CN105713866B - 人巨细胞病毒感染性克隆及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及人巨细胞病毒感染性克隆及其构建方法和应用。该方法包括将绿色荧光蛋白基因插入到BAC中，得到带有GFP的BAC载体；以野生型HCMV Han病毒基因组为模板，PCR扩增其左右同源重组臂，将产物经过纯化、酶切后再进行连接和PCR，得到的左右同源重组臂全长序列与带有GFP的BAC载体连接后，经酶切线性化转染经野生型HCMV Han病毒感染的HEL细胞，传代培养后提取细胞总DNA；并电转化至感受态细胞中在抗性的培养基培养即得。该感染性克隆产生的重组病毒的生物学特性与野生型病毒相似，且还可以通过GFP报告基因的表达来观察病毒株感染性克隆在细胞内的感染情况。

Description

人巨细胞病毒感染性克隆及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种人巨细胞病毒感染性克隆及其构建方法和应用。

背景技术

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)属于疱疹病毒β亚科，其基因组约230kb，编码超过200个开放阅读框(open reading frame,ORF)，是目前已知最大的人类疱疹病毒。HCMV的基因在宿主细胞内的转录具有时相性，分为立即早期(immediate early，IE)、早期(early，E)和晚期(late，L)三类。其中，立即早期基因表达的病毒蛋白如IE1和IE2(又名UL123和UL122)是病毒复制时最重要转录激活因子，也是之后的早期和晚期基因表达所必需的调控因子；早期基因编码的蛋白如UL44和pp65等主要与基因的复制相关；而晚期蛋白如gB和MCP等主要参与包装病毒的基因组形成完整的病毒粒子。

HCMV只能感染人类，可通过口腔，生殖道，胎盘，输血或器官移植等多途径传播，感染非常普遍，且多呈隐性或潜伏感染，多数感染者无临床症状，但在一定条件下侵袭多个器官和系统产生严重疾病。在我国，HCMV感染率高达90％以上。该病毒感染在免疫功能正常者几乎无任何临床症状，但多数HCMV感染可由原发性感染转为潜伏感染，并在免疫功能受损或抑制时被激活，因此对免疫低下者如艾滋病患者和器官移植受者则可能是致命的。

HCMV潜伏于唾液腺、骨髓、神经节、外周血单个核细胞(PBMC)等处，然而仅0.004％-0.01％的PBMC携带2-13个拷贝的HCMV基因组，因此通过PBMC样本进行研究是有限的。此外，相关技术中，研究人员先后利用小鼠和恒河猴建立了MCMV(murinecytomegalovirus)和RhCMV(rhesus cytomegalovirus)的动物模型，证实了脑是先天性CMV感染的靶器官，这些研究结果和研究工具，对于HCMV的研究具有重要的指导和借鉴作用。然而，由于严格的感染种属特异性，HCMV的致病机理研究受到实验材料的限制，因此继续发展新的HCMV研究手段和工具是非常必要的。

目前，对疱疹病毒感染的控制尚无特异性有效措施。寄希望于疫苗，特别是新型疫苗，如亚单位疫苗、重组活疫苗、DNA疫苗的研究。试验证明，疫苗对阻止原发感染有作用，但重组HCMV糖蛋白疫苗虽能诱生高水平中和抗体，却不能保护机体的再感染。在抗HCMV的药物中，临床常用的有无环鸟苷(acyclovir)、丙氧鸟苷(ganciclovir)、阿糖腺苷(vidarabine)等。这些药物均能抑制病毒DNA合成，使病毒在细胞内不能复制，从而减轻临床症状，但不能彻底防止潜伏感染的再发。

疱疹病毒是一类大分子量的DNA病毒，其基因组全长一般都超过100kb，要在如此巨大分子量的基础上研究病毒单个基因的功能和致病机理十分困难，基因组本身不能长时间保存，且不能自我复制，更不能进行分子生物学的突变改造等一系列的实验手段。并且，病毒长期在体外固定细胞系如HEL上进行传代扩增，可能丢失基因组上与细胞嗜性或毒性相关的部分基因，从而无法长期稳定的保存原始形状。因此，提供一种研究疱疹病毒(具体为HCMV)局部片段或者病毒自身编码蛋白的功能和致病机理的感染性克隆(以期深入了解HCMV病毒编码的蛋白的功能，有效地预防和治疗由于该病毒引起的疾病，并为HCMV病毒疫苗的研发提供理论基础)是人们亟待解决的一个技术问题。

有鉴于此，特突出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人巨细胞病毒感染性克隆的构建方法，通过该构建方法可以实现人巨细胞病毒感染性克隆，且该感染性克隆为深入开展HCMV病毒的复制机制与致病机理等方面提供了研究工具，具有巨大的应用价值。

本发明的第二目的在于提供上述方法构建的人巨细胞病毒感染性克隆，该感染性克隆具有稳定产生HCMV的能力，产生的HCMV重组病毒的生物学特性与野生型病毒相似，而且还可以通过GFP报告基因的表达来观察病毒株感染性克隆在细胞内的感染情况。

该感染性克隆发生抗原抗体反应后，与野生型HCMV Han病毒相比，不但检测灵敏性和特异性没有减弱，反而因为本身的荧光蛋白使得该病毒在IFA的实验中光强度更高，在显微镜下更利于视野的捕捉。荧光效率高，荧光色泽与背景色泽对比鲜明，标记后能保持生物学活性和免疫活性，标记方法简单、快速，安全无毒。

