ES2314999T3 - Factor celular madre. - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a nuevos factores de células germinales, oligonucleótidos que codifican los mismos y procedimientos para su producción. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas y procedimientos para tratara trastornos que implican a las células sanguíneas.
Description
Factor celular madre.
La presente invención se refiere en general a
factores nuevos que estimulan las células progenitoras primitivas,
inclusive las células progenitoras hematopoyéticas tempranas así
como a secuencias de ADN que codifican dichos factores. En
particular, la invención se refiere a estos factores nuevos, a
fragmentos y análogos polipeptídicos de los mismos y a secuencias
de ADN que los codifican.
El sistema de formación de sangre humana
(hematopoyético) está constituido por una serie de leucocitos (que
incluyen neutrófilos, macrófagos, basófilos, mastocitos,
eosinófilos, células T y B), glóbulos rojos (eritrocitos) y células
formadoras de coágulos (megacariocitos, plaquetas).
Se cree que pequeñas cantidades de ciertos
factores de crecimiento hematopoyéticos explican la diferenciación
de un pequeño número de "células madre" en una variedad de
progenitores de células sanguíneas, la tremenda proliferación de
dichas células así como la diferenciación final de células
sanguíneas maduras a partir de estas líneas. El sistema
regenerativo hematopoyético funciona bien en condiciones normales.
No obstante, debido al estrés derivado de la quimioterapia, la
radiación o los trastornos mielodisplásicos naturales existe un
período durante el cual los pacientes padecen serias
leucocitopenias, anemias o trombocitopenias. El desarrollo y la
utilización de factores de crecimiento hematopoyéticos acelera la
regeneración de la médula ósea durante esta fase peligrosa.
En algunos trastornos inducidos por virus, como
el síndrome de inmunodeficiencia adquirido (SIDA) se pueden
destruir específicamente elementos sanguíneos como células T. El
aumento de la producción de células T puede resultar terapéutico en
algunos casos.
Debido a que los factores de crecimiento
hematopoyéticos se encuentran presentes en cantidades extremadamente
pequeñas, la detección y la identificación de estos factores se
apoya en una serie de ensayos que hasta ahora sólo distingue entre
los distintos factores sobre la base de efectos estimuladores en
células cultivadas bajo condiciones artificiales.
La aplicación de técnicas de genética
recombinante ha permitido entender mejor las actividades biológicas
de algunos factores de crecimiento individuales. Se han obtenido, p.
ej. las secuencias de aminoácidos y ADN de la eritropoyetina (EPO),
que estimula la producción de eritrocitos (véase Lin, Patente US
4,703,008 que se incorpora aquí a modo de referencia). También se
han aplicado métodos recombinantes al aislamiento de cADN para un
factor estimulante de colonias de granulocitos humanos,
G-GSF (véase, Souza, Patente US 4,810,643, que se
incorpora aquí a modo de referencia) y factor estimulante de
colonia de granulocito-macrófago humano
(GM-CSF) [Lee, y colaboradores, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 82, 4360-4365 (1985);
Wong, y colaboradores, Science, 228,
810-814 (1985)], y el factor estimulante de colonia
de macrófago humano (CSF-l) [Kawasaki, y
colaboradores, Science, 230, 291 (1985)].
El sistema de ensayo de las ceéulas formadoras
de colonia de alto potencial proliferativo (HPP-CFC)
verifica la acción de los factores en progenitores hematopoyéticos
tempranos [Zont, J. Exp. Med., 159,
679-690 (1984)]. En la literatura existen varios
informes sobre factores activos en el ensayo
HPP-CFC. Las fuentes de estos factores se indican
en el Cuadro 1. Los factores mejor caracterizados se tratan a
continuación.
Toda actividad en un medio condicionado por el
bazo humano recibe el nombre de factor sinérgico (SF). Muchos
tejidos humanos y líneas celulares humanas y de ratón producen un
SF, designado SF-1, que, en sinergia con
CSF-1, estimula la HPP-CFC más
temprana. Dan cuenta del SF-1 algunos informes en
medios condicionados por células de bazo humano, células de
placenta humana, células 5637 (una línea celular de carcinoma
vesicular). Todavía está por determinar la identidad de
SF-1. Los informes iniciales muestran actividades
solapadas de interleucina-1 con SF-1
de la línea celular 5637 [Zsebo y colaboradores; Blood,
71, 962-968 (1988)]. Sin embargo, unos
informes adicionales han mostrado que la combinación de
interceucina-1 (IL-1) más
CSF-1 no puede estimular la misma formación de
colonia que la que se puede obtener con CSF-1 más
preparados particularmente purificados de medios condicionados por
5637 [McNiece, Blood, 73, 919 (1989)].
El factor sinérgico presente en extracto de
útero de ratón preñado es CSF-1. Las células
WEHI-3 (línea celular de leucemia mielomonocítica
de murino) producen un factor sinérgico que parece ser idéntico a
IL-3. Tanto CSF-1 como
IL-3 estimulan los progenitores hematopoyéticos que
son más maduros que la diana (referencia) de
SF-1.
Otra clase de factor sinérgico parece estar
presente en medios condicionados de células TC-1
(células estromales derivadas de médula ósea). Esta línea celular
produce un factor que estimula tanto los tipos de célula mieloide
temprana como las células linfoides. Ha recibido el nombre de
factor de crecimiento
hemo-linfo-poyético 1
(HLGF-1) tiene un peso molecular aparente de
120.000 [McNiece y colaboradores, Exp. Hematol., 16,
383 (1988)].
De las interceucinas y CSFs, conocidas, se han
identificado IL-1, IL-3 y
CSF-1 como poseedoras de actividad en el ensayo
HPP-CFC. Las demás fuentes de actividad sinérgicas
mencionadas en el Cuadro 1 no han sido identificadas
estructuralmente. Sobre la base de la secuencia de polipéptidos y el
perfil de actividad biológica, la presente invención se refiere a
una molécula diferente de IL-1,
IL-3, CSF-1 y
SF-1.
Cuando se administran por medio parenteral las
proteínas suelen ser sacadas rápidamente de la circulación y pueden
provocar por lo tanto una actividad farmacológica de vida
relativamente corta. Por consiguiente pueden ser necesarias
inyecciones frecuentes de dosis relativamente grandes de proteínas
bioactivas para reforzar la eficacia terapéutica. Las proteínas
modificadas por el enlace covalente de polímeros solubles en agua
como el polietilenglicol, copolímeros de polietilenglicol y
polipropilenglicol, carboxi metil celulosa, dextrano, polivinil
alcohol, polivinil pirrolidona o poliprolina tienen, como se sabe,
vidas medias en la sangre bastante más largas tras la inyección
intravenosa, si se compara con lo que ocurre con proteínas no
modificadas [Abuchowski y colaboradores: "Encimes as Drugs",
(Enzimas como Fármacos), Holcenberg y colaboradores, eds.
Wiley-Interscience, New York, NY,
367-383 (1981), Newmark y colaboradores, J.
Appl. Biochem. 4:185-189 (1982), y Katre
y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,
1487-1491 (1987)]. Estas modificaciones también
puede incrementar la solubilidad de la proteína en solución acuosa,
eliminar la agregación, potenciar la actividad física y química de
la proteína y reducir en gran medida la inmunogenicidad y la
antigenicidad de la proteína. Como resultado de ello, la actividad
biológica in vivo deseada se puede lograr mediante la
administración de estos aductos polímero-proteína
menos frecuentemente o en dosis más reducidas que con la proteína no
modificada.
La fijación del polietilenglicol (PEG) a las
proteínas resulta particularmente útil ya que el PEG tiene una
toxicidad muy baja en los mamíferos [Carpenter y colaboradores,
Toxicol. Appl. Pharmacol., 18, 35-40
(1971)]. Por ejemplo, un aducto PEG de adenosina de aminasa fue
aprobado en EEUU para su utilización en pacientes humanos para el
tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia combinada grave. Una
segunda ventaja que ofrece la conjugación de PEG es la de reducir
de modo eficaz la inmunogenicidad y la antigenicidad de proteínas
heterólogas. Por ejemplo, un adulto PEG de una proteína humana
podría ser útil para el tratamiento de trastornos en otras especies
mamíferas sin el riesgo de activar una respuesta inmune severa.
Los polímeros como el PEG se pueden fijar
convenientemente a uno o más residuos de aminoácido reactivo en una
proteína como el grupo alfa-amino del aminoácido
amino-terminal, los grupos amino épsilon de cadenas
laterales de lisina, los grupos de sulfhidrilo de cadenas laterales
de cisteína, los grupos de carboxilo de cadenas laterales de
aspartilo y glutamilo, el grupo alfa-carboxilo del
aminoácido carboxilo-terminal, cadenas laterales de
tirosina, o a derivados activados de cadenas de glicosilo fijadas a
ciertos residuos de asparagina, serina o treonina.
Se han descrito numerosas formas activadas de
PEG adecuadas para la reacción directa con proteínas. Como reactivos
PEG útiles para la reacción con grupos amino proteínicos, se pueden
citar los ésteres activos del ácido carboxílico o derivados de
carbonato, particularmente aquellos en los que los grupos de salida
son N-hidroxi succinimida,
p-nitrofenol, imidazol o
1-hidroxi-2-nitrobenceno-4-
sulfotato. Los derivados PEG que contienen grupos maleimido o
haloacetilo son reactivos útiles para la modificación de grupos
sulfhidrilo libres de proteína. Asimismo, los reactivos PEG que
contienen grupos amino, hidracina o hidracida resultan útiles para
la reacción con aldehídos generados por oxidación periodada de
grupos de carbohidrato en proteínas.
Uno de los objetos de la presente invención es
presentar un factor causante del crecimiento de células progenitoras
hematopoyéticas tempranas.
Según la presente invención, tal como se define
en las reivindicaciones, se ofrecen factores nuevos, que reciben
aquí el nombre de "factores célula madre" (SCF) que pueden
estimular el crecimiento de progenitores primitivos inclusive
células progenitoras hematopoyéticas tempranas. Estos SCFs también
pueden estimular células madre no hematopoyéticas como células madre
neurales y células madre germinales primordiales. Estos factores
comprenden factores célula madre naturales purificados. La
invención también se refiere a polipéptidos no naturales que tienen
secuencias de aminoácidos suficientemente duplicativas de las del
factor célula madre natural para permitir una actividad biológica
hematopoyética del factor célula madre natural.
La presente descripción presenta también
secuencias de ADN aisladas que se utilizan para garantizar la
expresión en células anfitrionas procarióticas o eucarióticas de
productos polipeptídicos que tienen secuencias de aminoácidos
suficientemente duplicativas de las de factor célula madre natural
para permitir una actividad biológica hematopoyética del factor
célula madre natural. Estas secuencias de ADN comprenden:
(a) las secuencias de ADN expuestas en las
Figuras 14 B, 14C, 15B, 15C, 42 y 44 o sus cadenas
complementarias;
(b) secuencias de ADN que hibridan con las
secuencias de ADN definidas en (a) o fragmentos de las mismas;
y
(c) secuencias de ADN que por degeneración del
código genético hibridarían con las secuencias ADN definidas en (a)
y (b).
La descripción también presenta vectores que
contienen dichas secuencias de ADN anfitrionas transformadas o
transfectadas con dichos vectores. La descripción también incluye
métodos para la producción de SCF por medio de técnicas
recombinantes y métodos para el tratamiento de trastornos. La
descripción presenta además, compuestos farmacéuticos, que
comprenden SCF y SCF que fija específicamente anticuerpos.
La descripción también se refiere a un proceso
para la recuperación eficaz del factor célula madre de un material
que contiene SCF, proceso que comprende las etapas de separación
cromatográfica por intercambio de iones y/o separación
cromatográfica líquida en fase inversa.
La presente descripción también ofrece un aducto
biológicamente activo que tiene una vida media in vivo
prolongada y una potencia mejorada en mamíferos, que comprende SCF
conjugado covalentemente con un polímero soluble en agua como
polietilenglicol o copolímeros de polietilenglicol y
propilenglicol, donde dicho polímero está insustituido o sustituido
en un extremo por un grupo alquilo. Otro aspecto de la presente
descripción reside en un proceso para la preparación del aducto
antes descrito, que comprende la reacción de SCF con un polímero
soluble en agua que tiene al menos un grupo reactivo terminal y la
purificación del aducto resultante para obtener un producto con
vida media de circulación ampliada y actividad biológica
potenciada.
La Figura 1 es un cromatograma de intercambio
aniónico de la purificación de SCF de mamífero.
La Figura 2 es un cromatograma de filtración por
gel de la purificación de SCF de mamífero.
La Figura 3 es un cromatograma de
aglutinina-agarosa de germen de trigo de la
purificación de SCF de mamífero.
La Figura 4 es un cromatograma intercambiador de
cationes de la purificación de SCF de mamífero.
La Figura 5 es un cromatograma de C_{4} de la
purificación de SCF de mamífero.
La Figura 6 muestra sodio dodecil sulfato
(SDS)-electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE)
(SDS-PAGE) de fracciones de columna de la figura
5.
La Figura 7 es un cromatograma de C_{4}
analítico de SCF de mamífero.
La Figura 8 muestra SDS-PAGE de
fracciones de columna de C_{4} de la figura 7.
La Figura 9 muestra SDS-PAGE de
SCF de mamífero purificado y SCF de mamífero deglicosilado.
La Figura 10 es un cromatograma de C_{4}
analítico de SCF de mamífero purficado.
La Figura 11 muestra la secuencia de aminoácidos
de SDF de mamífero derivado de la secuenciación proteínica.
La Figura 12 muestra
A. oligonucleótidos para cADN de SCF de rata
B. oligonucleótidos para ADN de SCF humano
C. oligonucleótidos universales.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 13 muestra
A. un esquema para la amplificación de reacción
en cadena de polimerasa (PCR) de cADN de SCF de rata
B. un esquema para la amplificación PCR de cADN
de SCF humano.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 14 muestra
A. estrategia de secuenciación para ADN genómico
de rata.
B. la secuencia de ácido nucleico de ADN
genómico de rata.
C. la secuencia de ácido nucleico de cADN de SCF
de rata y la secuencia de aminoácidos de proteína de SCF de
rata.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 15 muestra
A. la estrategia para la secuenciación de ADN
genómico humano.
B. la secuencia de ácidos nucleicos de ADN
genómico humano.
C. La secuencia de ácidos nucleicos compuestos
de cADN de SCF humano y la secuencia de aminoácidos de proteína de
SCF.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 16 muestra las secuencias de
aminoácido alineadas de proteína SCF humana, de mono, de perro, de
ratón y de rata.
La Figura 17 muestra la estructura del vector de
expresión celular de mamífero V19.8 SCF.
La Figura 18 muestra la estructura del vector de
expresión celular CHO de mamífero pDSVE.1.
La Figura 19 muestra la estructura del vector de
expresión de E. Coli pCFM1156.
La Figura 20 muestra
A. un radioinmunoensayo de SCF de mamífero.
B. SDS-PAGE de SC F de SCF de
mamífero inmuno-precipitado.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 21 muestra el análisis Western de SCF
humano recombinante.
La Figura 22 muestra análisis Western de SCF de
rata recombinante.
La Figura 23 es un gráfico de barras que muestra
el efecto de SCF de rata recombinante producido por célula
COS-1 sobre transplante de médula ósea.
La Figura 24 muestra el efecto de SCF de rata
recombinante sobre la curación de la anemia macrocítica de ratones
Steel.
La Figura 25 muestra el recuento de glóbulos
blancos periféricos (WBC) de ratones Steel tratados con SCF de rata
recombinante.
La Figura 26 muestra los recuentos de plaquetas
de ratones Steel tratados con SCF de rata recombinante.
\newpage
La Figura 27 muestra el recuento diferencial WBC
para ratones Steel tratados con SCF^{1-164} PEG 25
de rata recombinante.
La Figura 28 muestra los subconjuntos de
linfocitos para ratones Steel tratados con
SCF^{1-164} PEG 25 de rata recombinante.
La Figura 29 muestra el efecto del tratamiento
SCF de secuencia humana recombinante de primates normales en el
incremento del recuento de WBC periférico.
La Figura 30 muestra el efecto del tratamiento
SCF de secuencia humana recombinante de primates normales en el
aumento de los números de hematocrito y plaquetas.
La Figura 31 muestra fotografías de
A. colonias de médula ósea humana estimuladas
por SCF^{1-162} humano recombinante.
B. células teñidas Wright-Giemsa
de colonias de la Figura 31A.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 32 muestra SDS-PAGE de
fracciones de columna de S-sefarosa del cromatograma
mostrado en la Figura 33
A. con agente reductor
B. sin agente reductor
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 33 es un cromatograma de una columna
de S-sefarosa de E. Coli. derivado de SCF
humano recombinante.
La Figura 34 muestra SDS-PAGE de
fracciones de columna C_{4} de cromatograma de la Figurar 35
A. con agente reductor
B. sin agente reductor
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 35 es un cromatograma de una columna
C_{4} de SCF humano recombinante derivado de E. Coli.
La Figura 36 es un cromatograma de columna Q
sefarosa de SCF de rata recombinante derivado de HO.
La Figura 37 es un cromatograma de una columna
C_{4} de SCF de rata recombinante derivado de CHO.
La Figura 38 muestra SDS-PAGE de
fracciones de columna C_{4} del cromatograma de la Figura 37.
La Figura 39 muestra SDS-PAGE de
SCF de rata recombinante derivado de CHO purificado antes y después
de la deglicosilación.
La Figura 40 muestra
A. una cromatografía de filtración de gel de una
mezcla de reacción de SCF^{1-164} pegilado de rata
recombinante.
B. cromatografía de filtración de gel de
SCF^{1-164} de rata recombinante, sin
modificar.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 41 muestra SCF marcado que
interacciona con blastos leucémicos frescos.
La Figura 42 muestra una secuencia de cADN de
SCF humano obtenido de la línea celular fibrosarcoma HT1080.
La Figura 43 muestra un autorradiógrafo de
células COS-7 que expresan
SCF^{1-248} humano y células CHO que expresan
SCF^{1-164} humano.
La Figura 44 muestra una secuencia de cADN de
SCF humano obtenido de la línea celular del carcinoma de vejiga
5632.
La Figura 45 muestra la supervivencia potenciada
de ratones irradiados tras el tratamiento con SCF.
La Figura 46 muestra la supervivencia potenciada
de ratones irradiados tras el transplante de médula ósea con 5% de
un fémur y tratamiento con SDF.
La Figura 47 muestra la supervivencia potenciada
de ratones irradiados tras el transplante de médula ósea con 0,1 y
20% de un fémur y tratamiento con SDF.
\vskip1.000000\baselineskip
Expertos en la materia podrán apreciar numerosos
aspectos y ventajas de la invención en la siguiente descripción
detallada que ofrece ilustraciones de la práctica de la invención
en sus realizaciones actualmente preferidas.
Según la presente descripción, se presentan
nuevos factores célula madre y secuencias de ADN que codifican la
totalidad o parte de estos SCFs. El término "factor célula
madre" o "SCF" utilizado aquí se refiere a SCF natural (p.
ej. SCF humano natural) así como a polipéptidos no naturales (es
decir diferentes de los naturales) que tienen secuencias de
aminoácidos y glicosilación suficientemente duplicativa de la del
factor célula madre natural para permitir que tenga una actividad
biológica hematopoyética de factor célula madre natural. El factor
célula madre tiene la aptitud de estimular el crecimiento de
progenitores hematopoyéticos tempranos que son capaces de madurar a
eritroides, megacariocitos, granulocitos, linfocitos y células
macrófagas. El tratamiento con SCF de mamíferos da como resultado
unos incrementos de las células hematopoyéticas de linajes mieloide
y linfoide. Una de las características más importante de las
células madres es su aptitud para diferenciarse en células mieloides
y células linfoides [Weissman, Science, 241,
58-62 (1988)]. El tratamiento de ratones Steel (Ej.
8B) con SCF de rata recombinante tiene como resultado incrementos de
granulocitos, monocitos, eritrocitos, linfocitos y plaquetas. El
tratamiento de primates normales con SCF humano recombinante da
como resultado incrementos en las células mieloides y linfoides (Ej.
8C).
Existe una expresión embrionaria de SCF por
células en la vía migratoria y las zonas receptoras de
melanoblastos, células germinales, células hematopoyéticas, médula
cerebral y espinal. Las células progenitoras hematopoyéticas
tempranas son enriquecidas en médula ósea de mamíferos tratados con
5-Fluorouracil (5-FU). El fármaco
quimioterapéutico 5-FU merma los progenitores
hematopoyéticos tardíos. SCF actúa sobre la médula ósea post
5-FU.
La actividad biológica y el modelo de
distribución de tejido de SCF demuestra su función central en la
embriogénesis y la hematopoyesis así como su capacidad para el
tratamiento de varias deficiencias de célula madre.
La presente descripción ofrece secuencias de ADN
que incluyen: la incorporación de codones "preferidos" para su
expresión por anfitriones no mamíferos seleccionados; la provisión
de zonas para la segmentación por enzimas endonucleasas de
restricción; y la provisión de secuencias de ADN adicionales,
iniciales, terminales o intermedias que facilitan la construcción de
vectores de fácil expresión.
La presente descripción también ofrece
secuencias de ADN que codifican polipéptidos análogos o derivados
de SCF que difieren de las formas naturales en término de la
identidad o ubicación de uno o más residuos aminoácidos (es decir
análogos de supresión que contienen menos de la totalidad de los
residuos especificados para SCF; análogos de sustitución, donde uno
o más residuos especificados se sustituyen por otros residuos; y
análogos de adición donde se añade uno o más residuos de
aminoácidos a una parte terminal o medial del polipéptido) y que
comparten algunas o la totalidad de las propiedades de formas
naturales. La descripción ofrece específicamente secuencias de ADN
que codifican la secuencia de aminoácidos no procesada de longitud
normal así como secuencias de ADN que codifican la forma procesada
de SCF.
Las nuevas secuencias de ADN de la descripción
incluyen secuencias útiles para garantizar la expresión en células
huésped procarióticas o eucarióticas de productos polipeptídicos que
tienen por lo menos una parte de la conformación estructural
primaria y una o más de las propiedades biológicas del SCF natural.
Las secuencias de ADN de la descripción comprenden específicamente:
(a) secuencias de ADN expuestas en las figuras 14D, 14C, 15B, 15C,
42 y 44 o sus cadenas complementarias; (b) secuencias de ADN que
hibridan (en condiciones de hibridación descritas en el ejemplo 3 o
condiciones más rigurosas) a las secuencias de ADN de las Figuras
14B, 14C, 15B, 15C, 42 y 44 o a fragüentos de las mismas; y (c)
secuencias de ADN que si no fuera por la degeneración del código
genético, hibridarían a las secuencias de ADN de las Figuras 14B,
14C, 15B, 15C, 42 y 44. Específicamente comprendidas en las partes
(b) y (c) están las secuencias de ADN genómico que codifican formas
variantes alélicas de SCF y/o que codifican SCF de otras especies
mamíferas, y secuencias de ADN fabricadas que codifican SCF,
fragmentos de SCF, y análogos de SCF. Las secuencias de ADN pueden
incorporar codones que facilitan la transcripción y la traducción
de ARN mensajero en huéspedes microbianos. Dichas secuencias
fabricadas se pueden construir fácilmente según los métodos de Alton
y colaboradores, PCT solicitud publicada WO 83/04053.
Según otro aspecto de la descripción, las
secuencias de ADN descritas aquí, que codifican polipéptidos que
tienen actividad SCF resultan valiosas por la información que
facilitan acerca de la secuencia de la proteína de mamífero que
hasta la fecha no se encontraba disponible. Las secuencias de ADN
resultan también valiosas como productos útiles para proceder a la
síntesis a gran escala de SCF mediante toda una serie de técnicas
recombinantes. Dicho de otro modo, las secuencias de ADN que
aparecen en la descripción resultan útiles para generar nuevos y
útiles vectores ADN plásmidos virales y circulares, nuevas y útiles
células huésped procarióticas y eucarióticas transformadas y
transfectadas (inclusive células bacterianas y de levaduras así como
células de mamífero obtenidas en cultivo), y nuevos y útiles
métodos para el crecimiento en cultivo de las células huésped aptas
para la expresión de SCF y sus productos afines.
Las secuencias de ADN de la descripción son
también materiales adecuados que se utilizan como sondas rotuladas
en el aislamiento de ADN genómico humano que codifica SCF y otros
genes para proteínas afines así como cADN y secuencias de ADN
genómico de otras especies mamíferas. Las secuencias de ADN de la
descripción pueden resultar también útiles en varios métodos
alternativos de síntesis de proteína (p. ej. en células de insectos)
o en terapia genética de humanos y otros mamíferos. Se espera que
las secuencias de ADN de la descripción resulten útiles para
desarrollar especies de mamíferos transgénicos que pueden servir de
"huéspedes" eucarióticos para la producción de SCF y productos
de SCF en cantidad. Véase, en general, Palmier y colaboradores,
Science 222, 809-814 (1983).
La presente invención ofrece SCF natural
purificado y aislado (es decir purificado desde su estado natural o
fabricado de forma que la conformación primaria, secundaria y
terciaria, y el modelo de glicosilación sean idénticos al material
natural) así como polipéptidos no naturales que tienen una
conformación estructural primaria (es decir secuencia continua de
residuos de aminoácidos) y glicosilación suficientemente
duplicativa de la del factor célula madre natural para permitir que
posea una actividad biológica hematopoyética de SCF natural. Estos
polipéptidos comprenden derivados y análogos.
En una realización preferida, SCF se caracteriza
por ser el producto de expresión huésped procariótica o eucariótica
(p. ej. por células bacterianas, de levaduras, de plantas
superiores, insectos y mamíferos en cultivo) de secuencias de ADN
exógenas obtenidas por clonación genómica o de cADN o por síntesis
génica. Es decir, en una realización preferida, SCF es "SCF
recombinante". Los productos de expresión en levaduras típicas
(p. ej. Saccharomyces cerevisiae) o células huésped
procariotas (p. ej. E. coli) están libres de
asociación con proteínas de mamífero. Los productos de
expresión en células de vertebrados [p. ej. de mamífero no humano
(p. ej. COS o CHO) y de aves] están libres de asociación con
cualquier proteína humana. En función del huésped empleado, los
polipéptidos de la invención se pueden glicosilar con carbohidratos
de mamíferos u otros carbohidratos eucarióticos o pueden ser no
glicosilados. La célula huésped se puede alterar utilizando
técnicas como las descritas en Lee y colaboradores, J. Biol. Chem.
264 (1989) que se incorpora aquí a modo de referencia. Los
polipéptidos de la invención pueden incluir también un residuo de
aminoácido metionina inicial (en posición -1).
Además de las formas alélicas no naturales de
SCF, la presente invención también abarca otros productos SCF como
análogos de polipéptidos de SCF Estos análogos incluyen fragmentos
de SCF. Siguiendo los procedimientos de la solicitud antes
mencionada, publicada por Alton y colaboradores (WO 83/04053), es
posible diseñar y fabricar fácilmente genes que codifican para la
expresión microbiana de polipéptidos que tienen conformaciones
primarias que difieren de las aquí especificadas en términos de
identidad o ubicación de uno o más residuos (p. ej. sustituciones,
adiciones terminales e intermedias y supresiones). Por otra parte,
se pueden realizar fácilmente modificaciones de cADN y genes
genómicos utilizando técnicas bien conocidas de mutagénesis
orientada hacia la zona, que se utilizan para generar análogos y
derivados de SCF. Estos productos comparten por lo menos una de las
propiedades biológicas de SCF aunque pueden diferir en otras. Como
ejemplo, los productos de la invención incluyen aquellos que han
sido escorzados por ejemplo por supresiones; o aquellos que son más
estables a la hidrólisis (y, por consiguiente, puede tener efectos
más pronunciados o de mayor duración que los naturales); o que han
sido alterados para suprimir o modificar una o más zonas potenciales
para la O-glicosilación y/o
N-glicosilación o que tienen uno o más residuos de
cisteína suprimidos o sustituidos por ejemplo por residuos de
alanina o serina y se aíslan potencialmente de modo más fácil en
forma activa de los sistemas microbianos; o que tienen uno o más
residuos de tirosina sustituidos por fenil alanina y que interactúan
más o menos fácilmente con proteínas-blanco o con
receptores sobre células-blanco. También se incluyen
fragmentos de polipéptidos que duplican solamente una parte de la
secuencia continua de aminoácidos o conformaciones secundarias
dentro de SCF, fragmentos que pueden poseer una propiedad del SCF
(p. ej. fijación de receptor) y no otras (p. ej. actividad de
crecimiento celular hematopoyético temprano). Conviene señalar que
la actividad no es necesaria para que uno o varios de lo productos
de la invención tenga utilidad terapéutica [véase Weiland y
colaboradores, Blut, 44, 173-175
(1982)] o utilidad en otros contextos, como por ejemplo en ensayos
de antagonismo de SCF. Los antagonistas competitivos pueden resultar
muy útiles en casos, por ejemplo, de sobreproducción de SCF o casos
de leucemias humanas en las que las células malignas sobreexpresan
receptores para SCF, como indica la sobreexpresión de receptores de
SCF en blastos leucémicos (Ej. 13).
Acerca de la posibilidad de aplicación de
análogos polipeptidicos de la invención existen informes sobre la
propiedad inmunológica de péptidos sintéticos que duplican
sustancialmente la secuencia de aminoácidos existente en proteínas
naturales, glicoproteínas y nucleoproteinas. Más específicamente,
se ha visto que los polipéptidos de peso molecular relativamente
bajo participan en reacciones inmunes que son similares en duración
y extensión a las reacciones inmunes de proteínas fisiológicamente
significantes como antígenos virales, hormonas polipeptídicas y
similares. Las reacciones inmunes de estos polipéptidos incluyen la
provocación de formación de anticuerpos específicos en animales
inmunológicamente activos [Lerner y colaboradores, Cell,
23, 309-310 (1981); Ross y colaboradores,
Nature, 294, 654-656 (1981; Walter y
colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,
5197-5200 (1980); Lerner y colaboradores, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 78, 3403-3407
(1981); Walter y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
78, 4882-4886 (1981); Wong y colaboradores,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79,
5322-5326 (1982); Baron y colaboradores,
Cell, 28, 395-404 (1982); Dressmann y
colaboradores, Nature, 295, 185-160
(1982); y Lerner, Scientific American, 248,
66-74 (1983)]. Véase también, Kaiser y
colaboradores, [Science, 223, 249-255
(1984)] relativo a propiedades biológicas e inmunológicas de
péptidos sintéticos que comparten aprox. estructuras secundarias de
hormonas peptídicas pero no pueden compartir su conformación
estructural primaria.
La presente invención también incluye aquella
clase de polipéptidos codificados por porciones del ADN
complementario a la cadena codificadora de proteína del cADN humano
o secuencias de ADN genómico de SCF, es decir, "proteínas
complementarias invertidas", tal como describen Tramontado y
colaboradores, [Nucleid Acid Res. 12,
5049-5059 (1984)].
Los polipéptidos representativos de SCF de la
presente invención comprenden, sin que esto suponga limitación,
SCF^{1-148}, SCF^{1-162},
SCF^{1-164}, SCF^{1-165} y
SCF^{1-183}, en la Figura 15C;
SCF^{1-185}, SCF^{1-188},
SCF^{1-189} y SCF^{1-248} en la
Figura 42; y SCF^{1-157},
SCF^{1-160}, SCF^{1-161} y
SCF^{1-220} en la Figura 44.
