CN105567618B - Hsv1-h129-bac及其变体的构建方法与应用 - Google Patents

Hsv1-h129-bac及其变体的构建方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105567618B
CN105567618B CN201511029238.8A CN201511029238A CN105567618B CN 105567618 B CN105567618 B CN 105567618B CN 201511029238 A CN201511029238 A CN 201511029238A CN 105567618 B CN105567618 B CN 105567618B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bac
virus
gfp
seq
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201511029238.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105567618A (zh
Inventor
罗敏华
曾文波
江海飞
赵非
谌章舟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Institute of Virology of CAS
Original Assignee
Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Institute of Virology of CAS filed Critical Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority to CN201511029238.8A priority Critical patent/CN105567618B/zh
Publication of CN105567618A publication Critical patent/CN105567618A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105567618B publication Critical patent/CN105567618B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16621—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16631—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16641—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16643—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16651—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2710/16652—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及HSV1‑H129‑BAC及其变体，该病毒及其突变体带有细菌人工染色体BAC，能在特定的细菌内保持低拷贝的自我复制，解决了因疱疹病毒基因组过大而不能长时间保存、不能自我复制、不方便进行分子生物学突变改造的缺点。且该病毒及其突变体还带有GFP报告基因，大大拓展了疱疹病毒作为工具病毒的应用前景。本发明还提供了H129‑BAC及其变体的构建方法，通过该方法可使对H129进行改造获得H129‑BAC，并赋予H129‑BAC更多的变体种类；构建方法和H129及其变体组成了一个遗传改造平台,具有更多的应用可能。

