JP2009545309A - 組換え型生物学的製剤を製造する方法 - Google Patents

組換え型生物学的製剤を製造する方法 Download PDF

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Abstract

組換え型生物学的製剤を製造する方法であって、哺乳動物産生細胞培養物を利用する方法は、細胞培養の初期段階中に哺乳動物産生細胞のバイオマスを生成するステップと、望ましい濃度の哺乳動物産生細胞を得た後に哺乳動物産生細胞内で表1の1つ又は複数のmiRNA分子のレベルの増大を引き起こすステップとを含む。この方法は、培養の初期段階の開始時又は初期段階中に哺乳動物産生細胞内で表1の1つ又は複数のmiRNA分子の阻害剤のレベルを増大させるステップを含むこともできる。
【選択図】なし

Description

本発明は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞培養物を生成するための方法、及びCHO細胞培養物を使用して組換え型生物医薬品を製造する方法に関する。本発明は組換え型CHO細胞系にも関する。
発明の背景
チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)は、莫大な歳入を占める製薬学的用途及びCHO変異体に関するプロセス用の組換え型タンパク質を製造するために最も広く使用されている細胞系である(Andersen及びKrummen、2002)。ゲノムが完全に配列決定されていないにもかかわらず、幾つかの重要なCHOの転写プロファイリング研究が、非CHOアレイ(Baik et al.、2006)又は専有CHOcDNAアレイ(Wong et al.、2006)のいずれかを使用して実施されてきている。これらの研究は、CHO培養中の低温とアポトーシスの誘導の両方の影響を記載している。同様に、幾つかのプロテオーム研究は、CHOのプロテオーム及び温度などの培養条件に応じたタンパク質発現の変化を調べている(Baik et al.、2006;Champion et al.、1999;Van Dyk et al.2003;Kaufmann et al.、1999 Lee et al.、2003)。これらの研究により、CHO機能の制御及び特に低温の影響に関する全体的な理解が高まっている。
組換え生成CHO細胞系の低温培養は、製品品質の基準を維持しながら(Fogolin et al.、2005;Yoon et al.、2003b)、持続的生存能力及び増大した特異的生産性をもたらすことが示されてきている(Al−Fageeh et al.、2006;Fogolin et al.、2004;Furukawa及びOhsuye、1998;Kaufmann et al.、1999)。培養温度低下の最も明らかな結果は増殖率の即時低下であり、他の影響には代謝の低下(グルコース消費、酸素摂取、乳酸及びアンモニウム生成)及びせん断及びアポトーシスに対する耐性の増大がある(Chuppa et al.、1997;Furukawa及びOhsuye、1998;Moore et al.、1997;Yoon et al.、2003a)。増殖率の低下は細胞周期のG1期中の細胞の蓄積と関連があり(Hendrick et al.、2001;Kaufmann et al.、1999;Yoon et al.、2003a、b)、G1期の抑制は生産性の増大と関連している(Fussenegger、2001)。
上記に挙げた理由のため、多くの細胞培養プロセスは二相培養を実施し、それによって細胞を37℃で増殖させバイオマスを最大にし、次いで細胞を低温に移して、長期のより生存能力が高い静止期/生産期を維持しながらタンパク質生成を促進する(Fogolin et al.、2004、2005;Butler、2005;Fox et al.、2004)。温度変化後に誘導される最も知られている2つのタンパク質は、低温誘導性RNA結合タンパク質(CRIP)及びRMB3である。これらの中で、CRIPは低温の条件下で増殖停止を引き起こすことが知られているが(Danno et al.、2000;Nishiyama et al.、1997、Sonna et al.、2002)、全体的には、哺乳動物細胞が低温にどのように応答するかについてはほとんど知られていない。
miRNAは、翻訳のレベルで遺伝子発現を制御する低分子(約22nt)非コードRNA(ncRNA)である。それぞれのmiRNAが多数の遺伝子をおそらく制御し、数百のmiRNA遺伝子が哺乳動物内に存在すると予想される(Lim et al.2003)。最初のmiRNAは1993年にC.エレガンスにおいて発見され(Lee et al.、1993)、最近数年間では、膨大な数のこれらの分子が存在することが明らかになっている(2%までのヒトゲノムがmiRNAをコードする(Miska、2005))。近年miRNAは、発生(Ambros、2003;Chen et al.、2004)、細胞増殖及び細胞死(Brennecke et al.2003)、アポトーシス及び脂肪代謝(Xu et al.2003)、及び細胞分化(Chang et al.2004)に重要であることが分かってきている。
発明の記述
