CZ300760B6 - cDNA ptacího paramyxoviru, zpusob její prípravy, její infekcní kopie a vakcína je obsahující - Google Patents

Abstract

cDNA ptacího paramyxoviru obsahující alespon sekvenci nukleové kyseliny odpovídající 5' konci genomu viru Newcastleské choroby drubeže jak je videt z obrázku 6, umožnující prípravu infekcní kopie ptacího paramyxoviru. Zpusob prípravy infekcního viru Newcastleské choroby (NDV) klonováním cDNA úplné délky a užití vakcín a diagnostických testu vytvorených a odvozených behem zpusobu prípravy infekcní cástice NDV. Zpusob nabízí možnost modifikace genomu NDV pomocí genetických modifikací a umožnuje zavedení mutací, delecí a/nebo insercí. Zpusob umožnuje prípravu živých NDV markerových vakcín, které lze sérologicky odlišit od polních kmenu NDV.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká virových infekcí drůbeže způsobených virem Newcastleské choroby. Virus Newcastleské choroby (NDV) je jedním z nejproměnlivějších virů způsobujících smrt ptáků. Současně probíhající výskyt onemocnění způsobeného virem Newcastleské choroby v několika různých geografických oblastech je často klasifikován jako nové virové onemocnění, a to díky velké variabilitě v typu a závažnosti průběhu nemoci. Tento fakt působí určité problémy s nomenklaturou. Nemoc se nazývala nepravý slepičí mor, pseudomor drůbeže a ptačí pneumoencefalitida. Nemoc se stala velmi významnou v období 20. století, kdy se drůbežářství vyvinulo ve velmi výkonný mezinárodní průmysl, který je velmi silně závislý na obchodu mezi různými zeměmi.

Dosavadní stav techniky

Všeobecně se předpokládá, že první výskyty Newcastleské choroby se vyskytly v roce 1926 na Jávě v Indonésii a současně ve městě Newcastle nad řekou Týne v Anglii (Kraneveld, 1926; Doyle, 1927). Název nemoci Newcastleské choroba byl zaveden Doylem jako dočasný název, který měl obejít popisný název, který by byl zaměnitelný sjinými nemocemi. Teprve později bylo objasněno, že některé další nemoci s lehčím průběhem jsou způsobeny také viry, které jsou nerozeznatelné od NDV. V USA se nazývá podobná nemoc s relativně mírnými respíračními projevy nemoci ptačí pneumoencefalitida. Bylo prokázáno, zeje způsobena NDV (Beach, 1944). Během několika let se shromáždilo na celém světě mnoho ízolátů NDV, které způsobovaly pouze velmi lehké nebo dokonce žádné onemocněni kuřat.

V Šíření nemoci se uplatnily tyto další faktory: 1) pohyb chovaných živých ptáků, volně žijících ptáků, ptáků chovaných pro zábavu, závodních holubů a komerční drůbeže, 2) pohyb lidí a zařízení, 3) pohyb drůbežích produktů, 4) šíření vzduchem, 5) kontaminované drůbeží krmivo, 6) kontaminovaná voda, 7) nekompletně inaktivované heterogenní vakcíny. Podle OIE je Newcastleovská choroba nemoc drůbeže způsobená ptačím paramyxovirem sérotypu 1 (AMPV-1), který má intercerebrální index patogenity (ICPI) v jednodenních kuřatech 0,7 nebo vyšší.

Virulentní forma viru může být dále potvrzena přítomností několika bazických aminokyselin na C konci proteinu F2 a tím, že v pozici 117 je fenylalaninový aminokyselinový zbytek na N konci proteinu Fl. Nepodařilo se však prokázat, že tato aminokyselinová sekvence je nezbytná pro charakterizaci testem 1CP1. Do pojmu světové drůbeže se zahrnuje domácí drůbež, krocani, perličky, kachny, husy, křepelky, holubi, bažanti, koroptve a ptáci patřící do řádu Běžců (pštrosi) chovaní, nebo držení v zajetí pro chov, produkci masa nebo vajec pro spotřebu, pro chov zvířat určených k lovu.

Podle Alexandera (1988) od prvního objevení nemoct proběhly tři celosvětové epidemie této nemoci. První je reprezentovaná průlomem nemoci, kdy byla zasažena jihovýchodní Asie. Izolované výskyty nemoci, jako byl objev v Anglii 1926, daly do budoucna možnost vzniku hlavního proudu tohoto onemocnění, který se pohyboval pomalu přes Asii do Evropy.

Druhý výskyt měl ohnisko na Středním východě ke konci šedesátých let a zachvátil většinu zemí do roku 1973. Rychlejší průběh šíření nemoci byl způsoben velkou revolucí v drůbežářském průmyslu, což byl mezinárodní obchod.

Třetí epidemie primárné zasáhla domácí ptáky, jako holuby a hrdličky (Vindevogel a Dutchatel, 1988). Tato epidemie začala opět na Středním východě v pozdních sedmdesátých letech. Kolem roku 1981 zasáhla Evropu a potom se šířila kolem celého světa, hlavně kontakty ptáků na závodech, přehlídkách a v mezinárodním obchodě s těmito ptáky.

Dnes je Newcastleovská choroba stále rozšířena v mnoha státech Asie, Afriky, Ameriky i Evro5 py. Jen státy Oceánie jsou relativně nezasaženy touto nemocí (Spradbrow, 1988).

NDV patří k řádu Mononegaravirales, rodině Paramyxovirinae, rodu Rubulavirus. Mimo NDV, všeobecně nazývaného ptačí paramyxovirus typu-1, byly podle antigenních podobností v reakcích v hemaglutinačních inhibičních testech a sérum neutralizačních testech, rozlišeny ještě ptačí io paramyxoviry typu 2 až 9 {Alexander, 1993),

Pres konzistenci sérologických skupin se však vyskytly některé křížové reakce mezi viry různých sérotypů.

Genom NDV se skládá zjednovláknové molekuly RNA negativní polarity, která je komplementární mRNA kódující virové proteiny. Velikost virového genomu je přibližně 15 200 nukleotidů a genom kóduje následující genové produkty (uvádíme je v pořadí od 3’ k5’konci genomové RNA): nukleokapsidový protein (NP), fosfoprotein (P), matrixový protein (M), fúzní protein (F), hemaglutinin-neuraminidasa (HN) a velký protein polymerázy (L) (Chambers a další, 1986).

RNA tvoří s NP, P a L ribonukleokapsidovou částicí (RNP), která je obklopena obalem, který je spojen na vnitřní straně s M proteinem. Obal je tvořen F a HN proteiny, které se účastní v uchycení a proniknutí viru do buňky.

Replikace NDV je podobná strategii replikace ostatních paramyxovirů. Počátečním krokem je přichycení viru na receptor hostitelských buněk, což zprostředkovává HN protein. Fúze virového obalu s buněčnou membránou hostitelské buňky je závislá na účasti obou proteinů, HN a F. Výsledkem je uvolnění RNP do cytoplazmy, kde dochází k replikaci viru.

Virová RNA-dependentní RNA polymerasa (která je součástí RNP) produkuje komplementární transkripty, které mají úlohu mRNA kyselin a za využití buněčného translačního aparátu se tvoří virové proteiny, V důsledku akumulace NP proteinu se komplex RNA polymerasy přepne z transkripce na replikaci, čehož důsledkem je syntéza celých molekul genomové a antigenomové RNA.

Nově vytvořené molekuly RNP se enkapsidují na buněčné membráně za účasti F a HN proteinů, které se akumulují na buněčné plazmatické membráně. Nově tvořené virové částice se uvolňují z infikovaných buněk. Pro více podrobností týkajících se replikace NDV se podívejte do Peeples (1988). Nejnovější poznatky molekulární biologie paramyxovirů najdete v přehledném článku

Lam ba a Ko lakofského (1996),

Mimo domestikované druhy drůbeže (to znamená kuřat, krocanů, bažantů, perliček, kachen, hus, holubů), ještě další skupiny ptáků chovaných v zajetí, semi-domestikovaných i volně žijících, včetně migrujících vodních ptáků, mohou být vnímavé k infekci NDV a mohou sloužit jako primární zdroje infekce (Kaleta a Baldauf, 1988).

Patogenita kmenů NDV se velmi liší v závislosti na hostiteli. Mezi nejvíce odolné druhy patří vodní ptáci, zatímco k nejnáchylnějším patří ptáci žijící ve velkých společenstvech, kteří tvoří velká dočasná či trvalá hejna, také kuřata jsou velmi náchylná, ale i husy a kachny se mohou infikovat, ale vykazují jen slabé nebo žádné klinické příznaky, i u kmenů, které jsou letální pro kuřata.

Newcastleovská choroba je komplikovaná tím, že různé izoláty a kmeny virů mohou produkovat nesčetné množství variací v závažnosti průběhu nemoci. Beard a Hanson (1984) rozdělili NDV kmeny a izoláty do rozdílných patotypů, které se projevovaly určitými znaky u plně náchylných kuřat:

1) viscerotropní velogenní NDV, který vyvolává akutní letální infekci, při které se vyskytují markantní hemoragické léze na střevech, dále neurotropní velogenní NDV, která se projevuje vysokou mortalitou, které předchází respirační a neurologické projevy, ale nejsou přítomny léze na střevech; 2) mesogenní NDV, projevují se u některých ptáků nízkou mortalitou, akutními respiračními a neurologickými příznaky; 3) lentogenní NDV, patotypy projevující se mírnými nebo neznatelnými respiračními infekcemi, nebo jsou dokonce bez příznaků, jako střevní NDV, io avirulentní viry, které se replikují primárně v intestinálním traktu. Avšak bylo publikováno, že mezi jednotlivými skupinami se vyskytuje mnoho překrývajících se projevů.

Virus se dostává do organismu pomocí respiračního či intestinálního traktu, či očima. V průduškách se virus šíří pohybem řasinek a šířením z buňky do buňky. Po počátečním namnožení v mís15 tě vstupu, virus se šíří do sleziny, jater, ledvin a plic. Viry některých kmenů zasáhnou vitální orgány, jako jsou játra a ledviny velmi rychle, ptáci potom umírají tak rychle, že se neprojeví ani příznaky.

Většina virů zasáhne centrální nervovou soustavu, kam se dostane s krví, ještě před tím, než je nemoc prokazatelná vytvořením protilátek. Dlouhé, asymptomatické bacilonosičské období vyskytující se u papoušků, je vážnou hrozbou pro drůbežářský průmysl. Toto dlouhé období bacilonosičů bylo popsáno u obou skupin virů (lentogenní a velogenní) i u kuřat (Heuschele aEasterday, 1970).

Během replikace NDV je nezbytné, aby se prekurzorový glykoprotein Fo rozštěpil na F1 a F2, tak se stane potomstvo viru infekční (Rott a Klenek, 1988). Toto posttranslační štěpení je zprostředkováno proteasami hostitele. Jestliže se neuskuteční toto Štěpení, jsou produkovány virové částice, které nejsou infekční a nedojde k virové replikaci. Fo protein virulentních virů se štěpí velkým množstvím různých proteas, zatímco Fo proteiny ve virech s nízkou virulencí mají potla30 čenu citlivost k těmto enzymům a mohou růst in vivo jen ve vybraných typech buněk a většinou nemohou být pěstovány in vitro.

Lentogenní viry se replikují jen v oblastech s proteasami trypsinového typu, jako jsou respirační a intestinální trakt, zatímco virulentní viry se mohou replikovat v širokém okruhu tkání a orgánů, což vyústí ve fatální systémovou infekci.

Aminokyselinová sekvence prekurzoru Fo prokázala, že kmeny s nízkou virulencí mají argininový zbytek (R) spojující řetězce F1 a F2, zatímco u virulentních kmenů se vyskytuje ještě jedna bazická aminokyselina tvořící dva páry v místě štěpení K/R-X-K/R-R-F. Co více, F2 řetězec virulentních kmenů obvykle začíná fenylalaninem, zatímco u nevirulentních kmenů obvykle začíná leucinem.

U některých kmenů NDV se také HN protein vyskytuje jako prekurzor, kteiý vyžaduje proteolytické štěpení, aby byl biologicky aktivní (Garten a další, 1980; Millar a další, 1988).

Vedle štěpení F a HN proteinů, existují ještě další virové faktory, které přispívají kjeho patogenitě. Madansky a Bratt (1978, 1981a, 1981b) ukázali, že změny v transkripci a translaci mohou vyvolat změny růstu a šíření viru z buňky do buňky a dále také cytopatogenity.

Počáteční imunitní odpověď na infekci NDV je buněčné zprostředkovaná a lze ji určit nejdříve za 2 až 3 dny po infekci s živými kmeny vakcín. Tímto se dá vysvětlit časná ochrana proti patogenu zaznamenaná u vakcinovaných ptáků, ještě dříve, než bylo vyprodukováno měřitelné množství protilátkové odpovědi (Gough a Alexander, 1973).

Přibližně jeden týden po infekci mohou cirkulující protilátky ochránit hostitelský organismus od reinfekce. V ěasné fázi se objevují nejprve IgM, následně potom IgG. Nejvyšší titry a vrchol ochranného působení nastává po třech týdnech a potom klesá, není-li do organismu dodána další dávka antigenu. To znamená, že starší ptáci se musí podrobit revakcínaci.

Antigenní odpověď je stimulována pouze podáváním živých vakcín respirační cestou, kdy se stimuluje tvorba protilátek na všech površích sliznic a dále také v séru. Inaktivované vakcíny, podávané dokonce intramuskulámě, nevyvolávají navzdory vysoké koncentraci sérových protilátek lokální rezistenci respiračního traktu.

Tento fakt klade důraz na důležitost živých vakcín schopných prezentovat antigen v horních cestách dýchacího traktu atak indukovat jak lokální, tak systémovou imunitu. Malé kapénky procházejí do dolních cest dýchacích, kde vyvolávají hlavně humorální imunitní odpověď, zatímco kapičky s drsným povrchem stimulují lokální imunitu v horních cestách dýchacích.

Proto aerosoly s velkým rozsahem velikosti kapiček jsou schopny nejúčinněji generovat lokální i humorální imunitní odpověď.

Je však nutno poznamenat, že navzdory intenzivní vakcinaci běžnými vakcínami, které vytvářejí vysoké hladiny titrů protilátek, lze virus z povrchu sliznic stále ještě získat.

Identifikace Newcastleovské choroby v USA vedla k použití inaktivovaných vakcín (Hofstad, 1953). Pozorování, že některé viry způsobující endemické choroby vyvolávají pouze slabé příznaky onemocnění vedlo nejprve k vývinu mesogenní živé vakcíny Roakin (Beaudette a další,

1949) a následně k vývoji mírných kmenů Hitcher B1 (Hitcher a Johnson, 1948) a LaSota (Goldhaft, 1980), které jsou i nyní nejvíce používány jako živé vakcíny.

NDV živé vakcíny se dělí do dvou skupin, lentogenní a mesogenní. Mesogenní kmeny jsou vhodné pro sekundární vakcinaci ptáků, protože mají vyšší virulenci. Imunitní odpověď se zvýší v závislosti na vzrůstu patogenity živé vakcíny. Proto, chceme-li dosáhnout požadované úrovně ochrany organismu bez vážné reakce, musí se vypracovat očkovací program, který zahrnuje následné užití více virulentní vakcíny v každém dalším kroku, nebo živé vakcíny následované inaktivo vanýmí vakcínami.

Hlavní výhodou živých vakcín je, že mohou být podávány levnou aplikační technikou ve velkém. Běžná metoda aplikace je cestou podávání pitnou vodou. Avšak aplikace pitnou vodou musí být pečlivě sledována, protože virus může být inaktivován vysokou teplotou a světlem a dále virocidními příměsemi ve vodě.

Masová aplikace živých vakcín spreji a aerosoly je další velmi populární cestou, protože je jednoduchá a může tak být vakcinováno najednou velké množství ptáků v krátkém čase. Je dále nezbytné dosáhnout správné velikosti částic, to se děje kontrolou podmínek, za kterých částice vznikají.

Běžně používané živé vakcíny mají několik nevýhod. Vakcíny mohou vyvolat příznaky onemocnění, které závisí na okolních podmínkách a na přítomnosti komplikujících infekcí. Proto je důležité, aby se jako vakcíny pro primární očkování využívaly velmi mírné kmeny virů, což zase přináší nezbytnost několikanásobného očkování. Co více, protilátky odvozené z mateřských protilátek, mohou účinně bránit primární vakcinaci lentogenními živými vakcínami.

Inaktivované vakcíny se obvykle připravují z infekční alantoické tekutiny, která se ošetří formalinem nebo betapropiolaktonem, což usmrtí virus. Takto vzniklá vakcína se smíchá s vhodným adjuvans. Inaktivované vakcíny se podávají injekčně, buď intramuskulámě nebo subkutánně. Příprava s podávání inaktivovaných vakcín je drahá.

Avšak tyto vakcíny složené z inaktivovaných olejových emulzí nejsou atakovány mateřskými protilátkami, tak jak tomu bylo u výše zmíněných živých vakcín a mohou se tedy používat u jednodenních kuřat. Výhodou inaktivovaných vakcín je dále nízká úroveň nepříznivých reakcí u vakcinovaných ptáků, dále vyvolaná vysoká hladina obranných protilátek a dlouhá doba trvání ochrany. Žádná z výše zmíněných vakcín není sérologicky odvozena od divokého - přirozeně se vyskytujícího typu NDV.

Vývoj rekombínantních protilátek je v popředí zájmu drůbežářského průmyslu již řadu let. Koncepce vychází z inserce genů pro kritické, imunitu vyvolávající epitopy agens působícího nemoc do neesenciálního genu virového vektoru. Vakcinace za použití takovýchto rekombínantních virů vede k imunizaci jednak proti virovému vektoru, jednak proti vloženému epitopu uvažované nemoci.

Pro účely vývoje potenciálních živých vakcín pro drůbež bylo hodnoceno několik typů virů. is Nejvíce pozornosti se soustředilo na dva ptačí viry, virus ptačích neštovic (FPV) a krůtí herpes virus (HVT). FPV je DNA virus, který má velký genom, a proto je v jeho genomu dostatek místa pro vložení cizího genu.

Je-li oslaben, FPV nevyvolává klinické příznaky nemoci a je běžně používán pro vakcinaci kuřat.

HVT je také DNA virus, který je klasifikován jako sérotyp III skupiny virů Markovy nemoci (Marek’s disease, MDV). HVT je nepatogenní pro kuřata ještě nevakcinovaná proti MDV a je běžně používán pro očkování kuřat proti Markově nemoci.

Bylo prokázáno, že ochranu proti Newcastleovské chorobě lze navodit použitím rekombínantních

HVT nebo FPV vakcín (Morgan a další, 1992; 1993; Heckert a další, 1996; Boursnell a další, 1990; Taylor a další, 1990).

Avšak nástup ochrany proti Newcastleovské chorobě po takovémto typu rekombinantní vakcíny exprimující buď NDV nebo F protein, nebo oba proteiny F a NH, je kriticky zpožděn ve srovnání s konvenční živou nebo inaktivovanou NDV vakcínou. Pravděpodobně je to způsobeno tím, že rekombinantní vakcína neposkytuje tak široké imunologické spektrum jiných antigenně využitelných epitopů NDV, než ty, co jsou exprimovány v rekombinantní vakcíně z NDV proteinů, nebo nejsou tyto epitopy prezentovány správným způsobem imunitnímu systému,

Co více, rekombinantními vakcínami se také u ptáků efektivně neindukuje lokální (slíznice, dýchací trakt nebo střeva) imunitní odpověď. To je vážný nedostatek, protože vakcíny používané pro primární vakcinaci proti respíračním chorobám musí indukovat lokální imunitní odpověď proto, aby se předešlo infekci a šíření virulentního typu viru, který nakonec v polních podmínkách kuřata infikuje.

Protilátky proti NDV, které jsou schopné ochránit hostitele, se měří ve virus neutralizačních testech. Avšak, protože neutralizační odpověď může vypadat jako paralela hemaglutinační inhibiční odpovědi (HI), je nutné velmi často provést ještě další testy k ověření ochranné odpovědi, zvláště po očkování.

Protilátky proti proteinům F i HN mohou neutralizovat NDV. Avšak v testech in vivo a in vitro protilátky proti F proteinu vyvolávají větší neutralizační efekt, než protilátky generované proti HN (Meulemans a další, 1986).

Přítomnost specifických protilátek proti NDV v séru ptáků neposkytuje informaci o kmenu, který ptáky infikoval NDV, a proto má pro diagnostické účely limitující hodnotu.

Mnohočetná přítomnost lentogenních NDV kmenů u ptáků ve většině zemí a téměř univerzálně používané živé vakcíny, neumožňují diferenciaci, alespoň od divokého typu NDV. Znamená to, že pouhé prokázání infekce je nezřídka adekvátní zavedenou podmínkou pro kontrolní měření.

- 4 .

Protože výskyt nemoci v polních podmínkách může přinést nespolehlivé výsledky měření virulence virů, je nezbytné dále charakterizovat nalezené viry.

V nynější době existuje pouze jedna metoda diagnosy NDV, která umožňuje charakterizaci infi5 kujících kmenů, je to izolace viru s následným testem patogenity. V nynější době se pro tyto účely používají tři testy in vivo: 1) průměrná doba smrti ve vajíčkách; 2) intracerebrální index patogenity (1CPI) u jednodenních kuřat; 3) intravenosní index patogenity (IVPI) u šest týdnů starých ptáků.

ío Tyto testy narážejí na řadu těžkostí, jako je dostupnost zvířat, nízká reprodukovatelnost, dlouhá doba trvání testů. V neposlední řadě, tyto testy neposkytují jednoduchou sérologickou identifikaci drůbeže vakcinované očkovací látkou nebo nakažené divokým typem kmene.

Jako alternativní metoda k testům in vivo byl k rozlišení mezí virulentními a nevirulentními izolá15 ty s úspěchem použita polymerázová řetězová reakce (PCR) (Stauber a další, 1995; Kant a další, 1997). Avšak znovu nebylo možné sérologické rozlišení.

