JP2005046156A - 生体内血小板増殖効能が向上した新規なヒトトロンボポイエチン誘導体 - Google Patents

Abstract

【課題】 新規なヒトスロンボポイエチン（ｈＴＰＯ）誘導体およびその製造方法を提供する。
【解決手段】 遺伝子の再組換え方法によって天然型ｈＴＰＯ中の特定部位のアミノ酸をアスパラギン等のアミノ酸に置換して糖鎖を導入することによって製造する。
【効果】 生体内血小板増殖効能を画期的に向上させ、抗癌治療や骨髄移植による血小板減少症の治療に有用に使用できる。
【選択図】 図１０

Description

本発明は生体内（in vivo ）血小板増殖効能が向上した新規なヒトトロンボポイエチン（human thrombopoietin, 以下「ｈＴＰＯ」とする）誘導体およびその製造方法に関するものである。

より詳しくは、本発明は遺伝子組換え方法によって天然型ｈＴＰＯ中の特定位置のアミノ酸をアスパラギン等のアミノ酸で置換して糖鎖(Sugar chain)を導入した新規なｈＴＰＯ誘導体、これをコードする塩基配列、該塩基配列を含む発現ベクターおよびその製造方法、発現細胞株、そしてこれを利用したｈＴＰＯ誘導体の製造方法に関するものである。

抗癌治療または骨髄移植をする場合や其他、様々な原因によって誘発する血小板減少症（thrombocytopenia）は、骨髄細胞内に存在する血小板前駆細胞である巨核球コロニー形成前駆細胞等が抗癌治療または骨髄移植する過程で破壊され、それによって血小板の数が不足するようになり誘発される疾病である。軽い外的刺戟によっても簡単に出血が起こり、血小板減少症がひどい場合には、外部的な刺戟がなくても出血するようになる。また出血が起きた場合、止血がうまくできないためひどい場合には、死亡にまで至る深刻な疾病である。

現在までこのような血小板減少症を治療する方法としては、血小板を輸血する方法が唯一の利用されてきた方法である。しかし、これは血小板輸血に必要な血液の提供者が不足するという問題点以外に、エイズバイロスまたは肝炎バイロス等の血液に由来した感染源による感染、および外来血小板の輸血による免疫反応の誘発等の副作用がある。

血小板は、巨核球前駆細胞から作られる血液成分であり、出血を抑制する機能を示し、その数は肝臓または腎臓で生成され、分泌される糖蛋白質であるトロンボポイエチン（thrombopoietin, 以下「ＴＰＯ」とする）によって調節される。ＴＰＯは骨髄細胞内に存在する血小板の生産細胞である巨核球前駆細胞の増殖と分化を促進させ、血小板の生成を誘発し窮極的に血小板数を増加させる（Lok 等、Nature, 369: 565-568 (1994); De savage等、Nature, 369: 533-568 (1994))。

ＴＰＯ遺伝子中のヒトトロンボポイエチン（ｈＴＰＯ）の遺伝子が、１９９４年に初めてｃＤＮＡ形態にクローニングされて以後（Lok 等、Nature, 369: 565-568 (1994); De savage等、Nature, 369: 533-568 (1994); Miyazaki 等、Experimental hematol., 22: 838 (1994); 国際特許公開第９５／１８８５８号公報）、ｈＴＰＯが血小板数を調節する機能を持っていることを利用して、抗癌治療および骨髄移植時に誘発される血小板減少症を治療しようとする臨床実験が進行している(Murray 等、Exp. Hematol., 26: 207-216 (1998))。

以後、天然型ｈＴＰＯの活性を改善しようとする研究が多様に進められているが、大きく分けると３つの方法で行われている。

ｈＴＰＯは細胞内で３５３個のアミノ酸で構成された前駆体として発現した後、２１個のアミノ酸のシグナル配列が切断されて３３２個のアミノ酸で構成された活性型蛋白質として細胞外へ分泌される糖蛋白質である。ｈＴＰＯは赤血球生成を増加させる赤血球生成因子であるエリトロポイエチン（erythropoietin、ＥＰＯ）と高い配列相同性を持っており、ｈＴＰＯの活性を示す部位である始めの１５１個のアミノ酸配列と、ｈＴＰＯの細胞外分泌、体内安定性等に重要な役割をするものと推定される上記配列を除外したＣ−末端部位の二つの領域に区分される（Eaton 等、Exp. Hematol., 25:1-7 (1997)）。

このような天然型ｈＴＰＯを修飾させる一番目の方法は、ｈＴＰＯのＣ−末端部位を欠失させるかまたは、Ｃ−末端部位を欠失させた後、新しいアミノ酸を結合させることである。

このような方法で、アムゲン（Amgen)社は、ｈＴＰＯ₁₅₁ （アミノ酸１−１５１）、ｈＴＰＯ₁₇₄ （アミノ酸１−１７４）誘導体とｈＴＰＯ₁₆₃ のＮ−末端にメチオニンーライシンを添加させた誘導体を製造した。しかし、上記誘導体等は、試験管内試験では活性が維持されたにもかかわらず、生体内試験の結果では天然型ｈＴＰＯより活性が低下したものとしてあらわれた（国際特許公開第９５／２６７４６号公報、国際特許公開第９５／２５４９８号公報）。

また、ジェネテック（Genetech）社の場合は、Ｎ−末端にメチオニンを添加したｈＴＰＯ₁₅₃ 誘導体を大腸菌で発現させて製造した（国際特許公開第９５／１８８５８号公報）。キリン（Kirin)社の場合は、Ｃ−末端部位を欠失させた色々な誘導体とｈＴＰＯ₁₆₃ 内の特定アミノ酸を置換させたり、欠失または挿入させた誘導体等を製造した（国際特許公開第９５／２１９１９号公報）。その他にジモジェネティクス(Zymogenetics)社（国際特許公開第９５／２１９２０号公報、国際特許公開第９５／１７０６２号公報）および、ジー ディ セアル(G. D. Searl）社（国際特許公開第９６／２３８８８号公報）のよな研究機関でＴＰＯのＣ−末端部位を欠失させた色々な誘導体を製造したが、生体内実験結果では天然型ｈＴＰＯに比べて血小板生成活性が優れた誘導体を作るのに完全に失敗した。

二番目の方法は、アムゲン社のｈＴＰＯ₁₆₃ −ＰＥＧのようにｈＴＰＯ切片にポリエチレングリコール（以下「ＰＥＧ」とする）を付加して誘導体を作る方法である（国際特許公開第９５／２６７４６号公報）。

しかし、上記の方法は、ｈＴＰＯの安定性に重要な役割をするＣ−末端部位がないため、体内安定性の低下および蛋白質の折り畳み(folding）の変化に因る体内免疫学的防禦システムの露出容易性による安全性の低下、そして蛋白質発現の問題点等が生じ得る。また、ＰＥＧがｈＴＰＯ切片に付加される時、一定の比率で付加されないために品質の不均質性の問題が起こり得る。

また他の方法としては、ｈＴＰＯに糖鎖を導入することによってｈＴＰＯの活性を増加させようとする方法がある。このような方法としては、アムゲン社はｈＴＰＯをコードするｃＤＮＡにある特定の塩基を置換してアスパラギン−Ｘ−セリン／トレオニン（Ｘはプロリンを除外したアミノ酸）の形態に突然変異させてＣ−末端が欠失した１７４個のアミノ酸で構成されたｈＴＰＯにＮ−連結形糖鎖を一つ以上導入して、活性が増加したｈＴＰＯ誘導体を製造しようとした（国際許公開第９６／２５４９８号公報）。

韓国生命工学研究所は、アムゲン社とは異なりｈＴＰＯを切断しないで天然型形ｈＴＰＯに糖鎖を導入し糖鎖が一つ追加されたｈＴＰＯ誘導体を製造した（パク・フンロク等、 J. Biol. Chem., 273:256-261 (1998) ) 。しかし、生体内試験の結果、これらは全て天然型ｈＴＰＯよりも有意的に高いと認められる活性が現れなかった。

上述したように、生物学的活性が向上したhTPO誘導体を色々な方法によって開発しようとしたが、天然形より生体内活性が向上されたhTPO誘導体を得ることに全て失敗した。

一般的に多くの蛋白質は、糖鎖と蛋白質が結合した糖蛋白質として存在する。このような糖鎖化は、蛋白質の特定位置から発生し、たいてい２種類に分類される。たいてい糖の側鎖がセリンまたはトレオニンアミノ酸の酸素に付着するＯ−連結形糖鎖化とアスパラギン−Ｘ−セリン／トレオニン（Ｘはプロリンを除外したアミノ酸）のアスパラギンの窒素に付着するＮ−連結形糖鎖化がある。

糖蛋白質の糖鎖は、蛋白質の物理化学的、生物学的特性に多くの影響を与え、蛋白質の安定性と分泌に重要な機能を果たすものとして知られており、特に、生体内生物学的活性および薬物動力学的性質に重要な影響を与える（Jenkins 等、Nature Biotechnological., 14:975 - 981 (1996); Liu等、Act. TIBTECH., 10:114 - 120 (1992)）。

