72℃ 5분간 DNA 합성을 실시하였다. RT-PCR이 끝난 후 1,245 bp 크기의 핵산 증폭산물은 아가로스겔에서 전기영동을 실시하여 확인하였다. AMPV G 단백질 유전자의 핵산 염기서열은 자동염기서열분석기(ABI 377, USA)를 사용하여 RT-PCR 증폭산물로부터 직접 분석하였다.

유전자 분석은 G 단백질 유전자의 1,245 bp의 핵산 염기서열을 취하여 분석하였다. 계통발생학적 유전자 분석(phylogenetic tree)을 위한 핵산 염기서열 교정(editing), 아미노산 서열예측 및 정렬(alignements)은 Lasergene 7.0(DNASTAR, USA)를 사용하여 실시하였다. SC1509 바이러스의 유전자 염기서열 정보는 종래에 발표된 AMPV 유전자 염기서열 정보와 비교 분석하였다. 계통분류학적 분석은 Clustal W 프로그램 내에서 계통분석법(neighboring-joining method)으로 1,000 부트스트랩핑(bootstrapping)하여 분석하고 트리뷰(TreeView) 프로그램을 통해 분석 트리를 도식화하였다.

본 발명의 조류메타바이러스 SC1509주의 G 단백질의 유전자 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호 6 및 7로 나타내었다. 종래의 AMPV주들과 본 발명에 의한 SC1509주의 G 단백질 아미노산 서열을 비교 분석한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

본 발명의 AMPV SC1509주와 종래 AMPV 간 G 단백질의 핵산 및 아미노산 상동성

핵산	아미노산
	SC1509	1556 (A)	LAH/A (A)	CVL14/1 (A)	872S (B)	2119 (B)	657-4 (B)	Colorado (C)	Mn/2a (C)	Fr85/1 (D)	Fr85/1 (D)
SC1509	ID	0.326	0.323	0.326	0.922	0.925	0.927	0.111	0.152	0.256	0.256
1556(A)	0.511	ID	0.997	0.984	0.326	0.326	0.326	0.08	0.105	0.253	0.253
LAH/A(A)	0.511	0.998	ID	0.982	0.323	0.323	0.323	0.08	0.105	0.253	0.253
CVL14/1(A)	0.514	0.990	0.988	ID	0.326	0.326	0.326	0.078	0.103	0.253	0.253
872S(B)	0.958	0.518	0.517	0.522	ID	0.987	0.995	0.104	0.148	0.272	0.272
2119(B)	0.960	0.517	0.516	0.521	0.994	ID	0.992	0.104	0.148	0.270	0.270
657-4(B)	0.959	0.519	0.519	0.523	0.996	0.995	ID	0.104	0.148	0.270	0.270
Colorado(C)	0.225	0.247	0.246	0.245	0.222	0.221	0.222	ID	0.529	0.126	0.126
Mn/2a(C)	0.351	0.380	0.378	0.381	0.353	0.353	0.353	0.610	ID	0.152	0.152
Fr85/1(D)	0.453	0.523	0.522	0.526	0.456	0.455	0.456	0.259	0.376	ID	0.997
Fr85/2(D)	0.453	0.524	0.522	0.525	0.456	0.455	0.456	0.259	0.376	0.998	ID

즉, AMPV G 단백질의 핵산 서열수준에서는 본 발명의 AMPV SC1509주는 A형 바이러스주들과 51.1∼51.4%, B형 바이러스주들과 95.8∼96.0%, C형 바이러스주들과 22.5%∼35.1%, D형 바이러스주들과 45.3%의 상동성을 보였다. AMPV G 단백질의 아미노산 서열수준에서는 본 발명의 AMPV SC1509주는 핵산 서열수준에서는 A형 바이러스주들과 32.3∼32.6%, B형 바이러스주들과 92.2∼92.7%, C형 바이러스주들과 11.1%∼15.2%, D형 바이러스주들과 25.6%의 상동성을 보였다. 이것은 본 발명의 AMPV SC1509 바이러스가 B형 AMPV이며, 종래의 B형 바이러스들과는 핵산수준에서는 4.0∼4.2%, 아미노산 수준에서는 7.3∼7.8%의 유전적 차이가 존재함을 말해주는 것이며, 이러한 결과를 통하여 본 발명의 AMPV SC1509 바이러스가 국내유행 바이러스라는 것을 확인하였다.