Chov drůbeže a obchodování s jejími produkty je nyní organizován na mezinárodním základě, velmi často pod vedením mnohonárodních společností. Hrozba Newcastleovské choroby předsta20 vuje pro tento obchod velké nebezpečí.

Úspěšná kontrola Newcastleovské choroby by byla možná jen za podmínek, že všechny státy by oznámily její případný výskyt. Avšak navrhnout mezinárodní smlouvy není jednoduché vzhledem k enormní variaci rozsahu dohlížení na výskyt nemoci. Některé země neprovádějí vakcinaci a nebudou chtít zavést jakoukoli formu NDV do domácí drůbeže, protože očkovanou drůbež nelze odlišit od drůbeže infikované divokou formou NDV.

Jiné země nedovolují užití jiné, než specifické živé vakcíny a považují všechny ostatní vakcíny za neakceptovatelně virulentní. Zatímco v jiných zemích je přítomnost cirkulujícího vysoce viru30 lentního viru nerozpoznána, protože otevřený výskyt nemoci je maskován očkováním.

V mnoha zemích existuje ke kontrole výskytu NDV, který by mohl nastat, legislativa. Národní kontrolní mechanismy jsou zaměřeny na kontrolu prevence zavlečení a šíření. Mnoho zemí má omezení v obchodě s drůbežími produkty, vejci a živou drůbeží. Většina zemí zavedla karanténní opatření pro import, zvláště pro papouškovité ptáky.

Některé země zavedly politiku eradikace s povinným zabitím infikovaných ptáků, jejich kontaktních ptáků a zničení jejich produktů. Jiné státy vyžadují profýlaktické očkování ptáků, dokonce i v případě, že výskyt nemoci nebyi prokázán. Další státy zavedly politiku kruhové vakcinace ustanovenou kolem místa výskytu infekce a zavedly dále nárazníkovou oblast.

Z předchozího testu jasně vyplývá, že je potřeba zlepšit metody vakcinace a diagnostiky, čímž by se umožnila účinná kontrola Newcastleovské choroby. Je to nevyhnutelné i z hlediska již vzpomínaných velkých rozdílů v dávkování, které se dostanou jednotlivým ptákům při masové aplika45 ci živých vakcín a také z hlediska rozdílnosti úrovně získané mateřské imunity u mladých kuřat a post-vakcinačních reakcí. To je jedním z hlavních zájmů farmářů v zemích, kde je očkování povinné.

Mnoho vakcin je směsí sub-populací. Jsou-li klonovány, sub-populace se mohou signifikantně lišit jedna od druhé v imunogenitě a patogenitě (Hanson, 1988).

Největší nevýhodou doposud používaných běžných živých vakcín a inaktivovaných vakcín se jeví fakt, že vakcinovaná zvířata nejsou rozlišitelná od zvířat nakažených, protože používané techniky doposud užívané, jako je hemagiutinační inhibice nebo virus neutralizující testy, toto rozlišení neumožňují.

Virulentní polní viry se mohou stále šířit ve vakcinovaných hejnech, protože vakcinace maskuje příznaky nemoci. Jelikož izolace a charakterizace virů pomocí technik in vivo není možná ve velkých měřítcích, je velká potřeba vývoje nové efektivní oslabené živé vakcíny, která by byla odli5 šitelná od polních izolátů.

Takovéto vakcíny, nazývané NDV markerové vakcíny (které jsou ve formě kitů s popsanými diagnostickými metodami), které jsou schopné poskytnout plné imunologické spektrum antigenně relevantních NDV epitopů a lze je odlišit od divokého typu NDV, nebyly doposud k dispozici.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje metodu genetické modifikace genomu ptačího paramyxoviru, která poskytuje geneticky modifikovaný ptačí paramyxovirus a markerovou vakcínu proti ptačímu paramyxoviru.

Nástup moderních molekulárně biologických technik umožnil modifikaci mnoha RNA virů, včetně virů s negativním RNA vláknem. Tato technika se velmi často nazývá jako „reversní genetika“. Nejdříve se připraví cDNA kopie úplné virové RNA (ťull-length), po tomto kroku následuje transkripce této DNA v sukceptibilních buňkách a vytvoří se infekční RNA, která svou replikací vytvoří infekční virové částice.

Obecně lze říci, modifikací cDNA pomocí standardních technik používaných v molekulární biologii je možné získat geneticky modifikovaný RNA virus. Avšak tento postup nebyl nikdy prove25 den pro NDV a další ptačí paramyxoviry, protože doposud nebylo možné generovat minigenomové fragmenty nebo plazmidy s ptačími paramyxovirovými genomovými fragmenty, za účelem studia replikačních jevů u ptačích paramyxovirů, což by umožnilo porozumět, jak konstruovat infekční kopie viru.

Je překvapivé, ačkoli v dalším popisu je to plně prokázáno, že 1 když genom ptačích paramyxovirů je nejmenším genomem ze všech doposud sekvenovaných genomů paramyxovirů, zvláště 5’terminální sekvence NDV genomu je však mnohem delší, než bylo dříve určeno a než by se předpokládalo ze srovnání s dalšími členy Paramyxoviridae.

Vynález dále udává celou sekvenci genomu ptačího paramyxoviru a udává fíill-length neboli cDNA úplné délky minigenomu takovéhoto viru.

Vynález se dále týká cDNA ptačího paramyxoviru obsahující alespoň sekvenci nukleové kyseliny odpovídající 5’ konci genomu viru Newcastleské choroby drůbeže jak je vidět z obrázku 6, umožňující přípravu infekční kopie ptačího paramyxoviru, přičemž řečená cDNA ve výhodném uspořádání vynálezu obsahuje úplnou sekvenci (full-length) cDNA. Avšak vynález dále zahrnuje i cDNA obsahující alespoň nukleotidovou sekvenci odpovídající 5’ konci genomu ptačího paramyxoviru, která však umožňuje replikaci minigenomu ptačího paramyxoviru. Takovéto minigenomy jsou s výhodou užity k transkripci RNA a/nebo expresi proteinů podle modifikovaných sekvencí nukleových kyselin. Vynález popisuje získání cDNA podle vynálezu, která je alespoň částečně odvozena z viru Newcastleské choroby, například když řečený virus Newcastleské choroby je lentogenní virus, ve výhodném uspořádání odvozený z vakcinačního kmene, jako je kmen LaSota ATCC VR-699.

Vynález dále popisuje cDNA podle vynálezu, která vzniká dodatečnou modifikací, jako je delece, inserce, mutace, reverse, nebo dalšími změnami v nukleových kyselinách. Například je připravena cDNA, ve které řečená modifikace obsahuje nukleovou kyselinu kódující modifikaci štěpného místa proteasy, například uvedené štěpné místo je štěpným místem pro fúzní protein (F).

-7CZ 300760 B6

V dalším výhodném provedení vynález popisuje cDNA podle vynálezu, kde modifikovaná nukleová kyselina kóduje hybridní virový protein, jako je hybridní protein pro hemaglutininneuramidasu (HN), tak jak je to popsáno v experimentální části vynálezu. Vynález dále popisuje cDNA podle vynálezu, kde modifikace obsahuje deleci v nukleové kyselině kódující virový pro5 tein, takový jako je matrixový protein (M).

Vynález dále popisuje cDNA podle vynálezu dodatečně poskytující nukleovou kyselinu kódující heterogenní antigen, ve výhodném uspořádání uvedený antigen je odvozen od drůbežího patogenu, tak jak je to popsáno níže. RNA a protein odvozený od této cDNA je také součástí vynálezu.

V posledních letech bylo plně charakterizováno mnoho nesegmentovaných vírů s negativní RNA a byly provedeny také základní práce na objasnění a uskutečnění jejich replikace a exprese jejich genomů, což vyústilo v možnosti generovat infekční virové částice pomocí transfekce buněk klonovanou cDNA řečených virů (viz review Conzelmann, 1996).

Do nynější doby byla například takto generována z klonované cDNA infekční částice s nesegmentovanou negativní RNA patřící viru vztekliny (Schnell a další, 1994; Conzelmann; EP 0 702 085A1); vesikulámího stomatitis viru (Lawson a další, 1995; Whelan a další, 1995), Sendai viru (Garcin a další, 1995), viru spalniček (Radecke a další, 1995; Schneider a další,

1997; EP 0 780 475), lidský respirační syncitický virus (Collins a další, 1995), virus dobytčího moru (Baron a Barrett, 1997) a lidského viru působícího onemocnění dýchacích cest (parainfluenza virus typu 3) (Hoffman Banerjee, 1997, Conzelmann; ΕΡ0 702 085), Schnell a další, 1994; EP0 702 085).

Všechny výše zmíněné kopie infekčních virů jsou schopné růst jak in vivo, tak in vitro v hostitelích, dále tkáních nebo buňkách různých orgánů, umožňujících snadnou transfekci cDNA a replikaci a generaci infekčních virových částic ve vhodné buněčné linii.

Tato možnost však neexistuje pro NDV, určitě ne však pro lentogenní kmen NDV, který se používá pro přípravu vakcín. Virulence takovéhoto kmene NDV je spojena sjeho schopností replikace v širokém okruhu buněk, což odráží fakt, že virulentní kmeny se mohou snadno replikovat jak in vivo tak in vitro, zatímco vakcinační kmeny se mohou replikovat pouze in vivo.

Tak se u NDV dostáváme do patové situace. Zatímco popsané přístupy, kterými je možno gene35 rovat infekční kopii viru například z cDNA, vedou k infekčnímu viru, který nelze používat pro vakcinaci vzhledem k jeho vysoké virulenci, dá se využít fakt, že tento virus může být generován a replikován po transfekci cDNA v buněčné linii, kde dochází k snadnému štěpení proteinu Fo na F1 a F2, což je, jak je to diskutováno výše, charakteristickým znakem virulence NDV.

4o Využití vakcinačního kmene jako výchozího materiálu pro cDNA tento problém neřeší; vakcinační kmen, zejména lentogenního typu, neobsahuje lehce štěpitelný Fo protein, což poskytuje důkaz o nemožnosti generovat virus, který by se mohl replikovat. Buňky používané pro transfekci nejsou vnímavé pro jedno či více opakování replikace viru vakcínového typu s neštěpeným Fo proteinem.

Vynález popisuje elegantní metodu řešení tohoto problému vytvořením infekční kopie NDV, například pro použití ve vakcíně.

Vynález dále popisuje způsob generace infekční kopie viru Newcastfeovské choroby, dále popi50 suje transfekované buňky schopné exprese virových NP, P a L proteinů, které tvoří komplexy svirovou RNA, skloňovanou celkovou nebo genomovou cDNA řečeného viru. Dále systém obsahuje inkubaci řečených buněk v růstovém médiu vykazujícím proteolytickou aktivitu umožňující štěpení Fo řečeného viru.

V našem systému byla vynechána kotransfekce plazmidu exprimujícího NP. NP je pravděpodobně exprimován z úplné cDNA, protože NP gen je prvním genem na 5’ konci antigenomové RNA. Vzhledem k tomu, že eukaryotické mRNA jsou obvykle monocistronní, nepředpokládá se exprese vzdálených genů. Je však možné generovat úplnou cDNA, ve které je vzájemná poloha NDV genů pozměněna. Je-li prvním genem takovéto cDNA gen P nebo L, není nutno exprimovat odpovídající genový produkt z kotransfekovaného plazmidu.

Jako alternativa k použití úplné cDNA je možné použít dvě nebo více subgenomových cDNA, které se replikují za vzniku daných subgenomových RNA a které dohromady exprimují plný io počet proteinů ptačích paramyxovirů. Dokonce, i když jsou RNA obaleny jednotlivě, výsledné viru podobné částice (virus-like particles) se mohou využít pro následné cykly replikace pomocí koinfekce a komplementace genových funkcí.

Ve zvláště výhodném provedení vynálezu je popsán způsob, kdy proteolytická aktivita je odvo15 zena od enzymu, jako jsou trypsinu podobné enzymy, nebo je odvozena od sloučeniny mající proteolytickou aktivitu. V ještě výhodnějším provedení, růstové médium obsahuje alantoickou tekutinu s proteolytickou aktivitou. Pro generaci infekční virové částice je nezbytné štěpení Fo. Je možné vytvořit infekční virovou částici z lentogenního kmene bez přidání exogenní proteolytické aktivity. Lze to učinit inokulací supematantu transfekovaných buněk do alantoické dutiny embryogenních vajec, kde proteolytická aktivita alantoické tekutiny je schopna štěpit Fo protein a vytvářet fúzní kompetentní F1-F2 komplex. Viriony s takto aktivovaným F proteinem jsou schopny infikovat sukceptibilní buňky a replikaci v buňkách, které vykazují proteolytickou aktivitu, vzniká infekční potomstvo. Jako alternativní zdroj vytvářející proteolytickou aktivitu v supematantu transfekovaných buněk je možné využít buňky, které jsou tolerantní k NDV a které jsou schopné exprimovat požadovanou proteolytickou aktivitu. Takovouto buněčnou linii lze použít k produkci infekčního lentogenního NDV bez zavedení exogenní proteolytické aktivity. Takováto buněčná linie může být dále vytvořena stabilní transfekcí buněčné linie genem, který vykazuje řečenou aktivitu. Co více, je možné stabilní transfekcí vytvořit buněčnou linii, která exprimuje divoký typ F proteinu ve virovém obalu, čímž poskytuje infekční částice (které samotné neobsahují genetickou informaci kódující divoký typ F proteinu) s možností vstoupit do buňky.

Vytvoření infekčního lentogenního viru je dále možné infekcí transfekovaných buněk NDV pomocným virem (helpervirus). Základním požadavkem kladeným na pomocný virus je, že musí být vybrán tak, aby byl eliminován například pomocí neutralizačních protilátek, které ale nereagují s lentogenním virem.

Konečně mohou být konstruovány stabilní transfekční buněčné linie, které exprimují jeden, dva, nebo všechny tři nezbytné NDV proteiny - NP, P a L. Takovéto buněčné linie vyžadují koexpresi jen jediné z podmnožiny tří nezbytných proteinů, nebo nevyžadují vůbec žádnou koexpresi pro vytvořeni infekční kopie viru.

Ve zvláště výhodném provedení vynálezu, vynález popisuje způsob, kdy buňky použité k transfekci jsou odvozeny od kuřecích primárních nebo sekundárních buněk, či buněčných linií.

Používají se například CER nebo CEF buňky, u kterých, jako obecně u většiny in viíro buněk, chybí vhodné proteázy, které jsou požadovány ke štěpení Fo proteinu NDV, například kmene LaSota. Avšak lze použít například i jiné buňky, které jsou odvozené z jiných ptáků.

Vynález dále popisuje způsob přípravy infekčních kopií viru Newcastleovské choroby pomocí transfekce buněk úplnou (full-length) nebo částí genomové (genomic-length) cDNA daného viru, například zobrazené na obrázku 3 a popisuje dále inkubaci buněk v růstovém médiu, které má proteolytickou aktivitu umožňující štěpení proteinu Fo daného viru, dále ještě popisuje získání infekčních virových částic kultivací výše zmíněných buněk a inokulací materiálu získaného z těchto kultivovaných buněk do alantoické dutiny vaječných embryí. Popsaný materiál například obsahuje (sklizené nebo zmražené a rozmražené) buňky nebo buněčné zbytky či supematant odvozený z těchto kultur.

Například, vynález popisuje způsob získání infekčního viru, kdy supematant transfekované monomolekulámí vrstvy CEF buněk se inokuluje do alantoické dutiny embryogenních vajíček. O čtyři dny později se alantoická tekutina sklízí, analyzuje hemaglutinačním testem a pasážuje se do dalších vajíček.

V dalším výhodném provedení vynález popisuje způsob pasážování těchto infekčních kopií NDV i o sklízením alantoické tekutiny a reínokulaci embryogenních vajec.

Ve zvláště výhodném provedení vynálezu je popsán způsob, kdy uvedený virus je lentogenní virus, například odvozený z nevíru lentního izolátu NDV nebo z vakcínového kmene NDV, jako je LaSota NDV. Dále vynález popisuje způsob modifikace genomu ptačího paramyxoviru pomo15 cí genetické modifikace, která dovoluje zavedení jedné nebo více mutací, delecí a/nebo insercí nebo dalších modifikací. Například, je popsán způsob atenuace nebo modifikace virulence ptačího paramyxoviru modifikací cDNA, která kóduje například virový protein, jako je V protein, kdy je tato cDNA klonována do úplné cDNA a kdy se z tohoto klonu generuje infekční kopie viru, čímž vzniká nový kmen NDV nebo atenuovaná živá vakcína s vylepšenými vlastnostmi.

Ale mimo atenuaci provedenou modifikací genových produktů, je možné zeslabit ptačí paramyxoviru s modifikací nukleotídových sekvencí, které se podílejí na transkripci a/nebo replikaci. Takovéto modifikace ústí ve vznik atenuovaných kmenů, které exprimují divoký typ proteinů podobných proteinu F, které jsou Štěpitelné jak in vitro, tak in vivo ve velkém množství typu buněk a kdy vzniklé kmeny jsou více imunogenní než klasické kmeny používané pro vakcinaci.

V dalším výhodném uspořádání vynález popisuje způsob atenuace nebo modifikace virulence ptačího paramyxoviru jako je virus Newcastleovské choroby, obsahujícího modifikované štěpné místo proteasy virového proteinu pomocí modifikace cDNA kódující výše uvedené štěpné místo, dále popisující klonování uvedené cDNA do genomické cDNA viru Newcastleovské choroby a generaci infekčních kopií viru Newcastleovské choroby. Uvedené štěpné místo je například štěpným místem proteasy v F nebo HN proteinu viru Newcastleovské choroby. Atenuace se obvykle zužuje na restrikci virulence. Avšak v dnešní době je možné použít i relativně virulentní kmen NDV a vytvořit potomstvo tohoto kmene se zvýšenou virulencí, například se zvýšenou ten35 dencí replikace ve specifických buňkách určitého typu. Tak se dnes stává možným přidělení vlastností rozdílné virulence k NDV.

Vynález dále popisuje způsob antigenní modifikace ptačího paramyxoviru, jako je virus Newcastleovské choroby, zavedením modifikující cDNA kódující alespoň část virového proteinu nesoucího alespoň jeden imunodominantní epitop, dále obsahující klonování uvedené cDNA do genomové cDNA NDV viru a generaci infekční kopie viru.

V dalším výhodném provedení vynález popisuje způsob další modifikace NDV například použitím infekční kopie NDV (vakcína), která by poskytovala rekombinantní markerovou NDV vakcínu, ve které by bylo plně zastoupeno spektrum všech možných nebo vybraných antigenních NDV epitopů, které by byly sérologicky odlišné od epitopů divokého NDV, protože tyto vybrané epitopy, sérologicky relevantní epitopy nebo markéry by mohly být odstraněny pomocí rekombinantních technik.

Vynález popisuje způsob modifikace antigenního složení ptačího paramyxoviru jako je NDV, což umožňuje například generaci tak zvaných živých markerových NDV vakcín, které by mohly být sérologicky odlišné od polních kmenů ptačího paramyxoviru.

V jiném výhodném provedení vynálezu je popsána konstrukce infekční kopie NDV, kde HN protein NDV je modifikovaný rekombinací cDNA kódující Část tohoto proteinu HN odvozeného z ptačího paramyxoviru, například typu 2 nebo 4. Řečený hybridní HN protein slouží jako sérologický markér pro infekční kopii NDV kmene takto získaného, nebo může sloužit ke změně tropismu ptačího paramyxoviru k dalším buňkám a/nebo tkáním. Tyto, tak zvané markerové kmeny připravené podle vynálezu mohou sloužit k přípravě vakcín, které jsou nedocenitelnou pomůckou umožňující určení výskytu NDV v komerčních hejnech na celém světě. Co více, hromadná aplikace těchto markerových vakcín by mohla vést ke kompletní eradikaci NDV cestou intenzivního sledování a hubení infekčních hejn.

Dále může být popsaný způsob použit ke generaci infekčního NDV kmene, který exprimuje ío jeden nebo více antigenů jiných patogenů a které by bylo možno využít k vakcinaci proti mnoha chorobám. Takováto infekční kopie NDV viru může například obsahovat heterologní cDNA kódující heterologní protein získaný například z viru ptačí chřipky (AI) (Hemaglutinin (H5 a H7) a Neuraminidasy), viru ptačí leukosy (ALV) (obalový protein (gp85), viru kuřecí anemie (CAV) (VP1+VP2), viru Markovy nemoci (MDV) (glykoprotein B (gB,gH), infekčního laringotracheitis viru (1LT) (gB.gH,gD), infekčního bursal disesease viru (IBDV) (VP2 a VP3), viru krůtí rhinotracheítidy (TRT) (fuzní (F) protein), ptačího paramyxoviru -2,-3,-6 (PMV) (F protein, hemaglutinin neuramiodasa (HN), nebo další, jako jsou virus infekční bronchitidy (IBV) (peplomemí protein, nukleoprotein), Reovirus (sigma protein), Aenoviry, Pneumoviry, Salmonela enteritidis, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Bordatella avium (dříve Alcaligenes faecalis), Haemphi20 lus paragallinarum, Pasteurella multocida, Omithobacterium rhinotracheale, Riemerella (dříve nazývaná Pasteurella) anatipestifer, Mykoplasmy (M. gallisepticum, M. synoviae, M. meregridis, M. iowae), nebo Aspergilli (A. flavus, A. fumigatus).

Vynález dále popisuje ptačí paramyxovirus či kmeny od něj odvozené, které mohou být využity jako vakcínový vektor pro expresi antigenů z dalších drůbežích patogenů. Některé vlastnosti předurčují NDV jako ideální vakcínový vektor pro vakcinaci proti respiračním či střevním nemocem. I) NDV lze lehce kultivovat do vysokých titrů v embryogenních vejcích. 2) Kultivace NDV ve velkém v embryogenních vejcích je relativně levná. 3) NDV vakcíny jsou relativně stabilní lehce se administrují ve velkém, například pitnou vodou nebo postřikováním či ve formě aeroso30 lu. 4) Přirozená cesta infekce NDV je přes respirační/intestinální trakt, což je také přirozená cesta infekce pro většinu drůbežích patogenů. 5) NDV může indukovat lokální imunitu i přes přítomnost kolujících mateřských protilátek.