El SCF se puede purificar utilizando técnicas
conocidas por los expertos en la materia. La presente descripción
comprende un método para purificar SCF a partir de un material que
contiene SCF como por ejemplo medio condicionado u orina humana,
suero; dicho método comprende una o más de las etapas siguientes:
someter el material que contiene SCF a cromatografía de intercambio
iónico (ya sea cromatografía de intercambio catiónico o aniónico);
someter el material que contiene SCF a separación cromatográfica de
fase líquida inversa con la intervención por ejemplo de una resina
inmovilizada C_{4} ó C_{6}; someter el fluido a cromatografía de
lectina inmovilizada, es decir fijación de SCF en lectina
inmovilizada, y elución utilizando un azúcar que compite para dicha
fijación. Los detalles de la utilización de estos métodos se podrán
apreciar en las descripciones que se dan en los Ejemplos 1, 10 y 11
para la purificación de SCF. Las técnicas descritas en el Ejemplo 2
de Lai y colaboradores, patente US 4,667,016.
Se aíslan isoformas de SCF utilizando técnicas
estándar como las técnicas expuestas en el documento de propiedad
común US Ser. Nº 421,444 titulado Isoformas de Eritropoyetina,
presentado el 13 de Octubre de 1989.
La invención también comprende composiciones
farmacéuticas que incluyen cantidades terapéuticamente eficaces de
productos polipeptídicos de la invención junto con diluyentes
adecuados, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes
y/o excipientes de utilidad en la terapia con SCF. La expresión
"cantidad terapéuticamente eficaz" utilizada aquí se refiere a
la cantidad que proporciona un efecto terapéutico en un régimen de
administración y una determinada condición. Estas composiciones son
líquidos o formulaciones liofilizadas o secadas de alguna otra
manera y contienen diluyentes de diverso contenido tampón (por
ejemplo tris-HCl, acetato, fosfato), pH y
resistencia iónica, aditivos como albúmina o gelatina para evitar
la adsorción a superficies, detergentes (p. ej. Tween 20, Tween
80, Pluronic F68, sales de ácido de la bilis), agentes
solubilizantes (p. ej. glicerol, polietilenglicol), antioxidantes
(p. ej. ácido ascórbico, metabisulfito sódico), conservantes (p.
ej. Thimerosal, benzyl alcohol, parabens), sustancias que confieren
volumen o modificadores de tonicidad (p. ej. lactosa, mannitol),
enlace covalente de polímeros como polietilenglicol a la proteína
(descrito en el Ej. 12 siguiente), formación de complejo con iones
metálicos, o incorporación del material en preparados o sobre
preparados de partículas de compuestos poliméricos como ácido
poliláctico, ácido poliglicólico, hidrogeles, etc., o en liposomas,
microemulsiones, micelas, vesículas unilaminares o multilaminares,
segregaciones (ghostos) de eritrocitos, o esferoblastos. Estas
composiciones influirán en el estado físico, la solubilidad, la
estabilidad, la tasa de liberación in vivo, y la tasa de
aclaración in vivo de SCF. La elección de la composición
dependerá de las propiedades físicas y químicas de la proteína que
tiene actividad SCF. Por ejemplo, un producto derivado de una forma
ligada a membrana de SCF puede requerir una formulación que
contiene detergente. Las composiciones de liberación controlada o
sostenida incluyen la formulación en depósitos lipofílicos (p. ej.
ácidos grasos, ceras, aceite). La descripción también comprende
composiciones de partículas revestidas con polímeros (p. ej.
poloxámeros o poloxaminas) y SCF acoplado a anticuerpos dirigidos
contra receptores específicos del tejido, ligandos o antígenos o
acoplados a ligandos de receptores específicos del tejido. Otras
realizaciones de las composiciones de la descripción incorporan
formas en partículas, revestimientos protectores, inhibidores de
proteasa o potenciadores de permeación para diversas vías de
administración, inclusive parenteral, pulmonar, nasal y oral.
La invención también comprende composiciones con
uno o más factores hematopoyéticos adicionales como EPO,
G-CSF, GM-CSF,
CSF-1, IL-1, IL-2,
IL-3, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-7, IL-8,
IL-9, IL-10, IL-11,
IGF-I, o LIF (Factor de Inhibición Leucémico).
Los polipéptidos de la invención pueden ser
"rotulados" por asociación con una sustancia marcadora
detectable (p. ej. radio rotulados con ^{125}I o biotinilados)
para proporcionar reactivos útiles en la detección y la
cuantificación de SCF o sus células portadoras de receptor en tejido
sólido y muestras fluidas como sangre u orina.
El SCF biotinilado resulta útil junto con
estreptavidina inmovilizada para depurar blastos leucémicos de
médula ósea en transplante autólogo de médula ósea. El SCF
biotinilado resulta útil junto con estreptavidina inmovilizada para
enriquecer para células madre en células madres autólogas o
halogénicas en transplante autólogo o halogénico de médula ósea. Los
conjugados de toxina de SCF como ricina [Uhr, Prog. Clin. Biol.
Res. 288, 403-412 (1989)] toxina de
difteria [Moolten, J. Natl. Con. Inst., 55,
473-477 (1975)], y los radioisótopos resultan
útiles para una terapia directa antineoplásica (Ej. 13) o como
régimen acondicionador para transplante de médula ósea.
Los productos de ácido nucleico de la
descripción resultan útiles cuando se rotulan con marcadores
detectables (como radiomarcadores y rótulos no isotópicos como
biotina) y se emplean en procesos de hibridación para localizar la
posición del gen de SCF humano y/o la posición de cualquier familia
génica en un mapa cromosomal. Resultan también útiles para
identificar trastornos del gen SCF humano a nivel de ADN y se
utilizan como marcadores génicos para identificar genes vecinos y
sus trastornos. El gen SCF humano se codifica sobre cromosoma 12 y
los mapas génicos de SCF murino hasta cromosoma 10 en el lugar
S1.
SCF resulta útil, solo o en combinación con otra
terapia, en el tratamiento de ciertos trastornos hematopoyéticos.
SCF se puede utilizar solo o con uno o más factores hematopoyéticos
adicionales como EPO, G-CSF, GM-SCF,
SCF-1, IL-1, IL-2,
IL-3, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-7, IL-8,
IL-9, IL-10, IL-11,
IL-1, IGF-I o LIF en el tratamiento
de trastornos hematopoyéticos.
Existe un grupo de trastornos de célula madre
que se caracterizan por una reducción en la masa de la médula
funcional debido a lesión tóxica, radiante o inmunológica y que se
pueden tratar con SCF. La anemia aplásica es un trastorno de la
célula madre en el que se da una sustitución grasa de tejido
hematopoyético y pancitopenia. El SCF potencia la proliferación
hematopoyética y resulta útil en el tratamiento de anemia aplásica
(Ej. 8B). Los ratones Steel se utilizan como modelo de anemia
aplásica humana [Jones, Exp. Hematol. 11,
571-580 (1983)]. Se han obtenido resultados
prometedores con la utilización de una citoquina afín,
GM-CSF en el tratamiento de anemia aplásica [Antin,
y colaboradores, Blood, 70 129A (1987)]. La
hemoglobinuria paroxismal nocturna (PNH) es un trastorno de la
célula madre caracterizado por la formación de plaquetas y
granulocitos defectuosos así como eritrocitos
anormales.
anormales.
Existen muchas enfermedades que se pueden tratar
con SCF. Entre éstas, se encuentran las siguientes: mielofibrosis,
mieloesclerosis, osteopetrosis, carcinoma metastásico, leucemia
aguda, mieloma múltiples, enfermedad de Hodgkin, linfoma,
enfermedad de Gaucher, enfermedad de Nieman-Pick,
enfermedad de Letterer-Siwe, anemia eritroblástica
refractaria, síndrome de Di Guglielmo, esplenomegalia congestiva,
enfermedad de Hodgkin, Kala azar, sarcoidosis, pancitopenia
esplénica primaria, tuberculosis miliar, enfermedad de hongo
diseminado, septicemia fulminante, malaria, deficiencia de vitamina
D12 y de ácido fólico, deficiencia de piridoxina, anemia Diamond
Blackfan, trastornos de hipopigmentación como piebaldismo y
vitíligo. Las propiedades estimulantes de eritroides, megacariocitos
y granulocitos de SCF se ilustran en los Ejs. 8B y 8C.
La potenciación del crecimiento en células madre
no hematopoyéticas como células germinales primordiales,
melanocitos derivados de la cresta neural, axones comisurales
originarios de la médula espinal dorsal, células crípticas del
intestino, túbulos renales mesofrénicos y metanéfricos, y bulbos
olfativos, resulta beneficiosa en estados en los que se han
producido daños específicos del tejido en estas zonas. El SCF
resulta útil para el tratamiento de daños neurológicos y es un
factor de crecimiento para células nerviosas. El SCF resulta útil
durante los procesos de fertilización in vitro o en el
tratamiento de estados de infertilidad. El SCF resulta útil para el
tratamiento de daños intestinales derivados de radiación o
quimioterapia.
Existen trastornos mieloproliferativos de la
célula madre como policitemia vera, leucemia mielógena crónica,
mataplasia mieloide, trombocitemia primaria y leucemias agudas que
se pueden tratar con SCF, anticuerpos anti-SCF o
conjugados SCF-toxina.
Existen numerosos casos que documentan el
incremento de la proliferación de células leucémicas en los
factores de crecimiento de células hematopoyéticas
G-CSF, GM-CSF e
IL-3 [Delwel, y colaboradores, Blood,
72, 144-1949 (1988)]. Debido a que el éxito
de muchos fármacos quimioterapéuticos depende del hecho de que las
células neoplásicas tienen un ciclo más activo que las células
normales, el SCF solo o en combinación con otros factores actúa
como factor de crecimiento para células neoplásicas y las
sensibiliza a los efectos tóxicos de los fármacos
quimioterapéuticos. La sobreexpresión de receptores SCF en blastos
leucémicos se muestra en el Ejemplo 13.
Se está investigando la capacidad de cierto
número de factores hematopoyéticos recombinantes de acortar el
nadir leucocítico resultante de los regímenes de quimioterapia y
radiación. Aunque estos factores resultan muy útiles en este
escenario, hay un compartimento hematopoyético temprano que ha sido
dañado, especialmente debido a la radiación y se tiene que repoblar
antes que estos factores de crecimiento de actuación ulterior puedan
ejercer su acción óptima. La utilización de SCF solo o en
combinación con estos factores sigue acortando o elimina el nadir
de leucocitos y plaquetas resultante del tratamiento de
quimioterapia o radiación. Además, SCF permite una intensificación
de la dosis del régimen antineoplásico o de radiación (Ej. 19).
SCF resulta útil para expandir progenitores
hematopoyéticos tempranos en transplante de médula ósea singénico,
halogénico o autólogo. La utilización de factores de crecimiento
hematopoyético, como se ha visto, reduce el tiempo de recuperación
neutrófila después del transplante [Donahue, y colaboradores,
Nature, 121, 872-875 (1986) y Welte y
colaboradores, J. Exp. Med., 165,
941-949 (1987)]. Para el transplante de médula
ósea, se utilizan los tres escenarios siguientes, solos o en
combinación: se trata un donador con SCF solo o en combinación con
otros factores hematopoyéticos antes de la aspiración de médula ósea
o de la leucofóresis de sangre periférica para aumentar el número de
células disponibles para el transplante; la médula ósea se trata
in vitro para activar o expandir el número de células antes
del transplante. Finalmente, se trata el recipiente para potenciar
el injerto de la médula del donador.
El SCF resulta útil para potenciar la eficacia
de la terapia génica basada en la transfección (o infección con un
vector retroviral) de células madre hematopoyéticas. El SCF permite
cultivar y multiplicar las células progenitoras hematopoyéticas
tempranas que se tienen que transfectar. El cultivo se puede hacer
con SCF solo o en combinación con IL-6,
IL-3, o ambos. Una vez transfectadas, estas células
se infusionan entonces en un transplante de médula ósea en
pacientes que padecen trastornos genéticos. [Lim, Proc. Natl.
Acad. Sci, 86, 8892-8896 (1989)]. Como
ejemplo de genes útiles en el tratamiento de trastornos genéticos
pueden mencionarse los siguientes: adenosina, deaminasa,
glucocerebrosidasa, hemoglobina y fibrosis quística.
El SCF resulta útil para el tratamiento de
inmunoteficiencia adquirida (SIDA) o estados de inmunodeficiencia
combinada grave (SCID) solo o en combinación con otros factores como
IL-7 (véase Ej. 14). Lo ilustrativo de este efecto
es la capacidad de la terapia de SCF para aumentar el nivel absoluto
de linfocitos ayudantes T en circulación (CD4+, OKT_{4}+). Estas
células son el blanco celular primario del virus de
inmunodeficiencia humana (HIV) que conduce al estado de
inmunodeficiencia en pacientes de SIDA [Montagnier, in Human
T-Cell Leukemia/Lymphoma Virus, ed. R.C. Gallo,
Cold Spring Harbor, New York, 369-379 (1984)].
Además, el SCF resulta útil para combatir los efectos
mielosupresivos de fármacos anti-HIV como AZT [Gogu
Life Sciences, 45, Nº 4 (1989)].
El SCF resulta útil para potenciar la
recuperación hematopoyética tras pérdida aguda de sangre.
El tratamiento in vivo con SCF resulta
útil como refuerzo del sistema inmune para combatir la neoplasia
(cáncer). Un ejemplo de la utilidad terapéutica de la potenciación
de la función inmune directa por una citoquina clonada
recientemente (IL-2) se describe en Rosenberg y
colaboradores, N. Eng. J. Med. 313 1485 (1987).
La administración de SCF con otros agentes como
uno o más factores hematopoyéticos adicionales se espacia en el
tiempo o se realiza al mismo tiempo. El tratamiento previo con SCF
amplía una población de progenitores que responde a factores
hematopoyéticos que actúan en terminal como G-SCF o
EPO. La vía de administración puede ser intravenosa, intraperitoneal
subcutánea o intramuscular.
La presente descripción se refiere también a
anticuerpos que fijan específicamente factor célula madre.
El ejemplo 7 describe la producción de
anticuerpos policlonales. Otra realización de la descripción es el
SCF de fijación específica de anticuerpos policlonales (véase Ej.
20). En contraste con las preparaciones convencionales de
anticuerpos (policlonales) que suelen comprender anticuerpos
diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos),
cada anticuerpo policlonal está dirigido contra un solo determinante
en el antígeno. Los anticuerpos monoclonales resultan útiles para
mejorar la selectividad y especificidad de métodos de ensayo de
diagnóstico y analíticos que utilizan la fijación
antígeno-anticuerpo. Se utilizan también para
neutralizar o eliminar SCF del suero. Una segunda ventaja de los
anticuerpos policlonales es que pueden ser sintetizados por células
de hibridoma en cultivo, no contaminadas por otras
inmunoglobulinas. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar a
partir de sobrenadantes de células de hibridoma cultivadas o de
ascitas inducidas por inoculación intraperitoneal de células de
hibridoma en ratones. La técnica de hibridoma descrita
origi-nalmente por Köhler y Milstein [Eur. J.
Immunol., 6, 511-519 (1986] se ha
aplicado en gran medida para producir líneas celulares híbridas que
segregan niveles derivados de anticuerpos policlonales contra
muchos antígenos específicos.
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar
de forma más completa la invención aunque no se tienen que
interpretar como limitación del ámbito de la misma.
Existe una variedad de actividades biológicas
que se pueden atribuir al SCF de rata mamífero natural, así como
la proteína SCF de rata recombinante. Una de estas actividades es su
efecto sobre las células hematopoyéticas tempranas. Esta actividad
se puede medir en un ensayo de Célula Formadora de Colonia de Alto
Potencial Proliferativo (HPP-CPC) [Zsebo, y
colaboradores, supra (1988)]. Para investigar los efectos de
factores sobre células hematopoyéticas tempranas, el sistema del
ensayo HPP-CFC utiliza médula ósea de ratón derivada
de animales 2 días después del tratamiento con
5-fluorouracil (5-FU). El fármaco
quimioterapéutico 5-FU merma los progenitores
hematopoyéticos tardíos, permitiendo la detección de células
progenitoras tempranas y por consiguiente factores que accionan
sobre dichas células. El SCF de rata se cultiva en presencia de
SCF-1 o IL-6 en cultivos de agar
semisólido. Los cultivos de agar contienen medio completo Mochis
(GIBCO), 20% de suero de bovino fetal, 0,3% agar, y 2 x 10^{5}
células de célula ósea/ml. El medio completo McCoys contiene los
siguientes componentes: medio 1x Mochis suplementado con 0,1 mM
piruvato, 0,24x aminoácidos esenciales, 0,24x aminoácidos no
esenciales, 0,027% de bicarbonato sódico, 0,24x de vitaminas, 0,72
mM de glutamina, 25 pg/ml de L-serina y 12 pg/ml de
L-asparagina. Las células de médula ósea se obtienen
de ratones Balb/c inyectados i.v. con 150 mg/kg de
5-FU. Se cosechan los fémures 2 días después del
tratamiento con 5-FU del ratón y se limpia con agua
la médula ósea. Los glóbulos rojos se lisan con reactivo de lisado
de glóbulos rojos (Becton Dickenson) antes del cultivo. Se cultivan
sustancias de prueba con la mezcla anterior en placas de 30 mm.
Catorce días después se anotan las colonias (>1 mm diámetro) que
contienen miles de células. Este ensayo se utilizó durante toda la
purificación del SCF de rata derivado de célula de mamífero
natural.
En un ensayo típico, el SCF de rata es el
causante de la proliferación de aproximadamente 50
HPP-CFC por 200.000 células cultivadas. El SCF de
rata tiene actividad sinérgica sobre las células de médula ósea de
ratón tratado con 5-FU; no se formarán colonias de
HPP-CFC en presencia de factores únicos pero la
combinación de SCF y SCF-1 o SCF e
IL-6 es activa en este ensayo.
Otra actividad biológica útil del SCF de rata
recombinante y el derivado natural es la capacidad para causar la
proliferación del mastocito de murino dependiente de
IL-4, MC/9 (ATCC CRL 8306). Las células de MC/9 se
cultivan con una fuente de IL-4 según el protocolo
ATCC CRL 8306. El medio utilizado en el bioensayo es RPMI 1640, 4%
de suero de bovino fetal, 5 x 10^{-5}M
2-mercaptoetanol, y 1x de
glutaminapen-strep. Las células de MC/9 proliferan
en respuesta a SCF sin que se requieran otros factores de
crecimiento. Esta proliferación se mide cultivando primero las
células durante 24 horas sin factores de crecimiento, cultivando
500 células en cada pocillo de placas de 96 pocillos con muestra de
prueba durante 48 horas, pulsando durante 4 horas con 0,5 uCi
^{3}H-timidina (actividad específica 20 Ci/mmol),
cosechando la solución sobre filtros de fibra de vidrio y midiendo
posteriormente la radioactividad ligada específicamente. Este
ensayo se utilizó en la purificación de célula de mamífero derivada
de SCF de rata tras la etapa de filtración en gel ACA 54, sección
C2 de este Ejemplo. Por lo general, el SCF causó un incremento de 4
a 10 veces en CPM sobre fondo.
Se ha establecido la acción de SCF de mamífero
purificado, tanto derivado natural como recombinante, libre de
interferir en factores estimulantes de colonias (CSFs), sobre médula
ósea de ratón no mermado. Se utiliza un ensayo
CFU-GM [Broxmeyher y colaboradores, Exp.
Hematol., 5, 87 (1977)] para evaluar el efecto de SCF
sobre médula normal. Para resumir, se preparan en placas de Petri
células de médula ósea total después de la lisis de glóbulos rojos
en cultivos de agar semisólido que contienen la sustancia de
prueba. A los 10 días, se anotan las colonias que contienen grupos
de más de 40 células. Los cultivos de agar se pueden secar sobre
portaobjetos de cristal y la morfología de la célula se puede
determinar por medio de coloreados histológicos específicos.
Sobre la médula ósea de ratón normal, el SCF de
rata mamífera purificada era un SCF pluripotencial, que estimulaba
el crecimiento de colonias constituidas por células inmaduras,
neutrófilos, macrófagos, eosinófilos y megacariocitos sin necesidad
de otros factores. Partiendo de 200.000 células en placas de Petri
se cultivaron más de 100 de estas colonias durante un período de 10
días. Tanto el SCF de rata como del recombinante humano estimulan
la producción de células eritroides en combinación con EPO; véase
Ej. 9.
Se cultivaron células 3A de hígado de rata
Búfalo (BRL), procedentes de la American Type Culture Collection
(ATCC CRL 1442) sobre microportadores en un sistema de cultivo por
perfusión de 20 litros para la producción de SCF. Este sistema
utiliza un fermentador Biolafitte (Modelo ICC-20)
con excepción de los filtros utilizados para retener
microportadores y el entubado de oxigenación. Los filtros de malla
de 75 micras se mantienen libres de atasco de microportadores debido
a un lavado periódico que se realiza a través de un sistema de
válvulas de retención y de bombas controladas por ordenador. Cada
filtro actúa alternativamente como centro de alimentación y cosecha
de medio. Este modelo de flujo oscilante garantiza que los filtros
no se atasquen. La oxigenación se aportó a través de una tubería
de silicona (50 pies de largo, 0,25 pulgadas, ID, 0,03 pulgadas de
pared). El medio de crecimiento utilizado para el cultivo de
células BRL 3A era Medio Mínimo Esencial (con Sales Earle) (GIBCO),
2 mM de glutamina, 3 g/L de glucosa, triptosa fosfato (2,95 g/L), 5%
de suero bovino fetal y 5% de suero de ternera fetal. El medio de
cosecha era idéntico salvo la ausencia de suero. El reactor
contenía microportadores Cytodex 2 (Pharmacia) con una concentración
de 5g/L y había sido sembrado con 3 x 10^{9} BRL 3A cultivadas en
botellas de rodillos y quitadas por tripsinización. Se dejó que las
células se fijaran y crecieran sobre los microportadores durante
ocho días. Se procedió a la perfusión del medio de crecimiento a
través del reactor, según lo necesario, teniendo en cuenta el
consumo de glucosa. La concentración de glucosa se mantuvo a
aproximadamente 1,5 g/L. A los ocho días, se procedió a la
perfusión del reactor con seis volúmenes de medio libre de suero
para quitar la mayor parte del suero (concentración de proteína
< 50 \mug/ml). Se hizo trabajar entonces el reactor por lotes
hasta que la concentración de glucosa cayó por debajo de 2 g/L.
Desde este punto en adelante, el reactor funcionó a una tasa de
perfusión continua de aproximadamente 10 L/día. El pH del cultivo se
mantuvo a 6,9 \pm 0,3 ajustando el caudal de CO_{2}. El oxígeno
disuelto se mantuvo a más del 20% de la saturación de aire
suplementando con oxígeno puro en la medida de lo necesario. La
temperatura se mantuvo a 37 \pm 0,5ºC.
Se generaron aproximadamente 336 litros de medio
condicionado libre de suero a partir del sistema anterior, que se
utilizaron como material de partida para la purificación de SCF de
rata derivada de célula de mamífero natural.
Todo el trabajo de purificación se realizó a 4ºC
a no ser que se indique otra cosa.
Se aclaró por filtración a través de
Sartocápsulas 0,45 \mu (Sartorius). Medio condicionado generado
por el crecimiento sin suero de células de BRL 3A. Se sometieron por
separado varios lotes diferentes (41 L, 27 L, 39 L, 30,2 L, 37,5 L
y 161 L) a concentración, intercambio diafiltración/tampón y
cromatografía por intercambio aniónico de celulosa DEAE, de forma
similar para cada lote. Los conjuntos de celulosa DEAE se combinaron
entonces y se siguieron procesando como un lote en secciones
C2-5 de este Ejemplo. Se indica a continuación,
como ilustración, la manipulación del lote de 41 L. El medio
condicionado filtrado se concentró a -700 ml utilizando un aparato
de ultrafiltración de flujo tangencial Millipore Pellicon
con cuatro cassettes de membrana polisulfona cutoff de un peso
molecular de 10.000 (20 ft^{2} de área total de membrana; caudal
de la bomba -1095 ml/min y tasa de filtración
205-315 ml/min). El intercambio de
diafiltración/tampón en preparación para la cromatografía de
intercambio aniónico se realizó entonces añadiendo 500 ml de 50 mM
Tris-HCl, pH 7,8 al concentrado, reconcentrando a
500 ml utilizando el aparato de ultrafiltración de flujo tangencial,
y repitiendo lo anterior otras seis veces. El preparado
concentrado/diafiltrado se recuperó finalmente en un volumen de 700
ml. El preparado se aplicó a una columna de intercambio aniónico de
celulosa DEAE (5 x 20,4 cm; resina Whatman DE-52)
que había sido equilibrada con el tampón 50 mM
Tris-HCl, pH 7,8. Después de la aplicación de la
muestra, se lavó la columna con 2050 del tampón
Tris-HCl y se aplicó un gradiente de sal
(0-300 mM NaCl en el tampón
Tris-HCl; 4 L de volumen total). Se recogieron
fracciones de 15 ml a un caudal de 167 ml/h. La cromatografía se
muestra en la Figura 1. El número de colonia HPP-CFC
se refiere a la actividad biológica en el ensayo
HPP-CFC; se ensayaron 100 \mul de las fracciones
indicadas. Las fracciones recogidas durante la aplicación de la
muestra y el lavado no se muestran en la Figura; no se detectó
ninguna actividad biológica en estas fracciones.
El comportamiento de todos los lotes de medio
condicionado sometidos a la concentración, intercambio de
diafiltración/tampón y cromatografía de intercambio aniónico fue
similar. Las concentraciones de proteína para los lotes, determinada
por el método de Bradford [Anal. Biochem. 72,
248-154 (1976)] con albúmina de suero de bovino como
estándar oscilaron entre 30 y 50 \mug/m. El volumen total del
medio condicionado utilizado para este preparado fue de
aproximadamente 336 litros.
Se combinaron (volumen total 2900 ml) y se
concentraron hasta un volumen final de 74 ml con la utilización de
células removidas con Amicon y membranas YM10 fracciones que tenían
actividad biológica procedente de las columnas de celulosa DEAE,
utilizadas para cada uno de los seis lotes de medio condicionado
referidos anteriormente (p. ej. fracciones 87-114
para la serie mostrada en la Figura 1). Este material se aplicó a
una columna de filtración de gel (LKB) ACA 54 (Figura 2)
equilibrada en 50 ml de Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH
7,4. Se recogieron fracciones de 14 ml a un caudal de 70 ml/h.
Debido a factores inhibidores que coeluyen con las fracciones
activas, el pico de la actividad (número colonia
HPP-CFC) aparece dividido; no obstante, teniendo en
cuenta cromatogramas anteriores, la actividad coeluye con el pico de
proteína principal y por consiguiente se obtuvo un conjunto de las
fracciones.
Se reunieron fracciones 70-112
procedentes de la columna de filtración ACA 54. (500 ml). El
conjunto se dividió por la mitad y cada mitad se sometió a
cromatografía utilizando una columna de
glutinina-agarosa germen de trigo (5 x 24,5 cm;
resina de laboratorios E-Y, San Mateo, CA; la
aglutinina del germen de tribo reconocer ciertas estructuras de
carbohidrato) equilibrada en 20 mM Tris-HCl, 500 mM
NaCl, pH 7,4. Tras las aplicaciones de muestras, la columna se lavó
con aproximadamente 220 ml del tampón de la columna y se procedió a
la elución del material fijado aplicando una solución de 350 mM de
N-acetil-D-glucosamina
disuelta en el tampón de la columna, comenzando en la fracción
-210, Figura 3. Se recogieron fracciones de 13,25 ml a un caudal
de 122 ml/h. Una de las series cromatográficas se muestra en la
Figura 3. Se dializaron porciones de la fracción a ensayar respecto
de salino con tampón de fosfato; se colocaron 5 \mul de los
materiales dializados en el ensayo MC/9 (valores cpm en la Figura
3) y 10 \mul en el ensayo HPP-CFC (valores de
número de colonias en la Figura 3). Se puede ver que el material
activo fijado a la columna se eluyó con la
N-acetil-D-glucosamina,
mientras que gran parte del material contaminante pasó a través de
la columna durante la aplicación de la muestra y el lavado.
Se reunieron fracciones 211-225
de la cromatografía aglutinina-agarosa de germen de
trigo de la Figura 3 y fracciones equivalentes de la segunda serie 3
(375 ml) y se dializaron mM de formato sódico, pH 4,2. para reducir
al mínimo el tiempo de exposición a un pH bajo, la diálisis se
realizó durante un período de 8 horas, con 5 litros de tampón,
realizándose cuatro cambios durante el período de 8 horas. Al final
de este período de diálisis, el volumen de la muestra era de 480 ml
y el pH y la conductividad de la muestra eran similares a los del
tampón de diálisis. Apareció material precipitado en la muestra
durante la diálisis. Esto se eliminó por centrifugación a 22.000 x
g durante 30 minutos y el sobrenadante de la muestra centrifugada
se aplicó a una columna de intercambio catiónico de flujo rápido
S-Sefarosa (3,3 x 10,25 cm; resina de Pharmacia) que
había sido equilibrada en el tampón de formato sódico. El caudal
era de 465 ml/h y se recogieron fracciones de 14,2 ml. Tras la
aplicación de la muestra, se lavó la columna con 240 ml de tampón
de columna y se procedió a la elución del material fijado aplicando
un gradiente de 0-750 mM de NaCl (NaCl disuelto en
tampón de columna; volumen gradiente total 2200 ml), comenzando en
la fracción -45 de la Figura 4. El perfil de elusión se muestra en
la Figura 4. Las fracciones recogidas se ajustaron a un pH
7,7-4 añadiendo 200 \mul de Tris base 0,97 M. Los
cpm en la Figura 4 se refieren nuevamente a los resultados
obtenidos en el ensayo biológico MC/9; se dializaron partes de las
fracciones indicadas con salino con tampón de fosfato se colocaron
20 \mul en el ensayo. En la Figura 4 se ha visto que la mayoría
del material biológicamente activo pasó a través de la columna sin
fijarse, mientras que gran parte del material contaminante se fijó
y fue eluido en el gradiente de sal.
Se reunieron fracciones 4-40
(540 ml) de la columna S-Sefarosa de la columna 4.