Description

HSV1-H129-BAC及其变体的构建方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及HSV1-H129-BAC及其变体的构建方法与应用。
背景技术
单纯疱疹病毒(Human Herpesvirus,HSV)属于α疱疹病毒亚科，该型病毒共分为两种类型，Ⅰ型单纯疱疹病毒和Ⅱ型单纯疱疹病毒，即HSV1和HSV2。HSV1和HSV2都是DNA病毒，其中HSV1基因组全长为152kb，共编码超过80种不同的病毒蛋白，病毒质粒大小约180nm。HSV1对动物感染宿主范围较广。常用实验动物为家兔、豚鼠及小鼠等。HSV1可以在多种细胞中增殖，常用非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、人胚肾细胞以及地鼠肾细胞等传代细胞培养分离病毒。
HSV1-H129是一个典型的顺行标记神经环路的工具病毒，其具有严格顺向跨突触的特性，适合标记多级神经输出环路的结构；其可携带多种标示物，跨突触后可复制，信号不衰减，这种未改造的原始株可被直接用于中枢及外周感觉神经环路的研究。在灵长类动物的大脑中，HSV1-H129也具有同样的顺向跨突触特性，使其成为极具潜力的示踪工具。然而，在顺行标记神经环路的应用中，对HSV1-H129的检测却比较困难，目前常通过免疫组织化学或免疫组织荧光等方法对其进行检测，但这些实验操作繁琐复杂，实验成本较高，最主要的是对抗体的要求较高，否则很难得到准确的实验结果，这大为限制了HSV1-H129在顺行标记神经环路中的应用。
众所周知，疱疹病毒是一类大分子量的DNA病毒，其基因组全长一般都超过100kb，要在如此巨大分子量的基础上研究病毒单个基因的功能和致病机理十分困难，基因组本身不能长时间保存，且不能自我复制，更不能进行分子生物学的突变改造等一系列的实验操作。也因此，使得上述实验及对疱疹病毒 作为工具病毒的其他应用，或基于该病毒的药物筛选等应用都难以进一步得到发展。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种Ⅰ型单纯疱疹病毒感染性克隆H129-BAC，该病毒带有细菌人工染色体BAC，能在特定的细菌内(如DH10B、DY380、EL250、DY330和GS1783等)保持低拷贝的自我复制，解决了因疱疹病毒基因组过大而不能长时间保存、不能自我复制、不方便进行分子生物学突变改造的缺点。且该病毒带有GFP报告基因，大大拓展了疱疹病毒作为工具病毒的应用前景。
本发明的第二目的在于提供一种所述的Ⅰ型单纯疱疹病毒感染性克隆H129-BAC的构建方法，通过该方法能构建H129-BAC的感染性克隆，也能对H129-BAC基因组进行分子水平的改造，包括插入外源基因、缺失一个或者多个病毒基因等，这样构建了一个基于BAC的遗传改造平台，为HSV的复制机制和致病机理提供了研究工具，具有巨大的应用价值。
本发明的第三目的在于提供所述的Ⅰ型单纯疱疹病毒H129-BAC的变体病毒H129-GFP-BAC和H129-mGFP-BAC具有和野生型病毒相似的生物学特性，可以通过报告基因GFP的表达情况来观测重组病毒在细胞内的感染情况，与H129-BAC相比，重组病毒H129-GFP-BAC和H129-mGFP-BAC的GFP表达信号更强，应用更方便。
本发明的第四目的在于提供所述的Ⅰ型单纯疱疹病毒H129-BAC的变体病毒的构建方法，该方法简单可行，且通过应用该方法可使得更多H129-BAC的变体的实现变为可能，赋予H129-BAC更多的变体种类，具有更多的应用前景。
本发明的第五目的在于提供所述的病毒在顺行标记神经环路中的应用，HSV1-H129病毒是目前已知的少有的顺向跨突触传播的病毒，可用于标记神经环路，本申请提供的H129-BAC自带荧光信号，可使其在神经环路研究中更为方便；其变体病毒含有2-3个拷贝的GFP基因，比H129-BAC的应该信号更强， 荧光效率高，荧光色泽与背景色泽对比鲜明，标记后能保持生物学活性和免疫活性，标记方法简单、快速，安全无毒。
本发明的第六目的在于提供所述的病毒在病毒药物筛选中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种Ⅰ型单纯疱疹病毒感染性克隆H129-BAC，所述感染性克隆H129-BAC通过在H129的第46616与46617位碱基之间插入BAC序列得到；
所述BAC序列为pUS-F5质粒使用HindIII酶切所得，所述pUS-F5质粒序列为SEQ IDNO:1所示。
H129的GenBank号为：GU734772.1；BAC之上包含GFP基因，因而改造得到的H129-BAC病毒带有GFP蛋白。
细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome，BAC)是一种以F质粒(F-plasmid)为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，BAC最大的优势在于具有容纳100-300kb外源插入片段的能力，能稳定遗传，克隆入BAC载体的基因组在传代中不会轻易发生缺失、重组和嵌合现象，并且可以在E.coli中进行各种基因操作，方便、安全而又快捷。
本申请基于BAC的大基因组对HSV1-H129进行改造就是利用F因子的遗传优势而建立的，且进一步的，本申请优选在其中添加了绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)作为报告基因/蛋白，所改造得到的H129-BAC具有以下优点：
1)、H129-BAC病毒中的BAC序列解决了因疱疹病毒基因组过大而不能长时间保存、不能自我复制、不方便进行分子生物学突变改造的缺点。此外，虽然相比野生型HSV1-H129病毒多加了一段约9kb大小的BAC基因序列，但是其在蛋白质印迹中的敏感度、效果、生物活性和与抗体结合的特异性等发面没有任何的弱化。
2)、病毒中的GFP蛋白DNA分子量小，只有0.72Kb，与目的基因融合后不影响目的基因的结构功能，大量表达对细胞也无毒性，且对H129-BAC病毒的感染性无影响，得到的病毒为感染性克隆，可直接作为工具病毒使用。
3)、GFP可自发荧光，便于在实验中对其检测。通过GFP的表达，能够更好的更直接观察病毒的感染情况，由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧 光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。
4)、H129-BAC病毒能够在间接免疫荧光法(IFA)和蛋白质印迹法(western blot)实验方法的配合下深入了解HSV1病毒编码的蛋白功能，从而为有效地预防和治疗由于该病毒引起的疾病以及HSV1病毒疫苗的研发提供理论基础。
如上所述的Ⅰ型单纯疱疹病毒感染性克隆H129-BAC的构建方法，包括以下步骤：
1)、以野生型H129病毒基因组为模板，扩增其同源重组臂序列并将其克隆到含有BAC序列的pUS-F5载体中，得到同时含有H129同源重组臂序列及BAC序列的质粒；
2)、将所述同时含有H129同源重组臂序列及BAC序列的质粒线性化并与野生型H129病毒转染至同一细胞中，筛选GFP阳性细胞并从中提取得到H129-BAC的总基因组DNA；
3)、将所述含有H129-BAC的总基因组DNA通过转化至细胞中并根据所述质粒抗性筛选培养得到感染性克隆H129-BAC。
该构建方法能构建H129-BAC的感染性克隆，也能对H129-BAC基因组进行分子水平的改造，包括插入外源基因、缺失一个或者多个病毒基因等，为HSV的复制机制和致病机理提供了研究工具，具有巨大的应用价值。
优选的，如上所述的Ⅰ型单纯疱疹病毒感染性克隆H129-BAC的构建方法，在步骤2)中，用于转染的细胞为293T细胞。
优选的，如上所述的Ⅰ型单纯疱疹病毒感染性克隆H129-BAC的构建方法：
在步骤3)中，所述细胞为DH10B。
如上所述的Ⅰ型单纯疱疹病毒H129-BAC的变体病毒，包括：H129-GFP-BAC和H129-mGFP-BAC；
所述H129-GFP-BAC通过在H129-BAC基因组的UL37与UL38基因之间插入CMV-p+GFP+zeoR序列得到；GFP和zeoR的序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；
所述H129-mGFP-BAC通过在H129-GFP-BAC的UL10和UL11基因之间插入CMV-p+mGFP+kanR序列得到；mGFP和kanR的序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