Je prokázáno, že NDV má potenciální antineoplastické stejně tak imunitu stimulující vlastnosti.

(pro podrobnosti se lze podívat do review Schirrmacher a další, 1998) (Schirrmacher, V., Ahlert, T., Steiner, H.-H., Herold-Mende, C., Gerhards, R. a Hagmuller, E. (1998) Immunization with virus modified tumor cells. Seminars in Oncology 25: 677-696). Ačkoli se nezdá, že by se NDV byl schopen replikovat produktivně v normálních lidských buňkách, bylo pozorováno usmrcení lidských kancerogenních buněk selektivně zprostředkované NDV. Po lokální terapii NDV byla u holých myšek pozorována virová onkolýza a úplná remise lidských nádorových xenoimplantátů. Avšak problémem je, že takováto aplikace je zakázána pro lokální použití.

Infekce NDV indukuje interferony, chemokiny a další potenciálně důležité genové produkty a indukuje tak pleiotropní odpověď stimulující imunitu v nádorových buňkách. Tento přístup se využívá pro indukci vlastních antitumorových vakcín, které obsahují čerstvě voperovaný vzorek infikovaný NDV nebo ATV-NDV (Schirrmacher a další, 1998). Buňky infikované NDV jsou inaktivovány gama zářením, které zabraňuje dělení buněk, ale které ještě dovoluje replikaci NDV v cytoplasmě infikovaných buněk. Po inokulaci pacientů ATV-NDV, se začnou množit T buňky jako důsledek indukce chemokinů NDV. Některé z těchto buněk exprimují T-receptor, který může interagovat s peptidy z antigenů vyskytujících se na nádoru a tvoří se tak komplex s molekulami třídy I hlavního histokompatibilního komplexu na buněčném povrchu. Tato interakce ústí v indukci cytotoxické odpovědi zprostředkované T-buňkami, což se projeví ve specifické smrti vlastních nádorových buněk.

.11.

Vynález dále popisuje, že druh a množství chemokinů a imunitních stimulačních proteinů indukovaných NDV infekcí může být modulováno. Předkládaný vynález popisuje způsob přípravy rekombinantního NDV, který lze modifikovat vložením a expresí heterologního (heterologních) genu(ů). Takovýto rekombinantní NDV může být použít k modifikaci repertoáru a množství imunitu stimulujících proteinů v infikovaných buňkách. Ve zvláště výhodném uspořádání vynálezu se popisuje příprava rekombinantního NDV, který obsahuje a exprimuje geny kódující lidské interferony, chemokiny nebo další imunitu stimulující proteiny. Tento řečený rekombinantní NDV lze použít pro přípravu ATV-NDV, který je více potentní, než konvenční ATV-NDV. Například: cytokiny IFN-Alfa, -beta, TNF-alfa, IL—1, IL-6; chemokiny RANTES, IP—10; další io geny jako HSP, ACTH, endorfm, iNOS, EPA/TIMP; NFkB). Pleiotrofní imunitu stimulující vlastnosti NDV lze dále využít jako adjuvans pro vakcinaci zvířat a lidí proti infekčním nemocem. V dalším výhodném provedení vynálezu se jako induktoru imunitní odpovědi proti infekčním nemocem využívá cizích genů kódujících: významné antigen(y) infekčního agens, které jsou vloženy do genomu NDV a simultánně exprimovány, jak antigen(y), tak i imunitu stimulující proteiny pomocí infikovaných buněk, čímž se indukuje vlastní imunitní odpověď proti infekčnímu agens.

V dalším výhodném provedení vynálezu jsou vlastnosti stimulující imunitní odpověď dále zesíleny použitím NDV rekombinantů, kteří současně exprimují antigeny a specifické proteiny stimu20 lující imunitu. Ve zvláště výhodném provedení se vynálezu používá k přípravě AIDS vakcíny (syndrom získané imunodeficience - acquired immunedeficiency syndrome) pomocí rekombinantních NDV, které exprimují důležité antigeny z lidského imunodeficientního viru (HIV), buď samotné, nebo v kombinaci s proteiny stimulujícími imunitu.

NDV se užívá také jako adjuvans pro vakcinaci zvířat a lidí proti infekčním chorobám. V jednom z výhodných provedení vynálezu jsou heterologní nebo cizí geny kódující důležit(ý)é antigen(y) infekčního(ích) agens vloženy do NDV genomu a současná exprese antigenu a imunitu stimulujících proteinů v infikovaných buňkách může indukovat imunitní odpověď proti infekčnímu agens. V dalším výhodném provedení vynálezu jsou vlastnosti NDV stimulující imunitní odpo30 věď zesíleny pomocí užití NDV rekombinantů, které souběžně exprimují antigeny a specifické proteiny stimulující imunitní odpověď. Ve zvláště výhodném provedení se vynálezu používá k přípravě AIDS vakcíny (syndrom získané imunodeficience - acquired immunedeficiency syndrome) pomocí rekombinantních NDV, které exprimují důležité antigeny z lidského imunodeficientního viru (HIV), buď samotné, nebo v kombinaci s proteiny stimulujícími imunitu.

Dále vynález popisuje způsob konstrukce podmíněně letální NDV deleění mutanty, která může být užita jako samorestrikční nepřenosná (nosiěová) vakcína. NDV deleční mutantaje konstruována tak, že je neschopná exprimovat matrixový (M) protein, který ukotvuje NDV na vnitřní buněčné membráně. Vynález popisuje například fenotypicky doplněný kmen NDV, který nemůže exprimovat M protein, který je ale stále infekční a šíří se transmisí z buňky do buňky. Ale tato mutanta není schopná tvořit infekční potomstvo v nekomplementárních buňkách. Vynález popisuje fenotypicky komplementované NDV deleční mutanty, které mohou být užity jako bezpečné samorestrikční vakcíny, které se nemohou šířit do okolí. Takovéto nepřenosné vakcíny kombinují nejdůležitější výhodu živých vakcín, to znamená účinnost, s nejdůležitější vlastností usmrcených vakcín, to znamená bezpečností.

Vynález popisuje virus Newcastleovské choroby nebo od něj odvozené kmeny, a to například pomocí pasážování nebo další kultivace v embryogenních vajíčkách či příslušných buňkách, kdy tento virus je odvozen od infekční kopie víru získané způsobem popsaným ve vynálezu.

Například, NDV lze připravit tak, že se modifikuje alespoň jedna cesta ke generaci infekční kopie viru Newcastleovské choroby, která je buď oslabena, má modifikovanou virulenci, či modifikovanou antigenicitu, exprimuje heterologní antigen nebo jsou jeho částice nepřenosné, nebo se jedná o kombinaci uvedeného.

Tímto vynález popisuje NDV vakcíny, charakterizované například tím, že nesou odlišné atributy virulence nebo odlišné antigenní charakteristiky, čehož lze využít pro účely markerových vakcín a/nebo pro expresi heterologních antigenů odvozených od dalších patogenů, které mohou být v přenosné či nepřenosné formě.

Jako vakcíny mohou být ve formě usmrcených či živých vakcín.

Ve výhodném uspořádání je takováto vakcína živá vakcína, avšak usmrcená vakcína podle vynálezu výhodnější za těch podmínek, kdy živá vakcína nemůže být vůbec nebo z části aplikována, například z důvodů omezení obchodování nebo za dalších podmínek, které udávají kontrolní orgány.

Vynález se dále popisuje také jako diagnostiky a odpovídající kity k testování, které jsou založeny na detekci protilátek proti řečenému sérologicky imunodominantnírnu epitopu nebo markéru, čímž se zajišťuje způsob a prostředek k realizaci kontroly a/nebo eradikace NDV a/nebo dalších nemocí drůbeže. Vynález popisuje nové a efektivní vakcíny, které mohou být sérologicky odlišitelné od vakcín odvozených z polních izolátů a vakcín starého typu. Takovéto nové vakcíny, nazvané NDV markerové vakcíny, poskytuje úplné možné imunologické spektrum antigenně důležitých NDV epitopů a které jsou pomocí aplikovaných doprovodných diagnostických testů a kitů sérologicky odlišné od divokého typu NDV.

Vynález popisuje způsob pro odlišení zvířat nevakcinovaných a vakcinovaných NDV vakcínou podle vynálezu od zvířat infikovaných divokým typem NDV nebo vakcinovaných nemodifikovaným mesogenním nebo lentogenním NDV vakcinačním kmenem, a to na základě odběru alespoň jednoho vzorku (jako je sérum, krev, vajíčko nebo oční kapalina) z řečeného zvířete, ve kterém se určí přítomnost protilátek proti imunodominantnírnu epitopu nebo markéru exprimovanému výše zmíněným divokým typem nebo nemodifikovaným NDV, ale ne pomocí vakcíny podle vynálezu.

Vynález popisuje užití protilátek, které jsou produkovány proti HN nebo F proteinu NDV, napří30 klad proti hybridnímu proteinu, tak, jak je to popsané v experimentální části. Vynález dále popisuje například diagnostický test, kde řečené zvíře je vybráno ze skupiny složené z drůbeže, nejvýhodněji z kuřat.

Vynález dále popisuje diagnostický kit pro sérologické rozlišení zvířat.

Ve zvláště výhodném uspořádání se pro rozlišení vakcinovaných a infekčních zvířat používá jednoduchý a rychlý hemaglutinaČně inhibiční (HI) test. Zvířata vakcinovaná markerovou vakcínou, ve které je kompletní globulámí část HN viru NDV nahrazena odpovídající částí HN jiného sérotypu, neindukuje protilátku proti HN z NDV, a proto neinhibuje hemaglutinaci erytrocytů

NDV viriony.

Při užití markerových vakcín v HI testu, jsou detekovány protilátky proti hybridnímu proteinu HN a mohou být použity k měření účinnosti vakcinace. Jako alternativní způsob měření účinnosti vakcinace se používá detekce protilátek proti F proteinu NDV metodou ELISA.

Vedle testování HI, se ELISA testu užívá k určení přítomnosti protilátek proti HN proteinu NDV. Antigen používaný v tomto testu je například HN z NDV, kteiý je exprimován rekombinantními DNA technikami nebo pomocí konzervovaných peptidů z HN NDV.

Také lze použít blokovací ELISA test. V tomto testu se používá jedna nebo více monoklonálních protilátek proti konzervovanému epitopu HN z NDV k určení, zdaje ve vzorku z vakcinovaného zvířete přítomna kompetující protilátka. ELISA testy se mohou s výhodou použít tehdy, jestliže markerová vakcína obsahuje pouze chimérický protein HN, nebo je-li nahrazeno několik epitopů vHNzNDV.

n _

Vynález je dále vysvětlován v následující experimentální části, aniž je tímto jeho platnost jakkoli omezena jen na uvedené příklady.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1:

Transkripční vektor pOLTV je derivátem transkripčního vektoru popsaného Pattnaikem a dalšími io (1992). Podívejte se do textu na podrobnosti o konstrukci. Plazmid obsahuje T7 DNA-dependentní RNA polymerasový promotor (vyznačený tučně) následovaný specifickými restrikčními místy Stul a Smál a autokatalytickým ribozymem z hepatitis delta viru (HDV). DNA fragmenty mohou být klonovány mezi Stul a Smál místa a mohou být transkribovány buď in vitro nebo in vivo pomocí T7 RNA polymerasy. 5’ konec vznikajících transkriptů obsahuje navíc dva G zbytky, které nejsou kódovány insertem. Díky aktivitě ribozymu 3’ konec transkriptů přesně odpovídá poslednímu nukleotidu v insertu.

Obrázek 2:

Struktura minigenomu plazmidů pOLTV535 (obrázek 2A) a pOLTV553 (obrázek 2B).

Minigenom plazmidů je založen na transkripčním plazmidů pOLTVS (cf. obrázek 1) a obsahují 3’-oblast (nt 1-119) a 5’-oblast (nt 14970-15186) z NDV kmene LaSota ohraničujících gen kódující sekretovanou alkalickou fosfatasu (SEAP). Transkripcí pOLTV535 pomocí T7RNA polymerasy vzniká antigenomové RNA (nebo (+)-RNA) zatímco transkripce pOLTV553 vznikne genomová RNA (nebo (-)-RNA). Jsou zde vyznačeny startovní (S) a koncový (E) box, které představují virové signály pro iniciaci a termínaci transkripce. Startovní kodon genu SEAP je podtržen. Na obrázku jsou také vyznačeny v místě Clal sekvence insercí (NO až N5), pomocí nichž se generují minigenomové plazmidy, které se navzájem od sebe liší o lntvdélce (pOLTV535N0-N5 a pOLTV553N0-N5).

Obrázek 3:

Nukleotidová sekvence genomu NDV kmene LaSota a dedukovaná aminokyselinová sekvence

NDV genů. Uvedené sekvence odpovídají antigenomovému vláknu a jsou naznačeny ve směru od 5’ k 3’ ve formě ssDNA. Sekvence zobrazená v tomto obrázku je konsenzuální sekvencí, která byla určena kompletním sekvenováním dvou nezávislých setů překrývajících se subgenomových cDNA, které zahrnují vlastní genom NDV. Zbývající nejasnosti (vzniklé pravděpodobně jako výsledek chyb v PCR) byly vyřešeny sekvenováním daných oblastí třetího nezávislého setu klonů.

Sekvence úplné cDNA klonu pNDFL+, která byla poskládána z překrývajících se sekvencí subgenomových cDNA klonů (viz obrázek 4), se liší od konsenzuální NDV sekvence v následujících místech (konsenzuální sekvence je uvedena v závorkách): nt 1755, G(A);

nt 3766, A(G); nt 5109, G(A); nt 6999, T(C); nt 7056, G(A); nt 9337, G(A); nt 9486, A(T);

nt 10195, T(C); nt 13075, A(G). Tyto změny se obrážejí ve změně tří aminokyselinových zbytků (konsenzuální sekvence je uvedena mezi závorkami): F protein, R189 (Q); HN protein S200 (P),

L protein N369 (I).

Obrázek 4:

(A) Všeobecná strategie použitá pro složení úplné cDNA NDV z subgenomových překrývajících se cDNA klonů. cDNA byla dána dohromady v plazmidů pOLTV535, který obvykle obsaCZ 300760 B6 huje 3’ a 5’ konce NDV kmene LaSota (cf. obrázek 2). Výsledný plazmid, označený pNDFL+, byl použit pro přípravu infekčního NDV.

(B) Detailní proces klonování pro složení úplné cDNA NDV z překrývajících se cDNA klonů.

Cm je označení genu pro chloramfenikolovou resistenci, který byl dočasně zaveden jako fenotypický projev (detaily jsou uvedeny v textu).

(C) Detailní proces klonování pro přípravu geneticky modifikované úplné cDNA NDV. Modifikace sestává ze tří nukleotidových změn, které byly zavedeny do F genu a jejichž výsledkem ío je modifikace aminokyselinové sekvence proteolytického místa F proteinu (podrobnosti najdete v textu).

Obrázek 5:

(A) pOLTV535-série

Transkripce pomocí T7 RNA polymerasy dává vzniknout antigenomové RNA (nebo (+)-RNA), která může být přímo buňkou translatována do SEAP proteinu. Po infekci buněk pomocným virem (heJpevirem) (nebo po kotransfekci plazmidů kódujících NO, P a L), je antigenomová

RNA použita virovým polymerasovým komplexem pro syntézu genomové RNA (nebo (-)RNA). Genomová RNA je potom využita virovým polymerasovým komplexem pro syntézu obou mRNA (použitím transkripčních boxů pro start (S) a konec (E) a antigenomové RNA).

(B) pOLTV553-série

Transkripce pomocí T7 RNA polymerasy dává vzniknout genomové RNA (nebo (-)_RNA), která nemůže být přímo buňkou translatována do SEAP proteinu. Po infekci buněk pomocným virem (helpevirem) (nebo po kotransfekci plazmidů kódujících NP, P a L), je genomová RNA použita virovým polymerasovým komplexem pro syntézu obou mRNA (s použitím specifických transkripčních boxů pro start (S) a konec (E) a antigenomové RNA).

Obrázek 6:

Porovnání sekvencí 5’ konců nukleových kyselin NDV kmene LaSota a dalších paramyxovirů je znázorněna jako porovnání sekvence NDV s dalšími čtyřmi členy rodu Rubulavirus, tří členů rodu Paramyxovirus a rodu Morbillivirus. Sekvence jsou uvedeny od koncového boxu L genu k 5’ konci (3’-5* cDNA).

NDV, virus Newcastleovské choroby; hPIV2, lidský parainfluenza virus 2; MuV, virus příušnic;

SV5 a SV41, opičí virus 5 a 41; Se V, Sendai virus;

BPIV3 a hPIV3, hovězí a lidský parainfluenza virus; CDV, virus psinky; MeV virus spalniček; RPV virus dobytčího moru. Nukleotidové (nt) sekvence vlastních genomů byly získány pod následujícími přístupovými čísly: NDV (AF077761); hPIV2 (X57559); MuV (AB000388); SV5 (AF052755); SV41 (X64275); bPIV3 (D84095); hPIV3 (Z11S75); CDV (L13194); MeV (X16565); RPV (Z30697).

Příklady provedení vynálezu

Materiál a metody

Není-li uvedeno jinak, standardní klonovací postupy se prováděly dle Sambrooka a dalších (1989). Všechny konstrukty obsahující DNA fragmenty, které byly generovány pomocí polyme55 rasové řetězové reakce (PCR) byly ověřeny sekvenčními analýzami. V sekvencích příměrů, které c

jsou uvedeny dále v textu, podtržené nukleotidy odpovídají sekvencím NDV a je zde vyznačena pozice v NDV genomu. Nukleotidová sekvence restrikčních míst, která byla použita pro klonování, jsou indikovány v boldu.

Buňky a viry

CER buňky (Smith et al., 1976) se pěstovaly v růstovém médiu GMEM/EMEM (1:1) obsahujícím 5% fetální telecí sérum a 2% směsi antibiotik obsahující 1000 U/ml penicilinu, 1000 pg/ml Polymixinu B a 10 mg/ml Kanamycinu. QT35 buňky (Moscovici a další, 1977; Cho, 1982) byly ío pěstovány v médiu dodávaném GibcoBRL/Life Technologies (kat.č. 041-91536; patentované složení Fort Dodge) obohaceném 5% FCS a 2% směsí antibiotik. QMS buňky (Antin a Ordahi,

1991) byly pěstovány v médiu M199 obohaceném 10% tryptosofosfátovým bujónem, 10% FCS a 2% směsí antibiotik.

μ NDV kmen LaSota byl získán z ATCC (ATCC VR-699) a byl dvakrát pasážován v embryogenních vejcích. Před začátkem konstruování a klonování cDNA byl virus třikrát přečištěn plakovou purifikací na primárních kuřecích embryonálních fibroblastech (CEF). Na konci purifikace byl virus titrDván na CEF buňkách kultivovaných v GMEM/EMEM (1:1) obsahujícím 5% telecí fetální sérum, 2% směs antibiotik, 5% allantoickou tekutinu, 30 mM MgCh, 200 pg/ml DEAE20 dextran (Sigma) a 0,8% agar Noble (Difco). Virus ze třetího běhu plakové purifikace (označený jako klon E13-1) byl pěstován v embryonálních vejcích a po čtyři dny po inokulaci se sklízela allantoická tekutina, která se po alikvotech ukládala do -70 °C. Rekombinantní virus drůbežích neštovic fpEFLT7pol (Britton a další, 1996; později nazýván FPV-T7), který exprimuje T7 RNA polymerasu, byl laskavě darován Dr. Michaelem Skinerrem a byl množen v buňkách QT35.

Příklad 1: Izolace virové RNA

Všechny manipulace byly prováděny ve skle nebo plastu bez RNas. Všechny roztoky byly připraveny také z vody neobsahující RNasy, která se připravila přidáním 1% dietylpyrokarbonátu (DEPC) a po té se provedla sterilizace autoklávováním. Virus byl získán zallantoické tekutiny centrifugací při 21.000 rpm v rotou Beckman SW40 při 4°C. Peleta se rozpustila vhomogenizačním pufru (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% SDS) a poté byla podrobena působení Proteinasy K (200 pg/ml) po dobu 90 minut při 37 °C za konstantního třepání. Lyzát byl dvakrát extrahován směsí stejného dílu fenol/chloroform (1:1) pH 5,4 a jednou stejným objemem chloroformu. Virová RNA se precipitovala z vodné fáze přidáním 0,1 objemu 3M NaOAc pH 5,3 a 2,5 objemy 100% ethanolu. Precipitát se oddělil centrifugací, promyl jednou 70% ethanolem, resuspendoval se ve vodě a byl skladován po alikvotech při -70 °C.

Příklad 2: Reversní transkripce

Virová RNA (1,5 pg) se smíchala s 500 ng primeru v objemu 12 μΐ a nechala se ínkubovat po dobu 10 minut při 70 °C. Čtyři μΐ 5 x RT pufru (250 mM Tris-HCl, pH8,3, 375 mM K.C1,

15 mM MgCl₂; GibcoBRL/Life Technologies, 2 μΙ lOmM dNTP (2,5 mM každého) bylo přidáno do reakční směsi a ta se nechala Ínkubovat 2 min při 42 °C. Reversní transkripce se prováděla v konečném objemu 20 μΐ, do kterého bylo přidáno 200 jednotek reversní transkriptasy (Superscript II, GibcoBRL/Life Technologies). Poté následovala inkubace 60 minut při 42 °C.

