JP2009545309A - 組換え型生物学的製剤を製造する方法 - Google Patents

Abstract

組換え型生物学的製剤を製造する方法であって、哺乳動物産生細胞培養物を利用する方法は、細胞培養の初期段階中に哺乳動物産生細胞のバイオマスを生成するステップと、望ましい濃度の哺乳動物産生細胞を得た後に哺乳動物産生細胞内で表１の１つ又は複数のｍｉＲＮＡ分子のレベルの増大を引き起こすステップとを含む。この方法は、培養の初期段階の開始時又は初期段階中に哺乳動物産生細胞内で表１の１つ又は複数のｍｉＲＮＡ分子の阻害剤のレベルを増大させるステップを含むこともできる。
【選択図】なし

Description

本発明は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養物を生成するための方法、及びＣＨＯ細胞培養物を使用して組換え型生物医薬品を製造する方法に関する。本発明は組換え型ＣＨＯ細胞系にも関する。

発明の背景

チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）は、莫大な歳入を占める製薬学的用途及びＣＨＯ変異体に関するプロセス用の組換え型タンパク質を製造するために最も広く使用されている細胞系である（Ａｎｄｅｒｓｅｎ及びＫｒｕｍｍｅｎ、２００２）。ゲノムが完全に配列決定されていないにもかかわらず、幾つかの重要なＣＨＯの転写プロファイリング研究が、非ＣＨＯアレイ（Ｂａｉｋ ｅｔ ａｌ．、２００６）又は専有ＣＨＯｃＤＮＡアレイ（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、２００６）のいずれかを使用して実施されてきている。これらの研究は、ＣＨＯ培養中の低温とアポトーシスの誘導の両方の影響を記載している。同様に、幾つかのプロテオーム研究は、ＣＨＯのプロテオーム及び温度などの培養条件に応じたタンパク質発現の変化を調べている（Ｂａｉｋ ｅｔ ａｌ．、２００６；Ｃｈａｍｐｉｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９９；Ｖａｎ Ｄｙｋ ｅｔ ａｌ．２００３；Ｋａｕｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、１９９９ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、２００３）。これらの研究により、ＣＨＯ機能の制御及び特に低温の影響に関する全体的な理解が高まっている。

組換え生成ＣＨＯ細胞系の低温培養は、製品品質の基準を維持しながら（Ｆｏｇｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、２００５；Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．、２００３ｂ）、持続的生存能力及び増大した特異的生産性をもたらすことが示されてきている（Ａｌ−Ｆａｇｅｅｈ ｅｔ ａｌ．、２００６；Ｆｏｇｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、２００４；Ｆｕｒｕｋａｗａ及びＯｈｓｕｙｅ、１９９８；Ｋａｕｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、１９９９）。培養温度低下の最も明らかな結果は増殖率の即時低下であり、他の影響には代謝の低下（グルコース消費、酸素摂取、乳酸及びアンモニウム生成）及びせん断及びアポトーシスに対する耐性の増大がある（Ｃｈｕｐｐａ ｅｔ ａｌ．、１９９７；Ｆｕｒｕｋａｗａ及びＯｈｓｕｙｅ、１９９８；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．、１９９７；Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．、２００３ａ）。増殖率の低下は細胞周期のＧ１期中の細胞の蓄積と関連があり（Ｈｅｎｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．、２００１；Ｋａｕｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、１９９９；Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．、２００３ａ、ｂ）、Ｇ１期の抑制は生産性の増大と関連している（Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ、２００１）。

上記に挙げた理由のため、多くの細胞培養プロセスは二相培養を実施し、それによって細胞を３７℃で増殖させバイオマスを最大にし、次いで細胞を低温に移して、長期のより生存能力が高い静止期／生産期を維持しながらタンパク質生成を促進する（Ｆｏｇｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、２００４、２００５；Ｂｕｔｌｅｒ、２００５；Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．、２００４）。温度変化後に誘導される最も知られている２つのタンパク質は、低温誘導性ＲＮＡ結合タンパク質（ＣＲＩＰ）及びＲＭＢ３である。これらの中で、ＣＲＩＰは低温の条件下で増殖停止を引き起こすことが知られているが（Ｄａｎｎｏ ｅｔ ａｌ．、２０００；Ｎｉｓｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｓｏｎｎａ ｅｔ ａｌ．、２００２）、全体的には、哺乳動物細胞が低温にどのように応答するかについてはほとんど知られていない。

ｍｉＲＮＡは、翻訳のレベルで遺伝子発現を制御する低分子（約２２ｎｔ）非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）である。それぞれのｍｉＲＮＡが多数の遺伝子をおそらく制御し、数百のｍｉＲＮＡ遺伝子が哺乳動物内に存在すると予想される（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．２００３）。最初のｍｉＲＮＡは１９９３年にＣ．エレガンスにおいて発見され（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、１９９３）、最近数年間では、膨大な数のこれらの分子が存在することが明らかになっている（２％までのヒトゲノムがｍｉＲＮＡをコードする（Ｍｉｓｋａ、２００５））。近年ｍｉＲＮＡは、発生（Ａｍｂｒｏｓ、２００３；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、２００４）、細胞増殖及び細胞死（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．２００３）、アポトーシス及び脂肪代謝（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．２００３）、及び細胞分化（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００４）に重要であることが分かってきている。

発明の記述

本発明は、幾つかのｍｉＲＮＡ分子が、哺乳動物産生細胞の増殖周期の異なる段階で差次的に発現されるという発見に基づく。したがって本発明は、適切な一時的形式で（即ち、表１中に示すような）特異的ｍｉＲＮＡのレベルを増大又は低下させて細胞培養物の増殖を調節するための哺乳動物産生細胞の改変に関する。一実施形態では、ｍｉＲＮＡの発現を促進して細胞停止を促進する。この細胞停止は細胞周期のＧ１（増殖停止）期中の細胞の蓄積と関係があり、これは生産性の増大と関連がある。異なるが関連する実施形態では、培養の初期段階での特異的ｍｉＲＮＡの阻害又は機能低下を促進し、それによって増殖停止前のバイオマス生成を促進する。これには、短時間で多量の細胞の作業用ストックを生成する利点がある。一実施形態では、培養の初期段階に特異的ｍｉＲＮＡの阻害（又は抑制）を最初に促進し、次いで条件を変えて（即ち、ｍｉＲＮＡに関する一過的トランスフェクション、ｍｉＲＮＡをコードする核酸の発現を誘導することによって、又はリプレッサーの除去によって）細胞周期の増殖停止期中のｍｉＲＮＡのレベルの増大を引き起こす。これらの方法は、特に組換え型生物学的製剤、特に組換え型生物医薬品の製造における、哺乳動物産生細胞培養物の増殖及び使用において適用される。

