CN117143833B - 一种猴腺病毒毒株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及腺病毒技术领域，具体涉及一种猴腺病毒毒株及其应用。实施例公开了一种猴腺病毒毒株，分类命名为猴腺病毒(Simian Adenovirus)SAdV GZ3‑12，保藏号为CCTCCNO:V202385，保藏日期为2023年8月3日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。该病毒在人群中的预存免疫水平较低，能够作为一种降低或避免预存免疫干扰的基础病毒载体使用，以提高对外源基因的表达效率。同时，该病毒还能够与人腺病毒组合制备成重组的病毒载体，以作为新型预存免疫低的猴腺病毒载体，并具有作为疫苗载体和治疗载体的重要现实意义和应用前景。

Description

一种猴腺病毒毒株及其应用
技术领域
本申请涉及腺病毒技术领域，具体涉及一种猴腺病毒毒株及其应用。
背景技术
腺病毒在自然界中拥有广泛的宿主，截至目前，根据腺病毒感染的宿主的差异，ICTV将腺病毒分为6个属共87个种(https://ictv.global/taxonomy)，这些病毒分别感染哺乳动物、鸟类、鱼类、爬行动物和两栖动物[5]。灵长类动物腺病毒归为哺乳动物腺病毒属，其中人腺病毒(Human adenovirus，HAdV)被划分为7个种(HAdV A-G)，含有至少100个型。而非人灵长类动物腺病毒统称为猴腺病毒(Simian adenovirus，SAdV)，共划分为9个种(SAdVA-I)，截至目前已经鉴定了至少50个型别。
腺病毒载体因为一系列的优点而被广泛应用于构建病毒疫苗和基因治疗。腺病毒作为病毒载体其优势表现为：1，感染的细胞种类多，包括分化的和未分化的细胞；2，病毒基因组稳定，不与宿主基因组整合；3，可以高效表达外源基因；4，病毒在液体和粉末状态下都很稳定。因此，腺病毒自发现以来就表现出强大的应用潜力。一般而言，腺病毒基因组可以容纳的基因片段加上自身基因组不能超过原始基因组的105％，因此为了使病毒能够容纳更大的外源基因，改造腺病毒载体一直是重要的研究课题。
在中国，HAdV-5的血清中和抗体阳性率高达50％-80％，而在非洲的一些地区，阳性率高达90％甚至100％。广东省和山东省的一份调查中，1184份血清中HAdV-26中和抗体阳性率高达47％，中和抗体滴度在200-1000之间；而HAdV-35中和抗体阳性率为15％，抗体滴度相对较低(72-200)。在另一份研究中，发现人血清中针对HAdV-3的中和抗体阳性率高达63％。在韩国的一项研究中也发现，HAdV-55在人群中的抗体阳性率分别是18.8％和56.0％。总之，人群中高的预存免疫严重阻碍的人腺病毒载体的实际应用。
发明内容
为此，本申请从猴粪便中分离得到了一株猴腺病毒，其在人群中的预存免疫水平较低，能够作为一种降低或避免预存免疫干扰的基础病毒载体使用，以提高对外源基因的表达效率，同时能够与人腺病毒组合制备成重组的病毒载体，具有开发成为新型的预存免疫低的猴腺病毒载体，作为疫苗载体和治疗载体具有重要的现实意义和应用前景。
为此，本申请实施例至少公开了以下技术方案：
第一方面，实施例公开了一种猴腺病毒毒株，分类命名为猴腺病毒(SimianAdenovirus)SAdV GZ3-12，保藏号为CCTCC NO:V202385，保藏日期为2023年8月3日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
第二方面，实施例公开了含有第一方面所述猴腺病毒毒株的细胞培养物。
第三方面，实施例公开了第一方面所述的猴腺病毒毒株在制备预存免疫低的重组猴腺病毒载体中的应用。
第四方面，实施例公开了第一方面所述的猴腺病毒毒株在制备预存免疫低的重组猴腺病毒中的应用。
附图说明
图1为本申请实施例提供的猴腺病毒SAdV GZ3-12在HEK293细胞中生长状态。
图2为本申请实施例提供的猴腺病毒SAdV GZ3-12电镜图。病毒颗粒的大小约为70-90nm，放大倍数为43000倍，比例尺为100nm。
图3为本申请实施例提供的猴腺病毒SAdV GZ3-12在不同细胞中感染和产生子代病毒情况；Maker是DL1000 DNAmaker，数字1和2代表病毒感染细胞的传代次数。扩增片段大小300bp。
图4为本申请实施例提供的猴腺病毒SAdV GZ3-12病毒感染人气道类器官和肺泡类器官图；A、B是病毒感染气道类器官前和感染后第120h的照片，图C、D是病毒感染肺泡类器官前和感染后第120小时的照片，类器官放大倍数为100倍。
图5为本申请实施例提供的采用hexonF/R引物扩增猴腺病毒SAdV GZ3-12的电泳图；泳道1和泳道3是从类器官培养上清中收获的病毒感染的A549细胞，泳道2和泳道4分别是从气道和肺泡类器官细胞中收获的病毒感染A549细胞。P：阳性对照；N：阴性对照。扩增片段大小约300bp。
图6为本申请实施例提供的PCR法扩增多次传代SAdV-Ad5E4orf6病毒相关基因区的电泳图；图中Maker为DL10000 DNAmaker，泳道1、2、3为SAdV-Ad5E4orf6病毒的第5代、第10代和第20代的Ad5E4orf6(1437bp)区的产物扩增产物。
图7为本申请实施例提供的重组猴腺病毒SAdV-Ad5E4orf6在HEK293细胞中的生长图。
图8为本申请实施例提供的野生型及重组猴腺病毒的生长曲线图；A是病毒基因组DNA生长曲线，B是病毒FFU生长曲线。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
