JPH07165602A

JPH07165602A - 放射線障害防護剤

Info

Publication number: JPH07165602A
Application number: JP5316914A
Authority: JP
Inventors: Shinsuke Nishi; 信介西; Haruhiko Tsumura; 治彦津村; Hideo Inoue; 英男井上
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1993-12-16
Filing date: 1993-12-16
Publication date: 1995-06-27
Also published as: US5620685A

Abstract

(57)【要約】【目的】増殖因子の各種組合せによる最も効率的な放
射線防護剤の提供。【構成】ＳＣＦ、ＩＬ３、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ６か
ら成る、放射線障害防護剤。【効果】致死線量の放射線を被爆した動物を100%生存
させる、従来の方法では得られなかった効果を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、SCF(幹細胞増殖因子)
、IL3(インターロイキン3)、GM-CSF( 顆粒球マクロフ
ァージコロニー刺激因子) 、IL6(インターロイキン6)の
組み合わせを有効成分とする、放射線障害治療の製剤組
成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】放射性物質から放出されるα線、β線、
γ線、あるいは人工的に作り出した強力なＸ線、陽子
線、中性子線、電子線などの放射線は、生体細胞の細胞
分裂に障害をきたし、細胞増殖性を失わせる効果があ
る。過度の線量の放射線に被曝すると、細胞は破壊され
る。50グレイ以上の線量では中枢神経障害、10グレイ以
上で腸管障害、6 〜10グレイで造血障害が生じ、これを
原因として生体は死に至ると考えられている〔グレイ
は、吸収線量の単位〕。このことから、生体の中でも最
も放射線感受性が高いのは造血組織、即ち骨髄細胞であ
ると言える。ここでいう骨髄細胞とは骨髄中に存在する
細胞のことで、赤血球、好中球、好酸球、好塩基球、単
球、血小板等の種々の分化段階の細胞などが含まれてい
る。

【０００３】放射線に被曝した場合、末梢血液、特に、
白血球・血小板の数が激減し、生体の生存を左右する。
従って、一般に6 グレイ以上の放射線に被曝した場合の
有効な治療法の一つとして、骨髄移植があげられる。と
ころで骨髄移植では、提供者と宿主との骨髄の間での主
要組織適合抗原(HLA) の一致が求められる。HLA の一致
しない場合は、移植片対宿主病(GVHD)を生じる。しかし
ながら、HLA が一致する骨髄細胞を入手することは現実
には非常に困難である。

【０００４】原子力発電の普及、核燃料処理等の原子力
産業の発展に伴い、放射線作業従事者の被爆事故の可能
性は増加している。また、チェルノブイリ原子力発電所
の事故の際には、周囲地域の住民、家畜等も多大の影響
を受けた。しかしながら、このような強度の放射線を受
けた場合、その障害を有効に防護する薬剤は今の所存在
しない。

【０００５】近年、致死に対する延命効果が得られるよ
うな物質を用いる方法、例えば、IL1(インターロイキン
1)(Neta R ら J Immunol 136:2483, 1986)、G-CSF(顆粒
球コロニー刺激因子)(Tanigawa Sら Blood 76:445, 199
0)、免疫調節剤トリクロロ(ジオキソエチレン-O,O′)
テルル酸アンモニウム(Kalechman Yら J Immunol 145:1
512, 1990;特開平02-200630)、血清胸腺因子として知ら
れるノナペプチド( 特開平2-36126)、シメチジン- 銅錯
体( 特開平1-153640) 、2-フェニル-1,2- ベンゾイソセ
レナゾール-3(2H)- オン( 特開平1-135718) を用いる方
法が提案されている。しかしながら、より優れた放射線
防護剤に対して不断の希求があるのが現状である。