本明細書では、用語「哺乳動物産生細胞」は、例えば生物医薬品などの組換え型生物学的製剤の製造において有用な哺乳動物細胞を意味するとして理解すべきである。このような細胞系の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞であり得る。

本発明によれば、組換え型生物学的製剤を製造する方法であって、哺乳動物産生細胞培養物を利用し、
（ａ）細胞培養の初期段階中に哺乳動物産生細胞のバイオマスを生成するステップと、
（ｂ）望ましい濃度の哺乳動物産生細胞を得た後に哺乳動物産生細胞内で表１の１つ又は複数のｍｉＲＮＡ分子のレベルの増大を引き起こすステップと
を含む方法を提供する。

当業者は、いつ望ましい濃度の哺乳動物産生細胞が得られるかを知っているはずである。一般に、これは細胞周期の増殖停止期、その開始時、又はその直前であるはずである。

典型的には、細胞は表１の１つ又は複数のｍｉＲＮＡ分子で一過的にトランスフェクトする。ｍｉＲＮＡ分子はｍｉＲＮＡ前駆体分子であることが適切であり、合成ｍｉＲＮＡ前駆体分子であることが理想的である。しかしながらｍｉＲＮＡ分子は、一次ｍｉＲＮＡ又は成熟ｍｉＲＮＡ分子であってよい。表１の一次、前駆体及び成熟ｍｉＲＮＡ分子の配列は、ｍｉＲＮＡ配列、標的及び遺伝子命名のデータベース、ＭＩＲＢａｓｅ、ｈｔｔｐ：ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋから入手可能である。

或いは、転写プロモーターの制御下で表１のｍｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターで細胞を一過的にトランスフェクトすることができる。典型的には、核酸配列は表１のｍｉＲＮＡ分子の前駆体をコードする。転写プロモーターは構成的プロモーター又は誘導性プロモーターであることが適切である。プロモーターは温度誘導性であることが理想的であり、温度が低下するときは二相細胞培養に移すことが理想的である。発現ベクターを使用する一過的トランスフェクションのこの方法によって、核酸配列は一次ｍｉＲＮＡ又は成熟ｍｉＲＮＡをコードすることもできるが、一般にベクターは、表１のｍｉＲＮＡ分子のいずれかの前駆体型をコードする。発現ベクターはプラスミド、又は線状核酸構築体、ＰＣＲ産物又は制限断片などであってよい。

本発明の一実施形態では、例えばＮｅｏＦｘ（Ａｍｂｉｏｎ Ｃａｔ：４５１１）などのリポソームベースの方法を使用してトランスフェクションを媒介する。しかしながら、例えばエレクトロポレーションを使用して媒介するトランスフェクション、又はリン酸カルシウムを使用して媒介するトランスフェクションなどの、トランスフェクションの他の方法は当業者には明らかであるはずである。

一過的トランスフェクションの代替として、その方法は誘導性プロモーターの制御下で細胞ゲノム中に安定的に組み込まれた表１のｍｉＲＮＡ分子のコード配列を有するように工学処理した細胞を利用することができ、このような場合、方法は一般に、増殖周期中の望ましい地点で、一般に細胞停止期の開始時又は直前（即ち、望ましい濃度の生存産生細胞を得たとき）にｍｉＲＮＡ分子の発現を誘導するステップを含む。典型的には、プロモーターは温度誘導性プロモーターである。このような状況では、３７°から３１°への温度の低下はｍｉＲＮＡ分子の発現を誘導するはずである。ｍｉＲＮＡ分子のコード配列は一次、前駆体、又は成熟型のｍｉＲＮＡをコードすることができ、一般にそれは前駆体型のｍｉＲＮＡ分子をコードするはずであり、前駆体は細胞の機構によって成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされるはずである。

本発明の一実施形態では、細胞中のｍｉＲＮＡのコード配列は増殖の初期段階中に適切なリプレッサーを使用して抑制し、次いで細胞中のｍｉＲＮＡのレベルを、増殖停止期又はその直前にリプレッサーを回収することによって増大させる。適切なプロモーター／リプレッサー対は当業者にはよく知られているはずである。

本発明の好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子はｈｓａ−ｍｉＲ−２１及びｈｓａ−ｍｉＲ−２４を含む群から選択される。

他の態様では本発明は、組換え型生物学的製剤を製造する方法であって、哺乳動物産生細胞培養物を利用し、培養の初期段階中、典型的には培養の初期段階の開始時に細胞内で表１の１つ又は複数のｍｉＲＮＡ分子の阻害剤のレベルを増大させるステップを含む方法も提供する。このような阻害剤の配列は、ｍｉＲＮＡ配列、標的及び遺伝子命名のデータベース、ＭＩＲＢａｓｅ、ｈｔｔｐ：ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋから入手可能である。

適切にはその方法は、誘導性プロモーターの制御下で細胞ゲノム中に安定的に組み込まれたｍｉＲＮＡ阻害剤分子のコード配列を有するように工学処理した細胞を利用し、培養の初期段階中、理想的には培養の初期段階の開始時にｍｉＲＮＡ阻害剤分子の発現を誘導するステップを含む。これは増殖停止前にバイオマス生成を促進する効果を有し、短時間で多量の細胞の作業用ストックを生成する利点がある。

発現のインデューサーの存在によって、発現を誘導することが適切である。或いは、阻害剤をコードする配列は抑制プロモーターの制御下に存在してよい。この場合、阻害剤は培養の初期段階中に自由に発現し、細胞周期の望ましい段階で、一般に細胞周期の増殖停止期の直前又は開始時に、リプレッサーを加えてｍｉＲＮＡ阻害剤の発現を阻害する。

