CN113637705A - 猴1型腺病毒（SAdV-1）载体系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种猴1型腺病毒SAdV‑1载体系统，包括腺病毒质粒pKSAV1‑EG和包装细胞系293SE13。靶基因编码区可通过DNA组装或限制性酶切‑连接克隆插入pKSAV1‑EG质粒SpeI限制性内切酶切割位点，产生携带靶基因的腺病毒质粒；包含表达调控序列的外源基因表达框可类似插入pKSAV1‑EG的FseI位点，产生携带外源基因表达框的腺病毒质粒。将SwaI线性化的腺病毒质粒转染293SE13细胞，拯救重组病毒；293SE13也用于扩增重组病毒。产生的SAdV‑1病毒基因组E1/E3部位缺失，是复制缺陷型病毒。人类缺乏对SAdV‑1的预存免疫力，SAdV‑1的靶细胞与常用HAdV‑5载体不同，预计本载体系统在基因治疗和载体疫苗领域有广阔的应用前景。

Description

猴1型腺病毒（SAdV-1）载体系统及其应用
技术领域
本发明属于重组疫苗领域，具体而言，涉及一种重组猴腺病毒SAdV-1载体系统及其应用。
背景技术
腺病毒无包膜，病毒颗粒成正二十面体对称，直径约80nm。基因组为线性双链DNA，长度26-48kb。腺病毒科（Adenoviridae）分为5个属（genus），其中哺乳动物腺病毒属感染哺乳动物。在各类哺乳动物宿主，包括人类、猴、牛、马、猪、羊、小鼠等，均发现有腺病毒感染。人类腺病毒（humanadenovirus, HAdV）分为A-G共7个种，各个种又包括多个型别。总的来说，人类腺病毒致病力较弱，对于免疫功能正常的人野生型腺病毒一般不会引发严重疾病。对HAdV-C的2型和5型研究得最充分，HAdV-5被改造为基因转移载体，在科学研究、基因治疗和疫苗研发中得到大量应用[1]。与其他病毒载体相比，腺病毒载体具有很多优点或特性：基因组为中等大小的双链DNA，传代稳定性好，不易变异；在包装细胞的复制效率高，病毒无包膜，理化性质稳定，容易制备和纯化；既可感染分裂期细胞，又可感染非分裂期细胞，多个病毒颗粒能够进入一个宿主细胞，传递的外源基因拷贝数多，核转移效率高，因此外源基因表达水平高；进入细胞的病毒基因组以附加体的形式存在于染色体外，不整合到宿主基因组，遗传安全性好；病毒颗粒含有较多的结构蛋白，免疫原型强。
临床前研究或临床试验的结果表明血清中和抗体严重影响腺病毒载体的基因转移效率。HAdV-5中和抗体能够减弱基于HAdV-5的载体疫苗的免疫原性[2]。血清流行病学调查表明不同地区人群HAdV-5中和抗体阳性率不同，我国健康成人的HAdV-5中和抗体阳性率为60-82%。由于不同型别腺病毒感染的宿主细胞类型不同，使用不同型别的腺病毒载体一方面可以扩大靶细胞的多样性，另一方面可以规避预存中和抗体的中和作用。
有数篇文献分析比较了哺乳动物腺病毒、特别是猴腺病毒作为载体疫苗的免疫激活作用，又由于人群一般没有猴腺病毒的中和抗体，所以猴腺病毒是优良的候选载体[3-6]。猴1型腺病毒（SAdV-1）分离自健康食蟹猕猴（Macaca fascicularis）的肾细胞培养物[7, 8]，能够在猴的粪便中检出，可能不致病或引起腹泻[9-11]，其与属于同一个种（HAdV-G）的猴腺病毒52型在基因组水平同源性最高，有开发为疫苗载体或基因治疗载体的潜力[5]。
我们尝试构建SAdV-1感染性克隆，再依次删除E3区和E1区基因，并在E1区添加人EF1a启动子控制的外源基因表达框，制备了腺病毒质粒；构建携带SAdV-1 E1B55K基因的真核表达载体，转染293细胞，筛选稳定表达SAdV-1 E1B55K细胞株，作为重组SAdV-1的包装细胞；限制性酶切线性化腺病毒质粒，转染包装细胞，能够成功拯救重组病毒。
该载体系统具有以下特点：
1.腺病毒质粒构建基于单个质粒，制备简便快捷。含有目的基因的PCR产物通过Gibson组装或酶切-连接克隆直接得到腺病毒质粒。
常用的细菌细胞内同源重组法制备腺病毒质粒需要使用骨架质粒和穿梭质粒2个质粒。目的基因先通过酶切-连接克隆到穿梭质粒；线性化的穿梭质粒与骨架质粒共同电转化重组酶阳性的细菌菌株，筛选重组产生的腺病毒质粒；腺病毒质粒再转化重组酶阴性的细菌菌株，大量制备腺病毒质粒。整个过程需要经过三次细菌转化。本系统仅需要一次细菌化学转化实验，不需要电转化操作，即可得到目的腺病毒质粒，节省劳动力和时间，成功率高；由于不使用重组酶阳性的细菌菌株，质粒发生意外变异的可能性更小。
2. 该系统既可以用于更换目的基因编码区（codingsequence，CDS），也可以用于更换整个外源基因表达框（包括CDS和启动子、polyA加尾信号等调控序列）。
3. SAdV-1含有2个fiber基因，其进入细胞的受体未知，实验结果表明其既可以感染贴壁细胞也可以高效感染悬浮生长细胞。
4. 人类没有针对SAdV-1的预存中和抗体，该载体在人类基因治疗或载体疫苗中的应用具有优势。
发明内容
为了满足本领域的需求，本发明的目的是提供一种重组猴腺病毒SAdV-1载体系统。
本发明人由野生型猴1型腺病毒（SAdV-1）的基因组DNA出发，构建了E1/E3区缺失、在原E1区插入目的基因的复制缺陷型SAdV-1载体系统。
在第一方面，本发明提供一种重组腺病毒SAdV-1载体系统，所述载体系统包括1个起始腺病毒质粒和1株包装细胞系。本发明人将起始腺病毒质粒命名为pKSAV1-EG，所述包装细胞系命名为293SE13（保藏号CGMCC No.21500）。在一个优选的实施方案中，所述猴1型腺病毒（SAdV-1）载体系统由起始腺病毒质粒pKSAV1-EG和包装细胞系293SE13组成。
其中，起始腺病毒质粒pKSAV1-EG由本发明人设计并构建得到（见实施例1、实施例2和实施例3；图1和图2），其含有pBR322质粒的复制起点（Ori）、卡那霉素的抗性基因（Kan）、人EF1a启动子（EF1ap）、绿色荧光蛋白报告基因的编码区GFP、BGH polyA加尾信号和E1/E3缺失的SAdV-1基因组。本发明人通过将经PCR获得的Kan-Ori片段与野生型SAdV-1基因组序列（Genbank accession number: AY771780）进行DNA组装（DNA assembly）得到感染性克隆质粒pKSAV1，再依次删除E3区、E1区，并在原E1区位置添加EF1ap控制的GFP表达框，得到pKSAV1-EG质粒。
包装细胞株293SE13由本发明人设计构建真核表达质粒转染293细胞、筛选后得到（见实施例4和图3）。克隆SAdV-1的E1B55K基因CDS（SAV1E1B55K），插入携带有HAdV-41的三联体前导序列（tripartiteleadersequence, TPL）的pcDNA3质粒，得到pcDNA3T-SAV1E1B55K质粒（pcDNA3质粒多克隆位点HindIII/XhoI之间是外源序列TPL-SAV1E1B55K，SEQ ID NO：1），转染293细胞，筛选得到稳定表达SAdV-1 E1B55K基因的包装细胞株293SE13。表达SAdV-1的E1B55K基因的293SE13细胞株已于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，其保藏号为：CGMCC No.21500。