本发明的第三目的在于提供上述的人巨细胞病毒感染性克隆的用途，以实现其应用价值。

本发明所构建的带有GFP标签的HCMV-Han感染性克隆可以用于HCMV病毒编码的蛋白功能的研究中，从而为流行病学研究以及HCMV毒株疫苗的开发提供了材料。

为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种人巨细胞病毒感染性克隆的构建方法，包括以下步骤：

1)、将绿色荧光蛋白(GFP)基因插入到BAC中，得到带有GFP的BAC载体；

2)、以野生型HCMV Han病毒基因组为模板，PCR分别扩增左右同源重组臂，将扩增产物分别依次经过纯化、酶切后再进行连接和PCR扩增，得到同源重组臂全长序列；

3)、将所述同源重组臂全长序列与所述带有GFP的BAC载体进行连接后通过转化、质粒提取以及酶切线性化处理，得到带有HCMV Han同源序列的线性化BAC穿梭质粒；

4)、用野生型的HCMV Han病毒感染转染HEL细胞，并利用所述带有HCMV Han同源序列的线性化BAC穿梭质粒转染感染的HEL细胞，再经过传代培养后提取发生了同源重组且带有HCMV Han-BAC重组病毒基因组的细胞总DNA；

5)、将所述带有HCMV Han-BAC重组病毒基因组的细胞总DNA电转化至感受态细胞DH10B中，并在含有氯霉素抗性的培养基培养，得到人巨细胞病毒感染性克隆。

本发明所构建的感染性克隆可进行各种分子和细胞水平上的鉴定。通过细胞病变的观察、GFP的检测、病毒特定基因的检测和病毒的激活等方法，证明了HCMV Han-BAC全长感染性克隆具有稳定产生HCMV的能力，产生的HCMV重组病毒的生物学特性与野生型病毒相似。

该感染性克隆能够在间接免疫荧光法(IFA)和蛋白质印迹法(western blot)的配合下深入了解HCMV病毒编码的蛋白等功能，可有效地预防和治疗由于该病毒引起的疾病，还能为HCMV病毒疫苗的研发提供理论基础。此外，该方法构建的带有细菌人工染色体基因的HCMV Han病毒感染性克隆HCMV Han-BAC，其序列为可参照NCBI数据库(GenBank:KJ426589.1)。

可选的，在步骤1)中，具体包括：

11)、将mini-F质粒去掉BamHI位点，得到pUS-F2质粒；将pUS-F2质粒的其中一个限制性酶切位点ClaI去除，得到pUS-F3质粒；

12)、以去除BamHI位点的质粒pGET007为模板，扩增绿色荧光蛋白基因，并将该扩增产物克隆至pGEM-T载体中，得到pGEM-GFP质粒；

13)、以所述pGEM-GFP质粒为模板，继续扩增包括限制性酶切位点HindIII和两个ClaI位点的GFP片段，并克隆至所述pUS-F3质粒的ClaI位点处中，得到pUS-F4质粒；

14)、将所述pUS-F4质粒的两个ClaI位点之间的HindIII位点去除，得到pUS-F5质粒。

可选的，在步骤2)中，具体包括：

21)、提取野生型HCMV Han病毒基因组DNA；

22)、以所述野生型HCMV Han病毒基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示序列为引物，扩增位于HCMV Han基因组中US区域的左臂序列，以如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列为引物，扩增位于HCMV Han基因组中US区域的右臂序列，分别得到左臂片段和右臂片段两个同源重组臂；

23)、将所述左臂片段和所述右臂片段分别进行纯化和BamHI酶切后进行连接反应，并以该连接产物为模板进行PCR，得到同源重组臂全长序列。

可选的，在步骤3)中，具体包括：

31)、将所述同源重组臂全长序列与所述pUS-F5质粒分别利用HindIII进行酶切和纯化，纯化后于15-17℃进行连接反应4-5小时后转化到E.coli DN5α，于35-38℃培养于含氯霉素抗性的培养基后，挑取单克隆提质粒，得到带有左右臂同源序列的BAC穿梭质粒pUS-F6；

32)、将所述pUS-F6穿梭质粒利用BamHI进行单酶切反应，35-38℃水浴反应4-5小时后，向酶切反应体系中加入无水乙醇和醋酸钠，混匀后在-85℃～-75℃沉淀，经洗涤并重悬于去离子水后，得到带有HCMV Han同源序列的线性化pUS-F6质粒。

可选的，在步骤4)中：具体包括：

41)、用野生型的HCMV Han病毒感染HEL细胞；

42)、感染5-6小时后，利用带有HCMV Han同源序列的线性化pUS-F6质粒转染经HCMV Han病毒感染的HEL细胞，连续传代培养数次后，挑选带有GFP的病变噬斑；

43)、用所述带有GFP的病变噬斑感染新鲜的HEL细胞并继续培养至细胞至少有50％病变，该病变HEL细胞带有HCMV Han-BAC重组病毒基因组，提取病变细胞的总DNA。

可选的，在步骤5)中：所述培养基为LB固体培养基，且所述培养时间为35-37小时，培养温度为36-38℃。

可选的，在步骤23)中：

所述PCR所用的引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示。

权利要求所述的构建方法构建成的人巨细胞病毒感染性克隆在间接免疫荧光或者在蛋白质印迹中的应用。

权利要求所述的构建方法构建成的人巨细胞病毒感染性克隆在检测抗病毒药物活性中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)、本发明制备的带有绿色荧光蛋白基因(GFP)的细菌人工染色体(pUS-F5质粒)比改造前的mini-F质粒(pMBO1374即pUS-F1)增加了一个指示标签蛋白，通过该绿色荧光蛋白的表达，能够更好的更直接观察载体的表达情况，由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，用其作为活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。

(2)、本发明的带有细菌人工染色的HCMV Han感染性克隆拯救出的HCMV Han-BAC重组病毒与野生型HCMV Han病毒相比有着相同的生长趋势，但是HCMV Han-BAC重组病毒中由于含有GFP蛋白标签，该标签蛋白分子量小只有0.7Kb，不影响病毒基因的结构和功能，大量表达对细胞也无毒性。含GFP的重组HCMV Han病毒感染细胞，便可进行病毒对细胞感染情况的实时观察，更接近自然真实的状态。

