CN114214338B - 猪源piv5全长感染性克隆及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及猪源副流感病毒5型(PIV5)全长感染性克隆及其制备方法和应用，本发明利用一株分离自中国湖北腹泻猪的PIV5毒株，构建出以细菌质粒为骨架的病毒感染性克隆pPIV5‑HuB/YC，并能成功拯救出病毒，这是国内首次构建猪源PIV5全长感染性克隆。同时，将EGFP基因插入PIV5感染性克隆病毒基因组中，成功拯救出能表达该绿色荧光蛋白的重组PIV5病毒。在此基础之上，将猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的S基因替换EGFP基因，并成功拯救出能表达PDCoV S的重组PIV5病毒。本发明为深入开展PIV5的基础和应用研究提供了有效的平台，具有重要的科学应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及猪源PIV5全长感染性克隆及其制备方法和应用。
背景技术
副流感病毒5型(Parainfluenza virus 5，PIV5)属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)、腮腺炎病毒属(Rubulavirus)，其基因组为单股负链RNA，长度为15246nt。PIV5的基因组全长结构为3’-Leader-NP-V/P-M-F-SH-HN-L-Trailer-5’，即从3’端到5’端，除去前导序列(Leader sequence)和尾随序列(Trailer sequence)，依次编码核衣壳蛋白(Nuoleocapsid protein,NP)、V蛋白/磷酸化蛋白(Phosphoprotein,P)、膜基质蛋白(Matrix protein,M)、融合蛋白(Fusion protein,F)、小疏水性蛋白(Smallhydrophobic protein,SH)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(Hemagglutinin-neuraminidase,HN)以及聚合酶蛋白(Largeprotein,L)。其中，V蛋白、SH蛋白为非结构蛋白。
自上世纪五十年代从猴分离以来，又陆续从人、猪、牛等哺乳动物分离。目前，PIV5在我国已经呈现一定程度的地理分布，包括黑龙江、吉林、河南、湖北、江西、上海、广东、新疆等地都有关于PIV5分离株的报道，且宿主众多，包括猪、牛、犬、东北虎、小熊猫、穿山甲、马等。
PIV5是疫苗开发中优秀的病毒载体，有关PIV5重组疫苗的研究方兴未艾。近些年以来，科研人员不停地探索以PIV5为疫苗载体的可行性。常见的方案是插入某种病毒的保护性抗原基因到PIV5中，利用PIV5的复制和翻译来表达所插入的外源基因。鉴于PIV5可以通过呼吸道方式水平传播，常有科研人员利用这一优势，着力于控制某些呼吸道病毒感染。鉴于此，深入开展病毒的分子生物学特性、复制机制等研究，将有利于我们全面透彻的了解PIV5，从而为以PIV5作为基因工程疫苗载体的研究和病毒的基因功能研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪源PIV5全长感染性克隆的制备方法及应用。本发明利用一株分离自湖北某猪场腹泻猪的PIV5毒株，构建出以细菌质粒为骨架的病毒感染性克隆并能成功拯救出病毒，这是国内首次构建猪源PIV5全长感染性克隆。同时，将EGFP插入PIV5感染性克隆病毒基因组中，成功拯救出能表达该绿色荧光蛋白的重组PIV5病毒。在此基础之上，将猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的S基因替换EGFP基因，并成功拯救出能表达PDCoV S的重组PIV5病毒。本发明为深入开展PIV5的基础和应用研究提供了有效的平台，具有重要的科学应用价值。
为了实现上述发明，本发明采用的技术方案为：
一种猪源PIV5全长感染性克隆，所述猪源PIV5全长感染性克隆包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的序列。
猪源PIV5全长感染性克隆引物，所述引物序列如下：
本发明还提供一种猪源PIV5全长感染性克隆的制备方法，包括如下步骤：
提取PIV5/HuB/YC的RNA，以反转录得到的cDNA为模板，采用权利要求2所述的引物进行扩增，将得到的片段克隆至pCAGGS载体，得到pPIV5-NP、pPIV5-P、pPIV5-L辅助质粒；采用上述片段及辅助质粒构建pPIV5-HuB/YC病毒全长感染性克隆质粒，病毒拯救后得到猪源PIV5全长感染性克隆；将EGFP基因替换pPIV5-HuB/YC中的SH基因，得到pPIV5-HuB/YCΔSH/eG重组质粒，成功拯救出表达绿色荧光蛋白的重组PIV5病毒；将猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的S基因替换pPIV5-HuB/YCΔSH/eG中的EGFP基因，并成功拯救出能表达PDCoV-S的重组PIV5病毒。