将SwaI酶切线性化的腺病毒质粒（pKSAV1-EG）转染包装细胞293S13，能够拯救继而扩增重组病毒SAdV1-EG（见实施例5和图4）。电镜观察和限制性酶切分析证实重组病毒成功构建（见实施例5和图5）。
利用扩增纯化的SAdV1-EG病毒定量感染293SE13细胞，绘制一步生长曲线，定量比较了293SE13与母本细胞293的重组病毒包装能力（见实施例6和图6）。低剂量病毒感染293SE13细胞时，病毒产量随培养时间延长而增加；感染293细胞2天后，能够检测到子代病毒，但延长培养时间并不能明显增加病毒产量；培养8天，293SE13的病毒产量较293细胞高200倍。高剂量病毒感染后293SE13细胞的病毒产量较293细胞高10倍，说明293SE13细胞是SAdV-1理想的包装细胞。
在第二方面，本发明提供利用第一方面的重组猴腺病毒SAdV-1载体系统制备携带外源靶基因的重组SAdV-1腺病毒的方法。
在一个实施方案中，本发明人利用mCherry作为外源目的基因，验证了由本发明第一方面的重组猴腺病毒SAdV-1载体系统能够用于构建具有生物学活性的重组病毒。具体而言，设计引物，通过PCR扩增mCherry基因CDS，所得产物两端随引物引入一段约20bp的重叠区；用限制性内切酶SpeI酶切起始腺病毒质粒pKSAV1-EG，去除原有目的基因GFP；剩余的起始腺病毒质粒片段与PCR产物进行Gibson组装，得到新的腺病毒质粒pKSAV1EF1ap-Cherry；将pKSAV1EF1ap-Cherry用SwaI酶切线性化，转染293SE13细胞，拯救获得重组病毒SAdV1EF1ap-Cherry。重组病毒感染293SE13细胞，能够观察到细胞表达mCherry而产生的红色荧光，病毒的复制能够引发细胞病变效应（cytopathiceffect，CPE；见实施例7、图7和图8）。这意味着，利用本发明第一方面的重组猴腺病毒SAdV-1载体系统能够制备得到具有感染活性的重组腺病毒。
在另一个实施方案中，本发明人更换了起始腺病毒质粒pKSAV1-EG的外源基因表达框，制备了活性重组病毒。具体而言，设计引物，通过PCR扩增mCherry表达框，所得产物两端随引物引入一段约20bp的重叠区，该表达框含有CMV启动子（CMVp）、mCherry CDS和SV40polyA加尾信号；再经过前述类似步骤，利用pKSAV1-EG质粒的外源基因表达框两侧的FseI位点，更换原有EF1ap-GFP-BGHpA的表达框，得到腺病毒质粒pKSAV1CMVp-Cherry；线性化后转染293SE13包装细胞，能够拯救和制备新的具有感染活性的重组病毒SAdV1CMVp-Cherry（见实施例7、图7和图8）。
由于限制性酶切-连接克隆（restriction-ligationcloning）是常用可靠的外源基因克隆方法，本载体系统也可以利用该方法在起始腺病毒质粒pKSAV1-EG的SpeI或FseI位点插入外源序列，构建新的腺病毒质粒，制备重组病毒。
换言之，可以利用PCR扩增得到两端含有重叠区的目的基因片段，通过DNA组装将外源基因带入腺病毒质粒pKSAV1-EG；或者采取常用的限制性酶切-连接克隆将外源基因克隆到腺病毒质粒，构建携带新的外源基因的腺病毒质粒；SwaI线性化，去除质粒骨架Kan-Ori，释放重组病毒基因组DNA，转染包装细胞293SE13，拯救重组病毒；拯救的病毒又可以利用293SE13包装细胞进一步扩增。上述为利用本发明第一方面的重组猴腺病毒SAdV-1载体系统拯救表达外源目的基因的重组SAdV-1腺病毒的通用方法步骤。
在制备的重组腺病毒中，SAdV-1基因组的E1/E3区缺失，原E1区由含外源目的基因的表达框替代，腺病毒基因组其他部分保留。由于SAdV-1腺病毒在体外培养细胞中扩增时，E1区域是必需的，故该重组病毒在含有HAdV-5 E1区和SAdV-1 E1B55K基因的293E13包装细胞能够复制增殖，在其他不含有腺病毒E1区基因的细胞不能复制，是复制缺陷型病毒载体。
在第三方面，本发明提供利用第一方面的重组猴腺病毒SAdV-1载体系统制备的携带外源目的基因的重组腺病毒。其中所述外源目的基因可以是欲提高表达量的目的蛋白基因，例如，但不限于，抑癌基因或病毒结构蛋白基因等。
在第四方面，本发明提供利用第一方面的重组猴腺病毒SAdV-1载体系统或由该载体系统制备的携带外源目的基因的重组腺病毒在制备基因治疗试剂盒或重组疫苗中的应用。基于本发明第一方面的重组猴腺病毒SAdV-1载体系统，结合本领域中相关的技术手段，本领域技术人员能够预计到本发明产生的携带外源目的基因的重组FAdV-4病毒在重组疫苗研究或基因治疗试剂盒中具有广阔的应用前景。
在一个实施方案中，发明人比较了SAdV1-EG与常用的HAdV-5重组病毒对各种细胞感染效率的不同（见实施例8和图9）。SAdV1-EG能够比较高效地感染贴壁细胞，虽然基因转移效率低于HAdV-5；对于悬浮培养细胞，SAdV-1的感染效率则明显优于HAdV-5。结果说明SAdV-1的细胞靶向与HAdV-5有互补性，在基因治疗或载体疫苗领域具有应用优势。
相应地，本发明提供一种重组疫苗，其包含有效量的携带外源目的基因的重组猴腺病毒SAdV-1，其中所述携带外源目的基因的重组猴腺病毒SAdV-1载体利用本发明第一方面的重组猴腺病毒SAdV-1载体系统制备得到。具体制备方法可以为：利用PCR或其他方法获得中和抗原基因，利用本发明的重组猴腺病毒SAdV-1载体系统将所述中和抗原基因克隆到起始腺病毒质粒，并拯救、扩增所需要的重组病毒。
在另一个实施方案中，发明人检测了60位健康成人血清中HAdV-5或SAdV-1中和抗体滴度情况（见实施例9和图10）。HAdV-5中和抗体阳性率为75%；而98%的人SAdV-1抗体阴性，仅有1例SAdV-1抗体弱阳性。说明人群的SAdV-1中和抗体普遍阴性，SAdV-1具有作为疫苗载体的优势。
本发明还可以提供一种基因治疗试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一方面的重组猴腺病毒SAdV-1载体系统。取决于选择的外源目的基因，所得的基因治疗试剂盒可用于治疗人类或其他哺乳动物中与所述外源目的基因相关的疾病。例如，将抑癌基因p53克隆到腺病毒质粒，利用所述重组猴腺病毒SAdV-1载体系统制备所需要的重组病毒，可以用于治疗人类相关恶性肿瘤。
在第五方面，本发明提供一种预防或治疗疾病的方法，所述方法应用本发明的疫苗或基因治疗试剂盒进行。换言之，所述方法可以利用本发明的重组猴腺病毒SAdV-1载体系统进行。所述疾病可以是与利用本发明的重组猴腺病毒SAdV-1载体系统引入的外源目的基因相关的疾病，例如禽流感等，还可以是恶性肿瘤。适用的受试者是人类或其他哺乳动物。
由此可见，本发明提供的重组猴腺病毒SAdV-1载体系统能够拯救具有感染活性的重组腺病毒。该重组猴腺病毒SAdV-1载体系统可以作为良好的重组疫苗的工具，所得到的携带外源目的基因的重组腺病毒可以用于制备具有相应的预防功能的重组疫苗。由于人群缺乏针对SAdV-1的中和抗体，与已有腺病毒载体相比SAdV-1具有不同的细胞靶向性，本发明的重组猴腺病毒SAdV-1载体系统具有现有技术中其他腺病毒载体系统所不具备的优点。
