CN112771157A - 重组黏液瘤病毒及其用途 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供了经工程化以表达可溶形式的免疫检查点蛋白的重组溶瘤病毒。在某些方面中，溶瘤病毒是例如黏液瘤病毒的可复制型的病毒。还提供了癌症治疗方法，其包括施用表达可溶形式的免疫检查点蛋白的重组溶瘤病毒。

Description

重组黏液瘤病毒及其用途

本申请要求于2018年8月16日提交的美国临时专利申请No.62/718,990、于2018年10月4日提交的美国临时专利申请No.62/741,404、于2018年11月2日提交的美国临时专利申请No.62/754,622、和于2019年3月4日提交的美国临时专利申请No.62/813,375的权益，其各自的全部内容均通过引用并入本文。

本发明在由美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助No.5R01CA194090的政府支持下完成的。政府在本发明中具有某些权利。

背景技术

1.领域

本公开内容一般性地涉及分子生物学和医学领域。更特别地，其涉及表达免疫检查点蛋白(例如PD1或TIM3)的溶瘤病毒。

2.相关技术描述

当前用于治疗多种类型癌症的治疗倾向于通过毒害或杀伤癌细胞来发挥作用。不幸地，对癌细胞有毒性的治疗通常也倾向于对健康细胞有毒性。此外，肿瘤的异质性是使对于癌症的有效治疗仍然难寻的主要原因之一。当前的主流治疗(例如化学治疗和放射治疗)倾向于在狭窄的治疗毒性窗内使用。由于肿瘤细胞的类型不同和在其中可施用这些治疗的窗有限，因此这些类型的治疗具有有限的适用性。当前正在开发的现代抗癌治疗试图选择性靶向肿瘤细胞，同时对健康细胞的毒性较小，从而更有可能使健康细胞不受影响。

转移性黑素瘤是5年存活率为16％的侵袭性疾病，并且对大多数标准化学治疗的响应较差。干扰素和白介素2(IL-2)均已由美国食品与药物管理局(Food and DrugAdministration)批准用于黑素瘤治疗。两者均通过刺激抗肿瘤免疫应答来介导其益处。然而，毒性和低应答率显著限制了其使用。在2011年，美国食品与药物管理局(FDA)批准了首个免疫检查点抑制剂伊匹单抗(ipilimumab)，一种完全人免疫球蛋白G1单克隆抗体，其阻断细胞毒性T淋巴细胞抗原(cytotoxic T-lymphocyte antigen，CTLA)-4，并因此阻断PD-1途径用于治疗转移性黑素瘤。程序性细胞死亡蛋白1配体1(PDL1或PD-L1)和PDL2由黑素瘤细胞、T细胞、B细胞和自然杀伤细胞表达的发现导致开发程序性细胞死亡蛋白1(PD1或PD-1)特异性抗体(例如纳武单抗(nivolumab)和派姆单抗(pembrolizumab))。

因此，PD1途径阻断已成为除黑素瘤之外的抗癌药物开发中的主要焦点之一。已报道，除有益于患有肾细胞癌的患者之外，其还有益于患有先前认为对免疫治疗不敏感的肿瘤，包括非小细胞肺癌的患者。然而，由于与这些免疫治疗相关的毒性，仍存在局限性。因此，需要具有高效力和低毒性的最佳平衡的阻断PD1途径的免疫治疗。

已显示癌症治疗中的免疫检查点抑制对于治疗许多不同类型的癌症是有效的。然而，并非所有癌细胞都同样响应。另外，毒性和针对单个检查点抑制剂的抗性的发展也存在问题(Pardoll,2012；Topalian et al.,2015)。需要对免疫检查点抑制剂进行改善以对抗上述缺点。

用于癌症治疗的另一种有前景的治疗方法是使用溶瘤病毒。使用溶瘤病毒本身以及与其他治疗组合的治疗引发直接的肿瘤细胞毒性，并增强针对肿瘤细胞的免疫细胞的活化。溶瘤病毒具有新颖性，因为它们也可被“武装”以表达蛋白质来使其更加有效(Kaufmanet al.,2015)。

最近的工作已通过实验显示出通过对黏液瘤病毒(myxoma virus)进行工程化以表达人PD1检查点分子的胞外部分将溶瘤病毒与免疫检查点抑制剂组合的效力(Bartee etal.,2017)。PD1是T细胞上的膜蛋白，其与肿瘤细胞上的PDL1结合。该相互作用通过PD1触发信号传导，导致对针对肿瘤细胞的T细胞活化的抑制，从而保护肿瘤细胞免受免疫细胞的清除(Pardoll,2012)。在感染肿瘤细胞之后，通过直接注射至表达胞外PD1蛋白的黏液瘤病毒(vPD1)的肿瘤中，肿瘤上PDL1和T细胞上PD1的相互作用在局部被抑制。这是通过胞外PD1蛋白直接与阻断T细胞PD1与PDL1结合的肿瘤细胞PDL1的结合而发生的，导致T细胞免疫激活和抗肿瘤作用。

存在于肿瘤微环境中的另一个主要抑制途径是TIM3检查点，其中由肿瘤细胞表达的多种TIM3配体(包括GAL9、磷脂酰丝氨酸和HMGB1)与抗肿瘤T细胞或NK细胞上的TIM3结合，导致免疫细胞耗竭。当前克服该途径的方法包括全身性注射阻断TIM3-GAL9相互作用的抗体；然而，这些全身性治疗昂贵、费时且与低应答率和显著毒性相关。因此，对于抑制免疫检查点的改善方法存在未满足的需求。

发明内容

本公开内容的某些实施方案提供了包含重组溶瘤病毒的方法和组合物，所述重组溶瘤病毒包含一个或更多个表达盒，所述表达盒编码(a)可溶形式的程序性细胞死亡蛋白1(PD1或PD-1)，和任选(b)白介素2(IL-2)或白介素12(IL-12)或白介素15(IL-15)，其中所述病毒是可复制型的。在一些方面中，可溶性PD1包含人PD1的胞外区。在一些特别的方面中，人PD1的胞外区包含SEQ ID NO:4。在一些方面中，人PD1的胞外区包含与SEQ ID NO:4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些特别的方面中，人IL-12序列包含SEQ ID NO:7和8。在一些方面中，人IL-12包含与SEQ ID NO:7和8具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些特别的方面中，人IL-2序列包含SEQ ID NO:6。在一些方面中，人IL-2包含与SEQ ID NO:6具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在某些另一些方面中，提供了可溶性PD1的突变型或突变形式，以通过降低抗PD1抗体与可溶性PD1的抑制性结合来增强用抗PD1抗体的组合治疗的作用。在一些特别的方面中，突变型人可溶性PD1序列包含SEQ ID NO:5。在一些方面中，人PD1的胞外区包含与SEQ ID NO:5具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

本公开内容的某些实施方案提供了包含重组溶瘤病毒的方法和组合物，所述重组溶瘤病毒包含编码突变型可溶形式的PD1的表达盒，其中所述病毒是可复制型的。在一些方面中，突变型可溶性PD1包含人PD1的胞外区。在一些特别的方面中，人PD1的胞外区包含SEQID NO:5。在一些方面中，人PD1的胞外区包含与SEQ ID NO:5具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

在某些方面中，IL-12与跨膜结构域融合。例如，在一些方面中，IL-12可与CD28、CD8a或CD137的跨膜结构域融合。在另一方面中，IL-12可与和膜锚定蛋白结合的多肽融合。用于与IL-12融合的跨膜蛋白及其方法在例如Cheng et al.2008(通过引用并入本文)中提供。在一些具体的方面中，IL-12与由SEQ ID NO:12编码的跨膜结构域融合。在一些方面中，溶瘤病毒由与SEQ ID NO:13具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列编码。

本公开内容的另一些实施方案提供了包含一个或更多个表达盒的重组溶瘤病毒，所述表达盒编码可溶形式的T细胞免疫球蛋白及含黏蛋白结构域3(TIM3)。在某些方面中，可溶性TIM3包含鼠或人TIM3的胞外区。

在另一个实施方案中，提供了在有此需要的对象中治疗疾病的方法，所述方法包括：(a)测试对象的GAL9过表达；以及(b)向具有提高的GAL9表达的对象施用治疗有效量的溶瘤病毒或重组溶瘤病毒，其包含编码可溶形式TIM3的一个或更多个表达盒。在某些方面中，对象患有表现出提高的GAL9表达的癌症。

在某些方面中，所述一个或更多个表达盒可在病毒启动子的控制下。在一些方面中，病毒启动子是合成的早期/晚期痘病毒(poxvirus)启动子。例如，在一些方面中，合成的早期/晚期痘病毒启动子与

的序列具有约80％、85％、90％、95％或100％的同一性。

在一些方面中，病毒选自黏液瘤病毒、呼肠孤病毒(reovirus)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、麻疹病毒(measlesvirus)、逆转录病毒(retrovirus)、痘病毒、弹状病毒(rhabdovirus)、小核糖核酸病毒(picornavirus)、柯萨奇病毒(coxsackie virus)和细小病毒(parvovirus)。在一些特别的方面中，溶瘤病毒是黏液瘤病毒。在一些方面中，将可溶形式的TIM3或PD1的胞外区(例如突变型PD1)和/或IL-12或IL-2的一个或更多个表达盒在病毒M153R开放阅读框处并入黏液瘤基因组中。例如，在一些方面中，将胞外IL-12表达构建体插入病毒M153R的位置。在另一些方面中，将PD1(胞外结构域)表达构建体插入病毒M135之后或病毒M135与M136之间。在另一些方面中，可将PD1和IL-12二者的表达构建体插入病毒M153R的位置或病毒M135与M136之间。

在另一个实施方案中，提供了本文中提供的溶瘤病毒的药物组合物，所述药物组合物包含重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒(例如上述实施方案的重组溶瘤病毒)包含编码可溶形式的PD1(例如突变型PDl)以及任选IL-12或IL-2的一个或更多个表达盒。在另一些方面中，重组溶瘤病毒包含编码可溶形式的TIM3的一个或更多个表达盒。

在另一个实施方案中，提供了在有此需要的对象中治疗疾病的方法，所述方法包括施用有效量的本文中提供的药物组合物，所述药物组合物包含重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒包含编码可溶形式的TIM3或可溶形式的PD1(例如突变型PD1)以及任选IL-12或IL-2的一个或更多个表达盒。

在一些方面中，疾病是癌症，例如转移性癌症。在某些方面中，癌症具有提高的程序性死亡配体1(PDL1)的表达。因此，在一些方面中，用于根据一些实施方案治疗的对象是已确定患有表达PDL1的癌症的对象。在另一些方面中，癌症不具有提高的PDL1表达。例如，癌症可以是黑素瘤、肾癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、脑癌、白血病、前列腺癌、膀胱癌和卵巢癌。特别地，癌症是黑素瘤。在一些方面中，黑素瘤是转移性黑素瘤。在一些方面中，癌症已转移至肺。

在某些方面中，溶瘤病毒是动脉内、静脉内、腹膜内或瘤内施用的。在一些方面中，溶瘤病毒被施用两次或更多次。

在一些方面中，溶瘤病毒的施用导致表达可溶形式的TIM3或可溶性PD1(例如突变型PD1)，例如约20kDa至40kDa，例如约30kDa的蛋白质。在一些特别的方面中，表达的可溶性PD1(例如突变型PD1)被糖基化。在某些方面中，可溶性PD1(例如突变型PD1)的表达在施用之后长期持续存在，例如在施用之后持续至少3至5天，特别地至少6至14天。在一些特别的方面中，可溶性PD1的表达基本上定位于所治疗的对象中的肿瘤。

在一些特别的方面中，溶瘤病毒的施用不导致脱发，或至多导致轻微水平的脱发。

在一些方面中，治疗方法还包括向对象施用至少第二抗癌治疗。在一些方面中，第二抗癌治疗与重组病毒同时或依次施用。例如，第二抗癌治疗可以是免疫调节剂。在另一些方面中，第二抗癌治疗选自化学治疗、免疫治疗、放射治疗、基因治疗、外科手术、激素治疗、抗血管生成治疗或细胞因子治疗。在一些方面中，第二抗癌治疗包含施用T细胞，例如CD8⁺T细胞(例如，CD25⁺/CD69^hiCD8⁺T细胞)。在某些方面中，免疫治疗是免疫检查点抑制剂治疗。在一些具体的方面中，免疫检查点抑制剂治疗包含用针对PD1、PDL1或CTLA4的抗体治疗。在一些具体的方面中，抗体是派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、度伐单抗或伊匹单抗。在一个优选的方面中，治疗方法包括用针对PD1的抗体治疗。在一个特别优选的方面中，治疗包含用派姆单抗治疗。

在另一个实施方案中，本公开内容提供了在有此需要的对象中治疗疾病的方法，所述方法包括：(a)测试对象的PDL1过表达；以及(b)向具有提高的PDL1表达的对象施用治疗有效量的本文中提供的溶瘤病毒，所述溶瘤病毒包含重组溶瘤病毒，其包含编码可溶性PD1(例如突变型PD1)的表达盒。

在一些方面中，疾病是癌症，例如转移性癌症。在某些方面中，癌症具有提高的程序性死亡配体1(PDL1)的表达。在另一些方面中，癌症不具有提高的PDL1表达。例如，癌症是黑素瘤、肾癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、脑癌、白血病、前列腺癌、膀胱癌和卵巢癌。特别地，癌症是黑素瘤。在一些方面中，黑素瘤是转移性黑素瘤。在一些方面中，癌症已转移至肺。

在某些方面中，溶瘤病毒是动脉内、静脉内、腹膜内或瘤内施用的。在一些方面中，溶瘤病毒被施用两次或更多次。

在一些方面中，溶瘤病毒的施用导致表达可溶形式的TIM3或可溶性PD1(例如突变型PD1)，例如约20kDa至40kDa，例如约30kDa的蛋白质。在一些特别的方面中，表达的可溶性PD1被糖基化。在某些方面中，可溶性TIM3或可溶性PD1的表达在施用之后长期持续存在，例如在施用之后持续至少3至5天，特别地至少6至14天。在一些特别的方面中，可溶性TIM3或PD1的表达基本上定位于所治疗的对象中的肿瘤。在一些特别的方面中，溶瘤病毒的施用不导致脱发，或至多导致轻微水平的脱发。

在一些方面中，治疗方法还包括向对象施用至少第二抗癌治疗。在一些方面中，第二抗癌治疗与重组病毒同时或依次施用。例如，第二抗癌治疗可以是免疫调节剂。在另一些方面中，第二抗癌治疗是化学治疗、免疫治疗、放射治疗、基因治疗、外科手术、激素治疗、抗血管生成治疗或细胞因子治疗。在一些方面中，第二抗癌治疗包含施用T细胞，例如CD8⁺T细胞(例如，CD25⁺/CD69^hiCD8⁺T细胞)。40。在一些方面中，免疫治疗是免疫检查点抑制剂治疗。在一些具体的方面中，免疫检查点抑制剂治疗包含用针对PD1、PDL1或CTLA4的抗体治疗。在一些具体的方面中，抗体是派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、度伐单抗或伊匹单抗。

如本文中使用的“基本上不含”就指定组分而言在本文中用于意指该指定组分中的任一者均未被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何非预期的污染导致的指定组分的总量远低于0.05％。最优选的是其中用标准分析方法不能检测到指定组分的量的组合物。

如本文在说明书中所用的，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或更多个/种。如本文在权利要求书中所用的，当与词语“包含/包括”联合使用时，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或多于一个/种。

除非明确地指出仅指替代方案或者替代方案相互排斥，否则权利要求书中术语“或/或者”的使用用于意指“和/或”，但是本公开内容支持指仅替代方案和“和/或”的定义。如本文中使用的“另一”可意指至少第二个/种或更多个/种。