本発明は、幾つかのmiRNA分子が、哺乳動物産生細胞の増殖周期の異なる段階で差次的に発現されるという発見に基づく。したがって本発明は、適切な一時的形式で(即ち、表1中に示すような)特異的miRNAのレベルを増大又は低下させて細胞培養物の増殖を調節するための哺乳動物産生細胞の改変に関する。一実施形態では、miRNAの発現を促進して細胞停止を促進する。この細胞停止は細胞周期のG1(増殖停止)期中の細胞の蓄積と関係があり、これは生産性の増大と関連がある。異なるが関連する実施形態では、培養の初期段階での特異的miRNAの阻害又は機能低下を促進し、それによって増殖停止前のバイオマス生成を促進する。これには、短時間で多量の細胞の作業用ストックを生成する利点がある。一実施形態では、培養の初期段階に特異的miRNAの阻害(又は抑制)を最初に促進し、次いで条件を変えて(即ち、miRNAに関する一過的トランスフェクション、miRNAをコードする核酸の発現を誘導することによって、又はリプレッサーの除去によって)細胞周期の増殖停止期中のmiRNAのレベルの増大を引き起こす。これらの方法は、特に組換え型生物学的製剤、特に組換え型生物医薬品の製造における、哺乳動物産生細胞培養物の増殖及び使用において適用される。
本明細書では、用語「哺乳動物産生細胞」は、例えば生物医薬品などの組換え型生物学的製剤の製造において有用な哺乳動物細胞を意味するとして理解すべきである。このような細胞系の例は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又は仔ハムスター腎臓(BHK)細胞であり得る。
本発明によれば、組換え型生物学的製剤を製造する方法であって、哺乳動物産生細胞培養物を利用し、
(a)細胞培養の初期段階中に哺乳動物産生細胞のバイオマスを生成するステップと、
(b)望ましい濃度の哺乳動物産生細胞を得た後に哺乳動物産生細胞内で表1の1つ又は複数のmiRNA分子のレベルの増大を引き起こすステップと
を含む方法を提供する。
当業者は、いつ望ましい濃度の哺乳動物産生細胞が得られるかを知っているはずである。一般に、これは細胞周期の増殖停止期、その開始時、又はその直前であるはずである。
典型的には、細胞は表1の1つ又は複数のmiRNA分子で一過的にトランスフェクトする。miRNA分子はmiRNA前駆体分子であることが適切であり、合成miRNA前駆体分子であることが理想的である。しかしながらmiRNA分子は、一次miRNA又は成熟miRNA分子であってよい。表1の一次、前駆体及び成熟miRNA分子の配列は、miRNA配列、標的及び遺伝子命名のデータベース、MIRBase、http:microrna.sanger.ac.ukから入手可能である。
或いは、転写プロモーターの制御下で表1のmiRNA分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターで細胞を一過的にトランスフェクトすることができる。典型的には、核酸配列は表1のmiRNA分子の前駆体をコードする。転写プロモーターは構成的プロモーター又は誘導性プロモーターであることが適切である。プロモーターは温度誘導性であることが理想的であり、温度が低下するときは二相細胞培養に移すことが理想的である。発現ベクターを使用する一過的トランスフェクションのこの方法によって、核酸配列は一次miRNA又は成熟miRNAをコードすることもできるが、一般にベクターは、表1のmiRNA分子のいずれかの前駆体型をコードする。発現ベクターはプラスミド、又は線状核酸構築体、PCR産物又は制限断片などであってよい。
本発明の一実施形態では、例えばNeoFx(Ambion Cat:4511)などのリポソームベースの方法を使用してトランスフェクションを媒介する。しかしながら、例えばエレクトロポレーションを使用して媒介するトランスフェクション、又はリン酸カルシウムを使用して媒介するトランスフェクションなどの、トランスフェクションの他の方法は当業者には明らかであるはずである。
一過的トランスフェクションの代替として、その方法は誘導性プロモーターの制御下で細胞ゲノム中に安定的に組み込まれた表1のmiRNA分子のコード配列を有するように工学処理した細胞を利用することができ、このような場合、方法は一般に、増殖周期中の望ましい地点で、一般に細胞停止期の開始時又は直前(即ち、望ましい濃度の生存産生細胞を得たとき)にmiRNA分子の発現を誘導するステップを含む。典型的には、プロモーターは温度誘導性プロモーターである。このような状況では、37°から31°への温度の低下はmiRNA分子の発現を誘導するはずである。miRNA分子のコード配列は一次、前駆体、又は成熟型のmiRNAをコードすることができ、一般にそれは前駆体型のmiRNA分子をコードするはずであり、前駆体は細胞の機構によって成熟miRNAにプロセシングされるはずである。
本発明の一実施形態では、細胞中のmiRNAのコード配列は増殖の初期段階中に適切なリプレッサーを使用して抑制し、次いで細胞中のmiRNAのレベルを、増殖停止期又はその直前にリプレッサーを回収することによって増大させる。適切なプロモーター/リプレッサー対は当業者にはよく知られているはずである。
本発明の好ましい実施形態では、miRNA分子はhsa−miR−21及びhsa−miR−24を含む群から選択される。
他の態様では本発明は、組換え型生物学的製剤を製造する方法であって、哺乳動物産生細胞培養物を利用し、培養の初期段階中、典型的には培養の初期段階の開始時に細胞内で表1の1つ又は複数のmiRNA分子の阻害剤のレベルを増大させるステップを含む方法も提供する。このような阻害剤の配列は、miRNA配列、標的及び遺伝子命名のデータベース、MIRBase、http:microrna.sanger.ac.ukから入手可能である。