適切な細胞のバイオマスを得た後に、ｍｉＲＮＡの阻害剤分子の発現の誘導を停止することが好ましい。

好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤分子は、以下の阻害剤ｈｓａ−ｍｉＲ−２１及びｈｓａ−ｍｉＲ−２４を含む群から選択される。

一実施形態では本発明は、哺乳動物産生細胞培養物を生成する方法であって、本発明に従って培養の初期段階中又はその開始時に細胞内で表１の１つ又は複数のｍｉＲＮＡ分子の阻害剤のレベルを増大させ、後に本発明に従って細胞周期の増殖停止期の開始時又は直前に細胞内で表１の１つ又は複数のｍｉＲＮＡ分子のレベルを増大させるステップを含む方法に関する。

典型的には本発明の方法は、ＣＨＯ−Ｋ１又はＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞又はＢＨＫ細胞などのＣＨＯ細胞の増殖及び使用における適用に適している。

本発明の方法の一実施形態では、増殖停止期は初期増殖期より低い培養温度で実施する。典型的には、初期増殖期は３７℃で実施する。適切には、増殖停止期は３１℃で実施する。

本発明はさらに、誘導性プロモーターの制御下で細胞のゲノム中に安定的に組み込まれた表１のｍｉＲＮＡ分子をコードする核酸を含む哺乳動物産生細胞に関する。核酸はｈｓａ−ｍｉＲ−２１及びｈｓａ−ｍｉＲ−２４を含む群から選択されるｍｉＲＮＡ分子をコードすることが好ましい。プロモーターは温度誘導性プロモーターであることが適切である。

代替的、又は追加的に、本発明の哺乳動物産生細胞は、誘導性プロモーターの制御下で細胞のゲノム中に安定的に組み込まれた表１のｍｉＲＮＡ分子の阻害剤をコードする核酸を含むことができる。核酸は、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１及びｈｓａ−ｍｉＲ−２４を含む群から選択されるｍｉＲＮＡ分子の阻害剤をコードすることが適切である。プロモーターは温度誘導性プロモーターであることが適切である。

典型的には、哺乳動物産生細胞は例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞又はＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞などのＣＨＯ細胞である。或いは、哺乳動物産生細胞はＢＨＫ細胞であってよい。これらの細胞は以下のカタログ照会番号：ＣＲＬ−１０１５４−ＣＨＯ ＤｕＫＸ；ＣＲＬ−９６１８−ＣＨＯＫ１；ＣＣＬ−１０−ＢＢＫ−２１でＬＧＣＰｒｏｔｏｃｈｅｍ−ａｔｃｃ ｏｆ Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ、イングランドから入手することができる。

したがって、本発明の哺乳動物産生細胞系は、増殖停止期又は増殖停止期の直前に（表１の）特異的ｍｉＲＮＡ分子を誘導的に発現して増殖停止期中に高レベルのｍｉＲＮＡ分子を生成するように遺伝子工学処理することができ、或いは細胞系は、細胞培養の初期段階中に表１のｍｉＲＮＡ分子の阻害剤を誘導的に発現するように工学処理することができ、或いは細胞系は両方を行うように、即ち培養の初期段階中にｍｉＲＮＡ分子の阻害剤を発現し、したがって細胞停止期中にｍｉＲＮＡ分子を発現するように工学処理することができる。

本発明の方法及び細胞系において、発現の制御は誘導性プロモーターを使用し、次いで必要に応じて培養ブロスにインデューサーを添加又は除去することによって、実施することができることは理解されるはずである。当業者は、本発明の方法及び生成物は、構成的プロモーターを使用し発現のリプレッサーの使用により発現を制御することによって、制御することも可能であることを理解しているはずである。したがって本明細書では、用語「誘導性プロモーター」を使用する場合、構成的プロモーターを代替として使用することが可能であり、本発明の展望を得るのに必要とされる方法及び哺乳動物産生細胞系の改変は、当業者には明らかであることを理解されたい。

本発明は、組換え型生物学的製剤を製造するのに有用なキットであって、（ａ）哺乳動物産生細胞系、（ｂ）表１のｍｉＲＮＡ分子で細胞をトランスフェクトするための手段、及び／又は（ｃ）表１のｍｉＲＮＡ分子の１つの阻害剤で細胞をトランスフェクトするための手段を含むキットも提供する。トランスフェクション手段は一過的又は安定的であってよく、（ａ）合成ｍｉＲＮＡ分子（又は阻害剤）及び（ｂ）ｍｉＲＮＡ分子をコードする（又はｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする）核酸の一方又は両方を細胞に導入するステップを含む。

温度変化を組み込んだ培養（Ａ）及び３７℃の一定温度で培養した細胞に関する１×１０^５細胞／ｍｌで接種した後のＣＨＯ−Ｋ１バッチ培養の生存細胞数を示す図である。それぞれの場合、接種後７２時間と１４４時間で三連の生物サンプルをスピナーフラスコから得た（矢印によって示した）。 低分子ＲＮＡ種の収率及び完全性を示す、ＴＳサンプルから抽出したＲＮＡの１５％変性アクリルアミドゲル分析を示す図である。 合計６個のＣＨＯ−Ｋｌサンプルの教師なしクラスタリング分析が、指数関数的（３７℃）サンプルと休止状態（３１℃）サンプルを区別するサンプルの２つの主なクラスターをもたらすことを示す図である。クラスターツリー構造の先端から、サンプル１（ＴＳｄ３Ａ）及びサンプル５（ＴＳｄ６Ｂ）は異常値であることが分かるのは明らかである。それぞれのｍｉＲＮＡの相対的発現は、低（青色）発現から高（赤色）発現の範囲の色によって表す。相対的発現の範囲線はクラスターの下に示す。 成熟ｍｉＲＮＡの検出及び定量化のためのＡｍｂｉｏｎ ｑＲＴ−ＰＣＲ法の概略を示す図である。このイメージはＡｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．からの厚意で使用している。

