CN106544326B

CN106544326B - 顺行跨多级突触、跨神经元的示踪系统

Info

Publication number: CN106544326B
Application number: CN201610976085.6A
Authority: CN
Inventors: 罗敏华; 曾文波; 江海飞; 赵非; 杨虹; 宋一舸; 谌章舟
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2016-11-07
Filing date: 2016-11-07
Publication date: 2020-06-26
Anticipated expiration: 2036-11-07
Also published as: CN106544326A

Abstract

本发明提供了一个重组单纯疱疹病毒1型(HSV‑1)毒株H129衍生的(H129‑derived)顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统；所述示踪系统是一个重组单纯疱疹病毒1型(HSV‑1)毒株H129，包括两个或两个以上的荧光表达盒(fluorescence expression cassette)，插入到H129基因组的不同位点，其中每个荧光表达盒包含至少两个拷贝的荧光蛋白编码序列(fluorescent protein‑encoding sequence)，所述荧光蛋白编码序列前后排列，和至少一个连接子编码序列，两个荧光蛋白编码序列之间插入至少一个连接子编码序列,以便荧光蛋白编码序列和连接子序列转录成一个转录子；所述连接子编码序列编码一个连接子多肽；所述连接子多肽含有至少两个相邻氨基酸，他们间的肽键形成是非常低效的；因此，所述转录子被翻译时，由于所述连接子多肽阻碍肽键的形成，能够计量地产生至少两个非融合荧光蛋白。

Description

顺行跨多级突触、跨神经元的示踪系统

技术领域

本发明一般涉及神经生物学，并且更具体地涉及顺行(anterograde)跨多级突触、跨神经元的(multi-synaptic transneuronal)病毒示踪系统。

背景技术

绘制大脑连接组对了解大脑是如何工作来说是必不可少的。作为神经功能的基本单位，神经环路在宏观结构/功能和微分子/信号环路间起到桥梁的作用。然而，许多特定的功能神经环路的结构，包括组件，联接和分布，仍有待阐明。新的示踪技术和示踪工具，特别是病毒示踪工具，有助于发现新的环路和揭示已知的经典环路的新联结和功能。

病毒示踪工具已经用于神经科学研究。狂犬病病毒(RV)和伪狂犬病病毒(PRV)的衍生病毒示踪工具可以逆行追踪神经环路从而标记输入神经网络(1)。重组水泡口炎病毒(VSV)用于顺行或逆行跨突触环路示踪(2，3)。人单纯疱疹病毒1型(HSV-1)毒株H129(H129)是一个潜在的顺行跨突触神经环路的示踪工具(4,5)。

然而，高效和高分辨率地绘制顺行输出神经环路的细节仍然是一个挑战。因此，开发具有高跨突触标记效率的顺行示踪工具是迫切需要的。

发明内容

本发明提供了一个重组单纯疱疹病毒1型(HSV-1)毒株H129衍生的(H129-derived)顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统。在一个实施例中，所述H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统是一个重组单纯疱疹病毒1型(HSV-1)毒株H129，包括两个或两个以上的荧光表达盒(fluorescence expression cassette)，插入到H129基因组的不同位点，其中每个荧光表达盒包含至少两个拷贝的荧光蛋白编码序列(fluorescent protein-encoding sequence),所述荧光蛋白编码序列前后排列，和至少一个连接子编码序列，两个荧光蛋白编码序列之间插入至少一个连接子编码序列,以便荧光蛋白编码序列和连接子编码序列转录成一个转录子；所述连接子编码序列编码一个连接子多肽；所述连接子多肽含有至少两个相邻氨基酸，他们间的肽键形成是非常低效的；因此，所述转录子被翻译时，由于所述连接子多肽阻碍肽键的形成，能够计量地产生至少两个非融合荧光蛋白。

在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中，所述荧光表达盒包括一个启动子；所述启动子调节所述荧光蛋白编码序列和连接子编码序列的转录。

在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中，所述启动子在神经元细胞中可操作，包括CMV启动子，SV40启动子，CAG启动子，EF1a启动子，TH启动子，Syn1启动子.

在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中，所述在一个表达盒中的荧光蛋白编码序列编码相同的或不同的荧光蛋白。

在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中，所述荧光蛋白编码序列编码一个由氨基酸序列(SEQ ID NO 2)代表的荧光蛋白，或其变体。

在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中，所述荧光蛋白编码序列编码一个由氨基酸序列(SEQ ID NO 4)代表的膜结合绿色荧光蛋白(mGFP)，或其变体。

在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中，所述连接子多肽含有的至少两个相邻氨基酸是甘氨酸和脯氨酸。

在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中，所述连接子编码序列编码一个由氨基酸序列(SEQ ID NO 6)代表的多肽或其变体。

在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中，所述荧光蛋白编码序列和连接子编码序列编码一个氨基酸序列(SEQ ID NO 8)或其变体。

在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中，进一步含有BAC序列。

通过如下结合附图对优选实施例的详细描述，本发明的目的和优点是显而易见的。

附图说明

本发明的优选实施方案现在将参考附图进行说明，其中类似的附图标记表示相同的元件。

图1所示的结构示意图(a)H129-wt基因组的结构示意图，(b)H129-G1基因组结构示意图，(c)H129-G3基因组结构示意图，(d)H129-G4基因组结构示意图，(e)构建pUS-F6，和(f)构建H129-BAC(即H129-G1)。

图2所示：(a)H129-G1单克隆的PCR验证结果；(b)伴随病毒复制的GFP表达和细胞病变；(c)通过Western blot显示病毒蛋白；(d)H129-wt和H129-G1生长曲线；(e)H129-wt、H129-G1、H129-G3和H129-G4在VERO细胞中的生长曲线。

图3所示(a)图像和(b)H129-G1、H129-G3和H129-G4体外荧光强度。

图4显示微流控系统的结构示意图。

图5显示H129-G4在培养的神经元中的顺行传播；(a-b)H129-G4的胞体进入和顺行标记；(c-d)H129-G4顺行跨神经突触标记。

图6显示用H129-G3示踪VPM-S1环路

图7显示使用H129-G4绘制M1区输出的信号。

图8显示使用H129-G4绘制树鼩中M1区输出的信号。

图9显示使用H129-G4示踪视觉环路。

图10显示使用H129-G4示踪嗅觉环路。

具体实施方式

可以通过引用以下的本发明的某些实施例的详细描述而更容易地理解本发明。

在本申请中，为了更充分地描述本发明所涉及领域状态，当出版物被引用，这些出版物的公开内容的全部经引用而并入本申请。

除非另有说明，在本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)，微生物学，细胞生物学，生物化学，核酸化学和免疫学的现有技术，这些是在本领域的技能之内。这些技术在文献中已有完全解释，如分子克隆：实验室说明书，第三版(Sambrook和Russel，2001年)；分子生物学当代程序(FM Ausubel等主编，1987年，包括补充至2001年)。

单纯疱疹病毒1型(HSV-1)是一种普遍存在的、条件致病病原。其自然神经嗜性和跨神经突触的传播能力使其成为潜在的神经环路示踪工具。

HSV-1毒株McIntyre-B逆行传播，而HSV-1毒株H129优先顺行跨神经突触传播[6-8]。许多研究在不同的途径和不同的动物模型中的应用了这种病毒[6,9-12]。特别是，表达遗传改变的荧光蛋白(FP)的H129的研发促使了探索该病毒株在顺行神经环路中的示踪[3,13]。然而，由于有限的标记强度，这些H129衍生的示踪工具无法让突触环路可视化，也无法显示神经元形态的细节[5,14]

本发明提供H129衍生的(H129-derived)顺行跨多级突触、跨神经元的示踪系统，用于绘制跨多级突触、跨神经元的环路，所述H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的示踪系统标记强度高，足以让精细神经结构可视化，包括神经元轴突纤维和树突棘，同时与荧光显微光学切片成像(fMOST)兼容。简而言之，H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的示踪系统是一个重组单纯疱疹病毒1型(HSV-1)毒株H129，包括两个或两个以上的荧光表达盒(fluorescence expression cassette)，插入到H129基因组的不同位点，其中每个荧光表达盒包含至少两个拷贝的荧光编码构件(fluorescence-encoding construct)，所述荧光蛋白编码序列前后排列，和至少一个连接子编码序列，两个荧光蛋白编码序列之间插入所述至少一个连接子编码序列,以便荧光蛋白编码序列和连接子序列转录成一个转录子；所述连接子编码序列编码一个连接子多肽；所述连接子多肽含有至少两个相邻氨基酸，他们间的肽键形成是非常低效的；因此，所述转录子被翻译时，由于所述连接子多肽阻碍肽键的形成，能够计量地产生至少两个非融合荧光蛋白。例如，当翻译由连接序列耦合的两荧光编码构件时，计量地产生两个荧光蛋白(而不是一个融合蛋白)。

在一些实施例中，单纯疱疹病毒1型(HSV-1)毒株H129具有一个大的基因组(GenBank GU734772.1)。如图1(a)所示，H129-wt具有典型的单纯疱疹病毒的结构,包括一个单一的长序列和一个单一的短序列，每个独特组件两端分别是反向重复序列，因此可以形成4个同分异构体。

在一些实施例中，荧光表达盒包括一个启动子，至少两个串联排列的荧光蛋白编码序列，以及至少一个连接子编码序列，在两个荧光蛋白编码序列之间插入至少一个连接子编码序列，以便荧光蛋白编码序列和连接子编码序列被转录为一个单一转录子。

在一些实施例中，启动子可以是任何在神经元细胞中可操作的启动子。在一些实施例中，启动子包括CMV启动子,SV40启动子，CAG启动子,EF1a启动子,TH启动子，Syn1启动子。