Se combinaron 450 ml del conjunto con un volumen igual de tampón B
(100 mM de acetato de amonio, pH 6: isopropanol; 25:75) y se
aplicaron con un caudal de 540 ml/h a una columna C_{4}
(proteínas Vydac C_{4}; 2,4 x 2 cm) se equilibró con el tampón A
(60 mM de acetato de amonio, pH 6: isopropanol; 62,5: 37,5). Después
de la aplicación de la muestra, se redujo el caudal a 154 ml/h y se
lavó la columna con 200 ml de tampón A. Se aplicó entonces un
gradiente lineal del tampón A al tampón B (volumen total 140 ml) y
se recogieron fracciones de 9,1 ml. Se obtuvo 40 \mug/ml de
albúmina de suero de bovino a partir de porciones del conjunto de la
cromatografía S-Sefarosa, la muestra de partida de
la columna C_{4}, el conjunto del ensayo, y el conjunto de lavado,
añadiendo un volumen adecuado de 1 mg/ml de solución madre, y se
dializaron con salino con tampón de fosfato en preparación para
ensayo biológico. De forma similar, se combinaron partes (40 \mul)
de las fracciones gradiente con 360 \mul de salino con tampón
fosfato que contenía 16 \mug de albúmina de suero bovino, seguido
de diálisis con salido con tampón de fosfato en preparación para
ensayo biológico. Estas diversas fracciones se sometieron al
ensayo MC/9 (parte de 6,4 \mul de las fracciones preparadas de
gradiente; cpm en la Figura 5). Los resultados del ensayo también
indicaron que aproximadamente el 75% de la actividad recuperada se
encontraba en las fracciones del ensayo y del lavado, y 25% en las
fracciones de gradiente indicadas en la Figura 5. En la Figura 6 se
muestra SDS-PAGE de partes iguales de diversas
fracciones [Ñlaemmli, Nature, 227,
680-685 (1970); geles "stacking" que contenían
4% (p/v) de acrilamida y geles de separación que contenían 12,5%
(p/v) de acrilamida]. Para el gel mostrado, se secaron porciones
iguales de muestras bajo vacío se volvieron a disolver utilizando 20
\mul de tampón de tratamiento de muestra (no reductor, es decir
sin 2-mercaptoetanol) y se hirvieron durante 5
minutos antes de cargar sobre el gel. Las bandas A y B representan
el material de partida de la columna (75 pl sobre 890 ml) y el
ensayo de la columna (75 \mul sobre 880 ml), respectivamente; las
marcas numeradas a la izquierda de la Figura representan posiciones
de migración (reducida) de marcadores que tienen pesos moleculares
iguales a 10^{3} veces los números indicados, donde los
marcadores son fosforilasa b (M_{r} de 97.400), albúmina de suero
bovino (M_{r} de 66.200), ovalbúmina (Mr de 42.700), anhidrasa
carbónica (M_{r} de 31.000), inhibidor de tripsina de soja
(M_{r} de 21.500) y lisocima (M_{r} de 14.400); las bandas
4-9 representan las fracciones correspondientes
recogidas durante la aplicación del gradiente (60 \mu sobre 9,1
ml). El gel se plateó [Morrissey, Anal. Biochem., 117,
307-310 (1981)]. Se puede ver, comparando las
bandas A y B que la mayoría del material que se puede teñir pasa a
través de la columna. El material teñido en las fracciones
4-6 en las regiones justo por encima y por debajo
de la posición estándar M_{r} 31.000 coincide con la actividad
biológica detectada en las fracciones de gradiente (Figura 5) y
representa el material biológicamente activo. Hay que señalar que
este material se visualiza en las bandas 4-6, pero
no en las bandas A y/o B, ya que para el primero se cargó una
proporción mucho mayor del volumen total (0,66% del total para las
fracciones 4-6 frente a 0,0084% del total
para las bandas A y B). Se agruparon las fracciones
4-6 de esta columna.
Según lo antes indicado, aproximadamente el 75%
de la actividad recuperada pasó por la columna C_{4} de la Figura
5. Este material se volvió a cromatografiar utilizando resina
C_{4} esencialmente en la forma descrita anteriormente con la
diferencia de que se utilizó una columna más grande (1,4 x 7,8 cm)
y un caudal más lento (50-60 ml/h) de principio a
fin). Aproximadamente el 50% de la actividad recuperada estaba en
las fracciones "runthrough" y el 50% en la fracción del
gradiente que mostraban un aspecto similar en
SDS-PAGE al de las fracciones de gradiente activas
de la Figura 6. Se agruparon las fracciones activas (29 ml).
También se realizó un columna analítica C_{4}
prácticamente en la forma indicada anteriormente y las fracciones
se sometieron a ambos bioensayos. Tal como se indica en la Figura 7
de las fracciones de esta columna analítica coeluyen tanto las
bioactividades MC/9 como HPP-CFC. El análisis
SDS-PAGE (Figura 8) revela la presencia de proteína
M_{r}-31.000 en las fracciones de la columna que
contienen actividad biológica en ambos ensayos.
También s purificó por cromatografía C_{4}
material activo en el segundo pico de actividad (relativamente
menor) que se ve en la cromatografía S-Sefarosa (p.
ej. Figura 4, fracciones 62-72, fracciones
tempranas en el gradiente de sal). Mostró el mismo comportamiento
en SDS-PAGE y tenía la misma secuencia de
aminoácidos N-terminal (véase Ej. 2D) que el
material obtenido por cromatografía C_{4} de fracciones
"runthrough" de S-Sefarosa.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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En el Cuadro 2 se da un resumen de las etapas de
purificación descritas en los puntos 1-5
anteriores.
En la Figura 9 se muestra el
SDS-PAGE de fracciones de gradiente agrupadas de
las dos pasadas por columna C_{4} de gran escala. Se cargó 60
\mul del grupo para la primera columna C_{4} (banda 1) y 40
\mul del grupo para la segunda columna C_{4} (banda 2). Estas
bandas de gel se platearon.
Los marcadores de peso molecular fueron los
descritos en la Figura 6. Según lo mencionado, el material de
migración difusa por arriba y por debajo de la posición del marcador
M_{r} 31.000 representa el material biológicamente activo; la
heterogeneidad aparente se debe en parte a la heterogeneidad en la
glicosilación.
Para caracterizar la glicosilación, se yodó
material purificado con ^{125}I, tratado con una variedad de
glicosidadas, y se analizó por SDS-PAGE (condiciones
reductoras) con autorradiografía. Los resultados se muestran en la
Figura 9. Bandas 3 y 9, material rotulado ^{125}I sin ningún
tratamiento por glicosidasa. Las bandas 4-8
representan material rotulado ^{125}I tratado con glicosidasas,
según se indica a continuación. Banda 4 neuranimidasa. Banda 5,
neuraminidasa y O-glicanasa. Banda 6,
N-glicanasa. Banda 7, neuraminidasa y
N-glicanasa. Banda 8, neuraminidasa,
O-glicanasa y N-glicanasa. Las
condiciones fueron 5 mM
3-[3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato
(CHAPS), 33 m 2-mercaptoetanol, 10 mM
Tris-HCl, pH 7-7-2,
durante 3 horas a 37ºC. Se utilizó neuraminidasa de Arthrobacter
ureafaciens; Calbiochem) en concentración final de 0,25
unidades/ml. Se utilizó O-glicanasa (Genzime;
endolfa-N-acetil-galactosaminidasa)
a razón de 45 miliunidades/ml. Se utilizó
N-glicanasa (Genzime; péptido:
N-glicosidasa F;
péptido-N^{4}[N-acetil-beta-glucosaminil]
asparagina amidasa) a razón de 10 udes/ml.
Se obtuvieron resultados similares a los de la
Figura 9 después del tratamiento de SCF purificado sin rotular con
glicosidasas, y visualización de productos por plateado después de
SDS-PAGE.
Se realizaron, siempre que se consideró
conveniente, varias incubaciones de control que comprenden:
incubación en tampón adecuado, pero sin glicosidasas, para
verificar que los resultados eran debidos a los preparados de
glicosidasa añadidos; incubación con proteínas glicosiladas (p. ej.
eritropoyetina humana recombinante glicosilada) que según se sabe,
son sustratos para las glicosidasas, para verificar que las enzimas
de glicosidasa utilizadas eran activas; e incubación con
glicosidasas aunque no sustrato, para verificar que las
glicosidasas no contribuían a su vez u oscurecían las bandas de gel
visualizadas.
Se realizaron también tratamientos de
glicosidasas con
endo-beta-N-acetilglucosamidasa
F (endo F; NEN Dupont) y con
endo-beta-N-acetilglucosaminidasa
H (endo H: NEN Dupont), nuevamente con incubaciones de control
adecuadas. Las condiciones del tratamiento con endo F fueron las
siguientes: hervir durante 3 minutos en presencia de 1% (p/v) SDS,
100 mM 2-mercaptoetanol, 100 mM EDTA, 320 mM de
fosfato sódico, pH 6, seguido de 3 veces dilución con la inclusión
de Nonidet P-40 (1,17%, v/v, concentración final),
fosfato sódico (200 mM, concentración final) y endo F (7 udes/ml,
concentración final). Las condiciones del tratamiento endo H fueron
similares con la diferencia de que la concentración SDS fue de 0,5%
(p/v) y se utilizó endo H a una concentración de 1 pg/ml. Los
resultados con endo F fueron los mismos que los obtenidos con
N-glicanasa, considerando que endo H no tuvo efecto
alguno sobre el material SCF purificado.
Se puede extraer cierto número de conclusiones
de los experimentos de glicosidasa descritos anteriormente. Los
diversos tratamientos con N-glicanasa (que elimina
tanto el carbohidrato complejo como el vinculado a N manosa alto
[(Tarentino y colaboradores, Biochemistry 24,
4665-4671) (1985)], endo F[que actúa de
forma similar a N-glicanasa (Elder y Alexander,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79,
4540-1544 (1982)] endo H (que elimina carbohidrato
alto en mañosa y cierto carbohidrato ligado a N de tipo híbrido
[(Tarentino y colaboradores, Methods Enzymol. 50C,
574-580 (1978)], neuraminidasa (que elimina los
residuos del ácido siálico) y O-glicanasa [que
elimina ciertos carbohidratos ligados a O (Lambin y colaboradores,
Biochem. Soc. Trans. 12, 599-600
(1984)], sugieren que: se encuentran presente tanto los
carbohidratos ligados a N como los ligados a O la mayoría del
carbohidrato ligado a N es de tipo complejo; y se encuentra
presente ácido siálico y algo por lo menos del mismo forma parte de
las mitades ligadas a O. Se puede obtener alguna información acerca
de los posibles sitios de unión a N a partir de los datos de la
secuencia de aminoácidos (Ej. 2). El hecho de que el tratamiento
con N-glicanasa, endo F y
N-glicanasa/neuraminidasa puede convertir el
material heterogéneo aparente por SDS-PAGE en formas
de migración más rápida que son más homogéneas es coherente con la
conclusión de que la totalidad del material representa el mismo
polipéptido, siendo causada la heterogeneidad por heterogeneidad en
glicosilación. Vale también la pena señalar que las formas más
pequeñas obtenidas por los tratamientos combinados con las diversas
glicosidasas son del orden de M_{r} 18.000-20.000,
con respecto a los marcadores de peso molecular utilizados en el
SDA-PAGE.
La confirmación de que el material de migración
difusa en torno a la posición M_{r} 31.000 en
SDS-PAGE representa material biológicamente activo
que posee en su totalidad la misma cadena polipeptídica básica, la
ofrece el hecho de que los datos de la secuencia de aminoácidos
derivados del material que migra en esta región (p. ej. tras la
transferencia electroforética y el tratamiento con bromuro de
cianógeno; Ej. 2) se corresponde con lo demostrado para el gen
aislado cuya expresión por medios de ADN recombinante conduce a
material biológicamente activo (Ej. 4).
Aproximadamente 5 \mug de SCF purificado como
en el Ej. 1 (concentración = 0,117 mg/ml) se sometió a HPLC de fase
inversa utilizando una columna de calibre estrecho C_{4} (Vydac,
330 A, calibre grande, 2 mm x 15 cm). La proteína se eluyó con un
gradiente lineal de 97% de fase móvil A (0,1% de ácido
trifluoroacético)/3% fase móvil B (90% de acetonatrilo en ácido
trifluoroacético 0,1 W) a 30% de fase móvil A/70% fase móvil B en
70 minutos, seguido de elusión isocrática durante otros 10 minutos a
un caudal de 0,2 ml por minuto. Tras la sustracción de un
cromatograma en blanco de tampón, el SCF aparecía con un solo pico
simétrico al cabo de un tiempo de retención de 70,05 minutos según
se puede ver en la Figura 10. No se pudo detectar en estas
condiciones ningún pico de proteína contaminador importante.
Se trató de la siguiente forma SCF purificado
como en el Ej. 1 (0, 5 - 1, 0 nmol) con N-glicanasa,
una enzima que segmenta específicamente las mitades de carbohidrato
ligados a Asn unidas mediante enlace covalente a proteínas (véase
Ej. 1D). Se secaron bajo vacío 6 ml del material agrupado de las
fracciones 4-6 de la columna C_{4} de la Figura
5. Luego se añadieron 150 \mul de 14,25 mM CHAPS, 100 mM
2-mercaptoetanol, 335 mM de fosfato sódico, pH 8,6 y
se procedió a la incubación durante 95 minutos a 37ºC. A
continuación se añadieron 300 \mul de 74 mM fosfato sódico, 15
udes/ml de N-glicanasa, pH 8,6 y la incubación
prosiguió durante 19 horas. La muestra se hizo pasar entonces sobre
un gel de gradiente de SDS-poliacrilamida
9-18% (0,7 mm de grosor, 20 x 20 cm). Se
transfirieron electroforéticamente bandas de proteína en el gel
sobre el polivinildifluoruro (PVDF, Millipore Corp.) usando 10 mM
Caps tampón (pH 10,5) con una corriente constante de 0,5 Amp
durante 1 h [Matsuaira, J. Biol. Chem. 261,
10035-10038 (1987)]. Las bandas de proteína
transferida se visualizaron por tinción Coomassie Blue. Había
bandas en M_{r} \sim29.000-33.000 y M_{r}
\sim26.000, es decir que la deglicosilación fue solamente parcial
(véase Ej. 1D, Figura 9); la primera banda representa material no
digerido y la última representa material del que se quita
carbohidrato ligado a N. Las bandas se cortaron y se cargaron
directamente (40% para M_{r} 29.000-33.000
proteína y 80% para M_{r} 26.000 proteína) sobre un secuenciador
de proteína (Applied Biosystems Inc., model 477). El análisis de la
secuencia proteínica se realizó utilizando programas facilitados por
el fabricante [Hewick y colaboradores, J. Biol. Chem.,
256 7990-7997 (1981)] y los aminoácidos
feniltiohidantonil liberados se analizaron en línea utilizando HPLC
de fase inversa C_{18} de microcalibre. Ninguna de las dos bandas
dio señales para los ciclos de secuenciación 20-28,
sugiriendo que ninguno de los dos se podía secuenciar con una
metodología que utilizara química Edman. El nivel de fondo en cada
pasada de secuenciación osciló entre 1 y 7 pmol lo cual era muy
inferior a la cantidad de proteína presente en las bandas. Estos
datos sugieren que la proteína en las bandas estaba bloqueada
en
terminal N.
terminal N.
Para confirmar que la proteína estaba de hecho
bloqueada, se quitaron las membranas del secuenciador (parte B) y
se procedió in situ a la segmentación por bromuro de
cianógeno (CNBr) de las bandas transferidas [CNBr (5%, p/v) en 70%
de ácido fórmico durante 1 h a 45ºC] seguido de secado y análisis de
secuencia. Se detectaron fuertes señales de secuencia, que
representan péptidos internos obtenidos de la segmentación del
enlace péptidos metionilo por
CNBr.
CNBr.
\vskip1.000000\baselineskip
Ambas bandas produjeron señales de secuencia
mixta idéntica como las relacionadas a continuación para los
primeros cinco ciclos.
Las dos bandas produjeron también señales
similares hasta 20 ciclos. Los rendimientos iniciales fueron de
40-115 pmol para la banda M_{r} 26.000 y
40-150 pmol para la banda M_{r}
29.000-33.000. Estos valores son comparables a las
cantidades molares originales de proteína cargada sobre el
secuenciador. Los resultados confirmaron que las bandas proteínicas
correspondientes a SCF contenían un término N bloqueado. Los
procedimientos usados para obtener información útil sobre secuencia
de proteínas bloqueadas N-terminal son, entre otros:
(a) desbloqueo del término N (véase sección D); y (b) generación de
péptidos por segmentaciones internas por CNBr (véase Sección E),
por tripsina (véase sección F) y por Staphylococcus aureus
(cepa V-8) proteasa (Glu-C) (véase
Sección G). Se puede proceder al análisis de secuencia una vez que
el aminoácido N-terminal bloqueado ha sido
eliminado o se han aislado los fragmentos peptídicos. A
continuación se describen en detalle algunos ejemplos.
\newpage
La naturaleza química de la mitad de bloqueo
presente en el término amino de SCF resultó difícil de predecir. El
bloqueo puede ser post-traslacional in vivo
[F. Wold, Ann. Rev. Biochem., 50,
783-814 (1981)] o puede producirse in vitro
durante la purificación. Por lo general se observan dos
modificaciones post-traslacionales. La acetilación
de ciertos aminoácidos N-terminales como Ala, Ser,
etc. puede producirse, catalizada por
N-\alpha-acetil transferasa. Esto
se puede confirmar por medio de aislamiento y análisis
espectrométrico de masas de un péptido bloqueado en término N. Si
el termino amino de una proteína es glutamina, puede producirse la
deamidación de su gamma-amida. Se puede producir
entonces la ciclización en la que interviene el
gamma-carboxilato y el término N libre para producir
piroglutamato. Para detectar el piroglutamato, se puede utilizar la
enzima piroglutamato aminopeptidasa. Esta enzima elimina el residuo
piroglutamato, dejando un término amino libre empezando en el
segundo aminoácido. Se puede utilizar entonces la química Edman
para la secuenciación.
Se incubó SCF (purificado como en el Ej. 1; 400
pmol) en 50 mM de tampón fosfato sódico (pH 7,6 que contenía
ditriotreitol y EDTA), con 1,5 unidades de aminopeptidasa de ácido
piroglutámico de hígado de ternera (pE-AP) durante
16 horas a 37ºC. Tras la reacción, se cargó directamente la muestra
sobre el secuenciador de proteínas. Se pudo identificar una
secuencia importante dentro de los 46 ciclos. El rendimiento
inicial fue de aproximadamente 40% y el rendimiento repetitivo fue
de 94,2%. La secuencia N terminal de SCF que incluye el ácido
piroglutámico N-terminal es:
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados indicaron que el SCF contiene
ácido piroglutámico en su término N.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Se trató SCF purificado como en el Ej. 1
(20-28 \mug; 1,0-1,5 nmol) con
N-glicanasa según se describe en el Ej. 1. La
conversión en material M_{r} 26.000 fue completa en este caso. La
muestra se secó y se digirió con CNBr en ácido fórmico al 70% (5%)
durante 18 horas a temperatura ambiente. El digesto se diluyó con
agua, se secó y se volvió a disolver en ácido trifluoracético al
0,1%. Se separaron péptidos CNBr por HPLC de fase inversa
utilizando una columna de calibre estrecho C_{4} y condiciones de
elución idénticas a las descritas en la sección A de este Ejemplo.
Se aislaron varias fracciones peptídicas importantes y se
secuenciaron, resumiéndose los resultados en el siguiente
Cuadro:
\newpage
Se digirió SCF purificado como en el Ej. 1 (20
\mug en 150 \mul de bicarbonato de amonio 0,1 M) con 1 \mug
de tripsina a 37ºC durante 3,5 horas. El digesto se sometió de
inmediato a una pasada por HPLC C_{4} de fase inversa de calibre
estrecho utilizando condiciones de elusión idénticas a las
descritas en la Sección A de este Ejemplo. Todos los picos
peptídicos eluidos tenían tiempos de retención diferentes del
correspondiente al SCF no digerido (Sección A). Los análisis
secuenciales de los péptidos aislados se muestran a
continuación:
\newpage
Se sometió a segmentación de la proteasa
Glu-C a SCF purificado como en el Ejemplo 1 (20
\mug) en 150 \mul de bicarbonato de amonio 0,1 M) en una
proporción de proteasa/substrato de 1:20. La digestión se realizó a
37ºC durante 17 h. El digesto se separó de inmediato por HPLC 4 de
fase inversa de calibre estrecho. Se recogieron cinco fracciones
peptídicas principales y se secuenciaron del siguiente modo:
\vskip1.000000\baselineskip
Se secó completamente SCF (2 \mug) en 10 mM de
bicarbonato de amonio por centrifugación en vacío y se volvió a
disolver en 100 \mul de ácido acético glacial. Se añadió a la
solución o un exceso molar de 10 a 20 veces de
BNPS-skatole y la mezcla se incubó a 50ºC durante
60 minutos. La mezcla de reacción se secó entonces por
centrifugación en vacío. El residuo seco se extrajo con 100 \mul
de agua y nuevamente con 50 \mul de agua. Los extractos
combinados se sometieron entonces a análisis secuencial según lo
descrito anteriormente. Se detectó la siguiente secuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
No se asignó positivamente la posición 28; se
asignó como Asn en base a la zona de glicosilación potencial ligada
a N.
\newpage
Se intercambió-tampón una porción de proteína de
SCF (500 pmol) en 10 mM de acetato sódico, pH 4,0 (volumen final
de 90 \mul) y se añadió Brij-35 hasta 0,05% (p/v).
Se tomó una porción de 5 \mul para cuantificar la proteína. Se
diluyeron 40 \mul de la muestra hasta 100 \mul con el tampón
descrito anteriormente. Se añadió carboxipeptidasa P (de
Penicillium janthinellum) en una proporción de
enzima-substrato de 1:200. La digestión se realizó a
25ºC y se tomaron porciones de 20 \mul a los 0, 15, 30, 60 y 120
minutos. La digestión acabó en cada punto temporal añadiendo ácido
trifluoracético hasta una concentración final de 5%. Las muestras
se secaron y los aminoácidos liberados se derivaron por reacción con
cloruro Dabsyl (dimetilaminoazobencenosulfonil cloruro) en 0,2 M
NaHCO_{3} (pH 9,0) a 70ºC durante 12 minutos [Chang y
colaboradores, Methods Enzymol., 90,
41-48 (1983)]. Los aminoácidos derivados (un sexto
de cada muestra) se analizaron mediante HPLC de fase inversa de
calibre estrecho con una modificación del procedimiento de Chang y
colaboradores, [Techniques in Protein Chemistry, T. Hugli
ed., Acad. Press. NW (1989), pp. 305-311]. Se
obtuvieron resultados de composición cuantitativa en cada punto de
tiempo comparando con estándares de aminoácidos derivados (1 pmol).
En el tiempo 0, se detectó glicina contaminante. La alanina fue el
único aminoácido que aumentó con el tiempo de incubación. A las 2
horas de incubación, se detectó Ala en una cantidad total de 25
pmol, equivalente a 0,66 moles de Ala liberado por mol de proteína.
Este resultado indicaba que la molécula SCF de mamífero natural
contiene Ala como término carboxilo, lo cual es coherente con el
análisis secuencial de un péptido C-terminal,
S-2, que contiene Ala C-terminal.
Esta conclusión es también coherente con la conocida especificidad
de la carboxipeptidasa P [Lu, et al., J. Chromatog.
447, 351-364 (1989)]. Por ejemplo la
segmentación cesa si se encuentra la secuencia
Pro-Val. El péptido S-2 tiene la
secuencia
S-R-V-S-V-(T)-K-P-F-M-L-P-P-V-A-(A)
y se dedujo que era el péptido C-terminal de SCF
(véase Sección J en este Ejemplo). La secuencia
C-terminal de
- - -P-V-A-(A)
retringe la segmenta proteasa a alanina solamente. La composición de
aminoácidos del péptido S-2 indica la presencia de
1 Trh, Ser, 3 Pro, 2 Ala, 3 Val, 1 Met, 1 Leu, 1 Phe, 1 Lys y 1
Arg, es decir un total de 16 residuos. La detección de 2 residuos
de Ala indica que puede haber dos residuos Ala en el término C de
este péptido (véase cuadro en la Sección G). Por lo tanto, el BRL
SCF termina en Ala 164 o Ala 165.
Combinando los resultados obtenidos a partir del
análisis secuencial de (1) factor célula madre intacto tras
eliminar su ácido piroglutámico N-terminal, (2) los
péptidos CNBr, (3), los péptidos de tripsina, y (4) los fragüentos
de peptidasa Glu-C, se dedujo una secuencia
N-terminal y una secuencia
C-terminal (Figura 11). La secuencia
N-terminal comienza en el ácido piroglutámico y
termina en Met-48. La secuencia
C-terminal contiene 84/85 aminoácidos (posición 83 a
164/165). La secuencia de la posición 49 a la 81 no se detectó en
ninguno de los péptidos aislados. No obstante, se detectó una
secuencia para un péptido grande después de la segmentación de
BNPS-scatole de BRL SCF descrito en la Sección H de
este Ejemplo. A partir de estos datos adicionales, así como de la
secuencia de ADN obtenida del SCF de rata (Ejemplo 3) se pueden
alinear las secuencias N-terminal y
C-terminal y la secuencia global delineada en la
forma indicada en la Figura 11. El término N de la molécula es
ácido piroglutámico y el término C es alanina según se confirma por
digestión de aminopeptidasa piroglutamato y digestión de
carboxipeptidasa P, respectivamente.
A partir de los datos de la secuencia, se
concluye que Asn-72 está glicosilada;
Asn-109 y Asn-120 están
probablemente glicosilados en algunas moléculas pero no en otras.
Se pudo detectar Asn-65 durante el análisis
secuencial y por consiguiente sólo puede estar parcialmente
glicosilado, si lo está. No se pudo detectar
Ser-142, Thr-143 y
Thr-155, previsto a partir de la secuencia de ADN,
durante el análisis secuencial de aminoácidos y por consiguiente
podía haber zonas de fijación de carbohidrato ligado a O. Estas
zonas de fijación potenciales de carbohidrato se indican en la
Figura 11. El carbohidrato ligado a N se indica mediante letras en
legrita; carbohidrato ligado a O se indica mediante letras negrita
abiertas.
Se preparó material de la columna C_{4} de la
Figura 7 para el análisis de composición de aminoácidos por
concentración e intercambio de tampón en 50 mM de bicarbonato de
amonio.
Se hidrolizaron por separado dos muestras de 70
\mul en HCl 6 que contenía 0,1% de fenol y 0,05% de
2-mercaptoetanol a 110ºC in vacuo durante 24
horas. Los hidrolizados se secaron, se reconstituyeron en tampón de
citrato sódico y se analizaron utilizando cromatografía de
intercambio iónico (modelo Beckman 6300 analizador de aminoácidos).
Los resultados se muestran en el Cuadro 3. Utilizando 164
aminoácidos (de los datos de secuenciación de proteína) para
calcular la composición de aminoácidos se obtiene una mejor
concordancia con los valores previstos que se utilizan 193
aminoácidos (según se deduce de los datos de secuenciación de ADN
derivado de PCR, Figura 14C).
La inclusión de una cantidad conocida de un
estándar interno en los análisis de la composición de aminoácidos
también permitió la cuantificación de la proteína en la muestra; se
obtuvo un valor de 0,117 mg/ml para la muestra analizada.
La determinación de la secuencia de aminoácidos
de fragmentos de la proteína SCF de rata hizo posible diseñar
oligonucleótidos de secuencia mixta específicos para SCF de rata.
Los oligonucleótidos se utilizaron como sondas de hibridación para
la selección de bibliotecas genómicas y de cADN de rata y como
iniciadores en un intento de amplificar partes del cADN utilizando
estrategias de reacción en cadena de polimerasa (PCR) [Mullis y
colaboradores., Methods in Enzymol. 155,
335-350 (1987)]. Los oligonucleótidos se
sintetizaron mediante el método de fosforamidita [Beaucage y
colaboradores., Tetrahedron Lett., 22,
1859-1862 (1981); McBride y colaboradores
Tetrahedron Lett., 24, 245-248
(1983)]; sus secuencias se muestran en la Figura 12A. Las letras
representan: A, adenina; T, timina, C, citosina; G, guanina; I,
inosina. El asterisco * en la Figura 12A representa oligonucleótidos
que contienen secuencias de reconocimiento de endonucleasa de
restricción. Las secuencias se escriben 5'-3'.
Se examinaron una biblioteca genómica de rata,
una biblioteca de cADN de hígado de rata y dos bibliotecas de cADN
de BRL utilizando sondas de oligonucleótido mixtas
rotuladas^{32}p, 219-21 y 219-22
(Figura 12A), cuya secuencias se basaban en la secuencia de
aminoácidos obtenida como en el Ejemplo 2. No se aisló ningún clón
de SCF en estos experimentos utilizando métodos estándar de
clonación de cADN [Maniatis y colaboradores, Molecular
Cloning, Cold Spring Harbor 212-246 (1982)].
Un método alternativo que se traducía en el
aislamiento de secuencias de ácido nucleico SCF implicaba la
utilización de técnicas PCR. En esta metodología, la región de ADN
abarcada por dos iniciadores de ADN se amplifica selectivamente
in vitro mediante múltiples ciclos de replicación
catalizados por una polimerasa de ADN adecuada (como polimerasa de
ADN Taql) en presencia de trifosfatos de deoxinucleósido en un termo
ciclador. La especificidad de la amplificación de PCR se basa en dos
iniciadores de oligonucleótido que flanquean el segmento ADN que se
va a amplificar y que hibridan con cadenas opuestas. Se obtiene PCR
con especificidad bilateral para una región de ADN particular en
una mezcla compleja utilizando dos iniciadores con secuencias
suficientemente específicas de dicha región. El PCR con
especificidad unilateral utiliza un iniciador específico de la
región y un segundo iniciador que puede cebar en
sitios-blanco presentes en muchas o en la totalidad
de las moléculas de ADN en una mezcla particular [Loh et
al., Science, 243, 217-220
(1989)].
Los productos de ADN de reacciones de
amplificación de PCR exitosas son fuentes de información de la
secuencia ADN [Gyllensten, Biotehniques, 7,
100-708 (1989)] y se puede utilizar para realizar
sondas de hibridación rotuladas que poseen una mayor longitud y una
especificidad más elevada que las sondas de oligonucleótidos. Se
pueden diseñar también productos PCR, con secuencias iniciadoras
adecuadas, que se van a clonar en vectores plásmidos que permiten la
expresión del producto péptido codificado.
La estrategia básica para obtener la secuencia
de ADN del cADN de SCF de rata se expone en la Figura 13A. Las
flechas pequeñas indican amplificaciones de PCR y las flechas
gruesas indican reacciones de secuenciación de ADN. Se utilizaron
PCRs 90,6 y 96,2 en conjunción con secuenciación de ADN para
obtener una secuencia de ácido nucleico parcial para el cADN de SCF
de rata. Los iniciadores utilizados en estos PCRs fueron
oligonucleótidos mixtos basados en la secuencia de aminoácidos que
se muestra en la Figura 11. Utilizando la información de secuencia
obtenida a partir de PCRs 90.6 y 96.2 se realizaron iniciadores de
secuencia únicos (224-27 y 224-28,
Figura 12A) que se utilizaron en amplificaciones y reacciones de
secuenciación ulteriores. Se obtuvo en PCRs 90,3, 96,6 y 625,1 ADN
que contenía el extremo 5' del cADN, utilizando PCR de
especificidad bilateral. En PCR 90,4 se obtuvo una secuencia de ADN
adicional cerca del término C de la proteína de cSCF. La secuencia
de ADN para el resto de la región de codificación de cADN de SCF
de rata se obtuvo a partir de productos PCR 630,1, 630,2, 84,1 y
84,2 tal como se describe a continuación en la sección C de este
Ejemplo. Las técnicas utilizadas para obtener el cADN de SCF de
rata se describen a continuación.
Se preparó ADN a partir de células de BRL, según
describe Okayama y colaboradores, [Methods Enzymol.,
154, 3-28 (1987)]. Se aisló polyA+ ARN
utilizando una columna de oligo(dT) celulosa descrita por
Jacobson en [Methods in Enzymology, volume 152,
254-261 (1987)].
Se sintetizó cADN de primera cadena utilizando 1
\mug de polyA + ARN de BRL como plantilla y
(dT)_{12-18} como iniciador según el
protocolo suministrado con la enzima, transcriptasa inversa
Mo-MLV (Bethesda Research Laboratorios). Se procedió
a la degradación de cadena de ARN utilizando NaOH 0,14 M a 84ºC
durante 10 minutos o incubación en un baño de agua hirviendo durante
5 minutos. Se añadió un exceso de acetato de amonio para neutralizar
la solución, y el cADN se extrajo primero con fenol/cloroformo,
luego se extrajo con
cloroformo/iso-amyl-alcohol y se
precipitó con etanol. Para hacer posible la utilización de
iniciadores afines a oligo(dC) en PCRs con especificidad
unilateral, se añadió una cola de poly(dG) al término 3' de
una porción del cADN de primera cadena con transferasa terminal de
timo de ternera (Boehringer Mannheim) según lo descrito
anteriormente [Deng y colaboradores, Methods Enzymol,
100, 96-03 (1983)].
