KR20210035676A - 뉴캐슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 백신 - Google Patents

뉴캐슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조류 메타뉴모바이러스에 대한 백신에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 백신에 관한 것이다.

Description

뉴캐슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 백신{Avian metapneumovirus vaccine with high tilter using Newcastle virus vector}
본 발명은 조류 메타뉴모바이러스(aMPV)에 대한 백신에 관한 것으로서, 자세하게는 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 키메라 바이러스, 바람직하게는 aMPV subtype B의 표면 항원을 발현하는 키메라 바이러스와, 상기 키메라 바이러스를 이용한 백신 및 조류 면역화 방법에 관한 것이다.
조류메타뉴모바이러스 (avian metapneumovirus, AMPV)는 2001년 사람에서 최초로 분리 및 보고된 사람 메타뉴모바이러스 (human metapneumovirus)와 함께 파라믹소비리데 과 (Family Paramyxoviridae)의 새로운 genus인 Genus Metapneumovirus에 속하는 바이러스로 분류된다.
과거에는 칠면조 비기관염 (turkey rhinotracheitis), 조류비기관염 (avian rhinotracheitis), 두부 종창증, 조류뉴모 바이러스 감염증 (avian pneumovirus infection) 등으로 불리어 졌는데, 최근 동물보건기구(OIE)는 이 질병을 AMPV 감염증 또는 칠면조 비기관염으로 공식 명명 하고 있다.
AMPV 감염증은 AMPV 감염에 의해 발생하며, 닭에서 상부호흡기도 섬모의 감소와 운동성의 소실등을 야기하여 이로 인한 기침, 재채기 등 호흡기 증상, 두부종창증(swollen head syndrome), 산란중인 닭에서의 산란저하 및 비정상 탈색란 생산 등을 유발하는 닭의 호흡기성 바이러스성 전염병으로 양계산업이 있는 대부분의 국가들에서 발생하고 있다.
육용 종계나 산란계에서는 연령에 상관없이 발생하나 시산 또는 산란 피그기 전후에 주로 나타난다. 육계농장에서 흉선이 심하게 위축되어 면역억제소견을 보이는 육계군에서 APV가 검출 된 바 있으며, 또한 심한 콧물로 사료효율을 저하시키고 복막염 등 만성 호흡기로 지속적인 폐사를 유발한 육용종계군에서도 이 바이러스가 검출되고 있다. 닭에서 AMPV 단독 감염에 의한 임상증상은 뚜렷하게 나타나지는 않지만, AMPV 감염에 의해 손상된 점막 방어기전으로 인해 이차 세균 및 바이러스 감염이 용이하게 일어나게 된다. 따라서 Bordetella spp., Mycoplasma spp., E.coli 와 같은 세균 및 ND, IB 와 같은 바이러스에 의한 2차감염이 발생 할 경우 기낭염, 복막염 및 심각한 호흡기 증상을 유발하여 치사율이 증가된다고 보고되고 있다.
AMPV는 단일 혈청형(single serotype)만 존재하고 있으며 3'-N(nucleocapsid)-P(phospho protein)-M(matrix)-F(fusion)-M2(second matrix)-SH(small hydrophobic)-G(attachment glyco protein)-L(large polymerase)-5'의 순서대로 8개의 유전자 배열로 구성된 single-stranded, negative sense RNA genome을 가지고 있다. G 단백질의 유전자 염기서열을 기초로 A에서 D까지 4개의 유전형(genotype)이 존재한다. 모든 유전형이 발병하는 칠면조와 달리, 닭의 경우 A 및 B 유전형만이 질병 피해를 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다.
국내 가금농장에서 AMPV가 A와 B genotype이 거의 50%정도씩 발생하고 있으나, 백신은 A genotype 혹은 B genotype 단일 백신만 개발되어 이중 1개 genotype의 백신을 접종하여도 사육 중 다른 genotype의 AMPV가 발생해 산란율 감소 및 폐사율 증가에 따른 피해가 확인되고 있어 2 가지 genotype를 함께 예방이 가능한 백신 개발이 절실한 상황이다.
AMPV 생독백신의 경우 서브타입 별 교차방어가 된다고 알려져 있고 현재 해외에는 A 또는 B 각 서브타입 별 단독 생독 및 사독백신이 상용화되어 있는데 생독백신의 경우 백신주의 병원성 회귀에 의한 부작용이 계속 보고되고 있다. 일반적으로 생독백신 접종 후 6일 이내 면역이 발달되기 시작하여 14주까지 humoral antibodies가 지속되며(Avian Pathol. 18, 523-534., Vet. Rec. 136, 392-393.) 감염에 대해서는 22주까지 방어가 가능하다고 알려진 바 있다.
미국 및 프랑스에서는 AMPV에 대한 약독화 생독백신이 개발되어 상용화되어 있는데 백신주의 병원성 회귀에 의한 부작용이 계속 보고되고 있으며, 특히 단 한 개의 아미노산 변이에 의해서도 병원성이 증가하는 등 생독백신의 안전성이 계속 문제가 되고 있다. 국내에서는 백신바이러스의 병원성회귀로 인한 부작용의 우려로 AMPV 생독백신의 허가는 이루어지지 않고 있으며, 현재 A 또는 B 각 서브타입에 따른 단독 사독백신이 상용화되어 있다.
국내 상용화된 사독 백신의 경우 야외에서 분리한 바이러스를 일반적인 세포배양법으로 배양한 후 불활화한 형태로 뉴모바이러스의 특성상 BHK-21(Baby Hamster Kidneys), CEF(Chicken Embryo Fibroblast), CER(Chicken Embryo Related gene) 등 일반적으로 바이러스 배양에 사용되는 다양한 세포에서 최대 생산역가 106TCID50/ml로 충분한 면역반응 유도에 요구되는 사독백신 항원 양(106TCID50/수)을 맞추기는 사실상 불가능하다. 일례로, 국내 상용화된 AMPV 사독백신(고려비앤피 힘백달구방 뉴모오일백신)의 경우 국내 야외농장에서 분리한 바이러스를 Vero 세포(원숭이 신장 세포)에 접종하여 배양한 후 불활화한 백신으로, 백신 개발 과정에서 바이러스 함량 별로(103-106 TCID50) 백신을 접종한 후 주별로 항체가를 관찰하고 백신군에 대해 공격실험을 진행한 결과 효과적인 방어에 적합한 항원량은 106 TCID50/ml임을 정의내린 바 있다(특허공개번호 10-2015-0001558)
또한 A 또는 B 각 서브타입 한 가지에 대한 사독백신만이 판매되고 있는데 사독백신의 경우 생독백신과는 달리 서브타입 별 교차방어 효과가 현저히 떨어지기 때문에 한 가지 서브타입 백신 사용으로는 AMPV의 감염을 효과적으로 방어하기 어렵다.
본 발명의 일 예는 뉴캣슬병 바이러스 게놈과 조류메타뉴모바이러스(aMPV)의 표면항원인 F단백질을 암호화하는 유전자 및 G단백질을 암호화하는 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 표면항원 암호화 유전자를 포함하며, 상기 조류메타뉴모바이러스의 표면항원을 발현하는 키메라 바이러스에 관한 것이다.
본 발명의 일 예는 내열성 NDV 벡터 백신 platform기술 활용으로 1일령 분무 접종 시 모체이행항체 극복 가능한 생백신 개발 가능한 키메라 바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 예는 상기 키메라 바이러스를 1종 이상 포함하는 조류메타뉴모바이러스 감염증 또는 조류메타뉴모바이러스 감염에 의한 조류 질병에 대한 면역화용 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 추가 일 예는 키메라 바이러스를 2종을 포함하여, 조류 메타뉴모바이러스 A 및 B type을 함께 면역화 가능한 면역화용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 및 이를 이용한 조류메타뉴모바이러스 감염증의 백신에 관한 것이다.
본 발명은 역유전학을 이용하여 계태아에서 고역가로 증식할 수 있는 뉴캣슬병 바이러스(NDV)를 벡터로 활용하여 aMPV의 A또는 B서브타입별로 aMPV의 두 가지 표면항원 F와 G단백을 모두 발현하는 NDV 벡터 바이러스 작출하고 이들을 혼합한 불활화 백신을 제작함으로써 aMPV의 모든 서브타입 바이러스에 대해 효과적인 방어가 가능한 불활화 백신을 제조한다. 구체적으로, 역유전학을 이용하여 계태아에서 고역가(A type: 109.3EID50/ml, B type: 109.0 EID50/ml)로 증식할 수 있는 뉴캣슬병 바이러스에 aMPV 바이러스의 감염 및 중화항체 유도에 중요한 두 가지 표면항원을 발현하여 두 가지 서브타입 바이러스에 대해 효과적인 방어가 가능한 불활화 백신용 종독을 개발하였다.
상용화 AMP 백신은 단일 서브타입의 사독백신만 상용화되어 있으나 각 서브타입간에 아미노산의 상동성이 50~70%에 불과해 접종한 백신과 상이한 서브타입 바이러스에 감염에 대해서는 방어가 불충분하다. 기존 사독백신용 AMPV의 최대 생산역가는 106TCID50/ml에 불가해 농축 없이는 면역반응 유도에 필요한 항원 양(106TCID50/수)을 맞출 수 없으며 경제성도 없다.
