CN1880448A - 表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表达传染性法氏囊病毒(Infectiousbursal disease virus，IBDV)的VP2基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株，更具体地，重组新城疫LaSota弱毒疫苗株是rLasota－VP2。本发明还公开了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗株的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗株在制备预防新城疫病毒(Newcastal disease virus，NDV)和IBDV导致的疾病的疫苗中的应用。

Description

表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株

技术领域

本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本发明涉及一种表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株。本发明还涉及该重组新城疫LaSota弱毒疫苗株的制备方法及其作为疫苗的应用。

背景技术

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)为不分节段单股负链RNA病毒，作为副粘病毒科的重要成员和模型病毒，得到深入研究。重组NDV作为活病毒疫苗载体具有非凡的优点：包括LaSota株在内的NDV弱毒疫苗长期以来一直用于家禽防疫，其安全有效性已被充分证明；NDV遗传相对稳定，仅有一个血清型，毒株间发生重组及毒力返强可能性极小；复制过程在细胞浆内完成，从RNA到RNA，不存在DNA阶段及细胞基因组整合的可能；NDV弱毒疫苗可同时诱导全身性体液免疫、局部粘膜免疫及细胞免疫的形成，形成更加全面、确实的免疫保护；可通过饮水、喷雾、滴鼻、点眼或注射多种方式给苗，使用极为方便；NDV具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成本极为低廉^{(1，7，8，11，12，13)}。NDV为高度传染性和高度致死性的家禽疫病原，我国每年用于新城疫防制的弱毒疫苗至少在百亿羽份以上。NDV作为活病毒疫苗载体应用的经济意义十分巨大。

负链RNA病毒的反向遗传操作(Reverse genetic)是通过操作病毒基因组cDNA制造新病毒的过程，其基本过程是：①组装完整的病毒基因组(或重组型基因组)cDNA克隆，5’末端精确地缀于T7启动子后，3’末端精确缀于自我剪切的核酸酶序列和T7转录终止信号之前，构成基因组cDNA转录模板；②以基因组cDNA转录模板与启动病毒复制必须的转录相关功能结构蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表达质粒(T7启动子)一起，共转染整合表达T7聚合酶的病毒复制许可细胞；③24-72小时后收获培养上清，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获(rescue)病毒。对基因组cDNA进行突变、缺失或外源基因插入修饰后，通过反向遗传操作系统(reverse genetic system，RGS系统)可获得相应的突变或重组的负链RNA病毒^{(1，2，3，4，5，6)}。

NDV基因组全长15186核苷酸，与其它副粘病毒一样，包括核蛋白(NP)，磷蛋白(P)，基质蛋白(M)，融合蛋白(F)，凝集素神经氨酸酶蛋白(HN)，和大聚合酶蛋白(L)六个独立转录编码单元(图1A)。本研究将GFP蛋白克隆到P和M之间，来研究外源蛋白在NDV中的表达适当位置。NDV和其它负链RNA病毒一样，其最小感染单位是核糖核蛋白复合物，无蛋白包裹的RNA本身并无感染性。NDV的基因组RNA通过与NP、P、L蛋白一起组成核蛋白复合体，启动RNA的首轮转录及病毒蛋白的翻译合成、产生感染性子代病毒^(7，10)。根据这一原理，1999年欧洲学者率先建立了第一个高致病性NDV的反向遗传操作系统(reversegenetic system，RGS系统)⁽²⁾。目前在欧、美至少有4个实验室利用NDV的RGS技术在基础与应用研究方面开展激烈的竞争性研究。2001-2002年，Palese.P.等相继构建表达H1亚型流感病毒HA免疫原基因的重组NDV B1株和表达H7亚型流感病毒HA免疫原基因的重组NDVB1株，免疫试验表明这两种NDV活载体疫苗可分别在小鼠和禽类诱导保护性免疫反应。但是由于B1本身高度致弱，在免疫接种鸡体内的复制能力较差，因而诱导免疫鸡形成有效免疫保护的能力也相对较弱，试验表明，表达H7亚型HA基因的NDV B1株对NDV及H7亚型高致病力禽流感致死性攻击的存活保护分别仅为60％和40％，且不能阻止病毒在体内的复制和排放⁽¹²⁾。研究表明，NDV基因组在不同位点插入外源报告基因或免疫原基因，经细胞或鸡胚连续高代次传代仍保持高度的遗传和表达稳定性^{(11，12，13)}。