相比之下，在健康人群中有较低的猴腺病毒中和抗体阳性率。在泰国的一项研究中，经过检测猴子血清(n＝113)针对SAdV RBR-7-10病毒的中和抗体阳性率为6.8％，而在正常人血清中(n＝125)，该阳性率为0。此外在巴西的一项研究中，对200份人血清的检测表明针对猿猴腺病毒AdC6和AdC68的中和抗体阳性率分别为21％和23％。而在国内，相似的血清流行病学调查发现，在广州、宜昌、西安、成都等地的血清样本中SAdV-23的抗体阳性率在6％～20％之间。而在重庆的另一项研究中，发现健康志愿者血清中猿猴腺病毒6型和7型中和抗体的阳性率在12.22％和13.13％。因此，在人群中，猴腺病毒中和抗体阳性率远低于人腺病毒中和抗体的阳性率，间接说明猴腺病毒在人群中流行率较低。
毒株分离及鉴定
第一方面，实施例公开了一种猴腺病毒毒株，分类命名为猴腺病毒(SimianAdenovirus)SAdV GZ3-12，保藏号为CCTCC NO:V202385，保藏日期为2023年8月3日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
在实施例中，该猴腺病毒毒株的分离过程包括：
(1)猴粪便样本的获取
猴粪便样本采集自健康无异常症状的野生猴子，由云南省某野生动物园工作人员收集，样本采集时间为2019年6月至9月。有固定居所的猴子，猴舍经过清洁后，第二天收集新鲜的猴粪便样本保存于封口袋中，并标记取样猴子的称号或编号、种属的信息，无固定居所的猴子粪便的收集则是在猴子聚集地铺设干净的尼龙薄膜，第二天收集独立成堆的新鲜猴子粪便，置于封口袋，标记编号并保存，所有粪便样本收集完成后保存于-80℃冰箱，最终在干冰环境中运送至实验室。
(2)猴腺病毒分离
1)称取200mg冻存的猴子粪便，转移到2mL灭菌EP管中。
2)在EP管中加入预冷的PBS缓冲液，置于-80℃冰箱中冰冻10min，随后取出置于37℃温箱解冻。重复该冰冻-解冻步骤3次。
3)反复涡旋振荡60s使沉淀完全分散，以13000rpm的转速离心10min，去除沉淀，重复离心一次。
4)去除沉淀，在上清中加入200U的青霉素/链霉素，以13000rpm的转速离心10min，取上清，用0.22μm滤膜过滤，保存于-80℃冰箱。
5)取步骤(4)中获得的上清1mL，接种在长满HEK293细胞的六孔板中，将孔板放在细胞培养箱中，保持37℃恒温，5％ CO2浓度。每隔半小时摇晃孔板，使液体均匀覆盖孔板中的细胞。
6)2小时后，将孔板中的上清去除，替换为新培养基，置于细胞培养箱中继续培养，每日观察细胞状态及是否长菌，直至细胞出现CPE。
7)细胞出现CPE的孔板进行三次冰冻-解冻过程，最后将培养基收集到2mL灭菌EP管中，12000×g离心5min，取上清保存于-80℃冰箱。另取100μL上清提取核酸，用腺病毒通用引物扩增，初步鉴定是否是腺病毒及腺病毒型别，最后使用腺病毒特异性引物进行扩增验证。
(3)蚀斑法纯化猴腺病毒
1)提前一天将HEK293细胞按照105细胞/孔的密度接种到96孔板中，置于细胞培养箱中过夜培养。
2)将分离培养步骤(10)中获得的上清进行10倍稀释，最高稀释度达到1010.在96孔板中每孔接种100μL不同稀释度的病毒液，每个稀释度接种8个副孔。置于细胞培养箱孵育2h。
3)将含4％胎牛血清的DMEM培养基与6％低熔点琼脂糖等体积混合均匀，静止待温度下降到40℃以下，去除96孔板中的病毒液上清，迅速在每孔中加入配置好的低熔点琼脂糖，室温静止30min，待琼脂糖凝固后，将96孔板倒扣，置于细胞培养箱中培养7天，期间注意观察补液，防止琼脂糖干裂。
4)培养第7天，将96孔板置于显微镜下观察，寻找病毒感染细胞形成的蚀斑，在显微镜下用10μL长枪头挑取蚀斑，接种到DMEM培养基中。
5)将挑取的蚀斑再次接种到HEK293细胞中，待细胞出现CPE(如图1)，提取病毒核酸，用腺病毒通用引物扩增，将产物测序，若测序图谱无杂峰，则判定病毒纯化成功。对纯化成功的病毒样本分类命名为猴腺病毒(Simian Adenovirus)SAdV GZ3-12，于2023年8月3日保藏与中国典型培养物保藏中心。保藏号为CCTCC NO:V202385。测序得到的猴腺病毒SAdVGZ3-12的基因组如SEQ ID NO.18所示。
SEQ ID NO.18：
catcatcaatataacaccgcaagatggcgaccgagttaacatgcaaatgaggtgggcggagttacgcgacctttggctcgggaacgcggaagtgggcgcggcgggtttcggggaggagcgcggggcggggcgggcgtgtcgcgcggcggtgacgcgccgggaacccggaaattgagtagtttttattcattttgcaagtttttctgtacattttggcgcgaaaactgaaacgaggaagtgaaaagtgaaaaatgccgaggtagtcaccgggtggagatctgacctttgtcgtgtggagtttacccgctgacgtgtgggtttcggtctctatttttcactgtggtttttccgggtacggccaaaggtccccattttatgactccacgtcagctgatcgctagggtatttaatgcgcctcagaccgtcaagaggccactcttgagtgccggcgagaagagttttctcctccgcgctccgccaactgtgaaaaatgaggaacttcttgctatctccggggctgccagcgaccgtagccgccgagctgctggaggacattgttaccggagctctgggagacgaacctcaggtgatttctcacttttgtgaagattttagtcttcatgatctctatgacattgatccgggcgttgaggggcaagcggatgaatggctggagtctgtggacgggttttttccggacgctatgctgctagaggctgatttgcctccatctcacaattctaacactgagcccgagtcagctgctattcctgaattgtcatcaggtgaacttgacttggcttgttacgagactatgcctccggagtcggatgaggaggacagcgggatcagtaatcccacggcttatatggtctctaaggcaattgctatactaaaagaagatgatgatgatggcgatgatggatttcaactggacgctccggcagtgccggggagagactgtaagtcttgtgaataccaccgggagcgtaccggagacccgtctatgttgtgttctctgtgctatctccgtcttaacgctgcttttgtctacagtaagtgttttgtgctttttacactgtggctttgttcagttattttttctgtgtctcatagggtgttgtttattataggtcctgtttcagatgtggaggagcctgatagtactactggaaatgaggaggaaaagccctccccgcctaaactaactcagcggtgcagacctaatattctgagaccctcgccccagcgtgtgtcatcccggaaacgtgctgctgttaattgcatagaagatttattggaagagcccactgaacctttggacttgtccttaaagcgacctcgcccgcagtagggcacgctgccagttttttctctaagcttccgggtgactcagtgcaataaaaattttcttggcaacaggtgtatgtgtttactttacgggcgggaagggattaggggagtataaagctggaggggaaaaatccggggctgtcagatcgagtgagaagttccatggacttgtacgagagcctagagaatctaagttctttgcgacgtttgctggaggaggcttccgacagaacctcttacatttggaggtttctgtttggttcccctctgagtcgctttctgtaccgggtgaaacgagagcacctgacggaatttgatgggcttttagagcagctgcctgggctgtttgattctttgaatctcggccaccggacgctgctagaggagaggctttttccacaattggacttctcctctccaggccgtctgtgttcagcgcttgcttttgctgtacatctgttggacagatggaacgagcagacgcagctcagcccgggctacactctggacttcttgacgctatgcctatggaagttcgggatcaggagggggaggaagctgtacgagcgcctggtggagaggcatccgtctctgcgccagcagcgtctgcaagctcaagtgctgctgagacgggaggatctggaggccatttcggaggaggagagcggcatggaagaggagaatccgagagcggggctggaccctccagcggaggagtaggggggataccggacccttttcctgagctggccttgggggcggtggggggctcttctgtggtacgtgaggatgaagaggggtgccaacgtggacagaagcgggaccattttgagtcctcgacttttttggctgatgtaaccgtggccctgatggcgaaaaacaggttggaggtggtgtggtacccggaagtatgggaggactttgagaaaggggacttgcacctgctggaaaaatataactttgagcaggtgaaaacatactggatgaacccggatgaggactgggaggtggttttgaaccgatacggcaaggtggctctgcgcccagactgccgctaccaggttcgcgataaggtggtcctgcgacgcaacgtgtacctgttgggcaacggcgccaccgtggagatggtggaccccagaaggggcggttttgtggccaatatgcaagaaatgtgccccggggtggtgggcttgtctggggtgactttccatagtgtgaggtttagcggcagcaattttgggggcgtggttattaccgcgaacactcctgtggtcctgcataattgctacttttttggctttagcaacacctgtgtggaattgagggtgggtggcaaagtgcgcgggtgttcattttacgcttgctggaagggggtggtgagtcagggaaaggctaaagtgtctgttcacaagtgtatgctggagagatgcaccttgggcatttccagtgagggcttcctccacgccagcgacaacgtggcttctgataacggctgcgcctttcttgtaaagggaggtgggcgcatctgtcacaatatgatatgcggccctggggatgtccccccaaagccttaccagatggttacctgcacagatggcaaggtgcgcatgctcaagcctgtgcacattgtgggccaccggcgccaccgctggccagagtttgaacacaatgtgatgacccgctgtagcttgtacctgggaggcaggcgaggagttttcatgcctagacagtgtaacctggcccactgcaacgtgatcatggaacaatccgccgctacccaggtttgctttggaggaatatttgatataagcatggtggtgtataagatcttgcgctacgatgactgtcgggctcgtactcggacctgcgactgtggagcttctcacctgtgcaacctgactgtgatgggaatggtgactgaggaggtgcgactggaccattgtcagcattcatgcctgcgggaggagttttcttcctcggacgaggaggactaggtaggtgggttgggcgtggctagcgagagggtgggctataaaggggaggtgtcggctgaggctgtcttctgtttttcaggtaccatgagcggatcaagcagccagaccgcgctgagcttcgacggggccgtgtacagcccctttctgacggggcgcttgcctgcctgggccggagtgcgtcagaatgttaccggttcgaccgtggacggacgtcccgtggatccatctaacgctgcttctatgcgctacgctactatcagcacatctactctggacagcgccgctgctgctgccgccgccacctccgccgctctctccgcagccaagatcatggctattaacccaagcctttacagccctgtatccgtggacacctcagctctggagctttaccgccgagatctagctcaagtggtggagcaactcgcagccgtgagccaacagttgcagctggtgtcgacccgagtggagcaactttcccgccctccccagtaaccgcaaaaattcaataaacagaattcaataaacagcacttgaaaaagtttaaacttgtggttgactttattcctggatagctggggggagggaacggcgggaacggtaagatctggtccatcgttcccggtcgttgaggacacggtggatcttttccaagacccgatagaggtgggtctggacgttgagatacatgggcatgagcccgtctctggggtggaggtaggcccactgcagggcctcgttttcaggggtggtgttgtaaatgatccagtcgtaggccccccgctgggcgtggtgctggaagatgtccttcagcagtaagctgatggcaacgggaagacccttggtgtaggtgttgacaaagcggttgagttgagatgggtgcatgcgggggctgatgaggtgcattttggcctggatcttgaggttggctatgttgccgcccagatcacgcctgggattcatgttatgcaagaccaccagcaccgagtaaccggtgcagcgtgggaatttgtcgtgcagcttggaagggaaagcgtggaagaatttggagacccctcggtgcccgcctaggttttccatgcactcatccatgatgatggcgatgggtccccgggaggcagcctgggcaaaaacgttgcgggggtccgtgacgtcgtagttgtggtcctgggtgagttcatcataggacattttgacaaagcgcgggcagagggtcccagactggggaatgatggttccctccggtccaggggcgtagttgccctcacagatttgcatttcccaggctttgatttcagagggagggatcatgtcaacctggggggcgatgaaaaaaatggtttctggggcgggggtgatgagctgggtggaaagcaggttgcgcaacagctgtgacttgccgcagccggtgggcccgtagatgacagctatgacgggttgcagggtgtagtttagagagctacaactgccgtcatctttcaaaagcggggccacactgtttagaagttctctaacatgtaagttttcccgcactaagtcttgcaggagacgtgaccctcctagggagagaagctcaggaagcgaagcaaagtttttaagtggtttgaggccgtcggccaagggcaagttcctaagagtttgactgagcagttc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一个猴腺病毒SAdV GZ3-12全基因组提取及测序过程包括：
(1)基因组提取
1)在10cm细胞培养皿中接种107个HEK293细胞，置于细胞培养箱中过夜培养，保持37℃恒温和5％ CO2浓度。
2)用1MOI的病毒感染HEK293细胞，继续在细胞培养箱中培养40～48h。
3)待细胞全部出现CPE，用巴氏吸管冲洗细胞，并将细胞悬液转移到15mL离心管中，在室温下，以5000×g离心力离心10min，去除所有上清。
4)向细胞沉淀中加入1.2mL细胞裂解液和60μL蛋白酶K溶液，用枪头充分吹打使细胞分散，随后，转移黏液到1.5mL灭菌EP管中，置于56℃恒温水浴锅中孵育1h。
5)向裂解的细胞黏液中加入300μL PBS溶液，用枪头轻轻吹打直至混匀。
6)提前预冷离心机到4℃，将静置的裂解液以17000×g离心力离心20min。
7)小心吸取上层透明液体到另一灭菌EP管，向EP管中加入等体积的酚氯仿(苯酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1，体积比)，轻轻吹打使两种液体混匀形成乳状液，以14000×g离心力离心10min。
8)离心后，液体分为三层，最下层为有机相，中层为白色蛋白层，最上层为透明水相，小心吸取最上层水相至一灭菌EP管，避免触及白色蛋白层，向EP管中加入等体积氯仿异戊醇混合液(氯仿:异戊醇＝24:1，V/V)，轻轻吹打使溶液混匀，以14000×g离心力离心10min。
9)小心吸取最上层透明液体至灭菌EP管中，向EP管加入1/10体积的3M醋酸钠溶液和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻颠倒10次，可见有白色絮状物析出，将EP管静置于-80℃冰箱30min。