NDV 벡터는 비교적 적은 수의 단백질을 코딩하기 때문에 많은 종류의 단백질을 코딩하는 다른 바이러스 벡터와 달리 이종항원 발현 시 벡터 내 단백질과 이종항원 발현의 경쟁이 상대적으로 낮고, 계태아에서 고역가로 증식할 수 있는 장점(1010EID50 이상/ml)이 있어 다양한 항원의 발현에 사용되고 있다. 그러나, 현재까지 개발된 NDV 벡터는 내열성이 없는 LaSota vaccine주를 사용해 생백신으로는 사용이 불가하며, aMPV의 G와 F glycoprotein중에서 G glycoprotein 한 개만을 발현하여 주요 중화항원의 일부만 포함하는 기술적 한계를 갖고 있다.
반면, 본 발명은 NDV 벡터시스템을 이용하면서, AMPV의 두 가지 표면항원(G와 F)을 모두 발현하여 보다 완벽한 방어능을 갖도록 고안하였으며, 이를 A타입과 B타입 각각에 대하여 제작하고, 두 바이러스를 혼합한 불활화 백신을 제조함으로써 모든 서브타입 바이러스에 대해 효과적인 방어가 가능한 혁신적인 aMPV 불활화 백신을 개발하였다.
지금까지 다양한 viral 벡터시스템을 이용하여 AMPV 주요항원들의 발현과 관련된 실험이 진행되어 왔다. NDV 벡터는 비교적 적은 수의 단백질을 코딩하기 때문에 많은 종류의 단백질을 코딩하는 다른 viral vectors와 달리 이종항원 발현 시 벡터 내 단백질과 이종항원 발현의 경쟁이 상대적으로 낮고, 계태아에서 고역가로 증식할 수 있는 장점(1010EID50 이상/ml)이 있어 다양한 항원의 발현에 사용되고 있다.
NDV LaSota vaccine주에 aMPV subtype A, B glycoprotein(G)를 각각 발현시킨 재조합 바이러스를 작출(F와 HN사이)한다. 작출된 바이러스(rLS/aMPV-A G, rLS/aMPV-B G) 또는 PBS를 1일령 SPF 칠면조에 접종하고 14일후 aMPV-A, aMPV-B 바이러스를 IN/IO routes로 공격접종(106TCID50/수)(homologous challenge)한다(World Journal of Vaccines, 2013, 3, 130-139). Homologous 공격접종 후 각각의 시험군에서 virus shedding을 관찰한다. 백신 접종군의 경우 PBS 접종군에 비해 공격접종 바이러스의 재분리율이 크게 낮아져 AMPV에 대한 부분적인 방어가 이루어졌음을 보여준다. 백신과 Homologous AMPV를 공격접종한 후 매일 clinical signs을 측정한다. 모든 시험군이 공격 후 7-9일 사이에 가장 높은 clinical sign scores를 보였고 점차적으로 줄어드는 양상을 보인다. rLS/aMPV-A, rLS/aMPV-B G 백신 접종군의 경우 PBS 접종군에 비해 유의적으로 낮은 clinical sign을 보였으나 압착 시 비강 삼출물을 보인다.
NDV LaSota vaccine주에 aMPV subtype C glycoprotein(G)를 발현시킨 재조합바이러스 작출(F와 HN사이에 위치)한다(Vaccine 29 (2011) 8624-8633) 작출 된 바이러스(rLS/aMPV-C)를 1일령 SPF 칠면조에 접종하고 14일후 aMPV-CO Tr 바이러스를 IN/IO routes로 공격접종(106TCID50/수)(homologous challenge)한다.
Homologous 공격접종 후 매일 clinical signs을 측정한다. rLS/aMPV-C G 백신 접종군의 경우(E1:1회 백신, E2:2회 백신) 유의적으로 낮은 clinical sign을 보인다.
이와 같이 현재까지 해외에서 개발된 사례들은 모두 LaSota vaccine주를 NDV 벡터로 사용해왔으며, aMPV의 G와 F glycoprotein중 G glycoprotein 한 개만 발현하였다. 성공적인 백신은 AMPV의 감염을 막아주는 중화항체를 얼마나 잘 유도하는 가에 있다. 그러나 현재까지 개발된 모든 재조합 바이러스들은 F단백 또는 G단백 중에서 한 개의 항원만 발현하여 비록 sero-conversion이 유도되기는 하나 공격접종에 대한 완벽한 방어를 보이지는 않았다. 이와 같은 사례는 단일 항원 발현만으로는 충분한 중화항체를 얻는데 한계가 있음을 설명한다.
또한, 국내 사용되고 있는 LaSota 오일백신은 국내 유행하고 있는 유전형 7형의 강병원성 NDV 감염으로 인한 난포와 수란관 손상으로 인한 산란율 및 난질 저하 피해를 막지 못한다. 또한, Lasota백신 및 이를 backbone으로 한 바이러스 항원이 56
Figure pat00001
열처리에 의해 곧바로 혈구응집능이 소실된다.
따라서, 효과적인 AMPV 재조합 백신의 개발을 위해, 본 발명은 NDV 벡터시스템을 이용하나, AMPV의 A genotype과 B genotype 각각에서 두 가지 표면항원(F와 G단백)을 동시에 모두 발현하여 모든 서브타입 바이러스에 대해 효과적인 방어가 가능한 혁신적인 AMPV 불활화 백신을 개발하고자 하였다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일예는 뉴캣슬병 바이러스 게놈과 조류메타뉴모바이러스(aMPV)의 표면항원인 F단백질을 암호화하는 유전자 및 G단백질을 암호화하는 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 표면항원 암호화 유전자를 포함하며, 상기 조류메타뉴모바이러스의 표면항원을 발현하는 키메라 바이러스에 관한 것이다.
상기 조류메타뉴모바이러스의 표면항원은 닭으로부터 분리한 조류메타뉴모바이러스에서 유래된 것일 수 있다. 상기 표면 항원은 aMPV subtype A의 G 단백질 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하며 상기 aMPV subtype A의 F 단백질 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 표면 항원은 aMPV subtype B의 G 단백질 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하며 상기 aMPV subtype B의 F 단백질 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 뉴캣슬병 바이러스 게놈의 5'에서 3'방향으로 순차적으로 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 유전자를 포함하는 것이며, 상기 F 단백질을 암호화하는 유전자는 상기 뉴캐슬병 바이러스의 P 유전자와 M 유전자 사이에 위치하고, 상기 G 단백질을 암호화하는 유전자는 상기 뉴캐슬병 바이러스의 M 유전자와 F 유전자 사이에 위치하는 것일 수 있다. 구체적 일예에서, 상기 G 및 F 단백질의 유전자가 뉴캣슬병 바이러스 게놈에 삽입된 일 예를 도 2b에 나타낸다.
본 발명에 사용 가능한 뉴캣슬병 바이러스는 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 5'에서 3'방향으로 순차적으로 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 유전자를 포함하는 것일 수 있으며, 또한 상기 NP 단백질의 암호화 유전자의 5'-말단에 연결된 T7 promoter, 리더 서열 및 3' UTR 서열과, 상기 L 단백질의 암호화 유전자의 3'-말단에 5'UTR, 트레일러 서열 및 T7 terminator 서열을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 구체적 일예에서, 상기 뉴캣슬병 바이러스 게놈의 일 예는 도 2a (BP-NDV C7d 주를 backbone으로 한 재조합 NDV 게놈 전사벡터)에 나타낸다.
본 발명에 사용한 NDV 벡터 시스템은 국내 및 아시아지역에서 유행하는 강병원성 뉴캣슬병 바이러스와 항원성이 유사하지만, 병원성은 현재 사용되고 있는 백신주들과 유사하거나 현저하게 낮고, 내열성이 매우 높으므로, 높은 면역원성을 유도할 수 있는 이점이 있다. 내열성 NDV로부터 내열성 관련 유전자를 확보한 새로운 키메라 ND 바이러스(BP-ACND)를 개발하였다.
본 발명의 바람직한 뉴캐슬병 바이러스는 KCTC13595BP 기탁번호를 갖는 것일 수 있다. 상기 구현예에 따른 키메라 뉴캣슬병 바이러스는 기존 KBNP-C4152이 50 내지 60
Figure pat00002
의 온도에서 열처리 후 20분 내에 면역원성을 완전히 상실하는데 반해, 50 내지 60
Figure pat00003
의 온도에서 열처리 후 25분 이상, 30분 이상, 40분 이상, 50분 이상, 또는 60분 이상까지, 예를 들면 30분 내지 60분 또는 30분 내지 50분 면역원성을 유도할 수 있으며, 즉 혈구응집능 및 감염능을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 키메라 뉴캣슬병 바이러스는 현저히 개선된 내열성을 갖는 것이다.
본 발명의 구체적인 일 예에서, 상기 키메라 바이러스는 기탁번호 KCTC13574BP을 갖는 A genotype 의 조류메타뉴모바이러스 A 타입의 표면항원을 발현하는 것인 키메라 바이러스, 또는 기탁번호 KCTC13575BP을 갖는 B genotype 의 조류메타뉴모바이러스 B 타입의 표면항원을 발현하는 것인 키메라 바이러스일 수 있다.
본 발명은 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 을 포함하는 조류메타뉴모바이러스 감염증 예방용 백신 또는 조류 면역화용 조성물에 관한 것이다. 다른 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 키메라 뉴캣슬병 바이러스 및 적어도 하나의 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신이 제공된다.