適切にはその方法は、誘導性プロモーターの制御下で細胞ゲノム中に安定的に組み込まれたmiRNA阻害剤分子のコード配列を有するように工学処理した細胞を利用し、培養の初期段階中、理想的には培養の初期段階の開始時にmiRNA阻害剤分子の発現を誘導するステップを含む。これは増殖停止前にバイオマス生成を促進する効果を有し、短時間で多量の細胞の作業用ストックを生成する利点がある。
発現のインデューサーの存在によって、発現を誘導することが適切である。或いは、阻害剤をコードする配列は抑制プロモーターの制御下に存在してよい。この場合、阻害剤は培養の初期段階中に自由に発現し、細胞周期の望ましい段階で、一般に細胞周期の増殖停止期の直前又は開始時に、リプレッサーを加えてmiRNA阻害剤の発現を阻害する。
適切な細胞のバイオマスを得た後に、miRNAの阻害剤分子の発現の誘導を停止することが好ましい。
好ましい実施形態では、miRNA阻害剤分子は、以下の阻害剤hsa−miR−21及びhsa−miR−24を含む群から選択される。
一実施形態では本発明は、哺乳動物産生細胞培養物を生成する方法であって、本発明に従って培養の初期段階中又はその開始時に細胞内で表1の1つ又は複数のmiRNA分子の阻害剤のレベルを増大させ、後に本発明に従って細胞周期の増殖停止期の開始時又は直前に細胞内で表1の1つ又は複数のmiRNA分子のレベルを増大させるステップを含む方法に関する。
典型的には本発明の方法は、CHO−K1又はCHO−DUKX細胞又はBHK細胞などのCHO細胞の増殖及び使用における適用に適している。
本発明の方法の一実施形態では、増殖停止期は初期増殖期より低い培養温度で実施する。典型的には、初期増殖期は37℃で実施する。適切には、増殖停止期は31℃で実施する。
本発明はさらに、誘導性プロモーターの制御下で細胞のゲノム中に安定的に組み込まれた表1のmiRNA分子をコードする核酸を含む哺乳動物産生細胞に関する。核酸はhsa−miR−21及びhsa−miR−24を含む群から選択されるmiRNA分子をコードすることが好ましい。プロモーターは温度誘導性プロモーターであることが適切である。
代替的、又は追加的に、本発明の哺乳動物産生細胞は、誘導性プロモーターの制御下で細胞のゲノム中に安定的に組み込まれた表1のmiRNA分子の阻害剤をコードする核酸を含むことができる。核酸は、hsa−miR−21及びhsa−miR−24を含む群から選択されるmiRNA分子の阻害剤をコードすることが適切である。プロモーターは温度誘導性プロモーターであることが適切である。
典型的には、哺乳動物産生細胞は例えばCHO−K1細胞又はCHO−DUKX細胞などのCHO細胞である。或いは、哺乳動物産生細胞はBHK細胞であってよい。これらの細胞は以下のカタログ照会番号:CRL−10154−CHO DuKX;CRL−9618−CHOK1;CCL−10−BBK−21でLGCProtochem−atcc of Middlesex、イングランドから入手することができる。
したがって、本発明の哺乳動物産生細胞系は、増殖停止期又は増殖停止期の直前に(表1の)特異的miRNA分子を誘導的に発現して増殖停止期中に高レベルのmiRNA分子を生成するように遺伝子工学処理することができ、或いは細胞系は、細胞培養の初期段階中に表1のmiRNA分子の阻害剤を誘導的に発現するように工学処理することができ、或いは細胞系は両方を行うように、即ち培養の初期段階中にmiRNA分子の阻害剤を発現し、したがって細胞停止期中にmiRNA分子を発現するように工学処理することができる。
本発明の方法及び細胞系において、発現の制御は誘導性プロモーターを使用し、次いで必要に応じて培養ブロスにインデューサーを添加又は除去することによって、実施することができることは理解されるはずである。当業者は、本発明の方法及び生成物は、構成的プロモーターを使用し発現のリプレッサーの使用により発現を制御することによって、制御することも可能であることを理解しているはずである。したがって本明細書では、用語「誘導性プロモーター」を使用する場合、構成的プロモーターを代替として使用することが可能であり、本発明の展望を得るのに必要とされる方法及び哺乳動物産生細胞系の改変は、当業者には明らかであることを理解されたい。
本発明は、組換え型生物学的製剤を製造するのに有用なキットであって、(a)哺乳動物産生細胞系、(b)表1のmiRNA分子で細胞をトランスフェクトするための手段、及び/又は(c)表1のmiRNA分子の1つの阻害剤で細胞をトランスフェクトするための手段を含むキットも提供する。トランスフェクション手段は一過的又は安定的であってよく、(a)合成miRNA分子(又は阻害剤)及び(b)miRNA分子をコードする(又はmiRNA阻害剤をコードする)核酸の一方又は両方を細胞に導入するステップを含む。