10)以15000×g离心力离心20min，去除上清，可见EP管底部有白色沉淀，将EP管倒扣于干净的吸水纸上干燥。
11)待EP管壁水分挥发，向EP管加入100μL灭菌双蒸水重悬，并测定溶液中核酸的浓度和OD值，最后将所得的基因组分装保存于-80℃。
(2)猴腺病毒SAdV GZ3-12全基因组测序
利用VAHTS Universal Plus DNALibrary Prep Kit(Vazyme,Nanjing,China)构建DNA文库，每个文库的PCR产物使用Equalbit dsDNAHS Assay Kit(Vazyme)试剂盒进行定量。所有文库均在MGISEQ-2000RS平台(MGI，中国深圳)上采用100bp对端策略进行验证和测序。
(3)DNA测序生成的原始读数通过Fastp(v0.20.0)程序进行鉴定，以去除适配器和低质量读数，然后使用Megahit(v12.9)以默认设置重新组装。通过与NCBI非冗余核苷酸(nt)和蛋白质(nr)数据库的比较，使用Blastn对组装的重叠群进行注释(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，e值截止设置为1×10-5。为了确认病毒序列，将干净的读数映射回与Bowtie2(v2.4.1)接近全长基因组的腺病毒相关重叠群的参考序列。获得每个文库的基因组草案后，并使用Geneious(v2021.2.2)进行检查(Biomatters,Ltd.,https://www.geneious.com)。
在一个实施例中，对纯化的猴腺病毒SAdVGZ3-12进行了电镜观察。步骤包括：培养后病毒反复冻融三次，设置离心力8000×g，4℃离心30min，取上清；再次置离心力为30,000×g，4℃离心30min，去除上清；用适量的生理盐水重悬沉淀；在封口膜上滴加10μL待测病毒液，将200目铜网正面朝下放在小液滴上，静置3min，用洁净的吸水纸吸干液体；在封口膜上滴加10μL磷钨酸染液，将铜网正面朝下放在小液滴上，随后取出，静置5min，用洁净的吸水纸吸干液体；将铜网室温静置干燥10min；设置电压为120V，电镜观察，寻找典型的病毒颗粒并拍照。结果如图2所示，猴腺病毒GZ3-12的病毒颗粒呈典型的六边形结构，直径在70～90nm之间，表面还有规则排列的凸起，是腺病毒的fiber蛋白。
毒株的感染性、复制性能及预存免疫低性能测试
第二方面，实施例公开了含有第一方面所述猴腺病毒毒株的细胞培养物。
一个测试例对猴腺病毒SAdV GZ3-12对不同细胞的感染性进行了测试，并得到了不同的含有猴腺病毒SAdV GZ3-12的细胞培养物。具体包括：
(1)病毒准备
将上述分离得到的普通培养的猴腺病毒SAdV GZ3-12滴度可以达到107-108FFU/mL，通过氯化铯密度梯度离心之后，病毒的滴度可以达到109-1010FFU/mL。
(2)待测宿主细胞
人结肠癌细胞Caco2、人神经胶质瘤细胞U251、人肝癌细胞Huh7、人肝癌细胞HepG2、人宫颈癌细胞Hela、人乳腺癌细胞MCF7、非洲绿猴肾细胞Vero E6、人气道基底细胞、人气道纤毛细胞、人气道Club细胞、人气道杯状细胞或肺泡AT1或肺泡AT2细胞。
(3)测试方法
将不同的细胞分别接种到12孔板，培养至细胞完全贴壁或分化完成。用0.5MOI的猴腺病毒感染细胞或类器官。2小时后将病毒液去除并用1×PBS清洗一遍。每孔加入1mL维持培养基继续培养，第7天反复冻融后收获第一代病毒液。将感染病毒的不同细胞培养7天后，反复的冻融三次收获病毒上清，然后取500μL病毒液再次感染相同的细胞，感染2小时后，去除病毒液并用PBS缓冲液清洗3遍。换为维持培养基继续培养7天，收获第二代病毒液。通过PCR检测第一代病毒液和第二代病毒液中的病毒核酸。
(4)PCR检测病毒核酸
用SAdV GZ3-12感染不同的细胞系以判断病毒对不同细胞系中的感染和增殖能力，通过PCR扩增病毒hexon基因将Hexon-F/Hexon-R溶解并稀释成10μM的工作浓度，以收集第一代或第二代病毒液为模板，利用Hexon-F(gccccartgggcrtacatgcacatc，SEQ IDNO.1)/Hexon-R(agcacsccscgratgtcaaag，SEQ ID NO.2)将人5型腺病毒六邻体基因中的300bp(如SEQ ID NO.3所示)，以此判断病毒的是否增殖。
结果由图3所示，SAdV GZ3-12病毒感染人结肠癌细胞(Caco2)、人神经胶质瘤细胞(U251)、人肝癌细胞(Huh7、HepG2)、人宫颈癌细胞(Hela)、人乳腺癌细胞(MCF7)和非洲绿猴肾细胞(Vero E6)，在Hela细胞和MCF7细胞中感染效率较低。其中，在Caco2、U251和VeroE6细胞中第二代病毒液仍然可以检测到很高的病毒核酸。
在一个测试例中，为了验证病毒SAdV GZ3-12是否能够感染正常人细胞，用0.5MOI的病毒感染人类气道类器官(主要包含基底细胞、纤毛细胞、Club细胞和杯状细胞)和肺泡类器官(主要包含AT1和AT2细胞)，感染2小时后去除病毒液并用PBS清洗三遍类器官。结果如图4所示，正常培养的气道类器官体积比气泡类器官大(图A、C)，感染前正常类器官细胞团边缘清晰，管腔结构明显，感染病毒5天后，病毒引起细胞团边缘模糊，聚集皱缩，外膜破裂弥散，肿胀，管腔结构消失(图B、D)。
在一个测试例中，为验证病毒SAdV GZ3-12在类器官中是否产生感染性子代病毒，分别收获上述实施例感染了病毒SAdV GZ3-12的上清和类器官细胞沉淀，将感染病毒的类器官反复冻融三次，收获上清用于感染A549细胞，2小时后去除细胞上清，使用PBS清洗两次，并替换为维持培养基。如图5，类器官细胞和上清中收获的病毒再次感染A549细胞后，可以在A549细胞培养上清中检测到病毒核酸，表明在类器官中有感染性的子代病毒产生。