A no ser que se indique otra cosa en las
descripciones siguientes, la etapa de desnaturalización en cada
sitio de PCR se ajustó a 94ºC, 1 minuto; y la elongación a 72ºC
durante 3 ó 4 minutos. La temperatura y duración de hibridación fue
variable de PCR a PCR representando frecuentemente un compromiso
sobre la base de los requisitos estimados de varios PCRs diferentes
realizados simultáneamente. Cuando se redujeron las concentraciones
de iniciador para rebajar la acumulación de artefactos de iniciador
[Watson, Amplification, 2, 56 (1989)], se indicaron
tiempos de hibridación más largos; cuando la concentración de
producto PCR era elevada, se utilizaron tiempos de hibridación más
cortos y concentraciones de iniciador más elevadas para aumentar el
rendimiento. Un factor importante para determinar la temperatura de
hibridación fue el T_{d} estimado de asociación
iniciador-blanco [Suggs et al., en Developmental
Biology Using Purified Genes eds. Brown, D.D. y Fox, C.F.
(Academic, New York) pp. 683-693 (1981)]. Las
enzimas utilizadas en las amplificaciones se obtuvieron de uno de
los tres fabricantes siguientes: Stratagene, Promega, or
Pekín-Elmer Cetus. Los compuestos de reacción se
utilizaron en la forma sugerida por el fabricante. Las
amplificaciones se realizaron en termociclador de ADN Coy Temcycle
ó Perkin-Elmer CETUR.
La amplificación de fragmentos de cADN de SCF se
ensayó generalmente con electroforesis de gel agarosa en presencia
de bromuro de etidio y visualización por fluorescencia de bandas de
ADN estimuladas por radiación ultravioleta. En algunos casos en los
que se anticiparon pequeños fragmentos, se analizaron productos de
PCR por electroforesis de gel de poliacrilamida. La confirmación de
que las bandas observadas representaban fragmentos de cADN de SCF
se obtuvo mediante la observación de bandas adecuadas de ADN tras
la amplificación subsiguiente con uno o mas iniciadores anidados
internamente. La confirmación final se obtuvo por secuenciación
dideoxi [Sanger y colaboradores., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 74, 5463-5467 1977)] del producto
PCR y comparación de los productos de traducción previsto con
información de secuencia de péptido de SCF.
En los experimentos de PCR iniciales, se
utilizaron oligonucleótidos mezclados sobre la base de secuencia de
proteína de SCF [Gould, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
86, 1934-1938]. A continuación se dan
descripciones de las amplificaciones de PCR utilizadas para obtener
información de la secuencia de ADN para los aminoácidos
codificadores de cADN de rata -25 a 162.
En PCR 90,6, se amplificó cADN de BRL con 4 pmol
de cada 222-11 y 223-6 en un
volumen de reacción de 20 \mul. Se sometió a electroforesis sobre
gel agarosa una porción del producto de PCR 90,6 y se observó una
banda del tamaño más o menos esperado. Se siguió amplificando 1
\mul del producto 90,6 PCR con 20 pmol de cada uno de los
iniciadores 222-11 y 223-6 EN 50
\mul durante 15 ciclos, hibridando a 45ºC. Se sometió entonces
una parte de estos productos a 25 ciclos de amplificación en
presencia de iniciadores 222-11 y
219-25 (PCR 96.2), obteniéndose una sola banda de
producto importante tras electroforesis de gel agarosa. La
amplificación asimétrica del producto de PCR 96,2 con los mismos dos
iniciadores produjo una plantilla/molde que se secuenció con
éxito. Se realizó una amplificación selectiva ulterior de
secuencias de SCF en el producto de 96,2 por amplificación PCR del
producto en presencia de 222-11 y de iniciador
anidado 219-2. El producto de este PCR se utilizó
como plantilla para la amplificación asimétrica y la producción de
sonda radiorrotulada (PCR2).
Para aislar el extremo 5' del cADN de SCF de
rata, se utilizaron como iniciadores no específicos, iniciadores
que contenían secuencias (dC)_{n}, complementariamente a
las colas poly (dG) del cADN. El PCR 90,3 contenía
(dC)_{12} (10 pmol) y 223-6 (4 pmol) como
iniciadores y cADN de BRL como plantilla. El producto de reacción
actuó como un agregado de peso molecular muy elevado, permaneciendo
cerca del pocillo de carga en la electroforesis de gel agarosa. Se
siguió amplificando 1 \mul de la solución del producto en
presencia de 25 pmol de (dC)_{12} y 10 pmol
223-6 en un volumen de 25 \mul durante 15 ciclos,
hibridando a 45ºC. Se amplificó entonces la mitad de 1 gil de este
producto durante 25 ciclos con iniciador anidado internamente
219-25 y 201-7 (PCR 96,6). La
secuencia de 210-C se muestra en la Figura 12C. No
se observaron bandas en la electroforesis de gel agarosa. Se
realizaron otros 25 ciclos de PCR, hibridación a 40ºC, después de lo
cual se observó una banda prominente. Se realizó transferencia
Southern y se observó una sola banda de hibridación prominente. Se
realizaron otros 20 ciclos de PCR (625,1), hibridación a 45ºC
utilizando 201-7 e iniciador anidado
224-27. La secuenciación se realizó tras la
amplificación asimétrica por PCR, obteniéndose una secuencia que se
extendió más allá del término amino putativo de la supuesta
secuencia de codificación peptídica de señal de
pre-SCF. Esta secuencia se utilizó para diseñar un
iniciador de oligonucleótido 227-29 que contenía el
extremo 5' de la región de codificación del cADN de SCF
de rata.
de rata.
De forma similar, se obtuvo la secuencia de ADN
3' que termina en aminoácido 162, secuenciando PCR 90,4 (véase
Figura 13.A).
Se utilizaron sondas fabricadas a partir de la
amplificación PCR de SCF de rata codificadora de cADN según lo
descrito en la Sección A anterior, para examinar una biblioteca que
contenía secuencias genómicas de rata (obtenido de CLONTECH L
Laboratories, Inc.; catálogo número RL1022 j). La biblioteca se
construyó en el vector \lambda bacteriófago
EMBL-3 SP6/T7 utilizando ADN obtenido de una rata
adulta macho Sprague-Dawley. La biblioteca, según
indica el proveedor, contiene 2,3 x 10^{6} clones independientes
con un tamaño de inserto medio de 16 kb.
Se utilizaron PCRs para generar sondas rotuladas
^{32}p utilizadas en el examen de la biblioteca genómica. Se
preparó una sonda PCR1 (Figura 13A) en una reacción que contenía
16,7 \muM ^{32}P[alpha]-dATP, 200 \muM
dCTP, 200 \muM dGTP, 200 \muM dTTP, tampón de reacción
suministrado por Perkin Elmer Cetus polimerasa Taq (Perkin Elmer
Cetus) a 0,05 udes/ml, 0,5 \muM 219-26, 0,05
\muM 223-6 y 1 \mul de plantilla 90,1 que
contenía las zonas-blanco para los dos iniciadores.
Se obtuvo la sonda PCR 2 utilizando condiciones de reacción
similares con la diferencia de que se cambiaron los iniciadores y la
plantilla. La sonda PCR 2 se realizó utilizando 0,5 \muM
222-11, 0,05 \muM 21-921 y 1
\mul de una plantilla derivada de PCR 96,2.
Se cultivaron aproximadamente 10^{6}
bacteriófagos en la forma descrita en Maniatis y colaboradores,
[supra (1982)]. Las placas se transfirieron a filtros
GeneScreen Plus^{TM} (22 cm x 22 cm; NEN/DuPont) que se
desnaturalizaron, neutralizaron y secaron en la forma descrita en un
protocolo del fabricante. Se realizaron dos transferencias a filtro
para cada placa.
Los filtros se prehibridaron en NaCl 1M, 1% SDS,
0,1% de albúmina de suero bovino, 0,1% ficoll, 0,1%
polivinilpirrolidona (solución de hibridación) durante
aproximadamente 16 horas a 65ºC y se almacenó a -20ºC. Los filtros
se transfirieron a solución de hibridación fresca que contenía una
muestra PCR rotulada^{32}P a 1,2 x 10^{4} cpm/ml e hibridaron
durante 14 horas a 65ºC. Los filtros se lavaron en NaCl 0,9 M,
citrato sódico 0,09 M, SDS 0,1%, pH 7,2 (solución de lavado) durante
2 horas a temperatura ambiente seguido de un segundo lavado en
solución de lavado fresca durante 30 minutos a 65ºC. Se quitaron de
las placas y se volvieron a examinar con sondas PCR 1 y PCR 2
clones bacteriófagos de las áreas de las placas correspondientes a
manchas radioactivas en los autorradiogramas.
Se digirió ADN de clones positivos con
endonucleasas de restricción BamHI, SphI o SstI, y los fragmentos
resultantes se subclonaron en pUC119 y se secuenciaron
ulteriormente. La estrategia para la secuenciación del ADN de SCF
de rata se muestra esquemáticamente en la Figura 14A. En esta
Figura, la línea de la parte superior representa la región del SCF
codificador de ADN genómico de rata. Los huecos en línea indican
regiones que no han sido secuenciadas. Las casillas grandes
representan exones para codificar regiones del gen SCF con los
aminoácidos codificados correspondientes indicados encima de cada
casilla. Las flechas representan las regiones individuales que se
secuenciaron y se utilizaron para ensamblar la secuencia de consenso
para el gen SCF de rata. La secuencia para el en SCF de rata se
muestra en la Figura 14B.
Utilizando sonda PCR 1 para examinar la
biblioteca genómica de rata, se aislaron clones correspondientes a
exones que codifican aminoácidos 19 a 176 de SCF. Para obtener
clones para exones corriente arriba de la región de codificación
para aminoácido 19, se examinó la biblioteca utilizando sonda de
oligonucleótido 228-30. El mismo conjunto de
filtros utilizado anteriormente con la sonda PCR 1 se prehibridó
como antes y hibridó en solución que contenía oligonucleótido
228-30 rotulado ^{32}P (0,03 picomol/ml) a 50ºC
durante 16 horas. Los filtros se lavaron en solución de lavado a
temperatura ambiente durante 30 minutos seguido de un segundo
lavado en solución de lavado fresca a 45ºC durante 15 minutos. Se
quitaron de las placas y se volvieron a examinar con la sonda
228-30 los clones bacteriófagos de las áreas de las
placas correspondientes a manchas radioactivas en los
autorradiogramas. Se digirió ADN de clones positivos con
endonucleasas de restricción y se subclonó como antes. Utilizando
la sonda 228-30 se obtuvieron clones
correspondientes al exón codificador de aminoácidos -20 a 18.
Se realizaron varios intentos para aislar clones
correspondientes al/a los exón(es) que contienen la región
no traducida 5' y la región de codificación para aminoácidos -25 a
-21. No se aislaron clones para esta región del gen SCF de
rata.
Se elaboraron sistemas de expresión de células
de mamífero para cerciorarse de si un producto polipéptido activo de
SCF de rata podía expresarse en células de mamífero y ser segregadas
por las mismas. Se diseñaron sistemas de expresión para expresar
versiones truncadas de SCF de rata (SCF ^{1-162}
y SCF^{1-164}) y una proteína
(SCF^{1-193}) previstas a partir de la traducción
de la secuencia génica en la Figura 14C.
El vector de expresión utilizado en estos
estudios era un vector lanzadera que contenía secuencias de pUC119,
SV40 y HTLVI. El vector se diseñó para permitir la replicación
autónoma en células de mamífero y de E. Coli y para expresar
ADN exógeno insertado bajo el control de secuencias de ADN viral.
Este vector, designado V19.8, albergado en E. coli DH5, está
depositado en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn
Drive, Rockville, Md. (ATCC # 68124). Este vector es un derivado de
pSVDM19 descrito en la Patente US de Souza 4,810,643 que se
incorpora aquí a modo de referencia.
El cADN para SCF^{1-162} de
rata se insertó en vector plásmido V19.8. La secuencia de cADN se
muestra en la Figura 14C. El cADN que se utilizó en esta
construcción se sintetizó en reacciones de PCR 630.1 y 630.2, como
se muestra en la Figura 13A. Estos PCRs representan amplificaciones
independientes e iniciadores de oligonucleótido sintético
utilizados 227-29 y 227-30. La
secuencia para estos iniciadores se obtuvo a partir de cADN generado
de PCR tal como se describe en la Sección A de este Ejemplo. Las
reacciones, 50 \mul en volumen consistieron en 1x tampón de
reacción (de un kit Perkin Elmer Cetus), 250 \muM dATP, 250
\muMN dCTP, 250 \muM dGTP y 250 \muM dTTP, 200 ng cADN
oligo(dT) iniciado, 1 picomol de 227-29, 1
picomol de 227-30 y 2,5 unidades de polimerasa Taq
(Perkin Elmer Cetus). El cADN se amplificó durante 10 ciclos
utilizando una temperatura de desnaturalización de 94ºC durante 1
minuto, una temperatura de hibridación de 37ºC durante 2 minutos y
una temperatura de elongación de 72ºC durante 1 minuto. Tras estas
rondas iniciales de amplificación PCR, se añadieron a cada reacción
10 picomoles de 227-29 y 10 picomoles de
227-30. Prosiguieron las amplificaciones durante 30
ciclos en las mismas condiciones con la excepción de que la
temperatura de hibridación se cambió a 55ºC. Los productos del PCR
se digirieron con endonucleasas de restricción HindIII y SstII. Se
digirió de forma similar V19.8 con HindIII SstII, y en un caso, se
trató el vector plásmido digerido con fosfatasa alcalina intestinal
de ternera; en otros casos, el fragüento grande de la digestión se
aisló de un gel agarosa. El cADN se ligó a V19.8 utilizando ligasa
de polinucleótico T4. Los productos de ligadura se transformaron en
DH5 de cepa E. Coli competente según lo descrito [Okayama
et al., supra (1987)]. Se secuenció el ADN preparado
a partir de clones bacterianos individuales siguiendo el método
dideoxy Sanger. La Figura 17 muestra un constructo de V19.8 SCF.
Estos plásmidos se utilizaron para transfectar células de mamífero
tal como se describe en los Ejemplos 4 y 5.
El vector de SCF^{1-164} de
rata se construyó utilizando una estrategia similar a la utilizada
para SCF^{1-162} donde se sintetizó cADN
utilizando amplificación PCR y se insertó ulteriormente en V19.8.
El cADN utilizado en las construíciones se sintetizó en
amplificaciones PCR con V19.8 que contenía cADN de
SCF^{1-162} (V19.8 : SCF^{1-162}
como plantilla, 227-29 como el iniciador para el
extremo 5' del gen y 237-19 como iniciador para el
extremo 3' del gen. Las reacciones duplicadas (50 \mul) contenían
1 x tampón de reacción, 250 \muM cada una de dATP, dCTP, dGTP y
dTTP, 2,5 unidades de Taq polimerasa, 20 ng de V19. 8 :
SCF^{1-162}, y 20 picomoles de cada iniciador. El
cADN se amplificó durante 35 ciclos utilizando una temperatura de
desnaturalización de 94ºC durante 1 minuto, una temperatura de
hibridación de 55ºC durante 2 minutos y una temperatura de
elongación de 72ºC durante 2 minutos. Los productos de las
amplificaciones se digirieron con endonucleasas de restricción
HindIII y SstII y se insertaron en V19.8. El vector resultante
contiene la región de codificación para aminoácidos -25 a 164 de
SCF seguido de un codón de terminación.
El cADN para una forma de aminoácido 193 de SCF
de rata (SCF^{1-193} de rata se prevé a partir
dela traducción de la secuencia de ADN en la Figura 14C) se insertó
también en el vector plásmido V19.8 utilizando un protocolo similar
al utilizado para el SCF^{1-162} de rata. El cADN
que se utilizó en esta construcción se sintetizó en reacciones de
PCR 84.1 y 84.2 (Figura 13A) utilizando oligonucleótidos
227-29 y 230-25. Las dos reacciones
presentan amplificaciones independientes partiendo de preparaciones
de ARN diferentes. La secuencia para 227-29 se
obtuvo por medio de reacciones PCR tal como se describe en la
Sección A de este Ejemplo y la secuencia para el iniciador
230-25 se obtuvo de ADN genómico de rata (Figura
14B). Las reacciones, 50 \mul en volumen, consistieron en 1x
tampón de reacción (de un kit Perkin Elmer Cetus), 250 \muM dATP,
250 \muM dCTP, 250 \muM dGTP y 250 \muM dTTP, 200 ng de cADN
oligo(dT)-iniciado, 10 picomoles de
227-29, 10 picomoles de 230-25 y 2,5
unidades de Taq polimerasa (Perkin Elmer Cetus). El cADN se
amplificó durante 5 ciclos utilizando una temperatura de
desnaturalización de 94ºC durante 1,5 minutos, una temperatura de
hibridación de 50ºC durante 2 minutos y una temperatura de
elongación de 72ºC durante 2 minutos. Tras estas rondas iniciales,
prosiguieron las amplificaciones durante 35 ciclos en las mismas
condiciones con la excepción de que la temperatura de hibridación se
cambió a 60ºC. Los productos de la amplificación PCR se digirieron
con endonucleasas de restricción HindIII y SstII. El ADN de V19.8 se
digirió con HindIII y SstII y el fragmento grande de la digestión
se aisló de un gel agarosa. El cADN se ligó a V19.8 utilizando
ligasa de polinucleótido T4.Los productos de ligado se transformaban
en DH5 de cepa E. Coli y se secuenció ADN preparado a partir
de clones bacterianos individuales. Estos plásmidos se utilizaron
para transfectar células de mamífero en el Ejemplo 4.
El cADN de SCF humano obtenido de una línea
celular hepatoma HepG2 (ATCC HB 8065) utilizando amplificación PCR
tal como se muestra en la Figura 13B. La estrategia básica
consistió en amplificar cADN humano por PCR con iniciadores cuya
secuencia se obtuvo del cADN del SCF de rata.
Se preparó ARN en la forma descrita por Maniatis
y colaboradores, [supra (1982)]. Se preparó RNA polyA+
utilizando oligo dT celulosa siguiendo las instrucciones de los
fabricantes (Collaborative Research Inc.).
Se preparó cADN de primera cadena en la forma
descrita anteriormente para BRL cADN, con la diferencia de que la
síntesis se cebó/inició con 2 \muM de oligonucleótido
228-28, tal como se muestra en la Figura 12C, que
contiene una secuencia aleatoria corta en el extremo 3' unido a una
secuecia única más larga. La parte de secuencia única de
228-28 ofrece una zona-blanco para
la amplificación por PCR con iniciador 228-29 como
iniciador no específico. Se amplificaron secuencias de cADN humano
relacionadas con al menos parte de la secuencia SCF de rata, a
partir del cADN HepG2 mediante PCR utilizando iniciadores
227-29 y 228-29 (PCR 22,7, véase
Figura 13B; 15 ciclos de hibridación a 60ºC seguido de 15 ciclos de
hibridación a 55ºC. La electroforesis de gel agarosa no reveló
ninguna banda clara, únicamente una mancha de ADN de tamaño
aparentemente heterogéneo. Se intentó una amplificación
preferencial posterior de secuencias estrechamente relacionadas con
cADN SCF de rata realizando PCR con 1 \mul del producto PCR 22,7
utilizando iniciador 222-11 de SCF de rata anidado
internamente e iniciador 228-29 (PCR 24,3; 20 ciclos
de hibridación a 55ºC). Sólo se observó, nuevamente, una mancha
heterogénea de producto ADN sobre los geles agarosa. La
amplificación específica bilateral de los productos PCR 24,3 con
iniciadores 222-11 y 227-30 (PCR
25,10; 20 ciclos) dio lugar a una banda de producto única de
importancia, de mismo tamaño que el producto PCR de cADN de SCF de
rata correspondiente. La secuenciación de un ADN de producto PCR
asimétrico (PCR 33,1) utilizando 224-24 como
iniciador de secuenciación dio como resultado aproximadamente 70
bases de secuencias de SCF humano.
De forma similar, la amplificación de 1 \mul
del producto PCR 22,7, primero con iniciadores
224-25 y 228-29 (PCR 24,7, 20
ciclos) y luego con iniciadores 227-24 y
227-30 (PCR 41,11) generó una banda importante de
mismo tamaño que el producto SCF de rata correspondiente, y tras la
amplificación asimétrica sangre PCR 42,3) dio lugar a una secuencia
altamente homóloga con la secuencia SCF de rata cuando se utilizó
224-24 como iniciador de secuenciación. Se
sintetizaron oligodeoxinucleótidos de secuencia única tomando como
blanco el cADN de SCF humano y en la Figura 12 se dan sus
secuencias.
Para obtener la contrapartida humana de la
secuencia de codificación generada por PCR SCF que se habla
utilizado en estudios de expresión y de actividad, se realizó un
PCR con iniciadores 227-29 y 227-30
sobre 1 \mul de producto PCR 22,7 en un volumen de reacción de 50
\mul (PCR 39,1). La amplificación se realizó en un Coy Tempcycler.
Debido a que se desconocía el grado de mala adaptación
(mismatching) entre el cADN de SCF humano y el iniciador único SCF
de rata 227-30, se utilizó una hibridación de
rigurosidad baja (37ºC) para los primeros tres ciclos; después, la
hibridación se realizó a 55ºC. Apareció una banda prominente de
mismo tamaño (aprox. 590 bp) que el homólogo de rata y se amplificó
ulteriormente por dilución de una pequeña porción de producto PCR
39,1 y PCR con los mismos iniciadores (PCR 41,1). Debido a que se
observó más de una banda en los productos de PCR 41,1, se realizó un
PCR ulterior con iniciadores internos anidados con el fin de
determinar al menos una parte de su secuencia antes de la
clonación. Después de 23 ciclos de PCR con iniciadores
231-27 y 227-29 (PCR 51,2), se
apreció una sola banda intensa. Unos PCRs asimétricos con
iniciadores 227-29 y 231-27 y una
secuenciación confirmaron la presencia de las secuencias de cADN de
SCF humano. La clonación del ADN de SCF PCR 41,1 en el vector de
expresión V19.8 se realizó en la forma ya descrita para los
fragmentos de PCR SCF^{1-162} de rata en la
Sección S anterior. Se secuenció ADN de clones bacterianos
individuales utilizando el método dideoxy de Sanger.
Se utilizó una sonda PCR7 realizada a partir de
la amplificación PCR de cADN, véase Figura 13B, para examinar una
biblioteca que contenía secuencias genómicas humanas. Se utilizó
una ribosonda complementaria a una parte de cADN de SCF humano,
véase más abajo, para volver a examinar placas positivas. La sonda
PCR 7 se preparó empezando con el producto de PCR 41,7 (véase
Figura 13B). El producto de PCR 41,1 se siguió amplificando con
iniciadores 227-29 y 227-30. El
fragmento de 590 bp resultante se eluyó de un gel agarosa y se
reamplificó con los mismos iniciadores (PCR 58,1). El producto de
PCR 58,1 se diluyó 1000 veces en 50 \mul de reacción que contenía
10 pmoles 233-13 y se amplificó durante 10 ciclos.
Tras la adición de 10 pmoles de 227-30 a la
reacción, prosiguió el PCR durante 20 ciclos. Se añadieron 80 pmoles
adicionales de 233-13 y se aumentó el volumen de
reacción a 90 \mul, prosiguiendo el PCR durante 15 ciclos. Los
productos de reacción se diluyeron 200 veces en 50 \mul de
reacción, se añadieron 20 pmoles de 231-27 y 20
pmoles para 233-13, y se realizó el PCR durante 35
ciclos utilizando una temperatura de hibridación de 48º en reacción
96,1. Para producir PCR 7^{32}p rotulado se utilizaron
condiciones de reacción similares a las utilizadas para obtener PCR
1, con las siguientes excepciones. En un volumen de reacción de 50
\mul, se diluyó 100 veces PCR 96,1; se utilizaron 5 pmoles de
231-27 como único iniciador; y se realizaron 45
ciclos de PCR con desnaturalización a 94º durante 1 minuto,
hibridación a 48º durante 2 minutos y elongación a 72º durante 2
minutos.
La ribosonda, ribosonda 1, era un ARN de una
sola cadena rotulado ^{32}p complementario a los nucleótidos
2-436 de la secuencia de ADN hSCF mostrada en la
Figura 15B. Para construir el vector para la producción de esta
sonda, se digirió ADN de producto PCR 41,1 (Figura 13B) con HindIII
y EcoRI y se clonó en el poliligante del vector plásmido pGEM3
(Promega, Madison, Wisconsin). El ADN de plásmido PGEM3: hSCF
recombinante se linealizó seguidamente por digestión con HindIII.
Se preparó la ribosonda 1 rotulada ^{32}p a partir de ADN
plásmido linealizado por transcripción runoff con polimerasa de ARN
T7 según las instrucciones facilitadas por Promega. La reacción (3
\mul) contenía 250 ng de ADN de plásmido linealizado y 250
\muM^{32}p-_{rCTP} (catálogo nº
NEG-008H, New England Nuclear (NEN) sin CTP
adicional no rotulado.
La biblioteca genómica humana se obtuvo en
Stratagene (La Jolla, CA; catálogo nº: 946203). La biblioteca se
construyó en el vector bacteriófago Lambda Fix II utilizando ADN
preparado a partir de placenta masculina caucasiana. La biblioteca,
según las características del proveedor, contenían 2 x 10^{6}
placas primarias con un tamaño de inserto medio superior a 15 kb. Se
cultivaron aprox. 106 bacteriófagos según lo descrito por Maniatis
et al., [supra (1982)]. Las placas se transfirieron a
filtros Gene Screen Plus^{TM} (22 cm^{2}; NEN/DuPont) según el
protocolo del fabricante. Se realizaron dos transferencias a filtro
para cada placa.
Los filtros se prehibridaron en 6XSSC (0,9 M
NaCl, 0,09 M citrato sódico, pH 7,5), 1% SDS a 60ºC. Los filtros
se hibridaron en 6XSSC fresco, solución 1% SDS que contenía la
sonda PCR 7 rotulada ^{32}p en 2 x 10^{5} cpm/ml y se híbrido
durante 20 horas a 62ºC. Los filtros se lavaron en 6XSSC, 1% SDS
durante 16 horas a 62ºC. Se quitó un tapón (plug) bacteriófago de
una zona de una placa que correspondía a manchas radioactivas sobre
autorradiogramas y se volvió a examinar con la sonda PCR 7 y la
ribosonda 1. El nuevo examen con la sonda PCR 7 se realizó
utilizando condiciones similares a las utilizadas en el examen
inicial. El nuevo examen con ribosonda 1 se realizó en la siguiente
forma: los filtros se prehibridaron en 6XSSC, 1% SDS y se
hibridaron a 62ºC durante 18 horas en 0,25 M NaPO_{4} (pH 7,5),
0,25 M NaCl, 0,001 M EDTA, 15% formamida, 7% SDS y ribosonda a en 1
x 10^{6}/cpm/ml. Los filtros se lavaron en 6 XSSC, 1% SDS durante
30 minutos a 62ºC seguido de 1XSSC, 1% SDS durante 30 minutos a
62ºC. El ADN de los clones positivos se digirió con endonucleasas de
restricción Barn HI, SphI o SstI y los fragmentos resultantes se
subclonaron en pUC119 y se secuenciaron ulteriormente.
Utilizando la sonda PCR 7, se obtuvo un clón que
incluía exones que codifican aminoácidos 40 a 176 y este clón se
depositó en ATCC (depósito nº 40681). Para obtener clones para
exones SCF adicionales, se examinó la biblioteca genómica humana
con ribosonda 2 y sonda de oligonucleótido 235-29.
La biblioteca se examinó de forma similar a la realizada
anteriormente con las siguientes excepciones: la hibridación con la
sonda 235-29 se realizó a 37ºC y los lavados para
esta hibridación se hicieron durante 1 hora a 37ºC y 1 hora a 44ºC.
Se volvieron a examinar los clones positivos con ribosonda 2,
ribosonda 3 y sondas de oligonucleótidos 235-29 y
236-31. Se realizaron ribosondas 2 y 3 utilizando
un protocolo similar al utilizado para producir ribosonda 1, con
las siguientes excepciones: (a) el ADN de plásmido pGEM3:hSCF
recombinante se linealizó con endonucleasa de restricción PvuII
(ribosonda 2) o PstI (ribosonda 3) y (b) se utilizó la polimerasa
de ARN SP6 (Promega) para sintetizar la ribosonda 3.
La Figura 15A muestra la estrategia utilizada
para secuenciar ADN genómico humano. En esta Figura, la línea en
la parte superior representa la región de ADN genómico humano que
codifica SCF. Los huecos en la línea indican regiones que no han
sido secuenciadas. Las casillas grandes representan exones para
regiones de codificación del gen SCF con los aminoácidos
codificados correspondientes indicados encima de cada casilla. La
secuencia del gen SCF humano se muestra en la Figura 15b. La
secuencia del gen cADN SCF humano obtenidas con técnicas PCR se
muestra en la Figura 15C.
La secuenciación de productos de PCRs iniciados
por dos iniciadores gen-específicos revela la
secuencia de la región limitada por los extremos 3' de los dos
iniciadores. Los PCRs unilaterales, como se indica en el Ejemplo
3A, pueden producir la secuencia de regiones de flanco. Se utilizó
PCR unilateral para extender la secuencia de la región no traducida
5' de cADN de SCF humano.
Se preparó cADN de primera cadena a partir de
poly A+ARN de la línea celular 5637 del carcinoma de vejiga humano
(ATCC HTB 9) usando un ligonucleótico 228-28 (Figura
12C) como iniciador, según se describe en el Ej. 3D. Poniendo
residuos dG en la cola de este cADN, seguido de amplificación PCR
unilateral utilizando iniciadores que contienen secuencias
(dC)_{n} en combinación con iniciadores
SCF-específicos, no dio como resultado fragmentos de
cADN que se extienden corriente arriba (5') de la secuencia
conocida.
Se obtuvo una pequeña cantidad de información de
la secuencia a partir de la amplificación PCR de productos de
síntesis de segunda cadena iniciada por oligonucleótido
228-28. El cADN de primera cadena 5637 sin cola,
descrito anteriormente (aprox. 50 ng) y 2 pmol de
228-28 se incubaron con polimerasa Klenow y 0,5 mM
de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP a 10-12ºC durante
30 minutos en 10 \mul de tampón de protección lxNick [Miniatis
y colaboradores, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory (1982)].
La amplificación del cADN resultante por PCRs
unilateral secuencial con iniciador 228-29 en
combinación con iniciadores SCF anidados (en orden de uso:
235-30, 233-14,
236-31 y finalmente 235-29) dio como
resultado mezclas complejas de productos que aparecieron como
manchas sobre los geles agarosa. Un enriquecimiento significativo
de fragüentos de cADN relacionados con SCF lo indicó la intensidad
creciente de la banda de producto específico observada cuando se
amplificaron volúmenes comparables de los productos PCR unilaterales
sucesivos con dos iniciadores SCF (227-29 y
235-29, p. ej. obteniéndose un producto de aprox.
150 bp). Los intentos de seleccionar una gama de tamaños particular
de productos perforando partes de las manchas de gel agarosa y
reamplificando por PCR no dio en la mayoría de los casos como
resultado una banda bien definida que contenía secuencias
relacionadas con SCF.
Una reacción, PCR 16,17, que contenía solamente
el iniciador 235-29, dio lugar a una banda que
procedía aparentemente de la iniciación por 235-29
en una zona desconocida 5' de la región de codificación, además de
la zona esperada, como se muestra cartografiando con las enzimas de
restricción PvuII y PstI y el análisis PCR con iniciadores
anidados. Este producto se purificó con gel y se reamplificó con
iniciador 235-29 y se intentó la secuenciación con
el método dideoxy de Sanger utilizando iniciador
228-30 rotulado ^{32}p. La secuencia resultante
fue la base para el diseño del oligonucleótido 254-9
(Figura 12B). Al utilizar este iniciador dirigido hacia 3' en PCRs
subsiguientes en combinación con iniciadores SCF dirigidos hacia
5', se obtuvieron bandas del tamaño esperado. La secuenciación
directa Sanger de estos productos PCR produjo nucleótidos 180 a 204
de una secuencia de cADN de SCF humano Figura 15C.