Příklad 3: Polymerasová řetězová reakce (PCR)

Všechny PCR reakce, které byly provedeny k určení 3’ a 5’ konců genomu NDV (viz níže) se prováděly za použití Taq DNA polymerasy (Perkin Elmer). Pro klonování jednotlivých genů

NDV nebo velkých subgenomových cDNA se používala buď proofreadingová DNA polymerasa Pwo, nebo směs Taq a Pwo (Expand High Fidelity Kit nebo Expand Long Template Kit), které byly použity dle návodu výrobce (Boehringer Mannheim). Všechny vzorky se inkubovaly po dobu 2 min při 94 °C před startem daného počtu PCR cyklů. Po proběhnutí daného počtu PCR cyklů se vzorky nechaly inkubovat při elongační teplotě nejméně trojnásobek elongačního času PCR cyklu. PCR fragmenty se Čistily pomocí High Pure PCR Product Purification Kit (Boehringer Mannheim) nebo po agarosové elektroforese použitím Qiaexll extrakčního kitu (Qiagen) podle návodu dodaného výrobcem.

Příklad 4: Sekvenační analýza

Všechny sekvence byly určeny za použití PRISm Ready Reaction Dye Deoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer), Reakční směsi (5 μΐ) byly podrobeny 25 cyklům lineární ampli15 fikace (10 s při 94 °C, 5 s při 50 °C a 4 minuty při 60 °C) v termocycleru GeneAmp2400. Následně se reakční směsi srazily ethanolem, jednou promyly 70% ethanolem, resuspendovaly v 15 μΐ TSR pufru (Perkin Elmer) a nechaly se zahřívat 2 min při 94 °C. Poté byly naneseny na automatický sekvenátor Applied Biosystems AB310.

Nukleotidové sekvence primerů použitých k sekvenování kompletního genomu NDV kmene LaSota byly buď převzaty z publikovaných sekvencí, nebo byly přímo navrženy v rámci tohoto sekvenačního projektu. Sekvence primerů je ukázána v tabulce 1.

Příklad 5: Klonování a sekvenování 3’ a 5’ konce genomu NDV kmene LaSota

Nukleotidová sekvenace 3’ a 5’ konců NDV genomu byla provedena pomocí metody RACE (rapid amplification cDNA ends). NDV RNA se podrobila reversní transkripční reakci v konečném objemu 20 μΐ za užití primerů p360 (5 ’-GGCGATGTAATCAGCCTAGTGCTT-3 ’;

nt 14756-14779) který byl odvozen z publikované sekvence L-genu NDV (Yusoff a další, 1987). K jednovláknové cDNA (2,5 μΐ RT směsi) bylo přidáno 8 pmol ukotveného primerů ALG3 (5*— CACGAATTCACTATCGATTCTGGATCCTTC-3’) a směs byla ligována přes noc v pokojové teplotě v 20 μΐ reakční směsi obsahující 50 mM Tris-HCl, pH8,0, 10 mM MgCl₂, lOpg/ml BSA, 25% PEG, 1 mM HCC, 20μΜ ATP a 10 jednotek T4 RNA ligasy (New England Biolab), jak je popsáno Tessierem a dalšími (1986). Jeden μΙ ligační směsi se použil jako templát v PCR reakci pomocí primerů p375 (5’-C AATG AATTC AAAGG ATATTAC AGTAACT-3’: nt 1496414983) a ALG (5’-GAAGGATCCAGAATCGATAG-3’). Poslední primer je komplementární k primerů ALG3. Podmínky PCR (40 cyklů) byly následující: 1 min 94 °C, l min 55 °C a 2 min 72 °C. PCR produkty byly vyčištěny a klonovány do T- vektoru pBluescriptlI-TSK (Ichihara a Kurosawa, 1993). Souběžně na vyčištěné PCR produkty se působilo Klenow DNA polymerasou I, aby se vytvořily tupé konce a byly klonovány do HincII-místa plazmidu pGEM4Z (Promega). Bylo osekvenováno 13 nezávislých klonů (8x pBluesciptlI-TSK a 5x pGEM4Z) a byla tak určena nukleotidová sekvence 5’ konce genomu NDV kmene LaSota.

Nukleotidová sekvence 3’ konce byla určena dvěma nezávislými metodami. V metodě I byl primer ALG3 ligován k 3’ konci virové RNA pomocí T4 RNA ligasy, tak to popisuje Schutze a další (1995). Reakční směs (konečný objem 10 μΐ) obsahovala 2,5 pg NDV RNA, 100 pmol ALG3, 1 μΐ 10 χ T4 RNA ligasového pufru (500 mM Tris-HCl, pH7,8, 100 mM MgCl₂, lOOmM DTT, 10 mM ATP), 1 μΐ DMSO, 1 μΐ 10μΜ hexaminkobaltchloridu, 1 μΐ Rnasin (Promega) a 10 jednotek T4 RNA ligasy (New England Biolabs). Směs se inkubovala přes noc při pokojové teplotě a 5 μΐ ligační reakční směsi bylo použito jako templát v reversní transkripční reakci pomocí ALG4 jako primerů. Jeden μΐ RT- reakce se použil v PCR reakci pomocí primerů ALG4 a p376 (5’-GACCCTTAAGGAGCTOCTCGTACTGATC-3’; nt 137-164), který byl odvozen z publikované sekvence 3’ konce NDV (Ishida a další, 1986). Podmínky PCR reakce i σ byly tytéž, jako bylo popsáno výše pro 5’ RACE. V etodě II 3’ a 5’ konce virové RNA byly ligovány k sobě pomocí T4 RNA ligasy za stejných podmínek, jako je popsáno výše pro metodu I. Pět μΐ ligační směsi bylo použito jako templát v reversní transkripční reakci za užití primeru p360. Jeden μΐ RT- reakce se použil v PCR reakci za použití primerů p375 a p376 a za podmínek

PCR reakce popsaných výše pro 5'RACE. PCR produkty byly ošetřeny Klenow DNA polymerasou I, aby se vytvořily tupé konce a byly klonovány do HincII-místa plazmidu pGEM4Z (Promega). Bylo sekvenováno deset nezávislých klonů (4 z metody I a 6 z metody II), aby byla určena nukleotidová sekvence 3’ konce genomu NDV kmene LaSota.

io

Příklad 6: Konstrukce transkripčního vektoru

Nízkokopiový transkripční vektor byl konstruován pomocí plazmidu pOK12 (Vieira a Messing,

1991) jako základního replikonu. Plazmid pOK12 byl štěpen PvuII a byl izolován DNA fragment obsahující replikační počátek a gen pro kanamycinovou resistenci. Tento DNA fragment se ligová! k Eco47III-AflH fragmentu (AflIÍ fragment nesl po ošetření Klenow DNA polymerasou I tupé konce) pocházejícímu z transkripčního vektoru 2.0 (laskavý dar Dr. Andrew Balla; Pattnaik a další, 1992). Ze vzniklého plazmidu se vyštěpil Xbal-Nhel fragment, tak se eliminovala potřebná restrikční místa. Výsledný plazmid byl označen pOLTV5 (obr. 1). Trans20 kripční vektor pOLTV5 obsahuje T7 DNA dependentní RNA polymerázový promotor následovaný unikátními restrikčními místy Stul a Smál, autokatalytickým ribozymem z hepatitis delta viru (HDV) a transkripční terminační signál z bakteriofága T7. DNA fragmenty, které se klonují mezi restrikční místa Stul a Smál mohou být transkribovány jak in vitro, tak in vivo pomocí T7RNA polymerasy. Po transkripci 5’konec výsledného transkriptu obsahuje dva G zbytky kódované plazmidem. Pomocí autokatalytické funkce ribozymu z HDV, 3’konec transkriptu odpovídá opravdovému koncovému nukleotidu klonovaného DNA fragmentu (Pattnaik a další,

1992) .

Příklad 7: Konstrukce minigenomových plazmidů

Za účelem vyzkoušení požadavků kladených na replikaci a transkripci NDV byly konstruovány minigenomové plazmidy obsahující 3’ a 5’koncové oblasti NDV, které ohraničovaly zobou stran reporterový gen. Tím byly nahrazeny všechny NDV geny (obr. 2). DNA fragmenty odpovídající 3’ a 5’ koncovým oblastem NDV byly vytvořeny pomocí PCR za užití Pwo DNA polymerasy (30 cyklů; 15 s při 94 °C, 30 s při 50 °C a 30 s při 72 °C) za užití plazmidů obsahujících 3’ a 5’ RACE fragmenty jako templáty (viz výše).

3’ oblast (nt 1-119) byla generována užitím primerů 3UIT f5’-ACCAAACAGAGAATCCGT40 GAGTTACGA-3’; nt 1-27) a SEAP3 (S'-ATCGATACTGGTCAGCATGCXGGQNGNNGGCTTTCTCG-3’; nt 102-119). Oblast 5’ (nt 14973-15186) byla připravena použitím primerů SEAP5 (5 '-GCA TGCTGACCA GTA TCGA 7ATTAC AGTAACTGTG ACT-3: nt 14973-14990) a 5NDV (5'-ACCAAACAAAGATTTGGTGAATGACGA-3’: nt 15158-15186). Dva uvedené DNA fragmenty byly použity v překryvové PCR (překryv je v sekvenci primerů vyznačen kurzí45 vou) za použití primerů 3UIT a 5NDV. Výsledné DNA fragmenty, které představují fúzi 3’ a 5’ konce NDV oddělené 20 nukleotidy, byly fosforylovány pomocí T4 polynukleotid kinasy a klonovány v obou orientacích do transkripčního plazmidu pOLTV5 (obr. 1), který byl naštěpen Stul a Smál a defosforylován fosfatasou z telecích střev (Boehringer Mannheim). Nakonec byl štěpením plazmidu pSEAP-Basic (Clontech) enzymy Sphl a Clal získán SEAP-gen (kódující sekreto vanou alkalickou fosfatasu) a poté byl zaklonován mezi místa Sphl a Claí mezi 3’ a 5’ konce NDV. Vzniklé plazmidy byly označeny pOLTV535 a pOLTV553. In vivo a in vitro transkripcí za užití T7 RNA polymerasy z plazmidu pOLTV535 vznikla antigenomová (+) nebo (-) RNA, zatímco z plazmidu pOLTV553 vznikla genomová RNA (-) RNA.

Plazmidy označené pOLTV535NO až N5 a pOLTV5532NO až N5 byly konstruovány insercí ksobě komplementárních nukleotidů v místě Claí umístěných mezi genem SEAP a 5’ koncem NDV v pOLTV535 nebo pOLTV553 (obr. 2). Použité nukleotidové sekvence byly následující: NO, 5’-CGCGAGCTCG-3’; NI, 5’-CGCGAGSCTCG-3’; N2, 5’-CGCGAGCGCTCG-3’; N3,

5’-CGCGAGCWGCTCG-3’; N4, 5’-CGCGAGCATGCTCG-3'; N5, 5’=CGCGAGCASTGCTCG-3’ (W = A nebo T; S = C nebo G).

Příklad 8: Modifikace T7 promotoru v plazmidech pOLTV535 a pOLTV553 io

K přípravě in vitro a in vivo transkriptů obsahujících autentické 5’ a 3’ konce NDV byl modifikován T7 promotor v plazmidu pOLTV535 a pOLTV553 a to tak, že transkripce by měla začít na prvním nukleotidu 3’ nebo 5’ konce NDV. Byly navrženy příměry, které obsahovaly 1) BgHrestrikční místo, 2) sekvencí T7 promotoru (viz sekvence kurzívou), která byla modifikována tak, že dva zbytky G na konci promotoru T7 byly nahrazeny zbytky A a 3) 3’ (nt 1-21) nebo 5’ (nt 15164-15186) zNdv. K vytvoření DNA fragmentů obsahujících modifikovaný T7 promotor a vlastní 3’ konec NDV až k začátku SEAP genu vpOLTV535 byly použity příměry BGL3F2 ^-GATATGGCCATTCAGGCTTAATACGACTCACTATAACCAAÁCAGAGAAICCGTGÁG3’) a SEAP3 (viz výše). Obdobně byly připraveny DNA fragmenty obsahující modifikovaný T7 promotor a vlastní 5’ konec NDV až ke konci genu SEAP v pOLTV553 pomocí primerů BGL5F2 (5'-GA TATGGCCATTCAGGCTTAATACGACTCACTA7ΊACCAAACAAAGATTTGGTGAATG-3’) a SEAP5. Výsledné fragmenty byly naštěpeny BglI a Sphl (3’ konec) nebo BglI a Gal (5’ konec) a byly použity k nahrazení Bgll-Sphl fragmentu v pOLTV535, nebo v BglIClai fragmentu vpOLTV553. Výsledné plazmidy byly označeny pOLTV735 a pOLTV753.

Plazmidy pOLTV735N3 a pOLTV753N3 byly připraveny insercí k sobě kompatibilního oligonukleotidu (5’- CGCGAGCWGCTCCG-3’; W = A nebo T) do místa Gal umístěného mezi genem SEAP a 5’ koncem NDV v pOLTV735 a nebo pOLTV753.

Příklad 9: Konstrukce SEAP reportérových plazmidů

Plazmid pCIneoSEAP byl konstruován klonováním Xhol-Clal fragmentů (Gal místo bylo zastoupeno užitím Klenow DNA polymerasy I) obsahujících SEAP gen z plazmidu pSEAP-Basic (C lontech) mezi Xhol a Smál místa eukaryotického expresního vektoru pCIneo (Promega).

Posledně jmenovaný plazmid obsahuje k promotoru z bakteriofága T7 ještě přidaný promotor lidského cytomegaloviru (hCMV). K ověření a kvantifikaci SEAP exprese transkriptů generovaných pouze za účasti promotoru T7 byl sestrojen další plazmid, ve kterém chyběl promotor z hCMV. HCMV promotor byl odstraněn z plazmidu pCIneo parciálním štěpením HindlII následujícím kompletním štěpením BgJII. Fragment DNA (nt 756-5469 dle číslování Clontech), ze kterého byl hCMV promotor vyštěpen, byl vyizolován a pomocí působení T4 DNA polymerasy byly vytvořeny tupé konce a plazmid se recirkularizoval použitím T4 DNA ligasy. Výsledný plazmid byl označen pCIneoD. Nakonec se znovu získal gen SEAP z pSEAP-Basis, a to jako fragment MluI-AccI a byl klonován do pCIneoD mezi místa Mlul a Claí. Výsledný plazmid byl označen pCIneoD SEAP.

Příklad 10: Transfekce

Buňky byly vysety do 24-jamkových destiček, nechaly se růst přes noc do 60 až 80% nárůstu.

Poté byly infikovány v m.o.i. z 1 FPV-T7 po dobu jedné hodiny při 37 °C. Buňky byly transfekovány 0,5 μ§ minigenomové plazmidové DNA za použití 3 μΐ LipofectAMINE a OptiMem přesně tak, jak doporučuje výrobce (GibcoBRL/Life Technologies). Po čtyřhodinové inkubaci (CER buňky) nebo po 16 hodinách (QM5 buňky) při 37 °C buňky byly buď infikovány NDV (Holandský virulentní izolát č. 152608; 200 μΐ na jamku) v m.o.i. z 5, nebo byly nechány neinfi.10.

kovány. Inokulum se odsálo a nahradilo se 1 ml kompletního média. Buňky se dále inkubovaly při 37 °C.

Pro konfrontaci se buňky nechaly růst v šestijamkových kultivačních deskách a byly infikovány

FPV-T7 tak, jak bylo popsáno výše. Buňky byly kotransfekovány 0,25 pg minigenomové plazmidové DNA, 0,4 pg pCIneoNP, 0,2 pg pCIneoL(c) nebo pCIneo, buď za použití 8 pl LipofectAminu nebo 9 pl FuGene 6 (Boehringer Mannheim). Za účelem získání infekčního viru byl minigenomový plazmid vyměněn za plazmid transkripční obsahující celkovou cDNA NDV.

io

Příklad 11: Kvantifikace aktivity SEAP

Množství SEAP, které bylo sekretováno do média transfekovaných buněk se měřilo v 96-jamkových deskách najedno použití pomocí kitu Phospha-Light Chemiluminescent Reportér Assay pro sekretovanou alkalickou fosfatasu, a to dle návodu výrobce (Tropix).

Chemiluminiscence se kvantifikovala použitím kapalného scintilátoru (Wallac 1450 microbeta PLUS).

Příklad 12: Klonování a sekvenování cDNA zahrnujících vlastní genom NDV kmene LaSota

Za účelem klonování a sekvenací vlastního genomu NDV kmene LaSota byly připraveny klony velkých subgenomových cDNA pomocí RT PCR ajejich klonování do pGEM-T. První vlákno pro cDNA syntézu bylo připraveno použitím 3UIT primeru, tak jak je to popsáno v předchozím textu. Jeden pl RT reakční směsi byl použit pro PCR reakci zad Long Template PCR kitu (Boehringer Mannheim). PCR se skládala z 5 cyklů po 10 s při 94 °C, 30 s při 58 °C a 6 min při 68 °C, následovaných 10 cykly po 10 s při 94 °C, 30 s při 58 °C a 6 min při 68 °C, při kterých byl čas pro elongaci při 68 °C v každém následném cyklu o 20 s delší. PCR fragmenty byly klonovány do pGEM-T za použití pGEM-T klonovacího kitu a to přesně dle návodu dodavatele (Promega). Ligační směsí byly transformovány buňky E. coli kmene SURE II (Stratagene). Byly provedeny dvě nezávislé RT-PCR reakce (A a B) a výsledkem obou byla podobná sada cDNA klonů. Nukleotidová sekvence subgenomových klonů cDNA se určila pomocí NDV specifických prímerů (tabulka 1) a pomocí primerů ohraničujících inserty. Po porovnání nukleotidových sekvencí sérií klonů z A a B, zbývající nejasnosti byly vyřešeny sekvenováním důležitých oblastí pomocí třetí nezávislé série cDNA (C sérií). Nukleotidová sekvence NDV kmene LaSota je ukázána na obrázku 3.

Příklad 13: Konstrukce klonu obsahující úplnou genomovou cDNA NDV

Úplná genomová cDNA NDV byla generována v transkripčním plazmidu pOLTV5 za použití pOLTV535 jako počátečního plazmidu. Fragmenty DNA byly řazeny v překryvech za užití běžných restrikčních enzymů, tak jak je naznačeno na obrázku 4B, V sérii kroků byl sestrojen plaz45 mid (označený p535-Dl) obsahující nukleotidy 1 až 3521 a 12355 až 150186, který byl oddělen Clal místem, které bylo vytvořeno přidáním Clal míst v pozicích 3521 a 12335. V další sérii klonovacích kroků byl vytvořen plazmid (označený pGEM-B), který obsahoval část NDV genomu včetně nukleotidů 3521 až 12355 (Clal-fragment). K usnadnění klonování byl na posledně jmenovaný Clal-fragment připojen gen nesoucí resistenci k chloramfenikolu (Cm) z plazmidu pACYC184 (Chang a Cohen, 1978), K tomuto konci byl Cm-gen přidán z ACYC184 pomocí PCR za užití primerů CAT-F (5’-GCGTACGTCTAGACTGGTGTCCCTGTTGATACCGG-3’) a CAT-R (5’-GCTCTAGACGTACGACCCTGCCCTGAACCGACG-3’)· CR byla prováděna pomocí Pwo DNA polymerasy a sestávala z 30 cyklů po 30 s při 94 °C, 45 s při 60 °C a 60 s pří 72 °C. Vzniklý PCR fragment byl štěpen BsiWI a klonován do specifického místa BsiWI v pGEM-B, Čímž vznikl pGEM-B(CAT). Fragment Clal z pGEM-B(CAT) byl klonován do specifického místa Clal místa v p535-DI, čímž vznikl pNDFL (CAT). Nakonec byl vyštěpen enzymem BsiWI z tohoto plazmidu Cm gen, následovala nová ligace a transformace E. coli kmene DH5a. Vzniklý plazmid byl označen pNDFL+ a obsahoval cDNA sekvenci vlastní NDV, klonovanou mezi T7 promotor a HDV ribozym v transkripčním plazmidu pOLTV5.

Příklad 14: Klonování a exprese jednotlivých NDV genů

DNA fragmenty obsahující NDV LaSota geny byly připraveny pomocí RT-PCR a klonovány do ío pCIneo. Po klonování byly všechny fragmenty sekvenovány pomocí příměrů ohraničujících inserty a pomocí gen specifických příměrů.

NP-gen: Primer 386 (5'-GAGCAATCGAAGTCGTACGGGTAGAAGGTG-3’: nt 40-69) byl použit pro reversní transkripci. Primery 365 (5 ’-GTGTGAATTCCGAGTGCG AGCCCGAAG15 3’; nt 77-94) a 892 (5’-TTGCATGCCTGCAGGTCAGTACCCCCAGTC-3'; nt 1577-1593) byly použity pro PCR za použití Pwo DNA polymerasy. Vzniklé DNA fragmenty byly naštěpeny EcoRI a klonovány do pCIneo mezi místa EcoRI a Sami. Byl použit následující PCR profil (30 cyklů); 30 s při 95 °C, 40 s pří 65 °C a 45 s 72 °C. Pro reversní transkripci byl použit primer. Pro reversní transkripci byl použit primer při EcoRI a Sami. Exprese NP byla ověřena v imuno20 peroxidasovém jednovrstvém testu (IPMA) tak, jak je popsáno Peetersem a dalšími (1992) za užití monoklonální protilátky 38 (Russell a další, 1983).

P-gen: Pro reversní transkripci byl použit primer pRTl (5 ’-C AAAGAATTC AG AAAAAAGTACGGGTAGAA-3’: nt 1794-1814). Primeiy pRTl ap2 (5’-GC AGTCTAGATTAGCCATTC25 ACTGCAAGGCGC-3’; nt 3053-3071) byly použity pro PCR za užití Pwo DNA polymerasy. Byl použit následující PCR profil (30 cyklů); 30 s při 95 °C, 40 s při 65 °C a 60 s při 72 °C. Vzniklý DNA fragment byl naštěpen EcoRI a Xbal a klonován do pCIneo mezi místa EcoRI a Xbal. exprese P proteinu byla ověřena v imunoperoxidasovém jednovrstvém testu (IPMA) za užiti monoklonální protilátky 688 (Russell a další, 1983).