在一个测试例中，检测了病毒SAdV GZ3-12在人群中预存免疫低的特性。
例如，血清微量中和试验的步骤包括：
(1)测定猴腺病毒液的病毒滴度。
(2)用无血清的DMEM培养基将病毒液稀释成200TCID50/100μL。
(3)将血清置于56℃保持30min，灭活补体。
(4)用DMEM培养基将血清稀释成1:16～1:1024的不同稀释度。
(5)将等体积的不同稀释度的血清和200TCID50/100μL的病毒液混匀，37℃恒温孵育1小时。
(6)96孔板每孔预先接种104个细胞，随后在每孔中加入100μL血清-病毒混合液，每个稀释度血清重复4个副孔。同时以野生型HAdV-5病毒为阳性对照。
(7)继续培养细胞，至第7天观察记录每个稀释度下出现CPE的孔数。单个孔中超过半数的细胞产生CPE现象则判定该孔为阳性。
(8)按照Reed-Muench法计算血清50％中和滴度(NT50)。NT50>16判定为血清中和抗体阳性。
从我国6个省份收集了300份健康成年人血清样本，经过灭活补体后，通过血清微量中和实验测定血清中针对GZ3-12病毒的中和抗体水平。300份血清中，江苏省、山东省、陕西省、湖南省、河北省各20份以及广东省200份。其中女性血清占比46.7％(140/300)，男性血清占53.3％。以NT50<20判定为阴性，NT50>200判定为高中和滴度，经过统计，所有血清样本中，阳性样本数量为30份，总体阳性率为10％，但是高中和抗体滴度的样本数量为0份，且阳性样本中，中和滴度都在1:32以下。随机抽取的30份人血清，通过微量中和实验测定抗人5型腺病毒的中和抗体水平，结果发现30份血清抗人5型腺病毒抗体均为阳性，且中和抗体滴度均大于1:256。
由此可见，通过血清微量中和实验验证，健康成人血清中针对GZ3-12腺病毒的中和抗体阳性率在10％，远低于人5型腺病毒的血清阳性率60～100％，提示该猴腺病毒可以避免人群中可能存在的预存免疫的干扰。
毒株的应用
第三方面，实施例公开了第一方面所述的猴腺病毒在制备预存免疫低的重组猴腺病毒载体中的应用。
第四方面，实施例公开了第一方面所述的猴腺病毒在制备预存免疫低的重组猴腺病毒中的应用。
在一些实施例中，将猴腺病毒SAdVGZ3-12的基因组(如SEQ ID NO.1所示)替换为人腺病毒E4基因orf6区(人腺病毒基因组GenBank编号AC_000008.1，Ad5E4orf6区：33193nt～34077nt)能够构建一种重组猴腺病毒(命名为SAdV-Ad5E4orf6)。该重组猴腺病毒具有复制缺陷，即其在一些细胞中能够感染，但不能复；而且该重组腺病毒保持了病毒SAdVGZ3-12在人群中低中和抗体阳性率和低中和滴度的特性，减少了构建的重组病毒载体免疫预存的干扰，成为替代人腺病毒载体的优先选择目标，具有作为疫苗载体和治疗载体具有重要的现实意义和应用前景。
根据猴腺病毒SAdV GZ3-12基因组(SEQ ID NO.1)其相关功能区域的引物(如表1所示)。其中，根据测序和功能研究可知，E4orf6区位于SAdV GZ3-12基因组的31414nt～32268nt。
根据HAdV-5病毒基因组(GenBank编号AC_000008.1)设计及合成其Ad5E4orf6区(33193nt～34077nt)的特异性扩增引物(如表1所示)，所有引物由擎科生物科技有限公司合成，引物用ddH2O溶解为10μM的工作浓度，保存于4℃或-20℃。
表1猴腺病毒载体构建使用的引物列表
实施例1：制备pBRSAdV GZ3-12和SAdV GZ3-12
如图1所示，本实施例中，采用Gibson重组方法构建携带上述实施例提供的野生型猴腺病毒基因组的载体pBRSAdV GZ3-12。将该pBRSAdV GZ3-12转染细胞进行病毒组装即可得到野生型猴腺病毒SAdV GZ3-12。具体步骤包括：
(1)按照表2所示配制5×恒温反应缓冲液，分装并保存于-20℃备用。
表2 5×等温反应缓冲液成分表
试剂名称 使用量
1M Tris-HCl，pH＝7.5 1mL
2M MgCl2 50μL
10mM dNTP 200μL
1M DTT 100μL
PEG-8000 0.5g
100mM NAD 100μL
ddH2O 补充至2mL
(2)按照表3所示配制Gibson assembly酶混合物，分装并保存于-20℃备用。
表3 Gibson assembly酶混合物成分表
试剂名称 使用量
5×恒温反应缓冲液 40μL
10U/μL T5核酸外切酶 0.1μL
40U/μL Taq DNA ligase 20μL
2U/μL phusion DNA polymerase 2.5μL
ddH2O 87.4μL
(3)按照表4所示试剂配制Gibson assembly连接反应体系，其中，基因组DNA与线性pBR322片段的反应摩尔比为4:1。线性pBR322片段由PBR-SWAI-ITR-F/PBR-SWAI-ITR-R为引物对从pBR322质粒上扩增。
表4 Gibson assembly连接反应体系
试剂名称 使用量
基因组DNA 4当量
线性pBR322片段 1当量
Gibson assembly酶混合液 补充至20μL
混合体系置于4℃冰箱静置3小时后，50℃连接1小时。最后取出保存于-20℃。如图4所示，将pBRSAdV GZ3-12转染Ad293细胞，能够产生CPE效应，能够拯救得到SAdV GZ3-12，证明其不仅具有猴腺病毒全基因组还具有感染性，可以在细胞中包装出活病毒。
实施例2：制备pSAdV-Ad5E4orf6和SAdV-Ad5E4orf6