Para obtener más secuencia en el extremo 5' del
cADN de hSCF, se preparó cADN de primera cadena a partir de 5637
poly A^{+} ARN (aprox. 300 ng) utilizando un iniciador
SCF-específico (2 pmol de 233-14) en
16 \muL de reacción que contenía 0,22 U MMLV transcriptasa inversa
(que se compró a BRL) y 500 \muL cada dNTP. Después de las etapas
de extracción estándar fenol-cloroformo y
cloroformo y de precipitación de etanol (a partir de acetato de
amonio 0,1 M), se volvieron a suspender los ácidos nucleicos en 20
\mul de agua se colocaron en un baño de agua hirviendo durante 5
minutos, luego se enfriaron y se puso en cola con transferasa
terminal en presencia de 28 \muM dATP en tampón que contenía
CoCl_{2} [Deng y Wu, Methods in Enzymology, 100, pp.
96-103]. El producto, cADN de primera cadena de
cola (dA)_{n} se purificó por extracción de
fenol-cloroformo y precipitación de etanol y se
volvió a suspender en 20 \muM de 100 mM tris, pH 8,0 y 1 mM
EDTA.
El enriquecimiento y la amplificación de
fragmentos finales 5' de cADN relacionado con SCF humano a partir
de aprox. 20 ng del cADN 5637 de cola (dA)_{n} se
realizaron del siguiente modo: se procedió a 26 ciclos iniciales de
SCF unilateral en presencia de iniciador SCF específico
236-31 y un iniciador o mezcla de iniciadores que
contenía (dT)_{n} secuencias en o cerca del extremo 3', p.
ej. iniciador 221-12 o una mezcla de iniciadores
220-3, 220-7 y
220-11 (Figura 12C). Los productos (1 \mul) de
estos PCRs se amplificaron entonces en un segundo conjunto de PCRs
que contenía iniciadores 221-12 y
235-29. Se observó una banda de producto importante
de aproximadamente 370 bp en cada caso tras el análisis de gel
agarosa. Se perforó un tapón de gel que contenía parte de esta
banda con la punta de una pipeta Pasteur y se transfirió a un
pequeño tubo microfuga. Se añadieron 10 \mul de agua y el tapón
fundió en un bloque calefactor de 84ºC. Se inocularos iniciadores
que tenían PCR 221-12 y 235-29 (8
pmol cada uno) en 40 \muL con 2 \muL del tapón de gel fundido y
diluido. Después de 15 ciclos, se pudo ver una banda ligeramente
difusa de aprox. 370 bp tras el análisis de gel agarosa. Se
realizaron PCRs asimétricos para generar plantillas de
secuenciación de cadena superior e inferior: para cada reacción, 4
\muL de producto de reacción PCR y 40 pmol de iniciador
221-12 o iniciador 235-29 en un
volumen total de reacción de 100 pL se sometieron a 25 ciclos de
PCR (1 minuto, 95ºC; 30 segundos, 55º; 40 segundos, 72ºC). La
secuenciación directa de las mezclas de productos PCR iniciados
221-12 (después de las extracciones estándar y la
precipitación de etanol) con iniciador 262-13
rotulado ^{32}p (Figura 12B) produjo la secuencia 5' de uncleótido
1 a 179 (Figura 15C).
El examen de una biblioteca genómica humana con
sondas de oligonucleótido de SCF no reveló ningún clón que
contuviera la parte conocida del primer exón de codificación. Se
realizó entonces el intento de utilizar una técnica PCR unilateral
para amplificar y clonar secuencias genómicas que rodean dicho
exón.
Se realizó extensión de iniciador de ADN
placental humano desnaturalizado por calor (que se compró a Sigma)
con ADN polimerasa I (enzima Klenow, fragmento grande;
Boehringer-Mannheim) utilizando un iniciador no SCF
como un 228-28 ó 221-11 en
condiciones no rigurosas (baja temperatura) como p. ej. 12ºC para
favorecer la iniciación en un número muy grande de zonas
diferentes. Cada reacción se diluyó entonces cinco veces en tampón
de polimerasa ADN TaqI que contenía TaqI polimerasa y 100 \muM de
cada dNTP y se procedió a la elongación de cadenas de ADN a 72ºC
durante 10 minutos. El producto se enriqueció entonces para
secuencias de primer exón factor célula madre mediante PCR en
presencia de un oligonucleótido primer exón SCF (como 2549) y el
iniciador no SCF adecuado (228-29 ó
221-11). La electroforesis de gel agarosa reveló que
la mayoría de los productos eran cortos (menos de 300 bp). Para
enriquecer para especies más largas, se cortó la parte de cada vía
(lane) de gel agarosa correspondiente a una longitud superior a 300
by y se eluyó electroforéticamente. Tras la precipitación en etanol
y la resuspensión en agua, los productos PCR purificados en gel se
clonaron en un derivado de pGEM4 que contenía una zona Sfil como
fragmento HindIII a SfiI.
Se examinaron colonias con un oligonucleótido de
primer exón SCF rotulado ^{32}p. Se identificaron varias colonias
positivas y las secuencias de los insertos se obtuvieron mediante
el método Sanger. La secuencia resultante que se extiende corriente
abajo del primer exón a través de una banda
exón-intrón de consenso en el intrón vecino, se
muestra en la Figura 15B.
Se preparó cADN de primera cadena a partir de
ARN total o ARN poli A^{+} de hígado de mono (que se adquirió en
Clontech) y de líneas celulares NIH-3T3 (ratón, ATCC
CRL 1658) y D17 (perro, ATCC CCL 183). El iniciador utilizado en
la síntesis de cADN de primera cadena era el iniciador no
específico 228-28 o un iniciador SCF
(227-30, 237-19,
237-20, 230-25 ó
241-6). La amplificación PCR con el iniciador
227-21 y uno de los iniciadores
227-30, 237-19 ó
237-20 dio como producto un fragmento de tamaño
deseado que se secuenció directamente o después de clonación en
V19.8 ó un vector pGEM.
Se obtuvieron secuencias adicionales cerca del
extremo 5' de los cADN de SCF a partir de amplificaciones PCR
utilizando un iniciador SCF-específico en
combinación con 254-9 ó 228-29. Se
obtuvieron secuencias adicionales en el extremo 3' de las regiones
de codificación de SCF tras amplificación PCR de cADN con iniciador
230-25 (en el caso de ratón) o cADN con iniciador
241-6 (en el caso de mono) con
230-25 ó 241-6, según fuera lo
adecuado, y un iniciador SCF dirigido hacia 3'. No se obtuvieron
bandas de producto PCR de SCF en intentos similares para amplificar
cADN D17. El iniciador específico 228-28 se utilizó
para iniciar la síntesis de primera cadena de ARN total D17 y la
mezcla de producto complejo resultante se enriqueció para
secuencias relacionadas con SCF mediante PCR con iniciadores SCF
dirigidos hacia 3', como 227-29 ó
225-31 en combinación con 228-29. La
mezcla de producto se cortó con SfiI y se clonó en un derivado de
pGEM4 (Promega, Madison, Wisconsin) que contenía una zona SfiI como
un SfiI para un fragmento final extremo romo. La biblioteca
heterogénea resultante se examinó con 237-20 radio
rotulado y se secuenciaron varios clones positivos, obteniéndose
secuencias finales 3' de SCF de perro. Las secuencias de aminoácido
alineadas de las proteínas maduras de SCF de humano (Figura 42),
mono, perro, ratón y rata se muestran en la Figura 16.
Las secuencias de aminoácidos SCF conocidas son
altamente homólogas en gran parte de su longitud. En las regiones de
codificación de las cinco especies se encuentran presentes
secuencias típicas de señal de consenso idénticas. El aminoácido que
se esperaba en el término amino de la proteína madura por analogía
con SCF de rata recibe el número 1 en esta Figura. La secuencia de
cADN de perro contiene una ambigüedad que se traduce en una
ambigüedad valina/leucina en la secuencia de aminoácidos en el codón
129. Las secuencias de aminoácidos de humano, mono, ratón y rata
se co-alinean sin inserciones ni delecciones. La
secuencia de perro tiene un residuo extra único en la posición 130,
comparado con las demás especies. El humano y el mono difieren en
una sola posición, una sustitución conservadora de valina (humano)
por alanina (mono) en la posición 130. La secuencia de SCF prevista
inmediatamente antes y después de la zona de proceso putativo cerca
del residuo 164 se conserva en gran medida entre especies.
Para la expresión transitoria en células
COS-1 (ATCC CRL 1650), se transfectó el vector
V19.8 (Ejemplo 3C) que contenía los genes
SCF^{1-162} y SCF^{1-193} de
rata en placas duplicadas de 60 mm [Wigler y colaboradores,
Cell, 14, 725-731 (1979)]. El SCF
V19.8 plásmido se muestra en la Figura 17. Como control, también se
transfectó el vector sin inserto. Se cosecharon sobrenadantes de
cultivo de tejido en diferentes puntos de tiempo tras la
transfección y se hizo un ensayo de actividad biológica. El Cuadro
4 resume los resultados del bioensayo HPP-CFC y el
Cuadro 5 resumen los datos de absorción de
^{3}H-timidina MC/9 de experimentos de
transfección típicos. Los resultados del bioensayo de sobrenadantes
de células COS-1 transfectadas con los siguientes
plásmidos se muestran en los Cuadros 4 y 5: una forma truncada en
terminal C de SCF de rata con el término C en la posición de
aminoácido 162 (SCF^{1-162} de rata V19.8),
SCF^{1-162} que contenía un ácido en glutámico
posición 81 [SCF^{1-162} de rata V19.8] (Glu
81)], y SCF^{1-162} que contenía una alanina en
posición 19 [SCF^{1-162} (Ala 19 de rata V19.8)].
Las sustituciones de aminoácidos fueron el producto de reacciones
PCR realizadas en la amplificación de SCF^{1-162}
de rata tal como se indica en el Ejemplo 3. Se secuenciaron clones
individuales de SCF^{1-162} de rata V19.8 y se
comprobó que dos clones tenían sustituciones de aminoácidos. Como
se puede ver en los Cuadros 4 y 5, el SCF de rata recombinante es
activo en los bioensayos utilizados para purificar SCF de mamífero
natural en el Ejemplo 1.
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Se probaron individualmente SCF de rata
recombinante y otros factores en un ensayo de
CFU-GM humano [Broxmeyer y colaboradores,
supra (1977)] que mide la proliferación de células de médula
ósea normal y los datos se muestran en el Cuadro 6. También se
muestran en el Cuadro 6 los resultados de sobrenadantes de
COS-1 de cultivos 4 días después de la transfección
con V19.8 SCF^{1-162} en combinación con otros
factores. Los números de colonias son la media de cultivos
triplicados.
El SCF de rata recombinante tiene principalmente
una actividad sinergística sobre la médula ósea humana normal en
el ensayo CFU-GM. En el experimento del Cuadro 6,
SCF sinergizó con GM-SCF humano,
IL-3 humano y SCF-1 humano. En
otros ensayos se observó sinergia con G-CSF también.
Existía cierta proliferación de médula ósea humana 14 días después
con SCF de rata; no obstante los grupos estaban compuestos por menos
de 40 células. Se tuvieron resultados similares con SCF derivado de
mamífero natural.
Este ejemplo se refiere a un sistema de
expresión de mamífero estable para la secreción de SCF de células
CHO (ATCC CCL 61 seleccionadas para DHFR-).
El vector de expresión utilizado para la
producción de SCF fue V19.8 (Figura 17). El marcador seleccionable
utilizado para establecer transformantes estables fue el gen para
dihidrofolato reductasa en el plásmido pDSVE.1 El plásmido pDSVE
(Figura 18) es un derivado de pDSVE construido por digestión de
pDSVE por la enzima de restricción Sail y unión a un fragmento de
oligonucleótido constituido por los dos oligonucleótidos
5' TCGAC CCGGA TCCCC
3'
\hskip1,3cm3' G GGCCT AGGGG AGCT 5'
El vector pDSVE se describe en las US Ser. Nº.
025,344 y 152,045 (de propiedad común) que se incorporan aquí a
modo de referencia. La porción de vector de V19.8 y pDSVE.1
contiene largos trechos de homología que incluye un origen Co1E1
bacteriano de gen de resistencia de replicación y ampicilina y el
origen SV40 de replicación. Este solapamiento puede contribuir a la
recombinación homóloga durante el proceso de transformación,
facilitando de este modo la co-transformación.
Se realizaron co-precipitados de
fosfato cálcico de constructos de SCF V 19.8 y pDSVE.1 en presencia
o ausencia de 10 \mug de ADN de ratón portador utilizando 1,0 ó
0,1 \mug de pDSVE.1 que había sido linealizado con la
endonucleasa de restricción PvuI y 10 \mug de SCF V19.8 tal como
se describe [Wigler y colaboradores, supra (1978)]. Las
colonias se seleccionaron sobre la base de la expresión del gen
DHFR de pDSVE.1. Se seleccionaron colonias capaces de crecimiento
en ausencia de hipoxantina y timidina añadida utilizando cilindros
de clonación y se expandieron como líneas celulares independientes.
Se sometieron a prueba sobrenadantes celulares de líneas cellares
independientes en un ensayo de absorción de MC/9
^{3}H-timidina. Los resultados de un experimento
típico se presentan en el Cuadro 7.
También se logró la expresión de SCF en células
CHO utilizando el vector de expresión pDSVR\alpha2 que se
describe en la US Ser. Nº 501.904 (de propiedad común), depositada
el 29 Marzo 1990, que se incorpora aquí a modo de referencia. Este
vector incluye un gen para la selección y amplificación de clones
sobre la base de la expresión del gen DHFR. El clon pDSR\alpha2
SCF se generó en un proceso de dos etapas. El V19.8 SCF se digirió
con la enzima de restricción BamHI y el inserto SCF se ligó en la
zona BamHI pGEM3.
Se digirió ADN de pGEM3 SCF con HindIII y SalI y
se ligó en pDSR\alpha2 digerido con HindIII y SalI. Se repitió
el mismo proceso para genes humanos que codifican un término COOH
en las posiciones de aminoácido 162, 164 y 183 de la secuencia
mostrada en la Figura 15C y la posición 248 de las secuencias
mostradas en la Figura 42.
Se expusieron líneas celulares establecidas con
methotrexato [Shimke, en Methods in Enzymology, 151
85-104 (1987)] en 10 nM para aumentar los niveles de
expresión del gen DHFR y el gen SCF adyacente. Los niveles de
expresión de SCF humano recombinante se ensayaron en un ensayo
radioinmune, como en el Ej. 7, y/o inducción de formación de colonia
in vitro utilizando leucocitos de sangre periférica humana.
Este ensayo se realiza en la forma descrita en el Ej. 9 (Cuadro 12)
con la diferencia de que se utiliza sangre periférica en lugar de
médula ósea y la incubación se realiza a 20% O_{2}, 5% CO_{2} y
75 N_{2} en presencia de EPO humano (10 U/ml). Los resultados de
experimentos típicos se muestran en el Cuadro 8. El
SCF^{1-164} humano que expresa el clón CHO se
depositó el 25 de Septiembre de 1990 en ATCC (CRL 10557), siendo
así su designación Hu164SCF17.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Este ejemplo se refiere a la expresión en E.
Coli de polipéptidos de SCF por medio de una secuencia de ADN
que codifica SCF^{1-193} de rata [Met^{-1}]
(Figura 14C). Aunque se puede utilizar algún vector adecuado para
la expresión de proteína utilizando este ADN, el plásmido elegido
fue pCFM1156 (Figura 19). Este plásmido se puede construir
fácilmente a partir de pCFM 836 (ver Patente US 4,710,473, que se
incorpora aquí a modo de referencia) destruyendo las dos zonas de
restricción NdeI endógenas rellenando el extremo con enzima
polimerasa T4 seguido de ligado de extremo romo y sustituyendo la
secuencia de ADN pequeña entre las zonas de restricción únicas
C1a1 y Kpon1 por el pequeño oligonucleótido mostrado a
continuación.
5'
CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3'
3'
TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5'
El control de la expresión proteínica en el
plásmido pCFM1156 se realiza por medio de promotor lambda P_{L}
sintético controlado a su vez por un gen represor CI857 lambda
sensible a la temperatura [tal como el que aparece en las cepas
E. Coli FM5 (depósito ATCC nº 53911 o K12\DeltaHtrp]. El
vector pCFM1156 se construye de modo que tenga una secuencia de ADN
que contiene una zona de unión de ribosoma optimizada y un codón de
iniciación inmediatamente 3 a 3' del promotor PL sintético. Una
zona de restricción única NdeI, que contiene el codón de iniciación
ATG, precede un grupo de clonación de zona
multi-restricción seguido de una secuencia de
terminación de transcripción t-oop lambda.
Se digirió con BgIII y SstII
SCF^{1-193} plásmido V.19.8 que contenía el gen
SCF^{1-193} de rotaclonado del cADN amplificado
PCR (Figura 14C) tal como se describe en el Ej. 3 y se aisló un
fragmento de ADN de 603 bp. Con el fin de proporcionar un codón de
iniciación Met y restaurar los codones para los tres primeros
residuos aminoácidos (Gln, Glu y Ile) del polipéptido de SCF de
rata, se fabricó un ligante oligonucleótido sintético
5' TATGCAGGA 3'
3' ACGTCCTCTAG 5'
con extremos adhesivos NdeI y
BgIII. El pequeño oligonucleótido y el fragmento de gen
SCF^{1-193} de rata se insertaron ligando en
pCFM1156 en las zonas únicas NdeI y SstII en el plásmido mostrado
en la Figura 19. El producto de esta reacción es un plásmido de
expresión, SCF^{1-193} de rata
pCFM1156.
El plásmido SCF^{-193} de rata pCFM1156 se
transformó en células huésped de E. Coli FM5 competente. La
selección para las células que contienen plásmido se realizó sobre
la base del gen marcador de resistencia antibiótica (canamicina)
que lleva el vector pCFM1156. Se aisló ADN plásmido de células
cultivadas y se SCF confirmó por secuenciación de AND la secuencia
de AND del oligonucleótido sintético y su enlace al gen de SCF de
rata.
Para construir el SCF^{-193} de rata pCFM1156
plásmido que codifica el polipéptido SCF^{-193} de rata
[Met-1] se aisló un fragmento de restricción EcoRI
a SstII de SCF^{-193} de rata V. 19.8 y se insertó ligando en el
SCF^{-193} de rata pCFM plásmido en las zonas de restricción
únicas EcoRI y SstII sustituyendo de este modo la región de
codificación para el término carboxilo del gen SCF de rata.
Para construir el SCF^{-164} de rata pCFM1156
y SCF^{-165} de rata pCFM1156 plásmidos que codifican los
polipéptidos SCF^{-164} de rata [Met^{-1}] y SCF^{-165} de
rata Met^{-1}], respectivamente, se aislaron fragmentos de
restricción EcoRI a SstII de ADN amplificado PCR que codifica el
extremo 3' del gen SCF y diseñado para introducir cambios dirigidos
a la zona en el AND en la región que codifica el término carboxilo
del gen SCF. Las amplificaciones de ADN se realizaron utilizando
los cebadores oligonucleótidos 227-29 y
237-19 en la construcción de SCF^{-164} de rata
pCFM1156 y 227-29 y 237-20 en la
construcción de SCF-^{165} de rata pCFM1156.
Este ejemplo se refiere a la expresión en E.
Coli de polipéptidos SCF humano por medio de una secuencia de
ADN que codifica SCF^{-164} humano [Met^{-1}] y SCF^{-183}
humano [Met^{-1}] (Figura 15). Se utilizó SCF^{-162} humano
plásmido V19.8 que contenía el gen de SCF^{-162} humano como
plantilla para la amplificación del gen SCF humano.
Se utilizaron iniciadores de oligonucleótidos
227-29 y 237-19 para generar el ADN
de PCR que se digirió entonces con endonucleasas de restricción
PstI y SstII. Con el fin de proporcionar un codón de iniciación Met
y restaurar los codones para los cuatro primeros residuos de
aminoácidos (Glu8, Gly, Ile, Gys) del polipéptido SCF humano, se
fabricó un ligante oligonucleótido sintético
5' TATGGAAGGTATCTGCA 3'
3' ACCTTCCATAG 5'
con extremos adherentes NdeI y
PstI. El pequeño oligoligante y el fragmento de gen SCF derivado de
PCR se inertaron ligando en el plásmido de expresión pCFM1156
(según lo descrito anteriormente) en las zonas únicas NdeI y SstII
en el plásmido mostrado en la Figura
19.
El plásmido de SCF^{1-164}
humano pCFM1156 se transformó en células huésped E. Coli FM5
competentes. La selección para las células que contenían plásmido
se realizó sobre la base del gen marcador de resistencia
antibiótica (canamicina) transportado en el vector pCFM1156. Se
aisló ADN plásmido de células cultivadas y la secuencia de ADN del
gen SCF humano se confirmó por secuenciación de ADN.
Para construir el SCF^{1-183}
humano plásmido pCFM1156 que codifica el polipéptido de
SCF^{1-183} humano [Met^{-1}] (Figura 15C), se
aisló un fragmento de restricción EcoRI a HindIII que codifica el
término carboxilo del gen de SCF humano, de
SCF^{114-183} humano pCFM (descrito a
continuación), se aisló un fragmento de restricción SstI a EcoRI
que codifica el término amino del gen de SCF humano, de
SCF^{1-164} humano pCFM1156, y se aisló el mayor
fragmento de restricción HindIII a SstI de pCFM1156. Los tres
fragmentos de ADN se ligaron para formar el plásmido
SCF1-183 humano pCFM1156 que se transformó entonces
en células huésped E. Coli FM5. Tras la selección de colonia
utilizando la resistencia al fármaco canamicina, se aisló el ADN
plásmido y se confirmó la secuencia correcta de ADN mediante
secuenciación de ADN. El plásmido SCF^{114-183}
humano pGEM es un derivado de pGEM3 que contiene un fragmento
EcoRI-SphI que incluye nucleótidos 609 a 820 de la
secuencia de cADN de SCF humano mostrada en la Figura 15C. El
inserto EcoRI-SphI en este plásmido se aisló de un
PCR que utilizaba iniciadores u oligonucleóticos
235-1 y 241-6 (Figura 12B) y PCR
22.7 (Figura 13B) como plantilla. La secuencia del iniciador
241-6 se basaba en la secuencia genómina humana
hasta el lateral 3' del exón que contenía el codón para el
aminoácido 176.
Se realizaron fermentaciones para la producción
de SCF^{1-164} en fermentadores de 16 litros
utilizando un huésped K 12 de E. Coli FM5 que contenía el
SCF^{1-164} humano plásmido pCFM1156. Se
mantuvieron stocks del cultivo productor a -80ºC en 17% de glicerol
en caldo Luria. Para la producción de inoculum se
transfirieron 100 \muL del stock de siembra descongelado a 500 mL
de caldo Luria en un matraz Erlenmeyer de 2 L y se cultivó durante
la noche a 30ºC en un agitador giratorio (250 rpm).
Para la producción de pasta de célula de E.
Coli utilizada como material de partida para la purificación de
SCF^{1-164} humano mencionada en este ejemplo, se
utilizaron las siguientes condiciones de fermentación.
El cultivo inoculum se transfirió
asépticamente a un fermentador de 16 L que contenía 8 L de un medio
el lote (véase Cuadro 9). El cultivo se realizó en lotes hasta que
el OD-600 del cultivo fue de aproximadamente 3,5. En
ese momento, se introdujo un alimentador estéril (alimentador 1,
Cuadro 10) en el fermentador utilizando una bomba peristáltica para
controlar la velocidad del alimentador. La velocidad del
alimentador se incrementó exponencialmente con el tiempo para
obtener una tasa de crecimiento de 0,15 hr^{-1}. Se controló la
temperatura a 30ºC durante la fase de crecimiento. La concentración
de oxígeno disuelto en el fermentador se controló automáticamente a
un 50% de saturación utilizando la tasa de flujo de aire, la tasa de
agitación, la tasa de contrapresión y la suplementación de oxígeno
para el control. El pH del fermentador se controló au- tomáticamente
a 7,0 utilizando ácido fosfórico e hidróxido de amonio. A un
OD-600 de aproximadamente 30, se procedió a la fase
de producción de la fermentación aumentando la temperatura del
fermentador hasta 42ºC. Al mismo tiempo, se interrumpió la adición
del alimentador 1 y la adición del alimentador 2 (Cuadro 11) se
inició a un caudal de 200 ml/h. Aproximadamente 6 horas después se
incrementó la temperatura del fermentador, y se enfrió el contenido
del fermentador hasta 15ºC. El rendimiento de
SCF^{1-164} era de a- prox. de 30
mg/OD-L. Se cosechó entonces el granulado celular
por centrifugación en un rotor Beckman J6-B a 3000 x
g durante una hora. La pasta celular cosechada se almacenó
congelada a -70ºC.
Un método preferido para producir
SCF^{1-164} es similar al antes descrito pero con
las siguientes modificaciones.
- (1)
- La adición del alimentador 1 no se inicia hasta que el OD-600 del cultivo alcanza 5-6.
- (2)
- La tasa de adición del alimentador 1 se aumenta más lentamente, lo cual da como resultado una tasa de crecimiento más lenta (aprox. 0,08).
- (3)
- El cultivo se realiza a un OD-600 de 20.
- (4)
- El alimentador 2 se introduce en el fermentador a un caudal de 300 ml/h.
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las demás operaciones son similares al
método descrito anteriormente, inclusive el medio.
Utilizando este proceso, se han obtenido
rendimientos de SCF^{1-164} de aproximadamente
35-40 mg/OD-L a OD=25.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron procedimientos de
radioinmunoensayo (RIA) aplicados a la detección cuantitativa de
SCF en muestras, según lo indicado a continuación.
Se incubó junto con antisuero durante 2 horas a
37ºC un preparado de SCF de células BRL 3A purificadas como en el
ejemplo 1. Después de la incubación de 2 horas, los tubos de muestra
se enfriaron entonces sobre el hielo, se añadió
^{125}I-SCF y los tubos se incubaron a 4ºC durante
por lo menos 20 horas. Cada tubo de ensayo contenía 500 \mul de
mezcla de incubación que consistía en 50 \mul de antisuero
diluido, \sim60.000 cpm de ^{125}I-SCF (3,8 x
10^{7} cpm/\mug), 5 \mul de trasilol y 0-400
\mul de SCF estándar, con tampón salino con tampón de fosfato,
0,1% de albúmina de suero bovino, 0,05% de tritón
X-100, 0,025% de arcilla) que constituyeron el
volumen restante. El antisuero era el sangrado de segunda prueba de
un conejo inmunizado con un preparado puro al 50% de SCF natural de
medio condicionado BRL 3A. La dilución de antisuero final en el
ensayo era de 1:2000.
El ^{125}I-SCF unido al
anticuerpo se precipitó añadiendo 150 \mul de Staph A
(Calbiochem). Tras una hora de incubación a temperatura ambiente,
las muestras se centrifugaron y los granulados se lavaron dos veces
con 0,75 ml 10 mM Tris-HCL pH 8,2 que contenía NaCl
0,15 M. 2 mM EDTA y 0,05% Tritón X-100. Los
granulados lavados se recontaron en un contador gamma para
determinar el porcentaje de ^{125}I-SCF fijado.
Los recuentos fijados por tubos que carecían de suero se
sustrajeron de todos los valores finales con el objeto de corregir
la precipitación no específica. En la Figura 20 se muestra un RIA
típico. El porcentaje de inhibición de fijación
^{125}I-SCF producida por el estándar no rotulado
depende de la dosis (Figura 20A) y, como se indica en la Figura
20B, cuando se examinan los granulados precipitados inmunes por
SDS-PAGE y autorradiografía, la banda de proteína
^{125}I-SCF es concurrida. En la Figura 20B, la
vía 1 es ^{125}I-SCF y las vías 2, 3, 4 y 5 son
^{125}I-SCF inmunoprecipitado concurrido con 0,2,
100 y 200 ng de estándar SCF, respectivamente. Según lo determinado
por la reducción de cpm precipitable de anticuerpo observada en los
tubos RIA y la reducción en la banda proteínica
^{125}I-SCF inmunoprecipitado (que migra a aprox.
M_{r} 31.000, el antisuero poliglonal reconoce el estándar SCF que
se purificó como en el Ej. 1.
Se aplicaron también procedimientos Western para
detectar SCF recombinante expresado en células de E. coli,
COS-1 y CHO. Se sometieron a
SDS-PAGE^{1-193} de rata expresada
en E. Coli parcialmente purificada (Ej. 10),
^{1-162} de rata expresada en célula
COS-1 y SCF^{1-193} así como
SCF^{1-162} humano (Ejs. 4 y 5), y
SCF^{1-162} de rata expresada en célula CHO (Ej.
5). Tras la electroforesis, se transfirieron las bandas proteínicas
a 0,2 \mum de nitrocelulosa utilizando un aparato
Bio-Rad Transblot a 60 V durante 5 horas. Los
filtros de nitrocelulosa se bloquearon durante 4 horas en PBS, pH
7,6, que contenía 10% de suero de cabra seguido de incubación a
temperatura ambiente durante 14 horas con una dilución 1:200 de
suero preinmune o inmune de conejo (inmunización descrita arriba).
Los complejos de antisuero anticuerpo se visualizaron utilizando
reactivos IgG anti-conejo cabra
conjugada-peroxidasa rábano picante (Vector
laboratories) y reactivo de desarrollo de color
4-cloro-1-naftol.
En las Figuras 21 y 22 se presentan ejemplos de
dos análisis Western. En la Figura 21, las vías 3 y 5 son 200
\mul de SCF^{1-162} humano producido de célula
COS-1; las vías 1 y 7 son 200 \mul de EPO humano
producido por células COS-1 (células
COS-1 transfectadas con V19.8 EPO); y la vía 8 son
marcadores de peso molecular preteñidos. Las vías
1-4 se incubaron con suero preinmune y las vías
5-8 se incubaron con suero inmune. El suero inmune
reconoce específicamente una banda difusa con 1 M_{r} aparente de
30.000 daltons de SCF^{1-162} humano que produce
células COS-1 pero no de EPO humano que produce
células COS-1.
En los Western mostrados en la Figura 22, las
vías 1 y 7 son 1 \mug de un preparado parcialmente purificado de
SCF^{1-193} de rata producido en E. Coli;
las vías 2 y 8 son SCF^{1-193} de rata producido
por célula COS-1 purificada en
aglutinina-agarosa germen de trigo; las vías 4 y 9
son SCF^{1-162} de rata producido por célula
COS-1 purificada por
aglutinina-agarosa germen de trigo; las vías 5 y 10
son SCF^{1-162} de rata producido por célula CHO
purificada en aglutinina-agarosa germen de trigo; y
la vía 6 son marcadores de peso molecular preteñidos. Las vías
1-5 y las vías 6-10 se incubaron con
suero preinmune e inmune de conejo, respectivamente. El
SCF1-193 de rata producido por E. Coli (vías
1 y 7) migra con 1 M_{r} aparente de \sim24.000 daltons mientras
que el SCF^{1-193} producido por célula
COS-1 (vías 2 y 8) migra con 1 M_{r} aparente de
24-36.000 daltons. Esta diferencia en pesos
moleculares es la esperada ya que las células de mamífero, aunque
no las bacterias, son capaces de glicosilación. La transfección de
la secuencia que codifica SCF^{1-162} de rata en
COS-1 (vías 4 y 9) o células CHO (vías 5 y 10), da
como resultado la expresión de SCF con un peso molecular medio
inferior al producido con la transfección con
SCF^{1-193} (vías 2 y 8).