与H129-BAC相比，变体病毒H129-GFP-BAC、H129-mGFP-BAC的GFP表达信号更强，应用更方便；CMV-p为CMV的promoter序列；GFP基因为Gene ID为20473140；mGFP通过以pCAG-mGFP(Addgene公司，货号为14757)为模板扩增得到。
如上所述的Ⅰ型单纯疱疹病毒H129-BAC的变体病毒的构建方法，包括：
1)、将目的基因克隆至载体构建基因盒并将得到的基因盒扩增；
2)、将1)中得到的扩增产物转化至含有H129-BAC的感受态细菌中得到变体病毒克隆。
该方法借助Red同源重组系统对病毒基因进行特异性的基因敲除、基因替换、外源基因插入等一系列的分子生物学的改造，可赋予H129-BAC更多的变体种类，具有更多的应用可能。例如，基于H129-BAC的遗传改造平台，可以缺失病毒的Tk基因，使之在vero细胞内正常增殖，同时无法在神经元内传播；进而通过AAV辅助病毒系统补偿Tk，可实现跨一级突触传播，应用于示踪神经环路，病毒扩增容易。
优选的，如上所述的Ⅰ型单纯疱疹病毒H129-BAC的变体病毒的构建方法，在步骤1)中：
当目的变体病毒为H129-GFP-BAC时，目的基因为GFP基因，所用载体为pRK-zeo载体；所述pRK-zeo载体通过在pRK7载体的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点插入zeoR得到；
当目的变体病毒为H129-mGFP-BAC时，目的基因为mGFP基因，所用载体为pRK-kan载体；所述pRK-kan载体通过在pRK7载体的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点插入kanR得到。
所述pRK7载体购于addgene公司，货号为10883。
进一步优选的：
当目的变体病毒为H129-GFP-BAC时，将目的基因GFP克隆至载体所用引物为SEQID NO:6和SEQ ID NO:7所示；将所述基因盒扩增所用引物为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示；
当目的变体病毒为H129-mGFP-BAC时，将目的基因mGFP克隆至载体所用引物为SEQID NO:8和SEQ ID NO:9所示；将所述基因盒扩增所用引物为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示。
如上所述的H129-BAC病毒及其变体病毒在顺行标记神经环路中的应用。
本申请提供的HSV1-H129-BAC病毒及其变体，具有跨多级神经突触顺行传播的能力，且由于本身自带荧光信号，检测非常方便，为不同脑区解剖学和分子层面的神经连接的研究带来了更为有效的研究方法，可促进单纯疱疹病毒在神经生物学的广泛应用。
如上所述的H129-BAC病毒及其变体病毒在病毒药物筛选中的应用。
本发明中的带有细菌人工染色体的H129-BAC重组病毒相对于野生型HSV-1-H129病毒多加了一段约9kb大小的BAC序列，但是在蛋白质印迹中的敏感度、效果、生物活性和与抗体结合的特异性等发面没有任何的弱化。不仅如此，该重组病毒相对于野生型病毒来说，由于病毒基因组DNA能够在细菌内永久的保存使得H129-WT病毒基因组的自然突变几率大大降低，生物学特性保存的最为完整，在周期极长的条件下几乎不会对蛋白质印迹实验产生任何实质性的影响。该H129-BAC重组病毒能够在蛋白质印迹实验中一直保持抗原抗体结合的特异性和灵敏性，这是野生型H129-WT病毒所无法比拟的，因而非常适合于病毒药物筛选。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)H129-BAC病毒中的BAC序列解决了因疱疹病毒基因组过大而不能长时间保存、不能自我复制、不方便进行分子生物学突变改造的缺点。此外，虽然相比野生型HSV1-H129病毒多加了一段约9kb大小的BAC序列，但是其在蛋白质印迹中的敏感度、效果、生物活性和与抗体结合的特异性等发面没有任何的弱化。
(2)病毒中的GFP蛋白DNA分子量小，只有0.72kb，与目的基因融合后不影响目的基因的结构功能，大量表达对细胞也无毒性，且对H129-BAC病毒的感染性无影响，得到的病毒为感染性克隆，可直接作为工具病毒使用。
(3)GFP可自发荧光，便于在实验中对其检测。通过GFP的表达，能够更好的更直接观察病毒的感染情况，由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧 光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。
(4)H129-BAC病毒能够在间接免疫荧光法(IFA)和蛋白质印迹法(western blot)实验方法的配合下深入了解HSV1病毒编码的蛋白功能，从而为有效地预防和治疗由于该病毒引起的疾病以及HSV1病毒疫苗的研发提供理论基础。
(5)与H129-BAC相比，变体病毒H129-GFP-BAC、H129-mGFP-BAC的GFP表达信号更强，应用更方便。
(6)变体病毒的改造方法简单可行，借助Red同源重组系统对病毒基因进行特异性的基因敲除、基因替换、外源基因插入等一系列的分子生物学的改造，可赋予H129-BAC更多的变体种类，构建一个遗传改造平台，具有更多的应用可能。
(7)本申请提供的HSV1-H129-BAC病毒及其变体，具有跨多级神经突触顺行传播的能力，且由于本身自带荧光信号，检测非常方便，为不同脑区解剖学和分子层面的神经连接的研究带来了更为有效的研究方法，可促进单纯疱疹病毒在神经生物学的广泛应用。
(8)本发明中的带有细菌人工染色体的H129-BAC重组病毒相对于野生型HSV-1-H129病毒多加了一段约9kb大小的BAC基因序列，但是在蛋白质印迹中的敏感度、效果、生物活性和与抗体结合的特异性等发面没有任何的弱化。不仅如此，该重组病毒相对于野生型病毒来说，由于病毒基因组DNA能够在细菌内永久的保存使得H129-WT病毒基因组的自然突变几率大大降低，生物学特性保存的最为完整，在周期极长的条件下几乎不会对蛋白质印迹实验产生任何实质性的影响。该H129-BAC重组病毒能够在蛋白质印迹实验中一直保持抗原抗体结合的特异性和灵敏性，这是野生型H129-WT病毒所无法比拟的，因而非常适合于病毒药物筛选。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1提供的带有细菌人工染色体的H129-BAC感染性克隆的构建示意图；其中图A是将左右同源重组臂插入pUS-F5载体的示意图，图B是H129-BAC的结构示意图；
图2为本发明实施例1提供的H129-BAC感染性克隆的筛选和鉴定结果图；其中图A是H129-BAC单克隆的PCR鉴定，图B是H129-BAC感染性克隆的病毒拯救，图C是H129-BAC病毒蛋白的检测，图D是H129-BAC与H129-WT生长曲线对比；
图3为本发明实施例2中提供的H129-BAC的各变体的结构示意图；其中图A是H129-BAC及其变体H129-GFP-BAC和H129-mGFP-BAC的结构示意图,图B是H129-BAC及其变体H129-GFP-BAC和H129-mGFP-BAC感染vero细胞后的GFP荧光对比图,图C是各变体与H129-WT的生长曲线对比；
图4为本发明应用例1中H129-GFP-BAC重组病毒示踪嗅球-梨状皮层通路；其中图A嗅球颗粒细胞层(GCL，Granule cell layer)顺行传播示意图；图B与图C是在僧帽细胞层(MCL，Mitral cell layer)，前梨状皮层(APC，Anteriorpiriform cortex)、后梨状皮层(PPC，Posteriorpiriform cortex)、前嗅核(AON，anterior olfactory nucleus)、杏仁核(Amygdala)及背侧Tenia tecta等检测到的荧光信号示意图；
图5为本发明应用例2中H129-mGFP-BAC重组病毒示踪初级运动皮层-感觉皮层/丘脑/中脑通路；其中图A是运动皮层(M1，Primary motor cortex)及相关脑区域示意图；图B与图C是对侧M1、初级本体感觉皮层(S1BF，primary somatosensory cortex)、纹状体(CPu，caudate putamen)、丘脑(thalamus)及边缘皮层(PRh，perirhinal cortex)等检测到的荧光信号示意图；