IBDV(Infectious Bursal Disease Virus)是危害我国乃至世界养禽业健康发展的重要疫病原。IBDV属双股双节段RNA病毒(Birnaviridae)，基因组较小的节段B编码约90KD的RNA依赖聚合酶VP1，较长的节段A编码一个小的非结构蛋白VP5、一个大的裂解前体蛋白及其裂解产物VP2、VP4和VP3。真核细胞异源表达VP2-VP4-VP3前体蛋白并对VP3蛋白C段氨基酸进行适当修饰，可促进成熟的病毒粒子的装配形成。VP2及VP3构成了病毒粒子的主要结构蛋白，其中VP2是诱导保护性中和抗体的主要免疫原。感染雏鸡后的靶细胞主要为处于分化阶段的B细胞，引起B淋巴细胞发育相关淋巴组织、特别是法氏囊的病理损伤及免疫抑制，结果导致对其他病原更为易感及疫苗免疫失败。近20年来，IBDV流行株的毒力逐渐增强，世界各国不断出现对感染雏鸡致死率高达60～80％以上的超强毒株(vvIBDV)；另外，从1985年起美国开始分离到抗原性不同于IBDV经典株的变异株。疫苗免疫是防制IBD的主要手段。我国目前广泛采用低致病力或中等致病力活毒疫苗，但每年因IBD造成的直接和间接经济损失仍然数以亿计。超强毒的出现给我国养禽业IBD的防制构成巨大挑战。造成IBD活毒疫苗免疫失败的重要原因是生产现地新生雏鸡广泛存在母源抗体的干扰影响。由于母源抗体的存在，被迫采用毒力更强的中等毒力疫苗株，不可避免造成部分免疫雏鸡淋巴组织的病理损伤及免疫抑制；长期大量应用活毒疫苗被认为是超强毒及变异株出现的重要原因。长期以来，各国学者采用生物技术手段研制IBD新型疫苗以取代传统IBDV活毒疫苗的尝试与努力从未间断，并取得一系列重要进展，先后研制了不同表达系统的VP2亚单位疫苗、表达VP2抗原的重组禽痘病毒、重组火鸡疱疹病毒/马立克氏病毒、重组禽腺病毒等活载体疫苗也相继取得成功。但由于上述表达系统、活病毒载体本身的不足与缺陷以及使用成本等原因，均未实现在生产实际的广泛应用。

发明内容

针对上述研究背景，本发明人为进一步提高IBDV表达抗原的免疫原性，避免NDV特异母源抗体对免疫效果的干扰，构建表达我国IBDV超强毒分离株VP2抗原的重组NDV活载体二联弱毒疫苗rLasota-VP2，用于刍鸡新城疫与法氏囊病预防免疫的初次免疫或加强免疫。

因此，本发明的一个目的是一种表达传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株。优选所述新城疫LaSota弱毒疫苗株是AV1615，更优选所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗株是rLasota-VP2。

本发明还有一个目的是提供一种生产上述重组新城疫LaSota弱毒疫苗株的方法，该方法包括：

(1)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2基因的所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因组cDNA序列；

(2)构建一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒包括编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；

(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；

(4)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获重组病毒株。

在上述生产方法的一个实施方案中，将IBDV的VP2基因插入到新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因组P，M之间人工引入的PmeI位点。优选所述LaSota弱毒疫苗株是AV1615。

在上述生产方法的另一个实施方案中，包括在所述转录质粒中的基因组cDNA序列位于T7启动子之后，而在编码自我剪切的核酸酶的序列和T7转录终止子之前，构成基因组cDNA转录模板。优选所述自我剪切的核酸酶是丁型肝炎病毒核酶(Rib)。