発明の詳細な説明

材料及び方法
細胞系及び細胞培養
懸濁液に適合させたＣＨＯ−Ｋ１細胞をこの試験では使用した。培養培地は、１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）を補充したＡＴＣＣ培地（グルタミン及びピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２ Ｈａｍｓ；Ｓｉｇｍａ）からなっていた。細胞は２５０ｍＬスピナー容器（Ｔｅｃｈｎｅ）中に、必要に応じて３７℃又は３１℃のインキュベーター中のスピナープラットホームに６０ｒｐｍで維持した。バッチ培養の実験用に、指数関数的に増殖する細胞を、１００ｍＬの最終体積でスピナー容器中に１×１０^５細胞／ｍＬで接種した。全ての培養物に圧縮空気（Ａｉｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を毎日約１分間供給した。細胞数を２４時間毎に得て、細胞濃度は血球計を使用して測定し、生存細胞はトリパンブルー排除法を使用して死細胞と区別した。温度変化と３７℃での連続バッチ培養の両方に関して、三連のスピナー容器を７２時間と１４４時間でのサンプリングに利用した。

ＲＮＡのサンプリング及び抽出
サンプリング時に、細胞ペレットをＰＢＳ中で２回洗浄し、ＭｉＲＶａｎａ抽出キット（Ａｍｂｉｏｎ）中に与えられた溶解／結合溶液を使用して溶解した。これらの溶解物は抽出に必要とされるまで−８０℃で保存した。有機及びカラム系の方法による抽出は、製造者の説明書によって概説されたのと同様であった。ＲＮＡの質は、Ａｇｉｌｅｎｔ ６０００ナノチップと１５％変性アクリルアミドゲル電気泳動の両方を使用することによって決定した。ＲＮＡの定量化はＮａｎｏｄｒｏｐ（ＮＤ−１０００；Ｌａｂｔｅｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して実施した。

ＭｉＲＮＡバイオアレイ分析
ミクロＲＮＡプロファイリング試験用のサンプルは、Ａｓｕｒａｇｅｎにより、その会社の標準作業手順に従って処理された。ミクロＲＮＡ濃縮分画は、１０μｇの合計ＲＮＡをｆｌａｓｈＰＡＧＥ（商標）分留装置（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）に通すことによって得て、ｆｌａｓｈＰＡＧＥ反応クリーンアップキット（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用してクリーニング及び濃縮した。ＲＮＡ分子の３’末端に尾部を付け、製造者の説明書に従いｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ標識キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用して標識した。アミン修飾ヌクレオチドをポリ（Ａ）ポリメラーゼ媒介尾部付加反応中に取り込ませ、Ｃｙ５スクシンイミドエステル（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）をミクロＲＮＡ上のアミン部分と結合させた。ｍｉｒＶａｎａｍｉＲＮＡバイオアレイ（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）とのハイブリダイゼーションは、ｍｉｒＶａｎａｍｉＲＮＡバイオアレイ必須キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用して実施した。アレイ上のＣｙ５蛍光は、ＧｅｎｅＰｉｘ ４２００ＡＬスキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して６３５ｎｍの励起波長でスキャンした。プローブ及び局所バックグラウンドと関係がある蛍光シグナルを、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ（バージョン６．０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して抽出した。

閾値及びシグナルスケーリングを、ミクロＲＮＡ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐｒｅｍｉｕｍ分析（ｍｉＳＳＰパッケージ）の一部として実施されたのと同様に、Ａｓｕｒａｇｅｎによって選択されたアルゴリズムを使用して作成した。ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏによって生成したバックグラウンド調節した蛍光値を、Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．、２００２により記載された変動安定化変換法を使用してそれぞれのミクロＲＮＡに関して標準化した。実験設計中の群の数に応じた一元配置ＡＮＯＶＡ又はｔ−検定による仮説検定。

複数群の比較用に、我々は一元配置ＡＮＯＶＡ（分散分析）モデルを使用して、群間に差がないことを述べる帰無仮説を試験する。その目的は、全群中で同じ発現レベルを有する遺伝子を除去することである。

ペアワイズ比較を、ＡＮＯＶＡによって同定した差次的に発現される遺伝子に実施して、それらの遺伝子が互いにどのように異なるかを確認する。処理した各ペアに関して、２サンプルのｔ−検定を各遺伝子に実施し、５％のＦＤＲを使用するＢｅｎｊａｍｉｎｉ及びＨｏｃｈｂｅｒｇ（１９９５）によって記載されたのと同様のステップアップ手法を使用して、多重比較補正を続けて偽発見率（ＦＤＲ）を制御する。この方法は「保護型最小有意差法（ＬＳＤ）」と呼ばれる。詳細なｍｉＲＮＡの一覧及び倍数変化及びｐ値などの関連情報を報告する。

培養１４４時間での温度変化ＣＨＯ−Ｋ１細胞と、３７℃で指数関数的に増殖するＣＨＯ−Ｋ１細胞のＭｉＲＮＡプロファイリングによって、有意に異なるものとして２６のｍｉＲＮＡを同定した（表１）。

表１．

前述の成熟ｍｉＲＮＡの転写産物の配列は、以下の配列表中に示す。前述のｍｉＲＮＡの一次及び前駆体転写産物の配列は、ｍｉＲＮＡ配列、標的及び遺伝子命名のデータベース、ＭＩＲＢａｓｅ、ｈｔｔｐ：ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋから得ることができる。そのデータベースの中身及び使用はＧｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．の論文中で説明されている。

本発明の方法中で利用するｍｉＲＮＡ阻害剤の配列は、ｈｔｔｐ：／ｍｉｃｒｏｍａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／．で入手可能な表１の成熟ｍｉＲＮＡの正確なアンチセンス配列である。２’Ｏｍｅ修飾及び３’Ｃ３含有アミノリンカーを有するように阻害剤を修飾する（Ａｎｇｉｅ Ｍ．Ｃｈｅｎｇ、Ｍｉｋｅ Ｗ．Ｂｙｒｏｍ、Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｓｈｅｌｔｏｎ及びＬａｎｃｅ Ｐ．Ｆｏｒｄ^＊「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｉＲＮＡｓ ａｎｄ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｎ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｉＲＮＡ ｉｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００５ ３３（４）：１２９０〜１２９７）。

ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−２４ｍｉＲＮＡの阻害剤は、カタログ照会番号ＡＭ１０２０６（ｍｉＲ−２１）及びＡＭ１０７３７（ｍｉＲ−２４）でＡｍｂｉｏｎから市販されている。