一种猪源PIV5全长感染性克隆的制备方法，包括如下步骤：
(1)PIV5/HuB/YC株基因组全序列的扩增；
(2)pPIV5-NP、pPIV5-P、pPIV5-L辅助质粒的构建；
(3)pPIV5-HuB/YC病毒感染性克隆质粒的构建；
(4)pPIV5-HuB/YCΔSH/eG重组质粒的构建；
(5)pPIV5-HuB/YCΔSH/PDCoV-S重组质粒的构建；
(6)亲本病毒(rHuB/YC)与重组病毒(rHuB/YCΔSH/eG、rHuB/YCΔSH/PDCoV-S)拯救。
步骤(1)、(2)、(3)、(4)和(5)中，使用权利要求1所述的猪源PIV5全长感染性克隆的制备用引物。
步骤(1)、(2)中，提取PIV5/HuB/YC株的RNA，经过反转录得到cDNA；以cDNA为模板，分别用引物对通过PCR扩增得到NP、P、LA、LB、LC片段；将NP片段克隆至pCAGGS载体，得到pPIV5-NP；将P片段插入pCAGGS载体，得到重组质粒pPIV5-P；将LA片段插入pCAGGS载体，得到pPIV5-LA；将LB片段插入pPIV5-LA载体，得到pPIV5-LAB；将LC片段插入pPIV5-LAB载体，得到pPIV5-L。
步骤(3)中，分别用引物对通过PCR扩增得到S、Q、A、B、C、D1、D2片段；用引物HuB-S-F、HuB-Q-R通过Overlap，得到SQ片段；用引物HuB-B1-F、HuB-B2-R通过Overlap，得到B片段；将SQ片段克隆至pACYC177载体，得到pPIV5-Stuf；将A片段克隆至pPIV5-Stuf载体，得到pPIV5-A；将C、D1、D2片段克隆至pPIV5-Stuf载体，得到pPIV5-CD；将A片段克隆至pPIV5-CD载体，得到pPIV5-ACD；最后将B片段克隆至pPIV5-ACD载体，得到pPIV5-HuB/YC。
步骤(4)中，分别用引物对通过PCR扩增得到E、F、G片段；用引物HuB-E-F、HuB-F-R通过Overlap，得到EF片段；用引物HuB-E-F、HuB-G-R通过Overlap，得到EFG片段；将EFG片段克隆至pPIV5-HuB/YC，得到pPIV5-HuB/YCΔSH/eG。
步骤(5)中，用引物对通过PCR扩增得到PDCoV S片段，将其克隆至pPIV5-HuB/YCΔSH/eG中，得到pPIV5-HuB/YCΔSH/PDCoV-S。
步骤(6)中，pPIV5-HuB/YC转染BHK-21细胞后，可拯救亲本病毒rHuB/YC；pPIV5-HuB/YCΔSH/eG转染BHK-21细胞后，可拯救重组病毒rHuB/YCΔSH/eG；pPIV5-HuB/YCΔSH/PDCoV-S转染BHK-21细胞后，可拯救重组病毒rHuB/YCΔSH/PDCoV-S。
进一步的，病毒拯救步骤中质粒的用量及比例如下所示：
本发明还提供上述猪源PIV5全长感染性克隆或引物在制备PIV5诊断试剂和/或疫苗中的应用。
本发明还提供前述的引物或前述的制备方法在制备PIV5疫苗载体中的应用，以及前述的制备方法制备的猪源PIV5全长感染性克隆。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明利用一株分离自中国湖北某猪场腹泻猪的PIV5毒株，构建出以细菌质粒为骨架的病毒感染性克隆并能成功拯救出病毒，这是国内首次构建猪源PIV5全长感染性克隆，为更好地研究我国猪源PIV5的生物学特性奠定了基础。同时，用EGFP替换猪源PIV5感染性克隆中的SH基因，成功拯救出能表达该绿色荧光蛋白的重组PIV5病毒。本研究首次将报告基因EGFP插入猪源PIV5感染性克隆病毒基因组中，该基因能够在BHK-21、ST-R等等多种细胞系上进行表达。这种重组病毒可用作工具，在该病毒的基础和应用研究中起重要作用。在此基础之上，将猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的S基因替换EGFP基因，并成功拯救出能表达PDCoV S的重组PIV5病毒，为以PIV5为载体的疫苗研究奠定了基础。
所拯救的两种重组病毒滴度高，短约0.8kb、长至3.5kb的外源基因不仅能够正常表达，且其表达量也较为可观，能够与其对应的单克隆抗体或多克隆抗体发生反应。这意味着PIV5极有可能是优良的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的S基因的疫苗载体，为缓解新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情提供了一种崭新的解决方案。本发明为深入开展PIV5的基础和应用研究提供了有效的平台，具有重要的科学应用价值。
附图说明
图1：PIV5遗传进化分析；注：图中实心黑圆的毒株为PIV5/HuB/YC株；
图2：辅助质粒构建示意图；
图3：猪源PIV5感染性克隆构建示意图：A：PIV5/HuB/YC全长感染性克隆构建示意图；B：PIV5/HuB/YC-ΔSH/eG构建示意图；C：PIV5/HuB/YC-ΔSH/PDCoV-S构建示意图