温度変化を組み込んだ培養(A)及び37℃の一定温度で培養した細胞に関する1×10細胞/mlで接種した後のCHO−K1バッチ培養の生存細胞数を示す図である。それぞれの場合、接種後72時間と144時間で三連の生物サンプルをスピナーフラスコから得た(矢印によって示した)。 低分子RNA種の収率及び完全性を示す、TSサンプルから抽出したRNAの15%変性アクリルアミドゲル分析を示す図である。 合計6個のCHO−Klサンプルの教師なしクラスタリング分析が、指数関数的(37℃)サンプルと休止状態(31℃)サンプルを区別するサンプルの2つの主なクラスターをもたらすことを示す図である。クラスターツリー構造の先端から、サンプル1(TSd3A)及びサンプル5(TSd6B)は異常値であることが分かるのは明らかである。それぞれのmiRNAの相対的発現は、低(青色)発現から高(赤色)発現の範囲の色によって表す。相対的発現の範囲線はクラスターの下に示す。 成熟miRNAの検出及び定量化のためのAmbion qRT−PCR法の概略を示す図である。このイメージはAmbion Inc.からの厚意で使用している。
発明の詳細な説明
材料及び方法
細胞系及び細胞培養
懸濁液に適合させたCHO−K1細胞をこの試験では使用した。培養培地は、10%ウシ胎児血清(Sigma)を補充したATCC培地(グルタミン及びピルビン酸ナトリウムを含むDMEM/F−12 Hams;Sigma)からなっていた。細胞は250mLスピナー容器(Techne)中に、必要に応じて37℃又は31℃のインキュベーター中のスピナープラットホームに60rpmで維持した。バッチ培養の実験用に、指数関数的に増殖する細胞を、100mLの最終体積でスピナー容器中に1×10細胞/mLで接種した。全ての培養物に圧縮空気(Air Products)を毎日約1分間供給した。細胞数を24時間毎に得て、細胞濃度は血球計を使用して測定し、生存細胞はトリパンブルー排除法を使用して死細胞と区別した。温度変化と37℃での連続バッチ培養の両方に関して、三連のスピナー容器を72時間と144時間でのサンプリングに利用した。
RNAのサンプリング及び抽出
サンプリング時に、細胞ペレットをPBS中で2回洗浄し、MiRVana抽出キット(Ambion)中に与えられた溶解/結合溶液を使用して溶解した。これらの溶解物は抽出に必要とされるまで−80℃で保存した。有機及びカラム系の方法による抽出は、製造者の説明書によって概説されたのと同様であった。RNAの質は、Agilent 6000ナノチップと15%変性アクリルアミドゲル電気泳動の両方を使用することによって決定した。RNAの定量化はNanodrop(ND−1000;Labtech.International)を使用して実施した。
MiRNAバイオアレイ分析
ミクロRNAプロファイリング試験用のサンプルは、Asuragenにより、その会社の標準作業手順に従って処理された。ミクロRNA濃縮分画は、10μgの合計RNAをflashPAGE(商標)分留装置(Ambion、Inc.、Austin、TX)に通すことによって得て、flashPAGE反応クリーンアップキット(Ambion、Inc.、Austin、TX)を使用してクリーニング及び濃縮した。RNA分子の3’末端に尾部を付け、製造者の説明書に従いmirVana(商標)miRNA標識キット(Ambion、Inc.、Austin、TX)を使用して標識した。アミン修飾ヌクレオチドをポリ(A)ポリメラーゼ媒介尾部付加反応中に取り込ませ、Cy5スクシンイミドエステル(Amersham Biosciences(GE Healthcare)、Piscataway、NJ)をミクロRNA上のアミン部分と結合させた。mirVanamiRNAバイオアレイ(Ambion、Inc.、Austin、TX)とのハイブリダイゼーションは、mirVanamiRNAバイオアレイ必須キット(Ambion、Inc.、Austin、TX)を使用して実施した。アレイ上のCy5蛍光は、GenePix 4200ALスキャナー(Molecular Devices、Union City、CA)を使用して635nmの励起波長でスキャンした。プローブ及び局所バックグラウンドと関係がある蛍光シグナルを、GenePix Pro(バージョン6.0、Molecular Devices、Union City、CA)を使用して抽出した。
閾値及びシグナルスケーリングを、ミクロRNA Standard Service Premium分析(miSSPパッケージ)の一部として実施されたのと同様に、Asuragenによって選択されたアルゴリズムを使用して作成した。GenePix Proによって生成したバックグラウンド調節した蛍光値を、Huber et al.、2002により記載された変動安定化変換法を使用してそれぞれのミクロRNAに関して標準化した。実験設計中の群の数に応じた一元配置ANOVA又はt−検定による仮説検定。
複数群の比較用に、我々は一元配置ANOVA(分散分析)モデルを使用して、群間に差がないことを述べる帰無仮説を試験する。その目的は、全群中で同じ発現レベルを有する遺伝子を除去することである。
ペアワイズ比較を、ANOVAによって同定した差次的に発現される遺伝子に実施して、それらの遺伝子が互いにどのように異なるかを確認する。処理した各ペアに関して、2サンプルのt−検定を各遺伝子に実施し、5%のFDRを使用するBenjamini及びHochberg(1995)によって記載されたのと同様のステップアップ手法を使用して、多重比較補正を続けて偽発見率(FDR)を制御する。この方法は「保護型最小有意差法(LSD)」と呼ばれる。詳細なmiRNAの一覧及び倍数変化及びp値などの関連情報を報告する。
培養144時間での温度変化CHO−K1細胞と、37℃で指数関数的に増殖するCHO−K1細胞のMiRNAプロファイリングによって、有意に異なるものとして26のmiRNAを同定した(表1)。

表1.