贯穿本申请中，术语“约/大约”用于表示值包括用于装置、用来确定所述值的方法的固有误差变异，或者所述研究对象之间存在的变异。

根据以下详细描述，本公开内容的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应理解，详细描述和具体实例尽管指出了本公开内容的一些优选实施方案但是仅以举例说明的方式给出，因为通过该详细描述，在本公开内容的精神和范围内的多个变化和修改对于本领域技术人员而言将是明显的。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括以进一步示出本公开内容的某些方面。通过参照这些附图中的一幅或更多幅并结合本文中给出的具体实施方案的详细描述可更好地理解本公开内容。

图1-重组病毒基因组结构示意图。

图2-vPD1-IL2在皮下B16F10(B16F10PD1L-KO)对侧异种移植模型中的效力研究。

图3-vPD1-IL12在皮下B16F10(B16F10PD1L-KO)对侧异种移植模型中的效力研究。

图4-vPD1-IL15在皮下B16F10(B16F10PD1L-KO)对侧异种移植模型中的效力研究。

图5-vPD1-IL18在皮下B16F10(B16F10PD1L-KO)对侧异种移植模型中的效力研究。

图6-体内SC对侧模型。起始肿瘤尺寸。

图7-体内SC对侧模型。示出了处理结果。研究表明，vPD1/IL12构建体优于其他受测构建体。

图8-PD-1胞外域中C’D环的序列比对。人PD-1(hPD-1)的二级结构元件在比对的顶部示出，而鼠PD-1(mPD-1)的二级结构元件在底部示出。

图9-描绘使用可溶性TIM3黏液瘤病毒的治疗的示意图。

图10：MYXV治疗诱导CD8+T细胞和NK细胞上的TIM3。病毒处理起始之后六天，在指定的免疫亚组上分析TIM3表达。

图11A至11C：TIM3阻断改善黑素瘤的MYXV处理。SQ B16/F10肿瘤按指示进行处理。(A)肿瘤体积占起始体积的百分比。用白色圆圈标记对可见肿瘤的完全根除。(B)动物的总体存活。(C)在动物中观察到的脱发的实例。

图12A至12D：vTIM3从受感染细胞中分泌可溶性TIM3。(A)vGFP和vTIM3的基因组结构示意图。(B)在B16/F10细胞中产生新病毒。(C)在感染之后24小时分析细胞生存力的MTT测定。(D)TIM3转基因的表达。

图13A至13C：vTIM3重复了具有降低毒性的组合治疗的效力。(A)肿瘤体积占起始体积的百分比。用白色圆圈标记对可见肿瘤的完全根除。(B)动物的总体存活。(C)在用指示治疗处理的动物中观察到的平均脱发评分。

图14A至14B：TIM3中突变的产生。(A)对TIM3转基因所提出的突变示意图。(B)从新产生的重组vTIM3突变体病毒中表达突变型TIM3。应注意，由于糖基化的损失，GAL9突变体以较低的MW跑出。

图15A至15C：(A)描述小鼠研究的示意图。(B)单个肿瘤随时间推移的增长。(C)总体存活。

图16A至B：vPD1对局部肿瘤有效但对转移性肿瘤无效。在同质小鼠中建立了单一(A)或对侧(B)B16/F10肿瘤。然后用对照病毒(vGFP)或vPD1处理左胁上的肿瘤。不处理对侧模型中右胁上的肿瘤。然后监测单个肿瘤的响应性和总体存活。

图17A至17D：表达可溶性PD1和IL12二者的MYXV对转移性疾病高度有效。(A)表达可溶性PD1和促炎细胞因子二者的病毒的基因组结构。在同质小鼠中建立了对侧LLC肿瘤。然后如指示处理左胁上的肿瘤，并且不处理右胁上的肿瘤。然后监测(B)单个肿瘤的响应性和(C)总体存活。(D)如以上处理的荷有大的、对侧LLC肿瘤的小鼠的图片。

图18A至18C：vPD1/IL12对转移性肺癌有效。(A)在同质小鼠中建立对侧LLC肿瘤。然后如指示处理左胁上的肿瘤，并且不处理右胁上的肿瘤。然后监测(B)单个肿瘤的响应性和(C)总体存活。

图19A至19C：vPD1/IL12对转移性黑素瘤有效。(A)在同质小鼠中建立对侧B16/F10肿瘤。然后如指示处理左胁上的肿瘤，并且不处理右胁上的肿瘤。然后监测(B)单个肿瘤的响应性和(C)总体存活。

图20A至20C：vPD1/IL12对自发转移性乳腺癌有效。(A)在同质小鼠中建立单一4T1肿瘤，并使其建立和转移。然后如指示处理原发性肿瘤。然后监测(B)单个肿瘤的响应性和(C)总体存活。

具体实施方式

存在于肿瘤微环境中的两个主要抑制途径是PD1-PDL1检查点以及TIM3检查点，在PD1-PDL1检查点中，肿瘤细胞上表达的PDL1与抗肿瘤T细胞上的PD1结合，导致T细胞耗竭。当前克服这些途径的方法包括阻断PD1-PDL1或TIM3-GAL9相互作用的抗体全身性注射；然而，这些全身性治疗昂贵、费时且与低应答率和显著毒性相关。

本公开内容的某些实施方案提供了用于在癌症中靶向PD1-PDL1或TIM3途径的组合物和方法。在一些方面中，提供了重组溶瘤病毒，其已被工程化以表达人PD1蛋白或TIM3蛋白的胞外部分以及IL-2或IL-12。在某些方面中，溶瘤病毒是可复制型的病毒，例如黏液瘤病毒。特别地，PD1或TIM3的胞外区以及IL-2或IL-12可由一个或更多个表达盒编码，所述表达盒被整合到病毒基因组的对于复制不必要的区域中。在本研究中，溶瘤病毒提供了可显著改善溶瘤病毒治疗期间结局的肿瘤抑制。

因此，本公开内容的另一些实施方案提供了癌症治疗的方法，其包括施用表达可溶形式的PD1或TIM3以及IL-2或IL-12的重组溶瘤病毒，还提供了。因此，本公开内容的一些方面提供了方法和组合物，其用于与细胞因子治疗组合的靶向PD1-PDL1或TIM3-GAL9途径的治疗，具有低毒性和高应答率。

I.定义

本文中使用的术语“溶瘤病毒”是指这样的病毒：其能够在体外或体内在癌细胞或过度增殖细胞中选择性地复制，并减慢癌细胞或过度增殖细胞的生长或者诱导癌细胞或过度增殖细胞的死亡，同时对正常细胞不具有影响或具有最小的影响。示例性溶瘤病毒包括水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)、新城疫病毒(NDV)、单纯疱疹病毒(HSV)、呼肠孤病毒、麻疹病毒、逆转录病毒、流感病毒(influenza virus)、辛比斯病毒(Sinbis virus)、痘苗病毒(vaccinia virus)和腺病毒。

“启动子”是控制序列，其是核酸序列的在此控制转录的起始和速率的区域。其可包含调节蛋白和分子可在此结合的遗传元件(例如RNA聚合酶和其他转录因子)，以起始核酸序列的特异性转录。短语“可操作地定位”、“可操作地连接”、“在控制下”和“在转录控制下”意指启动子相对于核酸序列处于正确的功能位置和/或取向，以控制该序列的转录起始和/或表达。

术语“先天免疫”或“先天免疫应答”是指在暴露于特定环境抗原(例如微生物或大分子等)之前或独立于此而存在的免疫和非免疫二者的宿主防御库(repertoire of hostdefense)。例如，对抗原的第一宿主免疫应答涉及先天免疫系统。

本文中使用的术语“免疫原”或“抗原”是指当引入对象中时被免疫系统识别并能够引发免疫应答的物质。在某些实施方案中，产生的免疫应答是先天细胞免疫应答，并且本公开内容的重组溶瘤病毒能够抑制或降低先天细胞免疫应答。

本文中使用的短语“有效量”是指足以提供足够高的浓度以对其接受者赋予有益作用的剂量。任何特定对象的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的疾病；疾病的严重程度；具体化合物的活性；施用途径；化合物的清除率；治疗持续时间；与化合物组合或同时使用的药物；对象的年龄、体重、性别、饮食和总体健康状况；以及医学领域和科学中公知的类似因素。

本文中使用的术语“感染复数(multiplicity of infection，MOI)”意指每个细胞添加的感染性病毒颗粒的数量。

II.溶瘤病毒

A.溶瘤病毒平台

在一个方面中，本公开内容一般性地涉及重组、可复制型的溶瘤病毒。在一个实施方案中，提供了具有编码PD1或TIM3的异源性核酸序列的重组溶瘤病毒。可根据本公开内容的方法施用的溶瘤病毒包括但不限于腺病毒(例如，Delta-24、Delta-24-RGD、ICOVIR-5、ICOVIR-7、Onyx-015、ColoAd1、H101、AD5/3-D24-GMCSF)、呼肠孤病毒、单纯疱疹病毒(HSV；OncoVEX GMCSF)、新城疫病毒、麻疹病毒、逆转录病毒(例如流感病毒)、痘病毒(例如痘苗病毒，包括Copenhagen毒株、Western Reserve毒株、Wyeth毒株)、黏液瘤病毒、弹状病毒(例如水泡性口炎病毒(VSV))、小核糖核酸病毒(例如塞内加谷病毒(Seneca Valley virus)；SVV-001)、柯萨奇病毒和细小病毒。

在一个实施方案中，重组溶瘤病毒包含黏液瘤病毒。黏液瘤病毒(MYVX)是痘病毒科(Poxviridae family)的成员以及野兔痘病毒属(genus Leporipoxvirus)的原型。它仅对欧洲兔(穴兔(Oryctolagus cuniculus))致病，在其中引起称为黏液瘤病(myxomatosis)的致死性疾病，并且对于北美的两个物种，沙漠棉尾兔(Sylvilagus audubonni)和纳氏棉尾兔(Sylvilagus nuttalli)，在其中引起不那么严重的疾病。黏液瘤病毒仅在宿主细胞的胞质中复制，并且其基因组编码171个开放阅读框(Smallwood et al.,2010)。许多这些基因编码可干扰或调节宿主防御机制的蛋白质，并且数个在临床环境中显示出希望。

像痘病毒科的其他成员一样，黏液瘤病毒基因组由单个双链DNA(doublestranded DNA，dsDNA)组成，其中心部分编码在痘病毒属成员中保守的约100个必需基因。其余基因(包括映射在末端反向重复内的12个基因中每一个的两个拷贝)编码干扰和调节宿主防御机制的蛋白质。许多这些蛋白质与宿主细胞基因共享序列相似性，表明存在共进化途径(Johnston and McFadden,2003)。例如，一些被称为病毒编码受体(viroceptor)的蛋白质被分泌出并能够结合特异性配体，例如TNF。被称为病毒因子(virokine)的其他蛋白质也被分泌出并模仿宿主免疫抑制剂，而病毒缓和剂(viromitigator)则作为抑制细胞凋亡的宿主范围因子发挥作用(Johnston and McFadden,2003；Kerr and McFadden,2002)。这些特征使黏液瘤病毒在许多治疗环境中具有可能的实用性。黏液瘤病毒编码的一种免疫调节蛋白Serp-1处于针对急性不稳定型冠脉综合征(例如，不稳定型心绞痛和小型心脏病发作)的临床试验中。黏液瘤病毒的M-T7蛋白是一种抑制兔γ干扰素的分泌型糖蛋白，其在球囊血管成形术损伤动脉的兔模型中也已显示出抑制炎症应答(Liu et al.,2000)，并且多种其他免疫调节蛋白可被开发为抗炎或抗免疫治疗剂是可能的。

已显示黏液瘤病毒有成效地感染源自不同组织组的多种人癌细胞系(Sypula etal.,2004)，并且因此具有开发为可用于针对多种癌症治疗的溶瘤病毒的潜力。野生型黏液瘤病毒可选择性感染并杀伤细胞，包括人细胞，所述细胞具有先天性抗病毒应答缺陷，例如如在申请PCT/CA2004/000341(其通过引用完全并入本文)中所述对干扰素无应答的细胞。此外，黏液瘤病毒擅长逃避和干扰宿主的免疫应答，并可充当免疫调节蛋白的来源，其可在多种临床环境中用作治疗剂(Lucas and McFadden,2004)。另外，尽管黏液瘤病毒在人中不具有传染性，但是它能够有成效地感染许多人癌细胞系而非正常人细胞，并且已显示出在人胶质瘤的小鼠模型中提高存活时间。这些特征表明，可证明黏液瘤病毒在多种临床环境中是可行的治疗剂，包括作为抗炎或抗免疫治疗，或者作为溶瘤剂。

黏液瘤病毒已针对多种恶性肿瘤(包括骨髓瘤、黑素瘤、成胶质细胞瘤、胰腺癌等)建立了溶瘤潜力。认为该病毒通过两种不同的机制表现出抗肿瘤作用。第一，病毒直接感染并杀伤肿瘤细胞。第二，肿瘤细胞的病毒感染诱导继发性抗肿瘤免疫应答。尽管这些机制的组合在减积(debulk)原发性肿瘤上是有效的，但由于肿瘤微环境内的免疫抑制，通常无法产生长期治愈。

本公开内容的黏液瘤病毒可被减毒以增强抗肿瘤活性。例如，黏液瘤病毒可被遗传修饰以使一个或更多个基因失活。特别地，不表达功能性M135R的黏液瘤病毒可用于治疗具有先天抗病毒应答缺陷的细胞，包括用于溶瘤研究，因为该病毒为溶瘤病毒治疗提供了更安全的替代方法，因为对于接受治疗的患者不应需要不寻常的遏制策略(美国专利申请No.20090035276，其通过引用并入本文)。在某些方面中，黏液瘤病毒是黏液瘤病毒的减毒株，例如SG33毒株(美国专利No.8613915，其通过引用并入本文)。可根据本公开内容使用的减毒的黏液瘤病毒可从有毒性的野生型黏液瘤病毒中获得，尤其是通过以下一个或更多个基因的缺失来获得：M151R、M152R、M153R、M154L、M156R和M001R，并且优选通过另外的以下一个或更多个基因的缺失来获得：M008.1R、M008R、M007R、M006R、M005R、M004.1R、M004R、M003.2R、M003.1R和M002R。

黏液瘤病毒可在许多细胞系中繁殖，包括黏附细胞和悬浮培养物，并且仅需最小的纯化。例如，黏液瘤病毒可在数种细胞系中生长，包括RK13(兔肾上皮)细胞、BHK-21(小仓鼠肾)细胞、BGMK(水牛绿猴肾，Buffalo green monkey kidney)细胞、Vero(非洲绿猴肾上皮)细胞、BSC-40(非洲绿猴肾)细胞和CV-1细胞(非洲绿猴肾成纤维细胞)。仅需最小的纯化来提供适用于体外和体内工作二者的储备液。关于繁殖、纯化和定量黏液瘤病毒储备液的方案是本领域已知的(Smallwood et al.,2010，其通过引用并入本文)。

B.重组溶瘤病毒

重组病毒可通过本领域已知的操作构建以产生重组病毒。将编码PD1(例如突变型PD1)或TIM3的表达盒在对于病毒复制非必需的区域插入溶瘤病毒的基因组中。例如，表达盒可在基因间区整合到黏液瘤病毒中，例如在M135和M136开放阅读框之间。重组病毒可包含表达盒，所述表达盒包含与SEQ ID NO:3所示的人PD1胞外部分的核苷酸序列(例如，核苷酸序列的整个长度)具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的核苷酸序列。可将SEQ IDNO:3的核苷酸序列例如通过密码子优化来优化用于在重组病毒中表达。表达盒可编码可溶性TIM3(SEQ ID NO:11)或者与SEQ ID NO:11具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。