另外，HCMV Han-BAC感染性单克隆基因组由于含有BAC序列，能在特定的细菌内(如DH10B、DY380、EL250、DY330和GS1783等)保持低拷贝的自我复制，同时可借助Red同源重组系统对病毒基因进行特异性的基因敲除、替换、插入等一系列的分子生物学的改造。

(3)、本发明中的带有BAC序列的HCMV Han-BAC重组病毒在免疫荧光实验(IFA)中证明了该重组病毒相对于野生型HCMV Han病毒在抗原抗体反应后不但其感光灵敏性和特异性没有减弱，反而由于本身的荧光蛋白使得该病毒在IFA的实验中光强度更高，在显微镜下更利于视野的捕捉。荧光效率高，荧光色泽与背景色泽对比鲜明，标记后能保持生物学活性和免疫活性，标记方法简单、快速，安全无毒。

(4)、本发明中的带有细菌人工染色的HCMV Han-BAC重组病毒在核酸印迹实验中证明了该重组病毒相对于野生型HCMV Han病毒多加了一段约9kb大小的BAC基因序列，且插入方向和位点都符合预期，但是在蛋白质印迹中的敏感度、效果、生物活性和与抗体结合的特异性等发面没有任何的弱化。

此外，该重组病毒相对于野生型来说，由于能够在细菌内永久的保存，使得HCMVHan-BAC病毒基因组的自然突变几率大大降低，生物学特性保存的较为完整，在周期极长的条件下几乎不会对病毒性状和基因组产生影响任何实质性的影响，这是野生型HCMV Han病毒所无法比拟的。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明提供的pUS-F5质粒(即带有GFP的BAC载体)的构建示意图；

图2为本发明提供的带有细菌人工染色的HCMV Han-BAC感染性克隆(人巨细胞病毒感染性克隆)的构建示意图；

图3为本发明提供的HCMV Han-BAC感染性克隆的筛选和鉴定结果图；

其中，A：HCMV Han-BAC单克隆的PCR鉴定；B：HCMV Han-BAC的Southern Blot鉴定；C：HCMV Han-BAC重组病毒的拯救；D：HCMVHan-BAC重组病毒的同步生长曲线；

图4为本发明提供的HCMV Han-BAC感染性克隆感染HEL细胞后的间接免疫荧光图；

图5为本发明提供的HCMV Han-BAC感染性克隆感染HEL细胞后的蛋白质印迹图；

图6为野生型及本发明提供的感染性克隆的HCMV(WT HCMV Han和HCMV Han-BAC)在药物更昔洛韦(GCV)处理后对病毒生长的影响结果图；

其中，A为HCMV Han在GCV处理后相对于未加GCV的病毒滴度的生长曲线对比图；B；HCMV Han-BAC在GCV处理后相对于未加GCV的病毒滴度的生长曲线对比图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本发明中的具体实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例一

人巨细胞病毒感染性克隆的构建方法，包括以下步骤：

将绿色荧光蛋白基因插入到BAC中，得到带有GFP的BAC载体；以野生型HCMV Han病毒基因组为模板，PCR分别扩增左右同源重组臂，将扩增产物分别依次经过纯化、酶切后再进行连接和PCR扩增，得到同源重组臂全长序列；将所述同源重组臂全长序列与所述带有GFP的BAC载体进行连接后通过转化以及线性化处理，得到带有HCMV Han同源序列的线性化质粒；用野生型的HCMV Han病毒感染HEL细胞，再利用所述带有HCMV Han同源序列的线性化质粒转染感染后的HEL细胞，并经过传代培养后提取感染后HEL细胞且带有HCMV Han-BAC重组病毒基因组的DNA；将所述带有HCMV Han-BAC重组病毒基因组的DNA电转化至感受态细胞DH10B中，并在含有氯霉素抗性培养基培养，得到人巨细胞病毒感染性克隆。

为了更加易于实现人巨细胞病毒感染性克隆的构建，本发明还在上述实施例一的基础之上提供了实施例二和三，实施例二和三为实施例一的进一步限定和增加：

实施例二

本实施例人巨细胞病毒感染性克隆的构建方法包括以下步骤：

a)、将mini-F质粒去掉BamHI位点，得到pUS-F2质粒；将pUS-F2质粒的其中一个限制性酶切位点ClaI去除，得到pUS-F3质粒；

b)、以去除BamHI位点的质粒pGET007为模板，扩增绿色荧光蛋白基因，并将该扩增产物克隆至pGEM-T载体中，得到pGEM-GFP质粒；

c)、以pGEM-GFP质粒为模板，继续扩增带有限制性酶切位点ClaI和HindIII位点的GFP片段，并克隆至pUS-F3质粒中，得到pUS-F4质粒；

d)、将pUS-F4质粒的两个ClaI位点之间的HindIII位点去除，得到pUS-F5质粒。

e)、提取野生型HCMV Han病毒基因组DNA；

用野生型的HCMV Han病毒以感染复数(MOI)为1的量感染HEL细胞，感染12小时后，刮下细胞，离心收集沉淀，用solution I缓冲液清洗一遍，再用另外添加proteinaseK(0.25mg/ml)、十二烷基硫酸钠(SDS)(0.6％)和NaCl(1M)的solution I缓冲液(0.5ml)重悬细胞沉淀，50℃孵育2小时，继续加入RNase I，并于50℃孵育1小时，最后再用酚氯仿进行反复抽提获得细胞基因组沉淀，干燥后用一定量的无菌去离子水重悬核酸沉淀，这样溶解后的DNA中含有大量的野生型的HCMV Han病毒基因组DNA。

f)、以野生型HCMV Han病毒基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列为引物，扩增位于HCMV Han基因组中US区域的左臂序列，以如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示序列为引物，扩增位于HCMV Han基因组中US区域的右臂序列，分别得到左臂片段和右臂片段；

