CN113817690B - 猪圆环病毒4型制备方法及其应用 - Google Patents

猪圆环病毒4型制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供猪圆环病毒4型制备方法及其应用，猪圆环病毒4型基因序列是在如SEQ ID NO.4所示的PCV4全基因组序列上游和下游插入调控序列得到，如SEQ ID NO.2所示的调控序列位于PCV4全基因组序列上游，如SEQ ID NO.3所示的调控序列位于PCV4全基因组序列下游。本发明首次制备得到的PCV4病毒样品，可用于PCV4感染及致病机制的研究、疫苗研发等，为PCV4感染引起的疫病提供理论依据及预防控制该疫病的有效工具，在临床、实验室研究上均具有广阔的应用前景。

Description

猪圆环病毒4型制备方法及其应用
技术领域
本发明属于病毒分子生物学技术及生物工程领域，具体涉及一种猪圆环病毒4型(porcine circovirus，PCV4)制备方法，人工制备的PCV4用于PCV4感染及致病机制的研究、疫苗研发等。
背景技术
猪圆环病毒4型(porcine circovirus，PCV4)是近几年在家猪中检测到的一种新型猪圆环病毒，在世界部分国家已有报道。PCV4的基因组大小为1770nt，包含12个可能的开放阅读框(ORF)，其ORF1和ORF2是两个主要的开放阅读框。ORF1大小为891nt，编码296个氨基酸的Rep蛋白；ORF2大小为687nt，编码228个氨基酸的Cap蛋白。
猪圆环病毒4型在患有呼吸系统疾病、腹泻和皮炎与肾病综合征的病猪中被发现，表明猪圆环病毒4型可能对养猪业构成潜在威胁。但目前尚未获得分离纯化的猪圆环病毒4型样品，也没有关于猪圆环病毒4型感染性克隆与病毒颗粒及其制备方法的研究报道。
发明内容
本发明提供一种人工制备的猪圆环病毒4型及制备方法，得到的猪圆环病毒4用于疫苗研发、病毒感染检测方法的建立、病毒感染及致病机制的研究。
本发明提供一种人工制备的猪圆环病毒4型，其基因序列为如SEQ ID NO.1所示的人工合成PCV4基因序列。
本发明所述的人工合成PCV4基因序列是在如SEQ ID NO.4所示的PCV4全基因组序列上游和下游插入调控序列得到，如SEQ ID NO.2所示的调控序列位于PCV4全基因组序列上游，如SEQ ID NO.3所示的调控序列位于PCV4全基因组序列下游。
本发明提供的猪圆环病毒4型的制备方法如下：
S1、在如SEQ ID NO.4所示的PCV4全基因组序列上游和下游插入调控序列得到如SEQ ID NO.1所示的人工合成PCV4基因序列，如SEQ ID NO.2所示的调控序列位于PCV4全基因组序列上游，如SEQ ID NO.3所示的调控序列位于PCV4全基因组序列下游；
S2、用所述的人工合成的PCV4基因序列替换pBluescript SK(+)质粒上Kpn I和SacI位点之间序列，构建成PCV4重组质粒pSK-PCV4，即为PCV4感染性克隆pSK-PCV4；
S3、将pSK-PCV4转染进PK-15细胞后培养后，收集上清液离心过滤获得人工制备的猪圆环病毒4型原液。
本发明还提供一种以所述的人工制备的猪圆环病毒4型为活性成分的活疫苗或灭活疫苗。
本发明的疫苗是以所述人工制备的猪圆环病毒4型作为种毒，参照猪圆环病毒灭活疫苗的生产工艺进行生产，本发明的灭活疫苗内可以加入免疫佐剂与疫苗赋形剂等，本领域技术人员可以容易的进行生产。
本发明提供的人工制备的猪圆环病毒4型为活性成分的灭活疫苗能达到较好的免疫保护效果。
本发明在现有的猪圆环病毒4型全基因组的基础上插入了上游和下游两段调控序列，实现了人工制备了猪圆环病毒4型。
本发明构建的PCV4感染性克隆pSK-PCV4是在pBluescript SK(+)质粒的基础上，插入人工合成的PCV4全基因组和调控序列DNA而成，其特征在于：调控序列DNA 5’-ggtacc-3’和5’-gagctc-3’分别位于人工合成的PCV4全基因组DNA的上游和下游。
本发明公开的PCV4感染性克隆pSK-PCV4可以在PK-15细胞内复制、表达，其中PCV4感染性克隆pSK-PCV4上的人工合成的PCV4全基因组在复制过程中可以利用其两端的调控序列DNA及自身的保守序列专一性的连接成长度为1770nt的单链环形DNA，并与表达形成的PCV4病毒蛋白组装成PCV4病毒。