在上述生产方法的另一个实施方案中，包括在所述转录辅助质粒中的编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列都位于T7启动子之后。优选所述转录质粒是pBRN-FL-VP2，所述转录辅助质粒是质粒pBSNP，pBSP和pBSL。在一个优选实施方案中，所述宿主细胞是BHK-21。

本发明还提供了上述重组新城疫LaSota弱毒疫苗株(特别是rLasota-VP2)在制备预防传染性法氏囊病毒导致的疾病的疫苗中的应用。

本研究通过RT-PCR扩增了NDV疫苗株LaSota 10个cDNA片段，利用片段之间互相重叠的部分进行拼接，装配成全长cDNA克隆。序列测定结果已经登录GenBank，登录号为AY845400。将IBDV的VP2基因插入基因组P、M基因非编码区到全长基因组中，然后将其核蛋白(NP)、磷蛋白(P)和大聚合酶蛋白(L)辅助质粒共转染至表达T7聚合酶的痘病毒感染细胞内，从而合成反基因组RNA。此RNA在NP、P和L蛋白的作用下，进行转录和复制。将转染上清接种SPF胚，得到来自cDNA的具有感染性的病毒。通过碱基突变，产生了带有遗传标签的Lasota的派生株rLasota-VP2，救获的病毒在鸡胚上增殖特征与野毒相近，血凝价高达2¹²，以上结果显示，经遗传修饰的NDV可以从cDNA克隆救获病毒，再一次证实NDV具有作为疫苗活载体的潜力，利用已建立的NDV弱毒株LasotaAV1615株的反基因操作系统研制出了可同时防制NDV及IBDV的重组病毒活载体双价(二联)高效疫苗株。

附图说明

图1.从高保真RT-PCR产生的亚基因组重叠cDNA片段装配全长NDV cDNA。将cDNA片段在共有的限制位点连接，并且在转录质粒pBR322中装配，在转录质粒pBR322中将RBZ和T7终止子序列预先克隆在EcoRI和salI位点之间(详见说明书)。(A)显示亲代NDV的整个全长基因组的第一个和最后一个核苷酸。(B)显示含有IBDV的VP2基因的NDV的cDNA克隆，在遗传图谱之下的水平线显示单个cDNA的位置。

图2.通过RT-PCR产生引入修饰酶位点的核苷酸变化，并通过使用PRISM试剂盒(Perkin-Elmer)和Applied Biosystems ABI310自动测序仪测序。加框的是通过PCR诱变在pBRN1-10中引入的一个核苷酸替代(由A突变为G)。

图3.重组新城疫病毒rLasota-VP2表达抗原蛋白的免疫荧光分析。rLasota-VP2鸡胚传代F2代感染BHK-21细胞(A & C)和未感染BHK-21细胞(B & D)，分别以鸡抗新城疫高免血清(A & B)和鸡抗IBDV高免血清(C & D)为一抗进行间接免疫荧光检测。结果显示传染性法氏囊病毒VP2抗原在重组新城疫病毒rLasota-VP2获得有效表达。

图4.表达IBDV超强毒Gx株VP2抗原的重组新城疫病毒活载体疫苗鸡胚生长动力测定比较。SPF鸡胚传代F2代次种子毒尿囊液以1×10³ EID₅₀剂量接种10日龄SPF鸡胚50枚。于不同时间点分别取出10枚鸡胚，分别收获尿原液，10倍连续梯度稀释按常规进行EID₅₀滴定。

图5.Western-blot检测重组新城疫病毒rLasota-VP2表达传染性法氏囊病毒VP2抗原。rLasota-VP2株和NDV LaSota株，按MOI为1分别感染BHK-21细胞，感染24小时后收集感染细胞，SDS-PAGE电泳、以鸡抗IBDV高免血清为一抗、HRP-偶联的兔抗-鸡IgG为二抗，进行免疫Blot检测。结果显示传染性法氏囊病毒VP2抗原在重组新城疫病毒rLasota-VP2获得正确表达。(泳道1，蛋白质分子量标记；泳道2，rLasota-VP2感染BHK-21细胞；泳道3，NDV LaSota株)。