M-gen: Pro reversní transkripci byl použit primer 3UIT (5’-ACC AAAC AGAG AATCCGTG AGTTACGA-3’; nt 1-27). Primeiy NDV5M (5’-GGGTGCTAGCGGAGTGCCCC A ATTGTGCCAA-3’: nt 3268-3288) a NDV3M (5’-TCTCCCCGGGGCAGCTTTAATTTCTTAAAAGGAT-3’; nt 4368-4389) byly použity pro PCR za užití Expand High Fidelity kitu. Byl použit nás35 ledující PCR profil: 10 cyklů po 15 s při 95 °C, 30 s při 55 °C a 2 min při 68 °C, následováno 15 cykly, ve kterých byl elongační čas při 68 °C zvyšován v každém následném cyklu o 20 s. Vzniklý DNA fragment byl ošetřen T4 DNA polymerasou, aby se vytvořily tupé konce, naštěpen Nhel a klonován do pCIneo mezi místa Nhel a Smál. Exprese M proteinu byla ověřena v imunoperoxidasovém jednovrstvém testu (IPMA) za užití monoklonální protilátky 424 (Russell a další, 1983).

F-gen: Pro reversní transkripci byl použit primer 3UIT (viz výše). Primery NDV5F (5-ACGGGCTAGCGATTCTGGATCCCGGTTGG-3’; nt 4508-4526) a NDV3F f5’-ACTACCCGGGAAACCTTCGTTCCTCAT-3’; nt 6212-31) byly použity pro PCR reakci za použití Expand High Fidelity kitu a za podmínek zmíněných výše pro M-gen, Výsledný DNA fragment byl za použití

T4 DNA polymerasy zatupen, poté naštěpen Nhel a klonován do pCIneo mezi místa Nhel a Smál. Exprese F proteinu byla ověřena v imunoperoxidasovém jednovrstvém testu (IPMA) za užití monoklonální protilátky 8E12A8C3 (ID-DLO, oddělení ptačí virologie).

HN-gen: Pro reversní transkripci byl použit primer 3 UIT (viz výše). Primery NDVHN (5*—

GTAGGCTAGC AAGAGAGGCCGCCCCTC AAT-3’: nt 6535-6354) a NDVHN (5’CGAGCCCGGGCCGGC ATTCGGTTTGATTCTTG-3’: nt 8205-8227) byly použity pro PCR reakci za použití Expand High Fidelity kitu a za podmínek zmíněných výše pro M-gen. Výsledný DNA fragment byl za použití T4 DNA polymerasy zatupen, poté naštěpen Smál a klonován na tupo (Klenow DNA polymerasa) do pCIneo mezi místa Nhel a Xmal. Exprese HN proteinu byla ověOl řena v imunoperoxidasovém jednovrstvém testu (IPMA) za užití monoklonální protilátky 86 (Russell a další, 1983),

L-gen: L gen byl získán z cDNA klonu pGEM-L7a (obrázek 4A) štěpením SacII a Sall. Před štěpením Sáli bylo Sací místo zatopeno užitím T4 DNA polymerasy. Výsledný fragment byl klonován do pCIneo mezi zatopená (Klenow DNA polymerasa) místa Nhel a Sall. 5’ nepřekládaná oblast mezi T7 promotorem a ATG startovním kodonem L-genu obsahuje dva ATG kodony mimo rámec, které by mohly interferovat se správnou expresí L proteinu. Proto byl zkonstruován nový plazmid, ve kterém chybí první ATG a ve kterém druhý ATG byl zaměněn za AAG pomocí i o PCR mutageneze tak, jak je popsáno dále.

Příměry 5LE(E)

5’-CAATGGAATTCAAGGCAAAACAGCTCA4GGTAAATAATACGGG-3*; nt 8332-8374) a 3LE(B) 5~-GTGAATCTAGAATGCCGGATCCňTACGAATGC-3~: nt 8847-8870) byly použity v PCR reakci užitím plazmidu pGEM-L7a (obrázek 4) jako templátu.

Za užití Pwo DNA polymerasy. Byl použit následující PCR profil (30 cyklů); 30 s při 94 °C, 45 s při 60 ^qC a 60 s při 72 °C. Vzniklý DNA fragment byl štěpen EcoRl a Xbal a klonován do pCIneo mezi místa EcoRl a Xbal za vzniku plazmidu pCIneoL(N). Následně fragment BsiWlSall z pGEM-L7a, který obsahuje zbývající část genu L (nt 8852-1046) byl klonován do pCIneoL(N) mezi místa BsiWI a Sall, čímž vznikl plazmid pCIneo(C). Protože nebyly k dispozici protilátky proti L-proteinu, nemohla být exprese L-proteinu ověřena imunologicky.

Příklad 15: Vložení genetické značky (tag) do F-genu

K jednoznačnému důkazu, že infekční virus byl připraven z úplné virové cDNA, byla pomocí PCR mutageneze do genu F vložená genetická značka. K tomuto účelu byl F-gen klonován pomocí dvou překrývajících se fragmentů. První PCR fragment byl vytvořen užitím primerů NDV5F (viz výše) a primeru F5R (S^/ÍTdGCGCCGCTGrCTCCrCCCTCCAGA I GTAGTCAC—3'; nt 4859-4894). Zbytky, které jsou uvedeny točně, vyznačují změny, které byly zavedeny do primeru k záměně aminokyselinové sekvence proteolytického štěpného místa mezi Fl a F2 známého z kmene LaSota NDV (GGRQGR/L) za konsenzuální štěpné místo pro virulentní NDV kmeny (GRRQRR/F). Druhý PCR fragment byl připraven užitím primerů F3F (5'-~GGAGG.4G.1CáGCGGCGC77TATAGGCGCGATTATTGG-3'·. nt 4875-4911) a IVO9 (5'^CTCTGTCGACACAGACTACCAGAACTTTCAC-3': NT 6246-6266). PCR byla provedena za užití Pwo DNA polymerasy. Byl použit následující PCR profil: 25 cyklů po 15 s při 94 °C, 30 s při 55 °C a 2 min při 72 °C. Ve druhé PCR byly použity dva překrývající se fragmenty (překryv je v sek40 věnci primerů vyznačen kurzívou). Byly použity příměry NDV5F a IVO9 za stejných PCR podmínek. Vzniklý fragment, který obsahoval vlastní ORF pro F gen a který kódoval konsenzuální sekvenci štěpného místa virulentního kmene, byl štěpen Nhel a Sall a klonován do pCIneo mezi místa Nhel a Sall, čímž vznikl pCIneoF'*¹. Fragment Stol-Notl (nt 4646-4952) z pč'IneoF^wt byl použit k nahrazení odpovídajícího fragmentu v plazmidu p535-S, který byl konstruován insercí Clal-Scal (nt 3521-10311) zpGEM-B vp535-Dl mezi Clal a Seal místa (viz obrázek 4C). Vzniklý plazmid byl označen p535-S (T^wt c). Fragment PCR obsahující gen pro cm-resistenci zpACYC184 (viz výše) byl klonován jako Xbal fragment do specifického místa Xbal (pozice 6172 v NDV sekvenci) plazmidu p53 5-S (F^wt c), vznikl plazmid p535-S(F^w’ c)cm.

Následně Cm-značený Apal-Spel fragment (nt 2285-8094) tohoto plazmidu byl použit k nahrazení korespondujícího fragmentu úplného cDNA klonu pNDFL+. Nakonec cm-gen byl vyštěpen z tohoto plazmidu enzymem Xbal, potom následovala recirkularizace použitím T4 DNA ligasy. Vzniklý plazmid, který obsahoval geneticky pozměněný úplný klon NDV cDNA, byl označen pNDFL+tF¹).

Příklad 16: Příprava stabilních transformovaných buněčných linií, které exprimují jednotlivé NDV geny

Plazmidy pCIneoNP, pClneoP, pCIneoM, pCIneoF, pCIneoF*¹ a pCIneoNH byly užity pro přípravu stabilních transformovaných linií, které jednotlivě exprimují tyto proteiny. Den před transfekci se CER buňky vysely na kultivační misky a nechaly se růst přes noc do nárůstu 60 až 80 % plochy. Buňky se transfekovaly 2 μΐ LipofectAminu a OptiMem tak, jak je to popsáno výrobcem (GibcoBRL/Life Technologies). Po 48 hodinách byly buňky ošetřeny trypsinem a byly io vysety v ředěních na 10 cm kultivační misky v médiu obsahujícím 500 pg/ml G418 (Boehringer Mannheim). Každé tři dny bylo médium vyměněno za čerstvé obsahující vždy při každé další výměně o 100 pg/ml více G418 dokud se nedosáhlo koncentrace 800 μg/ml. Buňky byly drženy v médiu obsahujícím jednotlivé kolonie a přenášely se do 96-jamkových kultivačních desek. Klonované buněčné linie byly zkoušeny na expresi určitých genů NDV pomocí IPMA tak, jak to bylo popsáno pro transietní expresi.

Buněčné linie, které trvale exprimovaly NP, P, M nebo F se identifikovaly a izolovaly. Tímto postupem bylo však nemožné generovat buňky, které exprimovaly HN protein. Snad proto, že HN je toxický pro buněčnou kulturu.

Příklad 17: Příprava stabilních transformovaných buněčných linií, které exprimují T7 RNA polymerasu

Gen kódující T7 RNA polymerasu byl získán z plazmidu pRT7NT (René van Gennip, ID-DLO, Oddělení živočišné virologie) pomocí štěpení EcoRI a Sall. Výsledný fragment obsahuje T7 RNA polymerasový gen umístěný za bakulovirovým plO promotorem, DNA fragment byl klonován do plazmidu pCIneoO mezi EcoRI a Sall místa, čímž vznikl plazmid pCIneo!07. Plazmid pCIneoO nemá T7 promotor a je odvozen od pCIneo štěpením Nhel a následujícím částečným štěpením Seal, doplněním lepivých konců pomocí Klenow DNA polymerasy a recirkulaci za užití T4 DNA ligasy, Bakulovirové sekvence byly získány zpCIneol07 štěpením EcoRI a PacI, následujícím ošetřením T4 DNA polymerasou k vytvoření tupých konců a recirkularizací. Vzniklý plazmid byl označen pCIneo007. Exprese T7 RNA z polymerasy se ověřila kotransfekcí buněk pCIneo007 a pPRhOl. Posledně jmenovaný plazmid obsahuje E2 protein kla35 sického viru prasečího moru klonovaný za T7 promotor a obsahující vnitřní ribosomové vstupní místo (René van Gannip, osobní sdělení). Exprese E2 byla určena pomocí IPMA s monoklonální protilátkou V4 (Wensvoort a další, 1986). Stabilně transformované CER linie exprimující T7 RNA polymerasu byly připraveny a izolovány dle postupu uvedeného výše, výjimku tvoří misky o průměru 10 cm, kde byly pěstovány buňky transfekované 5 pg pCIneo007DNA a 25 μΐ

LipofectAminu. K ověření exprese T7 RNA polymerasy u individuálních buněčných linií, byly linie transfekovány plazmidem pPRhOl a byla určována exprese E2 (která je závislá na T7 RNA polymerase) pomocí IPMA a monoklonální protilátky V4. Bylo identifikováno několik buněčných linií, které exprimovaly T7 RNA polymerasu. Jedna buněčná linie, označená CER-C9 byla užita pro další pokusy.

Příklad 18: Klonování a exprese HN genů a hybridních HN genů

K syntéze jednovláknových cDNA NDV byl užit primer 3UIT pro ptačí paramyxovirus sérotypu

2 a 4 (APMV2 a APMV4) jak je popsáno výše. Všechny následné PCR reakce byly provedeny za užití následujícího schématu: 25 cyklů po 15 s při 94 °C. 30 s při 55 °C a 2 min při 72 °C. Vlastní kódující oblast HN-genu zAPMV2 byla získána pomocí PCR za použití primerů IVO3 (5’GGGGGAATTCCCCATTCAATGAAGGGTCTAC-3’) a IV05 (S’-GATCCCCGGGTCTTAAACCAGGCTTCGCAATG-3*), které byly odvozeny zNH genu APMV2 (přírůstkové číslo v GenBank Dl4030). Vlastní kódující oblast HN-genu z APMV4 byla získána pomocí PCR za použití příměrů IVO6 (5 ’-GGGGG AATTCTGGTAGGGTGGGG A AGGTAGC-3 ’) a IVO8 (5ATTGCCCGGGGGGTAACTAATCAGGATCTCAG-3’), které byly odvozeny zNH genu APMV4 (přírůstkové číslo vGenBank D14031). Vzniklé PCR fragmenty byly štěpeny (buď přímo nebo po subklonování do pGEM-T) pomoci EcoRJ a Xmal a klonovány do pICneo mezi místa EcoRJ a Xmal. Vzniklé plazmidy byly označeny pCIneoHN2 a pCIneoHN4.

Hybridy mezi geny HN z NDV kmene LaSota s HN geny z APMV2 a 4 byly konstruovány pomocí překrývajících se PCR, jak je popsáno dále. N-koncová část (aal-141) z HN genu NDV kmene LaSota byly amplifikovány pomocí Pwo DNA polymerasy za použití primerů IVO1B (5’io GTAGGAATCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3’; nt 6325-6354) a IV10 &-AATGAGTTCTTTGCCTATCCCCCC-r: NT 6811-6834). C-koncová část HN genu APMV2 (aal42-580) byla amplifikována pomocí Pwo DNA polymerasy za užití primerů 1V11B (5^-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTCAAGGAGATGCATCTGCAGGC~y} a IV05. Vzniklé PCR fragmenty byly spojeny v překryvové PCR (překryv je vyznačen kurzívou) s užitím primerů IV01B a IV05 pomocí Expand High Fidelity enzyme směsi. Výsledný PCR fragment byl naštěpen (buď přímo nebo po subklonování do pGEM-T) enzymy EcoRI a XmaJ a klonován do pCIneo mezi místa EcoRI a Xmal. Výsledný plazmid, který obsahoval hybridní gen HN sestávající zaal až 141 z NDV a aal42-590 z APMV2 byl označen jako pCIneoHN 1/2¹

C-koncová část HN genu zAPMV4 (aal43-569) byla amplifikována pomocí primerů IV14B (5 ^,-GGGGGG^L4GGCXLJGAJCrCJ77GTAGATGCATCTGCAGGCCTAAATTTCC-3 ’) a IV08. Tento fragment byl připojen k N-koncové části genu HN z NDV (viz výše) v překryvové PCR pomocí primerů IV01B a IV08. Vzniklý PCR fragment byl naštěpen buď přímo nebo po subklonování do pGEM-T) enzymy EcoRI a Xmal a klonován do pCIneo mezi místa EcoRI a Xmal. Výsledný plazmid, který obsahoval hybridní gen HN sestávající zaal až 141 z NDV aaai42 až 590 zAPMV4 byl označen jako pCIneoHNl/4¹⁴¹. V analogii s konstrukcemi popsanými výše byly sestrojeny HN geny, které sestávaly zaal až 143 z NDV a aal44 až 580 z APMV2, nebo aal až 143 z NDV a aal45 až 569 z APMV4. Pro tyto konstrukce byly získány PCR fragmenty, které byly získány pomocí následujících dvojic primerů; NDV aal až 143, primer IV01B a IV13 (5 -ATCTACAATGAGTTCTTTGCCTATC-3 ’: nt 6816-6840; V2 aal44590, primer IV14B (y-GGGGGGATAGGCAAAGAACTATTGTAGATGATGCATCTGCAGGCCTAAATTTCC-3’) IV05; APMV4 aal45-569, primer IV15B (y-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTGTAGATCAAACAGCTGACTACACAGCAG-y) a IV08. Výsledné PCR fragmenty byly naštěpeny (buď přímo nebo po subklonování do pGEM-T) enzymy EcoRI a Xmal a klonovány do pCIneo mezi místa EcoRI a Xmal. Výsledné plazmidy byly označeny jako pCIneoHN 1/2¹⁴³ a pCIneoHNl/4¹⁴³. K potvrzení exprese proteinů HN byly infikovány CER nebo QM5 buňky FPV-T7 po dobu jedné hodiny vm.o.i. z 1, transfekovány plazmidy pCIneoHN, pCIneoHN2, pCIneoHN4, pCIneoHN 1/2^l4! pCIneoHN 1/2¹⁴³, pCIneoHNl/4¹⁴¹, pCIneoHN 1/2¹⁴³ pCIneoHN 1/4¹⁴³ a 24 hodin po transfekcí byly monomolekutámí vrstvy převrstveny 1% suspenzí kuřecích erytrocytů v PBS po dobu 45 min při pokojové teplotě. Následně byly vrstvy pečlivě třikrát promyty PBS a mikroskopicky zkoumána adheze erytrocytů k trasfekovaným buňkám. K průkazu indukce buněčné fúze po koexpresi HN a F proteinu, CER nebo QMS buňky byly kotransfekovány pCIneoHN 1, pCIneoHN2, pCIneoHN4, pCIneoHNl/2¹⁴¹ pCIneoHN 1/4 , pCIneoHN 1/2¹⁴³ pCIneoHN 1/4¹⁴³. Po inkubaci trvající 2 až 3 dny, monomolekulámí vrstvy byly promyty PBS, barveny 15 min roztokem Giemsa (ředěni 1:30 ve vodě) a prohlédnuty mikroskopicky.

Příklad 19: Klonování hybridních genů HN do úplné genomové NDV cDNA

Do plazmidu pGEM-T (Promega) byl vložen syntetický linker, označený HN12, mezi místa pro Notl a Spěl. Bylo to provedeno pomocí oligonukleotidů HN12a (5’-CTAGTAAGTCGTTAACTCTAGAATATGC-3’) a HN12b (5’-CTAGTAAGTCGTTAACTCTAGAATATGC-3’). Syntetický linker označený HN14 byl vložen mezi restrikční místa Notl a Spěl v pGEM-T za užití olygonukleotidů HN14a (5’-GGCCGCATATTCTAGAGTTAACGA-3’) a HN14b (5’-CTAGCZ 300760 B6

TCGTTAACTCTAGAATATGC-3’). Vzniklé plazmidy byly označeny pGEM-HN12 a pGEMHNI4. Tyto plazmidy byly naštěpeny enzymy Notl a Xbal a použity ke klonování Notl-Spel fragmentu (nt 3390-7488) zplazmidu pSSó-SíF^cJCm. Vzniklé plazmidy byly označeny pGEM-HNl/2NS a pGEM-HNl/4NS. HN geny v těchto plazmidech byly nahrazeny hybridními

HN geny z plazmidů pCIneoHN 1/2¹⁴³ a pCIneoHNl/4¹⁴³ (viz kapitola: Klonování a exprese HN genů a hybridních HN genů). Dále byly plazmidy pCIneoHNl/2¹⁴³ a pCIneoHNl/4¹⁴³ naštěpeny Nhel a Smál a výsledné fragmenty (obsahující hybridní geny HN1/2¹⁴³ a HN1/4¹⁴³) byly klonovány mezi místa Nhel a Hpal plazmidů pGEM-HNl/2NS a pGEM-HNl/4NS, kdy vznikly plazmidy pGEM+HN12 a pGEM+HN14. Posledně jmenované plazmidy byly použity k zavedení io hybridních HN genů do klonu obsahujícího úplnou genomovou cDNA NDV. Plazmidy pGEM+HN12 a pGEM+HN14 byly štěpeny Notl a Spěl a fragment obsahující buď gen HN12 nebo HNI4 byl použit pro nahrazení odpovídajícího fragmentu pNDFL+. Takto vznikl pNDFL+HNl/2¹⁴³ Cm nebo pNDFL+HNl/4¹³ Cm. Cm gen byl odstraněn z plazmidů štěpením Xbal následovaným recirkularizací pomocí T4 DNA ligasy. Za účelem vyhovění pravidlu šesti, byl v těchto plazmidech mezi specifické místo Spěl vložen linker, a to pomocí komplementárních oligonukleotidů. Linker H2 (5’-CTAGCGAGCGCTCG-3’) byl vložen do plazmidů pNDFL+HNl/2¹⁴³ a linker H3 (5’-CTAGCGAGCWGCTCG-3’) byl vložen do plazmidů pNDFL+HNl/4¹⁴³, čímž vznikly plazmidy pNDFL+HNl/2¹⁴³ (H2) a pNDFL+HNl/4¹⁴³ (H3).

Příklad 20: Eliminace specifického epitopů v HN proteinu NDV kmene LaSota

Specifický epitop, to je aminokyseliny 346 až 354 (PDEQDYQ1R), v HN proteinu NDV kmene LaSota, který je rozpoznáván monoklonální protilátkou MAb4D6 (Long a další, 1986; Meule25 mans a další, 1986) byl eliminován nahrazením této sekvence odpovídající sekvencí pro HN proteiny z APMV-2 (NRTDIQQTI) nebo APMV-4 (PDPLQDQIL). K tomuto účelu byl užit plazmid pCIneoHN (viz kapitola: Klonování a exprese jednotlivých NDV genů) jako templát k vytvoření překryvových PCR fragmentů. Pro sekvenci APMV-2 byl první PCR fragment generován pomocí příměrů IV01 (5’-GTAGACGCGTAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3’) a příměru 3HN2 (5 ’-GATAGTTTGCTGTATATC AGTCCGATTGCATGTGTC ATTGTATCGCTTGTATATCAC-3’. Druhá PCR byla povedena pomocí příměrů 5HN2 (5-AATCGGACTGATATACAGCAAACTATCATGGCCAAGTCTTCGTATAAGCCTGG-AGCC-3’) a NDV3HN (5’-CGAGCCCGGGCCGGCATTCGGTTTGATTCTTG-3’). Výsledné fragmenty byly spojeny a použity jako templát pro třetí PCR pomocí příměrů IV01B (5’-GTAGGAATTCAAGAGAGGCCGCCC35 CTCAAT-3’) a primeru NDV3-HN. Pro sekvenci APMV-4 byla první PCR realizována pomocí prímeru IV01 a primeru 3HN4 (5’-TAAGATCTGATCTTGCAGCGGTTCAGGGCATGTGTCATTGTATCGCTTGTATATCAC-3’). Druhá PCR byla udělána pomocí příměrů 5HN4 (5’CCTGACCGCTGCAAGATCAGATCTTAATGGCCAAGTCTTCGTATAAGCCTGGAGCC3’)aNDV3-HN.