具体的，提取的野生型HCMV Han病毒基因组为模板PCR分别扩增左右同源重组臂，其中左臂(L-arm)序列位于HCMV Han基因组中US区域的No.197937-199536，序列全长1600bp，右臂序列(R-arm)位于基因组中US区域的No.205037-207036，序列全长2000bp。其中，SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4的序列分别为：

左臂F引物：5’-CGGGATCCGGGCAGTGGGAGTTCATGTT-3’；左臂R引物：5’-CCCAAGCTTAGCGAGAGCACTGGCAGGGG-3’；右臂F引物：5’-CCCAAGCTTGAGGGTACTGGGGCAGACGG-3’；右臂R引物：5’-CGGGATCCGTCCCCCGCACCCTAAAACA-3’。其中，下划线表示酶切位点。

g)、将左臂片段和右臂片段分别进行纯化和酶切后进行连接反应，并以该连接产物为模板进行PCR，得到同源重组臂全长序列。

具体的，用1％琼脂糖凝胶电泳分别纯化左右同源臂片段。将纯化后的左右臂片段分别用限制性内切酶BamHI进行单酶切，酶切体系的总体积为50μl，DNA量为2μg，37℃水浴反应4小时后，再用1％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，所得酶切纯化后的左右同源臂序列直接进行连接反应。

连接反应总体积为10μl，5μl 2x连接缓冲液，5μl纯化后的左右臂DNA(两臂DNA浓度比为1:1)，16℃反应4小时后，PCR扩增左臂和右臂的全长序列(L+R arms)，用1％琼脂糖凝胶电泳纯化同源重组臂全长序列(L+R arms)，得到同源重组臂全长序列。

h)、将同源重组臂全长序列与pUS-F5质粒分别利用HindIII进行酶切和纯化，纯化后于16℃反应4小时后转化到E.coli DN5α，于37℃培养后得到带有左右臂同源序列的pUS-F6质粒；

在该步骤中，将纯化后的L+R arms序列和环状的pUS-F5载体分别用HindIII内切酶进行单酶切，酶切体系的总体积为50μl，DNA量为2μg，37℃水浴反应约4小时后，再用1％琼脂糖凝胶电泳分别进行纯化，所得纯化后的载体pUS-F5和L+R arms序列进行连接反应，其反应总体积为10μl，5μl连接缓冲液，4.5μl的L+R arms序列和0.5μl的载体pUS-F5，16℃反应4小时后直接转化进感受态E.coli DN5α中37℃过夜培养，挑取单克隆，鉴定并测序，成功后的带有左右臂同源序列的pUS-F5质粒命名为pUS-F6。

i)、将pUS-F6质粒利用BamHI进行单酶切反应，37℃水浴反应4小时后，向酶切反应体系中加入无水乙醇和醋酸钠，混匀后在-80℃沉淀，得到带有HCMV Han同源序列的线性化pUS-F6质粒。

在该步骤中：酶切体系的总体积为50μl，DNA(pUS-F6质粒)量为2μg，限制性内切酶为BamHI，平行设置4支酶切反应管，37℃水浴反应4小时后，直接向每管酶切体系中加入100μl无水乙醇和20μl的醋酸钠(3M)，混匀后置于-80℃10分钟以便沉淀核酸，最后用20μl无菌去离子水重悬4支体系中的核酸沉淀，测定其浓度。

j)、用野生型HCMV Han病毒感染HEL细胞；

在该步骤中，感染前一天将HEL细胞分至培养板，转染当天细胞密度应达到50-80％，将野生型HCMV Han病毒以MOI＝3感染HEL细胞，后置于37℃培养箱中培养。

k)、利用带有HCMV Han同源序列的线性化pUS-F6质粒转染感染后的HEL细胞；

将SuperFect Transfection Reagent在室温与无血清和抗生素的培养基混匀后孵育15分钟，颠倒混匀数次并加入2μg线性化pUS-F6DNA。在感染6小时后，将转染混合物转染被感染的HEL细胞，并继续置于37℃培养箱中培养。经病毒感染后培养传代3代以后，在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，将挑取GFP阳性的HEL细胞病变噬斑并感染新鲜的HEL细胞，继续培养直到病变。观察绿色荧光蛋白的表达情况，若GFP阳性率大于50℅便可用于提取细胞总DNA。

l)、用带有GFP的病变噬斑感染新鲜的HEL细胞并继续培养至细胞至少有50％病变，提取病变HEL细胞且带有HCMV Han-BAC重组病毒基因组的总DNA；

在提取的过程中，包括：去除细胞培养基，用胰酶消化细胞，离心去上清，用solution I溶液清洗细胞沉淀，后用0.5ml细胞悬浮液重悬细胞沉淀，50℃孵育2小时后，继续加入RNase I并于50℃孵育1小时，最后用酚氯仿进行反复抽提获得细胞基因组，经沉淀干燥后用100μl无菌去离子水重悬核酸沉淀。这样溶解后的DNA中含有大量的野生型的HCMVHan-BAC重组病毒基因组DNA。

m)、将带有HCMV Han-BAC重组病毒基因组的DNA电转化至感受态细胞DH10B中，并在含有氯霉素抗性培养基培养，即得。

具体的，该步骤中，使用含有氯霉素抗性的LB固体培养基中于37℃中培养超过36小时。PCR鉴定单克隆，鉴定的基因为HCMV Han的序列，包括UL31、UL33、UL34、UL37、UL44、UL69、UL82、UL97、IE1、IE2、gB和US29。单克隆鉴定完后提取感染性单克隆的基因组进行琼脂糖凝胶电泳检查其基因组的质量。