特異的ｍｉＲＮＡを検出及び定量化するために、ｍｉＲＶａｎａ ｑＲＴＰＣＲ ｍｉＲＮＡ検出キット及びプライマーセットを製造者の説明書に従い使用した。いずれの場合も、ＳｕｐｅｒＴａｑ（Ａｍｂｉｏｎ）を重合反応に使用した。ＳＹＢＲグリーン及びＲＯＸ標準化色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して検出及び標準化を容易にした。ＲＴ反応とＰＣＲ反応の両方を、ＡＢＩ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して実施した。生物学的な再現結果は、スチューデントのｔ−検定及び０．０５のｐカットオフ値を使用して統計的有意性に関して調べた。

ハツカネズミ、ドブネズミ及びホモサピエンス由来のプレ−ｍｉＲ２１配列と隣接する、対応するゲノム領域のアラインメントに基づいて、モンゴルキヌゲネズミのｍｉＲ−２１をクローニングするためにプライマーを設計した。使用したプライマーは５’ａｔｇｔｔｔｇｃｔｔｔｇｃｔｔｔａａａｃｃｃｔｇｃｃｔｇａｇｃａ３’及び５’ｃｔｇｃａａａｃｃａｔｇａｔｇｃｔｇｇｇｔａａｔｇｔｔｔｇａ３’であった。ゲノムＤＮＡは約５×１０^６個のＣＨＯ−Ｋ１細胞から抽出し（全血抽出キット、Ｎｕｃｌｅｏｎ）、１００ｕｌの水に溶解した。１．５ｕｌ（約１００ｎｇ）のＤＮＡをＰＣＲ用の鋳型として使用した。反応混合物は４００ｎＭの各プライマー、１ｕｌのＤＭＳＯ及び２０．５ｕｌのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）も含んでいた。サイクル条件は９５℃で３分、９４℃で３０秒、５３℃で３０秒及び７２℃で４５秒を３０サイクル、その後７２℃で７分であった。ＰＣＲ産物はアガロースゲル上で適切な長さ（約２２０ｂｐ）の特異的バンドに関して調べ、混合物の残りは配列決定用にクリーンアップした（Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキット）。配列決定はクローニングプライマー（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を使用して両鎖に対して実施した。

結果
細胞培養
懸濁液に適合させたＣＨＯ−Ｋ１細胞をスピナーフラスコ（サプライヤー）中に１×１０^５細胞／ｍＬで接種し、３７℃で６日間、又は３７℃で３日間、次にさらに３日間３１℃の温度変化のいずれかで培養した。図１中に見ることができるように、温度変化させた細胞は対数増殖がすぐに止まり、１．６７×１０^６±０．１５細胞／ｍｌのピークの生存細胞密度を超えず、一方３７℃で培養した細胞はさらに２４時間対数増殖が続き、２．０２×１０^６±０．１１細胞／ｍｌの平均ピークの生存細胞密度を得た。ＲＮＡ及びタンパク質抽出用に、７２時間と１４４時間で細胞をサンプリングした。細胞ペレットをＰＢＳ中で２回洗浄し、ｍｉＲＶａｎａ溶解／結合バッファー中ですぐに溶解し、ＡｍｂｉｏｎのｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ単離キットを使用して抽出するまで−８０℃で保存した。

全てのＲＮＡはいずれもＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用してＱＣ’ｄし、低分子ＲＮＡ種の存在及び完全性は、１５％変性ポリアクリルアミドゲル上での視覚化によって確認した（図２）。

ｍｉＲＮＡバイオアレイ分析
第３日（ＴＳｄ３）及び第６日（ＴＳｄ６）に単離した全てのＲＮＡの三連の生物サンプルは、７２時間で３１℃に移した細胞から抽出し、後にｍｉＲＮＡバイオアレイ分析に使用した。

ｍｉＲＮＡバイオアレイを標識したモンゴルキヌゲネズミのＲＮＡでプローブ処理すると、平均細胞存在率は領域内で２７．３％（±４．８）であった、これは２６．９％（±５．７）の平均細胞存在率を有していたヒト細胞系ＲＮＡに都合良く匹敵する。ＣＨＯ−Ｋ１のＲＮＡでプローブ処理したアレイからの平均蛍光シグナルは、ヒト細胞のデータ（２９６．６±７１．５）に匹敵した３０６．４±５５．２の蛍光単位であった。発現データの教師なしクラスタリング分析は、別個の亜集団として集めたＣＨＯ−Ｋ１サンプルは、非ハムスター対照として分析中に含めた６個のヒト細胞系に分かれることを明らかにした（データ示さず）。ＣＨＯ−Ｋｌサンプル内の教師なしクラスタリングは、指数関数的３７℃サンプルと３１℃で増殖した休止期のサンプルの分離をもたらした（図３）。亜集団内では、スピナーサンプル１（ＴＳｄ３Ａ）及び５（ＴＳｄ６Ｂ）は異常値であり、それはおそらく、これらのアレイと関係がある全体の低い中央フォアグラウンド読み取り値及び低い細胞存在率による標識及び／又はハイブリダイゼーションの人為的結果であることは明らかである。これは後の分析ステップの重要な品質管理測定基準である。

全サンプルを分析するための材料及び方法中に概説した統計的方法を使用して、７２時間（ＴＳｄ３）サンプルと１４４時間（ＴＳｄ６）サンプルの間で２６個のｍｉＲＮＡは統計上異なる（ｐ≦０．０５）と考えられることが分かった（表１）。

１４４時間３７℃で培養したＣＨＯ−Ｋ１細胞由来のＣＨＯ−Ｋ１の全ＲＮＡにおける特異的ｍｉＲＮＡ発現の定量ＱＲＴ−ＰＣＲ分析物を第３日（３７ｄ３）及び第６日（３７ｄ６）にサンプリングし（図１ｂ）、第３日に温度変化を組み込んだ細胞由来のＲＮＡ（ＴＳｄ３及びＴＳｄ６）は、バイオアレイ分析から選択した標的のｑＲＴ−ＰＣＲ分析用に使用した。最初の実験は、反応当たり２．５ｎｇのＲＮＡを使用して最適な結果を得ることができ、５Ｓ内因性対照の場合ＰＣＲ−プライマーの１／１０希釈を使用することを示した。５Ｓ ＲＮＡは増殖期又は培養温度と無関係に全サンプルにおいて同等のレベルで発現されたことが示され、これは図２中の品質管理分析と一致する。ｍｉＲＮＡ用ｑＲＴ−ＰＣＲ反応の原理は、特異的ｍｉＲＮＡの３’末端に特異的な専有ＲＴ−プライマーを利用し、次いでＲＴ−反応ステップ中にＡｒｒａｙＳｃｒｉｐｔ（商標）酵素によって特異的ｍｉＲＮＡをミクロｃＤＮＡに延長する。ｑＰＣＲステップはｉｎ−ｓｉｔｕで実施し、５’ｍｉＲＮＡ特異的プライマー及び原型ＲＴ−プライマーの共通３’末端を標的化する３’共通プライマーを使用する（図４）。したがって、これは個々の成熟ｍｉＲＮＡを増幅する非常に特異的な手段である。