在一些实施例中，适用于本发明的荧光蛋白编码序列可以是目前和未来在该领域中可用的任何荧光基因。荧光基因可以是野生型或重组变体物，只要他们的荧光强度没有减少。例如，荧光基因包括GFP(green fluorescent protein),eGFP(enhanced greenfluorescent protein),mGFP(membrane bound form of EGFP),sfGFP(superfoldergreen fluorescent protein),EYFP(enhanced yellow fluorescent protein),ECFP(enhanced cyan fluorescent protein),EBFP2(enhanced blue fluorescent protein2),tdTomato,MRFP(monomer red fluorescent protein,mCherry,Ypet,mKO,mkate,等等。在一些实施例中，在一个表达盒中的至少两个荧光蛋白编码序列可以是相同的或不同的。在一些实施例中，核苷酸序列(SEQ ID NO 1)代表的荧光蛋白编码序列编码由氨基酸序列(SEQ ID NO 2)代表的绿色荧光蛋白(GFP)。在一些实施例中，核苷酸序列(SEQ ID NO 3)代表的荧光蛋白编码序列编码由氨基酸序列(SEQ ID NO 4)代表的膜结合绿色荧光蛋白(mGFP)。在一些实施例中，它们的变体可以用；“变体”的定义为一个蛋白与一个由序列号代表的氨基酸序列有至少90％，优选95％，更优选98％，甚至更优选99％的同一性，只要变体中的变化不影响其功能。

在一些实施例中，连接子编码序列编码一个连接子多肽，其中该连接子多肽包含至少两个相邻的氨基酸，在它们之间形成肽键是非常低效的。在一些实施例中，所述至少两个相邻的氨基酸是甘氨酸和脯氨酸。在一些实施例中，由一个核苷酸序列(SEQ ID NO 5)所代表的连接子编码序列编码一个由氨基酸序列(SEQ ID NO 6)代表的连接子多肽。在一些实施例中，它们的变体可以用；“变体”的定义为一个多肽与一个由序列号代表的氨基酸序列有至少90％，优选95％，更优选98％，甚至更优选99％的同一性，只要变体中的变化不影响其功能。

在一些实施例中，至少两拷贝荧光蛋白编码序列和至少一个连接子编码序列由核苷酸序列(SEQ ID NO 7)代表，编码一个由氨基酸序列(SEQ ID NO 8)代表的多肽。在一些实施例中，它们的变体可以用；“变体”的定义为一个多肽与一个由序列号代表的氨基酸序列有至少90％，优选95％，更优选98％，甚至更优选99％的同一性，只要变体中的变化不影响其功能。

在一些实施例中，荧光表达盒插入到H129基因组任何位点，只要插入不干扰病毒复制。在一些实施例中，插入位点位于任意两个相邻基因的非编码区。在一些实施例中，BAC骨架的插入位点是46616-46617，H129-G3中mGFP的插入位点是24671-24672。

在一些实施例中，该重组H129基因组含有细菌人工染色体(BAC)序列；从而重组H129基因组可以在细菌中操作。BAC序列可以被插入到H129基因组的合适位点；例如，BAC序列插入到病毒基因组的46616-46617。大的病毒基因组可以保持在细菌人工染色体(BAC)上,便于在大肠杆菌内进行同源重组操作以达到插入或者缺失基因的目的,将其转染真核细胞能产生感染性病毒。[18，19]

实施例

提供下面实施例的唯一目的是说明本发明的原理；它们决不旨在限制或缩小本发明的范围

实施例1

细胞和细胞培养

VERO-E6细胞(VERO，ATCC#CRL-1586)培养在Dulbecco培养基(DMEM)(含10％胎牛血清(FBS)和青霉素-链霉素(100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素、Gibco))。

沿用常规程序，分离和培养来源于小鼠胚胎的海马神经元[20,21]。简而言之，在胚胎18.5天(E18.5)从C57BL/6小鼠的幼崽中解剖出海马，切片，进一步用胰酶/DNA酶I在37℃消化15分钟。分离的神经元用无菌汉克平衡盐溶液洗涤(HBSS)洗涤，悬浮和培养在添加了2％B27，glutamax(25μm)和青霉素-链霉素(100单位/毫升和100微克/毫升)(GIBCO)神经细胞基本培养基中。每隔一天换一次培养基。

实施例2

构建H129-G1

将HSV-1-H129基因组克隆至带有绿色荧光蛋白基因的细菌人工染色体上，得到H129-BAC(即H129-G1)。如附图1e和1f所示,具体主要步骤如下：

(2.1)H129-wt病毒基因组的提取

用H129-wt病毒[22]以感染复数为1的病毒量感染VERO细胞，感染12小时后，刮下细胞，离心收集细胞沉淀，用solution I(10mM Tris,10mM EDTA,pH 8.0)溶液清洗一遍，再用0.5ml的solution I溶液(包含有0.25mg Proteinase K/ml(美国Roche公司)；0.6％十二烷基硫酸钠(SDS)(国药集团)；终浓度为1M的氯化钠)重悬细胞沉淀，50℃孵育2小时，加入终浓度为10mg/ml的RNase I(日本TaKaRa公司)37℃孵育1小时,最后再用酚氯仿(1:1)进行抽提获得DNA沉淀，干燥后用一定量的无菌去离子水(100ul)重悬核酸沉淀。这样溶解后的DNA中含有大量的野生型的H129-wt病毒基因组DNA。

(2.2)PCR分别扩增左右同源臂

以野生型H129-wt病毒基因组为模版PCR分别扩增左右同源重组臂，其中左臂(L-arm)序列全长1605bp，位于HSV-1-H129基因组(GenBank:GU734772.1)中的No.45011-46616，右臂(R-arm)序列全长1953bp,位于基因组中的No.46617-48570。PCR反应体系(PrimeStar DNA Polymerase，TaKaRa公司)的总体积为50μl,包含10μl 5×buffer,4μldNTP,1.5μl正向引物,1.5μl反向引物,0.5μl PrimeStar酶，1μl模板,和31.5μl水。其中左臂正向引物序列为:5’-cgggatccagactgacacattaaaaaacac-3’(SEQ ID NO 9),左臂反向引物序列:为5’-cccaagcttataacttcgtataatgtatgctatacgaagttataacacggaaggagacaataccg-3’(SEQ ID NO 10),右臂正向引物序列为5’-cccaagcttataacttcgtataatgtatgctatacgaagttattcagttagcctcccccatctc-3’(SEQ ID NO 11),右臂反向引物序列为:5’-cgggatcccttcggacctcgcgggggccgc-3’(SEQ ID NO 12)。扩增条件为：1)94℃2min；2)98℃15s；3)55℃15s；4)72℃2min；5)72℃10min；6)16℃10min；步骤2-4循环30次。然后将PCR产物进行1％琼脂糖(西班牙Biowest公司)凝胶电泳，纯化左右同源重组臂，纯化步骤完全按照试剂盒(美国omega公司)说明书来做。

(2.3)连接左右同源臂

将纯化后的左右臂DNA分别用限制性内切酶BamHI(TaKaRa公司)进行单酶切，酶切反应的总体积为50μl，DNA量为2μg，37℃水浴反应约4小时后，再用1％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，所得酶切纯化后的左右同源臂DNA直接进行连接反应，其连接反应总体积为10μl，包含1μl T4 DNA Ligase(TaKaRa公司)，1μl 10X buffer，8μl左右臂DNA(浓度比为1:1，16℃反应约4小时后，PCR扩增全长的左臂和右臂(L+R)，其PCR扩增反应总体积为50μl，包含10μl5×buffer,4μl dNTP,1.5μl左臂正向引物(5’-cgggatccagactgacacattaaaaaacac-3(SEQID NO 13)),1.5μl右臂反向引物(5’-cgggatcccttcggacctcgcgggggccgc-3’(SEQ ID NO14))，0.5μl PrimeStar酶，1μl模板，31.5μl水。扩增条件为：1)94℃2min；2)98℃15s；3)55℃15s；4)72℃4min；5)72℃10min；6)16℃10min；步骤2-4循环30次。用1％琼脂糖凝胶电泳纯化全长同源重组臂(L+R)DNA片段。

(2.4)构建pUS-F6

将上述纯化的全长同源重组臂(L+R)DNA片段和环状pUS-F5(SEQ ID NO 59)载体分别用HindIII(TaKaRa公司)限制性内切酶进行酶切；酶切反应的总体积为50μl，包含2μgDNA，37℃水浴反应约4小时后，再用1％琼脂糖凝胶电泳，分别进行纯化；所得纯化的线性pUS-F5载体和L+R DNA片段进行连接反应，其连接反应总体积为10μl，包含1μl T4DNALigase(TaKaRa公司)，1μl 10X buffer，4μl L+R DNA片段和4μl线性pUS-F5载体；16℃反应约4小时后直接转化进感受态E.coli DH5α细胞中，37℃过夜培养，PCR鉴定及测序，带有左右臂同源序列的pUS-F5质粒命名为pUS-F6.

(2.5)pUS-F6的线性化

使用质粒抽提试剂盒(美国Promega公司)提取pUS-F6质粒，得到环状的pUS-F6质粒后，接着用限制性内切酶为BamHI进行酶切反应；酶切反应的总体积为50μl，包含2μgDNA，平行设置4管酶切反应，37℃水浴反应约4小时后，直接向每管酶切反应中加入2倍的无水乙醇和20μl的醋酸钠(3M)，混匀后放-80℃大约10分钟，用少量的(20μl)无菌去离子水重悬DNA沉淀，最后使用NanoDrop 2000(美国Thermo Scientific公司)测定其浓度。

(2.6)将线性化pUS-F6质粒DNA转染至293T细胞

转染前一天将细胞接种于6孔板后孵育过夜，转染当天细胞达到50-80％融合度。将2μg线性化pUS-F6质粒DNA与不含血清和抗生素的DMEM培养基(美国GIBCO公司)混匀，再加入10μl转染试剂(SuperFect Transfection Reagent，德国Qiagen公司)，室温孵育10-15分钟，将转染混合液加入6孔板，培养3-4小时后，PBS清洗一次，加入DMEM完全培养基(GIBCO)，CO₂培养箱中于37℃培养。

(2.7)H129-wt病毒的感染

上述步骤(2.6)的质粒转染5-6小时后，用H129-wt病毒感染293T细胞，感染复数为1-3(MOI＝1-3)，即刻放入37℃，5％的CO₂培养箱(Thermo Scientific)中培养。