또한 바이러스의 유전적 계통을 분석한 결과, 본 발명에 의한 AMPV SC1509주는 상동성 조사에서와 같이 B형 AMPV 그룹에 포함되었다. 즉, 본 발명에 의한 조류 메타뉴모바이러스 SC1509주는 유전형 B형 조류 메타뉴모바이러스임을 확인할 수 있었다.

[실시예 5] AMPV SC1509주의 세포 증식성 조사

실시예 3에서 분리한 AMPV SC1509주를 Vero 세포에 접종하여 증식시킴으로써 계대 배양하였다. 즉, Vero 세포를 실시예 3의 EMEM 배양액으로 각각 약 2 x 10⁶ 세포/ml가 되도록 세포수를 조정하여 25 ㎠ 세포배양용 플라스크에 5 ml 첨가하여 5% CO₂가 공급되는 배양기에서 배양하였다. 플라스크에 단층이 완전히 형성되도록 배양한 후 본 발명의 SC1509주(10⁶ TCID₅₀/0.5 ml)를 플라스크당 0.5 ml씩 접종하여 37℃에서 1시간 동안 감작한 다음 접종액을 제거하고 1x 항생제-항진균제 용액과 2% 우태아혈청을 함유하는 EMEM 배양액을 배양 용기당 5 ml씩 첨가하고 5% CO₂가 공급되는 배양기에서 배양하면서 세포변성효과(CytoPathic Effects, 이하 “CPE"라 함)가 나타날 때까지 배양하였다. 그 후 도 4에서 보여지는 바와 같이, CPE가 80% 형성되면 배양기에서 꺼내어 세포 상층액만 수확하여 계대배양에 사용하였다. 계대배양은 상기의 바이러스 증식방법대로 Vero 세포에서 반복하는 방법으로 40대까지 계대배양을 실시하면서 바이러스 독력을 순화시켰다.

상기의 Vero 세포에서 증식한 본 발명의 SC1509주는 96웰 마이크로플레이트(96-well microplate)에서 감염 역가를 측정하였다. 즉, 마이크로플레이트에 실시예 3의 EMEM 배양액으로 각각 약 10⁶ 세포/ml가 되도록 세포수를 조정하여 웰당 100 μl씩 첨가한 후 5% CO₂가 공급되는 배양기에서 하루 동안 배양하였다. 그 후 바이러스액을 10진 단계 희석하여 웰당 100 μl씩 첨가한 후 5% CO₂가 공급되는 배양기에서 일주일간 배양하면서 세포변성효과가 나타나는지 여부를 관찰하였다. 바이러스의 감염 역가는 접종 웰들 중 절반(50%)에서 세포변성효과가 나타나는 바이러스액 희석배수의 역수(50% tissue culture infective dose, 이하 “TCID₅₀"이라 함)로 표시하였으며, TCID₅₀은 Reed & Muench (1938)의 방법에 따라 산출하였다. 그 결과 본 발명의 조류 메타뉴모바이러스 SC1509주는 최소한 1 ml 당 10^7.5 TCID₅₀의 높은 역가를 나타내었다.

[실시예 6] 조류 메타뉴모바이러스 사독백신 제조

실시예 5의 조류 메타뉴모바이러스 SC1509주에 포르말린 0.1%(v/v)를 첨가하여 실온에서 8시간 동안 반응시키면서 바이러스를 불활화하였다. 그 후 바이러스액과 면역보강제(ISA70)를 30:70의 무게비로 혼합한 후 유화기(TK Homomixer MARK FII사 제품)로 3분 내지 5분 동안 교반하면서 유화시켰다. 제조한 사독백신은 실험에 사용하기 전까지 실온에서 보관하였다.