Los productos de producción de
SCF^{1-162} de rata de células
COS-1 y CHO son una serie de bandas cuyo M_{r}
aparente oscila entre 24.000 y 36.000 daltons. La heterogeneidad
del SCF expresado es probablemente debida a variantes de
carbohidrato, donde el polipéptido SCF es glicosilado en medidas
diferentes.
En resumen, los análisis Western indican que el
suero inmune de conejos inmunizados con SCF de mamífero natural
reconocen el SCF recombinante producido en células de E.
coli, COS-1 y CHO pero no reconoce ninguna banda
en una muestra de control constituida por EPO producido por célula
COS-1. Como soporte adicional a la especificidad del
antisuero SCF, el suero preinmune del mismo conejo no reaccionó con
ninguno de los productos de expresión de SCF de rata o humano.
Se transfectaron células COS-1
con V19.8 SCF^{1-162} en un experimento a gran
escala (matraces T175 cm^{2} en lugar de recipientes de 60 mm),
descrito en el ejemplo 4. Se cosechó aproximadamente 270 ml de
sobrenadante. Este sobrenadante se cromatografió sobre
aglutinina-agarosa de germen de trigo y
S-sefarosa esencialmente en la forma descrita en el
Ej. 1. El SCF recombinante se evaluó en un modelo de transplante de
médula ósea basado en genética de murino W/W^{v}. El ratón
W/W^{v} tiene un defecto de célula madre que entre otras
características tiene como resultado una anemia macrocitica
(glóbulos rojos grandes) y permite el transplante de médula ósea de
animales normales sin necesidad de radiación del animal receptor
[Russel, y colaboradores, Science, 144,
844-846 (1964)]. Las células madre del donador
crecen más que las células defectuosas del receptor después del
transplante. En el siguiente ejemplo, cada grupo contenía 6 ratones
emparejados por edad. Se cosechó médula ósea de ratones donadores
normales y se transplantó a ratones W/W^{v}. El perfil sanguíneo
de los animales receptores se controla en varios momentos
posteriores al transplante y el injerto de la médula del donador se
determina por el desplazamiento de los glóbulos sanguíneos
periféricos del fenotipo del receptor al donador. La conversión del
fenotipo del receptor al donador se detecta siguiendo y controlando
el perfil de dispersión hacia delante (FASCAN, Becton Dickenson) de
los glóbulos rojos. El perfil de cada animal transplantado se
comparó con el de animales de control no transplantados, donador y
receptor, en cada momento. La comparación se realizó utilizando un
programa informático basado en la estadística
Kolmogorov-Smirnov para el análisis de histogramas
de sistemas de flujo [Young, J. Histochem. And Cytochem.,
25, 935-941 (1977)]. Un indicador cualitativo
independiente de injerto es el tipo de hemoglobina detectado por
electroforesis de la hemoglobina dela sangre del receptor [Wong, y
colaboradores, Mol. And Cell. Biol., 9,
798-808 (1989)] y concuerda bien con las
determinaciones de la estadística de
Kolmogorov-Smirnov.
Aproximadamente 3 x 10^{5} células se
transplantaron sin tratamiento SCF (grupo de control en la Figura
23) de donadores C56BL/6J a receptores W/W^{v}. Un segundo grupo
recibió 3 x 10^{5} células de donador que habían sido tratadas
con SCF (600 U/ml) a 37ºC durante 20 minutos y se habían inyectado
juntas (grupo pretratado en la Figura 23). (Una unidad de SCF se
define como la cantidad que resulta en la estimulación
semi-máxima del bioensayo MC/9). En un tercer grupo,
los ratones receptores se inyectaron por vía subcutánea
(sub-Q) con aproximadamente 400 U SCF/día durante 3
días después del transplante de 3 x 10^{5} células de donador
(grupo de inyección sub-Q en la Figura 23. Como se
indica en la Figura 23,en ambos grupos tratados con SCF, la médula
del donador se injerta más rápidamente que en el grupo de control
no tratado. A los 29 días posteriores al transplante, el grupo
pretratado con SCF había convertido el fenotipo del donador. Este
ejemplo ilustra la utilidad de la terapia SCF en el transplante de
médula ósea.
Las mutaciones en el locus S1 causan
deficiencias en células hematopoyéticas, células de pigmento y de
germen. El defecto hematopoyético se manifiesta como números
reducidos de glóbulos rojos [Russell, In: Al Gordon, Regulation
of Hematopoyesis, Vol, I, 649-675
Appleton-Century-Crafts, New York
(1970)], neutrófilos [Ruscetti, Prod. Soc. Exp. Biol. Med.,
152, 398 (1976), monocitos [Shibata, J. Immunol, 135,
3905 (1985)], megacariocitos [Ebbe, Exp. Hematol., 6,
201 (1978)], linfocitos citolíticos naturales [(Clark,
Immunogenetics, 12, 601 (1981)] y mastocitos [Hayashi,
Dev. Biol., 109, 234 (1985)]. Los ratones Steel son
pobres receptores de un transplante de médula ósea debido a su
reducida aptitud para soportar células madre [Bannerman, Prog.
Hematol. 8, 131 (1973)]. El gen que codifica este SCF se
suprime en los ratones Steel (S1/S1).
Los ratones Steel proporcionan un modelo in
vivo sensible para la actividad SCF. Se probaron diversas
proteínas SCF recombinante en ratones Steel-Dickie
(S1/S1^{d}) durante períodos de tiempo de longitud variable. Se
compraron en Jackson Labs, Bar Harbor, ME ratones Steel de 6 a 10
semanas de edad (WCB6F1-S^{1}/S1^{d}). Se
controló y siguió la sangre periférica con un contador microcelular
SYSMEX F-800 (Baxter, Irvine, CA) de glóbulos rojos,
hemoglobina y plaquetas. Para contar el número de glóbulos blancos
periféricos (WBC) se utilizó un Coulter Channelyzer 256 (Coulter
Electronics, Marieta, GA).
En el experimento de la Figura 24, se trataron
ratones Steel-Dickie con SCF 1-164
derivado de E. Coli purificado como en el Ejemplo 10, a una
dosis de 100 \mug/kg/día durante 30 días, y luego a una dosis de
30 \mug/kg/día durante 20 días más. La proteína se formuló en
suero de bovino fetal + 0,1% salino inyectable (Abbott Labs, North
Chicago, IL). Las inyecciones se realizaron diariamente, por vía
subcutánea. La sangre periférica se controló y siguió por medio de
sangrados de cola de -50 \mul en los tiempos indicados en la
Figura 24. La sangre se recogió en jeringas revestidas de EDTA 3% y
se dispensó en tubos micrófugos de EDTA en polvo (Brinkmann,
Westbury, NY). Existe una notable corrección de la anemia
macrocítica en los animales tratados con respecto a los animales de
control. Al finalizar el tratamiento, los animales tratados vuelven
al estado inicial de anemia macrocítica.
En el experimento mostrado en las Figuras 25 y
26, se trataron ratones Steel-Dickie con formas
recombinantes diferentes de SCF, según lo descrito anteriormente,
aunque a una dosis de 100 \mug/kg/día durante 20 días. Tal como
se describe en el Ej. 10, se produjeron dos formas de SDF de rata,
SCF^{1-164} y SCF^{1-193}
derivado de E. Coli. Además también se comprobó
SDF^{1-164} de E. Coli modificado por la
adición de polietilenglicol (SDF^{1-164} PEG25),
como en el Ej. 12. También se sometió a prueba
SDF^{1-162} derivado de CHO producido como en el
Ej. 5 y purificado como en el Ej. 11. Los animales se sangraron
mediante punción cardíaca con jeringas recubiertas de EDTA 3% y se
dispensaron en tubos con polvo EDTA. Los perfiles de sangre
periférica después de 20 días de tratamiento se muestran en la
Figura 25 para los glóbulos blancos (WBC) y en la Figura 26 para las
plaquetas. Los diferenciales de WBC para el grupo
SDF^{1-164} PEG25 se muestra en la Figura 27.
Existen incrementos absolutos en neutrófilos, monocitos, linfocitos
y plaquetas. El efecto más espectacular se puede apreciar con
SDF^{1-164} PEG25.
También se realizó una medida independiente de
subconjuntos de linfocitos y los datos se muestran en la Figura 28.
El equivalente murino de CD4 humano, o marcador de linfocitos T
cooperadores es L3T4 [Dialynas, J. Immunol., 131,
2445 (1983)]. LyT-2 es un murino sobre células T
citotóxico [Ledbetter, J. Exp. Med., 153 1503 (1981)].
Se utilizaron anticuerpos monoclonales contra estos antígenos para
evaluar su subconjuntos de linfocitos T en los animales tratados. Se
tiñó sangre completa para subconjuntos de linfocitos T de la
siguiente forma.
Se extrajeron doscientos microlitos de sangre
completa de animales individuales en tubos tratados con EDTA. Cada
muestra de sangre se lisó con agua desionizada estéril durante 60
segundos y luego se hizo isotónica con salino con tampón de fosfato
l0X Dulbecco (PBS) (Gibco, Grand Island, NY). Esta sangre lisada se
lavó dos veces con 1X PBS (Gico, Grand Island, NY) suplementada con
0,1% de suero bovino fetal (Flow Laboratory, McLean, VA) y 0,1% de
azida sódica. Cada muestra de sangre se depositó en recipientes
agrupados de 96 pocillos de fondo redondo y se centrífugo. Se
volvió a suspender el granulado celular (que contenía
2-10 x 10^{5} células) con 20 microlitros de L3T4
anti-ratón de rata conjugado con ficoeritrina (PE)
(Becton Dickinson, Mountain View, CA), y 20 microlitros de
Lyt-2 anti-ratón de rata conjugado
con isotiocianato de fluoresceína incubado sobre hielo (4ºC)
durante 30 minutos (Becton Dickinson). Tras la incubación, las
células se lavaron dos veces en 1X PBS suplementado en la forma
indicada anteriormente. Cada muestra de sangre se analizó entonces
sobre un sistema de análisis celular FACSan (Becton Dickinson,
Mountain View, CA). Este sistema se estandarizó utilizando
procedimientos de autocompensación estándar y Perlas de Calibrita
(Becton Dickinson, Mountain View, CA). Estos datos indicaban un
increpento absoluto tanto en las poblaciones de linfocitos T
cooperantes como en los números de linfocitos T citotóxicos.
Se comprobó la actividad biológica in
vivo en primates normales de SCF 1-164 humano
expresado en E. Coli (Ej. 6B) y se purificó hasta la
homogeneidad como en el Ej. 10. Se estudiaron en tres grupos
babuinos machos adultos (Papio sp.): sin tratar, n = 3; SCF
100 \mug/kg/día, n = 6; y SCF 30 \mug/kg/día, n = 6. Los
animales tratados recibieron inyecciones subcutáneas diarias de SCF.
Se obtuvieron muestras de sangre de los animales bajo restricción
de cetamina. Se obtuvieron muestras del recuento de sangre
completa, recuento de reticulocitos y recuento de plaquetas los días
1, 6, 11, 15, 20 y 25 de tratamiento.
Todos los animales sobrevivieron al protocolo y
no tuvieron ninguna reacción adversa a la terapia con SCF. El
recuento de glóbulos blancos aumentó en los animales tratados con
100 \mug/kg tal como se indica en la Figura 29. El recuento
diferencial, obtenido manualmente a partir de manchas de sangre
periféricas teñidas Wright Giemsa, también se indica en la Figura
29. Se vio un aumento absoluto de neutrófilos, linfocitos y
monocitos. Tal como se indica en la Figura 30 también hubo un
incremento en la dosis de 100 \mug/kg tanto de los hematocrito
como de las plaquetas.
El SCF humano (hSCF^{1-164}
modificado por la adición de polietilenglicol como en el Ej. 12)
también se comprobó en babuinos normales, a una dosis de 200
\mug/kg-día, administrada por infusión intravenosa
continua y se comparó con la proteína no modificada. Los animales
comenzaron con SCF el día 0 y se trataron durante 28 días. Los
resultados de los glóbulos blancos periféricos se dan en el Cuadro
siguiente. El SCF modificado por PEG provocaron un aumento más
temprano en los glóbulos blancos periféricos que el SCF no
modificado.
\vskip1.000000\baselineskip
El cADN de SCF humano correspondiente a los
aminoácidos 1-162 obtenido por reacciones PCR
mostradas en el Ej. 3D, se expresó en células COS-1
tal como se describe para el SCF de rata en el Ej. 4. Se ensayaron
sobrenadantes de COS-1 sobre médula ósea humano así
como en los ensayos de HPP-CFC de murino y MC/9. La
proteína humana no era activa en las concentraciones sometidas a
prueba en los ensayos de murino; sin embargo era activa sobre la
médula ósea humana. Las condiciones de cultivo del ensayo fueron
las siguientes: se centrífugo médula ósea humana de voluntarios
sanos sobre gradientes Ficoll-Hypaque (Pharmacia) y
se cultivó en 2,1% de metil celulosa, 30% de suero de ternera
fetal, 6 x 10^{-5} M 2-mercaptoetanol, 2 mM
glutamina, medio ISCOVE (GIBCO), 20 U/ml EP, y 1 x 10^{5}
células/ml durante 14 días en atmósfera humedecía que contenía 7%
O_{2}, 10% CO_{2} y 83% N_{2}. Los números de colonias
generadas con sobrenadantes de COS-1 de SCF humano y
de rata recombinante se indican en el Cuadro 12. Únicamente se
indican las colonias que tienen un tamaño igual a 0,2 mm o
mayor.
Las colonias que crecieron durante el período de
14 días se muestran en la Figura 31A (ampliación 12x). La flecha
indica una colonia típica. Las colonias se parecían a las colonias
HPP-CFC de murino por su gran tamaño (media 0,5
mm). Debido Las a la presencia de EPO, algunas de las colonias se
hemoglobinizaron. Cuando las colonias se aislaron y centrifugaron
sobre portaobjetos de cristal utilizando un Cytospin (Shandon)
seguido de teñido con Wright-Giemsa, el tipo celular
predominante era una célula indiferenciada con una relación núcleo:
citoplasma grande, tal como se muestra en la Figura 31B (ampliación
400x). Las flechas de la Figura 31B apuntan a las estructuras
siguientes: flecha 1, citoplasma; flecha 3, núcleo, flecha 3,
vacuolas. Las células inmaduras como clase son grandes y las
células se van haciendo progresivamente más pequeñas al madurar
[Diggs y colaboradores, The Morphology of Human Blood Cells,
Abbott Labs, 3, (1978)]. Los núcleos de células tempranas de
la secuencia de maduración hematopoyética son relativamente grandes
en relación con el citoplasma. Además, el citoplasma de células
inmaduras se tiñen con un color más oscuro con
Wright-Giemsa que lo hace el núcleo. Al madurar las
células, el núcleo se tiñe de color más oscuro que el citoplasma.
La morfología de las células de médula ósea humana resultantes de
cultivo con SCF humano recombinante se corresponde con la conclusión
de que el productoblanco e inmediato de la acción de SCF es un
progenitor hematopoyético relativamente inmadura.
Se sometió a prueba SCF humano recombinante en
ensayos de colonia agar sobre médula ósea humana en combinación con
otros grupos de crecimiento como los descritos anteriormente. Los
resultados se muestran en el Cuadro 13. SCF establece sinergia con
G-CSF, GM-CSF, IL-3
y EPO para incrementar la proliferación de blancos de médula ósea
para los SCFs individuales.
Otra actividad del SCF humano recombinante es la
capacidad de causar proliferación en agar blando de la línea
celular de leucemia mielógena aguda humana (AML),
KG-1 (ATCC CCL 246). Se sometieron a prueba
sobrenadantes de COS 1 de células transfectadas en un ensayo de
clonación agar KG-1 [Koeffler y colaboradores,
Science, 200, 11553-11554 (1978),
esencialmente como se describió con la diferencia que las células
se cultivaron a 3000/ml. El Cuadro 14 muestra los datos
correspondientes a los cultivos triplicados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó la fermentación de
SCF^{1-164} humano de E. Coli con según el
Ej. 6C. Las células cosechadas (912 g de peso húmedo) se
suspendieron en agua hasta un volumen de 4,6 L y se rompieron en
tres pasadas a través de un homogenizador de laboratorio (Gaulin
Modelo 15MR-8TBA) a 8000 psi. Se obtuvo una fracción
de granulado de célula rota por centrifugación (17700 x g, 30
minutos, 4ºC), se lavó una vez con agua (resuspensión y
recentrifugación), y finalmente se suspendió en agua hasta un
volumen de 400 ml.
\newpage
La fracción de granulado que contenía SCF
insoluble (estimación de 10-12 g SCF) se añadió a
3950 ml de una mezcla adecuada de tal forma que las concentraciones
finales de los componentes de las mezclas fueron de 8 M urea (grado
ultrapuro), 0,1 mM EDTA de plasma, 50 mM acetato sódico, pH
6-7; la concentración de SCF se estimó en 1,5 mg/ml.
Se realizó la incubación a temperatura amiente durante 4 horas
para solubilizar el SCF. El material insoluble restante se eliminó
por centrifugación (17700 x 5, 30 minutos, temperatura ambiente).
Para la renaturalización/reoxidación del SCF solubilizado, se
añadió lentamente la fracción de sobrenadante, agitando, hasta
alcanzar 39,15 L de una mezcla adecuada de tal forma que las
concentraciones finales de componentes en la mezcla fueran de 2,5 M
urea (calidad ultrapura), 0,01 mM EDTA, 5 mM acetato sódico, 50 mM
Tris-HCI pH 8,5, 1 mM glutationa, 0,02%
(peso/volumen), de azida sódica. La concentración de SCF se estimó
en 150 \mug/ml. Después de 60 horas a temperatura ambiente
[también pueden utilizarse tiempos más cortos (p. ej. 20 horas)] y
agitando, la mezcla se concentró dos veces utilizando un dispositivo
de ultrafiltración Millipore Pellicon con tres cassettes de membrana
polisulfona cutoff de peso molecular 10.000 (área total de 15
pies^{2}) y luego se diafiltró con 7 volúmenes de 20 mM
Tris-HCl, pH 8. La temperatura durante la
concentración/ultrafiltración fue de 4ºC, la tasa de bombeo fue de
5 L/min. y la tasa de filtración fue de 500 ml/min. El volumen
final de "retentate" recuperado fue de 26,5 L. Utilizando
SDS-PAGE realizado con y sin reducción de muestras,
es evidente que la mayoría (más de 80%) del SCF de la fracción
granulada se solubiliza con la incubación con urea 8 M, y que
después del plegamiento (naturalización)/oxidación están presentes
múltiples especies (formas) de SCF, como se puede ver en el
SCF-PAGE de muestras no reducidas. La forma
principal que representa SCF oxidado correctamente (ver más abajo),
migra con M_{r} aparente de aprox. 18-10.000 (no
reducido) respecto de los marcadores de peso molecular (reducido)
descritos para la Figura 9. Otras formas comprenden material que
migra con M_{r} aparente de aprox. 18-20.000 (no
reducido), que se piensa representa SCF con enlaces de disulfuro
intracadena incorrectos; y bandas que migran con M_{r} aparente
de aproximadamente 37.000 (no reducido) o mayor que se piensa
representan varias formas de SCF que tienen enlaces de disulfuro
intercadena que dan como resultados cadenas polipeptídicas de SCF
unidas por enlace covalente para formar dímeros u oligómeros más
grandes, respectivamente. Las siguientes etapas de fraccionamiento
se traducen en eliminar los contaminantes E. Coli restantes
y las formas de SCF no deseadas, de tal modo que se obtiene SCF
purificado hasta homogeneidad aparente, en conformación
biológicamente activa.
El pH del "retentate" de ultrafiltración se
ajustó a 4,5 añadiendo 375 ml de ácido acético 10% (vol/vol), lo
cual conduce a la presencia de material precipitado visible. A los
60 minutos, momento en el cual gran parte del material precipitado
se había depositado en la parte inferior del recipiente, se
decantaron los 24 litros superiores y se filtraron a través de un
filtro de profundidad Cuno^{TM} 30 SP a 500 ml/min para completar
la clarificación. El filtrado se diluyó entonces 1,5 veces con agua
y se aplicó a -4ºC a una columna S-Sepharose Fast
Flow (Pharmacia) (9 x 18,5 cm) se equilibró en 25 mM de acetato
sódico, pH 4, 5. La columna funcionó a un caudal de 5 L/h, a 4ºC.
Después de la aplicación de la muestra, se lavó la columna con
cinco volúmenes de columna (\sim6 L) de tampón de columna y
material SCF, que se había fijado en la columna, se eluyó con un
gradiente de 0 a 0,35 M NaCl en tampón de columna. El volumen de
gradiente total fue de 20 L y se recogieron fracciones de 200 ml. El
perfil de elución se muestra en la Figura 33. Unas porciones (10
\mul) de fracciones recogidas de la columna
S-Sefarosa se analizaron por
SDS-PAGE realizado con (Figura 32A) y sin (Figura
32 B) reducción de las muestras. A partir de estos análisis se
puede ver que prácticamente toda la absorbancia a 280 nm (Figuras
32 y 33) se debe a material SCF.
La forma oxidada correctamente predomina en el
pico de mayor absorbancia (fracciones 22-38, Figura
33). Las especies (formas) menores que se pueden visualizar en
fracciones incluyen el material oxidado incorrectamente con M_{r}
aparente de 18-20.000 en SCF-PAGE
(no reducido), presente en el borde inicial del principal pico de
absorbancia (fracciones 10-21, Figura 32B); y
material dímero con enlace a disulfuro presente en toda la región
de absorbancia (fracciones 10-38, Figura 32B).
Se reunieron fracciones 22-38 de
la columna S-Sefarosa y el grupo se ajustó a un pH
de 2,2 añadiendo aprox. 11 ml de HCl 5 N y se aplicó a una columna
Vydac C_{4} (altura 8,4 cm, diámetro 9 cm) equilibrada con 50%
(vol/vol) de etanol, 12,5 mM HCl (solución A) y que funcionaba a
4ºC. La resina de la columna se preparó suspendiendo la resina seca
en 80% (vol/vol) de etanol, 12,5 mM HCl (solución B) y luego
equilibrando con solución A. Antes de la aplicación de la muestra,
se aplicó un gradiente liso (blank) de la solución A a la solución
B (6 L de volumen total) y la columna se reequilibró entonces con
solución A. Después de la aplicación de la muestra, se lavó la
columna con 2,5 L de solución A y se eluyó material SCF, ligado a
la columna, con un gradiente de la solución A a la solución B (18 L
de volumen total) a un caudal de 2670 ml/h. Se recogieron 286
fracciones de 50 ml cada una y se analizaron porciones por
absorbancia a 280 nm (Figura 35), y mediante
SCF-PAGE (25 \mul por fracción) según lo antes
descrito (Figura 34 A, condiciones de reducción; Figura 34 B,
condiciones de no reducción).Se reunieron fracciones
62-161, que contenían SCF oxidado correctamente en
estado altamente purificado [las cantidades relativamente pequeñas
de monómero oxidado incorrectamente con M_{r} de aprox.
18-20.000 (no reducido) se eluyeron posteriormente
en el gradiente (fracciones aprox. 166-211) y se
eluyó también posteriormente un material dímero unido a disulfuro
(aprox. fracciones 199-235) (35)].
Para quitar el etanol del conjunto de fracciones
62-161 y concentrar el SCF se recurrió al siguiente
procedimiento que utiliza resina cambiadora de iones
Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia). El grupo (5 L) se
diluyó con agua hasta un volumen de 15.625 L, llevando la
concentración de etanol a aprox. 20% (vol/vol). Seguidamente se
añadió Tris base 1 M (135 ml) para llevar el pH a 8, seguido de un
Tris-HCl, pH 8, (23,6 ml) para llevar la
concentración total de Tris a 10 mm. A continuación se añadieron 10
mM Tris-HCl, pH 8 (\sim15,5 L) para llevar el
volumen total a 31,25 litros y la concentración de etanol a aprox.
10% (vol/vol). Se aplicó entonces el material a 4ºC a una columna
de Q-Sefarosa Fast Flow(altura 6,5 cm,
diámetro 7 cm) equilibrada con 10 mM Tris-HCl, pH 8
seguido de lavado de la columna con 2,5 L de tampón de columna. El
caudal durante la muestra y el lavado fue de aprox. 5,5 L/h. Para
eluir el SCF fijado se bombearon 200 mM NaCl, 10 mM
Tris-HCl, ph 8 en sentido inverso a través de la
columna a aprox. 200 ml/h. Se recogieron fracciones de aprox. 12 ml
y se analizaron por absorbancia 280 nM y SDS-PAGE,
como arriba. Se reunieron las fracciones 16-28 (157
ml).
El grupo que contenía SCF se aplicó entonces en
dos pasadas cromatográficas separadas (78,5 ml aplicado a cada
una) a una columna de filtración de gel Sephacryl
Se-200 HR (Pharmacia) (5 x 138 cm) equilibrado con
salino con tampón de fosfato a 4ºC. Se recogieron fracciones de
aprox. 15 ml a un caudal aproximadamente 75 ml/h. En cada caso, un
pico importante de material con absorbancia a 280 nm eluyó en
fracciones que corresponden grosso modo al volumen de elución de
1370 a 1635 ml. Las fracciones que representan los picos de
absorbancia de las dos pasadas de columna se combinaron en un solo
conjunto de 525 ml, que contenía aprox. 2,3 g de SCF. Este material
se esterilizó por filtración utilizando un cartucho de membrana
Millipore Millipak 20.
Alternativamente, se puede concentrar material
de la columna C_{4} por ultrafiltración e intercambiar el tampón
por diafiltración, antes de la filtración estéril.
El material SCF^{1-164} humano
recombinante aislado es de alta pureza (>98% por
SDS-PAGE con teñido de plata) y se considera que
tiene calidad farmacéutica. Utilizando los métodos indicados en el
ejemplo 2, se ha comprobado que el material tiene composición de
aminoácidos que se corresponde con la esperada del análisis del gen
de SCF, y tiene una secuencia de aminoácidos
N-terminal
Met-Glu-Gly-Ile...,
según lo esperado, con la retención del Met codificado por el codón
de iniciación.
Con procedimientos comparables con los
mencionados para SCF^{1-164} humano expresado en
E. Coli, se puede recuperar SCF^{1-164} de
rata (también presente en forma insoluble en el interior de la
célula tras la fermentación) en un estado purificado con actividad
específica altamente biológica. Similarmente, se puede recuperar
SCF^{1-183} humano y SCF^{1-193}
de rata. El SCF^{1-193} de rata, durante la
naturalización/oxidación tiende a formar más especies oxidadas de
forma diferente, y las especies no deseadas resultan más difíciles
de eliminar cromatográficamente.
El SCF^{1-193} de rata y el
SCF^{1-183} humano tienen tendencia a la
degradación proteolítica durante las etapas iniciales de
recuperación, solubilización y naturalización/oxidación. Una zona
principal de proteólisis se encuentra situada entre los residuos 160
y 170. La proteólisis se puede minimizar manipulando adecuadamente
las condiciones (p. ej. concentración de SCF; variando el pH,
inclusión de EDTA a 2-5 mM, u otros inhibidores de
proteasa) y formas degradadas hasta el extremo de que se encuentran
presentes se pueden eliminar por etapas de fraccionamiento
adecuada.
Aunque la utilización de la urea para la
solubilización y durante la naturalización/oxidación, según lo
indicado es una realización preferida se pueden utilizar de forma
eficaz otros agentes de solubilización como
guanidina-HCl (p. ej. 6 M durante la solubilización
y 1,25 M durante la naturalización/oxidación) y sodio
N-lauroil sarcosina. Después de eliminar los agentes
tras la naturalización/oxidación, se pueden recuperar SCFs
purificado, según lo determinado por SDS-PAGE,
utilizando etapas de fraccionamiento adecuadas.
Además, si bien el uso de glutationa a 1 mM
durante la naturalización/oxidación es una realización preferida,
se pueden utilizar otras condiciones con eficacia igual o casi
igual. Estas incluyen, p. ej., la utilización en lugar de 1 mM
glutationa de 2 mM glutationa más 0,2 mM glutationa oxidada o 4 mM
glutationa más 0,4 mM glutationa oxidada, ó 1 mM
2-mercaptoetanol u otros reactivos tiol también.
Además de los procedimientos cromatográficos
descritos, otros procedimientos que resultan útiles en la
recuperación de SCFs en forma activa purificada pueden ser la
cromatografía de interacción hidrofóbica [p. ej. la utilización de
fenil-Sefarosa (Pharmacia), aplicando la muestra a
un pH neutro en presencia de 1,7 M de sulfato de amonio y eluyendo
con un gradiente de sulfato de amonio decreciente]; cromatografía
por afinidad de metal inmovilizado [p. ej. la utilización de
queratina-Sefarosa (Pharmacia) cargada con ion
Cu^{2+} aplicando la muestra a un pH casi nuestro en presencia de
un 1 mM de imidazol eluyendo con un gradiente de imidazol
creciente], cromatografía de hidroxilapatita [aplicando la muestra a
un pH neutro en presencia de 1 mM de fosfato y eluyendo con un
gradiente de fosfato creciente]; y otros procedimientos conocidos
por los expertos en la materia.
Otras formas de SCF humano, correspondientes a
la totalidad o parte del marco de lectura abierto que codifica por
aminoácidos 1-248 en la figura 42, o
correspondientes al marco de lectura abierto codificado por mARNs
cortados y empalmados alternativamente que pueden existir (como los
representados por la secuencia cADN de la figura 44) se pueden
expresar también en E. coli y recuperarse en forma purificada
mediante procedimientos similares a los descritos en este ejemplo, o
mediante otros procedimientos conocidos por los expertos en la
materia.
La purificación y formulación de formas que
incluyen la denominada región transmembrana referida en el ejemplo
16 puede comprender la utilización de detergentes, inclusive
detergentes no iónicos, y lípidos, inclusive estructuras de
liposomas que contienen fosfolípidos.
Se cultivaron células de ovario de hámster chino
recombinante (CHO) (cepa CHO pDSR\alpha2
hSCF^{1-162}) sobre microportadores en un sistema
de cultivo por perfusión de 20 litros para la producción de
SCF^{1-162} humano. El sistema fermentador es
similar al utilizado para el cultivo de células BRL 3A, Ej. 1B, con
las siguientes diferencias: el medio de crecimiento utilizado para
el cultivo de células CHO era una mezcla de Dulbecco's (DMEM) y
mezcla de nutriente Ham'2 F-12 en una proporción de
1:1 (GIBCO), suplementado con 2 mM de glutamina, aminoácidos no
esenciales (para duplicar la concentración existente utilizando
dilución 1:100 de Gibco nº 320-1140) y 5 de suero
bovino fetal. El medio de cosecha era idéntico con la diferencia de
la omisión de suero. El reactor se inoculó con 5,6 x 10^{9}
células CHO cultivadas en dos matraces giratorios de 3 litros. Se
dejó que las células crecieran hasta una concentración de 4 x
10^{5} células/ml. En ese punto se añadieron 100 g de
microportadores citodex-2
pre-esterilizados (Pharmacia) al reactor en forma
de suspensión de 3 litros en salino con tampón de fosfato. Se dejó
que las células se fijarán y crecieran sobre los microportadores
durante 4 días. Se procedió a la perfusión del medio de crecimiento
a través del reactor según lo necesario en virtud del consumo de
glucosa. La concentración de glucosa se mantuvo a aprox. 2,0 g/L.
Después de cuatro días, se procedió a la perfusión del reactor con
6 volúmenes de medio sin suero para eliminar la mayor parte del
suero (concentración de proteínas <50 \mug/ml). El reactor se
hizo funcionar entonces por lotes hasta que la concentración de
glucosa cayó por debajo de 2 g/L. A partir de este punto, el
reactor trabajó a una velocidad de perfusión continua de aprox. 20
litros/día. Se mantuvo el pH del cultivo en 6,9 \pm 0,3 ajustando
el caudal de CO_{2}. El oxígeno disuelto se mantuvo por encima del
20% de saturación de aire suplementando con oxígeno puro en la
medida de lo necesario. La temperatura se mantuvo en 37 \pm
0,5ºC.