图4：感染性克隆的构建；
图5：荧光显微镜观察拯救的病毒：A：rHuB/YC感染ST-R细胞IFA(20×)；B：正常ST-R细胞(20×)；C:rHuB/YCΔSH/eG感染ST-R细胞(20×)；D：正常ST-R细胞(20×)；E：rHuB/YCΔSH/PDCoV-S感染ST-R细胞(20×)；F：正常ST-R细胞(20×)；
图6：拯救病毒的Western Blot鉴定：A：rHuB/YC、rHuB/YCΔSH/eG病毒感染ST-R细胞，Western Blot检测分析结果(一抗为本实验室保存的PIV5 NP蛋白单克隆抗体)；B：rHuB/YCΔSH/PDCoV-S感染ST-R细胞，Western Blot检测分析结果(一抗为本实验室保存的PIV5 NP蛋白单克隆抗体)；C：rHuB/YCΔSH/PDCoV-S感染ST-R细胞，Western Blot检测分析结果(一抗为本实验室保存的PDCoV-S1-CTD多克隆抗体)
图7：rHuB/YC、rHuB/YCΔSH/eG病毒在ST-R细胞上的生长动力学曲线；
图8：天然免疫相关因子检测；
图9：rHuB/YC以及rHuB/YCΔSH/eG按MOI＝1感染ST细胞的试验结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
1材料与方法
1.1病毒、细胞、菌株及参考序列
实验室保存有2015年分离自湖北某猪场腹泻猪的PIV5/HuB/YC毒株(GenBankaccession number:MT890699)。BHK-21细胞、ST-R细胞(猪睾丸细的胞)、pCAGGS载体、pACYC177载体、大肠杆菌TOP10感受态细胞由本实验室保存。
1.2主要试剂和仪器
限制性内切酶、Prime STARTM DNA Polymerase购自Takara公司(北京)；RNA提取试剂盒购自杭州博日生物科技有限公司；DNA Marker、反转录试剂盒购自南京Vazyme公司；质粒DNA小量提取试剂盒、PCR纯化试剂盒以及胶回收试剂盒均购自Omega Bio-tek公司；Gibson Assembly Kit购自NEB；PIV5 NP蛋白单克隆抗体由本实验室提供；Dylight 488标记的羊抗鼠单克隆抗体购自Abbkine；凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司；PCR仪购自Bio-Rad公司；荧光显微镜购自LeiCa公司。
1.3引物设计
设计全长感染性克隆所需引物，如表1所示。
表1全长感染性克隆所需引物
注：F正向引物，R：反向引物；引物中的限制性内切酶位点用下划线标出；表1中，引物从上至下依次为SEQ ID No.1-34。
1.4PIV5/HuB/YC株基因组全序列的扩增
提取PIV5/HuB/YC的RNA，然后按
III 1st strand cDNASynthesis Kit(+gDNA wiper)试剂盒说明书反转录得到cDNA。以cDNA为模板，分别用引物NP(SEQ IDNo.1-2)、P(SEQ ID No.2-4)、LA(SEQ ID No.5-6)、LB(SEQ ID No.7-8)、LC(SEQ ID No.9-10)、S(SEQ ID No.11-12)、Q(SEQ ID No.13-14)、A(SEQ ID No.15-16)、B1(SEQ ID No.17-18)、B2(SEQ ID No.19-20)、C(SEQ ID No.21-22)、D1(SEQ ID No.23-24、D2(SEQ ID No.25-26)、E(SEQ ID No.27-28)、F(SEQ ID No.29-30)、G(SEQ ID No.31-32)通过PCR扩增，得到NP、P、LA、LB、LC、S、Q、A、B1、B2、C、D1、D2、E、F、G片段。经测序、拼接后获得PIV5/HuB/YC株全基因组，将该序列与GenBank已公布其他PIV5毒株全基因组序列进行序列比对，结果导入MEGA7.0.26软件，采用最大似然法(Maximum Likelihood,ML)对全基因组序列绘制遗传进化树(Bootstrap＝1000)。
1.5辅助质粒的构建
将NP片段克隆至pCAGGS载体，得到pPIV5-NP；将P片段插入pCAGGS载体，得到重组质粒pPIV5-P；将LA片段插入pCAGGS载体，得到pPIV5-LA；将LB片段插入pPIV5-LA载体，得到pPIV5-LAB；将LC片段插入pPIV5-LAB载体，得到pPIV5-L。
1.6 pPIV5-HuB/YC的构建
利用引物对HuB-S-F、HuB-Q-R，将片段S、Q通过Overlap得到SQ片段；利用引物对HuB-B1-F、HuB-B2-R，将片段B1、B2通过Overlap，得到B片段；将SQ片段克隆至pACYC177载体，得到pPIV5-Stuf；将A片段克隆至pPIV5-Stuf载体，得到pPIV5-A；将C、D1、D2片段克隆至pPIV5-Stuf载体，得到pPIV5-CD；将A片段克隆至pPIV5-CD载体，得到pPIV5-ACD；最后将B片段克隆至pPIV5-ACD载体，得到猪源PIV5全长感染性克隆pPIV5-HuB/YC，所述猪源PIV5全长感染性克隆pPIV5-HuB/YC包括如SEQ ID NO:1所示的序列。