다음으로 하기 시험예를 통하여 본 발명의 AMPV SC1509주의 닭에서의 면역원성, 병원성 및 방어효능 평가를 실시하였으며 이를 통하여 본 발명의 AMPV SC1509주가 백신으로서의 효능이 인정됨을 확인하였다.

[시험예 1] 조류 메타뉴모바이러스 생독백신의 병원성 및 면역원성 평가

먼저, 1주령 SPF 닭 10수에 실시예 5의 순화 바이러스(수당 10^5.0 TCID₅₀)를 비강 접종한 시험군(이하 “순화시험군”이라 함), 1주령 SPF 닭 10수에 실시예 1의 AMPV SC1509 종독바이러스(수당 10^5.0 TCID₅₀)를 비강접종한 시험군(이하 “종독시험군”이라 함), 1주령 SPF 닭 10수에 PBS 용액을 비강접종(이하 “대조군”이라 함)하였다. 그 후 2 주간 관찰하면서 임상증상 여부, 폐사여부 및 면역형성여부 등을 조사하였다.

본 발명의 AMPV SC1509주의 병원성과 면역원성을 평가한 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

본 발명의 AMPV 접종군의 닭에 대한 병원성 및 면역원성 조사결과

그룹	접종수수	폐사율(%)	호흡기 증상	접종 2주후 항체양성율
종독시험군	10	0%(0/10*)	10/10*	10/10*(100%)
순화시험군	10	0%(0/10)	0/10	10/10(100%)
대조군	10	0%(0/10)	0/10	0/10(0%)

* 양성수수/검사수수

표 4의 결과에서, 종독시험군의 경우 접종 후 3일부터 콧물 등 호흡기 증상을 나타내었으나, 폐사하는 닭은 관찰되지 않았다. 순화시험군은 2주일의 관찰기간 동안 임상증상이 거의 관찰되지 않았다. 대조군의 닭 10수는 2주일의 관찰기간 동안 어떠한 임상 증상을 나타내지 않았다. 이 같은 결과는 본 발명의 SC1509 순화바이러스는 SC1509 종독바이러스주에 비해 닭에서의 병원성이 순화되어 있음을 확인할 수 있었다.

접종 직전과 접종 후 14일 째 모든 닭을 채혈하여 AMPV에 대한 항체검사를 실시한 결과, 바이러스 접종군의 닭에서 모두 접종 14일 째 AMPV 항체가 형성됨을 확인하였다. 이것은 접종 후 AMPV에 대한 면역이 형성되었음을 보여주는 것이다. 그러나 대조군의 경우 시험기간 내내 AMPV 항체가 검출되지 않았다.

[시험예 2] 본 발명의 조류 메타뉴모바이러스 SC1509주의 방어 효능 평가

먼저, 1주령 SPF 닭 10수에 실시예 5의 순화 바이러스(수당 10^5.0 TCID₅₀)를 비강접종(이하, “생독시험군”이라 함), 1주령 SPF 닭 10수에 실시예 6에서 제조한 사독백신(수당 0.5 ml)을 피하접종(이하, “사독시험군”이라 함), 그리고 1주령 SPF 닭 20수에 인산완충용액을 비강접종(이하, “대조군”이라 함)하였다. 그 후 3주령 때 AMPV SC1509 종독바이러스(수당 10^5.0 TCID₅₀)를 비강접종법으로 공격 접종하였다. 이때 대조군 중 10수는 종독바이러스로 동일한 방법으로 공격접종(이하, “공격대조군”이라 함)하고, 나머지 10수는 아무 것도 접종하지 않았다(이하, “미접종대조군”이라 함). 공격 접종 후 5일째에 모든 닭에 대하여 상기도 분비물 스왑을 채취하여 실시예 1의 RT-PCR법으로 바이러스 검출여부를 조사하였으며, 공격 접종 후 일주일간 임상증상을 관찰하였다. 본 발명의 AMPV SC1509주의 닭에서의 방어효능을 평가한 결과는 표 5에 나타내었다.