その例として、人間インターフェロンガンマ（human interferon- γ）やグルコース輸送蛋白質(glucose transport protein）の場合、Ｎ−糖鎖部位が導入されるアスパラギンアミノ酸を他のアミノ酸に置換することによって糖鎖が導入されないようにした時、蛋白質の生物学的活性度が顕著に減少して現れることによってＮ−糖鎖が糖蛋白質の活性に多くの影響を与えることが確認された（Sareneva等、Biochemical J. 303:831 - 840 (1994); Asano等、FEBS, 324:258 - 261(1993)）。

しかし、また、糖鎖が追加導入されたとしても、蛋白質の生物学的活性がそれにつれて増加するものではない。これは、上記アムゲン社および韓国生命工学研究所の先行技術（国際特許公開第９６／２５４９８号公報; パク・フンロク等、J. Biol. Chem., 273:256-261(1998) ）等からも確認されているが、これらの場合、糖鎖が追加されたにもかかわらず、蛋白質の生物学的活性はむしろ天然型よりも減少した。従って、糖鎖が追加導入されることによって蛋白質の活性が増加されるためには、糖鎖が多く付くことより特定部位に導入されることが重要である。

それゆえ、本発明者達は、ｈＴＰＯの生物学的活性を増加させようと、色々な部位に糖鎖が導入された誘導体を多様に製造してその活性を測定した結果、１６４番目のアミノ酸であるアルギニンをアスパラギンに置換したｈＴＰＯ誘導体；１９３番目のアミノ酸であるトレオニンをアスパラギンに置換したｈＴＰＯ誘導体；１５７番目のプロリンおよび１６４番目のアルギニンをそれぞれアスパラギンに置換したｈＴＰＯ誘導体；および１０８番目のロイシン、１１７番目のアルギニンおよび１６４番目のアルギニンをそれぞれアスパラギンに置換したｈＴＰＯ誘導体；が驚くべきことに既存の他のｈＴＰＯ誘導体とは異なって天然型ｈＴＰＯに比べて顕著に向上した生体内血小板生成能力を示すことを確認することによって本発明を完成した。

本発明は、生体内（in vivo ）での血小板生成活性が天然型ｈＴＰＯより向上した新規なｈＴＰＯ誘導体を提供することをその目的とする。

具体的には、本発明は天然型ｈＴＰＯのアミノ酸配列中の特定部位のアミノ酸をアスパラギン等のアミノ酸で置換して糖鎖を導入することにより、生体内（in vivo ）血小板生成活性が向上したｈＴＰＯ誘導体を提供する。

また、本発明は上記ｈＴＰＯ誘導体をコードする遺伝子を提供する。

さらにまた、本発明は上記遺伝子を適当なベクターに導入した後、このベクターで宿主細胞を形質転換し、そして得られた形質転換体を適当な培地で培養してｈＴＰＯ誘導体を得る、ｈＴＰＯ誘導体を製造する方法を提供する。

本発明は、天然天然型ｈＴＰＯのアミノ酸配列中の特定部位のアミノ酸をアスパラギン等のアミノ酸で置換して糖鎖を導入することにより、生体内の血小板生成活性を向上させるｈＴＰＯ誘導体を提供する。

まず、本発明は、生体内で血小板生成活性が向上したｈＴＰＯ誘導体を開発するために、ｈＴＰＯ蛋白質の特定部位がＮ−糖鎖の導入部位であるアスパラギン−Ｘ−セリン／トレオニン（Ｘはプロリンを除外したアミノ酸）配列になるように１つ以上のアミノ酸を置換することによって糖鎖が１つ以上導入された色々な種類のｈＴＰＯ誘導体を製造した。

具体的には、本発明は、天然型ｈＴＰＯに糖鎖が１つ以上追加されたｈＴＰＯ誘導体を製造するためにオーバーラップ重合酵素連鎖反応（overlap PCR; Cheng等、PNAS、91:5695(1994) ）による部位特異的突然変異法（site-specific mutagenesis ）を利用して、天然型のｈＴＰＯの特定アミノ酸が置換されたｈＴＰＯ誘導体の遺伝子を分離した。（図１参照）

まず、下記の変異塩基配列を含むプライマーを化学的に合成する。このプライマーは、両方向のオリゴヌクレオチドにそれぞれ新しく置換させようとするアミノ酸の塩基配列を含み、その配列を中心に５’方向と３’方向にｈＴＰＯ遺伝子の塩基配列に該当するいくつかの塩基が連結した一対のセンスおよびアンチセンスプライマーである。

オーバーラップＰＣＲ（overlap PCR ）は、具体的にｈＴＰＯ ｃＤＮＡ遺伝子がクローニングされている公知の移動ベクターｐＢｌｕｅ（大韓民国特許出願第９７−７５１２号明細書）を鋳型にして、ｈＴＰＯシグナル配列をコードする塩基配列を含む配列１のオリゴヌクレオチドおよび上記表１の変異塩基配列を含むオリゴヌクレオチド対中のＮ−プライマー、または残りのＣ−プライマーとｈＴＰＯ Ｃ−末端転写解読枠部分と終結コドンを含む配列２のオリゴヌクレオチドをそれぞれ始発体にして実施した。

上記オーバーラップＰＣＲの産物は、ｈＴＰＯ遺伝子のシグナル配列を含み、Ｎ−末端からアミノ酸置換部位までに該当する塩基配列と、アミノ酸置換部位からＣ−末端までに該当する塩基配列を含むようになる。

アミノ酸変異が起きる塩基配列部位を含む完全な長さのｈＴＰＯ ｃＤＮＡ遺伝子を得るために、上記の２つのオーバーラップＰＣＲ産物を鋳型にして、上記配列１および配列２のオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーにしてＰＣＲを実施した。

このような過程で１０７８ｂｐの変異塩基配列部位を含む完全な長さのｈＴＰＯ誘導体ｃＤＮＡを製造した。（図１参照）

上記過程で製造したｈＴＰＯ誘導体ｃＤＮＡを含む形質転換体を製造するために，まずｈＴＰＯ誘導体ｃＤＮＡを含む移動ベクターを製造し、このベクターを利用して発現ベクターを製造した。

具体的に公知の移動ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４と各ｈＴＰＯ誘導体遺伝子を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩでそれぞれ切断し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（T4 DNA ligase ）で連結し各ｈＴＰＯ誘導体遺伝子を含む移動ベクターを得た。（図２参照）

上記で得た移動ベクターの種類と、その移動ベクターの変化したｈＴＰＯ誘導体遺伝子配列とそれによって置換されるアミノ酸部位を下記の表２に示す。

本発明でｈＴＰＯ誘導体のアミノ酸配列は、配列３０で記載される天然型ｈＴＰＯのアミノ酸配列から置換させたアミノ酸配列を表記する方法で示した。例えば、本発明のｈＴＰＯ誘導体４０４３０のアミノ酸序列は、［Ａｓｎ¹⁰⁸ ］ｈＴＰＯで表記する。これは、配列３０のアミノ酸のアミノ酸序列から１０８番目のアミノ酸残基がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列と一致する。

上記の移動ベクターを動物細胞に形質転換させるために哺乳動物細胞発現ベクターを製造した。

具体的には、天然型ｈＴＰＯのｃＤＮＡを公知のｐＣＤＮＡ３．１ベクターに挿入して製造したｐＣＤＴベクターと上記のｈＴＰＯ誘導体遺伝子を含む移動ベクターｐＢｌｕｅ２９、ｐＢｌｕｅ３０、ｐＢｌｕｅ３１、ｐＢｌｕｅ３２、ｐＢｌｕｅ３３、ｐＢｌｕｅ３４、ｐＢｌｕｅ５８、ｐＢｌｕｅ５９、ｐＢｌｕｅ６０、ｐＢｌｕｅ６１、ｐＢｌｕｅ６２、ｐＢｌｕｅ６３を制限酵素ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩでそれぞれ切断してＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、各ｈＴＰＯ誘導体遺伝子を含む動物細胞発現ベクターを得た。（図３および表３参照）

この時、遺伝子コード配列の縮重（degeneracy）に起因して、表３に表示されたＤＮＡ配列とは異なるが、表３のアミノ酸配列をコードする条件に符合する他の塩基配列も本発明の範疇に含まれる。すなわち本発明で表３の変化したアミノ酸配列を含むｈＴＰＯ誘導体のアミノ酸配列をコードする全ての塩基配列が突然変異ｈＴＰＯ遺伝子の塩基配列に利用できる。

例えば、配列１１と配列１２の塩基配列を持ったプライマーによって突然変異が導入されたｈＴＰＯ誘導体発現ベクターｐ４０４３３によって発現するｈＴＰＯ誘導体は、配列３０のアミノ酸序列で１６４番アミノ酸がアスパラギンに置換されたポリペプチドを含み、これをコードする塩基配列は、配列３１の塩基配列だけではなく、遺伝子コード配列の縮重による同種の塩基配列を含む。