前述の成熟miRNAの転写産物の配列は、以下の配列表中に示す。前述のmiRNAの一次及び前駆体転写産物の配列は、miRNA配列、標的及び遺伝子命名のデータベース、MIRBase、http:microrna.sanger.ac.ukから得ることができる。そのデータベースの中身及び使用はGriffiths−Jones et al.の論文中で説明されている。
本発明の方法中で利用するmiRNA阻害剤の配列は、http:/microma.sanger.ac.uk/sequences/.で入手可能な表1の成熟miRNAの正確なアンチセンス配列である。2’Ome修飾及び3’C3含有アミノリンカーを有するように阻害剤を修飾する(Angie M.Cheng、Mike W.Byrom、Jeffrey Shelton及びLance P.Ford「Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis」Nucleic Acids Research 2005 33(4):1290〜1297)。
miR−21及びmiR−24miRNAの阻害剤は、カタログ照会番号AM10206(miR−21)及びAM10737(miR−24)でAmbionから市販されている。
特異的miRNAを検出及び定量化するために、miRVana qRTPCR miRNA検出キット及びプライマーセットを製造者の説明書に従い使用した。いずれの場合も、SuperTaq(Ambion)を重合反応に使用した。SYBRグリーン及びROX標準化色素(Invitrogen)を使用して検出及び標準化を容易にした。RT反応とPCR反応の両方を、ABI7500リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems、Foster City、CA)を使用して実施した。生物学的な再現結果は、スチューデントのt−検定及び0.05のpカットオフ値を使用して統計的有意性に関して調べた。
ハツカネズミ、ドブネズミ及びホモサピエンス由来のプレ−miR21配列と隣接する、対応するゲノム領域のアラインメントに基づいて、モンゴルキヌゲネズミのmiR−21をクローニングするためにプライマーを設計した。使用したプライマーは5’atgtttgctttgctttaaaccctgcctgagca3’及び5’ctgcaaaccatgatgctgggtaatgtttga3’であった。ゲノムDNAは約5×10個のCHO−K1細胞から抽出し(全血抽出キット、Nucleon)、100ulの水に溶解した。1.5ul(約100ng)のDNAをPCR用の鋳型として使用した。反応混合物は400nMの各プライマー、1ulのDMSO及び20.5ulのPlatinum Supermix(lnvitrogen)も含んでいた。サイクル条件は95℃で3分、94℃で30秒、53℃で30秒及び72℃で45秒を30サイクル、その後72℃で7分であった。PCR産物はアガロースゲル上で適切な長さ(約220bp)の特異的バンドに関して調べ、混合物の残りは配列決定用にクリーンアップした(Qiagen PCRクリーンアップキット)。配列決定はクローニングプライマー(MWG Biotech、ドイツ)を使用して両鎖に対して実施した。
結果
細胞培養
懸濁液に適合させたCHO−K1細胞をスピナーフラスコ(サプライヤー)中に1×10細胞/mLで接種し、37℃で6日間、又は37℃で3日間、次にさらに3日間31℃の温度変化のいずれかで培養した。図1中に見ることができるように、温度変化させた細胞は対数増殖がすぐに止まり、1.67×10±0.15細胞/mlのピークの生存細胞密度を超えず、一方37℃で培養した細胞はさらに24時間対数増殖が続き、2.02×10±0.11細胞/mlの平均ピークの生存細胞密度を得た。RNA及びタンパク質抽出用に、72時間と144時間で細胞をサンプリングした。細胞ペレットをPBS中で2回洗浄し、miRVana溶解/結合バッファー中ですぐに溶解し、AmbionのmirVana miRNA単離キットを使用して抽出するまで−80℃で保存した。
全てのRNAはいずれもAgilent Bioanalyzerを使用してQC’dし、低分子RNA種の存在及び完全性は、15%変性ポリアクリルアミドゲル上での視覚化によって確認した(図2)。
miRNAバイオアレイ分析
第3日(TSd3)及び第6日(TSd6)に単離した全てのRNAの三連の生物サンプルは、72時間で31℃に移した細胞から抽出し、後にmiRNAバイオアレイ分析に使用した。
miRNAバイオアレイを標識したモンゴルキヌゲネズミのRNAでプローブ処理すると、平均細胞存在率は領域内で27.3%(±4.8)であった、これは26.9%(±5.7)の平均細胞存在率を有していたヒト細胞系RNAに都合良く匹敵する。CHO−K1のRNAでプローブ処理したアレイからの平均蛍光シグナルは、ヒト細胞のデータ(296.6±71.5)に匹敵した306.4±55.2の蛍光単位であった。発現データの教師なしクラスタリング分析は、別個の亜集団として集めたCHO−K1サンプルは、非ハムスター対照として分析中に含めた6個のヒト細胞系に分かれることを明らかにした(データ示さず)。CHO−Klサンプル内の教師なしクラスタリングは、指数関数的37℃サンプルと31℃で増殖した休止期のサンプルの分離をもたらした(図3)。亜集団内では、スピナーサンプル1(TSd3A)及び5(TSd6B)は異常値であり、それはおそらく、これらのアレイと関係がある全体の低い中央フォアグラウンド読み取り値及び低い細胞存在率による標識及び/又はハイブリダイゼーションの人為的結果であることは明らかである。これは後の分析ステップの重要な品質管理測定基準である。
全サンプルを分析するための材料及び方法中に概説した統計的方法を使用して、72時間(TSd3)サンプルと144時間(TSd6)サンプルの間で26個のmiRNAは統計上異なる(p≦0.05)と考えられることが分かった(表1)。
144時間37℃で培養したCHO−K1細胞由来のCHO−K1の全RNAにおける特異的miRNA発現の定量QRT−PCR分析物を第3日(37d3)及び第6日(37d6)にサンプリングし(図1b)、第3日に温度変化を組み込んだ細胞由来のRNA(TSd3及びTSd6)は、バイオアレイ分析から選択した標的のqRT−PCR分析用に使用した。最初の実験は、反応当たり2.5ngのRNAを使用して最適な結果を得ることができ、5S内因性対照の場合PCR−プライマーの1/10希釈を使用することを示した。5S RNAは増殖期又は培養温度と無関係に全サンプルにおいて同等のレベルで発現されたことが示され、これは図2中の品質管理分析と一致する。miRNA用qRT−PCR反応の原理は、特異的miRNAの3’末端に特異的な専有RT−プライマーを利用し、次いでRT−反応ステップ中にArrayScript(商標)酵素によって特異的miRNAをミクロcDNAに延長する。qPCRステップはin−situで実施し、5’miRNA特異的プライマー及び原型RT−プライマーの共通3’末端を標的化する3’共通プライマーを使用する(図4)。したがって、これは個々の成熟miRNAを増幅する非常に特異的な手段である。
バイオアレイ及びq−RT−PCRを使用して検出したmiRNAが実際、バイオアレイにおいてヒト及びマウスmiRNAの真のハムスターオルソログであったことを保証するため、クローニング及び配列決定用に代表的なmiRNAを選択した(miR−21)。以下の表2中に見ることができるように、成熟miR−21は全種中で保存されており、その配列は利用可能であるが、前駆体配列全体はラットの配列と完全に同一である。

表2.