本实施例中，将野生型猴腺病毒SAdV GZ3-12基因组的E4基因orf6区替换为人5型腺病毒E4基因orf6区，得到了一种重组的猴腺病毒基因组，将重组的猴腺病毒基因组构建至一个载体上得到一种猴腺病毒载体pSAdV-Ad5E4orf6。将pSAdV-Ad5E4orf6转染细胞并经包装，能够得到重组猴腺病毒SAdV-Ad5E4orf6。
具体的，SAdV-Ad5E4orf6制备过程包括：构建携带猴腺病毒基因组的猴腺病毒载体pBRSAdV GZ3-12；构建携带人腺病毒E4orf6的载体pUC-Ad5E4orf6，以替换猴腺病毒基因组的E4orf6区；将pBRSAdV GZ3-12和pUC-Ad5E4orf6同时转入可表达重组酶的大肠杆菌，得到猴腺病毒载体pSAdV-Ad5E4orf6。将所述pSAdV-Ad5E4orf6转染HEK293细胞包装获得重组猴腺病毒SAdV-Ad5E4orf6。
在本实施例中，用于替换所述猴腺病毒基因组E4orf6的核酸序列由人5型腺病毒E4orf6完整基因片段以及猴腺病毒E4orf6基因上游各2500bp的核酸序列和下游800bp的核苷酸序列组成。
SAdV-Ad5E4orf6的具体制备过程如下。
本步骤中，pUC-Ad5E4orf6的构建过程包括：
(1)以pUC19-F/pUC19-R为引物，大量扩增pUC19质粒(B610005-0050，生工生物工程(上海)股份有限公司)，提取质粒后，用EcoRI限制性内切酶酶切pUC19质粒，得到线性化pUC19；
(2)以SAdV GZ3-12基因组为模板，以E4L-F和E4L-R为引物对扩增SAdV GZ3-12基因组第28912nt至31413nt的核苷酸序列(E4orf6基因上游2500nt)，得到如SEQ ID NO.14的E4区上游的同源序列；
(3)以SAdV GZ3-12基因组为模板，以E4R-F和E4R-R为引物对扩增以SAdV GZ3-12基因组第32269nt至33068nt的核苷酸序列(E4orf6基因下游800nt)，得到如SEQ ID NO.15的E4区下游的同源序列；
(4)以Ad5E4orf6-F和Ad5E4orf6-R为引物对从HAdV-5病毒株基因组Ad5E4orf6序列，得到如SEQ ID NO.16的Ad5E4orf6的同源序列；
(5)按照无缝克隆技术，将线性化pUC19、E4区上游的同源序列、E4区下游的同源序列和Ad5E4orf6的同源序列同时加入连接体系中，37℃反应30min；
(6)产物化转DH5α感受态细胞后，在氨苄抗性的琼脂平板中筛选单菌落，经过PCR扩增和测序，即可得到pUC-Ad5E4orf6。
本实施例中，pSAdV-Ad5E4orf6的构建过程包括：
(1)用SpeI限制性内切酶酶切pBRSAdV GZ3-12质粒使之线性化，暴露同源臂。同时使用PacⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶酶切pUC-E4orf6质粒，并回收E4区上游的同源序列、Ad5E4orf6的同源序列、E4区下游的同源序列的连接片段；
(2)取200ng的pBRSAdV GZ3-12线性化载，200ng的E4区上游的同源序列、Ad5E4orf6的同源序列、E4区下游的同源序列的连接片段，同时化转入至BJ5183感受态细胞，进行同源重组；
(3)从氨苄抗性的琼脂平板上筛选单菌落，使用Hexon-F/Hexon-R为引物和Ad5E4orf6-F/Ad5E4orf6-R引物进行筛选，双阳性的质粒化转DH5α感受态进行质粒纯化和扩增；
(4)选取4种限制性内切酶酶切PCR扩增双阳性的质粒，酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳后，条带与SnapGene模拟图一致的质粒，判定为重组正确的质粒，验证正确的质粒即为pSAdV-Ad5E4orf6，命名为pSAdV-Ad5E4orf6。
本实施例中，SAdV-Ad5E4orf6的制备步骤包括：扩增pSAdV-Ad5E4orf6后，使用SwaⅠ限制性内切酶将质粒酶切为猴腺病毒基因组和pBR322质粒骨架；切胶回收重组的猴腺病毒基因组，并通过脂质体转染到Ad293细胞，包装病毒；每日观察细胞生长状态。如图7所示，细胞产生变圆、融合和葡萄串状等典型CPE现象，则收获病毒，反复冻融三次后取病毒上清液继续Ad293细胞扩大培养。通过PCR扩增、酶切等方法验证病毒，验证正确的病毒即为SAdV-Ad5E4orf6。
在一个测试例中，对SAdV-Ad5E4orf6进行遗传稳定性检测。用SAdV-Ad5E4orf6感染HEK293，并在细胞中传20代。收集第5代、10代和20代病毒，使用Ad5E4orf6-F和Ad5E4orf6-R为引物对扩增Ad5E4orf6区的病毒核酸。结果如图6所示，可以看到Ad5E4orf6区相应位置上都有明亮的条带。将所有扩增的产物进行测序，并未发现突变碱基，说明在HEK293细胞传代过程中，重组病毒的基因组保持稳定，能够作为人腺病毒载体，具有作为疫苗载体和治疗载体具有重要的现实意义和应用前景。
实施例3：大量制备病毒样本
在本实施例中，收获上述实施例1～5的细胞液，使用PBS洗涤细胞，将其置于的-80℃(冰冻)和37℃(解冻)的步骤3次，促使病毒充分从细胞中释放。将释放病毒的液体于12000×g离心2min，取上清液，即分别为大量收获的SAdV GZ3-12样本和SAdV-Ad5E4orf6样本。
测试例1：qPCR检测病毒DNA含量
待测样本：SAdV GZ3-12样本和SAdV-Ad5E4orf6样本。
检测方法：
(1)将Hexon-F/Hexon-R溶解并稀释成10μM的工作浓度。