上記で製造した移動ベクターに突然変異が正しく導入されているかどうかを確認するために、ＰＣＲ産物の塩基配列を決定することもできるが、突然変異誘導始発体の作製時に始発体の塩基配列に新しい制限酵素部位を導入するかまたは鋳型にあった制限酵素部位が消滅するようにして、突然変異遺伝子を作り出して特定制限酵素に反応させてみれば、ＤＮＡ塩基配列分析をしなくても簡便に突然変異が導入されているかどうかを判断できる。例えば、発現ベクターｐ４０４３３の場合、突然変異が導入されていれば、天然型ｈＴＰＯの塩基配列ＧＡＡＣＣＴがＡＣＡＣＧＴに換わり、制限酵素ＡｆｌＩＩＩの新しい切断部位を生成するようになる。したがって、発現ベクターｐ４０４３３を制限酵素ＡｆｌＩＩＩに反応させてみれば、突然変異の導入の有無を簡単に確認できる。

また、本発明は、ｈＴＰＯ内の二部位以上に糖鎖を導入すために上記ｈＴＰＯ誘導体ｃＤＮＡを含む発現ベクターを利用して、ｈＴＰＯ蛋白質のお互いに異なった２つ以上のアミノ酸が置換された誘導体を製造した。

具体的に、各ｈＴＰＯ誘導体遺伝子を含む動物細胞発現ベクター２種を制限酵素でそれぞれ切断して、上記ｐＣＤＴベクターにクローニングしてお互いに異なる二部位または新しい部位のアミノ酸が置換されたｈＴＰＯ誘導体遺伝子を含む発現ベクターを得る。その例として、発現ベクターｐ４０４２９を制限酵素ＮｈｅＩおよびＢｓｐＭＩで切断して、Ａｒｇ¹¹⁷ →Ａｓｎ¹¹⁷ のアミノ酸置換部位が含まれたＤＮＡ切片を分離し、発現ベクターｐ４０４３１を制限酵素ＢｓｐＭＩおよびＢｓｕ３６Ｉで切断し、Ｇｌｙ¹⁴⁷ →Ａｓｎ¹⁴⁷ のアミノ酸置換部位が含まれたＤＮＡ切片を分離後、ｐＣＤＴベクターをＢｓｐＭＩおよびＢｓｕ３６Ｉで切断し、これらを連結させることによってＡｒｇ¹¹⁷ →Ａｓｎ¹¹⁷ とＧｌｙ¹⁴⁷ →Ａｓｎ¹⁴⁷ の２つのアミノ酸置換部位が導入された遺伝子を含んだ発現ベクターｐ４０４３５を得た。これと同じ方法で、ｐ４０４３６ないしｐ４０４３９とｐ４０４４６ないしｐ４０４４９を製造した（表３参照）。

上記で製造した発現ベクターを利用してｈＴＰＯ誘導体を発現する動物細胞形質転換体を製造した。

具体的には、上記発現ベクターをリポペクタミン方法を利用して、動物細胞ＣＨＯ／Ｋ−１に形質転換させ、それぞれのｈＴＰＯ誘導体を発現する動物細胞形質転換体を製造した。

上記形質転換細胞株をベクター名に合わせてＣＨＯ Ｋ−１／ｐ４０４２９、ＣＨＯ Ｋ−１／ｐ４０４３０、ＣＨＯ Ｋ−１／ｐ４０４３１、ＣＨＯ Ｋ−１／ｐ４０４３２、と命名し、その中のＣＨＯ Ｋ−１／ｐ４０４３３を国際寄託機関である遺伝子銀行（Korean Collection for Type Cultures, KCTC ）に１９９８年６月１７日付で寄託した。（受託番号 : KCTC 0495BP）

上記動物細胞形質転換体を培養して、それから動物細胞で発現するｈＴＰＯ誘導体を製造した。

具体的には、形質転換体を血清が含まれた培地で大量に継代培養した後、分泌培地に交替培養して培養上澄み液を得、これを濃縮、透析してｈＴＰＯ誘導体を得た。上記ＣＨＯ Ｋ−１／ｐ４０４３３を培養して分離したｈＴＰＯ誘導体は、配列３０のアミノ酸序列で１６４番アルギニンがアスパラギンに置換されたポリペプチド［Ａｓｎ¹⁶⁴ ］ｈＴＰＯである。

上記ＣＨＯ Ｋ−１／ｐ４０４３４を培養して分離したｈＴＰＯ誘導体は、配列３０のアミノ酸序列で１９３番トレオニンがアスパラギンに置換されたポリペプチド［Ａｓｎ¹⁹³ ］ｈＴＰＯである。

上記ＣＨＯ Ｋ−１／ｐ４０４４９を培養して分離したｈＴＰＯ誘導体は、配列３０のアミノ酸配列で１０８番ロイシン、１１７番アルギニン、１６４番アルギニンがそれぞれアスパラギンに置換されたポリペプチド［Ａｓｎ¹⁰⁸ 、Ａｓｎ¹¹⁷ 、Ａｓｎ¹⁶⁴ ］ｈＴＰＯである。

上記ＣＨＯ Ｋ−１／ｐ４０４５８を培養して分離したｈＴＰＯ誘導体は、配列３０のアミノ酸配列で１５７番プロリン、１６４番アルギニンがそれぞれアスパラギンに置換されたポリペプチド［Ａｓｎ¹⁵⁷ 、Ａｓｎ¹⁶⁴ ］ｈＴＰＯである。

上記動物細胞で発現したｈＴＰＯ誘導体をベクター名によって、４０４２９ないし４０４３９、４０４４６、４０４４７、４０４４９、４０４５８ないし４０４６３と命名して、これらの試験管内（in vitro）生物学的活性を試験するために、巨核球細胞性白血病細胞株の細胞増殖検定法を実施した。

その結果４０４２９、４０４３０、４０４３２、４０４３３、４０４３４、４０４３７、４０４３８、４０４３９誘導体等が天然型ｈＴＰＯより優れた生物学的活性を示した。糖鎖が１つ導入された場合と２つ導入された場合とそれぞれ活性が増加したものと低下したもとが現れたことから導入された数と活性との比例的関係はないものと思われる。（図４参照）

上記ｈＴＰＯ誘導体の生体内生物学的活性を試験するために、ｈＴＰＯ誘導体をマウスに投与して血小板数を測定した。

具体的には、８週齢程度のマウスを平均体重を基準にして４〜５群に分けて、一定の濃度のｈＴＰＯを皮下投与する。投与後、末梢血の採血を実施して末梢血中の血小板数を測定した結果、大部分の誘導体群は天然型ｈＴＰＯよりも血小板生成効果が低下したものとして現れた反面、４０４３３誘導体、４０４３４誘導体、４０４４９誘導体、４０４５８誘導体は、その効果が天然型ｈＴＰＯと類似または、より優れたものとして現れた。（図６、図７ａおよび図７ｂ参照）

上記実験結果からｈＴＰＯの生体内活性は、導入される糖鎖数が多けば多いほど増加するというものではなく、導入される部位との間に密接な関係があることが分った。つまり、ｈＴＰＯの活性が増加するためには、糖鎖をｈＴＰＯの３３２個アミノ酸配列中の特定部位、いうならば１６４番または１９３番等に導入しなければならないことが分った。

特に４０４３３誘導体の場合、生体内血小板生成活性は投与後３〜４日経過後から約２日間、天然型ｈＴＰＯより活性が高く現れ、臨床的に血小板減少症治療剤等に有用に使用できることが確認された。４０４３３誘導体の血小板生成活性の最高値は、投与後５日目に天然型ｈＴＰＯより３４％以上顕著に向上した結果を示し、全体的には、天然型が示す活性よりも８０％以上増加した活性を示した。

上記実験結果から天然型ｈＴＰＯに比べて活性が同じかそれ以上の誘導体の生体内活性を調査するために、上記で作製したｈＴＰＯ誘導体遺伝子を含むｄｈｆｒ増幅発現ベクターを製造して、ｈＴＰＯ誘導体の発現効率が高められた細胞株を製造した。

具体的には、dhfr遺伝子を含むベクターｐＳＶ２−ｄｈｆｒのＰｖｕＩＩ−ＳｐｈＩ切片にＢａｍＨＩリンカーを付けて、ｄｈｆｒＩ遺伝子を含んだ１７１０ｂｐ断片を得た後、これをｐＣＤＴに挿入して天然型ｈＴＰＯ遺伝子を含むｄｈｆｒ増幅発現ベクターであるｐＤＣＴを製造した。予め製造した本発明のｈＴＰＯ誘導体遺伝子を上記ｐＤＣＴに天然型ｈＴＰＯ遺伝子の代りに挿入し、ｈＴＰＯ誘導体遺伝子を含むｄｈｆｒ増幅発現ベクターｐＤ４０４３３、ｐＤ４０４３４、ｐＤ４０４４９、ｐＤ４０４５８を製造する。（図８参照）