本发明公开的制备方法适用于人工制备PCV4病毒，得到的PCV4病毒可用于PCV4疫苗研发、PCV4病毒感染检测方法的建立、PCV4病毒感染及致病机制的研究，相关研究可为PCV4感染引起的疫病提供理论依据，为预防控制该疫病提供有效工具，在临床、实验室研究上均具有广阔的应用前景。
附图说明
图1、pSK-PCV4的质粒图谱；
图2、pSK-PCV4的酶切鉴定；
1.DNA Marker 15000；2.pSK-PCV4经Sac I和Kpn I双酶切；3.pSK-PCV4经Sac I单酶切；4.pSK-PCV4经Kpn I单酶切；5.pSK-PCV4；
图3、负染电镜结果；
图4、PCV4的拷贝数在盲传1-4代中的变化。
具体实施方式
在本发明中若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1 PCV4感染性克隆的构建；
1)以NCBI上公开的PCV4序列(GenBank：MT311854.1)为基础，人工合成包含如SEQID NO.4所示PCV4全基因组和如SEQ ID NO.2所示的上游调控序列和如SEQ ID NO.3所示的下游调控序列的如SEQ ID NO.1所示人工合成PCV4基因序列；
2)将如SEQ ID NO.1所示人工合成PCV4基因序列连接到pBluescript SK(+)质粒相应位点上，替换pBluescript SK(+)质粒上Kpn I和SacI位点之间序列，构建成PCV4重组质粒pSK-PCV4，即PCV4感染性克隆pSK-PCV4，如图1所示。
实施例2 PCV4感染性克隆的鉴定；
提取pSK-PCV4重组质粒，利用Sac I和Kpn I核酸内切酶对pSK-PCV4进行37℃水浴15min的酶切反应的酶切鉴定。反应体系中各成分添加如下：
序号 试剂 含量
1 FastDigest enzyme 1μl
2 10×FasrDigest buffer 1μl
3 DNA 2μl
4 ddH2O 6μl
总计 10μl
酶切反应结束后对产物进行DNA水平凝胶电泳(0.8％Agarose、120V、30min)。如图2所示，在双酶切的泳道1中可以观察到2.8kb的pBluescrpt SK载体条带和1.7kb的PCV4序列条带；在单酶切的2、3泳道中可以观察到线性化的pSK-PCV4重组质粒，而泳道4是未经过酶切反应的自然状态下超螺旋结构的pSK-PCV4重组质粒。核酸测序表明，PCV4病毒基因组全长为1770bp，与合成序列的模板PCV4进行比对碱基完全一致。酶切及测序鉴定证明，成功构建了PCV4重组质粒pSK-PCV4。
所以本发明成功构建了可用于制备PCV4病毒的PCV4重组质粒pSK-PCV4，该重组质粒即为PCV4感染性克隆。
实施例3 PCV4病毒的拯救及电镜鉴定
1质粒：PCV4感染性克隆pSK-PCV4。
2细胞：猪肾上皮细胞(PK-15)。
3实验过程如下：
1)细胞转染
参照Lipofectamine 3000说明书，将pSK-PCV4转染进PK-15细胞中。
操作如下：在6孔板中接种细胞至70-90％时转染。将5μl的LipofectamineTM 3000试剂加入125μl的Opti-MEMTM培养基中混匀备用。将含有5μg DNA(0.5-5μg/μl)的pSK-PCV4质粒溶液和10μl的P3000TM试剂(2μl/μg DNA)加入125μl的Opti-MEMTM培养基。将上述两管混合均匀，室温孵育10-15分钟。将混合液用移液器轻轻吸起，缓慢均匀地滴加在上述培养的PK-15细胞中，可轻轻摇晃使混合液充分接触细胞，平稳地将细胞转移至37℃，5％CO2的温箱中培养。
2)病毒盲传
病毒的盲传是指在不确定是否存在病毒的情况下，按照病毒存在的情况传代接种新的细胞进行培养。
本发明中转染的细胞记为第0代，转染后的细胞培养72h，通过反复冻融法裂解细胞收集重组病毒，冻融后的病毒直接接种新的细胞记为盲传的第1代，之后每72h进行一次盲传记为一代，以此类推。每代次反复冻融获得的裂解液即为PCV4病毒原液。
3)电镜鉴定