图6.表达IBDV超强毒Gx株VP2抗原重组新城疫病毒活载体双价疫苗免疫1周龄SPF雏鸡诱导新城疫病毒特异HI抗体免疫反应。疫苗经滴鼻加点眼途径免疫7日龄雏鸡，每羽2×10⁶ EID₅₀剂量，共100μl体积；免疫后第1、2、3、4周分别采集翅静脉血，进行NDV特异HI抗体检测。

图7.pBTRT的质粒图谱。

图8.pBTRT质粒的DNA序列。第一个斜体部分：T7启动子；带下划线部分：核酶序列；第二个带下划线的斜体部分：T7终止子。

图9.pBRN-FL-VP2的质粒图谱。

图10.pBRN-FL-VP2质粒的DNA序列。带下划线的斜体部分是VP2基因。

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

     实施例1表达传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2基因的

          重组新城疫LaSota弱毒疫苗株的构建

细胞和病毒

BHK-21细胞(乳仓鼠肾细胞ATCC CCL-10)，培养基为含10％胎牛血清(Hyclone)的DMEM(Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基)；NDV Lasota疫苗株AV1615(购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC))。接种9-10日龄SPF鸡胚尿囊腔扩增并滴定鸡胚半数感染量(EID₅₀)后-70℃冻存备用；鸡抗NDV高免性血清由本研究室制备(Chu，H.P.，G.Snell，D.J.Alexander，和G.C.Schild.1982.Avian Pathol 11：227-234)；SPF鸡胚及SPF鸡雏均由哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心提供。IBDV超强毒株vvIBDV GX株购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所菌毒种保藏中心。

转录载体的构建

基因组RNA转录载体pBTRT以低拷贝克隆载体pBR322(Invitrogen)为骨架并在EcoRI/salI位点插入T7启动子(T7promotor)、丁肝病毒核酶(Rib)和T7转录终止信号(T7terminal)，由本实验室自行构建。克隆在T7启动子和核酶之间的DNA片段可以在T7RNA聚合酶的作用下得到转录，并且由于Rib的自身催化功能，可以保证转录产物的3′末端与克隆的DNA片断精确一致。

插入IBDV的V2基因的重组NDV LaSota株基因组全长cDNA的构建

为建立NDV新城疫Lasota疫苗株的反向遗传操作系统，必须首先构建相应基因组的全长cDNA克隆，作为基因组负链RNA转录模板，为此构建了覆盖整个基因组的十个cDNA克隆片段，利用各个片断间重叠部分的酶切位点，在低拷贝质粒转录载体质粒pBTRT连接组装获得了15186nt的完整cDNA克隆，序列测定结果已经登录GenBank，登录号为AY845400，并将IBDV的V2基因(GenBank AY444873)克隆到P，M之间。在全长cDNA片段5’末端前缀T7RNA聚合酶启动子，在cDNA片断后连有具有自我催化功能的肝炎δ核酶(GenBank X04451)和T7转录终止信号。构建完成的质粒命名为pBRN-FL-VP2。为避免Xba位点的甲基化，通过PCR基因组将基因组cDNA中F蛋白编码区第6178位碱基由T同义突变为C，并作为拯救病毒的分子标记。与其他研究者一样，我们同时在T7聚合酶启动子于基因组cDNA的5’末端引入两个多余的G，这可能有助于副粘病毒反向遗传操作的病毒拯救。具体如下：

