JPS63301798A - コロニー刺激因子誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 本発明は一般に、蛋白質の生産に関し、さらに詳しくは
、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子に類似す
る活性を有する新規な蛋白質に関する。

〔従来の技術〕

コロニー刺激因子（ＣＳＦ）は、培養において造血系子
孫細胞の生存、増殖および分化のために要求される酸性
糖蛋白質である（ＢｕｒｇｅｓｓおよびＭｅｔｃａｌｆ
、　Ｂｌｏｏｄ　　５６　：９４７−９５８　、１９８
０）　、機能的には、種々のＣＳＦが半固体の培養にお
いて生成された造血系コロニーのタイプによって定義さ
れた。

それゆえ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（
ＧＭ　−ＣＳＦ）は、顆粒球、マクロファージ、または
両者の細胞のタイプの組み合わせを含有するコロニーを
生じさせる子孫の増殖を刺激する（Ｗｏｎｇ等、　５ｃ
ｉｅｎｃｅ　２２８　：　８１０−８１５　、１９８５
）　、　ＧＭ−ＣＳＦに加えて、顆粒球ＣＳＦ　（ＧＭ
　−ＣＳＦまたはＣＳＦ　β）、マクロファージＣＳＦ
　（Ｍ−ＣＳＦまたはＣＳＦ　−１）およびマルチ−Ｃ
ＳＦ　（またはＩＬ−３）は特徴づけられ、そしてヒト
起源からクローニングされてきた（Ｓｏｕｚａ等、　５
ｃｉｅｎｃｅ　　２３２　：　６１−６５　、１９８６
　；　Ｋａｗａｓａｋｉ等。

５ｃｉｅｎｃｅ　　２３１　：　２９０−２９６．１９
８５；Ｙａｎｇ等、譚旦、ｕ。

３−１０　、１９８６）。

コロニー刺激因子は種々の生理学的機能を有する蛋白質
である。Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ等＋（Ｐｒｏｃ、　　Ｎ
ａ工ＬＡｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　　８３：３
１０１−３１０５．１９８６）およびその他（Ｅｍｅｒ
ｅｓｏｎ等、　Ｊ、　　Ｃｌ１ｎ、　　Ｉｎｖｅｓｔ、
　　７６　：１２８６−１２９０　、１９８５）は、Ｃ
Ｏ５−１細胞中で発現された組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ　
（ｈＧＭ−Ｃ５）が、好中球、好酸および単球−マクロ
ファージ子孫細胞を刺激するばかりでなく、かつまたエ
リトロポイエチン、赤血球、および赤血球−非赤血球混
合物コロニー形成細胞の存在下に、巨核球コロニー形成
細胞を刺激することを発見した。さらに、ｈＧＭ　−Ｃ
ＳＦは、成熟好中球を刺激して炎症部位に局在化しくＷ
ｅｔｓｂａｒｔ等、　Ｎａｔｕｒｅ　　３１４　：　３
６１−３６３．１９８５）　、成熟好酸球および筆法を
刺激して活性化するようになり、かつそれらのせん虫の
死亡を増大しくＨａｎｄｍａｎおよびＢｕｒｇｅｓｓ　
、　、Ｌ、　ｊｌｕ旗−１２２，：　１１３４−１１３
７゜１９７９　；　Ｖａｄａｓ等；　Ｂｌｏｏｄ　６１
　：　１２３２−１２４１　、１９８３）、そして成熟
単球およびマクロファージを刺激して食作用および腫瘍
細胞の死亡を増大する（Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ等、　５ｃ
ｉｅｎｃｅ　　２３２　：　５０６−５０８　、１９８
６）　ことが示された。これらのｉｎ　ｖｉｔｒｏの活
性に加えて、組換えｈＧＭ　−ＣＳＦは、最近霊長類に
おいてｉｎ　ｖｉｖｏでの造血を刺激することが証明さ
れた（Ｄｏｎａｈｕｅ等。

Ｎａｔｕｒｅ　　２３１　：　８７２−８７５．１９８
６）。

ヒトＧＭ　−ＣＳＦは、ヒトＧ−ＣＳＦまたはプルリボ
イエチン（ｐｌｕｒｉｐｏｉｅｔｉｎ）と区別され、ヒ
トＭ　−ＣＳＦ（Ｋａｗａｓａｋｉ等、　５ｃｉｅｎｃ
ｅ　　２３０　：　２９１−２９６．１９８５）（また
ＣＳＦ−１とも呼ばれる）と機能的に区別され、そして
ヒトマルチ−ＣＳＦ（Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ上
り、４７゜３−１０．１９８６）　（またＩＬ−３とし
ても知られている）と区別される。ＧＭ　−ＣＳＦは赤
血球、好酸球、好中球、単球および巨核球の細胞を刺激
するが、マスト細胞のコロニーを刺激せず、そしてヒト
細胞に対して特異的である。対照的に、ヒト　Ｍ−ＣＳ
Ｆ（約４４ｋＤａのへテロダイマー）は単球／マクロフ
ァージのコロニー形成をほとんど独占的に刺激し、ヒト
Ｇ−ＣＳＦは主として好中球の形成を刺激するが、好酸
球のコロニーを刺激せず、赤血球および混合赤血球／非
赤血球のコロニー形成を、顆粒球または顆粒球／マクロ
ファージのコロニー形成の刺激に必要であるよりも１０
倍高い濃度においてのみ刺激し、そしてまた、ネズミ好
中球のコロニー形成を刺激し、そしてヒト多−ＣＳＦは
マスト細胞のコロニー形成を刺激する。

組換えＧＭ　−ＣＳＦは、いくつかの系において生産さ
れてきた。このような系の列は、次の開示において見出
される。（ａ）Ｇｏｌｄｅ等（米国特許第４、４３８．
０３２号）、これはＭｏの細胞系から誘導されたｃＤＮ
Ａを使用する旦、印旦中でのヒトＧＭ　−ＣＳＦの生産
を記載している；（ｂ）欧州特許１８３．３５０号およ
びＧｒａｂｓｔｅｉｎ等（前掲）、これは酵母中でのヒ
トＧＭ　−ＣＳＦの生産を記載している；（ｃ）ＰＣＴ
出願ＷＯ／８５０４１８８号、これは細菌および哺乳動
物の宿主細胞中で発現されうる、ネズミＧＭ　−ＣＳＦ
をエンコードするｃＤＮＡを記載している：並びに（ｄ
）ＰＰＣＴ出願−〇／８６０３２２５号およびＰＣＴ出
願賀０／８６００６３９号、これらの両者は旦、並置お
よび他の宿主細胞中の組換えヒトＧＭ　−ＣＳＦの生産
を記載している。

組換えヒｌ−ＧＭ　−ＣＳＦが入手可能である以前にお
いて、多くの研究は対応するネズミ蛋白質について実施
された。ヒトおよびネズミのＧＭ　−ＣＳＦは６０％の
相同性である（Ｗｏｎｇ等、前掲）が、マウス蛋白質は
ヒト顆粒球またはマクロファージ子孫細胞に結合せず、
またそれらを刺激しない（ＭｅＬｃａｌｆ　、５ｃｉｅ
ｎｃｅ　　２２９　：　１６−２２　、１９８５）　、
ネズミＧＭ　−ＣＳＦはまた、５ｐａｒｒｏ−等（Ｐｒ
ｏｃ、　　Ｎａ土ＬＡｃａｄ、　　Ｓｅｉ、　　ＵＳＡ
　　８２：２９２−２９６　、１９８５）およびＤｅＬ
ａｍａｒｔｅｒ等（ＥＮＢＯＪ、　　４：２５７５−２
５８１．１９８５）によって生産された。

インビトロおよび現在インビボでのｈＧＭ　−ＣＳＦの
生理学を瑠り巻く知識の発展にもかかわらず、成長因子
の４１１々の機能的性質の原因となる構造的面について
ほとんど知られていない。例えば、ＣＳＦは高度にグリ
コジル化された分子である。

しかしながら、Ｄｏｎａｈｕｅ等、　Ｎａｔｕｒｅ　　
３２１　：　８７２−８７５．１９８６）は、旦、延中
で生産された非グリコジル化ＧＭ　−ＣＳＦを研究し、
そして炭水化物の欠乏がｉｎ　ｖｉｔｒｏの活性にほと
んど影響を与えないことを結論した。さらに、Ｗｏｎｇ
等、　　（Ｃａｎｃｅｒ　　釦旦３　　：　　２３５−
　２４１　　、Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂ
ｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、　１９８５）は、天然および組換
えのＧＭ　−ＣＳＦが１５ｋＤおよび２３ｋＤａの間で
変化する分子量を示すことを観察した。彼らは、これを
、精製における区別的炭水化物の付加または区別的炭水
化物の損失に起因させたが、種々の分画の比活性または
生物学的性質における差を検出しなかった。さらに、最
近、すべての炭水化物を欠＜ＧＭ−ＣＳＦは赤血球の子
孫細胞の成長を支持することができないことが発見され
た（Ｂｕｒｇｅｓｓ等、坦μ星　監＝４３−５１．１９
８７　）。

糖蛋白質の炭水化物部分の生理学的役割は不明瞭のまま
である。ＡｓｈｗｅｌｌおよびＭａｒｔｅｌｌ（Ａｉｄ
ｉ。

Ｅｎｚ　ｍｏｌ、　Ｒｅ１ａｔ、　Ａｒｅａｓ　Ｍｏ１
．　Ｂｉｏｌ、　　４１　：　９９−１２８＋１９７４
）は、循環中の生存の増大、移送のための血漿帯白質へ
の結合の増強、または蛋白質溶解性の増大を包含する、
炭水化物の種々の機能を示唆した。Ｈｏｆｆｍａｎ等（
Ｊ　、　Ｃｌ１ｎ、　　Ｉｎｖｅｓｔ、　　７５　：　
１１７４−１１８２　、１９８５）は、巨核球のコロニ
ーの脱グリコジル化が生物学的活性を損失させることを
発見した。

同様に、ＳａｉｒａｍおよびＢｈａｒｇａｖｉ　（Ｓｃ
ｔｅｎｃｅ　　２２９　：６５−６７、１９８５）は、
糖蛋白質のホルモンのα−サブユニットの炭水化物の部
分が細胞中への生物学的シグナルのトランスダクション
に関与することを発見した。

〔発明が解決しようとする課題〕

−Ｃに、ＧＭ　−ＣＳＦは、応答性細胞のタイプの増殖
が望まれる種々の臨床的応用において使用できる。これ
らの応用は、化学療法および骨髄の移植を包含する。し
かしながら、先行技術の不明確な特性をかんがみて、天
然ヒトＧＭ　−ＣＳＦに類似する活性を示す蛋白質を生
産する、いっそう首尾一貫した方法を開発すること、お
よび天然分子より高い特異的活性を有するこのような蛋
白質を開発することは有利であろう。本発明は、この要
求を満足し、そしてさらに、他の関連する利点を提供す
る。

〔課題を解決するための手段〕

簡単に述べると、本発明は、ヒｌ−ＧＭ−ＣＳＦと実質
的に同一の生物学的活性を有する、種々の独特の蛋白質
、ならびに天然ヒｌ−ＧＭ　−ＣＳＦより高い比活性を
有する蛋白質を開示する。本発明の１つの面において、
蛋白質はグリコジル化されていないが、他の面において
、蛋白質はＮ−結合グリコシル化に欠けるが、〇−結合
グリコシル化を有する。

なお他の面において、天然ヒトＧＭ　−ＣＳＦに特徴的
な２つのＮ−結合炭水化物類の１つを欠く。

後述する特定の実施態様の範囲内で、蛋白質は次の配列
を有する：（ａ）番号１８のアラニンから出発し、そし
て番号１４４のグルタミン酸で終る第１図のアミノ酸配
列を有する；（ｂ）番号１８のアラニンから出発し、そ
して番号１４４のグルタミン酸で終る第２図のアミノ酸
配列を有する；および（ｃ）番号１８のアラニンから出
発し、そして番号１４４のグルタミン酸で終る第３図の
アミノ酸配列を有する。これらの蛋白質をコードするＤ
ＮＡ配列もまた開示される。

本発明の関連する１つの面において、天然ヒトＧＭ　−
ＣＳＦより高い比活性を有する蛋白質を生成する方法が
開示される。簡単に述べると、この方法は、（ａ）真核
生物の宿主細胞中に発現単位を導入し、この発現単位は
プロモーターおよびこれに続く下流のここに開示する蛋
白質の１つをコードするＤＮＡ配列を含んでなり、（ｂ
）真核生物の宿主細胞を適当な培地中で増殖せしめ、そ
して（ｃ）ＤＮＡ配列によってコードされておりかつ真
核生物の宿主細胞によって生産された蛋白質生成物を分
離することを含んでなる。これに関して適当な真核生物
の宿主細胞は、哺乳動物、昆虫、酵母および糸状真菌宿
主細胞を包含する。

本発明のなお他の面は、有効量のここに記載する蛋白質
の１つ、および生理学的に許容されうる担体または希釈
剤を含んでなる医薬組成物を開示する。

本発明のこれらの目的および他の目的は、以下の詳細な
説明および添付図面を参照すると明らかとなるであろう
。

第１図は、Ｎ−結合炭水化物類を欠＜ＧＭ−ＣＳＦのア
ミノ酸配列を、この蛋白質をコードするヌクレオチド配
列と一緒に示す、成熟蛋白質をはミノ酸１８　（Ａｌａ
）から始まる。星印は、変更されたコドンの位置を示す
。

第２図は、Ｎ−結合炭水化物および〇−結合炭水化物を
欠＜ＧＭ−Ｃ５１７のアミノ酸配列を、この蛋白質をコ
ードするヌクレオチド配列と一緒に示す。

成熟蛋白質はアミノ酸１８　（Ａｌａ）から始まる。

第３図は、アミノ酸４４においてＮ−結合炭水化物を欠
＜ＧＭ−ＣＳＰのアミノ酸配列、およびコーディングヌ
クレオチド配列を示す、成熟蛋白質はアミノ酸１　Ｂ　
（Ａｌａ）から始まる。

第４図は、発現ベクターｐＤＸの造成を示す。

使用した記号は次の通りである：　Ｅ、　ＳＶ４０エン
ハンサ−；ｏｒｉ、アデノウィルス５からの０−１マツ
プ単位；　Ａｄ２　ＭＬＰ　、アデノウィルス２からの
主要後期（ｌａｔｅ）プロモーター；Ｌｌ−３、アデノ
ウィルス２のトリパルタイト（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）
リーダー配列；５’ｓｓ、５°スプライス（ｓｐｌｉｃ
ｅ）部位；３’ｓｓ、。

３°スプライス部位；　ｐＡ、　ＳＶ４０ポリアデニル
化シグナル；−１ｐＢＲ３２２ｒポイズン（ｐｏｉｓｏ
ｎ）　Ｊ配列の除去部位。

第５図は、ＣＯ５−１細胞中で生産された組換えヒト　
ＧＭ　−ＣＳＦの天然および突然変異体の形態を示す、
蛋白質を、ＳＤＳ　−ＰＡＣｆ！によって大きさで分画
し、ニトロセルロースに移し、ヒトＧＭ−ＣＳＦ特異的
抗血清でブロービングし、そしてヤギ抗ウサギビオチン
ーアビジンーペルオキシダーゼ複合体で発色した。レー
ン１　、ＨＰＬＣ−精製した天然ＧＭ−ＣＳＦ　　；レ
ーン２、天然ＧＭ−ＣＳＦ　　ｉレーン３、Ｎ−結合炭
水化物を欠＜ＧＭ−ＣＳＦ　　；レーン４、〇−結合炭
水化物を欠＜ＧＭ−ＣＳＦ　　：レーン５、すべての炭
水化物を欠＜ＧＭ−ＣＳＦ　　；レーン６、炭水化物が
酵素的手段によって除去されたＧＭ−ＣＳＦ　　；レー
ン７、分子量のマーカー、すべてのレーンは、半分だけ
多くの単位を含有するレーン３を除外して、ＧＭ−コロ
ニー−刺激活性の等しい数値の生物学的活性単位を含有
する。

第６Ａ図、第６Ｂ図、および第６Ｃ図は、ヒヒにおける
ＭｌｔｅえＧＭ　−ＣＳＦの薬理動態の結果を示す。

本発明を記載する前に、以後使用するいくつかの用語の
定義を記載することは、本発明の理解に役立つであろう
。

生豆ヱｍ話並：生物学的な関係において（すなわち、生
物体においてまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏの模倣において）
分子により発揮される機能または機能の組み。ヒトＧＭ
　−ＣＳＦについて、生物学的活性はある種の造血系子
孫細胞の増殖および分化によって特徴づけられる。ヒｌ
−ＧＭ　−Ｃ５Ｐは、好中球、好酸球、単球および巨核
球の細胞、ならびにエリトロポイエチンの存在下での赤
血球系細胞を刺激する。

几輩ユニ活性／単位質量で表わした、ある蛋白質に関連
する生物学的活性の量的記載、天然ヒトＧＭ　−Ｃ５Ｐ
について、比活性は４〜８×１０１単位／■の範囲内で
あることが決定された０本発明の範囲内で、用語「より
高い比活性」は約４Ｘ１０”単位／■より大きい比活性
を示す蛋白質を包含する。

光■華亘：主要なヌクレオチド配列の転写を指令しかつ
調節する他のヌクレオチド配列と一緒に、問題の蛋白質
をコードする主要なヌクレオチド配列を含んでなるＤＮ
Ａ構成構成体０単現単、少なくとも主要なヌクレオチド
配列および、前記主要なヌクレオチド配列から上流に位
置しかつそれと作用可能に結合したプロモーター配列を
包含する。

追加の遺伝子要素をも含めて発現の効率を増大すること
ができる。これらの要素は、転写ターミネイター、ポリ
アデニル化シグナル、エンハンサ−配列、リーダー、お
よびＲＮＡスプライス部位を包含する。

本発明の新規な蛋白質は、応答性細胞タイプの増殖が望
まれる種々の臨床的応用において使用できる。これらの
応用は化学療法を包含し、ここでこれらの蛋白質を使用
することによって、細胞毒性薬物誘発白血病からの回復
をｈａ速することができ、これらの蛋白質はこのような
治療のいっそう集中的使用を可能とすることができる。

これらの蛋白質を使用する処置はまた、骨髄毒性薬物の
より頻繁な使用、骨髄移植の間の骨髄分離からの速い回
復を可能とし、そして骨髄の増殖過多の状態、例えば、
無形成貧血における白血球生成を改良することができる
。さらに、白血球供与体として利用される人における中
球生産を増大することができる。これらの蛋白質はまた
、圧倒的な細菌、真菌または寄生体が感染した患者にお
いて、あるいは非応答性の癌をもつ患者において、非特
異的防御機構を増大するために使用できる０本発明のあ
る蛋白質は、より高い比゛活性のため、天然ＧＭ　−Ｃ
ＳＦよりもさらに有利である。この増大した活性は、よ
り少ない物ｆ／患者／投与の使用を可能とし、これによ
り望ましくない副作用、例えば、毛管漏出の症候群を減
少することを期待することができる。この症候群は組換
え天然ＧＭ　−ＣＳＦの治療的使用で観察された（Ｂｒ
ａｎｄｔ等、　Ｂｌｏｏｄ　　７０　：　５ｕｐｐｌ。

１　、１９８７）。

患者への投与のため、本発明の精製した蛋白質を日常の
手順に従って医薬として許容されうる担体または希釈剤
と混合する。典型的には、このような組成物は滅菌した
５％のデシストロースまたは生理学的食塩水中の溶液か
らなり、滅菌について試験され、そして、例えば、リム
ラス（Ｌｉｍｕｌｕｓ）アメーバ一様細胞アッセイ系に
よって、内毒素の汚染の不存在について評価されるであ
ろう、治療用配合物は、静脈内注入または皮下注射によ
って投与されるであろう、配合物はまた、必要に応じて
、他の治療剤を含有することができる。投与は、患者の
特徴および処置する状態の性質および過酷さに基づいて
決定され、これらは当業者にとって明らかであり、そし
て当業者の技量の範囲内であろう。

グリコジル化されないＧＭ　−ＣＳＦを生産するための
従来のほとんどの試みは、原核生物の宿主細胞の使用に
幀り、これはＮ−結合グリコシル化および〇−結合グリ
コシル化のいずれも付加しなかった。したがって、得ら
れる蛋白質は余分のアミノ末端メチオニン残基を含有す
る。このメチオニンは、ヒトの体によって異質と認識さ
れるか、あるいはそうでなければ蛋白質の活性に影響を
及ぼすことがある。対照的に、本発明はグリコジル化さ
れていない蛋白質、またはＮ−結合グリコシル化に欠け
るが、〇−結合グリコシル化を有する蛋白質、または天
然ヒトＧＭ　−ＣＳＦに特徴的である２っのＮ−結合炭
水化物鎖の１つを欠く蛋白質を提供し、これらの蛋白質
はトランスフェクションした哺乳動物の細胞中で生産さ
れる。これらの蛋白質は天然ヒトＧＭ　−ＣＳＦの生物
学的活性を有し、そしより高い比活性を有することがで
きる。さらに、本発明の蛋白質はアミノ末端メチオニン
をもたない。

本発明の蛋白質は、トランスフェクションまたは形質形
成された宿主細胞中で突然変異したＤＮＡ配列を発現す
ることによって生産される。

ＧＭ　−ＣＳＦをコードするｃＯＮＡは、ｃＤＮＡライ
ブラリーから、普通の手順によって得ることができる（
例えば、Ｗｏｎｇ等、前掲の手順）。あるいは、ｃＤＮ
＾は、ここに記載するように、クローニングしたヒｌ−
ＧＭ　−ＣＳＦ遺伝子を発現するトランスフェクション
した哺乳動物細胞から得ることができる。

ヒトＧＭ　−ＣＳＰゲノムのクローンは、Ｋａｕｓｈａ
ｎｓｋｙ等。

（前掲）によって開示されている。このような細胞はＧ
Ｍ　−ＣＳＦ特異的ｍＲＮＡの冨む入手源である。

ｈＧＭ　−ＣＳＦのアミノ末端残基の遺伝情報を指定す
る配列より上流の翻訳の開始および停止のシグナルを除
去することによって、生物学的に活性な蛋白質は、ＣＯ
５−１中でＳＶ４０　ｏｒｉに基づく発現系を使用して
、無傷の遺伝子から高いレベルで発現された。ノザン・
プロット分析によって直接比較すると、一時的に発現す
るｃｏｓ−を細胞は、レクチン刺激リンパ球よりほぼ１
０倍高いレベルのＧＭ−ＣＳＦ特異的ｍＲＮＡを有し、
そしてそれ故にこのようなｍＲＮＡの富かな入手源であ
る。λｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリーをこれらのｃｏ
ｓ−を細胞のｍＲＮＡから調製するとき、このライブラ
リーにおける独立のＭ１換えｃＤＮＡクローンのほぼ０
．１％がｈＧＭ　−ＣＳＦ特異的であることが発見され
た。評価したクローンのすべてが適切なイントロンのス
プライシングを示し、そして配列決定したクローンのす
べてがｈＧＭ　−ＣＳＦｃＤＮＡの完全なコピーを含有
した。最後に、このｃＤＮＡは、ゲノムのｃＤＮＡに比
較して、生物学的に活性なｈＧＭ　−ＣＳＦの高いレベ
ルの合成を指令した。

いったんｈＧＭ　−ＣＳＦについての完全なｃＤＮＡが
得られた後、部位特異的（ｓｉｔｅ　−ｄｉｒｅｃｔｅ
ｄ）突然変異誘発（ＺｏｌｅｒおよびＳｍ１ｔｈ　　、
　用値、　、３−　：　４７９−４８８゜１９８４）を
使用して配列を変更した。二重突然変異体を単一な反応
において発生させ、もはやいずれの天然部位においても
Ｎ−結合グリコシル化されえないポリペプチドの遺伝情
報を指定するｃＤＮＡを得た。追加の突然変異誘発は、
もはや〇−結合グリコシル化できない突然変異および両
者の形態の炭水化物を欠いた突然変異を発生した。単一
のグリコジル化部位は、また、個々に除去することがで
きる。Ｎ−結合グリコシル化部位におけるＡｓｎ残基（
配列Ａｓｎ　−Ｘ　−５ｅｒ　／Ｔｈｒ　、ここでＸは
いずれかのアミノ酸である）を他のアミノ酸残基に変更
することによって、グリコジル化を遮断することができ
る＊　Ａｓｎ残基をＧｉｎ残基に変えることがとくに好
ましい、　Ａｓｎは、また、ＳｅｔまたはＴｈｒに変え
るえることができる。さらに、配列中の他の変更を、コ
ードされる蛋白質のグリコジル化を遮断する目的で導入
することができる。例えば、配列Ａｓｎ　−Ｘ　−３ｅ
ｒ　／Ｔｈｒの第２位置のプロリン残基はグリコジル化
阻止することができる（Ｍａｒｓｈａｌｌ、　　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、　　５ｏ９−Σν１４０　：　１７−２６＋
１９７４）。他の置換を、この位置において行うことも
できる。Ｎ−結合グリコシル化部位の第３アミノ酸は、
また、好ましくは八Ｉａ、　Ｃｙｓ　、　Ｇｌｙ、Ａｓ
ｎまたはＧｉｎに変化させることができる。〇−結合炭
水化物鎖は、通常プロリンによって挟まれている（ｆｌ
ａｎｋｅｄ）されている、セリンまたはスレオニンの残
基へ結合される。〇−結合グリコシル化は、セリンまた
はスレオニンを他のアミノ酸、好ましくはアラニンで置
換することによって、あるいはフランキングプロリンを
他のアミノ酸で置換することによって遮断することがで
きる。

糖蛋白質の１またはそれより多い炭水化物部分は循環中
の蛋白質の維持に寄与しうるので、ある場合において、
炭水化物のあるものを保持することが好ましいことがあ
る。本発明者らは、例えば、Ｎ−結合炭水化物を欠く蛋
白質上に〇−結合炭水化物を保持する場合、得られる蛋
白質は完全にグリコジル化されていない蛋白質の増大し
た活性を有し、そして循環中で増大した維持性を有する
ことができることを発見した。さらに、単一のＮ−結合
炭水化物側鎖の保持が、組換え細胞培養中の蛋白質の生
産の効率を増大せしめることができる。

こうして、〇−結合炭水化物のみ、あるいは０−結合炭
水化物および１つのＮ−結合炭水化物を保持するように
変更された分子は、自然ＧＭ　−ＣＳＦおよび完全にグ
リコジル化されていない蛋白質の両者もよりも有意な利
点を提供できる。

次いで、突然変異せしめたｃＤＮＡ配列を発現ベクター
中に挿入し、そしてトランスフェクションＣＯ５−１（
ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５０）中で発現せしめた。他の培
養した哺乳動物細胞系、例えば、ＢＨに（ＡＴＣＣＣＣ
Ｌ　１０）、２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５７３）、Ｃ
ＨＯ（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）　、Ｊ５５８Ｌ（ＡＴＣＣ
ＴＩＢ　６）およびＢＩＩＫ　ｔｋ−ｔｓ１３（Ｗａｅ
ｃｈｔｅｒおよびＢａｓｅｒｇａ＋　　　　　　　　　
　　’奥　到：　１１０６−１１１０．１９８２）細胞
系、ならびに他のタイプの宿主細胞も使用できる。

哺乳動物細胞中で使用するための発現ベクターまたは発
現単位は、哺乳動物細胞中に導入されたクローニングさ
れた遺伝子の転写を指令できるプロモーターを含有する
。とくに好ましいプロモーターは、ＳＶ４０　（Ｓｕｂ
ｒａｍａｎｉ等、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ旧ｏ１゜土：　
８５４−８６４．１９８１）　、ＭＴ−１（Ｐａｌｓ＋
１ｔｅｒ等、　５ｃｉｅｎｃｅ％ス：　８０９−８１４
．１９８３）　、およびアデノウィルス２主要後期プロ
モーターを包含する０発現ベクターは、また、発現すべ
きＤＮＡ配列のための挿入部位より下流に位置する、ポ
リアデニル化シグナルを含有できる。ウィルスのポリア
デニル化シグナル、例えば、ＳＶ４０からの初期または
後期ポリアデニル化シグナルあるいはアデノウィルス５
：ＥＪｂ領域からのポリアデニル化シグナルが好ましい
。

発現ベクターはまた、ＲＮＡスプライシング部位および
ウィルスのリーダー配列、例えば、アデノウィルス２ト
リパルタイトリーダー（プロモーターとＲＮＡスプライ
シング部位との間に位置する）を含むことができる。好
ましいベクターは、また、エンハイサー配列、例えばＳ
Ｖ４０エンハンサ−を含むことができる。

次いで、クローニングしたＤＮＡ配列を、培養した哺乳
動物細胞中に、リン酸カルシウム仲介トランスフェクシ
ョン（Ｗｉｇｌｅｒ等、堕旦、ト段、　７２５゜１９７
８　ｉ　ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍ
ａｔｉｃ　　Ｃｅ旦Ｇｅｎｔｉｃｓ　　７　：　６０３
　　、１９８１　；　ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ　ｄｅ
ｒＥｂ、　ｕ皿旦■５２　：　４５６　　、１９７３）
　、またはエレクトロポレイション（ｅｌｅｃｔｒｏｐ
ｏｒａｔｉｏｎ）　（Ｎｅｕｍａｎｎ等。

Ｅ？ＩＢＯＪ、　　土：　８４１−８４５　　、１９８
２）によって導入できる。ある比率の細胞はＤＮＡを取
り込み、そしてそれを細胞の内に数日間維持する。小比
率の細胞（典型的には１０４細胞中１細胞）はＤＮＡを
ゲノム中に組み込むか、あるいはＤＮＡを非染色体各構
造中に維持する。これらの組み込み体を同定するために
、選択可能な表現型を与える遺伝子（選択遺伝標識）が
、一般に、問題の遺伝子と一緒に導入される。好ましい
選択遺伝標識は、薬物、例えば、Ｇ−４１８およびメト
トレキセイトに対する耐性を与える遺伝子である。選択
遺伝標識は、問題の遺伝子と同時に別のプラスミド上で
細胞中に導入でき、あるいは同一プラスミド上で導入で
きる。好ましい選択遺伝標識は、薬物メトトレキセイト
に対する耐性を付与する遺伝子である。また、「担体Ｄ
ＮＡＪとして知られている追加のＤＮＡを、細胞中に導
入する混合物に添加することは有利でることがある。細
胞がＤＮＡを取り込んだ後、・細胞をある期間、典型的
には１〜２日間、増殖させて問題の遺伝子の発現を開始
させる。次いで、安定な態様で選択遺伝標識を発現して
いる細胞の増・殖について選択するために、薬物選択を
適用する。このような細胞のクローンを、問題の蛋白質
の発現についてスクリーニングすることができる。

真核微生物、例えば、酵母サツカロミセス・セレビシェ
−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｓｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）　、または糸状真菌、例えば、アスペルギルス（
Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ）も宿主細胞として使用できる
。

アスペルギルスのとくに好ましい種は、Ａ、ニドランス
（Ａ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）　、Ａ、ニガー（人、　恒
ｌ猛）Ａ、オリゼー（Ａ　、　肛■ｕ）　、およびＡ、
テレウス（人、　ｔｅｒｒｅｕｓ）を包含する。酵母を
トランスフェクションするための技術は、Ｂｅｇｇ、　
Ｎａｔｕｒｅ２１５　：　１０４−１０８，１９７８に
記載されている。酵母中に使用するための発現ベクター
は、ＹＲρ７　（ＳＬｒｕｈｌ等。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ　　７６　：　１０３５−１０３９　　。

１９７９）　、ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈ等、　ｈ旺Ｊ
Ｌ　：１２１−１３３゜１９７９）　、ｐＪＤ８２４Ｂ
およびｐＪＤＢ　２１９（Ｂｅｇｇ、前掲）、およびそ
れらの誘導体を包含する。このようなベクターは、一般
に、選択可能な遺伝標識、例えば、栄養遺伝標識ＴＲＰ
からなり、これは「且突然変異を有する宿主株中の選択
を可能とする。酵母発現ベクター中で使用するために好
ましいプロモーターは、酵母解糖系遺伝子からのプロモ
ーター（Ｈｉｔｚｅｗａｎ等、　に　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、　　２５５　：　１２０７３−１２０８０　、１９
８０　：　ＡｌｂｅｒおよびＫａｕａｓａｋｉ、　ム」
虹−＾１．　Ｇｅｎｅｔ、土：　４１９−４３４　、１
９８２　；　Ｋａｗａｓａｋｉ　。

米国特許第４．５９９．３１１号）、またはアルコール
デヒドロゲナーゼ遺伝子からのプロモーター（Ｙｏｕｎ
ｇＰｌｅｎｕｍｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　１９８２　；
およびＡｍｍｅｒｅｒ、　Ｍｅｔｈ。

ｉｎ　Ｅｎｚ　！１ｏｌｏ　　　１０１　：　１９２−
２０１．１９８３）を包含する。

Ｎ末端メチオニン残基の存在を回避し、精製を促進しか
つ酵母細胞に対する異質蛋白質の潜在的毒性作用を回避
するために、選択した蛋白質をコードする酵母遺伝子か
らのシグナル配列を発現ベクター中に含めることが好ま
しい。とくに好ましいシグナル配列はＭＦ　　１　　遺
伝子のプレープロ領域である（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅ
ｒｓｋｏｗｉｔｚ、　Ｃｅ旦、別。

９３３−９４３．１９８２）。シグナル配列は、また、
他の酵母遺伝子、例えば、鷹（国際特許出願間／８６０
０６３７）およびａ−因子をコードする遺伝子（欧州特
許１２３．２８９号）から得ることができる。アスペル
ギルスの種は既知の手順、例えば、Ｙｅｌｔｏｎ等。

（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｌ
ＩＳＡ’−８１：　１７４０−１７４７　。

１９８４＞の手順に従って形質転換することができる。

本発明の蛋白質は、好ましくは、宿主細胞の培地からイ
ムノアフィニティークロマトグラフィーおよび引続（Ｈ
ＰＬＣによって分離するが、他の常用の技術を使用する
こともできる。精製はドツト・プロットアッセイまたは
抗ＧＭ　−ＣＳＦ抗血清を利用するラジオイムノアッセ
イを使用して監視することができ、そして活性は骨髄コ
ロニー形成アッセイによって評価することができる。生
成物の純度は、好ましくは、銀着色を用いるＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動およびアミノ酸配列分析に
よって評価する。

突然変異したｃＤＮＡは、培養したｃｏｓ−を細胞中で
野生型ｃＤＮＡに類似するレベルで転写され、そして生
成した組換えポリペプチドは、コンカナバリンＡアガロ
ースのクロマトグラフィーによって末端マンノース残基
を欠くことが立証された。突然変体組換え蛋白質の相対
的比活性をｉｎ　ｖｉｔｒｏで評価したとき、Ｎ−結合
炭水化物を欠くポリペプチドはほぼ６倍高い比活性を有
することがわかった。

次いで、組換え突然変異体蛋白質の機能的性質を天然成
長因子のそれと比較した。全寒天培養および細胞化学を
用いて、天然形態および非グリコジル化形態のｈＧＭ　
−（１：ｓＦによって刺激された細胞のタイプの分布は
同様であることが示された。さらに、投与量一応答分析
によって、両者の形態は、巨核球コロニーの増殖および
、エリトロボイエチンの存在下での赤血球系細胞のバー
ストを等しく刺激できた。さらに、ｉｎ　ｖｉｖｏの研
究は、突然変異体蛋白質のあるものが血漿の半減期を延
長したことを立証した。

これらの研究から明らかなように、天然ｈＧＭ　−Ｃ８
Ｆによってｉｎ　ｖｉｔｒｏで提供される全範囲の子孫
細胞の刺激を可能とするためには、炭水化物の付加は必
要ではない。さらに、Ｎ−結合炭水化物を欠く組換え蛋
白質は化学誘引剤ｆＭｅｔ−１、ｅｕ　−Ｐｈｅに向か
う成熟好中球の移動を阻止できた。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。

〔実施例〕

１　、　ＧＭ−ＣＳＦ　ｃＤＮＡのクローニングヒトＧ
Ｍ−ＣＳＦ　（ｈＧＭ−ＣＳＦ）をコードするゲノムの
クローンを、Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ等、　（Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　８３　：　３１０１−３１０５．
１９８６）に記載されるでいるようにして得た。簡単に
述べると、ヒトゲノムＤＮＡの１回漕幅ノシャロン４Ａ
フェージライブラリーを、ネズミおよびヒトＧＭ　−Ｃ
ＳＦアミノ酸配列から誘導した７０塩基のオリゴヌクレ
オチドのプローブを使用してスクリーニングした。陽性
のクローンをプラーク精製し、そして制限酵素分析およ
びプラークハイブリダイゼーションによって分析した。

３個のクローンが、ヒトＧＭ　−ＣＳＦの５°および３
″末端に対する追加のプローブに対してハイブリダイゼ
ーションすることがわかった（Ｗｏｎｇ等、前掲）。こ
れらのクローンは同一であることがわかり、そしてλｈ
ＧＭ−ＣＳＦと表示した。

次いで、ＧＭ　−ＣＳＦゲノムクローンを哺乳動物細胞
発現ベクターｐＤ５’　中にサブクローニングし、そし
て培養したＣＯ５−１細胞をトランスフェクションする
ために使用した。ｐＤ５”　は、アデノウィルスの主要
後期プロモーターの制御下に外来ゲノムおよびｃＤＮＡ
断片の発現を可能とするＳＶ４０のｏｒｉ　に基づくプ
ラスミドベクターであるｅｐＤ５’は、また、アデノウ
ィルス部分リーダー配列、ＳＶ４０エンハンサ−、アデ
ノウィルスから誘導されたポリアデニル化シグナル、お
よびベクターｐＭＬ−１中のユニークＢｃｌｌクローニ
ング部位を含む（ＬｕｓｋｙおよびＢｏｔｃｈａｎ　＋
　Ｎａｔｕｒｅ　　２９３ニア９−８１　　。

１９８１）。ｐＤ５“の造成は実施例４に記載されてい
る。

発現ベクターを調製するために、ＴＡＴＡボックス（ｂ
ｏｘ）からポリアデニル化シグナルまでの顯域のみを含
有する、λｈＧＭ　−ＣＳＦからの２．６ｋｂのＢｓｔ
ＥＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片を、ｐＤ５’　のＢｃ１１部位
中にサブクローニングし、そしてＣＯＳ　−１細胞をト
ランスフェクションするため使用した（Ｇｒａｈａｍお
よびＶａｎｄｅｒ　Ｅｂ、　ｎ匹圏■５２　：　４５６
　、１９７３）　、　３日目のＣＯ５−１の上澄みを、
標準ヒト骨髄培養によって生物学的に活性なｈＧＭ　−
ＣＳＦについてアッセイした（Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ等
、前掲）　。ｐＤｇＧＭＩＩ　と表示するこの発現ベク
ターは１．９〜２．９　Ｘ　１０４０／−のｈＧＭ−Ｃ
ＳＦの生産を指令した。

ポリＡ含有ＲＮＡを、オリゴｄＴセルロース上でのクロ
マトグラフィーによって、トランスフェクションしたＣ
ＯＳ　−１細胞から調製した。λｇｔｌｌファージライ
ブラリーの生産に適合したＲＮアーゼＩＩ／ＤＮＡポリ
メラーゼＩ法（ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ、、
　Ｇｅｎｅ　　２５　：　２６３−２６９　　、１９８
３）の変法によって、二本鎖ｃＤＮＡを調製した。５Ｉ
！ｇのポリ　（Ａ）＋ＲＮ＾を使用して、オリゴｄＴプ
ライミングを使用する逆転写酵素によって、２．５罐の
第１ＭのｃＤＮ八を調製した。ＲＮアーゼＨおよびＤＮ
Ａポリメラーゼを使用して第２鎖ｃＤＮＡを合成した。

　Ｔ４ＯＮＡポリメラーゼでｃＤＮＡ分子を平滑末端と
した後、２可の二本鎖ｃＤＮＡを等しい量のＥｃｏＲＩ
　リンカ−に結合した。反応成分をＥｃｏＲＩで消化し
、そしてｃＤＮＡをリンカ−モノマーからゲルろ過りロ
マトクラフィーによって分離した。　５６０ｎｇのｃＤ
Ｎ＾をカラムの空隙体積から回収した。ＥｃｏＲＩで消
化しそして子牛アルカリ性ホスファターゼで処理したλ
ｇｔｌｌの等量にｃＤＮ八を結合した。結合混合物中の
ＤＮＡをλフアージパッケージング抽出物でパフケージ
ングした。

３７ｎｇのｃＯＮＡから調製した５Ｘ１０’組換え体の
うちで、３Ｘ１０５をスクリーニングした。ファージを
ニトロセルロースに移し、そして前ハイブリダイゼーシ
ョンした（Ｕｌｌｒｉｃｈ等、　ＥＭＢＯＪ、　３　：
３６１−３６４．１９８０）。フィルターをプローブと
しての１０’ｃｐｍ／−の一ツク翻訳した５４０ｂｐの
５ｓｔｒヒトＧＭ　−ＣＳＦゲノム断片とハイブリダイ
ゼーションし、そして０．２　ｘＳＳＣ、０，１％のＳ
ＤＳ中で６５℃において６０分間洗浄した。全体として
、２４８個のプラークは使用した非常にきびしい洗浄条
件下にニック翻訳ゲノムプローブと強くハイブリダイゼ
ーションし、これによってクローンのほぼ０．１％がｈ
ＧＭ　−ＣＳＦのためのｃＤＮＡを含有することが示唆
された。

６つのｃＤＮ＾クローンをプラーク精製し、そしてファ
ージＤＮＡを液体培養から調製しくＭａｎｉａｔｉｓ等
、釦旦、　ｌｆｉ、　６８７−７０１．１９７８）　、
そしてｐＵｃ１３のＥｃｏＲ１部位中にサブクローニン
グした。クローニングしたｃＤＮＡを、また、ジデオキ
シヌクレオチドチェインターミネーション法による配列
決定のため、Ｍ１３ｍｐｌＢ’およびＭ１３ｍｐ１９中
にサブクローニングした（Ｓａｎｇｅｒ等、ヒ匹ユ基態
し」９九」渣ヒ」鎚Ｌ４ｉ５４６３〜５４６７、１９７
７）。すべての６つのクローンは単一のオープンリーデ
ィングフレームを含有し、そしてそれらの配列はヒトＧ
Ｍ−ＣＳＦ　ｃＤＮＡクローンについて前に発表された
ものと一致した（Ｗｏｎｇ等。

前掲：　Ｌｅｅ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　８２：４３６０−４３６４
　　、１９８５）。

１つのｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターｐＤＸ中にサブ
クローニングし、そしてｈＧＭ　−ＣＳＦを一時的に発
現するために使用した。発現ベクターｐＤＸは、実施例
４Ｂ中に記載するようにｐＤ５°から誘導した。全ＧＭ
−ＣＳＦコード配列を含有するキャップ（ｃａｐ）部位
から３“非翻訳領域の中央までの５９３ｂｐのＳｓ　ｔ
Ｊ　／　Ｎｃｏ　ｌ断片を、ｐＵｃｃＧＭから取り出し
た。ｃＤＮＡ制限断片をＴ４ポリメラーゼで平滑末端と
し、ＥｃｏＲＩ　リンカ−に結合し、ＥｃｏＲＩで消化
し、そしてｐＤＸのユニークＨｃｏＲ１部位中にサブク
ローニングした。得られたプラスミドをｐＤｃＧＭＩと
表示した。プラスミドＤＮＡを、リン酸カルシウム沈殿
によって、ＣＯＳ　−１中にトランスフェクションした
（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ＋　前掲）
。トランスフェクションしたＣＯ５−１によってコンデ
ィショニングした培地抗生物質および１０％の胎児子牛
血清（ＦＣＳ　）を補充したダルベツコの改変必須培地
あるいはＩ　ｎ　／　ｍｌのフィブロネクチン、１０ｔ
ｒｙ　／　ｔｎｌのトランスフェリン、５１μｇ／−の
インスリンおよび１５ｎＭのセレン酸を含有する血清不
含培地ＣＣｏ１１ａｂｏｒ　ａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ　）　）を、３７℃において７％のＣＯ２下に３日
間インキュベーションした後収穫し、そして実施例３に
記載するようにして生物学的に活性なＧＭ　−ＣＳＦに
ついてアッセイした。

天然または突然変異ＧＭ−ＣＳＦ　ｃＤＮＡを一時的に
発現するＣＯ３−１細胞からの血清不含上澄みを、限外
ろ過によって濃縮し、そして前もって２０ｍＭのトリス
（Ｔｒｉｓ）　（ｐ＋１７．４　）　、１５０ｍＭのＮ
ａＣ１％　　１　ｍＭのＭｎＣ１ｚ　、１ｍＭのＣａＣ
１ｚおよび１ｍＭのＭｇＣ１１で平衡化したコンカナバ
リンＡアガロース（１ｃｍＸ７ｃ＋ｎ）の５−〇カラム
にゆっくり適用した。カラムを５力ラム体積の同一緩衝
液で洗浄し、そして結合した糖蛋白質を０．４Ｍのα−
メチルマンノシド（αＭＭ）を含有する緩衝液で溶出し
た。試料を数回のＰＢＳの交換に対して透析し、そして
実施例３に記載するように生物学的に活性なｈＧＭ　−
ＣＳＦについてアッセイした。ゲノム発現ベクターｐＤ
ｇＧＭＩ　Ｉに比較したとき、ｃＤＮＡは４倍多い組換
えｈＧ門−ＣＳＦまたは血清含有培地当りＩ　Ｘ１０’
Ｕ／ｍ！合成を指令した。

ζ　　２．＠、　　　、空然・　燻 ヒトＧＭ−ＣＳＦ　ｃＤＮＡを部位特異的ｉｎ　ｖｉｔ
ｒｏ突然変異誘発（ＺｏｌｅｒおよびＳｍ１ｔｈ、ＤＮ
Ａ、　　３　：　４７９−４８８゜１９８４）によって
修飾して、５つのグリコジル化部位を除去した。

ヒトＧＭ−ＣＳＦ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＵ
ｃｃＧＭをＥｃｏＲＩで切断して、０．９ｋｂのｃＤＮ
Ａインサートを分離した。この断片をＥｃｏＲＩによっ
て線状化したＭ１３ｍｐｌＢ中に結合した０部位特異的
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（Ｚｏ　ｌｅｒおよびＳ
ｍ１ｔｈ　　、前掲）を、アプライド・バイオシステム
ス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３８０Ａ
　ＤＮＡ合成装置で合成したオリゴヌクレオチドを使用
して、得られたファージ（Ｍ１３ｃＧ旧）上で実施し、
そして変性ゲル上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって精製した。アミノ酸４４および５４におけるグ
リコジル化部位を変化するための突然変異誘発（アミノ
酸は第１図〜第３図に示すように番号を付される）を、
オリゴヌクレオチドＺＣ５５６（５’ＧＣＧＴＣＴＣＣ
ＴＧＣＡＡＣＴＧＡＧＴＡＧＡＧ３’）をイ吏用してア
ミノ酸４４におけるアスパラギンをグルタミンに変化せ
しめ、そしてオリゴヌクレオヂドプライマーＺＣ８７（
５’　ＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴ３’　）　　と
−社Ｉに、オリゴヌクレオチドＺＣ５５５（５″ＴＧＣ
ＴＧＡＧＡＴＧＣ八八ＧＡＡＡＣＡＧＴＡ３°）を使用
してアミノ酸５４におけるアスパラギンをグルタミンに
変化した。ハイブリダイゼーションシグナルを保持する
ために２１または２２塩基の合致のみを可能とするため
に十分な洗浄条件（３Ｍの塩化テトラメチルアンモニウ
ム［ＴＭＡＣｌ　’ｌ　）を用いて各３２Ｐ末端標識オ
リゴヌクレオチドでプラークをプロービングすることに
よって、二重突然変異をスクリーニングした（Ｗｏｏｄ
等　、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　Ｓ
ｃｉ、　　ＵＳＡ　　　旦２　　：　　１５８５−１５
８８、１９８５）。はぼ６０個のファージはいずれかの
プローブに独立にハイブリダイズしたが、わずかに３つ
は両者のプローブにハイブリダイズした。

陽性のクローンを翻訳開始部位から突然変異原を与えた
部位にわたって配列決定して突然変異を確認した。陽性
のクローンをＭ　１３−５５５−５５６と表示した。〇
−結合グリコシル化部位を除去するために、ファージＭ
１３−５５５−５５６およびＭ１３ｃＧＭｒを、オリゴ
ヌクレオチドＺＣ８６７（５’　ＡＣＣＣＧＣＣＣＧＣ
ＧＣＡＣＣＣＧＣＡＣＣＣＧＣＡＡＣＧＣＡＧＣＣＣＴ
３’　）を使用して、位置２２．２４および２６に見出
されるセリンのコドンをアラニンのコドンに変化させる
部位特異的突然変異誘発を行った。

突然変異したファージを、３ＭのＴＭＡＣｌ中で７５℃
において洗浄することによって、前述のようにスクリー
ニングした。このようにして、〇−結合のみ、又はＮ−
結合のみを含有するか、あういは既知の炭水化物の付加
部位のい、ずれも含有しない突然変異ｃＤＮＡクローン
を発生させた。陽性のクローンを、翻訳開始部位から突
然変異部位にわたって配列決定して突然変異を確認した
。５つのすべての突然変異した部位を含有するクローン
をＭ１３−５５５−５６６−８６７と表示し、〇−結合
部位のみを含有するものをＭＬ３−５５５−５５６と表
示し、そしてＮ−結合部位のみを含有するクローンをＭ
１３−８６７と表示した。

複製形ＤＮＡを、ファージクローンＭ１３−５５５−５
５６　、　Ｍ１３−５５５−５５６−８６７およびＭ１
３−８６７からつくった。ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し
て、０．９ｋｂの断片を各ファージクローンから分離し
た。Ｍ１３−５５５−５５６から分離したＯ、　’９　
ｋｂの断片を、ＥｃｏＲＩで消化して線状化したｐＵｃ
１３中に結合して、プラスミドｐＵｃｃｃＧＭｓｓｓ　
　ｓｓｂを発生させた。Ｍ１３−５５５−５５６−８６
７から分離した０、９ｋｂの断片を、ＥｃｏＲＩで消化
して線状化したｐ［ＪＣ１３中に結合して、プラスミド
ｐＵＣＣｃＧＭｓｓｓ　　ｓｓｂ　　！１６７を発生さ
せた。Ｍ１３−８６７からの０．９ｋｂの断片をｐＵｃ
１３中−に挿入してｐＵｃｃＧＭ８６７を構成した。こ
れらのプラスミドはＧＭ　−ＣＳＦコード領域より上流
に２１１ｂｐのｐＤ３由来の配列を含有したので、プラ
スミド由来の配列を、５ｓｔｌで切断し、Ｔ４ＤＮＡポ
リメラーゼで平滑末端とし、ＥｃｏＲＩ　リンカ−に結
合し、そしてＥｃｏＲＩで切断することによって除去し
た。得られた断片をｐＤＸ中にサブクローニングして、
ｐＤｃＧ旧１（−Ｎ）、ｐＤｃＧＭＩＩＩ　（０）　、
およびｐＤｃＧＭＩＶ、（−Ｎ　、−〇）を生成せしめ
た。突然変異したＤＮＡ配列およびコードされるアミノ
酸配列を第１図（−Ｎ）および第２図（−０、−Ｎ）に
示す。引続く分析によって、突然変異ＧＭ−Ｃ５ＰＩＩ
ＩおよびＩＶはスレオニン番号１１に〇−結合部位を含
有することが示された。この部位は組換え蛋白質分子の
約５０％においてグリコジル化されていることがわかっ
た。

生物学的に活性なｈＧＭ　−ＣＳＦが変更されたｃＤＮ
Ａによって発現されるかどうかを決定するため、ｐＤＣ
Ｇ旧１　、ｐＤｃＧＭＩＩＩおよびｐＤｃＧＭＩＶを別
々にＣ０５＝１細胞の並行培養物中にトランスフェクシ
ョンし、ｐＤｃＧ旧をもつ対照トランスフェクションと
比較した。２日後にＲＮＡを細胞から得、そして３日後
に別の培養物から培地を得た。ＧＭ　−ＣＳＦ特異的ｍ
ＲＮＡのレベルはすべてのｃＤＮＡ種について等しいこ
とが示されたが、異る量の生物学的に活性な組換えＧ？
Ｉ　−ＣＳＦがバイオアッセイによって検出された。

同様な方法において、Ａｓｎ４４におけるＮ−結合グリ
コシル化部位を除去した。ファージＭ１３ｃＧＭ１を、
オリゴヌクレオチドＺＣ５５６およびＺＣ８７を使用し
て突然変異誘発せしめた。得られたファージのクローン
をＭ１３−５５６と表示した。

複製形ＤＮＡをＭ１３−５５６から調製し、そして変更
したＧＭ　−ＣＳＦ配列を前述のようにｐＤＸ中にサブ
クローニングした。得られた発現ベクターをｐＤｃＧＭ
νと表示した。ｃＤＮＡのインサートおよびコードされ
る蛋白質の配列を第３図に示す。

夫扁■ニーＩ迫ｌ少立扼 突然変異ポリペプチド中の炭水化物の除去を生化学的に
立証するために、組換えヒ！−ＧＭ　−ＣＳＦ調製物を
アフィニティークロマトグラフィーによって分析した。

血清不含ｃｏｓ　−ｉ細胞の上澄みをコンカナバリナン
Ａアガロースのカラムに適用した。

コンカナバリナンＡアガロースの２＋ｎＺＯカラム（６
ｍＸ８０ｍ）を、２０ｍＭのトリス（ｐＨ７，５）／１
５０ｍＭのＮａＣ１／　１　ｍＭのＣａＣ１ｚ　／　１
　ｍＭのＭｇＣ１ｇ　／１ｍＭのＭｎＣ１ｔ中で平衡化
した。天然ヒトＧ門−ＣＳＦまたは修飾ＧＭ−ＣＳＦに
ついてｃＤＮＡを一時的に発現するＣＯ５−１細胞によ
ってコンディショニングした培地をゆっくり　（０，２
ｄ／分）流し、そしてカラムを平衡化緩衝液で洗浄した
。カラムに結合した物質を平衡化緩衝液中０．４Ｍのα
−メチルマンノシドで溶離した。出発物質、通過画分、
洗浄画分および溶離分画をＰＢＳに対して透析し、ろ過
滅菌し、そしてコロニーの形成によってＧＭ　−ＣＳＦ
についてアッセイした。表■に示すように、有意な量の
天然ＧＭ　−ＣＳＦおよびもはや〇−結合炭水化物を含
有しない蛋白質はコンカナバリナンＡアガロースに結合
し、そしてカラムから溶離することができた。対照的に
、Ｎ−結合炭水化物を欠く両者の突然変異ＧＭ　−ＣＳ
Ｆ種はコンカナバリナンＡアガロースに結合することが
できず、そして成長因子はカラムから溶離することがで
きなかった０表■中の結果は、適用された単位に対する
通過画分および洗浄画分および溶離した分画中に回収さ
れた百分率として表わす。

以下余白 表１ 培地　　　　　　　　結合せず　　結合および溶出ｐＤ
ｃＧＭＩ　　　（自然”）　　　　　　７０　　　　　
　　３０ｐＤｃＧＭＩＩ　　（Ｎ）　　　　　１００　
　　　　　　０ｐＤｃＧＭＩＩＩ　（０）　　　　　７
１　　　　　　２９ｐＤｃＧＭＩＶ　　（−Ｎ　−０）
　　　１００　　　　　　０次に、突然変異発現ベクタ
ーによって生成された種々の形態のＧＭ　−ＣＳＦの相
対的比活性を評価するため、コンディショニングした培
地を免疫学的に分析した。ウサギ抗血清を、キーホール
・リンペット・ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍ
ｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に結合した１５残基の
合成ペプチドに対して生じさせた。この抗血清は炭水化
物付加部位から遠い叶−ＣＳＦの領域を認識する。抗血
清は、炭水化物が酵素的に除去された蛋白質の同一量に
対してと同様に、高度に精製されたＧＭ　−ＣＳＦに強
く結合する。この抗血清を使用して、トランスフェクシ
ョンしたＣＯＳ　−１細胞によってコンディショニング
した、等しい生物学的に活性な量の培地中に存在する組
換え突然変異蛋白質および天然蛋白質を分析した。第５
図に示すように、有意に少ない免疫活性蛋白質は、自然
の形態のｈＧＭ　−ＣＳＦ中よりも、Ｎ結合炭水化物を
欠（ポリペプチド中のこの活性を説明する。〇−結合炭
水化物は、これらの相対的比活性に有意な程度に影響を
及ぼさない、最後に、これらの発見を定量するために、
コンディショニングした培地の系統的希釈物を、ウェス
タン・プロットにより、Ｉ！Ｊヤギ抗ウサギ抗血清を第
２抗体として使用して分析した。オートラジオグラフィ
ー後、ハイブリダイゼーションする蛋白質をプロットか
ら切り出し、そして計数した。免疫反応的に等量の天然
ＧＭ　−ＣＳＦ中よりも、６倍大きい量の造血活性が２
つのＮ結合炭水化物欠乏成長因子中に存在した。自然ヒ
ト　ＧＭ　−ＣＳＦがほぼ８×１０’単位／■の比活性
を有するとすれば、Ｎ−結合炭水化物欠乏形態の蛋白質
は４Ｘ１０＠単位／■を越える比活性を有する。

、　　　え　　白　　の　　２　〜 血清不含ＣＯ５−１細胞の限界希釈物を、半固体の培養
物中で顆粒球および／またはマクロファージのコロニー
形成を刺激するそれらの能力についてアッセイした。５
つの別々の実験において、天然形および突然変異影絵換
えヒトＧＭ　−ＣＳＦによって生成された顆粒球および
マクロファージ（ＧＭ）のコロニーの最大数の間に有意
差は存在しなかった。０Ｍコロニーを細胞化学的に細胞
のタイプについて評価したとき、好中球、好酸球および
単球−マクロファージ含有コロニーを生長させた（表■
）、骨髄細胞を記載されているようにして（Ｂａｇｂｙ
　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　　Ｉｎｖｅｓ
ｔ、　　６８：５６−６３９０　、１９８１）調製した
が、ただし０．３％の寒天で半固体とした。全培養物を
固定し、クロロアセテートエステラーゼについて染色し
、そしてトルイジンブルーで対比染色した。データは各
形態のＧＭ−ｃｓｐについて合計２００を越えるコロニ
ーを含有する３回の反復実験の平板の結果を表わし、そ
して各細胞タイプを含有するコロニーの百分率として表
わされている。培養物を変化する濃度の組換え成長因子
で刺激したとき、あるいはコロニーのの大きさまたは細
胞の組成を分析したとき、有意差は存在しなかった。。

表■ 実験１ 好中球　　　［ｉ７　　　７１ 好酸球　　　１７　　　１６ 単球　５６５２ 実験２ 好中球　　　５５　　　　　　４３　　　５１好酸球　
　　４０　　　　　　　４７　　　４４単球　３２　　
　２９　３９ 最後に、突然変異蛋白質及び天然ｍ換え蛋白質の両者は
巨核球のコロニーの増殖および赤血球系細胞のバースト
（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ　ｂｕｒｓｔ）を支持することが
できた。トランスフェクションした（：０５−１細胞か
らのスペント培地を、骨髄コロニー形成アッセイにおい
て１％の最終濃度でプレートした。

対照はジャム（ｓｈａｏ＋）　　トランスフェクション
したＣＯ５−１細胞コンデイシヨンド培地および１％Ｐ
ＨＡ刺激リンパ球コンディションド培地を包含する。表
■に示すように、０Ｍコロニー形成を最大の半分で刺激
するであろう、組換え天然または突然変異非グリコジル
化ＧＭ−ＣＳＦのいずれの濃度も、巨核球コロニーの増
殖および赤血球系細胞のバーストを最大に刺激するそれ
らの能力において等しかった。データは、３回の反復実
験においてプレートした典型的な実験で形成しコロニー
の平均の数（±ＳＥＭ）を表わす。−データーは３回再
現された。

以下余白 表■ ジャムトランスフェクションした Ｃ０３−Ｉ　ＣＭ　　　　３．０＋１．１　　　　３．
４＋０．９　　　　０ＰＩＩＡ−ＬＣＭ　　　　　４３
．０±３．０　　　２８．０±２．０　　２．０±０天
然ｃＤＮ＾　　　２９．０±３．０．　　２６．０±１
．０　　３．３±０．７突然変異ｃＤＮＡ ｐＤｃＧＭ　ＩＩ　（−Ｎ）　　３１．０±５．０　　
　２９．０±４．０　　２．３±０．９ｐＤｃＧＭ　ｍ
　（−０）　　２９．０±３．０　　　１９．０±３．
０　　　’　　Ｎ、Ｄ。

ｐＤｃＧＭｒＶ（−Ｎ−０）　３６．０ｔｈ２．ｏ　　
　　２２．０±２．ＯＮ、［ｌ。

＊Ｎ、Ｄ、−実施せず 告知して承諾を得た正常なヒト志廓者から得赳骨髄細胞
を、フィコール−ハイバーク（Ｆｉｃｏｌｌ　−ｈｙｐ
ａｑｕｅ）密度勾配（比重１．００７）で分画した。低
い密度の細胞から二重プラスチック付着によって付着細
胞を減少させ、そしてＥ−ロゼツト形成（トｒｏｓｅｔ
ｉｎｇ）によってＴ細胞を減少させた（Ｂａｇｂｙ等。

Ｊ、　　　ＣＩｉ　　ｎ、　　Ｉｎｖｅｓｔ、　　６８
　　　：　　１２８６−１２９０　　．１９８１）　　
。

５０．０００〜１００．０００の細胞を、１５％の胎児
子牛血ｉ　（Ｆｅ２）　、抗生物質、０．９％のメチル
セルロース、および１０％までのアッセイすべき物質の
存在下に培地中で培養した。培養物を５％のＣＯ□を含
有する湿潤雰囲気中で１３日間インキュベーションし、
そして顆粒球−マクロファージのコロニーを倒立顕微鏡
検査によって計数した。記載する各実験は、３回の反復
実験の培養の平均を表わす、ヒトＧＭ−ＣＳＦの５０単
位（Ｕ）は、最適濃度のフィトヘマグルチニン刺激リン
パ球コンディシッン培地（ＰＨＡ−ＬＣＭ）に比較して
、最大の半分のコロニー形成を刺激する希釈と定義され
る。巨核球コロニーの増殖のため、２５％のヒト血漿を
Ｆｅ２の代わりに使用しくＫｉｍｕｒａ等、　Ｊ、　Ｃ
ｅ１ｌハ■圏且　月、８　：　８７−９６　、１９８４
）　、そして赤血球系細胞のバーストおよび混合細胞の
コロニーの増殖のため（Ｐｏｗｅ　Ｉ　１等、　Ｂｒ、
　Ｊ、　Ｈａｅｓ＋ａｔｏ１．５１　　：８１−８９、
１９８４）　、１単位の組換えエリトロボイエチン（Ａ
ｍｇｅｎ、　Ｉｎｃ、）を培養の第４日に添加した。最
適の刺激は１％のＰＩＩＡ−ＬＣＭによって提供された
。

形態学的分析のため、培養物を０．３％の寒天で半固体
とし、固定し、そしてクロロアセテートエステラーゼに
ついて染色し、そしてトルイジンブルーで対比染色した
。コロニーを計数し、そして直接顕微鏡検査によってス
コアをつけた。

−４Ａ、　　Ｄ５の゛ ＳＶ４０エンハンサ−およびアデノウィルス２主要後期
プロモーターおよびトリパルタイトリーダーを含んでな
るプラスミドｐＤ５を、プラスミドｐ。

ＨＦＲＩＩＩ　（Ｂｅｒｋｎｅｒおよび５ｈａｒｐ、　
Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ。

旦：　８４１−８４７．１９８５）から生じさせた。ｐ
ＤＨＦＲＩＩＩ中のＡＤ）ＩＰＲ配列からすぐ上流のＰ
ｓｔ　１部位を、５単位のＰｓｔｌで１０埋のプラスミ
ドを３７℃において１００−の緩衝液Ａ（１０ｎ＋Ｍの
トリスｐＨ８，１０ｍＭのＭｇ細胞、６＋＋＋ＭのＮａ
ｃｌ、　７　ｍＭの−ＭＳＩ（）中で消化することによ
って、Ｂａａ　Ｉ１１部位に転化した。ＤＮＡをフェノ
ール抽出し、ｔ！ｔｏ）！沈殿させ、１０ｍＭのｄＣＴ
Ｐおよび１６単位の７４ＤＮＡポリメラーゼを含有する
４　０　ｔｔｌの緩ｉｊｉ？ｆｌ　Ｂ　（５０ｍＭのト
リス（ｐｌ＋　８　）、７ｍＭのＭｇｃｔ、　、７ｍＭ
のｍＭ　Ｓ　Ｉ−（）中に再懸濁させ、そして１２℃で
６０分間インキュベーションした。

Ｅｔ０１１沈殿後、このＤＮＡを４００単位のＴ４ポリ
ヌクレオチドリガーゼを含有する１４μｌの緩衝液Ｃ（
ｌｏｆｆｉＭのトリス（ｐＨ８）　、ｌ　ＯｍＭのＭｇ
Ｃ１ｚ　、１ｍＭのＤＴＴ、１．４＋ｎＭのＡＴＰ）中
で１２℃において１２時間、２．５ｎのキナーゼ化Ｂａ
ｍ１ｌｌ　リンカ−に結合した。フェノール抽出および
ＥｔＯＨ沈殿後、このＤＮＡを１２０４の緩衝液Ｄ（７
５ｍＭのＫＣＩ、６ｍＭのトリスｐＨ７，５，１０ｍＭ
の−ｇＣｈ　、１ｍＭのＤＴＴ）中に再懸濁させ、１０
０単位のＢａｍｔｌｌで５０℃で６０分間消化し、次い
でアガロースで電気泳動させた。ｐＢＲ３２２およびベ
クター配列（１０ｎ）を含有する４、９ｋｂのＤＮＡ断
片をゲルから分離し、５０単位のＴ４ポリヌクレオチド
リガーゼを含有するＩＯＪの緩衝液Ｃ中で１２℃で２時
間結合し、そしてＥ　、　ｃｏｌｉｌｌＢｌｏｌを形質
転換するための使用した。陽性のコロニーを迅速ＤＮＡ
調製分析によって同定し、そしてプラスミドＤＮＡ（ｐ
ＤＨＦＲ’と表示）を調製しあ。

次いで、まず１００ａ１の緩衝液り中でｐｓＶ４０（２
５蛸）を２５単位のＢａ１ｌで５０℃において６０分間
切断し、次いで５０単位のＢａｍＨ１を添加し、さらに
３７℃で６０分間インキュベーションすることによって
、プラスミドｐＤ１を発生させた。プラスミドｐＤＨＦ
Ｒ’をＢａｍ　ＩＩで線状化し、そして子牛腸ホスファ
ターゼで処理した。ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳
動によって分離し、４．９ｋｂのｐＤｔｌＦＲ’断片お
よび０．２　ｋｂ（７）ＳＶ４０断片を単離した。。

これらの断片（２００ｎｇのｐＤｌｌＰＲ’のＤＮＡお
よび１１００ｎの５Ｃ４０のＤＮＡ）を、１００単位の
Ｔ４ポリヌクレオチドリガーゼを含有する１０１ｔｌの
緩衝液Ｃ中で１２℃において１２時間インキュベーショ
ンし、得られた構成体（ｐＤｌ）を使用してＥ、ｃｏｌ
ｉ　ＲＲＩを形質転換した。

プラスミドｐＤ１は、ｐＢＲ３２２６Ｕ域中の「ポイズ
ン（ｐｏｉｓｏｎ）　Ｊ配列を欠失することによって修
飾されている（ｌｕｓｋｙおよびＢｏｔｃｈａｎ、　Ｎ
ａｔｕｒｅ　２９３　ニア９−８Ｌ　１９８１）。プラ
スミドｐＤＩ（６，６ｎ）およびｐＭＬ　−１（Ｌｕｓ
ｋｙおよびＢｏｔｃｈａｎ、前掲）（４ｉ）を、５０Ｊ
の緩衝液Ａ中で、１０単位の各ＥｃｏＲＩおよびＮｒｕ
　１とともに３７゛Ｃで２時間インキュベーションし、
次いでアガロースゲルの電気泳動を実施した。１．７ｋ
ｂのｐＤ１断片および１．８　ｋｂのｐＭＬ−１断片を
分離し、１００ｊｉｉ位のＴ４ポリヌクレオチドリガー
ゼを含有する２０バの緩衝液Ｃ中で１２℃で２時間−緒
に（各々５０ｎｇ）結合し、次いでＥ、　ｃｏｌｉ　Ｉ
ＩＩＩＩＯＩ中に形質転換した。所望の構成体（ｐｐＤ
　１と表示）を含有するコロニーを、急速調製分析によ
って同定した。次いで、１０硝のｆｌｐｏ　Ｉを２０単
位の各ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌｌｌで、５０ｕｌの緩衝
液Ａ中で３７℃で２時間消化した。ＤＮＡを７ガロース
ゲルの電気泳動にかけ、そしてｐＢＲ３２２，３“スプ
ライス部位およびポリＡ配列を含んでなる所望の２．８
ｋｂの断片（断片Ｃ）を分離した。

ｐＤ５を造成するとき使用する残りの断片を発生させる
ために、ｐＤＨＦＲＩＩＩを修飾して、Ｓａｃ　ＩＩ（
ＳｓｔｌＴ）部位を旧ｎｄｌｌｌまたはＫｐｎ　１部位
に転化した。１０賄のｐ［１ＩＩＦＲＩＩＩを２０単位
の５ｓｔｌｌで３７℃で２時間消化し、次いでフェノー
ルで抽出し、そしてエタノールで沈殿させた。再懸濁し
たＤＮＡを、１０ｍＭのｄＣＴＰおよび１６単位のＴ４
ＤＮＡポリメラーゼを含有する１００　Ｊｌｌの緩衝液
Ｂ中で１２°Ｃにおいて６０分間インキュベーションし
、フェノール抽出し、そしてエタノール沈殿させた。Ｄ
ＮＡ（５硝）を、４００単位のＴ、ＤＮＡ　リガーゼを
含有する２０ｍの緩衝液Ｃ中で、５０ｎｇのキナーゼ処
理されたｌＩｉｎｇＩＩＩ　またはにｐｎｌリンカ−と
１２℃において１０時間結合し、フェノール抽出し、そ
してエタノール沈殿させた。５０ｍの緩衝？＆、Ａ中に
再懸濁させた後、適当ならば、得られたプラスミドを５
０単位の旧ｎｄｌｌｌまたはＫｐｎ　ｒで消化し、そし
てアガロースゲル電気泳動にかけた。ゲル分離したＤ　
Ｎ　Ａ　（２５０ｎｇ）を、４００争位のＴ、ＤＮＡ　
リガーゼを含有する３０ｔ１１の緩衝液Ｃ中で１２℃に
おいて４時間結合し、そしてＥ、　ｃｏｌｉＲＲｌを形
質転換するために使用した。得られたプラスミドをｐ　
Ｄ　ＨＦＲＩＩＩ　（旧ｎｄｌＴＩ）およびｐＤＩＩＦ
ＲＩ　Ｉ　Ｉ　（Ｋｐｎ　ｒ）を表示した。

次いで、０．４ｋｂのＥｃｏＲＩ　　Ｋｐｎｌ断片（断
片Ａ）をｐＤｌ（ＦＲｒｒｒ　（Ｋｐｎｌ）から、Ｅｃ
ｏＲＩおよびＫｐｎＪによる消化および引続くアガロー
スゲルの電気泳動によって精製した。

ＳＶ４０エンハンサ−配列をｐＤｌ（ＦＲｒｌＩ　（Ｉ
ｌｉｎｄｌｒｒ）中に次のようにして挿入した；５０硝
のＳＶ４０　ＤＮＡを１２０ｕｌの緩衝液Ａ中で５０単
位のｌ１ｉｎｄ　ＩＩＩとともに３８℃で２時間インキ
ュベーションし、そして１１ｉｎｄｌｌｌ　Ｃ５Ｃ４０
断片（５１７１−１０４０ｂｐ）をゲル精製した。プラ
スミドｐＤＩＩＦＲＩＩＩ　（旧ｎｄｌ［）　（１０／
！ｇ）を２５０ｎｇの子牛腸ホスファターゼで３７℃に
おいて１時間処理し、フェノール抽咄し、そしてエタノ
ール沈殿させた。直線化したプラスミド（５０ｎｇ）を
２５０ｎｇの旧ｎ＋ＨＩＴ　ＣＳＶ４０断片と１６ｔｄ
の緩衝液Ｃ中で１２℃において、２００単位のＴ４ポリ
ヌクレオチドリガーゼを使用して、３時間結合し、そし
てＢ、　ｃｏｌｉＩＩＢＩＯＩ中に形質転換した。次い
で、０．９ｋｂのＫｐｎ　Ｉ−Ｂｇｌｒｌ断片（断片Ｂ
）をこのプラスミドから分離した。

ｐＤ５の最後の構成のため、断片ＡおよびＢ（各々５０
ｎｇ）を１０ｎｇの断片Ｃと、２００単位のＴ４ポリヌ
クレオチドリガーゼで１２℃において４時間結合し、次
いでＥ、　ｃｏｌｔ　ＲＲＩ中に形質転換した。陽性の
コロニーを急速プラスミド調製およびエンドヌクレアー
ゼ分析によって検出し、そしてｐＤ５の大規模な調製を
実施した（第４図）。

実嫡貨１畏−」」す錫カ１成。

ベクターｐＤＸをｐＤｌｌおよびｐＤ５’　から誘導し
た。プラスミドｐＤ５’　はｐＤ５と同一のベクターで
あるが、ただしＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（すな
わち、ＳＶ４０　Ｒａｍ）ＩＩ　［２５３３ｂｐｌ　−
Ｂｃｌ　１［２７７０ｂｐｌ断片）は後期の配向である
（第４図）。

すなわち、ｐＤ５’　は遺伝子の挿入部位としてＢｃ１
１部位を含有する。プラスミドｐＤ１１はｐＤ５と異な
り、エンハンサ−配列を含有する１ｌｉｎｄｌｌｌ（Ｓ
Ｖ４０のゲノムにおいて５１７１ｂｐ）　　Ｋｐｎｌ　
（ＳＶ４０において２９４ｂｐ）が反対の向きである。

ｐＤＸを生じさせるため、ｐＤｌｌ中のＥｃｏＲ１部位
を、ＥｃｏＲＩ切断、Ｓ■ヌクレアーゼとのインキュベ
ーション、および引続＜Ｂｃｌｌリンカ−との結合によ
って、Ｂｃｌ　１部位に転化した。陽性と同定されたコ
ロニーからＤＮＡを調製し、そして変更された制限部位
を含有する１、　９　ｋｂのＸｈｏ　［−ＰｓｔＩ断片
をアガロースゲル電気泳動によって調製した。第２の修
正法において、Ｂｃｌ　Ｉ切断ｐＤ５″をキナーゼ処理
されたＥｃｏ　ＲＥ−Ｂｃｌ　　１アダプター（オリゴ
ヌクレオチドＺＣ５２５，５’　ＧＧ＾＾ＴＴＣＴ３’
）第３よびＺＣ５２６、５’　ＧＡＴＣＡＧ八八ＴＴＣ
へへ３″）と結合して、遺伝子を発現ベクター中に挿入
するための位置としてＥｃｏ　Ｒ１部位を発生させた。

陽性のコロニーを制限エンドヌクレアーゼ分析によって
同定し、そしてこれからのＤＮＡを使用して修飾された
制限部位を含有する２、　３　ｋｂのＸｈｏ　Ｔ−Ｐｓ
ｔ　［断片を分離した。２つの前述のＤＮＡ断片を７４
ＤＮＡと一緒にインキュベーションし、■−島ｕＨＢＩ
ＯＩ中に形質転換し、 そして陽性のコロニーを制限分析によって同定した。こ
のようなりＮＡ　（ｐ　ＤＸと呼ぶ）の調製を実施した
。

以下全白 実態１しょＢ　ＨＫ　　　　のＧＭ　−ＣＳＦの　ユＢ
ＨＫ　ｔｋ−ｔｓ１３細胞をトランスファクションして
、天然ＧＭ−ＣＳＦ並びに突然変異ＧＭ−ＣＳＦ　ＩＩ
及びｒｖを発現した。培養した細胞をトリプシン処理に
よってバラバラにし、１５％の密度で再プレートし、そ
して１０％の加熱不活性化胎児子牛血清および１％の抗
生物質を補充したＤＭＥＭ中で２４時間増殖させた。１
０■のＣｓＣ１バンド形成プラスミドＤＮＡ（ｐＤｃＧ
ＭＩｐｐＤｃＧＭＩ　ＴまたはｐＤｃＧ旧Ｖ）を、１■
のプラスミドＤＨＦＲゝ”−ｐＨ５″　（メトトレキセ
イト耐性ＤＨＦＲ遺伝子を含有するｐＨ５“誘導プラス
ミド［Ｌｅｖｉｎｓｏｒｒ＄　Ｐ欧州特許１１７，０６
０号コ）および１０躍の超音波処理したサケ精子ＤＮＡ
　（担体として）と共沈させた。この混合物を１−の２
×ヘブス（Ｈｅｂｓ）　＊樹液（ＩｇのＨＥＰＥＳ、　
１．６　ｇのＮａＣ１，０，０７ｇのにＣ１、０，０３
ｇのＮａＪＰＯ＊−２ｔｌｘＯ／１００ｄ、ｐＨ７，０
５）中に再懸濁させた。１１Ｒ１の２５０１のＣａＣ１
，をこの溶液にゆっくり添加し、その間それを通して空
気を通人し、そしてＤＮＡ−リン酸カルシウム沈殿物を
形成させた。沈殿物をＢＨＫ細胞の２４時間の培養物に
添加し、そして４時間インキュベーションさせた。培養
の上澄みを吸引によって除去し、ＴＢＳ（５０ｍＭのト
リスｐｌ＋７．５．１５０ｍＭのＮａＣＩ）中の１５％
のグリセロールの２−を細胞に２分間添加した。このグ
リセロール溶液を除去し、細胞をグリセロールを含まな
いＴＢＳ中ですすぎ、そして正規の培地を添加した。

３日後、培養の上澄みを取り出して生物学的に活性なＧ
Ｍ−ＣＳＦについてアッセイし、そして細胞をトリプシ
ン処理によって１０％のコンフルエンスに分割しせた。

次いで、細胞を、１０％の加熱不活性化し透析した胎児
子牛血清、−１％の抗生物質および２５０ｎＨのメトト
レキセイトを含有するＤＭＥＭ中でインキュベージラン
した。

１週間のインキュベーション後、培地を交換し、そして
細胞をさらに１週間インキュベーションした。次いで、
ここのコロニーをクローニング用シリンダーで分離し、
そして細胞をトリプシン処理した。次いで、細胞を３５
鶴の培養において同−培地中で１週間インキュベーショ
ンし、次いでトリプシンで１００ｗの平板中に分割した
。細胞を、次の条件で、トリプシン処理によって１０％
のコンフルエンスに分割することによって順次に継代培
養した： ２５０ｎＨのメトトレキセイト×２ ■−のメトトレキセイト×２ ５犀のメトトレキセイト×２ ２５−のメトトレキセイト×２ １００声のメトトレキセイト×２ 最後の継代培養後、細胞をマクシブレイト（ｍａｘｉｐ
ｌａ　Ｌｅ）中で１００声のメトトレキセイト含有倍地
中でコンフルエンスに生長させ、そして４枚の平板をＮ
ｕｎｃ　１０平板細胞ファクトリ−（ｆａｃｔｏｒｙ）
中に分割し、そしてコンフルエンスに生長させた。

次いで、細胞を０．５％の胎児子牛血清および１％の抗
生物質を補充したＤＭＥＭに移した。

組換えＧＭ−ＣＳＦ　Ｉ、ＩＩおよび１■をＢＨＫ細胞
コンディション培地から、イムノアフィニティークロマ
トグラフィーと高性能液体クロマトグラフィーとの組み
合わせによって精製した。

ＧＭ−ＣＳＦに対するモノクローナル抗体を等体積の２
　ＸＴＮＥＮ　（Ｉ　ＭのトリスｐＨ８，０，５ＭのＮ
ａＣｌ、２５（１ｗＭ　〕ＨＤＴＡ、　　１０％ノＮＰ
　　４０）　Ｔ：希釈し、そしてこの溶液を３０，６０
０Ｘｇで２０分間遠心した。沈殿を廃棄し、そして上澄
みを１０−のプロティンＡ−セファロース（Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ）カラム（ＴＮＥＮ中で平衡化しである）に適
用した。このカラムを２０−のリン酸塩緩衝化食塩水（
ＰＢＳ）で洗浄して結合しない物質を除去した。このカ
ラムを０．１　Ｍのクエン酸ナトリウムｐＨ３，０で溶
離し、そして集めた分画をトリスｐＨ８，８でｐＨ７，
０に中和した。酢酸セルロース電気泳動によって決定し
てピークの分画をプールし、そして０．１　ＭのＮａＨ
ＣＯｚ、０．５　ＭのＮａＣ１（ｐＨ８，３）に対して
透析した。蛋白質の収量を２８０ｎｍにおける吸収によ
って決定した。

２０ｍのイムノアフィニティーカラムを、５０■の精製
した抗体をＣｎＢｒ活性化セファロース（Ｐｈａｒｎ＋
ａｃｉａ、　Ｉｎｃ、、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎ
Ｊ）に製造業者が特定した条件下に結合させることによ
って調製した。

ＧＭ−ＣＳＦ蛋白質を、濃縮した培地から精製した。

はぼ１２リツトルの培地をアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）　
Ｒへ２０００濃縮装置でほぼ４００ｒｎ１に濃縮した。

濃縮物をイムノアフィニティーカラムに適用し、そして
このカラムを０．５ＭのＮａＣ１を含有するＰＢＳの３
０ｍ１で洗浄した。結合した物質をカラムから０．１Ｍ
のグリシン（ｐＨ２，５）で溶離した。蛋白質含有分画
をプールした。

アフィニティー精製したＧＭ−ＣＳＦをＨＰＬＣによっ
てさらに精製した。プールした物質をＣ−４カラム上に
装入し、そして時間Ｏにおいて１００％のＡ（Ｈ！０中
０．１％のトリフルオロ酢酸［ＴＦＡ］）から３５分に
おいて７０％のＢ（アセトニトリル中０、１％にＴＦＡ
）／３０％のＡの勾配で１ｍ／分の速度で溶出した。溶
出を２８０ｎｍで監視した。ピークの分画を凍結乾燥し
、−８０℃で貯蔵し、そしてアリコートを１２％のポリ
アクリルアミドゲルの電気泳動によってアッセイした。

ゲルから同定した凍結乾燥したピーク分画を１０ｗＭの
酢酸中に再溶解し、プールし、アリコートをとり、凍結
乾燥し、そして−８０℃で貯蔵した。

−６，えＧＭ−ＣＳＦの　　　　１ トランスフエクシヨンしたＢＨＫ細胞からの、精製した
天然（ｃＧＭＩ）　、Ｏ−結合炭水化物含有（ｃＧ暦Ｉ
Ｉ）　、および炭水化物欠乏（ｃＧＭＩＶ）形態の組換
えヒトＧＭ−ＣＳＦを、ヒしにおいて、循環中の半減期
および血球の計数への作用について試験した。

３頭のヒヒを研究のために選択した１代謝の個々の変動
のための実験誤差を排除するために、各動物は各形態の
蛋白質で５．２０または８０ｕｇ／ｋｓｒにおいて１週
の間隔で試験した。第２組の実験において、同一動物に
すべての３１類の投与レベルの同一調製物を１週の間隔
で与えた。この実験の計画は表■に記載する。

以下金白 ノＵ！ 勤皇　　　　　１　　　　　　　２　　　　−３週１　
　５Ｊ１ｇ／　ｋｇ　Ｉ　　　２０ｎ／　ｋｇ　Ｉ　　
　８０ｎ／　ｋｇ　Ｔ週２　　５ｘ／ｋｇＩＩ　　　２
０ｎ／ｋｇＩＩ　　　８０ｎ／ｋｇ■週３　　　５ｊｒ
ｇ／ｋｇｒＶ　　　　２０ｎ／ｋｇＩＶ　　　　８０ｎ
／ｋｇＩＶ週４　　５ｑ／ｋｇｌ　　　５ｎ／ｋｇＩｒ
　　　５ｑ／ｋｇ■週５　２０ｎ／ｋｇ　Ｉ　　　２０
ｎ／ｋｇｆｆ　　　２Ｏｎ／ｋｇｌＶ週６８０屑／眩Ｉ
　　　８０ｎ／ｋｇＩＩ　　　８０屑／　ｋｓｒ　ｒＶ
投与のため、ＨＰ　ＬＣ精製したＧＭ−ＣＳＦ　（実験
例５）を、５６℃で３０分間処理することによって加熱
不活性化したオートロガス血清中に希釈した。動物に１
分の期間にわたって１度の注射（ｂｏｌｕｓ　ｊｎｊｅ
ｃｔｉｎ）を与えた。

循環中の蛋白質の半減期を決定するために、１ｃｃの血
漿試料を、注射後、２．４．６．８．１０．１５．２０
．３０．４０．５０．６０．９０および１２０分に取り
、そしてＧＭ−ＣＳＦ蛋白質度をラジオイムノアッセイ
によって測定した。ＧＭ−ＣＳＦに対するネズミモノク
ローナル抗体を緩衝液Ａ［０，１ＭのＮａｇＣＯｓ　（
ｐＨ９，６）、０．０２％のＮａＮｚ］中に２．５　ｎ
　／　ｍｌに希釈し、そしてこの溶液の１００ｕ１を９
６ウエル（ｗｅｌｌ）のマイクロタイタープレートの各
ウェルに添加した。プレートを３７℃で少なくとも１．
５時間インキュベーションし、次いで１５０ｍ／ウェル
の緩衝液Ｃ（０，０５％のツイーン−２０，０，０２％
のＮａＮ　３を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した０次い
で、ウェルを２００ｄの緩衝液Ｂ　（２％のウシ血清ア
ルブミン、０．０５％のツイーン、０．０２％のＮａＮ
３を含有するＰＢＳ）に添加によってブロックし、そし
てプレートを３７℃で少なくとも１．５時間インキュベ
ーションした。緩衝液を除去し、そしてウェルを１５０
１１！の緩衝液Ｃで３回洗浄した。次いで、試料（１０
ｍ＋９０ｍの緩衝液Ｂ）を添加し、そしてプレートを３
７℃で少なくとも１時間インキュベーションした。溶液
を除去し、そしてプレートを緩衝液Ｃで３回洗浄した。

次いで、ｌ！ＳＩで標識した第２ネズミ高ＧＭ　−ＣＳ
Ｆモノクロ一ナル抗体を１００、　ＯＯＯｃｐｍ／ウェ
ルで添加し、そしてプレートを３７℃で少なくとも１時
間インキュベーションした。溶液を除去し、ウェルを緩
衝液Ｃで３回洗浄し、そしてガンマカウンターで計数し
た。第６Ａ図、第６Ｂ図および第６Ｃ図に示す結果から
明らかなように、突然変異の形態のＧＭ　−ＣＳＦは循
環中で、とくにより高い投与量で延長された半減期を有
する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｎ−結合炭水化物類を欠＜　ＧＭ−ＣＳＦの
アミノ酸配列を、この蛋白質をコードするヌクレオチド
配列と一緒に示す。 第２図は、Ｎ−結合炭水化物および〇−結合炭水化物を
欠＜ＧＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列を、この蛋白質をコー
ドするヌクレオチド配列と一緒に示す。 第３図は、アミノ酸４４においてＮ−結合炭水化物を欠
＜ＧＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列およびコードヌクレオチ
ド配列を示す。 第４図は、発現ベクターｐＤＸの造成を示す。 第５図は、ＣＯ５−１細胞中で生産された組換えヒトＧ
Ｍ−ＣＳＦの天然および突然変異の形態を示す。 第６Ａ図、第６Ｂ図、および第６Ｃ図は、ヒトにおける
組換えＧＭ　−ＣＳＦの薬理動態の結果を示す。 ｇｍｃｓｐ　Ｍ−Ｌｉｎｋｅｄ　ｓｉヒｅｓ　Ｅｌｉｍ
ｉｎａｔｅｄテＧム ＦＩＧ、１ ｑｍｃｓＦ　Ｎ−ａｎｄ　Ｏ−Ｌｉｎｋｅｄ　５ｉｔｅ
ｓ　ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄτＣＡ ＦＩＧ、２ 、ｃｇｙ　ｏｎｅＨ−１，１ｎｋｅｄ　　５ｉｔｅ　　
Ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ入＾０００ＣＣＣＣＴＴＯＡＣＣ
ＡＴＯＡ？０（ｉｃｅＡＧｅＣＡＣ〒ＡＣＡＡＯＣ入Ｇ
ｅＡｃＷＣＣＣＴＣＣｋＡＣＣｔ、ｙｓ　　Ｃ１ｙ　Ｐ
ｒｏ　　Ｌ＊ｕ　　Ｔｈｔ　　Ｍ＠ｔ　　Ｈａｔ　Ａｌ
ａ　　！ｓｒ　　ＨＬｍ　　Ｔｙｅ　　Ｌｙｓ　　Ｃ＋
１ｎ　　ｌ１ｌｓ　　Ｃｙｓ　　Ｐｚｏ　　Ｐｒｏ　　
ＴＭ丁Ｃ入 ＦＩＧ、３ Ｆ工Ｇ、５ ＝ 判鳴濃度】　　　邂 鞠（ｄ濃度ｌ 〜〜〜〜ｙＬ＋１！＋Ｊ！、＋Ｉ−！＋１＾＾−一＾−
−一　−ω　　　　〜　−ｃｙ＋　　艶　　　　Ｍ　＾
　■　■手続補正書（方式） 昭和６３年５月２３日 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 １、　事件の表示 昭和６３年特許願第０１９４６８号 名称　ザイモジェネティクス。 インコーホレイティド（外１名） ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号静光
虎ノ門ビル　電話５０４−０７２１５６　　補正命令の
日付 昭和６３年４月２６日（発送日） ６、補正の対象 （１１願書の「出願人の代表者」の欄 （２）委任状 （３）明細書 （４）図面 （５）明細書の「図面の簡単な説明」の欄７、補正の内
容 （１１（２１別紙の通り （３）明細書の浄書（内容に変更なし）（４）図面の浄
ＩＦ（内容に変更なし）（５）　　明細書第６７頁１８
行目「突然変異の形態を示す、ノをｒ突然変異体の形態
を示す図面に代る写真である。１に補正する。 ８、添附書類の目録 ＋１）訂正願書　　　　　１通 （２）　　委任状及び訳文　　　　　　　　　各２通（
３）浄書明細書　　　　　　１通 （４）浄書図面　　　　　１通

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｎ−結合グリコシル化に欠けるが、Ｏ−結合グリコ
   シル化を有し、そして天然ヒトＧＭ−ＣＳＦより高い比
   活性を有することを特徴とする蛋白質。 ２、１個のみＮ−結合炭水化物鎖を有し、そして天然ヒ
   トＧＭ−ＣＳＦより高い比活性を有することを特徴とす
   る蛋白質。 ３、番号１８のアラニンから出発し、そして番号１４４
   のグルタミン酸で終る第１図のアミノ酸配列を有し、そ
   して天然ヒトＧＭ−ＣＳＦより高い比活性を有すること
   を特徴とする蛋白質。 ４、前記蛋白質がｂｐ５２〜ｂｐ４３２の第１図のＤＮ
   Ａ配列によってコードされる、請求項３に記載の蛋白質
   。 ５、番号１８のアラニンから出発し、そして番号１４４
   のグルタミン酸で終る第２図のアミノ酸配列を有し、そ
   して天然ヒトＧＭ−ＣＳＦより高い比活性を有すること
   を特徴とする蛋白質。 ６、前記蛋白質がｂｐ５２〜ｂｐ４３２の第２図のＤＮ
   Ａ配列によってコードされる請求項５に記載の蛋白質。 ７、番号１８のアラニンから出発し、そして番号１４４
   のグルタミン酸で終る第３図のアミノ酸配列を有し、そ
   して天然ヒトＧＭ−ＣＳＦより高い比活性を有すること
   を特徴とする蛋白質。 ８、前記蛋白質がｂｐ５２〜ｂｐ４３２の第３図のＤＮ
   Ａ配列によってコードされる請求項第７に記載の蛋白質
   。 ９、天然ヒトＧＭ−ＣＳＦより高い比活性を有する蛋白
   質を生成する方法であって、 真核生物の宿主細胞中に発現単位を導入し、前記発現単
   位はプロモーターおよびそれに続く下流に請求項１〜８
   のいずれか一項に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列
   を含んでなり、前記蛋白質は天然ヒトＧＨ−ＣＳＦより
   高い比活性を有し；前記真核生物の宿主細胞を適当な培
   地中で増殖せしめ；そして 前記ＤＮＡ配列によってコードされておりかつ前記真核
   生物の宿主細胞によって生産された蛋白質生成物を分離
   する； を含んでなることを特徴とする前記方法。 １０、前記真核生物の宿主細胞が、哺乳類、酵母および
   アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の細胞から
   成る群より選択される請求項９に記載の方法。 １１、有効量の請求項１〜８にのいずれか１項に記載の
   蛋白質であって天然ヒトＧＭ−ＣＳＦより高い比活性を
   有するもの、および生理学的に許容されうる担体または
   希釈剤を含んでなることを特徴とする医薬組成物。 １２、活性な治療用物質として使用するための請求項１
   〜８項のいずれか１項に記載の蛋白質。