综上所述，本发明提供下述技术方案：
1. 一种重组猴腺病毒SAdV-1载体系统，其包括一个起始腺病毒质粒和一株包装细胞系；其中所述腺病毒质粒命名为pKSAV1-EG，其含有质粒骨架、外源基因表达框和E1/E3缺失的SAdV-1基因组，质粒骨架包括pBR322质粒的复制起点（Ori）、卡那霉素的抗性基因（Kan），质粒骨架与E1/E3缺失的SAdV-1基因组连接处各含有一个SwaI酶切位点，外源基因表达框由人EF1a启动子（EF1ap）、绿色荧光蛋白报告基因的编码区（GFP）、BGH polyA加尾信号组成，外源基因表达框通过位于末端的FseI限制性酶切位点插入到SAdV-1基因组原E1区位置，GFP编码框两侧各含有一个SpeI酶切位点；其中所述的包装细胞株命名为293SE13，其是由pcDNA3T-SAV1E1B55K质粒转染293细胞、筛选后稳定表达SAdV-1 E1B55K基因的细胞株，pcDNA3T-SAV1E1B55K质粒是在多克隆位点处插入有HAdV-41的三联体前导序列和SAdV-1 E1B55K基因编码区的pcDNA3质粒。
2. 第1项中所述的重组猴腺病毒SAdV-1载体系统在制备基因治疗试剂盒或重组疫苗中的应用。
3. 一种基因治疗试剂盒，其包含第1项中所述的重组猴腺病毒SAdV-1载体系统。
4. 一种重组疫苗，其包含有效量的携带外源目的基因的重组猴腺病毒SAdV-1载体，其中所述携带外源目的基因的重组猴腺病毒SAdV-1利用第1项中所述的重组猴腺病毒SAdV-1载体系统制备得到。
附图说明
图1是在猴1型腺病毒感染性克隆质粒pKSAV1中删除E3区示意图。pKSAV1质粒含有完整的SAdV-1基因组DNA，使用AscI酶切pKSAV1，电泳并回收含有E3区的片段（pKSAV1-AscI-FS），与117bp的linker-AscI链接区进行DNA组装（Gibson assembly）反应，得到中间质粒pKSAV1-AscI；PCR扩增获得pKSAV1-AscI质粒PacI位点至E3区的片段、以及E3区至PmeI位点的片段，2条PCR产物与PacI/PmeI双酶切pKSAV1-AscI去除E3区后的片段进行DNA组装得到E3区删除的中间质粒pKSAV1DE3-AscI；PacI酶切线性化pKSAV1DE3-AscI，与AscI酶切pKSAV1电泳后回收的长片段（pKSAV1-AscI-FL）进行DNA组装得到质粒pKSAV1DE3。pKSAV1DE3含有缺失E3的SAdV-1基因组DNA。图中 ITR：反向末端重复（the invertedterminal repeat）；Kan：卡那霉素抗性开放阅读框（kanamycin resistance ORF）；Ori：pBR322复制起点（pBR322 origin of replication）。
图2是起始腺病毒质粒pKSAV1-EG构建示意图。使用SalI酶切pKSAV1DE3质粒，分别回收大、小2个片段（pKSAV1DE3-FL和pKSAV1DE3-FS）；PCR获得邻近SalI位点之间的片段，合成链接序列linker-SalI，与pKSAV1DE3-FS进行DNA组装得到中间质粒pKSAV1ME1-SalI；PCR扩增获得AscI位点至E1区之间的片段AscI-E1A、报告基因GFP表达框EF1ap-GFP-pA片段和E1B基因至EcoRV位点之间的片段E1B-EcoRV，与AscI/EcoRV双酶切pKSAV1ME1-SalI去除E1区的片段进行DNA组装，得到E1区替换的中间质粒pKSAV1EG-SalI；PacI线性化pKSAV1EG-SalI后，与pKSAV1DE3-FL进行DNA组装得到pKSAV1-EG质粒。pKSAV1-EG质粒含有E1/E3删除的SAdV-1基因组，在原E1区位置插入有GFP表达框。图中 ITR：反向末端重复；Kan：卡那霉素抗性开放阅读框；Ori：pBR322复制起点；EF1ap：人EF1a启动子；pA：牛生长激素多聚A加尾信号（BGH polyA signal）。
图3是包装细胞系构建与鉴定示意图。（A）SAdV-1 E1B55K基因的PCR产物通过DNA组装克隆到pcDNA3TF41-11p质粒的KpnI/XhoI位点，得到pcDNA3T-SAV1E1B55K质粒；该质粒相当于在pcDNA3质粒多克隆位点的HindIII/XhoI之间插入HAdV-41的三联体前导序列（TPL）和SAdV-1 E1B55K CDS。（B）pcDNA3T-SAV1E1B55K质粒转染293细胞，筛选得到一株病毒包装效率高的细胞株293SE13；设计扩增TPL和SAdV-1 E1B55K特性引物，以细胞基因组为模板能够扩增得到预计长度的PCR产物，测序结果表明是SAdV-1 E1B55K基因，说明293SE13稳定整合有SAdV-1 E1B55K基因。图中Amp：氨苄青霉素抗性开放阅读框；CMVp：CMV启动子；Ori：pBR322复制起点；pA：多聚A加尾信号；SV40p：SV40启动子；TPL41: HAdV-41的三联体前导序列。
图4显示由起始腺病毒质粒在包装细胞拯救重组病毒。（A）SwaI酶切线性化pKSAV1-EG质粒，转染293SE13细胞，转染7天后，荧光显微镜下可见由GFP+细胞形成的噬斑。（B）将转染所得种子病毒感染293SE13细胞，感染后1天可见细胞表达GFP，感染后2天病毒复制引发细胞病变效应（cytopathiceffect，CPE）。说明SAdV1-EG病毒成功拯救。
图5显示对重组病毒的电镜和限制性酶切鉴定。（A）纯化的重组病毒颗粒在透射电子显微镜下可见典型的腺病毒形态：正二十面体结构，直径约80nm。（B）提取重组病毒SAdV1-EG基因组DNA，使用限制性内切酶酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，以腺病毒质粒pKSAV1-EG为对照，观察酶切结果。M: Lambda/HindIII DNA分子量标记。对于SAdV1-EG病毒基因组，酶切预计片段分子量分别为：AgeI/1440, 3324, 3500, 5017, 6937, 10849 bp；AvrII/2986, 3906, 5883, 6269, 12023 bp；EcoRV/564, 1138, 1639, 1732, 2423,5245, 8130, 10196 bp。对于pKSAV1-EG质粒，酶切预计片段分子量分别为：AgeI/1440,3500, 6937, 10842, 10849 bp；AvrII/5883, 6269, 9393, 12023 bp；EcoRV/ 564,1639, 1732, 5245, 6062, 8130, 10196 bp。电泳图显示酶切片段的实际分子量大小与预计的一致，说明拯救的病毒是SAdV1-EG。