A.CHO−K1cgr−miR−21配列並びにマウス(mmu−)、ラット(rno−)、ヒト(hsa−)及びウシ(bta−)miR−21の配列のアラインメント。CHO配列は、Sanger miRNA貯蔵所(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)において公開されたrno−miR−21の配列と同一である。
B.赤で強調表示したcgr−miR21及び成熟miRNAの予想ステムループ構造。
考察
図1中に示すように、培養温度を低下させることは細胞増殖に対して即効性があり、培養の144時間後に、31℃における細胞は安定した生存細胞数を維持し、一方37℃で培養した細胞は後期静止期/死期に突入していることも見ることができる。温度変化後に観察した代謝活性、せん断感受性及びアポトーシス率の低下により、組換えタンパク質生成におけるその使用が促進された(Fogolin et al.、2004;Fogolin et al.、2005;Fox et al.、2004)。
培養144時間での温度変化CHO−K1細胞と、37℃で指数関数的に増殖するCHO−K1細胞のmiRNAプロファイリングによって、有意に異なるものとして26のmiRNAを同定した(表1)。CHO−K1のRNAの全体のプロファイリング分析は、Ambionバイオアレイが細胞存在率及び平均スポット強度に基づくCHOプロファイリングに適していることを明らかに実証した。CHO−K1のプロファイルを6個のヒト細胞系と比較したとき、CHO−K1はそれらが発現するmiRNAのプロファイルが独自に異なることを明らかに観察した。qRT−PCRによる有効性確認試験は、miR−21及びmiR−24は非温度依存形式で、バッチ試験の最後にCHO−K1細胞において有意に上方制御されることが分かったことを示した。バイオアレイで同定した個々のmiRNAの相対的発現レベルはqRT−PCRのデータによって反映され、バイオアレイに対する定量的及び定性的態様が示された。
miR−21及びmiR−24と増殖阻害の関係は、両方のmiRNAが休止細胞中で増大し、この系においてmiR−21はアポトーシスを制御する際の重要な要因ではない可能性があるという、ここで観察した結果と一致している。この研究室での予備的分析は、miR−21のレベルは31℃で連続的に培養した細胞中で増大し、再度これは緩慢な増殖と関係があることを示している。
前の実施例において、本出願人は、低下した培養温度又は栄養制限及び老廃物蓄積が原因である通常静止期の増殖のいずれかによる、増殖停止時のチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)における幾つかのmiRNAの増大した発現を確認している。成熟miR−21は調べた哺乳動物種全体で完全に保存されているという検証によって、成熟miRNAは哺乳動物細胞系中で大部分は保存されているという理論が確かなものとなる。これによって、人工哺乳動物(例えば、ネズミ又はヒト)miRNA前駆体分子(Ambionから市販されているCat:17100)を使用して特異的miRNAを過剰発現させるため、或いは特異的miRNA阻害剤分子(Ambionから市販されているCat:17000)を使用してmiRNAの作用を阻害するためのCHO細胞の改変が可能となる。生物医薬品の効率の良い製造は一般に、十分なバイオマスを生成するための37℃での初期増殖期、次に低い培養温度での生成期を有する二相培養を利用するので、本出願人は、表1のmiRNA分子、及び/又はmiRNA分子の阻害剤を利用して、特に組換え型生物医薬品の製造における、CHO細胞培養物の効率の良い増殖及び使用に必要な条件を作製すること、又は既存の条件を拡大することができることを提唱する。
ケース1:CHO増殖を阻害するためのmiRNAの一過的トランスフェクション
十分なバイオマスを得た後に(通常は約80%の最大生存細胞密度で得る)、CHO−K1細胞(LGSProtochem−atccカタログ照会番号:CRL−9618−CHOK1)に導入する合成miRNA前駆体分子miR−21(表1)(Ambion Cat:17100)を使用して、培養中のCHO細胞の挙動を改変する。このトランスフェクションの目的は、温度変化を必要とせずに増殖を阻害すること、及び/又は同時に表1の特異的miRNAを(単独又は組合せで)一過的にトランスフェクトすることによって培養温度を低下させる有益な効果を高めることである。トランスフェクションはNeoFx(Ambion Cat:4511)を含めた従来のリポソームベースの方法によって媒介される。使用する方法は製造者の説明書に従う。
ケース2:CHO増殖を阻害するためのmiRNAコード配列の一過的発現
十分なバイオマスを得た後に(通常は約80%の最大生存細胞密度で得る)細胞に導入する、発現ベクター(Ambion Cat:5775、5777、5779)中の合成miRNAコード配列(又はPCR反応から若しくは制限断片として得た直鎖状発現分子)を使用して、培養中のCHOの挙動を改変する。これらの発現構築体は少なくとも以下の構成要素、転写プロモーター(構成的又は誘導性、ウイルス、哺乳動物又は他の起源のもの)及びmiRNA前駆体分子をコードする配列を含む。利用したpSILENCER発現カセットは、高レベルの発現を誘導するための修飾RNApolII型CMVプロモーター及び最適SV40ポリアデニル化シグナルを含む。これは広範囲の細胞における高発現を容易にする。このトランスフェクションの目的は、温度変化を必要とせずに増殖を阻害すること、及び/又は同時に表1の特異的miRNAを(単独又は組合せで)トランスフェクトすることによって培養温度を低下させる有益な効果を高めることである。トランスフェクションはリポフェクタミン2000(Invirogen)を含めた従来のリポソームベースの方法によって媒介される。使用する方法は製造者の説明書に従う。