(2.8)流式细胞分选

上述步骤(2.7)中病毒感染后24小时，在倒置荧光显微镜下(日本Nikon公司)观察绿色荧光蛋白的表达情况，若阳性率大于1℅即可准备细胞的分选。首先用胰酶(GIBCO)消化293T细胞，PBS清洗一遍，然后用灭菌处理的300目滤膜过滤细胞悬浮液，将流过300目滤膜的293T细胞进行流式分选，GFP表达阳性的293T细胞单独分选出来，与铺好的VERO细胞共培养。

(2.9)H129-G1重组病毒基因组DNA的制备

上述步骤(2.8)中流式分选GFP阳性的293T细胞与VERO细胞共培养大约48小时后，观察绿色荧光蛋白的表达情况。当GFP阳性率大于20℅，H129-G1重组病毒基因组DNA通过上述步骤(2.1)所描述的方法制备。

(2.10)H129-G1感染性单克隆的初步筛选和鉴定

将上述步骤(2.9)中制备的H129-G1重组病毒DNA电转化(1.6/1.8kv，25uF，200Ω，1mm)进感受态细胞DH10B(美国Invitrogen公司)中，涂布在含有氯霉素抗性(科密欧公司)的LB平板,37℃中培养36-48小时。PCR鉴定单克隆，所有的PCR反应条件参照上述步骤(2.2)，鉴定的序列为H129-WT的基因，包括UL3、UL14、UL26、UL37、UL38、UL50、US3、US8和US12，它们的引物分别是UL3-F：TCGGTTTGAAAGGCATCG(SEQ ID NO 15)，UL3-R：GACAAGGTCGCCATCTGCT(SEQ ID NO 16)；UL14-F：GGGCACGCGAGACTATCAGAG(SEQ ID NO 17)，UL14-R：TCATTCGCCATCGGGATAGTC(SEQ ID NO 18)；UL26-F：ATGGAGGAGCCCCTACCAGA(SEQ IDNO 19)，UL26-R：TACCAAAGACCGGGGCGAAT(SEQ ID NO 20)；UL37-F：TGGTAACTAGTTAACGGCAAGTCCG(SEQ ID NO 21)，UL37-R：ATGCCGGGACTTAAGTGGCCGTATA(SEQID NO 22)；UL38-F：ATGAAGACCAATCCGCTACCCGCA(SEQ ID NO 23)，UL38-R：AACACTCGCGTTTCGGGTTTCAGT(SEQ ID NO 24)；UL50-F：ATGAGTCAGTGGGGATCCGG(SEQ ID NO25)，UL50-R：CCCGGAACGAACCCCAAGCT(SEQ ID NO 26)；US3-F：GCCAACGACCACATCCCT(SEQ IDNO 27)，US3 R：CAGCGGCAAACAAAGCAG(SEQ ID NO 28)；US8-F：GGGGTTTCTTCTCGGTGTTTG(SEQID NO 29)，US8-R：GCGGTGCTGATGGTAATGTG(SEQ ID NO 30)；US12-F：AAATTGCCCTAGCACAGGGG(SEQ ID NO 31)，US12-R：GGTCTCTCCGGCGCACATAA(SEQ ID NO 32)，以H129-WT阳性对照，鉴定结果如图2(a)所示。

(2.11)拯救H129-G1感染性病毒

转染前一天将VERO细胞传代至6孔板，待细胞融合度为80％左右。以上述步骤(2.10)中鉴定的H129-G1感染性单克隆的DNA转染VERO细胞。转染混合液的制备如下：2μg环状H129-G1 DNA，10μl SuperFect Transfection Reagent，和无血清和抗生素的DMEM培养基配成100μl混合液，室温放置5-10分钟后，再加入600μl无血清和抗生素的DMEM稀释成转染混合液。去掉细胞培养基，用预热的PBS洗一遍细胞，然后直接加上转染混合液，置于细胞培养箱培养。2-3小时后，吸去转染混合液，用PBS清洗一次，最后加入DMEM完全培养基；H129-G1感染性单克隆转染后48小时后开始出现细胞病变现象，置于倒置荧光显微镜下观察，发现病变处都可以观察到绿色荧光，说明我们的感染性单克隆的拯救是成功的，如图2(b)所示。然后继续培养直到细胞全部病变后，收集细胞培养液，即获得H129-G1重组病毒，加入1％的DMSO于-80℃冻存。

(2.12)检测重组病毒蛋白表达

VERO细胞种在100mm培养皿中后，在37℃，5％CO₂条件下培养，待细胞完全贴壁后，分别用H129-wt病毒和H129-G1重组病毒以MOI＝1感染细胞。37℃、5％CO₂培养箱中吸附2h后，用含2％胎牛血清的MEM培养基替换培养皿中的病毒接种液，感染24小时后，用胰酶消化细胞，收集细胞在1000rmp离心5分钟。用预冷的PBS洗涤细胞一遍，继续离心去掉上清液。收集细胞沉淀放入液氮中冰冻10秒，作为检测样品，准备进行Western Blot实验。

Western Blot实验的操作如下：往细胞沉淀中加入50μl裂解缓冲液，利用超声破碎细胞，接着测定蛋白含量，加入5x上样Buffer，按照同等蛋白量上样(20μg)，进行SDS-聚丙稀酰胺凝胶(PAGE)电泳。之后进行转膜反应，先用甲醇处理尼龙膜2分钟，然后在转膜缓冲液中浸泡15分钟后，开始转膜。转膜条件为恒流200mA,90分钟(美国Bio-Red公司)。转膜完毕后，即刻用TBST液洗膜3分钟，再用5％的牛奶/TBST封闭1小时。接着用TBST洗膜3次后，分别孵育gD和gB特异性的单克隆抗体(美国Abcam公司)，洗膜后孵育二抗后并再次洗膜。最后进行化学发光显影(美国Alpha公司)，结果如图2(c)所示。

(2.13)H129-wt和重组病毒H129-G1的生长对比

将VERO细胞传代至6孔板(美国corning公司),细胞融合度为60-80％。待细胞完全贴壁后，用H129-wt和H129-G1感染复数MOI为0.1的病毒量分别感染细胞(此时设为感染后0小时)。孵育2小时后换掉培养基。用DMEM完全培养基开始培养感染后的细胞；然后分别在病毒感染后不同时间点2，6，12，24，36，48h收取样本并保存于-80℃。当所有的病毒样品收集完成后按照以下步骤测定每个样本的病毒滴度。

病毒滴度测定步骤如下:将VERO细胞传代至12孔板，待细胞长满，用培养基梯度稀释H129-wt和H129-G1病毒，每个浓度做3个重复，吸去12孔板里的培养基，PBS清洗一次，每孔加200μl病毒液。1～1.5h后，吸去病毒液，PBS清洗3次，再补加2ml完全培养基(含2％FBS)培养24～48h，密切观察，直至最低浓度出现的噬斑数不再增加。弃去培养基，每孔中加入300μl染色剂,孵育后，用双蒸水反复洗，然后数空斑计算滴度，结果如图2(d)所示。

实施例3

构建H129-G3

基于H129-G1同源重组改造得到H129-G3。图1(c)显示H129-G3的结构构造。

(3.1)Cassette构建

通过PCR、酶切、连接、转化将zeo^R克隆至载体pRK-GFP，构建CassetteCMVpromoter-GFP-Zeo^R，正向引物为F:CGGGATCCCAAGTTTCGAGGTCGAGTGTC-(SEQ ID NO33),反向引物为R:GCGAATTCGGAACGGACCGTGTTGACAA(SEQ ID NO 34)；同样的方法，将mGFP克隆至载体pRK-kan，构建Cassette CMVpromoter-mGFP-kan^R，正向引物为F:GCGTCGACATGCTGTGCTGTATGAGAAG(SEQ ID NO 35),反向引物为R:CGGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCC(SEQ ID NO 36)。

(3.2)含有H129-G1的活化大肠杆菌细胞的制备

(i)将含有H129-G1的E.coli DY380在含有相应抗性的LB固体平板上划线，32℃培养过夜；

(ii)挑取单克隆放入5ml LB培养基中培养，摇床，32℃培养过夜；

(iii)以1：100的比例将其转移到100ml液体培养基中，摇床，32℃培养，OD600值在0.4-0.6左右(0.55-0.6最佳)，大约需要3小时；

(iv)42℃水浴15分钟；

(v)取出细菌悬浮液置于冰上10分钟左右；

(vi)4000rpm，4℃，10分钟，离心去上清；

(vii)用超纯水重悬细菌沉淀，4000rpm，4℃，10分钟，离心去上清；

(viii)用含有10﹪的甘油重悬细菌沉淀，4000rpm，4℃，10分钟，离心去上清；

(ix)重复步骤(viii)一遍。

(x)800μl含有10﹪的甘油的纯净水重悬细菌沉淀，以80μl每管分装细菌悬浮液，液氮处理冷冻，放入-80℃冻存备用。

(3.3)PCR扩增各cassettes

PCR的反应体系(PrimeStar DNA Polymerase，日本TaKaRa公司)总体积为50μl，包括10μl 5×buffer,4μl dNTP,1.5μl正向引物，1,5μl反向引物，0.5μl PrimeStar酶，1μl模板，31.5μl水。引物序列如下表1所示。扩增条件为：1)94℃2min，2)98℃15s，3)55℃15s，4)72℃3min，5)72℃10min，6)16℃10min，步骤2-4循环30次。然后将PCR产物进行1％琼脂糖(西班牙Biowest公司)凝胶电泳，纯化步骤完全按照试剂盒(美国Omega公司)说明书，最后用去离子水来洗脱DNA。

表1.PCR扩增cassettes的正向和反向引物序列

(3.4)电转化Cassette pRK-CMV-GFP-zeo和同源重组得到H129-G2

将300ng的Cassette DNA(约5-15μl)加入步骤(2)制备的含有H129-G1的活化大肠杆菌细胞中混匀；电击条件为：1.6/1.8kv，25uF，200Ω,1mm；电击完毕后迅速加入培养基混匀细菌并转移到1.5ml的EP管中在32℃培养1-2小时；将细菌均匀的涂布在固体LB平板(含有相应筛选抗性)，32℃培养36-48h；挑取单克隆进行PCR验证。