此外，在本实施例中，得到HCMV Han-BAC感染性克隆，还进行其活病毒的拯救和活力测定，步骤如下：

1.将HEL细胞铺于6孔板中，密度约为80％。培养过夜后，以上述步骤m)中得到的HCMV Han-BAC感染性单克隆的DNA转染HEL细胞中。其中含环状HCMV Han-BAC DNA为2μg，SuperFect TransfectionReagent原试剂取10μl，再用无血清和抗生素的MEM培养基配成100μl的混合液，室温放置5-10分钟后，再加上600μl无血清和抗生素的MEM稀释转染混合液。去除细胞培养基，用预热的PBS清洗细胞，然后直接加上700μl的转染混合液，37℃孵育2-3小时后，用PBS清洗细胞，最后加入MEM完全培养基，置于37℃培养箱中培养；

2.HCMV Han-BAC感染性单克隆转染后约2周，开始出现细胞病变现象，将病变细胞置于倒置荧光显微镜下观察，发现病变处均表达GFP，说明感染性单克隆的拯救是成功的。然后继续培养直到细胞全部病变后，收集细胞培养液加入1％的DMSO放在-80℃冻存备用；

3.测定野生型的HCMV Han病毒，重组病毒HCMV Han-BAC，HCMVTowne和Toledo(作为对照)的滴度。将HEL细胞以1×10⁶/孔铺于6孔板，用1ml不同种病毒(HCMV Han，HCMVHan-BAC，HCMV Towne和Toledo)分别感染HEL细胞，每种病毒设置3个重复。感染8-10小时后，直接提取感染的细胞基因组DNA，稀释成浓度为10ng/μl用于做荧光定量PCR。同时准备标准曲线的质粒pcDNA3-UL83(10ng/μl)和内参质粒pcDNA3-GAPDH(10ng/μl)并以10倍级别梯度稀释5个数量级，即10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，最后在实时定量PCR仪上取得数据，计算单个细胞内的病毒基因组数，然后计算病毒滴度。

4.将HEL细胞按照1×10⁶个/孔的密度铺于6孔板中，将病毒(HCMVHan，HCMV Han-BAC，HCMV Towne和Toledo)按照MOI＝3分别感染细胞(此时设为感染后0小时)。孵育2小时后换掉培养基，用MEM完全培养基开始培养感染后的细胞；然后分别在感染后不同的时间点(1，2，3，4，5，6，7，8，9天)收取细胞沉淀并保存于-80℃。当所有的病毒样品收集齐后按照上述步骤3的叙述测定所有样品的滴度，然后根据不同病毒感染后在各个时间点的滴度绘制出它们的生长曲线进行对比来判断重组型HCMV Han-BAC病毒的活力。

实施例三

本实施例感染性克隆的构建方法具体通过以下步骤实现，主要分为以下两个部分：

1)带有绿色荧光蛋白基因(GFP)的细菌人工染色体(BAC)的构建：

(11)、在原始质粒(pMBO1374即pUS-F1)基础上改造后重新连接为pUS-F2

先将2μg原始质粒pUS-F1放入总体积为20μl的BamHI单酶切反应体系中,37℃反应4小时。然后把反应后的酶切体系用琼脂糖凝胶电泳纯化，纯化步骤参照试剂盒(美国omega公司)说明书。继续用S1Nuclease核酸酶消化被BamHI单酶切后的pUS-F1DNA，反应体系如下：DNA2μg，10×S1Buffer 2μl，S1Nuclease 20U，用ddH₂O补齐至20μl，室温反应15分钟，用20μl的20mM EDTA停止反应。加入40μl的苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，充分混匀。离心，取上层(水层)移至另一微量离心管中。然后加入40μl的氯仿/异戊醇(24：1)，充分混匀。离心，取上层(水层)移至另一微量离心管中。接着加入4μl(1/10量)的3M NaOAC(pH5.2)，加入2.5倍量的冷无水乙醇，-20℃放置30分钟后离心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥10分钟后溶解于适量的ddH₂O后，用T4DNA Polymerase(购于日本TaKaRa公司)连接DNA的平滑末端，那么连接后的环状质粒即为去掉酶切位点BamHI的pUS-F2质粒。

(12)、在pUS-F2质粒的基础上继续改造并重新连接为pUS-F3

先将2μg pUS-F2放入总体积为20μl的ClaI单酶切反应体系中,37℃反应4小时。按照(11)所述方法以S1Nuclease核酸酶消化纯化的酶切产物，经沉淀、重悬、连接后得到去掉酶切位点ClaI的pUS-F3质粒。

(13)、除去原始质粒pGET007中限制性酶切位点BamHI并重新连接为pGET007(BamHI^－)

先将2μg原始质粒pGET007放入总体积为20μl的BamHI单酶切反应体系中，37℃反应4小时。按照(11)所述方法以S1Nuclease核酸酶消化纯化的酶切产物，经沉淀、重悬、连接后得到去掉酶切位点BamHI的pGET007(BamHI^-)质粒。

(14)、在pGET007(BamHI^－)质粒基础上PCR扩增GFP片段，并且将该片段克隆至pGEM-T载体为pGEM-GFP

以pGET007(BamHI^－)质粒为模板，PCR扩增绿色荧光蛋白基因。PCR反应体系为：2μl10×buffer，0.4μl dNTP，0.2μl上游引物物(5’-ATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3’)，0.2μl下游引物(5’-TTTGTATAGTTCATCCATGC-3’)，0.2μl rTaq聚合酶酶，无菌去离子水补足总体积至20μl。扩增条件为：94℃2min，(94℃30s，55℃30s，72℃3min)30个循环，72℃10min，16℃10min。然后把PCR片段进行琼脂糖凝胶电泳纯化。测定DNA的浓度，接着用pGEM-T载体试剂盒(购于日本TaKaRa公司)中的pGEM-T载体0.5μl，纯化回收所得的GFPPCR片段4.5μl，连接缓冲液5μl，混合后于16℃反应4小时，之后将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α(本实验室所有)中。