【０００６】ところで、増殖因子の相乗効果を利用した
治療方法が幾つか提案されている。巨核球産生のための
GM-CSF、G-CSF 、IL6 、IL5(インターロイキン5)、IL3
の組み合わせ(WO91/07988)、血小板減少症のためのMMF
(巨核球成熟因子) 、SCF 、G-CSF 、IL3 、Meg-CSF(巨
核球コロニー刺激因子) 、Epo(エリスロポエチン) の組
み合わせ(WO92/06712)あるいはIL7(インターロイキン
7)、IL1 α( インターロイキン1 アルファ) 、IL1 β、
IL3 、IL4(インターロイキン4)、IL6 、Epo 、GM-CSF、
G-CSF の組み合わせ(WO90/09194)や、放射線防護のため
の組合せ、例えば、IL4 、GM-CSF、G-CSF 、IL1 、IL2
(インターロイキン2)、IL3 、IL5 、IL6 、IFN(インタ
ーフェロン) α(EP/410750) あるいはBCDF(B細胞分化因
子) 、IL1 、IL3 、IL4 、G-CSF 、GM-CSF、M-CSF(マク
ロファージコロニー刺激因子)(特開平2-76820)が提案さ
れている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上に示
したIL1 、G-CSF 、トリクロロ( ジオキソエチレン-O,
O′) テルル酸アンモニウム、ノナペプチド、シメチジ
ン- 銅錯体、2-フェニル-1,2- ベンゾイソセレナゾール
-3(2H)- オン等を用いた場合、放射線照射前からの薬剤
投与が必要であったり、長期に及ぶ延命効果が得られ
ず、事故による放射線障害に対する十分な防護効果は期
待できない。一方、増殖因子の組合せ効果を利用した放
射線防護作用(EP/410750) ( 特開平2-76820)に関して
は、実施例での確認は行われておらず、単なる机上の提
案にすぎない。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、増殖因子
の各種組合せによる最も効率的な放射線防護効果を検討
した結果、SCF 、IL3 、GM-CSF、IL6 の特定の組合せ
が、放射線被曝後における著しい放射線防護効果を有す
ることを見いだし、本発明を完成した。

【０００９】SCF は、c-kit 遺伝子産物に対するリガン
ドとして単離されたストローマ細胞由来の糖蛋白であ
る。またSCF は、MGF(Williams DE ら Cell 63:167, 19
90) 、KL(Huang Eら Cell 63:225, 1990) 、Steel Fact
or(Witte ON ら Cell 63:5, 1990) とも呼ばれている。
哺乳類では、齧歯類、ヒトに認められており、あらゆる
血液細胞に分化することのできる幹細胞や肥満細胞の増
殖を刺激することが知られている。本発明に関しては、
マウスSCF 、ヒトSCF など脊椎動物由来のSCF のいずれ
かを用いることができる。これらのSCF は由来生物種の
違いこそあれ、機能的には異ならない(Migliaccio G ら
Blood 79:2620, 1992) (Tsuji Kら Blood78:1223, 199
1) 。尤も、ヒト体内投与の際の抗原性を考慮すれば、
より好ましくはヒトSCF を用いることがよい。ここでマ
ウスSCF とは、248 個のアミノ酸からなる分子量70〜90
Kdの糖蛋白質であり (Williams DE ら Cell 63:167, 19
90)(Zsebo KM ら Cell 63:195, 1990) (Huang Eら Cell
63:225, 1990) 、ヒトSCFとは248 個のアミノ酸からな
る糖蛋白質である(Zsebo KM ら平4-502628) (Martin FH
ら Cell 63:203, 1990) (WO91/05795)。本発明で言うSC
F には、既知のSCFのアミノ酸配列そのままのものは勿
論のこと、それらに置換、欠失あるいは付加を施された
ものも、SCF の活性を有する限り含まれる。以下の実施
例においては、マウス体内における試験が必須のため、
種特異性を考慮してマウスSCF を選んだが、これに限定
されるものではない。