(3.5)含有H129-G2的活化大肠杆菌细胞的制备

制备含有H129-G2的活化大肠杆菌细胞的方法与步骤(3.2)相同。

(3.6)电转化Cassette pRK-CMV-GFP-kan和同源重组得到H129-G3

电转化Cassette pRK-CMV-GFP-kan和同源重组得到H129-G3的方法与步骤(3.4)相似；在电转化中，用了在步骤(3.5)中制备的含有H129-G2的活化大肠杆菌细胞。

(3.7)拯救H129-G3病毒

将鉴定正确的含有H129-G3单克隆细菌细胞分别接种200ml的LB培养基，32℃培养过夜，然后用试剂盒(购自MN公司)提取DNA，按照说明书操作，最后用100μl去离子水溶解。转染前一天将VERO细胞传代至6孔板，待细胞融合度为80％左右。以上述提取的DNA转染VERO细胞。转染混合液的制备如下：2μg环状H129-G3 DNA，10μl SuperFect TransfectionReagent，和无血清和抗生素的DMEM培养基配成100μl混合液，室温放置5-10分钟后，再加入600μl无血清和抗生素的DMEM稀释成转染混合液。去掉细胞培养基，用预热的PBS洗一遍细胞，然后直接加上转染混合液，置于细胞培养箱培养。2-3小时后，吸去转染混合液，用PBS清洗一次，最后加入DMEM完全培养基；H129-G3感染性单克隆转染后48小时后开始出现细胞病变现象，置于倒置荧光显微镜下观察，发现病变处都可以观察到绿色荧光，说明我们的感染性单克隆的拯救是成功的，如图2(b)所示。然后继续培养直到细胞全部病变后，收集细胞培养液，即获得H129-G3重组病毒，加入1％的DMSO于-80℃冻存。

实施例4

构建H129-G4

基于H129-G1构建H129-G4。

(4.1)敲除BAC序列左端的loxp序列

(4.1.1)PCR扩增Cassette kan，即kan^R基因，模板来源于质粒pGBK-T7(Clonetech，K1612-1)，用于替换BAC序列左端的loxp及cam^R基因，正向引物(F)为：tttattgccgtcatagcgcgggttccttccggtattgtctccttccgtgttcgctcagaagaactcgtcaagaaggc(SEQID NO 41)；反向引物(R)为：cgggcgtattttttgagttatcgagattttcaggagctaaggaagctaaaatgattgaacaagatggattgcacgc(SEQ ID NO 42)；PCR反应体系(PrimeStar DNA Polymerase，TaKaRa公司)总体积为50μl，包括10μl 5×buffer,4μl dNTP,1.5μl正向引物,1.5μl反向引物,0.5μl PrimeStar酶，1μl模板，31.5μl H₂O。扩增条件为：1)94℃2min，2)98℃15s，3)55℃15s，4)72℃1min，5)72℃10min，6)16℃10min，步骤2-4循环30次。然后将PCR产物进行1％琼脂糖(西班牙Biowest公司)凝胶电泳，纯化步骤完全按照试剂盒(美国Omega公司)说明书来做，最后用30μl去离子水来洗脱DNA。

(4.1.2)含有H129-G1的活化大肠杆菌细胞的制备

制备含有H129-G1的活化大肠杆菌细胞的方法与步骤(3.2)相同。

(4.1.3)电转化Cassette kan，同源重组得到H129-BAC-DLloxp克隆

电转化Cassette kan和同源重组得到H129-BAC-DLloxp克隆的方法与步骤(3.4)相似；在电转化中，用了在步骤(4.1.ii)中制备的含有H129-BAC的活化大肠杆菌细胞。PCR鉴定,正向引物(F)为：caacacccgtgcgttttattc(SEQ ID NO 43),反向引物(R)为：gtaagaggttccaactttcacc(SEQ ID NO 44).

(4.2)构建H129-BAC-mGFP-2A-GFP，敲除BAC序列右端的loxp序列

(4.2.1)构建Cassette CMV-promoter-mGFP-2A-GFP-Zeo^R，用于替换BAC序列右端的loxp序列和SV40-promoter-GFP)

构建载体pRK-GFP-zeo：在载体pRK-GFP的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ之间插入抗性基因zeocin,zeocin有独立的EM7启动子；正向引物(F)为:cgggatcccaagtttcgaggtcgagtgtc(SEQ ID NO 45)；反向引物(R)为：gcgaattcggaacggaccgtgttgacaa(SEQ ID NO 46)。构建载体pRK-mGFP-2A-GFP-zeo：在载体pRK-GFP-zeo的Hind Ⅲ和Sal Ⅰ之间插入mGFP-2A序列(去掉了mGFP的终止密码子)；正向引物(F)为:cccaagcttatgctgtgctgtatgagaag(SEQ IDNO 47)；反向引物(R)为:cggtcgactgggccaggattctcctcgacgtcaccgcatgttagcagacttcctctgccctccttgtacagctcgtcc(SEQ ID NO 48)。

(4.2.2)PCR扩增Cassette CMV-promoter-mGFP-2A-GFP-Zeo^R

模板为质粒pRK-mGFP-2A-GFP-zeo，正向引物(F)为：aggtaccttctgaggcggaaagaaccagctgtggaatgtgtgtcagttagacattgattattgactagttattaatag(SEQ ID NO 49)；反向引物(R)为：tctgcgacctggcgcgcacgtttgcccgggagatgggggaggctaactgaggaacggaccgtgttgacaattaatc(SEQ ID NO 50)；PCR的反应和DNA产物的纯化与步骤(4.1.1)类似。

(4.2.3)含有H129-BAC-DLloxp的活化大肠杆菌细胞的制备

制备含有H129-BAC-DLloxp的活化大肠杆菌细胞的方法与步骤(3.2)相同。

(4.2.4)电转化，同源重组得到H129-BAC-mGFP-2A-GFP克隆

电转化Cassette CMV-promoter-mGFP-2A-GFP-Zeo^R和同源重组得到H129-BAC-mGFP-2A-GFP克隆的方法与步骤(3.4)相似。PCR鉴定,正向引物(F)为：acctctgaaagaggaacttgg(SEQ ID NO 51),反向引物(R)为：gatggtccagacccacgtcac(SEQID NO 52).

(4.3)构建H129-mGFP-2A-GFP-BAC-mGFP-2A-GFP(即H129-G4)

(4.3.1)构建Cassette CMV-promoter-mGFP-2A-GFP-cam^R

在载体pRK-mGFP-2A-GFP–zeo的BamHⅠ之后插入抗性基因cam,cam有独立的cat启动子；正向引物(F)为：cgggatcctgatcggcacgtaagaggttc(SEQ ID NO 53)，反向引物(R)为：cgggatccttacgccccgccctgccactcat(SEQ ID NO 54)。

(4.3.2)PCR扩增Cassette CMVpromoter-mGFP-2A-GFP-cam^R

模板为质粒pRK-mGFP-2A-GFP-cam，正向引物(F)为：caaagaatggatgggaggagttcaggaagccggggagagggcccgcggcgacattgattattgactagttattaatag(SEQ ID NO 55)；反向引物(R)为：ccgcaccaacccgccagaagagccaaagtcaacacaacaacgccttaaatgtgatcggcacgtaagaggttccaac(SEQ ID NO 56)；PCR的反应和DNA产物的纯化与步骤(4.1.1)类似。

(4.3.3)含有H129-BAC-mGFP-2A-GFP的活化大肠杆菌细胞的制备

制备含有H129-BAC-mGFP-2A-GFP的活化大肠杆菌细胞的方法与步骤(3.2)相同。

(4.3.4)电转化，同源重组得到H129-G4克隆

电转化Cassette CMVpromoter-mGFP-2A-GFP-cam^R和同源重组得到H129-G4克隆的方法与步骤(3.4)相似。PCR鉴定,正向引物(F)为：cggaaaccaaagaaggaagc(SEQ ID NO57),反向引物(R)为：gggagcccaacaaacagcac(SEQ ID NO 58).

(4.3.5)拯救H129-G4病毒

拯救H129-G4病毒的操作与步骤(3.7)相同。

(4.3.6)H129-wt和重组病毒的生长对比

生长曲线对比的操作参照步骤(2.13)。现参照图2(e)，图示H129-wt,H129-G1,H129-G3和H129-G4在VERO细胞中生长曲线。H129-wt,-G1,-G3or-G4感染VERO细胞的MOI为3，在指定的时间的上清液中的子代病毒，由空斑形成试验标准检测。所显示的是从3个独立实验的平均值(标准差)。如图2(e)所示，H129-wt,-G1,-G3or-G4的复制动力学相似，这表明在H129基因组插入位置灵活。

实施例5

H129-G1,H129-G3和H129-G4在VERO细胞中的荧光强度

现参照图3，(a)图像显示和(b)图示H129-G1,H129-G3和H129-G4的体外荧光强度。H129-G1,H129-G3和H129-G4感染VERO细胞的MOI为1，感染后24小时观察GFP信号。在相同条件下拍摄的图像。比例尺＝50μm，如图3(b)所示，H129-G4是H129-G1的5.3倍，H129-G3是H129-G1的2.3倍；这意味着荧光强度并不是一个荧光基因的简单相加。

实施例6

微流体装置

现参照图4，给出了微流体装置的原理结构示意图。如图4所示，微流体装置包括两分离培养室，由多个微通道的连接，所述多个微通道只允许轴突生长通过，但是完全阻碍树突。微流体装置的制作按照先前描述的程序[21,23,24]。

实施例7

在微流体装置中培养神经细胞

在微流体装置中培养神经元，新鲜分离的鼠胚海马神经元(2.5x10⁶，500μl培养基)被植入一个腔室(图5(a)和(b)中的蓝腔)(第1天)。双室培养，在第5天的时候，当第一批植入的神经元的轴突长入微通道时，一批新的神经元(2.5x10⁶，250μl)加入到相反腔室(图5(c)和(d)中的红腔)。每天更新培养基，在传出和传入端室的体积始终分别保持在500μl和250μl。为了引导轴突在微通道中定向生长，较高的静水压力是由传出室较大的介质体积产生；为了防止轴突逆行生长，减少4天后接种神经元的数量(第5天)。感染时，H129-G4被加入到如图5(a)和(c)所示的任意一个腔室，在指定的时间点达到终浓度为1x10⁷pfu/ml。为了避免病毒扩散到相反腔室，在感染腔室中的介质体积保持小于相反腔室的一半。在感染24小时后(hpi)获取图像。