NDV Lasota疫苗株病毒鸡胚接种尿囊液经常规方法(动物病毒学，第二版)提取基因组RNA；整个基因组分为末端部分重叠的10个片段(F1-F10)进行RT-PCR扩增，cDNA片段克隆至pBluescript(Clontech)SmaI位点并经序列分析确证与病毒基因组RNA序列完全一致；序列测定结果已经登录GenBank，登录号为AY845400。为引入特异的分子遗传标签，选择Lasota疫苗株基因组cDNA 6172bp处存在一甲基化的XbaI位点，序列为TCTAGATCA，利用PCR手段将其突变为TCTAGACCA，使其不再受甲基化酶识别，因而能够被限制性内切酶XbaI所识别；利用相邻片段重叠部分存在的限制酶切位点连接成组装完整的NDV基因组cDNA(图1A)；另外，参照文献[15]，SDS-蛋白酶-K法提出IBDV基因组，-70℃保存备用作为RT-PCR模板。RT-PCR反转录体系为20μl。在500μl的EP管中依次加入如下成分，病毒RNA，IBDV的VP2基因上、下游引物，dNTP，水。65℃水浴5min；再向管中加入5×1st buffer 4μl，0.1mol/L DTT 2μl，RNase抑制剂(20U/μl)1μl，混匀后37℃水浴2min；加入M-MLV(鼠源反转录酶)(10U/μl)1μl，37℃水浴反应50min，70℃水浴终止反应15min。以RT-PCR扩增的VP2基因ORF的cDNA为模板进行PCR扩增，体系中加入如下引物。上游引物5’gtttaaacttagaaaaaatacgggtagaacgccaccatgacgaacctgcaagat3’，下游引物5’gtttaaacgtcaccttagggcccgg3’。PCR反应步骤：95℃预变性10min，按94℃1min，53.8℃1min，72℃2min的顺序，30个循环后，72℃终延伸10min。PCR产物经PmeI酶切后克隆到LaSota新城疫病毒株基因组P、M之间人工引入的PmeI位点，并在前装上基因终止和基因起始序列(GE/GS)(TTAAGAAAAAA/T/ACGGGTAGAA)，并克隆在转录载体pBTRT上，构建成含有IBDV VP2基因的新城疫LaSota弱毒基因组转录质粒pBRN-FL-VP2(图1B)；表达核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)及大聚合酶蛋白(L)基因的开放阅读框架(ORF)cDNA分别紧接着克隆在pBluescriptII(+/-)质粒T7启动子下游，分别构成转录辅助质粒pBSNP，pBSP和pBSL。

从重组全长cDNA克隆救获感染性NDV(病毒拯救)

为了从克隆的重组cDNA中拯救感染性重组NDV，首先以pBRN-FL-VP2及表达NDV NP、P、L蛋白的辅助质粒共转染BHK-21细胞。NDV的融合蛋白F0必须裂解成F1和F2才具有感染性，对于Lasota弱毒株而言，BHK-21细胞不能分泌裂解F0蛋白所需的蛋白酶，因此在培养基中加入相应蛋白酶，所以此时应换成无血清培养基并加入TPCK(Sigma)(1μg/ml)，继续培养2-3天，收获转染细胞上清接种于9-11日龄的SPF鸡胚。4天后收获鸡胚尿囊液，血凝(HA)试验结果阳性，不同鸡胚的HA价介于2^8-11；NDV免疫血清血凝抑制(HI)试验分析同样呈现阳性结果。收获病毒阳性尿囊液作为救获病毒rLasota-VP2的F1代。进一步的RT-PCR及序列分析结果显示，F1代救获病毒基因组cDNA的6178位点碱基为C，而非原LaSota亲本株的C，和预期完全相符(图2)。结果表明，通过反遗传操作技术，利用NDV LaSota疫苗株基因组cDNA克隆成功地救获具有感染性的子代病毒rLasota-VP2。更具体地，实验步骤如下：