挑取菌落并进行PCR鉴定，PCR程序如上，鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒命名为pGEM-GFP。

(15)、PCR扩增带有ClaI和HindIII位点的GFP片段克隆转移至pUS-F3质粒中形成pUS-F4质粒

以pGEM-GFP质粒为模板，PCR扩增绿色荧光蛋白基因。PCR鉴定的反应体系如步骤(14)。

所用引物为5’-ATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3’和5’-TTTGTATAGTTCATCCATGC-3’。扩增条件为：94℃2min，(94℃30s，55℃30s，72℃3min)30个循环，72℃10min，16℃10min。之后纯化PCR片段并测定DNA浓度。接着用限制性内切酶ClaI分别酶切纯化后的GFP片段和pUS-F3载体。酶切体系为20ul，包括ClaI酶2μl和DNA2μg，ddH₂O补齐至20μl。37℃水浴4小时后胶回收纯化。

最后用酶切后的pUS-F3质粒载体0.5μl，GFP PCR片段4.5μl，连接缓冲液5μl，于16℃混合反应4小时。后将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α。挑取菌落并进行PCR鉴定，PCR程序如上所述，鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒命名为pUS-F4。

(16)、在pUS-F4质粒的基础上去掉除2个ClaI位点之间的HindIII位点，最终命名为pUS-F5

参照步骤(11)所述方法将pUS-F4质粒以HindIII酶切、S1Nuclease消化、沉淀重悬连接后的环状质粒即为去掉酶切位点HindIII的即为pUS-F5质粒。具体的pUS-F5质粒的构建过程请参考图1。

2)带有细菌人工染色体基因的人巨细胞病毒临床株(HCMV Han)的感染性克隆(HCMV Han-BAC)的制备

(21)、HCMV Han病毒基因组的提取

该步骤与实施例二的步骤e)一致，在此不作赘述。

(22)、带有HCMV Han同源序列的细菌人工染色体的构建

以野生型HCMV Han病毒基因组为模板PCR分别扩增左右同源重组臂，其中左臂(L-arm)序列位于HCMV Han基因组(GenBank:KJ426589.1)US区域中的No.197937-199536，序列全长1600bp，右臂序列(R-arm)位于基因组US区域中的No.205037-207036，序列全长2000bp。

PCR反应体系为：10×buffer 2μl，dNTP 0.4μl,上下游引物各0.2μl(左臂F引物-5’-CGGGATCCGGGCAGTGGGAGTTCATGTT-3’，左臂R引物5’-CCCAAGCTTAGCGAGAGCACTGGCAGGGG-3’；右臂F引物5’-CCCAAGCTTGAGGGTACTGGGGCAGACGG-3’，右臂R引物-5’-CGGGATCCGTCCCCCGCACCCTAAAACA-3’)，PrimeStar聚合酶：0.2μl，ddH₂O补足至总体积20μl。扩增条件为：94℃2min，(94℃30s，55℃30s，72℃3min)30个循环，72℃10min，16℃10min。

用1％琼脂糖凝胶电泳纯化试剂盒纯化左右同源重组臂序列。将纯化后的左右臂序列分别用限制性内切酶BamHI进行单酶切，酶切体系的总体积为50μl，包括DNA2μg。37℃水浴反应4小时后，用1％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，所得酶切纯化后的左右同源臂序列直接进行连接反应，其反应总体积为10μl，包括5μl连接缓冲液和5μl的左右臂序列纯化产物(浓度比为1:1)，16℃反应4小时后，PCR扩增左臂和右臂的全长序列(L+Rarms)，PCR反应体系为：10×buffer 2μl，dNTP 0.4μl，左臂F引物(5’-CGGGATCCGGGCAGTGGGAGTTCATGTT-3’)0.2μl，右臂R引物(5’-CGGGATCCGTCCCCCGCACCCTAAAACA-3’)0.2μl，PrimeStar聚合酶0.2μl，ddH₂O补足至总体积为20μl。扩增条件为：94℃2min，(94℃30s，55℃30s，72℃3min)30个循环，72℃10min，16℃10min。

用1％琼脂糖凝胶电泳纯化同源重组臂全长序列(L+R arms)。最后将此纯化后的L+R arms序列和环状的pUS-F5载体分别用HindIII酶切，酶切体系的总体积为50μl，含DNA2μg，37℃水浴反应4小时后，再用1％琼脂糖凝胶电泳分别进行纯化，所得纯化后的载体pUS-F5和L+R arms序列进行连接反应，其反应总体积为10μl，包括5μl连接缓冲液，4.5μl的L+Rarms酶切纯化产物和0.5μl的载体pUS-F5酶切纯化产物，16℃反应4小时后直接转化感受态E.coli DN5α中37℃过夜培养，鉴定及测序，成功后的带有左右臂同源序列的pUS-F5质粒命名为pUS-F6。