图6为本发明应用例3中野生型及本发明提供的感染性克隆的HSV-1(H129－WT和H129-BAC)在药物更昔洛韦(GCV)处理后对病毒生长的影响结果图；其中，A为H129－WT在GCV处理后相对于未加GCV的病毒滴度的生长曲线对比图；B为H129-BAC在GCV处理后相对于未加GCV的病毒滴度的生长曲线对比图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1 I型单纯疱疹病毒感染性克隆H129-BAC的构建方法
1、以野生型H129病毒基因组为模板，扩增其同源重组臂序列并将其克隆到含有GFP基因的BAC载体中，得到同时含有H129同源重组臂序列及BAC序列的质粒。
(1)野生型H129病毒基因组的提取
用野生型的H129-WT病毒(Szpara,M.L.Parsons,L.Enquist,L.W.Sequencevariability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus1reveals new mutations.[J].J Virol.84:5303-13)以感染复数为1的病毒量感染vero细胞，感染12h后，刮下细胞，离心收集细胞沉淀，用solution I(10Mm Tris,10Mm EDTA,pH8.0)溶液清洗一遍，再用0.5ml的solution I溶液(包含有0.25mg of proteinase K/ml,购于美国Roche公司；终浓度为0.6％的十二烷基硫酸钠，购于国药集体公司；终浓度为1M的氯化钠)重悬细胞沉淀，50℃孵育2h，加入终浓度为10mg/ml的RNase I(购于日本TaKaRa公司)37℃孵育1h，最后再用酚氯仿(1:1)进行抽提获得细胞基因组沉淀，干燥后用一定量的无菌去离子水(100μl)重悬核酸沉淀。这样溶解后的DNA中含有大量的野生型的H129病毒基因组DNA。
(2)PCR分别扩增左右同源臂
以野生型H129病毒基因组为模版PCR分别扩增左右同源重组臂，其中左臂(L-arm)序列位于HSV-1-H129基因组(GenBank:GU734772.1)中的No.45011-46616，序列全长1605bp，右臂序列(R-arm)位于基因组中的No.46617-48570，序列全长1953bp。
PCR的反应体系(PrimeStar DNA Polymerase，购于日本TaKaRa公司)为：
Figure BDA0000899150750000091
Figure BDA0000899150750000101
其中左臂正向引物序列为:5’-cgggatccagactgacacattaaaaaacac-3’,左臂反向引物序列:为5’-cccaagcttataacttcgtataatgtatgctatacgaagttataacacggaaggagacaataccg-3’,右臂正向引物序列为5’-cccaagcttataacttcgtataatgtatgctatacgaagttattcagttagcctcccccatctc-3’,右臂反向引物序列为:5’-cgggatcccttcggacctcgcgggggccgc-3’。
扩增反应程序为：扩增反应程序
Figure BDA0000899150750000102
反应结束后将PCR产物进行1％琼脂糖(西班牙Biowest公司)凝胶电泳，纯化左右同源重组臂序列，纯化步骤完全按照试剂盒(美国omega公司)说明书来做。
(3)连接左右同源臂
将纯化后的左右臂序列分别用限制性内切酶BamHI(购于日本TaKaRa公司)进行单酶切，酶切体系的总体积为50μl，DNA量为2μg，37℃水浴反应约4h后，再用1％琼脂糖凝胶(如前述)电泳进行纯化，所得酶切纯化后的左右同源臂序列直接进行连接反应，其反应总体积为10μl，1μl T4 DNA Ligase(购于日本TaKaRa公司)，1μl 10X buffer，8μl的左右臂序列(浓度比为1:1)，16℃反应约4h后，PCR扩增左臂和右臂的全长序列L+R，PCR鉴定的反应体系为：
Figure BDA0000899150750000103
Figure BDA0000899150750000111
左臂正向引物为：5’-cgggatccagactgacacattaaaaaacac-3’，右臂反向引物为：5’-cgggatcccttcggacctcgcgggggccgc-3’。
扩增反应程序为：
Figure BDA0000899150750000112
反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳纯化同源重组臂全长序列(L+R)。
(4)将左右同源臂插入pUS-F5，构建pUS-F6
将上述纯化后的L+R序列与环状的pUS-F5载体分别用HindIII(购于日本TaKaRa公司)内切酶进行单酶切，酶切体系的总体积为50μl，DNA量为2μg，37℃水浴反应约4h后，再用1％琼脂糖凝胶电泳，分别进行纯化，所得纯化后的载体pUS-F5和L+R序列进行连接反应，其反应总体积为10μl，1μl T4 DNA Ligase(购于日本TaKaRa公司)，1μl 10X buffer，4μl的L+R arms序列和4μl的载体pUS-F5，16℃反应约4h后直接转化进感受态E.coli DN5α中，37℃过夜培养，PCR鉴定及测序，连接成功的带有左右臂同源序列的pUS-F5质粒命名为pUS-F6(见图1A)。
2、将pUS-F6质粒线性化并与野生型H129病毒转染至同一细胞中，筛选GFP阳性细胞并提取得到含有H129-BAC的总基因组DNA。
(1)pUS-F6的线性化
大量提取pUS-F6质粒，使用质粒抽提试剂盒(购于美国promega公司miniprepsA1330)，得到环状的pUS-F6质粒后，接着用限制性内切酶为BamHI进行单酶切反应，酶切体系的总体积为50μl，DNA量为2μg，平行设置4管酶 切体系，37℃水浴反应约4h后，直接向每管酶切体系中加入2倍的无水乙醇和20μl的醋酸钠(3M)，混匀后放-80℃大约10min以便核酸更好的沉淀下来，用少量的(20μl)无菌去离子水重悬核酸沉淀，最后使用NanoDrop 2000(美国Thermo Scientific公司)测定其浓度。
(2)将线性化pUS-F6质粒转染至293T细胞
转染前一天将细胞传代至培养皿，转染当天细胞应50-80％融合。将细胞接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度，将2μg线性化pUS-F6DNA与不含血清和抗生素(购于美国Gibco公司)的DMEM培养基混匀，再加入10μl的SuperFect Transfection Reagent(购于德国Qiagen公司)转染试剂，室温孵育10-15min，将转染混合液颠倒混匀一下加入6孔板，培养3-4h后，PBS清洗一次，加入DMEM完全培养基(购于美国Gibco公司)于37℃，5％的CO2培养箱(美国Thermo Scientific公司)中培养。
(3)H129-WT病毒的感染
上述步骤(2)的质粒转染5-6h后，用H129-WT病毒感染293T细胞，感染复数为1-3(MOI＝1-3)，即可放入37℃，5％的CO2培养箱中培养。
(4)流式细胞分选
上述步骤(3)中病毒感染后24h，在倒置荧光显微镜下(日本Nikon公司)观察绿色荧光蛋白的表达情况，若阳性率大于1℅即可准备细胞的分选，首先用胰酶(购自美国Gibco公司)消化293T细胞，PBS清洗一遍，然后用灭菌处理的300目滤膜过滤细胞悬浮液，将流过300目滤膜的293T细胞进行流式分选，GFP表达阳性的293T细胞单独分选出来，与铺好的vero细胞共培养。
(5)感染后细胞基因组DNA的提取
上述步骤(4)中流式分选GFP阳性的293T细胞与vero细胞共培养大约48h后，观察绿色荧光蛋白的表达情况。若GFP阳性率大于20℅的话便可直接准备提取感染后细胞的基因组DNA。先将细胞培养基吸掉，再用胰酶消化，离心去上清收集细胞，再用solution I(10Mm Tris，10Mm EDTA，pH 8.0)溶液清洗细胞沉淀一遍，最后用0.5ml的细胞悬浮液(10MmTris,10Mm EDTA，pH 8.0，0.25mg of proteinase K/ml，终浓度为0.6％的十二烷基硫酸钠(SDS)，终浓度为1M的氯化钠)重悬细胞沉淀，50℃孵育2h，继续加入终 浓度为10mg/ml的RNase I，50℃孵育1h,最后再用酚氯仿(1:1)进行反复抽提获得细胞基因组DNA沉淀，干燥后用一定量的无菌去离子水(100μl)重悬核酸沉淀。溶解后的DNA中含有大量的H129-BAC重组病毒基因组DNA(见图1B)。
3、将所述含有H129-BAC的总基因组DNA通过转化至细胞中并根据所述质粒抗性筛选培养得到感染性克隆H129-BAC，并对筛选得到的病毒进行过PCR鉴定、病毒拯救、病毒蛋白检测来进行验证。
(1)H129-BAC感染性单克隆的初步筛选和鉴定