상기 구현예에서, 상기 백신은 생독 백신, 사독 백신, 서브유니트 백신, 벡터 백신, 키메라 백신 및 DNA 백신을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역원성 조성물"은 조류 메타뉴모바이러스 로부터 발현되는 관심의 항원 또는 면역원에 대해 면역 반응을 유발시키는 임의의 조성물을 의미하는 것으로, 예를 들면, 대상에 투여될 후 관심의 표적 면역원 또는 항원에 대해 면역 반응을 유발시킬 수 있는 조성물을 포함한다. 용어 "백신"은 관심의 항원에 대하여 방어 면역 반응을 유도하거나 또는 그 항원에 대해 효과적으로 방어하는 조성물을 의미하는 것으로, 예를 들면, 대상에 투여하거나 주사된 후 표적 항원 또는 면역원에 대해 방어 면역 반응을 유발시키거나 또는 조류메타뉴모바이러스, 바람직하게는 본원 발명에 따른 조류메타뉴모바이러스의 표면 항원인 G 단백질 및/또는 F 단백질로부터 발현된 항원 또는 면역원에 대해 효과적인 방어를 제공하는 임의의 조성물을 포함한다.
조류 대상에 본 발명에 따른 키메라 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 조류 대상의 접종 방법 또는 면역화 방법이 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 "조류 대상"은 조(Aves) 강에 속하는 임의의 모든 가내 및 야생 조류를 의미하는 것으로, 신조상목 및 치조상목을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 신조상목은 기러기목, 칼새목, 부세로포메스, 쏙독새목, 도요목, 황새목, 쥐새목, 비둘기목, 파랑새목, 뻐꾸기목, 매목, 갈벌리포메스, 닭목, 아미목, 두루미목, 무소파기포메스, 오피스토코미포메스, 참새목, 다라새목, 홍학목, 딱다구리목, 논병아리목, 바다제비목, 앵무목, 펭귄목, 올빼미목, 벌새목, 비단날개새목, 세가락메추라기목 및 후투티목 등을 포함할 수 있다. 치조상목은 키위새목, 화식조목, 공조목, 레아목, 타조목 및 티니아미포메스 등을 포함하며, 바람직하게는 닭일 수 있다. 상기 조류 대상은 성숙 조류, 조류 새끼 및 조류 배아/난을 포함할 수 있다.
상기 면역원성 조성물은 발육종란내(In Ovo), 비강내, 기관내, 경구, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 결막 및 피하의 경로로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 우수한 내열성을 갖기 때문에, 음용수를 통하는 것 또는 분무와 같이 농업적 목적을 위한 집단 투여의 경로에 적합할 수 있다.
본 발명에 따른 백신 생산 방법의 구체적 일 예로서, SPF 발육란에 NDV C7d-aMPV 바이러스를 105.0 EID50 접종하고 접종 후 24시간마다 검란을 실시하여 중사란을 확인한다. 접종 72시간 후 접종란을 4
Figure pat00004
냉장한 후 요막강액을 채취하여 닭 적혈구 응집반응을 통해 바이러스의 배양을 확인한다. 배양이 확인된 바이러스는 9-11일령 SPF 발육란에 십진 희석 후 접종하여 EID50 측정한다. 포르말린을 최종함량 0.05%(v/v)가 되도록 첨가하고 37℃ 온도에서 24시간 교반하여 바이러스를 불활화한다. 불활화된 바이러스를 오일 어쥬번트(Seppic ISA70)과 3:7 중량비로 혼합하여 사독백신을 제조할 수 있다.
상기 구현예에서, 상기 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 당업계에 잘 알려져 있는 것으로, 예를 들면, 살균수, 식염수 용액 또는 인산염 완충액을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의한 aMPV 예방용 백신을 제조하기 위하여, 상기 aMPV 입자는 그 자체로 사용할 수도 있지만, 수의학적으로 수용 가능한 매개체 내에 장입할 수 있고, 부형제로서 선택적으로 어쥬번트(adjuvant)를 보충할 수 있다. 본 발명의 특별한 구현양태에서, 조성물은 면역원성 조성물 및 항원보강제를 포함하고, 이들로 필수적으로 구성되고/되거나 구성된다. 본 발명의 항원보강제의 비제한적인 예는 알루미늄 유래 항원보강제, 사포닌, 미네랄 겔, 다가음이온, 플루로닉 폴리올, 사포닌 유도체, 리소레시틴 및 다른 유사한 표면 활성 물질, 글리코시드, 모든 유형의 오일 및 이들의 조합을 포함한다. 본 발명의 특별한 구현양태에서, 조성물은 수-중-유-중-수 에멀젼을 포함할 수 있다.
상기 매개체로는 아데노바이러스, 허피스바이러스, 폭스바이러스 등과 같은 전달매개체를 사용할 수 있으나 이에만 한정되는 것은 아니다. 또한 어쥬번트로서 수산화알루미늄을 사용하거나, 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체, 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 중합체 등을 사용할 수 있고, 백신을 O/W(oil-in-water) 에멀젼 형태로 제형화할 수 있다. 상기 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체는 특히 당 또는 폴리알코올의 폴리알케닐 에테르로 가교결합되어 있다. 이들 화합물은 카보머(carbomer)라는 명 칭으로 알려져 있다. 또한, 상기 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체 중에서 말레산 무수물과 에틸렌의 공중합체로는 선형 또는 예를 들면 디비닐 에테르와 가교결합된 EMA(R) 공중합체(Monsanto사)가 사용될 수 있다. 최종 백신 조성물에서의 중합체 농도는 0.01% 내지 1.5%(w/v), 보다 구체적으로는 0.05% 내지 1%(w/v), 바람직하게는 0.1% 내지 0.4%(w/v)일 수 있다.
상기 O/W 에멀젼은 특히 액체 파라핀 경유(유럽 약전 타입); 스쿠알란, 스쿠알렌과 같은 이소프레노이드 오일; 이소부텐 또는 데센의 존재 하에 알켄의 올리고머화로 얻어지는 오일; 선형 알킬기를 함유하는 산 또는 알코올의 에스테르, 특히 식물유, 에틸올레이트, 프로필렌글리콜 디(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴트리(카프릴레이트/카프레이트), 프로필렌글리콜 디올레이트; 분지형 지방산 알코올 또는 산의 에스테르, 특히 이소스테아르산의 에스테르 등을 기본으로 할 수 있다. 에멀젼을 형성하기 위해 상기 오일은 유화제와 혼합하여 사용된다. 바람직한 유화제로는 비이온성 계면활성제, 특히 소르비탄, 만나이드, 글리세롤, 폴리글리세롤 또는 프로필렌 글리콜의 에스테르; 및 선택적으로 에톡시화되어 있는 올레산, 이소스테아르산, 리신올레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르, 또는 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체 등을 들 수 있다.
본 발명은 조류 메타뉴모바이러스에 대한 백신에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 백신에 관한 것이다. 본 발명은 닭 메타뉴모바이러스 A 및 B type을 동시 예방 가능한 백신주를 제공하고, 내열성 NDV 벡터 백신 platform기술 활용으로 1일령 분무 접종 시 모체이행항체 극복 가능한 생백신 개발 가능하며, 양계 농장에서의 산란율 피해 저감 및 백신접종비용 절감하고, 양계 백신 수입대체 및 수출 증대 및 생산량 증대에 기여할 수 있다.
도 1a 내지 도 1b는 최근 국내 및 해외에서 유행하는 aMPV subtype A의 G 단백 합성유전자 서열과 aMPV subtype A의 F 단백 합성유전자 서열을 나타낸다.
도 1c 내지 도 1d는 최근 국내 및 해외에서 유행하는 aMPV subtype B의 G 단백 합성유전자 서열과 aMPV subtype B의 F 단백 합성유전자 서열을 나타낸다.
도 2a는 BP-NDV C7d를 backbone으로 내열성을 갖는 7형 뉴캣슬병바이러스 작출을 위한 재조합 NDV (BP-NDV C7d) 게놈 전사벡터를 나타낸다.
도 2b는 상기 제조된 BP-NDV C7d 벡터상의 AgeI, NgoMIV 및 PshAI 제한효소 인식부위를 이용한 조류메타뉴모바이러스 표면항원 F 및 G 도입한 BP-NDV C7d-a MPV-A 또는 BP-NDV C7d-a MPV-B를 나타낸다.
도 3a는 뉴캣슬병 바이러스 F 유전자 다양성부위를 Neighbor-Joining 법을 이용하여 계통 분석한 결과로 BP-NDV C7d(8006)주는 7d 형에 속함을 나타낸다.
도 3b는 국내 분리 7형 뉴캣슬병바이러스 BP-NDV C7d(8006)의 전체 RNA 게놈 염기서열 분석을 위한 프라이머 8세트의 해당 증폭부위를 나타낸다.
도 3c는 BP-NDV C7d NDV 게놈 전사벡터 제조과정 중 클로닝 연결부위의 확인결과를 나타낸다.
도 3d는 재조합 7형 NDV 바이러스 작출 과정을 나타낸 것으로서, 구체적으로 작출된 재조합 7형 NDV 바이러스의 NDV F 유전자 증폭을 통한 바이러스 유무를 확인한 결과로 transfection에 사용한 DNA에 의한 false positive 반응여부를 확인하기 위해 추출한 RNA를 RT-PCR 및 PCR하여 확인하고 그 결과를 나타낸 것이다.