Se generaron aprox. 450 litros de medio
condicionado libre de suero a partir del sistema antes citado, que
se utilizó como material de partida para la purificación de
SCF^{1-162} humano recombinante.
También se generaron aprox. 589 litros de medio
condicionado sin suero de forma similar aunque utilizando la cepa
CHO pDSR\alpha2 rSCF^{1-162} que se utilizó
como material de partida para la purificación de
SCF^{1-162} de rata.
Todo el trabajo de purificación se realizó a 4ºC
a no ser que se indique otra cosa.
Se aclaró por filtración a través de 0,45
\alpha sartocápsulas (Sartorius) medio condicionado generado por
crecimiento sin suero de SCF^{1-162} de rata de
cepa de célula CHO pDSR\alpha2, en la forma realizada en la
sección A anterior. Se sometieron por separado a concentración e
intercambio de diafiltración/tampón varios lotes diferentes (36 L,
101 L, 102 L, 200 L y 150 L). La manipulación del lote 36 L fue la
siguiente. El medio de condición filtrado se concentró a \sim500
ml utilizando un equipo de ultrafiltración de flujo tangencial
Millipore Pellicom con tres casetes de membrana de acetato de
celulosa cutoff de peso molecular 10.000 (15 pies cuadrados de área
total de membrana; tasa de bombeo \sim2.200 ml/min y tasa de
filtración -750 ml/min). Se realizó entonces el intercambio
diafiltración/tampón como preparación para la cromatografía de
intercambio de aniones añadiendo 100 ml de 10 mM
Tris-HCl, pH 6,7-6,8 al concentrado,
reconcentrando hasta 500 ml utilizando el equipo de ultrafitración
de flujo tangencial y repitiendo esta operación otras 5 veces. El
preparado concentrado/diafiltrado se recuperó finalmente en un
volumen de 120 ml. El comportamiento de todos los medios
condicionados sometidos a intercambio de diafiltración/tampón fue
similar. Las concentraciones de proteína para los lotes determinados
para el método de Bradford [Anal. Bioch. 72,
248-254 (1976)] con albúmina de suero bovina como
standard, oscilaron entre 70-90 \mug/ml. El
volumen total de medio condicionado utilizado para este preparado
fue de aproximadamente 589 L.
Los preparados concentrados/diafiltrados de cada
uno de los 5 lotes de medio condicionado referidos anteriormente se
combinaron entre sí (volumen total 5.000 ml). Se ajustó el pH a 6,75
añadiendo 1 M HCl. Se utilizaron 2.000 ml de 10 mM
Tris-HCl, ph 6,7 para llevar la conductividad a
aprox. 0,700 mmho. Se aplicó el preparado a una columna de
intercambio aniónico de flujo rápido Q-Sefarosa (36
x 14 cm); resina de flujo rápido Q-Sefarosa
Pharmacia que se había equilibrado con los 10 mM de
Tris-HCl, pH 6,7 tampón. Después de la aplicación
de la muestra, se lavó la columna con 28.700 ml de tampón Tris. Tras
este lavado, la columna se lavó con 23.000 ml de 5 mM ácido
acético/1-mM glicina/6 M urea/20 \muM CusO_{4} a
aprox. pH 4,5. La columna se lavó entonces con 10 mM
Tris-HCl 20 \mum CuSO_{4}, pH 6,7 tampón para
volver al pH neutro y eliminar urea, y se aplicó un gradiente de sal
(0-700 mM NaCl en 10 mM Tris-HCl, 20
\muM CuSO_{4}, pH 6,7 tampón; 40 L volumen total. Se recogieron
fracciones de aprox. 490 ml a un caudal de aprox. 3.250 ml/h. El
cromatograma se muestra en la figura 36. "MC/9 cpm" se refiere
a la actividad biológica del ensayo MC/9; se sometieron a ensayo 5
\mul de las fracciones indicadas. Se recogieron eluatos durante la
aplicación de la muestra y no se muestran los lavados en la figura;
no se detecto ninguna actividad biológica con estas fracciones.
Se combinaron (11.200 ml) de fracciones
44-46 de la pasada mostrada en la figura 36 y se
añadió EDTA hasta una concentración final de 1 mM. Este material se
aplicó a un caudal aproximado de 2.000 ml/h a una columna C_{4}
(Vydac Proteins C_{4}; 7 x 8 cm) equilibrada con tampón A (10 mM
Tris pH 6,7/20% etanol). Después de la aplicación de la muestra se
lavó la columna con 1.000 ml de tampón A. Se aplicó entonces un
gradiente lineal del tampón A al tampón B (10 mM Tris pH 6,7/94%
etanol) (volumen total 6000 ml) y se recogieron fracciones de
30-50 ml. Se dializaron partes de la muestra
inicial de la columna C_{4}, conjunto de ensayo y de lavado
además de 0,5 ml de porciones de las fracciones de gradiente con
salino con tampón de fosfato en preparación para ensayo biológico.
Estas diversas fracciones se ensayaron utilizando la prueba MC/9 (5
\mul de porciones de las fracciones de gradientes preparadas; cpm
en la figura 37). SDS-PAGE [Laemmli, nature
277, 680-685 (1970); en la figura 38 se
muestran geles "stacking" que contiene 4% (p/v) de acrilamida
y geles de separación que contienen 12,5% (p/v) de acrilamida] de
porciones de diversas fracciones. Para los geles mostrados se
secaron bajo vacío porciones de muestra (100 \mul) y luego se
volvieron a disolver utilizando 20 \mul de tampón de tratamiento
de muestra (reductor, es decir con
2-mercaptoetanol) y se hirvió durante 5 minutos
antes de cargar sobre el gel. Las marcas numeradas a la izquierda de
la figura representan posiciones de migración de marcadores de peso
molecular (reducido) como en la figura 6. Las vías numeradas
representan las fracciones correspondientes recogidas durante la
aplicación de la última parte del gradiente. Los geles se tiñeron
de plata [Morrissey, Anal. Bioch. 177,
307-310 (1981)].
Se agruparon (1050 ml) fracciones
98-124 de la columna C_{4} mostrada en la figura
37. El conjunto se diluyó 1:1 con 10 mM Tris, pH 6,7 tampón para
reducir la concentración de etanol. El conjunto diluido se aplicó
entonces a una columna de intercambio aniónico de flujo rápido
Q-Sefarosa (3,2 x 3 cm, resina de flujo rápido
Q-Sefarosa de Pharmacia) que había sido equilibrada
con el 10 mM Tris-HCl, 6,7 tampón. El caudal era de
463 ml/h. Después de la aplicación de la muestra se lavó la columna
con 135 ml de tampón de columna y la elución del material fijado se
realizó lavando con 10 mM Tris-HCl, 6350 mM NaCl,
pH 6,7. Se invirtió el sentido de flujo de la columna con el fin de
minimizar el volumen de material eluido y se recogieron 7,8 ml de
fracciones durante la elución.
Se agruparon (31 ml) fracciones que contenían
proteína eluida del lavado de sal de la columna intercambiadora de
aniones de flujo rápido Q-Sefarosa. Se aplicaron 30
ml a una columna de filtración de gel (Pharmacia) Sephacryl
S-200 HR (5 x 55,5 cm), equilibrada en salino con
tampón de fosfato. Se recogieron fracciones de 6,8 ml a un caudal de
68 ml/h. Se agruparon fracciones que corresponden al pico de
absorbancia en 280 nm y que representan el material purificado
final.
El cuadro 15 muestra un resumen de la
purificación.
La secuencia de aminoácidos
N-terminal de SCF^{1-162} de rata
purificada es aprox. la mitad
Gln-Glu-Ile... y la mitad
PyroGlu-Glu-Ile... según lo
determinado en los métodos mostrados en el Ej. 2. Este resultado
indica SCF^{1-162} de rata es el producto del
procesamiento/segmentación proteolítica entre los residuos indicados
como números (-1) (Thr) y (+1) (Gln) en la figura 14C.
De forma similar, el
SCF^{1-162} humano purificado de medio
condicionado de célula CHO transfectada (más abajo) tiene una
secuencia de aminoácidos N-terminal
Glu-Gly-Ile, que indica que es el
producto del procesamiento/segmentación entre residuos indicados con
los números (-1) (Thr) y (+1) (Glu) en la figura 15C.
Utilizando el protocolo descrito anteriormente
se obtendrá proteína SCF humana purificada, formas recombinantes
expresadas en CHO o derivadas naturalmente.
Otros métodos de purificación adicionales que
resultan útiles en la purificación de SCFs recombinante derivado de
célula de mamífero son los indicados en los Ejs. 1 y 10 así como
otros métodos que conocen los expertos en la materia.
Otras formas de SCF humano que corresponden a la
totalidad o parte del marco de lectura abierta codificado por
aminoácidos 1-248 mostrados en la figura 42, o que
corresponden al marco de lectura abierto codificado por mARNs
empalmados alternativamente que pueden existir (como lo representado
por la secuencia de cADN de la figura 44), se puede expresar
también en células de mamífero y recuperar en forma purificado
mediante procedimientos similares a los descritos en este ejemplo,
o mediante otros procedimientos conocidos por los expertos en la
materia.
En la figura 39 se muestra el
SDS-PAGE de fracciones agrupadas de la columna de
filtración de gel Sephacryl S-200 HR; se cargaron
2,5 \mul del conjunto (vía 1). La vía se tiñó de plata. Los
marcadores de peso molecular (vía 6) fueron los descritos en la
figura 6. El material migrante diferente por encima y ligeramente
por debajo de la posición del marcador 31.000 M_{r} representa el
material biológicamente activo; la heterogeneidad aparente se debe
en gran medida a la heterogeneidad en la glicosilación.
Para la caracterización, el material purificado
por glicosilación se trató con una variedad de glicosidasas, se
analizó por SDS-PAGE (condiciones reductoras) y se
visualizó con teñido de plata. Los resultados se muestran en la
figura 39. Vía 2, neuraminidasa. Vía 3 neurominidasa y
O-glicanasa. Vía 4 neurominidasa,
O-glicanasa y N-glicanasa. Via 5,
neurominidasa, y N-glicanasa. Via 7,
N-glicanasa. Vía 8 N-glicanasa sin
sustrato. Vía 9 O-glicanasa sin sustrato. Las
condiciones fueron 10 nM
3-[(3-colamidopropil)dimetil
amonio]-1-propano sulfonato (CHAPS),
66,6 mM 2-mercaptoetanol, 0,04% (p/v) azida sódica,
salino con tampón de fosfato, durante 30 minutos a 37ºC, seguido de
incubación a la mitad de las concentraciones descritas en presencia
de glicosidasa durante 18 horas a 37ºC. La Neurominidasa (de
Arthobacter ureafaciens); suministrada por Calbiochem) se
utilizó a una concentración final de 0,5 udes/ml. La
O-glicanasa (Genzima;
endo-alfa-N-acetil
galactosaminidasa) se utilizó a 7,5 miliunidades/ml. La
N-glicanasa (Genzima; péptido:
N-glicosidasa F;
péptido-N^{4}[N-acetil-beta-glucosaminil]
asparagina amidasa) se utilizó a 10 udes/ml). Siempre que se
consideró conveniente se realizaron diversas incubaciones de control
que comprendían: incubación sin glicosidasas, para comprobar que
los resultados eran debidos a los preparados de glicosidasa
añadidos; incubación con proteínas glicosilatadas (p. ej.
eritropoyetina humana recombinante glicosilatada) conocidas por ser
sustratos de las glicosidasas, para comprobar que las enzimas de
glicosidasa utilizadas eran activas e incubación que glicosidasas
pero sin sustrato para apreciar si los preparados de glicosidasa
contribuían o ocultaban la visualización de bandas de gel (figura 39
vías 8 y 9).
De los experimentos descritos anteriormente se
pueden extraer ciertas conclusiones. Los diversos tratamientos con
N-glicanasa [que elimina el carbohidrato unido a N
tanto el complejo como el que tiene un elevado contenido de mannosa
(Tarentino y colaboradores Biochemistry 24,
4665-4671 (1988)], neurominidasa (que elimina los
residuos de ácido siálico). Y O-glicanasa (que
elimina ciertos carbohidratos ligados a O (Lambin y colaboradores,
Biochem. Soc. Trans. 12, 599-600 (1984)] sugieren
que: están presentes los carbohidratos unidos N y a O; reencuentra
presente el ácido siálico, incorporado, parte del mismo en mitades
unidas a O. El hecho de que el tratamiento con
N-glicanasa puede convertir el material heterogéneo
que aparece por SDS-PAGE en una forma de migración
más rápida que es mucho más homogénea indica que la totalidad del
material representa el mismo polipéptido y que la heterogeneidad es
causada principalmente por heterogeneidad en la glicosilación.
Se utilizó como material de partida para la
modificación del polietilenglicol descrita a continuación,
SCF^{1-162} de rata, purificado a partir de un
sistema de expresión E. coli recombinante según los ejemplos
6A y 10.
Se añadió metoxipolietilen
glicol-succinimidil succinato (18,1 mg = 3,63
\mumol); SS-MPEG = Sigma Chemical Co. Nº M3152,
peso molecular aproximado = 5.000) en 0.327 mL de agua desionizada a
13,3 mg (0,727 \mumol) de SCF^{1-162} de rata
recombinante en 1,0 mL 138 mM de fosfato sódico, 62 mM NaCl, 0,62
mM acetato sódico, pH 8,0. La solución resultante se agitó
suavemente (100 rpm) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se
aplicó entonces, una porción de 1,0 mL de la mezcla de reacción
final (10 mg proteína) a una columna de filtración de gel Pharmacia
Superdex 75 (1,6 x 50 cm) y se eluyó con 100 mM de fosfato sódico,
pH 6,9 a una velocidad de 0,25 mL/min a temperatura ambiente. Se
descartaron los primeros 10 mL de efluente de columna y se
recogieron después 1,0 mL de fracciones. La absorbancia W (280 nm)
del efluente de columna se controló y siguió de forma continua tal
como se muestra en la figura 40A. Se combinaron fracciones, número
25 a 27, y se esterilizaron por ultrafiltración a través de una
membrana de polisulfona de 0,2 \mu (Gelman Sciences nº 4454), y el
conjunto resultante se designó PEG-25. De igual
modo, se combinaron fracciones nº 28 a 32, se esterilizaron por
ultrafiltración y se designaron PEG-32. La fracción
agrupada PEG-25 contenía 3,06 mg de proteína y la
fracción agrupada PEG-32 contenía 3,55 mg de
proteína, según el cálculo de medidas A280 utilizando para la
calibración una absorbancia de 0,66 para 1,0 mg/mL de solución de
SCF^{1-164} de rata no modificado. El
SCF^{1-164} de rata sin reaccionar, que
representaba un 11,8% de la proteína total en la mezcla de
reacción, se eluyó en fracciones número 34 a 37. En condiciones
cromatográficas similares se eluyó SCF^{1-164} de
rata no modificado como pico fundamental con un volumen de
retención de 45,6 mL, Figura 40B. Las fracciones número 77 a 80 de
la figura 40A contenían N-hidroxisuccinimida, un
subproducto de la reacción de SCF^{1-164} de rata
con SS-MPEG.
Los grupos amino potencialmente reactivos en
SCF^{1-164} de rata incluyen 12 residuos de
lisina y el grupo amino alfa el residuo de glutamina
N-terminal. La fracción agrupada
PEG-25 contenía 9,3 mol de grupos amino reactivos
por mol de proteína, según se determino por titilación
espectroscópica con ácido de trinitobenceno sulfónico (TNBS)
utilizando el método descrito por Habeeb, Anal. Biochem.
14:328-336 (1966). Del mismo modo la fracción
agrupada PEG-32 contenía 10,4 mol y el
SCF^{1-164} de rata no modificado contenía 13,8
mol de grupos amino reactivos por mol de proteína, respectivamente.
Por lo tanto, una media de 3,3 (13,7 menos 10,4) grupos amina de
SCF^{1-164} de rata en fracción agrupada
PEG-32 se modificaron por reacción con
SS-MPEG. De similar forma, se modificó una media de
4,4 grupos amino de SCF^{1-164} de rata en
fracción agrupada PEG-25. El SCF humano
(hSCF^{1-164}) producido como en el Ej. 10 se
modificó también utilizando los procedimientos mencionados
anteriormente.
Especialmente, se hicieron reaccionar 714 mg
(38,4 \mumol) hSCF^{1-164} con 962,5 mg (192,5
\mumol) SS-MPEG en 75 mL de 0,1 M de tampón de
fosfato sódico, pH 8,0 durante 30 minutos a temperatura ambiente. La
mezcla de reacción se aplicó a una columna Sephacryl
S-200HR (5 x 134 cm) y se eluyó con PBS (salino con
tampón de fosfato de Gibco Dulbecco's sin CaCl_{2} ni MgCl_{2})
a una velocidad de 102 mL/hr y se recogieron 14,3 mL fracciones. Se
agruparon fracciones número 39-53, de forma análoga
al conjunto PEG-25 descrito anteriormente y en la
figura 40 y se vio que contenían un total de 354 mg de proteína. La
actividad in vivo de este SCF modificado en primates se
presenta en el Ej. 8C.
Se cosecharon blastos leucémicos de la sangre
periférica del paciente con leucemia de linaje mixto. Las células
se purificaron por centrifugación de ardiente de densidad y
depleción de adherencia. Se iodó SCF^{1-164}
humano según el protocolo del Ej. 7. Las células se incubaron con
concentraciones diferentes de SCF yodado descrito [Broudy, Blood,
75 1622-1626 (1990)]. Los resultados del
experimento de fijación de receptor se muestran en la figura 41. La
densidad de receptor estimada es de aprox. 70.000
receptores/célula.
La capacidad de SCF^{1-164} de
rata recombinante (rrSCF^{1-164}), para actuar
sinérgicamente con IL-7 para potenciar la
proliferación de células linfoides se estudió en cultivos agar de
médula ósea de ratón. En este ensayo, las colonias formadas con
rrSCF^{1-164} solo contenían monolitos,
neutrófilos y blastocitos, mientras que las colonias estimuladas
por IL-7 solo o en combinación con
rrSCF1-164 contenían principalmente células
pre-B. Las células pre-B,
caracterizados como B220^{+}, sIg^{-}, c\mu^{+}, se
identificaron por análisis FACS de células agrupadas, utilizando
anticuerpos rotulados por fluorescencia del antígeno B220 [Coffman,
Immunol, Rev., 69, 5 (1982)] y de Ig de superficie
(FITC-cabra, anti-K, Southern
Biotechnology Assoc., Birmingham, AL); y mediante análisis de
portaobjetos de citospina para expresión \mu citoplásmica
utilizando anticuerpos rotulados por fluorescencia
(TRITC-cabra anti-\mu Southern
Biotechnology Assoc.). Se obtuvo IL-7 humano
recombinante (rhIL-7) de Biosource International
(Westlake Villages, CA). Al añadir rrSCF^{1-164}
en combinación con el factor de crecimiento celular
pre-B, IL-7 se observó un
incremento sinérgico en la formación de colonia (Cuadro 16), lo
cual indica una función estimulante de
rrSCF^{1-164} sobre progenitores de célula B
tempranos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Cada valor es la media de los recipientes
triplicados \pm SD.
\vskip1.000000\baselineskip
Para comprobar si SCF1-164 es el
ligando para c-kit, se amplificó el cADN para el
c-kit de murino entero [Qiu y colaboradores.,
EMBO J., 7 1003-1011 (1988)] se
amplificó utilizando PCR de MC/9 línea mastocito sensible a
SCF^{1-164} [Nabel et al., Nature,
291, 332-334 (1981)] con iniciadores
designados de la secuencia pública. Los dominios de fijación de
ligando y transmembrana de c-kit humano, codificado
por aminoácidos 1-549 [Yarden et. Al, EMBO
J., 6, 3341-3351 (1987)], se clonaron
utilizando técnicas similares de la línea celular eritroleucemia
humana, HEL [Martin and Papayannopoulou, Science, 216,
1233-1235 (1982)]. Los cADN del
c-kit se insertaron en el vector de expresión de
mamífero V19.8 transfectado en células COS-1 y se
prepararon fracciones de membrana para ensayos de fijación
utilizando ^{125}I-CF^{1-164} de
rata o humano según los métodos descritos en las secciones B y C
siguientes. El cuadro 17 muestra los datos de un ensayo de fijación
típico. No se vio fijación específica detectable de
^{125}I-SCF^{1-164} humano a
células COS-1 transfectadas con V18 solamente. No
obstante, los dominios de fijación de ligando transmembrana del
c-kit recombinante humano que expresa células
COS-1 (Kit-LT1) si que fijaron
1252-hSCF^{1-164} (cuadro 17). La
adición de un exceso molar de 200 veces de
SCF^{1-164} humano no rotulado redujo la fijación
a niveles de referencia. De forma similar, las celular
COS-1 transfectadas con el c-kit de
murino de longitud normal (mckit-L1) fijaron
^{125}I-SCF^{1-164} de rata. Se
detectó una pequeña cantidad de fijación de
^{125}I-SCF^{1-164} de rata en
transfectantes de células COS-1 V19.8 solamente, y
también se observó en células no transfectadas (no conocido), lo
cual indica que la célula COS-1 expresan
c-kit endógeno. Este hallazgo ser corresponde con la
amplia distribución celular de la expresión c-kit.
El ^{125}I-SCF^{1-164} de rata
interactúa de modo similar con c-kit humano y de
murino, mientras
^{125}I-CF^{1-164} humano
interactúa con menor actividad con c-kit de murino
(Cuadro 17). Estos datos se corresponden con el modelo de
reactividad cruzada de SCF^{1-164} entre especies.
El SCF^{1-164} de rata induce la proliferación de
médula ósea humana con una actividad específica similar a la de
SCF^{1-164} humano, mientras que la proliferación
inducida por SCF^{1-164} humano de mastocitos de
murino se produce con una actividad específica 800 veces inferior a
la de proteína
de rata.
de rata.
En resumen, estos resultados confirman que las
anomalías fenotípicas expresadas por ratones mutantes W o S1 son la
consecuencia de defectos primarios en interacciones receptor/ligando
c-kit, criticas para el desarrollo de diversos tipos
celulares.
Se derivaron clones cADN de
c-kit humano y de murino utilizando técnicas PCR
[Saiki et al., Science 239, 487-491
(1988)] de ARN total aislado por un procedimiento de extracción de
fenol/cloroformo ácido [Chomczynsky and Sacchi, Anal.
Biochem., 162, 156-159, (1987)] de la
línea celular eritroleucemia humana HEL y células MC/9,
respectivamente. Se diseñaron oligonucleótidos de secuencia única a
partir de las secuencias de c-kit humana y de
murino publicadas el cADN de primera cadena se sintetizó a partir
del ARN total según el protocolo proporcionado con la enzima,
transcripción inversa Mo-MLV (Bethesda Research
Laboratories, Bethesda, MD), utilizando oligonucleótidos anti
sentido de c-kit como iniciadores. La amplificación
de regiones superpuestas de los dominios de quinasa tirosina y de
fijación de ligando de c-kit se realizó utilizando
pares adecuados de iniciadores de c-kit. Estas
regiones se clonaron en el vector de expresión de mamífero V19.8
(figura 17) para la expresión en células COS-1. La
secuenciación del ADN de diversos clones reveló mutaciones
independientes producidas al parecer durante la amplificación PCR
en cada clon. Se construyó un clon libre de estas mutaciones
volviendo a ensamblar fragmentos de restricción sin mutación de
clones separados. Algunas diferencias de la secuencia publicada
aparecieron en la totalidad o en aprox. la mitad de los clones; se
concluyó que estas eran las secuencias actuales presentes en la
líneas celulares utilizadas, que pueden representar diferencias
allélicas respecto de las secuencias publicadas. Los siguientes
plásmidos se construyeron en V19.8:
V19.8:mckit-LT1, el c-kit de murino
entero; y V19.8: Kit-L1 que contenía la región de
fijación de ligando más la región transmembrana (aminoácidos
1-549) del c-kit humano.
Los plásmidos fueron transfectados en células
COS-1, esencialmente en la forma descrita en el Ej
4.
Dos días después de la transfección, las células
COS-1 se quitaron rascando del recipiente, se
lavaron en PBS y se congelaron hasta su utilización. Después de la
descongelación las células se volvieron a suspender en 10 mM
Tris-Hcl, 1 mM MgCl_{2} que contenía 1 mM PMSF,
100 \mug/ml aprotinina, 25 \mug/ml leupeptina, 2 \mug/ml
pepstatina y 200 \mug/ml TLC-HCl. La suspensión
se dispersó pipetando hacia arriba y hacia abajo 5 veces, se incubó
sobre hielo 15 minutos y las células se homogenizaron con
15-20 pasadas de un homogenizador Dounce. Se añadió
sucrosa (250 mM) al homogenato, y se granuló la fracción nuclear y
las células residuales no destruidas por centrifugación a 500 x g
durante 5 minutos. El sobrenadante se centrifugó a 25.000 g durante
30 minutos a 4ºC para granular los residuos celulares restantes. Se
radio-iodó SCF^{1-164} humano y
de rata utilizando cloramina-T [Günter and
Greenwood, Nature, 194, 495-496
(1962)]. Se incubaron fracciones de membrana COS-1
con ^{125}I-SCF^{1-164} humano
o de rata (1,6 nM) con o sin un exceso molar (200 veces) de
SCF^{1-164} no rotulado en tampón de fijación que
consistía en RPMI suplementado con 1% de albúmina de suero bovino y
50 mM HEPES (pH 7,4) durante 1 hora a 22ºC. Al término de la
incubación de fijación, los preparados de membrana se aplicaron
suavemente en capas sobre 150 gl de aceite de ftalato y se
centrifugaron durante 20 minutos en Beckman Microfuge 11 para
separar el ^{125}I-SCF^{1-164}
ligado a la membrana del
^{125}I-SCF^{1-164} libre. Los
gránulos se quitaron cortando y se cuantificó
^{125}I-SCF^{1-164} asociado a
la membrana.
Se aisló ARN total de la línea celular de
fibrosarcoma humano HT 1080 (ATCC CCL 121) con el método de
extracción de ácido guanidinio
tiocianato-fenol-cloroformo
[Chomczynski et al., Anal. Biochem. 162, 156 (1987)],
y se recu- peró poli(A) ARN utilizando columna spin oligo/dT
adquirida en Clontech. Se preparó cADN de doble cadena a partir de
2 \mug de poli(A) ARN con un kit de síntesis de cADN BRL
(Bethesda Research Laboratory) en las condiciones recomendadas por
el proveedor. Aprox. 100 ng de cADN de doble cadena fraccionada en
columna con un tamaño medio de 2 kb se ligaron con 300 ng de vector
digerido SalI/NotI pSPORT 1 [D'Alessio et al., Focus,
12, 47-50 (1990)] y se transformaron en células
DH5\alpha (BRL, Bethesda, MD) por electroporación [Dower et
al., Nucl. Acids Res., 16 6127-6145
(1988)].
Aprox. 2,2 x 10^{5} transformantes primarios
se dividieron en 44 conjuntos que contenían cada uno de ellos
\sim5000 clones individuales. Se preparó ADN plásmido de cada
conjunto con el método de precipitación CTAB-ADN
descrito [Del Sal et al., Biotechniques, 7,
514-519 (1989)]. Se digirieron dos microgramos de
cada conjunto de ADN plásmido con enzima de restricción NotI y se
separó por electrofóresis de gel. Se transfirió ADN linealizado
sobre membrana Gene-Screen Plus (DuPont) y se
hibridó con cADN SCF humano generado por PCR rotulado ^{32}p (Ej.
3) en las condiciones descritas anteriormente [Lin et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,
7580-7584 (1985)]. Se identificaron tres conjuntos
que contenían señal positiva de la hibridación. Estos conjuntos de
colonias se volvieron a examinar mediante el procedimiento de
hibridación de colonia [Lin et al., Gene 44,
201-209 (1986)] hasta que se obtuvo una sola colonia
de cada conjunto. Los tamaños de cADN de estos tres clones
aislados oscilan entre 5,0 y 5,4 kb. Las digestiones de enzima de
restricción y la determinación de la secuencia de nucleótidos en el
extremo 5' indican que tres de los dos clones son idénticos
(10-1a y 21-7a). Contienen ambos la
región de codificación y aprox. 200 bp de región no traducida 5' (5'
UTR). El tercer clon (26-1a) es grosso modo 400bp
más corto en el extremo 5' que los otros dos. La secuencia de este
cADN de SCF humano se muestra en la figura 42. Hay que señalar en
particular la secuencia de dominio de transmembrana hidrófoba que
comienza en la región de los aminoácidos 186-190 y
termina en aminoácido 212.
Se generó pDSR\alpha2
hSCF^{1-248} utilizando plásmidos
10-1a (según se describe en el Ej. 16B) y pGEM3
hSCF^{1-164} del siguiente modo. El inserto
HindIII de pGEM3 hSCF^{1-164} se transfirió a
M13mp18. Los nucleótidos inmediatamente corriente arriba del codón
de iniciación ATG se cambiaron por mutagénesis dirigida a la zona
de tttccttATG utilizando el oligonucleótido anti sentido
5'-TCT TCT TCA TGG CGG CGG CAA
GCT T 3'
y el kit del sistema de mutagénesis in
vitro dirigido hacia el oligonucleótido y los protocolos de
Amersham Corp. Para generar M13mp18 hSCF^{1-164}
Este ADN se digerió con HindIII y se inserto en pDSR\alpha2 que
había digerido con HindIII. Este clon se designa pDRS\alpha2
hSCF^{K1-164} Se digirió ADN de pDRS\alpha2
hSCF^{K1-164} con XbaI y se hizo que el ADN
tuviera un extremo romo añadiendo enzima Klenow y cuatro dNTPs. Una
vez terminada esta reacción, se siguió digiriendo el ADN con la
enzima SpeI. Se digirió el clon 10-1a con Dral para
generar un extremo romo 3' en el marco de lectura abierta en el
inserto y con SpeI que corta en la misma zona dentro del gen tanto
en pDRS\alpha2 hSCF^{K1-164} como
10-1a. Estos ADN se ligaron juntos para generar
pDRS\alpha2 hSCF^{K1-248}.
Se transfectaron células COS-7
(ATCC CRL 1651) con ADN construido en la forma indicada
anteriormente. Se electroporaron 4 x 10^{6} células en 0,8 ml DMEN
+ 5% FBS a 1600 V con 10 \mug de pDRS\alpha2
hSCF^{K1-248} ADN o 10 \mug de ADN de vector
pDRS\alpha2 hSCF^{K1-248} (control de vector).
Tras la electroporación, se volvieron a cultivar células en dos
recipientes de 60 mm. A las 24 horas, el medio se sustituyó por
medio fresco completo.
72 horas después de la transfección, cada
recipiente se rotuló con medio ^{35}S según una modificación del
protocolo de Yarden y colaboradores. (PNAS 87,
2569-2573, 1990). Se lavaron una vez células con
PBS y luego se incubaron con DMEN
(met-cys-DMEN) libre de cisteína y
de metionina durante 30 minutos. El medio se eliminó y se añadió a
cada recipiente 1 ml de met-cys-DMEN
que contenía 100 \alphaCi/ml rótulo Trans^{35}S (ICN). Se
incubaron células a 37ºC durante 8 horas. El medio se cosechó, se
aclaró por centrifugación para eliminar residuos celulares y se
congeló a -20ºC.