(23)、pUS-F6的线性化

该步骤与步骤i)一致，在此不作赘述。

(24)、带有细菌人工染色体基因的HCMV Han病毒感染性克隆的构建

具体的，该步骤包括以下几个步骤：

(241)、线性化pUS-F6质粒在HEL细胞中的转染

与实施例二中的步骤j)一致，在此不做赘述。

(242)、HCMV Han病毒的感染

与实施例二中的步骤k)一致，在此不做赘述。

(243)、感染后细胞基因组的提取

该步骤与实施例二中步骤l)一致，在此不做赘述。具体的，上述带有细菌人工染色的HCMV Han-BAC感染性克隆的构建，其示意图如图2所示。

(244)、HCMV Han-BAC感染性克隆的初步筛选和鉴定

与实施例二中步骤m)的区别在于，在该步骤中，在鉴定不同的序列的时(包括UL31、UL33、UL34、UL37、UL44、UL69、UL82、UL97、IE1、IE2、gB和US29)，所用的引物及扩增片段如下表所示：

245)、HCMV Han-BAC感染性克隆活病毒的拯救

246)、HCMV Han-BAC重组病毒的活力测定

上述步骤245)和246)与实施例二中的活病毒的拯救和活力测定、以及HCMV Han-BAC重组病毒的活力测定的步骤一致，在此不作赘述。筛选和鉴定结果如图3所示，在图3中，A：HCMV Han-BAC单克隆的PCR鉴定结果；B：HCMV Han-BAC的Southern Blot鉴定；C：HCMVHan-BAC重组病毒的拯救；D为HCMV Han-BAC重组病毒的同步生长曲线。通过图3可知，该感染性克隆，含有所有测试且分布于整个基因组不同区域的HCMV基因。

应用例1

将本发明实施例3构建成的带有细菌人工染色体基因的HCMV Han的感染性克隆应用到间接免疫荧光法中，具体为：

在100mm²的培养皿中均匀放置3-5片圆形玻片，然后将HEL铺满整个培养皿底部，形成单细胞层，在37℃，5％的CO₂培养条件下，待细胞密度度达到80％时，用HCMV Han-BAC重组病毒按MOI＝1感染HEL细胞。

同步设置阴性对照。37℃、5％CO₂培养箱中吸附2h后，将培养皿中的病毒液全部换掉，重新加入完全MEM培养基培养。感染72小时后，用镊子小心将圆形玻片取出，准备进行IFA实验。操作步骤是：先用3％的甲醛固定贴在圆形玻片的HEL细胞，大约15分钟后，用PBS洗涤2遍，再用1％的TritonX-100孵育5分钟，用PBS洗涤3遍，接着用含30％的封闭液封闭15分钟，之后孵育一抗(病毒蛋白的IE1，gB，UL44和pp65单克隆抗体)。用PBS反复洗掉未结合的抗体后，再用标记的第二抗体与Hoechst分别孵育，使之形成抗原-单克隆抗体-标记的第二抗体(羊抗鼠IgG)复合物，孵育10分钟，用PBS洗干净，然后干燥、封片后最后使用正置荧光显微镜分别观察荧光。

结果见图4，图4中显示了病毒感染前后细胞的形态，及细胞核和病毒蛋白IE1/2/UL44/pp65/gB的染色结果，感染前细胞形态正常呈梭型，感染后细胞变圆，而细胞核染色结果显示细胞核变小变圆，感染病毒之后病毒蛋白(IE12/UL44/pp65/gB)被标记显示荧光，而未感染的则不会被标记。

应用例2

将本发明实施例3构建成的带有BAC序列的HCMV Han的感染性克隆应用蛋白质印迹法中，具体为：

在100mm²的培养皿中按照2×10⁶/皿铺HEL细胞，在37℃，5％CO₂条件下培养，待细胞完全贴壁后，用HCMV Han-BAC重组病毒以MOI＝1感染细胞。

同步设置阴性对照。37℃、5％CO₂培养箱中吸附2h后，用含2％胎牛血清的MEM培养基替换培养皿中的病毒接种液，感染72小时后，用胰酶消化细胞，收集细胞在1000rmp离心5分钟。用预冷的PBS洗涤细胞一遍，继续离心去掉上清液。收集细胞沉淀放入液氮中冰冻10秒，作为检测样品，准备进行western blot实验。具体操作是：往细胞沉淀中加入50μl裂解缓冲液，涡旋混匀沉淀，利用超声破碎细胞壁，接着测定蛋白含量，最后加入5x LoadingBuffer，按照同等蛋白量上样(20μg)，进行SDS-聚丙稀酰胺凝胶(PAGE)电泳。之后进行转膜反应，先用甲醛处理尼龙膜2分钟，然后在转膜缓冲液中浸泡15分钟后，开始转膜。转膜条件为恒流200mA,90分钟(美国Bio-Red公司)。转膜完毕后，即刻用TBST液洗膜3分钟，再用5％的牛奶/TBST封闭1小时。接着用TBST洗膜3次后，分别孵育IE1/2，UL44，pp65和gB特异性的单克隆抗体，洗膜后孵育二抗后并再次洗膜。最后进行化学发光显影(美国Alpha公司)其结果可参见附图5。

在图5中，病毒感染前后目标蛋白(IE1/2，UL44，pp65和gB)的化学发光结果中可以清楚的看到感染了病毒的样本就能显色出目标条带，而未感染病毒的样本则不能显色出目标条带。

应用例3

本发明实施例3构建成的带有细菌人工染色体基因的HCMV Han的感染性克隆应用到抗病毒药物中，具体步骤为：

将HEL细胞按照1×10⁶个/孔铺至6孔板中，待细胞贴壁后用病毒(HCMV Han和HCMVHan-BAC)按照MOI＝2分别感染细胞(此时设为感染后0小时)。孵育2小时后换掉培养基，同时加入终浓度为117μg/ml的更昔洛韦(GCV)(湖北科益药业有限公司)并设置阴性对照，每隔24小时重新加入相同剂量的GCV。用MEM完全培养基开始培养感染后的细胞；然后分别在病毒(HCMV Han和HCMV Han-BAC，)感染后不同的时间点(1，2，3，4，5，6，7dpi)收取样本。