同源重组(homologous recombination，HR)，也称为一般重组，在所有生命形式中使用的遗传重组的一种类型，其中核苷酸序列在两条相似或相同的DNA链之间交换。自20世纪80年代中期以来，该技术已成为用于哺乳动物细胞中基因组工程化的标准方法。过程涉及物理断裂和最终重新结合DNA的数个步骤。该过程最广泛地用于修复DNA中潜在致命的双链断裂。另外，同源重组在减数分裂期间产生DNA序列的新组合，真核生物通过该过程制造出如精子和卵子的生殖细胞。这些DNA的新组合代表了后代的遗传变异，这使种群随时间推移在进化上适应变化的环境条件。同源重组还用于水平基因转移，以在细菌和病毒的不同株以及物种之间交换遗传物质。同源重组还用作分子生物学中用于将遗传变化引入靶生物体内的技术。

包含在可用于本公开内容的载体中的表达盒优选包含(以5’至3’方向)与蛋白质编码序列可操作地连接的真核转录启动子。启动子的非限制性实例包括早期或晚期病毒启动子，例如，SV40早期或晚期启动子、巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)即早期启动子、劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV)早期启动子；真核细胞启动子，例如，如β肌动蛋白启动子(Ng,1989；Quitsche et al.,1989)、GADPH启动子(Alexander et al.,1988,Ercolani et al.,1988)、金属硫蛋白启动子(Karin et al.,1989；Richards et al.,1984)；以及级联响应元件启动子(concatenated response element promoter)，例如环化AMP响应元件启动子(cre)、血清响应元件启动子(sre)、佛波醇酯启动子(TPA)和最小的TATA框附近的响应元件启动子(tre)。也可使用人生长激素启动子序列(例如，Genbank登录no.X05244第283至341位核苷酸中所述的人生长激素最小启动子)或小鼠乳腺肿瘤启动子(可从ATCC，目录号ATCC 45007获得)。一个具体的实例可以是合成的早期/晚期(sE/L)痘病毒启动子(参见，例如，SEQ ID NO:10的构建体的启动子)。

将表达盒引入细胞，然后将其用未经修饰的溶瘤病毒感染以产生重组病毒。如本文中所述的或将为本领域普通技术人员已知的，表达盒向细胞中的引入可使用用于细胞转化的核酸递送的任何合适的方法。这样的方法包括但不限于：直接递送DNA，例如通过离体转染(Wilson et al.,1989,Nabel et al,1989)，通过注射(美国专利No.5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，其各自通过引用并入本文)，包括显微注射(Harland and Weintraub,1985；美国专利No.5,789,215，其通过引用并入本文)；通过电穿孔(美国专利No.5,384,253，其通过引用并入本文；Tur-Kaspa et al.,1986；Potter et al.,1984)；通过磷酸钙沉淀(Graham andVan Der Eb,1973；Chen and Okayama,1987；Rippe et al.,1990)；通过使用DEAE-右旋糖酐随后使用聚乙二醇(Gopal,1985)；通过直接声波加载(Fechheimer et al.,1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau and Sene,1982；Fraley et al.,1979；Nicolau et al.,1987；Wong et al.,1980；Kaneda et al.,1989；Kato et al.,1991)和受体介导的转染(Wuand Wu,1987；Wu and Wu,1988)；通过微粒轰击(PCT申请No.WO 94/09699和95/06128；美国专利No.5,610,042、5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，并且其各自通过引用并入本文)；通过与碳化硅纤维一起搅拌(Kaeppler et al.,1990；美国专利No.5,302,523和5,464,765，其各自通过引用并入本文)；通过农杆菌(Agrobacterium)介导的转化(美国专利No.5,591,616和5,563,055，其各自通过引用并入本文)；通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus et al.,1985)，以及这样的方法的任何组合。通过应用例如这样的技术，可稳定或瞬时转化一种或更多种细胞器、一种或更多种细胞、一种或更多种组织或一种或更多种生物体。

然后例如通过可选择的标志物从细胞中纯化重组病毒。这样的标志物将赋予细胞以可鉴定的变化，允许容易地鉴定包含表达载体的细胞。通常，选择标志物是赋予允许选择的特性的标志物。阳性选择标志物是其中标志物的存在允许其选择的标志物，而阴性选择标志物是其中其存在阻止其选择的标志物。阳性选择标志物的一个实例是药物抗性标志物。通常包含药物选择标志物有助于转化体的克隆和鉴定，例如赋予针对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素(zeocin)和组氨醇之抗性的基因是有用的选择标志物。除赋予允许基于条件实施来区分转化体之表型的标志物之外，还考虑了其他类型的标志物，包括可筛选标志物，例如GFP，其基础是比色分析。或者，可利用作为阴性选择标志物的可筛选酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。认为使用的标志物不重要，只要其能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。例如，重组溶瘤病毒可以是未经标记的或表达荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、番茄红(tdRed)或其他荧光蛋白。选择标志物和可筛选标志物的另外的实例是本领域技术人员公知的。

在Liu et al.(2009)J.Virology 83:5933-5938中已描述了表达番茄红荧光的转基因(tdTr)，其在体外和体内用作黏液瘤复制的荧光标志物。Liu观察到，表达与tdTr融合的IL-15的黏病毒(myxovirus)(vMyx-IL-15-tdTr)显著减毒，并且未能在兔中诱导致死的黏液瘤病。该构建体分泌IL-15并支持正常病毒复制。因此，Liu得出结论，vMyx-IL-15-tdTr是对于溶瘤病毒治疗的体内动物研究的安全候选物，并且tdTr是用于重组黏病毒的合适标志物。

如果需要，可使用本领域已知的方法，例如使用基于Flp重组酶或基于Cre-lox重组系统从病毒转座子中切除一种或更多种遗传元件，例如表达荧光标志物的转基因。

C.PD1

程序性细胞死亡蛋白1，也称为PD-1和CD279(分化簇279)，是一种在细胞表面发现的蛋白质，具有通过抑制T细胞炎性活动来下调免疫系统并促进自我耐受以调节免疫系统对人体细胞应答的作用。这阻止了自身免疫病，但其也可阻止免疫系统杀伤癌细胞。

人PD-1的胞外结构域的氨基酸序列见于Uniprot登录号Q15116，SEQ ID NO:4，并且长度为168个氨基酸，其包含20个氨基酸的信号序列，所述序列可被不同的信号序列替代、或当不需要时从本公开内容的PD-1序列中删除以指导分泌。

PD-1是免疫检查点，并通过两种机制针对自身免疫提供保护。第一，它促进淋巴结中抗原特异性T细胞的凋亡(程序性细胞死亡)。第二，它降低调节性T细胞(抗炎，抑制性T细胞)的凋亡。PD-1抑制剂是阻断PD-1、激活免疫系统来攻击肿瘤的新型药物，并且用于治疗某些类型的癌症。

人中的PD-1蛋白由PDCD1基因编码。PD-1是一种细胞表面受体，其属于免疫球蛋白超家族并且在T细胞和祖B(pro-B)细胞上表达。PD-1结合两种配体，PD-L1和PD-L2。PD-1是268个氨基酸的I型膜蛋白。PD-1是扩展的CD28/CTLA-4家族T细胞调节剂的成员。该蛋白质的结构包含胞外IgV结构域，随后是跨膜区和胞内尾。胞内尾包含定位于基于免疫受体酪氨酸的抑制基序和基于免疫受体酪氨酸的开关基序中的两个磷酸化位点，这表明PD-1负调节T细胞受体TCR信号。这与配体结合之后SHP-1和SHP-2磷酸酶与PD-1的胞质尾的结合相一致。另外，PD-1连接上调了E3-泛素连接酶CBL-b和c-CBL，这触发了T细胞受体下调。PD-1在活化的T细胞、B细胞和巨噬细胞表面表达，表明与CTLA-4相比，PD-1更广泛地负调节免疫应答。

PD-1具有两种配体，PD-L1和PD-L2，它们是B7家族的成员。PD-L1蛋白在响应LPS和GM-CSF处理时在巨噬细胞和树突细胞(DC)上上调，并且在TCR和B细胞受体信号传导后，在T细胞和B细胞上上调，而在静息小鼠中，PD-L1 mRNA可在心、肺、胸腺、脾和肾中检测到。用IFN-γ处理之后，PD-L1在几乎所有鼠肿瘤细胞系中表达，包括PA1骨髓瘤、P815肥大细胞瘤和B16黑素瘤。PD-L2的表达受到更多限制，并且主要由DC和一些肿瘤系表达。

数条证据表明PD-1及其配体负调节免疫应答。已显示，PD-1敲除小鼠分别在C57BL/6和BALB/c背景下发生狼疮样肾小球肾炎和扩张型心肌病。在体外，用PD-L1-Ig处理抗CD3活化的T细胞导致降低的T细胞增殖和IFN-γ分泌。IFN-γ是促进T细胞炎性活动的关键促炎细胞因子之一。T细胞增殖的降低也与IL-2分泌减弱相关，并且这些数据共同表明PD-1负调节T细胞应答。

使用PD-L1转染的DC和表达PD-1转基因(Tg)CD4⁺和CD8⁺T细胞进行的实验表明，CD8⁺T细胞更易受PD-L1的抑制，尽管这可取决于TCR信号传导的强度。Rafi Ahmed小组使用慢性感染的LCMV病毒载体模型，表明PD-1-PD-L1相互作用抑制病毒特异性CD8⁺T细胞的活化、扩增和获得效应功能可通过阻断PD-1-PD-L1相互作用来逆转，这与负调节CD8⁺T细胞应答的作用相一致。

PD-L1在肿瘤细胞上的表达通过PD-1在效应T细胞上的接合来抑制抗肿瘤活性。PD-L1在肿瘤上的表达与食管癌、胰腺癌和其他类型癌症的存活降低相关，这突出了该途径作为免疫治疗的一个靶标。通过其配体PD-L1触发在单核细胞上表达并在单核细胞活化之后上调的PD-1诱导了IL-10产生，这抑制了CD4T细胞功能。

在小鼠中，当注射抗CD3抗体时，在胸腺中诱导了该基因的表达，并且大量胸腺细胞经受凋亡。在BALB/c背景上繁殖的缺乏该基因的小鼠发生扩张型心肌病，并且死于充血性心力衰竭。这些研究表明该基因产物在T细胞功能中也可能是重要的，并有助于预防自身免疫病。CD8+T细胞上PD1的过表达是T细胞耗竭的指标之一(例如，在慢性感染或癌症中)。

PD-L1是PD1的主要配体，其在数种癌症中高度表达，并且因此，PD1在癌症免疫逃避中的作用已得到充分确立。加强免疫系统的靶向PD-1的单克隆抗体正被开发用于治疗癌症。许多肿瘤细胞表达PD-L1，其是免疫抑制性的PD-1配体；抑制PD-1和PD-L1之间的相互作用可增强体外T细胞应答并介导临床前抗肿瘤活性。这称为免疫检查点阻断。

在检查点抑制领域内，使用抗PD1和抗CTLA4治疗剂二者的组合治疗已成为重要的肿瘤治疗。已显示，在治疗多种癌症中，PD1和CTLA4抗体的组合比单独任一种抗体更有效。两种抗体的作用显示并不是多余的。抗CTLA4治疗导致增强的抗原特异性T细胞依赖性免疫反应，而抗PD-1显示重新激活了CD8+T细胞裂解癌细胞的能力。

在临床试验中，尽管由于抗CTLA4治疗引起的毒性水平提高，但已显示出组合治疗在对单一共抑制性阻断无响应的患者中降低肿瘤尺寸是有效的。PD1和CTLA4的组合诱导高至十倍数量的积极渗透肿瘤组织的CD8+T细胞。作者假设，更高水平的CD8+T细胞浸润是由于抗CTLA-4抑制了CD4 T细胞向T调节剂细胞(T regulator cell)的转化，并且用抗PD-1进一步降低了T调节抑制。这种组合促进了对肿瘤的更稳健的炎性应答，降低了癌症的尺寸。最近，FDA在2015年10月批准了使用抗CTLA4(伊匹单抗)和抗PD1(纳武单抗)二者的组合治疗。

使肿瘤接受抗PD1治疗所必需的分子因子和受体仍然未知。PD-L1在癌细胞表面上的表达发挥重要作用。PD-L1阳性肿瘤对组合治疗的响应可能性是两倍。然而，患有PD-L1阴性肿瘤的患者也具有有限的对抗PD1的应答，这表明PD-L1的表达并不是治疗有效性的绝对决定因素。

肿瘤中较高的突变负荷与较大作用抗PD1治疗相关。在临床试验中，罹患癌症(例如黑素瘤、膀胱癌和胃癌)的受益于抗PD1治疗的患者具有比对治疗确实无响应的患者中位数更高的平均突变数。然而，较高的肿瘤负荷与PD-1免疫阻断的临床有效性之间的相关性仍不确定。

D.IL-12

白介素12(IL-12)是由响应于抗原刺激的树突细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和人B成淋巴细胞样细胞(NC-37)天然产生的白介素。IL-12由四个α螺旋的束构成。它是由两个不同的基因IL-12A(p35)和IL-12B(p40)编码的异二聚体细胞因子。在蛋白质合成之后形成了活性异二聚体(称为“p70”)以及p40的同二聚体。人IL-12α亚基的氨基酸序列见于Uniprot登录号P29459，SEQ ID NO:7，并且长度为219个氨基酸，其包含22个氨基酸的信号序列，所述序列可被不同的信号序列替代、或当不需要时从本发明的IL-12α亚基序列中删除以指导分泌。人IL-12β亚基的氨基酸序列见于Uniprot登录号P29460，SEQ ID NO:8，并且长度为328个氨基酸，其包含22个氨基酸的信号序列，所述序列可被不同的信号序列替代、或当不需要时从本发明的IL-12β亚基序列中删除以指导分泌。可将编码IL-12α和β亚基的核苷酸序列例如通过密码子优化来优化用于在重组病毒中表达。

在某些实施方案中，IL-12α亚基和IL-12β亚基可表达为来自单个DNA构建体的融合蛋白。在这样的情况下，仅需要单个信号肽，优选在表达的融合蛋白的N末端。在这样的情况下，可使用柔性接头肽连接IL-12α亚基和IL-12β亚基。合适的接头肽序列是本领域已知的，并且包括例如(GGGS)_n，其中n＝1至4。

IL-12参与初始T细胞向Th1细胞的分化。它被称为T细胞刺激因子，其可刺激T细胞的生长和功能。它刺激从T细胞和自然杀伤(NK)细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，并降低IL-4介导的IFN-γ抑制。产生IL-12的T细胞具有与IL-12活性相关的共受体CD30。

IL-12在自然杀伤细胞和T淋巴细胞的活性中发挥重要作用。IL-12介导NK细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞的细胞毒性活性的增强。IL-2和NK细胞中IL-12的信号转导之间似乎也存在联系。IL-2刺激两种IL-12受体IL-12R-β1和IL-12R-β2的表达，维持NK细胞中参与IL-12信号传导的关键蛋白的表达。IFN-γ的产生和靶细胞的杀伤表明了增强的功能应答。

IL-12也具有抗血管生成活性，这意味着它可阻断新血管的形成。它通过提高干扰素γ的产生来做到这一点，这转而提高了被称为诱导蛋白10(IP-10或CXCL10)的趋化因子的产生。然后IP-10介导了该抗血管生成作用。由于其诱导免疫应答的能力及其抗血管生成活性，因此对测试IL-12作为可能的抗癌药物已产生了兴趣。然而，迄今为止，尚未显示出其在受测肿瘤中具有显著活性。IL-12与银屑病和炎性肠病之间存在可用于治疗的联系。