バイオアレイ及びｑ−ＲＴ−ＰＣＲを使用して検出したｍｉＲＮＡが実際、バイオアレイにおいてヒト及びマウスｍｉＲＮＡの真のハムスターオルソログであったことを保証するため、クローニング及び配列決定用に代表的なｍｉＲＮＡを選択した（ｍｉＲ−２１）。以下の表２中に見ることができるように、成熟ｍｉＲ−２１は全種中で保存されており、その配列は利用可能であるが、前駆体配列全体はラットの配列と完全に同一である。

表２．

Ａ．ＣＨＯ−Ｋ１ｃｇｒ−ｍｉＲ−２１配列並びにマウス（ｍｍｕ−）、ラット（ｒｎｏ−）、ヒト（ｈｓａ−）及びウシ（ｂｔａ−）ｍｉＲ−２１の配列のアラインメント。ＣＨＯ配列は、Ｓａｎｇｅｒ ｍｉＲＮＡ貯蔵所（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／）において公開されたｒｎｏ−ｍｉＲ−２１の配列と同一である。
Ｂ．赤で強調表示したｃｇｒ−ｍｉＲ２１及び成熟ｍｉＲＮＡの予想ステムループ構造。

考察
図１中に示すように、培養温度を低下させることは細胞増殖に対して即効性があり、培養の１４４時間後に、３１℃における細胞は安定した生存細胞数を維持し、一方３７℃で培養した細胞は後期静止期／死期に突入していることも見ることができる。温度変化後に観察した代謝活性、せん断感受性及びアポトーシス率の低下により、組換えタンパク質生成におけるその使用が促進された（Ｆｏｇｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、２００４；Ｆｏｇｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、２００５；Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．、２００４）。

培養１４４時間での温度変化ＣＨＯ−Ｋ１細胞と、３７℃で指数関数的に増殖するＣＨＯ−Ｋ１細胞のｍｉＲＮＡプロファイリングによって、有意に異なるものとして２６のｍｉＲＮＡを同定した（表１）。ＣＨＯ−Ｋ１のＲＮＡの全体のプロファイリング分析は、Ａｍｂｉｏｎバイオアレイが細胞存在率及び平均スポット強度に基づくＣＨＯプロファイリングに適していることを明らかに実証した。ＣＨＯ−Ｋ１のプロファイルを６個のヒト細胞系と比較したとき、ＣＨＯ−Ｋ１はそれらが発現するｍｉＲＮＡのプロファイルが独自に異なることを明らかに観察した。ｑＲＴ−ＰＣＲによる有効性確認試験は、ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−２４は非温度依存形式で、バッチ試験の最後にＣＨＯ−Ｋ１細胞において有意に上方制御されることが分かったことを示した。バイオアレイで同定した個々のｍｉＲＮＡの相対的発現レベルはｑＲＴ−ＰＣＲのデータによって反映され、バイオアレイに対する定量的及び定性的態様が示された。

ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−２４と増殖阻害の関係は、両方のｍｉＲＮＡが休止細胞中で増大し、この系においてｍｉＲ−２１はアポトーシスを制御する際の重要な要因ではない可能性があるという、ここで観察した結果と一致している。この研究室での予備的分析は、ｍｉＲ−２１のレベルは３１℃で連続的に培養した細胞中で増大し、再度これは緩慢な増殖と関係があることを示している。

前の実施例において、本出願人は、低下した培養温度又は栄養制限及び老廃物蓄積が原因である通常静止期の増殖のいずれかによる、増殖停止時のチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）における幾つかのｍｉＲＮＡの増大した発現を確認している。成熟ｍｉＲ−２１は調べた哺乳動物種全体で完全に保存されているという検証によって、成熟ｍｉＲＮＡは哺乳動物細胞系中で大部分は保存されているという理論が確かなものとなる。これによって、人工哺乳動物（例えば、ネズミ又はヒト）ｍｉＲＮＡ前駆体分子（Ａｍｂｉｏｎから市販されているＣａｔ：１７１００）を使用して特異的ｍｉＲＮＡを過剰発現させるため、或いは特異的ｍｉＲＮＡ阻害剤分子（Ａｍｂｉｏｎから市販されているＣａｔ：１７０００）を使用してｍｉＲＮＡの作用を阻害するためのＣＨＯ細胞の改変が可能となる。生物医薬品の効率の良い製造は一般に、十分なバイオマスを生成するための３７℃での初期増殖期、次に低い培養温度での生成期を有する二相培養を利用するので、本出願人は、表１のｍｉＲＮＡ分子、及び／又はｍｉＲＮＡ分子の阻害剤を利用して、特に組換え型生物医薬品の製造における、ＣＨＯ細胞培養物の効率の良い増殖及び使用に必要な条件を作製すること、又は既存の条件を拡大することができることを提唱する。

ケース１：ＣＨＯ増殖を阻害するためのｍｉＲＮＡの一過的トランスフェクション
十分なバイオマスを得た後に（通常は約８０％の最大生存細胞密度で得る）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＬＧＳＰｒｏｔｏｃｈｅｍ−ａｔｃｃカタログ照会番号：ＣＲＬ−９６１８−ＣＨＯＫ１）に導入する合成ｍｉＲＮＡ前駆体分子ｍｉＲ−２１（表１）（Ａｍｂｉｏｎ Ｃａｔ：１７１００）を使用して、培養中のＣＨＯ細胞の挙動を改変する。このトランスフェクションの目的は、温度変化を必要とせずに増殖を阻害すること、及び／又は同時に表１の特異的ｍｉＲＮＡを（単独又は組合せで）一過的にトランスフェクトすることによって培養温度を低下させる有益な効果を高めることである。トランスフェクションはＮｅｏＦｘ（Ａｍｂｉｏｎ Ｃａｔ：４５１１）を含めた従来のリポソームベースの方法によって媒介される。使用する方法は製造者の説明書に従う。