将收取的细胞沉淀并保存于-80℃，当所有的病毒样品收集齐后直接提取感染的细胞基因组DNA，稀释成浓度为10ng/μl用于荧光定量PCR(QRT-PCR)。同时准备好做标准曲线的质粒pcDNA3-UL83(10ng/μl)和内参质粒pcDNA3-GAPDH(10ng/μl)并以10倍级别梯度稀释5个数量级即10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，最后在实时定量PCR仪上取得数据，计算单个细胞内的病毒基因组数，然后计算病毒滴度；再根据HCMV Han和HCMV Han-BAC病毒感染后在各个时间点的滴度分别绘制出它们在有无药物处理的生长曲线进行对比来判断药物GCV对重组型HCMVHan-BAC病毒的活力是否也有相同的抑制作用。

结果如图6所示，图6为野生型及感染性克隆的HCMV(WT HCMVHan和HCMV Han-BAC)在药物更昔洛韦(GCV)处理后对病毒生长的影响。其中，A：HCMV Han在GCV处理后相对于未加GCV的病毒滴度的生长曲线对比图；B：HCMV Han-BAC在GCV处理后相对于未加GCV的病毒滴度的生长曲线对比图。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.HCMV Han病毒感染性克隆在检测抗病毒药物活性中的应用，其特征在于，所述HCMVHan病毒感染性克隆的构建方法，包括以下步骤：

1)、将绿色荧光蛋白基因插入到BAC中，得到带有GFP的BAC载体；

2)、以野生型HCMV Han病毒基因组为模板，PCR分别扩增左右同源重组臂，将扩增产物分别依次经过纯化、酶切后再进行连接和PCR扩增，得到同源重组臂全长序列；

3)、将所述同源重组臂全长序列与所述带有GFP的BAC载体进行连接后通过转化、质粒提取以及酶切线性化处理，得到带有HCMV Han同源序列的线性化BAC穿梭质粒；

4)、用野生型的HCMV Han病毒感染转染HEL细胞，并利用所述带有HCMV Han同源序列的线性化BAC穿梭质粒转染感染的HEL细胞，再经过传代培养后提取发生了同源重组且带有HCMV Han-BAC重组病毒基因组的细胞总DNA；

5)、将所述带有HCMV Han-BAC重组病毒基因组的细胞总DNA电转化至感受态细胞DH10B中，并在含有氯霉素抗性的培养基培养，得到人巨细胞病毒感染性克隆；

在步骤2)中，具体包括：

21)、提取野生型HCMV Han病毒基因组DNA；

22)、以所述野生型HCMV Han病毒基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列为引物，扩增位于HCMV Han基因组中US区域的左臂序列，以如SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示序列为引物，扩增位于HCMV Han基因组中US区域的右臂序列，分别得到左臂片段和右臂片段两个同源重组臂；

23)、将所述左臂片段和所述右臂片段分别进行纯化和BamHI酶切后进行连接反应，并以该连接产物为模板进行PCR，得到同源重组臂全长序列；

所述SEQ ID NO:1序列为：

5’-CGGGATCCGGGCAGTGGGAGTTCATGTT-3’；

所述SEQ ID NO:2序列为：

5’-CCCAAGCTTAGCGAGAGCACTGGCAGGGG-3’；

所述SEQ ID NO:3序列为：

5’-CCCAAGCTTGAGGGTACTGGGGCAGACGG-3’；

所述SEQ ID NO:4序列为：

5’-CGGGATCCGTCCCCCGCACCCTAAAACA-3’。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在步骤1)中，具体包括：

11)、将mini-F质粒去掉BamHI位点，得到pUS-F2质粒；将pUS-F2质粒的其中一个限制性酶切位点ClaI去除，得到pUS-F3质粒；

12)、以去除BamHI位点的质粒pGET007为模板，扩增绿色荧光蛋白基因，并将该扩增产物克隆至pGEM-T载体中，得到pGEM-GFP质粒；

13)、以所述pGEM-GFP质粒为模板，继续扩增包括限制性酶切位点HindIII和两个ClaI位点的GFP片段，并克隆至所述pUS-F3质粒的ClaI位点处中，得到pUS-F4质粒；

14)、将所述pUS-F4质粒的两个ClaI位点之间的HindIII位点去除，得到pUS-F5质粒。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在步骤3)中，具体包括：

31)、将所述同源重组臂全长序列与所述pUS-F5质粒分别利用HindIII进行酶切和纯化，纯化后于15-17℃进行连接反应4-5小时后转化到E.coliDN5α，于35-38℃培养于含氯霉素抗性的培养基后，挑取单克隆提质粒，得到带有左右臂同源序列的BAC穿梭质粒pUS-F6；

32)、将所述pUS-F6穿梭质粒利用BamHI进行单酶切反应，35-38℃水浴反应4-5小时后，向酶切反应体系中加入无水乙醇和醋酸钠，混匀后在-85℃～-75℃沉淀，经洗涤并重悬于去离子水后，得到带有HCMV Han同源序列的线性化pUS-F6质粒。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在步骤4)中，具体包括：

41)、用野生型HCMV Han病毒感染HEL细胞；

42)、感染5-6小时后，利用带有HCMV Han同源序列的线性化pUS-F6质粒转染经HCMVHan病毒感染的HEL细胞，连续传代培养数次后，挑选带有GFP的病变噬斑；

43)、用所述带有GFP的病变噬斑感染新鲜的HEL细胞并继续培养至细胞至少有50％病变，该病变HEL细胞带有HCMV Han-BAC重组病毒基因组，提取病变细胞的总DNA。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在步骤5)中：所述培养基为LB固体培养基，且所述培养时间为35-37小时，培养温度为36-38℃。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在步骤23)中：

所述PCR所用的引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示。

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