实施例8

脑内注射病毒

用立体定位系统，在BSL-2动物实验室，按照批准的SOP，对成年野生型C57BL/6，DAT-Cre小鼠，PV-Cre小鼠，和树鼩进行脑内注射病毒。DAT-Cre转基因小鼠在多巴胺(DA)神经元中特异表达Cre重组酶，表达受多巴胺转运体(DAT)启动子的控制；PV Cre转基因小鼠在PV中间神经元表达Cre重组酶。都是C57BL/6背景。麻醉动物的脑内注射病毒用到机动立体定向器(Stoelting Co.)。根据小鼠脑立体定位图谱，用内外侧(ML),前后(AP)和背腹(DV)与Bregma的距离测定小鼠核团的确切位置(7)；树鼩核团的坐标根据树鼩脑立体定位图谱决定(8)。当有注明时，Alexa Fluor 594共轭霍乱毒素B亚单位(CTB)(Invitrogen)是随着注入病毒。注入细节列在表1中。

表1.注射位点和H129衍生的示踪系统

*双耳代替AP

脑内注射病毒，应用到8-10周龄的雄性小鼠和成年雄性树鼩时，没有随机化或致盲。病毒注射后每天监测动物，如果观察到严重的疾病，实验将被终止，动物将被排除在外。

实施例9

双光子荧光显微光学切片成像(fMOST)

fMOST成像标本嵌入

9100甲基丙烯酸甲酯(MMA,Electron MicroscopySciences)，如前所述([27])。简而言之，PFA固定的动物大脑用0.01M PBS冲洗12h，用一系列醇(50％，75％，95％，100％和100％的乙醇，每个浓度2h)完全脱水，接着浸泡在二甲苯两次(每次2h)以至透明。然后渗透标本，转移到明胶胶囊和浸渍在聚合溶液中。最后，带试样的胶囊被封闭和保存在干燥室，暗处，4℃，72h。聚合完成后，使用fMOST系统全脑成像，数据采集率的像素大小为0.5μm×0.5μm×1μm[28]。最后，对获得的数据集的图像叠加转化为大数据，应用Amira软件(Visage Software,USA)进行三维图像重建[29]。

实施例10

H129-G4在培养的神经元中的顺行传播

现参照图5，显示H129-G4在培养的神经元中的顺行传播。(a-b)H129-G4的胞体进入和顺行标记。新鲜分离的小鼠胚胎海马神经元接种到微流体装置的一个腔室，开始24h称之为1天，在第8天，H129-G4加到胞体(蓝色)或轴突终端腔室(红色)至终浓度10⁷pfu/ml(a)。左和右图分别显示胞体和轴突的终端侧感染的代表结果。GFP信号图像(上图)和相位对比(下图)，感染后24小时(hpi)。虚线表示腔室和微通道之间的边界。标尺，100μm(b)。(c-d)H129-G4顺行跨神经突触标记。神经元依次在第1天和第5天分别接种到两个腔室，然后在第12天H129-G4添加到传出(蓝色)或传入室(红色)至终浓度10⁷pfu/ml(c)。左和右图分别显示传出和传入侧感染的代表结果。GFP信号图像(上图)和相位对比(下图)，感染后24小时。虚线表示腔室和微通道之间的边界。尺度杆，100μm(d)。

当H129-G4添加到胞体侧(图5(a))，神经元及其轴突，感染后24小时(hpi)显示GFP标记(图5(b))。然而，当病毒被添加到轴突终端侧时，没有绿色荧光蛋白标记的神经元被观察到(图5(b)，右图)。这些数据表明，H129-G4只在特定的病毒剂量特定的观测时间微乎其微地通过神经远末端感染神经元。

当H129-G4添加到传出神经元，H129-G4能够通过在微通道内的轴突传播和用GFP标记相反腔室的传入神经元(图5(d)，左侧图)。然而，当H129-G4添加到传入腔室内，只在同一腔室内观察到GFP阳性神经元，在传出腔室无神经元标记(图5(d)，右面图)。这些数据表明，H129-G4在微流体装置所培养的神经元之间，在特定的病毒剂量特定的观测时间以一种严格的顺行跨突触的方式传播。

实施例11

使用H129-G3示踪VPM-S1环路的时间过程

现参照图6，显示使用H129-G3示踪VPM-S1环路的时间过程。(a)VPM-S1环路架构。VPM，丘脑腹后内侧核；nRT，网状丘脑核；S1，初级体感皮层；L4和L6，皮质IV和VI层。(c-g)H129-G3示踪VPM-S1环路的代表结果。H129-G3(1x10⁶PFU，300nl)和Alexa Fluor 594共轭CTB(CTB，红色)，被注入到野生型C57BL/6小鼠的VPM。显示感染后第2(c)，3(d)，4(e)和5(f)的示踪结果。框内区域被放大并呈现在右图上。在c1中分散的GFP阳性神经元为白色箭头指示。(h)一个有代表性的GFP标记的单神经元。感染后第4天，在S1，一个锥体神经元树突树被完整的标记。显示心尖段(h1和h2)和基底树突(h3)的放大图像。

H129-G3(10⁶pfu，300nl)和Alexa Fluor 594标记霍乱毒素B亚单位(CTB)一起注入VPM，标示注射部位和通过轴突末端吸收逆行标记神经元胞体。通过感染时间过程的确定，我们评估了H129-G3的标记方向、效率、和跨突触传播。在接种病毒后2天(2dpi)，CTB(红色)和GFP双阳性细胞存在于注射部位。在附近的nRT也观察到GFP阳性神经元(图6(c))。在接种病毒后3天，除了在nRT的GFP信号外(图6(d))，在皮层观察到少量的GFP阳性神经元(图6(d1))。在接种病毒后4天，两个分离的细胞群在同侧S1明显标记：GFP阳性细胞群在L4和CTB标记的细胞群在L6。两个细胞群之间没有重叠(图6(e))。这些数据表明，H129-G3顺行和跨突触地标记L4神经元，但不经过在VPM的轴突末梢逆行标记L6神经元。在次级体感皮层的L4也观察到较小的GFP阳性细胞群(S2)(图6(f))，提示可能直接VPM-S2投射。在接种病毒后5天，H129-G3蔓延到其他皮质层包括L6(图6(g))，而CTB阳性细胞保留在L6。这些结果证实，H129-G3是跨神经元的，多突触的，和严格地顺行。

一个有代表性的锥体神经元，有很好的标记的顶端和基底树突显示在图6(h)，其中个别树突棘可以很容易地在GFP信号的基础上检测到。值得注意的是，虽然H129-G3标记强度足够让神经元结构可视化，但是，它是不够的，因为单个轴突不是清晰可辨。

实施例12

使用H129-G4绘制M1投射输出信号

现参照图7，显示使用H129-G4绘制M1投射输出信号。(a)对M1投射环路架构。M1，初级运动皮层；cont M1，对侧M1；S1，初级躯体感觉皮层；PRh，边缘皮层；STh，丘脑底核；CPu，尾状核。(b-c)M1投影示踪的代表结果。H129-G4(10⁶pfu，200nl)被注入到野生型C57BL/6小鼠的M1，在病毒感染后第4天，获取脑冠状切片图像。框内区域显示具有较高的放大倍率。(d)H129-G4标记的单个神经元代表。显示一个具有代表性的在PRh内GFP标记的神经元，具有个体棘(d1和d2)和轴突(d3)的树突段的放大图像在右边显示。(e-j)fMOST和H129-G4示踪相结合。在病毒感染后第4天获取的大脑进一步处理至fMOST成像。全脑的三维图像重建(e)。M1神经支配的代表性脑区，包括contM1(f)、纹状体(g)和S1(h)，显示其细节。同时显示在同侧S1(i)和contM1(j)的单个神经元代表。

初级运动皮层(M1)是主要的皮层区域，生成并发送运动控制信号至下游靶点。自M1的直接投射已经被很好的定义(图7(a))。H129-G4应用于该途径来验证其顺行示踪能力和效率。野生型C57BL/6小鼠在脑内M1区域注射H129-G4(10⁶pfu，200nl)，然后在病毒感染后第4天检查。在M1的注射位置，H129-G4标记大量的神经元。在对侧M1有相当一批神经元也被标记(图7(b)-(c))。此外，连接双侧M1的纤维清晰可见(图7(b2))。在同侧S1也观察到GFP标记的神经元(图7(c2))，反映出从M1投影到S1。M1神经支配的其他脑区也被标记，包括丘脑、丘脑下核(STh)，边缘皮层(PRh)，和尾壳核(CPu)(数据未显示)。除了宏观环路示踪，H129-G4还揭示了神经元的详细结构(图7(d))。

荧光显微光学切片成像(fMOST)是一个功能强大的高通量成像系统，自动重建全脑神经环路，达到亚微米级的高分辨率[30]。到目前为止，H129-G4是唯一顺行跨突触病毒示踪系统，标记强度高到足够应用fMOST。重建全脑fMOST图像所显示的H129-G4的一般追踪和标记模式(图7(e))与激光共聚焦显微镜检测一致(图7(b)-(d))。在接种的M1，对侧M1(图7(f))，和同侧S1(图7(h))，一大群神经元被标记。突出的轴突纤维也清晰可见(图7(g))。即使在长距离区域，H129-G4仍然稀疏标记神经元，具有高荧光强度，可以获得单神经元及其突起的详细结构(图7(i)-(j))。因此，H129-G4是一种高效的顺行跨多级突触病毒示踪工具，一般可用于示踪神经环路和绘制连接组。

实施例13

使用H129-G4绘制树鼩M1投射输出信号

现参照图8，显示使用H129-G4绘制树鼩M1投射输出信号。(a)小鼠和树鼩脑比较。在灌注、固定和脱水后，成年小鼠和树鼩脑的前(左)或侧视图(中)。(b-g)H129-G4示踪树鼩M1投影输出结果。H129-G4(2×10⁶pfu，300nl)与CTB(红色)一起注射到树鼩M1，在病毒感染后第6天获取大脑。显示冠状脑切片的有代表性的图像，框内区域显示具有较高的放大倍率。(h)H129-G4标记的树鼩单个神经元。显示注射周围的一个代表性的GFP标记的神经元，右边显示被放大的顶端(h1-h3)和基底树突(h4)。