Výsledné fragmenty byly kombinovány a užity jako templát pro třetí PCR za užití příměrů IV01B a NDV3-HN. Příměry 3HN2/5HN2 a 3HN4 jsou částečně komplementární a obsahují genetické kódy buď pro HN2 sekvenci (NRTDIQQTI) a nebo HN4 sekvenci (PDPLQDQIL). PCR reakce se prováděla s kitem Expand Long Template PCR kit (Boehringer-Mannheim). Byl užit následující PCR profil: 30 cyklů, 10 s při 94 °C, 30 s při 58 °C a 2 min při 68 °C, následováno jedním cyklem 4 min při 68 °C. Vzniklé PCR fragmenty byly štěpeny EcoNI a Bsu36I a klonovány do pCIneoHN mezi místa EcoNI a Bsu36I za vzniku plazmidů označeného buď pCIneoHN l(HN2e) nebo pCIneoHN l(HN4e).

Studovaná transietní exprese naznačila, že modifikované HN proteiny se správně exprimovaly a byly transportovány k povrchu buňky, což bylo potvrzeno studiemi za užití hemadsorpce kuřecích erytrocytů.

Co více, MAb6D4, která reaguje specificky s lineárním epitopem HN z NDV a jejíž epitop se skládá z (nebo alespoň obsahuje aminokyseliny 346 až 354) nereagovala s modifikovanými HN proteiny.

Plazmidy pCIneoHNl(HN2e) a pCIneoHNl(HN4e) byly štěpeny Narl a Spěl a fragmenty obsahující modifikované HN geny byly klonovány mezi Narl a Spěl místa pGEM-HNl/2NS apGEM-HNl/4NS. Výsledné plazmidy, označené jako pGEM-HNl(HN2e) a pGEMHNl(HN4e) byly naštěpeny Notl a Spěl a užity k nahrazení Notl-Spel fragmentu vpNDFL+. Výsledné plazmidy byly označeny pNDFL-HN(HN2e)Cm a pNDFL-HN(HN4e)Cm. Gen Cm ío byl z těchto plazmidů odstraněn digescí Xbal následovanou novou ligací. Výsledné plazmidy byly označeny pNDFL-HN(HN2e) a pNDFL-HN(HN4e).

Nukleotidová sekvence 3’ a 5’ konců genomu NDV kmene LaSota

Byla publikována odvozená sekvence 3’ konce genomu NDV (Ishida a další, 1986), ale pro jiný kmen NDV (D26), než byl užit v předloženém vynálezu (LaSota). (Yusoff a další, 1987) publikovali sekvenci genu L a relativně velké nekódující oblasti ležící ze L-genem z NDV kmene Beaudette C. Avšak, tato sekvence nezahrnuje celý 5’ konec virového genomu, což způsobuje, že nelze generovat celou kopii infekční virové částice NDV. 3’ a 5’ konce genomu u virů s geno20 mem složeným z jednovláknové RNA s negativní orientací plní klíčovou roli v replikaci a transkripci (Lamb a Kolakofsky, 1996). Tak, k přípravě klonu s úplnou cDNA pro NDV, ze kterého by šla připravit infekční virová částice pomocí reversní genetiky (Conzelmann, 1996), se musí použít virový genom obsahující úplné 3’ a 5’ konce. Proto jsme pomocí RACE postupu (Rapid amplification of cDNA ends) určili přesné nukleotidové sekvence obou konců (3’ a 5’) virové

RNA pro NDV kmene LaSota. 5’ konec byl získán pomocí PCR po ligací jednovláknového ukotvovacího primeru (ALG3) do jednovláknové cDNA, která byla získána pomocí reversní transkripce 5’ konce genomové RNA. Pomocí primeru (ALG4), který je komplementární k ukotvovacímu primeru a dalšího primeru specifického k NDV byly generovány PCR produkty, které obsahovaly 5’ konec.

Ke klonování 3’ konce NDV byl jednovláknový ukotvovací primer ALG3 ligován k 3’ konci virové RNA pomocí T4 RNA ligasy a amplifikován pomocí PCR za užití primeru ALG4 a primeru specifického k NDV (metoda I). Alternativní postup přípravy zahrnoval ligací 5’ a 3’ konců NDV RNA k sobě pomocí T4 RNA ligasy a výsledná konkatenovaná RNA byla užita pro RT35 PCR pomocí NDV specifických primerů, které ohraničovaly lígační produkt (metoda II). 3’ a 5’ RACE produkty byly klonovány do T vektoru pBluescriptlI-TSK (Ichihara a Kurosawa, 1993) nebo do pGEM4Z. Několik nezávislých klonů se vyizolovalo a sekvenovalo. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2. K usnadnění přímého srovnání sekvencí 3’ a 5’ konců, sekvence jsou uvedeny ve formě DNA a 3’ konec genomového vlákna je reprezentován jako 5’ konec antigenomového vlákna. Na úrovni genomové RNA sekvence 3’konce lze číst 3’-UGGUUUGUCUCUUAG, zatímco sekvence 5’ konce je UUUAGAAACAAACCA-5’. Sekvence 3’ konce je velmi podobná publikované 3’ koncové sekvenci NDV kmene D26 (Ishida a další, 1986). Avšak sekvence 5’ konce ukazuje, že NDV kmen LaSota obsahuje ve srovnání s uveřejněnou sekvencí L-genu NDV kmene Beaudette C (Yusoff a další, 1987) 64 přidaných nukleotidů (obrázek 6).

Replikace minigenomu NDV pomocí pomocného viru

K určení, zda jsou 3’ a 5’ konce funkční v procesu replikace a transkripce, byly konstruovány minigenomy, které sestávaly z 3’ konce NDV (nt 1-119), reportérového genu sekretujícího alka50 lickou fosfatasu (SEAP), 5’ konce NDV (nt 14973-15186) (obrázek 2).

Tyto minigenomy byly klonovány v obou orientacích do transkripčního vektoru pOLTVS, kdy vznikly touto cestou plazmidy pOLTV535 a pOLTV553 (pro detailní popis konstrukce se lze podívat do experimentální části). Plazmid pOLTV5 (obrázek 1) obsahuje T7 RNA polymerasový promotor následovaný specifickými restrikčními místy Stul a Smál, autokatalytickým ribozymem z hepatitits delta viru (HDV) a transkripční terminační signál z bakteriofága T7 (Pattnaik a další, 1992). Při invivo í in vitro transkripci za užití T7 RNA polymerasy vznikne z plazmidů pOLTV535 antigenomová RNA (nebo (+)-RNA), zatímco transkripcí plazmidů pOLTV553 vznikne genomová RNA (nebo (+)-RNA) (obrázek 5).

K vyzkoušení, zda minigenomy RNA generované plazmidy pOLTV535 a pOLTV553 mohou být replikovány a exprimovány pomocí NDV jako pomocného viru (helperviru), byly použity CER buňky, které exprimují T7 RNA polymerasu buď konstitutivně (CER-C9 buňky, viz experimentální část), nebo po infekci rekombinantním virem ptačích neštovic fpEFLT7pol (Britton a další, io 1995, nazvaným FPV-T7), který exprimuje T7 RNA polymerasu. CER-C9 buňky a FPV-T7 infikované CER buňky byly transfekovány minigenomovýnri plazmidy pOLTV535 nebo pOLTV553 a po inkubaci 3 h při 37 °C byly buňky buď po dobu jedné hodiny infikovány NDV, nebo zůstaly neinfikovány. Přibližně 24 hodin po transfekci byl odebrán vzorek média a byl zkoušen na přítomnost SEAP aktivity. Výsledky prokázaly, že SEAP exprese byla velmi vysoká v buňkách infikovaných FPV-T7, které byly transfekovány pOLTV535. Není to překvapující výsledek, protože transkripce pomocí T7 RNA polymerasy generuje antigenomovou (+)-RNA, která nese enzymy viru drůbežích neštovic a je účinně přepisována hostitelskou buňkou. V buňkách transfekovaných pOLTV553 transkripce T7 RNA polymerasy generuje genomovou (-)RNA, která musí být převedena nejdříve na (+)-RNA za účasti pomocného viru, teprve potom může dojít k translaci do SEAP proteinu (obrázek 5). V obou případech nebylo pozorováno zvýšení exprese SEAP ve srovnání buněk infikovaných NDV a neinfikovaných. Naopak, exprese SEAP v buňkách infikovaných NDV byla oproti očekávání přibližně dvakrát nižší než u neinfikovaných buněk (výsledky nejsou uvedeny). Pro pOLTV535 transfekované buňky to může být vysvětleno tím, že v tomto případě existuje vždy vysoká hladina exprese SEAP pomocí T7 RNA polymerasy. Avšak v pOLTV553 transfekovaných buňkách, kde účinná exprese SEAP závisí na přeměně genomové (-)-RNA na antigenomovou (+)-RNA nebo mRNA pomocí virového polymerasového systému, zde bylo očekáváno zvýšení SEAP exprese po NDV infekci. Můžeme uvažovat dva důvody, proč by se minigenomy nemohly exprimovat a replikovat pomocí NDV. První důvod je, že velikost minígenomových RNA neodpovídá tak zvanému „pravidlu šesti“ (Calain a Roux, 1993; Kolakofsky a další, 1998).

Podle tohoto pravidla se mohou genomy paramyxovirů účinně replikovat, je-li jejich délka násobkem šesti nukleotidů. Druhý důvod je, že dva zbytky G, které jsou přítomny zvlášť na 5’ konci minígenomových RNA mohou interferovat se správnou replikací a/nebo transkripcí pomocí virového polymerasového komplexu. Z důvodu prokázání, zda je replikace genomu závislá na tzv. „pravidle šesti“, byla do plazmidů pOLTV535 a pOLTV553 (obrázek 2) zavedena série krátkých k sobě komplementárních oligonukleotidů, které zvyšují svou délku vždy o jeden nt do specifického místa pro Clal. Vzniklé plazmidy (označené pOLTV535NO-N5 a pOLTV553N0N5) se liší v množství nukleotidů od 1 do 6 nt a proto každý z nich může generovat minigenomo40 vou RNA, která odpovídá „pravidlu šesti“. Plazmidy byly použity k transfekci buď buněk CER nebo FPV-T7 infikovaných buněk CER-C9 tak, jak je popsáno výše. Výsledky ukázaly, že pouze plazmidy pOLTV535N3 a pOLTV553N3 zvyšují po infekci NDV aktivitu SEAP. Délka minígenomových RNA generovaných z plazmidů pomocí T7 RNA polymerasy byly vypočítány na 6a + 2. Vzhledem k tomu, že na 5’ konci minígenomových RNA sekvencí jsou přítomny dva další specifické zbytky G, tyto výsledky naznačují, že pravidlu šesti odpovídá pouze sekvence, která je lokalizovaná mezi autentickými 3’ a 5’ konci minigenomové RNA. Tento předpoklad byl ověřen konstrukcí minigenomového plazmidů, ve kterém transkripční start T7 RNA polymerasy byl změněn tak, že první nukleotid, který byl začleněn do RNA byl první nukleotid 3’ a 5’ konce NDV (viz experimentální Část). Po transfekci těchto plazmidů se zjistilo, že pouze minigenomové

RNA odvozené z plazmidů pOLTV735N3 a pOLTV753N3 se replikují pomocí pomocného viru (výsledky nejsou uvedeny). Tyto výsledky znovu prokázaly, že replikace NDV je přísně závislá na pravidlu šesti. Co více, tato zjištění potvrzuje fakt, že přítomnost dvou dalších zbytků G na 5’ konci minígenomových RNA neinterferuje se správnou replikací. Podobné výsledky byly získány s minigenomovými plazmidy (nebo Dl plazmidy) z dalších paramyxovirů (Pattnaik a další, 1992;

Harty a Palese, 1995).

Obalování NDV minigenomů pomocí pomocných virů

K určení, zda minigenomové RNA mohou být zabaleny pomocí NDV pomocných virů, bylo médium z transfekovaných buněk přeneseno na čerstvou monomolekulámí vrstvu a po hodině adsorpce se vrstva třikrát promyla PBS a dále se inkubovala v kompletním médiu. Po 24 hodinách inkubace se měřila SEAP aktivita v médiu. Výsledky ukázaly, že aktivita SEAP byla prokázána pouze u buněk, které byly ošetřeny médiem z buněk transfekovaných minigenomovým plazmidem pOLTV553N3 (tabulka 4). Toto zjištění naznačuje, že minigenomové RNA mohou být ío zabaleny do obalů NDV a že tyto Částice jsou schopné infikovat buňky. Co více, tyto výsledky prokázaly, že pakážování je závislé na replikaci, která indikuje, že pouze ty RNA molekuly, které tvoří komplex sNP, P a L proteiny jsou pakážovány do viru podobných částic (virus-like particles).

Replikace NDV minigenomů pomocí plazmidů exprimujících NP, P a L proteiny

K určení, zda by minigenomové RNA mohly být replikovány pomocí plazmidů kódujících esenciální NP, P a L proteiny, byla provedena řada pokusů s kotransfekci buněk infikovaných FPVT7. Buňky byly transfekovány kombinací plazmidů obsahujících minigenomových plazmid a plazmidy pCIneoNP, nebo -P a L(c). V negativní kontrole byl nahrazen plazmid pCIneoL(c), který kóduje esenciální L protein, za vektorový plazmid pCIneo. Výsledky (tabulka 5) naznačují, že pouze plazmidy, které kódovaly NP, P a L byly schopny replikace minigenomových RNA. Výsledky dále prokázaly, že podobně jako replikace minigenomů pomocí pomocného viru, tak také replikace NP, P a L proteinů je závislá na pravidle šesti.

Nukleotidová sekvence úplného genomu NDV kmene LaSota

Subgenomové cDNA fragmenty představující vlastní genom NDV byly konstruovány pomocí RT-PCR (obrázek 4). Za účelem udržení počtu chyb v PCR na minimu, byla použita pro30 ofreadingová enzymová směs (Expand Long Template; Boehringer Mannheim) v kombinaci s omezeným počtem PCR cyklů (15 cyklů). Pro reversní transkripci byl použit primer 3UIT, který je komplementární k 3’ konci NDV RNA a pro PCR byly použity genově specifické primery. K odhalení možných chyb v PCR byly provedeny tři nezávislé RT reakce a tyto produkty byly použity k přípravě tří nezávislých setů subgenomových cDNA. cDNA, jejichž veli35 kosti se měnily přibližně od 4 do 7 kb, byly klonovány do pGEM-T. Byly určeny nukleotidové sekvence dvou setů cDNA pomocí příměrů, které byly buď odvozeny z publikovaných sekvencí NDV, nebo pomocí primerů odvozených od sekvencí získaných ze sekvenačních dat pro NDV v rámci tohoto projektu (tabulka 1). Zbývající nejasnosti byly řešeny sekvenováním daných oblastí třetího setu klonů cDNA. Genom NDV kmen LaSota se skládá z 15186 nt (obrázek 3), což ukazuje na to, že daný genom je nejmenší ze všech paramyxovirových genomů doposud uveřejněných (Kolakofsky a další, 1998).

Konstrukce klonu s úplnou cDNA NDV v transkripčním plazmidů pOLTV5

Ke konstrukci klonu NDV kmene LaSota byly použity překrývající se klony cDNA, které představovaly vlastní NDV genom. Tyto klony byly dány dohromady pomocí sdílených restrikčních míst podle strategie zobrazené na obrázku 4. Vlastní NDV cDNA byla sestavena v minigenomů plazmidů pOLTV535 (viz výše), který byl odvozen od transkripčního plazmidů pOLTV5.

Jak je vidno z obrázku 4B, posledním krokem v sestavení kompletní NDV cDNA bylo klonování fragmentu velkého přibližně 8.8 kb Clal (nt 3521-12355) z plazmidů pGEM-B do p535-Dl, který obsahoval sekvenci NDV ohraničenou místy Clal z každé strany (to znamená nt 1-3521 a 12355-15186). Provedení tohoto kroku bylo velmi obtížné, protože jsme se několikrát mýlili v přípravě správných klonů. Proto Clal fragment z pGEM-B byl spojen s genem pro chloramfe55 nikolovou resistenci (Cm) z plazmidů pACYC184. Fragment Clal obsahující Cm gen byl izoloCZ 300760 B6 ván a klonován do Clal místa v p535—Dl a byly vybrány transformanty nesoucí resistenci k oběma Cm. Protože transformanty rostly velmi málo, byly použity nižší koncentrace antibiotik pro selekci, a to 15 pg/ml Cm a 10 pg/ml Km a dále byla snížena inkubační teplota z 37 °C na 32 °C. Nakonec byl Cm-gen odstraněn z tohoto plazmidu pomocí štěpení BsiWI následovaným recirku5 larizací pomocí T4 DNA ligasy. Po transformaci E. coli byly buňky nesoucí daný plazmid identifikovány fenotypicky pomocí skríningu Km-resistence a Cm-citlivosti. Získaný plazmid sestával z úplné cDNA pro NDV klonované mezi místa Smál a Stul v transkripčním plazmidu pOLTV5, který byl označen pNDFL+.

io Příprava infekčních částic NDV z úplné cDNA

K získání infekčního NDV přímo z klonované cDNA, byl použit k pokusům s kotransfekcí plazmid pNDFL+ s pCIneoNP, -P a L(c), tak jak je to popsáno výše pro minigenomové plazmidy. Transfekce CER nebo CEF buněk byla monitorována pomocí minigenomového plazmidu pOLTV553N3 a pomocí měření exprese SEAP. V negativní kontrole byl plazmid pCIneoL(c) nahrazen pCíneo. Po kotransfekcí byly buňky inkubovány 3 až 6 dní v médiu obsahujícím 5 % alantoické tekutiny. Přidání alantoické tekutiny je nezbytné, protože CER i CEF buňky nemají vhodné proteasy, které umí štěpit protein F NDV kmene LaSota.

Štěpení proteinu F je nezbytné pro šíření viru z buňky do buňky a pro generování infekčních částic viru. Po třech dnech inkubace se provedlo imunochemické barvení fixované monomolekulámí vrstvy pomocí monoklonální protilátky proti proteinu F. Výsledky ukázaly, že buňky, které se označily protilátkou, byly přítomny jen v monomolekulámí vrstvě buněk, které byly kotransfekovány pNDFL(+), pCIneoNP, -P a L(c). Tyto výsledky indikuji, že v těchto buňkách proběhla replikace a exprese genomu. V buňkách, kde byl v kotransfekčních pokusech pCIneoL(c) nahrazen pCíneo, nebylo prokázáno žádné imunochemické značení buněk. Za účelem získání infekčního viru byl supematant transfekovaných buněk z monomolekulámí vrstvy injikován do alantoické dutiny embrya nesoucích vajíček. Za čtyři dny se alantoická tekutina sklidila, analyzovala se hemaglutinačním testem a pasážovala dále ve vejcích. Výsledky prokázaly, že pouze supema30 tant buněk transfekovaných kombinací pNDFL+ a pCíneo NP, -P a L(c) dávaly pozitivní reakci v hemaglutinačním testu. Alantoická tekutina, která vykázala pozitivní reakci v hemaglutinačním testu, byla dále podrobena hemaglutinačnímu inhibičnímu testu pomocí monoklonální protilátky 7B7, 8C11, 5A1, 7D4 a 4D6 (Long a další, 1986), které se používají k rozlišení kmenů NDV. Výsledky těchto testů ukazují, že NDV kmen, který byl získán z inokulovaných vajíček, vykazo35 val stejnou reaktivitu jako originální kmen LaSota. Virus, který byl získán z inokulovaných vajíček byl označen NDFL, aby bylo vyznačeno rozlišení od originálního kmene LaSota.

Příprava geneticky modifikovaného NDV z úplné cDNA

K důkazu, že k získání infekčního viru z klonu s úplnou cDNA NDV pomocí kotransfekčního systému, byl do plazmidu pNDFL(+) vložen genetický markér (tag). Tímto postupem byla aminokyselinová sekvence štěpného místa proteasy v Fo proteinu změněna ze sekvence vyskytující se v kmeni LaSota (GGRQGR/L) na konsenzuální sekvenci virulentního NDV kmene ((GRRQRR/F) a to pomocí PCR mutagenizace (na detaily se podívejte do experimentální části).

Výsledný plazmid pNDFL+(F^M) byl použit k přípravě viru pomocí kotransfekčního systému popsaného výše. Infekční virus označený NDFLfF**) byl získán z alantoické tekutiny vajíček nesoucích embryo, které byly inokulovány médiem z kotransfekovaných CEF buněk. V HI testu všechny MAbs včetně 7D4, která je specifická pro kmen LaSota, vykazovaly s nově vytvořeným virem stejnou reaktivitu, jako s originálním kmenem LaSota. Nukleotidová sekvence oblasti kódující proteasové štěpné místo v F proteinu byla určena pomocí PCR. Výsledky ukázaly, že nukleotidová sekvence obsahuje určité změny v nukleotidovém složení, které byly zavedeny mutagenizaěním primerem, který byl použit k modifikaci originální sekvence kmene LaSota. Tato zjištění ukazují, že virus byl odvozen z plazmidu pNDFL+(F^wt) a demonstrují tak, že geneticky modifikovaný NDV může být vytvořen přímo z klonu obsahujícího úplnou cDNA NDV.