图6 显示重组病毒SAdV1-EG在293SE13细胞的复制情况。（A）低剂量种子病毒（1病毒颗粒每细胞，1vp/cell）接种293SE13或293细胞（12孔板培养），培养1-8天后检测子代病毒产量。（B）高剂量种子病毒（200 vp/cell）接种293SE13或293细胞（12孔板培养），培养1-4天后检测子代病毒产量。IU：感染单位（infectiousunit），是病毒生物学活性的单位。
图7显示pKSAV1-EG起始腺病毒质粒目的基因更换部位的关键序列信息。（A）显示pKSAV1-EG质粒FseI位点（更换外源基因表达框）或SpeI位点（更换目的基因编码区）周围核苷酸序列。可以参考这些序列设计引物PCR扩增外源基因表达框或目的基因编码区，再经过限制性酶切-DNA组装途径更换目的基因表达框或编码区。（B）显示mCherry编码区PCR产物，重点显示引物设计细节，上下游引物的5’端是Gibson组装所需的重叠区（overlap），3’端是基因特异性序列。（C）显示mCherry表达框（含有CMV启动子和SV40 polyA信号）PCR产物，重点显示引物设计细节，上下游引物的5’端是Gibson组装所需的重叠区（overlap），3’端是基因特异性序列。
图8 显示更换目的基因后新的重组病毒的拯救和扩增。将GFP编码区更换为mCherry的腺病毒质粒命名为pKSAV1EF1ap-Cherry，对应的重组病毒命名为SAdV1EF1ap-Cherry；将EF1ap-GFP表达框更换为CMVp-mCherry的腺病毒质粒命名为pKSAV1CMVp-Cherry，对应的重组病毒命名为SAdV1CMVp-Cherry。（A）SwaI酶切线性化pKSAV1EF1ap-Cherry质粒转染293SE13细胞3天后荧光显微镜观察到mCherry+细胞形成荧光灶；（B、C）质粒转染拯救所得子代病毒SAdV1EF1ap-Cherry感染293SE13细胞，细胞发生完全细胞病变效应（CPE）；（D）SwaI酶切线性化pKSAV1CMVp-Cherry质粒转染293SE13细胞3天后荧光显微镜观察到mCherry+细胞形成荧光灶；（E、F）质粒转染拯救所得子代病毒SAdV1CMVp-Cherry感染293SE13细胞，荧光灶扩大形成噬斑。
图9显示重组病毒SAdV1-EG对各类细胞系的基因转导效率情况。以不同的感染强度感染贴壁细胞（293和HEp-2）或悬浮细胞（K562和HL-60），继续培养2天后，利用流式细胞术测定感染细胞中GFP表达阳性细胞的比例。以E1/E3缺失的人5型腺病毒（HAdV-5）为对照，其中HAdV5-GFP携带CMV启动子控制的GFP基因表达框，而HAdV5-EG携带人EF1a启动子控制的GFP基因表达框。
图10显示人群SAdV-1血清抗体调查情况。使用通用的中和抗体定量方法测定了60名大学生的血清抗体中和活力[12]，将能够抑制50%病毒活性的最高抗体稀释度定义为中和抗体的滴度值，低于20的抗体滴度定义为中和抗体阴性（0）。以常用的腺病毒载体HAdV-5为对照，结果显示人群HAdV-5抗体阳性率75%；SAdV-1抗体仅有1份弱阳性，该例HAdV-5滴度大于1280。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
本发明实施例中所用的质粒pKFAV4GFP、pKFAV4-CX19A和pcDNA3TF41-11p的构建过程已经公开发表[13, 14]。pKFAV4GFP质粒含有质粒骨架（Kan-Ori，包括卡那霉素抗性基因和pBR322复制起点）以及GFP编码区（codingsequence，CDS）；pKFAV4-CX19A质粒含有CMV启动子、SV40 polyA信号控制的mCherry表达框；pcDNA3TF41-11p在pcDNA3质粒的多克隆位点处插入有HAdV-41的三联体前导序列（TPL41）；pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒含有人EF1a启动子，购自System Biosciences (SBI)公司。这些质粒元件在实施例中用到，它们多是常见的质粒克隆元件，可有多种来源，TPL41可以直接合成。
试剂：PCR耐热DNA聚合酶（Q5高保真DNA聚合酶）和DNA组装试剂（NEBuilder HiFiDNA Assembly Master Mix, Cat. E2621）购自美国NEB公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（Cat. D4045）和DNA片段纯化和浓缩试剂盒（Cat. D4010）购自ZYMO RESEARCH公司；各种限制性内切酶购自NEB或TaKaRa Bio公司；大肠杆菌TOP10感受态细胞购自天根生化科技有限公司；PCR引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成；人类细胞系293（Cat. CRL-1573）、HEp-2（Cat. CCL-23）、K562（CCL-243）、HL-60（CCL-240），猴1型腺病毒（SAdV-1，Cat.VR-195）购自美国模式培养物保藏库（American type culture collection，ATCC）。
实施例1、将SAdV-1基因组克隆到质粒
野生型SAdV-1基因组序列已知（Genbank accession number: AY771780）。SAdV-1在293细胞扩增，使用Hirt法提取SAdV-1基因组DNA[15]。在标准的聚合酶链反应（PCR）条件下，以pKFAV4GFP质粒为模板，以2001KSAV1p2：tgatgatgat ttaaatccaa gtcgacgatcccgagcggta tcagctc，2001KSAV1p3：tgatgattta aatggttggc gcgcctggaa caacactcaaccctatcg为引物扩增得到2514 bp片段；再以该片段为模板，以2001KSAV1p1：gtttccagaataaggtatat tattgatgat gatttaaatc caagtcgac，2001KSAV1p4：gtttccagaa taaggtatattattgatgat gatttaaatg gttggcgcgc c为引物扩增得到2563 bp片段Kan-Ori。该片段两端31 bp与SAdV-1基因组的ITR的末端序列相同。将电泳回收的Kan-Ori片段与野生型FAdV-4基因组DNA混合，再加入等体积DNA组装试剂（Gibson组装），50度反应1 h。取反应产物直接转化E. coliTOP10感受态细胞，涂布含卡那霉素的LB琼脂糖平板，阳性菌落使用LB液体培养基扩大培养，提取质粒pKSAV1，酶切鉴定后保存。
实施例2、E3区删除的腺病毒质粒pKSAV1DE3的构建