본 발명의 AMPV SC1509주로 제조한 생독 및 사독 접종군에서의 방어효능 평가 결과

그룹	접종수수	폐사율(%)	호흡기 증상	바이러스검출 (공격접종 5일째)
생독시험군(실시예 5)	10	0%(0/10*)	0/10*	1/10*(10%)
사독시험군(실시예 6)	10	0%(0/10)	0/10	1/10(10%)
공격대조군	10	0%(0/10)	10/10	10/10(100%)
미접종대조군	10	0%(0/10)	0/10	0/10(0%)

* 양성수수/검사수수

표 5의 결과에서, 생독시험군과 사독시험군 모두 일주일간 AMPV 감염으로 나타날 수 있는 어떠한 임상증상도 관찰되지 않았다. 그러나 공격대조군의 경우 공격접종 4일부터 콧물 등 호흡기증상을 나타내었으나 폐사하는 닭은 없었다. 미접종대조군은 관찰기간 내내 어떠한 임상증상도 나타내지 않았다. 또한, 공격대조군의 경우 모든 닭에서 공격접종 후 5일째 상기도 분비물에서 AMPV가 검출되었으나 생독시험군과 사독시험군의 경우 각각 1마리에서만 상기도 분비물에서의 바이러스가 검출되었다. 무접종대조군의 경우 AMPV가 검출되지 않았다. 이 결과는 생독시험군과 사독시험군을 접종한 닭에서 모두 야외바이러스에 방어 효능이 나타내고 있음을 말해준다.

상기의 시험예를 통하여, 본 발명을 통하여 분리한 야외 바이러스가 심한 콧물 등 호흡기 증상을 유발하는 것을 증명하였다. 이러한 병원성을 확인한 것은 본 발명의 바이러스가 국내사육 닭에서 질병 피해를 입히는 바이러스임을 말해주는 것이다. 또한, 본 발명을 통하여 Vero 세포에서 순화시킨 SC1509주(생독 시험백신)는 닭에서 병원성이 거의 없을 뿐 아니라 야외 강독바이러스에 대한 방어효능도 인정되었다. 본 발명을 통하여 Vero 세포에서 순화시킨 SC1509주로 제조한 사독 시험백신의 경우에도 야외 강독바이러스에 대한 방어효능도 인정되었다. 그러므로 본 발명을 통하여 발명한 SC1509주는 생독 또는 사독으로 사용할 경우 현재 국내사육 닭에서 조류 메타뉴모바이러스에 의한 피해를 줄일 수 있을 것으로 판단된다.

또한 본 발명에 의한 SC1509주는 Vero 세포에서 고농도로 증식되기 때문에 바이러스를 사독 백신을 제조하는데 용이할 뿐만 아니라 또는 독력을 순화시킨 바이러스입자백신(whole virus vaccine), 유전자 재조합기법을 이용하여 서브유닛백 신, 벡터백신, 키메라 백신 또는 DNA 백신 등 다양한 형태의 백신 개발이 가능하게 되었다.

도 1은 발생농장의 검체 시료에서 역전사-중합효소연쇄반응법(RT-PCR)법으로 조류메타뉴모바이러스감염증을 진단한 결과이다.

도 2는 형광항체법(FA법)에 의해 본 발명의 AMPV SC1509주를 동정한 결과이다.

도 3은 본 발명의 AMPV SC1509주의 유전적 계통분석 결과이다.