ケース3:CHO増殖を阻害するためのmiRNAコード配列の安定的発現
誘導性プロモーター、MTの制御下で細胞ゲノム中に安定的に組み込まれた表1のmiR−21又はmiR−24miRNAのコード配列を有する、新規のCHOベースの細胞系を生成する。このプロモーターは特異的シグナルを得てプロモーター(即ちZnSO)が活性化するまで不活性である、これらのシグナルを得た後、次いでプロモーターの制御下で任意のコード配列が転写される。
方法は市販の発現系(Ambion Cat:5775、5777、5779)由来のmiRNAコード配列の、誘導系、例えばpCytTS(Cytos biotechnology)へのサブクローニングを含む。他の考えられる発現系は、complete control(登録商標)系(Stratagene)又はpSUPERIOR(Oligoengine)(これは誘導性プロモーターを含むようにAmbionベクターを改変することによって得ることもできる)である。これらの新たな発現系を、製造者の説明書に従い、リポフェクタミン2000(Invitrogen)などの従来のリポソームベースのトランスフェクション試薬を使用してCHO細胞にトランスフェクトする。適切な選択剤を用いた選択を使用して均一なクローン集団を単離した後、培養温度が低下するまで、新たな細胞系を指数関数的増殖で正常に増殖させる。この場合、miRNAの発現は100μMのレベルでZnSOを加えることによって誘導する。或いは、温度誘導性プロモーターの場合、単なる温度変化が増殖阻害miRNAの増大した発現による一層の増殖停止をもたらす(表1)。一般に、他の誘導性プロモーターの場合、プロモーターは培養ブロスへの刺激/リプレッサー分子(例えばテトラサイクリン)の添加又はそれらの回収によって活性化される。したがってこれらの新たな細胞系は、治療目的で組換え糖タンパク質を発現させるための他の改変に理想的に利用可能である。
ケース4:CHO増殖を促進するためのmiRNAコード配列の安定的発現
温度誘導性プロモーター又は他の様々な誘導性プロモーターのいずれかの制御下で表1に挙げるmiRNAを標的化する阻害剤配列を有する、新規のCHOベースの細胞系を作製する。方法は市販の発現系(Ambion Cat:5775、5777、5779)由来のmiRNA阻害剤コード配列の、誘導系、例えばcomplete control(登録商標)系(Stratagene)又はpSUPERIOR(Oligoengine)(これは誘導性プロモーターを含むようにAmbionベクターを改変することによって得ることもできる)へのサブクローニングを含む。これらの新たな発現系を、リポフェクタミン2000(Invitrogen)などの従来のリポソームベースのトランスフェクション試薬を使用してCHO細胞にトランスフェクトする。適切な選択剤を使用して均一なクローン集団を単離した後、培養温度が低下し、インデューサーを回収し/リプレッサーを加えるまで、新たな細胞系はインデューサー/リプレッサー(例えばテトラサイクリン)の存在/不在下における37℃での指数関数的増殖中に加速度的に増殖する。この時点で、阻害剤の発現は止まる。阻害剤を回収した後、これによって特異的miRNAの発現、増殖阻害、したがって改善された生成が可能となる。この系を設計して、培養の初期での増大したバイオマス生成を可能にすることによって生産性を増大させ、したがって通常の形式での静止期の生成を容易にする。したがってこれらの新たな細胞系は、治療目的で組換え糖タンパク質を発現させるための他の改変に理想的に利用可能である。
ケース5 リサーチツール
前のケース3及び4で生成した安定した細胞系は、特異的miRNAの発現/阻害によって影響を受ける標的分子及び経路の同定によって、技術研究者には重大な関心事となる。MiRNAは特異的タンパク質の翻訳を妨げることによって作用し、したがって2Dゲル電気泳動などの方法を使用して、特異的タンパク質の発現又は阻害後に差次的に発現されるタンパク質、したがって標的を同定することができる。これは、細胞系の工学処理、及びプロセス設計、例えば培地配合中の特異的阻害剤分子の封入のための合理的設計手法を容易にする可能性がある。
本発明は本明細書で前に記載した実施形態に限られず、それらは本発明の精神から逸脱せずに構造及び詳細を変化させることができる。この点において、本発明の主な記述は組換え型生物学的製剤を製造する方法に関するものである一方で、哺乳動物産生細胞培養物を生成する方法において、それらの方法を同様に利用することができる。

Claims (33)

  1. 組換え型生物学的製剤を製造する方法であって、哺乳動物産生細胞培養物を利用し、前記哺乳動物産生細胞培養物を改変して増殖周期中の前記細胞培養物内の少なくとも1つのmiRNAのレベルを調節するステップを含む方法。
  2. 組換え型生物学的製剤を製造する方法であって、哺乳動物産生細胞培養物を利用し、
    (a)細胞培養の初期段階の開始時又は初期段階中に哺乳動物産生細胞のバイオマスを生成するステップと、