图1显示了腺病毒质粒pKSAV1DE3的构建过程。采用自pKSAV1先分离出一个含有E3区的中间质粒、在中间质粒删除E3区、再将改造后中间质粒恢复到pKSAV1的策略。利用2对引物（2001KSAV1p5：gatagggttg agtgttgttc caggcgcgcc aaccatttaa atcatcat，2001KSAV1p6：gcgcgccaac catttaaatc atcatcaata atatacctta attaagac，2001KSAV1p7：cgccgctggc ggcagaggag tttgtcttaa ttaaggtata ttattgat，2001KSAV1p8：cgctgaaaccggaccacagg gcgcgccgct ggcggcagag gagtttgt）进行重叠延伸PCR合成长117bp连接区linker-AscI；AscI酶切pKSAV1质粒，电泳后分别回收小片段pKSAV1-AscI-FS（13290bp）和大片段pKSAV1-AscI-FL（23661bp）；小片段与linker-AscI混合，DNA组装得到中间质粒pKSAV1-AscI。再以pKSAV1-AscI为模板，以2001KSAV1p9：cgcgccaacc atttaaatcatcatcaataa tatacctt和2001KSAV1p10：ccttaaaaat atccctgcag gatgtaatcc gggcgtggggcag为引物，PCR扩增2680bp片段PacI-E3；以pKSAV1-AscI为模板，以2001KSAV1p17：ggattacatc ctgcagggat atttttaagg tgtaaatcaa taataaactt acc和2001KSAV1p18：cattttgcgt agtaatggga tctctgtagt ttaagcttaa cactccaagt gg为引物，PCR扩增1522bp片段E3-Fiber；使用PacI/PmeI双酶切pKSAV1-AscI（6378，6980 bp），电泳回收6980 bp片段；与上述2个片段混合，DNA组装得到E3删除的中间质粒pKSAV1DE3-AscI。PacI酶切线性化pKSAV1DE3-AscI，与回收的大片段pKSAV1-AscI-FL（23661bp）混合后，进行DNA组装得到E3区删除的腺病毒质粒pKSAV1DE3（34668bp）。
实施例3、E1/E3区删除腺病毒质粒pKSAV1-EG的构建
图2显示了腺病毒质粒pKSAV1-EG的构建过程。SalI酶切pKSAV1DE3质粒（441，11188，23039 bp），电泳分别回收较小片段pKSAV1DE3-SalI-FS（11188 bp）和较大片段pKSAV1DE3-SalI-FL（23039 bp）。再以pKSAV1为模板，以2001KSAV1p19：gacgctccatggcctcgtag aagtccacgg cgaagttgaa aaattg和2001KSAV1p20：aatcatcatc aataatataccttattaatt aacgctttcc tagagaagtt ctcggatc为引物，扩增SalI-SalI片段（529 bp）；两条引物2001KSAV1p21：gcgttaatta ataaggtata ttattgatga tgatttaaat ccaagtcgac和2001KSAV1p22：gtgagctgat accgctcggg atcgtcgact tggatttaaa tcatcatcaa自身退火延伸得到linker-SalI片段（73bp）；这2个片段与pKSAV1DE3-SalI-FS混合后进行DNA组装，得到中间质粒pKSAV1ME1-SalI（11704 bp）。AscI/EcoRV双酶切，电泳后回收8163 bp片段；以pKSAV1为模板，以2001KSAV1p23：cgcgataggg ttgagtgttg ttccagg和2001KSAV1p24：gagcggccgg cccgcggcag cgcggaggag aaaac为引物，PCR扩增片段AscI-E1A（530 bp）；以pKSAV1为模板，以2001KSAV1p31：ggtggccggc cgaggttgta tcctgtaacc ctgaacgt和2001KSAV1p32：tctgaagcgg tatcggggtt agcttgggat为引物，PCR扩增片段E1B-EcoRV（579bp）；以质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP为模板，以2001KSAV1p25：cgctgccgcg ggccggccgctccggtgccc gtcagtggg和2001KSAV1p26：catggtggc actagtgtag gcgccggtca c为引物，扩增EF1a启动子片段（566 bp），以pKFAV4GFP为模板，以2003SAV1EGFPf：gtgaccggcgcctacactag tgccaccatg gtgagcaagg g和2003SAV2EGFPr：ggtcaaggaa ggcacgggggagactagttt agagtccgga cttgtacagc tc为引物，扩增GFP编码区794 bp，以pcDNA3TF41-11p质粒为模板，以2001KSAV1p29：gactctaaac tagtctcccc cgtgccttcc ttgacc和2001KSAV1p30：ggatacaacc tcggccggcc accccacccc ccagaataga atg为引物，扩增BGHpolyA片段（151 bp），上述EF1a启动子、GFP编码区和BGH polyA信号片段混合，通过重叠延伸PCR合并为GFP表达框片段EF1ap-GFP-pA（1434 bp）；将8163 bp片段、AscI-E1A（530 bp）、EF1ap-GFP-pA（1434 bp）和E1B-EcoRV（579 bp）混合，进行DNA组装，得到E1区删除并添加GFP表达框的中间质粒pKSAV1EG-SalI（10604 bp）。PacI酶切线性化pKSAV1EG-SalI，与pKSAV1DE3-SalI-FL（23039 bp）混合后，进行DNA组装，得到腺病毒质粒pKSAV1-EG（33568bp）。
实施例4、包装细胞系293SE13的建立
E1/E3删除的重组SAdV-1病毒难以在常用的腺病毒包装细胞293中进行拯救和扩增，需要建立新的重组病毒包装细胞系。以SAdV-1基因组DNA为模板，以2007SAV1E1Bf：gctgccttta ttacctatat tttgg和2007SAV1E1Br：cctcatgccc ctttataccc tt为引物，PCR扩增1489bp片段；以该片段为模板，以2007TSAV1E1Bf：tcgagccaat cacagtcgcaagatggagca acagcgacag cc和2007TSAV1E1Br：agggccctct agatgcatgc tcgagtcactcctcatcgct ggattcat为引物，PCR扩增1466 bp片段，该片段含有SAdV-1 E1B55K基因编码区。KpnI/XhoI双酶切pcDNA3TF41-11p质粒，电泳回收质粒骨架（5569 bp），该片段与PCR产物混合后，进行DNA组装，得到质粒pcDNA3T-SAV1E1B55K（6992 bp，图3A）。该质粒相当于在pcDNA3质粒的多克隆位点HindIII/XhoI之间添加HAdV-41病毒的三联体前导序列和SAdV-1E1B55K编码区（SEQ ID NO：1）。