도 4는 본 발명의 조류 메타뉴모바이러스 SC1509주의 Vero 세포에서의 세포변성 효과를 보여준다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(Management: Ministry of Agriculture and Forestry, National Veterinary Research) <120> Avian metapneumovirus type B SC1509 strain isolated from chicken in Korea and the use thereof <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nc primer <400> 1 ttctttgaat tgtttgagaa ga 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nd primer <400> 2 agcaggatgg agagcctctt tg 22 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nx primer <400> 3 catggcccaa cattatgtt 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gf1 primer <400> 4 atggggtcag agctctacat c 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gr1 primer <400> 5 ttattgacta gtacagcacc ac 22 <210> 6 <211> 1245 <212> DNA <213> G protein of AMPV SC1509 <400> 6 atggggtcag agctctacac catagagggg gtgagctcat ttgaaatagc cctcaagcaa 60 gtcctcagaa ggagcaaaaa aatactgtta ggactggtgt tatcagccct aggcttgacg 120 ctcactagca ctattgttat atctatttgt attagtgtag aacaggtcaa attacgacag 180 tgtgtggaca cttattgggt ggaaaatgga tccttacatc caggacagtc aacagaaaat 240 acttcaacaa gagataagac tacaacaaaa aaccctagaa gattacaggc gactggagca 300 ggaaagtttg agaactgtgg gtatgtgcaa gttgttgatg gtgatatgca tgatcacagt 360 tatgctgtac tgggtggtgt tgattgtttg ggcttattgg ctctttgtga atcaggacca 420 atttgtcaga gagatacttg gtctgaaggc ggaaacttct gccgatgcac tttttcttcc 480 catggggtga gttgctgcaa aaaaaccaaa agcaaggcaa ccactgccca gaggaactcc 540 aaaccagcta acagaaaatc aactcctccg gtacattcag acagggccag caaagaacat 600 aacccctccc aagaggaaca accccgaagg gggccaacca gcagcaagac aactattgtt 660 ggcacccctt caacagaaga cactgctaag ccaacgatca gcaaacccaa actcaccatc 720 aggccctcga aaagaggtcc atccagcagc accaaggcag cctccagcac tcccagccac 780 aagaccaaca ccagcggcac cagcgaagcg accgaccaga aaccccgcac cggacccacc 840 tctgaaaggc ccagacaaac ccacagcaca gtgactctgc ccctcacaac tccaatccac 900 aagggccggg ccccaacccc caaaccaaca acagacccca aggtcaaccc aagggaaggc 960 ggcacaagcc caactgcaat acagaaaaac ccaaccacac aaagtaatct tgttgactgc 1020 acactgtctg atccagatga gccacaaagg atttgttacc aggtaggaac ttacaatcct 1080 agtcaatcgg gaacctgcaa catagaggtt ccaaaatgtt ctacttatgg gtatgcttgt 1140 atggctacat tatataacac cccattcaac tgctggcgca ggaccaggag atgcatctgt 1200 gattctggag gggagctgat tgagtggtgc tgtactagtc aataa 1245 <210> 7 <211> 414 <212> PRT <213> G protein of AMPV SC1509 <400> 7 Met Gly Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Glu Gly Val Ser Ser Phe Glu Ile 1 5 10 15 Ala Leu Lys Gln Val Leu Arg Arg Ser Lys Lys Ile Leu Leu Gly Leu 20 25 30 Val Leu Ser Ala Leu Gly Leu Thr Leu Thr Ser Thr Ile Val Ile Ser 35 40 45 Ile Cys Ile Ser Val Glu Gln Val Lys Leu Arg Gln Cys Val Asp Thr 50 55 60 Tyr Trp Val Glu Asn Gly Ser Leu His Pro Gly Gln Ser Thr Glu Asn 65 70 75 80 Thr Ser Thr Arg Asp Lys Thr Thr Thr Lys Asn Pro Arg Arg Leu Gln 85 90 95 Ala Thr Gly Ala Gly Lys Phe Glu Asn Cys Gly Tyr Val Gln Val Val 100 105 110 Asp Gly Asp Met His Asp His Ser Tyr Ala Val Leu Gly Gly Val Asp 115 120 125 Cys Leu Gly Leu Leu Ala Leu Cys Glu Ser Gly Pro Ile Cys Gln Arg 130 135 140 Asp Thr Trp Ser Glu Gly Gly Asn Phe Cys Arg Cys Thr Phe Ser Ser 145 150 155 160 His Gly Val Ser Cys Cys Lys Lys Thr Lys Ser Lys Ala Thr Thr Ala 165 170 175 Gln Arg Asn Ser Lys Pro Ala Asn Arg Lys Ser Thr Pro Pro Val His 180 185 190 Ser Asp Arg Ala Ser Lys Glu His Asn Pro Ser Gln Glu Glu Gln Pro 195 200 205 Arg Arg Gly Pro Thr Ser Ser Lys Thr Thr Ile Val Gly Thr Pro Ser 210 215 220 Thr Glu Asp Thr Ala Lys Pro Thr Ile Ser Lys Pro Lys Leu Thr Ile 225 230 235 240 Arg Pro Ser Lys Arg Gly Pro Ser Ser Ser Thr Lys Ala Ala Ser Ser 245 250 255 Thr Pro Ser His Lys Thr Asn Thr Ser Gly Thr Ser Glu Ala Thr Asp 260 265 270 Gln Lys Pro Arg Thr Gly Pro Thr Ser Glu Arg Pro Arg Gln Thr His 275 280 285 Ser Thr Val Thr Leu Pro Leu Thr Thr Pro Ile His Lys Gly Arg Ala 290 295 300 Pro Thr Pro Lys Pro Thr Thr Asp Pro Lys Val Asn Pro Arg Glu Gly 305 310 315 320 Gly Thr Ser Pro Thr Ala Ile Gln Lys Asn Pro Thr Thr Gln Ser Asn 325 330 335 Leu Val Asp Cys Thr Leu Ser Asp Pro Asp Glu Pro Gln Arg Ile Cys 340 345 350 Tyr Gln Val Gly Thr Tyr Asn Pro Ser Gln Ser Gly Thr Cys Asn Ile 355 360 365 Glu Val Pro Lys Cys Ser Thr Tyr Gly Tyr Ala Cys Met Ala Thr Leu 370 375 380 Tyr Asn Thr Pro Phe Asn Cys Trp Arg Arg Thr Arg Arg Cys Ile Cys 385 390 395 400 Asp Ser Gly Gly Glu Leu Ile Glu Trp Cys Cys Thr Ser Gln 405 410