上記のように作製されたｈＴＰＯ誘導体遺伝子を含むｄｈｆｒ発現ベクターは、真核細胞株に形質転換された後、継代培養によって上記細胞株の染色体の中でたやすく増幅される。より詳しく言えば、本発明では、これを動物細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ（−）に形質転換させる。上記のように作られた新しい形質転換された細胞株をそれぞれＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４３３、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４３４、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４４９、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４５８と命名し、この中のＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４３４、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４４９、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４５８を国際寄託機関である遺伝子銀行（Korean Collection for Type Cultures, KCTC ）に１９９９年６月８日付けで寄託した (受託番号 :ＫＣＴＣ ０６３０ＢＰ、ＫＣＴＣ ０６３１ＢＰ、ＫＣＴＣ ０６３２ＢＰ）。上記の方法で、その他のｈＴＰＯ誘導体遺伝子を含むｄｈｆｒベクターとその形質転換細胞株を容易に得ることができる。

上記細胞株は、大量培養が可能であるので、これから各誘導体を公知の方法を使って精製できる。上記ｈＴＰＯ誘導体遺伝子を含むｄｈｆｒ増幅発現ベクターで形質転換された細胞株からｈＴＰＯ誘導体を精製するためには、多様なカラムクロマトグラフィーを利用できるが、本発明では、ＣＭイオン交換親和カラム、フェニルセパローズカラム、ヒドロキシルアパタイトカラム等を組合わせて使用して精製した。（図９参照）

上記の精製されたｈＴＰＯ誘導を生体内生物学的活性を試験するために、上記で言及した方法で各々精製されたｈＴＰＯ誘導体をマウスに投与して血小板数を測定した。その結果、投与日から１０日目まで天然型ｈＴＰＯに比べて４０４３３誘導体は、７７％、４０４３４誘導体は、９１％、４０４４９誘導体は、２６％、４０４５８誘導体は、７９％ずつ増加した活性を示した。（図１０参照）

上記ｈＴＰＯ誘導体は、糖鎖導入の可否を確認するために、精製された天然型ｈＴＰＯおよびｈＴＰＯ誘導体に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を行った。その結果、糖鎖が１つ導入された４０４３３、４０４３４誘導体は天然型ｈＴＰＯに比べて分子量が増加したことが確認でき、同じように糖鎖がそれぞれ２つ、３つ導入された４０４５８、４０４４９誘導体の分子量も導入された糖鎖の数にしたがい、比例的に増加したものとして現れた。（図１１参照）

また、天然型ｈＴＰＯとｈＴＰＯ誘導体中、４０４３３をトロンビンで処理した後、時間変化による蛋白質の帯の変化様相を観察することによってｈＴＰＯ誘導体の安定性増加可否を確認した。その結果、ｈＴＰＯ誘導体の４０４３３が天然型ｈＴＰＯに比べてトロンビンに対する安定性を増加したことを示した（図１２参照）。したがって、糖鎖導入による安定性増加がｈＴＰＯ誘導体の生体内活性増加に寄与したとみられる。

本発明のｈＴＰＯ誘導体が治療用薬剤に利用されるためには、薬剤学的分野で公知の方法によって製造でき、それ自体または薬学的に許容される担体、賦形剤、稀釈剤等と混合して、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤または注射剤等の剤形に製造して使用できる。

具体的には、水、燐酸緩衝液、またはエクストロソ溶液、アルブミン溶液、抗酸化剤、デキストリン等と混ぜて投与でき、投与方法としては静脈注射または皮下注射を利用するのが好ましい。

投与用量は天然型よりも相当にすくない量を投与するだけで良い。例えば、０．０１〜１０００μｇ／ｋｇ／日で投与する。

本発明のｈＴＰＯ誘導体は、多様な疾患に因る血小板減少症（thrombocytopeina）に使用できる。

例えば、抗癌剤投与、放射線療法による血小板減少症、骨髄移植による血小板減少症、肝炎・肝硬化による血小板減少症等の治療に有用に使用できる。上記疾病を治療する方法としては、アドリアマイシン、シスプラチン等の抗癌剤と併用投与でき、ＩＬ−３、ＭＣＳＦ、ＳＣＦ、ＥＰＯ等の血球促進サイトカイン（hematopoietic cytokine）等と併用投与できる。

以下、実施例によって本発明を詳細に説明する。下記実施例は本発明を具体的に例示するものであり、本発明の内容がこれによって限定されるものではありません。

実施例１
ＰＣＲによるｈＴＰＯ誘導体をコードするｃＤＮＡの製造
天然型ｈＴＰＯ遺伝子に部位特異的突然変異を誘導するためには、アミノ酸を置換させる特異的部位を含む両方向のオリゴヌクレオチド１２対を作製し、そのそれぞれを上記表１のように命名した。

ｈＴＰＯ遺伝子を増幅させるための鋳型には、ｈＴＰＯ ｃＤＮＡがクローニングされている公知の移動ベクターｐＢｌｕｅ４０４（大韓民国特許出願第９７−７５１２号明細書）を使用した。

具体的には、移動ベクターｐＢｌｕｅ４０４約５０ｎｇを鋳型にして、ｈＴＰＯ遺伝子シグナル配列の塩基配列を含む配列１のオリゴヌクレオチドと上記突然変異部位を含むオリゴヌクレオチド対中、アンチセンスオリゴヌクレオチド（表１のＮ−プライマー）をプライマーに使用してＰＣＲを実施した。それぞれのプライマーをμＬ当り４０ｐｍｏｌになるように溶かした後、その溶液４μＬにＰｆｕ（Pyrococcus furiosus ）重合酵素（２．５ｕ／μＬ; Stratagene社、Cat. No. 600153 ）１μＬを付加して最終１００μＬの体積にしてＰＣＲ反応を進行させた。ＰＣＲは、１次変成 ;９４℃９０秒、変成; ９４℃４０秒、プライマー接合 ;５５℃１分、伸長反応 ;７２℃２分過程を３５回反復して進行させた後、最終酵素反応を７２℃５分で実施し反応を終了した。

同様に、ｈＴＰＯ遺伝子のＣ−末端転写読み取り枠（open reading frame, ORF ）領域と終結コドンを含む塩基配列を持った序列２のオリゴヌクレオチドと上記突然変異部位を含むオリゴヌクレオチド対中、センスオリゴヌクレオチド（表１の−プライマー）をプライマーに使用して同一の条件でＰＣＲを遂行した。

上記と同じ過程で、それぞれｈＴＰＯ遺伝子のシグナル配列を含み、Ｎ−末端からアミノ酸置換部位までに該当する遺伝子切片とアミノ酸置換部位からＣ−末端までに該当する遺伝子切片を得た。

各ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル電気泳動を実施して該当する大きさのＤＮＡバンドを剃刀ナイフで切出し、クイエクスＩＩ（QIAEXＩＩ）キット（Qiagen社、 Cat. No. 20021 ）を利用して溶出し、これを最終的に５０μＬになるように三次蒸溜水に溶かした。

上記ＰＣＲ産物から突然変異配列を含みシグナル配列を含む３３２個のアミノ酸をコードする完全な長さのｈＴＰＯ ｃＤＮＡ遺伝子を得るためには、２つのＰＣＲ切片１０ｎｇずつを鋳型にして配列１と配列２のオリゴヌクレオチドをプライマーに使用して最終１００μＬ体積でＰＣＲを進行させた。ＰＣＲは１次変成 ;９４℃９０秒、変成 ;９４℃４０秒、プライマー接合 ;５８℃１分、酵素伸長反応 ;７２℃２分過程を３５回反復して進行させた後、最終酵素反応を７２℃５分で実施して反応を終了した。ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル電気泳動に付して上記と同じ方法で１０７８ｂｐ大きさのＤＲＡバンドを分離した後３０μＬの三次蒸溜水に溶かした。

一方、二部位以上の突然変異配列を含むｈＴＰＯ遺伝子を製造するためには、５８−Ｎ、５８−Ｃプライマー対、６０−Ｎ、６０−Ｃプライマー対、６１−Ｎ、６１−Ｃプライマー対、６３−Ｎ、６３−Ｃプライマー対によって作られたｃＤＮＡ配列にもう一度上記の突然変異誘発過程を反復して、３３−Ｎ、３３−Ｃプライマー対を使用して突然変異を起こさせた。

上記過程で生成されたｈＴＰＯ誘導体の変化したアミノ酸配列と塩基配列を上記表２に示した。

実施例２
ｈＴＰＯ誘導体ｃＤＮＡを含んだ哺乳動物細胞発現ベクターの製造およびＣＨＯ細胞での発現

（２−１）転位ベクターの製造
実施例１で製造したｈＴＰＯ誘導体遺伝子をまず、公知の移動ベクターであるｐＢｌｕｅＢａｃ４（Invitrogen社、Cat. No. V1995-20 ）に下記の方法でクローニングした。