该质粒转染293细胞，使用G418筛选后，挑取细胞集落并培养扩增，使用SwaI线性化pKSAV1-EG质粒转染克隆化细胞，筛选到一株病毒拯救和包装效率高的细胞株，命名为293SE13。293SE13在体外连续传代15次后，提取基因组DNA作为模板，设计引物，2101SAV1E1Bs1：gatagcggtt tgactcacgg、2101SAV1E1Bs2：gttctcctcc accactcggt，2101SAV1E1Bs3：tggagcaaca gcgacagcc、2101SAV1E1Bs4：accgccttcc agcaaccat，进行PCR扩增，产物分别长594, 811 bp；以293细胞基因组DNA为模板，进行对照实验。293SE13 DNA为模板能够扩增得到预计分子量的PCR产物，而293 DNA为模板时，无扩增（图3B）。扩增产物测序后证明为pcDNA3T-SAV1E1B55K质粒中CMV启动子-E1B55K编码区序列，说明SAdV-1E1B55K表达框已经稳定整合于293SE13细胞的基因组。
实施例5、包装细胞系293SE13用于重组病毒的拯救和扩增
SwaI酶切pKSAV1-EG质粒，回收的线性化DNA转染293SE13细胞，培养7天后，荧光显微镜下可见由GFP+细胞形成的噬斑，说明重组病毒SAdV1-EG成功拯救（图4A）。拯救的种子病毒在293SE13细胞继续扩增（图4B）。使用传统的CsCl超速离心方法进行纯化，纯化的重组病毒颗粒负染后在透射电子显微镜下观察，可见典型的腺病毒形态，为正二十面体结构，直径约80nm（图5A）。Hirt法提取重组病毒的基因组DNA，使用多种限制性内切酶酶切后电泳，以腺病毒质粒pKSAV1-EG作为对照，电泳条带与预计的情况完全相同，说明获得的重组病毒即为SAdV1-EG病毒（图5B）。实验结果显示293SE13能够用于E1/E3缺失的重组SAdV1病毒的拯救和扩增。
实施例6、一步生长曲线评价293SE13细胞的重组病毒包装能力
绘制SAdV1-EG病毒的一步生长曲线来定量评价293SE13细胞的病毒包装能力（图6）。当使用较低的感染强度（感染复数为1病毒颗粒每细胞，MOI=1 vp/cell）感染293SE13细胞2小时后，子代病毒产量持续升高，在第8天12孔培养板中1个孔的细胞产生的子代病毒量达到7.0 × 106 IU（感染单位，infectiousunit）；对照细胞293在感染后2天的病毒产量为2.4 × 104 IU，随培养时间延长，病毒产量基本没有变化。当使用MOI=200 vp/cell的感染强度时，超过90%的细胞被同步感染，293SE13的病毒产量在感染后2天达到峰值3.4 × 107IU，继续培养后产量略有下降；在293细胞的曲线变化趋势类似，但病毒产量较293SE13低一个数量级。这说明293SE13细胞的病毒包装能力远高于其母细胞293，在病毒扩增的早期（感染强度较低）二者的差距更大。
实施例7、利用建立的SAdV-1载体系统构建新的重组病毒
举例介绍利用建立的SAdV-1载体系统构建新的重组SAdV-1病毒，包括更换靶基因的CDS，或更换靶基因的表达框（包括CDS以及启动子和polyA信号等控制序列）。图7A显示了pKSAV1-EG质粒外源基因表达区域核苷酸序列的详细情况，两个SpeI位点之间的序列是GFP基因的CDS，可以更换为其他目的基因的CDS，将得到由人EF1a启动子、BGH polyA信号控制表达的E1/E3缺失的重组SAdV-1重组病毒；两个FseI位点之间的序列是GFP基因的表达框（包括了人EF1a启动子，GFP CDS和BGH polyA信号），可以更换为其他目的基因的表达框，即可以同步更换靶基因CDS和其调控序列（包括启动子等），得到新的E1/E3缺失的重组SAdV-1重组病毒。更换方法有2种，一种是常规的限制性酶切-连接克隆，是常用方法，这里不再介绍；另一种是限制性酶切-DNA组装方法。可以选用PCR扩增靶序列，通过在PCR引物的5’端引入Gibson组装所需的重叠区（overlap），使得PCR产物的末端带有一段长15-40 bp的重叠区，限制性内切酶SpeI或FseI酶切pKSAV1-EG质粒，去除原有的靶序列，添加PCR产物，进行DNA组装，就可以将新的外源靶序列引入腺病毒质粒。图B显示了将GFP CDS更换为mCherryCDS时，PCR产物末端的细节；以pKFAV4-CX19A质粒为模板（含有CMV启动子、SV40 polyA信号控制的mCherry表达框），以2101CherryF:gatccaagct gtgaccggcg cctacactagtgccaccatg gtgagcaagg gcgaggag和2101CherryR:cagggtcaag gaaggcacgg gggagactagtctacttgta cagctcgtcc atgccg为引物，PCR扩增mCherry CDS（779bp）；SpeI酶切pKSAV1-EG（741, 32827 bp），电泳后回收32827 bp片段与PCR产物进行DNA组装，得到新的腺病毒质粒pKSAV1EFap-Cherry（33550 bp）。图C显示了将GFP表达框更换为由CMV启动子、SV40polyA信号控制的mCherry表达框时，PCR产物末端的细节；以pKFAV4CX19A质粒为模板，以2101CMV-CheF：ttctcctccg cgctgccgcg ggccggccgt tacataactt acggtaaatg gccc和2101CMV-CheR：cagggttaca ggatacaacc tcggccggcc taagatacat tgatgagttt ggacaaac为引物，PCR扩增mCherry表达框（1604 bp）；FseI酶切pKSAV1-EG（1404, 32164 bp），电泳后回收32164 bp片段与PCR产物进行DNA组装，得到新的腺病毒质粒pKSAV1CMVp-Cherry（33718 bp）。
SwaI酶切pKSAV1EFap-Cherry或pKSAV1CMVp-Cherry，回收线性化DNA，转染293SE13细胞，转染后3d在荧光显微镜下即可见mCherry阳性细胞形成的荧光灶（图8AD），收集细胞及培养上清，冻融3次，离心去除细胞碎片，上清感染293SE13细胞，感染后6天，mCherry阳性细胞发生细胞病变效应（cytopathiceffect，CPE；图8BC）或形成噬斑（图8EF），说明病毒成功拯救并可在293SE13细胞扩增。
实施例8、重组SAdV-1病毒的基因转导特性
SAdV-1病毒含有2个fiber基因，其细胞受体未知，SAdV-1细胞感染特性有可能与已知的其他腺病毒不同。利用SAdV1-EG携带的GFP报告基因可以方便地观察重组病毒对各类细胞的感染情况。使用不同剂量的SAdV1-EG感染各类细胞系，培养2d后，使用流式细胞仪检测GFP+细胞的比例。以E1/E3缺失的HAdV-5病毒作为对照，其中HAdV5-GFP中GFP是由CMV启动子控制表达，而HAdV5-EG中GFP 由人EF1a启动子控制表达。可见SAdV1-EG对贴壁细胞293或HEp-2的感染能力稍低于对照病毒，但仍然有较高的基因转移效率，100 vp/cell时，95%以上293细胞被感染；500 vp/cell是70%以上HEp-2被感染。SAdV1-EG对悬浮细胞的感染效率则明显高于对照病毒，500 vp/cell时，98% K562细胞表达GFP，70%的HL-60细胞表达GFP；同样条件下，对照病毒HAdV5-EG的表达效率约为40%或10%（图9）。
实施例9、SAdV-1病毒血清中和抗体调查
检测了60名身体健康大学生血清中SAdV-1或HAdV-5的中和抗体情况。使用常用的中和抗体定量方法[12]，将能够抑制50%病毒活性的最高抗体稀释度定义为中和抗体的滴度值。结果显示75%的大学生（45名）HAdV-5血清抗体阳性（滴度值大于20），而仅有1名学生的SAdV-1血清抗体弱阳性（滴度值为80），该名学生的HAdV-5滴度值大于1280，推测HAdV-5抗血清对SAdV-1有微弱的交叉保护（图10）。SAdV-1不会在人间传播流行，结果证实了人群血清中基本不存在SAdV-1中和抗体。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
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序列表
<110> 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
<120> 猴1型腺病毒（SAdV-1）载体系统及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1634
<212> DNA
<213> 人工序列(synthesized sequence)
<220>
<221> misc_signal
<222> (7)..(209)
<223> HAdV-41 tripartite leader
<220>
<221> CDS
<222> (210)..(1628)
<223> SAdV-1 E1B55K
<400> 1
aagcttactt tcttccgcat cgctgtgggc aagagccagc tgttcggttc gcggttcagg 60
aggtactcct cgcggtcctt ccagtaatct tcggccggaa agccacgttc gtctgcacgg 120
cagagattgc caagcgttgt tgagcgagtc caattggacg ggatcagaaa acttttcaag 180
gaaagcatcg agccaatcac agtcgcaag atg gag caa cag cga cag cca cct 233
Met Glu Gln Gln Arg Gln Pro Pro
1 5
gtc gtg gga gta cat gct gga tta cat ggc gat ggc tct gtg gag ggc 281
Val Val Gly Val His Ala Gly Leu His Gly Asp Gly Ser Val Glu Gly
10 15 20
cat gct gcg gag gag ggt ttg cat tta ctt gcg ggc gca gcc tcc gcg 329
His Ala Ala Glu Glu Gly Leu His Leu Leu Ala Gly Ala Ala Ser Ala
25 30 35 40
gct gga ccg agt ggt gga gga gaa cga gcc gga gga gac cga gaa tct 377
Ala Gly Pro Ser Gly Gly Gly Glu Arg Ala Gly Gly Asp Arg Glu Ser
45 50 55
gag agc cgg cct gga ccc tcc agt gga aga cta ggt gct gag gat gat 425
Glu Ser Arg Pro Gly Pro Ser Ser Gly Arg Leu Gly Ala Glu Asp Asp
60 65 70
cct gaa gag ggg act agt ggg ggt gct agg aaa aag caa aaa act gag 473
Pro Glu Glu Gly Thr Ser Gly Gly Ala Arg Lys Lys Gln Lys Thr Glu
75 80 85
cct gaa cct aga aac ttt ttg aat gag ttg act gta agc cta atg aat 521
Pro Glu Pro Arg Asn Phe Leu Asn Glu Leu Thr Val Ser Leu Met Asn
90 95 100
cgg cag cgt cct gag acg gtg ttt tgg act gag ttg gag gat gag ttc 569
Arg Gln Arg Pro Glu Thr Val Phe Trp Thr Glu Leu Glu Asp Glu Phe
105 110 115 120
aag aag ggg gaa tta aac ctc ttg tac aag tat ggg ttt gag cag ttg 617
Lys Lys Gly Glu Leu Asn Leu Leu Tyr Lys Tyr Gly Phe Glu Gln Leu
125 130 135
aaa act cac tgg ttg gag ccg tgg gag gat atg gaa atg gct cta gac 665
Lys Thr His Trp Leu Glu Pro Trp Glu Asp Met Glu Met Ala Leu Asp
140 145 150
acc ttt gct aaa gtg gct ctg cgg ccg gat aaa gtt tac act att cgc 713
Thr Phe Ala Lys Val Ala Leu Arg Pro Asp Lys Val Tyr Thr Ile Arg
155 160 165
cgc act gtt aat ata aaa aag agt gtt tat gtt atc ggc cat gga gct 761
Arg Thr Val Asn Ile Lys Lys Ser Val Tyr Val Ile Gly His Gly Ala
170 175 180
ctg gtg cag gtg cag acc cca gac cgg gtg gct ttc aat tgc ggc atg 809
Leu Val Gln Val Gln Thr Pro Asp Arg Val Ala Phe Asn Cys Gly Met
185 190 195 200
cag agt ttg ggc ccc ggg gtg ata ggt ttg aat gga gtt aca ttt caa 857
Gln Ser Leu Gly Pro Gly Val Ile Gly Leu Asn Gly Val Thr Phe Gln
205 210 215