BHK-21细胞接种于35mm六孔板内生长达50-80％单层时人工感染表达T7聚合酶的重组痘病毒，转录质粒及辅助质粒pBRN-FL-VP2、pBSNP、pBSP和pBSL分别以5μg、2.5μg、1.25μg 1.25μg，共转染BHK-21细胞，采用CaPO4转染试剂盒(Invitrogene)，操作按试剂盒说明书进行。转染后8-12小时，弃去转染混合物，用含10％DMSO的PBS液休克细胞2.5分钟，加入完全DMEM过夜孵育，第二天换成无血清培养基，并加入TPCK(1μg/ml)继续孵育2-3天后，收获培养物上清，0.22um孔径滤器过滤后接种9-11天的SPF胚尿囊腔；接种后的SPF胚继续培养，3-5天，取鸡胚尿囊液50μl进行按常规进行新城疫病毒的血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验(Thayer SG，Nersessian BN，Rivetz B，Fletcher OJ.Comparison ofserological tests for antibodies against Newcastle disease virus and infectiousbronchitis virus using ImmunoComb solid-phase immunoassay，a commercialenzyme-linked immunosorbent assay，and the hemagglutination-inhibitionassay.Avian Dis.1987Jul-Sep；31(3)：459-63.)。收获HA及HI试验结果阳性尿囊液，-70℃冻存，并按常规方法分别于9-10日龄鸡胚及鸡胚成纤维细胞滴定每毫升EID₅₀及PFU病毒含量⁽¹⁴⁾。救获新城疫病毒命名为rLasota-VP2。

实施例2重组新城疫病毒rLasota-VP2表达抗原蛋白的免疫荧光分析

NDV LaSota疫苗株能一过性感染体外培养的哺乳动物细胞。为证明rLasota-VP2病毒在BHK-21细胞内的复制及病毒抗原表达，将rLasota-VP2鸡胚传代F2代感染BHK-21细胞(3A & 3C)和未感染BHK-21细胞(3B& 3D)，分别以鸡抗新城疫高免血清(3A & 3B)和鸡抗IBDV高免血清(3C& 3D)为一抗进行间接免疫荧光检测。结果显示病毒感染细胞荧光显微镜下观察到强阳性反应(图3A & 3C)，而SPF鸡对照血清荧光染色则为阴性(图3B & 3D)。

实施例3重组NDV表达IBDV VP2蛋白的Western-Blot鉴定

取扩增的rLaSota-VP2的BHK-21细胞弃去培养液，加入1/10体积的PBS，悬起细胞，加入等体积的2×SDS裂解缓冲液沸水裂解10min后，12000g离心10min，取上清进行SDS-PAGE(Bio-Rad)；将蛋白电转移(Bio-Rad)到尼龙膜上(Ameresco)，10％脱脂乳封闭过夜，PBST(0.05％Tween20)洗涤后加入1∶50 PBST稀释的一抗(鸡抗IBDV高免血清)。二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗鸡山羊抗鼠IgG(Sigma)，1∶2500倍PBST稀释。DAB(二氨基联苯胶，Sigma)显色3～5分钟后用去离子水终止反应。结果如图5，证明传染性法氏囊病毒VP2抗原在重组新城疫病毒rLasota-VP2获得有效表达。

实施例4rNDV在鸡胚的生长特性及致病特性

为确定反向遗传操作救获rLaSota-VP2的鸡胚生长特性及其对鸡胚的致病性，进行表达IBDV超强毒Gx株VP2抗原的重组新城疫病毒活载体疫苗鸡胚生长动力测定比较。将SPF鸡胚传代F2代次种子毒尿囊液以1×10³ EID₅₀剂量接种10日龄SPF鸡胚50枚。于不同时间点10枚鸡胚，每鸡胚分别收获尿原液100μl，10倍连续梯度稀释按常规进行EID₅₀滴定，结果显示rLaSota-VP2鸡胚生长动力学与野生型新城疫LaSota弱毒疫苗株相似。按照OIE标准，测定rLaSota-VP2脑内致病指数(ICPI)为0.35，静脉内致病指数(IVPI)为0，鸡胚平均致死时间(MDT)大于96小时。结果表明反向遗传操作救获病毒rLasota-VP2仍然保持NDV LaSota疫苗亲本株在鸡胚的高滴度生长及低致死的生物学特性。