将上述步骤中提取的含有H129-BAC重组病毒DNA的细胞基因组电转化(1.6kV，25μF，200Ω，1mm)进特殊的感受态细胞DH10B(购自美国Invitrogen公司)中，涂布在含有氯霉素抗性(购于科密欧公司)的LB平板，37℃中培养36-48h。PCR鉴定单克隆，所有的PCR体系完全按照上述方法进行，鉴定的序列为H129-WT的基因，包括UL14、UL26、UL37、UL38、UL50、US8和US12，它们的引物分别是：
UL3-F：TCGGTTTGAAAGGCATCG，
UL3-R：GACAAGGTCGCCATCTGCT；
UL14-F：GGGCACGCGAGACTATCAGAG，
UL14-R：TCATTCGCCATCGGGATAGTC；
UL26-F：ATGGAGGAGCCCCTACCAGA，
UL26-R：TACCAAAGACCGGGGCGAAT；
UL37-F：TGGTAACTAGTTAACGGCAAGTCCG，
UL37-R：ATGCCGGGACTTAAGTGGCCGTATA；
UL38-F：ATGAAGACCAATCCGCTACCCGCA，
UL38-R：AACACTCGCGTTTCGGGTTTCAGT；
UL50-F：ATGAGTCAGTGGGGATCCGG，
UL50-R：CCCGGAACGAACCCCAAGCT；
US3-F：GCCAACGACCACATCCCT，
US3R：CAGCGGCAAACAAAGCAG；
US8-F：GGGGTTTCTTCTCGGTGTTTG，
US8-R：GCGGTGCTGATGGTAATGTG；
US12-F：AAATTGCCCTAGCACAGGGG，
US12-R：GGTCTCTCCGGCGCACATAA。
以H129-WT为阳性对照，鉴定结果如图2中A所示。
(2)H129-BAC感染性克隆活病毒的拯救
转染前一天将vero细胞传代至6孔板，待细胞密度为80％左右。以上述步骤(1)中提出的H129-BAC感染性单克隆的DNA转染vero细胞中，其中环状的H129-BAC DNA为2μg，SuperFect Transfection Reagent原试剂10μl，再用无血清和抗生素的DMEM培养基配成100μl的混合液，室温放置5-10min后，再加入600μl无血清和抗生素的DMEM稀释转染混合液。去掉细胞培养基，用预热的PBS洗一遍细胞，然后直接加上700μl的转染混合液，置于细胞培养箱培养。2-3h后，吸去转染混合液，用PBS清洗一次，最后加入DMEM完全培养基；H129-BAC感染性单克隆转染后48h后开始出现细胞病变现象，置于倒置荧光显微镜下观察，发现病变处都可以观察到绿色荧光，说明我们的感染性单克隆的拯救是成功的，如图2B所示。然后继续培养直到细胞全部病变后，收集细胞培养液，即获得H129-BAC重组病毒，加入1％的DMSO于-80℃冻存。
(3)检测重组病毒蛋白表达
在100mm的培养皿中按照2×106每皿铺vero细胞，在37℃，5％CO2条件下培养，待细胞完全贴壁后，分别用H129-WT野生型病毒和H129-BAC重组病毒以MOI＝1感染细胞。37℃、5％CO2培养箱中吸附2h后，用含2％胎牛血清的MEM培养基替换培养皿中的病毒接种液，感染24h后，用胰酶消化细胞，收集细胞在1000rmp条件下离心5min。用预冷的PBS洗涤细胞一遍，继续离心去掉上清液。收集细胞沉淀放入液氮中冰冻10s，作为检测样品，准备进行western blot实验。
具体操作是：往细胞沉淀中加入50μl裂解缓冲液，涡旋混匀沉淀，利用超声破碎细胞壁，接着测定蛋白含量，加入5×loading buffer，按照同等蛋白量上样(20μg)，进行SDS-聚丙稀酰胺凝胶(PAGE)电泳。之后进行转膜反应，先用甲醇处理尼龙膜2min，然后在转膜缓冲液中浸泡15min后，开始转膜。转膜条件为恒流200mA，90min(美国Bio-Red公司)。转膜完毕后，即刻用TBST液洗膜3min，再用5％的牛奶/TBST封闭1h。接着用TBST洗膜3次后，分别孵育gD和gB特异性的单克隆抗体(购自美国abcam公司)，洗膜后孵育二抗后并再次洗膜。最后进行化学发光显影(美国Alpha公司)，结果如图2C所示。
(4)对比H129-WT和重组病毒H129-BAC的生长趋势
将vero细胞传代至6孔板(购自美国corning公司)，细胞密度为60-80％每孔。待细胞完全贴壁后，用感染复数MOI为0.1的病毒(H129－WT和H129-BAC)量分别感染细胞(此时设为感染后0h)。孵育2h后换掉培养基。用DMEM完全培养基开始培养感染后的细胞；然后分别在病毒(H129-WT和H129-BAC)感染后不同时间点2，6，12，24，36，48h收取样本并保存于-80℃。当所有的病毒样品收集完成后按照步骤测定每个样本的滴度。
滴度测试步骤如下:将vero细胞传代至12孔板，待细胞长满，用培养基梯度稀释(H129-WT和H129-BAC)病毒，每个浓度做3个重复，吸去12孔板里的培养基，PBS清洗一次，每孔加200μl病毒液。1～1.5h后，吸去病毒液，PBS清洗3次，再补加2ml完全培养基(含1％低熔点琼脂糖)培养48～72h，密切观察，直至最低浓度出现的噬斑数不再增加。弃去培养基，每孔中加入300μl染色剂孵育后，用双蒸水反复洗，然后数空斑计算滴度，结果如图2D所示。
实施例2 I型单纯疱疹病毒H129-BAC的变体病毒的构建方法
(1)Cassette构建
通过PCR、酶切、连接、转化将GFP基因克隆至载体pRK-zeo，构建Cassette CMV-promoter-GFP-zeoR，所述GFP基因序列为SEQ ID NO:2示；PCR时所用引物为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。
同样的：
将mGFP基因克隆至载体pRK-kan，构建Cassette CMV-promoter-mGFP-kanR，所述mGFP基因序列为SEQ ID NO:4所示；PCR时所用引物为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示；
(2)PCR扩增各Cassette
PCR的反应体系(PrimeStar DNA Polymerase，购于日本TaKaRa公司)为：
Figure BDA0000899150750000151
Figure BDA0000899150750000161
引物如下表所示：
Figure BDA0000899150750000162
扩增反应程序为：
Figure BDA0000899150750000163
反应结束后将PCR产物进行1％琼脂糖(西班牙Biowest公司)凝胶电泳，纯化步骤完全按照试剂盒(美国omega公司)说明书来做，最后用去离子水来洗脱DNA。
(3)电转感受态制备
1.用接种环将含有H129-BAC的细菌E.coli DY380在含有相应抗性的LB固体平板上划线在32℃过夜培养；
2.挑取单克隆放入5ml LB培养基中培养，32℃，220rpm，过夜；
3.以1:100的比例将其转移到100ml液体培养基中32℃培养，220rpm，OD600值在0.4-0.6左右(0.55-0.6最佳)，大约需要3h；
4. 42℃水浴培养15min；
5.取出细菌悬浮液置于冰上10min左右；
6. 4000rpm，4℃，10min离心去上清；
7.用超纯水重悬细菌沉淀，4000rpm，4℃，10min离心去上清；
8.用含有10％的甘油(超纯水配，灭菌，使用时4℃预冷)重悬细菌沉淀，4000rpm，4℃，10min离心去上清；
9.重复步骤8一遍；
10. 800μl的含有10﹪的甘油的纯净水重悬细菌沉淀后，以80μl每管分装细菌悬浮液后，液氮处理冷冻，放入-80℃冻存备用。
(4)电转化，同源重组
将5-15μl的Cassette(约300ng)加入制备好的电转感受态中混匀，然后加入1mm的电转杯中，置于冰上5min，准备电击；电击条件：1.6/1.8kV，25μF，200Ω；电击完毕后迅速加入培养基混匀细菌并转移到1.5ml的EP管中在32℃培养1-2h；将细菌均匀的涂布在固体LB平板(含有相应筛选抗性)，32℃培养36-48h；挑取单克隆进行PCR验证。
(5)拯救病毒验证
将鉴定正确的H129-BAC变体单克隆分别接种200ml的LB培养基，32℃过夜培养，然后用试剂盒(购自MN公司)提取DNA，按照说明书操作，最后用100μl去离子水溶解。