IL-12与IL-12受体结合，IL-12受体是由IL-12Rβ1和IL-12Rβ2形成的异二聚体受体。认为IL-12R-β2在IL-12功能中发挥关键作用，因为它在活化的T细胞上被发现并且被促进Th1细胞发育的细胞因子刺激以及被促进Th2细胞发育的细胞因子抑制。结合之后，IL-12R-β2变为被酪氨酸磷酸化，并且为激酶Tyk2和Jak2提供结合位点。这些激酶在激活与T细胞和NK细胞中的IL-12信号传导有关联的关键转录因子蛋白(例如STAT4)中是重要的。该途径被称为JAK-STAT途径。

IL-12与自身免疫有关。已显示，向患有自身免疫病的人施用IL-12加重了自身免疫现象。认为这是由于其在诱导Th1免疫应答中的关键作用。相反，小鼠中的IL-12基因敲除或用IL-12特异性抗体对小鼠的治疗改善了该疾病。

白介素12(IL-12)由活化的抗原呈递细胞(树突细胞、巨噬细胞)产生。它促进Th1应答的发展，并且是T细胞和NK细胞产生IFNγ的强力诱导剂。

发现患有卡介苗芽孢杆菌(Bacillus Calmette–Guérin)和肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)感染的儿童在IL-12p40亚基基因内具有大的纯合缺失，排除了通过活化的树突细胞和吞噬细胞表达功能性IL-12p70细胞因子。作为结果，该儿童淋巴细胞的IFNγ产生显著受损。这表明IL-12对于针对胞内细菌(例如分枝杆菌(mycobacteria)和沙门菌(Salmonella))的保护性免疫至关重要。

通过观察到IL-12的受体对于通过淋巴细胞的IFNγ产生是重要的，为该想法提供了支持。来自患有严重特发性分枝杆菌和沙门菌感染的七位无关联患者的T细胞和NK细胞在用IL-12刺激之后无法产生IFNγ。患者在其他方面是健康的。发现他们在IL-12受体β1链中具有突变，导致胞外结构域中的提前终止密码子，从而导致对该细胞因子无响应能力，再次表明了IL-12在宿主防御中的关键作用。

导致慢性黏膜皮肤念珠菌病的缺陷型Th1和Th17免疫应答是由IL-12信号传导途径更下游的突变引起的。该性状被映射到STAT1基因中的突变，这与响应于IL-12或IL-23受体相关的Jak2和Tyk2活性的干扰素-γ、IL-17和IL-22的产生降低相关。

E.IL-2

白介素-2(IL-2)是一种白介素，白介素是免疫系统中的一类细胞因子信号传导分子。它是调节负责免疫的白血细胞(白细胞，通常为淋巴细胞)活性的蛋白质。IL-2是身体针对微生物感染并区分外来(“非自身”)和“自身”的天然应答的一部分。IL-2通过与淋巴细胞表达的IL-2受体结合来介导其作用。人IL-2的氨基酸序列见于Uniprot登录号P60568，SEQID NO:6，并且长度为153个氨基酸，其包含20个氨基酸的信号序列，所述序列可被不同的信号序列替换、或当不需要时从本发明的IL-2序列中删除以指导分泌。可将编码IL-2的核苷酸序列例如通过密码子优化来优化用于在重组病毒中表达。

在一个优选的实施方案中，可用于本发明的IL-2是SEQ ID NO:9的高亲和力变体IL-2氨基酸序列，其包含可被不同的信号序列替换的20个氨基酸的信号序列，并且其还包含C末端His标签。Levin et al.(2012)Nature 484:529-533。如果不需要IL-2的功能，则可删除信号序列和His标签中的任一或二者。

IL-2是细胞因子家族的成员，该家族的每个成员均具有四个α螺旋束；该家族还包含IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21。IL-2通过IL-2受体发出信号，IL-2受体是由三条链(称为α、β和γ)组成的复合体。γ链为所有家族成员所共有。

IL-2受体(IL-2R)α亚基对其配体具有低亲和力，但是具有将IL-2R亲和力提高100倍的能力(当与β和γ亚基结合时)。IL-2R的β和γ亚基的异二聚化对于T细胞中的信号传导至关重要。

IL-2的基因表达调节可处于多个水平或通过不同的方式。检查点之一是通过TCR受体(T淋巴细胞的抗原受体)在识别MHC-肽复合体之后发出信号。然后，来自TCR的信号传导途径经过磷脂酶C(PLC)依赖性途径。PLC激活3种主要的转录因子及其途径：NFAT、NFkB和AP-1。来自CD28的共刺激之后，诱导了IL-2表达和这些途径的最佳激活。

同时，表达了Oct-1。它有助于激活。Oct1在T淋巴细胞中表达，并且Oct2在细胞活化之后被诱导。NFAT有多个家族成员，所有成员都位于胞质中，并且信号传导经过钙调磷酸酶，NFAT被去磷酸化，并且因此易位至细胞核。AP-1是二聚体并且由c-Jun和c-Fos蛋白构成。它与包括NFkB和Oct在内的其他转录因子协同作用。通过CD28共刺激之后，NFkB易位至细胞核。NFkB是异二聚体，在IL-2启动子上有两个结合位点。

IL-2主要通过其对T细胞的直接作用在免疫系统的关键功能(耐受性和免疫性)中具有关键作用。在T细胞成熟的胸腺中，其通过促进某些未成熟T细胞分化为调节性T细胞来预防自身免疫病，所述调节性T细胞抑制在其他情况下致敏以攻击体内正常健康细胞的其他T细胞。当初始T细胞也被抗原刺激时，IL-2还促进T细胞分化为效应T细胞和记忆T细胞，从而帮助身体抵抗感染。它的表达和分泌受到严格调节，并且在增强和减弱免疫应答中作为瞬时正反馈回路和负反馈回路二者的一部分发挥作用。通过其在取决于抗原选择T细胞克隆的数量扩增和功能的T细胞免疫记忆发展中的作用，它在持久的细胞介导的免疫中发挥关键作用。

阿地白介素(aldesleukin)是重组白介素-2的一种形式。它使用重组DNA技术制备，并作为蛋白质治疗剂销售，品牌为Proleukin。它已获得美国食品与药物管理局(FDA)的批准，并在数个欧洲国家中用于以大的间歇剂量治疗癌症(恶性黑素瘤、肾细胞癌)，并已广泛用于连续剂量。

Interking是由深圳海王(Shenzhen Neptunus)出售的在125位残基处具有丝氨酸的重组IL-2。

在美国和全世界使用多种剂量的IL-2。不同剂量的效率和副作用通常是一个分歧点。通常，在美国，受癌症类型、对治疗的响应以及患者总体健康的影响，使用更高的剂量选择。患者通常连续五天进行治疗，每天三次，每次十五分钟。接下来约10天帮助患者在治疗之间恢复。IL-2在住院基础上静脉内递送，以能够适当监测副作用。

较低剂量方案通常涉及在门诊患者的基础上在皮肤下注射IL-2。也可作为替代地在住院基础上1到3天之内给予，类似于化学治疗的递送并且通常包括化学治疗的递送。病灶内IL-2通常用于治疗转运中(in-transit)的黑素瘤转移，并且具有高的完全应答率，并且通常具有良好的耐受性。

IL-2具有狭窄的治疗窗，并且剂量水平通常决定了副作用的严重程度。一些常见的副作用包括类似流感的症状(发热、头痛、肌肉和关节疼痛、疲劳)，恶心/呕吐，皮肤干燥、发痒或出疹，呼吸无力或短促，腹泻，低血压，嗜睡或意识错乱，以及食欲不振。有时会看到更严重和危险的副作用，例如毛细血管渗漏综合征、呼吸问题、严重感染、癫痫、过敏反应、心脏问题或多种其他可能的并发症。

III.治疗性施用

在另一个方面中，本公开内容提供了通过以足以抑制肿瘤细胞生长或杀伤肿瘤细胞的感染复数施用根据本公开内容的重组溶瘤病毒来抑制肿瘤细胞的生长或促进肿瘤细胞的杀伤或治疗癌症(例如黑素瘤)的方法。在某些实施方案中，重组溶瘤病毒被施用多于一次，优选两次、三次或多至10次。

可使用本公开内容的方法治疗的肿瘤细胞或癌症的实例包括乳腺癌，卵巢癌，肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)，黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)，前列腺癌，结肠癌，肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)，骨癌，骨肉瘤，横纹肌肉瘤，平滑肌肉瘤，软骨肉瘤，胰腺癌，皮肤癌，纤维肉瘤，慢性或急性白血病，包括急性淋巴细胞白血病(acutelymphocytic leukemia，ALL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病，淋巴管肉瘤，淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(anaplastic large-cell lymphomas、ALCL)、皮肤T细胞淋巴瘤、结节性小分裂细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、Lennert淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、中心母细胞性/中心细胞性(entroblastic/centrocytic)(cb/cc)滤泡性淋巴瘤癌、B系弥漫性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞淋巴结病(angioimmunoblasticlymphadenopathy，AILD)样T细胞淋巴瘤和基于HIV相关体腔的淋巴瘤(HIV associatedbody cavity based lymphomas))，卡斯尔曼病(castleman’s disease)，卡波西肉瘤，血管内皮瘤，多发性骨髓瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)和其他B细胞淋巴瘤，鼻咽癌，头颈癌，黏液肉瘤，脂肪肉瘤，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，直肠癌，肛门区域癌，胃癌，睾丸癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，外阴癌，移行细胞癌，食管癌，恶性胃泌素瘤，小肠癌，胆管细胞癌，腺癌，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道、阴茎癌，睾丸癌，恶性畸胎瘤，儿童期实体瘤，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾盂癌，恶性脑膜瘤，中枢神经系统(CNS)肿瘤，肿瘤血管生成，脊柱轴肿瘤，垂体腺瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌，环境诱导的癌症，包括由石棉诱导的那些，例如间皮瘤，以及这些癌症的组合。许多癌症过表达免疫检查点蛋白，例如PDL1(PDL1⁺)。无论PDL1状态如何，均可使用本公开内容的方法治疗肿瘤或癌症。

根据本公开内容的溶瘤病毒可局部或全身性施用。例如但不限于，根据本公开内容的溶瘤病毒可通过以下途径施用：血管内(动脉内或静脉内)、瘤内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、经口、肠胃外、鼻内、气管内、经皮、脊柱内、经眼或颅内。

在又一个实施方案中，所述方法涉及肠胃外施用重组溶瘤病毒，优选通过动脉或通过留置医疗装置。重组溶瘤病毒可与免疫治疗剂或免疫调节剂一起施用，例如与肿瘤特异性抗原结合的抗体(例如，嵌合的、人源化的或人单克隆抗体)一起施用。在另一个实施方案中，重组溶瘤病毒治疗可与外科手术(例如，肿瘤切除)、放射治疗、化学治疗或免疫治疗组合，并且可在补充治疗之前、期间或之后施用。

在另一些实施方案中，所述方法涉及用本发明的黏液瘤病毒离体转导细胞，随后向对象施用包含所述细胞的组合物。在某些实施方案中，细胞可以是自体的，即对象自己的细胞。在自体实施方案中，以类似于血浆去除术(apheresis)的过程，可从对象获得细胞，将细胞用本发明的黏液瘤病毒转导并重新施用到对象中。用于将病毒离体递送到细胞中的示例性制剂可包括使用本领域已知的多种转导剂，例如磷酸钙、电穿孔、热休克和多种脂质体制剂(即脂质介导的转染)。如下面所更详细描述的，脂质体是包裹一部分水性流体的脂质双层。DNA自发地与阳离子脂质体的外表面缔合(借助其电荷)，并且这些脂质体将与细胞膜相互作用。

在某些实施方案中，重组溶瘤病毒和免疫治疗剂或免疫调节剂可以以该药剂不干扰病毒活性的方式同时或依次施用。在某些实施方案中，重组溶瘤病毒是动脉内、静脉内、腹膜内、瘤内、或其任何组合施用的。在又一个实施方案中，在施用根据本公开内容的重组溶瘤病毒之前施用干扰素，例如干扰素-α或聚乙二醇化的干扰素。

根据本公开内容的溶瘤病毒可以以单次施用或多次施用来施用。病毒可以以以下剂量施用：1×10⁵个噬斑形成单位(plaque forming unit，PFU)、5×10⁵PFU、至少1×10⁶PFU、5×10⁶或约5×10⁶PFU、1×10⁷、至少1×10⁷PFU、1×10⁸或约1×10⁸PFU、至少1×10⁸PFU、约或至少5×10⁸PFU、1×10⁹或至少1×10⁹PFU、5×10⁹或至少5×10⁹PFU、1×10¹⁰PFU或至少1×10¹⁰PFU、5×10¹⁰或至少5×10¹⁰PFU、1×10¹¹或至少1×10¹¹、1×10¹²或至少1×10¹²、1×10¹³或至少1×10¹³。例如，可以以约10⁷至10¹³、约10⁸至10¹³、约10⁹至10¹²或约10⁸至10¹²的剂量施用病毒。

A.组合治疗

可将另外的治疗与在此之前描述的本公开内容的任何方法组合，以提高对癌细胞的杀伤、对癌细胞生长的抑制、对血管生成的抑制或以其他方式改善肿瘤细胞恶性表型的逆转或降低。这些组合物将以有效杀伤或抑制细胞增殖的组合量提供。该过程可涉及使细胞与表达构建体和一种或更多种药剂或者一种或更多种因子同时接触。这可通过使细胞与包含两种药剂的单一组合物或药理学制剂接触或者通过使细胞与两种不同的组合物或制剂同时接触来实现，其中一种组合物包含病毒组合物而另一种包含第二药剂治疗。

或者，治疗可以以数分钟至数周的间隔在其他药剂或治疗之前或之后进行。在其中向细胞单独施加药剂的一些实施方案中，通常应确保每次递送之间的重要时间段没有期满，以使得药剂仍将能够对细胞发挥有利的组合作用。在这样的情况下，考虑在彼此的约12至24小时内并且更优选在彼此的约6至12小时内使细胞与这两种形式接触，其中最优选延迟时间为仅约12小时。然而，在一些情况下，可期望显著延长治疗时间段，其中各施用之间相隔数天(2、3、4、5、6或7天)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8周)至数月(1、2、3、4、5、6、7或8月)。

还可想到，任一药剂的多于一次施用将是期望的。可采用多种组合，例如，其中在施用第二药剂之前施用一种或更多种溶瘤病毒治疗；或者可在溶瘤病毒施用之前施用第二药剂。连续施用可包括溶瘤病毒治疗或第二药剂的一次或更多次施用。再次，为了实现细胞杀伤，将这两种药剂以有效杀伤细胞的组合量递送至细胞。例如，要求保护的PD1+IL-2/IL-12试剂和免疫调节剂的组合。

根据本公开内容的某些实施方案，提供了用于治疗癌症的方法，一旦对象被鉴定为这样的治疗(例如vMYX-PD1治疗)的响应者或可能响应于这样的治疗，则可将该方法与溶瘤病毒治疗联合使用。当本公开内容的测定表明对象不太可能响应于使用可复制型的溶瘤病毒(例如黏液瘤病毒)的治疗时，可使用这样的治疗。或者，在通过本方法鉴定对象不太可能响应于仅使用可复制型的溶瘤病毒的治疗的情况下，可将这样的治疗与可复制型的溶瘤病毒(例如腺病毒)组合使用。

约60％患有癌症的人将经历一些类型的外科手术，其包括预防性、诊断性、阶段性、治愈性和姑息性外科手术。治愈性外科手术是可与其他治疗(例如本公开内容的治疗、化学治疗、放射治疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或替代治疗)联合使用的癌症治疗。

治愈性外科手术包括其中物理去除、切除和/或破坏全部或一部分癌组织的切除术。肿瘤切除是指物理去除至少一部分的肿瘤。除肿瘤切除之外，通过外科手术的治疗还包括激光外科手术、冷冻外科手术、电外科手术和用显微控制的外科手术(莫氏外科手术(Mohs’surgery))。还考虑本公开内容可与去除浅表癌、癌前病变(precancer)或附带量的正常组织联合使用。

在某些方面，在外科手术之前或者在切除一部分或全部癌细胞、组织或肿瘤之后，通过瘤内注射施用治疗。治疗也可通过向这些区域灌注、直接注射或局部施加另外的抗癌治疗来完成。可重复这样的治疗，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这样的治疗也可具有多种剂量。

根据本公开内容可使用广泛多种化学治疗剂。术语“化学治疗”是指使用药物来治疗癌症。“化学治疗剂”用于表示在癌症的治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物通过其在细胞内的活性模式(例如其是否影响细胞周期和在什么阶段影响细胞周期)进行分类。或者，药剂可基于其直接交联DNA、嵌入到DNA中或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来表征。大多数化学治疗剂落入以下几类：烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂和有丝分裂抑制剂。

烷化剂直接与基因组DNA相互作用以阻止癌细胞增殖。这类药物包括影响细胞周期所有阶段的药剂，并且通常用于治疗慢性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、恶性黑素瘤、多发性骨髓瘤，以及特别地，乳腺癌、肺癌和卵巢癌。它们包括氮芥类，例如二氯甲基二乙胺(氮芥)、苯丁酸氮芥、环磷酰胺

异环磷酰胺和美法仑，亚硝基脲，例如链脲霉素、卡莫司汀(BCNU)和洛莫司汀，烷基磺酸酯类例如白消安，三嗪类例如达卡巴嗪(DTIC)和替莫唑胺

乙撑亚胺类，例如噻替哌和六甲蜜胺(六甲蜜胺)，以及铂类药物，例如顺铂、卡铂和奥沙拉铂。

抗代谢物破坏DNA和RNA的合成。与烷化剂不同，它们特异性影响S期期间的细胞周期。它们已被用于对抗慢性白血病以及乳腺、卵巢和胃肠道肿瘤。抗代谢物包括5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、卡培他滨

克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷

氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨

羟基脲、甲氨蝶呤、培美曲塞、喷司他丁和硫鸟嘌呤。

抗肿瘤抗生素具有抗微生物和细胞毒性活性二者。这些药物还通过化学地抑制酶和有丝分裂或改变细胞膜来干扰DNA。这些药剂在细胞周期的所有阶段均发挥作用，并用于治疗多种癌症。代表性实例包括柔红霉素、多柔比星

表柔比星、伊达比星、放线菌素-D、博来霉素和丝裂霉素-C。通常，这些化合物以25至100mg/kg的剂量通过推注i.v.注射施用。

拓扑异构酶抑制剂干扰拓扑异构酶(有助于分离DNA链使得它们可被复制的酶)并用于治疗某些白血病，以及肺癌、卵巢癌、胃肠道癌和其他癌症，并且包括拓扑替康、伊立替康、依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷。

有丝分裂抑制剂，通常是植物生物碱，在细胞周期的M期期间发挥作用，并阻止有丝分裂或抑制酶产生细胞复制所需的蛋白质。代表性实例包括紫杉烷类，例如紫杉醇

和多西他塞

埃博霉素，例如伊沙匹隆

长春花生物碱，例如长春花碱

长春新碱

和长春瑞滨

以及雌氮芥

在一些实施方案中，免疫治疗可以是使用免疫检查点抑制剂的治疗。免疫检查点调高信号(例如，共刺激分子)或调低信号。可通过免疫检查点阻断被靶向的抑制性免疫检查点包括：腺苷A2A受体(A2A receptor，A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B和T淋巴细胞衰减剂(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4，也称为CD152)、吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(killer-cellimmunoglobulin，KIR)、淋巴细胞激活基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG3)、程序性死亡1(programmed death 1，PD-1)、T-细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3，TIM-3)和T细胞激活的V结构域Ig抑制剂(V-domain Ig suppressor of T cell activation，VISTA)。

免疫检查点抑制剂可以是药物，例如小分子、重组形式的配体或受体、或者特别是抗体，例如针对免疫检查点蛋白的人抗体(例如，国际专利公开WO2015016718；Pardoll,2012；二者均通过引用并入本文)。可使用免疫检查点蛋白的已知抑制剂或其类似物，特别地，可使用嵌合的、人源化的或人形式的抗体。如技术人员将知晓的，替代和/或等同名称可用于本公开内容中提及的某些抗体。在本公开内容的上下文中，这样的替代和/或等同名称是可互换的。例如，已知兰立珠单抗(lambrolizumab)也以替代和等同名称MK-3475和派姆单抗而为人所知。示例性免疫检查点抑制剂包括PD-1抑制剂，例如派姆单抗和纳武单抗；PD-L1抑制剂，例如阿特珠单抗、阿维单抗和度伐单抗；以及CTLA-4抑制剂，例如伊匹单抗。

在某些优选的实施方案中，可通过将黏液瘤vPD1与T细胞上PD1的阻断直接组合来实现累加的抗肿瘤作用。临床上，这可通过使用结合PD1来阻断与PDL1的相互作用的抗体来实现。临床上观察到，单个免疫检查点抑制的组合实现了好得多的抗肿瘤活性(Johnsonand Win,2017，其通过引用整体并入本文)。根据本发明的将黏液瘤vPD1和抗PD1抗体组合的另外的益处可以是解决转移性疾病。由于PK/PD问题，通过瘤内注射的局部施用的黏液瘤vPD1对于转移性疾病可能不是最佳的。

虽然将根据本发明的溶瘤病毒与抗PD1抗体组合是有前景的方法，但是通过抗PD1抗体与由黏液瘤病毒表达的可溶性PD1的相互作用可发生可能的并发症。为了改善这种可能性，产生了表达PD1构建体的黏液瘤病毒，所述构建体在CD环中包含阻止两种经临床批准的抗PD1抗体之间的抗体识别的突变。在一个实施方案中，PD1蛋白中D85G位置的位点突变将完全消除抗PD1抗体派姆单抗与PD1的结合(Tan et al.,2017，其通过引用整体并入本文；和Na et al.其通过引用整体并入本文)。因此，在该实施方案中，在截短的PD1黏液瘤构建体的CD环之间引入单个点突变或单个点突变的组合将降低抗PD1抗体的任何抑制性结合。

其他化学治疗剂包括靶向治疗，例如伊马替尼

吉非替尼

舒尼替尼

索拉非尼

硼替佐米

贝伐单抗

曲妥珠单抗

西妥昔单抗

和帕尼单抗

激素治疗，包括抗雌激素药，例如氟维司群

他莫昔芬、托瑞米芬，芳香酶抑制剂，例如阿那曲唑、依西美坦和来曲唑，孕酮，例如乙酸甲地孕酮和促性腺素释放激素，以及免疫治疗，例如可与药物或毒素(例如放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素)缀合的针对肿瘤特异性抗原(例如前列腺特异性抗原、癌胚抗原、泌尿系统肿瘤相关抗原(urinary tumor associated antigen)、胎儿抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层黏连蛋白受体、erb B和p155)的抗体。

放射治疗也称为放疗，是用电离辐射治疗癌症和其他疾病，其可用于治疗局部实体瘤，例如皮肤癌、舌癌、喉癌、脑癌、乳腺癌或宫颈癌，或者可用于治疗造血细胞癌症(白血病)和淋巴系统癌症(淋巴瘤)的癌症。放射治疗包括但不限于使用y射线、X射线和/或将放射性同位素定向递送至肿瘤细胞。可考虑其他形式的DNA损伤因素，例如微波和UV-辐照。X射线的剂量范围为持续延长时间段(3至4周)的50至200伦琴的日剂量到2000至6000伦琴的单一剂量。

放射治疗还包括使用经放射标记的抗体将放射剂量直接递送至癌症部位(例如，放射免疫治疗、适形放射治疗)、高分辨率强度调制放射治疗和立体定向放射外科手术。用于脑和其他肿瘤的立体定向放射外科手术(γ刀)从数百个不同角度采用精确靶向的γ放射治疗束。只需要一段时间(one session)，约4至5个小时。

B.药物组合物

本文中所述的重组溶瘤病毒可作为与可药用载体一起配制的药物(pharmaceutical)或药物(medicament)施用。因此，重组溶瘤病毒可用于制备药物或药物组合物。本公开内容的药物组合物可被配制为用于肠胃外施用的溶液或冻干粉末。在使用之前，可通过添加合适的稀释剂或其他可药用载体来重构粉末。液体制剂可以是经缓冲的、等张的水溶液。粉末也可以以干燥形式喷雾。合适的稀释剂的实例是一般的等张盐溶液，标准的水中的5％右旋糖或者经缓冲的乙酸钠或乙酸铵溶液。这样的制剂尤其适合于肠胃外施用，但是也可用于经口施用或包含在用于吸入的定量吸入器或雾化器中。可期望添加赋形剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、明胶、羟基纤维素、阿拉伯胶、聚乙二醇、甘露醇、氯化钠、柠檬酸钠等。

或者，可将治疗剂包封、制成片剂或以乳剂或糖浆剂制备用于经口施用。可添加可药用固体或液体载体以增强或稳定组合物，或促进组合物的制备。固体载体包括淀粉、乳糖、二水合硫酸钙、白土(terra alba)、硬脂酸镁或硬脂酸、滑石、果胶、阿拉伯胶、琼脂或明胶。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、盐水和水。载体还可包括持续释放材料，例如单独或与蜡一起的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。固体载体的量有所变化，但是将优选为每剂量单位约20mg至约1g。药物制剂是按照常规药学技术制成的，包括对于片剂形式的研磨、混合、制粒和压制(当需要时)；或对于硬明胶胶囊形式的研磨、混合和填充。当使用液体载体时，制剂可以是糖浆剂、酏剂、乳剂或水性或非水性混悬剂的形式。对于直肠施用，本公开内容化合物可与赋形剂(例如可可脂、甘油、明胶或聚乙二醇)组合并模制成栓剂。

治疗剂可配制为包含其他医学上可用的药物或生物剂。治疗剂也可与可用于本公开内容化合物所针对的疾病或病症的其他药物或生物剂的施用联合来施用。

可配制本公开内容的生物或药物组合物，以使得在向对象施用该组合物之后，本文中包含的重组溶瘤病毒是生物可利用的。在施用之后，血清、肿瘤和其他组织中重组溶瘤病毒的水平可通过多种公认的技术来监测，例如基于抗体的测定(例如ELISA)。在某些实施方案中，配制重组溶瘤病毒组合物用于肠胃外施用给有此需要的对象(例如患有肿瘤的对象)，例如非人动物或人。优选的施用途径包括静脉内、动脉内、皮下、瘤内或肌内。

如本领域已知的，适当的制剂取决于选择的施用途径。例如，全身性制剂是这样的一个实施方案，其包括被设计用于通过注射，例如皮下、动脉内、静脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射施用的制剂，以及被设计用于瘤内、经皮、经黏膜、经口、鼻内、或肺部施用的制剂。在一个实施方案中，全身性或瘤内制剂是无菌的。在对于注射的实施方案中，本公开内容的重组溶瘤病毒组合物可在水溶液中或者在生理相容性溶液或缓冲液(例如Hanks溶液、林格溶液、甘露醇溶液或生理盐水缓冲液)中配制。在某些实施方案中，本文中所述的任何重组溶瘤病毒组合物可包含配制剂，例如助悬剂、稳定剂或分散剂。在对于经黏膜施用的实施方案中，适合于待渗透的屏障的渗透剂、增溶剂或润肤剂(emollient)可用于制剂中。例如，1-十二烷基六氢-2H-氮杂

-2-酮(1-dodecylhexahydro-2H-azepin-2-one)

油酸、丙二醇、薄荷醇、二乙二醇乙氧基醇单乙醚

聚山梨酯聚乙烯山梨聚糖单月桂酸酯

和药物7-氯-1-甲基-5-苯基-3H-1,4-苯并二氮杂

-2-酮(地西泮)、肉豆蔻酸异丙酯和本领域通常已知的其他这样的渗透剂、增溶剂或润肤剂可用于任何本公开内容的组合物中。

施用可使用多种途径的组合来实现，例如，首先使用动脉内途径施用，并且随后通过静脉内或瘤内途径或其任何组合施用。

IV.实施例

包含以下实施例以说明本公开内容的优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本公开内容的实践中很好地发挥作用的技术，因此可以认为构成其实践的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应理解，可在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，对所公开的具体实施方案作出许多变化而仍然获得相同或类似的结果。

实施例1-vMYX-PD1构建体的产生和表征

重组病毒构建体可用可溶性PD1或可溶性PD1和任选地多种白介素来制造。参见例如图1中的代表性重组病毒基因组结构的示意图。

为了构建vPD1和突变型vPD1，通过使用以下引物的PCR从预先构建的模板质粒(PlasmID数据库，克隆HsCD00345685)扩增人PD1的胞外区(第1至168位氨基酸)。

正向引物：

反向引物：

可溶性PD1核苷酸序列

天然可溶性PD1氨基酸序列(1至168)

Q15116 20个氨基酸的信号肽

突变型可溶性PD1氨基酸序列(1至168)(D85G替换消除派姆单抗与PD1的结合)

20个氨基酸的信号肽

人IL-2氨基酸序列(1至153)

P60568 20个氨基酸的信号肽

人IL-12，α亚基氨基酸序列(1至219)

P29459 22个氨基酸的信号肽

人IL-12，β亚基氨基酸序列(1至328)

P29460 22个氨基酸的信号肽

高亲和力人IL-12氨基酸变体(1至164)

P60568 20个氨基酸的信号肽

图2示出了vPD1-IL2在皮下B16F10(B16F10 PD1L-KO)对侧异种移植模型中的效力研究。图3示出了vPD1-IL12在皮下B16F10(B16F10 PD1L-KO)对侧异种移植模型中的效力研究。图4示出了vPD1-IL15在皮下B16F10(B16F10 PD1L-KO)对侧异种移植模型中的效力研究的结果。同样，图5示出了来自vPD1-IL18在皮下B16F10(B16F10 PD1L-KO)对侧异种移植模型中的效力研究的结果。综上所述，IL-2和IL-15显示显示出对肿瘤尺寸的适度降低，而IL-12提供了最大的降低。IL-18显示具有最小的作用。

如图6和7所示，采用体内皮下(SC)对侧小鼠模型来测试多种病毒构建体。对左侧(WT-B16/F10)隔两天进行三次瘤内注射，而对右侧(PDL1-KO-B16/F10)不进行处理。经注射的肿瘤(左)和对侧未经注射的肿瘤(右)显示响应于vPD1/IL12和vPD1/IL2处理。vPD1/IL15也显示出适度的应答，而vPD/IL18则显示出可忽略不计的作用。综上所述，与其他受测的构建体相比，IL-12出乎意料地显示出对经注射肿瘤和对侧肿瘤二者的尺寸更大的降低。

表1-原始病毒处理数据

如图15所示，进行了小鼠研究以评估单独的vPD1、单独的vIL12以及vPD1+IL12的组合的效力。在两胁上向小鼠注射4×10⁶个B16/F10细胞。肿瘤建立之后，在5天内用3次指定病毒的注射来处理较大的肿瘤(第0、2和4天)。监测肿瘤的生长和小鼠的体重，直至当总肿瘤负荷超过400mm²时使小鼠安乐死。已发现，vPD1+IL12的组合对降低肿瘤生长和提高小鼠的总体存活具有最显著的作用。

病毒的进一步发展包括向IL12添加跨膜结构域。跨膜结构域阻止IL12渗漏到血液中。

跨膜和胞质结构域

PD1-IL12-跨膜结构域构建体

实施例2-vMYX-TIM3构建体的产生

通过使未经修饰的黏液瘤病毒(Lausanne毒株)与包含以下关键元件的质粒pBS-M135/M136-sE/L GFP+TIM3进行同源重组来产生vTIM3。

-pBluescript质粒骨架

-与M134/M135同源的黏液瘤基因组区域

-由共有痘病毒合成的早期/晚期启动子驱动的eGFP

-由第二共有痘病毒合成的早期/晚期启动子驱动的鼠TIM3的第1至195位aa

-与M136同源的黏液瘤基因组区域

TIM3-GFP构建体

可溶性TIM3

将pBS-M135/M136-sE/L GFP+TIM3转染到BSC40细胞中，然后将其用未经修饰的黏液瘤病毒(Lausanne毒株)感染。将细胞培养72小时，其产生重组病毒，其中在M135和M136之间的病毒基因组的非翻译区域被表达eGFP和可溶性TIM3二者的盒替换(图12A)。然后通过选择GFP⁺克隆，在BSC40细胞上纯化重组病毒的四重噬斑。然后使用PCR确认最终病毒(vTIM3)的克隆性。

vTIM3的体外表征：vTIM3从受感染细胞分泌可溶性PD1：通过对来自感染了盐水(模拟)、vGFP(对照病毒)或vTIM3的B16/F10黑素瘤细胞在感染24小时之后的上清液进行western印迹，确认来自受病毒感染细胞的可溶性PD1的分泌。在感染vTIM3的细胞的上清液中特异性地观察到与可溶部分的TIM3一致的强条带(图12D)。

vTIM3在体外显示出正常的复制和溶瘤能力：为了确定TIM3转基因的插入是否会改变MYXV复制，在多种细胞中对vGFP和vTIM3二者进行了一步生长曲线。观察到在所有受测的细胞类型中两种病毒均表现出相同的复制(图12B和12C)。为了进一步测试TIM3转基因的分泌是否会改变MYXV直接杀伤受感染细胞的能力，接下来询问了vGFP和vTIM3二者在杀伤B16/F10黑素瘤细胞上的有效性如何。用指定感染复数的vGFP或vTIM3感染B16/F10细胞。24小时之后，使用MTT测定分析细胞生存力。观察到，vGFP和vTIM3二者均显示出相同的体外杀伤受感染黑素瘤细胞的能力(图13)。

在体内针对黑素瘤的溶瘤潜力：为了测试vTIM3在体内是否显示出提高的溶瘤能力，在小鼠中测试了其使已建立的黑素瘤肿瘤消退的能力。向C57/B6小鼠皮下植入5×10⁵个B16/F10黑素瘤细胞。在注射肿瘤细胞之后七天(当肿瘤为约15至20mm²时)开始处理。处理包括在第7天和第12天两次瘤内注射盐水、1×10⁷FFU的vGFP或1×10⁷FFU的vTIM3。然后每天监测动物的肿瘤尺寸，并且在肿瘤沿任何方向达到150mm时使动物安乐死。用vGFP处理的动物显示出降低的肿瘤生长，然而，这些动物中的大多数肿瘤仍在进展，最终需要安乐死(图13)。相比之下，用vTIM3处理的许多小鼠显示出已建立肿瘤的迅速消退，导致7/12的动物完全持久的缓解。

构建了表达可溶性TIM3蛋白变体的一系列病毒，其中通过诱变已去除了先前验证的针对每种TIM3配体的结合位点(图14)。测试每种这些病毒在体内诱导α肿瘤免疫和根除已建立肿瘤的能力。这确定了机制，该机制为基于vTIM3的检查点阻断所涉及的以及通过允许构建具有改善的治疗效力的下一代vTIM3构建体。

实施例3-在转移性疾病中的vMYX治疗

还研究了表达分泌形式的可溶性PD1的重组MYXV(vPD1)，以确定其相对于转移性癌症的活性。不幸的是，尽管vPD1在根除局部疾病上是极其有效的(例如，通过维持抗肿瘤免疫)，参见例如图16，但另外的实验已表明，相对于未经注射的转移性肿瘤，其具有降低的有效性(参见图16B)。由于vPD1无法有效地使未经处理的病变消退，因此为了提高该病毒的临床潜力，研究了可添加至vPD1骨架的另外的修饰，其可导致提高的全身性效力。另外的重组病毒，其表达可溶性PD1以及另外的可溶性T细胞检查点蛋白或一系列促炎细胞因子二者(参见图17A)。然后将每种这些病毒纯化至具有克隆性，并测试其在标准对侧肿瘤模型中使经注射和未经注射的Lewis肺癌(Lewis Lung Carcinomas，LLC)消退的能力。结果表明，在受测的分子中，只有包含IL-12(作为p40/p35融合蛋白被编码)显著提高了vPD1骨架针对未经注射的病变的效力(图17B至C)。然而，令人印象深刻的是，vPD1/IL12能够在几乎所有经处理小鼠中使经注射和未经注射病变二者完全消退(10/12的动物的持久完全应答持续>120天)，导致几乎90％的有效“治愈率”。值得注意的是，即使在患有大的、确立已久的疾病的动物(来自最初“模拟”组群的显示出总肿瘤负荷为350至400mm²的动物)中，用vPD1/IL12处理单个肿瘤可导致经处理肿瘤的完全消除以及在未经处理的肿瘤中的显著消退(图17D)。这些研究表明，vPD1/IL12病毒代表了即使在晚期转移性疾病中也具有强大临床潜力的新的治疗剂。

为了继续这个令人兴奋的初步发现，对vPD1/IL12病毒的治疗范围进行了进一步研究。为实现这一点，在转移性疾病的临床前模型：LLC肺癌(SQ对侧肿瘤模型)、B16/F10黑素瘤(SQ对侧肿瘤模型)、4T1和三阴性乳腺癌(自发转移至肺的单个SQ肿瘤)中，将表达IL12融合蛋白的单个重组MYXV(vIL12)该病毒的效力与vPD1和vPD1/IL12二者的效力进行了比较。所有模型的结果均清楚地表明：1)vPD1/IL12病毒能够使来自广泛范围的不同的恶性肿瘤(包括代表免疫学上“热门(hot)”(LLC和B16/F10)和免疫学上“冷门(cold)”(4T1和ID8)形式的疾病二者的肿瘤)的经处理和未经处理病变二者消退。2)在按照使用单一重组病毒(vPD1或vIL12)的处理的任何模型中均未观察到这种临床效力，表明vPD1/IL12的治疗作用是由于独特形式的组合协同作用所致(图18至20)。

根据本公开内容，本文中公开且要求保护的所有方法均可在没有过度实验的情况下做出和执行。尽管已经根据一些优选实施方案描述了本公开内容的组合物和方法，但是对于本领域技术人员将明显的是，可对本文中所述方法和步骤或所述方法的步骤依次进行改变而不脱离本公开内容的概念、精神和范围。更具体地，将明显的是，在化学和生理两方面均相关的某些物质可替代本文中所述的物质而实现相同或类似的结果。对本领域技术人员明显的所有这些类似替代和修改都被认为在由所附权利要求书限定的本公开内容的精神、范围和概念内。

参考文献

以下参考文献就其提供补充本文中所阐述的那些的示例性操作或其他细节而言特定地通过引用并入本文。

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<130> MESC.P0113WO

<150> US 62/718,990

<151> 2018-08-16

<150> US 62/741,404

<151> 2018-10-04

<150> US 62/754,622

<151> 2018-11-02

<150> US 62/813,375

<151> 2019-03-04

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 1

atcgcccggg aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg aatataaata accatgcaga 60

tcccacaggc gcc 73

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 2

atcggaattc tcaggtttgg aactggccgg ctg 33

<210> 3

<211> 504

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 3

atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60

ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120

ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180

gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240

gctttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300

cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360

tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420

gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480

aggccagccg gccagttcca aacc 504

<210> 4

<211> 168

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 4

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr

165

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<211> 168

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 5

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Gly Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr

165

<210> 6

<211> 153

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 6

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

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Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

145 150

<210> 7

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 7

Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu

1 5 10 15

Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro

20 25 30

Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val

35 40 45

Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys

50 55 60

Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser

65 70 75 80

Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys

85 90 95

Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala

100 105 110

Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr

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Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys

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Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu

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Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr

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Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr

195 200 205

Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser

210 215

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 8

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1 5 10 15

Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val

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Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu

35 40 45

Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln

50 55 60

Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys

65 70 75 80

Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val

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Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp

100 105 110

Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe

115 120 125

Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp

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Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser

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Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn

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275 280 285

Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala

290 295 300

Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser

305 310 315 320

Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser

325

<210> 9

<211> 164

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 9

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

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Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

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Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

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<220>

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<220>

<221> misc_feature

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<223> n是a、c、g或t

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<222> (12)..(12)

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<220>

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<222> (1860)..(1860)

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nnnnnnnnnn cncgnggngg cggccgctct agtaggatta cctggtctat atagataaca 60

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aggagcacga caataacgta accgattact tcgcggaata catgcgatcc ctccaaatgg 300

cgaataaaag tcatacgaat aatattatcg cggtcgcttt agcggggata atcgtcattg 360

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acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca 1800

gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgn 1860

tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc 1920

gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg 1980

agctgtacaa gtaaagcggc cgggtaatta cccgggatgt tttcaggtct taccctcaac 2040

tgtgtcctgc tgctgctgca actactactt gcaaggtcat tggaaaatgc ttatgtgttt 2100

gaggttggta agaatgccta tctgccctgc agttacactc tatctacacc tggggcactt 2160

gtgcctatgt gctggggcaa gggattctgt ccttggtcac agtgtaccaa cgagttgctc 2220

agaactgatg aaagaaatgt gacatatcag aaatccagca gataccagct aaagggcgat 2280

ctcaacaaag gagacgtgtc tctgatcata aagaatgtga ctctggatga ccatgggacc 2340

tactgctgca ggatacagtt ccctggtctt atgaatgata aaaaattaga actgaaatta 2400

gacatcaaag cagccaaggt cactccagct cagactgccc atggggactc tactacagct 2460

tctccaagaa ccctaaccac ggagagaaat ggttcagaga cacagacact ggtgaccctc 2520

cataataaca atggaacaaa aatttccaca tgggctgatg aaattaagga ctctggagaa 2580

acgatcagaa ctgctatcca ctaggaattc taacattttt taaaacaatt tcgttatgtt 2640

aaattatgga acggtcgccc acttacacgg tacacgataa acgcttttct atcgtcgcac 2700

taaacggaca atacgacatg gtggacgatt ttggtcttag tttttcttac acagcgatcg 2760

acgatatttc taaaaatcat tccatcaaac acgttttaga agaatacttt tcatggcgcg 2820

cgtatatagg ccgggtatgt atcataccga atcacgtggg aaagctctac atcaaactta 2880

caaagttgga caccacggcg aagaacaaac taggcaatct agatatattg ttatgcgacg 2940

tgttaaaaat agacgaggac ggaggcaacg agaaactgtt tcaattcata cggtcgcgga 3000

tcccccaatt cgatatcaag cttatcgata ccgtcgacct cg 3042

<210> 11

<211> 585

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 11

atgttttcag gtcttaccct caactgtgtc ctgctgctgc tgcaactact acttgcaagg 60

tcattggaaa atgcttatgt gtttgaggtt ggtaagaatg cctatctgcc ctgcagttac 120

actctatcta cacctggggc acttgtgcct atgtgctggg gcaagggatt ctgtccttgg 180

tcacagtgta ccaacgagtt gctcagaact gatgaaagaa atgtgacata tcagaaatcc 240

agcagatacc agctaaaggg cgatctcaac aaaggagacg tgtctctgat cataaagaat 300

gtgactctgg atgaccatgg gacctactgc tgcaggatac agttccctgg tcttatgaat 360

gataaaaaat tagaactgaa attagacatc aaagcagcca aggtcactcc agctcagact 420

gcccatgggg actctactac agcttctcca agaaccctaa ccacggagag aaatggttca 480

gagacacaga cactggtgac cctccataat aacaatggaa caaaaatttc cacatgggct 540

gatgaaatta aggactctgg agaaacgatc agaactgcta tccac 585

<210> 12

<211> 177

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 12

cttgtgctct ttggggcagg attcggcgca gtaataacag tcgtcgtcat cgttgtcatc 60

atcaaatgct tctgtaagca cagaagctgt ttcagaagaa atgaggcaag cagagaaaca 120

aacaacagcc ttaccttcgg gcctgaagaa gcattagctg aacagaccgt cttcctt 177

<210> 13

<211> 7620

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 13

agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60

acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120

tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagctcg 240

aaattaaccc tcactaaagg gaacaaaagc tggagctcca ccgcggtggc ggccgcataa 300

acgcgtttaa acagtccccc gtacgcggta catcgtacgc acacttcact aacgatgtcg 360

tacatcgatt acacaaagaa gtagagtcat acgacgtacg tttccctata aaatcggtaa 420

acctagacgc ggtgtttcta tccataaacg taacacgtgt acgtctacgt tggaagatac 480

ccttgaccga acacaatcct tatcagacgg cctacggatg ttctaacgac agattataca 540

gctacaacga gtacgctttt tctcatttaa aacaagaccg tgtaaagatc atagaactcc 600

catgtgacga cgattacagc gtcgtgttaa tcacacacga tagccgttcg actattacac 660

cggataaagt gaccgggtgg ctgcgcacga cccgtctacg ttacgtaaac gtatccctac 720

ccaagggttc cacggaaacg ggacacaacg taacgtgtct aactcccaca cacgtcaatc 780

tatgtcatcg ttgtcgtata acgattacca aaacgggcgt ggacgcaacc gcgttctcat 840

gcgtcgacgg cgatacatgc accgaacacg acacgaccgc gtcaacgtgt acgattatta 900

taaaaacgac gggactggac tttttgttta tggggaaact ctaaaaaaaa ttgtcaatta 960

aagtaactgc agatcgatcg catatgaaaa ttgaaatttt attttttttt tttggaatat 1020

aaataatggt gagcaagggc gaggaggtca tcaaagagtt catgcgcttc aaggtgcgca 1080

tggagggctc catgaacggc cacgagttcg agatcgaggg cgagggcgag ggccgcccct 1140

acgagggcac ccagaccgcc aagctgaagg tgaccaaggg cggccccctg cccttcgcct 1200

gggacatcct gtccccccag ttcatgtacg gctccaaggc gtacgtgaag caccccgccg 1260

acatccccga ttacaagaag ctgtccttcc ccgagggctt caagtgggag cgcgtgatga 1320

acttcgagga cggcggtctg gtgaccgtga cccaggactc ctccctccaa gacggcacgc 1380

tgatctacaa ggtgaagatg cgcggcacca acttcccccc cgacggcccc gtaatgcaga 1440

agaagaccat gggctgggag gcctccaccg agcgcctgta cccccgcgac ggcgtgctga 1500

agggcgagat ccaccaggcc ctgaagctga aggacggcgg ccactacctg gtggagttca 1560

agaccatcta catggccaag aagcccgtgc aactgcccgg ctactactac gtggacacca 1620

agctggacat cacctcccac aacgaggact acaccatcgt ggaacagtac gagcgctccg 1680

agggccgcca ccacctgttc ctggggcatg gcaccggcag caccggcagc ggcagctccg 1740

gcaccgcctc ctccgaggac aacaacatgg ccgtcatcaa agagttcatg cgcttcaagg 1800

tgcgcatgga gggctccatg aacggccacg agttcgagat cgagggcgag ggcgagggcc 1860

gcccctacga gggcacccag accgccaagc tgaaggtgac caagggcggc cccctgccct 1920

tcgcctggga catcctgtcc ccccagttca tgtacggctc caaggcgtac gtgaagcacc 1980

ccgccgacat ccccgattac aagaagctgt ccttccccga gggcttcaag tgggagcgcg 2040

tgatgaactt cgaggacggc ggtctggtga ccgtgaccca ggactcctcc ctccaagacg 2100

gcacgctgat ctacaaggtg aagatgcgcg gcaccaactt cccccccgac ggccccgtaa 2160

tgcagaagaa gaccatgggc tgggaggcct ccaccgagcg cctgtacccc cgcgacggcg 2220

tgctgaaggg cgagatccac caggccctga agctgaagga cggcggccac tacctggtgg 2280

agttcaagac catctacatg gccaagaagc ccgtgcaact gcccggctac tactacgtgg 2340

acaccaagct ggacatcacc tcccacaacg aggactacac catcgtggaa cagtacgagc 2400

gctccgaggg ccgccaccac ctgttcctgt acggcatgga cgagctgtac aagtaacccg 2460

ggaaaaattg aaattttatt tttttttttt ggaatataaa taaccatgtg tcctcagaag 2520

ctaaccatct cctggtttgc catcgttttg ctggtgtctc cactcatggc catgtgggag 2580

ctggagaaag acgtttatgt tgtagaggtg gactggactc ccgatgcccc tggagaaaca 2640

gtgaacctca cctgtgacac gcctgaagaa gatgacatca cctggacctc agaccagaga 2700

catggagtca taggctctgg aaagaccctg accatcactg tcaaagagtt tctagatgct 2760

ggccagtaca cctgccacaa aggaggcgag actctgagcc actcacatct gctgctccac 2820

aagaaggaaa atggaatttg gtccactgaa attttaaaaa atttcaaaaa caagactttc 2880

ctgaagtgtg aagcaccaaa ttactccgga cggttcacgt gctcatggct ggtgcaaaga 2940

aacatggact tgaagttcaa catcaagagc agtagcagtt cccctgactc tcgggcagtg 3000

acatgtggaa tggcgtctct gtctgcagag aaggtcacac tggaccaaag ggactatgag 3060

aagtattcag tgtcctgcca ggaggatgtc acctgcccaa ctgccgagga gaccctgccc 3120

attgaactgg cgttggaagc acggcagcag aataaatatg agaactacag caccagcttc 3180

ttcatcaggg acatcatcaa accagacccg cccaagaact tgcagatgaa gcctttgaag 3240

aactcacagg tggaggtcag ctgggagtac cctgactcct ggagcactcc ccattcctac 3300

ttctccctca agttctttgt tcgaatccag cgcaagaaag aaaagatgaa ggagacagag 3360

gaggggtgta accagaaagg tgcgttcctc gtagagaaga catctaccga agtccaatgc 3420

aaaggcggga atgtctgcgt gcaagctcag gatcgctatt acaattcctc atgcagcaag 3480

tgggcatgtg ttccctgcag ggtccgatcc ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg 3540

ggtggcggcg gatctagggt cattccagtc tctggacctg ccaggtgtct tagccagtcc 3600

cgaaacctgc tgaagaccac agatgacatg gtgaagacgg ccagagaaaa actgaaacat 3660

tattcctgca ctgctgaaga catcgatcat gaagacatca cacgggacca aaccagcaca 3720

ttgaagacct gtttaccact ggaactacac aagaacgaga gttgcctggc tactagagag 3780

acttcttcca caacaagagg gagctgcctg cccccacaga agacgtcttt gatgatgacc 3840

ctgtgccttg gtagcatcta tgaggacttg aagatgtacc agacagagtt ccaggccatc 3900

aacgcagcac ttcagaatca caaccatcag cagatcattc tagacaaggg catgctggtg 3960

gccatcgatg agctgatgca gtctctgaat cataatggcg agactctgcg ccagaaacct 4020

cctgtgggag aagcagaccc ttacagagtg aaaatgaagc tctgcatcct gcttcacgcc 4080

ttcagcaccc gcgtcgtgac catcaacagg gtgatgggct atctgagctc cgcccttgtg 4140

ctctttgggg caggattcgg cgcagtaata acagtcgtcg tcatcgttgt catcatcaaa 4200

tgcttctgta agcacagaag ctgtttcaga agaaatgagg caagcagaga aacaaacaac 4260

agccttacct tcgggcctga agaagcatta gctgaacaga ccgtcttcct ttgagaattc 4320

acgaatcgaa taaaaacccg tgtacacacg gacgttaatt ttttttgtgg tttaaaaaat 4380

gaccacattt acgctttttt ttaacgcgtt atataaggta tctcgtttgt ctataacaaa 4440

gatcgtaact gacctttttt atatcgagaa aacatacgtt tagttcatcc tcaaacgtaa 4500

caccgtaact gcctcggaca tcctccttgt tgtcgtacac aaacatacta atcggatgcg 4560

tgaaatgagg attcacttta atcggattgg tttctaggtt aacacatgtt acacaagatc 4620

ctaagatggt tatggacaca tccttgttgt gatgtaacga gtcgggaagt tgattgccgt 4680

agttgcccac gtcgccctcc ggttccagac acgtaatggt taggtatata tccgaatact 4740

tcgtcaacgg atgagtcgta aataacatga tggatagctt gttcccatct cctgcaccag 4800

cactggccgc cacaaatcgt tgtaccacgt tagtaatcgt aatgtttatc ataagcccgt 4860

acccggttaa tatgagcgtg gacgttttat gatcgtatcg ttccttcatg tgacattctc 4920

ccataaccgt ttcgacgtac cgatttaacc cgatggttag ctcggcggct aagtgccagt 4980

ggatccccca attcgatatc aagcttatcg ataccgtcga cctcgagggg gggcccggta 5040

cccaattcgc cctatagtga gtcgtattac aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt 5100

gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc 5160

agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 5220

aatggcgaat gggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg 5280

cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct 5340

tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta 5400

gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt 5460

tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg 5520

ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat 5580

tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt 5640

taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta ggtggcactt 5700

ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 5760

atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 5820

tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 5880

tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 5940

gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 6000

aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 6060

gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg 6120

ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat 6180

gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg 6240

gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg 6300

atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc 6360

ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt 6420

cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct 6480

cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc 6540

gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca 6600

cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct 6660

cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt 6720

taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga 6780

ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 6840

aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac 6900

caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 6960

taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag 7020

gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 7080

cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt 7140

taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 7200

agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 7260

ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 7320

gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 7380

acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 7440

acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 7500

tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg 7560

ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag 7620

<210> 14

<211> 26

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 14

Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Gly Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln

20 25

<210> 15

<211> 26

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 15

Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro

1 5 10 15

Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln Ile Ile Gln

20 25

<210> 16

<211> 26

<212> PRT

<213> 黑家鼠（Rattus rattus）

<400> 16

Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala Phe Cys Asn Gly Tyr Ser Gln Pro

1 5 10 15

Val Arg Asp Ala Arg Phe Gln Ile Val Gln

20 25

<210> 17

<211> 26

<212> PRT

<213> 家犬（Canis familiaris）

<400> 17

Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Gln Glu Asp Arg Ile Glu Pro

1 5 10 15

Gly Arg Asp Arg Arg Phe Arg Val Met Arg

20 25

<210> 18

<211> 26

<212> PRT

<213> 家马（Equus caballus）

<400> 18

Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Arg Glu Asp Ser Ser Gln Pro

1 5 10 15

Gly Arg Ser Gly Arg Phe Arg Val Thr Arg

20 25

<210> 19

<211> 195

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 19

Met Gly Ser Gly Leu Thr Leu Asn Cys Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu

1 5 10 15

Leu Leu Ala Arg Ser Leu Glu Asp Gly Tyr Lys Val Glu Val Gly Lys

20 25 30

Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Ser Tyr Thr Leu Pro Thr Ser Gly Thr Leu

35 40 45

Val Pro Met Cys Trp Gly Lys Gly Phe Cys Pro Gln Ser Gln Cys Thr

50 55 60

Asn Glu Leu Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asn Val Thr Tyr Gln Lys Ser

65 70 75 80

Ser Arg Tyr Gln Leu Lys Gly Asp Leu Asn Lys Gly Asp Val Ser Leu

85 90 95

Ile Ile Lys Asn Val Thr Leu Asp Asp His Gly Thr Tyr Cys Cys Arg

100 105 110

Ile Gln Phe Pro Gly Leu Met Asn Asp Lys Lys Leu Glu Leu Lys Leu

115 120 125

Asp Ile Lys Ala Ala Lys Val Thr Pro Ala Gln Thr Ala His Gly Asp

130 135 140

Ser Thr Thr Ala Ser Pro Arg Thr Leu Thr Thr Glu Arg Asn Gly Ser

145 150 155 160

Glu Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu His Asn Asn Asn Gly Thr Lys Ile

165 170 175

Ser Thr Trp Ala Asp Glu Ile Lys Asp Ser Gly Glu Thr Ile Arg Thr

180 185 190

Ala Ile His

195

<210> 20

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 20

aaaattgaaa ttttattttt tttttttgga atataaata 39

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.包含一个或更多个表达盒的重组溶瘤黏液瘤病毒，所述表达盒编码(a)可溶形式的程序性细胞死亡蛋白1(PD1)和(b)白介素12(IL-12)，其中所述病毒是可复制型的。

2.权利要求1所述的重组溶瘤黏液瘤病毒，其包含一个或更多个表达盒，所述表达盒编码突变型可溶形式的PD1(mutPD1)和(b)白介素12(IL-12)，其中所述病毒是可复制型的，并且其中所述mutPD1阻止抗PD1抗体识别mutPD1。

3.权利要求2所述的重组溶瘤黏液瘤病毒，其中所述mutPD1在CD环中包含阻止抗PD1抗体的抗体识别的突变。

4.权利要求3所述的重组溶瘤黏液瘤病毒，其中所述mutPD1在CD环中包含点突变，所述点突变包含D85G。

5.权利要求4所述的重组溶瘤黏液瘤病毒，其中所述mutPD1不被派姆单抗识别。

6.权利要求1或2所述的重组溶瘤黏液瘤病毒，其中所述可溶性PD1包含人PD1的胞外区。

7.权利要求6所述的重组溶瘤黏液瘤病毒，其中所述人PD1的胞外区和IL-12在单个表达盒中编码。

8.权利要求1或2所述的重组溶瘤黏液瘤病毒，其中所述一个或更多个表达盒在一种或更多种病毒启动子的控制下。

9.权利要求8所述的重组溶瘤黏液瘤病毒，其中所述一种或更多种病毒启动子是合成的早期/晚期痘病毒启动子。

10.权利要求9所述的重组溶瘤黏液瘤病毒，其中所述合成的早期/晚期痘病毒启动子与SEQ ID NO:20具有至少90％的同一性。

11.权利要求1或2所述的重组溶瘤黏液瘤病毒，其中将所述PD1的胞外区和IL-12的一个或更多个表达盒：(i)在病毒M153R开放阅读框处并入黏液瘤基因组中；或在M135基因与M136基因之间并入。

12.权利要求11所述的重组溶瘤黏液瘤病毒，其中将所述PD1的胞外区并入M135基因与M136基因之间。

13.权利要求11所述的溶瘤病毒，其中将所述IL-12在病毒M153R开放阅读框处并入黏液瘤基因组中。

14.权利要求11所述的溶瘤病毒，其还包含标志物基因。

15.权利要求14所述的溶瘤病毒，其中IL-12与跨膜结构域融合。

16.权利要求15所述的溶瘤病毒，其中所述跨膜结构域由SEQ ID NO:12编码。

17.权利要求16所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒由SEQ ID NO:13编码。

18.权利要求1或2所述的溶瘤病毒的药物组合物。

19.在有此需要的对象中治疗疾病的方法，所述方法包括施用有效量的权利要求1或2所述的溶瘤病毒或权利要求18所述的药物组合物。

20.权利要求19所述的方法，其中所述疾病是癌症。

21.权利要求20所述的方法，其中所述癌症具有提高的程序性死亡配体1(PDL1)的表达。

22.权利要求20所述的方法，其中已确定所述对象患有表达提高的PDL1的癌症。

23.权利要求20所述的方法，其中所述癌症不具有提高的PDL1表达。

24.权利要求20所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤、肾癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、脑癌、白血病、前列腺癌、膀胱癌和卵巢癌。

25.权利要求20所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤。

26.权利要求25所述的方法，其中所述黑素瘤是转移性黑素瘤。

27.权利要求19所述的方法，其中所述溶瘤病毒是动脉内、静脉内、腹膜内或瘤内施用的。

28.权利要求19所述的方法，其中所述溶瘤病毒被施用两次或更多次。

29.权利要求19所述的方法，其还包括向所述对象施用至少第二抗癌治疗。

30.权利要求29所述的方法，其中所述第二抗癌治疗与所述重组病毒同时或依次施用。

31.权利要求29所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是免疫调节剂。

32.权利要求29所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是免疫治疗、化学治疗、放射治疗、基因治疗、外科手术、激素治疗、抗血管生成治疗或细胞因子治疗。

33.权利要求32所述的方法，其中所述免疫治疗是免疫检查点抑制剂治疗。

34.权利要求33所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂治疗包含用针对PD1、PDL1或CTLA4的抗体治疗。

35.权利要求34所述的方法，其中所述抗体是派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、度伐单抗或伊匹单抗。

36.权利要求51所述的方法，其中所述抗体是派姆单抗。

37.在有此需要的对象中治疗疾病的方法，所述方法包括：

(a)测试所述对象的PDL1过表达；以及

(b)向具有提高的PDL1表达的对象施用治疗有效量的权利要求1或2所述的溶瘤病毒。

38.权利要求37所述的方法，其中所述疾病是癌症。

39.权利要求38所述的方法，其中所述癌症具有提高的程序性死亡配体1(PDL1)的表达。

40.权利要求38所述的方法，其中所述癌症不具有提高的PDL1表达。

41.权利要求38所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤、肾癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、脑癌、白血病、前列腺癌、膀胱癌和卵巢癌。

42.权利要求38所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤。

43.权利要求42所述的方法，其中所述黑素瘤是转移性黑素瘤。

44.权利要求37所述的方法，其中所述溶瘤病毒是动脉内、静脉内、腹膜内或瘤内施用的。

45.权利要求37所述的方法，其中所述溶瘤病毒被施用两次或更多次。

46.权利要求37所述的方法，其还包括向所述对象施用至少第二抗癌治疗。

47.权利要求46所述的方法，其中所述第二抗癌治疗与所述重组病毒同时或依次施用。

48.权利要求46所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是免疫调节剂。

49.权利要求46所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是化学治疗、免疫治疗、放射治疗、基因治疗、外科手术、激素治疗、抗血管生成治疗或细胞因子治疗。

50.权利要求49所述的方法，其中所述免疫治疗是免疫检查点抑制剂治疗。

51.权利要求50所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂治疗包含用针对PD1、PDL1或CTLA4的抗体治疗。

52.权利要求51所述的方法，其中所述抗体是派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、度伐单抗或伊匹单抗。

53.包含一个或更多个表达盒的重组溶瘤病毒，所述表达盒编码可溶形式的T细胞免疫球蛋白及含黏蛋白结构域3(TIM3)。

54.权利要求53所述的溶瘤病毒，其中所述可溶性TIM3包含鼠TIM3的胞外区。

55.权利要求53所述的溶瘤病毒，其中所述一个或更多个表达盒在一种或更多种病毒启动子的控制下。

56.权利要求56所述的溶瘤病毒，其中所述一种或更多种病毒启动子是合成的早期/晚期痘病毒启动子。

57.权利要求53所述的溶瘤病毒，其中所述病毒选自黏液瘤病毒、呼肠孤病毒、单纯疱疹病毒、新城疫病毒、麻疹病毒、逆转录病毒、痘病毒、弹状病毒、小核糖核酸病毒、柯萨奇病毒和细小病毒。

58.权利要求57所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是黏液瘤病毒。

59.权利要求58所述的溶瘤病毒，其中将所述在病毒M153R开放阅读框处并入黏液瘤基因组中。

60.权利要求59所述的溶瘤病毒，其还包含标志物基因。

61.权利要求60所述的溶瘤病毒，其中所述标志物基因是增强型绿色荧光蛋白(eGFP)。

62.权利要求53所述的溶瘤病毒的药物组合物。

63.在有此需要的对象中治疗疾病的方法，所述方法包括施用有效量的权利要求53所述的溶瘤病毒或权利要求62所述的药物组合物。

64.权利要求63所述的方法，其中所述疾病是癌症。

65.权利要求70所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤、肾癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、脑癌、白血病、前列腺癌、膀胱癌和卵巢癌。

66.权利要求65所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤。

67.权利要求66所述的方法，其中所述黑素瘤是转移性黑素瘤。

68.权利要求67所述的方法，其中所述溶瘤病毒是动脉内、静脉内、腹膜内或瘤内施用的。

69.权利要求68所述的方法，其中所述溶瘤病毒被施用两次或更多次。

70.权利要求69所述的方法，其还包括向所述对象施用至少第二抗癌治疗。

71.权利要求70所述的方法，其中所述第二抗癌治疗与所述重组病毒同时或依次施用。

72.权利要求71所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是免疫调节剂。

73.权利要求72所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是免疫治疗、化学治疗、放射治疗、基因治疗、外科手术、激素治疗、抗血管生成治疗或细胞因子治疗。

74.权利要求73所述的方法，其中所述免疫治疗是免疫检查点抑制剂治疗。

75.权利要求74所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂治疗包含用针对PD1、PDL1或CTLA4的抗体治疗。

76.权利要求75所述的方法，其中所述抗体是派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、度伐单抗或伊匹单抗。

77.在有此需要的对象中治疗疾病的方法，所述方法包括：

(a)测试所述对象的GAL9过表达；以及

(b)向具有提高的GAL9表达的对象施用治疗有效量的权利要求53所述的溶瘤病毒。

78.权利要求77所述的方法，其中所述疾病是癌症。

79.权利要求86所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤、肾癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、脑癌、白血病、前列腺癌、膀胱癌和卵巢癌。

80.权利要求79所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤。

81.权利要求80所述的方法，其中所述黑素瘤是转移性黑素瘤。

82.权利要求77所述的方法，其中所述溶瘤病毒是动脉内、静脉内、腹膜内或瘤内施用的。

83.权利要求77所述的方法，其中所述溶瘤病毒被施用两次或更多次。

84.权利要求77所述的方法，其还包括向所述对象施用至少第二抗癌治疗。

85.权利要求84所述的方法，其中所述第二抗癌治疗与所述重组病毒同时或依次施用。

86.权利要求84所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是免疫调节剂。

87.权利要求84所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是化学治疗、免疫治疗、放射治疗、基因治疗、外科手术、激素治疗、抗血管生成治疗或细胞因子治疗。

88.权利要求87所述的方法，其中所述免疫治疗是免疫检查点抑制剂治疗。

89.权利要求88所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂治疗包含用针对PD1、PDL1或CTLA4的抗体治疗。

90.权利要求89所述的方法，其中所述抗体是派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、度伐单抗或伊匹单抗。

91.权利要求89所述的方法，其中所述抗体是派姆单抗。

92.权利要求6所述的重组溶瘤黏液瘤病毒，其中所述人PD1的胞外区和IL-12在多于一个的表达盒中编码。

93.权利要求92所述的重组溶瘤黏液瘤病毒，其中IL-12被编码为融合蛋白，其中IL-12α亚基和IL-12β亚基通过柔性接头连接。

94.权利要求93所述的重组溶瘤黏液瘤病毒，其中所述柔性接头具有序列(GGGGS)_n。

95.权利要求92所述的重组溶瘤黏液瘤病毒，其中所述IL-12α亚基和IL-12β亚基由两个单独的DNA构建体表达。

96.权利要求92所述的重组溶瘤黏液瘤病毒，其中所述IL-12α亚基和IL-12β亚基在单独的启动子的控制下由单个DNA构建体表达。

97.权利要求92所述的重组溶瘤黏液瘤病毒，其中所述IL-12α亚基和IL-12β亚基在单独的启动子的控制下由单个DNA构建体表达。

98.权利要求1所述的重组溶瘤黏液瘤病毒，其中所述IL-12包含与SEQ ID NO:7和8具有至少90％同源性的序列。

99.权利要求2所述的重组溶瘤黏液瘤病毒，其中所述突变型可溶形式的PD1的包含与SEQ ID NO:5具有至少90％同源性的序列。

100.权利要求95所述的重组溶瘤黏液瘤病毒，其中所述IL-12α亚基包含与SEQ ID NO:7具有至少90％同源性的序列，并且所述IL-12β亚基包含与SEQ ID NO:8具有至少90％同源性的序列。

Claims (95)

1.包含一个或更多个表达盒的重组溶瘤病毒，所述表达盒编码(a)可溶形式的程序性细胞死亡蛋白1(PD1)和(b)白介素12(IL-12)或白介素2(IL-2)，其中所述病毒是可复制型的。

2.权利要求1所述的溶瘤病毒，其中所述病毒包含一个或更多个表达盒，所述表达盒编码(a)可溶形式的程序性细胞死亡蛋白1(PD1)和(b)白介素12(IL-12)。

3.包含一个或更多个表达盒的重组溶瘤病毒，所述表达盒编码突变型可溶形式的PD1(mutPD1)和任选白介素12(IL-12)或白介素2(IL-2)，其中所述病毒是可复制型的，并且其中所述mutPD1阻止抗PD1抗体识别mutPD1。

4.权利要求3所述的溶瘤病毒，其中所述病毒包含一个或更多个表达盒，所述表达盒编码突变型可溶形式的PD1(mutPD1)和白介素12(IL-12)。

5.权利要求3所述的溶瘤病毒，其中所述mutPD1在CD环中含有阻止抗PD1抗体的抗体识别的突变。

6.权利要求5所述的溶瘤病毒，其中所述mutPD1在CD环中含有点突变，所述点突变包含D85G。

7.权利要求6所述的溶瘤病毒，其中所述mutPD1不被派姆单抗识别。

8.权利要求1或3所述的溶瘤病毒，其中所述可溶性PD1包含人PD1的胞外区。

9.权利要求8所述的溶瘤病毒，其中所述人PD1的胞外区和IL-2或IL-12在单个表达盒中编码。

10.权利要求1或3所述的溶瘤病毒，其中所述一个或更多个表达盒在一种或更多种病毒启动子的控制下。

11.权利要求10所述的溶瘤病毒，其中所述一种或更多种病毒启动子是合成的早期/晚期痘病毒启动子。

12.权利要求11所述的溶瘤病毒，其中所述合成的早期/晚期痘病毒启动子与SEQ IDNO:20具有至少90％的同一性。

13.权利要求1或3所述的溶瘤病毒，其中所述病毒选自黏液瘤病毒、呼肠孤病毒、单纯疱疹病毒、新城疫病毒、麻疹病毒、逆转录病毒、痘病毒、弹状病毒、小核糖核酸病毒、柯萨奇病毒和细小病毒。

14.权利要求13所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是黏液瘤病毒。

15.权利要求14所述的溶瘤病毒，其中将所述PD1的胞外区、IL-2和/或IL-12的一个或更多个表达盒：(i)在病毒M153R开放阅读框处并入黏液瘤基因组中；或在M135基因与M136基因之间并入。

16.权利要求14所述的溶瘤病毒，其中将所述PD1的胞外区并入M135基因与M136基因之间。

17.权利要求14所述的溶瘤病毒，其中将所述IL-12的胞外区在病毒M153R开放阅读框处并入黏液瘤基因组中。

18.权利要求15所述的溶瘤病毒，其还包含标志物基因。

19.权利要求14所述的溶瘤病毒，其中IL-12与跨膜结构域融合。

20.权利要求19所述的溶瘤病毒，其中所述跨膜结构域由SEQ ID NO:12编码。

21.权利要求20所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒由SEQ ID NO:13编码。

22.权利要求1或3所述的溶瘤病毒的药物组合物。

23.在有此需要的对象中治疗疾病的方法，所述方法包括施用有效量的权利要求1或3所述的溶瘤病毒或权利要求22所述的药物组合物。

24.权利要求23所述的方法，其中所述疾病是癌症。

25.权利要求24所述的方法，其中所述癌症具有提高的程序性死亡配体1(PDL1)的表达。

26.权利要求24所述的方法，其中已确定所述对象患有表达提高的PDL1的癌症。

27.权利要求24所述的方法，其中所述癌症不具有提高的PDL1表达。

28.权利要求24所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤、肾癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、脑癌、白血病、前列腺癌、膀胱癌和卵巢癌。

29.权利要求24所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤。

30.权利要求29所述的方法，其中所述黑素瘤是转移性黑素瘤。

31.权利要求23所述的方法，其中所述溶瘤病毒是动脉内、静脉内、腹膜内或瘤内施用的。

32.权利要求23所述的方法，其中所述溶瘤病毒被施用两次或更多次。

33.权利要求23所述的方法，其还包括向所述对象施用至少第二抗癌治疗。

34.权利要求33所述的方法，其中所述第二抗癌治疗与所述重组病毒同时或依次施用。

35.权利要求33所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是免疫调节剂。

36.权利要求33所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是免疫治疗、化学治疗、放射治疗、基因治疗、外科手术、激素治疗、抗血管生成治疗或细胞因子治疗。

37.权利要求36所述的方法，其中所述免疫治疗是免疫检查点抑制剂治疗。

38.权利要求37所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂治疗包含用针对PD1、PDL1或CTLA4的抗体治疗。

39.权利要求38所述的方法，其中所述抗体是派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、度伐单抗或伊匹单抗。

40.权利要求55所述的方法，其中所述抗体是派姆单抗。

41.在有此需要的对象中治疗疾病的方法，所述方法包括：

(a)测试所述对象的PDL1过表达；以及

(b)向具有提高的PDL1表达的对象施用治疗有效量的权利要求1或3所述的溶瘤病毒。

42.权利要求41所述的方法，其中所述疾病是癌症。

43.权利要求42所述的方法，其中所述癌症具有提高的程序性死亡配体1(PDL1)的表达。

44.权利要求42所述的方法，其中所述癌症不具有提高的PDL1表达。

45.权利要求42所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤、肾癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、脑癌、白血病、前列腺癌、膀胱癌和卵巢癌。

46.权利要求42所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤。

47.权利要求46所述的方法，其中所述黑素瘤是转移性黑素瘤。

48.权利要求41所述的方法，其中所述溶瘤病毒是动脉内、静脉内、腹膜内或瘤内施用的。

49.权利要求41所述的方法，其中所述溶瘤病毒被施用两次或更多次。

50.权利要求41所述的方法，其还包括向所述对象施用至少第二抗癌治疗。

51.权利要求50所述的方法，其中所述第二抗癌治疗与所述重组病毒同时或依次施用。

52.权利要求50所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是免疫调节剂。

53.权利要求50所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是化学治疗、免疫治疗、放射治疗、基因治疗、外科手术、激素治疗、抗血管生成治疗或细胞因子治疗。

54.权利要求53所述的方法，其中所述免疫治疗是免疫检查点抑制剂治疗。

55.权利要求54所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂治疗包含用针对PD1、PDL1或CTLA4的抗体治疗。

56.权利要求55所述的方法，其中所述抗体是派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、度伐单抗或伊匹单抗。

57.包含一个或更多个表达盒的重组溶瘤病毒，所述表达盒编码可溶形式的T细胞免疫球蛋白及含黏蛋白结构域3(TIM3)。

58.权利要求57所述的溶瘤病毒，其中所述可溶性TIM3包含鼠TIM3的胞外区。

59.权利要求57所述的溶瘤病毒，其中所述一个或更多个表达盒在一种或更多种病毒启动子的控制下。

60.权利要求60所述的溶瘤病毒，其中所述一种或更多种病毒启动子是合成的早期/晚期痘病毒启动子。

61.权利要求57所述的溶瘤病毒，其中所述病毒选自黏液瘤病毒、呼肠孤病毒、单纯疱疹病毒、新城疫病毒、麻疹病毒、逆转录病毒、痘病毒、弹状病毒、小核糖核酸病毒、柯萨奇病毒和细小病毒。

62.权利要求61所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是黏液瘤病毒。

63.权利要求62所述的溶瘤病毒，其中将所述在病毒M153R开放阅读框处并入黏液瘤基因组中。

64.权利要求63所述的溶瘤病毒，其还包含标志物基因。

65.权利要求64所述的溶瘤病毒，其中所述标志物基因是增强型绿色荧光蛋白(eGFP)。

66.权利要求57所述的溶瘤病毒的药物组合物。

67.在有此需要的对象中治疗疾病的方法，所述方法包括施用有效量的权利要求57所述的溶瘤病毒或权利要求66所述的药物组合物。

68.权利要求67所述的方法，其中所述疾病是癌症。

69.权利要求74所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤、肾癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、脑癌、白血病、前列腺癌、膀胱癌和卵巢癌。

70.权利要求69所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤。

71.权利要求70所述的方法，其中所述黑素瘤是转移性黑素瘤。

72.权利要求71所述的方法，其中所述溶瘤病毒是动脉内、静脉内、腹膜内或瘤内施用的。

73.权利要求72所述的方法，其中所述溶瘤病毒被施用两次或更多次。

74.权利要求73所述的方法，其还包括向所述对象施用至少第二抗癌治疗。

75.权利要求74所述的方法，其中所述第二抗癌治疗与所述重组病毒同时或依次施用。

76.权利要求75所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是免疫调节剂。

77.权利要求76所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是免疫治疗、化学治疗、放射治疗、基因治疗、外科手术、激素治疗、抗血管生成治疗或细胞因子治疗。

78.权利要求77所述的方法，其中所述免疫治疗是免疫检查点抑制剂治疗。

79.权利要求78所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂治疗包含用针对PD1、PDL1或CTLA4的抗体治疗。

80.权利要求79所述的方法，其中所述抗体是派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、度伐单抗或伊匹单抗。

81.在有此需要的对象中治疗疾病的方法，所述方法包括：

(a)测试所述对象的GAL9过表达；以及

(b)向具有提高的GAL9表达的对象施用治疗有效量的权利要求57所述的溶瘤病毒。

82.权利要求81所述的方法，其中所述疾病是癌症。

83.权利要求90所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤、肾癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、脑癌、白血病、前列腺癌、膀胱癌和卵巢癌。

84.权利要求83所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤。

85.权利要求84所述的方法，其中所述黑素瘤是转移性黑素瘤。

86.权利要求81所述的方法，其中所述溶瘤病毒是动脉内、静脉内、腹膜内或瘤内施用的。

87.权利要求81所述的方法，其中所述溶瘤病毒被施用两次或更多次。

88.权利要求81所述的方法，其还包括向所述对象施用至少第二抗癌治疗。

89.权利要求88所述的方法，其中所述第二抗癌治疗与所述重组病毒同时或依次施用。

90.权利要求88所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是免疫调节剂。

91.权利要求88所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是化学治疗、免疫治疗、放射治疗、基因治疗、外科手术、激素治疗、抗血管生成治疗或细胞因子治疗。

92.权利要求91所述的方法，其中所述免疫治疗是免疫检查点抑制剂治疗。

93.权利要求92所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂治疗包含用针对PD1、PDL1或CTLA4的抗体治疗。

94.权利要求93所述的方法，其中所述抗体是派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、度伐单抗或伊匹单抗。

95.权利要求93所述的方法，其中所述抗体是派姆单抗。

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