实施例5诱导保护性抗体的免疫效果

为测定反向遗传操作救获病毒rLasota-VP2作为弱毒疫苗对SPF鸡雏的免疫原性，将rLasota-VP2经滴鼻加点眼途径免疫7日龄SPF雏鸡(哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心提供)，每羽2×10⁶ EID₅₀剂量，共100ul体积；免疫后第1、2、3、4周分别采集翅静脉血，进行NDV特异HI抗体检测。结果如图6所示，rLasota-VP2重组病毒一次免疫雏鸡后3周，即可诱导高水平的NDV特异HI抗体水平反应。

表达IBDV超强毒Gx株VP2抗原重组新城疫病毒rLasota-VP2免疫1周龄SPF雏鸡，免疫后3周可检测到显著的IBDV病毒VP2抗原特异的抗体免疫反应。(结果见表1)

表1.表达IBDV超强毒Gx株VP2抗原重组新城疫病毒rLasota-VP2免疫1周龄SPF雏鸡攻毒前后IBDV特异抗体免疫反应

分组	SPF鸡(羽)	疫苗	剂量	抗体滴度**
								VP2特异ELISA(OD490nm)		AGP
				攻毒前	攻毒后	攻毒前	攻毒后
								123	10338	rLaSotarLasota-VP2PBS	2×1062×106	0.04±0.01(a)0.12±0.04(b)0.03±0.01(a)	0.25±0.09(a)0.19±0.04(b)0.27±0.07(a)	---	+-+

^*重组新城疫病毒rLasota-VP2经滴鼻加点眼途径免疫7日龄雏鸡，每羽共100ul体积；免疫后21天采用传染性法氏囊病毒超强毒GX株4×10³ ELD₅₀经滴鼻、点眼途径感染进行攻击；

^**免疫后19天(26日龄)采集血清进行NDV特异HI抗体，包括基于原核表达VP2抗原的ELISA抗体检测及IBDV常规血清琼脂扩散(AGP)抗体检测；攻毒后第7天存活鸡进行基于原核表达VP2抗原的ELISA抗体检测及常规血清AGP抗体检测；

a/b，差异显著

最后，将rLasota-VP2重组病毒对1周龄SPF雏鸡免疫，评估其对新城疫强毒致死性攻击和IBDV超强毒致死性攻击的免疫保护作用。结果分别如表2和表3，结果表明，rLasota-VP2重组病毒疫苗免疫雏鸡对新城疫强毒株和IBDV超强毒病毒致死攻击形成100％完全免疫保护，不发病、不死亡，效果非常显著。

表2.表达IBDV超强毒Gx株VP2抗原重组新城疫病毒rLasota-VP2免疫1周龄SPF雏鸡对新城疫强毒致死攻击的免疫保护

分组	SPF雏鸡(羽)	疫苗a	NDV F48E9b
					发病	死亡
			123	101111			rLaSotarLasota-VP2PBS	0/110/1010/10	0/110/1010/10

a.重组新城疫病毒rLasota-VP2经滴鼻加点眼途径免疫7日龄雏鸡，每羽2×10⁶EID₅₀剂量共100ul体积；

b.免疫后21天(28日龄)采用NDV强毒F48E9株(中国兽药监察所提供)1×10⁴ELD₅₀剂量经肌肉注射途径攻击，持续观察14天。

表3.表达IBDV超强毒Gx株VP2抗原重组新城疫病毒rLasota-VP2免疫1周龄SPF雏鸡对IBDV超强毒攻击的免疫保护

分组	SPF雏鸡(羽)		疫苗	体重(g)c	法氏囊变化				免疫保护f
											囊重指数d		组织病理损伤e		7d发病	7d死亡
					3d	7d	3d	7d
									3da	7db
	123	667									1068	rLasota-VP2rLaSotaPBS	269±36(A)201±10(B)191±36(B)	1.17±0.371.11±0.211.01±0.23			1.18±0.43(A)0.66±0.14(B)0.56±0.13(B)	±++++++	-++++++++	0/106/68/8	0/102/64/8