実施例１で準備した各ｈＴＰＯ誘導体のＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩ制限酵素を添加して３７℃で３時間反応させた後、１％アガロースゲル電気泳動で１０６８ｂｐのＤＮＡ切片を分離した。ｐＢｌｕｅＢａｃ４ベクターは、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで上記の条件で切断し、４７７ｂｐのＤＮＡ切片を分離した。

ｈＴＰＯ誘導体のｃＤＮＡ ＰＲＣ産物と移動ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４を連結させるために、これらを４：１のモル比率で混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（NEB 社、Cat. No. 202S ）を利用して１６℃で１６時間反応させた。この反応液を大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’（Invitrogen社、Cat. No.C3030-03）菌株に公知の電気穿孔法で形質転換させ大腸菌形質転換体を得た。形質転換体クローンをＬＢ（１Ｌ当１０ｇトリプトン、５ｇ酵母抽出物、１０ｇＮａＣｌ）培地５０ｍＬに３７℃で１８時間培養後、ウイザードミディプレップ（Wizard Midiprep ）キット(Promega社、Cat. No. A7640）を利用して、転位ベクターを大量抽出した。

上記と同じ過程で製造されたｈＴＰＯ誘導体遺伝子を含む転位ベクターをそれぞれｐＢｌｕｅ２９、ｐＢｌｕｅ３０、ｐＢｌｕｅ３１、ｐＢｌｕｅ３２、ｐＢｌｕｅ３３、ｐＢｌｕｅ３４、ｐＢｌｕｅ５８、ｐＢｌｕｅ５９、ｐＢｌｕｅ６０、ｐＢｌｕｅ６１、ｐＢｌｕｅ６２、ｐＢｌｕｅ６３と命名した。（図２参照）

（２−２）動物細胞発現ベクターの製造
ｈＴＰＯ誘導体遺伝子を含む組換え動物細胞発現ベクターを製造するために、天然型ｈＴＰＯを既存のｐＣＤＮＡ３．１（Invitrogen 社、Cat.No.790-20)ベクターのＫｐｎＩとＥｃｏＲＩ部位に挿入して製造したｐＣＤＴベクターを利用した。

具体的にｐＣＤＴベクターＤＮＡ５μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｈｅＩで３７℃で３時間反応させた後１％アガロースゲル電気泳動を遂行して４９５８ｂｐのＤＮＡ切片を分離した。（２−１）で製造した各ｈＴＰＯ誘導体を含む転位ベクター５μｇを取って、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで上記の条件下で切断し、１０８７ｂｐのＤＮＡ切片を分離した。

上記ｐＣＤＴとｈＴＰＯ誘導体ｃＤＮＡ切片を連結させるために、それぞれを１：３のモル比率で混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して１６℃で１８時間反応させた。この反応液を大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’（Invitrogen社、Cat.No.C3030-03 ）菌株に公知の電気穿孔法で形質転換させ、大腸菌形質転換体を得た。（図３参照）形質転換体クローンをＬＢ培地５０に３７℃で１８時間培養後ウイザードミディプレップ（Wizard Midiprep ）キット（Promega 社、Cat.No.A7640）を利用して発現ベクターを大量抽出した。上記と同じ過程で製造されたｈＴＰＯ誘導体遺伝子を含む動物細胞発現ベクターをそれぞれｐ４０４２９、ｐ４０４３０、ｐ４０４３１、ｐ４０４３２、ｐ４０４３３、ｐ４０４３４、ｐ４０４５８、ｐ４０４５９、ｐ４０４６０、ｐ４０４６１、ｐ４０４６２、ｐ４０４６３と命名した（図３参照）。分離したプラスミドＤＮＡは、制限酵素ＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、Ｓｓｕ３６Ｉで切断して遺伝子が正しく挿入されているかを確認し、上記ベクター内の変異したＤＮＡ部位は、制限酵素地図作成および塩基配列分析をによって確認した。ＤＮＡ電気泳動法（Sambrook et al., Molecular cloning - A laboratory manual, 2nd Ed., Cold spring harbor laboratory press (1987) ）によって、各発現ベクターを定量し、ＣＨＯ／Ｋ−１細胞株の形質転換に使用した。

（２−３）ｈＴＰＯ誘導体のＣＨＯ細胞における発現
動物細胞の形質転換過程は、リポフェクタミン(lipofectamin; Gibco-BRL社、Cat. No. 18324012)方法によって実施した。まず、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Gibco-BRL 社、Cat. No.12052-098 ）６００μＬに各プラスミドＤＮＡ１２μｇを添加した後リポフェクタミン３６μＬが添加されたＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地６００μＬとよく混ぜ３０分間室温で放置した。放置後２４時間経過前に６−ウェルプレートに２Ｘ１０⁵ 細胞／ウェルで接種されたＣＨＯ／Ｋ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）をＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地で１回洗浄後、０．８の新鮮な培地を加えた。３０分経過後、リポフェクタミンおよびＤＮＡと培地混合物を２００μＬずつ６−ウェルプレートに分株後、５時間５％ＣＯ₂ 、３７℃条件で培養した。以後１０％ＦＢＳが含まれた培養培地１を添加後、５％ＣＯ₂、３７℃で２４時間培養し、１０％ＦＢＳ（Gibco-BRL 社、Cat.No.16000-036）が添加されたＨａｍ Ｆ−１２（Gibco-BRL 社、Cat.No.11059）培地に交替後、５％ＣＯ₂ 、３７℃培養条件で７２時間培養し一過性の発現液を製造した。

そして、１０％ＦＢＳが添加されたＨａｍ Ｆ−１２培地に交替後４８時間経過後に６−ウェルプレート中の１ウェルの細胞を１００ｍｍディッシュに移し、５００μｇ／ｍＬのゼオシン（zeocin; Gibco-BRL 社、Cat. No. R25001 ）が含まれた培地下で７〜１０日間培養した。顕微鏡でゼオシン耐性を示すコロニーが形成されたことを確認した後、クローニングシリンダー（cloning cylinder; Bellco社、Cat. No. 2090-01010 ）を利用して各誘導体当り１２個以上のコロニーを分離した。ｈＴＰＯのＥＬＩＳＡキット（R&D 社、Cat. No. DTP00）を利用し発現量を比較し、最も高い発現量を示したものを各誘導体の発現菌株に選定した。

実施例３
二部位以上のアミノ酸が置換されたｈＴＰＯ誘導体ｃＤＮＡを含む哺乳動物細胞発現ベクターの製造およびＣＨＯ細胞における発現

ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ遺伝子内に二部位以上のアミノ酸を置換させたｈＴＰＯ誘導体を製造するために、上記実施例２で製造したｈＴＰＯ誘導体ｃＤＮＡを含んだ哺乳動物細胞発現ベクター利用した。

具体的には、ｐ４０４３５の場合、発現ベクターｐ４０４２９を制限酵素ＮｈｅＩとＢｓｐＭＩで切断して、Ａｒｇ¹¹⁷ →Ａｓｎ¹¹⁷ のアミノ酸置換部位が含まれた４９４ｂｐの遺伝子断片を分離した。そして、発現ベクターｐ４０４３１を制限酵素ＢｓｐＭＩとＢｓｕ３５１で切断して、Ｇｌｙ¹⁴⁷ →Ａｓｎ¹⁴⁷ のアミノ酸置換部位を含んだ３５５ｂｐの遺伝子断片を分離した。また、ｈＴＰＯｃＤＮＡ遺伝子がクローニングされている動物細胞発現ベクターｐＣＤＴを制限酵素ＮｈｅＩとＢｓｕ３６１で切断後、上記の二つの遺伝子断片と連結してＡｒｇ¹¹⁷ →Ａｓｎ¹¹⁷ とＧｌｙ¹⁴⁷ →Ａｓｎ¹⁴⁷ の二部位のアミノ酸を置換したｈＴＰＯ誘導体ｃＤＮＡを含む動物細胞発現ベクターｐ４０４３５を製造した。

Ａｒｇ¹¹⁷ →Ａｓｎ¹¹⁷ とＡｒｇ¹⁶⁴ →Ａｓｎ¹⁶⁴ のアミノ酸置換を含むｐ４０４３６は、予めｐ４０４２９から分離した４９４ｂｐの遺伝子断片と発現ベクターｐ４０ｅ３３を制限酵素ＢｓｐＭＩとＥｃｏＲＩで切断して分離したＡｒｇ¹⁶⁴ →Ａｓｎ¹⁶⁴ を含む５９３ｂｐの遺伝子断片を、制限酵素ＮｈｅＩとＥｃｏＲ１で切断して分離した動物細胞発現ベクターｐＣＤＴと連結して製造した。

Ｐ４０４３７、Ｐ４０４３８、Ｐ４０４３９の場合も上記と同様にそれぞれに該当する２種の発現ベクターから置換されたアミノ酸部位を含む遺伝子断片を分離して、動物細胞発現ベクターｐＣＤＴにクローニングする方法で製造した（表３参照）。