树鼩(Tupaia belangeri chinensis)，一个较小的尺寸原猴亚目灵长类动物，在行为、解剖、基因组和进化水平更接近于其他灵长类动物而不是啮齿类动物[26]。它的大脑结构和神经元环路也更类似于其他灵长类动物而不是啮齿类动物。到目前为止，没有病毒示踪系统，跨神经突触地绘制树鼩的神经环路。测试在树鼩的适用性，H129-G4与CTB一起脑内注射到树鼩脑M1。由于树鼩脑比老鼠的大脑体积大(图8(a))，注入的病毒量增加到2×10⁶pfu，300nl。在感染后第6天(图8(b))，GFP和CTB同时标记注射部位。类似于小鼠M1输出，GFP标记的细胞在对侧M1，S1，CPu(图8(d)-(e))、丘脑(图8(f)-(g))中也观察到。有趣的是，H129-G4注射到树鼩脑M1导致GFP阳性细胞出现在梨状皮质中(Pir)(图8(c))，infraradiata足(IRd)(图8(c)-(d))，屏状核(Cl)和初级视觉皮层(V1)(图8(g))，而这些大脑区域在小鼠中未被标记。H129-G4标记强度在树鼩比小鼠降低，但仍足以揭示单个神经元的结构(图8(h))，包括的心尖和基树突。

实施例14

使用H129-G4示踪视觉环路

现参照图9，显示使用H129-G4示踪视觉环路。(a)老鼠视觉环路架构。LGN，外侧膝状体核；LP，丘脑后外侧核；SC，上丘；V1和V2，初级和次级视皮层；(b-d)H129-G4示踪视觉环路代表结果。H129-G4(10⁶pfu，1μl)注入野生型C57BL/6小鼠的视网膜下，图像在感染后第6天获得。显示在LGN和LP(b)以及视觉皮层(c)的代表图像，框内区域相应地放大。

实施例15

使用H129-G4示踪嗅觉环路

现参照图10，显示使用H129-G4示踪嗅觉环路。(a)小鼠嗅觉环路的架构。MOB，主嗅球；GCL，颗粒细胞层；MCL、僧帽细胞层；AON，前嗅核；APC，前梨状皮层；PPC，后梨状皮质；(b-f)H129-G4示踪嗅觉环路代表结果。H129-G4(10⁶pfu，200nl)注射到野生型C57BL/6小鼠GCL，图像在感染后第4天获取。显示MOB(b)，AON(c)，APC(d)、PPC(e)和Amy(f)的代表图像，框内区域被放大。

尽管本发明参照特异的实施方式来描述，但是将被理解的是，实施例是说明性的，本发明的范围并不局限于此。本发明的替代实施例对本发明涉及的领域的普通技术人员将变得显而易见。这样的替代实施例都被认为是包含在本发明的精神和范围之内。因此，本发明的范围由所附的权利要求被描述，由前面的描述所支持。

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SEQUENCE LISTING

<110> Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences

中国科学院武汉病毒研究所

<120> ANTEROGRADE MULTI-SYNAPTIC TRANSNEURONAL TRACER

顺行跨多突触神经示踪系统

<130> 1003.P001

<160> 60

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 720

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Green fluorescence protein

<400> 1

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 2

<211> 239

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Green fluorescence protein

<400> 2

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 3

<211> 780

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> modified green fluorescence protein

<400> 3

atgctgtgct gtatgagaag aaccaaacag gttgaaaaga atgatgagga ccaaaagatc 60

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 120

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 180

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 240

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 300

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 360

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 420

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 480

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 540

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 600

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 660

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 720

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 780

<210> 4

<211> 259

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> modified green fluorescence protein

<400> 4

Met Leu Cys Cys Met Arg Arg Thr Lys Gln Val Glu Lys Asn Asp Glu

1 5 10 15

Asp Gln Lys Ile Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val

20 25 30

Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe

35 40 45

Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr

50 55 60

Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr

65 70 75 80

Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro

85 90 95

Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly

100 105 110

Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys

115 120 125

Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile

130 135 140

Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His

145 150 155 160

Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp

165 170 175

Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile

180 185 190

Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro

195 200 205

Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr

210 215 220

Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val

225 230 235 240

Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu

245 250 255

Leu Tyr Lys

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> linker sequence

<400> 5

gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg ccca 54

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> linker sequence

<400> 6

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 7

<211> 1548

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> mGFP-2A-GFP sequence

<400> 7

atgctgtgct gtatgagaag aaccaaacag gttgaaaaga atgatgagga ccaaaagatc 60

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 120

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 180

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 240

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 300

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 360

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 420

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 480

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 540

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 600

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 660

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 720

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaaggag 780

ggcagaggaa gtctgctaac atgcggtgac gtcgaggaga atcctggccc agtgagcaag 840

ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac 900

ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc 960

ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc 1020

ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc 1080

ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac 1140

ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc 1200

gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac 1260

aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg 1320

aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag 1380

cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc 1440

cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc 1500

gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagtaa 1548

<210> 8

<211> 515

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> mGFP-2A-GFP sequence

<400> 8

Met Leu Cys Cys Met Arg Arg Thr Lys Gln Val Glu Lys Asn Asp Glu

1 5 10 15

Asp Gln Lys Ile Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val

20 25 30

Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe

35 40 45

Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr

50 55 60

Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr

65 70 75 80

Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro

85 90 95

Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly

100 105 110

Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys

115 120 125

Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile

130 135 140

Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His

145 150 155 160

Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp

165 170 175

Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile

180 185 190

Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro

195 200 205

Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr

210 215 220

Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val

225 230 235 240

Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu

245 250 255

Leu Tyr Lys Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

260 265 270

Glu Asn Pro Gly Pro Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val

275 280 285

Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe

290 295 300

Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr

305 310 315 320

Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr

325 330 335

Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro

340 345 350

Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly

355 360 365

Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys

370 375 380

Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile

385 390 395 400

Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His

405 410 415

Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp

420 425 430

Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile

435 440 445

Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro

450 455 460

Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr

465 470 475 480

Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val

485 490 495

Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu

500 505 510

Leu Tyr Lys

515

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 9

cgggatccag actgacacat taaaaaacac 30

<210> 10

<211> 65

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 10

cccaagctta taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tataacacgg aaggagacaa 60

taccg 65

<210> 11

<211> 64

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 11

cccaagctta taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tattcagtta gcctccccca 60

tctc 64

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 12

cgggatccct tcggacctcg cgggggccgc 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 13

cgggatccag actgacacat taaaaaacac 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 14