转染前一天将vero细胞传代至6孔板，待细胞密度为80％左右。以上述提取的DNA转染vero细胞中，其中环状的H129-BAC DNA为2μg，SuperFect Transfection Reagent原试剂10μl，再用无血清和抗生素的DMEM培养基配成100μl的混合液，室温放置5-10min后，再加入600μl无血清和抗生素的DMEM稀释转染混合液。去掉细胞培养基，用预热的PBS洗一遍细胞，然后直接加上700μl的转染混合液，置于细胞培养箱培养。2-3h后，吸去转染混合液，用PBS清洗一次，最后加入DMEM完全培养基；H129-BAC变体感染性单克隆转染后48h后开始出现细胞病变现象，置于倒置荧光显微镜下观察，发现病变处都可以观察到绿色荧光，说明我们的感染性单克隆的拯救是成功的，如图3B所示。然后继续培养直到细胞全部病变后，收集细胞培养液，即获得H129-BAC重组病毒，加入1％的DMSO于-80℃冻存。
(6)对比H129-WT和重组病毒的生长趋势
将vero细胞传代至6孔板(购自美国corning公司),细胞密度为60-80％每孔。待细胞完全贴壁后，用感染复数MOI为3的病毒(H129－WT，H129-GFP-BAC和H129-mGFP-BAC)量分别感染细胞(此时设为感染后0h)。孵育2h后换掉培养基。用DMEM完全培养基开始培养感染后的细胞；然后分别在病毒(H129-WT,H129-GFP-BAC和H129-mGFP-BAC)感染后不同时间点3，6，9，12，24h收取样本并保存于-80℃。当所有的病毒样品收集完成后按照步骤测定每个样本的滴度。
滴度测试步骤如下:将vero细胞传代至12孔板，待细胞长满，用培养基梯度稀释(H129-WT和H129-BAC)病毒，每个浓度做3个重复，吸去12孔板里的培养基，PBS清洗一次，每孔加200μl病毒液。1-1.5h后，吸去病毒液，PBS清洗3次，再补加2ml完全培养基(含1％低熔点琼脂糖)培养48－72h，密切观察，直至最低浓度出现的噬斑数不再增加。弃去培养基，每孔中加入300μl染色剂孵育后，用双蒸水反复洗，然后数空斑计算滴度，结果如图3C所示。
应用例1 129-GFP-BAC重组病毒示踪嗅球-梨状皮层通路
(1)浓缩病毒并测定病毒滴度
按MOI＝0.1接种vero细胞(8个T175的培养瓶)，37℃二氧化碳培养箱培养48h后收取上清液,在4℃条件下25000rpm离心2个h，500μl PBS重悬最后的沉淀。滴度测试步骤如下：将vero细胞传代至12孔板，待细胞长满，用培养基梯度稀释H129-GFP-BAC重组病毒，每个浓度做3个重复，吸去12孔板里的培养基，PBS清洗一次，每孔加200μl病毒液。1-1.5h后，吸去病毒液，PBS清洗3次，再补加2ml完全培养基(含1％低熔点琼脂糖)培养48－78h，密切观察，直至最低浓度出现的噬斑数不再增加。弃去培养基，每孔中加入300μl染色剂孵育后，用双蒸水反复洗，然后数空斑计算滴度；
(2)病毒注射
示踪工作中所使用H129-GFP-BAC重组病毒的滴度均为2×109pfu/ml，实验动物为8周龄雄性C57BL/6J小鼠，实验动物使用5％水合氯醛麻醉后通过脑立体定位仪将头部固定。微量注射部位为右侧嗅球的颗粒细胞层(坐标：+1.15mm ML、+3.92mm AP、-2.00mm DV)，注射体积为200nl。
(3)图像采集
在H129-GFP-BAC重组病毒注射48h后对实验动物进行心脏灌流，先加PBS，再用4％多聚甲醛，取完整脑，4％多聚甲醛固定12h后，再进行30％蔗糖脱水。冰冻切片条件为：冠状切，厚度40μm。所得切片贴于粘附载玻片，盖玻片封片。使用共聚焦显微镜进行图像采集，所得结果如图4所示。病毒在注射位点嗅球颗粒细胞层(GCL，Granule cell layer)完成复制后，顺行跨突触到达僧帽细胞层(MCL，Mitral cell layer)，再顺行跨突触到达前梨状皮层(APC，Anteriorpiriform cortex)、后梨状皮层(PPC，Posteriorpiriform cortex)、前嗅核(AON，anterior olfactory nucleus)、杏仁核(Amygdala)及背侧Tenia tecta。H129-GFP-BAC重组在此通路中表现出很好的顺行标记效果。
应用例2 129-mGFP-BAC重组病毒示踪初级运动皮层-感觉皮层/丘脑/中脑通路
(1)按应用例一的方式浓缩H129-mGFP-BAC重组病毒并测定滴度。
(2)病毒注射
示踪工作中所使用H129-mGFP-BAC重组病毒的滴度均为2×109pfu/ml。实验动物为8周龄雄性C57BL/6J小鼠，实验动物使用5％水合氯醛麻醉后通过脑立体定位仪将头部固定。微量注射部位为右侧嗅球的颗粒细胞层(坐标：+2.00mm ML、+2.10mm AP、1.88mm DV)，注射体积为300nl。
(3)图像采集
在注射H129-mGFP-BAC重组病毒72h后对实验动物进行心脏灌流，先加PBS，再用4％多聚甲醛，取完整脑，4％多聚甲醛固定12h后，再进行30％蔗糖脱水。冰冻切片条件为：冠状切，厚度40μm。所得切片贴于粘附载玻片，盖玻片封片。使用共聚焦显微镜进行图像采集，所得结果如图5所示。病毒在注射位点初级运动皮层(M1，Primary motor cortex)完成复制后，顺行跨突触到达对侧M1、初级本体感觉皮层(S1BF，primary somatosensorycortex)、纹状体(CPu，caudate putamen)、丘脑(thalamus)及边缘皮层(PRh，perirhinalcortex)。H129-mGFP-BAC重组病毒在此通路中表现出很好的顺行标记效果。
应用例3细菌人工染色体(BAC)感染性克隆H129-BAC在抗HSV-1病毒药物筛选中的应用
在12孔板(购自美国corning公司)中铺上vero细胞，细胞数为5×105/孔。待细胞完全贴壁后，用感染复数为0.1(MOI＝0.1)的病毒(H129-WT和H129-BAC)量分别感染细胞(此时设为感染后0h)。孵育2h后换掉培养基，同时加入终浓度为117μg/ml的更昔洛韦(GCV)并设置阴性对照，每隔24h重新加入相同剂量的GCV。用DMEM完全培养基开始培养感染后的细胞；然后分别在病毒(H129-WT和H129-BAC)感染后2，6，12，24，36，48h收取不同样本，将收取的样本保存于-80℃。当所有的病毒样品收集完毕后按照步骤测定每个样本的滴度。将vero细胞铺至12孔板中，细胞数为1×105个/孔，然后开始测不同时间点样本的病毒(H129-WT和H129-BAC)滴度。孵育2h后换掉培养基，用含2％血清的DMEM培养基开始培养感染后的细胞。当所有样品的滴度测定后，根据H129-WT病毒和H129-BAC病毒感染后在各个时间点的滴度分别绘制出它们在有无药物处理情况下的生长曲线,对比判断药物GCV对重组型H129-BAC病毒的活力是否也有相同的抑制作用。结果如图6所示，其中，图6A为H129－WT在GCV处理后相对于未加GCV的病毒滴度的生长 曲线对比图；图6B为H129-BAC在GCV处理后相对于未加GCV的病毒滴度的生长曲线对比。
表1：在有无药物处理的条件下，野生型H129-WT病毒感染后在不同时间点的滴度表
2hpi 6hpi 12hpi 24hpi 48hpi 72hpi
H129-WT(-GCV) 5.4×10 7×10<sup>2</sup> 1×10<sup>4</sup> 9×10<sup>4</sup> 9×10<sup>5</sup> 2×10<sup>7</sup>
H129-WT(﹢GCV) 5×10 5.8×10 6×10 6.6×10 7.3×10 8.3×10
表2：在有无药物处理的条件下，重组H129-BAC病毒感染后在不同时间点的滴度表
2hpi 6hpi 12hpi 24hpi 48hpi 72hpi
H129-BA(-GCV) 4.5×10 5×10<sup>2</sup> 6.5×10<sup>3</sup> 2.3×10<sup>4</sup> 4.5×10<sup>5</sup> 4.5×10<sup>6</sup>
H129-BA(﹢GCV) 1×10 3×10 3.9×10 6.5×10 6.5×10 8×10
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Figure IDA0000899150840000011
Figure IDA0000899150840000021
Figure IDA0000899150840000031
Figure IDA0000899150840000041
Figure IDA0000899150840000051
Figure IDA0000899150840000061
Figure IDA0000899150840000071
Figure IDA0000899150840000081
Figure IDA0000899150840000091
Figure IDA0000899150840000101