1.7 pPIV5-HuB/YC-ΔSH/eG的构建
利用引物对HuB-E-F、HuB-F-R，将E、F片段通过Overlap得到EF片段；利用引物对HuB-E-F、HuB-G-R，将EF、G片段通过Overlap得到EFG片段；将EFG片段克隆至pPIV5-HuB/YC，得到缺失SH基因、表达EGFP基因的猪源PIV5感染性克隆pPIV5-HuB/YCΔSH/eG，所述pPIV5-HuB/YCΔSH/eG包括如SEQ ID NO:2所示的序列。
1.8 pPIV5-HuB/YC-ΔSH/PDCoV-S的构建
利用引物对PDCoV-S-F、PDCoV-S-R，通过PCR扩增得到PDCoV S片段，将其克隆至pPIV5-HuB/YC-ΔSH/eG，得到缺失SH基因、表达猪德尔塔冠状病毒S基因的猪源PIV5感染性克隆pPIV5-HuB/YC-ΔSH/PDCoV-S，所述pPIV5-HuB/YCΔSH/eG包括如SEQ ID NO:3所示的序列。
1.9病毒拯救
按照如下操作进行5个重组质粒的共转染：
①、将生长状态良好的BHK-21细胞均匀铺到六孔板中，待BHK-21细胞贴壁并生长至六孔板一孔的70％～80％时；
②、将125μL的Opti-MEM DMEM、5μL的P3000 Reagent与T7-opt、pCAGGS-NP、pCAGGS-P、pCAGGS-L、感染性克隆混匀，室温下静置5min，质粒的用量及比例如下表所示：
③、将125μL的Opti-MEM DMEM与3.75μL的Lipofectamine 3000Regant混匀，室温下静置5min；
④、将②和③中的混合液一同混匀，室温下静置15min
⑤、将④中混合液加至BHK-21细胞培养基中，轻轻晃动六孔板后，放置于37℃，5％CO2恒温培养箱继续恒温培养；
⑥、恒温培养6h后，弃去六孔板中的上清液，加入2mL含有2％胎牛血清的DMEM培养基，放置于37℃，5％ CO2恒温培养箱继续恒温培养；
⑦、视BHK-21细胞的生长状况，4～5d后收集上清液，标记为P1代，冻存于-80℃冰箱备用。
1.10拯救病毒的鉴定
1.10.1间接免疫荧光鉴定
取300μL的P1代病毒液感染提前准备好的生长状态良好的ST-R细胞(铺于六孔板中)，同时设置正常的ST-R细胞作为阴性对照。37℃，5％ CO2恒温培养箱孵育2h后，弃去六孔板中的上清液；加入2mL含有2％胎牛血清的DMEM培养基，放置于37℃，5％ CO2恒温培养箱继续恒温培养。3d后，收取上清液，分别标记为P2代。所拯救的重组病毒直接在倒置荧光显微镜下观察；而所拯救的亲本病毒按如下操作进行间接免疫荧光鉴定：
①、取出六孔板，弃去上清，用PBS缓冲液清洗2遍；
②、固定：加入4％多聚甲醛，室温环境下固定10min，用PBS缓冲液清洗2遍；
③、封闭：加入终浓度为0.1％的TritonX-100和2％ BSA，室温下破膜封闭30min，用PBS缓冲液清洗2遍；
④、一抗孵育：将PIV5 NP单克隆抗体或PDCoV-S1-CTD多克隆抗体按照1:1000的比例稀释，37℃孵育1h，用PBS缓冲液清洗3遍；
⑤、二抗孵育：Dylight 488标记的羊抗鼠单克隆抗体按照1:1000的比例稀释，37℃孵育1h，用PBS缓冲液清洗2遍；
⑥、倒置荧光显微镜观察结果。
1.10.2 Western Blot鉴定
取P2代病毒液，分别按MOI＝1感染ST-R细胞，接毒后2h换液为2mL含2％胎牛血清的培养基，然后分别在病毒感染后72h收集蛋白样品。其中，一抗使用抗PIV5 NP蛋白单克隆抗体或PDCoV-S1-CTD多克隆抗体，二抗使用HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG。
1.10.3生长特性的探究
为了解所拯救病毒的生长特性，将其分别按MOI＝1接种PIG-PAM(3D4/21)、ST、ST-R、PK-15、LLC-PK1、IPEC-J2、Vero、MDCK、MDBK细胞，120h后收取上清液，检测滴度。
为了更进一步的了解所拯救病毒的生长特性，按照如下操作绘制生长曲线：
①、将生长状态良好的ST-R细胞均匀地铺到六孔板中，待ST-R细胞贴壁并生长至90％左右的时候，弃去上清，取P2代病毒液分别按MOI＝1感染ST-R细胞(每个毒株都设置复孔)，同时设置正常的ST-R细胞作为阴性对照；
②、37℃，5％ CO2恒温培养箱孵育2h后，弃去上清，用高压灭菌过的PBS洗3遍，加2mL含2％胎牛血清的培养基，置于37℃，5％ CO2恒温培养箱继续恒温培养；
③、分别在病毒感染后12h，24h，48h，72h，96h这5个时间点分别收集病毒液150μL，再补加150μL含2％胎牛血清的DMEM培养基；
④、将收集到的病毒液置于-80℃冻存，而后进行毒价测定。