aat gtc agg ttt act ggt gat gat ttt aat ggc tct gtg ttt gtg act 905
Asn Val Arg Phe Thr Gly Asp Asp Phe Asn Gly Ser Val Phe Val Thr
220 225 230
agc acc cag cta acc ctc cac ggt gtt tac ttt ttt aac ttt aac aat 953
Ser Thr Gln Leu Thr Leu His Gly Val Tyr Phe Phe Asn Phe Asn Asn
235 240 245
aca tgt gtg gag tca tgg ggt agg gtg tct ctg agg ggc tgc agt ttt 1001
Thr Cys Val Glu Ser Trp Gly Arg Val Ser Leu Arg Gly Cys Ser Phe
250 255 260
cat ggt tgc tgg aag gcg gtg gtg gga aga att aaa agt gtc atg tct 1049
His Gly Cys Trp Lys Ala Val Val Gly Arg Ile Lys Ser Val Met Ser
265 270 275 280
gtg aag aaa tgc ata ttt gaa cgc tgt gtg ata gct cta gca gta gag 1097
Val Lys Lys Cys Ile Phe Glu Arg Cys Val Ile Ala Leu Ala Val Glu
285 290 295
ggg tac gga cgg atc agg aat aac gcc gca tct gag aat gga tgt ttt 1145
Gly Tyr Gly Arg Ile Arg Asn Asn Ala Ala Ser Glu Asn Gly Cys Phe
300 305 310
ctt ttg ctg aaa ggt acg gcc agc gtt aag cat aat atg att tgc ggc 1193
Leu Leu Leu Lys Gly Thr Ala Ser Val Lys His Asn Met Ile Cys Gly
315 320 325
agc ggc ctg tgc ccc tcg cag ctc tta act tgc gca gat gga aac tgt 1241
Ser Gly Leu Cys Pro Ser Gln Leu Leu Thr Cys Ala Asp Gly Asn Cys
330 335 340
cac acc ttg cgc acc gtg cac ata gtg tcc cac tcg cgc cgc acc tgg 1289
His Thr Leu Arg Thr Val His Ile Val Ser His Ser Arg Arg Thr Trp
345 350 355 360
cca aca ttt gag cac aat atg ctc atg cgt tgc gcc gtt cac cta ggt 1337
Pro Thr Phe Glu His Asn Met Leu Met Arg Cys Ala Val His Leu Gly
365 370 375
gct aga cgc ggc gtg ttt atg cct tat caa tgt aac ttt agt cat act 1385
Ala Arg Arg Gly Val Phe Met Pro Tyr Gln Cys Asn Phe Ser His Thr
380 385 390
aag att ttg ctg gaa act gat tcc ttc cct cga gta tgt ttc aat ggg 1433
Lys Ile Leu Leu Glu Thr Asp Ser Phe Pro Arg Val Cys Phe Asn Gly
395 400 405
gtg ttt gac atg tca atg gaa ctt ttt aaa gtg ata aga tat gat gaa 1481
Val Phe Asp Met Ser Met Glu Leu Phe Lys Val Ile Arg Tyr Asp Glu
410 415 420
acc aag tct cgt tgt cgc tca tgt gaa tgc gga gct aat cat ttg agg 1529
Thr Lys Ser Arg Cys Arg Ser Cys Glu Cys Gly Ala Asn His Leu Arg
425 430 435 440
ttg tat cct gta acc ctg aac gtt acc gag gag ctg agg acg gac cac 1577
Leu Tyr Pro Val Thr Leu Asn Val Thr Glu Glu Leu Arg Thr Asp His
445 450 455
cac atg ctg tct tgc ctg cgt acc gac tat gaa tcc agc gat gag gag 1625
His Met Leu Ser Cys Leu Arg Thr Asp Tyr Glu Ser Ser Asp Glu Glu
460 465 470
tga ctcgag 1634

Claims (4)

1.一种重组猴1型腺病毒SAdV-1载体系统，其包括一个起始腺病毒质粒和一株包装细胞系；其中所述腺病毒质粒命名为pKSAV1-EG，其含有质粒骨架、外源基因表达框和E1/E3缺失的SAdV-1基因组，质粒骨架包括pBR322质粒的复制起点Ori、卡那霉素的抗性基因Kan，质粒骨架与E1/E3缺失的SAdV-1基因组连接处各含有一个SwaI限制性内切酶酶切位点，外源基因表达框由人EF1a启动子EF1ap、绿色荧光蛋白报告基因编码区GFP、BGH polyA加尾信号组成，外源基因表达框通过位于末端的FseI限制性内切酶酶切位点插入到SAdV-1基因组原E1区位置，GFP编码框两侧各含有一个SpeI限制性内切酶酶切位点；其中所述的包装细胞株命名为293SE13，其是由pcDNA3T-SAV1E1B55K质粒转染293细胞、筛选后稳定表达SAdV-1E1B55K基因的细胞株，pcDNA3T-SAV1E1B55K质粒是在多克隆位点处插入有HAdV-41的三联体前导序列和SAdV-1 E1B55K基因编码区的pcDNA3质粒。
2.第1项中所述的重组猴腺病毒SAdV-1载体系统在制备基因治疗试剂盒或重组疫苗中的应用。
3.一种基因治疗试剂盒，其包含第1项中所述的重组猴腺病毒SAdV-1载体系统。
4.一种重组疫苗，其包含有效量的携带外源目的基因的重组猴腺病毒SAdV-1载体，其中所述携带外源目的基因的重组猴腺病毒SAdV-1利用第1项中所述的重组猴腺病毒SAdV-1载体系统制备得到。
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