ｐ４０４４６、ｐ４０４４７、ｐ４０４４９の場合は、それぞれに該当する３種の発現ベクターから置換されたアミノ酸部位を含む遺伝子断片を分離して、動物細胞発現ベクターｐＣＤＴにクローニングする方法で製造した（表３参照）。
製造した８種の動物細胞発現ベクターを実施例２と同様に、６−ウェルプレートでＣＨＯ／Ｋ−１細胞に形質転換させ一過性の発現液を得た。そして実施例２と同じく、ゼオシン耐性を持った発現菌株を分離した。

実施例４
ｈＴＰＯ誘導体の試験管内生物学的活性評価：Ｍ−Ｏ７ｅ細胞増殖検定法

まず、ｈＴＰＯ誘導体試料を製造するために、各誘導体の発現菌株をセルファクトリー（cell factory; Nunc社、Cat. No. 170009)を使用して、１０Ｌ大量養した。１０％ＦＢＳが添加されたＨａｍ Ｆ−１２培地で各発現菌株細胞を５Ｘ１０⁴ 細胞／ｍＬでセルファクトリーにより継代培養した後７２時間経過後ＰＢＳで１回洗浄し、エクセル培地（ExCell; JRH 社、Cat. No. 14311-10L）に交替した。５％ＣＯ₂ 、３７℃で９６時間培養後、培養上澄み液を得た後、ペリコン（pelicon ）濃縮機（Millipore 社、Cat. No. 42PEL60）を使用して、１次濃縮を行い、ミニタン（minitan ）濃縮機（Millipore 社、Cat. No. 80EL004）を使用して、２次濃縮を行った。濃縮された各試料は、１×ＴＮＴ緩衝溶液(10 mM Tris, 0.15 M NaCl, 0.01% Tween20, pH 7.4)で４℃で３０時間透析を実施し、最後にウルトラフリー（Ultrafree; Millipore 社、Cat. No. UFV2BGC10）で３次濃縮を行った。得られた試料をＥＬＩＳＡキットで３回定量して生体内試験に使用した。

巨核細胞性白血病細胞株(Mega karyocyte leukemia cell line) Ｍ−Ｏ７ｅは、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｕ／ｍＬ）、１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培養培地（Gibco-BRL 社、Cat. No. 22400-089）で維持した。

活性評価をするために、評価培地(5% FBS, RPMI1640)を製造後、上記で培養された細胞を遠心分離して集め、ＲＰＭＩ１６４０で３回洗浄後、最終評価培地に８×１０⁴ 細胞／ｍＬになるように調整し、Ｔ−７５フラスコに浮遊させて５％ＣＯ₂ 培養機で２４時間培養後、再び細胞を集め１×１０⁵ 細胞／ｍＬになるように調整して９６−ウェルプレートに１００ｍずつ分株した。標準物質(rhTPO,25m)をＲＰＭＩ１６４０で８段階の濃度(100.0〜0.78125 ng/)で連続稀釈して準備した。対照物質は、ＣＨＯ細胞由来の天然型ｈＴＰＯを使用し、全部で１１種の誘導体(40429ないし40439)を各１．５６２５、６．２５、２５ｎｇ／ｍＬの濃度に稀釈して準備した後に各試料をウェル当り１００ｍずつ分株し、最終体積を２００μＬに合わせて５％ＣＯ₂ 培養機に入れて２０時間培養後に１μＣｉ（37 kBq)³Ｈ−チミジンを添加し、４時間５％ＣＯ₂ 培養機で培養した。４時間経過後、培養機から実験用プレートを取り出し、ガラス繊維フィルターが装着された細胞収集機に細胞だけを収集しＰＢＳを使用して７回洗浄した。

細胞が収集されたフィルターを測定バイアル(vial)に順番に入れ、液体シンチレーションカウンターで ³Ｈ−放射能を測定し、リアスマート(Riasmart)ソフトウエアーを使用して標準物質、対照物質と試料の最高濃度の中間値(Half-maximal)濃度を計算し、各濃度における活性を比較測定した。

各濃度におけるＭ−０７ｅ細胞増殖促進活性は、誘導体間でほぼ同じ様相を示し、天然型ｈＴＰＯと比較して同等以上の活性を示したのは、２５ｎｇ／ｍＬの濃度で４０４２９、４０４３０、４０４３２、４０４３３、４０４３４、４０４３７、４０４３８、４０４３９の８種だった。それぞれの生物学的活性は、天然型ｈＴＰＯの力価を１００とする時１１７、１３５、１２０、１３１、９７、１２１、１６６、１３３％の増減を示した（図４参照）。

実施例５
ＣＨＯ細胞で発現されたｈＴＰＯ誘導体の生体内活性

生体内活性試験は、動物細胞で発現されたｈＴＰＯ誘導体を投与したマウスからの血小板数を測定する方法で行ない、その結果を図６、図７ａおよび図７ｂに示した。動物は、８週齢で使用するために７週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウスを購入し(Charles River社、日本）、恒温（２４±１℃）、恒湿（５５％）、照明時間１２時間（午前７時−午後７時）に設定された大熊製薬中央研究所動物室で１週間程度飼育馴化後、使用した。試験期間中にも動物は、同一飼育室で飼育した。

１群が５匹になるように体重を指標にした層別無作為抽出によってマウスをグループ分けし、それぞれを培養培地投与群、天然型スロンボポイエチン投与群、各誘導体投与群および薬剤を投与しない無処理群に設定した。

ｈＴＰＯ誘導体は、３６μｇ／ｋｇまたは１０μｇ／ｋｇの一定の濃度で単回皮下投与し、採血は、投与開始日を１日目として、１０日目まで毎日行ない、採決前日の投与から２４時間以内に行った。エーテル痲酔下でマウスの腹部下大静脈から全血を採取しＥＤＴＡ処理チューブに移した後、末梢血中の血小板数を自動血球計測機(Cell dyn 3500、エボト社）を使用して測定した。結果は、平均±標準誤差で示した。天然型ｈＴＰＯは、血小板数の増加を刺戟し、３日目から増加し始め５日目に最大血小板数を示したが、１０日目には正常水準に回復した。処理した全ての誘導体は、血小板数の増加を刺戟した。その中でも４０４３３、４０４３４、４０４４９、４０４５８誘導体は、天然型ｈＴＰＯに比べて同等以上の活性を示した。特に、４０４３３誘導体の場合、生体内血小板生成活性が投与後５日目に、天然型ｈＴＰＯよりも約３４％以上そして、全体的には８０％以上顕著に向上した結果を示した。

比較例１
天然型ｈＴＰＯの生体内（in vivo ）活性

動物細胞に由来した天然型ｈＴＰＯを処理したマウスから血小板数を測定し図５に示した。動物は、８週齢で使用するために７週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウスを購入し(Charles River社、日本），恒温（２４±１℃）、恒湿（５５％）、照明時間１２時間（午前７時−午後７時）に設定された大熊製薬中央研究所動物室で１週間程度飼育馴化後、使用した。試験期間中にも動物は、同一飼育室で飼育した。

１群が５匹になるように体重を指標にした層別無作為抽出によってマウスをグループ分けし、それぞれを培養培地投与群、天然型スロンボポイエチン投与群および薬剤を投与しない無処理群に設定した。天然型ｈＴＰＯは、それぞれ１μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇの濃度で単回皮下投与し、採血は、投与開始日を１日目として、４日目、８日目、１０日目に行ない、採決前日の投与から２４時間以内に行った。エーテル痲酔下でマウスの腹部下大静脈から全血を採取しＥＤＴＡ処理チューブに移した後、末梢血中の血小板数を自動血球計測機(Cell dyn 3500、エボト社）を使用して測定した。結果は、平均±標準誤差で示した。天然型ｈＴＰＯは、血小板数の増加を刺戟し、４日目から増加し始め８日目に最大血小板数を示したが、１０日目には約２０％減少した。

実施例６
ｈＴＰＯ誘導体ｃＤＮＡを含んだ哺乳動物細胞ｄｈｆｒ増幅発現ベクターの製造および発現細胞株の選定

（６−１）ｈＴＰＯ誘導体のｃＤＮＡを含むｄｈｆｒ増幅発現ベクターの製造
実施例５における結果から４０４３３、４０４３４、４０４４９、４０４５８の４種の誘導体に対してｄｈｆｒ増幅発現ベクターを製造した。

まず、ｄｈｆｒ遺伝子を含むベクターｐＳＶ２−ｄｈｆｒ( 受託番号 :ＡＴＣＣ ３７１４６）にＢａｍＨＩリンカーを挿入した。ＢａｍＨＩリンカーは、配列２７と配列２８のオリゴヌクレオチドをそれぞれ燐酸化させた後、アニーリングして使用した。具体的には、Ｔ４キナーゼ (T4 polynucleotide kinase, NEB社、Cat. No. 201S ）を使用して３７℃で３時間反応させ、各オリゴヌクレオチドを燐酸化させた後、同量の各オリゴヌクレオチドを混ぜた後、９４℃で２分間放置後、６５℃から３７℃まで３０秒当り０．２℃ずつ温度が下がるように反応させる方法でアニーリングを行った。ベクターｐＳＶ２−ｄｈｆｒを制限酵素ＰｖｕＩＩとＳｐｈＩで切断後、準備されたＢａｍＨＩリンカーと連結させた。このようにして得たベクターを制限酵素ＢａｍＨＩで切断してｄｈｆｒ遺伝子を含む１７１０ｂｐの遺伝子切片を分離した。