7Ω

Proteasové štěpné místo proteinu Fo z NDV je klíčem určujícím determinantu virulence

Všeobecně se předpokládá, že aminokyselinová sekvence proteasového štěpného místa Fo proteinu je klíčovou determinantou pro virulenci v různých kmenech NDV. Pro přípravu různých gene5 ticky modifikovaných kmenů LaSota, ve kterých byla změněna aminokyselinová sekvence štěpného místa proteasy z lentogenní (nevirulentní) na velogenní (virulentní), poskytuje NDV kmen jedinečnou příležitost otestovat tento přístup. Proto byl určen index intracerebrální patogenicity (ICPI) nově připraveného viru NDFLÍF*¹) a porovnán s tímtéž indexem pro kmen NDFL a pro originální LaSota kmen (klon El3-1). Výsledky ukazují, že ICPI pro kmen NDFL(F^W') byl index ίο 1.3, což je hodnota daleko nad hodnotou pro kmen NDFL (ICPI = 0.0) a klon El 3-1 (ICPI = 0.3). Tyto výsledky naznačují, jak se očekávalo, že virulence NDV je ponejvíce určena aminokyselinovou sekvencí štěpného místa proteasy v Fo proteinu.

Zavedení sérologického markéru

Obalové glykoproteiny NDV značené F a HN, jsou nejvíce imunogenní proteiny viru. Po infekci oba proteiny F i HN vykazují silnou odpověď na neutralizační protilátku. Indukce takovéto odpovědi s neutralizační protilátkou je základem úspěšné vakcinace pomocí nevirulentních kmenů NDV (jako je Široce používaný kmen LaSota). Avšak protilátková odpověď proti NDV vakcinač20 nímu kmenu se neliší od protilátkové odpovědi získané z virulentního NDV polního izolátu. Z tohoto důvodu nelze odlišit infekci virulentním kmenem pomocí sérologických metod. Tato situace je neuvěřitelná, protože polní infekce vyvolané virulentním kmenem jsou maskovány vakcinaci a klinické příznaky, které působí, mohou být přehlédnuty nebo přičítány vakcinaci. Proto úspěšná diferenciace mezi vakcinaci a infekcí je nezbytná pro eradikaci NDV. Z tohoto důvodu jsme se rozhodli vyvinout geneticky modifikovaný kmen NDV, který může být užit pro vakcinaci a který je sérologicky odlišitelný od NDV polních kmenů (tak zvanou markerovou vakcínu).

Za účelem vývoje NDV markerové vakcíny, virus byl geneticky modifikován, a to tak, že jeden nebo několik imunodominantních epitopů jednoho z (hlavních) antigenů, jsou buď vynechány, nebo modifikovány. Vynecháním části(í) jednoho esenciálního proteinu může vést ke ztrátě biologických funkcí proteinu. Proto jsme si vybrali modifikaci jednoho imunodominantního obalového proteinu z NDV, a to takovou cestou, že biologická funkce proteinu zůstala, zatímco repertoár protilátek proti modifikovanému proteinu se lišil od repertoáru protilátek generovaných proti originálnímu proteinu. Z důvodů, které jsou specifikovány dále v textu, jsme ve zvláště výhodném provedení vynálezu vybrali modifikovaný protein HN NDV. Infekce NDV je iniciována fúzí obálky virionu s plazmatickou membránou hostitelské buňky. Pro tento proces jsou potřeba oba proteiny, F i HN. Bylo prokázáno, že F a HN proteiny fyzicky interagují a že tato interakce je požadovaná pro membránovou fúzi (Deng a další, 1995). Co více, bylo prokázáno, že tato

4o interakce je typově specifická, to znamená, že F a HN proteiny musí být odvozeny z téhož viru, aby mohly vykázat fuzní aktivitu. Interakční oblast HN proteinu NDV je lokalizována na tak zvané stopce či stéblu proteinu, která obsahuje prvních 92 aminokyselinových zbytků z ektodomény HN proteinu (Deng a další, 1995). Hybridní HN proteiny obsahující aal-141 z NDV aaal4l-572 z lidského parainfluenza viru typu 3 (hPlV3) vykázaly fúzní aktivitu, jestliže byly koexprimovány s F proteinem NDV. Tato zjištění prokázala, že geneticky modifikované NDV kmeny, které obsahují HN protein, kteiý obsahuje oblast stopky proteinu z NDV následovanou globulámt hlavou HN proteinu z různých sérotypů ptačích paramyxovirů, jsou schopné života. Co více, takovéto kmeny by mohly navodit imunitní odpověď proti HN, která by byla odlišná od odpovědi vyvolané NDV. Protože imunitní odpověď pomocí neutralizačních protilátek proti

F proteinu vyvolává dostatečnou ochranu proti nastupující virové infekci, tak modifikované NDV kmeny splňují dva základní požadavky kladené na markerové vakcíny, to je ochrana proti nemoci a sérologická diferenciace.

Λ Λ

Hybridní geny HN byly konstruovány tak, že obsahují fúzi buď aal-141 z NDV a aa 142-580 z ptačího paramyxoviru typu -2 (APMV2) (označený HN1/2¹⁴¹) nebo aal-143 z NDV a aal44580 z APMV (označený HN1/2¹⁴³).

Obdobně, hybridní geny HN byly konstruovány tak, že obsahovaly buď vlastní aal-141 a aa143569 zAMPV4 (označený HN1/4¹⁴¹) nebo aal-143 z NDV a aal45-569 zAPMV4 (označený HN1/4¹⁴³). Hybridní geny byly klonovány do eukaryotického expresního vektoru pCIneo a byly užity v kotransfekčních experimentech s plazmidy obsahujícími F protein z NDV. Nakonec, F protein byl modifikován tak, že byla změněna sekvence proteolytického štěpného místa mezi ío F2 a F1 proteinem a to tak, že sekvence odpovídající kmenu LaSota za konsenzuální sekvenci virulentních kmenů NDV (F^wt, viz experimentální část). Kotransfekční pokusy s buňkami CER a QMS indikovaly, že oba HN1/2¹⁴¹ a HN1/2¹⁴³, stejně tak HN1/4¹⁴¹ a HN1/4¹⁴³, stejně tak HN1/4¹⁴¹ a HN1/4¹⁴³ indukují buněčnou fůzi, jsou-li koexprimovány sF^wt proteinem. Tyto výsledky indikují, že komplexy mezi hybridními HN proteiny a F proteinem jsou biologicky aktivní. Hybridní HN proteiny HN1/2¹⁴³ a HN1/4¹⁴³ byly použity k nahrazení originálního HN genu v úplném cDNA klonu pNDFL+, čehož výsledkem je pNDFL-HNl/2¹⁴ a pNDFLHN1/4¹⁴³. Poslední dva uvedené plazmidy byly následně použity pro přípravu infekčního viru pomocí užití kotransfekČního systému popsaného výše. Životaschopné rekombinantní virové částice (označené NDFL-HN1/2¹⁴³ a -HN1/4¹⁴³) byly izolovány zalantoické tekutiny vajec nesoucích embrya, které byty inokulovány supematantem z transfekovaných buněk.

Přítomnost hybridního genu HN v obou rekombinantech byla ověřena pomocí RT PCR. Hemaglutinaění inhibiční testy prokázaly, že monoklonální protilátky i polyklonální antisérum proti NDV nejsou schopny inhibovat aglutinaci kuřecích erytrocytů způsobenou rekombinantním virem NDFL-HN1/2¹⁴³ a NDFL- HN1/4¹⁴³. Tyto výsledky indikují, že kmeny NDFL-HN1/2¹⁴³ aNDFL-HNl/4¹⁴³ mohou být využity jako vakcíny, které lze sérologicky odlišit od klasických NDV vakcín.

Exprese heterologního proteinu z rekombinantního NDV

K vyzkoušení, zda mohou být cizí geny začleněny do NDV genomu byl zkonstruován rekombinantní virus, který nesl SEAP reporterový gen. SEAP gen byl odvozen z plazmidu pOLTV535 a byl modifikován zavedením typického transkripěního stop kodonu a startovního boxu z NDV. Fragment DNA obsahující SEAP gen následovaný transkripčním stopem a startovními boxy byl vložen do XmnI místa (nt 109) v plazmidu pNDFL+(F^w'), Infekční virus, označený NDFL-AP, byl připraven pomocí kotransfekČního systému a přítomnost genu SEAP byla ověřena pomocí RT PCR. Buňky infikované kmenem NDFL-AP exprimovaly velké množství SEAP proteinu, výpočtem jsme zjistili, že x % proteinů exprimovaných v buňkách infikovaných NDFL-AP sestává ze SEAP proteinu.

Tyto výsledky ukazují, že heterologní geny lze exprimovat z rekombinantního NDV na velmi vysoké úrovni.

Příprava deleční mutanty NDV v trans- komplementní buněčné linii

Z důvodu zrušení exprese proteinu M v NDV, byla velká Část tohoto proteinu odstraněna štěpením plazmidu pNDFL+(F^wt) pomocí BsaAI (nt 3087) a následným štěpením pomocí HindlII (nt 4252), Po doplnění HindlIÍ místa pomocí Klenow DNA polymerasy byl fragment recirkularizován pomocí T4 DNA ligasy a použit k transformaci E. coli. Výsledný plazmid, označený pNFDL+(F^wt)dM byl použit k vytvoření viru pomocí kotransfekČního systému v trans-komplementních buňkách CER-M, které exprimovaly NDVM protein. Supernatant transfekované monovrstvy byt třikrát pasážován v CER-M buňkách a analyzován na přítomnost viru. Virus byl získán jako důkaz faktu, že supernatant po třetím pasážování dával pozitivní výsledky v hemaglutinačním (HA) a hemaglutinačně inhibičním (HI) testu. Virus byl označen NDFL-dM. Byl-li

NDFL-dM použit k infekci monovrstvy CEF buněk, virus byl stále schopen šířit se z buňky do _ 11 _ buňky, jak bylo dokázáno pomoci IPMA za užití monoklonální protilátky proti F proteinu. Jak se očekávalo, exprese M proteinu nebyla prokázána pomocí IPMA s monoklonální protilátkou proti M proteinu. Toto zjištění naznačuje, že infekční virus nelze generovat v nekomplementních CEF buňkách. Toto tvrzení bylo dále prokázáno pozorováním, že vajíčka inokulovaná supematantem z infikovaných CEF buněk netvoří potomstvo viru, jak bylo dokázáno pomocí HA a HI testů. Potřeba lepších NDV vakcín nás vedla k vývoj i reversního genetického systému, který by nám umožnil genetickou modifikaci NDV. V tomto dokumentu popisujeme přípravu infekčního NDV přímo klonováním z úplné cDNA. Prokázali jsme, že se virulence NDV dramaticky mění modifikací 3 nukleotidů, které určují specifitu proteasového štěpného místa v proteinu F. V tomto přípaio dě se proteasové štěpné místo mění z místa typického pro kmen LaSota na místo odpovídající konsenzuálnímu Štěpnému místu virulentního kmene NDV. Přípravou takovéhoto geneticky modifikovaného kmene NDV jsme podali formální důkaz, že štěpení F proteinu je jedním z klíčových předpokladů (ale nikoli jediným) pro virulencí NDV. Pomocí stejného reverzního genetického přístupu bylo štěpné místo modifikováno dle našeho přání jinou aminokyselinovou sekvencí. To vedlo k vytvoření série kmenů NDV, které vykazovaly různé hladiny virulence.

In vivo

Jak již bylo zmíněno výše, prokázalo se, že vedle schopnosti štěpení F a HN proteinů také další virové proteiny přispívají kpatogenitě. Změny v transkripcí a translaci mohou modulovat růst a šíření viru z buňky do buňky a/nebo cytopatogenitu. Získání cDNA z infekčního NDV nám dovolilo systematické modifikace sekvencí, které se zapojují do transkripce a replikace. To vedlo k návrhu nové NDV vakcíny, ve které se spojila optimální imunogenita s prakticky neexistující virulencí.

Bezpečnost je jedna z nejdůležitějších vlastností živých vakcín. Avšak u většiny živých vakcín je často inverzní vztah mezi imunogenitou a virulencí. Z tohoto důvodu je další oslabování živých vakcín bez ztráty imunogenity jedním z nejdůležitějších požadavků kladených na užití genetických modifikací. V tomto ohledu je cenné poznamenat, že eliminace exprese genu pro V protein vSendai viru vyústila ve značnou redukci invivo patogenity pro myši (Kato a další, 1997). Podobně jako u Sendai viru, NDV generuje V protein pomocí mechanismu známého jako RNA editace (Steward a další, 1993). Je pravděpodobné a předpokládá se, že eliminace exprese V proteinu NDV by mohla také vést k oslabenému fenotypu in vivo.

Vedle změny virulence NDV, jsem prokázali, že je možné měnit antígenní vlastnosti NDV, a to tím způsobem, že kmen může být generován tak, že může být sérologicky odlišen od polních izolátů NDV. Takováto, tak zvaná markerová vakcína, je nedocenitelným pomocníkem k určení rozšíření NDV v komerčních chovech na celém světě.

Co více, aplikace takovýchto markerových vakcín ve velkém měřítku může vést ke kompletní eradikaci NDV pomocí procesu intenzivního vyhledávání a odstraňování infekčních hejn. V patentu bylo také dokumentováno užití cizích genů, které mohou být inzerovány do NDV genomu. Tyto cizí geny se mohou v infekčních buňkách z genomu NDV exprimovat na velmi vysokých úrovních exprese. To ukazuje na možnost, že NDV může být použit jako vakcinační vektor pro expresi antigenu dalších (drůbežích) patogenů.

Hned několik proteinů dělá z NDV ideální vakcinační vektor s možností uplatnění proti respiračním chorobám, či chorobám střevního traktu.

1) NDV může být snadno namnožen na vysoký titr v embryogenních vejcích.

2) Produkce NDV ve velkém tímto způsobem je relativně levná.

3) NDV vakcíny jsou relativně stálé a mohou být jednoduše podávány v masovém měřítku (podávání pitnou vodou nebo postřikem nebo tvorbou aerosolu).

4) Přirozená cesta infekce NDV je přes respirační či střevní trakt, což jsou i hlavní cesty infekce u mnoha dalších drůbežích patogenů.

5) NDV indukuje, navzdory přítomnosti cirkulujících vrozených protilátek, lokální imunitu.

Dále se ještě prokázalo, že životaschopné deleční mutanty NDV se mohou generovat užitím trans-komplementních buněčných linií. Byly vytvořeny NDV deleční mutanty, které nejsou schopné exprimovat matrixový (M) protein, který se účastní uchycení NDV k vnitrní buněčné io membráně. Prokázali jsme dále, že ve fenotypově komplementovaném kmeni NDV není možno exprimovat M protein, ačkoli je virus stále ještě schopen infikovat buňky a šířit se z buňky do buňky. Avšak, mutantní virus není schopen generovat infekční potomstvo na nekomplementních buňkách. Tato zjištění ukazují, že fenotypově komplementované deleční mutanty NDV by mohly být užity jako bezpečné vakcíny, které se nešíří do okolního prostředí. Takovéto nepřenosné vakcíny kombinují nejdůležitější výhodu živých vakcín, to je účinnost, s nejdůležitější vlastností neživých vakcín, to je bezpečností.

Reference:

Alexander, D.J. (1993) Paramyxovirus infections. V knize Virus infections of birds. McFerran, J.B. a McNulty, M.S. (eds), strana 321-340, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam.

Antin, P.B. a Ordahl, C.P. (1991) Isolation and characterization of an avian myogenic cell line. Dev, Biol. 143: 111-121.

Baron, M.D. a Barrett, T. (1997) Rescue of rinderpest virus from cloned cDNA. J. Virol. 71: 1265-1271.

Beach, J.R. (1944) The neutralization in vitro of avian pneumoencephalitis virus by Newcastle disease immuneserum. Science 100: 361-362.

Beard, C.W. a Hanson, R.P. (1984) Newcastle disease. V knize M.S. Hofstad a další, (eds) Disease of Poultry, 8th Ed., strana 452-470. lowa State University Press, Ames.

Beaudette, F.R., Bivins, J.A. a Miller, B.R. (1949) Newcastle disease immunization with live virus. Cornell Vet. 39: 302-334.

Boursnell, M.E.G., Green, P.F., Samson, A.C.R., Campbell, J.I.A., Deuter, A., Peters, R.W., Millar, N.S., Emmerson, P.T. a Binns, M.M. (1990) A recombinant fowlpox virus expressing the hemagglutininneuraminidase gene of Newcastle disease virus (NDV) protects chickens against challenge by NDV. Virology 178: 297-300.

Britton, P., Green, P., Kottier, S., Mawditt, K.L., Penzes, Z., Cavanagh, D. a Skinner, M. (1996) Expression of bacteriophage T7 RNA polymerase in avian and mammalian cells by a recombi45 nant fowlpox virus. J. Gen. Virol. 77: 963-967.

Calain, P. a Roux, L. (1993) The rule of six, a basic feature for efficient replicatíon of Sendai virus defective interfering RNA. J. Virol. 67: 4822-4830.

Chambers, P., Millar, N.S., Bingham, R.W. a Emmerson, P.T. (1986) Molecular cloning of complementary DNA to Newcastle disease virus and nucleotide sequence analysis of the junction between the genes encoding the haemagglutinin-neuraminidase and the large protein. J. Gen. Virol. 67: 475-486.

Ί'ϊ

Chang, A.C.Y. a Cohen, S.N. (1978) Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J. BacterioL 134: 1141-1156.

Cho, B.R. (1982) Cytopathic effects and focus formation by reticuloendotheliosis viruses in a quail fibroblast cell line. Avian Diseases 27: 261.

Collins, P.L., Hill, M.G., Camargo, E., Grosfeld, H., Chanock, R.M. a Murphy, B.R. (1995) Production of infectious human respirátory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for transcription elongation factor from the 5’ proximal open reading fřame of the M2 ío mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine development. Proč. Natí Acad

Sci. USA 92: 11563-11567.

Conzelmann, K.-K. (1996) Genetic manipulation of nonsegmented negative-strand RNA viruses.

J. Gen. Virol. 77: 381-389.

Cowen, B.S. a Braune, M.O. (1988) The propagation of avian viruses in a continuous cell line (QT35) of Japanese quail origin. Avian Diseases 32: 282-297.

Deng, R., Wang, Z., Mirza, A.M. a Iorio, R.M. (1995) Localization of a domain on the paramy20 xovirus attachment protein required for the promotion of cellular fusion by its homologous fusion protein spike. Virology 209: 457-496.

Doyle, T.M. (1927) A hitherto unrecorded disease of fowls due to a filter-passing virus. J. Comp.

Pathoi 5 Ther. 40: 144-169.

Garcin, D., Pelet, T., Calain, P., Roux, L., Curran, J. a Kolakofsky, D. (1995) A highly recombinogenic systém for the recovery of infectious Sendai paramyxovirus from cDNA: generation of a novel copy-back non-defective interfering virus. EMBOJ. 14: 6087-6094.

Garten, W., Berk, W., Nagai, Y., Rott, R. a Klenk, H.D. (1980) Mutational changes of the protease suceptibility of glycoprotein F of Newcastle disease virus: Effects on pathogenicity. J. Gen. Virol. 50:135-147.

Goldhaft, T.M. (1980) Historical notě on the origin of the LaSota strain of Newcastle disease virus. Avian Dis. 24: 297-301.

Gough, R.E. a Alexander, D.J, (1973) The speed of resistance to challenge induced in chickens vaccinated by different routes with a B1 strain of live NDV. Vet. Rec. 92: 563-564.

Hanson, R.P. (1988) Heterogeneity within strains of Newcastle disease virus: key to survival. V knize D.J. Alexander (ed.), Newcastle Disease, strana 113-130. Kluwer Academie Publ., Boston. Harty, R.N. a Palese, P, (1995) Mutations within noneoding terminál sequences of model RNA’s of Sendai virus: Influence on reportér gene expression. J. Virol. 69: 5128-5131.

Heckert, R.A., Riva, J., Cook, S., McMillen, J. a Schwartz, R.D. (1996) Onset of protective immunity in chicks after vaccination with a recombinant herpesvirus of turkeys vaccine expressing Newcastle disease virus fusion and hemagglutinatinin-neuraminidase antigens. Avian Dis. 40: 770-777.

Heuschele, W.P. a Easterday, B.C. (1970) Local immunity and persistence of virus in the tracheas'ofchickens following infection with Newcastle disease virus. II, Immunofluorescent and histopathologícal studies. J. Inf. Dis. 121; 497-504.

Hitchner, S.B. a Johnson, E.P. (1948) A virus of low virulence for immunizing fowls against

Newcastle disease (avian pneumoencephalitis). Vet. Med. 43: 525-530.

Hoffman, M.A. a Banerjee, A.K. (1997) An infectious cloně of human parainfluenza virus type 3. J. Virol. 71: 4272-4277. Hofstad, M.S. (1953) Immunization of chickens against Newcastle disease by formalin-inactivated vaccine. Am. J. Vet. Res. 14: 586-589.

Ichihara, Y. a Kurosawa, Y. (1993) Construction of new T vectors for direct cloning of PCR Products. Gene 130: 153-154.

Ishida, N., Taira, H., Omata, T., Mizumoto, K., Hattori, S., Iwasaki, K. a Kawakita, M. (1986) ío Sequence of 2617 nucleotides front the 3’ end of Newcastle disease virus genome RNA and the predicted amino acid sequence of the viral NP protein. Nucl. Acids Res. 14: 6551-6564.

Kaleta, E.F. a Baldauf, C. (1988) Newcastle Disease in free-living and pet birds. V knize D.J. Alexander (ed.), Newcastle Disease, strana 197-246. Kluwer Academie Publ., Boston.

Kant, A., Koch, G., van Roozelaar, D.J., Balk, F. a ter Huume, A. (1997) Diťferentiation of virulent and non-virulent strains of Newcastle disease virus within 24 hours by polymerase chain reaction. Avian Pathol. 26: 837-849.

Kolakofsky, D., Pelet, T., Garcin, D., Hausmann, S., Curran, J. a Roux, L. (1998) Paramyxovirus RNA synthesis and the requirement for hexamer genome length: the rule of six revisited. J. Virol. 72: 891-899.

Kraneveld, F.C. (1926) A poultry disease in the Dutch East Indies. Ned. Indisch Bl. Diergeneesk.

38:448-450.

Lamb, R.A. a Kolakofsky, D. (1996) Paramyxoviridae: the viruses and their replication. V knize: Fundamental Virology (Fields a další, eds), kapitola 20, strana 577-604, Lipincott-Raven Publishers, Philadelphia.

Lawson, N.D., Stillman, E.A., Whitt, M.A. a Rose, J.K. (1995) Recombinant vesicular stomatitís virus from DNA. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481.

Long, L., Portetelle, D., Ghysdael, J., Gonze, M., Bumy, A. a Meulemans, G. (1986) Monoclonal antibodies to haemagglutininneuraminidase and fusion glycoproteins of Newcastle disease virus: relationship between glycosylation and reactivity. J. Virol. 57: 1198-1202.

Madansky, C.H. a Bratt, M.A. (1978) Noncytopathic mutants of Newcastle disease virus. ./. Virol. 26: 724-729.

Madansky, C.H. a Bratt, M.A. (1981a) Noncytopathic mutants of Newcastle disease virus are defective in virus-specifíc RNA synthesis. J. Virol. 37: 317-327.

Madansky, C.H. a Bratt, M.A. (1981b) Relationships among virus spread, cytopathogenicity, and virulence as revealed by the noncytopathic mutants of Newcastle disease virus. J. Virol. 40: 691702.

Meulemans, G., Gonze, M., Carlier, M.C,, Petit, P., Bumy, A. a Long, L. (1986) Protective effects of HN and F glycoproteinspecific monoclonal antibodies on experimental Newcastle disease. Avian Pathol. 15:761-768.

Millar, N.S., Chambers, P. a Emmerson, P.T. (1988) Nucleotide sequence of the fusion and haemagglutininneuraminidase gene of Newcastle disease virus, strain Ulster: Molecular basis for variations in pathogenicity between strains. J. Gen. Virol. 69: 613-620.

Morgan, R.W., Gelb, Jr., I, Schreurs, C.S., Lutticken, D., Rosenberger, J.K. a Sondermeijer, P. (1992) Protection of chickens from Newcastle and Marek’s disease with a recombinant herpesvirus ofturkeys vaccine expressing the Newcastle disease virus fusion protein. Avian Dis 36: 858-870.

Morgan, R.W., Gelb, Jr., J., Pope, C.R. a Sondermeijer, P. (1993) Efficacy in chickens of a herpesvirus of turkeys recombinant vaccine containing the fusion gene of Newcastle disease virus: onset of protection and effect of matemal antibodies.

ío Moscovici, C., Moscovici, M.G., Jimenez, H., Lai, M.M., Haymann, M.J. a Vogt, P.K. (1977) Continuous tissue culture cell lineš derived from chemically induced tumors of Japanese quaii. CellX 1:95-103.

Pattnaik, A.K., Balí, L.A., LeGrone, A.W. a Wertz, G.W. (1992) Infectious defective interfering particles of VSV from transcripts of a cDNA cloně. Cell 69: 1011-1020.

Peeples, M.E. (1988) Newcastle disease virus replication. V knize: D.J. Alexander (ed.) Newcastle Disease, strana 45-78. Kluwer Academie Publ., Boston.

Peeters, B., N. de Wind, M. Hooisma, F. Wagenaar, A. Gielkens a R. Moormann. (1992) Pseudorabies virus envelope glycoproteins gp50 and gll are essential for virus penetration, but only gll is involved in membrane fusion. J. Víro!. 66: 894-905.

Radecke, F., Spielhofer, P., Schneider, H., Kaelin, K., Huber, M., Dotsch, C., Christiansen, G.

a Billeter, M.A. (1995) Rescue of measles virus from cloned DNA. ENIBOJ. 14: 5773-5784.

Rott, R. a Klenk. H.-D. (1988) Molecular basis of infectivity and pathogenicity of Newcastle disease virus. V knize D.J. Alexander (ed.), Newcastle Disease, strana 98-112. Kluwer Academie Publ., Boston.

Russell, P.H., Griffiths, P.C., Goswami, K.K.A., Alexander, D.J., Cannon, M.J. a Russell, W.C. (1983) The characterization of monoclonal antibodies to Newcastle disease virus. J. Gen. Virol. 64: 2069-2072.

Sambrook, J., Fritsch, E.F., a Maniatis, T. (1989) Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY.

Schneider, H., Spielhofer, P., Kaelin, K., Dotsch, C., Radecke, F., Sutter, G. a Billeter, M.A. {1997) Rescue of measles virus using a replication-deficient vacciniaT7 vector. J. Virol. Meth.

64:57-64.

Schnell, M.J., Mebatsion, T. a Conzelmann, K.-K. (1994) Infectious rabies viruses from cloned cDNA. F. PMOJ. 13: 4195-4203,

Schiitze, H., Enzmann, P.-J., Kuchling, R., Mundt., E., Niemann, H, a Mettenleiter, T.C. (1995) Complete genomic sequence of the fish rhabdovirus infectious haematopoietic neerosis virus. J. Gen. Virol. 76: 2519-2527.

Smith, A.L., Tignor, G.H., Mifune, K. a Motohashi, T. (1977) Isolation and assay of rabies serogroup viruses in CER cells. Intervirology 8: 92-99.

Spradbrow, P.B. (1988) Geographical distribution. V knize D.J. Alexander (ed.), Newcastle Disease, strana 247-255. Kluwer Academie Publ., Boston.

CZ 300760 Bó

Stauber, N., Brechtbuhl, K., Bruckner, L. a Hofmann, M.A. (1995) Detection of Newcastle disease virus in poultry vaccines using the polymerase chain reaction and direct sequencing of amplified DNA. Vaccine 13: 360-364.

Steward, M., Vipond, I.B., Millar, N.S. a Emmerson, P.T. (1993) RNA editing in Newcastle disease virus. J Gen. Virol. 74: 2539-2547.

Taylor, J., Edbauer, C., Rey-Senelonge, A., Bouquet, J., Norton, E., Goebel, S., Desmettre, P. a Paoletti, E. (1990) Newcastle disease virus fusion protein expressed in a fowlpox virus recomio binant confers protection in chickens. J. Virol. 64: 1441-1450.

Tessier, D.C., Brousseau, R. a Vemet, T. (1986) Ligation of single-stranded oligodeoxyribonucleotides by 5 T4 RNA ligase. Anal. Biochem. 158: 171-178.

Vieira, J. a Messing, J. (1991) New pUC-derived cloning vectors with different selectable markers and DNA replication origins. Gene 100: 189-194.

Vindevogel, H. a Duchatel, J.P. (1988) Panzootic Newcastle disease virus in pigeons. V knize D.J. Alexander (ed.), Newcastle Disease, strana 184-196. Kluwer Academie Publ., Boston.

Whelan, S.P.J., Balí, L.A., Barr, J.N. a Wertz, G.T.W. (1995) Effícient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely fřom cDNA clones. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392.

Wensvoort, G., Terpstra, C., Bonstra, J., Bloemraad, M. a Van Zaane, D. (1986) Production of 25 monoclonal antibodies against swine fever virus and their use in laboratory diagnosis. Vet.

Microbiol. 12: 101-108.

Yusoff, K., Millar, N.S., Chambers, P. a Emmerson, P.T, (1987) Nucleotide sequence analysis of the L gene of Newcastle disease virus: homologies with Sendai and vesicular stomatitis viruses.

Nucl. Acids Res. 15: 3961-3976.

Ί7 .

Tabulka 1:

3’UIT	ACCAAACAGAGAATCCGTGAGTTA	1-24
P368+	GTGATGAGGAACCATGTTGC	368-387
P800+	GTCCGCATCTTCTTGGTTAG	800-819
P1201+	GAGACTTGGAGTAGAGTACG	1201-1220
P1279+	AGCAGCAATGAAGGGCCTGG	1279-1298
P1356+	AAATCGGAGTCCTCACTGGG	1356-1375
P1683+	CTCTATATGACCACACCCTC	1664-1683
PRT1	CAAAGAATTCAGAAAAAAGTACGGGT AGAAG	1785-1814
P2357+	GGAAACAGTCAGGAAAGACC	2358-2377
P2599+	TAAGTAAAGTTGACTATCAG	2599-2618
P2852+	GGCACTTAATAAACTTTCGC	2852-2871
P3496+	GAATGAAGAAGCCACTGTCG	3496-3515
P3587+	CGGAGATCTTGTTGAGTTGG	3589-3608
P4267+	CATTATCCAAGCAGGTACCC	4270-4299
NDV5-F	ACGGGCTAGCGATTCTGGATCCCGGT TGG	4498-4526
P4731+(LS)	AAGCTCCTCCCGAATCTGCC	4733-4752
P4958+	AGCTCTGATACAAGCCAAAC	4960-4979
P5266+(LS)	CTGGTGGGAATATGGATTAC	5267-5286
P5591+(LS)	AGTAACGTTCCCTATGTCCC	5593-5612
P5616+	GTATTTATTCCTGCTTGAGC	5616-5635
P6000	AATACCCTTGATCAGATGAGAGCC	6166-6190
NDV5-HN	GTAGGCTAGCAAGAGAGGCCGCCCCT CAAT	6325-6354
P6693+(L)	CATTGTTAAAAACTGAGACC	6695-6714
P7110+(L)	ATCGGAAGTCTTGCAGTGTG	7112-7131
P7501+(L)	TGGTGGGAAACGCATCCAGC	7503-7522
P7900+(LS)	AAGACTTAATCCTACGTCTG	7902-7921
P8590+	AACTCGGAAGGGCAGTACAC	8592-8611
L9000	TTTGTCACTCCTGAACTTGTCATT	9008-9031
P9359+	CAATGATATAGCAGAATCCG	9361-9380
P9371+	GCAGAATCCGTGACTCATGC	9371-9411
P9390+	ATAGCTACTGTATTCTCTGG	9392-9411
P9686+	TCACACGATATCATGTTGAG	9686-9705
P9799+	CACACCCTAACGATAATTGG	9801-9820
P10198+	ATAAGAAACGTATCACTGAC	10200-10219
P10601+	TTGTCGCGTTGCCTGTATGG	10603-10622
P11006+	GCAGACATACTTTGACTCTG	11008-11027
P11393+	TCCCTTATTGTCTGGAGTGC	11395-11414
P11798+	TGATACGATAGAACTCGTAG	11800-11819
L12000	CATATGTCGCCACATGTGAAGGCT	12008-12031
P12373+	CAACCAGGACATATGATGAG	12375-12394
P12796+	TCGACTGTTCTTACCAACTC	12798-12817
P12978+	CACACCAACTTGCAGATACG	12978-12997
P13236+	GAGTATCTACTGTCGGATGC	13238-13257
P13601+	ATACTTGTTCAGAGGAATAG	13603-13622

P13943+	GACCTGACCTCAGATAAAGC	13946-13965
P14002+	TATCATTGCTGCATTGTGAC	14004-14023
P360	GGCGATGTAATCAGCCTAGTGCTT	14756-14779
P14812+	ACTAAGGACATACTTGAAGC	14812-14831
P230-	CCGGGACTTCTACTTTTAAG	230-211
P998-	TTTGGATATCGCCTGAGAGG	998-979
P1898-	AAAGGTGGCCATGTTTGTCC	1898-1879
P2617-	TGATAGTCAACTTTACTTAC	2617-2598
P3328-	GCAGAATCAAAGTACAGCCC	3330-3311
P3610-	CTTGCCAACTCAACAAGATC	3612-3593
P3990-	GATTAGCATAGTATCCACTG	3992-3973
NDV3-M	TCTCCCCGGGGCAGCTTATTTCTTAA AAGGAT	4400-4368
P4593-	GACAGATGCAACTCAGTACC	4625-4606
P4618-(LS)	&TGCAACTCAGTACCAGCGC	4620-4601
P5390-	GTAGAGTTACCTGTATACCC	5411-5392
NDV3-F	ACTACCCGGGAAACCTTCGTTCCTCA T	6238-6212
P6710-(LS)	TCTCAGTTTTTAACAATGCC	6712-6693
P7093-(LS)	GTTGATGGAACGCAGAGTAG	7095-7076
P7522-(LS)	CTGCTGGATGCGTTTCCCAC	7524-7505
P367	AGGGACCTCAATACTAGCCAGTTC	8692-8666
P9905-	CTCTATCAAGAGGCGATTAG	9907-9888
P10320-	TAAGACAGTACTTTTGCAGG	10322-10303
P.10684-	GATGCAACTGTGTCAACACC	10687-10706
P11122-	AATTGGGCAGGAGTCAGAAC	11124-11105
P11510-	TGCCTCCATGATAGCATGCG	11512-11493
P11903-	ATTGCTTGGAAGATGGAACC	11905-11886
P12717-	TGTCATACACTATTATGGCG	12719-12700
P13141	CAAAGAGTACCGTGTACAGACAGCAT AACC	13172-13143
P13281-	GACATGATAGAGCTCACCTG	13302-13283
P14101-	ACGGAATGCATGGCAATCAG	14163-14144
P14522-	GCTCACCAAACTCTCTGCAC	14524-14505
P14687-	AGGATCTGTCTCGTGCACTG	14709-14690
P377	TTTCCTTAAGTTTGGTAATACCTAGG AC	14888-14861
P359	CACCAAGTCGACAATTGGCCAGAAAA GGAG	15046-15017
5NDV	ACCAAACAAAGATTTGGTGAATGACG	15186-15159

. 10 .

Tabulka 2. Sekvence 3’ a 5’ konců genomu NDV kmene LaSota

A. Sekvence 3’ konce (udáno jako 5’ konec antigenomového vlákna cDNA)

Metoda I. Klon	Sekvence
04	ACCAAACAGAGAATC
05	ACCAAACAGAGAATC
13	ACCAAACAGAGAATC
21	ACCAAACAGAGAATC.

Metoda II:
26	ACCAAACAGAGAATC
28	ACCAAACAGAGAATC
30	ACCAAACAGAGAATC
31	GCCAAACAGAGAATC
32	ACCAAACAGAGAATC
33	ACCAAACAGAGAATC
Konsenzus	ACCAAACAGAGAATC

B. Sekvence 5’ konce (zobrazeno jako DNA)

pBluescriptlI-TSK klonované klony r3101-13	Sekvence ACCAAACAAAGATTT
r3101-14	ACCAAACAAAGATTT
r3101-15	ACCAAACAAAGATTT
Γ2601-17	CCAAACAAAGATTT
r2601-18	ACCAAACAAAGATTT

Tabulka 2- pokračování r2601-19	ACCAAACAAAGATTT
Γ2601-20	AACAAGGTGAAGATA

r2601-21

ACCAAACAAAGATTT pGEM4Z klony sekvence r3101-16 ACCAAACAAAGATTT Γ3101-17 ACCAAACAAAGATTT Γ3101-18 ACCAAACAAAGATTT Γ3101-19 ACCAAACAAAGATTT r3101-22 ACCAAACAAAGATTT

Konsensus

ACCAAACAAAGATTT

Tabulka 3. Replikace minigenomu pomocí NDV helpeviru

A. Aktivita SEAP (cps) po transfekci CER-C9 buněk sérií plazmidů pOLTV535 a pOLTV553

Llazmid	+NDV	-NDV	poměr
pOLTV535NO	3.5 x 10*	7.1x10*	0.49
POLTV535N1	5.9	12.1	0.49
tpOLTV535N2	2.4	6.2	0.39
POLTV535N3	7.6	5.2	1.46
pOLTV535N4	1.8	4.1	0.44
pOLTV535N5	1.5	3.0	0.50
?OLTV553NO	5.5 x IQ3	9.6 xlO3	0.57
□OLTV553N1	9.6	27.6	0.35
pOLTV553N2	2.4	3.5	0.68
POLTV553N3	15.1	9.5	1.59
20 pOLTV553N4	3.4	7.9	0.43
pOLTV553N5	2.9	4.8	0.60

ίο B. Aktivita SEAP (cps) po transfekci CER buněk po infekci FPV-T7 sérií plazmidů pOLTV535 a pOLTV553

iPlasmid	+NDV	-NDV	poměr
POLTV553N0	7.2 x 10*	8.3 x 10*	0.86
pOLTV553Nl	8.4	12.0	0.70
POLTV553N2	8.9	12.6	0.71
30 pOLTV553N3	27.4	8.6	3.19
pOLTV553N4	9.7	10.4	0.93
pOLTV553N5	8.5	8.1	1.05

Tabulka 4: Přenos SEAP aktivity (cps) po působení supematantu z FPV-T7 infikovaných buněk, které byly transfekovány sérií plazmidů pOLTV553 a u kterých proběhla superinfekce sNDV (viz tab. 3)

Plazmid pOLTV553NO pOLTV553Nl pOLTV553N2 pOLTV 5-5 3N3 io pOLTV553N4 pOLTV553N5

2,4 x 10³ 6,2 2,0

20,6

2,0

2,1

Tabulka 5: Aktivita SEAP (cps) po kotransfekcí CER buněk sérií plazmidů pOLTV553 15 a plazmidy pCIneoNP, pCIneoP a pCIneoL(c) (nebo pCíneo jako negativní kontrola).

Poměr plazmidů NP, P & L,P,pCIneo
pOLTV553NO	3.1 x 10’	2.7xlOJ	11.7
POLTV553N1	4.1	5.2	7.9
POLTV553N2	3.1	3.1	10.0
POLTVS53N3	35.9	3.6	100.8
15 pOLTV553N4	1.9	4.6	4.1
POLTV553N5	1.0	4.1	2.5

Claims (31)

1. PATENTOVÉ NÁROKY
2. 2. cDNA podle nároku 1 obsahující cDNA úplné délky.
3. 3. cDNA obsahující alespoň sekvenci nukleové kyseliny odpovídající 5’ konci genomu ptačího paramyxoviru umožňující přípravu replikujícího se minigenomu ptačího paramyxoviru.
4. 4. cDNA podle nároku 1, 2 nebo 3 alespoň částečně odvozená od viru Newcastleské choroby

   35 drůbeže.
5. 5. cDNA podle nároku 4, kde virus Newcastleské choroby drůbeže je lentogenní virus, výhodně odvozený od vakcinaěního kmene.

   40

   5’ konci genomu viru Newcastleské choroby drůbeže jak je vidět z obrázku 6, umožňující přípravu infekční kopie ptačího paramyxoviru.
6. 6. cDNA podle nároku 5, kde vakcinační kmen je kmen LaSota ATCC VR-699.
7. 7. cDNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 s dodatečně provedenou modifikací nukleové kyseliny, kde modifikace je vybrána ze skupiny obsahující delecí, inserci, mutaci, a reverzi.
8. 8. cDNA podle nároku 7, kde se modifikace týká nukleové kyseliny kódující modifikované štěpné místo proteasy.
9. 9. cDNA podle nároku 8, kde štěpné místo je štěpné místo proteasy fúzního proteinu F.
10. 10. cDNA podle nároku 7, kde modifikace obsahuje nukleovou kyselinu kódující hybridní virový protein.
11. 11. cDNA podle nároku 10, kde protein je protein hemaglutinin neuraminidasy HN.
12. 12. cDNA podle nároku 7, kde uvedená modifikace obsahuje deleci nukleové kyseliny kódující virový protein.
13. 13. cDNA podle nároku 12, kde virový protein je matrixový protein M.
14. 14. cDNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13 dodatečně opatřená nukleovou kyselinou kódující heterologní antigen.
15. 15. cDNA podle nároku 14, kde antigen je odvozen z drůbežího patogenu.
16. 16. cDNA podle nároku 14 nebo 15 dodatečně vybavená nukleovou kyselinou kódující protein stimulující imunitu nebo jeho část.
17. 17. RNA získaná z cDNA podle kteréhokoliv z nároků l až 16.
18. 18. Způsob přípravy infekční kopie ptačího paramyxoviru, vyznačující se tím, že se transfekuje alespoň jedna buňka cDNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16, kde buňka je schopná alespoň exprese virového nukleokapsidu NP, fosfoproteinu P a velkého polymerasového proteinu L.
19. 19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že dále obsahuje možnost štěpení fúzního proteinu viru.
20. 20. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 18a 19, vyznačující se tím, že se buňky 35 dále pěstují v médiu majícím proteolytickou aktivitu.
21. 21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že růstové médium obsahuje alantoickou tekutinu mající proteolytickou aktivitu.

    40 22. Způsob podle kteréhokoli nároku 18 až 21, vyznačující se tím, že se buňka odvozuje od kuřecí buňky.
22. 22.
23. 23. Infekční kopie ptačího paramyxoviru získaná způsobem podle kteréhokoliv z nároků 18 až
24. 24. Vakcína obsahující virus podle nároku 23,
25. 25. Živá vakcína podle nároku 24.

    50

    25 1. cDNA ptačího paramyxoviru obsahující alespoň sekvenci nukleové kyseliny odpovídající
26. 26. Vakcína podle nároku 24 nebo 25, kde infekční kopie ptačího paramyxoviru je alespoň částečně odvozena z viru Newcastleské choroby drůbeže NDV.
27. 27. Způsob rozlišení nevakcinovaných zvířat nebo zvířat vakcinovaných NDV vakcínou podle nároku 26 od zvířat infikovaných divokým typem NDV nebo vakcinovaných nemodifikovaným

    55 mesogenním či lentogenním NDV kmenem, vyznačující se tím, že se určí přítomnost protilátek směrovaných proti imunodominantnímu epitopu nebo markéru exprimovanému divokým typem nebo nemodifikovaným NDV, ale nikoli vakcínou ve vzorku ze zvířete.
28. 28. Způsob podle nároku 27, v y z n a č ii j í c í se tí m, že protilátky jsou generovány proti 5 HN či F proteinu NDV.
29. 29. Způsob podle nároku 27 nebo 28, vyznačující se tím, že se zvíře vybere ze skupiny tvořené drůbeží, výhodně kuřaty.

    ío
30. 30. Infekční ptačí paramyxovir obsahující heterologní gen získatelný způsobem podle některého z nároků 18 až 23.
31. 31, Infekční ptačí paramyxovir podle nároku 30, kde heterologní gen je imunní stimulační protein.