在细胞盲传后，通过反复冻融法裂解细胞，离心后收集病毒样品，进行电镜负染观察病毒粒子形状。收集盲传至第四代的病毒，负染后进行电镜观察。结果如图3所示，在检测样品中可以清晰观察到典型的猪圆环病毒粒子，球形病毒粒子直径大约为20nm，证明成功拯救出了PCV4病毒。
实施例4 PCV4拯救病毒SYBR两步法荧光定量PCR鉴定
在盲传的过程中收集每一代的病毒，并提取病毒基因组DNA，用于对拯救的PCV4病毒拷贝数的检测。
本发明采取SYBR两步法荧光定量PCR，针对PCV4序列上100bp左右的片段进行扩增，从而确定该病毒的拷贝数。
将2×qPCR Mix 5μl、上下游引物各0.3μl、病毒基因组DNA模板1μl、ddH2O 3.4μl混合。经过预变性，35个循环的变性延伸、采集SYBR荧光信号，测定溶解曲线，计算相对定量结果。上述SYBR两步法荧光定量PCR检测中用到的特异引物序列为：
PCV4-qPCR-F：5’-GCAAGTGGTGGGATGGATATAA-3’，
PCV4-qPCR-R：5’-TGTCCATGAGTCTCAACAAGTC-3’。
在对病毒进行细胞盲传培养至第四代后通过检测PCV4的拷贝数确定拯救病毒的增殖情况。利用SYBR荧光定量PCR检测盲传1-4代中的病毒基因组DNA拷贝数，如图4所示，可以观察到，在盲传的第一代中因为转染后重组质粒的残留，拷贝数较高。在随后几代的盲传过程中，PCV4的拷贝数一直保持稳定，表明在重组质粒转染PK-15细胞后，细胞中存在病毒基因，也就是用PCV4感染性克隆可以拯救出PCV4病毒，同时也表明该病毒在PK-15细胞中具有良好的复制增殖能力。
上述结果证明，本发明拯救的PCV4病毒具有感染PK-15细胞和在该细胞中增殖、传代的能力。
用本发明实施例1制备的PCV4感染性克隆可以成功拯救出PCV4病毒，其可作为活性成分用于制备疫苗。
本发明的疫苗是以所述人工制备的猪圆环病毒4型作为种毒，参照猪圆环病毒灭活疫苗的生产工艺进行生产，本发明的灭活疫苗内可以加入免疫佐剂与疫苗赋形剂等，本领域技术人员可以容易的进行生产。经过验证，本发明提供的人工制备的猪圆环病毒4型为活性成分的灭活疫苗能达到较好的免疫保护效果。
本发明对比实施例为将如SEQ ID NO.4所示的PCV4全基因组序列替换pBluescript SK(+)质粒上Kpn I和SacI位点之间序列，其余步骤相同，不能成功拯救出PCV4病毒。
本发明对比实施例为将如SEQ ID NO.2和3所示的调控序列替换为其他调控序列再得到的新的序列用于替换pBluescript SK(+)质粒上Kpn I和SacI位点之间序列，其余步骤相同，不能成功拯救出PCV4病毒。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林大学
<120> 猪圆环病毒4型制备方法及其应用
<130> 2021
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1782
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 1
ggtacccagt attacccgag acatcggcac acttcggcac actcgagcgg cgcgagattg 60
tgccgagcac ccccctatcg atgataatgg cgggccaccc cgtgaagaga tattgtttca 120
ctcttaacaa ctacacagaa gaggaggaga agaaaattaa agaattcctt acctctgaga 180
actgtgagta cgctgttgtc gggaaggagg ttggagaaaa tggcaccccg cacctgcaag 240
ggtttgtgaa cctgaaaaag aaaatgaggt tccacccgtt taagaaagct atcggagagc 300
ggagccatat tgagcaggcc cgcggtactg attgtgataa taagaagtat tgctccaaag 360
gaggggactt actactggaa gtaggagagc ccagtgccca gggaaagcgc agcgacctta 420
aagcggctgt ggccgccctg aatgccggca gctcaatgag tgaagtggcc cgtgagttcc 480