1.11天然免疫相关因子检测为了探究SH在PIV5感染细胞的过程中是否发挥作用，分别将rHuB/YC以及rHuB/YCΔSH/eG的P2代病毒液按MOI＝1感染ST细胞，在48h和96h收取细胞样品，提取cDNA后通过qPCR实验检测IFN-β、IFN-γ、TNF-α、MX1、RIG-I、IRF3基因的表达是否会因为SH的缺失而有所不同，实验重复两次。
2.结果
2.1 PIV5/HuB/YC株遗传进化分析
将PIV5/HuB/YC株的全基因组序列与GenBank已公布的其他PIV5毒株全基因组进行遗传进化分析，采用最大似然法绘制遗传进化树(图1)。结果表明，该毒株与中国猪源SH-1202株亲缘关系最为接近，并且与之处于同一分支；与俄罗斯人源Moskva株亲缘关系最远。值得注意的是，目前所有的猪源PIV5毒株中，只有中国猪源毒株具有SH基因，其他国家猪源毒株由于起始密码子突变为终止密码子等导致其SH基因无法正常表达。
2.2所拯救亲本病毒的间接免疫荧光鉴定
取300μL的P1代病毒液感染ST-R细胞，同时设置正常的ST-R细胞作为阴性对照。3d后，对其进行间接免疫荧光鉴定(一抗为本实验室保存的抗PIV5NP蛋白单克隆抗体)，检测病毒蛋白的表达。倒置荧光显微镜下观察到特异性的绿色荧光(图5A、B)，表明所拯救病毒感染ST-R细胞，有PIV5蛋白的表达，同时也表明拯救出了具有感染性的PIV5病毒。
2.3缺失SH基因、表达EGFP基因的重组病毒的倒置荧光显微镜鉴定
取300μL的P1代病毒液感染ST-R细胞，同时设置正常的ST-R细胞作为阴性对照。3d后，倒置荧光显微镜下可直接观察到特异性的绿色荧光(图5C、D)，表明所拯救重组病毒感染ST-R细胞，有绿色荧光蛋白的表达，同时也表明拯救出了具有感染性的PIV5病毒。这是首次将EGFP基因插入到猪源PIV5感染性克隆中，该重组病毒可用作有利工具，在该病毒的基础和应用研究中起重要作用。
2.4缺失SH基因、表达PDCoV S基因的重组病毒的倒置荧光显微镜鉴定
取300μL的P1代病毒液感染ST-R细胞，同时设置正常的ST-R细胞作为阴性对照。3d后，对其进行间接免疫荧光鉴定(一抗为本实验室保存的PDCoV-S1-CTD多克隆抗体)，检测病毒蛋白的表达。倒置荧光显微镜下观察到特异性的绿色荧光(图5E、F)，表明所拯救病毒感染ST-R细胞，有PDCoV S蛋白的表达，同时也表明拯救出了具有感染性的PIV5病毒。所表达的PDCoV S蛋白能够与其对应的多克隆抗体发生反应，这意味着可将PIV5用作疫苗载体表达其他病毒的关键蛋白，譬如新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的S基因，为缓解新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情提供了一种崭新的解决方案。
2.5所拯救病毒的Western Blot鉴定取所拯救的亲本病毒和重组病毒分别感染ST-R细胞，制备全细胞裂解物通过Western印迹分析(图6)，结果表明所拯救病毒感染的ST-R细胞样品中存在目的蛋白。
2.6所拯救病毒的生长特性
将所拯救病毒分别按MOI＝1接种PIG-PAM(3D4/21)、ST、ST-R、PK-15、LLC-PK1、IPEC-J2、Vero、MDCK、MDBK细胞，120h后收取上清液，检测滴度(图7)。结果表明，对于前六种猪源细胞系而言，所拯救病毒在PIG-PAM(3D4/21)上的滴度最高，生长状况最好，；而同样是肾细胞，在PK-15上的滴度要比LLC-PK1高近一个梯度；较猴源、犬源、牛源细胞系，所拯救病毒在猪源细胞系滴度更高，生长状况更好。PIG-PAM(3D4/21)是猪肺泡巨噬细胞，在不同细胞系的生长特性提示，猪源PIV5作为疫苗载体时，呼吸道接种可能是优良的疫苗接种方式，有利于产生更好的免疫效果。
为了进一步了解所拯救病毒的生长特性，将所拯救的亲本病毒与重组病毒分别按MOI＝1接种到ST-R细胞上，做病毒生长曲线分析(图8)。结果表明，所拯救的重组病毒与亲本病毒具有相似的复制能力和增殖特性，均在感染后96h达到最高滴度。
2.7天然免疫相关因子检测
将rHuB/YC以及rHuB/YCΔSH/eG按MOI＝1感染ST细胞，分别在48h和96h收取细胞样品，提取cDNA后进行qPCR实验(图9)。结果表明，病毒在缺失SH基因后感染ST细胞，细胞中TNF-α的表达量显著提高。尽管还不知机理如何，但是TNF-α可以激活通路导致细胞凋亡。将SH基因替换为外源基因后，TNF-α的表达量显著提高，感染细胞后较rHuB/YC的CPE更为明显。因而对于宿主来说，SH基因位点处作为外源基因的插入位点要更加安全。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 猪源PIV5全长感染性克隆及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3121
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagatgatct tcttgagatc gttttggtct gcgcgtaatc tcttgctctg aaaacgaaaa 60