도 3e는 transfection에 사용한 DNA에 의한 false positive 반응여부를 확인하기 위해, 재조합 7형 NDV 바이러스의 RT-PCR를 통한 바이러스 유무를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3f는 재조합 7형 재조합 NDV 바이러스의 주요항원부위를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4g는 실시예 3에 따라 제조된 BP-NDV C7d-aMPV-A 게놈 전사벡터 전체 염기서열을 나타낸다.
도 5a 내지 도 5g는 실시예 3에 따라 제조된 BP-NDV C7d-aMPV-B 게놈 전사벡터 전체 염기서열을 나타낸다.
도 6은 실시예 4에 따라 제조된 조류메타뉴모바이러스 표면항원 F와 G를 발현하는 재조합 NDV 게놈 전사벡터를 이용한 바이러스 작출방법을 나타낸다.
도 7a는 작출된 A형 조류메타뉴모바이러스 표면항원(F,G) 발현 재조합 NDV 바이러스의 NDV-F 유전자 증폭을 통한 바이러스 유무를 확인한 결과로 transfection에 사용한 DNA에 의한 false positive 반응여부를 확인하기 위해 추출한 RNA를 RT-PCR 및 PCR하여 확인하고 그 결과를 나타낸 것이다.
도 7b는 작출된 B형 조류메타뉴모바이러스 표면항원(F,G) 발현 재조합 NDV 바이러스의 NDV-F 유전자 증폭을 통한 바이러스 유무를 확인한 결과로 transfection에 사용한 DNA에 의한 false positive 반응여부를 확인하기 위해 추출한 RNA를 RT-PCR 및 PCR하여 확인하고 그 결과를 나타낸 것이다.
도 8a는 작출된 A형 조류메타뉴모바이러스 표면항원(F,G) 발현 재조합 NDV 바이러스의 주요항원부위를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8b는 작출된 B형 조류메타뉴모바이러스 표면항원(F,G) 발현 재조합 NDV 바이러스의 주요항원부위를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
하기 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.
실시예 1: AMPV의 G단백 및 F 단백에 대한 유전자 준비
1-1: AMPV G, F 단백유전자 정보 수집
최근 국내 및 해외에서 유행하는 aMPV subtype A와 B의 G 또는 F 단백질에 대한 유전자 정보를 GenBank로부터 수집하고 계통분석도 비교를 통해 subtype 별 대표 유전자를 선정함. 수집한 유전 정보로부터 각 subtype을 대표하는 표면항원 G단백 및 F단백을 선정하여 합성할 대표 유전자 서열을 결정함. 상기 선정된 subtype 별 표면항원 G단백 및 F단백을 선정하였다.
구분 염기서열 정보 합성대상 대표 유전자 서열
Subtype A aMPV G protein 유전자 염기서열 정보
총 60개 조사완료 		합성할 유전자 서열
aMPV A-F
Subtype B aMPV G protein 대한 유전자 염기서열 정보
총 66개 조사완료		 합성할 유전자 서열
aMPV B-F
Subtype A aMPV F protein 유전자 염기서열 정보
총 12개 조사완료 		합성할 유전자 서열
aMPV A-G
Subtype B aMPV F protein 유전자 염기서열 정보
총 29개 조사완료		 합성할 유전자 서열
aMPV B-G
1-2: G단백 및 F 단백에 대한 유전자의 인공합성 진행
GeneBank 유전자은행으로부터 검색하여 정리한 유전자 정보(aMPV A-G:60개, aMPV B-G:66개, aMPV A-F:12개, aMPV B-F:29개)로부터 대표유전자를 선별하여 바이오니아에 해당 유전자에 대한 유전자 합성을 의뢰하였다. 도입하는 유전자의 각각 양쪽 끝부분에는 도입에 필요한 제한효소 인식부위를 도입하였고 도입유전자가 NDV 발현 벡터 내에서 내부 유전자와 같은 방식으로 단백질로 발현될 수 있는 gene cassette 형태를 갖출 수 있도록 gene start sequence, gene end sequence, intergenic sequence를 맞추어 합성을 의뢰 한다. 하기 aMPV subtype B의 F protein gene은 GCCG G C를 GCCG C C로 치환하였다(NgoMIV site 제거함).
aMPV subtype A의 G protein gene: 서열번호 1 (도 1a)
aMPV subtype B의 G protein gene: 서열번호 2 (도 1b)
aMPV subtype A의 F protein gene: 서열번호 3 (도 1c)
aMPV subtype B의 F protein gene: 서열번호 4 (도 1d)
도 1a 내지 도 1b는 최근 국내 및 해외에서 유행하는 aMPV subtype A의 G 단백 합성유전자 서열과 aMPV subtype A의 F 단백질 합성유전자 서열을 나타낸다. 도 1c 내지 도 1d는 최근 국내 및 해외에서 유행하는 aMPV subtype B의 G 단백질 합성유전자 서열과 aMPV subtype B의 F 단백 합성유전자 서열을 나타낸다.
실시예 2: aMPV 역유전학 시스템 개발
2-1: 7형 뉴캣슬병 바이러스 분리
2008년 5월 29일 경기도 용인시 처인구 소재 종계 농가(6계동, 37,000수 규모)에서 ㈜바이오포아 병성감정기관에 의뢰한 샘플로부터 7형 강병원성주의 항원성을 갖는 뉴캣슬병 바이러스를 분리하였다(8006주). 의뢰농가 6계동 전체에서 높은 폐사(매일 40여수씩 폐사 발생)와 함께 심한 산란율 저하가 보였으며(산란율이 68-70% 수준에서 정체됨) 수의사 현장부검 당시 암탉 2수, 수탉 1수 모두에 공통적으로 복막염과 선위출혈이 확인되었고 수탉에서는 청색증, 심한 기관지 출혈과 함께 기관내강에 저류된 삼출물이 관찰되었고 요산침착증 소견이 보였다. 현장부검에서 개체별로 채취한 기관 및 맹장편도를 멸균 PBS로 고형물이 10%가 되도록 유제한 후 NDV pathotyping RT-PCR을 실시한 결과 양성반응을 보였다. 유제액을 계태아 섬유아세포(CEF) 상에서 3회 플라크 정제를 수행하여 클로닝하였고, SPF 발육란에서 2회 계대배양하여 바이러스를 분리하였다.
상기 분리된 바이러스의 F 유전자 다양성부위(384bp)에 대해 Neighbor-Joining 법을 이용한 결과 7d 형에 속함을 확인하였다(도 3a 참조)
2-2: 국내 분리 7형 NDV 바이러스의 RNA 게놈 염기서열 분석
GenBank에 등록되어 있는 7형 NDV 바이러스 서열을 다중 정렬하여 공통적으로 특이적인 프라이머 세트를 제작하였다. 결과적으로 상기 BP-NDV C7d 바이러스 15,210bp 게놈을 6개의 중첩되는 단편으로 나누어 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 제작하였다. 바이러스 게놈 RNA의 3'-말단 및 5'-말단을 제외한 전체부분을 각각의 프라이머를 이용, cDNA 합성 및 PCR증폭한 후 염기서열을 분석하였고 3' 및 5' 말단 염기서열은. RACE 방법을 사용하여 해당 부분에 대한 cDNA 합성 및 PCR 증폭하여 염기서열 분석을 진행하였다. 반응에 사용된 primer들은 표 2에 요약하였으며, 프라이머 설계 부위를 도 3b에 나타낸다.
Position Oligonucleotide Primer sequence (5' -> 3')
3'-RACE NDV C7d-NP-754R CAAGTTGTAATATGTAGAGC
751-3,570 NDV C7d-NP-801-F GAAGAAGTACATCCTTCATC
NDV C7d-P gene-366R GTCGAGCATGGACAGAAGG
NDV C7d-P-2268-F AGACCAGCGACACACAGCTC
NDV-C7d-M-3621-R AGCTCGTGCCTGGGATTGTC
3,443-5,101 NDV C7d-M-130F CAGCGTCTTGATTCGTGGAC
NDV-C7d-F-realTime-R GTGTTCTGTTATATGCCTCC
NDcomR/ptR TGCCACTGMTAGTTGYGATA
4,723-7,613 NDcom156/f ATACACCTCRTCYCAGACAG
NDV C7d-HN-62R CATGTGTTCTTTGCTTCTC
NDV C7d-F 912F GACCTTATCTGTAAGTACA
SF-7575R TTAGGTGGAATAGTCAGCACC
7,053-9,616 NDV C7d-HN-7102-F AGCACTTGGTGTGCTTCGG
NDV C7d-L gene 65R GAGGATAGATGTGACTCTGG
NDV C7d-L gene 1212R GTATCCATTGATGATTGTTC
8,520-11,945 NDV C7d-L-8569-F CGCTTCCTGATGAATGCG
NDV-All-10772-R ATTATCACTGGCTTGATGCA
NDV C7d-L-10018-F TGGAATACCTGACAACCCTC
NDV C7d-L-11495-R CATCAGTCAGCTCTATATTGC
11,598-14,992 NDVC7d-L-3193-F AGATTGCACTGACTAGGAGG
NDV C7dCND-L-3512F ATCTTCCAAGCAATATAGA
NDV C7dCND-L-5373R GATGCCTTATACCAAGA
NDV C7dCND-L-5068F ATTGGTGCTCGAGTGAAAG
C7d-Lgene-6588R CTTGGCAGCATTACCTATG
5'-RACE NDV C7d-L-14931-F AGCGGTCCTGGGTATTACTA
2-3: BP-NDV C7d 주를 기본골격(backbone)으로 한 재조합 NDV 게놈 전사 벡터 제조
실시예 1-2에서 얻어진 야외 분리 7형 ND 바이러스 전체 유전자를 8개의 단편으로 나누어 인공적으로 합성하였다. 모든 합성유전자는 제조사로부터 pBHA vector에 클로닝되어 제공받았다. 각 단편에는 해당 위치의 뉴캣슬병 바이러스 단백질을 암호화하는 서열 및 발현벡터 도입에 필요한 제한효소 인식부위를 부가하였다.
진핵 발현 숙주세포 내에서 전사 및 해독 발현조절을 위해 S1 단편에는 T7 promoter와 3' UTR 서열을, S8 단편에는 5'UTR와 T7 terminator 서열을 추가로 부가하였다. 특히 NDV의 cDNA로부터 바이러스를 만들어낼 때 바이러스 게놈의 5'과 3' 양쪽 끝에 불필요한 염기의 첨가없이 바이러스 게놈과 똑 같은 구조로 전사되도록 T7 프로모터를 전사개시부 바로 앞에 위치하도록 하였고, NDV 안티게놈 RNA 직후에는 간염 델타 바이러스(Hepatitis delta virus : HDV) ribozyme RNA 서열을 위치시켜 self cleavage가 일어날 수 있도록 하였으며, T7 promoter와 3' UTR 사이, 5'UTR과 T7 terminator 사이에는 바이러스 비전사 영역인 리더(leader, 20nt) 및 트레일러(trailer, 22nt)를 각각 위치시켜 게놈 RNA의 복제, 바이러스의 encapsidation 및 packaging을 제어하도록 하였다.
또한 F gene의 cleavage site서열(112-RRQKRF-117)을 적어도 비병원성 아미노산 codon을 갖도록 디자인하여 합성하였다. 즉 cleavage site 서열 중 특히 115번 코돈은 112-GRQARL-117의 비병원성 아미노산 codon을 갖도록 디자인하였는데 이 경우 2번 이상의 점 돌연 변이를 거쳐야 염기성 아미노산을 코딩하는 코돈으로 변하여 병원성을 나타낼 수 있다. S2-S8까지 모든 합성유전자는 S1 pBHA vector 내 작성해 놓은 다중 제한효소 부위를 이용하여 순차적으로 도입하였고 각 도입단계마다 연결부위 전과 후에 위치하는 프라이머 조합으로 PCR하여 새롭게 도입된 유전자를 확인하였다. BP-NDV C7d 바이러스 게놈 전사벡터 클로닝 단계 별 연결확인 프라이머세트는 표 3에 요약하며, 프라이머 설계 부위를 도 3c에 나타낸다. 연결부위가 확인된 NDV 게놈 전사 벡터는 표 4에 요약된 프라이머 세트로 전체 염기서열을 확인하였다.
연결확인 부위 Oligonucleotide Primer sequence (5' -> 3') Amplicon
size(bp)
S1-S2 NDV C7d-178delta NgoMIV-IF TACCAATGGCCGCCCTCTGCCAACT 2,162
NDV C7d-Pgene-366R GTCGAGCATGGACAGAAGG
S2-S3 NDV C7d-NP-1576-F ATCCTGCACAGAGCACCA 2,044
NDV-C7d-M-3621-R AGCTCGTGCCTGGGATTGTC
S3-S4 NDcom156/f ATACACCTCRTCYCAGACAG 875
NDV C7d+Ampv-8563R CCAGATCGGACTCTATACAG
S4-S5 NDV C7d-HN-7102-F AGCACTTGGTGTGCTTCGG 1,863
NDV-all-L-511R TGGACCATTTTGAGTGAA
S5-S6 NDV C7d-L-10018-F TGGAATACCTGACAACCCTC 776
NDV-All-10772-R ATTATCACTGGCTTGATGCA
S6-S7 NDVC7d-L-3193-F AGATTGCACTGACTAGGAGG 2,080
NDV C7dCND-L-5373R GATGCCTTATACCAAGA
S7-S8 NDV C7dCND-L-5068F ATTGGTGCTCGAGTGAAAG 1,521
C7d-Lgene-6588R CTTGGCAGCATTACCTATG
Position Oligonucleotide Primer sequence (5' -> 3')
NP T7-pro-new CTTAATACGACTCACTATAGG
NP-P NDV C7d-NP-801-F GAAGAAGTACATCCTTCATC
NDV C7d-NP-1576-F ATCCTGCACAGAGCACCA
P NDV C7d-P-2268-F AGACCAGCGACACACAGCTC
P-M NDV-C7d-M-339-R CATGGTGAGGCAGGCTCTC
M NDV-C7d-M-1F ATGGACTCATCCAGGACA
M-F NDV-C7d-M-856F CGGACTAAGCTACTTGCTCCT
NDV-C7d-F-realTime-R GTGTTCTGTTATATGCCTCC
F NDV-C7d-Fgene-7536F TATCCGTCTGACAAGCTCT
F-HN NDV C7d-F-5704-F TGAGCGGCAACACATCAGC
HN NDV-all-HN-948R AACTGGGAACCATACACG
NDV C7d-HN-7102-F AGCACTTGGTGTGCTTCGG
HN-L NDV C7d-HN-7834-F AGGTAGTGTCCCTTGCCAG
L NDV C7d-L-8569-F CGCTTCCTGATGAATGCG
NDV C7d-L-9288-F AGGTAATCAAGTCTATGATG
NDV C7d-L-10018-F TGGAATACCTGACAACCCTC
NDV C7d-11842R CTGTCAGGGGTGACCAGCT
NDV C7d-L-11495-R CATCAGTCAGCTCTATATTGC
NDV C7d-L-3106F CGTGTCGCACATGCTATCATGG
NDV C7d-L-12507-F CGAGAAGCGCCTGTTGCGGT
NDV C7d-L-13307-F CACTGAGTATCTACTGTCAG
NDV C7d-L-6588 CTTGGCAGCATTACCTATGG
L-T7 terminator NDV C7d-L-14931-F AGCGGTCCTGGGTATTACTA
Vector-ori-AmpR pBHA-ORI-142F CTTACCGGATACCTGTCCGC
T7 promoter-3-leader-NP NDV C7d-178delta NgoMIV-IR AGTTGGCAGAGGGCGGCCATTGGTA
2-4: 7형 재조합 NDV 바이러스 작출
전체 NDV 유전자를 복제하는 재조합 전장 NDV C7d cDNA vector로부터 7형 ND 바이러스를 도 3d와 같이 작출하였다.
Hep-2세포 주를 6well 플레이트 에 80%가랑 키워놓은 후, vaccinia T7 바이러스를 감염시켰다. 이후 세포주에 T7 promoter에 의해 개시되어 단백질이 발현되는 pCR-TM-NP, pCR-TM-P, pCR-TM-L 플라스미드 벡터 3개와 T7 promoter에 의해 개시되어 HDV 라이보자임에 의해 스스로 절단되어 정확하고 완전한 전체 키메라 내열성 NDV 게놈을 만들어 낼 수 있는 플라스미드인 NDV C7d-H5N6-HANA pBHA을 준비하였다. 각각을 1:1:0.1:1 비율로 섞어 Lipofectamine TM(Invitrogen. co)과 적정 비율로 혼합하여 트랜스펙션하였다. 이후 1ug/ml의 acetylated trypsin을 첨가하여 내열성 비병원성 재조합 바이러스가 생성되어 감염성을 갖도록 하였다. 2-3일간 37
Figure pat00005
에서 배양한 후 6 well의 세포를 수확하여 11일령의 SPF 발육란에 접종하여 감염성 NDV를 얻었다.
2-5 7형 재조합 NDV 바이러스의 확인 실험
11일령 SPF 발육란 접종 후 24시간마다 검란을 실시하여 중사란을 확인하고, 접종 72시간 후 접종란을 4
Figure pat00006
냉장한 후 요막강액을 채취하여 바이러스 확인실험을 실시하였다.
2-5-1 RT-PCT
요막강액 150㎕에 Virus genome Ex Kit(BIOPOA) lysis buffer 150㎕를 첨가하고 균질하게 혼합한 후 실온에서 10분간 정치하였다. 여기에 다시 binding buffer 300㎕를 첨가하고 균질하게 혼합한 후 column에 loading하고 washing buffer A, B를 사용하여 차례로 column을 세척하고 elution buffer로 column에 부착되어있는 RNA를 용해시켰다.