Claims (7)

1. 기탁번호 KCTC 11576BP의 조류메타뉴모바이러스 SC1509주.
2. 제 1항에 있어서, 상기 바이러스는 서열번호 5의 핵산 염기 서열 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 인코딩되는 G 단백질을 갖는 것임을 특징으로 하는 조류메타뉴모바이러스 SC1509주.
3. 기탁번호 KCTC 11576BP의 조류메타뉴모바이러스 SC1509주를 포함하는 조류메타뉴모바이러스 감염증 예방용 백신.
4. 제 3항에 있어서, 상기 백신은 Vero 세포에서 연속 계대함으로써 닭에서의 독력을 순화시킨 조류메타뉴모바이러스 SC1509주를 포함하는 생독 백신임을 특징으로 하는 조류메타뉴모바이러스 감염증 예방용 백신.
5. 제 3항에 있어서, 상기 백신은 사독 백신, 서브유닛 백신, 벡터 백신, 키메라 백신 또는 DNA 백신임을 특징으로 하는 조류메타뉴모바이러스 감염증 예방용 백신.
6. 제 3항에 있어서, 상기 조류메타뉴모바이러스 SC1509주는 수의학적으로 수용 가능한 매개체 내에 장입된 형태로 포함됨을 특징으로 하는 조류메타뉴모바이러스 감염증 예방용 백신.
7. 제 3항에 있어서, 상기 백신은 부형제로서 어쥬번트를 더 포함하는 것임을 특징으로 하는 조류메타뉴모바이러스 감염증 예방용 백신.

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