aaccgccttg cagggcggtt tttcgaaggt tctctgagct accaactctt tgaaccgagg 120
taactggctt ggaggagcgc agtcaccaaa acttgtcctt tcagtttagc cttaaccggc 180
gcatgacttc aagactaact cctctaaatc aattaccagt ggctgctgcc agtggtgctt 240
ttgcatgtct ttccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 300
actgaacggg gggttcgtgc atacagtcca gcttggagcg aactgcctac ccggaactga 360
gtgtcaggcg tggaatgaga caaacgcggc cataacagcg gaatgacacc ggtaaaccga 420
aaggcaggaa caggagagcg cacgagggag ccgccagggg gaaacgcctg gtatctttat 480
agtcctgtcg ggtttcgcca ccactgattt gagcgtcaga tttcgtgatg cttgtcaggg 540
gggcggagcc tatggaaaaa cggctttgcc gcggccctct cacttccctg ttaagtatct 600
tcctggcatc ttccaggaaa tctccgcccc gttcgtaagc catttccgct cgccgcagtc 660
gaacgaccga gcgtagcgag tcagtgagcg aggaagcgga atatatcctg tatcacatat 720
tctgctgacg caccggtgca gccttttttc tcctgccaca tgaagcactt cactgacacc 780
ctcatcagtg ccaacatagt aagccagtat acactccgct agcgctgagg tctgcctcgt 840
gaagaaggtg ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc catcatccag ccagaaagtg 900
agggagccac ggttgatgag agctttgttg taggtggacc agttggtgat tttgaacttt 960
tgctttgcca cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg tgatctgatc cttcaactca 1020
gcaaaagttc gatttattca acaaagccac gttgtgtctc aaaatctctg atgttacatt 1080
gcacaagata aaaatatatc atcatgaaca ataaaactgt ctgcttacat aaacagtaat 1140
acaaggggtg ttatgagcca tattcaacgg gaaacgtctt gctcgaggcc gcgattaaat 1200
tccaacatgg atgctgattt atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca 1260
ggtgcgacaa tctatcgatt gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat 1320
ggcaaaggta gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg 1380
gaatttatgc ctcttccgac catcaagcat tttatccgta ctcctgatga tgcatggtta 1440
ctcaccactg cgatccccgg gaaaacagca ttccaggtat tagaagaata tcctgattca 1500
ggtgaaaata ttgttgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcattc gattcctgtt 1560
tgtaattgtc cttttaacag cgatcgcgta tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg 1620
aataacggtt tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa 1680
caagtctgga aagaaatgca taagcttttg ccattctcac cggattcagt cgtcactcat 1740
ggtgatttct cacttgataa ccttattttt gacgagggga aattaatagg ttgtattgat 1800