ケース２：ＣＨＯ増殖を阻害するためのｍｉＲＮＡコード配列の一過的発現
十分なバイオマスを得た後に（通常は約８０％の最大生存細胞密度で得る）細胞に導入する、発現ベクター（Ａｍｂｉｏｎ Ｃａｔ：５７７５、５７７７、５７７９）中の合成ｍｉＲＮＡコード配列（又はＰＣＲ反応から若しくは制限断片として得た直鎖状発現分子）を使用して、培養中のＣＨＯの挙動を改変する。これらの発現構築体は少なくとも以下の構成要素、転写プロモーター（構成的又は誘導性、ウイルス、哺乳動物又は他の起源のもの）及びｍｉＲＮＡ前駆体分子をコードする配列を含む。利用したｐＳＩＬＥＮＣＥＲ発現カセットは、高レベルの発現を誘導するための修飾ＲＮＡｐｏｌＩＩ型ＣＭＶプロモーター及び最適ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む。これは広範囲の細胞における高発現を容易にする。このトランスフェクションの目的は、温度変化を必要とせずに増殖を阻害すること、及び／又は同時に表１の特異的ｍｉＲＮＡを（単独又は組合せで）トランスフェクトすることによって培養温度を低下させる有益な効果を高めることである。トランスフェクションはリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ）を含めた従来のリポソームベースの方法によって媒介される。使用する方法は製造者の説明書に従う。

ケース３：ＣＨＯ増殖を阻害するためのｍｉＲＮＡコード配列の安定的発現
誘導性プロモーター、ＭＴの制御下で細胞ゲノム中に安定的に組み込まれた表１のｍｉＲ−２１又はｍｉＲ−２４ｍｉＲＮＡのコード配列を有する、新規のＣＨＯベースの細胞系を生成する。このプロモーターは特異的シグナルを得てプロモーター（即ちＺｎＳＯ_４）が活性化するまで不活性である、これらのシグナルを得た後、次いでプロモーターの制御下で任意のコード配列が転写される。

方法は市販の発現系（Ａｍｂｉｏｎ Ｃａｔ：５７７５、５７７７、５７７９）由来のｍｉＲＮＡコード配列の、誘導系、例えばｐＣｙｔＴＳ（Ｃｙｔｏｓ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）へのサブクローニングを含む。他の考えられる発現系は、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（登録商標）系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）又はｐＳＵＰＥＲＩＯＲ（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ）（これは誘導性プロモーターを含むようにＡｍｂｉｏｎベクターを改変することによって得ることもできる）である。これらの新たな発現系を、製造者の説明書に従い、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの従来のリポソームベースのトランスフェクション試薬を使用してＣＨＯ細胞にトランスフェクトする。適切な選択剤を用いた選択を使用して均一なクローン集団を単離した後、培養温度が低下するまで、新たな細胞系を指数関数的増殖で正常に増殖させる。この場合、ｍｉＲＮＡの発現は１００μＭのレベルでＺｎＳＯ_４を加えることによって誘導する。或いは、温度誘導性プロモーターの場合、単なる温度変化が増殖阻害ｍｉＲＮＡの増大した発現による一層の増殖停止をもたらす（表１）。一般に、他の誘導性プロモーターの場合、プロモーターは培養ブロスへの刺激／リプレッサー分子（例えばテトラサイクリン）の添加又はそれらの回収によって活性化される。したがってこれらの新たな細胞系は、治療目的で組換え糖タンパク質を発現させるための他の改変に理想的に利用可能である。

ケース４：ＣＨＯ増殖を促進するためのｍｉＲＮＡコード配列の安定的発現
温度誘導性プロモーター又は他の様々な誘導性プロモーターのいずれかの制御下で表１に挙げるｍｉＲＮＡを標的化する阻害剤配列を有する、新規のＣＨＯベースの細胞系を作製する。方法は市販の発現系（Ａｍｂｉｏｎ Ｃａｔ：５７７５、５７７７、５７７９）由来のｍｉＲＮＡ阻害剤コード配列の、誘導系、例えばｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（登録商標）系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）又はｐＳＵＰＥＲＩＯＲ（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ）（これは誘導性プロモーターを含むようにＡｍｂｉｏｎベクターを改変することによって得ることもできる）へのサブクローニングを含む。これらの新たな発現系を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの従来のリポソームベースのトランスフェクション試薬を使用してＣＨＯ細胞にトランスフェクトする。適切な選択剤を使用して均一なクローン集団を単離した後、培養温度が低下し、インデューサーを回収し／リプレッサーを加えるまで、新たな細胞系はインデューサー／リプレッサー（例えばテトラサイクリン）の存在／不在下における３７℃での指数関数的増殖中に加速度的に増殖する。この時点で、阻害剤の発現は止まる。阻害剤を回収した後、これによって特異的ｍｉＲＮＡの発現、増殖阻害、したがって改善された生成が可能となる。この系を設計して、培養の初期での増大したバイオマス生成を可能にすることによって生産性を増大させ、したがって通常の形式での静止期の生成を容易にする。したがってこれらの新たな細胞系は、治療目的で組換え糖タンパク質を発現させるための他の改変に理想的に利用可能である。

ケース５ リサーチツール
前のケース３及び４で生成した安定した細胞系は、特異的ｍｉＲＮＡの発現／阻害によって影響を受ける標的分子及び経路の同定によって、技術研究者には重大な関心事となる。ＭｉＲＮＡは特異的タンパク質の翻訳を妨げることによって作用し、したがって２Ｄゲル電気泳動などの方法を使用して、特異的タンパク質の発現又は阻害後に差次的に発現されるタンパク質、したがって標的を同定することができる。これは、細胞系の工学処理、及びプロセス設計、例えば培地配合中の特異的阻害剤分子の封入のための合理的設計手法を容易にする可能性がある。