cgtctgtatt tataaggtat gggcgtggcc tccgggacta cgtcattact gcaggcctgg 540
gtaagtcccg ggagtggaag actgaagtgc acgtcatcgt gggtatcccc ggcgtgggca 600
agtccagaca tgtccaagag aaggggggtg cggacctcta ctggaaacca cgtggcaagt 660
ggtgggatgg atataatggc cagagtcacg tggtcctcga tgactattat ggctggttgc 720
catatgatga cttgttgaga ctcatggaca gataccctct ccgtgtggag acaaaggggg 780
gttccattga gttcgtggcc aagacaatgt ggattaccag caacaagcag atcaaggact 840
ggtatgatta tgtggagctg aaagtggata tcagagccct gtaccggcgc gtgaccacct 900
atcaggtcat gagggaggat gggcaattgt atgatataca aatgacagga gacaataaaa 960
tcaattatta aacagacttt atttgtgtca tcacttcgga tactacactt gatcttagcc 1020
aaaaggctcg ttgattgagt gatcattacg cattatccct gtttggggta gttaacaagg 1080
tcaaattctc tgaattgcac atacagagta aatctcactg tccacacctg cacaaagtta 1140
gaattttgta tactgtattg gaggccatga tggactaggt cctggtccgc catgctgatc 1200
caccattggt ttcttttgtt gttaggctgg aagtggaggg tgtgggtttc cccagagggg 1260
tcctggggtt ttggagtgaa atagcgactg tgtctagcaa tattggtgaa accatgcctg 1320
ctgctgtggt ttgccaggac atcataagtt tggtttttcc cttcccccac atagtctcca 1380
tccagttgta tagcagtgct agagtaagtc ctattactgt taatgccatt tagtggcaga 1440
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tggtgggcgg ggtgtgccga tgtctcggtt 1770

Claims (2)

1.一种猪圆环病毒4型，其特征在于：其基因序列为如SEQ ID NO.1所示的人工合成PCV4基因序列，所述的人工合成PCV4基因序列是在如SEQ ID NO.4所示的PCV4全基因组序列上游和下游插入调控序列得到，如SEQ ID NO.2所示的调控序列位于PCV4全基因组序列上游，如SEQ ID NO.3所示的调控序列位于PCV4全基因组序列下游；
所述的猪圆环病毒4型的制备方法，步骤如下：
S1、在如SEQ ID NO.4所示的PCV4全基因组序列上游和下游插入调控序列得到如SEQID NO.1所示的人工合成PCV4基因序列，如SEQ ID NO.2所示的调控序列位于PCV4全基因组序列上游，如SEQ ID NO.3所示的调控序列位于PCV4全基因组序列下游；
S2、用所述的人工合成的PCV4基因序列替换pBluescript SK(+)质粒上Kpn I和SacI位点之间序列，构建成PCV4重组质粒pSK-PCV4；
S3、将所述的PCV4重组质粒pSK-PCV4转染进PK-15细胞后培养后，收集上清液离心过滤获得人工制备的猪圆环病毒4型原液。
2.一种将如权利要求1所述的圆环病毒4型作为活性成分的灭活疫苗。
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