Se inmunoprecipitaron porciones de medio
condicionado rotulado de COS/pDRS\alpha2
hSCF^{K1-248} y control vector COS/pDRS\alpha2
junto con muestras de medio de 17 células de clon de
CHO/pDRS\alpha2 hSCF^{K1-164} rotulado ^{35}S
(ver Ej. 5 según una modificación del protocolo de Yarden et
al. (EMBO, J., 6, 3341-3351,
1987). Se trató 1 mm de cada muestra de medio condicionado con 10
\mul de suero de conejo pre-inmune (nº 1379
P.I.). Se incubaron muestras durante 5 horas a 4ºC. Se añadió a cada
tubo 100 gl de una suspensión al 10% de Staphylococcus aureus
(Pansorbin, Calbiochem.) en 0,15 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 0,2%
Triton X-100. Se incubaron muestras durante una
hora más a 4ºC. Se granularon complejos inmunes por centrifugación
a 13.000 x g durante 5 minutos. Se transfirieron los sobrenadantes
a nuevos tubos y se incubaron con 5 \mul de antisuero policlonal
de conejo (nº 1381 TB4), purificado como en el Ej. 11, contra
hSCF^{K1-162} derivado de CHO durante la noche a
4ºC. Se añadieron 100 gl de Pansorbin durante 1 hora y se
granularon como antes complejos inmunes. Se lavaron gránulos una vez
con tampón de lisis (0,5% Na-deoxicolato,
0,5%.MP-40, 50 mM NaCl, 25 mM Tris pH 8), 3 veces
con tampón de lavado (0,5 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 0,2 Triton
X-100), y una vez con 20 mM Tris pH 7,5. Se
volvieron a suspender gránulos en 50 \mul de 10 mM Tris pH 7,5,
0,1% SDS, 01 M \beta-mercaptoetanol. Se eluyó
proteína de SCF hirviendo durante 5 minutos. Se centrifugaron
muestras a 13.000 x g durante 5 minutos y se recuperaron los
sobrenadantes.
Se realizó del siguiente modo el tratamiento con
glicosidasas: se añadieron 3 microlitros de 75 mM CHAPS que
contenía 1,6 mU O-glicanasa, 0,5 U
N-glicanasa y 0,02 U neuraminidasa a 25 \mul de
muestras de complejo inmune y se incubaron durante 3 horas a 37ºC.
Se añadió un volumen igual de tampón de muestra 2 x PAGE y se
hirvieron muestras durante 3 minutos. Las muestras digeridas y no
digeridas se sometieron a electrofóresis sobre un gel reductor de
15% SDS-poliacrilamida durante la noche a 8 mA. Se
gel se fijó en ácido metanol-acético, se trató con
potenciador Enlightening (NRN) durante 30 minutos, se secó y se
expuso a película Kodak XAR-5 a -70ºC.
La figura 43 muestra el auto radiograma de los
resultados. Las vías 1 y 2 son muestras de cultivos de control COS
pDRS\alpha2, las vías 3 y 4 de COS/pDRS\alpha2
hSCF^{K1-248}, las vías 5 y 6 CHO/pDRS\alpha2
hSCF^{1-164}. Las vías 1, 3 y 5 son precipitados
inmunes no digeridos; las vías 2, 4 y 6 han sido digeridas con
glicanasas en la forma descrita anteriormente. Las posiciones de los
marcadores de peso molecular se muestran a la izquierda. El
procesamiento del SCF en COS transfectado con pDRS\alpha2
hSCF^{K1-248} se parece mucho al de
hSCF^{1-164} secretado de CHO transfectado con
pDRS\alpha2 hSCF^{K1-164} (Ej. 11). Esto sugiere
con gran probabilidad que la zona de procesamiento proteolítico
natural que libera SCF de la célula se encuentra cerca del
aminoácido 164.
Tras calibración de la columna de filtración de
gel (ACA 54) descrita en el Ej. 1 para la purificación de SCF de
medio celular BRL con standards de peso molécula, y tras la
introducción de SCF purificado de otras columnas de filtración de
gel calibradas es evidente que el SCF purificado de medio celular
BRL se comporta con un peso molecular aparente de aproximadamente
70.000-90.000 respecto de los standards de peso
molecular. Como contraste, el peso molecular aparente mediante
SDS-PAGE es aprox. de 28.000-35.000.
Si bien se reconoce que las proteínas glicosiladas pueden
comportarse de modo anómala en estos análisis, el resultado sugiere
que el SCF de rata derivado de BRL puede existir como dímero
asociado no forma covalente en condiciones no desnaturalizadoras.
Similares resultados muestran la relevancia de formas SCF
recombinante (p. ej. SCF^{1-164} de rata y humano
derivado de E. Coli, SCF^{K1-164} de rata y
humano derivado de células CHO) ya que el tamaño molecular estimado
por filtración del gel en condiciones no desnaturalizadoras es,
grosso modo dos veces superior al estimado por filtración de gel en
condiciones de desnaturalización (es decir en presencia de SDS), o
por SDS-PAGE, en cada caso particular. Además, el
análisis de la velocidad de sedimentación que proporciona una
determinación precisa del peso molecular en solución, da un valor
de aprox. 36.000 para el peso molecular de
SCF^{K1-164} humano recombinante derivado de E.
coli. Este valor es nuevamente unas dos veces superior al que se
obtiene con SDS-PAGE
(\sim18.000-19.000). Por consiguiente, si bien se
reconoce que pueden existir estados oligoméricos múltiples
(inclusive el estado monomérico), parece ser que el estado dimérico
predomina en ciertas circunstancias en solución.
Se aisló ARN total de la línea celular de
carcinoma de vejiga humana 5637
(ATCC-HTB-9) mediante el método de
extracción guanidinio
tiocianato-fenol-cloroformo
[Chomczynski et al., Anal. Biochem, 162, 156
(1987)], y se recuperó poli(A) ARN utilizando una columna
spin oligo (dT) que se adquirió en Clontech. Se preparó cADN de
doble cadena a partir de 2 \mug de poli (A) ARN con un kit de
síntesis de cADN BRL en las condiciones recomendadas por el
proveedor. Se ligaron aproximadamente 80 ng de cADN de doble cadena
fraccionado en columna con un tamaño medio de 2 kb a 300 ng de
vector digerido por SalI/NotI sPORT 1 [D'Alessio et al.,
Focus, 12, 47-50 (1990)] y se
transformaron en células DH5\alpha por electroporación [Dower
et al., Nucl. Acids Res. 16
6127-6145 (1988)].
Se dividieron aprox. 1,5 x 10^{5}
transformantes primaios en 30 conjuntos que contenía cada uno de
ellos aprox. 5000 clones individuales. Se preparó ADN plásmido a
partir de cada conjunto por el método de precipitación
CTAB-ADN descrito [De Sal et al.,
Biotechniques, 7, 514-519 (1989)]. Se
digirieron dos microgramos de cada conjunto de ADN plásmido con
enzima de restricción NotI y se separó por electrofóresis de gel. Se
transfirió ADN linealizado a la membrana GeneScreen Plus (DuPont) y
se hibridó con cADN de SCF humano de longitud plena rotulado
^{32}P de la línea celular HT1080 (Ej. 16) en las condiciones
antes descritas [Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 82, 7580-7580 (1985)]. Se
identificaron de la hibridación siete conjuntos que posean señal
positiva. Los conjuntos de colonias se volvieron a examinar con cADN
de SCF humano generado por PCR rotulado ^{32}P (Ej. 3) mediante el
procedimiento de hibridación de colonias [Lin et al.,
Gene, 44, 201-209 (1986)] hasta
obtener una sola colonia a partir de 4 de los conjuntos. Los
tamaños de inserción de cuatro colones aislados son de aprox. 5,3
kb. Las restricciones de enzima de restricción y el análisis de
secuencia de nucleótidos de los extremos 5' de los clones indican
que cuatro clones son idénticos. La secuencia de este cADN humano
se muestra en la figura 44. El cADN de la figura 44 codifica un
polipéptido en el que los aminoácidos 149-177 de
las secuencias en la figura 42 son sustituidos por un solo residuos
Gly.
Se comprobó el efecto de SCF en supervivencia de
ratones tras radiación letal. Los ratones utilizados fueron Balb/c
hembra de 10 a 12 semanas de edad. Se utilizaron grupos de 5
ratones en todos los experimentos y los ratones se seleccionaron
según el peso corporal dentro de cada experimento. Los ratones se
sometieron a radiación de 850 rad ó 950 rad en dosis única. Se
inyectaron los ratones con factores solos o factores más células de
médula ósea de Balb/c normal. En el primer caso, los ratones se
inyectaron por vía intravenosa 24 horas después de la radiación con
SCF^{1-164} PEG de rata (20 \mug/kg) purificado
de E. coli y modificado por la adición la adición de
polietilenglicol como en el Ej. 12 o con salino para animales de
control. Para el modelo de transplante, los ratones se inyectaron
por vía intravenosa con varias dosis celulares de médula ósea de
Balb/c 4 horas después de la radiación. El tratamiento con PEG-
SCF^{1-164} de rata se realizó añadiendo 200
\mug/kg de PEG-SCF^{1-164} de
rata a la suspensión celular una hora antes de la inyección y se
dio en forma de una sola inyección intravenosa de factor más
células.
Tras la radiación a 850 rad, se inyectaron los
ratones con PEG-SCF^{1-164} de
rata o salino. Los resultados son mostrados en la figura 45. La
inyección de PEG-SCF^{1-164} de
rata potenció notablemente el tiempo de supervivencia de los
ratones comparado con los animales de control (p<0,0001). Los
ratones inyectados con salino sobrevivieron una media de 7,7 días
mientras que los ratones tratados con
PEG-SCF1-164 sobrevivieron una
media de 4,7 días (figura 45). Los resultados presentados en la
figura 45 representan la compilación de cuatro experimentos
separados con 30 ratones en cada grupo de tratamiento.
El aumento de supervivencia de los ratones
tratados con PEG-SCF^{1-164} de
rata sugiere un efecto de SCF sobre las células de la médula ósea
de los animales radiados. Unos estudios preliminares de los
parámetros hematológicos de estos animales muestran ligeros
incrementos en los niveles de las plaquetas comparados con los
animales de control a los seis días de la radiación; no obstante, a
los 7 días de la radiación, los niveles de plaquetas no eran muy
diferentes de los animales de control. No se detectaron diferencias
en los niveles de RBC o WBC o celularidad de médula ósea.
Unas dosis de 10% de fémur de células de médula
ósea de Balb/c transplantadas en ratones radiados a 850 rad pueden
salvar el 90% o más de los animales (no se ofrecen datos). Por
consiguiente se consiguió una dosis de radiación de 850 rad con una
dosis de transplante de 5% de fémur para estudiar los efectos del
PEG-SCF^{1-164} de rata sobre la
supervivencia. Con esta dosis celular se esperaba que un gran
porcentaje de los ratones que no recibiera SCF no sobreviviría; si
el PEG-SCF^{1-164} de rata podría
estimular la células transplantadas, era posible que se produjera
un incremento en la supervivencia. Como se muestra en la figura 46,
aprox. el 30% de los ratones de control sobrevivieron tras 8 días
de radiación. El tratamiento con
PEG-SCF^{1-164} de rata dio como
resultado un notable incremento de la supervivencia: más del 95% de
estos ratones sobrevivieron por lo menos 30 días (figura 46). Los
resultados presentados en la figura 46 representan la compilación
de resultados de 4 experimentos separados que representan 20 ratones
tanto los de control como los ratones tratados con
PEG-SCF^{1-164} de rata. A dosis
superiores de radiación, el tratamiento de los ratones con
PEG-SCF^{1-164} de rata
conjuntamente con transplante de médula dio también como resultado
una mayor supervivencia (figura 47). Los ratones de control radiados
a 950 rad y transplantados con 10% de fémur murieron a los 8 días,
mientras que aprox. el 40% de los ratones tratados con
PEG-SCF^{1-164} de rata
sobrevivieron 20 días o más. El 20% de los ratones de control
transplantados con 20% de fémur sobrevivieron unos 20 días mientras
que el 80% de los animales tratados rSCF sobrevivieron (figura
47).
Se inyectó por vía subcutánea en ratones Balb/c
hembras de semanas de edad (Charles River, Wilmington, MA) 20
\mug de SCF^{1-164} humano expresado a partir
E. Coli en adyuvante completo de Freund
(HT37-Ra; Difco Laboratories, Detroit, MI). Se
administraron ulteriormente inmunizaciones de refuerzo de 50 \mug
del mismo antígeno en adyuvante incompleto de Freund, los días 14,
38 y 57. Tres días después de la última inyección, se sacrificaron
dos ratones y sus células de bazo se condensaron con la línea sp
2/0 mieloma según los procedimientos descritos por Nowinski y
colaboradores, [Virology 93, 11-116
(1979)].
El medio utilizado para el cultivo celular de sp
2/0 y el hibridoma fue el medio de Eagle modificado de Dulbecco
(DMEM) (Gibco, Chagrin Falls, Ohio) suplementado con 20% de suero
bovino fetal inactivado al calor (Phibro Chem., Fort Lee, NJ), 110
mg/ml de pirovato sódico, 100 u/ml de penicilina y 100 mcg/ml de
estreptomicina (Gibco). Después de la. fusión celular se
seleccionaron híbridos en medio HAT, el medio superior que contenía
10^{-4}M hipoxantina,
4 x 10^{-7}M aminopterina y 1,6 x 10^{-5}M timidina, durante dos semanas, luego se cultivaron en medio que contenía hipoxantina y timidina durante dos semanas.
4 x 10^{-7}M aminopterina y 1,6 x 10^{-5}M timidina, durante dos semanas, luego se cultivaron en medio que contenía hipoxantina y timidina durante dos semanas.
Se examinaron los hibridomas de la siguiente
forma: se sensibilizaron pocillos de poliestireno (Costar,
Cambridge, MA) con 0,25 \mug de SCF^{1-164}
humano (E. Coli.) en 50 \mul de 50 mM tampón de
bicarbonato pH 9,2 durante dos horas a temperatura ambiente, y luego
durante la noche a 4ºC. Se bloquearon entonces las placas con 5% BSA
en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente, luego se
incubaron con sobrenadante de cultivo de hibridoma durante 1 hora a
37ºC. La solución se decantó y los anticuerpos fijados se incubaron
con una dilución de 1:500 de IgG
cabra-anti-ratón conjugado con
peroxidasa de rábano picante (Boehringer Mannheim Biochemicals,
Indianápolis, IN) durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron con
solución de lavado (KPL, Gaithersburg, MD) y luego se revelaron con
mezcla de H_{2}O_{2} y ABTS (KPL). Se realizó la colorimetría a
405 nm.
Se sometieron a un test ELISA cultivos de célula
de hibridoma que secretan anticuerpo específico de
SCF^{1-164} humano (E. Coli), como los
procedimientos de examen de hibridoma, para detectar reactividades
cruzadas con SCF^{1-162} humano (CHO). Se
subclonaron hibridomas con el método de dilución limitadora. 55
pocillos de sobrenadante de hibridoma resultaron fuertemente
positivos a SCF^{1-164} humano (E. Coli) ;
9 de ellos tuvieron reacción cruzada con
SCF^{1-162} humano (CHO).
Se clonaron varias células de hibridoma, de la
siguiente forma:
El 26 de septiembre de 1990 se depositaron en
ATCC los hibridomas 4G12-13 y 8H7A.
\vskip1.000000\baselineskip
Si bien la presente invención se ha descrito
sobre la base de realizaciones preferidas, es evidente que a los
expertos en la materia se les ocurrirán variaciones y
modificaciones. Por consiguiente, lo que se pretende es que las
reivindicaciones adjuntas abarquen todas estas variaciones
equivalentes que entran dentro del ámbito de la invención
reivindicada.
Las características presentadas en la
descripción anterior, en las siguientes reivindicaciones y/o en las
figuras adjuntas pueden ser, tanto por separado como en combinación,
fundamentales para la realización de la invención en sus diversas
formas.
Claims (69)
1. Método para obtener células hematopoyéticas
adecuadas para la administración a un sujeto, método que
comprende:
expansión de células progenitoras
hematopoyéticas, con exclusión de células embrionarias humanas,
añadiendo a las células una dosis hematopoyéticamente eficaz de un
producto polipéptido que tiene por lo menos una parte de la
confirmación estructural primaria y una o más de las propiedades
biológicas del factor célula madre (SCF) que se presenta de forma
natural, que tiene una secuencia proteínica que corresponde a los
aminoácidos 1-162; 1-164 ó
1-165 de la secuencia siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
el polipéptido consiste
opcionalmente en metionina
N-terminal.
2. Método según la reivindicación 1, donde las
células progenitoras hematopoyéticas han sido tratadas con factores
hematopoyéticos antes de tratar con SCF.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2 donde
las células progenitoras hematopoyéticas se derivan de la médula
ósea.
4. Método según la reivindicación 1 ó 2 donde
las células progenitoras hematopoyéticas se derivan de la sangre
periférica.
5. Método según la reivindicación 1 ó 2 donde
las células progenitoras hematopoyéticas se derivan de la sangre
del cordón umbilical.
6. Método según la reivindicación 1 ó 2 donde
las células hematopoyéticas se eligen entre: células madre, células
progenitoras linfoides, células progenitoras mieloides,
megacariocitos y eritroblastos.
7. Método según la reivindicación 1 ó 2, donde
las células hematopoyéticas se eligen entre: células dendríticas, B
linfocitos, T linfocitos, basófilos, eosinófilos, neutrófilos,
macrófago, plaquetas, promielocitos, metamielocitos, mielocitos,
mieloides, mieloblasto y eritrocitos.
8. Método para obtener células hematopoyéticas
adecuadas para la administración a un sujeto para obtener la
recuperación hematopoyética en el sujeto; dicho método
comprende:
\newpage
expansión de células progenitoras
hematopoyéticas, con exclusión de células embrionarias humanas,
añadiendo a las células una dosis hematopoyéticamente eficaz de un
producto polipéptido que tiene por lo menos una parte de la
confirmación estructural primaria y una o más de las propiedades
biológicas del factor célula madre (SCF) que se presenta de forma
natural, que tiene una secuencia proteínica que corresponde a los
aminoácidos 1-162; 1-164 ó
1-165 de la secuencia siguiente:
1-165 de la secuencia siguiente:
el polipéptido consiste
opcionalmente en metionina
N-terminal.
9. Método según la reivindicación 8, donde las
células progenitoras hematopoyéticas han sido tratadas con factores
hematopoyéticos antes de tratar con SCF.
10. Método según la reivindicación 8 ó 9, donde
las células progenitoras hematopoyéticas son derivan de la médula
ósea.
11. Método según la reivindicación 8 ó 9, donde
las células progenitoras hematopoyéticas se derivan de la sangre
periférica.
12. Método según la reivindicación 8 ó 9, donde
las células progenitoras hematopoyéticas se derivan de la sangre
del cordón umbilical.
13. Método para obtener células hematopoyéticas
adecuadas para la administración a un sujeto para tratar trastornos
hematopoyéticos en el sujeto; dicho método comprende:
expansión de células progenitoras
hematopoyéticas, con exclusión de células embrionarias humanas,
añadiendo a las células una dosis hematopoyéticamente eficaz de un
producto polipéptido que tiene por lo menos una parte de la
confirmación estructural primaria y una o más de las propiedades
biológicas del factor célula madre (SCF) que se presenta de forma
natural, que tiene una secuencia proteínica que corresponde a los
aminoácidos 1-162; 1-164 ó
1-165 de la secuencia siguiente:
1-165 de la secuencia siguiente:
el polipéptido consiste
opcionalmente en metionina
N-terminal.
14. Método según la reivindicación 13, donde las
células progenitoras hematopoyéticas han sido tratadas con factores
hematopoyéticos antes de tratar con SCF.
15. Método según la reivindicación 13 ó 14,
donde el trastorno hematopoyético es la insuficiencia medular.
16. Método según la reivindicación 13 ó 14,
donde el trastorno hematopoyético es inducido por una enfermedad
infecciosa.
17. Método según la reivindicación 16, donde la
enfermedad infecciosa se elige dentro del grupo formado por HIV,
Síndrome de Deficiencia Adquirida Inducida (SIDA), Kala Azar,
tuberculosis miliar, septicemia fulminante, micosis diseminada y
malaria.
18. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 17, donde las células progenitoras
hematopoyéticas se derivan de la médula ósea.
19. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 17, donde las células progenitoras
hematopoyéticas se derivan de la sangre periférica.
20. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 17, donde las células progenitoras
hematopoyéticas se derivan de la sangre del cordón umbilical.
21. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20, donde el polipéptido de las células madre
(SCF) se elige entre los aminoácidos: 1-100,
1-110, 1-120, 1-123,
1-127, 1-130, 1-33,
1-137, 1-141, 1-145,
1-148, 1-152, 1-156,
1-157, 1-158, 1-159,
1-160, 1-161, 1,163,
1-166, 1-168,
1-173, 1-178, 2-164,
2-165, 5-164,
11-164, 1-180,
1-183, 1-185,
1-189, 1-220 y 1-248
tal como se puede apreciar en la figura 42; los polipéptidos
consisten opcionalmente en una metionina
N-terminal.
22. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20, donde el polipéptido del factor célula
madre (SCF) se elige entre: aminoácidos 1-152,
1-157, 1-160, 1-160,
1-161 y 2-220, tal como se puede
apreciar en la figura 44, y el polipéptido consiste opcionalmente
en metionina N-terminal.
23. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 22, donde el factor célula madre (SCF) está
conjugado de forma covalente con un polímero.
24. Método según la reivindicación 23, donde el
polímero soluble en agua es polietilenglicol.
25. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 24, donde las células progenitoras
hematopoyéticas se exponen al factor célula madre (SCF) en presencia
por lo menos otra citoquina.
\newpage
26. Método según la reivindicación 25, donde la
citoquina se elige entre: 1L-1,
1L-2, 1L-3, 1L-4,
1L-5, 1L-6, 1L-7,
1L-8, 1L-9, 1L-10,
IL-11, EPO, G-CFS,
GM-CSF, CSF-1,
1GF-1, MGDF y L1F.
27. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 24, donde las células progenitoras
hematopoyéticas se exponen al factor célula madre (SCF) en presencia
de por lo menos otro factor hematopoyético.
28. Método para la expansión de células
hematopoyéticas ex vivo, método que comprende:
expansión de células progenitoras
hematopoyéticas, con exclusión de células embrionarias humanas,
añadiendo a las células una dosis hematopoyéticamente eficaz de un
producto polipéptido que tiene por lo menos una parte de la
confirmación estructural primaria y una o más de las propiedades
biológicas del factor célula madre (SCF) que se presenta de forma
natural, que tiene una secuencia proteínica que corresponde a los
aminoácidos 1-162; 1-164 ó
1-165 de la secuencia siguiente:
el polipéptido consiste
opcionalmente en metionina
N-terminal.
29. Método según la reivindicación 28, donde las
células progenitoras hematopoyéticas han sido tratadas con factores
hematopoyéticos ante de tratar con SCF.
30. Método según la reivindicación 28 ó 29,
donde las células progenitoras hematopoyéticas se exponen al factor
célula madre (SCF) en presencia de al menos otra citoquina.
31. Método según la reivindicación 30, donde la
citoquina se elige entre: 1L-1,
1L-2, 1L-3, 1L-4,
1L-5, 1L-6, 1L-7,
1L-8, 1L-9, 1L-10,
IL-11, EPO, G-CFS,
GM-CSF, CSF-1,
1GF-1, MGDF y L1F.
32. Composición que comprende un factor célula
madre que se utiliza en la expansión de células progenitoras
hematopoyéticas, con exclusión de células embrionarias humanas ex
vivo, que comprende una dosis hematopoyéticamente eficaz de un
producto polipéptido que tiene por lo menos una parte de la
confirmación estructural binaria y una o más de las propiedades
biológicas del factor célula madre que se presenta de forma natural
(SCF) con una secuencia proteínica que corresponde a los aminoácidos
1-162, 1-164 ó 1-165
de las secuencia siguiente:
el polipéptido consiste
opcionalmente en metionina
N-terminal.
33. La composición según la reivindicación 32,
donde las células progenitoras hematopoyéticas se tratan con
factores hematopoyéticos antes de tratar con la composición que
comprende SCF.
34. La composición según la reivindicación 32 ó
33, donde las células progenitoras hematopoyéticas se derivan de la
médula ósea.
35. La composición según la reivindicación 32 ó
33, donde las células progenitoras hematopoyéticas se derivan de la
sangre periférica.
36. La composición según la reivindicación 32 ó
33 donde las células progenitoras hematopoyéticas se derivan de la
sangre del cordón umbilical.
37. La composición según la reivindicación 32 ó
33, donde las células progenitoras hematopoyéticas se eligen entre:
células progenitoras linfoides de células madre, células
progenitoras mieloides, megacariocitos y eritroblastos.
38. La composición según la reivindicación 32 ó
33, donde las células hematopoyéticas se eligen entre: células
dendríticas, B linfocitos, T linfocitos, basófilos, eosinófilos,
neutrófilos, macrófago, plaquetas, promielocitos, metamielocitos,
mielocitos, mieloides, mieloblasto y eritrocitos.
39. La composición según cualquiera de las
reivindicaciones 32 a 38, donde dicha utilización produce células
hematopoyéticas adecuadas para su administración a un sujeto para
conseguir la recuperación hematopoyética en el sujeto.
40. La composición según cualquiera de las
reivindicaciones 32 a 39, donde dicha utilización produce células
hematopoyéticas adecuadas para su administración a un sujeto para
tratar trastornos hematopoyéticos en el sujeto.
41. La composición según la reivindicación 40,
donde el trastorno hematopoyético es insuficiencia medular.
42. la composición según la reivindicación 40,
donde el trastorno hematopoyético es inducido por una enfermedad
infecciosa.
43. La composición según la reivindicación 42,
donde la enfermedad infecciosa se elige entre: HIV Síndrome de
Deficiencia Adquirida Inducida (SIDA), Kala Azar, tuberculosis
miliar, septicemia fulminante, micosis diseminada y malaria.
44. La composición según una de las
reivindicaciones 33 a 43, donde el polipéptido de las células madre
(SCF) se eligen entre los aminoácidos: 1-100,
1-110, 1-120, 1-123,
1-127, 1-130, 1-33,
1-137, 1-141, 1-145,
1-148, 1-152, 1-156,
1-157, 1-158,
1-159, 1-160, 1-161,
1,163, 1-166, 1-168,
1-173, 1-178, 2-164,
2-165, 5-164,
11-164, 1-180,
1-183, 1-185, 1-189,
1-220 y 1-248 tal como se puede
apreciar en la figura 42; los polipéptidos consisten opcionalmente
en una metionina N-terminal.
45. La composición según cualquiera de las
reivindicaciones 32 a 43, donde el polipéptido del factor célula
madre (SCF) se elige entre los aminoácidos 1-152,
1-157, 1-160,
1-160, 1-161 y
2-220, tal como se puede apreciar en la figura 44, y
el polipéptido consiste opcionalmente en metionina
N-terminal.
46. La composición según cualquiera de las
reivindicaciones 32 a 45, donde el factor célula madre (SCF) está
ligado a un polímero soluble en agua.
47. La composición según la reivindicación 46,
donde el polímero soluble en agua es polietilenglicol.
48. La composición según cualquiera de las
reivindicaciones 32 a 45, donde la composición comprende además por
lo menos otra citoquina.
49. La composición sobre la reivindicación 48,
donde la citoquina se elige entre: 1L-1,
1L-2, 1L-3, 1L-4,
1L-5, 1L-6, 1L-7,
1L-8, 1L-9, 1L-10,
IL-11, EPO, G-CFS,
GM-CSF, CSF-1,
1GF-1, MGDF y L1F.
50. La composición según cualquiera de las
reivindicaciones 32 a 45, donde la composición comprende además por
lo menos otro factor hematopoyético.
51. Utilización de SCF en la fabricación de una
composición que se utiliza en un método para la expansión de células
progenitoras hematopoyéticas, con exclusión de células embrionarias
humanas, método que comprende la adición a las células de una dosis
hematopoyéticamente eficaz de un producto polipéptido que tiene por
lo menos una parte de la confirmación estructural primaria y una o
más de las propiedades biológicas del factor célula madre (SCF) que
se presenta de forma natural, que tiene una secuencia proteínica
que corresponde a los aminoácidosl-162;
1-164 ó 1-165 de la secuencia
siguiente:
el polipéptido consiste
opcionalmente en metionina
N-terminal.
52. La utilización de la reivindicación 51,
donde las células progenitoras hematopoyéticas se tratan con
factores hematopoyéticos antes de tratar con la composición que
comprende SCF.
53. La utilización según la reivindicación 51 ó
52, donde las células progenitoras hematopoyéticas son derivadas de
la médula ósea.
54. La utilización según la reivindicación 51 ó
52, donde las células progenitoras hematopoyéticas son derivadas de
la sangre periférica.
55. La utilización según la reivindicación 51 ó
52, donde las células progenitoras hematopoyéticas son derivadas de
la sangre del cordón umbilical.
56. La utilización según la reivindicación 51 ó
52, donde las células hematopoyéticas se eligen entre: células
progenitoras linfoides de células madre, células progenitoras
mieloides, megacariocitos y eritroblastos.
57. La utilización según la reivindicación 51 ó
52, donde las células hematopoyéticas se eligen entre: células
dendríticas, B linfocitos, T linfocitos, basófilos, eosinófilos,
neutrófilos, macrófago, plaquetas, promielocitos, metamielocitos,
mielocitos, mieloides, mieloblasto y eritrocitos.
58. La utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 51 a 57 donde dicho uso produce células
hematopoyéticas adecuadas para su administración a un sujeto para
obtener la recuperación hematopoyética en el sujeto.
59. La utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 51 a 58, donde dicho uso produce células
hematopoyéticas adecuadas para su administración en un sujeto para
tratar trastornos hematopoyéticos en el sujeto.
60. La utilización según la reivindicación 59,
donde el trastorno hematopoyético es la insuficiencia medular.
61. La utilización según la reivindicación 59,
donde el trastorno hematopoyético es inducido por una enfermedad
infecciosa.
62. La utilización según la reivindicación6l,
donde la enfermedad infecciosa se elige entre: HIV, Síndrome de
Deficiencia Adquirida Inducida (SIDA), Kala Azar, tuberculosis
miliar, septicemia fulminante, micosis diseminada y malaria.
63. La utilización según cualquiera de las 51 a
62 donde donde el polipéptido de las células madre (SCF) se eligen
entre los aminoácidos: 1-100, 1-110,
1-120, 1-123, 1-127,
1-130, 1-33, 1-137,
1-141, 1-145, 1-148,
1-152, 1-156, 1-157,
1-158, 1-159, 1-160,
1-161, 1,163, 1-166,
1-168, 1-173, 1-178,
2-164, 2-165, 5-164,
11-164, 1-180,
1-183, 1-185, 1-189,
1-220 y 1-248 tal como se puede
apreciar en la figura 42; los polipéptidos consisten opcionalmente
en una metionina N-terminal.
64. La utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 51 a 62 donde el polipéptido del factor célula
madre (SCF) se elige entre los aminoácidos 1-152,
1-157, 1-160,
1-160, 1-161 y
2-220, tal como se puede apreciar en la figura 44, y
el polipéptido consiste opcionalmente en metionina
N-terminal.
65. La utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 51 a 64, donde el factor célula madre (SCF) está
conjugado de forma covalente clon un polímero.
66. La utilización según la reivindicación 65,
donde el polímero soluble en agua es polietilenglicol.
67. La utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 57 a 64, donde la composición comprende además por
lo menos otra citoquina.
68. La utilización según la reivindicación 67,
donde la citoquina se eligen entre: 1L-1,
1L-2, 1L-3, 1L-4,
1L-5, 1L-6, 1L-7,
1L-8, 1L-9, 1L-10,
IL-11, EPO, G-CFS,
GM-CSF, CSF-1,
1GF-1, MGDF y L1F.
69. La composición según cualquiera de las
reivindicaciones 51 a 64, donde la composición comprende además por
lo menos otro factor hematopoyético.
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