(2)从冰箱中取出分装的标准质粒(pUC-hexon，如SEQ ID NO.17所示)，冰上解冻，并用灭菌的去离子水稀释成102-108copies/μL的工作浓度，作为标准样本，同时使用2uL待测样本液作为模板。其中，标准质粒pUC-hexon的构建方法包括：利用Hexon-F/Hexon-R将人5型腺病毒六邻体基因中的300bp(如SEQ ID NO.3所示)扩增出来，将扩增产物连接到pUC19载体上，得到重组质粒，验证正确后，命名为标准质粒pUC-hexon。测定该标准质粒的浓度，按照公式：质粒浓度ng/μL×10-9×6.02×1023/双链DNA的分子量＝质粒的拷贝数copies/μL，换算并记录质粒的拷贝数，分装后置于-20℃冰箱保存备用。使用时将标准质粒稀释成101-107copies/μL的浓度，作为标准质粒。
(3)配制20μL qPCR反应体系，在2mL灭菌EP管中依次加入1mL TB GreenTM PremixEx TaqMTⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×)、40uL ROX Reference DyeⅡ(50×)、10μM的上游引物HexF和下游引物HexR各80μL、600μL的灭菌水，混匀后，短暂离心，并将混合液分装至专用的八连管中，每管分装18μL，分装完成后，在每管中加入2μL模板DNA。此步骤全程在冰上操作，完成后短暂离心使液体聚集到管底。
(4)在QuantStudioTM Real-Time PCR Software系统上设置扩增和检测程序：95℃预变性5min，40个扩增循环(95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸20s)，熔解曲线扩增(95℃反应15s，60℃反应1min，95℃反应15s)。
(5)结合扩增曲线、熔解曲线调整背景值、标准样本的DNA拷贝数和CT值制作标准曲线，然后根据标准曲线计算待测样本(SAdV GZ3-12样本、SAdV-Ad5E4orf6样本、第五病毒样本和第七病毒样本)的CT值。根据CT值计算待测样本的DNA拷贝数。以待测样本的DNA拷贝数作为纵坐标(Log10 genomic DNA copies/mL)，病毒感染细胞的不同时间点作为横坐标，绘制其病毒的生长曲线。
结果如图8A所示，SAdV-Ad5E4orf6在A549细胞中的病毒DNA含量较低，而在Ad293细胞系中病毒DNA含量较高。而SAdV GZ3-12(野生型病毒)在A549细胞和Ad293细胞中均具有较高的病毒DNA含量。
测试例2：直接免疫荧光法检测活病毒数
待测样本：SAdV GZ3-12样本和SAdV-Ad5E4orf6样本。
检测方法：用DMEM培养基分别将SAdV GZ3-12样本、SAdV-Ad5E4orf6样本、第五病毒样本和第七病毒样本按10倍倍比稀释，滴加至去除培养基的105cells/mL的Ad293细胞悬液中以感染细胞，每个稀释度做4个副孔，同时做阴性对照和阳性对照孔，放入细胞培养箱入37℃、含5％CO2培养2小时后，每孔加入100μL维持培养基，继续37℃、含5％CO2培养40小时，去除细胞培养基，在生物安全柜中干燥10min。每孔加入100μL 4℃预冷的无水甲醇，并将孔板置于-20℃保持10min固定细胞。去除甲醇，每孔加入100μL PBST，置于摇床上缓慢摇晃10min，重复洗板3次。每孔加入100μL含1％ BSA的PBS，37℃缓慢摇晃30min。再次用PBST洗板3次。弃去洗液，每孔加入50μL 1:500稀释的FITC标记的腺病毒通用抗体(广州锐达生物科技有限公司)，用铝箔纸将孔板完全包裹，避光，置于摇床上缓慢摇晃1小时。去除抗体，用PBST重复洗板3次后，去除洗液，并将孔板倒扣到干净的吸水纸上，吸干洗液。在荧光显微镜下观察细胞荧光状况，若阴性孔细胞无绿色荧光，阳性孔细胞大部分发荧光，则可继续观察待测样品孔情况，并计数待测样品孔中发荧光的细胞数量。待测样本活病毒含量的计算公式为：荧光形成单位(FFU)/mL＝10×样品稀释倍数×四个副孔平均GFP阳性细胞数。
结果如图8B所示，SAdV-Ad5E4orf6在A549细胞中病毒滴度较低，而在Ad293细胞系中病毒滴度较高。而SAdV GZ3-12(野生型病毒)在A549细胞和Ad293细胞中均具有较高的病毒滴度。结合图8A/10B可知，SAdV-Ad5E4orf6在Ad293细胞系内正常复制，而在A549细胞系中仅感染不复制(其他细胞系Caco2、Hela、Huh7、HepG、Vero表现出相同的趋势)，说明SAdV-Ad5E4orf6具有复制缺陷特点，仅在特定细胞Ad293细胞内可以复制，安全性较高。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种猴腺病毒毒株，分类命名为猴腺病毒(SimianAdenovirus)SAdV GZ3-12，保藏号为CCTCCNO:V202385，保藏日期为2023年8月3日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，所述猴腺病毒毒株的基因组如SEQ ID NO.18所示。
2.一种猴腺病毒载体，其携带有至少一个如SEQ ID NO.18所示的病毒基因组。
3.含有权利要求1所述猴腺病毒毒株的细胞培养物。
4.根据权利要求3所述的细胞培养物，其特征在于，所述细胞选自人胚肾细胞293、人肺癌细胞A549、人结肠癌细胞Caco2、人神经胶质瘤细胞U251、人肝癌细胞Huh7、人肝癌细胞HepG2、人宫颈癌细胞Hela、人乳腺癌细胞MCF7、非洲绿猴肾细胞Vero E6、人气道基底细胞、人气道纤毛细胞、人气道Club细胞、人气道杯状细胞或肺泡AT1或肺泡AT2细胞。
5.一种病毒颗粒，其由权利要求2所述的猴腺病毒载体经转染细胞包装获得。
6.权利要求1所述的猴腺病毒毒株在制备预存免疫低的重组猴腺病毒载体中的应用。
7.权利要求1所述的猴腺病毒毒株在制备预存免疫低的重组猴腺病毒中的应用。
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