重组新城疫病毒rLasota-VP2经滴鼻加点眼途径免疫7日龄雏鸡，每羽2×10⁶ EID₅₀剂量，共100ul体积；免疫后21天(28日龄)采用IBDV超强毒Gx株经鼻腔感染途径攻击，剂量均为每羽4000ELD₅₀，攻毒后持续观察7天；

a.3d为攻毒后观察3天扑杀组；

b.7d为攻毒后观察7天扑杀组；

c.体重根据7d组的统计结果；

d.囊重指数试验鸡囊重比与同龄健康对照鸡囊重比的比值

e.3d组含病死及扑杀鸡，“+”数目与囊淋巴滤泡炎症损伤程度成正比；7d组包含自然死亡及人工扑杀组，“+”数目与囊淋巴滤泡萎缩程度成正比；

f.发病率及死亡率均根据7d组统计结果；

A/B，差异极显著

新城疫病毒(NDV)为不分节单股负链RNA病毒，基因组结构与功能背景清楚，遗传相对稳定，重组NDV中插入的外源基因在细胞或鸡胚经高代次传代后仍可保持稳定表达，非常适合作为表达或疫苗载体。NDV弱毒疫苗可通过饮水、喷雾、滴鼻或点眼给苗，使用方便，成本极为低廉，以NDV作为禽流感疫苗活载体构建的二联弱毒疫苗，具十分巨大的有经济意义。

本发明以新城疫病毒(NDV)的RGS为平台，以IBDV的保护性免疫原VP2蛋白为目的基因，在5’端加上NDV基因组P基因相应转录终止(GE)序列和M基因转录起始(GS)序列，插入基因组内P基因和M基因间非编码区，构建了表达传染性法氏囊病毒VP2保护性免疫原基因的重组新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株rLaSota-VP2，作为预防传染性法氏囊病的双价弱毒疫苗。免疫荧光及Western-blot检测表明VP2抗原在重组病毒获得正确、稳定的高效表达。鸡胚生长动力试验及脑内致病指数测定证明rLaSota-VP2保持了新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株鸡胚高滴度生长及低致病力特性。新城疫强毒致死性攻击和IBDV超强毒致死性攻击实验证明rLasota-VP2重组病毒对新城疫强毒株和IBDV超强毒病毒致死攻击形成有效的免疫保护。

参考文献

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Claims (14)

1.一种表达传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株。

2.根据权利要求1的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株，其中所述新城疫LaSota弱毒疫苗株是AV1615。

3.根据权利要求2的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株，其中所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗株是rLasota-VP2。

4.一种生产根据权利要求1的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株的方法，该方法包括：

(1)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2基因的所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因组cDNA序列；

(2)构建一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒包括编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；

(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；

(4)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获重组病毒株。

5.根据权利要求4的方法，其中将IBDV的VP2基因插入到新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因组P，M之间的人工引入的PmeI位点。

6.根据权利要求4或5的方法，其中所述LaSota弱毒疫苗株是AV1615。

7.根据权利要求4或5的方法，其中包括在所述转录质粒中的基因组cDNA序列位于T7启动子之后，而在编码自我剪切的核酸酶的序列和T7转录终止子之前，构成基因组cDNA转录模板。

8.根据权利要求7的方法，其中所述自我剪切的核酸酶是丁型肝炎病毒核酶(Rib)。

9.根据权利要求4或5的方法，其中包括在所述转录辅助质粒中的编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列都位于T7启动子之后。

10.根据权利要求4的方法，其中所述转录质粒是pBRN-FLVP2。

11.根据权利要求4的方法，其中所述转录辅助质粒是质粒pBSNP，pBSP和pBSL。

12.根据权利要求4的方法，其中所述宿主细胞是BHK-21。

13.根据权利要求1的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株在制备预防传染性法氏囊病毒导致的疾病的疫苗中的应用。

14.根据权利要求13的应用，其中所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗株是rLasota-VP2。

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