天然型ｈＴＰＯ遺伝子を含むベクターｐＣＤＴを制限酵素ＢｇｌＩＩで切断後、予め得たｄｈｆｒ遺伝子を含む１７１０ｂｐの遺伝子切片を挿入した。このようにして得た天然型ｈＴＰＯ遺伝子を含むｄｈｆｒ増幅発現ベクターをｐＤＣＴと命名した（図８参照）。

５種の誘導体に対するｄｈｆｒ増幅発現ベクターを製造するために、配列２９のオリゴヌクレオチドと配列２のオリゴヌクレオチドをプライマーにして、各誘導体の遺伝子を実施例１と同じ条件で増幅した。増幅した遺伝子を制限酵素ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで切断後、同一の制限酵素で切断したｄｈｆｒ増幅発現ベクターｐＤＣＴと連結させた。完成した各誘導体の遺伝子を含むｄｈｆｒ増幅発現ベクターをそれぞれｐＤ４０４３３、ｐＤ４０４３４、ｐＤ４０４４９、ｐＤ４０４５８と命名した。

（６−２）ＣＨＯ／ｄｈｆｒ（−）細胞株への形質転換と遺伝子増幅
各誘導体の遺伝子を含むｄｈｆｒ増幅発現ベクターを実施例２と同じリポフェクタミン方法で動物細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ（−）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）に形質転換させた。この時形質転換には、ＩＭＤＭ培地(Gibco-BRL社、Cat. No. 12200-036）を使用した。培養時には、１０％透析されたＦＢＳ（Gibco-BRL社、Cat. No. 26300-061）が含まれたＩＭＤＭ培地を使用した。

形質転換された細胞株を選別するために、形質転換後４８時間経過後、細胞を９６−ウェルプレートにウェル当り１×１０³ 細胞数で継代した後、５００μｇ／ｍＬのゼオシンがふくまれた培地下で１０〜１４日間培養した。ゼオシン耐性を示すコロニーを分離後、ＥＬＩＳＡ定量を通じて発現量が高い細胞株を１０〜１０個ずつ選定した。

選定した各細胞株を２０ｎＭ ＭＴＸ (Methotrexate, Sigma 社、Cat. No. M8407）が含まれた培養培地下で継代しながら遺伝子増幅を行った。具体的には、Ｔ−２５フラスコに細胞が一杯になるまで培った後、細胞数を１／５、１／１０、１／１５に減らしながら継代して、最終１／１５の細胞数で継代した後、３〜４日後にＴ−２５フラスコが細胞で一杯になったら増幅を完了した。各誘導体に対して２０ｎＭ ＭＴＸを含んだ培養培地で増幅した細胞株中ＥＬＩＳＡ定量結果発現量が最も高いものを発現細胞株に選定し、生体内活性評価のための精製試料生産に使用した。

実施例７
ＣＨＯ／ｄｈｆｒ（−）細胞における天然型ｈＴＰＯおよびｈＴＰＯ誘導体の発現および精製

まず、天然型ｈＴＰＯおよびｈＴＰＯ誘導体試料を製造するために、実施例６で製造した天然型および各誘導体の発現菌株をセルファクトリー(cell factory; Nunc 社、Cat. No. 170069）を使用して４リットル大量培養した。１０％ＦＢＳが添加されたＩＭＤＭ培地で各発現菌株細胞を５×１０⁴ 細胞／ｍＬでセルファクトリーに継代して、７２時間経過後ＰＢＳで１回洗浄し、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ
Ｆ−１２培地に交替した。５％ＣＯ₂ 、３７℃で９６時間培養後、培養上澄み液を得た後、精製過程に入った。

ＣＭ Ａｆｆｉ−Ｇｅｌブルーレジン（Bio-Rad 社; Cat. No. 153-7304 ）５０ｍＬをＸＫ２６／２０カラム（Amersham-pharmacia 社; Cat. No. 18-1000-72 ）に充填後、緩衝液Ａ (10mM 燐酸ナトリューム、150mM 塩化ナトリューム、pH 7.4）で一晩充分に洗浄した。上記の培養上澄み液４リッターを５ｍＬ／分の速度でカラムを通過するようにさせ、２８０ｎｍでＵＶにモニターリングした。培養上澄み液を全て捨てた後、緩衝液Ｂ (10 mM 燐酸ナトリューム、2M尿素、pH7.4)でＵＶ数値が基底水準になるまで洗浄後、緩衝液Ｃ (10mM 燐酸ナトリューム、2M 尿素、1M 塩化ナトリューム、pH 7.4）でＴＰＯを含むレジンに付いた蛋白質を溶出させた後、この分割を集めて次の段階であるフェニルセパローズカラムクロマトグラフィーに付した。フェニルセパローズＣＬ４Ｂレジン(Sigma社; Cat. No. P7892)５０ｍＬをＸＫ２６／２０カラムに充填後、緩衝液Ｃで一晩充分に洗浄した。ＣＭ Ａｆｆｉ−Ｇｅｌブルー段階で得た溶出分割を３ｍＬ／分の速度でカラムに付して、２８０ｎｍでＵＶにモニターリングした。分割を全部捨てた次に緩衝液Ｃで、ＵＶ数値が基底水準になるまで洗った後、緩衝液ＢでＴＰＯを含んだレジンに付いた蛋白質等を溶出させた後、この分割を集めて、次の段階であるヒドロキシルアパタイトカラムクロマトグラフィー(hydroxylapatite column chromatography）に適用した。ヒドロキシルアパタイとレジン(Bio-Rad社; Cat. No. 130-0420 ）１０ｍＬをＸＫ１６／２０カラム(Amersham-pharmacia 社; Cat. No. 18-8773-01 ）に充填後、緩衝液Ｄ（10 mM 燐酸ナトリューム、2M尿素、pH 6.8）で一晩中、充分に洗浄する。フェニルセパローズ段階で得た溶出分割を、５Ｎ ＨＣｌでｐＨ６．８に調整後、１ｍＬ／分の速度で適用した。この段階では、ＴＰＯはレジンに付かないで流れ出て、不純蛋白質だけがレジンに付くため、流れ出た分割を集めた。緩衝液ＤでＵＶ数値が基底水準になるまで洗浄後、緩衝液Ｅ（0.5 M 燐酸ナトリューム、2M尿素、pH 6.8）でレジンに付いている不純蛋白質を溶出させた。ヒドロキシルアパタイト段階で得たＴＰＯ分割は、濃縮させるためにエコノパックＱカートリッジ（Econo-Pac Qcartridge, Bio-Rad 社; Cat. No. 732-0021 ）を利用して、１０ｍＬの体積に濃後、塩分および尿素成分を除去するために１０ｍＭの燐酸ナトリューム緩衝液で２４時間透析した。ｈＴＰＯ誘導体の各精製過程の産物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとシルバーステイニングで確認した（図９参照）。染色法は、シルバーステインプラスキット（Bio-Rad 社、Cat. No. 161-0449）を使用して製造社の実験法にしたがって実施した。

このようにして得た、ｈＴＰＯの精製試料で実施例５の時と同じ方法で１０μｇ／ｋｇの濃度で生体内活性試験を行った。処理した全ての誘導体は、血小板数の増加を刺戟しただけではなく、天然型ｈＴＰＯに比べて増強した活性を示した。具体的には、投与後１日目から１０日目まで全体的に天然型ｈＴＰＯに比べて、４０４３３誘導体は７７％、４０４３４誘導体は９１％、４０４４９誘導体は２６％、４０４５８誘導体は７９％の活性増加を示した（図１０参照）。

実施例８
ｈＴＰＯ誘導体の特性分析 :糖鎖導入可否確認および安定性分析
ｈＴＰＯ誘導体の糖鎖が導入されているかの可否を確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を実施して、ｈＴＰＯ誘導体のバンドが天然型ｈＴＰＯのバンドよりさらに重い方に現れるかの可否を確認した。

１０〜２０％句配トリシンポリアクリルアミドゲル(10 〜20% gradient tricine polyacrylamide gel, Novex社; Cat. No. EC66252）に精製された天然型ｈＴＰＯおよびｈＴＰＯ誘導体をローディングして１０Ｖ／ｃｍで電気泳動させた。このゲルをニトロセルロースフィルターに吸着させた。フィルターを１時間５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ溶液(pH 7.5)に処理した後、山羊の抗ヒトＴＰＯポリクローナル抗体（R&D system 社）を１：１０００の比率に稀釈し、１８時間反応させた。その後２次抗体として複合アルカリホスファターゼ−抗山羊ＩｇＧ（Sigma 社）を１：１００００の比率に稀釈して２時間処理し、発色基質のＢＣＩＰ／ＮＢＴ(Sigma）溶液加えて発色させた。その結果ｈＴＰＯ誘導体の分子量が、導入された糖鎖数に比例的に天然型ｈＴＰＯに比べて増加したことを確認した（図１１参照）。