    (b)望ましい濃度の哺乳動物産生細胞を得た後に哺乳動物産生細胞内で表1の1つ又は複数のmiRNA分子のレベルの増大を引き起こすステップと、を含む方法。
  3. 表1の1つ又は複数のmiRNA分子で哺乳動物産生細胞を一過的にトランスフェクトする、請求項1又は2に記載の方法。
  4. miRNA分子が合成miRNA前駆体分子である、請求項3に記載の方法。
  5. リポソーム送達、エレクトロポレーション、又はリン酸カルシウムを使用してトランスフェクションを媒介する、請求項3又は4に記載の方法。
  6. 転写プロモーターの制御下で表1のmiRNA分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターで細胞を一過的にトランスフェクトする、請求項1又は2に記載の方法。
  7. 核酸配列が表1のmiRNA分子の前駆体をコードする、請求項6に記載の方法。
  8. 転写プロモーターが構成的プロモーター又は誘導性プロモーターである、請求項6又は7に記載の方法。
  9. 誘導性プロモーターの制御下で細胞ゲノム中に安定的に組み込まれた表1のmiRNA分子又は分子の前駆体のコード配列を有するように工学処理した哺乳動物産生細胞を利用し、細胞周期の増殖停止期の開始時又は直前にmiRNA分子の発現を誘導するステップを含む、請求項1又は2に記載の方法。
  10. プロモーターが温度誘導性プロモーターである、請求項9に記載の方法。
  11. miRNA分子がhsa−miR−21及びhsa−miR−24を含む群から選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 培養の初期段階の開始時又は初期段階中に哺乳動物産生細胞内で表1の1つ又は複数のmiRNA分子の阻害剤のレベルを増大させるステップを含む、請求項1に記載の方法。
  13. 少なくとも1つのmiRNAが表1の一次、前駆体、又は成熟miRNAである、請求項1に記載の方法。
  14. 誘導性プロモーターの制御下で細胞ゲノム中に安定的に組み込まれた阻害剤のコード配列を有するように工学処理した哺乳動物産生細胞を利用し、培養の初期段階の開始時又は初期段階中に阻害剤分子の発現を誘導するステップを含む、請求項12に記載の方法。
  15. 発現のインデューサーの存在によって、又は発現のリプレッサーの不在によって発現を誘導する、請求項14に記載の方法。
  16. 適切な細胞のバイオマスを得た後、miRNAの阻害剤分子の発現の誘導を停止する、請求項14又は15に記載の方法。
  17. 培養の初期段階の開始時又は初期段階中に細胞内で表1の1つ又は複数のmiRNA分子の阻害剤のレベルを増大させ、後に細胞周期の増殖停止期の前又は増殖停止期の最中に細胞内で表1の1つ又は複数のmiRNA分子のレベルを増大させるステップを含む、請求項1に記載の方法。
  18. 細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
  19. CHO細胞がCHO−K1又はCHO−DUKX細胞である、請求項18に記載の方法。
  20. 増殖停止期を初期増殖期より低い培養温度で実施する、請求項2〜19のいずれか一項に記載の方法。
  21. 初期増殖期を37℃で実施する、請求項20に記載の方法。
  22. 増殖停止期を31℃で実施する、請求項20又は21に記載の方法。
  23. 誘導性プロモーターの制御下で細胞のゲノム中に安定的に組み込まれた(一次、前駆体、又は成熟型の)表1のmiRNA分子をコードする核酸を含む哺乳動物産生細胞。
  24. 核酸がhsa−miR−21及びhsa−miR−24を含む群から選択されるmiRNA分子をコードする、請求項23に記載の哺乳動物産生細胞。
  25. プロモーターが温度誘導性プロモーターである、請求項23又は24に記載の哺乳動物産生細胞。
  26. 誘導性プロモーターの制御下で細胞のゲノム中に安定的に組み込まれた表1のmiRNA分子の阻害剤をコードする核酸を含む哺乳動物産生細胞。
  27. 核酸がhsa−miR−21及びhsa−miR−24を含む群から選択されるmiRNA分子の阻害剤をコードする、請求項26に記載の哺乳動物産生細胞。
  28. プロモーターが温度誘導性プロモーターである、請求項25又は26に記載の哺乳動物産生細胞。
  29. CHO細胞又はBHK細胞である、請求項23〜28のいずれか一項に記載の哺乳動物産生細胞。
  30. CHO−K1細胞又はCHO−DUKX細胞である、請求項29に記載の哺乳動物産生細胞。
  31. 組換え型生物学的製剤を製造するのに有用なキットであって、(a)哺乳動物産生細胞系、(b)(一次、前駆体、又は成熟型の)表1のmiRNA分子で前記細胞系の細胞をトランスフェクトするための手段、及び/又は(c)表1のmiRNA分子の阻害剤で前記細胞系の細胞をトランスフェクトするための手段を含むキット。
  32. 細胞をトランスフェクトするための手段が、細胞を一過的又は安定的にトランスフェクトするための手段を含む、請求項30に記載のキット。
  33. 一過的トランスフェクションが(a)合成miRNA分子及び(b)miRNA分子をコードする核酸の一方又は両方を細胞に導入するステップを含む、請求項32に記載のキット。
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