gttggacgag tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc 1860
ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct 1920
gatatgaata aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaatc agaattggtt 1980
aattggttgt aacactggca gagcattacg ctgacttgac gggacggcgg ctttgttgaa 2040
taaatcgaac ttttgctgag ttgaaggatc agatcacgca tcttcccgac aacgcagacc 2100
gttccgtggc aaagcaaaag ttcaaaatca ccaactggtc cacctacaac aaagctctca 2160
tcaaccgtgg ctccctcact ttctggctgg atgatggggc gattcaggcc tggtatgagt 2220
cagcaacacc ttcttcacga ggcagacctc agcgctcaaa gatgcagggg taaaagctaa 2280
ccgcatcttt accgacaagg catccggcag ttcaacagat cgggaagggc tggatttgct 2340
gaggatgaag gtggaggaag gtgatgtcat tctggtgaag aagctcgacc gtcttggccg 2400
cgacaccgcc gacatgatcc aactgataaa agagtttgat gctcagggtg tagcggttcg 2460
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gtcggctgtg gcacaggctg aacgccggag gatccgcggc cgctaatacg actcactata 2580
gggagaggga gattggtctg atgagtccgt gaggacgaaa cggagtctag actccgtcac 2640
caaggggaaa atgaagtggt gactcaaatc atcaaagacc ctcgagatta cataggtccg 2700
gaacttatgg ccttcgtgac cgacctcgag tcagagtagt tcaataagga cctatcaagt 2760
ttgggcaatt tttcgtcccc gacacaaaaa tgtcatccgt gcttaaagca tatgagcgat 2820
tcacactcac tcaagaactg caagatcaga gtgaggaagg tacaatccca cctacaacac 2880
taaaaccggt aatcagggta tttatactaa cctctaataa cccagagcta agatcccggc 2940
ttcttctatt ctgcctacgg attgttctca gtaatggtgc aagggattcc catcgctttg 3000
gagcattact tacaatgttt tcgctaccat cagccacaat gctcaatcat gtcaaattag 3060
ctgaccagtc accagaagct gatatcgaaa gggtagagat cgatggcttt gaggagggat 3120
c 3121
<210> 2
<211> 1060
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgcaactct tggaacaaga taagacagta atccattagt aatttttaag aaaaaaacga 60
taggaccgaa actagtattg aaagaaccgt ctcggtcaat ctaggtaatc gagctgatac 120
cgtctcggaa agctcaaatc gtcgacacca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg 180
gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt 240
ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca 300
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<212> DNA
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tgtatactgg ctctcttact ggagctatgg tatttggagg actgactgcc gcagctgcaa 2400