ｈＴＰＯ誘導体の安定性可否を確認するために、天然型ｈＴＰＯとｈＴＰＯ誘導体の中から４０４３３誘導体にトロンビンを処理して時間変化によって蛋白質バンドの大きさが減少する様相を観察した。ｈＴＰＯ誘導体（50m/mL）にトロンビン（5 units/mL; Sigma 社）を処理後、３７℃でＯ．５、１、２、３、４、６時間反応させた後、上に書いた方法と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロット分析を実施して、蛋白質が切り放される様相を観察した。天然型ｈＴＰＯは、トロンビン処理３０分以後から顕著に切り放された一方、４０４３３誘導体はトロンビン処理４時間以後から切り放され始めた（図１２参照）。すなわち、これは天然型ｈＴＰＯに比べて４０４３３誘導体がさらに安定であることを示し、それは導入した糖鎖に起因すると見ることができる。

図１はオーバーラップ重合酵素連鎖反応を利用して突然変異ｈＴＰＯ誘導体ｃＤＮＡを製造する過程を図示したものである。１: 配列番号１のプライマー；２: 配列番号１のプライマー；Ｎ: Ｎ−プライマー；Ｃ: Ｃ−プライマー；Ｓ: シグナル配列； 図２は突然変異ｈＴＰＯ誘導体遺伝子を移動ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４に連結させる過程を示したものである。 図３はｐＣＤＴベクターに突然変異ｈＴＰＯ誘導体ｃＤＮＡをクローニングして動物細胞発現ベクターを作製する過程を図示したものである。 図４は、Ｍ−０７ｅ細胞増殖検定法で動物細胞にて発現したｈＴＰＯ誘導体の活性を測定して示したものである。 図５は天然型ｈＴＰＯを処理したマウスの血小板数を測定する方法で、生体内（in vivo）活性を検査して示したものである。 図６は動物細胞で発現したｈＴＰＯ誘導体を３６μｇ／ｋｇで処理したマウスの血小板数を測定する方法で、生体内活性を検査して示したものである。 図７ａは動物細胞で発現したｈＴＰＯを１０μｇ／ｋｇで処理したマウスの血小板数を測定する方法で生体内活性を検査して示したものである。 図７ｂは動物細胞で発現したｈＴＰＯを１０μｇ／ｋｇで処理したマウスの血小板数を測定する方法で生体内活性を検査して示したものである。 図８は天然型ｈＴＰＯおよびｈＴＰＯ誘導体遺伝子を包む動物細胞ｄｈｆｒ増幅発現ベクターを作製する過程を図示したものである。 図９はｈＴＰＯ誘導体の各精製過程の産物でＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施後、銀染色法に付した結果を示したものである。レーンＭ：マーカー、レーン１：培養上澄み液、レーン２：ＣＭイオン交換アフィニティーカラム分割、レーン３：フェニルセパローズカラム分割、レーン４：ヒドロキシルアパタイトカラム分割、レーン５：Ｑカートリッジカラム分割 図１０は天然型ｈＴＰＯおよび精製されたｈＴＰＯ誘導体を１０μｇ／ｋｇで処理したマウスの血小板数を測定する方法で、上記誘導体の生体内活性を検査して示したものである。 図１１は精製された天然型ｈＴＰＯおよびｈＴＰＯ誘導体にＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施後、ウエスタンブロット分析に付した結果を示したものである。レーンＭ：マーカー、レーン１：天然型ｈＴＰＯ、レーン２：４０４３３、レーン３：４０４３４、レーン４：４０４４９、レーン５：４０４５８ 図１２ａは精製された天然型ｈＴＰＯ形をトロンビンで処理後、時間経過による変化様相をウエスタンブロットで示したものである。レーンＭ：マーカー、レーン１：トロンビン処理前、レーン２：トロンビン処理後３０分、レーン３：トロンビン処理後１時間、レーン４：トロンビン処理後２時間、レーン５：トロンビン処理後３時間、レーン６：トロンビン処理後４時間、レーン７：トロンビン処理後５時間 図１２ｂは精製された４０４３３誘導体をトロンビンで処理後、時間経過による変化様相をウエスタンブロットで示したものである。レーンＭ：マーカー、レーン１：トロンビン処理前、レーン２：トロンビン処理後３０分、レーン３：トロンビン処理後１時間、レーン４：トロンビン処理後２時間、レーン５：トロンビン処理後３時間、レーン６：トロンビン処理後４時間、レーン７：トロンビン処理後５時間

Claims (12)

1. 配列番号３０により記載される天然型ヒトトロンボポイエチン（ｈＴＰＯ）の誘導体として、Ｎ−連結型糖鎖が導入され、［Ａｓｎ¹⁰⁸ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹¹⁷ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹⁴⁷ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹⁵³ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹⁶⁴ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹⁹³ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹¹⁷ 、Ａｓｎ¹⁴⁷ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹¹⁷ 、Ａｓｎ¹⁶⁴ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹⁰⁸ 、Ａｓｎ¹⁴⁷ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹⁰⁸ 、Ａｓｎ¹⁶⁴ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹⁴⁷ 、Ａｓｎ¹⁶⁴ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹¹⁷ 、Ａｓｎ¹⁴⁷ 、Ａｓｎ¹⁶⁴ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹⁰⁸ 、Ａｓｎ¹⁴⁷ 、Ａｓｎ¹⁶⁴ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹⁰⁸ 、Ａｓｎ¹¹⁷ 、Ａｓｎ¹⁶⁴ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹⁵⁷ 、Ａｓｎ¹⁶⁴ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹⁶² 、Ｓｅｒ¹⁶⁴ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹⁶² 、Ｔｈｒ¹⁶⁴ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹⁵³ 、Ｓｅｒ¹⁵⁵ 、Ａｓｎ¹⁶⁴ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹⁵³ 、Ｔｈｒ¹⁵⁵ 、Ａｓｎ¹⁶⁴ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹⁵⁹ 、Ｓｅｒ¹⁶¹ 、Ａｓｎ¹⁶⁴ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹⁵⁹ 、Ｔｈｒ¹⁶¹ 、Ａｓｎ¹⁶⁴ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹⁶⁶ 、Ｓｅｒ¹⁶⁸ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹⁶⁶ 、Ｔｈｒ¹⁶⁸ ］ｈＴＰＯ、および［Ａｓｎ¹⁶⁴ 、Ａｓｎ¹⁶⁸ ］ｈＴＰＯからなる群から選択されるヒトトロンボポイエチン誘導体。
2. ［Ａｓｎ¹⁶⁴ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹⁹³ ］ｈＴＰＯ、［Ａｓｎ¹⁰⁸ 、Ａｓｎ¹¹⁷ 、Ａｓｎ¹⁶⁴ ］ｈＴＰＯ、または［Ａｓｎ¹⁵⁷ 、Ａｓｎ¹⁶⁴］ｈＴＰＯである請求項１記載のヒトトロンボポイエチン誘導体。
3. 請求項１記載のヒトトロンボポイエチン誘導体をコードする再組換えヒトトロンボポイエチン遺伝子。
4. ヒトトロンボポイエチン誘導体が請求項２記載のヒトトロンボポイエチン誘導体である請求項３記載の再組換えヒトトロンボポイエチン遺伝子。
5. 請求項３記載の遺伝子を含む真核細胞用発現ベクター。
6. ｐ４０４３３、ｐ４０４３４、ｐ４０４４９、ｐ４０４５８、ｐＤ４０４３３、ｐＤ４０４３４、ｐＤ４０４４９またはｐＤ４０４５８である請求項５記載の真核細胞用発現ベクター。
7. 請求項６記載の発現ベクターｐ４０４３３で形質転換された哺乳動物細胞株ＣＨＯ Ｋ−１／ｐ４０４３３（ＫＣＴＣ ０４９５ＢＰ）。
8. 請求項６記載の発現ベクターｐＤ４０４３４で形質転換された哺乳動物細胞株ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４３４（ＫＣＴＣ ０６３０ＢＰ）。
9. 請求項６記載の発現ベクターｐＤ４０４４９で形質転換された哺乳動物細胞株ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４４９（ＫＣＴＣ ０６３１ＢＰ）。
10. 請求項６記載の発現ベクターｐＤ４０４５８で形質転換された哺乳動物細胞株ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４５８（ＫＣＴＣ ０６３２ＢＰ）。
11. 請求項３記載の再組換えヒトトロンボポイエチン遺伝子を含む哺乳動物細胞株を培養してヒトトロンボポイエチン誘導体をえることを特徴とする請求項１記載のヒトトロンボポイエチン誘導体の製造方法。
12. 請求項１記載のヒトトロンボポイエチン誘導体を有効成分とする血小板減少症治療剤。

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