cgggatccct tcggacctcg cgggggccgc 30

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 15

tcggtttgaa aggcatcg 18

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 16

gacaaggtcg ccatctgct 19

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 17

gggcacgcga gactatcaga g 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 18

tcattcgcca tcgggatagt c 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 19

atggaggagc ccctaccaga 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 20

taccaaagac cggggcgaat 20

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 21

tggtaactag ttaacggcaa gtccg 25

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 22

atgccgggac ttaagtggcc gtata 25

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 23

atgaagacca atccgctacc cgca 24

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 24

aacactcgcg tttcgggttt cagt 24

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 25

atgagtcagt ggggatccgg 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 26

cccggaacga accccaagct 20

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 27

gccaacgacc acatccct 18

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 28

cagcggcaaa caaagcag 18

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 29

ggggtttctt ctcggtgttt g 21

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 30

gcggtgctga tggtaatgtg 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 31

aaattgccct agcacagggg 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 32

ggtctctccg gcgcacataa 20

<210> 33

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 33

cgggatccca agtttcgagg tcgagtgtc 29

<210> 34

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 34

gcgaattcgg aacggaccgt gttgacaa 28

<210> 35

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 35

gcgtcgacat gctgtgctgt atgagaag 28

<210> 36

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 36

cgggatcctt acttgtacag ctcgtcc 27

<210> 37

<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 37

caaagaatgg atgggaggag ttcaggaagc cggggagagg gcccgcggcg acattgatta 60

ttgactagtt attaatag 78

<210> 38

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 38

ccgcaccaac ccgccagaag agccaaagtc aacacaacaa cgccttaaat gaggcggccg 60

cactagtgat agatct 76

<210> 39

<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 39

cgaccgtggt gtatgtctgg tgtgtggcgt ccgatcccgt tactatcacc acattgatta 60

ttgactagtt attaatag 78

<210> 40

<211> 77

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 40

cgtgtcgttt ttaaaaaacc cacaatcgcc ggggttgagg ggggggggac gttcaggtgg 60

cacttttcgg ggaaatg 77

<210> 41

<211> 77

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 41

tttattgccg tcatagcgcg ggttccttcc ggtattgtct ccttccgtgt tcgctcagaa 60

gaactcgtca agaaggc 77

<210> 42

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 42

cgggcgtatt ttttgagtta tcgagatttt caggagctaa ggaagctaaa atgattgaac 60

aagatggatt gcacgc 76

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 43

caacacccgt gcgttttatt c 21

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 44

gtaagaggtt ccaactttca cc 22

<210> 45

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 45

cgggatccca agtttcgagg tcgagtgtc 29

<210> 46

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 46

gcgaattcgg aacggaccgt gttgacaa 28

<210> 47

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 47

cccaagctta tgctgtgctg tatgagaag 29

<210> 48

<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 48

cggtcgactg ggccaggatt ctcctcgacg tcaccgcatg ttagcagact tcctctgccc 60

tccttgtaca gctcgtcc 78

<210> 49

<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 49

aggtaccttc tgaggcggaa agaaccagct gtggaatgtg tgtcagttag acattgatta 60

ttgactagtt attaatag 78

<210> 50

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 50

tctgcgacct ggcgcgcacg tttgcccggg agatggggga ggctaactga ggaacggacc 60

gtgttgacaa ttaatc 76

<210> 51

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 51

acctctgaaa gaggaacttg g 21

<210> 52

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 52

gatggtccag acccacgtca c 21

<210> 53

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 53

cgggatcctg atcggcacgt aagaggttc 29

<210> 54

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 54

cgggatcctt acgccccgcc ctgccactca t 31

<210> 55

<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 55

caaagaatgg atgggaggag ttcaggaagc cggggagagg gcccgcggcg acattgatta 60

ttgactagtt attaatag 78

<210> 56

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 56

ccgcaccaac ccgccagaag agccaaagtc aacacaacaa cgccttaaat gtgatcggca 60

cgtaagaggt tccaac 76

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 57

cggaaaccaa agaaggaagc 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 58

gggagcccaa caaacagcac 20

<210> 59

<211> 9193

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pUS-F5

<400> 59

aagcttttat ctaatctccc agcgtggttt aatcagacga tcgaaaattt cattgcagac 60

aggttcccaa atagaaagag catttctcca ggcaccagtt gaagagcgtt gatcaatggc 120

ctgttcaaaa acagttctca tccggatctg acctttacca acttcatccg tttcacgtac 180

aacatttttt agaaccatgc ttccccaggc atcccgaatt tgctcctcca tccacgggga 240

ctgagagcca ttactattgc tgtatttggt aagcaaaata cgtacatcag gctcgaaccc 300

tttaagatca acgttcttga gcagatcacg aagcatatcg aaaaactgca gtgcggaggt 360

gtagtcaaac aactcagcag gcgtgggaac aatcagcaca tcagcagcac atacgacatt 420

aatcgtgccg atacccaggt taggcgcgct gtcaataact atgacatcat agtcatgagc 480

aacagtttca atggccagtc ggagcatcag gtgtggatcg gtgggcagtt taccttcatc 540

aaatttgccc attaactcag tttcaatacg gtgcagagcc agacaggaag gaataatgtc 600

aagccccggc cagcaagtgg gctttattgc ataagtgaca tcgtcctttt ccccaagata 660

gaaaggcagg agagtgtctt ctgcatgaat atgaagatct ggtacccatc cgtgatacat 720

tgaggctgtt ccctgggggt cgttaccttc cacgagcaaa acacgtagcc ccttcagagc 780

cagatcctga gcaagatgaa cagaaactga ggttttgtaa acgccacctt tatgggcagc 840

aaccccgatc accggtggaa atacgtcttc agcacgtcgc aatcgcgtac caaacacatc 900

acgcatatga ttaatttgtt caattgtata accaacacgt tgctcaaccc gtcctcgaat 960

ttccatatcc gggtgcggta gtcgccctgc tttctcggca tctctgatag cctgagaaga 1020

aaccccaact aaatccgctg cttcacctat tctccagcgc cgggttattt tcctcgcttc 1080

cgggctgtca tcattaaact gtgcaatggc gatagccttc gtcatttcat gaccagcgtt 1140

tatgcactgg ttaagtgttt ccatgagttt cattctgaac atcctttaat cattgctttg 1200

cgttttttta ttaaatcttg caatttactg caaagcaaca acaaaatcgc aaagtcatca 1260

aaaaaccgca aagttgttta aaataagagc aacactacaa aaggagataa gaagagcaca 1320

tacctcagtc acttattatc actagcgctc gccgcagccg tgtaaccgag catagcgagc 1380

gaactggcga ggaagcaaag aagaactgtt ctgtcagata gctcttacgc tcagcgcaag 1440

aagaaatatc caccgtggga aaaactccag gtagaggtac acacgcggat agccaattca 1500

gagtaataaa ctgtgataat caaccctcat caatgatgac gaactaaccc ccgatatcag 1560

gtcacatgac gaagggaaag agaaggaaat caactgtgac aaactgccct caaatttggc 1620

ttccttaaaa attacagttc aaaaagtatg agaaaatcca tgcaggctga aggaaacagc 1680

aaaactgtga caaattaccc tcagtaggtc agaacaaatg tgacgaacca ccctcaaatc 1740

tgtgacagat aaccctcaga ctatcctgtc gtcatggaag tgatatcgcg gaaggaaaat 1800

acgatatgag tcgtctggcg gcctttcttt ttctcaatgt atgagaggcg cattggagtt 1860

ctgctgttga tctcattaac acagacctgc aggaagcggc ggcggaagtc aggcatacgc 1920

tggtaacttt gaggcagctg gtaacgctct atgatccagt cgattttcag agagacgatg 1980

cctgagccat ccggcttacg atactgacac agggattcgt ataaacgcat ggcatacgga 2040

ttggtgattt cttttgtttc actaagccga aactgcgtaa accggttctg taacccgata 2100

aagaagggaa tgagatatgg gttgatatgt acactgtaaa gccctctgga tggactgtgc 2160

gcacgtttga taaaccaagg aaaagattca tagccttttt catcgccggc atcctcttca 2220

gggcgataaa aaaccacttc cttccccgcg aaactcttca atgcctgccg tatatcctta 2280

ctggcttccg cagaggtcaa tccgaatatt tcagcatatt tagcaacatg gatctcgcag 2340

ataccgtcat gttcctgtag ggtgccatca gattttctga tctggtcaac gaacagatac 2400

agcatacgtt tttgatcccg ggagagacta tatgccgcct cagtgaggtc gtttgactgg 2460

acgattcgcg ggctattttt acgtttcttg tgattgataa ccgctgtttc cgccatgaca 2520

gatccatgtg aagtgtgaca agtttttaga ttgtcacact aaataaaaaa gagtcaataa 2580

gcagggataa ctttgtgaaa aaacagcttc ttctgagggc aatttgtcac agggttaagg 2640

gcaatttgtc acagacagga ctgtcatttg agggtgattt gtcacactga aagggcaatt 2700

tgtcacaaca ccttctctag aaccagcatg gataaaggcc tacaaggcgc tctaaaaaag 2760

aagatctaaa aactataaaa aaaataatta taaaaatatc cccgtggata agtggataac 2820

cccaagggaa gttttttcag gcatcgtgtg taagcagaat atataagtgc tgttccctgg 2880

tgcttcctcg ctcactcgag ggcttcgccc tgtcgctcga ctgcggcgag cactactggc 2940

tgtaaaagga cagaccacat catggttctg tgttcattag gttgttctgt ccattgctga 3000

cataatccgc tccacttcaa cgtaacaccg cacgaagatt tctattgttc ctgaaggcat 3060

attcaaatcg ttttcgttac cgcttgcagg catcatgaca gaacactact tcctataaac 3120

gctacacagg ctcctgagat taataatgcg gatctctacg ataatgggag attttcccga 3180

ctgtttcgtt cgcttctcag tggataacag ccagcttctc tgtttaacag acaaaaacag 3240

catatccact cagttccaca tttccatata aaggccaagg catttattct caggataatt 3300

gtttcagcat cgcaaccgca tcagactccg gcatcgcaaa ctgcacccgg tgccgggcag 3360

ccacatccag cgcaaaaacc ttcgtgtaga cttccgttga actgatggac ttatgtccca 3420

tcaggctttg cagaactttc agcggtatac cggcatacag catgtgcatc gcataggaat 3480

ggcggaacgt atgtggtgtg accggaacag agaacgtcac accgtcagca gcagcggcgg 3540

caaccgcctc cccaatccag gtcctgaccg ttctgtccgt cacttcccag atccgcgctt 3600

tctctgtcct tcctgtgcga cggttacgcc gctccatgag cttatcgcga ataaatacct 3660

gtgacggaag atcacttcgc agaataaata aatcctggtg tccctgttga taccgggaag 3720

ccctgggcca acttttggcg aaaatgagac gttgatcggc acgtaagagg ttccaacttt 3780

caccataatg aaataagatc actaccgggc gtattttttg agttatcgag attttcagga 3840

gctaaggaag ctaaaatgga gaaaaaaatc actggatata ccaccaccgt tgatatatcc 3900

caatggcatc gtaaagaaca ttttgaggca tttcagtcag ttgctcaatg tacctataac 3960

cagaccgttc agctggatat tacggccttt ttaaagaccg taaagaaaaa taagcacaag 4020

ttttatccgg cctttattca cattcttgcc cgcctgatga atgctcatcc ggaattccgt 4080

atggcaatga aagacggtga gctggtgata tgggatagtg ttcacccttg ttacaccgtt 4140

ttccatgagc aaactgaaac gttttcatcg ctctggagtg aataccacga cgatttccgg 4200

cagtttctac acatatattc gcaagatgtg gcgtgttacg gtgaaaacct ggcctatttc 4260

cctaaagggt ttattgagaa tatgtttttc gtctcagcca atccctgggt gagtttcacc 4320

agttttgatt taaacgtggc caatatggac aacttcttcg cccccgtttt caccatgggc 4380

aaatattata cgcaaggcga caaggtgctg atgccgctgg cgattcaggt tcatcatgcc 4440

gtttgtgatg gcttccatgt cggcagaatg cttaatgaat tacaacagta ctgcgatgag 4500

tggcagggcg gggcgtaatt tttttaaggc agttattggt gcccttaaac gcctggttgc 4560

tacgcctgaa taagtgataa taagcggatg aatggcagaa attcgatgat aagctgtcaa 4620

acatgagaat tggtcgacca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt 4680

aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta 4740

atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctc ccggctcgta 4800

tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt 4860

acgccaagcg cgcaattaac cctcactaaa gggaacaaaa gctgggtacc gggccccccc 4920

tcgaggtcga cggtatcgcg attgaagcgt gcgcctgtta ttccaaaaca tacgctcaat 4980

actcaaccgg ttgaagatac ttcgttatcg acaccagctg ccccgatggt ggattcgtta 5040

attgcgcgcg taggagtaat ggctcgcggt aatgccatta ctttgcctgt atgtggtcgg 5100

gatgtgaagt ttactcttga agtgctccgg ggtgatagtg ttgagaagac ctctcgggta 5160

tggtcaggta atgaacgtga ccaggagctg cttactgagg acgcactgga tgatctcatc 5220

ccttcttttc tactgactgg tcaacagaca ccggcgttcg gtcgaagagt atctggtgtc 5280

atagaaattg ccgatgggag tcgccgtcgt aaagctgctg cacttaccga aagtgattat 5340

cgtgttctgg ttggcgagct ggatgatgag cagatggctg cattatccag attgggtaac 5400

gattatcgcc caacaagtgc ttatgaacgt ggtcagcgtt atgcaagccg attgcagaat 5460

gaatttgctg gaaatatttc tgcgctggct gatgcggaaa atatttcacg taagattatt 5520

acccgctgta tcaacaccgc caaattgcct aaatcagttg ttgctctttt ttctcacccc 5580

ggtgaactat ctgcccggtc aggtgatgca cttcaaaaag cctttacaga taaagaggaa 5640

ttacttaagc agcaggcatc taaccttcat gagcagaaaa aagctggggt gatatttgaa 5700

gctgaagaag ttatcactct tttaacttct gtgcttaaaa cgtcatctgc atcaagaact 5760

agtttaagct cacgacatca gtttgctcct ggagcgacag tattgtataa gggcgataaa 5820