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tcatgcatgc agtgctagta cccaacaaat tcacacgtgt caacgcttct gccggcattt 3000
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aggcccgaac actaatcgtg ccggcagtgc cactgcacac acaacactac acatacaata 3780
cactacaatg gttgcagaag atgcccctgt taggggcact tgccgagtat tatttcgaac 3840
Claims (8)
1.猪源PIV5全长感染性克隆的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取PIV5/HuB/YC的RNA，以反转录得到的cDNA为模板，采用猪源PIV5全长感染性克隆引物进行扩增，将得到的片段克隆至pCAGGS载体，得到pPIV5-NP、pPIV5-P、pPIV5-L辅助质粒；采用上述片段及辅助质粒构建pPIV5-HuB/YC病毒全长感染性克隆质粒，并进一步得到pPIV5-HuB/YCΔSH/eG、pPIV5-HuB/YCΔSH/PDCoV-S重组质粒，病毒拯救后得到猪源PIV5全长感染性克隆；所述猪源PIV5全长感染性克隆包含如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ IDNO:3所示的序列；
所述猪源PIV5全长感染性克隆引物序列如下：
2.根据权利要求1所述的猪源PIV5全长感染性克隆的制备方法，其特征在于，提取PIV5/HuB/YC株的RNA，经过反转录得到cDNA；以cDNA为模板，分别用引物对通过PCR扩增得到NP、P、LA、LB、LC片段；将NP片段克隆至pCAGGS载体，得到pPIV5-NP；将P片段插入pCAGGS载体，得到重组质粒pPIV5-P；将LA片段插入pCAGGS载体，得到pPIV5-LA；将LB片段插入pPIV5-LA载体，得到pPIV5-LAB；将LC片段插入pPIV5-LAB载体，得到pPIV5-L。
3.根据权利要求1所述的猪源PIV5全长感染性克隆的制备方法，其特征在于，分别用引物对通过PCR扩增得到S、Q、A、B1、B2、C、D1、D2片段；用引物HuB-S-F、HuB-Q-R通过Overlap，得到SQ片段；用引物HuB-B1-F、HuB-B2-R通过Overlap，得到B片段；将SQ片段克隆至pACYC177载体，得到pPIV5-Stuf；将A片段克隆至pPIV5-Stuf载体，得到pPIV5-A；将C、D1、D2片段克隆至pPIV5-Stuf载体，得到pPIV5-CD；将A片段克隆至pPIV5-CD载体，得到pPIV5-ACD；最后将B片段克隆至pPIV5-ACD载体，得到pPIV5-HuB/YC。
4.根据权利要求1所述的猪源PIV5全长感染性克隆的制备方法，其特征在于，分别用引物对通过PCR扩增得到E、F、G片段；用引物HuB-E-F、HuB-F-R通过Overlap，得到EF片段；用引物HuB-E-F、HuB-G-R通过Overlap，得到EFG片段；将EFG片段克隆至pPIV5-HuB/YC，得到pPIV5-HuB/YCΔSH/eG。
5.根据权利要求1所述的一种猪源PIV5全长感染性克隆的制备方法，其特征在于，用引物对PDCoV-S-F、PDCoV-S-R通过PCR扩增得到PDCoV-S片段，将其克隆至pPIV5-HuB/YCΔSH/eG，得到pPIV5-HuB/YCΔSH/PDCoV-S。
6.根据权利要求1所述的猪源PIV5全长感染性克隆的制备方法，其特征在于，pPIV5-HuB/YC转染BHK-21细胞后，拯救亲本病毒rHuB/YC；而pPIV5-HuB/YCΔSH/eG转染BHK-21细胞后，拯救重组病毒rHuB/YCΔSH/eG；pPIV5-HuB/YCΔSH/PDCoV-S转染BHK-21细胞后，拯救重组病毒rHuB/YCΔSH/PDCoV-S。
7.根据权利要求1所述的猪源PIV5全长感染性克隆的制备方法，其特征在于，病毒拯救步骤中质粒的用量及比例如下所示：
8.权利要求1所述方法在制备PIV5诊断试剂和/或疫苗中的应用。
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Applications Claiming Priority (1)
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Family
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2021
- 2021-08-26 CN CN202110986944.0A patent/CN114214338B/zh active Active
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