本発明は本明細書で前に記載した実施形態に限られず、それらは本発明の精神から逸脱せずに構造及び詳細を変化させることができる。この点において、本発明の主な記述は組換え型生物学的製剤を製造する方法に関するものである一方で、哺乳動物産生細胞培養物を生成する方法において、それらの方法を同様に利用することができる。

Claims (33)

1. 組換え型生物学的製剤を製造する方法であって、哺乳動物産生細胞培養物を利用し、前記哺乳動物産生細胞培養物を改変して増殖周期中の前記細胞培養物内の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを調節するステップを含む方法。
2. 組換え型生物学的製剤を製造する方法であって、哺乳動物産生細胞培養物を利用し、
   （ａ）細胞培養の初期段階の開始時又は初期段階中に哺乳動物産生細胞のバイオマスを生成するステップと、
   （ｂ）望ましい濃度の哺乳動物産生細胞を得た後に哺乳動物産生細胞内で表１の１つ又は複数のｍｉＲＮＡ分子のレベルの増大を引き起こすステップと、を含む方法。
3. 表１の１つ又は複数のｍｉＲＮＡ分子で哺乳動物産生細胞を一過的にトランスフェクトする、請求項１又は２に記載の方法。
4. ｍｉＲＮＡ分子が合成ｍｉＲＮＡ前駆体分子である、請求項３に記載の方法。
5. リポソーム送達、エレクトロポレーション、又はリン酸カルシウムを使用してトランスフェクションを媒介する、請求項３又は４に記載の方法。
6. 転写プロモーターの制御下で表１のｍｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターで細胞を一過的にトランスフェクトする、請求項１又は２に記載の方法。
7. 核酸配列が表１のｍｉＲＮＡ分子の前駆体をコードする、請求項６に記載の方法。
8. 転写プロモーターが構成的プロモーター又は誘導性プロモーターである、請求項６又は７に記載の方法。
9. 誘導性プロモーターの制御下で細胞ゲノム中に安定的に組み込まれた表１のｍｉＲＮＡ分子又は分子の前駆体のコード配列を有するように工学処理した哺乳動物産生細胞を利用し、細胞周期の増殖停止期の開始時又は直前にｍｉＲＮＡ分子の発現を誘導するステップを含む、請求項１又は２に記載の方法。
10. プロモーターが温度誘導性プロモーターである、請求項９に記載の方法。
11. ｍｉＲＮＡ分子がｈｓａ−ｍｉＲ−２１及びｈｓａ−ｍｉＲ−２４を含む群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 培養の初期段階の開始時又は初期段階中に哺乳動物産生細胞内で表１の１つ又は複数のｍｉＲＮＡ分子の阻害剤のレベルを増大させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
13. 少なくとも１つのｍｉＲＮＡが表１の一次、前駆体、又は成熟ｍｉＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
14. 誘導性プロモーターの制御下で細胞ゲノム中に安定的に組み込まれた阻害剤のコード配列を有するように工学処理した哺乳動物産生細胞を利用し、培養の初期段階の開始時又は初期段階中に阻害剤分子の発現を誘導するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
15. 発現のインデューサーの存在によって、又は発現のリプレッサーの不在によって発現を誘導する、請求項１４に記載の方法。
16. 適切な細胞のバイオマスを得た後、ｍｉＲＮＡの阻害剤分子の発現の誘導を停止する、請求項１４又は１５に記載の方法。
17. 培養の初期段階の開始時又は初期段階中に細胞内で表１の１つ又は複数のｍｉＲＮＡ分子の阻害剤のレベルを増大させ、後に細胞周期の増殖停止期の前又は増殖停止期の最中に細胞内で表１の１つ又は複数のｍｉＲＮＡ分子のレベルを増大させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
18. 細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. ＣＨＯ細胞がＣＨＯ−Ｋ１又はＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞である、請求項１８に記載の方法。
20. 増殖停止期を初期増殖期より低い培養温度で実施する、請求項２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 初期増殖期を３７℃で実施する、請求項２０に記載の方法。
22. 増殖停止期を３１℃で実施する、請求項２０又は２１に記載の方法。
23. 誘導性プロモーターの制御下で細胞のゲノム中に安定的に組み込まれた（一次、前駆体、又は成熟型の）表１のｍｉＲＮＡ分子をコードする核酸を含む哺乳動物産生細胞。
24. 核酸がｈｓａ−ｍｉＲ−２１及びｈｓａ−ｍｉＲ−２４を含む群から選択されるｍｉＲＮＡ分子をコードする、請求項２３に記載の哺乳動物産生細胞。
25. プロモーターが温度誘導性プロモーターである、請求項２３又は２４に記載の哺乳動物産生細胞。
26. 誘導性プロモーターの制御下で細胞のゲノム中に安定的に組み込まれた表１のｍｉＲＮＡ分子の阻害剤をコードする核酸を含む哺乳動物産生細胞。
27. 核酸がｈｓａ−ｍｉＲ−２１及びｈｓａ−ｍｉＲ−２４を含む群から選択されるｍｉＲＮＡ分子の阻害剤をコードする、請求項２６に記載の哺乳動物産生細胞。
28. プロモーターが温度誘導性プロモーターである、請求項２５又は２６に記載の哺乳動物産生細胞。
29. ＣＨＯ細胞又はＢＨＫ細胞である、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の哺乳動物産生細胞。
30. ＣＨＯ−Ｋ１細胞又はＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞である、請求項２９に記載の哺乳動物産生細胞。
31. 組換え型生物学的製剤を製造するのに有用なキットであって、（ａ）哺乳動物産生細胞系、（ｂ）（一次、前駆体、又は成熟型の）表１のｍｉＲＮＡ分子で前記細胞系の細胞をトランスフェクトするための手段、及び／又は（ｃ）表１のｍｉＲＮＡ分子の阻害剤で前記細胞系の細胞をトランスフェクトするための手段を含むキット。
32. 細胞をトランスフェクトするための手段が、細胞を一過的又は安定的にトランスフェクトするための手段を含む、請求項３０に記載のキット。
33. 一過的トランスフェクションが（ａ）合成ｍｉＲＮＡ分子及び（ｂ）ｍｉＲＮＡ分子をコードする核酸の一方又は両方を細胞に導入するステップを含む、請求項３２に記載のキット。