Claims (8)

1.Ⅰ型单纯疱疹病毒感染性克隆H129-BAC或其变体病毒在非诊断目的和非治疗目的的顺行标记神经环路中的用途，其中，所述感染性克隆H129-BAC通过在H129的第46616与46617位碱基之间插入BAC序列得到，并且所述BAC序列为pUS-F5质粒使用HindIII酶切所得，所述pUS-F5质粒序列为SEQ ID NO:1所示；
所述变体病毒选自H129-GFP-BAC和H129-mGFP-BAC，
其中所述H129-GFP-BAC通过在H129-BAC基因组的UL37与UL38基因之间插入CMV-p+GFP+zeoR序列得到，所述GFP和zeoR的序列分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；
其中所述H129-mGFP-BAC通过在H129-GFP-BAC的UL10和UL11基因之间插入CMV-p+mGFP+kanR序列得到，所述mGFP和kanR的序列分别为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
2.Ⅰ型单纯疱疹病毒感染性克隆H129-BAC或其变体病毒在病毒药物筛选中的用途，其中，所述感染性克隆H129-BAC通过在H129的第46616与46617位碱基之间插入BAC序列得到，并且所述BAC序列为pUS-F5质粒使用HindIII酶切所得，所述pUS-F5质粒序列为SEQ ID NO:1所示；
所述变体病毒选自H129-GFP-BAC和H129-mGFP-BAC，
其中所述H129-GFP-BAC通过在H129-BAC基因组的UL37与UL38基因之间插入CMV-p+GFP+zeoR序列得到，所述GFP和zeoR的序列分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；
其中所述H129-mGFP-BAC通过在H129-GFP-BAC的UL10和UL11基因之间插入CMV-p+mGFP+kanR序列得到，所述mGFP和kanR的序列分别为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述Ⅰ型单纯疱疹病毒感染性克隆H129-BAC通过包括以下步骤的方法构建：
1)、以野生型H129病毒基因组为模板，扩增其同源重组臂序列并将其克隆到含有BAC序列的pUS-F5载体中，得到同时含有H129同源臂序列及BAC序列的质粒；
2)、将所述同时含有H129同源臂序列及BAC序列的质粒线性化并与野生型H129病毒转染至同一细胞中，筛选GFP阳性细胞并从中提取得到H129-BAC的总基因组DNA；
3)、将所述含有H129-BAC的总基因组DNA通过转化至细胞中并根据所述质粒抗性筛选培养得到感染性克隆H129-BAC。
4.根据权利要求3所述的用途，其中在步骤2)中，用于转染的细胞为293T细胞。
5.根据权利要求3所述的用途，其中在步骤3)中，所述细胞为DH10B。
6.权利要求1或2所述的用途，其中所述Ⅰ型单纯疱疹病毒H129-BAC的变体病毒通过包括以下步骤的方法构建：
1)、将目的基因克隆至载体构建基因盒并将得到的基因盒扩增；
2)、将1)中得到的扩增产物转化至含有H129-BAC的感受态细菌中得到变体病毒克隆。
7.根据权利要求6所述的用途，其中在步骤1)中：
当目的变体病毒为H129-GFP-BAC时，目的基因为GFP基因，所用载体为pRK-zeo载体；所述pRK-zeo载体通过在pRK7载体的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点插入zeoR得到；
当目的变体病毒为H129-mGFP-BAC时，目的基因为mGFP基因，所用载体为pRK-kan载体；所述pRK-kan载体通过在pRK7载体的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点插入kanR得到。
8.根据权利要求7所述的用途，其中在步骤1)中：
当目的变体病毒为H129-GFP-BAC时，将目的基因GFP克隆至载体所用引物为SEQ IDNO:6和SEQ ID NO:7所示；将所述基因盒扩增所用引物为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示；
当目的变体病毒为H129-mGFP-BAC时，将目的基因mGFP克隆至载体所用引物为SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:9所示；将所述基因盒扩增所用引物为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示。
CN201511029238.8A 2015-12-31 2015-12-31 Hsv1-h129-bac及其变体的构建方法与应用 Active CN105567618B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511029238.8A CN105567618B (zh) 2015-12-31 2015-12-31 Hsv1-h129-bac及其变体的构建方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511029238.8A CN105567618B (zh) 2015-12-31 2015-12-31 Hsv1-h129-bac及其变体的构建方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105567618A CN105567618A (zh) 2016-05-11
CN105567618B true CN105567618B (zh) 2020-12-08