atggtgctta acctggacag gtctcgtgtt ccaactgagt gtatagagaa aattgaggcc 5880

attcttaagg aacttgaaaa gccagcaccc tgatgcgacc acgttttagt ctacgtttat 5940

ctgtctttac ttaatgtcct ttgttacagg ccagaaagca taactggcct gaatattctc 6000

tctgggccca ctgttccact tgtatcgtcg gtctgataat cagactggga ccacggtccc 6060

actcgtatcg tcggtctgat tattagtctg ggaccacggt cccactcgta tcgtcggtct 6120

gattattagt ctgggaccac ggtcccactc gtatcgtcgg tctgataatc agactgggac 6180

cacggtccca ctcgtatcgt cggtctgatt attagtctgg gaccatggtc ccactcgtat 6240

cgtcggtctg attattagtc tgggaccacg gtcccactcg tatcgtcggt ctgattatta 6300

gtctggaacc acggtcccac tcgtatcgtc ggtctgatta ttagtctggg accacggtcc 6360

cactcgtatc gtcggtctga ttattagtct gggaccacga tcccactcgt gttgtcggtc 6420

tgattatcgg tctgggacca cggtcccact tgtattgtcg atcagactat cagcgtgaga 6480

ctacgattcc atcaatgcct gtcaagggca agtattgaca tgtcgtcgta acctgtagaa 6540

cggagtaacc tcggtgtgcg gttgtatgcc tgctgtggat tgctgctgtg tcctgcttat 6600

ccacaacatt ttgcgcacgg ttatgtggac aaaatacctg gttacccagg ccgtgccggc 6660

acgttaaccg ggctgcatcc gatgcaagtg tgtcgctgtc gagtacaggt gttggccgtt 6720

gtgcccggac gggagatcga gtcccgtgat cggatcgcca agatatgcga caattttgct 6780

attagcaaag tagcccggga tatggagcag ttgttggcca ccaaaaattt ggagaagcca 6840

ctggagcagc cggagaatgg gtacacctac aaggccacct ggttcatgca gttccgggcg 6900

gtcctgtggc gatcctggct gtcggtgctc aaggaaccac tcctcgtaaa agtgcgactt 6960

attcagacaa cggtgagtgg ttccagtgga aacaaatgat ataacgctta caattcttgg 7020

aaacaaattc gctagatttt agttagaatt gcctgattcc acacccttct tagttttttt 7080

caatgagatg tatagtttat agttttgcag aaaataaata aatttcattt aactcgcgaa 7140

catgttgaag atatgaatat taatgagatg cgagtaacat tttaatttgc agatggttgc 7200

catcttgatt ggcctcatct ttttgggcca acaactcacg caagtgggcg tgatgaatat 7260

caacggagcc atcttcctct tcctgaccaa catgaccttt caaaacgtct ttgccacgat 7320

aaatgtaagt cttgtttaga atacatttgc atattaataa tttactaact ttctaatgaa 7380

tcgatggccg gcctagtctt ctacgtagac ttattgtctt aattaacaat tcggcgcagc 7440

accatggcct gaaataacct ctgaaagagg aacttggtta ggtaccttct gaggcggaaa 7500

gaaccagctg tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg 7560

cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg 7620

ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc 7680

gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca 7740

tggctgacta atttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc 7800

cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggatcga tccaccggtc gccaccatgg 7860

tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg 7920

acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca 7980

agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg 8040

tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc 8100

acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca 8160

aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga 8220

accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc 8280

tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca 8340

tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc 8400

actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc 8460

tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc 8520

tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtaaagcg 8580

gccgcctgca gcttaagacc ggtaagctag cttacgcgtg ctagcgggcc cgttaacttg 8640

tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa 8700

gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat 8760

gtctggatct taattaacca gcgatcgcat cgattcgatt taggtgttca cctcagagct 8820

gccagttttt atgagggagg cccgaagtcg atggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta 8880

accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg cgtcccattc gccattcagg 8940

ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg 9000

aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga 9060

cgttgtaaaa cgacggccag tgagcgcgcg taatacgact cactataggg cgaattggag 9120

ctccaccgcg gtggcggccg ctctagaact agtggatcga tcccccgggc tgcaggaatt 9180

cgatatcaag ctt 9193

<210> 60

<211> 5520

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pRK-GFP

<400> 60

ttcgagctcg cccgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca 60

ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct 120

ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta 180

acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac 240

ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt 300

aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag 360

tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat 420

gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat 480

gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc 540

ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt 600

ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga 660

caccgggacc gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca ttggaacgcg gattccccgt 720

gccaagagtg acgtaagtac cgcctataga gtctataggc ccaccccctt ggcttcgtta 780

gaacgcggct acaattaata cataacctta tgtatcatac acatacgatt taggtgacac 840

tatagaataa catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag gtccaactgc 900

acctcggttc taagcttgcc gccatggact acaaggacga cgatgacaag gggtcgagcg 960

tcgacgtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg 1020

acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct 1080

acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca 1140

ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga 1200

agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct 1260

tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc 1320

tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc 1380

acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga 1440

acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg 1500

ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc 1560

actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg 1620

tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagg 1680

cggccgcgac ctgcaggcgc agaactggta ggtatggaag atccctcgag gatccccggg 1740

taccgagctc gaattcatag gtaggtaaat cgatggccgc catggcccaa cttgtttatt 1800

gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt 1860

ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg 1920

atcgggaatt aattcggcgc agcaccatgg cctgaaataa cctctgaaag aggaacttgg 1980

ttaggtacct tctgaggcgg aaagaaccag ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga 2040

aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca 2100

accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc 2160

aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc 2220

agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag 2280

gccgcctcgg cctgtgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc 2340

ttttgcaaaa agctgttaac agcttggcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg 2400

aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccccttc gccacctggc 2460

gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgtagc ctgaatggcg 2520

aatggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatac 2580

gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtac gggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt 2640

tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt 2700

cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc 2760

tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg atttgggtga 2820

tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc 2880

cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggg 2940

ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct 3000

gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa ttttatggtg 3060

cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc caactccgct atcgctacgt 3120

gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct 3180

tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt 3240

cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagt attcttgaag acgaaagggc 3300

ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca 3360

ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat 3420

tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa 3480

aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt 3540

tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag 3600

ttgggtgcac gagtgggtta catggaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt 3660

tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg 3720

gtattatccc gtgatgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag 3780

aatgacttgg ttgagtactc accagccaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta 3840

agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg 3900

acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta 3960

actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac 4020

accacgatgc cagcagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt 4080

actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca 4140

cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag 4200

cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta 4260

gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag 4320

ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt 4380

tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 4440

aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 4500

gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 4560

acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 4620

tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag 4680

ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 4740

atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 4800

agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 4860

cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gcattgagaa 4920

agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 4980

acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 5040

gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 5100

ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg gtggcctttt 5160

gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt 5220

gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag 5280

gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa 5340

tccagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat 5400

gtgagttacc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg 5460

ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac 5520

Claims

1.重组单纯疱疹病毒1型(HSV-1)毒株H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统，其特征在于，所述H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统是一个重组单纯疱疹病毒1型(HSV-1)毒株H129，包括两个或两个以上的荧光表达盒，插入到H129基因组的不同位点，其中每个荧光表达盒包含至少两个拷贝的荧光蛋白编码序列，所述荧光蛋白编码序列前后排列，和至少一个连接子编码序列，两个荧光蛋白编码序列之间插入所述至少一个连接子编码序列,以便荧光蛋白编码序列和连接子编码序列转录成一个转录子；

所述荧光表达盒中的至少两个拷贝的荧光蛋白编码序列中一个拷贝编码膜结合荧光蛋白，另一个拷贝编码不与膜结合的荧光蛋白，所述膜结合荧光蛋白编码序列和不与膜结合的荧光蛋白的编码序列表达相同的荧光蛋白；

所述连接子编码序列编码一个连接子多肽；所述连接子多肽含有至少两个相邻氨基酸，他们间的肽键形成是非常低效的；所述至少两个相邻氨基酸是甘氨酸和脯氨酸；

因此，所述转录子被翻译时，由于所述连接子多肽阻碍肽键的形成，能够计量地产生膜结合荧光蛋白和荧光蛋白。

2.根据权利要求1所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统，其特征在于，所述荧光表达盒包括一个启动子；所述启动子调节所述荧光蛋白编码序列和连接子序列的转录。

3.根据权利要求2所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统，其特征在于，所述启动子在神经元细胞中可操作，包括巨细胞病毒(CMV)启动子,猿猴病毒40(SV40)启动子,人巨细胞病毒最早期/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子，延伸因子1α(EF1a)启动子，酪氨酸羟化酶(TH)启动子，突触蛋白1(Syn1)启动子。

4.根据权利要求1所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统，其特征在于，所述荧光蛋白编码序列编码一个由如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列代表的荧光蛋白，或其变体。

5.根据权利要求1所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统，其特征在于，所述荧光蛋白编码序列编码一个由如SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列代表的膜结合绿色荧光蛋白(mGFP)，或其变体。

6.根据权利要求1所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统，其特征在于，所述连接子编码序列编码一个由如SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列代表的多肽或其变体。

7.根据权利要求1所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统，其特征在于，所述荧光蛋白编码序列和连接子编码序列编码一个如SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列或其变体。

8.根据权利要求1所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统，其特征在于，还含有BAC序列。