추출한 재조합 뉴캣슬병바이러스의 RNA 2㎕를 다음 NDVcomF/NDVcomR primer를 사용하여 ONE-STEP RT-PCR Kit(iNtRON)로 45
Figure pat00007
℃?/5min-(94℃?/20sec-50℃?/15sec-72℃?/30sec)30cycles 조건하에서 RT-PCR 하여 바이러스의 유무를 확인하였으며, Transfection에 사용한 DNA에 의한 false positive 반응을 확인하기 위하여 추출한 RNA를 NDVcomF/NDVcomR primer를 사용하여 MG-taq polymerase(MGmed)로 하기의 조건하에서 PCR하여 확인하고, 그 결과를 도 3e에 나타내었다:
바이러스 NDV F 유전자 확인 RT-PCR:
45
Figure pat00008
℃?/5min-(94℃?/20sec-50℃?/15sec-72℃?/30sec)30cycles
False positive 확인 PCR:
94
Figure pat00009
℃?/20sec-50℃?/15sec-72℃?/30sec)30cycles
primer sequence (5-> 3)
NDVcomF: ATACACCTCRTCYCAGACAG
NDVcomR: TGCCACTGMTAGTTGYGATA
상기 프라이머세트로 NDV F 유전자에 대한 확인이 완료된 바이러스는 NDV 주요 항원부위에 대하여 4종 RT-PCR 후 염기서열 분석하여 확인하였으며, 그 결과를 도 3f에 나타내었다. 확인이 완료된 바이러스는 BP-NDV-C7d라고 명명하고 KCTC 생물자원센터에 2019년 7월 23일자로 기탁하여 KCTC13595BP 기탁번호를 수여받았다.
바이러스 NDV F 유전자 확인 RT-PCR 조건
45℃/5min-(94℃/20sec-50℃/20sec-72℃/1min 20sec)30cycles
No. Oligonucleotide Sequence (5'->3’) 확인 부분
P1 P480-NDV C7d-P-2268-F AGACCAGCGACACACAGCTC P->M M->P
P550-NDV-C7d-M-3621-R AGCTCGTGCCTGGGATTGTC
P2 P436-NDV-C7d-M-5168 CAATCTTGCGCTCAATGTCA M->F F->M
P471-NDV C7d+Ampv-8563R CCAGATCGGACTCTATACAG
P3 P753-NDV C7d-F 912F GACCTTATCTGTAAGTACA F->HN HN->F
P754-NDV C7d-HN-62R CATGTGTTCTTTGCTTCTC
P4 P482-NDV C7d-HN-6401-F GAACGGTCAGAGGAGCCAC HN
P755-NDV C7d-HN gene end-R GCTCAATCGGCCACGTCTAG
추출한 요막강액을 닭혈구와 반응하여 혈구응집반응을 통해 작출된 재조합 NDV 바이러스를 확인하였다. NDV 바이러스의 혈구응집반응 최초 작출 확인 이후 바이러스별로 종란에 2회, 3회 계대배양 후 혈구응집반응을 통해 바이러스의 배양을 확인하였다.
본 발명에 따른 BP-NDV-C7d 바이러스 작출 벡터는, 7형 NDV의 유전자를 도입하여 만든 벡터로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2013년 기탁(KCTC12444BP로)한 BP-ACND와는 상이하며, 종래 Lasota 바이러스를 backbone으로 한 바이러스들에 비해 내열성이 향상되어 56 ℃ 온도에서 열처리 후 20분까지 HA 활성이 유지되나(Lasota backbone 바이러스의 경우 10분) BP-NDV-C7d 바이러스는 이보다 내열성이 더욱 향상된 바이러스로 56 ℃ 온도에서 열처리 후 20분 이상, 25분 이상, 또는 30분이상, 바람직하게는 30분 내지 50분까지 HA (혈구응집반응) 활성이 유지되고 세포 감염능이 또한 유지됨을 확인하였다.
실시예 3: aMPV-F, G 표면항원을 탑재한 키메라바이러스 제조를 위한 발현 벡터 제조
상기 실시에 2에서 얻어진 7형 NDV 발현벡터(NDV-C7d)에 조류메타뉴모바이러스에 대한 인공합성 subtype A aMPV-F, G 유전자 도입하여 키메라 바이러스를 제조하였다.
NDV의 각 유전자들은 개별적인 개시서열과 종결서열이 있어 RNA 의존 RNA 중합효소에 의해 각각의 mRNA로 전사되는데 transcriptional polarity에 의해 5'쪽 ORF 일수록 전사되는 mRNA가 감소하고 이에 따라 발현되는 단백질량이 저하된다. 재조합 바이러스 증식성에는 영향을 미치지 않는 동시에 ND 발현벡터 내 조류메타뉴모바이러스 G, F 항원의 발현율을 높이기 위해 발현벡터 내 3'쪽에 위치하는 P-M 또는 M-F 사이에 조류메타뉴모바이러스 G 및 F 유전자를 각각 도입하였다.
상기 제작된 NDV C7d vector 내 aMPV G 및 F 항원도입에 필요한 AgeI, NgoMIV 및 NgoMIV-PshAI 제한효소 인식부위를 부가한 후 조류메타뉴모바이러스 G 및 F 단백 코딩서열을 도입하였다. 도입이 완료된 NDV 게놈 전사 벡터는 표에 요약된 프라이머세트로 전체 염기서열을 확인하였다. 상기 PCR 반응에 사용된 BP-NDV C7d-aMPV-A 게놈 전사벡터 전체 염기서열 확인용 프라이머 세트를 하기 표 6에 나타내고, BP-NDV C7d-aMPV-B 게놈 전사벡터 전체 염기서열 확인용 프라이머 세트를 하기 표 7에 나타낸다.
PRIMER 명명 SEQUENCE (5'->3')
P474-NDV C7D-177DELTA NGOMIV-F TCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTG
P476-NDV C7D-178DELTA NGOMIV-IF TACCAATGGCCGCCCTCTGCCAACT
P478-NDV C7D-NP-801-F GAAGAAGTACATCCTTCATC
P479-NDVC7D-NP-1576-F ATCCTGCACAGAGCACCA
P480-NDVC7D-P-2268-F AGACCAGCGACACACAGCTC
P433-NDV-C7D-PGENE-2788-F GGCATGATGAAAATTCTGGAC
P460-NDV-C7D-M-856F CGGACTAAGCTACTTGCTCCT
P441-NDV-C7D-AMPV-A-F-5985F GACACTGAGTTAGTACTCAC
P442-NDV-C7D-AMPV-A-F-6750F TGAAGATGATTGTGAGGTAAG
P24-LA-4941F ACAGCGGCACAGATAACAGCA
P471-NDV C7D+AMPV-8563R CCAGATCGGACTCTATACAG
P481-NDV C7D-F-5704-F TGAGCGGCAACACATCAGC
P482-NDV C7D-HN-6401-F GAACGGTCAGAGGAGCCAC
P483-NDV C7D-HN-7102-F AGCACTTGGTGTGCTTCGG
P484-NDV C7D-HN-7834-F AGGTAGTGTCCCTTGCCAG
P485-NDV C7D-L-8569-F CGCTTCCTGATGAATGCG
P486-NDV C7D-L-9288-F AGGTAATCAAGTCTATGATG
P487-NDV C7D-L-10018-F TGGAATACCTGACAACCCTC
P493-PBHA-ORI-16199-F ACCACCGCTGGTAGCGGTGG
P488-NDV C7D-L-11719-F GCAATGTTGTTCAGAGATGA
P489-NDV C7D-L-12507-F CGAGAAGCGCCTGTTGCGGT
P490-NDV C7D-L-13307-F CACTGAGTATCTACTGTCAG
P491-NDV C7D-L-14126-F GCTTATTAGATCAACTGGCT
P492-NDV C7D-L-14931-F AGCGGTCCTGGGTATTACTA
P190-T7-TERMINATOR CCGCTGAGCAATAACTAGC
P493-NDV C7D-11842R CTGTCAGGGGTGACCAGCT
Primer 명명 Sequence (5'->3')
P474-NDV C7D-177DELTA NGOMIV-F TCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTG
P476-NDV C7D-178DELTA NGOMIV-IF TACCAATGGCCGCCCTCTGCCAACT
P478-NDV C7D-NP-801-F GAAGAAGTACATCCTTCATC
P479-NDV C7D-NP-1576-F ATCCTGCACAGAGCACCA
P480-NDV C7D-P-2268-F AGACCAGCGACACACAGCTC
P433-NDV-C7D-PGENE-2788-F GGCATGATGAAAATTCTGGAC
P436-NDV-C7D-M-5168 CAATCTTGCGCTCAATGTCA
P446-NDV-C7D-AMPV-B-F-5880R ATTAGTAGCAGTTTGAGGTAC
P444-NDV-C7D-AMPV-B-F-6024F GAACATAACATGTAATGATGG
P445-NDV-C7D-AMPV-B-F-6749F GTTATGCTTGTCTGCTGCG
P24-LA-4941F ACAGCGGCACAGATAACAGCA
P471-NDV C7D+AMPV-8563R CCAGATCGGACTCTATACAG
P481-NDV C7D-F-5704-F TGAGCGGCAACACATCAGC
P482-NDV C7D-HN-6401-F GAACGGTCAGAGGAGCCAC
P483-NDV C7D-HN-7102-F AGCACTTGGTGTGCTTCGG
P484-NDV C7D-HN-7834-F AGGTAGTGTCCCTTGCCAG
P485-NDV C7D-L-8569-F CGCTTCCTGATGAATGCG
P486-NDV C7D-L-9288-F AGGTAATCAAGTCTATGATG
P487-NDV C7D-L-10018-F TGGAATACCTGACAACCCTC
P473-NDV C7D-11842R CTGTCAGGGGTGACCAGCT
P488-NDV C7D-L-11719-F GCAATGTTGTTCAGAGATGA
P489-NDV C7D-L-12507-F CGAGAAGCGCCTGTTGCGGT
P490-NDV C7D-L-13307-F CACTGAGTATCTACTGTCAG
P491-NDV C7D-L-14126-F GCTTATTAGATCAACTGGCT
P492-NDV C7D-L-14931-F AGCGGTCCTGGGTATTACTA
P190-T7-TERMINATOR CCGCTGAGCAATAACTAGC
P493-NDV C7D-11842R CTGTCAGGGGTGACCAGCT
상기 방법에 따라 최종 제작된 BP-NDV C7d-aMPV-A 게놈 전사벡터 전체 염기서열은 서열번호 5로서 도 4a 내지 도 4g에 나타내고, BP-NDV C7d-aMPV-B 게놈 전사벡터 전체 염기서열은 서열번호 6으로서 도 5a 내지 도 5g에 나타낸다.
실시예 4: aMPV-F, G 표면항원을 탑재한 키메라바이러스 작출
4-1: 역유전학을 이용한 aMPV 표면항원 F, G 발현 각각의 NDV 키메라 바이러스의 작출
전체 NDV 유전자를 복제하는 재조합 전장 NDV C7d cDNA vector로부터 aMPV G, F 단백질 발현하는 ND 바이러스를 도 6과 같이 작출하였다.
Hep-2 세포주를 6well 플레이트에 80%가랑 키워놓은 후, vaccinia T7 바이러스를 감염시켰다. 이후 세포주에 T7 promoter에 의해 개시되어 단백질이 발현되는 pCR-TM-NP, pCR-TM-P, pCR-TM-L 플라스미드 벡터 3개와 T7 promoter에 의해 개시되어 HDV 라이보자임에 의해 스스로 절단되어 정확하고 완전한 전체 키메라 바이러스를 제조할 수 있는 플라스미드인 BP-NDV C7d-aMPV-A 및 BP-NDV C7d-aMPV-B (실시예 3의 산물)을 준비하였다.
상기pCR-TM-NP, pCR-TM-P, pCR-TM-L 플라스미드 벡터, BP-NDV C7d-aMPV-A 또는 BP-NDV C7d-aMPV-B를 1:1:0.1:1 비율로 섞어 Lipofectamine TM(Invitrogen. co)과 적정 비율로 혼합하여 트랜스펙션하였다. 이후 1ug/ml의 acetylated trypsin을 첨가하여 내열성 비병원성 재조합 바이러스가 생성되어 감염성을 갖도록 하였다. 2-3일간 37
Figure pat00010
에서 배양한 후 6 well의 세포를 수확하여 11일령의 SPF 발육란에 접종하여 감염성 NDV를 얻었다.
4-2 : aMPV-F, G 표면항원 발현 NDV 종독 작출 및 확인
11일령 SPF 발육란 접종 후 24시간마다 검란을 실시하여 중사란을 확인하고, 접종 72시간 후 접종란을 4
Figure pat00011
냉장한 후 요막강액을 채취하여 바이러스 확인실험을 실시하였다.
4-2-1 작출된 재조합 ND 바이러스의 혈구응집반응 확인
추출한 요막강액을 닭혈구와 반응하여 혈구응집반응을 통해 작출된 재조합 NDV 바이러스를 확인하였다. NDV 바이러스의 혈구응집반응 최초 작출 확인 이후 바이러스별로 종란에 2회, 3회 계대배양 후 혈구응집반응을 통해 바이러스의 배양을 확인하였다.
4-2-2 RT-PCT를 통한 바이러스 유무 확인
요막강액 150㎕에 Virus genome Ex Kit(BIOPOA) lysis buffer 150㎕를 첨가하고 균질하게 혼합한 후 실온에서 10분간 정치하였다. 여기에 다시 binding buffer 300㎕를 첨가하고 균질하게 혼합한 후 column에 loading하고 washing buffer A, B를 사용하여 차례로 column을 세척하고 elution buffer로 column에 부착되어있는 RNA를 용해시켰다.
추출한 재조합 뉴캣슬병바이러스의 RNA 2㎕를 다음 NDVcomF/NDVcomR primer를 사용하여 ONE-STEP RT-PCR Kit(iNtRON)로 45
Figure pat00012
℃?/5min-(94℃?/20sec-50℃?/15sec-72℃?/30sec)30cycles 조건하에서 RT-PCR 하여 바이러스의 유무를 확인하였으며, Transfection에 사용한 DNA에 의한 false positive 반응을 확인하기 위하여 추출한 RNA를 NDVcomF/NDVcomR primer를 사용하여 MG-taq polymerase(MGmed)로 하기의 조건하에서 PCR하여 확인하고, 그 결과를 도 7a 및 도 7b에 나타내었다:
바이러스 NDV F 유전자 확인 RT-PCR:
45
Figure pat00013
℃?/5min-(94℃?/20sec-50℃?/15sec-72℃?/30sec)30cycles
False positive 확인 PCR:
94
Figure pat00014
℃?/20sec-50℃?/15sec-72℃?/30sec)30cycles
primer sequence (5-> 3)
NDVcomF: ATACACCTCRTCYCAGACAG
NDVcomR: TGCCACTGMTAGTTGYGATA
도 7a는 작출된 A형 조류메타뉴모바이러스 표면항원(F,G) 발현 재조합 NDV 바이러스의 NDV-F 유전자 증폭을 통한 바이러스 유무를 확인한 결과로 transfection에 사용한 DNA에 의한 false positive 반응여부를 확인하기 위해 추출한 RNA를 RT-PCR 및 PCR하여 확인하고 그 결과를 나타낸 것이다.
도 7b는 작출된 B형 조류메타뉴모바이러스 표면항원(F,G) 발현 재조합 NDV 바이러스의 NDV-F 유전자 증폭을 통한 바이러스 유무를 확인한 결과로 transfection에 사용한 DNA에 의한 false positive 반응여부를 확인하기 위해 추출한 RNA를 RT-PCR 및 PCR하여 확인하고 그 결과를 나타낸 것이다.
4-2-3 RT-PCR를 통한 재조합 바이러스의 주요 항원 부위 확인
상기 프라이머 세트로 NDV F 유전자에 대한 확인이 완료된 바이러스는 도입된 G, F 항원 포함하는, 주요 항원부위에 대하여 6종 RT-PCR 후 염기서열 분석하여 확인하였으며, 그 결과를 도 8a 및 도 8b에 나타내었다. 확인이 완료된 바이러스는 BP-NDV-C7d-aMPV-AGF, BP-NDV-C7d-aMPV-BGF라고 명명하고 KCTC 생물자원센터에 __자로 기탁하여, BP-NDV-C7d-aMPV-AGF는 기탁번호 KCTC13574BP를 수여받고, BP-NDV-C7d-aMPV-BGF는 KCTC13575BP를 수여받았다.
상기 바이러스 주요 항원부위 확인 RT-PCR 조건은 다음과 같으며 사용된 프라이머 세트는 NDV-C7d aMPV-A에 대한 것은 표 8에 나타내고, NDV-C7d aMPV-B에 대한 것은 표 9에 나타낸다.
45℃/30분-프라이94℃/20sec - 50℃/20sec - 72℃/1min 20sec)30cycles
Oligonucleotide Sequence(5' -> 3') 확인 부분
P1 P433-NDV-C7d-Pgene-2788-F GGCATGATGAAAATTCTGGAC P-G
P448-AMPV-A-G-3787-R ACATTGTTTTCTACTAGTGT
P2 P439-NDV-C7d-A-G-3531-F CTACAATGGAGGAGATAGAG G-M
P501-NDV-C7d-M-339-R CATGGTGAGGCAGGCTCTC
P3 P460-NDV-C7d-M-856F CGGACTAAGCTACTTGCTCCT M-F
P461-AMPV-A-F-339R CTGTTACGGCAGCAGCTGT
P4 P441-NDV-C7d-AMPV-A-F-5985F GACACTGAGTTAGTACTCAC F
P498-aMPV-F-1108R CAGGGTGTCTACCTGTGCT
P5 P442-NDV-C7d-AMPV-A-F-6750F TGAAGATGATTGTGAGGTAAG F-NDV-F
P499-NDV C7d-F-4317-R GGAGCAACTTGACTATGATT
P6 P438-NDV-C7d-Fgene-7536F TATCCGTCTGACAAGCTCT F cleavage site
P471-NDV C7d+Ampv-8563R CCAGATCGGACTCTATACAG
Oligonucleotide Sequence(5' -> 3') 확인 부분
P1 P433-NDV-C7d-Pgene-2788-F GGCATGATGAAAATTCTGGAC P-G
P450-AMPV-B-G-3881R GAGTTCCTCTGGGCAGTG
P2 P443-NDV-C7d-AMPV-B-G-3581F TACTTCAACAAGAGGTAAGAC G-M
P501-NDV-C7d-M-339-R CATGGTGAGGCAGGCTCTC
P3 P460-NDV-C7d-M-856F CGGACTAAGCTACTTGCTCCT M-F
P463-AMPV-B-F-586R GCTAAAGCTACGGCGGCTG
P4 P444-NDV-C7d-AMPV-B-F-6024F GAACATAACATGTAATGATGG F
P498-aMPV-F-1108R CAGGGTGTCTACCTGTGCT
P5 P445-NDV-C7d-AMPV-B-F-6749F GTTATGCTTGTCTGCTGCG F-NDV-F
P499-NDV C7d-F-4317-R GGAGCAACTTGACTATGATT
P6 P438-NDV-C7d-Fgene-7536F TATCCGTCTGACAAGCTCT F cleavage site
P471-NDV C7d+Ampv-8563R CCAGATCGGACTCTATACAG
실시예 4: A type 과 B type의 aMPV-F, G 표면항원을 탑재한 키메라바이러스의 배양 및 증식성 확인
작출 바이러스를 SPF종란에서 105.5-106.5EID50 ml virus를 접종, 37도 인큐베이터에서 72시간 배양 후 요막강액을 수확하는 방법으로 바이러스를 계대배양 하였다. 안정적 배양이 확인된 NDV-C7d-aMPV-A(E4), NDV-C7d-aMPV-B(E5) virus의 SPF 발육란 및 CEK 세포에서의 증식성을 확인함. 37
Figure pat00015
에 인산완충용액으로 10진희석 후 각각의 희석액을 9~11 일령 발육란 4-5개의 장뇨막강 내 0.1㎖씩 접종. 접종 후 24시간 이내에 폐사한 것은 제외하고 24시간 이후에 폐사한 것은 뉴캣슬병 바이러스에 의한 폐사임을 확인하고 7일 후에 생존한 것에 대하여는 장뇨막강액의 닭 적혈구 응집성을 조사함. 닭 적혈구를 응집하는 것을 양성으로 인정하여 EID50을 산출하였다.
96well plate에 배양 해 놓은 CEK 초대세포에 인산완충용액으로 10진 희석한 바이러스를 25ul씩 첨가한 후 37℃ CO2 incubator에서 7일간 배양하여 ND바이러스에 의한 세포변성효과를 확인하고 상층액을 수확하여 닭 적혈구와 반응하여 응집하는 것을 양성으로 인정하여 TCID50를 산출하였다. 재조합 바이러스의 종란 및 세포에서의 증식성 분석 결과를 하기 표 10에 나타낸다.
키메라 바이러스 구분 EID50/ml TCID50/ml
NDV-C7d-aMPV-A(E4) 9.3 8.4
NDV-C7d-aMPV-B(E5) 9.0 8.9
실시예 5: 키메라 바이러스 사독백신의 효능평가
키메라 바이러스의 사독백신으로서의 면역원성을 평가하기 위해 백신 접종 후 채혈하여 중화 항체가를 관찰하였으며, 구체적인 실험방법은 다음과 같다.
(1) 96 well round bottom plate에 serum free media를 B열부터 H열까지 100μl씩 분주.
(2)미리 1/16 희석해 놓은 혈청을 B열에 100μl 첨가한 후 2진 희석하며 균질화 한다.
(3) 새로운 96well plate에 희석된 혈청을 100ul/well 분주해 놓음.
(4) 혈청중화시험에 사용하는 SC1509 virus를 37도 항온수조에서 녹인 후 무혈청배지로 최종 300TCID50가 되도록 희석함.
(5)희석된 혈청이 들어있는 96well plate에 위에서 준비한 바이러스 100ul(최종100-200 TCID50)을 첨가한 후 37도 인큐베이터에서 1시간 반응
(6) 전날 96well plate에 배양해 놓은 vero cell에서 배양배지를 제거한 후 바이러스와 혈청 반응액의 혼합액 100ul를 첨가함.
(7) 37 ℃인큐베이터에서 배양 7일 후 바이러스에 의한 CPE를 판독 한다.
재조합바이러스의 사독백신으로서의 면역원성을 평가하기 위해 포르말린으로 불활화한 바이러스 1수분(8.5 EID50)을 6주령 SPF 병아리에 근육 접종하고 4주, 6주후 채혈하여 SC1509(aMPV B-type virus) 바이러스에 대한 혈청중화능을 측정함.
상기 재조합 바이러스 사독백신의 효능 평가 결과는 NDV-C7d aMPV-A type 백신에 대해서는 채혈한 혈청에서 aMPV Subtype B virus(SC1509)에 대한 중화항체가 확인되었다 (하기 표 11 참조). 또한, NDV-C7d aMPV-B type 백신에 대해서는 채혈한 혈청에서 aMPV B type commercial 백신보다 다소 높은 중화항체지수를 확인하였다(하기 표 12 참조). NDV C7d-aMPV-A 사독백신의 aMPV-B 바이러스(SC1509)에 대한 중화능시험 결과를 표 11에 나타내고, NDV C7d-aMPV-B 사독백신의 aMPV-B 바이러스(SC1509)에 대한 중화능시험 결과를 표 12에 나타낸다.
Figure pat00016
Figure pat00017
실시예 6: 키메라 바이러스 생독백신의 효능 시험
1일령 병아리를 이용한 생독 백신의 효능을 시험하였다. 구체적으로, BP-NDV-C7d-aMPV-AGF 및 BP-NDV-C7d-aMPV-BGF 바이러스는 사독백신 종독 바이러스로 1일령에서는 SPF 병아리에서만 BP-NDV-C7d-aMPV-BGF 바이러스에 대하여 생독백신 효능시험을 진행하였다.
1일령 SPF 병아리 그룹당 각 10수씩 108.0, 107.0 EID50 점안접종 2주후 모든 병아리에서 채혈한 혈청에서 SC1509 aMPV B 바이러스에 대한 중화항체지수를 확인하였다. NDV C7d-aMPV-B 생독 바이러스의 효능평가 결과를 하기 표 13에 나타낸다.
Figure pat00018
한국생명공학연구원 KCTC13574BP 20180710 한국생명공학연구원 KCTC13575BP 20180710 한국생명공학연구원 KCTC13595BP 20180723

Claims (16)

  1. 뉴캣슬병 바이러스 게놈과 조류메타뉴모바이러스(aMPV)의 표면항원인 F단백질을 암호화하는 유전자 및 G단백질을 암호화하는 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 표면항원 암호화 유전자를 포함하며, 상기 조류메타뉴모바이러스의 표면항원을 발현하는 키메라 바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조류메타뉴모바이러스의 표면항원은 닭으로부터 분리한 조류메타뉴모바이러스에서 유래된 것인 키메라 바이러스.
  3. 제1항에 있어서, 상기 뉴캣슬병 바이러스 게놈는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 5'에서 3'방향으로 순차적으로 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 유전자를 포함하는 것인 키메라 바이러스.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 뉴캣슬병 바이러스 게놈는, 상기 NP 단백질의 암호화 유전자의 5'-말단에 연결된 T7 promoter, 리더 서열 및 3' UTR 서열과, 상기 L 단백질의 암호화 유전자의 3'-말단에 5'UTR, 트레일러 서열 및 T7 terminator 서열을 추가로 포함하는 것인. 키메라 바이러스.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 aMPV subtype B의 G 단백질 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하며 상기 aMPV subtype B의 F 단백질 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것인 키메라 바이러스.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 5'에서 3'방향으로 순차적으로 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 유전자를 포함하는 것이며,
    상기 F 단백질을 암호화하는 유전자는 상기 뉴캐슬병 바이러스의 P 유전자와 M 유전자 사이에 위치하고, 상기 G 단백질을 암호화하는 유전자는 상기 뉴캐슬병 바이러스의 M 유전자와 F 유전자 사이에 위치하는 것인, 키메라 바이러스.
  7. 제 1항에 있어서, 뉴캐슬병 바이러스는 기탁번호 KCTC13595BP을 갖는 것인. 키메라 바이러스.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 키메라 바이러스는 기탁번호 KCTC13575BP을 갖는 B genotype 의 조류메타뉴모바이러스 B 타입의 표면항원을 발현하는 것인 키메라 바이러스.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 키메라 바이러스는 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 것인 키메라 바이러스.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 키메라 바이러스 및 수의학적으로 담체 또는 희석제를 포함하는 조류메타뉴모바이러스 감염증 또는 조류메타뉴모바이러스 감염에 의한 조류 질병에 대한 면역화용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 백신은 생백신, 사독 백신, 서브유닛 백신, 벡터 백신, 키메라 백신 또는 DNA 백신임을 특징으로 하는 면역화용 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 백신은 불활성화된 형태인 것을 특징으로 하는 면역화용 조성물.
  13. 제10항에 있어서, 상기 백신은 항원 보강제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역화용 조성물.
  14. 제10항에 있어서, 발육종란내(In Ovo), 비강내, 기관내, 경구, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 결막 및 피하의 경로로 투여되는 것인 면역화용 조성물.
  15. 제10항에 있어서, 상기 키메라 바이러스는, 조류메타뉴모바이러스 A 타입의 표면항원을 발현하는 것인 키메라 바이러스 및 조류메타뉴모바이러스 B 타입의 표면항원을 발현하는 것인 키메라 바이러스로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 키메라 바이러스를 포함하는 것인, 면역화용 조성물.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 키메라 바이러스 및 수의학적으로 담체 또는 희석제를 포함하는 조류메타뉴모바이러스 감염증 또는 조류메타뉴모바이러스 감염에 의한 조류 질병에 대한 면역화용 조성물을, 조류에 투여하여 면역화를 유도하는 단계를 포함하는, 조류의 면역화 방법
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CN117625688B (zh) * 2024-01-26 2024-04-30 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统及其应用

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