Family

ID=55878252

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201511029238.8A Active CN105567618B (zh) 2015-12-31 2015-12-31 Hsv1-h129-bac及其变体的构建方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105567618B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107630009A (zh) * 2016-07-19 2018-01-26 中国科学院武汉物理与数学研究所 一种减毒增亮、复制可控的hsv重组病毒及制备方法和应用
CN106544326B (zh) * 2016-11-07 2020-06-26 中国科学院武汉病毒研究所 顺行跨多级突触、跨神经元的示踪系统
CN106520709A (zh) * 2016-11-07 2017-03-22 中国科学院武汉病毒研究所 顺行跨单级突触神经示踪系统
WO2018082093A1 (en) * 2016-11-07 2018-05-11 Wuhan Institute Of Virology, Chinese Academy Of Sciences Anterograde monosynaptic transneuronal tracer system
CN110029127A (zh) * 2018-01-11 2019-07-19 中国科学院武汉物理与数学研究所 一种携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒及制备方法和应用
CN112501137B (zh) * 2020-11-11 2023-10-20 深圳先进技术研究院 一种神经环路标记系统

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009051823A2 (en) * 2007-10-18 2009-04-23 Michigan State University Bacterial artificial chromosome containing feline herpes virus type 1 genome and uses thereof
CN101864442A (zh) * 2010-05-19 2010-10-20 江苏省农业科学院 重组火鸡疱疹病毒细菌人工染色体转移载体

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009051823A2 (en) * 2007-10-18 2009-04-23 Michigan State University Bacterial artificial chromosome containing feline herpes virus type 1 genome and uses thereof
CN101864442A (zh) * 2010-05-19 2010-10-20 江苏省农业科学院 重组火鸡疱疹病毒细菌人工染色体转移载体

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Construction and characterization of bacterial artificial chromosomes containing HSV-1 strains 17 and KOS;GIERASCH,W.W.等;《JORURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》;20060502;第135卷;197-206 *
Construction of an Excisable Bacterial Artificial Chromosome Containing a Full-Length Infectious Clone of Herpes Simplex Virus Type 1: Viruses Reconstituted from the Clone Exhibit Wild-Type Properties In Vitro and In Vivo;Michiko T.等;《JOURNAL OF VIROLOGY》;20030131;第77卷(第2期);1382-1391 *
Evaluation of HSV-1 and adenovirus vector-mediated infection,replication and cytotoxicity in lymphoma cell lines;ZHANG,X.D.等;《ONCOLOGY REPORTS》;20111231;第26卷;637-644 *
The Complete DNA Sequence of the Long Unique Region in the Genome of Herpes Simplex Virus Type I;McGEOCH,D.J.等;《J.GEN.VIROL.》;19881231;第69卷;1531-1574 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105567618A (zh) 2016-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105567618B (zh) Hsv1-h129-bac及其变体的构建方法与应用
Wille et al. A human cytomegalovirus gO-null mutant fails to incorporate gH/gL into the virion envelope and is unable to enter fibroblasts and epithelial and endothelial cells
Hahn et al. The human cytomegalovirus ribonucleotide reductase homolog UL45 is dispensable for growth in endothelial cells, as determined by a BAC-cloned clinical isolate of human cytomegalovirus with preserved wild-type characteristics
Ma et al. A new model of Epstein-Barr virus infection reveals an important role for early lytic viral protein expression in the development of lymphomas
Liu et al. A duck enteritis virus-vectored bivalent live vaccine provides fast and complete protection against H5N1 avian influenza virus infection in ducks
Tischer et al. A self-excisable infectious bacterial artificial chromosome clone of varicella-zoster virus allows analysis of the essential tegument protein encoded by ORF9
Banerjee et al. Therapeutic gene delivery in human B-lymphoblastoid cells by engineered non-transforming infectious Epstein–Barr virus
Moore et al. The African swine fever virus thymidine kinase gene is required for efficient replication in swine macrophages and for virulence in swine
Robertson et al. An Epstein-Barr virus with a 58-kilobase-pair deletion that includes BARF0 transforms B lymphocytes in vitro
Zhang et al. Marek's disease virus-encoded MicroRNA 155 ortholog critical for the induction of lymphomas is not essential for the proliferation of transformed cell lines
WO2022218325A1 (zh) 一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和应用
WO2020239040A1 (zh) 重组溶瘤病毒以及制备方法、应用和药物
Tandon et al. Control of cytoplasmic maturation events by cytomegalovirus tegument protein pp150
CN102212559B (zh) 一种重组的hsv扩增子载体及其用途
Pagnani et al. Molecular and biological properties of BK virus-IR, a BK virus variant isolated from a human tumor
CN108220251B (zh) 一种重组传染性脓疱溶瘤病毒及其制备方法与应用
Takimoto et al. Epstein-Barr virus nuclear antigen-positive nasopharyngeal hybrid cells
Lilja et al. Functional genetic analysis of rhesus cytomegalovirus: Rh01 is an epithelial cell tropism factor
CN105713866B (zh) 人巨细胞病毒感染性克隆及其构建方法和应用
CN104928261A (zh) 伪狂犬病病毒la-a株、构建方法及其应用
Chen et al. Construction of a full-length infectious bacterial artificial chromosome clone of duck enteritis virus vaccine strain
EP2460878B1 (en) Orf7 deficient varicella virus, vaccine comprising the virus and use thereof
EP3992282A1 (en) Method for producing virus and harvest liquid composition
He et al. Rana grylio virus as a vector for foreign gene expression in fish cells
Bilello et al. A genetic system for rhesus monkey rhadinovirus: use of recombinant virus to quantitate antibody-mediated neutralization

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Luo Minhua

Inventor after: Zeng Wenbo

Inventor after: Jiang Haifei

Inventor after: Zhao Fei

Inventor after: Chen Zhangzhou

Inventor before: Luo Minhua

Inventor before: Zeng Wenbo

Inventor before: Jiang Haifei

Inventor before: Zhao Fei

Inventor before: Chen Zhangzhou

Inventor before: Xu Fuqiang

COR Change of bibliographic data
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 430071 No. 44, Middle District, little Hongshan, Wuchang District, Hubei, Wuhan

Applicant after: Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences

Address before: 430071 No. 44, Middle District, little Hongshan, Hongshan District, Hubei, Wuhan

Applicant before: Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant