KR102047030B1 - 바이러스 벡터 제조 - Google Patents

바이러스 벡터 제조 Download PDF

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KR102047030B1
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Abstract

본 발명은 변형된 포유동물 세포로서 상기 세포의 게놈은 프로모터의 조절 하에서 CP77을 인코딩하는 서열을 포함하도록 변형되고 상기 변형된 세포주는 변형되지 않은 세포에서 거의 증식할 수 없거나 또는 증식할 수 없는 폭스 바이러스의 증식을 지속시키는 것인 변형된 포유동물 세포에 관한 것이다.

Description

바이러스 벡터 제조{VIRAL VECTOR MANUFACTURE}
[0001] 본 출원은 2013년 11월 1일에 출원된 호주 특허출원 번호 2013904242 및 2014년 2월 7일에 출원된 호주 특허출원 번호 2014900370과 관련되어 있고 이에 대한 우선권을 수반하며, 이들 출원 각각의 전체 내용을 참조로서 본 명세서에 포함한다.
발명의 분야
[0002] 본 발명은 폭스바이러스-기반된 의약을 증식시켜 제조하기에 적합한 세포 및 세포주의 개발에 관한 것이다. 특히, 본 명세서는 치료제 또는 예방제의 제조를 위해 그러한 폭스바이러스를 증식시키기 위한 재조합 변형된 세포내 기질에 관한 것이다.
[0003] 본 명세서 내 참고문헌들의 상세한 서지사항은 본 명세서의 끝에 나열되어 있다.
[0004] 어떠한 선행 공개문헌 (또는 이로부터 유래된 정보), 또는 공지된 어떠한 문제에 대한 본 명세서 내 참고문헌은 인정 또는 승인 또는 그러한 선행 공개문헌 (또는 이로부터 유래된 정보) 또는 알려진 문제가 아니며, 인정 또는 승인 또는 그러한 선행 공개문헌 (또는 이로부터 유래된 정보) 또는 알려진 문제가 본 명세서가 관련되어 있는 연구 분야에서 일반적인 지식의 일부를 형성하는 어떠한 형태의 제안으로 간주되지 않는다.
[0005] 본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌들은 그 전문이 참조로서 본 명세서에 삽입된다.
[0006] 폭스 바이러스 패밀리는 2개의 서브패밀리인 코르도폭스비리내(Chordopoxvirinae) 및 엔토모폭스비리내(Entomopoxvirinae)로 구성된다. 코르도폭스비리내는 인간을 감염시키는 종을 포함하는 오르토폭스비리대(Orthopoxviridae) (예를 들어, 바리올라 바이러스, 천연두의 원인인자, 카우폭스 바이러스 (1796년에 Jenner에 의해 보고된 원래의 천연두 백신을 형성하였던), 백시니아 바이러스 (2세대 천연두 백신으로서 이용됨) 및 원두 바이러스), 및 계두 및 카나리아 바이러스 같은 새를 감염시키는 종을 포함하는 아비폭스비리대(Avipoxviridae) 바이러스를 포함하는 8개의 속으로 구성된다. 천연두 백신에서 항원으로서의 이들의 용도 외에도, 재조합 백시니아-기반된 바이러스 및 "백본" 벡터로서의 아비폭스 바이러스의 이용에 대한 많은 관심이 있다. 세포 내-세포질 벡터로서, 상기 오르토폭스비리대는 외래 항원을 숙주 세포질로 운반시킬 수 있으며 그 중에서도 세포 표면 위로의 제시를 위해 항원을 펩타이드로 프로세싱하는 항원 프로세싱 경로를 유발할 수 있다. 외래 항원을 발현시키는 그러한 벡터는 다른 백신화 전략에 의해 치료하기 어려운 것으로 증명되었던 AIDS, 결핵, 말라리아 및 암 같은 질병들을 위한 백신의 개발에 이용되고 있다.
[0007] 코르도폭스비리내는 파라목스바이러스의 130kb부터 아비폭스바이러스 내 300kb를 넘는 크기의 범위인 선형 이중-가닥 DNA 게놈을 가지고 전체적으로 숙주 내 라이프 사이클은 숙주세포 세포질에서 이루어진다. 상기 폭스바이러스는 실질적으로 이들의 숙주세포 및 숙주세포 분자들과 독립적으로 작용하는데, 특히 초기 mRNA 합성에 포함된 과정들에 있어서 독립적으로 작용한다. 하지만, 숙주 분자들은 중간 및 후기 바이러스 전사의 개시 또는 종결에 이용되는 것으로 보인다. 상기 폭스바이러스는 바이러스 복제를 허용하는 세포내 조건을 가능하게 하는 숙주 시그널링 경로들을 특이적으로 타겟팅하고 조작하는 구조적으로 다양한 "숙주 범위 인자들"을 생산한다. 대부분의 폭스바이러스는 포유동물 세포에 결합하고 감염시킬 수 있지만, 이후 감염이 감수성 (감염성 비리온을 생산할 수 있는) 또는 비-감수성 (실질적으로 감염성 비리온을 생산할 수 없는)인 지는 특이적 폭스바이러스 및 이에 포함된 특이적 세포 타입에 의존한다. 폭스 바이러스-숙주 상호작용의 분자적 레벨, 특히 숙주-범위 유전자, 및 바이러스 및 세포내 증식 모두를 촉진하는 연관성을 조절하는 인자들에 대해 상대적으로 현재까지 거의 알려진 게 없다. 숙주 범위 유전자들의 검토를 위해 Werden 등 2008이 참조될 수 있고, 이의 전문이 본 명세서에 삽입된다.
[0008] 천연두 백신 및 이후 바이러스 벡터로서 백시니아 스트레인의 용도와 관련된 백시니아 스트레인에 대한 관찰은 1960년대 초기부터 현재까지 공지되어왔었다. 천연두 백신으로 기능하는 스트레인들을 포함하는 백시니아의 어떤 스트레인들은 인간세포에서 증식할 수 있어서 바이러스 뇌염의 발생 같은 건강상의 위험을 나타낸다. 더 안전한 백신을 개발하기 위한 목적으로, 안카라 ("CVA"로 언급됨)로부터 유래된 백시니아 스트레인은 비-인간 세포에서 500번 이상 패시징되었다. 이러한 과정 동안 백시니아 게놈은 원래의 CVA 게놈과 비교하여 적어도 6개의 주요 결실의 발생을 포함하여 실질적으로 변화하였다. 상기 변형된 바이러스는 인간에게 덜 병원성을 가졌지만 여전히 보호 면역 반응을 유발할 수 있었다. 이러한 약화된 백시니아 바이러스는 MVA (변형된 백시니아 안카라)로서 언급되고 또한 다른 패시지 수를 가진 바이러스들이 유전학적 및 표현형적 특징으로 밝혀졌기 때문에 패시지 수에 의해 분류된다. 하지만, 패시지 수 515에 따른 MVA515는 유전학적으로 안정적인 것으로 이해되었다. 1990년대 초기에, MVA572 같은 MVA 스트레인들 및 이의 유도체인 MVA F6는 비-감수성 세포 (상기 세포에서 상기 바이러스가 증식하지 않을 것이다)에서 높은 레벨로 백시니아 단백질 및 이종 (재조합) 단백질을 발현할 수 있는 것으로 관찰되어 백신을 위한 항원을 인코딩하는 분자들 또는 치료제 운반 같은 목적 이종 분자들에 대한 벡터로서 MVA의 개발을 가능하게 하였다.
[0009] 보다 최근에, MVA의 6개의 거대한 알려진 결실을 CVA로 도입시켜 MVA의 특성을 가지는 변형된 백시니아 바이러스를 생산하고자 하는 시도가 있었다. 흥미롭게도, 이러한 시도는 MVA의 약화된 특징을 가지는 바이러스를 초래하지 않았다. 숙주 범위 유전자의 부재가 상기 관찰된 약화를 책임질 것으로 제안되었지만, 이것은 입증되지 않았다 (예를 들어, Meyer 등, Journal of General Virology (1991) 72:1031-1038을 참조하시오.
[0010] 폭스바이러스는 거대, 선형 dsDNA 게놈, 증식을 위한 세포질 위치 및 복합적 비리온 형태에 의해 특징화되는 바이러스의 거대 패밀리를 구성한다. 백시니아 바이러스는 이러한 그룹의 바이러스의 대표적 바이러스이며 바이러스 형태형성의 측면에서 가장 많이 연구된다. 백시니아 바이러스 비리온은 "측면체들(lateral bodies)"에 의해 플랭킹된 벽을 가진, 양면이 오목한 코어로 특징화되는 복합적 내부 구조를 가지는 "벽돌 형태(brick shaped)" 또는 "타원형" 막-결합된 입자들처럼 보인다. 상기 비리온 어셈블리 경로는 미성숙 비리온 (immature virions, IVs)로 발생한 후 성숙 비리온 (mature virions, MVs)으로 진화하는 크레센트(crescents)를 포함하는 막의 형성을 포함한다. 백시니아 바이러스 비리온 내에는 70개 이상의 특이적 유전자 산물을 포함하고, 백시니아 바이러스 어셈블리 상에 50개 이상의 특이전 유전자들에서 돌연변이의 효과가 현재 알려져 있다.
[0011] 백시니아 바이러스는 숙주세포의 세포막과 백시니아 바이러스의 표면 막의 융합에 의해 세포 내로 들어가고, 상기 코어 (및 측면체들)을 세포질로 배출하여 바이러스 전사 프로그램을 활성화시킨다. 상기 비리온 코어는 초기 mRNA의 합성 및 변형에 요구되는 바이러스-코딩된 효소들의 전체 보체를 포함한다. 초기 유전자들은 DNA 증식에 필요한 효소들을 인코딩하여, 초기 유전자 발현 피크로서 바이러스 DNA 증식이 "공장(factories)"으로 명명된 세포질 위치에서 발생한다. 또한 초기 유전자들은 중간 전사 인자들을 인코딩하며, 순차적으로 중간 유전자들은 후기 전사 인자들을 인코딩하는데, 이에 따라 바이러스 DNA 증식의 필수적인 개시 후 중간 및 후기 유전자들이 연속적으로 발현한다. 따라서, 바이러스 유전자들의 완전한 보체는 클래스-특이적 전사적 프로모터 및 바이러스 인코딩된 전사 인자들에 의해 구별되는 초기, 중간 및 후기 클래스들과 함께 일시적 캐스캐이드로 전사된다. 더 나아가, 증식된 게놈만이 중간 및 후기 전사를 위한 능력있는 템플레이트가 된다. 이들 2개의 클래스의 유전자들이 비리온 구조적 단백질, 비리온 효소, 및 어셈블리 인자들을 함께 인코딩하고 새로운 자손 바이러스 입자들의 어셈블리에 필요하다.
[0012] 바이러스 흡수 및 초기 발현 후 빠르게 감염-특이적 세포질 도메인들이 밀도가 균일하고 시간에 따라 크기가 증가하는 소포체 (ER) 유래된 시스터네에 의해 때때로 둘러쌓여 있는 세포 내에서 형성된다. 이러한 도메인들은 바이러스 DNA 증식의 위치를 나타내며 종종 "바이러스 공장들(viral factories)"로 불리운다.
[0013] 바이러스 어셈블리는 상기 바이러스 공장 내에 견고한 크레센트-형태의 구조 (3차원에서 빨판)의 형성으로 시작한다. 고해상도 전자 현미경 사진에서 이러한 크레센트-형태의 구조의 외부 층은 "침상체(spicules)"로 명명되는 규칙적으로-간격 형성된 돌출부로 구성된다. 크레센트는 미성숙 비리온 (IV)로 불리우는 밀폐된 원을 형성할 때까지 (3차원에서 구체) 동일한 곡률을 유지하면서 길이적으로 뚜렷하게 성장한다. IV는 밀도적으로 균일하지만 주변 공장보다 더 전자 밀도가 명확하게 높은 "바이러스원형질(viroplasm)" 물질로 채워진다. 상기 IVs 형태로서 포집된 DNA의 흡수도 일어난다: 이들은 "뉴클레오이드(nucleoid)"로 불리우는 IVs 내 전자 밀집되거나, 둥글거나 또는 타원형의 서브도메인으로서 전자 현미경 사진에서 보여진다. 응집된 DNA의 뉴클레오이드를 포함하는 IVs는 "IVN"으로서 종종 언급된다. 단백질 가수분해적 분해를 통한 여러 비리온 단백질 전구체들의 성숙은 성숙 비리온 (MV)으로의 IVN의 형태형성에 필수적이다. 성숙 비리온의 대부분은 공장 외부에서 발견되고 공장 주변 또는 가장 근접한 공장으로부터 유의한 거리로 확실하게 분리된 부분 중 어느 하나에서 클러스터로 존재할 수 있다.
[0014] 폭스바이러스 비리온은 3개의 감염 형태로 존재한다: 성숙 비리온 (MV), 포장된 비리온 (wrapped virions, WV), 및 세포외 비리온 (extracellular virions, EV). 상기 바이러스의 가장 간단한 형태인 MV는 코어의 오목한 곳을 채우는 측면체들에 의해 플랭킹된 양면이 오목한, DNA-함유 코어를 포함하는 막을 가진 입자들이다. MV는 정상적으로는 세포 내부에서만 발견되며 세포 용해에 의해서만 해방된다. WV는 트랜스-골지 시스터네로부터 유래된 2개의 추가적인 지질 이중막에 의해 둘러쌓인 MV로 구성된다. 외부 막이 특징적인 바이러스 단백질을 포함하는 WV는 EV의 전구체이고 또한 세포 내부에서 발견된다. EV는 세포막과의 최외관 WV 막의 융합을 통해 엑소사이토시스되는 WV로 구성되어 하나의 추가적인 막으로 포장된 MV로 이루어진다. EV의 분획은 세포 표면에 부착되어 발견되고, 몇몇은 세포외 배지에서 자유로운 상태로 발견된다. EV는 생물체 내 바이러스의 전파를 위해 중요한 것으로 여겨진다.
[0015] 바이러스로부터 필수 유전자들의 제거 및 숙주세포 내 보충성(complementation)은 치료 및 치료법을 위한 안전하고 효과적인 바이러스 벡터를 발생시키기 위해 일반적으로 제안된 전략으로서 당업계에 알려져 있다. 증가된 안정성, 발현 및/또는 면역원성을 가진 개선된 약화된 오르토폭스 벡터들에 대한 요구가 있으며 그러한 오르토폭스 벡터를 안전하고 경제적으로 증식시키고 제조하기 위한 방법에 대한 상응하는 요구가 있다.
[0016] 많은 포유동물 세포주들이 연구 목적으로 재조합 단백질의 제조에 이용되고 있다. 이러한 세포주들은 래빗, 햄스터, 영장류 및 인간 유래된 세포주들을 포함하는데, 예컨대 당업계에 알려진 대로 HEK293, 293T, 143B, CHO, HeLa, Vero 및 BHK, HepG2, 및 3T3 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 하지만, 특히 재조합 치료 단백질 대부분의 GMP 제조는 CHO 세포에서 이루어졌으며, 이것은 이 세포주를 인간 치료법을 위한 가장 잘 연구되고 승인된 세포주로 만들었다. CHO 세포는 현탁 배양에서 매우 높은 밀도로 성장할 수 있고 산물을 정제하기 위한 다운스트림 과정들이 매우 잘 확립되어 있다. 이와 관련하여, 백시니아-COP 또는 백시니아-WR 같은 백시니아 또는 MVA 및 NYVAC 같은 이의 유도체들 중 어느 것도 CHO 세포에서 증식하지 않는다.
[0017] 국소 바이러스 프로모터 및 폭스 바이러스 RNA 폴리머라제의 조절 하에서 상기 폭스 바이러스로부터 유래된 바이러스 숙주 범위 유전자들의 발현은 당업계에 알려져 있다.
[0018] 바이러스 복제를 구출 또는 허용하고 숙주세포 생존을 허용하기 위해 적절한 시기에 포유동물 세포의 게놈으로부터 어떤 바이러스 숙주 범위 유전자들의 발현은 이전에 알려지지 않았다.
[0019] 본 명세서는 폭스바이러스 숙주 범위 인자를 발현하기 위해 형질전환된 인 비트로 배양된 포유동물 세포 및 그러한 세포를 배양하는 단계를 포함하는 바이러스 벡터를 증식하는 방법을 기술한다.
[0020] 첫 번째 양태에서 본 발명은 변형된 세포주는 변형되지 않은 세포에서 거의 증식할 수 없거나 또는 증식할 수 없는 폭스 바이러스의 증식을 지속시키도록 세포의 게놈은 프로모터의 조절 하에서 CP77을 인코딩하는 서열을 포함하도록 변형되는 변형된 포유동물 세포를 제공한다.
[0021] 두 번째 양태에서 본 발명은 CHO 세포에서 증식하지 않는 오르토폭스바이러스를 증식시키는 과정으로서, 상기 과정은 상기 폭스바이러스를 포유동물 세포주에서 인 비트로 증식시키는 단계를 포함하며 상기 세포주는 프로모터의 조절 하에서 CP77을 인코딩하고 발현시키도록 변형되는 것인 과정을 제공한다.
[0022] 다양한 택일적인 구현예들에서 상기 변형된 세포는 프로모터의 조절 하에서 D13L을 인코딩하는 서열을 포함하고/포함하거나 프로모터의 조절 하에서 K1L을 인코딩하는 서열을 포함하도록 추가적으로 변형된다.
[0023] 본 명세서에서 "CP77", "K1L" 및 "D13L"에 대한 레퍼런스는 기능적 오솔로그(orthologs) 및 기능적 변이체를 포함한다.
[0024] 대상 발명은 특정 과정 또는 제제, 제제의 특이적 제형 및 다양한 의학적 방법학들이 다양하기 때문에 그러한 것에 제한되지 않는다. 본 명세서에서 이용되는 명명학은 특정 구현예들만을 기술하기 위한 목적일 뿐이며 이에 제한하고자 하는 것은 아니다. 다르게 특정되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야 내 숙련자에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
[0025] 본 명세서에서 기재되는 물질 및 방법들과 유사하거나 또는 균등한 어떠한 물질 및 방법들이 본 발명을 실시하거나 테스트하기 위해 이용될 수 있다. 전문직 종사자는 특히: Sambrook 등, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, N.Y.; Ausubel 등 (1999) Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York; Murphy 등 (1995) Virus Taxonomy Springer Verlag:79-87, Mahy Brian WJ and Kangro O Hillar (Eds): Virology Methods Manual 1996, Academic Press; 및 Davison AJ and Elliott RM (Eds): Molecular Virology, A practical Approach 1993, IRL Press at Oxford University Press; Perkus 등, Virology (1990) 179(1):276-86 또는 통상의 기술자에게 알려진 당업계의 정의 및 용어 및 다른 방법들을 참고한다.
[0026] 본 명세서에서 기재되는 물질 및 방법들과 유사하거나 또는 균등한 어떠한 물질 및 방법들이 본 발명의 실행 또는 테스팅에 이용될 수 있을 지라도, 선호되는 방법 및 물질들이 기재된다. 본 발명의 목적을 위해, 다음의 용어들이 하기에 정의되어 있다.
[0027] 본 명세서 전반에 걸쳐서, 맥락이 다르게 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)", "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 기재된 단계 또는 요소(element) 또는 단계들 또는 요소들의 군의 포함을 의미하는 것으로 이해될 것이지만 어떠한 다른 단계 또는 요소 또는 단계들 또는 요소들의 군의 배제를 의미하는 것으로 이해되지 않을 것이다. 따라서, 상기 용어 "포함하는" 및 이와 유사한 것의 사용은 나열된 요소들이 요구되거나 의무적인 것을 지시하지만, 다른 요소들이 선택적이고 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 것을 나타낸다. 약화된 오르토폭스 벡터의 맥락에서, 대상 벡터는 약화를 위해 필수적인 성숙 또는 어셈블리 유전자의 결실을 포함하도록 변형되지만 항원 또는 다른 단백질을 매개하기 위한 그러한 추가적인 변형이 포괄된다.
[0028] 무엇이든 간에 구 "이루어진(consisting of)"는 "이루어진"을 포함하고, 이에 제한된다는 것을 의미한다. 따라서, 상기 구 "이루어진"은 나열된 요소들이 요구되거나 의무적이며, 다른 요소들이 존재하지 않을 것이라는 것을 지시한다. "본질적으로 이루어진(consisting essentially of)"은 상기 구 이후에 나열된 어떠한 요소들을 포함하는 것을 의미하고, 상기 나열된 효소들에 대한 개시사항에 특화된 활성 또는 활동을 방해하지 않거나 기여하지 않는 다른 요소들에 제한되는 것을 의미한다. 따라서, 상기 구 "본질적으로 이루어진"은 나열된 요소들이 요구되거나 의무적인 것을 지시하지만, 그들이 상기 나열된 요소들의 활성 또는 활동에 영향을 미치는 지 여부에 따라 다른 요소들이 선택적이고 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 것을 나타낸다.
[0029] 본 명세서에서 사용되는 대로 단수형 "a", "an" 및 "the"는 맥락이 확실하게 지시하지 않는 한 복수 형태를 포함한다. 따라서, 예를 들어 "하나의 세포(a cell)"에 대한 언급은 단일 세포 뿐 아니라 2개 이상의 세포들을 포함한다; "하나의 생물체(an organism)"에 대한 언급은 하나의 생물체 뿐 아니라 2개 이상의 생물체를 포함한다; 등등. 몇몇 구현예들에서, "an"은 "하나 또는 하나 이상(one or more than one)"을 의미한다.
[0030] 본 명세서에서 사용되는 대로, "및/또는"은 하나 또는 이상의 연관되어 나열된 항목들의 어떠한 조합 및 모든 가능한 조합 뿐 아니라 선택사항으로 해석되는 경우 (또는) 조합의 부재를 의미하고 이를 포괄한다.
[0031] 본 명세서에서 사용되는 대로 "약화(Attenuation)" 또는 "약화된(attenuated)"은 바이러스 벡터 병독성의 감소를 의미한다. 병독성은 특정 숙주에서 질병을 야기하는 바이러스의 능력으로서 정의된다. 감염성 바이러스를 생산할 수 없는 폭스바이러스 벡터는 초기에 세포를 감염시킬 수 있지만 실질적으로 그 자체로 완전하게 복제하거나 숙주 내에서 증식하거나 상태를 야기할 수 없다. 이것은 벡터가 숙주세포 세포질로 단백질 또는 핵산을 운반하지만, 대상체에 해롭지 않기 때문에 바람직하다.
[0032] 특정 폭스바이러스, 벡터, 플라스미드 또는 세포에 작동가능하게 결합된 코딩 서열의 발현에 필요한 핵산 서열 (예컨대, DNA)는 "조절 요소" 또는 "조절 서열"을 의미한다. 진핵세포에 적합한 조절 서열은 프로모터, 폴리아데닐화 시그널, 전사적 인핸서, 번역 인핸서 및 내부 리보좀 결합 위치(IRES) 같은 번역 조절 서열, mRNA 안정성을 조절하는 핵산 서열, 뿐 아니라 전사된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 산물을 세포 내 세포내 구획 또는 세포외 환경으로 타겟팅하는 타겟팅 서열을 포함한다.
[0033] 서열이 제공되는 경우, 상응하는 서열이 포괄된다. "에 상응하다(corresponds to)" "상응하는(corresponding)" 또는 "에 상응하는(corresponding to)"는 레퍼런스 핵산 서열에 대한 구체적인 서열 동일성을 보여주는 핵산 서열 (예컨대, 상기 레퍼런스 핵산 서열의 전체 또는 일부에 대해 적어도 약 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 97, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 심지어 100%까지의 서열 동일성) 또는 레퍼런스 아미노산 서열에 대해 구체적인 서열 유상성 또는 동일성을 나타내는 아미노산 서열 (예컨대, 상기 레퍼런스 아미노산 서열의 전체 또는 일부에 대해 적어도 약 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 97, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 심지어 100%까지의 서열 유사성 또는 동일성)을 의미한다.
[0034] 타겟 항원 또는 생물체에 대해 상태를 치료 또는 예방하거나 또는 면역반응을 조절하는 맥락에서 "효과적인 양"은 증상을 치료하거나, 그러한 증상을 체크하여 멈추거나, 및/또는 존재하는 증상을 치료하기 위한 예방, 그러한 상태의 예방 또는 타겟 항원 또는 생물체에 대해 면역 반응을 조절하기 위해 효과적인 제제의 양의 투여 (예컨대, 본 명세서에 기재된 대로 약화된 오르토폭스 벡터) 또는 그러한 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에 단일 투여량 또는 연속 투여의 일부 중 어느 하나로 동일하게 포함되는 조성물을 의미한다. 상기 효과적인 양은 치료될 개체의 건강 및 물리적 상태, 치료될 개체의 분류학적 군, 조성물의 제형, 의학적 상태의 평가, 및 다른 관련 인자들에 따라 다양할 것이다. 상기 양이 일상적인 임상을 통해 결정될 수 있는 상대적으로 넓은 범위에 속할 것이라는 것이 예상된다.
[0035] 본 명세서에서 사용되는 대로, 상기 용어 "인코딩한다(encode)", "인코딩하는(encoding)" 및 이와 유사한 것은 다른 핵산 또는 폴리펩타이드를 제공하는 핵산의 능력을 의미한다. 예를 들어, 핵산 서열은 폴리펩타이드를 생산하도록 전사 및/또는 번역될 수 있거나 또는 폴리펩타이드를 생산하도록 전사 및/또는 번역될 수 있는 형태로 프로세싱될 수 있다면 폴리펩타이드를 "인코딩한다"고 언급된다. 그러한 핵산 서열은 코딩 서열 또는 코딩 서열 및 비-코딩 서열 모두를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 용어 "인코딩한다", "인코딩하는" 및 이와 유사한 것은 DNA 분자의 전사로부터 초래되는 RNA 산물, RNA 분자의 번역으로부터 초래되는 단백질, DNA 분자의 전사로부터 RNA 산물을 형성하고 이후 상기 RNA 산물의 번역을 초래하는 단백질, 또는 DNA 분자의 전사로부터 RNA 산물을 제공하고, 상기 RNA 산물의 프로세싱을 통해 프로세싱된 RNA 산물 (예컨대, mRNA) 및 이후 상기 프로세싱된 RNA 산물의 번역을 초래하는 단백질을 포함한다.
[0036] 상기 용어 "내인성(endogenous)"은 정상적으로 숙주 생물체에서 발견되는 유전자 또는 핵산 서열 또는 절편을 의미한다.
[0037] 상기 용어 "발현가능한(expressible)", "발현된(expressed)", 및 이의 변이체는 뉴클레오타이드 서열을 RNA로 전사하고 선택적으로 상기 mRNAm를 번역하여 생물학적 또는 생화학적 기능을 제공하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 합성하는 세포의 능력을 의미한다.
[0038] 본 명세서에서 사용되는 대로, 상기 용어 "유전자"는 mRNA를 생산하는 데 이용될 수 있는 핵산 분자를 포함하고 선택적으로 이러한 과정에 도움을 주는 요소들의 첨가를 포함한다. 유전자는 기능성 단백질을 생산하기 위해 이용될 수 있거나 또는 이용될 수 없다. 유전자는 코딩 부위 및 비-코딩 부위 (예컨대, 인트론, 조절성 요소, 프로모터, 인핸서, 종결 서열 및 5' 및 3' 비번역된 부위) 모두를 포함할 수 있다.
[0039] 상기 용어 "이종성 핵산 서열", "이종성 뉴클레오타이드 서열", "이종성 폴리뉴클레오타이드", "외래 폴리뉴클레오타이드", "외인성 폴리뉴클레오타이드" 및 이와 유사한 것은 실험적 조작에 의해 생물체의 게놈 내로 도입되는 어떠한 핵산 (예컨대, IRES를 포함하는 뉴클레오타이드 서열)을 의미하는 것으로 상호교환하여 이용되고, 상기 도입된 유전자가 변형 전에 바이러스 게놈 서열에 대한 일부 변형 (예컨대, 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 점 돌연변이, 결실, 치환 또는 부가, 엔도뉴클레아제 절단 위치의 존재, loxP 위치의 존재, 등)을 포함하는 한 그러한 생물체에서 발견되는 유전자 서열을 포함할 수 있다.
[0040] 상기 용어 "이종성 폴리뉴클레오타이드", "외래 폴리펩타이드" 및 "외인성 폴리펩타이드"는 상기 정의된 바와 같은 "이종성 핵산 서열", "이종성 뉴클레오타이드 서열", "이종성 폴리뉴클레오타이드", "외래 폴리뉴클레오타이드" 및 "외인성 폴리뉴클레오타이드"에 의해 인코딩되는 어떠한 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미하는 것으로 상호교환적으로 이용된다.
[0041] 상기 용어 "포유동물 세포"는 본 발명의 약화된 오르토폭스 벡터를 포함하는 벡터가 폭스바이러스 벡터를 증식할 목적으로 도입될 수 있는 세포를 의미한다. 하나의 구현예에서, 상기 세포는 무한증식 세포주(continuous cell line)이다. 상기 변형된 세포가 끊임없이 분열할 수 있는 세포주라는 것이 반드시 필수적인 것은 아니다. 포유동물 또는 보다 고등 진핵세포는 본 발명에 따라 변형된 후 형질전환 또는 불멸화되어 지속적으로 분열하는 세포주가 될 수 있다. 하지만, 변형 전 세포는 매우 잘 특징화되어 있으며 생명공학 적합한 당업계에 알려진 무한증식 세포주로 끊임없이 분열한다. 그러한 세포들은 ATCC (American Type Culture Collection) 또는 ECACC (European Collection of Cell Cultures) 같은 기탁 기관들로부터 쉽게 이용가능하다.
[0042] 적합한 포유동물 세포주는 RK18, BHK, VERO, HBOC-143B, HaCat, HepG2, HeLa, HT1080, HEK-293, RD, COS-7, CHO, Jurkat, HUT, SUPT, C8166, MOLT4/clone8, MT-2, MT-4, H9, PM1, CEM, 골수종 세포 (예컨대, SB20 세포)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니고, 예를 들어 CEMX174는 ATCC로부터 이용가능하다.
[0043] 이종 유전자들을 발현하는 변형된 세포주를 생산하기 위한 당업계에 알려진 어떠한 게놈 공학 방법이 이용될 수 있다. 피기백(piggyBac) 벡터를 이용하여 유전자를 세포내 게놈으로 삽입하는 트랜스포존 기술의 이용이 참조된다. 하지만, 레트로바이러스 트랜스덕션 (예컨대, MoMLV, 등), 렌티바이러스 트랜스덕션, 플라스미드 형질전환 및 통합, 아데노바이러스, AAV (아데노바이너스 연관된 바이러스), EBV 및 선형 DNA, 조작된 메가뉴셀라제, 전사-활성인자 유사 이펙터 뉴클레아제 (TAL-뉴클레아제), Zinc-finger-뉴클레아제 (ZFNs) 및 CRISPRs를 이용한 동종 재조합에 의한 위치 특이적 삽입을 위한 게놈 편집 기술 같은 세포주를 형질전환시키기 위한 다른 바이러스 시스템을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 유전자를 세포 내로 도입하기 위한 많은 방법들이 알려져 있다.
[0044] 하나의 구현예에서, 상기 포유동물 세포는 CHO 세포이다. 바이러스 숙주 명 유전자를 인코딩하지 않는 선행 기술인 CHO 세포주들은 인간 내에서 실질적으로 증식할 수 없는 백시니아 또는 백시니아 유도체들의 제조를 지지하지 않는다. 통상의 기술자들에게 알려진 대로, 햄스터, 크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus)의 난소로부터 유래된 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포는 항체를 포함하는 재조합 단백질 치료법의 생물-산업적 및 GMP 생산을 위해 가장 일반적으로 이용되는 포유동물 세포이다. 이러한 목적을 위한 CHO 세포의 대중성은, 부분적으로 빠른 성장 및 높은 단백질 생산으로부터 기인한다. 그 결과, CHO 세포주는 잘 특징화되었다. 적합한 CHO 세포주는 A2, A2H, XrS6, CHO-K1, CHO/dhfr, RR-CHO-K1, UT-I, P22, CHO-1C6, Lec1, Lec2, Lec8, Pro-5 및 CDKXB1 라인을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 접근번호 ATCC CLL-61 또는 ATCC CRL-9618로 ATCC에 기탁된 CHO-K1 세포주가 빈번하게 이용된다. CHO-K1 세포주는 Puck T. (1957)에 의해 성체 중국 햄스터의 난소의 생검으로부터 시작된 부모 CHO 세포주로부터 유래된 서브클론이었다. 본 명세서는 변형된 CHO 세포 외에 변형된 세포를 기재한다.
[0045] 몇몇 구현예들에서, 상기 포유동물 세포는 인간 세포, 영장류 세포, 햄스터 세포 또는 래빗 세포이다.
[0046] 세포는 단일세포성일 수 있거나, 또는 액체 배양, 단일층 또는 이와 유사한 것 같은 조직 배양에서 성장할 수 있다. 숙주세포는 또한 조직으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 유래될 수 있거나 또는 동물을 포함하는 생물체 내에 존재할 수 있다.
[0047] 본 명세서에서 고려되는 대로 면역반응을 "유도하는(inducing)"은 면역반응을 촉발 또는 자극하는 것 및/또는 이전에 존재하는 면역반응을 증가시키는 것을 포함한다는 것이 이해될 것이다.
[0048] 본 명세서에서 이용되는 대로, 상기 용어 "내부 리보좀 진입 위치" 또는 "IRES"는 mRNA 내 코딩 부위 내부의 위치 또는 상기 mRNA의 3' 또는 5' 말단에서 mRNA의 번역의 개시를 허용하여 내부 리보좀 진입 위치의 다운스트림 (즉, 3')에 위치하는 작동가능하게 결합된 코딩 부위의 번역을 제공하는 바이러스, 세포내, 또는 합성 (예컨대, 재조합) 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이것은 5' 캡 구조, 및 mRNA의 5' 말단과 독립적으로 번역을 가능하게 한다. IRES 서열은 작동가능하게 결합된 코딩 부위의 번역 개시에 요구되는 필요한 시스-작용(cis-acting) 서열을 제공한다.
[0049] 본 명세서에서 이용되는 대로 상기 용어 "분리된(isolated)"은 화합물이 자연적으로 발생하는 환경과 다른 환경 내에 존재하는 세포, 목적 화합물 (예컨대, 재조합 폭스바이러스, 게놈 같은 핵산 분자, 폴리펩타이드, 등)을 나타내는 데 이용된다. "분리된"은 목적 화합물에 대해 실질적으로 풍부화된 시료 내에 존재하는 화합물 및/또는 목적 화합물이 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 시료 내에 존재하는 화합물을 포함하는 것을 의미한다.
[0050] 본 명세서에서 사용되는 대로 상기 용어 "작동가능하게 연결된(operably connected)" 또는 "작동가능하게 결합된(operably linked)"은 기재된 대로 구성성분들이 의도된 방식에서 기능하도록 허용하는 관련성으로 존재하는 것인 병치를 의미한다. 예를 들어, 코딩 서열에 "작동가능하게 결합된" 전사적 조절 서열은 상기 전사 조절 서열과 합치가능한 조건 하에서 상기 코딩 서열의 발현을 허용하는 상기 코딩 서열에 대해 전사적 조절 서열의 위치화 및/또는 방향을 의미한다. 다른 예에서, 오르토폭스 바이러스 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 IRES는 상기 오르토폭스 바이러스 코딩 서열의 cap-독립적 번역을 허용하도록 상기 오르토폭스 바이러스 코딩 서열에 대해 IRES의 위치화 및/또는 방향을 의미한다.
[0051] 본 명세서에서 이용되는 대로 상기 용어 "개방 판독 프레임" 및 "ORF"는 코딩 서열의 번역 개시 및 종결 코돈 사이에서 인코딩된 아미노산 서열을 의미하는 것으로 상호교환가능하게 이용된다. 용어 "개시 코돈" (예컨대, ATG) 및 "종결 코돈" (예컨대, TGA, TAA, TAG)은 각각 단백질 합성 (mRNA 번역)의 시작 및 체인 종결을 명시하는 코딩 서열 내 3개의 인접한 뉴클레오타이드의 단위 ('코돈')을 의미한다.
[0052] 본 명세서에서 이용되는 대로, 상기 용어 "부모 바이러스"는 이종 핵산 서열을 삽입하도록 변형되어 본 발명의 재조합 바이러스를 형성하는 바이러스에 대한 레퍼런스로 이해될 것이다.
[0053] 본 명세서에서 이용되는 대로 상기 용어 "폴리뉴클레오타이드", "폴리뉴클레오타이드 서열", "뉴클레오타이드 서열", "핵산" 또는 "핵산 서열은 mRNA, RNA, cRNA, cDNA 또는 DNA를 의미한다. 상기 용어는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드 또는 어떠한 타입의 뉴클레오타이드의 변형된 형태 중 어느 하나로, 전형적으로 적어도 10개의 염기 길이의 뉴클레오타이드의 폴리머 형태를 의미한다. 상기 용어는 RNA 또는 DNA의 단일 및 이중 가닥된 형태를 포함한다.
[0054] "폴리펩타이드", "펩타이드", "단백질" 및 "단백질성 분자(proteinaceous molecule)"는 아미노산 잔기의 폴리머를 포함하거나 또는 이로 이루어진 분자 및 동일한 것의 변이체 및 합성 유사체를 의미하고 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 따라서, 이러한 용어들은, 하나 이상의 아미노산 잔기들이 상응하는 천연 아미노산의 화학적 유사체 뿐 아니라 천연 아미노산 폴리머 같은 합성적 비-천연 아미노산인 아미노산 폴리머에 적용한다.
[0055] 본 명세서에서 사용되는 대로 "핵산 분자", "폴리뉴클레오타이드" 및 이와 유사한 것에 적용되는 상기 용어 "재조합"은 본 명세서에 기재된 숙주세포 또는 세포-부재 시스템에서 전사 및/또는 번역될 수 있는 인공저긴 핵산 구조 (즉, 비-복제성 cDNA 또는 RNA; 또는 레플리콘, 자가-복제성 cDNA 또는 RNA)를 의미하는 것으로 이해된다. 재조합 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드는 벡터 내로 삽입될 수 있다. 플라스미드 발현 벡터 같은 비-바이러스 벡터 또는 바이러스 벡터가 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 핵산 컨스트럭트의 삽입을 위한 벡터 및 기술의 종류는 통상의 기술자에게 알려져 있다. 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드는 본 발명에 의해 기재된 배열에서 천연에서 발생되지 않는다. 즉, 이종 뉴클레오타이드 서열은 부모 바이러스 게놈의 요소 (예컨대, 프로모터, ORF, 폴리아데닐화 시그널, 리보자임)와 천연적으로 연결되지 않는다.
[0056] 본 명세서에서 이용되는 대로, 상기 용어 "재조합 바이러스"는 적어도 하나의 이종 핵산 서열을 포함하는 "부모 바이러스"에 대한 레퍼런스로 이해될 것이다.
[0057] 본 명세서에서 사용되는 대로 상기 용어 "서열 동일성"은 서열이 비교 윈도우 상에 뉴클레오타이드-대-뉴클레오타이드 기반 또는 아미노산-대-아미노산 기반하여 동일한 정도를 의미한다. 따라서, "서열 동일성의 백분율"은 비교 윈도우 상에서 2개의 최적으로 배열된 서열들을 비교하고, 동일한 핵산 염기 (예컨대, A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기 (예컨대, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 양 서열 내에 존재하는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 얻어, 비교 윈도우 내 총 위치 수 (즉, 윈도우 크기)로 매칭된 위치의 수를 나누며, 그 결과를 100으로 나누어서 서열 동일성의 백분율을 얻음으로써 산출된다. 본 발명의 목적을 위해, "서열 동일성"은 소프트웨어에 수반하는 레퍼런스 매뉴얼에서 이용되는 표준 디폴트를 이용하는 DNASIS 컴퓨터 프로그램 (윈도우용 2.5 버전; 히타치 소프트웨어 공학사, 남 샌프란시스코, 캘리포니아, 미국으로부터 이용가능함)에 의해 산출된 "매치 백분율(match percentage)"을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
[0058] 상기 용어 "시그널 서열" 또는 "시그널 펩타이드는 세포질로부터 어떤 세포내 소기관, 예를 들어 핵, 마이토콘드리아 매트릭스, 및 소포체 같은 세포내 소기관으로 공동- 또는 번역-후 이동을 지시하는 짧은 (약 3 내지 약 60개의 아미노산 길이) 펩타이드를 의미한다. ER 타겟팅 시그널 펩타이드를 가지는 단백질에 있어서, 상기 단백질이 ER로 운반된 후 상기 시그널 펩타이드는 시그널 펩타이드를 포함하는 전구체 형태로부터 전형적으로 절단되며, 결과적인 단백질은 배출 경로를 따라 세포내 (예컨대, 골지체, 세포막 또는 세포벽) 또는 세포외 위치로 이동한다. 본 명세서에서 이용되는 대로 "ER 타겟팅 시그널 펩타이드"는 단백질의 일부 또는 전체가 ER 막을 통해 ER 루멘 내로 삽입됨에 따라 항상 효소적으로 제거되는 아미노-말단 소수성 서열을 포함한다. 따라서, 서열의 시그널 전구체 형태가 단백질의 전구체 형태의 일부로서 존재할 수 있지만, 상기 단백질의 성숙 형태에는 일반적으로 존재하지 않을 것이라는 것이 당업계에 알려져 있다.
[0059] "유사성"은 하기 표 A에 정의된 대로 동일하거나 또는 구성적으로 보존적 치환인 아미노산의 백분율 수를 의미한다. 유사성은 GAP (Deveraux 등 1984, Nucleic Acids Research12: 387-395) 같은 서열 비교 프로그램을 이용하여 결정할 수 있다. 이러한 방식에서, 본 명세서에서 인용된 서열에 대해 유사하거나 또는 실질적으로 다른 길이의 서열들이 삽입 갭, 예컨대 GAP에 의해 이용되는 비교 알고리즘에 의해 결정되는 그러한 갭을 이용하여 상기 정렬 내로 비교될 수 있다.
표 A: 예시적인 보존성 아미노산 치환들
Figure 112016053028627-pct00001
[0060] 비교 윈도우를 정렬하기 위한 서열들의 최적 정렬은 알고리듬의 컴퓨터적 실행 (위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지 방출 7.0 내 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, 유전학 컴퓨터 그룹, 575 사이언스 드라이브 매디손, WI, USA) 또는 선택된 다양한 방법들 중 어느 하나에 의해 발생되는 조사 및 최적 정렬 (즉, 상기 비교 윈도우에서 가장 높은 백분율 상동성을 초래하는 조사 및 최정 정렬)에 의해 실시될 수 있다. 예를 들어 Altschul 등, 1997, Nucl. Acids Res.25:3389에 의해 개시된 대로 BLAST 패밀리의 프로그램을 참조할 수도 있다. 서열 분석의 상세한 논의사항은 Ausubel 등, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15의 유니트 19.3에서 볼 수 있다.
[0061] 본 명세서에서 상호교환가능하게 이용되는 상기 용어 "대상(subject)", "환자(patient)", "숙주(host)" 또는 "개체(individual)"는 어떠한 대상, 특히 척추동물 대상, 그리고 보다 더 구체적으로는 치료 또는 예방이 소망되는 포유동물 대상을 의미한다. 본 발명의 범위 내에 속하는 적합한 척추동물은 영장류 (예컨대, 인간, 원숭이 및 유인원, 및 마카카 속 (예컨대, 마카카 파시쿨라리스 같은 시노몰로구스 원숭이, 및/또는 붉은털 원숭이(Macaca mulatta))으로부터 유래된 원숭이 종 및 개코원숭이 (Papio ursinus) 뿐 아니라, 마모셋 (칼리트릭스 속으로부터 유래된 종), 다람쥐원숭이 (사이미리 속으로부터 유래된 종) 및 타마린스 (사구이누스 속으로부터 유래된 종) 뿐 아니라, 침팬지 (Pan troglodytes)를 포함한다), 설치류 (예컨대, 마우스, 래트, 기니피그), 토끼류 (예컨대, 래빗, 산토끼), 소류 (예컨대, 소), 양류 (예컨대, 양), 염소류 (예컨대, 염소), 돼지류 (예컨대, 돼지), 말류 (예컨대, 말), 개류 (예컨대, 개), 고양이류 (예컨대, 고양이), 조류 (예컨대, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 카나리아, 작은 앵무새 같은 동반 새, 등), 해양 포유동물류 (예컨대, 돌고래, 고래), 파충류 (뱀, 개구리, 도마뱀, 등), 및 어류를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 선호되는 대상은 상태의 치료 또는 예방이 요구되는 인간이다. 하지만, 상기 언급된 용어들은 증상을 나타내는 것을 포함하지 않는 것이 이해될 것이다.
[0062] 상기 용어 "트랜스유전자(transgene)"는 본 명세서에서 숙주 생물체의 게놈 내에 존재하였거나 또는 상기 게놈 내로 인위적으로 도입될 것이고 상기 숙주의 자손으로 전달되는 유전적 물질을 기술하는 데 이용된다. 몇몇 구현예들에서, 상기 트랜스유전자는 포유동물 세포 또는 도입될 오르토폭스 벡터에 소망된 특성을 부여하거나, 또는 그렇지 않다면 소망된 치료적 또는 진단적 성과를 유도한다.
[0063] 본 명세서에서 이용되는 대로, 상기 용어 "치료(treatment)", "치료하는(treating)", 및 이와 유사한 것은 소망된 약물학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 상기 효과는 질병 또는 이의 증상을 완전하게 또는 부분적으로 예방하는 측면에서 예방적이고/예방적이거나 질병 및/또는 상기 질병으로부터 기인하는 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치료의 측면에서 치료적일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 대로, "치료"는 포유동물, 특히 인간 내 질병의 어떠한 치료를 포괄하며, (a) 질병에 취약하지만 아직 그것을 가지는 것으로 진단되지 않은 대상에서 발생하는 질병을 예방하는 것; (b) 상기 질병을 억제하는 것, 즉 이의 발생을 저지하는 것; 및 (c) 상기 질병을 완화시키는 것, 즉 상기 질병의 퇴행을 야기시키는 것을 포함한다.
[0064] 생물체, 폴리펩타이드, 또는 핵산 서열과 관련하여, 상기 용어 "야생형(wild-type)", "천연("natural)", "토종(native)" 및 이와 유사한 것은 상기 생물체 폴리펩타이드, 또는 핵산 서열이 천연이거나 또는 변화하지 않거나, 돌연변이되지 않거나, 또는 그렇지 않다면 인간에 의해 조작되지 않은 적어도 하나의 천연 생물체에서 이용가능하다는 것을 의미한다.
[0065] 변이체들은 참조된 분자 또는 이의 전체 또는 일부에 걸쳐서 상보적인 형태와 충분히 유사한 핵산 분자, 또는 적어도 약 15개의 뉴클레오타이드를 비교하는 비교 윈도우 하에서 참조된 폭스바이러스 숙주 범위 인자를 제한하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 약 60% 내지 90% 또는 90 내지 98% 서열 동일성을 가지는 핵산 분자를 포함하여 선택적 혼성화가 중간 또는 고 엄격 조건 하에서 이뤄질 수 있다. 좋게는, 상기 혼성화 부위는 약 12개 내지 약 18개 핵염기 길이 또는 그 이상이다. 좋게는, 특정 뉴클레오타이드 서열과 레퍼런스 서열 간의 퍼센트 동일성은 적어도 약 80%, 또는 85%, 또는 더 좋게는 약 90% 유사하거나 또는 그 이상, 예컨대 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이다. 80%와 100% 사이의 퍼센트 동일성은 포괄된다. 뉴클레오타이드 서열의 길이는 제안된 기능에 따른다. 상동체는 포괄된다. 상기 용어 "상동체(homolog)", "상동 유전자(homologous genes)" 또는 "상동체들"은 다른 종들로부터 유래된 기능적 및 구조적으로 관계된 분자들을 포함하는 기능적 및 구조적으로 관계된 분자들을 폭넓게 의미한다. 상동체 및 오솔로그는 변이체의 예들이다.
[0066] 핵산 서열 동일성은 다음과 같이 결정될 수 있다. 대상 핵산 서열은 핵산 서열 데이터베이스, 예컨대 프로그램 BLASTM 버전 2.1 (Altschul 등 (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402에 기반됨)을 이용하는 GenBank 데이터베이스 (http://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/ 웹 사이트에서 이용가능함)를 조사하는 데 이용된다. 갭이 없는 모드에서 상기 프로그램을 이용한다. 낮은 복합성 부위들로 인해 서열 상동성을 제거하는 데 디폴트 필터링을 이용한다. BLASTM의 디폴트 매개변수를 이용한다.
[0067] 아미노산 서열 동일성은 다음과 같이 결정될 수 있다. 대상 폴리펩타이드 서열은 폴리펩타이드 서열 데이터베이스, 예컨대 BLASTP 프로그램을 이용하는 GenBank 데이터베이스 (http://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/ 웹 사이트에서 이용가능함)를 조사하는 데 이용된다. 갭이 없는 모드에서 상기 프로그램을 이용한다. 낮은 복합성 부위들로 인해 서열 상동성을 제거하는 데 디폴트 필터링을 이용한다. BLASTM의 디폴트 매개변수를 이용한다. 낮은 복합성의 서열들에 대한 필터링은 SEG 프로그램을 이용할 수 있다.
[0068] 선호된 서열들은 엄격 조건 하에서 레퍼런스 서열 또는 이의 상동물과 혼성화할 것이다. 상기 용어 "엄격 조건 하에서의 혼성화시키다(hybridize under stringent conditions)", 및 이의 문법적 균등물은 온도 및 염 농도의 제한된 조건 하에서 타겟 핵산 분자 (예컨대 DNA 또는 RNA 블랏, 예컨대 서던 블랏 또는 노던 블랏 상에 고정된 타겟 핵산 분자)와 혼성화하는 핵산 분자의 능력을 의미한다. 약 100개의 염기 길이보다 더 큰 핵산 분자와 관련하여, 전형적인 엄격 혼성화 조건들은 기껏해야 천연 이합체의 녹는점 (Tm) 이하 25℃ 내지 30℃ (예컨대, 10℃)이다 (일반적으로, Sambrook 등, (앞서 인용됨); Ausubel 등, (1999)을 참조). 약 100개의 염기 길이보다 더 큰 핵산 분자에 대한 Tm은 Tm=81.5+0.41% (G+C-log (Na+)) 식에 의해 산출될 수 있다. 약 100개의 염기 길이 미만의 핵산 분자와 관련하여 예시적 엄격 혼성화 조건은 Tm 이하의 5℃ 내지 10℃이다.
[0069] 본 맥락에서 상기 용어 "결실(deletion)"은 타겟 유전자의 코딩 부위의 전체 또는 일부의 제거이다. 또한 상기 용어는 타겟 유전자의 유전자 발현을 제거하거나 또는 상기 인코딩된 단백질의 레벨 또는 활성을 제거하거나 또는 실질적으로 하향 조절시키는 돌연변이 또는 형질전환의 어떠한 형태를 포괄한다.
[0070] "유전자"에 대한 언급은 유전자의 엑손 또는 개방 판독 프레임에 해당하는 DNA를 포함한다. 또한 본 명세서에서 "유전자"에 대한 언급은: 전사 및/또는 번역 조절 서열 및/또는 코딩 부위 및/또는 비-번역된 서열 (즉, 인트론, 5'- 및 3'-비번역된 서열)로 이루어진 전통적인 게놈 유전자; 또는 상기 유전자의 코딩 부위 (즉, 엑손) 및 5'- 및 3'-비번역된 서열에 해당하는 mRNA 또는 cDNA를 포함한다.
[0071] "조절성 엘리먼트(regulatory element)" 또는 "조절성 서열"은 특정 숙주세포에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 핵산 서열 (예컨대, DNA)를 의미한다. 원핵세포에 적합한 조절성 서열은, 예를 들어 프로모터 및 선택적으로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 위치 같은 시스-활성 서열을 포함한다. 진핵세포에 적합한 조절 서열은 프로모터, 폴리아데닐화 시그널, 전사적 인핸서, 번역적 인핸서, 리더 또는 mRNA 안정성을 조절하는 트레일링 서열 뿐 아니라, 전사된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 산물을 세포 내 세포내 구획 또는 세포외 환경으로 타겟팅하는 타겟팅 서열을 포함한다.
[0072] 본 발명에서 변형된 포유동물 세포에 효과적인 적합한 키메릭 컨스트럭트는 오르토폭스 조절성 서열과 작동가능하게 연결된 숙주 범위 인자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 적합하게는 상기 조절성 서열은 세포 내 발현에 합치될 것인 전사 및/또는 번역 조절 서열을 포함한다. 전형적으로, 상기 전사 및 번역 조절성 조절 서열은 프로모터 서열, 5' 비-코딩 부위, 전사적 조절 단백질 또는 번역적 조절 단백질에 대한 기능적 결합 위치, 업스트림 개방 판독 프레임, 리보좀-결합 서열, 전사적 개시 위치, 번역적 개시 위치, 및/또는 리더 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 같은 시스-조절성 부위, 종결 코돈, 번역적 중단 위치 및 3'-비-번역된 부위를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 당업계에 알려진 구성적 또는 유도가능한 프로모터가 고려된다. 상기 프로모터는 천연 프로모터, 또는 하나 이상의 프로모터의 요소들로 결합하는 혼성 프로모터 중 어느 하나일 수 있다.
[0073] 고려되는 프로모터 서열은 포유동물 세포 자체 이거나 또는 상기 부위가 선택된 생물체에서 기능적인 택일적 소스로부터 유래될 수 있다. 프로모터의 선택은 의도된 숙주세포에 따라 다를 것이다. 예를 들어, 포유동물 세포에서 발현에 이용될 수 있는 프로모터는 카드뮴 같은 중금속에 반응하여 유도될 수 있는 메탈로티오네인 프로모터, SV40 거대 T 항원 프로모터 같은 바이러스 프로모터 뿐 아니라 β-액틴 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) 매개된 초기 (IE) 프로모터, 라우스 육종 바이러스 LTR 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 LTR 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (Ad MLP), 헤르페스 심플렉스 바이러스 프로모터, 및 HPR 프로모터, 특히 HPV 업스트림 조절성 부위 (URR), 등을 포함한다. 이러한 모든 프로모터들은 당업계에 잘 기재되고 용이하게 이용가능하다.
[0074] 또한 인핸서 엘리먼트는 상기 포유동물 컨스트럭트의 발현 레벨을 증가시키기 위해 본 명세서에서 이용될 수 있다. 예는 Dijkema 등 (1985) EMBO J. 4:761에서 예로서 기재된 SV40 초기 유전자 인핸서, Gorman 등, (1982) Proc. Natl . Acad . Sci . USA 79:6777에서 예로서 기재된 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복 (LTR)로부터 유래된 인핸서/프로모터 및 CMV 인트론 A 서열에 포함된 엘리먼트 같은 Boshart 등 (1985) Cell 41:521에서 예로서 기재된 인간 CMV로부터 유래된 엘리먼트를 포함한다.
[0075] 키메릭 컨스트럭트는 또한 3' 비-번역된 서열을 포함할 수 있다. 3' 비-번역된 서열은 폴리아데닐화 시그널 및 mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현을 유효화시킬 수 있는 어떠한 다른 조절성 시그널을 포함하는 DNA 절편을 포함하는 유전자의 그러한 부분을 의미한다. 상기 폴리아데닐화 시그널은 mRNA 전구체의 3' 말단에 폴리아데닐산 트랙의 부가를 유효화시키는 것으로 특징화된다. 폴리아데닐화 시그널은 변이가 비정상적이지 않을 지라도 정본 형태인 5' AATAAA-3'에 대한 상동체의 존재에 의해 공통적으로 인지된다. 상기 3' 비-번역된 조절성 DNA 서열은 좋게는 약 50부터 1,000 nts까지를 포함하며 폴리아데닐화 시그널 및 mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현을 유효화시킬 수 있는 어떠한 다른 조절성 시그널 외에도 전사 및 번역 종결 서열을 포함할 수 있다.
[0076] 몇몇 구현예들에서, 키메릭 컨스트럭트는 선택가능한 마커 유전자를 추가적으로 포함하여 상기 컨스트럭트를 포함하는 세포의 선택을 허용한다. 선택 유전자들은 당업계에 잘 알려져 있고 목적 세포에서 발현을 위해 양립가능할 것이다.
[0077] 하나의 구현예에서, 오르토폭스 구조 또는 어셈블리 유전자의 발현은 프로모터의 조절 하에 존재한다. 하나의 비-제한적인 구현예에서, 상기 프로모터는 세포내 구성적 프로모터, 예컨대 숙주세포에 유의한 독성 효과의 부재 하에서 바이러스 증식을 지속시키도록 유의한 레벨의 CP77 발현을 지시하는 인간 EF1 알파 (human elongation factor 1 alpha gene promoter), DHFR (dihydrofolate reductase gene promoter) 또는 PGK (phosphoglycerate kinase gene promoter)이다. 또한 프로모터는 유도가능할 수 있는데, 예컨대 세포내 유도가능한 프로모터, MTH (메탈로티오네인 유전자로부터 유래된) 바이러스 프로모터, 예컨대 CMV, RSV, SV-40, 및 MoU3도 포유동물 세포에서 이용될 수도 있다.
[0078] 첫 번째 양태에서 본 발명은 변형된 포유동물 세포로서 상기 세포의 게놈은 프로모터의 조절 하에서 CP77을 인코딩하는 서열을 포함하도록 변형되고 상기 변형된 세포주는 변형되지 않은 세포에서 거의 증식할 수 없거나 또는 증식할 수 없는 폭스 바이러스의 증식을 지속시키는 것인 변형된 포유동물 세포를 제공한다.
[0079] 두 번째 양태에서 본 발명은 CHO 세포에서 증식하지 않는 오르토폭스바이러스를 증식시키는 과정으로서, 상기 과정은 상기 폭스바이러스를 포유동물 세포주에서 인 비트로 증식시키는 단계를 포함하며 상기 세포주는 프로모터의 조절 하에서 CP77을 인코딩하고 발현시키도록 변형되는 것인 과정을 제공한다.
[0080] 하나의 구현예에서 상기 세포의 게놈은 프로모터의 조절 하에서 D13L을 인코딩하는 서열을 추가적으로 포함하고/포함하거나 프로모터의 조절 하에서 K1L을 인코딩하는 서열을 추가적으로 포함한다.
[0081] 다른 구현예에서 상기 세포는 무한증식 세포주, 좋게는 CHO 세포이다.
[0082] 다른 구현예들에서 상기 세포는 인간 세포, 영장류 세포, 햄스터 세포 또는 래빗 세포이다.
[0083] 다른 구현예에서 상기 CP77 유전자, D13L 유전자 및/또는 K1L 유전자는 포유동물 프로모터의 조절 하에 존재한다.
[0084] 다른 구현예에서 상기 CP77 유전자의 발현은 바이러스의 증식을 도와 허용 세포주에서 관찰되는 바이러스 생산과 동등한 바이러스 생산을 발생시키고 좋게는 500 이상의 바이러스 복제 증폭 비율을 제공한다.
[0085] 다른 구현예에서 상기 CP77, D13L 및/또는 K1L은 포유동물 세포 내 발현에 최적화된 뉴클레오타이드 코돈의 인접 서열에 의해 인코딩된다.
[0086] K1L 서열의 예는 서열번호 6 및 서열번호 7로 제공된다.
[0087] 본 명세서는 넓게는 배양된 고등 진핵 숙주세포에서 바이러스 벡터의 인 비트로 제조를 위한 변형된 (재조합 또는 형질전환된) 세포 및 과정에 관한 것이고, 상기 세포는 인 비트로에서 상기 세포 내 또는 세포 개체군을 통해 상기 바이러스 벡터의 증식(multiplication)을 증가 또는 촉진시키는 방식으로 유전적으로 변형된다. 하나의 비-제한적인 구현예에서, 본 명세서는 변형된 중국햄스터 난소(CHO) 세포에서 백시니아-기반된 폭스바이러스의 증식을 제공한다.
[0088] 통상의 기술자에게 알려진 대로, 햄스터 크리세툴루스 그리세우스의 난소로부터 유래된 중국햄스터 난소 (CHO) 세포는 항체를 포함하는 재조합 단백질 치료법의 생물-산업적 및 GMP 생산을 위해 가장 일반적으로 이용되는 포유동물 세포이다. 이러한 목적을 위한 CHO 세포의 대중성은, 부분적으로 빠른 성장 및 높은 단백질 생산으로부터 기인한다. 그 결과, CHO 세포주는 잘 특징화되었다. 적합한 CHO 세포주는 A2, A2H, XrS6, CHO-K1, CHO/dhfr, RR-CHO-K1, UT-I, P22, CHO-1C6, Lec1, Lec2, Lec8, Pro-5 및 CDKXB1 라인을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. ATCC 접근번호 CLL-61 또는 ATCC CRL-9618로 ATCC에 기탁된 CHO-K1 세포주가 빈번하게 이용된다. CHO-K1 세포주는 Puck T. (1957)에 의해 성체 중국 햄스터의 난소의 생검으로부터 시작된 부모 CHO 세포주로부터 유래된 서브클론이었다. 본 명세서는 변형된 CHO 세포 외에 변형된 세포를 기재한다.
[0089] 생산된 바이러스의 수율을 최대화시키기 위해, CHO 세포 같은 세포주들은 표준 기술을 이용하는 현탁액 배양에 조정될 수 있다. 재조합 또는 변형된 세포에 대한 언급은 이의 자손을 포함한다. 세포는 동결 또는 액체 현탁 형태를 포함하여 어떠한 형태로 구매될 수 있다. 세포는 폭스바이러스 벡터로 감염되어 구매될 수 있다.
[0090] 본 명세서에서 CP77에 대한 언급은 Sphener 등 (1988), 및 Hsiao 등 (2006)에서 언급된 카우폭스 숙주 범위 유전자를 의미하며 본 명세서에서 결정된 대로 이의 기능적 오솔로그 및 변형된 형태들일 수 있으며 포유동물 숙주세포의 게놈 내 이종 유전자로서 발현되는 경우 폭스 바이러스 성장을 도운다. "변형된 형태(modified forms)"에 대한 언급은 야생형 또는 레펀런스 서열에 대한 변이 (예컨대 결실, 치환 또는 부가)를 포함한다. 레퍼런스 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1로 제공된다. 변형된 형태는 적어도 200개의 인접 염기쌍을 포함하는 코딩 부위 또는 하나 이상의 코딩 부위들에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 공유한다. 변형된 형태는 CHO 세포를 포함하는 포유동물 또는 다른 고등 진핵세포에서의 발현에 최적화된 본 명세서에 기재된 코돈 최적화된 형태를 포함한다. CP77에 대한 언급은 오솔로그, 즉 다른 종에 존재하거나 또는 다른 이름으로 동정된 동일한 기능을 가지는 유전자들을 포함한다. 카우폭스 숙주 범위 인자, CP77은 또한 VHR1, CHOhr, 및 CPXV025로도 알려져 있다. 백시니아의 웨스턴 리저브 (WR) 스트레인 내 CHOhr/CP77 유전자는 실질적으로 단편화되어 기능성 인자를 생산하지 못 한다. CP77은 MVA 및 코펜하겐 스트레인에는 존재하지 않는다.
[0091] "CP77", "D13L" 및 "K1L"에 대한 본 명세서에서의 언급은 기능성 오솔로그 및 기능성 변이체를 포함한다. "기능성(functional)"은 발현하는 세포 세포질 내에서 폭스바이러스 증식을 지지하기 위해 배양된 세포의 포유동물 게놈으로부터 지시되는 발현의 특질 (즉, 전사 및 번역)을 의미한다. 상기 용어 "증식하다(propagate)"는 세포내 증식 및 세포간 증식을 포함하며 성숙한 바이러스 입자의 생산을 포괄한다.
[0092] 하나의 구현예에서, 상기 변형된 세포의 개체군은 변형되지 않은 대조군 세포에서 거의 증식할 수 없거나 또는 실질적으로 증식할 수 없는 폭스바이러스의 증식을 유지시킨다. 증식하지 못한다는 것은 세포 대 세포 또는 대상 대 대상 전이가 전형적으로는 일어나지 않는다는 것을 의미한다.
[0093] "비변형된 대조군 세포(unmodified control cell)"에 대한 언급은 CP77, K1L 및 SPI-1로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 바이러스 숙주 범위 인자를 인코딩하고 당업계에 알려진 프로모터 뿐 아니라 다른 적합한 대조군 세포의 조절 하에서 이의 게놈으로부터 동일하게 발현시킬 변형 전에 존재하였던 변형된 세포를 포함한다.
[0094] 예를 들어, MVA 및 백시니아 같은 폭스바이러스는 CHO 세포에서 증식할 수 없다. 하지만, 놀랍게도 본 명세서에서 결정된 대로, 프로모터의 조절 하에서 CHO 세포의 게놈으로부터 CP77을 발현시키도록 재조합적으로 변형된 CHO 세포는 백시니아 뿐 아니라 MVA 같은 백시니아의 유도체들의 증식도 지지할 수 있다. 상기 대상 변형된 CHO-CP77 세포의 증식 후, MVA 및 백시니아는 여전히 비변형된 CHO 세포 또는 다른 적합한 대조군에서 증식할 수 없다.
[0095] 본 명세서에서 "폭스바이러스(poxvirus)"에 대한 언급은 의약, 예방제, 진단제 또는 치료제로서 목적 이종 분자 (예컨대 목적 항원)를 인코딩하는 재조합 폭스바이러스 벡터를 포함한다. 그러한 재조합 폭스바이러스 벡터는 전형적으로 비-폭스바이러스 유도된 질병 또는 상태에 대한 백신으로서 이용된다. 또한, 상기 용어 폭스바이러스는 천연두 또는 천연두 감염 같은 폭스바이러스 감염에 대한 치료적 또는 예방적 백신으로서 이용하기 위해 제안된 분리된 폭스바이러스 및 이의 유도체를 포함한다.
[0096] 본 명세서에서 "백시니아-기반된(vaccinia-based)"에 대한 언급은 백시니아 및 백시니아 바이러스의 유도체 및 변형된 형태를 포함한다. 백시니아 기반된 유도체는 MVA 및 NYVAC을 포함하지만, 이에 한정되는 방식은 아니다. MVA 및 NYVAC에 대한 언급은 당업계에 알려진 이들 폭스바이러스의 스트레인 및 유도체를 포함한다. 변형된 형태는 하나 내지 10개 이상의 유전자들에서의 변형을 가질 수 있다. 상기 용어 "변형(modification)"은 야생형 또는 레펀런스 서열에 대한 변이 (예컨대 결실, 치환 또는 부가)를 의미하도록 의도된다. "약화된"에 대한 언급은 폭스 바이러스의 비-약화된 형태와 비교하여 관련 대상에서 증식하지 않거나 또는 실질적으로 더 약한 정도로 증식하는 폭스바이러스를 포함한다. 또한 상기 용어는 대상에서 비-병원성인 바이러스를 포함한다.
[0097] 하나의 구현예에서, 상기 세포는 무한증식 세포주이다. 상기 변형된 세포가 끊임없이 분열할 수 있는 세포주라는 것은 덜 필수적이다. 포유동물 또는 고등 진핵세포는 본 발명에 따라 변형된 후 끊임없이 분열하는 세포주가 되도록 형질전환 또는 불명화될 수 있다. 하지만, 변형 전 세포는 간편하게 잘 특징화되고 당업계에 알려진 끊임없이 분열하는 생명공학 양립가능한 무한증식 세포이다. 그러한 세포는 ATCC (American Type Culture Collection) 및 ECACC (European Collection of Cell Cultures) 같은 기탁 기관으로부터 간편하게 이용가능하다.
[0098] 적합한 포유동물 세포주는 RK18, BHK, VERO, HBOC-143B, HaCat, HepG2, HeLa, HT1080, HEK-293, RD, COS-7, CHO, Jurkat, HUT, SUPT, C8166, MOLT4/clone8, MT-2, MT-4, H9, PM1, CEM, 골수종 세포 (예컨대, SB20 세포) 및 CEMX174을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니고, 예를 들어 상기 세포들은 ATCC로부터 이용가능하다.
[0099] 하나의 구현예에서, 상기 세포는 CHO 세포이다. 바이러스 숙주 명 유전자를 인코딩하지 않는 당업계의 CHO 세포는 인간에서 실질적으로 복제할 수 없는 백시니아 또는 백시니아 유도체의 제조를 지지하지 않는다.
[0100] 몇몇 구현예들에서, 상기 세포는 인간 세포, 영장류 세포, 햄스터 세포 또는 래빗 세포이다.
[0101] 본 발명의 변형된 포유동물 세포를 유효화시키기에 적합한 키메릭 컨스트럭트는 조절성 서열에 작동가능하게 연결된 폭스바이러스 숙주 범위 인자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 상기 조절성 서열은 적합하게는 전사적 및/또는 번역적 대조군 서열을 포함하여, 세포 내 발현에 합치될 것이다. 전형적으로, 상기 전사적 및 번역적 조절성 대조군 서열은 프로모터 서열, 5' 비-코딩 부위, 전사적 조절 단백질 또는 번역적 조절 단백질에 대한 기능적 결합 위치, 업스트림 개방 판독 프레임, 리보좀-결합 서열, 전사적 개시 위치, 번역적 개시 위치, 및/또는 리더 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 같은 시스-조절성 부위, 종결 코돈, 번역적 중단 위치 및 3'-비-번역된 부위를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 당업계에 알려진 구성적 또는 유도가능한 프로모터가 고려된다. 상기 프로모터는 천연 프로모터, 또는 하나 이상의 프로모터의 요소들로 결합하는 혼성 프로모터 중 어느 하나일 수 있다.
[0102] 고려되는 프로모터 서열은 포유동물 세포 자체이거나 또는 상기 선택된 생물체에서 기능적인 택일적 소스로부터 유래될 수 있다. 프로모터의 선택은 의도된 숙주세포에 따라 다를 것이다. 예를 들어, 포유동물 세포에서 발현에 이용될 수 있는 프로모터는 카드뮴 같은 중금속에 반응하여 유도될 수 있는 메탈로티오네인 프로모터, SV40 거대 T 항원 프로모터 같은 바이러스 프로모터 뿐 아니라 β-액틴 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) 매개된 초기 (IE) 프로모터, 라우스 육종 바이러스 LTR 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 LTR 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (Ad MLP), 헤르페스 심플렉스 바이러스 프로모터, 및 HPR 프로모터, 특히 HPV 업스트림 조절성 부위 (URR), 등을 포함한다. 이러한 모든 프로모터들은 당업계에 잘 기재되고 용이하게 이용가능하다.
[0103] 또한 인핸서 엘리먼트는 상기 포유동물 컨스트럭트의 발현 레벨을 증가시키기 위해 본 명세서에서 이용될 수 있다. 예는 Dijkema 등 (1985) EMBO J. 4:761에서 예로서 기재된 SV40 초기 유전자 인핸서, Gorman 등, (1982) Proc . Natl. Acad . Sci . USA 79:6777에서 예로서 기재된 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복 (LTR)로부터 유래된 인핸서/프로모터 및 CMV 인트론 A 서열에 포함된 엘리먼트 같은 Boshart 등 (1985) Cell 41:521에서 예로서 기재된 인간 CMV로부터 유래된 엘리먼트를 포함한다.
[0104] 키메릭 컨스트럭트는 또한 3' 비-번역된 서열을 포함할 수 있다. 3' 비-번역된 서열은 폴리아데닐화 시그널 및 mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현을 유효화시킬 수 있는 어떠한 다른 조절성 시그널을 포함하는 DNA 절편을 포함하는 유전자의 그러한 부분을 의미한다. 상기 폴리아데닐화 시그널은 mRNA 전구체의 3' 말단에 폴리아데닐산 트랙의 부가를 유효화시키는 것으로 특징화된다. 폴리아데닐화 시그널은 변이가 비정상적이지 않을 지라도 정본 형태인 5' AATAAA-3'에 대한 상동체의 존재에 의해 공통적으로 인지된다. 상기 3' 비-번역된 조절성 DNA 서열은 좋게는 약 50부터 1,000 nts까지를 포함하며 폴리아데닐화 시그널 및 mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현을 유효화시킬 수 있는 어떠한 다른 조절성 시그널 외에도 전사 및 번역 종결 서열을 포함할 수 있다.
[0105] 몇몇 구현예들에서, 키메릭 컨스트럭트는 선택가능한 마커 유전자를 추가적으로 포함하여 상기 컨스트럭트를 포함하는 세포의 선택을 가능하게 한다. 선택 유전자들은 당업계에 잘 알려져 있고 목적 세포에서 발현을 위해 양립가능할 것이다.
[0106] 하나의 구현예에서, 바이러스 숙주 범위 유전자의 발현은 프로모터의 조절 하에 존재한다. 하나의 비-제한적인 구현예에서, 상기 프로모터는 세포내 구성적 프로모터, 예컨대 숙주세포에 유의한 독성 효과의 부재 하에서 바이러스 증식을 지속시키도록 유의한 레벨의 CP77 발현을 지시하는 인간 EF1 알파 (human elongation factor 1 alpha gene promoter), DHFR (dihydrofolate reductase gene promoter) 또는 PGK (phosphoglycerate kinase gene promoter)이다. 또한 프로모터는 유도가능할 수 있는데, 예컨대 세포내 유도가능한 프로모터, MTH (메탈로티오네인 유전자로부터 유래된) 바이러스 프로모터, 예컨대 CMV, RSV, SV-40, 및 MoU3도 포유동물 세포에서 이용될 수도 있다.
[0107] 적합하게는, 하나의 구현예에서, 상기 바이러스 숙주 범위 유전자의 발현은 바이러스의 증식을 도와 감수성 세포주에서 관찰되는 바이러스 수율과 균등한 바이러스 수율을 발생시킨다. 예를 들어, 상기 바이러스 숙주 범위 유전자의 발현은 500 이상의 바이러스 복제 증폭 비율을 제공한다. 상기 바이러스 숙주 범위 유전자의 발현은 유의한 숙주세포 독성의 부재 하에서 바이러스 증식을 지지한다. 유의한 숙주세포 독성은 조숙한 숙주세포 죽음 또는 분열의 실패로 인해 바이러스 수율을 감소시키는 바이러스 숙주 범위 인자 발현의 레벨을 의미한다. 통상의 기술자는 숙주세포 생존 및 증식 같은 숙주세포 매개변수들, 및 바이러스 숙주 범위 유전자 발현, 바이러스 복제 및 바이러스 수율 같은 바이러스 매개변수들을 정성적 또는 정량적으로 평가하는 방법들을 잘 알고 있다.
[0108] 하나의 구현예에서, 상기 폭스바이러스는 기능성 CP77 또는 CP77 오솔로그를 인코딩하는 오르토폭스 바이러스 외에 코르도폭스 바이러스이다. 카우폭스 바이러스는 CP77을 인코딩하여 본 양태에 포함되지 않는다. 오르토폭스 바이러스는 버팔로폭스 바이러스, 카우폭스 바이러스, 카멜폭스 바이러스, 엑트로멜리아 바이러스, 몽키폭스 바이러스, 래빗폭스 바이러스, 라콘폭스 바이러스, 테트라폭스 바이러스, 백시니아 바이러스, 볼레폭스 바이러스, 스쿤크폭스 바이러스, 및 말의 우아신 기슈 병 바이러스를 포함한다. 다른 속은 파라폭스바이러스, 아비폭스바이러스, 카프리폭스바이러스, 레포리폭스바이러스, 스와인폭스바이러스, 몰루시폭스바이러스 및 야타폭스바이러스를 포함한다.
[0109] 하나의 구현예에서, 상기 폭스바이러스는 MVA 또는 인간/대상에서 실질적으로 복제할 수 없는 MVA의 유도체이다.
[0110] 하나의 구현예에서, 상기 폭스바이러스는 백시니아 또는 인간에서 실질적으로 인 비보 복제하지 않는 백시니아의 유도체이다.
[0111] 다른 구현예에서, 상기 폭스바이러스는 폭스바이러스 백신으로서 이용하기에 적합하다.
[0112] 하나의 추가적인 구현예에서, 상기 폭스바이러스는 의학 목적의 항원 같은 목적 이종 분자를 인코딩하고 발현하는 재조합 폭스바이러스 벡터로 상기 재조합 폭스바이러스 벡터는 대상에서 진단제, 치료제 또는 예방제로서 이용된다.
[0113] 본 명세서에서 K1L에 대한 언급은 Shisler 및 Jin (2004)에 의해 기재된 유전자 및 이의 오솔로그 또는 변형된 형태를 의미한다.
[0114] 본 명세서에서 SPI-1에 대한 언급은 Brookes 등 (1995)에 의해 기재된 유전자 및 이의 오솔로그 또는 변형된 형태를 의미한다.
[0115] 몇몇 구현예들 및 의심을 피하기 위해, 본 발명의 증가된 바이러스 증식 과정은 상기 폭스바이러스 게놈으로의 유전자들의 부가를 요구하지 않는다. 물론, 이것은 다른 목적, 예컨대 백신 목적을 위해 목적 항원으로서 이종 분자를 인코딩하거나 또는 대상에 면역 반응을 불러일으키는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 목적을 위한 바이러스 벡터의 변형을 배제하지 않는다.
[0116] 상기 숙주세포 핵으로부터의 상기 폭스바이러스 숙주 범위 유전자의 전사 및 인코딩된 산물의 이동은 감염된 세포에서 일어나고 상기 숙주세포 세포질에서 폭스 바이러스 증식을 위해 충분하다. 어떠한 특이적 활성 모드에 대한 제한 없이, CP77은 바이러스 보호제라는 것이 제안된다.
[0117] 하나의 예증적 구현예에서, 감염된 세포주에 의해 발현되는 폭스바이러스 숙주 범위 유전자는 CP77이다. 실시예 4에서 볼 수 있듯이, CHO 세포 핵이 CP77을 인코딩하고 발현하도록 변형되는 경우 143B 같은 감수성 세포주인 것처럼 바이러스 증폭을 유지하는 것이 가능하다. 전형적으로, 컨플루언트 플락크가 감염 2일 내에 관찰된다.
[0118] 하나의 구현예에서, 변형된 세포 내 바이러스 증식의 레벨은 적어도 5000까지의 증폭 비율을 제공한다. 증폭 비율은 몇몇 구현예들에서 500과 3000, 또는 1000과 4000 사이이다.
[0119] 다른 구현예에서, 상기 이종 폭스 바이러스 숙주 범위 유전자의 프로모터 촉진성 발현은 세포 내 폭스 바이러스 숙주 범위 이종 유전자 발현의 레벨을 제공한다. CP77 발현의 레벨은 감수성 세포 내 카우폭스 바이러스에 의해 생산되는 발현과 유사하거나 또는 이를 초과할 수 있다.
[0120] 다른 구현예에서, 상기 이종 폭스 바이러스 숙주 범위 유전자의 프로모터 촉진성 발현은 세포 내 폭스 바이러스 숙주 범위 이종 유전자 발현의 레벨을 제공하여 적어도 감수성 세포 내 바이러스 증식의 레벨로 바이러스 증식을 허용한다.
[0121] 하나의 구현예에서, CHO 세포주 내 폭스바이러스 생산은 양성 대조군 세포 내 폭스바이러스 생산의 레벨과 동일하거나 또는 이 레벨을 초과한다.
[0122] 하나의 구현예에서, CHO 세포 내 MVA 바이러스 생산 레벨은 CEF 세포 내 MVA 바이러스 생산의 레벨과 실질적으로 동일하거나 또는 이를 초과한다.
[0123] 하나의 구현예에서, CP77, K1L 및/또는 SPI-1은 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된 코돈인 뉴클레오타이드의 연속 서열로 인코딩된다.
[0124] 본 명세서에서 추가적으로 기재된 대로, CP77을 인코딩하는 코돈 최적화된 핵산 서열은 브라이튼 레든 스트레인의 카우폭스 CP77 단백질을 인코딩하는 서열 (UniprotKB/Swiss-Prot:P12932.1)과 80% 미만 또는 75% 미만의 뉴클레오타이드 서열 동일성을 가질 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 상기 코돈 최적화된 서열은 서열번호 1로 설명되는 서열을 가지거나 또는 서열번호 1로 설명되는 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 가지는 핵산 서열을 포함하는 기능성 변이체이다. 몇몇 구현예들에서, 상기 CP77 바이러스 숙주 범위 인자는 서열번호 2로 설명되는 아미노산 서열을 가지거나 또는 서열번호 2로 설명되는 아미노산 서열과 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 가진다.
[0125] 몇몇 구현예들에서, 키트는 본 명세서에 기재된 대로 포유동물 게놈으로부터 CP77을 발현하는 변형된 포유동물 세포의 개체군, 예컨대 클론 개체군으로 구성되거나 실질적으로 이루어진 것으로 고려된다. 몇몇 구현예들에서, 상기 변형된 세포는 백시니아 바이러스를 포함하지 않는다.
[0126] 본 발명의 기재는 CHO 세포에서 증식하지 않는 폭스바이러스를 제조하는 방법 또는 이를 위한 과정을 기재하고, 상기 과정은 포유동물 세포주에서 폭스바이러스를 인 비트로에서 증식시키는 단계를 포함하며, 상기 세포주는 프로모터의 조절 하에서 CP77을 인코딩하고 발현하도록 변형된다. 상기 과정은 바이러스 입자를 분리하는 것을 추가적으로 포함할 수 있다.
[0127] 상기 세포주는 편리하게도 의약 또는 치료제, 진단제 또는 예방제의 제조에 적합하도록 통상의 기술자에게 알려진 포유동물 세포주이다.
[0128] 본 명세서는 변형된 CHO 세포를 기술하며, 상기 CHO 세포는 CP77을 인코딩하고 프로모터의 조절 하에서 상기 세포의 게놈으로부터 동일한 것을 발현하도록 변형된다.
[0129] 하나의 구현예에서, 상기 변형된 CHO 세포주는 CP77을 발현하지 않는 세포인 비변형된 대조군 CHO 세포에서 덜 증식하거나 또는 증식할 수 없는 바이러스의 증식을 유지시킨다.
[0130] 하나의 구현예에서, 상기 바이러스는 CP77을 인코딩하는 오르토폭스 바이러스 외에 오르토폭스 바이러스이다. 당업계에 알려진 대로, 카우폭스 바이러스는 CP77을 인코딩하는 폭스 바이러스이다.
[0131] 몇몇 구현예들에서, 상기 바이러스는 백시니아 또는 인간/대상에서 실질적으로 복제할 수 없는 백시니아의 유도체이다.
[0132] 몇몇 구현예들에서, 상기 바이러스는 MVA이다.
[0133] 다른 구현예에서, 본 명세서는 인간에서 실질적으로 복제하지 않는 폭스바이러스를 증식시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은: (i) CP77을 발현하도록 형질전환된 CHO 세포를 배양하는 것; 및 (ii) (i)로부터 얻어진 배양된 CHO 세포를 인간에서 실질적으로 복제하지 않는 폭스바이러스로 감염시키는 것을 포함한다.
[0134] 다른 구현예에서, 본 명세서는 인간에서 실질적으로 복제하지 않는 폭스바이러스를 증식시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은: (i) CP77 및 D13L 및/또는 K1L을 발현하도록 형질전환된 CHO 세포를 배양하는 것; 및 (ii) (i)로부터 얻어진 배양된 CHO 세포를 인간에서 실질적으로 복제하지 않는 폭스바이러스로 감염시키는 것을 포함한다.
[0135] 다른 구현예에서, 본 명세서는 MVA를 증식하는 방법을 제공하고, 상기 방법은: (i) CP77 및 D13L 및/또는 K1L을 발현하도록 형질전환된 CHO 세포를 배양하는 것; 및 (ii) (i)로부터 얻어진 배양된 CHO 세포를 MVA로 감염시키는 것을 포함한다.
[0136] 다른 구현예에서, 본 명세서는 인간에서 실질적으로 복제하지 않는 백시니아 유도체를 증식하는 방법을 제공하고, 상기 방법은: (i) CP77 및 D13L 및/또는 K1L을 발현하도록 형질전환된 CHO 세포를 배양하는 것; 및 (ii) (i)로부터 얻어진 배양된 CHO 세포를 백시니아 유도체로 감염시키는 것을 포함한다.
[0137] 다른 구현예에서, 본 명세서는 인간에서 실질적으로 복제하지 않는 이종 단백질을 인코딩하는 MVA를 증식하는 방법을 제공하고, 상기 방법은: (i) CP77 및 D13L 및/또는 K1L을 발현하도록 형질전환된 CHO 세포를 배양하는 것; 및 (ii) (i)로부터 얻어진 배양된 CHO 세포를 MVA로 감염시키는 것을 포함한다.
[0138] 다른 구현예에서, 본 명세서는 인간에서 실질적으로 복제하지 않는 이종 단백질을 인코딩하는 백시니아 유도체를 증식하는 방법을 제공하고, 상기 방법은: (i) CP77 및 D13L 및/또는 K1L을 발현하도록 형질전환된 CHO 세포를 배양하는 것; 및 (ii) (i)로부터 얻어진 배양된 CHO 세포를 백시니아 유도체로 감염시키는 것을 포함한다.
[0139] 다른 구현예에서, 본 발명의 명세서는 포유동물 세포주에서의 발현을 위한 프로모터 같은 조절성 엘리먼트에 작동가능하게 연결된 바이러스 숙주 범위 유전자의 핵산 서열을 포함하는 인공적으로 창출된 벡터, 폴리뉴클레오타이드 또는 플라스미드를 제공한다. 몇몇 구현예들에서, 상기 바이러스 유전자는 카우폭스 안키린 반복 도메인-포함 단백질 CP77 유전자 (UniProtKBSwiss-Prot P12932.1 [025LBR CP77 protein]이다. 하나의 구현예에서, CP77 같은 바이러스 숙주 범위 유전자는 포유동물 세포주에서의 발현에 최적화된 코돈이다. 적합한 벡터 및 플라스미드는 당업계에 알려져 있다.
[0140] 하나의 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 CP77을 인코딩한다. 몇몇 구현예들에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 (CHO 같은 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된 코돈)로 설명되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1로 설명되는 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 2로 설명되는 아미노산 서열을 인코딩하는 이의 변이체를 포함한다.
[0141] 다른 구현예에서, 본 발명의 명세서는 포유동물 세포 내로 바이러스 숙주 범위 유전자의 안정적인 삽입을 위한 전위 운반 벡터(transposition delivery vector)를 기재하였다.
[0142] 본 발명의 명세서는 또한 바이러스, 상기 바이러스에 허용가능한 세포로 실질적으로 비-감수성인 포유동물 또는 고등 진핵 배양 세포를 형질전환시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 CP77을 발현하도록 세포를 형질전환시키는 것을 포함한다.
[0143] 몇몇 구현예들에서, 상기 방법은 포유동물 프로모터의 조절 하에서 인코딩된 CP77의 발현을 지시할 수 있는 벡터로 상기 세포를 트랜스펙션시키는 것을 포함한다.
[0144] 몇몇 구현예들에서 상기 벡터는 포유동물 프로모터의 조절 하에서 CP77을 인코딩하는 전위 운반 벡터이다.
[0145] 하나의 비-제한적인 구현예에서 상기 프로모터는 세포내 구성적 프로모터, 예컨대 숙주세포에 유의한 독성 효과의 부재 하에서 바이러스 증식을 지속시키도록 충분한 레벨의 CP77 발현을 지시하는 인간 EF1 알파 (human elongation factor 1 alpha gene promoter), DHFR (dihydrofolate reductase gene promoter) 또는 PGK (phosphoglycerate kinase gene promoter)이다. 또한 프로모터는 유도가능할 수 있는데, 예컨대 세포내 유도가능한 프로모터, MTH (메탈로티오네인 유전자로부터 유래된) 바이러스 프로모터, 예컨대 CMV, RSV, SV-40, 및 MoU3도 포유동물 세포에서 이용될 수도 있다.
[0146] 몇몇 구현예들에서, 상기 세포는 CHO 세포이다.
[0147] 몇몇 구현예들에서, 상기 바이러스는 폭스바이러스이다.
[0148] 몇몇 구현예들에서 상기 폭스바이러스는 인간에서 비-병원성 또는 비-복제성 백시니아 유도체이다.
[0149] "분리된"은 천연 상태에서 정상적으로 동반하는 구성성분들과 실질적으로 또는 본질적으로 자유로운 물질을 의미한다. 예를 들어, 본 명세서에서 이용되는 대로 "분리된 폴리뉴클레오타이드" 또는 "분리된 폴리펩타이드" 및 이와 유사한 것은 자연 세포내 환경, 및 세포의 다른 구성성분들과의 관계로부터 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 인 비트로 분리 및/또는 정제를 의미한다. 분리된 조성물, 복합체, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 또는 폴리펩타이드는 정제의 의해 분리되거나 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생산된 서열로 분리되는 원래의 서열을 의미한다.
[0150] 변이체들은 참조된 분자 또는 이의 전체 또는 일부에 걸쳐서 상보적인 형태와 충분히 유사한 핵산 분자, 또는 적어도 약 15개의 뉴클레오타이드를 비교하는 비교 윈도우 하에서 참조된 폭스바이러스 숙주 범위 인자를 제한하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 약 60% 내지 90% 또는 90 내지 98% 서열 동일성을 가지는 핵산 분자를 포함하여 선택적 혼성화가 중간 또는 고 엄격 조건 하에서 이뤄질 수 있다. 좋게는, 상기 혼성화 부위는 약 12개 내지 약 18개 핵염기 길이 또는 그 이상이다. 좋게는, 특정 뉴클레오타이드 서열과 레퍼런스 서열 간의 퍼센트 동일성은 적어도 약 80%, 또는 85%, 또는 더 좋게는 약 90% 유사하거나 또는 그 이상, 예컨대 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이다. 80%와 100% 사이의 퍼센트 동일성은 포괄된다. 뉴클레오타이드 서열의 길이는 제안된 기능에 따른다. 상동체는 포괄된다. 상기 용어 "상동체", "상동 유전자" 또는 "상동체들"은 다른 종들로부터 유래된 기능적 및 구조적으로 관계된 분자들을 포함하는 기능적 및 구조적으로 관계된 분자들을 폭넓게 의미한다. 상동체 및 오솔로그는 변이체의 예들이다.
[0151] 핵산 서열 동일성은 다음과 같이 결정될 수 있다. 대상 핵산 서열은 핵산 서열 데이터베이스, 예컨대 프로그램 BLASTM 버전 2.1 (Altschul 등 (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402에 기반됨)을 이용하는 GenBank 데이터베이스 (http://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/ 웹 사이트에서 이용가능함)를 조사하는 데 이용된다. 갭이 없는 모드에서 상기 프로그램을 이용한다. 낮은 복합성 부위들로 인해 서열 상동성을 제거하는 데 디폴트 필터링을 이용한다. BLASTM의 디폴트 매개변수를 이용한다.
[0152] 아미노산 서열 동일성은 다음과 같이 결정될 수 있다. 대상 폴리펩타이드 서열은 폴리펩타이드 서열 데이터베이스, 예컨대 BLASTP 프로그램을 이용하는 GenBank 데이터베이스 (http://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/ 웹 사이트에서 이용가능함)를 조사하는 데 이용된다. 갭이 없는 모드에서 상기 프로그램을 이용한다. 낮은 복합성 부위들로 인해 서열 상동성을 제거하는 데 디폴트 필터링을 이용한다. BLASTM의 디폴트 매개변수를 이용한다. 낮은 복합성의 서열들에 대한 필터링은 SEG 프로그램을 이용할 수 있다.
[0153] 선호된 서열들은 엄격 조건 하에서 레퍼런스 서열 또는 이의 상동물과 혼성화할 것이다. 상기 용어 "엄격 조건 하에서의 혼성화시키다", 및 이의 문법적 균등물은 온도 및 염 농도의 제한된 조건 하에서 타겟 핵산 분자 (예컨대 DNA 또는 RNA 블랏, 예컨대 서던 블랏 또는 노던 블랏 상에 고정된 타겟 핵산 분자)와 혼성화하는 핵산 분자의 능력을 의미한다. 약 100개의 염기 길이보다 더 큰 핵산 분자와 관련하여, 전형적인 엄격 혼성화 조건들은 기껏해야 천연 이합체의 녹는점 (Tm) 이하 25℃ 내지 30℃ (예컨대, 10℃)이다 (일반적으로, Sambrook 등, (앞서 인용됨); Ausubel 등, (1999)을 참조). 약 100개의 염기 길이보다 더 큰 핵산 분자에 대한 Tm은 Tm=81.5+0.41% (G+C-log (Na+)) 식에 의해 산출될 수 있다. 약 100개의 염기 길이 미만의 핵산 분자와 관련하여 예시적 엄격 혼성화 조건은 Tm 미만의 5℃ 내지 10℃이다.
[0154] "벡터"는 폴리뉴클레오타이드 분자, 적합하게는 예를 들어 폴리뉴클레오타이드가 삽입 또는 클로닝될 수 있는 플라스미드, 박테리오파아지, 효모, 바이러스, 포유동물, 조류, 파충류 또는 어류로부터 유래된 DNA 분자를 의미한다. 좋게는 벡터는 하나 이상의 독특한 제한효소 위치를 포함하고 타겟 세포 또는 조직 또는 이의 전구세포 또는 조직를 포함하는 특정된 숙주세포에서 자가 복제가 가능할 수 있거나, 또는 상기 클로닝된 서열이 재생산가능한 특정된 세포의 게놈과 함께 통합가능할 수 있다. 따라서, 상기 벡터는 자가 복제성 벡터, 즉 염색체 외의 본체로서 존재하고 이의 복제가 염색체 복제와 독립적인 벡터, 예컨대 선형 또는 밀폐된 원형 플라스미드, 염색체 외 엘리먼트, 미니염색체, 또는 인공 염색체일 수 있다. 상기 벡터는 자가-복제를 보장하기 위한 어떠한 수단을 포함할 수 있다. 택일적으로, 상기 벡터는 숙주세포 내로 도입되는 경우 게놈 내로 통합되어 통합되었던 염색체(들)과 함께 복제되는 벡터일 수 있다. 벡터 시스템은 단일 벡터 또는 플라스미드, 2개 이상의 벡터 또는 플라스미드를 포함할 수 있고 이들은 숙주세포의 게놈 내로 통합될 총 DNA, 또는 트랜스포존을 함께 포함한다. 상기 벡터의 선택은 전형적으로 상기 벡터가 도입될 숙주세포와 상기 벡터의 양립가능성에 의존할 것이다. 또한 상기 벡터는 적합한 형질전환체의 선택에 이용될 수 있는 항생제 내성 유전자 같은 선택 마커를 포함할 수 있다. 그러한 내성 유전자의 예들은 통상의 기술자에게 알려져 있다.
[0155] "유전자"에 대한 언급은 유전자의 엑손에 해당하는 cDNA를 포함한다. 또한 본 명세서에서 "유전자"에 대한 언급은: 전사 및/또는 번역 조절 서열 및/또는 코딩 부위 및/또는 비-번역된 서열 (즉, 인트론, 5'- 및 3'-비번역된 서열)로 이루어진 전통적인 게놈 유전자; 또는 상기 유전자의 코딩 부위 (즉, 엑손) 및 5'- 및 3'-비번역된 서열에 해당하는 mRNA 또는 cDNA를 포함한다.
[0156] "조절성 엘리먼트" 또는 "조절성 서열"은 특정 숙주세포에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 핵산 서열 (예컨대, DNA)를 의미한다. 원핵세포에 적합한 조절성 서열은, 예를 들어 프로모터 및 선택적으로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 위치 같은 시스-활성 서열을 포함한다. 진핵세포에 적합한 조절 서열은 프로모터, 폴리아데닐화 시그널, 전사적 인핸서, 번역적 인핸서, 리더 또는 mRNA 안정성을 조절하는 트레일링 서열 뿐 아니라, 전사된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 산물을 세포 내 세포내 구획 또는 세포외 환경으로 타겟팅하는 타겟팅 서열을 포함한다.
[0157] 상보적 서열 및 이들의 일부가 포괄된다. 핵산 분자와 연결되어 이용되는 경우 상기 용어 "상보체(complement)" 및 "상보적(complementary)"은 왓슨-크릭 염기쌍에 의해 결정되는 상보적 핵산 서열을 의미한다. 예를 들어, 핵산 서열 5'CCATG3'의 상보체는 5'CATGG3'이다.
[0158] 상기 구 "특이적으로 혼성화하는(hybridizing specifically to)" 및 이와 유사한 것은 서열이 복합체 혼합물 (예컨대, 총 세포내) DNA 또는 RNA에 존재하는 경우 엄격 조건 하에서 특정 뉴클레오타이드 서열에만 분자의 결합, 이합화, 또는 혼성화하는 것을 의미한다.
[0159] 본 명세서에서 상호교환가능하게 이용되는 용어 "대상" 또는 "개체" 또는 "환자"는 치료 또는 예방이 소망되는 어떠한 대상, 특히 척추동물 대상, 및 보다 더 특이적으로는 포유동물 대상을 의미한다. 본 발명의 범위 내에 속하는 적합한 척추동물은 영장류, 조류, 가축 동물 (예컨대, 양, 소, 말, 당나귀, 돼지), 실험실 테스트 동물 (예컨대, 래빗, 마우스 랫트, 기니피그, 햄스터), 반려동물 (예컨대, 고양이, 개) 및 포획된 야생동물 (예컨대, 여우, 사슴, 딩고)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 선호되는 대상은 영장류, 예컨대 치료 또는 예방이 요구되는 인간이다. 하지만, 상기 언급된 용어들은 증상을 나타내는 것을 포함하지 않는 것이 이해될 것이다.
[0160] 본 명세서에서 가능한 다양한 구현예들이 다음의 비-제한적 실시예들에 의해 추가적으로 기재된다.
실시예 1
VACV - COP 은 CHO 세포에서 성장하지 못 한다
재료 및 시약
- VACV-COP, VSS02, SEM120213, 역가: 1.6x10(8) pfu/mL
- Vero: WHO-VERO-MCB 패시지 No 141, 08/08/2005, Virax Holdings Limited
- CHO: SA-Pathology 7.05.2004
- 성장 배지: RPMI, 10% FBS, Pen/Strep
- 유지 배지: RPMI, 2%FBS, Pen/Strep
[0161] CHO 및 Vero 세포는 세포주 당 하나의 6-웰 플레이트 (6-WP)에서 컨플루언시까지 배양하였다. 각 웰은 4x10(4) pfu의 VACV-COP VSS02로 상온에서 45분 동안 감염시킨 후 이후에 37℃/5%CO2에서 배양하였다. 각 세포주로부터, 2개의 웰의 함유물이 24h, 48h, 72h 감염 후에 수거되어 풀링되었다. 바이러스 추출물은 3번의 동결-해동에 의해 얻어졌고 적정에 이용될 때까지 -80℃에서 저장되었다. 각 추출물은 실시예 4에 기재된 프로토콜에 따라 Vero 세포를 이용하여 적정되었다.
[0162] 동결-해동 후 균질화 프로브(homogenation probe)는 이들 거대 불용성 클럼프를 파괴시키기 위해 이용될 수 있다. 수거될 각 웰은 2mL의 MM을 포함한다. 각 시간점에서, 2개의 웰이 풀링되어 각 시간점 당 4mL의 총 용량을 제공한다. TE 완충액이 첨가되어 각 시간점 당 6mL의 총 용량을 제공할 수 있다.
[0163] 상기 적정 결과, 바이러스 수율 결과 및 생산 수율은 표 1에 만들어져 있다. 상기 결과들은 바이러스 생산이 시간에 따라 증가하는 Vero 세포와 달리 VACV-COP가 CHO 세포 내에서 낮은 moi로 증식할 수 없다는 것은 보여준다. VACP-COP는 CHO 세포에 비-감수성이다.
실시예 2
CHO 대 Vero 에서 VACV + PH22 [ CP77 ]을 위한 다 -단계 성장
- CP77 는 VACV 에서 활성을 가진다
[0164] CP77을 인코딩하는 카우폭스 바이러스 BRO25L을 발현하는 재조합 VACV-COP (VACV-PH22 [CP77])의 CHO 내 증식능은 다단계 성장 연구에서 Vero 세포와 비교하여 결정하였다.
[0165] VACV-PH22는 CHO 숙주 범위 단백질인 CP77을 코딩하는 카우폭스 바이러스의 브라이튼 스트레인으로부터 유래된 원래의 O25L ORF를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 코펜하겐 스트레인이다. 또한 백시니아 내 이러한 ORF는 BR025L 천연 프로모터의 조절 하에 있다. 상기 천연 BR025L 유전자 (천연 프로모너 및 ORF)를 클로닝하여 레드 형광 단백질, DsRed-Express2도 코딩하는 pPH22를 만들었다. pPH22는 BR025L 유전자 및 DsRed 유전자를 가용성 및 세포 표면 IFN 알파/베타 수용체 단백질도 코딩하는 VACV-COP의 B19R ORF 내로 삽입시킬 통합 벡터이다. VACV-COP 내로의 BR025L 및 DsRed의 삽입은 VACV-COP의 다중도로 CHO를 감염시키고 pPH22을 이용한 형질전환의 결과인 상동 재조합에 의해 이루어졌다. BR025L 유전자를 포함하는 바이러스만이 레드 형광 단백질 감염된 세포 또는 플라크의 존재에 의해 시각적으로 확인될 수 있는 CHO 세포에서 추가적으로 증폭될 것이다.
[0166] 상동 재조합 후 3일째에 추출된 바이러스를 CHO에서 3번 증폭시킨 후 CHO 세포에서의 다단계 성장 연구에 이용하기 전에 Vero 세포에서 적정되었다.
재료 및 시약
- VACV-COP, VSS02, SEM120213, 역가: 1.6x108pfu/mL
- VACV-PH22 [CP77], 역가: 8x106pfu/mL
- Vero: WHO-VERO-MCB 패시지 No 141, 08/08/2005
- CHO: SA-Pathology 7.05.2004
- 성장 배지: RPMI, 10% FBS, CHO 및 Vero를 위한 Pen/Strep
- 유지 배지: RPMI, 2%FBS, CHO 및 Vero를 위한 Pen/Strep
[0167] CHO 및 Vero 세포는 세포주 당 2 x T25 플라스크에서 컨플루언시까지 배양하였다. 각 세포주의 한 개의 플라스크가 1x105pfu의 VACV-COP VSS02로, 각 하나는 1x105pfu의 VACV-PH22로 상온에서 45분 동안 감염된 후 이후에 37℃/5%CO2에서 배양하였다. 각 세포주로부터, 각 플라스크의 함유물이 96h 감염 후에 수거되었다. 바이러스 추출물은 3번의 동결-해동에 의해 얻어졌고 적정에 이용될 때까지 -80℃에서 저장되었다. 각 추출물은 24 웰 플레이트 포멧의 실시예 4에 기재된 프로토콜에 따라 Vero 세포를 이용하여 적정되었다.
[0168] 감염은 T25 플라스크에서 세포주 당 2개의 플라스크로 실시하였는데, 플라스크 1이 VACV-COP로 감염되고 플라스크 2가 VACV-PH22로 감염되었다. 수거는 96h 감염 후에만 실시하였다. 상기 결과들은 표 2에 제공된다. 표 2로부터: CHO 세포가 VACV-COP 바이러스 자손 생산을 지지할 수 없다는 것을 알 수 있었다. 이것은 실시예 1에 기재된 결과들을 확인시켜준다. 또한, VACV-COP는 본 연구에서 감수성 세포주인 Vero 세포의 감염이 200배 이상으로 접종물 레벨을 증폭시킬 때 생존가능하였기 때문에, 본 결과들은 숙주세포 제한으로 인한 CHO에서 보여졌다. 하지만, CP77이 재조합 백시니아 바이러스, VACV-PH22에 의해 발현되는 경우, 접종물의 증폭은 약 700배까지 얻어졌다. VACV-PH22를 이용한 vero 세포의 감염도 접종물을 증폭시켰기 때문에 CP77의 발현은 백시니아 숙주 범위를 CHO 세포에만 제한시키기 않았다. 하지만, 증폭 레벨은 CP77이 없는 백시니아처럼 좋지는 않을 수 있다. 적정 결과의 표준 오차가 매우 크기 때문에 수율에서의 차이가 유의하지 않을 수 있다.
[0169] 이러한 결과들은 상기 바이러스 게놈으로부터 발현된 CP77이 Vero 같은 감수성 세포 기질로부터 예상되는 것과 유사한 수율을 생산하여 비-감수성 CHO 세포주에서 VACV-COP를 증폭시키기에 보다 더 적합하다는 것을 보여준다.
[0170] CHO 세포의 백시니아 바이러스 감염 동안 CP77 단백질에 대한 가능한 기능은 Hsiao 등 (2006)에 의해 보고되었다. 저자들은 CP77이 바이러스 공장에 위치된 새롭게 합성된 백시니아 게놈으로부터 HMG20A와 결합하고 제거하여 상기 백시니아 생활 주기를 CHO 세포 내에서 지속 가능하게 해준다고 제안한다. CP77이 새롭게 합성되는 게놈을 패키징에 이용가능하게 한다고 본 명세서에서 상정되고, 그렇지 않다면 게놈에 결합하고 "단속하는(locking up)" HMG20a로 인해 CHO 세포에서 이용가능하지 않을 것이다. CP77의 기능이 Vero 같은 감수성 세포주에서 바이러스 증폭에 필요하지 않기 때문에, 적어도 CHO 세포에서는 비활성 또는 존재하지 않지만 감수성 세포주에서는 활성 또는 존재하는 이러한 기능을 가지는 택일적인 균등 단백질, 심지어 세포내 단백질이 존재한다고 본 명세서에서 제안된다. 상기 택일적 단백질은 CP77를 필요하지 않게 할 수 있어 이의 기능 손실은 넓은 숙주 범위에 필수적이지 않기 때문에 백시니아의 진화 과정 동안 이후에 결실 또는 재배열되었다.
실시예 3
p- LL07 - CHO ( CP77 을 발현하는 다중클론 세포주)의 구축
[0171] CHO 세포주가 CP77 단백질을 발현하도록 구축되었다. 녹색 형광 단백질 (EGFP)를 발현하는 VACV-COP 재조합 바이러스는 감염 후 몇일 내에 컨플루언트 감염으로 발전하는 플라크를 형성한다.
[0172] 백시니아-COP (SCV401C)은 증가된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 단백질 코딩 서열과 작동적으로 결합되고 강한 백시니아 바이러스 초기/후기 프로모터로 이루어진 발현 카세트가 A39R ORF로 삽입되며 폭스바이러스 초기 전사적 중단 서열에 의해 종결되는 코펜하겐 스트레인 (VACV-COP)의 재조합 백시니아 바이러스이다. 비-감수성 및 감수성 세포의 감염 상에, EGFP는 형광 현미경을 이용하여 시각화될 수 있는 감염된 세포 내에서 발현될 것이다. 감수성 세포에서, 상기 녹색 형광은 상기 바이러스가 세포 개체군 전반에 걸쳐서 퍼지기 때문에 세포부터 세포까지 번지는 것으로 보여질 수 있다.
[0173] CP77 단백질 코딩 서열은 카우폭스바이러스 브라이튼 레드 스트레인 UniProtKB/Swiss-Prot: P12932.1의 O25L ORF에 의해 인코딩되는 CP77의 아미노산으로부터 유래된 DNA 서열을 재창출 (역 번역 또는 거꾸로 번역)하는 GeneArt GmbH (Germany) 및 포유동물 세포 (CHO) 세포 내 발현에 최적화된 코돈에 의해 합성적으로 제조되었다. CP77의 단백질 코딩 서열의 발현을 위해 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열에 대해 서열번호 1을 참조하라.
[0174] pPH51 (코돈 최적화된 CP77 단백질 코딩 서열을 가지고 있는 클로닝 벡터)로부터 유래된 코돈 최적화된 CP77 단백질 코딩 서열은 5' 프라이머가 개시 코돈 주위의 코작 서열에 부가되도록 고안되고 3' 프라이머가 종결 코돈 전 flag-Tag 서열에 부가되도록 고안된 PCR 프라이머를 이용하여 PCR 증폭되었다. 상기 증폭된 PCR 산물은 DNA2.0 사 (USA)로부터 구매된 트랜스포존 피기백 벡터 pJ507-2 (Hyg+)의 Bsa I 클로닝 위치로 서브클로닝되었다. Bsa I 내로의 클로닝은 코멧(comet) GPF 코딩 서열을 상기 CP77 단백질 코딩 서열로 효과적으로 대체시켜 pLL07을 창출한다. 상기 CP77은 이제 인간 구성적 연장 인자 1 알파 프로모터 (EF1a)의 조절 하에 있게 되고 일단 양 유전자가 함께 트랜스펙션된 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합되면 하이그로마이신 내성 유전자와 공동 발현된다.
[0175] 트랜스포존에 의한 CHO 의 트랜스덕션은 CP77 및 하이그로마이신 내성 발현 카세트의 안정적인 삽입에 도움을 주었다: CHO 세포는 6 웰 플레이트의 웰로 분주되어 하룻밤 동안 배양 후 약 50% 컨플루언시에 도달하였다. 제조자의 설명서에 따라 Qiagen에서 구매한 에펙텐 트랜스펙션 시약을 이용하여, 1ug의 pLL07을 50% 컨플루언트 CHO 세포에 트랜스펙션시켰다. 상기 트랜스펙션된 세포는 이후 성장 배지에서 하룻밤 동안 배양시켰다. 다음날, 상기 배지를 트랜스덕션된 세포를 선택하기 위해 500ug/mL 하이그로마이신 B를 포함하는 성장 배지로 교체하였다. 상기 선택 배지는 2-3일 마다 교환하였고 트랜스덕션된 세포가 수 적으로 성장하기 시작할 때 TrypLE Select (Life Technologies)를 이용하여 회수하여 추가적인 세포 확장을 위한 T25 플라스크에 분주하였다.
웨스턴 블랏팅 ( Flag 태깅됨)에 의한 CP77 발현의 확인
[0176] 래빗 항- CP77 혈청을 만들다: 래빗에 CP77 단백질의 짧은 내부 아미노산 서열을 나타내는 KHL 단백질에 연결된 15개의 아미노산 펩타이드를 주입하였다. 이 아미노산 서열은: UniProtKBSwiss-Prot P12932.1 [025LBR CP77 단백질] 서열번호 2의 481 내지 495 아미노산 위치인 - SGSDVNIRSNNGYTC였다.
[0177] 한 달간 차이나는 총 3개의 주입을 실시하여 이러한 KHL-컨쥬게이션된 아미노산 서열에 대한 항체를 만들었다. 상기 주입된 래빗으로부터 얻은 혈액을 이용하여 박테리아 발현되고 Ni-NTA 정제된 N-말단 His-태깅된 CP77 단백질에 대해 웨스턴 블랏을 테스트하였다. 상기 래빗 항-CP77 혈청이 재조합 CP77 단백질을 명확하게 인지하였다.
[0178] p- LL07 - CHO 에 의한 CP77 발현에 대한 테스팅: 2개의 T25 플라스크에 CHO 및 p-LL07-CHO를 분주하여 각 플라스크 내 세포 단일층이 100% 컨플루언시에 도달할 때까지 배양하였다. 각 플라스크로부터 세포들을 수거하고, PBS로 세척한 후 200uL에 재현탁하였다. 여기에, 50 μL의 5X SDS-PAGE 로딩 완충액을 재현탁된 세포의 각 튜브에 첨가한 후 98℃에서 5분 동안 반응시켰다. 각 세포 단백질 추출물 15uL를 2개의 10% SDS-PAGE 겔 내로 로딩하여 전기영동시킨 후 전기-블랏팅으로 Hybond ECL 니트로셀룰로오스로 블랏팅시켰다.
[0179] 전기-블랏팅된 막에 Tween 20 (TBST)을 포함하는 Tris 염 완충액에 녹여진 5% 탈지유로 상온에서 1시간 동안 처리하여 상기 막 위에 모든 가능한 비-특이적 항체 결합 위치를 차단시켰다. 이후 항체를 이용한 프로빙 전에 상기 막을 TBST로 여러 번 세척하였다. 막 1은 HRP (ab49763, Sapphire Bioscience)에 컨쥬게이션된 항-DDDDK tag 항체 [M2]의 1:5000 희석으로 4℃에서 하룻밤 동안 프로빙하였다. 막 2는 1:100 희석의 항-CP77 항혈청으로 4℃에서 하룻밤 동안 프로빙하고, TBST로 3번에 걸쳐서 세척한 후 2차 항체인 HRP 컨쥬게이션된 항-래빗 항체 (GE Healthcare)의 1:5000 희석으로 2시간 동안 프로빙하였다. 양 막을 TBST로 3번에 걸쳐서 세척한 후 ECL 웨스턴 블랏팅 검출 시약 (GE Healthcare)으로 처리하고 사용자 설명서에 의해 지시된 대로 X-선 필름에 노출시켰다.
[0180] CHO 및 p- LL7 - CHO 에서의 플라크 어세이: CHO 및 p-LL7-CHO 세포를 복수의 6웰 플레이트에 분주하여 세포 단일층이 100% 컨플루언시에 도달할 때까지 배양시켰다.
[0181] 초기/후기 백시니아 바이러스 프로모터 (SCV401C)의 조절 하의 EGFP 발현 카세트 (녹색 형광 단백질)을 가지는 재조합 백시니아 바이러스 (코펜하겐 스트레인)를 이용하여 세포들을 감염시켰다. SCV401C의 미지의 역가로 인해, 10 μl의 스톡 바이러스가 우선 1ml의 MM 배지 (Dil 1: 1:100 희석)에 희석된 후 500 μl의 바이러스 희석액으로 각 웰을 감염시켰다. 감염 1일 후, 대부분의 세포가 녹색 형광을 띠며 높은 moi 감염을 보였다. 2ml의 MM 배지로 100 μl Dil 1를 첨가 (Dil 2)하여 Di1 1의 추가적인 1:20 희석을 실시하기로 결정하였다. 이후 이것을 이용하여 500 μl의 Dil 2로 각 웰을 감염시켰다
[0182] 상기 바이러스 감염은 GFP 필터 (Cat#U-MGFPHQ, Olympus)를 가지는 형광 현미경 (Olympus IX51)으로 관찰하였다. 상기 이미지는 cellSens 디지털 이미징 소프트웨어 (Olympus)로 얻었다.
[0183] 녹색 형광 단백질을 발현하는 VACV-COP (SCV401C)은 예측한 대로 CHO 세포에서 증식하지 않는다는 것을 상기 결과들로부터 알 수 있었다. 녹색 형광을 보이는 단일 세포는 세포에 들어가서 EGFP를 포함하는 유전자를 발현하지만 새로운 감염성 바이러스 입자를 생산할 수 없어 감염을 주위 세포로 퍼지게 할 수 없는 바이러스의 결과이다. 하지만, CP77을 발현하는 CHO 세포주에서, 상기 백시니아 바이러스는 감염 1일 추까지 감염 foci를 형성하기 위해 주변 세포로 번지는 새로운 감염성 바이러스를 생산할 수 있다. 이러한 감염 foci는 전체 세포 단일층이 3일까지 SCV401C로 감염되는 경우 감염 2틀째까지 컨플루언트 감염되었다. 숙주 범위 단백질인 CP77을 발현하는 CHO 세포는 부모 (원래의) CHO 세포와 달리 백시니아 바이러스 감염을 허용한다.
[0184] HMG20A는 HMG 박스 도메인을 포함하는 단백질 패밀리에 속한다. HMG 단백질은 십자형태(cruciforms) 같은 비틀어진 DNA 구조를 인식하는 염색체 리모델링 단백질이다. 또한 그들은 DNA 내 마이너 그루브에 결합하여 DNA 벤딩을 유도할 수 있다. 따라서 HMG 박스-포함 단백질은 DNA 복제, 재조합, 또는 리페어 동안 염색체 리모델링에 중요할 것으로 고려된다. 또한, 어떤 HMG 박스-포함 단백질은 프로모터 위치에 전사 인지와 함께 상호작용하여 유전자 전사에 영향을 미칠 수 있다.
[0185] Hsiao 등 2006에 의해 공개된 연구는 CP77이 CHO-K1 세포 내 HMG20A에 결합한다는 것을 보였다. 이러한 숙주세포 단백질인 HMG20A는 백시니아 감염된 CHO 세포의 바이러스 공장 내 바이러스 DNA에 결합하는 것처럼 보이고 이러한 숙주세포 단백질이 바이러스 공장 내 DNA를 단속하고 백시니아 생활 주기의 다음 단계를 예방하여 자손 감염성 바이러스의 생산을 억제하는 것으로 상정되었다. 카우폭스 바이러스에 의한 CP77의 발현은 숙주 HMG20A를 바이러스 DNA로부터 제거시키며 자손 감염성 바이러스 입자의 최종 생산을 다시 시작하는 바이러스 생활 주기를 허용하는 것처럼 보인다.
[0186] 하지만, 바이러스 감염의 부재 하에서 CHO 내 CP77의 발현과 함께, 이 단백질이 핵으로 이동하기 전에 세포질에 존재하는 새롭게 합성된 HMG20A를 격리시키는 것으로 예측된다. 이것이 그 경우라면, 핵에서 HMG20A의 기능이 소실되고, HMG20A가 유전자 전사 동안의 기능 외에도 DNA 복제, 재조합 및 리페어 동안 핵심적인 기능을 하기 때문에, CP77의 발현이 세포 다중도 및 유지 동안 CHO 세포의 통합성에 안 좋은 영향을 미칠 것으로 예상된다. 뜻밖에도, 이것은 부모 CHO 세포주와 비교하여 CP77을 발현하는 CHO 세포주가 많은 세대에 걸쳐서 복제하는 능력 상에 뚜렷한 효과 없이 무한증식 배양으로서 순조롭게 유지되었던 경우는 아닌 것처럼 보인다.
실시예 4
다단계 성장 연구
[0187] 다단계 성장 동력학적 연구는 p-LL07-CHO에서 실시하였다: 숙주 범위 유전자 CP77을 발현하는 CHO 세포주의 백시니아 바이러스 감염에 대한 감수성을 평가하였고 천연 감수성 인간 세포주 - 143B에서 달성되는 생산 레벨과 바이러스 생산의 레벨이 비교되었다.
[0188] 목표는 p-LL07-CHO 내 VACV-COP, CHO 및 143B 세포주의 증식 특성을 비교하는 것이었다. 이 연구에서, p-LL07-CHO에 의해 발현된 CP77의 기능성은 CHO (비-감수성) 및 143B (감수성) 세포 내 증폭 특성과 비교하여 이러한 세포주 내 VACV-COP의 증폭 특성을 조사하여 테스트하였다.
재료 및 방법
세포주 셋업
[0189] CHO 셋업: 하나의 6-웰 플레이트 (6WP)에 CHO 세포를 분주하고 성장 배지 (RPMI+10% FBS)에서 컨플루언트할 때까지 배양하였다.
[0190] 143B 셋업: 하나의 6-웰 플레이트 (6WP)에 143B 세포를 분주하고 성장 배지 (RPMI+10% FBS)에서 컨플루언트할 때까지 배양하였다.
[0191] p- LL07 - CHO 셋업: 하나의 6-웰 플레이트 (6WP)에 p-LL07-CHO 세포를 분주하고 성장 배지 (RPMI+10% FBS+500 ug/ml HygromycinB)에서 컨플루언트할 때까지 배양하였다.
[0192] VACV - COP 의 희석: 총 용량 500uL 내 0.01 pfu로 각 6WP의 각 웰을 감염시켰다. 100% 컨플루언시에서 웰 당 세포 카운트는 4x106 세포인 것으로 추정되었다. 0.01 pfu/웰의 감염율을 위해, 웰 당 4x104pfu가 요구되어서 스톡 바이러스를 유지 배지 (RPMI/2% FBS)에서 8x104pfu/mL로 희석하였다.
[0193] 감염: 희석된 바이러스 500 μL를 첨가하고 상온에서 1시간 동안 반응시켜 세포가 바이러스를 흡수하게 한 후 배양 배지를 각 플레이트의 각 웰에서 제거하였다. 이후, 바이러스 접종물을 제거하고 각 감염된 웰을 1mL 멸균 PBS로 한번 세척한 후 37℃/5%CO2에서 웰 당 2mL MM에서 반응시켰다.
[0194] 수득( Harvesting ): 각 플레이트로부터 유래된 2개 세트의 웰은 다음의 감염 후 시간점에서 수거되었다: 24h, 48h, 및 72h. 수득 하루째에, 세포를 배양 배지로부터 긁어서 각 세포주로부터 얻은 2개 세트의 웰을 합치고 1000g에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛팅된 세포를 얻었다. 각 세포 펠렛은 1mL의 10mM TrisHCl pH8에 재현탁하였다. 상기 재현탁된 세포 펠렛을 3번의 동결-해동시켜 적정 때까지 -80℃에 저장하였다.
[0195] 적정은 24-웰 플레이트에서 100% 컨플루언시로 배양된 Vero 및 143B 세포에서 실시하였다.
[0196] 희석: 상기 바이러스 추출물을 냉동고로부터 꺼내, 해동시키고 초음파처리하여 시각적 덩어리들을 균질화시켰다. 상기 바이러스 추출물을 유지 배지에서 10- 8으로 연속 희석시켰다.
[0197] 감염: 성장 배지를 각 웰로부터 제거하여 1mL의 각 희석액 (희석 당 4 웰, 10-2 희석으로 시작하는 각 바이러스에 대해 하나의 플레이트)으로 상온에서 1시간 동안 감염시켰다. 접종 후, 각 플레이트를 배양기로 옮겨 플라크가 발생하도록 3일 동안 37℃/5%CO2에서 반응시켰다.
[0198] 역가의 계산: 20 내지 50개의 플라크를 포함하는 희석액, 플라크를 카운팅한 후 평균으로 나타냈다. 이러한 평균 카운트는 희석의 역수로 곱해졌으며 1mL 감염을 이용하였기 때문에, 결과적인 도면은 pfu/mL에서의 역가일 것이다.
[0199] 표준 오차의 계산: 95% 신뢰도에서의 표준 오차 (SE)는 다음의 공식을 이용하여 평균을 구성하는 4개의 적정 값으로부터 계산하였다: 1.95 x (SD/√n): SD는 작은 시료에 대한 표준편차이고, n은 적정 복제물의 수이다 (본 경우에는 4).
[0200] 수율의 계산: 이것은 적정된 바이러스 추출물 내 바이러스의 총 양이다: 평균 적정 (pfu/mL) X 바이러스 추출물의 총 용량 = pfu.
[0201] 증폭 비율의 계산: 본 도면은 접종물로서 이용된 양에 대한 증폭 배수를 나타낸다: pfu에서 pfu/접종물 크기의 수율.
[0202] 다단계 성장 동력학 연구는 6 웰 플레이트에서 실시하였다 - 시간점 당 세포주 당 2개의 웰. 각 웰은 4x104pfu의 VACV-COP로 감염시켰고 수득을 위해 각 세포주 및 시간점에 대해 2개의 웰이 수득 및 합쳐졌으며 이로부터 바이러스 추출물을 제조하였다. 8x104pfu (4x104pfu X 2)의 접종물 크기로부터 초래되는 2개의 감염을 합친 이러한 바이러스 추출물인 1mL의 총 용량을 적정하였다. 적정은 2개의 지시인자 세포주인 143B 및 Vero를 이용하여 실시하였다.
[0203] 역가 및 바이러스 수율 결과는 각각 표 3 및 표 4에 제시된다. VACV-COP는 비-감수성 CHO 세포에서 증폭하지 않았는데, 즉 인풋 접종물에서 이용된 양보다 적은 바이러스를 생산하였다. 하지만, 숙주-범위 유전자 CP77을 발현하는 CHO 세포주에서의 바이러스 증폭은 인풋 접종물보다 약 2000배 이상이었다 (지시인자 세포주로서 143B 세포를 이용한 적정 결과에 기반됨). 감수성 세포로부터의 증폭은 인풋 접종물보다 약 3000배 이상이었다. 표준오차가 중첩되기 때문에 p-LL07-CHO와 143B 세포 간 증폭에서의 차이는 통계적으로 유의하지 않다.
[0204] 두 세포주 간의 바이러스 증폭이 Vero 지시인자 세포의 적정 결과를 이용하여 비교된다면 증폭은 143B 세포보다 p-LL07-CHO에서 미미하게 더 일어나는 것으로 보이지만 통계적으로 유의하지는 않았다.
[0205] 이러한 연구에서 바이러스 생산의 레벨이 접종물로서 이용된 바이러스의 양보다 훨씬 더 낮았기 때문에 백시니아 바이러스가 CHO 세포에서 감수성을 가지지 않는다는 것을 추가적으로 확인하였다. 하지만, CHO가 CP77 단백질을 인코딩하는 카우폭스 바이러스 숙주 범위 유전자를 발현하는 경우, 상기 세포는 백시니아 바이러스에 감수적이 되고 감수성 세포주에서 보여지는 레벨과 동일하게 바이러스 생산을 지원한다. 또한 이러한 세포주를 백시니아 생산을 위해 "사용가능한(usable)" 감수성 세포 기질로 변화시키는 것이 하나의 숙주 범위 유전자 CP77의 발현만을 요구하였다는 것이 놀랍다. CHO가 박테리아처럼 빠르게 성장하고, 소태아혈청 같은 생물학적 부가물에 대한 필요 없이 특정된 합성 배양 배지에서 배양될 수 있으며 바이오리액터(bioreactor)에서 세포 현탁액으로서 배양될 수 있다는 점에서 생명공학 친화적 세포주이기 때문에 CHO로부터 백시니아를 생산하는 것은 매우 바람직하다. 또한 CHO는 생물학적 의학 산물을 생산가는 역사를 가지고, 잘 특성화 및 알려져 있으며 FDA 및 EMEA 같은 생의학적 조절 기관에 의해 선호된다.
[0206] 구성적 세포내 프로모터의 조절 하에서 CP77 단백질을 발현하는 트랜스제닉 CHO 세포주는 높은 레벨의 자손 바이러스를 생산하는 천연의 감수성 세포주에서 보여지는 레벨과 동일한 정도로 백시니아 바이러스 복제 및 증식에 관대하다.
실시예 5
CHO - CP77 세포에서 MVA 증식
CHO , 143B 및 p- LL07 - CHO 에서 MVA + GFP 증식
재료 및 방법
[0207] 성장 배지 ( GM ): RPMI-1640, 10% FBS, 2mM L-글루타민, 페니실린 및 젠타마이신이 보충됨, Hepes
[0208] 유지 배지 ( MM ): RPMI-1640, 2% FBS, 2mM L-글루타민, 페니실린 및 젠타마이신이 보충됨, Hepes
[0209] p-LL07-CHO 배양 시 주의점: p-LL07-CHO 세포주의 일반적인 증식 및 유지는 500ug/mL의 하이그로마이신 B를 포함하는 GM에서 실시하였지만, 감염 전 플레이팅 및 100% 컨플루언시까지의 배양을 위해서 세포는 하이그로마이신 B 없는 GM에서 배양시켰다.
[0210] 세포 셋업: 143B, CHO 및 P-LL07-CHO 세포를 다중 6-웰 플레이트에 분주하여 세포 단일층이 100% 컨플루언트할 때까지 성장 배지 (GM)에서 37℃/5% CO2 하에서 배양시켰다. 세포주 당 하나의 플레이트를 배양하였다.
감염
● GFP 발현 카세트 (녹색 형광 단백질)을 운반하는 재조합 MVA를 이용하여 6-웰 플레이트에서 배양된 세포를 감염시켰다. MVA-GFP의 역가가 알려지지 않았기 때문에, 상기 바이러스는 다음과 같이 유지 배지 (MM)에서 연속적으로 희석되었다:
○ Dil 1: 20 ul의 스톡 바이러스를 2ml의 MM 배지에서 희석 (1:100 희석)하여 격한 볼텍싱으로 혼합시켰다.
○ Dil 2: 500 ul의 Dil 1에 4.5 ml의 MM 배지를 첨가 (1:103 희석)하여 격한 볼텍싱으로 혼합시켰다.
○ Dil 3: 500 ul의 Dil 2에 4.5 ml의 MM 배지를 첨가 (1:104 희석)하여 격한 볼텍싱으로 혼합시켰다.
○ Dil 4: 500 ul의 Dil 3에 4.5 ml의 MM 배지를 첨가 (1:105 희석)하여 격한 볼텍싱으로 혼합시켰다.
● 각 플레이트의 하나의 웰을 다음의 500 μl 바이러스 희석물 Dil 2, Dil 3, 및 Dil 4로 감염시켰다.
● 각 플레이트를 5일의 기간 동안 반응시켰으며 형광성 세포의 foci의 발생 및 전파에 대해 조사하였다. 본 연구에서, Dil 4는 3일 기간에 지나 형광성 세포의 분명한 foci를 생산하였다. 각 플레이트의 비감염된 웰은 자가-형광에 대한 대조군이었다.
현미경적 관찰( Microscope Viewing )
[0211] 바이러스 감염은 GFP 필터 (Cat#U-MGFPHQ, Olympus)를 가지는 형광 현미경 (Olympus IX51)으로 관찰하였다. 상기 이미지는 cellSens 디지털 이미징 소프트웨어 (Olympus)로 얻었다.
결과
[0212] 상기 결과들은 예측한 대로 녹색 형광 단백질을 발현하는 MVA가 CHO 및 143B 세포에서 증식하지 않는다는 것을 나타냈다. 녹색 형광을 보이는 단일 세포는 세포에 들어가서 GFP를 포함하는 유전자를 발현하지만 새로운 감염성 바이러스 입자를 생산할 수 없어 감염을 주위 세포로 퍼지게 할 수 없는 바이러스의 결과이다. 하지만, CP77을 발현하는 CHO 세포주에서, MVA는 3일까지의 추가적인 발생과 함께 감염 1일 후에 감염 foci를 형성하기 위해 주변 세포로 번지는 새로운 감염성 바이러스를 생산할 수 있다.
실시예 6
p- LL07 - CHO 감염으로부터 수득된 MVA 의 숙주 범위 제한의 확인
세포 셋업
[0213] 143B, CHO 및 BHK-21 세포를 다중 6-웰 플레이트에 분주하여 세포 단일층이 100% 컨플루언트에 도달할 때까지 성장 배지 (GM)에서 37℃/5% CO2 하에서 배양시켰다. 세포주 당 하나의 플레이트를 배양하였다.
실시예 5로부터 바이러스 수득
[0214] 실시예 5의 Dil 3 감염된 P-LL07-CHO 웰로부터 얻은 MVA+GFP를 감염 5일 후에 다음과 같이 수득하였다:
● 상층액 및 세포 모두를 웰로부터 수거하여 1000g에서 5분 동안 원심분리 시켜 감염된 세포를 펠렛팅하였다.
● 상기 세포 펠렛을 500 ul의 100 mM Tris-HCl pH8 완충액에 재현탁시켰다.
● 상기 재현탁된 세포 펠렛을 적어도 3번 동결 및 해동시켜 상기 감염된 세포로부터 바이러스를 방출시켰다.
감염
● 상기 바이러스 조추출물의 역가가 알려져 있지 않기 때문에 상기 바이러스를 실시예 5와 같은 방식으로 MM 배지에서 연속적으로 희석시켰다.
● 각 플레이트의 하나의 웰을 다음의 500 μl 바이러스 희석물 Dil 2, Dil 3, 및 Dil 4로 감염시켰다.
● 각 플레이트를 5일의 기간 동안 반응시켰으며 형광성 세포의 foci의 발생 및 전파에 대해 조사하였다. 본 연구에서, Dil 3은 3일 기간에 지나 형광성 세포의 분명한 foci를 생산하였다.
현미경적 관찰
[0215] 바이러스 감염은 GFP 필터 (Cat#U-MGFPHQ, Olympus)를 가지는 형광 현미경 (Olympus IX51)으로 관찰하였다. 상기 이미지는 cellSens 디지털 이미징 소프트웨어 (Olympus)로 얻었다.
결과
[0216] CP77을 발현하는 CHO 세포주로부터 수득되었던 MVA는 비-감수성 세포주 CHO (햄스터) 및 143B 세포 (인간)에서 증식할 수 없어서 여전히 제한된 숙주 범위를 유지하였다. CHO 및 143B 세포의 감염 후 3일 기간에 걸친 녹색 형광 foci의 부재는 이들 세포주에서 어떠한 감염성 자손 바이러스를 생산하지 않았다는 것을 증명한다. 하지만, 다음 3일까지 크기 성장하는 감염 1일 후에 감염의 녹색 형광 foci를 볼 수 있었기 때문에 이러한 MVA는 BHK21 세포 (햄스터)에 대한 숙주 범위를 여전히 유지하였다.
결론
● 숙주 범위 단백질 CP77을 발현하는 CHO 세포는 부모 (원래의) CHO 세포와 달리 MVA 감염에 관대하다.
● CP77을 발현하는 CHO 세포주에서 증식하였던 MVA는 CHO 및 143B (인간) 같은 비-감수성 세포주에 대한 숙주 범위를 증가시키지 않았다.
실시예 7
pLL07 의 구축
[0217] 백그라운드 정보: pPH51 DNA 템플레이트로부터 유래된 CP77 (CHO 코돈 최적화됨) CDS PCR 산물을 클론텍의 인퓨전 클로닝 시스템에 의한 pJ507-2 (Hyg+) 피기백 시스템으로 클로닝하여 pLL07을 만들었다. 상기 flag-태깅된 CP77 서열을 pJ507-2의 BsaI으로 삽입시켜 코멧 GFP 서열을 제거하였다 (서열번호 3).
[0218] pPH51 플라스미드 DNA로부터 CP77-CHO 유전자를 PCR 증폭시키는 데 이용되는 PCR 프라이머 쌍: AACACGTCTCGGGGGgccgccaccATGTTCGACTACCTGGAAAATGAGGAAGTG (서열번호 4) 및 CAGGAAGACGCTTTTtcaCTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCCTGCTGCTCGAAGATCTTGTACT (서열번호 5). 상기 Flag 택 서열은 Inf-LL07-CP77-Rv 프라이머에서 굵은 글씨로 보여진다.
[0219] 플라스미드 INSERT/CASSETTE 형태는 다음과 같다. Insert/Cassette Map. pLL7 클론 #3이 시퀀싱되었다.
[0220] pLL07 레퍼런스 파일 "pLL07_ref.sbd"와 함께 15개의 ABI 시퀀싱 파일들이 Lasergene의 DNAstar Seqman 컴퓨터 프로그램에 도입되어 1개의 컨센서스 컨티그(consensus contig)로 어셈블리되었다. 정렬 서열이 레퍼런스 서열의 시작과 끝에 매칭되도록 정돈된 후 컨센서스 서열의 확정에 어떠한 영향도 없기 때문에 상기 정렬로부터 상기 레퍼런스 서열을 제거하였다. 상기 컨티그의 컨센서스 서열은 "pLL07_#3 consensus.seq"로 명명된 DNA 서열 파일로 저장되었다. 상기 컨티그의 판독 방향을 결정하여 상기 레퍼런스 서열처럼 동일한 판독 방향을 나타낸다는 것을 발견하였다. 메가라인 (DNAstar)을 이용하여 "pLL07_#3 consensus"를 "pLL07_ref.sbd" 레퍼런스 서열에 수작업으로 정렬시켜 상기 레퍼런스 서열과 pLL07_#3 내 서열 간의 불일치를 동정하였다. Seqman (디폴팅 셋팅)을 이용하는 AGRF-시퀀싱 서비스로부터 pLL07Clone#3에 대한 15개의 AB1 파일을 어셈블리하는 것은 pLL07 삽입 레퍼런스 서열의 전장을 포괄하는 하나의 컨센서스 컨티그를 창출하였다. pLL07_#3 내 서열과 레퍼런스 서열 간에 어떠한 불일치도 없었다. pLL07_#3 컨티그 컨센서스 내 삽입 서열은 상기 레퍼런스 서열과 동일하다.
실시예 8
포유동물 세포에서 G1L 및 I7L 의 발현
[0221] Flag-태깅된-G1L 또는 Flag-태깅된-17L을 인코딩하는 발현 플라스미드를 구축하여 이들 단백질을 발현하는 트랜스제닉 143B 세포주를 제조하는 데 이용하였다. 비록 트랜스덕션된 세포를 양성적으로 선택하기 위해 이들 세포들이 게네티신의 존재 하에서 증폭되고 PCR 분석이 이들 세포주의 게놈 내에 이들 단백질 코딩 서열의 존재를 확인시켜 주었을 지라도, 항-DDDDK 항체로 프로빙하였을 때 웨스턴 블랏 분석은 발현된 Flag-태깅된-단백질들의 존재를 검출하는데 실패했다.
[0222] C-말단 Flag-태깅된 COP-G1L 및 COP-17L의 단백질 코딩 서열은 GeneArt (Life Technologies)에 의해 합성되었으며 DNA2.0 사 (USA)에서 구매된pJ503-2 (piggyBac - 네오마이신 항생제 선택)의 Bsa I 위치로 서브클로닝되었다. 이러한 클로닝 과정은 코멧 GFP를 Flag-태깅된-G1L 또는 -17L 단백질 코딩 서열로 교환시킨다. 결과적인 클론들은 G1L 피기백 벡터에 대해서 pLL08 및 17L 피기백 벡터에 대해서 pLL10으로 명명되었다.
[0223] 이들 2개의 플라스미드 벡터의 핵심 특징은: flag-태깅된 단백질 코딩 서열이 구성적 인간 프로모터 EF1알파의 조절 하에 있고, NPT II 발현 카세트 (네오마이신 내성 유전자)를 가진 이러한 발현 카세트는 좌 및 우 트랜스포존 경계로 플랭킹되어 인위적인 트랜스포존 엘리먼트를 형성한다는 것이다. 상기 인위적인 트랜스포존 엘리먼트 외에 존재하지만 동일한 플라스미드 내에 포함되는 것이 상기 트랜스포존 엘리먼트의 숙주 게놈 내로의 비가역적 통합을 매개하는 트랜스포존 효소 발현 카세트이다. 이러한 트랜스포존 엘리먼트를 운반하는 세포는 세포 성장 배지에 G418 (게네티신)을 포함시킴으로써 양성적으로 선택될 수 있다.
[0224] 플라스미드 벡터 pLL08 (Flag-태깅된-G1L) 및 pLL10 (Flag-태깅된-I7L)을 143B 세포에 트랜스펙션시켜 2개의 형질전환된 트랜스제닉 세포주를 만들었다: G1L-143B (G1L 발현 카세트를 포함), 및 I7L-143B (I7L 발현 카세트를 포함). 성공적인 트랜스포존 통합을 가지는 세포는 성장 배지 내 게네티신의 포함으로 실행가능한 양으로 증폭되었다. 성공적인 통합을 확인하기 위해, 키트의 설명 매뉴얼에 따른 설명서에 따라 Qiqgen에서 구매한 DNeasy DNA 추출 키트를 이용하여 총 세포내 DNA를 이들 트랜스제닉 세포로부터 추출하였다. 추출된 DNA를 G1L 및 I7L의 PCR 증폭에 특이적인 PCR 프라이머 쌍을 이용한 PCR 증폭 반응에 대한 템플레이트로서 이용하였다. 양 세포주는 게놈 상에 G1L 및 I7L DNA 서열의 존재에 양성이었다.
[0225] 이들 세주에에서 G1L 및 I7L 발현에 대한 테스트를 위해 HRP에 컨쥬게이션된 항-Flag 택 항체 [M2] (항-DDDDK 항체, Abcam #ab49763)를 이용하여 각 Flag-태깅된 단백질의 존재를 검출하도록 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. G1L-143B 및 I7L-143B 세포주로부터 추출된 총 단백질을 이용한 이들 웨스턴 블랏 분석의 결과는 항-Flag-택 항체가 예상한 대로 143B로부터 추출된 어떠한 단백질도 검출하지 않았고 항-flag-택 항체가 flag-태깅된 단백질을 인식할 수 있다는 것으로 보여주는 Flag-택-CP77 트랜스제닉 CHO 세포주 (CP77-CHO)에서 발현된 Flag-택 단백질을 검출할 수 있다는 것을 보여줬다. 하지만, 어떠한 Flag-태깅된-G1L 단백질도 G1L-143B 시료로부터 유래된 단백질 추출물에서 검출될 수 없었다. 박테리아적으로 발현된 Flag-태깅된-I7L 단백질은 항-Flag-택 항체에 의해 검출될 수 있지만 I7L-143B 세포주에 의한 Flag-태깅된-I7L 발현을 검출할 수 없었다.
[0226] G1L 및 I7L 발현 카세트는 각 세포주에서 검출되었기 때문에, 상기 발현된 단백질이 백시니아 감염의 부재 하에서 합성 후 빠르게 분해, 즉 G1 및 I7 모두 바이러스 특이적 효소이고 백시니아 특이적 효소 기질 없이 불안정할 수 있거나, 또는 프로모터 촉진성 2개의 발현 카세트들이 결점이 있을 수 있다는 것이 결론이다. 다른 가설로서, 백시니아 감염의 부재 하에서 이들 단배질의 발현이 세포 및 게네티신 선택 과정 동안에 "독성"이 있고, 상기 세포는 트랜스제닉 G1L 및 I7L 발현 카세트를 사일런싱시켰지만 NPT II 발현 카세트가 G1L 및 I7L 단백질을 발현하지 않았던 게네티신 내성 세포의 증폭을 가능하게 하였다. pJ503-2 피기백 플라스미드는 143B 세포에서 COP-D13L의 발현에 대해 본 실험실에서 성공적으로 이용되었기 때문에, EF1알파 프로모터가 기능적이고 이들 단백질이 백시니아 감염 또는 이들 단백질의 프로모터 발현을 촉진하는 프로모터의 부재 하에서 불안정하여 게네티신의 존재 하에서 세포 증폭 동안 "독성" 단백질의 발현을 억제하도록 선택적으로 사일런싱되었다고 제안된다.
실시예 9
필수적인 구조적 성숙 또는 어셈블리 단백질의 예로서 D13L 은 포유동물 세포에서 발현되고 상기 D13L 유전자으로 결실을 가진 백시니아로 레스큐하고 상기 D13L 결실된 백시니아는 감염된 세포에서 단백질을 발현한다
[0227] D13-레스큐 세포주의 구축 - 어셈블리/성숙 과정을 차단하여 백시니아를 약화시키는 예로서, 코펜하겐 스트레인의 D13L ORF가 결실을 위해 타겟팅되었다. 그러는 동안, 이 단백질을 발현하는 세포주가 우선 구축되어야만 하고 이에 따라 COP-D13L-결실된 바이러스가 증식될 수 있다. 상기 레스큐 세포주의 구죽을 위해, "생물공학" 친화적이기 때문에 종종 CHO로 언급되는 중국햄스터 난소 세포주를 선택하였다. COP-D13L 결실을 가진 감염성 백시니아 바이러스를 레스큐하기 위해, 이러한 세포주는 백시니아 바이러스가 아닌 세포의 전사 기구를 이용하여 이의 핵 게놈으로부터 D13-단백질을 발현해야만 한다. 상기 세포내 발현된 D13-단백질의 단백질 아미노산 서열은 C-말단 태깅된 아미노산 서열 DYKDDDDK (Flag-택, Hopp 등 1988)을 포함하였고 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 생산하도록 CHO 코돈 최적화되었다. 포유동물 프로모터 및 포유동물 폴리-아데닐화 시그널 서열로 이루어진 이러한 태깅된 D13L-CHO 코돈 최적화된 발현 카세트의 핵 DNA로의 안정적인 통합은 Urschitz 등 및 Matasci 등 2011에 의해 보고된 타입의 트랜스포존 통합 기술에 의해 달성되었다. CHO의 트랜스덕션은 DNA2.0 사 (USA)로부터 구매된 피기백 벡터 시스템을 이용하여 달성하였다.
[0228] D13L 단백질 코딩 서열의 구축 - 상기 D13L 단백질 코딩 서열은 백시니아 바이러스 코펜하겐 스트레인의 D13L ORF에 의해 인코딩되고 CHO 세포 내 발현을 위해 코돈 최적화된 D13-아미노산으로부터 상기 DNA 서열을 창출하는 GeneArt of LifeTechnologies의 GeneArt에 의해 합성적으로 제조하였다. VACV-COP D13L ORF의 단백질 코딩 서열은 서열목록에 기재되어 있다.
[0229] D13L 세포 트랜스덕션 벡터의 구축 - pLL17로부터 상기 코돈 최적화된 D13-단백질 코딩 서열 (D13LchoTagged)을 PCR 증폭하여 DNA2.0 사 (USA)로부터 구매된 트랜스포존 피기백 벡터 pJ503-2 (pHULK piggyBac Mammalian Expression Vector with CometGFP and Neo+) Bsa I 클로닝 사이트 내로 서브클로닝되어 pLL19를 만들었다. 인-퓨전 클로닝 (Clontech: 리가제 부재 클로닝)에 의한 BsaI 사이의 클로닝은 인 비트로 상동 재조합을 통해 코멧 GFP 코딩 서열을 제거하고 이를 상기 태깅된 D13-단백질 코딩 서열로 대체한다. 상기 D13LchoTagged 단백질 코딩 서열은 이제 인간 연장 인자 1 알파 프로모터 (EF1a)의 조절 하에 존재하며 일단 양 유전자가 트랜스펙션된 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합되면 네오마이신 내성 유전자와 함께-발현될 것이다. 숙주 게놈 내로의 안정적인 통합은 피기백 벡터의 좌 및 우 트랜스포존 보더에 의해 결합된 상기 DNA 서열의 트랜스포존 통합에 의해 매개된다.
[0230] D13LchoTagged 서열의 PCR 증폭은 다음의 프라이머 쌍을 이용하여 실시하였다:
정방향 프라이머 서열:
Inf - LL19 - D13LC - Fw : 5'- AACACGTCTCGGGGGgccgccacc ATGAACAACACCATCATCAA-3'
[0231] 텍스트 내 대문자, 굵은 및 밑줄친 서열은 인-퓨전 클로닝을 위해 필요한 pJ503-2 (Neo+) 내 코멧 GFP의 BsaI 위치 업-스트림에 상동적인 서열을 나타낸다. 텍스트 내 소문자, 붉은 및 밑줄친 서열은 변형된 Kozak 서열이다. 정상적인 대문자 텍스트의 서열은 pLL17 내 D13LchoTagged 서열의 5'-말단에 상동적이다.
역방향 프라이머 서열
Inf - LL19 - D13LC - Rv : 5'- CAGGAAGACGCTTTT TCACTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAG-3'
[0232] 텍스트 내 대문자, 굵은 및 밑줄친 서열은 인-퓨전 클로닝을 위해 필요한 pJ503-2 (Neo+) 내 코멧 GFP의 BsaI 위치 다운-스트림에 상동적인 서열을 나타낸다. 정상적인 대문자 텍스트의 서열은 pLL17 내 D13LchoTagged 서열의 3'-말단에 상동적이다. 제조자의 설명서에 따른 인퓨전 클로닝 (Clontech)에 의해 예상되는 1719bp PCR 산물을 BsaI 커트 pJ503-2 (Neo+) 내로 클로닝하여 pLL19를 만들었다.
[0233] D13 -단백질을 발현하는 CHO 세포주의 구축: p-LL19-CHO-CHO 세포를 6-웰 플레이트의 웰에 분주하고 하룻밤 동안 배양한 후 50% 컨플루언시 근처에 도달하였다. Qiagen으로부터 구매된 에펙텐 트랜스펙션 시약 (Cat # 301425)을 이용하여, 제조자의 설명서에 따라 1ug의 pLL19를 50% 컨플루언트 CHO 세포의 하나의 웰에 트랜스펙션시켰다. 상기 트랜스펙션된 세포를 성장 배지 (RPMI 1640/10% FBS/2mM Glutamax/Pen-Strep)에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음 날에, 트랜스덕션된 세포를 선택하기 위해 상기 배지를 1000ug/mL 게네티신을 포함하는 성장 배지로 교체하였다. 상기 선택 배지는 2 내지 3일 마다 교체하였다. 상기 트랜스덕션된 세포를 90 내지 100% 컨플루언시까지 성장시켰을 때, 상기 세포들은 TrypLE Select (Gibco-Invitrogen Corp, Cat #12563-029)를 이용하여 회수하고 추가적인 세포 확장을 위해 T25 플라스크에 분주하였다.
[0234] 웨스턴 블랏팅에 의한 D13 발현의 확인 - 래빗 항- D13 항혈청 생산: 래빗에 원래의 D13-단백질의 C-말단 아미노산에 해당하는 KLH 단백질에 결합된 16개의 아미노산 펩타이드를 주입하였다. 이러한 아미노산 서열을: CYDQGVSITKIMGDNN였다. 1개월의 차이로 총 3개의 주입을 실시하여 이러한 아미노산 서열에 대한 항체를 생산하였다. 상기 주입된 래빗으로부터 얻은 혈청을 다음 세포 추출물에 대한 웨스턴 블랏 분석으로 테스트하였다: 143B 전체 세포 추출물, Flag-태깅된-D13L을 발현하는 143B 트랜스제닉 세포주 (p-LL06-143b)로부터 유래된 총 추출물 및 VACV-COP 감염된 143B 세포 추출물. 결과들은 상기 래빗 항-D13 혈청이 D13-단백질을 특이적으로 인식할 수 있다는 것을 명확하게 증명하였다.
[0235] CHO - 트랜스덕션된 세포 제조 - D13LchoTagged 트랜스덕션된 CHO 다중클론 확장된 세포주 (p-LL19-CHO)는 정상적인 CHO 세포처럼 T25 플라스크에서 100% 컨플루언시까지 배양시켰다. 각 플라스크로부터 얻어진 세포를 TrypLE Select (Gibco-Invitrogen Corp, Cat #12563-029)로 수득하고, 저속도 원심분리 (300g에서 5분 동안)로 펠렛팅시키며, PBS로 세척 후 200uL의 PBS에 재현탁시켰다.
[0236] 웨스턴 블랏 분석 - 50uL의 5x SDS-PAGE 로딩 완충액을 각 세포 현탁액에 첨가한 후 98℃에서 5분 동안 반응시켰다. 15uL의 각 세포 단백질 추출물을 2개의 SDS-PAGE 겔에 로딩하여 전기영동시킨 후 전기적-블랏팅에 의해 Hybond ECL 니트로셀룰로오스로 블랏팅시켰다. 상기 전기블랏팅된 막에 Tween 20 (TBST)을 포함하는 Tris 염 완충액에 녹여진 5% 탈지유로 상온에서 1시간 동안 처리하여 상기 막 위에 모든 가능한 비-특이적 항체 결합 위치를 차단시켰다. 항체를 이용한 프로빙 전에 상기 막을 TBST로 여러 번 세척하였다. 막 1은 HRP (ab49763, Sapphire Bioscience)에 컨쥬게이션된 항-DDDDK tag 항체 [M2]의 1:5000 희석으로 4℃에서 하룻밤 동안 프로빙하였다. 막 2는 1:2000 희석의 래빗 D13-항혈청으로 4℃에서 하룻밤 동안 프로빙하고, TBST로 3번에 걸쳐서 세척한 후 2차 항체인 HRP 컨쥬게이션된 항-래빗 항체 (Abcam, Cat # ab97069)의 1:5000 희석으로 2시간 동안 프로빙하였다. 양 막을 TBST로 3번에 걸쳐서 세척한 후 ECL 웨스턴 블랏팅 검출 시약 (GE Healthcare)으로 처리하고 사용자 설명서에 의해 지시된 대로 X-선 필름에 노출시켰다.
실시예 10
D13L ORF 결실에 의한 VACV - COP 의 약화
[0237] 백시니아 바이러스를 약화시키기 위해, COP-D13L ORF의 단백질 코딩 서열의 대부분과 함께 상기 보존된 후기 프로모터 서열이 상동 재조합에 의한 결실로 결정되었고 해당 부위에 선택/리포터 카세트가 삽입되어 상동 재조합에 의한 성공적인 결실이 D13-단백질을 발현하는 CHO 세포주에 대해 선택할 수 있었으며 감염이 빨간색 형광으로 시각화될 수 있었다. 상기 선택/리포터 카세트는 백시니아 프로모터의 조절 하에서 CP77을 발현하는 CHO 숙주 범위 유전자 및 DsRed-Express2 서열로 이루어져 있다.
[0238] COP - D13L 결실 상동성 재조합 벡터의 구축 - 상동 재조합에 의한 VACV-COP로부터 상기 D13L ORF의 결실을 위해, 2개의 상동성 재조합 팔이 COP-D13L ORF의 양 사이드를 플랭킹하도록 고안되었다. 하지만, 상기 COP-D12L ORF의 프로모터 서열이 COP-D13L ORF의 3' 말단 내에 위치하기 때문에, 약 200 bp의 COP-D13L ORF의 3' 말단이 온전한 채로 남겨졌다.
[0239] 상동성 재조합 팔 F1 및 F2의 구축 - 상동성 재조합 팔은 하기에 보여지는 프라이머 쌍을 이용하여 VACV-COP 게놈 DNA로부터 PCR 증폭하였다. 굵고 밑줄친 텍스트는 선택/리포터 카세트 및 Clontech의 인-퓨전 키트에서 제공되는 선형화된 pUC19에 상기 F1 및 F2를 결합시키기 위한 인-퓨전 팔을 나타낸다. 인-퓨전 라이게이션은 pLL09로 명명된 원형 플라스미드를 초래할 것이다.
VACV - COP DNA 로부터 D13L -F1 팔을 PCR 증폭하기 위해 이용되는 PCR 프라이머 쌍:
Inf - PCR - D13L -F1- Fw: 5' CGGTACCCGGGGATC ACGAAAAATAATAGTAACCA-3'. 굵고 밑줄친 텍스트 (15bp)는 ClonTech 인-퓨전 키트에 의해 제공되는 선형화된 pUC19 플라스미드의 좌측 말단에 상동적인 서열을 나타낸다.
Inf - PCR - D13L -F1- Rv : 5'- AATTTAGTGTGCGCG TGGAAAAAGCTTACAATAAACTC-3'. 굵고 밑줄친 텍스트 (15bp)는 선택/리포터 카세트의 5' 말단에 상동적인 서열을 나타낸다. 예상된 PCR 산물 크기: 657 bp
VACV - COP DNA 로부터 D13L -F2 팔을 PCR 증폭하기 위해 이용되는 PCR 프라이머 쌍:
Inf - PCR - D13L -F2- Fw : 5'- ATATTTAAATGCGCG CAATAATGGAACAAGAACCCT-3'. 굵고 밑줄친 텍스트 (15bp)는 선택/리포터 카세트의 3' 말단에 상동적인 서열을 나타낸다.
Inf - PCR - D13L -F2- Rv : 5'- CGACTCTAGAGGATC GCGCTGAGGTCGGCAACTACG-3'. 굵고 밑줄친 텍스트 (15bp)는 ClonTech 인-퓨전 키트에 의해 제공되는 선형화된 pUC19 플라스미드의 우측 말단에 상동적인 서열을 나타낸다. 예상된 PCR 산물 크기: 621 bp
[0240] 선택/리포터 카세트의 구축 - 선택/리포터 발현 카세트는 카우폭스 바이러스 025L ORF (브라이튼 레드 스트레인)로부터 얻어진 CP77 CHO 숙주-범위 유전자 및 DsRed-Express2의 빨간색 형광 단백질 코딩 서열로 이루어져 있다. 이러한 발현 카세트는 Life Technologies GeneArt에 의해 합성적으로 제조되어 CP77 단백질 코딩 서열이 이의 원래 프로모터 (CP77 ATG 개시 코돈의 업스트림 100bp 서열)의 조절 하에 존재하고 폭스바이러스 초기 전사적 중단 서열 (T5NT)로 종결되게 된다. 상기 DsRed 단백질 코딩 서열은 백시니아 바이러스 초기/후기 프로모터의 조절하게 존재하며 또한 폭스바이러스 초기 전사적 중단 서열로 종결된다.
[0241] pLL09 의 어셈블리 - 선택/리포터 카세트와 함께 D13L-F1 및 D13L-F2 PCR 산물을 제조자의 설명서에 따른 인-퓨전 클로닝에 의해 ClonTech으로부터 구매된 인퓨전 키트에서 제공되는 pUC19 내로 어셈블리시켜 pLL09를 생산하였다.
[0242] 상동 재조합에 의한 COP-D13L의 결실 및 SCV104를 생산하기 위한 플라크 정제 - 대부분의 단백질 코딩 서열 및 보존된 후기 프로모터 엘리먼트 "TAAAT"을 결실시켜 상기 COP-D13L ORF를 불활성화시켰다. COP-D13L ORF는 백시니아 바이러스 후기 프로모터의 조절 하에 존재하고 상기 보존된 후기 프로모터 엘리먼트는 프로모터 활성에 핵심적이다 (Moss, 2007) - 이러한 결실은 사일런싱되는 COP-D13L ORF를 초래할 것이다. 상기 단백질 코딩 서열 및 보존된 프로모터 엘리먼트의 결실은 VACV-COP과 pLL09 간의 상동 재조합에 의해 유효화되며 상동 재조합의 결과는 상기 결실된 부위 내로 CP77/DsRed 발현 카세트의 삽입이다. 이러한 발현 카세트의 삽입은 재조합 바이러스, 이제 SCV104로 지명된 바이러스가 CHO 세포지만 오직 p-LL19-CHO 같은 기능성 D13-단백질을 발현하는 세포에서 증식할 수 있게 한다. "캐리오버(carryover)"를 오염시키는 상동 재조합 후 부모 바이러스 (VACV-COP)는 연속적인 플라크 정제 라운드에 의해 제거되었다. 오염성 부모 바이러스의 존재는 삽입 위치에 대한 PCR 분석으로 모니터링하였다.
[0243] 상동 재조합 - 성장 배지 (RPMI-1640/10% FCS/2mM Glutamax/Pen-Strep and 1000ug/mL Geneticin)를 포함하는 3개의 T25 플라스크에 p-LL19-CHO를 분주하고 100% 컨플루언시까지 37℃/5%CO2에서 배양하였다. 감염 당일에, 2개의 플라스크에 moi 0.01 pfu/세포로 VACV-COP를 감염시켰고, 다른 플라스크는 감염시키지 않았다 (비감염된 대조군). 플라스크 1 및 2를 상온에서 45분 동안 감염시킨 후, 상기 바이러스 접종물을 제거하고 세포의 단일층을 PBS로 2번에 걸쳐서 세척하였다. 세척 후, 동일한 세척 단계를 실시했던 플라스크 3을 포함하는 각 플라스크에 4 ml의 유지 배지 (MM: RPMI-1640/2% FCS/2mM Glutamax/Pen-Strep)를 첨가하였다.
[0244] 트랜스펙션은 제조자의 설명서에 따라 에펙텐 트랜스펙션 시약 (Qiagen, Cat No 301425)을 이용하여 실시하였다. 간략하게는, 16uL의 인핸서를 150uL의 EC 완충액 내 2ug의 선형 pLL09에 첨가하여 세심히 혼합한 후 상온에서 5분 동안 방치하였다. 여기에 25μl의 에펙텐 트랜스펙션 시약을 첨가하고 상온에서 10분 동안 방치하였다. 마지막으로, 1 ml의 MM (RPMI-1640/2% FCS/2mM Glutamax/Pen-Strep)을 상기 혼합물에 첨가하고 매우 부드럽게 함께 혼합하였다. 이후 이러한 트랜스펙션 혼합물을 VACV-COP로 미리 감염된 플라스크 1에 첨가하였다.
[0245] 플라스크 1 (상동 재조합), 2 (대조군만 감염), 3 (비감염된 대조군)을 37℃/5%CO2에서 하룻밤 동안 반응시키고 다음날 각 플라스크 배지를 신선한 MM - 플라스크 당 5 mL로 교체하고 총 CPE가 플라스크 1에서만 보여질 수 있을 때까지 37℃/5%CO2에서 추가적으로 반응시켰다. VACV-COP가 CHO 세포에 비-감염성이기 때문에 플라스크 2에서는 어떠한 감염 징후도 없었고 단일층은 플라스크 3에서 건강하게 보였다.
[0246] 하룻밤 동안의 감염 후 빨간색 형광 세포는 도립 형광 현미경으로 관찰 시 분명하게 구별가능할 수 있다. 상기 배양 배지 내 세포를 긁어서 저속도 원심분리 (상온에서 500g로 5분)에 의한 펠렛팅, 그리고 1mL의 10 mM Tris-HCl pH8 내에 세포 펠렛을 재현탁시킴으로써 플라스크 1 내 세포를 수득하기로 결정하였다. 바이러스 추출물은 다중 동결 및 해동 주기로 제조한 후 플라크 정제 단계를 위해 -80℃에 저장하였다. 바이러스 컨스트럭트는 SCV104로 지정하였다.
[0247] 플라크 정제 과정 - 상기 상동 재조합 추출물을 연속적으로 희석하고 48 웰 플레이트에서 배양된 p-LL19-CHO 세포의 일 열을 감염시키기 위해 각 희석액을 이용하는 것이 합리적이다. 웰 당 1 pfu 감염까지 바이러스를 아래로 희석한 후 수득 전 약 30hr의 감염 후 오직 하나의 형광 플라크를 포함하는 웰을 관찰하는 것이 목표이다.
[0248] p-LL19-CHO 세포를 48-웰 플레이트의 각 웰에 분주하고 1000ug/mL 게네티신을 포함하는 성장 배지 (RPMI-1640/10% FBS/2mM Glutamax/pen-strep)에서 100%까지 37℃/5%CO2에서 배양시켰다.
[0249] 감염을 위해, 상기 상동 재조합 추출물 (SCV104)를 해동시켜 약하게 초음파 처리하여 덩어리 및 응집체를 파괴시켰다. 10-5까지의 바이러스 추출물의 10-배 연속 희석을 1mL 용량에서 MM (RPMI/2% FBS/Glutamax/PenStrep)을 이용하여 실시하였다. 각 희석을 위해, 각 웰로부터 성장 배지를 제거하고 PBS로 한번 세척한 후 48-웰 플레이트의 일 열에 500uL의 희석된 바이러스를 분주하였다. 바이러스 흡수가 일어나게 하기 위해 상기 48-웰 플레이트를 상온에서 45분 동안 방치하였다. 바이러스 흡수 후, 상기 바이러스 접종물을 조심스럽게 각 웰로부터 제거하고 잔여 접종물을 웰 당 500uL의 PBS로 이루어진 세척 단계로 제거하였다. 세척 후, 500uL의 MM (RPMI/2% FBS/Glutamax/PenStrep)을 각 웰에 첨가하고 이후 감염의 형광 빨간색 foci를 형광 현미경 하에서 명확하게 볼 수 있을 때까지 37℃/5%CO2에서 반응시켰다.
[0250] 가능한 가장 낮은 희석에서 단일 형광 foci를 포함하는 웰만을 수득하기 위해 선택하였다. 선택된 웰로부터 배지를 조심스럽게 제거하고 100uL의 10mM TrisHCl pH8을 첨가하였다. 상기 플레이트를 3번에 걸쳐서 동결 해동시킨 후 선택된 웰의 함유물을 회수하였다. 각 회수된 플라크를 위해, 플라크 정제 과정을 추가적으로 5번 반복하였다.
[0251] 이후 선택된 클론은 상기 웰로부터 성장 배지를 제거하고 500uL PBS에 희석된 10uL의 바이러스 추출물을 첨가하여 p-LL19-CHO 세포를 포함하는 6-웰 플레이트의 1 웰을 100% 컨플루언시로 감염시켜 추가적으로 증폭시켰다. 상온에서 45분 후 2mL의 MM을 상기 웰에 첨가하고 대부분의 세포가 형광 현미경 하에서 빨간색 형광을 보일 때까지 3일 동안 37℃/5%CO2에서 추가적으로 반응시켰다. 상기 감염된 웰 내 세포들은 배양 배지로 긁혀진 후 500g에서 5분 동안 펠렛팅되었다. 상기 펠렛팅된 세포는 500uL의 10mM TrisHCl pH8에 재현탁시키고 간단하게 초음파 처리되어 바이러스 추출물을 얻었다.
[0252] SCV104 의 D13L ORF 내로 CP77 / DsRed 발현 카세트 삽입의 PCR 확인 - PCR 분석은 상동 재조합 및 플라크 정제 후 상기 D13L ORF가 실제로 CP77/DsRed 발현 카세트를 대체하였는 지를 결정하기 위해 실시하였다. PCR 프라이머 쌍은 2개의 플랭킹 상동 재조합 팔의 부위 외부에 결합하도록 고안되어 "도입된" DNA보다 오히려 "원래의" DNA 서열에 결합할 것이다. 그러한 방식에서의 프라이머 쌍을 고안하는 것은 이러한 프라이머 쌍이 DNA 템플레이트로서 VACV-COP 및 SCV104를 PCR 증폭을 위해 이용할 수 있고 상기 PCR 산물의 크기가 D13L ORF 내로의 발현 카세트의 삽입 또는 어떠한 삽입도 없는 바이러스, 즉 VACV-COP의 검출을 지시할 것이라는 것을 의미한다. 이러한 PCR 어세이는 삽입의 존재를 나타낼 뿐 아니라 다중 라운드의 플라크 정제 후 잔류 오염성 부모 바이러스 (VACV-COP)가 여전히 존재하는 지를 동정할 수 있게 해준다. 원하지 않는 VACV-COP의 잔류 오염의 존재는 매우 바람직하지 않은데, 이러한 오염물은 SCV104에 대한 인 트랜스 D13 도움을 제공할 수 있어 SCV104의 약화를 감소시킬 수 있다.
[0253] QIAGEN DNeasy 조직 키트 ( Cat # 69504)를 이용한 DNA 추출 - 바이러스 DNA는 제조자의 설명서에 따라 DNeasy 조직 키르를 이용하여 상기 SCV104 증폭된 바이러스 200 uL로부터 추출하였다. 간략하게는 이것은 20uL의 프로테나제 K를 200uL의 바이러스 추출물에 첨가하고 잘 혼합하여 실시하였다. 여기에, 200ul의 완충액 AL을 첨가하고 56℃ (히팅 블락)에서 10분 동안 반응시키기 전에 완전히 혼합시켰다. 반응 후, 200ul의 100% 에탄올을 첨가하여 잘 섞은 후 총 용량을 스핀 컬럼에 첨가하였다. 상기 액체는 제조자의 설명서에 지시된 대로 스핀 컬럼을 통해 원심분리로 통과시킨 후 AW1 및 AW2 완충액으로 스핀 컬럼을 세척하였다. 상기 스핀 컬럼에 결합된 DNA를 100uL의 AE 완충액으로 2번에 걸쳐서 용출시켰다. 상기 용출된 DNA를 단일 튜브로 합쳐서 PCR 분석을 실시하거나 또는 PCR 분석할 때까지 4℃에 저장하였다.
[0254] PCR 증폭 - SCV104 (상기 섹션 4.2.3.1 참조)로부터 추출된 DNA를 PCR 증폭용 템플레이트로 이용하여 D13L ORF 내에 삽입이 일어났는 지 여부를 결정하였다. 하기 기재된 PCR 프라이머는 D13L ORF 외부의 플랭킹 서열에 결합하여 SCV104 DNA로부터 증폭이 부모 바이러스, VACV-COP로부터 증폭되는 2881bp의 PCR 산물에 덧붙여진 4360bp의 PCR 산물을 증폭시킬 것이다. PCR 분석은 SCV104의 6번째 플라크 정제된 클론만이 4000bp보다 더 크고 5000bp 미만인 산물을 증폭한다는 것을 보였는데 이는 SCV104가 D13L ORF 내에 CP77/DsRed 카세트를 포함한다는 것을 의미한다. 3000bp 근처의 PCR 산물의 부재는 SCV104 증폭된 스톡에 검출가능한 레벨의 부모 바이러스 오염이 존재하지 않는다는 것을 의미한다.
프라이머 쌍의 상세내용
ID_D12L_LL04_Fw: 5'-TACAAAATCAAATAATGGTCGAAAC-3'
ID_A2L_LL04_Rv: 5'-TGCCAAGAAAACACTCCTTCTAAGACAAT-3'
실시예 11
플라크 감염능 어세이에 의한 약화에 대한 SCV104 테스팅
[0255] D13L ORF에 의해 인코딩되는 단백질이 바이러스 어셈블리에 필수적이기 때문에, 실험자는 SCV104 레스큐된 바이러스의 세포 진입이 백시니아 바이러스에 대해 관대한 정상 세포 내 감염성 자손 비리온을 생산할 수 없어 주변 세포로 전파하는 초기 감염의 무능력으로 인해 감염의 지속적 확장성 foci를 형성할 것으로 예측할 것이다. 이것이 그러한 경우인 지를 확인하기 위해, 본 발명에서 기재된 상기 D13L 결실된 바이러스 (SCV104)를 일정 점까지 연속적으로 희석하여 낮은 수의 플라크 형성 단위를 6-웰 플레이트에서 배양된 세포를 감염하는데 이용하였고 이에 따라 감염성 바이러스의 세포 대 세포 전파를 어떤 날짜의 기간 동안 모니터링할 수 있었다. 이러한 연구에서 3개의 세포주들을 연구하였다: 백시니아 바이러스에 감수성인 143B 세포, 백시니아 바이러스에 비감수성지이지만 백시니아 바이러스가 CP77 단백질을 발현할 수 있는 CHO 세포 및 D13L 단백질을 발현하는 재조합 세포주인 p-LL19-CHO. CP77/DsRed 발현 카세트가 D13L ORF에 삽입되어 D13-단백질이 어떠한 기능도 발현될 수 없는 본 발명에 기재된 바이러스는 p-LL10-CHO 세포주 내 감염의 감염성 foci만을 형성할 것이다. 143B 세포 단일층 내 감염의 foci의 존재는 오염물이 인 트랜스 D13L 도움을 제공할 것이기 때문에 바이러스 개체군 혼합물 내에 오염성 백시니아 바이러스의 존재를 나타낸다. CHO 단일층 내 감염의 foci의 존재는 CP77/DsRed 카세트의 삽입이 D13L ORF를 불활성화시키지 않았다는 것을 의미한다.
[0256] 세포 셋업 - 143B, CHO 및 p-LL19-CHO 세포를 다중 6 웰 플레이트에 분주하고 세포 단일층이 100% 컨플루언트에 도달할 때까지 37℃/5%CO2에서 성장 배지 (RPMI-1640/10% FBS/2mM Glutamax/pen-strep, 및 p-LL19-CHO에서만 1000ug/mL 게네티신)에서 배양하였다.
[0257] 감염 - 증폭된 3차 플라크 정제된 바이러스 추출물로 세포를 감염시켰다. 알려지지 않은 역가의 이러한 바이러스로 인해, 10-배 연속적으로 희석된 스톡 바이러스를 다음과 같이 10-4까지 이용하였다: 우선, 60 ul의 스톡 바이러스를 6ml의 MM 배지에 희석 (Dil 1; 1:100 희석)한 후, 800 ul의 희석액 1에 7.2ml의 MM 배지를 첨가하여 추가적인 희석액 (희석액 2; 10-3 희석)을 제조하고 이후에 반복하여 10-4 희석액을 제조하였다. 감염을 위해, 500ul의 각 희석액을 6-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다 - 이용된 세포주 당 하나의 플레이트. 바이러스 흡수를 상온에서 45분 동안 실시한 후 상기 바이러스 접종물을 각 웰로부터 제거하고 MM을 웰 당 2mL로 첨가하기 전에 각 웰을 PBS로 세척하였다. 상기 플레이트를 37℃/5%CO2에서 배양시키고 형광 현미경으로 매일 관찰하였다. 관찰 시, 10-2 희석액이 가장 좋은 바이러스 감염율을 나타냈다.
[0258] 현미경적 관찰 - 상기 바이러스 감염은 GFP 필터 (Cat#U-MGFPHQ, Olympus)를 가지는 형광 현미경 (Olympus IX51)으로 관찰하였다. 상기 이미지는 cellSens 디지털 이미징 소프트웨어 (Olympus)로 얻었다.
[0259] 결과 - 10-2 희석액 감염이 시작 단일 세포 감염 및 주변 세포로의 감염의 전파를 관찰하는 데 가장 좋은 결과를 나타냈다. 143B 세포의 조사는 바이러스가 단일 세포 감염의 존재를 1일째에 나타내고 여기서 상기 바이러스는 2일 및 3일까지 이웃 세포로 전파할 수 없었는데, 이는 단일 세포들 내로의 상기 바이러스 진입이 일어나지만 어떠한 감염성 바이러스 자손이 2일 및 3일까지 생산되지 않았다는 것을 의미한다. CHO 단일 감염된 세포에서도 동일한데, 즉 어떠한 감염성 바이러스 자손이 개시 단일 세포 감염으로부터 생산되지 않는다.
[0260] p-LL19-CHO 세포주의 조사는 개시 단일 세포 감염이 1일째 감염의 작은 foci로서 보여지듯이 자손 감염성 바이러스를 생산한다는 것을 보여준다. 이들 감염의 foci는 2일 및 3일까지 크기적으로 빠르게 증가하였는데, 이는 시간이 지남에 따라 바이러스 증폭이 일어나고 있다는 것을 의미한다.
[0261] 따라서, 어떠한 백시니아 바이러스로부터 유래된 기능성 백시니아 크레센트 스캐폴드 단백질 코딩 서열의 제거가 이 바이러스를 크게 약화시킬 것이다. 비록 이 바이러스가 초기 감염 하에서 감염성 자손 바이러스를 생산할 수 없을 지라도, 이의 단백질, 특히 DsRed의 발현이 시각적인 빨간색 형광의 증거로서 정말로 개시 단일 감염된 세포에서 일어난다. 이러한 바이러스는 백시니아 바이러스 감염과 별도로 백시니아 크레센트 스캐폴드 단백질을 발현하는 세포주로부터 레스큐될 수 있다. 트랜스제닉 세포주에 의한 백시니아 크레센트 스캐폴드 단백질의 구성적 발현은 이러한 세포주의 성장 또는 생리학 상에 부정적인 효과를 가지지 않는다.
실시예 12
D13L 을 발현하는 C11 - LL19 - HeLa 세포의 구축
[0262] D13L 결실을 가진 비-형광성 SCV를 적정하기 위해, 용해성 플라크 형성으로 나타나는 백시니아 감수성 세포주로 이루어진 D13 단백질을 발현하는 레스큐 세포주를 제조하였다. CHO 세포에서, CP77을 발현하는 백시니아 바이러스 또는 CP77의 세포주 발현은 크리스탈 바이올렛으로 염색되고 육안으로 카운팅될 수 있는 용해성 플라크 형성을 지지하지 않는다. 적정 세포주를 창출하기 위해, HeLa 세포를 트랜스덕션시켜 구성적 포유동물 프로모터, 개시 코돈 주위에 Kozak 서열을 포함하는 D13-단백질 코딩 서열 및 폴리아데닐화 시그널 서열에서 종결되는 것으로 구성되는 발현 카세트의 안정적인 통합에 의해 D13 단백질을 발현시켰다. 이러한 카세트를 숙주세포 게놈 DNA로 안정적이 유전자 전달 및 항생제 선택에 의해 성공적인 통합을 위한 선택을 가능하게 하는 플라스미드 벡터 내로 클로닝하였다. 이후 D13 발현 카세트를 포함하는 세포를 선택하기 위한 항생제 선택을 이용하여 트랜스덕션된 세포를 증폭시킨 후 세포 당 0.001 pfu의 moi에서 세포의 단일층을 감염시키고 3일 동안 가장 큰 플라크 크기를 생산하는 세포-주 클론을 선택함으로써 SCV104 (D13L ORF 결실)를 이용하여 플라크 어세이를 실시하였다. SCV104는 D13L ORF가 2개의 발현 카세트를 가지도록 교체하였다: CP77 단백질의 발현을 위한 카세트 및 빨간색 형광 단백질의 발현을 위한 카세트. D13 단백질을 발현하는 HeLa 세포주의 SCV104 감염은 빨간색 형광 용해 플라크를 초래할 것이다.
[0263] pLL19의 구축 - D13 세포 트랜스덕션 벡터: pLL19의 구축은 상기 기재되어 있다. 이러한 플라스미드에서 상기 C-말단 Flag-태깅된 D13-단백질 코딩 서열은 구성적 인간 연장 인자 1 알파 프로모터의 조절 하에 있으며 세포 내 게놈 DNA로의 안정적인 유전자 전달은 전위에 의해 매개된다. 전위는 또한 네오마이신 항생제 선택 발현 카세트를 삽입시켜 성장 배지 내에 G418/게네티신을 첨가함으로써 트랜스덕션된 세포를 양성적으로 선택할 수 있다.
[0264] pLL19 의 트랜스덕션에 의한 D13 - Flag 태깅된 발현 카세트의 HeLa 세포 내로의 안정적인 삽입: HeLa 세포를 T25 플라스크에 분주하고 RPMI-1640/10% FBS/2mM Glutamax/pen-strep 성장 배지에서 약 50% 컨플루언시로 배양하였다. Qiagen (Cat # 301425)으로부터 구매한 에펙텐 트랜스덕션 시약을 이용하여, 제조자의 설명서에 따라 1ug의 pLL19를 50% 컨플루언트 HeLa 세포의 T25 플라스크에 트랜스펙션시켰다. 상기 트랜스펙션된 세포를 성장 배지 (RPMI 1640/10% FBS/2mM Glutamax/Pen-Strep)에서 하룻밤 동안 배양시켰다. 다음 날, 상기 배지를 트랜스덕션된 세포를 선택하기 위해 1000ug/mL 게네티신을 포함하는 신선한 성장 배지로 교체하였다. 대부분의 세포들이 죽을 때 남아있는 세포를 TrypLE Select (Gibco-Invitrogen Corp, Cat #12563-029)로 플라스크 표면으로부터 이들을 떨어뜨려서 회수하고 단일 세포를 성장 배지 및 1000ug/mL 게네티신을 포함하는 96-웰 플레이트로 분류하였다. 세포의 콜로니를 각 웰에서 볼 수 있을 때까지 이들 플레이트들을 37℃/5%CO2에서 배양시켰다. 상기 선택 배지는 2 내지 3일 마다 교체하였다. 각 세포의 콜로니를 회수하여 다음에서 배양하여 연속적으로 확장시켰다: 48-웰 플레이트 대 24-웰 플레이트 대 6-웰 플레이트 대 T25 플라스크 및 동결된 세포 스탁을 제조할 때까지 1:5 스플릿 비율로 T25 플라스크에서 유지됨.
[0265] SCV104 플라크 형성을 가장 잘 지지하는 단일클론 세포주에 대한 스크리닝: SCV104는 이의 D13L ORF가 카우폭스 바이러스 025L 프로모터 플러스 CP77 단백질을 코딩하는 ORF, 및 빨간색 형광 단백질 발현 카세트 (DsRed Express2)로 대체된 백시니아 바이러스이다. 상기 CP77 발현은 HeLa 세포에서 플라크 형성에 중요하거나 필요하지 않지만 이러한 바이러스는 D13 단백질의 세포주 발현의 부재 하에서 증식하지 않을 것이다. 하지만, D13-단백질을 발현하는 HeLa 세포주에서 SCV104는 증폭하여 다른 이웃 세포들로 전파할 수 있고 세포 단일층 내에 빨간색 형광 용해성 플라크를 형성할 것이다. 이러한 바이러스는 클론성 LL19-HeLa 세포주에서의 플라크 형성 연구에 이용되어 플라크 형성을 가장 잘 지지하는 클론을 선택하게 해준다.
[0266] 세포주 셋업: LL19-HeLa의 많은 세포주 클론들은 6웰 플레이트의 웰에 분주하여 1000ug/mL 게네티신을 포함하는 성장 배지에서 100% 컨플루언시까지 37℃/5%CO2에서 배양하였다:
[0267] 바이러스 감염: MM (RPMI-1640/2% FBS/2mM Glutamax/pen-strep) 내 바이러스를 103 pfu/ml로 희석하여 세포 당 0.001 pfu로 세포를 감염시키는 데 SCV104를 이용하였다. 1ml의 희석된 바이러스를 감염을 위해 각 웰에 첨가하였다. 6-웰 플레이트의 각 웰은 컨플루언트되었을 때 약 1x106 세포를 포함하고 이에 따라 1ml의 103 pfu/ml이 0.001 moi를 초래한다. 0.001의 moi는 단일 감염된 세포로부터 플라크 형성을 보장할 것이다. 모든 플레이트는 상온에서 1시간 동안 반응시켜 상기 바이러스가 세포에 흡수될 수 있고 이후에 1mL의 MM을 각 웰에 첨가한 후 모든 플레이트는 세포 내로의 바이러스 동시 진입을 촉진하는 37℃/5%CO2에서 배양시킨 후 바이러스 증폭에 따라 시간이 지남에 따라 세포 대 세포 전파를 초래할 수 있다. 빨간색 형광 플라크 형성은 형광 현미경으로 매일 관찰하였다.
[0268] 현미경적 관찰: 3일의 기간 동안 바이러스 감염 및 플라크 형성은 DsRed 필터 (Cat#U-MGFPHQ, Olympus)를 가지는 형광 현미경 (Olympus IX51)으로 관찰하였다. 상기 이미지는 cellSens 디지털 이미징 소프트웨어 (Olympus)로 얻었다.
[0269] 결과: 감염 1일 후에, 모든 감염은 산발적인 빨간 형광의 작은 foci를 초래하였다. 3일까지, 모든 클론 세포주는 상당한 크기의 빨간 형광 용해성 플라크를 생산하였고 클론 11 (C11)은 모든 테스트된 클론 중 가장 큰 플라크 크기를 생산하였다.
[0270] 결론: 이러한 결과들은 상기 C11 클론 (C11-LL19-HeLa)이 SCV104 감염으로부터 테스트된 모든 클론들 중 가장 큰 플라크 형성을 지지하기에 충분한 D13 단백질을 발현하고 있다는 것을 증명한다. 이러한 세포주 클론 (C11)은 일반적으로 백시니아 바이러스를 적정하는 데 이용되는 적정의 용해성 플라크 카운팅 방법을 이용하여 D13L 결실된 백시니아 바이러스를 정량하는 데 최적이다.
실시예 13
CP77 및 D13L 을 발현하는 p- LL07 - LL29 - CHO 세포주의 구축
[0271] CHO 세포에서 D13L ORF 결실로 VACV-COP를 레스큐하기 위해, D13 및 CP77 단백질을 발현하는 CHO 세포주를 구축해야만 했다. 이것은 발현을 추진하는 포유동물 프로모터, D13 또는 CP77 단백질을 코딩하는 CHO 선호된 코돈 최적화된 DNA 시퀀싱 및 이에 뒤따르는 폴리아데닐화 시그널 서열로 이루어진 D13 포유동물 발현 카세트 및 CP77 포유동물 발현 카세트를 구축하여 실시하였다. 이러한 카세트를 숙주세포 게놈 DNA로 안정적인 유전자 전달 및 항생제 선택에 의해 성공적인 통합을 위한 선택을 가능하게 하는 플라스미드 벡터 내로 클로닝하였다. 이후 D13 및 CP77 발현 카세트 모두를 포함하는 세포를 선택하기 위한 항생제 선택을 이용하여 트랜스덕션된 세포를 증폭시켰다. CP77의 발현을 확인하기 위해, 증가된 녹색 형광 단백질을 발현하는 백시니아 바이러스 (SCV505)로 트랜스제닉 세포주를 감염시켜 형광성 플라크 발생을 4일의 기간 동안 모니터링하였다. 4일의 기간에 걸쳐 상당히 확장하는 녹색 형광 플라크 크기는 상기 세포주에 의한 CP77 발현을 확인시켜 주었다. D13 단백질의 발현을 확인하기 위해 CP77 (SCV104) 및 DsRed 형광 단백질을 발현하는 D13L 결실된 백시니아 바이러스로 트랜스제닉 세포주를 감염시켜 플라크 발생을 4일에 걸쳐서 모니터링하였다. 4일의 기간에 걸쳐 상당히 확장하는 빨간색 형광 플라크 크기는 상기 세포주에 의한 D13 단백질 발현을 확인시켜 주었다.
pLL07 의 구축 - CP77 유전자 전달 플라스미드
[0272] CP77 단백질 코딩 서열의 구축: CP77 단백질 코딩 서열은 카우폭스바이러스 브라이튼 레드 스트레인 UniProtKB/Swiss-Prot: P12932.1의 025L ORF에 의해 인코딩되는 CP77의 아미노산 서열로부터 유래되고 중국햄스터 난소 (CHO) 세포 내 발현에 코돈 최적화된 DNA 서열을 재창출 (역 번역 또는 거꾸로 번역)하는 GeneArt GmbH (Germany)에 의해 합성적으로 제조되었다.
[0273] CP77 세포 트랜스덕션 벡터의 구축:
pPH51 (코돈 최적화된 CP77 단백질 코딩 서열을 가지고 있는 클로닝 벡터)로부터 유래된 코돈 최적화된 CP77 단백질 코딩 서열은 5' 프라이머가 시작 코돈 주위의 코작 서열에 부가되도록 고안되고 3' 프라이머가 종결 코돈 전 Flag-Tag 서열에 부가되도록 고안된 PCR 프라이머를 이용하여 PCR 증폭되었다. 상기 증폭된 PCR 산물은 DNA2.0 사 (USA)로부터 구매된 트랜스포존 피기백 벡터 pJ507-2 (Hyg+)의 Bsa I 클로닝 위치로 서브클로닝되었다. Bsa I 내로의 클로닝은 코멧 GPF 코딩 서열을 상기 CP77 단백질 코딩 서열로 효과적으로 대체시켜 pLL07을 창출한다. 상기 CP77은 이제 구성적 인간 연장 인자 1 알파 프로모터 (EF1a)의 조절 하에 있게 되고 일단 양 유전자가 함께 트랜스펙션된 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합되면 하이그로마이신 내성 유전자와 공동 발현된다. 숙주 게놈 내로의 안정적인 통합은 피기백 벡터의 좌 및 우 트랜스포존 보더에 의해 결합된 상기 DNA 서열의 트랜스포존 통합에 의해 매개된다.
pPH51 플라스미드 DNA 로부터 CP77 - CHO 유전자를 PCR 증폭하는 데 이용되는 PCR 프라이머 쌍:
정방향 프라이머 서열:
AACACGTCTCGGGGGgccgccaccATGTTCGACTACCTGGAAAATGAGGAAGTG (서열번호 4)
역방향 프라이머 서열:
CAGGAAGACGCTTTTtcaCTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCCTGCTGCTCGAAGATCTTGTACT (서열번호 5). 상기 Flag Tag 서열은 종결 코돈 (소문자) 이후에 밑줄쳐져 있다.
pLL29 의 구축 - D13 유전자 전달 플라스미드
[0274] CHO-코돈 최적화된 D13 코딩 서열은 pLL19로부터 PCR 증폭되어 (이전에 기재된 대로) DNA2.0 사 (Cat # pJ503-2)로부터 구매된 pJ503-02 (코멧 GFP 및 Neo+를 가진 pHULK 피기백 포유동물 발현 벡터) 내의 Bsa I 클로닝 위치로 클로닝하기 전에 C-말단 Flag-tag 서열을 HA-tag 서열로 교체하였다.
[0275] D13L-HA 세포 트랜스덕션 벡터의 구축: pLL19로부터 상기 코돈 최적화된 C-말단 Flag-tag 서열이 없는 D13-단백질 코딩 서열을 PCR 증폭하여 DNA2.0 사 (Cat # pJ503-2)로부터 구매된 트랜스포존 피기백 벡터 pJ503-2 (pHULK piggyBac Mammalian Expression Vector with CometGFP and Neo+) Bsa I 클로닝 사이트 내로 서브클로닝되어 pLL29를 만들었다. 인-퓨전 클로닝 (Clontech: 리가제 부재 클로닝)에 의한 BsaI 위치들 간 클로닝은 인 비트로 상동 재조합을 통해 코멧 GFP 코딩 서열을 제거하고 이를 상기 새롭게 HA-태깅된 D13-단백질 코딩 서열로 대체한다. 상기 D13LchoHA-태깅된 단백질 코딩 서열은 이제 구성적 인간 연장 인자 1 알파 프로모터 (EF1a)의 조절 하에 존재하며 일단 양 유전자가 트랜스펙션된 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합되면 네오마이신 내성 유전자와 함께-발현될 것이다. 숙주 게놈 내로의 안정적인 통합은 피기백 벡터의 좌 및 우 트랜스포존 보더에 의해 결합된 상기 DNA 서열의 트랜스포존 통합에 의해 매개된다. pLL29의 플라스미드 맵은 하기에 보여진다.
D13L cho - HA 태깅된 서열의 PCR 증폭은 다음의 프라이머 쌍을 이용하여 실시하였다:
정방향 프라이머 서열:
Inf-LL19-D13LC-Fw:
5'-AACACGTCTCGGGGGGCCGCCACCATGAACAACACCATCATCAA -3'
역방향 프라이머 서열:
Inf-LL27-D13L-Rv:
5' CAGGAAGACGCTTTTttaAGCATAATCTGGAACATCATATGGATAGTTGTTATCGCCCATGATCT-3'
밑줄친 텍스트 내 서열은 HA 코딩 서열을 나타낸다. "tta"는 종결 코돈을 나타낸다.
[0276] CP77-Flag 태깅된 발현 카세트 및 D13-HA 태깅된 발현 카세트의 CHO 세포 내로의 안정적인 이중 삽입은 pLL07 및 pLL29의 동시 트랜스덕션에 의해 이루어진다.
[0277] CHO 세포를 T25 플라스크에 분주하고 RPMI-1640/10% FBS/2mM Glutamax/pen-strep 성장 배지에서 약 50% 컨플루언시까지 배양하였다. Qiagen (Cat # 301425)으로부터 구매한 에펙텐 트랜스덕션 시약을 이용하여, 제조자의 설명서에 따라 1ug의 pLL07 및 1ug의 pLL29를 50% 컨플루언트 CHO 세포의 T25 플라스크에 트랜스펙션시켰다. 상기 트랜스펙션된 세포를 성장 배지 (RPMI 1640/10% FBS/2mM Glutamax/Pen-Strep)에서 하룻밤 동안 배양시켰다. 다음 날, 상기 배지를 트랜스덕션된 세포를 선택하기 위해 500ug/mL 게네티신 및 250ug/mL 하이그로마이신 B을 포함하는 신선한 성장 배지로 교체하였다. 상기 선택 배지를 대부분의 세포들이 죽고 단일 세포 유래된 떨어진 남아 있는 세포 콜로니를 형성할 때까지 2일 내지 3일 마다 교체하였다. 트랜스덕션된 세포가 90 내지 100% 컨플루언시까지 성장시켰을 때, 상기 세포들은 TrypLE Select (Gibco-Invitrogen Corp, Cat #12563-029)를 이용하여 회수하고 추가적인 세포 확장을 위해 T25 플라스크에 분주하였다. 이러한 새로운 다중클론 세포주를 p-LL07-LL29-CHO로 지정하였다.
[0278] 백시니아 바이러스 및 D13L ORF 가 결실된 백시니아 바이러스를 레스큐하여 D13 및 CP77 발현의 확인
[0279] SCV505는 증가된 녹색 형광 단백질 (EGFP)를 발현하고 CP77 단백질의 존재 하에서 CHO 세포에서만 증식하는 백시니아 바이러스이다. 이러한 바이러스는 p-LL07-LL29-CHO에서 플라크 감염능 연구에 이용되어 이러한 세포주에 의한 CP77 발현을 확인시켜 준다. SCV104는 이의 D13L ORF가 카우폭스 바이러스 025L 프로모터 플러스 CP77 단백질을 코딩하는 ORF, 및 빨간색 형광 단백질 발현 카세트 (DsRed Express2)로 대체된 백시니아 바이러스이다. 이러한 바이러스는 D13 단백질의 세포주 발현의 부재 하에서 증식하지 않을 것이다. 이러한 바이러스는 p-LL07-LL29-CHO에서 플라크 감염능 연구에 이용되어 이러한 세포주에 의한 D13 발현을 확인시켜 준다.
[0280] p- LL07 - LL29 - CHO 세포주 플라크- 감염능 연구
[0281] 다양한 세포주들이 본 연구에서 이용되어 SCV505 (D13+ CP77- EGFP+) 및 SCV104 (D13- CP77+ DsRed+)에 의한 감염으로부터 p-LL07-LL29-CHO에 의한 D13 및 CP77의 발현을 정량화하는 데 도움을 준다. 다음의 세포주들에서 예상되는 결과는 다음과 같다:
[0282] Vero: 이 세포주는 정상적으로는 백시니아 바이러스 감염에 관대하다. 이 바이러스가 이러한 세포주에 정상적으로 감염성이기 때문에 SCV505 감염에 대한 녹색 형광에 의해 검출되는 대로 플라크 형성은 시간에 따라 증폭된 바이러스의 세포 대 세포 전파를 나타냈다. 하지만, SCV104 감염에 대한 레드 형광의 부재 또는 단일 세포 형광만으로 검출되는 대로 어떠한 플라크 형성도 발견되지 않았는데, 이는 세포주 또는 바이러스에 의한 D13 단백질의 부재로 인해 시간이 지남에 따라 증폭된 바이러스의 세포 대 세포 전파가 없다는 것을 의미한다.
[0283] C11 - LL19 - HeLa: 이것은 pLL19 트랜스덕션을 통해 D13 단백질을 발현하는 백시니아 바이러스 감수성 세포주이다. SCV505 감염에 따른 플라크 형성이 예측되는 데 이는 D13의 세포주 발현에도 불구하고 녹색 형광에 의해 검출되는 대로 시간이 지남에 따라 증폭된 바이러스의 세포 대 세포 전파를 의미한다. 이 바이러스는 이제 D13 단백질의 세포주 발현으로 인해 이 세포주에서 증폭할 수 있기 때문에 SCV104 감염에 따른 플라크 형성이 예측된다.
[0284] CHO: 이 세포주는 백시니아 바이러스 감염에 비-감수성이다. 레드 또는 녹색 형광의 부재 또는 단일 세포 형광만으로 검출되는 대로 SCV505 및 SCV104 감염에 따른 어떠한 플라크 형성도 관찰되지 않을 것으로 예상된다. 비록 이 바이러스가 CP77을 발현할 수 있을 지라도 이것은 SCV104 이벤트를 레스큐할 필요가 있는 세포주에 의한 D13 단백질의 부재로 인해 시간이 지남에 따라 증폭된 바이러스의 세포 대 세포 전파가 없고 세포주에 의한 CP77 단백질 발현의 부재가 SCV505를 레스큐하기 위해 요구되었는 것을 나타낸다.
[0285] p- LL07 - LL29 - CHO: 이것은 D13 및 CP77 단백질 모두를 발현하는 CHO 세포주이다. SCV505 감염에 따른 플라크 형성이 예상되는데 이는 녹색 형광에 의해 검출되는 대로 시간이 지남에 따라 증폭된 바이러스의 세포 대 세포 전파가 CP77 단백질의 세포주 발현을 나타낸다는 것을 의미한다. SCV104 감염에 따른 플라크 형성이 예상되는데 이는 레드 형광에 의해 검출되는 대로 시간이 지남에 따라 증폭된 바이러스의 세포 대 세포 전파가 D13 단백질의 세포주 발현을 나타낸다는 것을 의미한다.
[0286] 세포주 셋업: Vero, CHO, C11-LL19-HeLa, 및 p-LL07-LL29-CHO 세포주를 2개 세트의 다중 6 웰 플레이트 (SCV505 감염을 위해 1개 세트 및 SCV104 감염을 위해 1개 세트)에 분주하여 해당하는 성장 배지 (다음과 같은)에서 100% 컨플루언시에 도달할 때까지 37℃/5%CO2에서 배양하였다:
● Vero, CHO: RPMI-1640/10% FBS/2mM Glutamax/pen-strep
● C11-LL19-Hela: RPMI-1640/10% FBS/2mM Glutamax/pen-strep, 플러스 1000ug/mL 게네티신
● p-LL07-LL29-CHO: RPMI-1640/10% FBS/2mM Glutamax/pen-strep, 플러스 500ug/mL 게네티신 및 250 ug/ml 하이그로마이신 B
[0287] 바이러스 감염: SCV104 및 SCV505를 MM (RPMI-1640/2% FBS/2mM Glutamax/pen-strep)에서 103 pfu/ml로 희석하여 세포 당 0.001 pfu로 세포를 감염시켰다. 플레이트 당 하나의 바이러스: 1ml의 희석된 바이러스를 감염을 위해 각 웰에 첨가하였다. 6-웰 플레이트의 각 웰은 컨플루언트 시 약 1x106 세포를 포함하여, 이에 따라 1ml의 103 pfu/ml이 0.001 moi를 초래한다. 0.001의 moi는 단일 감염된 세포로부터 플라크 형성을 보장할 것이다. 모든 플레이트는 상온에서 1시간 동안 반응시켜 상기 바이러스가 세포에 흡수될 수 있고 이후에 1mL의 MM을 각 웰에 첨가한 후 모든 플레이트는 세포 내로의 바이러스 동시 진입을 촉진하는 37℃/5%CO2에서 배양시킨 후 바이러스 증폭에 따라 시간이 지남에 따라 세포 대 세포 전파를 초래할 수 있다. 형광 플라크 형성은 형광 현미경으로 매일 관찰하였다.
[0288] 현미경적 관찰: 4일의 기간 동안 바이러스 감염 및 플라크 형성은
SCV104 바이러스용 DsRed 필터 (Cat#U-MGFPHQ, Olympus) 및 SCV505 바이러스용 GFP 필터 (Cat# U-MGFPHQ, Olympus)를 가지는 형광 현미경 (Olympus IX51)으로 관찰하였다. 상기 이미지는 CellSens 디지털 이미징 소프트웨어 (Olympus)로 얻었다.
결과:
[0289] 0.001의 moi 에서 SCV104 및 SCV505 으로의 CHO 세포 감염: 감염 1일 후에, 오직 산발적인 단일 세포 형광이 관찰되었는데, 이는 모든 바이러스가 세포 내로 진입하였지만 이웃 세포로의 감염 전파로 아직 증폭되지 않았다는 것을 의미한다. 하지만, 이것은 감염 후 2일부터 4일까지 동일하게 진행된 채였는데, 즉 오직 단일세포 감염만이 관찰되고 이웃 세포로의 어떠한 바이러스 전파도 시간에 따라 나타나지 않았다.
[0290] 0.001의 moi에서 SCV104 및 SCV505으로의 Vero 세포 감염: SCV505를 이용한 감염은 예측한 대로 감염 1일 후에 작은 플라크들을 형성하였고, 모두 어떤 점까지 크기적으로 증가하였으며 모든 플라크들이 4일까지 세포 단일층의 하나의 컨플루언트 감염 내로 어우러졌다. 이것은 1일부터 증폭된 바이러스가 감염 4일까지 완전하게 감염을 전파시켰다는 것을 나타냈다. 하지만, 이것은 SCV104 감염과 완전히 다르다. 감염 1일 후에 오직 산발적인 단일세포 형광이 관찰되었고 다음 3일 동안 동일하게 남아있었다. 이것은 SCV104가 D13L ORF가 없어 바이러스 게놈 복제 후 바이러스 어셈블리를 시작할 수 없으며 또한 이 세포주가 바이러스 증폭을 레스큐하는 데 도움을 주는 D13 단백질을 발현하지 않았기 때문에 상기 바이러스가 이 세포주에서 증폭하고 증식할 수 없다는 것을 의미하였다.
[0291] 0.001의 moi 에서 SCV104 및 SCV505 으로의 C11 - LL19 - HeLa 세포 (D13 단백질을 발현하는 HeLa 세포주) 감염: SCV505를 이용한 감염은 예측한 대로 감염 1일 후에 작은 플라크들을 형성하였고, 모두 어떤 점까지 크기적으로 증가하였으며 모든 플라크들이 4일까지 세포 단일층의 하나의 컨플루언트 감염 내로 어우러졌다. 이것은 1일부터 증폭된 바이러스가 감염 4일까지 완전하게 감염을 전파시켰다는 것을 의미했다. 또한 SCV505를 이용한 감염도 동일한 결과를 나타냈는데, 이는 SCV104에서 D13L ORF의 부재를 보충하는 이 세포주에 의해 생산된 D13 단백질 및 이 세포주에 의해 생산된 양이 온전한 D13L ORF를 가지는 SCV505와 비교하여 바이러스 증폭 및 감염의 전파를 지지하기에 충분하다는 것을 확인시켜 주었다.
[0292] 0.001의 moi에서 SCV104 및 SCV505으로의 p-LL07-LL29-CHO 세포 (D13 및 CP77 단백질을 발현하는 CHO 세포주) 감염: SCV104 및 SCV505 모두에 대해, 감염의 작은 foci가 감염 1일 째에 관찰되었다. 다음 3일 동안 이들 감염의 foci는 매우 크게 더 거대한 플라크로 확장되어 마침내 감염 4일 째에 컨플루언트 감염으로 어우러졌다. 이것은 CP77이 SCV505의 증폭 및 증식을 지지하였던 대로 발현되고 있는 중이고 D13 단백질 또한 SCV104의 증폭 및 증식을 지지하였던 대로 발현되고 있는 중이라는 것을 확인시켜 주었다.
[0293] 결론: 이러한 결과들은 CP77 및 D13 단백질을 발현하는 CHO 세포주가 D13L 결실된 백시니아 바이러스의 생산 및 제조를 위한 세포 기질로 이용될 수 있다는 것을 증명한다. 정상적인 감수성 세포의 감염 동안 D13L 결실된 바이러스는 바이러스 어셈블리를 개시할 수 없어 감염성 생활 주기를 완료할 수 없고 이에 따라 상기 바이러스를 안전성의 측면에서 인간 및 동물 백신화를 위해 뛰어난 바이러스 백신 운반 벡터로 만들어준다. 하지만, 이 세포주가 CHO 숙주-범위 단백질 (CP77) 및 분실된 어셈블리 단백질 (D13-단백질)을 발현하는 경우 이러한 매우 약화된 백시니아 벡터는 생물공학 친화적인 CHO 세포주에서 제조될 수 있다.
실시예 14
웨스턴 블랏팅에 의한 p- LL07 - LL29 - CHO 세포주의 D13 및 CP77 단백질 발현 분석
백그라운드 정보
[0294] p-LL07-LL29-CHO에 의해 발현되는 D13 및 CP77 단백질은 태깅되어 D13 및 CP77 단백질의 C-말단 끝에 존재하는 아미노산 tag 서열을 특이적으로 인지하는 항체를 이용하여 검출될 수 있다. D13 및 CP77 단백질을 특이적으로 인지하는 항체의 부재 하에서, 웨스턴-블랏 분석은 이러한 항-tag 항체들을 이용하여 실시함으로써 p-LL07-LL29-CHO 세포주 내 D13 및 CP77 단백질의 발현을 확인할 수 있다. 상기 D13 단백질의 C-말단 끝은 HA-tag 아미노산 서열인 "YPYDVPDYA"을 포함하며 CP77 단백질의 C-말단 끝은 Flag-tag 아미노산 서열인 "DYKDDDDK"을 포함한다.
웨스턴 - 블랏 분석 방법학
[0295] 다음의 세포주를 T75 플라스크에 분주하여 적절한 선택 항생제를 포함하는 성장 배지 (RPMI 1640/10% FBS/2mM Glutamax/Pen-Strep)에서 100% 컨플루언시까지 배양하였다: 선택 항생제가 없는 CHO, 500ug/mL 게니티신 및 250 ug/ml 하이그로마이신 B를 포함하는 p-LL07-LL29-CHO, 250 ug/ml 하이그로마이신 B를 포함하는 p-LL07-CHO, 및 1000ug/mL 게네티신을 포함하는 C11-LL19-HeLa. 컨플루언트 세포 단일층을 분리하여 TrypLE Select로 37℃에서 10분 동안 단일 세포 현탁액을 절단하였다. 각 플라스크로부터 얻은 세포를 회수하여 300g에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛팅하고 PBS로 2번에 걸쳐서 세척하였다. 최종 세척 후 상기 세포 펠렛을 500uL의 PBS에 재현탁하였다. 4x SDS-PAGE 로딩 완충액을 상기 단백질 추출물에 첨가하여 1x의 최종 농도를 만들어 98℃에서 2 내지 3분 동안 열처리하였다. 상기 변성된 단백질 시료를 200V에서 30 내지 45분 동안 Biorad Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™ 프리캐스트 겔 (gradient gel)에서 전기영동하였다. 전기영동 후, 분리된 단백질을 100V에서 1시간 동안 전기블랏팅하여 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다.
[0296] 단백질 검출을 위해 상기 니트로셀룰로오스 막을 PBS에 녹여진 5% 탈지유로 상온에서 1시간 동안 처리하여 비-특이적 항체 결합 위치를 차단시켰다. HA 태깅된 단백질의 검출을 위해, 상기 막을 차단 완충액에 녹여진 1:1000 희석의 항-HA HRP 컨쥬게이션된 항체 (Abcam Cat# AB1265)에서 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. Flag-태깅된 단백질의 검출을 위해, 개별 전기블랏팅된 니트로셀룰로오스 막을 차단 완충액에 녹여진 1:1000 희석의 항-Flag HRP 컨쥬게이션된 항체 (Abcam Cat# AB49763)에서 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 이후 막들을 세척 당 5분씩 PBS로 3번에 걸쳐서 세척한 후, BioRad XRS 겔 doc 시스템을 이용하여 이미지를 얻기 전에 ECL 기질 (Thermo Scientific Pierce ECL Western-bot substrate, Cat No 32106)에서 2-3분 동안 반응시켰다.
결과
[0297] HA - tag 검출을 통한 D13 단백질의 검출: 항-HA-tag 항체는 p-LL07-LL29-CHO로부터 제조된 총 세포 단백질 추출물로부터 예상된 크기의 단백질을 검출할 수 있었지만 CHO 세포로부터 제조된 총 세포 단백질 추출물로부터는 어떠한 단백질도 검출할 수 없었다. 이것은 p-LL07-LL29-CHO가 D13 단백질을 발현하고 있다는 것을 명확하게 보여주었다.
[0298] Flag - Tag 을 통한 CP77 단백질의 검출: 항-Flag-tag 항체는 p-LL07-LL29-CHO 및 p-LL07-CHO (CP77만을 발현하는 CHO 세포주)로부터 제조된 총 세포 단백질 추출물로부터 예상된 크기의 단백질을 검출할 수 있었지만 CHO 세포로부터 제조된 총 세포 단백질 추출물로부터는 어떠한 단백질도 검출할 수 없었다. 이것은 p-LL07-LL29-CHO 및 p-LL07-CHO가 CP77 단백질을 발현하고 있다는 것을 명확하게 보여주었다.
[0299] Flag - tag 검출을 통한 D13 단백질의 검출: C11-LL19-HeLa에 의해 발현된 상기 D13-단백질은 C-말단 Flag-tag을 가지는 D13-단백질을 발현하였고 이 세포주로부터 제조된 총 세포 단백질 추출물의 웨스턴 블랏 시 항-Flag-tag 항체는 예상된 크기의 단백질을 검출할 수 있었다. 이것은 C11-LL19-HeLa가 D13 단백질을 발현하고 있다는 것을 명확하게 보여주었다.
[0300] 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 많은 변형들이 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
표 A
서열 동정자의 요약
Figure 112016053028627-pct00002
표 1
적정 결과
Figure 112016053028627-pct00003
바이러스 수율 (아웃풋)
감염 (인풋)에 이용된 바이러스의 양은 4x104 pfu/mL였다. 비교 편의상 수율은 104 값으로 표현된다. 값들은 시간점 당 평균 수율, 즉 3mL 수득으로부터의 수율 (2개의 웰로 나뉘어진 6mL)을 나타낸다.
Figure 112016053028627-pct00004
생산 수율 (아웃풋/인풋 비율)
하기 표는 각 수득 시점에 각 세포주로부터 얻어진 상기 인풋 레벨에 따라 생산된 바이러스 수율, 즉 아웃풋/인풋 비율을 보여준다.
Figure 112016053028627-pct00005
표 2
pfu / mL 에서의 적정 결과
Figure 112016053028627-pct00006
웰 당 감염으로부터의 평균 바이러스 아웃풋 (수율)
플라스크 당 바이러스 추출물 용량은 1mL이었다. 적정을 위한 플레이팅 용량은 1mL이었다. 따라서, 바이러스 수율은 1mL (플레이팅 용량)에 의해 곱해진 pfu/mL에서의 적정과 동일하다.
Figure 112016053028627-pct00007
pfu 접종물 당 수율, 즉 1 pfu 접종물로부터 생산되는 총 pfu
플라스크 당 접종물 크기: 1x105pfu
Figure 112016053028627-pct00008
표 3
이것은 각 1mL 바이러스 추출물의 역가이다.
Figure 112016053028627-pct00009
표 4
표 4는 각 1 mL 바이러스 추출물 내 바이러스 총량을 제공한다.
Figure 112016053028627-pct00010
표 B
Figure 112016053028627-pct00011
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gagcgactcc cggtcttgcg tgaaccccga ggtggtcaag 660 tgcctgatca accacggcat caacccctcc agcatcgata agaactactg caccgccctg 720 cagtactaca tcaagtcctc ccacatcgac atcgatatcg tgaagctgct gatgaagggc 780 atcgacaaca ccgcctacag ctacatcgac gacctgacct gctgcacccg gggcatcatg 840 gccgactacc tgaacagcga ctaccggtac aacaaggacg tggacctgga tctggtcaaa 900 ctgttcctgg aaaacggcaa gcctcacggc atcatgtgct ccatcgtgcc cctgtggcgg 960 aacgacaaag agacaatctc cctgatcctg aaaaccatga actccgacgt gctgcagcat 1020 atcctgatcg agtacatcac cttctccgat atcgacatct ctctggtcga gtacatgctg 1080 gaatacggcg ctgtggtcaa caaagaggcc atccacggct acttcaagaa catcaacatc 1140 gactcctaca ccatgaagta cctgctgaaa aaagagggcg gcgacgccgt caaccacctg 1200 gacgacggcg agatccccat cggccacctg tgcaagagca actacggccg gtacaacttt 1260 tacaccgaca cctaccggca gggcttccgg gacatgtcct acgcctgccc catcctgtcc 1320 accatcaaca tctgcctgcc ctacctgaag gacatcaata tgatcgataa gcggggcgag 1380 acactgctgc acaaggccgt gcgctacaac aagcagtccc tggtgtccct gctgctggaa 1440 agcggctccg acgtgaacat ccggtccaac aacggctaca cctgtatcgc tatcgccatc 1500 aacgagtccc ggaacatcga gctgctgaat atgctgctgt gccacaagcc taccctggac 1560 tgcgtgatcg actccctgcg cgagatcagc aacatcgtgg acaacgccta cgccatcaag 1620 cagtgcatca gatacgccat gattatcgac gactgcatct cctccaagat ccccgagtcc 1680 atctccaagc actacaacga ctacattgac atctgcaacc aggaactgaa cgagatgaag 1740 aaaatcatcg tgggcggcaa caccatgttc agcctgatct tcaccgatca cggcgccaag 1800 atcatccacc gctacgccaa caaccccgag ctgcgggcct actacgagtc caagcagaac 1860 aagatctacg tcgaggtcta cgacatcatc agcaacgcca tcgtgaagca caacaagatt 1920 cacaagaaca tcgagtccgt ggacgacaac acctacatct ccaacctgcc ctataccatc 1980 aagtacaaga tcttcgagca gcaggattac aaggatgacg atgacaagtg a 2031 <210> 2 <211> 676 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of CP77 encoded by SEQ ID NO: 1 <400> 2 Met Phe Asp Tyr Leu Glu Asn Glu Glu Val Ala Leu Asp Glu Leu Lys 1 5 10 15 Gln Met Leu Arg Asp Arg Asp Pro Asn Asp Thr Arg Asn Gln Phe Lys 20 25 30 Asn Asn Ala Leu His Ala Tyr Leu Phe Asn Glu His Cys Asn Asn Val 35 40 45 Glu Val Val Lys Leu Leu Leu Asp Ser Gly Thr Asn Pro Leu His Lys 50 55 60 Asn Trp Arg Gln Leu Thr Pro Leu Gly Glu Tyr Thr Asn Ser Arg His 65 70 75 80 Gly Lys Val Asn Lys Asp Ile Ala Met Val Leu Leu Glu Ala Thr Gly 85 90 95 Tyr Ser Asn Ile Asn Asp Phe Asn Ile Phe Thr Tyr Met Lys Ser Lys 100 105 110 Asn Val Asp Ile Asp Leu Ile Lys Val Leu Val Glu His Gly Phe Asp 115 120 125 Phe Ser Val Lys Cys Glu Lys His His Ser Val Ile Glu Asn Tyr Val 130 135 140 Met Thr Asp Asp Pro Val Pro Glu Ile Ile Asp Leu Phe Ile Glu Asn 145 150 155 160 Gly Cys Ser Val Ile Tyr Glu Asp Glu Asp Asp Glu Tyr Gly Tyr Ala 165 170 175 Tyr Glu Glu Tyr His Ser Gln Asn Asp Asp Tyr Gln Pro Arg Asn Cys 180 185 190 Gly Thr Val Leu His Leu Tyr Ile Ile Ser His Leu Tyr Ser Glu Ser 195 200 205 Asp Ser Arg Ser Cys Val Asn Pro Glu Val Val Lys Cys Leu Ile Asn 210 215 220 His Gly Ile Asn Pro Ser Ser Ile Asp Lys Asn Tyr Cys Thr Ala Leu 225 230 235 240 Gln Tyr Tyr Ile Lys Ser Ser His Ile Asp Ile Asp Ile Val Lys Leu 245 250 255 Leu Met Lys Gly Ile Asp Asn Thr Ala Tyr Ser Tyr Ile Asp Asp Leu 260 265 270 Thr Cys Cys Thr Arg Gly Ile Met Ala Asp Tyr Leu Asn Ser Asp Tyr 275 280 285 Arg Tyr Asn Lys Asp Val Asp Leu Asp Leu Val Lys Leu Phe Leu Glu 290 295 300 Asn Gly Lys Pro His Gly Ile Met Cys Ser Ile Val Pro Leu Trp Arg 305 310 315 320 Asn Asp Lys Glu Thr Ile Ser Leu Ile Leu Lys Thr Met Asn Ser Asp 325 330 335 Val Leu Gln His Ile Leu Ile Glu Tyr Ile Thr Phe Ser Asp Ile Asp 340 345 350 Ile Ser Leu Val Glu Tyr Met Leu Glu Tyr Gly Ala Val Val Asn Lys 355 360 365 Glu Ala Ile His Gly Tyr Phe Lys Asn Ile Asn Ile Asp Ser Tyr Thr 370 375 380 Met Lys Tyr Leu Leu Lys Lys Glu Gly Gly Asp Ala Val Asn His Leu 385 390 395 400 Asp Asp Gly Glu Ile Pro Ile Gly His Leu Cys Lys Ser Asn Tyr Gly 405 410 415 Arg Tyr Asn Phe Tyr Thr Asp Thr Tyr Arg Gln Gly Phe Arg Asp Met 420 425 430 Ser Tyr Ala Cys Pro Ile Leu Ser Thr Ile Asn Ile Cys Leu Pro Tyr 435 440 445 Leu Lys Asp Ile Asn Met Ile Asp Lys Arg Gly Glu Thr Leu Leu His 450 455 460 Lys Ala Val Arg Tyr Asn Lys Gln Ser Leu Val Ser Leu Leu Leu Glu 465 470 475 480 Ser Gly Ser Asp Val Asn Ile Arg Ser Asn Asn Gly Tyr Thr Cys Ile 485 490 495 Ala Ile Ala Ile Asn Glu Ser Arg Asn Ile Glu Leu Leu Asn Met Leu 500 505 510 Leu Cys His Lys Pro Thr Leu Asp Cys Val Ile Asp Ser Leu Arg Glu 515 520 525 Ile Ser Asn Ile Val Asp Asn Ala Tyr Ala Ile Lys Gln Cys Ile Arg 530 535 540 Tyr Ala Met Ile Ile Asp Asp Cys Ile Ser Ser Lys Ile Pro Glu Ser 545 550 555 560 Ile Ser Lys His Tyr Asn Asp Tyr Ile Asp Ile Cys Asn Gln Glu Leu 565 570 575 Asn Glu Met Lys Lys Ile Ile Val Gly Gly Asn Thr Met Phe Ser Leu 580 585 590 Ile Phe Thr Asp His Gly Ala Lys Ile Ile His Arg Tyr Ala Asn Asn 595 600 605 Pro Glu Leu Arg Ala Tyr Tyr Glu Ser Lys Gln Asn Lys Ile Tyr Val 610 615 620 Glu Val Tyr Asp Ile Ile Ser Asn Ala Ile Val Lys His Asn Lys Ile 625 630 635 640 His Lys Asn Ile Glu Ser Val Asp Asp Asn Thr Tyr Ile Ser Asn Leu 645 650 655 Pro Tyr Thr Ile Lys Tyr Lys Ile Phe Glu Gln Gln Asp Tyr Lys Asp 660 665 670 Asp Asp Asp Lys 675 <210> 3 <211> 11742 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of pLL07 <400> 3 tcagaattgg ttaattggtt gtaacactga cccctatttg tttatttttc taaatacatt 60 caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 120 ggaagaatat gagccatatt caacgggaaa cgtcgaggcc gcgattaaat tccaacatgg 180 atgctgattt atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca ggtgcgacaa 240 tctatcgctt gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat ggcaaaggta 300 gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg gaatttatgc 360 cacttccgac catcaagcat tttatccgta ctcctgatga tgcatggtta ctcaccactg 420 cgatccccgg aaaaacagcg ttccaggtat tagaagaata tcctgattca ggtgaaaata 480 ttgttgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcactc gattcctgtt tgtaattgtc 540 cttttaacag cgatcgcgta tttcgcctcg ctcaggcgca atcacgaatg aataacggtt 600 tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa caagtctgga 660 aagaaatgca taaacttttg ccattctcac cggattcagt cgtcactcat ggtgatttct 720 cacttgataa ccttattttt gacgagggga aattaatagg ttgtattgat gttggacgag 780 tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt 840 ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct gatatgaata 900 aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaact catgaccaaa atcccttaac 960 gtgagttacg cgcgcgtcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 1020 ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 1080 accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 1140 cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt tagcccacca 1200 cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 1260 tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 1320 taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 1380 gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 1440 agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 1500 ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 1560 acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 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tataagcaga 2460 gctcgtttag tgaaccgtca gatcactaga agctttattg cggtagttta tcacagttaa 2520 attgctaacg cagtcaggcc aacatgggct ctagcctgga cgacgagcac atcctgagcg 2580 ccctgctgca gagcgacgac gaactggtgg gcgaggacag cgacagcgag gtcagcgacc 2640 acgtgtccga ggacgacgtg cagtccgaca ccgaggaagc cttcatcgac gaggtgcacg 2700 aagtgcagcc taccagcagc ggctccgaga tcctggacga gcagaacgtg atcgagcagc 2760 ctggcagctc cctggccagc aacagaatcc tgaccctgcc ccagagaacc atcagaggca 2820 agaacaagca ctgctggtcc acctccaaga gcaccaggcg gagcagagtg tccgccctga 2880 acatcgtgcg gagccagagg ggccccacca gaatgtgcag aaacatctac gaccccctgc 2940 tgtgcttcaa gctgttcttc accgacgaga tcatcagcga gatcgtgaag tggaccaacg 3000 ccgagatcag cctgaagagg cgggagagca tgaccagcgc caccttcaga gacaccaacg 3060 aggacgagat ctacgccttc ttcggcatcc tggtgatgac cgccgtgaga aaggacaacc 3120 acatgagcac cgacgacctg ttcgacagat ccctgagcat ggtgtacgtg tccgtgatga 3180 gcagagacag attcgacttc ctgatcagat gcctgagaat ggacgacaag agcatcagac 3240 ccaccctgcg ggagaacgac gtgttcaccc ccgtgcggaa gatctgggac ctgttcatcc 3300 accagtgcat ccagaactac acccctggcg cccacctgac catcgatgag cagctgctgg 3360 gcttcagagg cagatgcccc ttcagagtgt acatccccaa caagcccagc aagtacggca 3420 tcaagatcct gatgatgtgc gacagcggca ccaagtacat gatcaacggc atgccctacc 3480 tgggcagagg cacccagaca aacggcgtgc ccctgggcga gtactacgtg aaagaactga 3540 gcaagcctgt gcatggcagc tgcaggaaca tcacatgcga caactggttc accagcatcc 3600 ccctggccaa gaacctcctg caggaaccct acaagctgac catcgtgggc accgtgcgga 3660 gcaacaagcg ggagatccca gaggtgctga agaacagcag atccagacct gtgggaacaa 3720 gcatgttctg cttcgacggc cccctgaccc tggtgtccta caagcccaag cccgccaaga 3780 tggtgtacct cctgtccagc tgcgacgagg acgccagcat caacgagagc accggcaagc 3840 cccagatggt gatgtactac aaccagacca agggcggcgt ggacaccctg gaccagatgt 3900 gcagcgtgat gacatgcagc agaaagacca acagatggcc tatggccctg ctgtacggca 3960 tgatcaatat cgcctgcatc aacagcttca tcatctacag ccacaacgtg tccagcaagg 4020 gcgagaaggt gcagagccgg aagaaattca tgcggaacct gtacatgagc ctgacctcca 4080 gcttcatgag aaagagactg gaagccccca ccctgaagag atacctccgg gacaacatca 4140 gcaacatcct gcccaaggaa gtgccaggaa caagcgacga cagcaccgag gaacccgtga 4200 tgaagaagag gacctactgc acctactgtc ccagcaagat cagaagaaag gccaacgcca 4260 gctgcaagaa atgcaaaaaa gtgatctgcc gggagcacaa catcgacatg tgccagagct 4320 gtttctgatt cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg 4380 cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt 4440 ataagctgca ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag 4500 ggggagatgt gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg taagcaggtt 4560 taaccctaga aagatagtct gcgtaaaatt gacgcatgca ttcttgaaat attgctctct 4620 ctttctaaat agcgcgaatc cgtcgctgtg catttaggac atctcagtcg ccgcttggag 4680 ctcccgtgag gcgtgcttgt caatgcggta agtgtcactg attttgaact ataacgaccg 4740 cgtgagtcaa aatgacgcat gattatcttt tacgtgactt ttaagattta actcatacga 4800 taattatatt gttatttcat gttctactta cgtgataact tattatatat atattttctt 4860 gttatagata tctttcttta tgttttaaat gcactgacct cccacattcc ctttttagta 4920 aaatattcag aaataattta aatacatcat tgcaatgaaa ataaatgttt tttattaggc 4980 agaatccaga tgctcaaggc ccttcataat atcccccagt ttagtagttg gacttaggga 5040 acaaaggaac ctttaataga aattggacag caagaaagcg agctattcct ttgccctcgg 5100 acgagtgctg gggcgtcggt ttccactatc ggcgagtact tctacacagc catcggtcca 5160 gacggccgcg cttctgcggg cgatttgtgt acgcccgaca gtcccggctc cggatcggac 5220 gattgcgtcg catcgaccct gcgcccaagc tgcatcatcg aaattgccgt caaccaagct 5280 ctgatagagt tggtcaagac caatgcggag catatacgcc cggagccgcg gcgatcctgc 5340 aagctccgga tgcctccgct cgaagtagcg cgtctgctgc tccatacaag ccaaccacgg 5400 cctccagaag aagatgttgg cgacctcgta ttgggaatcc ccgaacatcg cctcgctcca 5460 gtcaatgacc gctgttatgc ggccattgtc cgtcaggaca ttgttggagc cgaaatccgc 5520 gtgcacgagg tgccggactt cggggcagtc ctcggcccaa agcatcagct catcgagagc 5580 ctgcgcgacg gacgcactga cggtgtcgtc catcacagtt tgccagtgat acacatgggg 5640 atcagcaatc gcgcatatga aatcacgcca tgtagtgtat tgaccgattc cttgcggtcc 5700 gaatgggccg aacccgctcg tctggctaag atcggccgca gcgatcgcat ccatggcctc 5760 cgcgaccggc tgcagaacag cgggcagttc ggtttcaggc agatcttgca acgtgacacc 5820 ctgtgcacgg cgggagatgc aataggtcag gctctcgctg aattccccaa tgtcaagcac 5880 ttccggaatc gggagcgcgg ccgatgcaaa gtgccgataa acataacgat ctttgtagaa 5940 accatcggcg cagctattta cccgcaggac atatccacgc cctcctacat cgaagctgaa 6000 agcacgagat tcttcgccct ccgagagctg catcaggtcg gacacgctgt cgaacttttc 6060 gatcagaaac ttctcgacag acgtcgcggt gagttcaggc tttttcatgg tggcggacga 6120 aaggcccgga gatgaggaag aggagaacag cgcggcagac gtgcgctttt gaagcgtgca 6180 gaatgccggg cctccggagg accttcgggc gcccgccccg cccctgagcc cgcccctgag 6240 cccgcccccg gacccacccc ttcccagcct ctgagcccag aaagcgaagg agcaaagctg 6300 ctattggccg ctgccccaaa ggcctacccg cttccattgc tcagcggtgc tgtccatctg 6360 cacgagacta gtgagtcgtg ctacttccat ttgtcacgtc ctgcacgacg cgagctgcgg 6420 ggcggggggg aacttcctga ctaggggagg agtagaaggt ggcgcgaagg ggccaccaaa 6480 gaacggagcc ggttggcgcc taccggtgga tgtggaatgt gtgcgaggcc agaggccact 6540 tgtgtagcgc caagtgccca gcggggctgc taaagcgcat gctccagact gccttgggaa 6600 aagcgcctcc cctacccggt agagaaactt gatctgtcgc cgcaattcaa gcttcgtgag 6660 gctccggtgc ccgtcagtga cctgctatac tctggagacg gcacatcgcc cacagtcccc 6720 gagaagttgg gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac 6780 tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat 6840 ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag 6900 gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg 6960 ccttgaatta cttccacctg gctccagtac gtgattcttg atcccgagct ggagccaggg 7020 gcgggccttg cgctttagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctgggc 7080 gctggggccg ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata 7140 agtctctagc catttaaaat ttttgatgac gtgctgcgac gctttttttc tggcaagata 7200 gtcttgtaaa tgcgggccag gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg cccgcggccg 7260 gcgacggggc ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc 7320 caccgagaat cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg 7380 cgccgccgtg tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt 7440 gagcggaaag atggccgctt cccggccctg ctccaggggg ctcaaaatgg aggacgcggc 7500 gctcgggaga gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag 7560 ccgtcgcttc atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct 7620 ggagcttttg gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc 7680 cccacactga gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct 7740 tggaatttgg cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc 7800 aaagtttttt tcttccattt caggtgtcgt gaacacgtct cggggggccg ccaccatgtt 7860 cgactacctg gaaaatgagg aagtggccct ggacgagctg aagcagatgc tgcgggaccg 7920 ggaccccaac gacacccgga accagttcaa gaacaacgcc ctgcacgcct acctgtttaa 7980 cgagcactgc aacaacgtgg aagtggtcaa gctgctgctg gactccggca ccaaccccct 8040 gcacaagaac tggcggcagc tgacccccct gggcgagtac accaactccc ggcacggcaa 8100 agtgaacaag gatatcgcca tggtgctgct ggaagctacc ggctactcca acatcaacga 8160 cttcaacatc ttcacctaca tgaagtccaa gaacgtggac atcgacctga tcaaggtgct 8220 ggtggaacac ggcttcgact tctccgtgaa gtgcgagaag caccactccg tgatcgagaa 8280 ctacgtgatg accgacgacc ccgtgcctga gatcatcgac ctgttcatcg agaacggctg 8340 ctccgtgatc tacgaggacg aggacgacga gtacggctac gcctacgagg aataccactc 8400 ccagaacgac gactaccagc cccggaactg cggcaccgtg ctgcacctgt acatcatctc 8460 ccacctgtac tccgagagcg actcccggtc ttgcgtgaac cccgaggtgg tcaagtgcct 8520 gatcaaccac ggcatcaacc cctccagcat cgataagaac tactgcaccg ccctgcagta 8580 ctacatcaag tcctcccaca tcgacatcga tatcgtgaag ctgctgatga agggcatcga 8640 caacaccgcc tacagctaca tcgacgacct gacctgctgc acccggggca tcatggccga 8700 ctacctgaac agcgactacc ggtacaacaa ggacgtggac ctggatctgg tcaaactgtt 8760 cctggaaaac ggcaagcctc acggcatcat gtgctccatc gtgcccctgt ggcggaacga 8820 caaagagaca atctccctga tcctgaaaac catgaactcc gacgtgctgc agcatatcct 8880 gatcgagtac atcaccttct ccgatatcga catctctctg gtcgagtaca tgctggaata 8940 cggcgctgtg gtcaacaaag aggccatcca cggctacttc aagaacatca acatcgactc 9000 ctacaccatg aagtacctgc tgaaaaaaga gggcggcgac gccgtcaacc acctggacga 9060 cggcgagatc cccatcggcc acctgtgcaa gagcaactac ggccggtaca acttttacac 9120 cgacacctac cggcagggct tccgggacat gtcctacgcc tgccccatcc tgtccaccat 9180 caacatctgc ctgccctacc tgaaggacat caatatgatc gataagcggg gcgagacact 9240 gctgcacaag gccgtgcgct acaacaagca gtccctggtg tccctgctgc tggaaagcgg 9300 ctccgacgtg aacatccggt ccaacaacgg ctacacctgt atcgctatcg ccatcaacga 9360 gtcccggaac atcgagctgc tgaatatgct gctgtgccac aagcctaccc tggactgcgt 9420 gatcgactcc ctgcgcgaga tcagcaacat cgtggacaac gcctacgcca tcaagcagtg 9480 catcagatac gccatgatta tcgacgactg catctcctcc aagatccccg agtccatctc 9540 caagcactac aacgactaca ttgacatctg caaccaggaa ctgaacgaga tgaagaaaat 9600 catcgtgggc ggcaacacca tgttcagcct gatcttcacc gatcacggcg ccaagatcat 9660 ccaccgctac gccaacaacc ccgagctgcg ggcctactac gagtccaagc agaacaagat 9720 ctacgtcgag gtctacgaca tcatcagcaa cgccatcgtg aagcacaaca agattcacaa 9780 gaacatcgag tccgtggacg acaacaccta catctccaac ctgccctata ccatcaagta 9840 caagatcttc gagcagcagg attacaagga tgacgatgac aagtgaaaaa gcgtcttcct 9900 gttctcatca catcatatca aggttatata ccatcaatat tgccacagat gttacttagc 9960 cttttaatat ttctctaatt tagtgtatat gcaatgatag ttctctgatt tctgagattg 10020 agtttctcat gtgtaatgat tatttagagt ttctctttca tctgttcaaa tttttgtcta 10080 gttttatttt ttactgattt gtaagacttc tttttataat ctgcatatta caattctctt 10140 tactggggtg ttgcaaatat tttctgtcat tctatggcct gacttttctt aatggttttt 10200 taattttaaa aataagtctt aatattcatg caatctaatt aacaatcttt tctttgtggt 10260 taggactttg agtcataaga aatttttctc tacactgaag tcatgatggc atgcttctat 10320 attattttct aaaagattta aagttttgcc ttctccattt agacttataa ttcactggaa 10380 tttttttgtg tgtatggtat gacatatggg ttccctttta ttttttacat ataaatatat 10440 ttccctgttt ttctaaaaaa gaaaaagatc atcattttcc cattgtaaaa tgccatattt 10500 ttttcatagg tcacttacat atatcaatgg gtctgtttct gagctctact ctattttatc 10560 agcctcactg tctatcccca cacatctcat gctttgctct aaatcttgat atttagtgga 10620 acattctttc ccattttgtt ctacaagaat atttttgtta ttgtctttgg gctttctata 10680 tacattttga aatgaggttg acaagttaat aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa 10740 agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta 10800 atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa 10860 tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg 10920 tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc 10980 ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc 11040 cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg 11100 gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg 11160 acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg 11220 ctgccggctc tgcggcctct tccgcctctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc 11280 ctttgggccg cctccccgca tcgcctgcta ttgtcttgcc aatcctcccc cttgctgtcc 11340 tgccccaccc caccccccag aatagaatga cacctactca gacaatgcga tgcaatttcc 11400 tcattttatt aggaaaggac agtgggagtg gcaccttcca gggtcaagga aggcacgggg 11460 gaggggcaaa caacagatgg ctggcaacta gaaggcacat ttgttacttt atagaagaaa 11520 ttttgagttt ttgttttttt ttaataaata aataaacata aataaattgt ttgttgaatt 11580 tattattagt atgtaagtgt aaatataata aaacttaata tctattcaaa ttaataaata 11640 aacctcgata tacagaccga taaaacacat gcgtcaattt tacgcatgat tatctttaac 11700 gtacgtcaca atatgattat ctttctaggg ttaagaagac tg 11742 <210> 4 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer for CP77-CHO gene from pPH51 plasmid <400> 4 aacacgtctc ggggggccgc caccatgttc gactacctgg aaaatgagga agtg 54 <210> 5 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer for CP77-CHO gene from pPH51 plasmid <400> 5 caggaagacg ctttttcact tgtcatcgtc atccttgtaa tcctgctgct cgaagatctt 60 gtact 65 <210> 6 <211> 855 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of vaccinia Copenhagen K1L gene (extract from Genbank M35027.1) <400> 6 atggatctgt cacgaattaa tacttggaag tctaagcagc tgaaaagctt tctctctagt 60 aaagatacat ttaaggcgga tgtccatgga catagtgcct tgtattatgc aatagctgat 120 aataacgtgc gtctagtatg tacgttgttg aacgctggag cattgaaaaa tcttctagag 180 aatgaatttc cattacatca ggcagccaca ttagaagata ccaaaatagt aaagattttg 240 ctattcagtg gaatggatga ttcacaattt gatgacaaag gaaacaccgc attgtattat 300 gcggttgata gtggtaacat gcaaacggtg aaactgtttg ttaagaaaaa ttggagactg 360 atgttctatg ggaaaactgg atggaaaact tcattttatc atgccgtcat gcttaatgat 420 gtaagtattg tatcatactt tctttcagaa ataccatcta cttttgatct ggctattctc 480 cttagttgta ttcacaccac tataaaaaat ggacacgtgg atatgatgat tctcttgctc 540 gactatatga cgtcgacaaa caccaataat tcccttctct tcattccgga cattaaattg 600 gctatagata ataaagacat tgagatgtta caggctctgt tcaaatacga cattaatatc 660 tactctgtta atctggaaaa tgtactattg gatgatgccg aaataactaa gatgattata 720 gaaaagcatg ttgaatacaa gtctgactcc tatacaaaag atctcgatat cgtcaagaat 780 aataaattgg atgaaataat tagcaaaaac aaggaactca gactcatgta cgtcaattgt 840 gtaaagaaaa actaa 855 <210> 7 <211> 284 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of vaccinia Copenhagen K1L (extract from Genbank M35027.1) encoded by SEQ ID NO: 6 <400> 7 Met Asp Leu Ser Arg Ile Asn Thr Trp Lys Ser Lys Gln Leu Lys Ser 1 5 10 15 Phe Leu Ser Ser Lys Asp Thr Phe Lys Ala Asp Val His Gly His Ser 20 25 30 Ala Leu Tyr Tyr Ala Ile Ala Asp Asn Asn Val Arg Leu Val Cys Thr 35 40 45 Leu Leu Asn Ala Gly Ala Leu Lys Asn Leu Leu Glu Asn Glu Phe Pro 50 55 60 Leu His Gln Ala Ala Thr Leu Glu Asp Thr Lys Ile Val Lys Ile Leu 65 70 75 80 Leu Phe Ser Gly Met Asp Asp Ser Gln Phe Asp Asp Lys Gly Asn Thr 85 90 95 Ala Leu Tyr Tyr Ala Val Asp Ser Gly Asn Met Gln Thr Val Lys Leu 100 105 110 Phe Val Lys Lys Asn Trp Arg Leu Met Phe Tyr Gly Lys Thr Gly Trp 115 120 125 Lys Thr Ser Phe Tyr His Ala Val Met Leu Asn Asp Val Ser Ile Val 130 135 140 Ser Tyr Phe Leu Ser Glu Ile Pro Ser Thr Phe Asp Leu Ala Ile Leu 145 150 155 160 Leu Ser Cys Ile His Thr Thr Ile Lys Asn Gly His Val Asp Met Met 165 170 175 Ile Leu Leu Leu Asp Tyr Met Thr Ser Thr Asn Thr Asn Asn Ser Leu 180 185 190 Leu Phe Ile Pro Asp Ile Lys Leu Ala Ile Asp Asn Lys Asp Ile Glu 195 200 205 Met Leu Gln Ala Leu Phe Lys Tyr Asp Ile Asn Ile Tyr Ser Val Asn 210 215 220 Leu Glu Asn Val Leu Leu Asp Asp Ala Glu Ile Thr Lys Met Ile Ile 225 230 235 240 Glu Lys His Val Glu Tyr Lys Ser Asp Ser Tyr Thr Lys Asp Leu Asp 245 250 255 Ile Val Lys Asn Asn Lys Leu Asp Glu Ile Ile Ser Lys Asn Lys Glu 260 265 270 Leu Arg Leu Met Tyr Val Asn Cys Val Lys Lys Asn 275 280 <210> 8 <211> 1062 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of Copenhagen C12L gene (ortholog of SPI-1) (extract from Genbank M35027.1) <400> 8 atggatatct ttaaagaact aatcgtaaaa caccctgatg aaaatgtttt gatttctcca 60 gtttctattt tatctacttt atctattcta aatcatggag cagctggttc tacagctgaa 120 caactatcaa aatatataga gaatatgaat gagaatacac ccgatgacaa taatgacatg 180 gacgtagata ttccgtattg tgcgacacta gctaccgcaa ataaaatata cggtagcgat 240 agtatcgagt tccacgcctc cttcctacaa aaaataaaag acgattttca aactgtaaac 300 tttaataatg ctaaccaaac aaaggaacta atcaacgaat gggttaagac aatgacaaat 360 ggtaaaatta attccttatt gactagtccg ctatccatta atactcgtat gacagttgtt 420 agcgccgtcc attttaaagc aatgtggaaa tatccatttt ctaaacatct tacatataca 480 gacaagtttt atatttctaa gaatatagtt accagtgttg atatgatggt gggtaccgag 540 aataacttgc aatatgtaca tattaatgaa ttattcggag gattctctat tatcgatatt 600 ccatacgagg gaaactctag tatggtgatt atactaccgg acgacataga aggtatatat 660 aacatagaaa aaaatataac agatgaaaaa tttaaaaaat ggtgtggtat gttatctact 720 aaaagtatag acttgtatat gccaaagttt aaagtggaaa tgacagaacc gtataatctg 780 gtaccgattt tagaaaattt aggacttact aatatattcg gatattatgc agattttagc 840 aagatgtgta atgaaactat cactgtagaa aaatttctac atacgacgtt tatagatgtt 900 aatgaggagt atacagaagc atcggccgtt acaggagtat ttacgattaa cttttcgatg 960 gtatatcgta cgaaggtcta cataaaccat ccattcatgt acatgattaa agacaccaca 1020 ggacgtatac tttttatagg gaaatactgc tatccgcaat aa 1062 <210> 9 <211> 353 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of vaccinia Copenhagen C12L (ortholog of SPI-1) (extract from Genbank M35027.1) encoded by SEQ ID NO: 8 <400> 9 Met Asp Ile Phe Lys Glu Leu Ile Val Lys His Pro Asp Glu Asn Val 1 5 10 15 Leu Ile Ser Pro Val Ser Ile Leu Ser Thr Leu Ser Ile Leu Asn His 20 25 30 Gly Ala Ala Gly Ser Thr Ala Glu Gln Leu Ser Lys Tyr Ile Glu Asn 35 40 45 Met Asn Glu Asn Thr Pro Asp Asp Asn Asn Asp Met Asp Val Asp Ile 50 55 60 Pro Tyr Cys Ala Thr Leu Ala Thr Ala Asn Lys Ile Tyr Gly Ser Asp 65 70 75 80 Ser Ile Glu Phe His Ala Ser Phe Leu Gln Lys Ile Lys Asp Asp Phe 85 90 95 Gln Thr Val Asn Phe Asn Asn Ala Asn Gln Thr Lys Glu Leu Ile Asn 100 105 110 Glu Trp Val Lys Thr Met Thr Asn Gly Lys Ile Asn Ser Leu Leu Thr 115 120 125 Ser Pro Leu Ser Ile Asn Thr Arg Met Thr Val Val Ser Ala Val His 130 135 140 Phe Lys Ala Met Trp Lys Tyr Pro Phe Ser Lys His Leu Thr Tyr Thr 145 150 155 160 Asp Lys Phe Tyr Ile Ser Lys Asn Ile Val Thr Ser Val Asp Met Met 165 170 175 Val Gly Thr Glu Asn Asn Leu Gln Tyr Val His Ile Asn Glu Leu Phe 180 185 190 Gly Gly Phe Ser Ile Ile Asp Ile Pro Tyr Glu Gly Asn Ser Ser Met 195 200 205 Val Ile Ile Leu Pro Asp Asp Ile Glu Gly Ile Tyr Asn Ile Glu Lys 210 215 220 Asn Ile Thr Asp Glu Lys Phe Lys Lys Trp Cys Gly Met Leu Ser Thr 225 230 235 240 Lys Ser Ile Asp Leu Tyr Met Pro Lys Phe Lys Val Glu Met Thr Glu 245 250 255 Pro Tyr Asn Leu Val Pro Ile Leu Glu Asn Leu Gly Leu Thr Asn Ile 260 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atgacagttg ttagcgccgt ccattttaaa gcaatgtgga aatatccatt ttctaaacat 480 cttacatata cagacaagtt ttatatttct aagaatatag ttaccagcgt tgatatgatg 540 gtgagcactg agaacgactt acaatatgta catattaatg aattattcgg aggattctct 600 attatcgata ttccatacga gggaaactct agtatggtaa ttatactacc ggacgacata 660 gaaggtatat ataacataga aaaaaatata acagatgaaa aatttaaaaa atggtgtggt 720 atgttatcta ctaaaagtat agacttgtat atgccaaagt ttaaagtgga aatgacagaa 780 ccgtataatc tggtaccgat tttagaaaat ttaggactta ctaatatatt cggatattat 840 gcagatttta gcaagatgtg taatgaaact atcactgtag aaaaatttct acatacgacg 900 tttatagatg ttaatgagga gtatacagaa gcatcggccg ttacaggagt atttatgact 960 aacttttcga tggtatatcg tacgaaggtc tacataaacc atccattcat gtacatgatt 1020 aaagacaaca caggacgtat actttttata gggaaatact gctatccgca ataa 1074 <210> 11 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of Rabbitpox virus SPI-1 encoded by SEQ ID NO: 10 <400> 11 Met Asp Ile Phe Lys Glu Leu Ile Leu Lys His Pro Asp Glu Asn Val 1 5 10 15 Leu Ile Ser Pro Val Ser Ile Leu Ser Thr Leu Ser Ile Leu Asn His 20 25 30 Gly Ala Ala Gly Ser Thr Ala Glu Gln Leu Ser Lys Tyr Ile Glu Asn 35 40 45 Val Asn Glu Asn Thr Pro Asp Asp Lys Lys Asp Asp Asn Asn Asp Met 50 55 60 Asp Val Asp Ile Pro Tyr Cys Ala Thr Leu Ala Thr Ala Asn Lys Ile 65 70 75 80 Tyr Cys Ser Asp Ser Ile Glu Phe His Ala Ser Phe Leu Gln Lys Ile 85 90 95 Lys Asp Gly Phe Gln Thr Val Asn Phe Asn Asn Ala Asn Gln Thr Lys 100 105 110 Glu Leu Ile Asn Glu Trp Val Lys Thr Met Thr Asn Gly Lys Ile Asn 115 120 125 Ser Leu Leu Thr Ser Pro Leu Ser Ile Asn Thr Arg Met Thr Val Val 130 135 140 Ser Ala Val His Phe Lys Ala Met Trp Lys Tyr Pro Phe Ser Lys His 145 150 155 160 Leu Thr Tyr Thr Asp Lys Phe Tyr Ile Ser Lys Asn Ile Val Thr Ser 165 170 175 Val Asp Met Met Val Ser Thr Glu Asn Asp Leu Gln Tyr Val His Ile 180 185 190 Asn Glu Leu Phe Gly Gly Phe Ser Ile Ile Asp Ile Pro Tyr Glu Gly 195 200 205 Asn Ser Ser Met Val Ile Ile Leu Pro Asp Asp Ile Glu Gly Ile Tyr 210 215 220 Asn Ile Glu Lys Asn Ile Thr Asp Glu Lys Phe Lys Lys Trp Cys Gly 225 230 235 240 Met Leu Ser Thr Lys Ser Ile Asp Leu Tyr Met Pro Lys Phe Lys Val 245 250 255 Glu Met Thr Glu Pro Tyr Asn Leu Val Pro Ile Leu Glu Asn Leu Gly 260 265 270 Leu Thr Asn Ile Phe Gly Tyr Tyr Ala Asp Phe Ser Lys Met Cys Asn 275 280 285 Glu Thr Ile Thr Val Glu Lys Phe Leu His Thr Thr Phe Ile Asp Val 290 295 300 Asn Glu Glu Tyr Thr Glu Ala Ser Ala Val Thr Gly Val Phe Met Thr 305 310 315 320 Asn Phe Ser Met Val Tyr Arg Thr Lys Val Tyr Ile Asn His Pro Phe 325 330 335 Met Tyr Met Ile Lys Asp Asn Thr Gly Arg Ile Leu Phe Ile Gly Lys 340 345 350 Tyr Cys Tyr Pro Gln 355

Claims (17)

  1. 변형된 CHO 세포로서,
    상기 세포의 게놈은 구성적 프로모터의 조절 하에서 CP77을 인코딩하는 서열을 포함하도록 변형됨으로써 변형된 세포주가 비변형 세포에서는 증식할 수 없는 백시니아 바이러스의 증식을 지속하는 것이고,
    상기 세포의 게놈은 구성적 프로모터의 조절 하에 D13L을 인코딩하는 서열 및/또는 구성적 프로모터의 조절 하에 K1L을 인코딩하는 서열을 더 포함하는 것인 변형된 CHO 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포의 게놈은 구성적 프로모터의 조절 하에서 D13L을 인코딩하는 서열을 포함하는 것인 세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포의 게놈은 구성적 프로모터의 조절 하에서 K1L을 인코딩하는 서열을 포함하는 것인 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 세포의 게놈은 구성적 프로모터의 조절 하에서 D13L을 인코딩하는 서열을 포함하고 구성적 프로모터의 조절 하에서 K1L을 인코딩하는 서열을 포함하는 것인 세포.
  5. 제1항에 있어서, 상기 세포는 무한증식 세포주 (continuous cell line)인 것인 세포.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 CP77 유전자의 발현은 상기 바이러스의 증식을 도와 상기 바이러스에 대한 감수성 세포주에서 관찰되는 바이러스 생산과 동등한 바이러스 생산을 발생시키는 것인 세포.
  9. 제1항에 있어서, 상기 CP77 유전자의 발현은 500 이상의 바이러스 복제 증폭 비율을 지원하는 것인 세포.
  10. 제1항 내지 제5항, 제8항 및 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 CP77은 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 뉴클레오타이드 코돈의 인접 서열에 의해 인코딩되는 것인 세포.
  11. CHO 세포에서 증식하지 않는 오르토폭스바이러스를 증식시키는 방법으로서, 상기 방법은 CHO 세포주에서 백시니아 바이러스를 인 비트로 증식시키는 것을 포함하되,
    상기 세포주는 구성적 프로모터의 조절 하에서 CP77을 인코딩 및 발현하고; 각각의 구성적 프로모터의 조절 하에서 D13L 및/또는 K1L을 인코딩 및 발현하도록 변형되는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 변형된 상기 세포주는 구성적 프로모터의 조절 하에서 D13L을 인코딩 및 발현하도록 변형되는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 변형된 상기 세포주는 구성적 프로모터의 조절 하에서 K1L을 인코딩 및 발현하도록 변형되는 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 변형된 상기 세포주는 구성적 프로모터의 조절 하에 D13L을 인코딩 및 발현하도록 변형되고 구성적 프로모터의 조절 하에 K1L을 인코딩 및 발현하도록 변형되는 것인 방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
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