【００１０】IL3 は哺乳類では、齧歯類、ヒトに認めら
れるＴ細胞由来のサイトカインの一種として単離された
糖蛋白である。マウス、ヒトともに未分化な造血前駆細
胞の分化増殖、肥満細胞、マクロファージ、顆粒球、巨
核球、赤芽球系のコロニー形成を促進する活性を持つこ
とが知られている。本発明に関してマウスIL3 、ヒトIL
3 など脊椎動物由来のIL3 のいずれかを用いることがで
きる。これらのIL3 は由来生物種の違いこそあれ、機能
的には異ならない(Hapel AJ ら Blood 65:1453, 1985)
(Suda T ら J Cell Physiol 124:182, 1985) (Leary AG
ら Blood 75:1960, 1990) 。ヒト体内投与の際の抗原性
を考慮すれば、より好ましくはヒトIL3を用いることが
よい。ここでマウスIL3 とは140 個のアミノ酸からなる
分子量約28000 の糖蛋白質であり(Fung MCら Nature 30
7:233, 1984)、ヒトIL3 とは133個のアミノ酸からなる
糖蛋白質(Yang YCら Cell 47:3, 1986) である。ここで
言うIL3 とは既知のIL3 のアミノ酸配列そのままのもの
は勿論のこと、それらに置換、欠失あるいは付加を施さ
れていても、IL3 の活性を有する限りこれに含まれる。
以下の実施例においては、マウス体内における試験が必
須のため、種特異性を考慮してマウスIL3 を用いたが、
これに限定されるものではない。

【００１１】GM-CSFは哺乳類では、齧歯類、ヒトに認め
られるコロニー刺激因子(CSF) の一種として単離された
糖蛋白質であり、マウス、ヒトにおいてマクロファー
ジ、顆粒球、好酸球、巨核球コロニーの形成を促進する
活性を持つ。本発明に関し、マウスGM-CSF、ヒトGM-CSF
など脊椎動物由来のGM-CSFのいずれかを用いることがで
きる。これらのGM-CSFは由来生物種の違いこそあれ、機
能的には異ならない(Metcalf D Jら Cell Physiol 128:
421, 1986) (Robinson BE ら J Clin Invest 79:1648,
1987) (Metcalf Dら Blood 67:37, 1986) (Mazur Eら E
xp Hematol 15:1128, 1987) (Migliaccio ARら Blood 7
0:1867, 1987) 。ヒト体内投与の際の抗原性を考慮すれ
ば、より好ましくはヒトGM-CSFを用いることがよい。こ
こでマウスGM-CSFとは124 個のアミノ酸からなる分子量
約23000 の糖蛋白質であり(Gough NM ら EMBO J 4:645,
1985)、ヒトGM-CSFとは127 個のアミノ酸からなる分子
量約22000 の糖蛋白質(Wong GGら Science 228:810, 19
85) である。ここで言うGM-CSFとは、既知のGM-CSFのア
ミノ酸配列そのままのものは勿論のこと、それらに置
換、欠失あるいは付加を施されていてもGM-CSFの活性を
有する限りこれに含まれる。以下の実施例においては、
マウス体内における試験が必須のため、種特異性を考慮
してマウスGM-CSFを用いたが、これに限定されるもので
はない。

【００１２】IL6 は哺乳類では、齧歯類、ヒトに認めら
れるサイトカインの一種であり、Ｂリンパ球の抗体産生
細胞への分化を誘導する機能のほかに、造血幹細胞、巨
核球に対する作用を持つことが知られている。本発明に
関してマウスIL6 、ヒトIL6など脊椎動物由来のIL6 の
いずれかを用いることができる。これらのIL6 は由来生
物種の違いこそあれ、機能的には異ならない(Hirano T
ら Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82:5490, 1985) (Ikebu
chi Kら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9035, 1987)
(Ishibashi T ら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 6:5
953, 1988) 。ここでヒトIL6 は184 個のアミノ酸から
なる分子量約21000 の糖蛋白質であり(Hirano T ら Nat
ure 324:73, 1986) 、マウスIL6 は187 個のアミノ酸か
らなる糖蛋白である。ここで言うIL6 とは既知のIL6 の
アミノ酸配列の置換、欠失あるいは付加を施されていて
もIL6 の活性を有する限りこれに含まれる。

【００１３】

【作用】本発明物を医薬として使用する場合は、経口若
しくは非経口投与によりSCF 、IL3 、GM-CSF、IL6 を有
効成分として治療有効量含む医薬組成物を製剤化し、そ
れを投与する。投与量は、症状の程度、患者の年齢、性
別、体重、感受性差、投与方法、投与時間、投与間隔、
医薬製剤の性質、調剤、医薬製剤の種類、有効成分の種
類などによって一般に変動する。本発明の場合、通常成
人の体重1kg あたり約2 〜4 μg であり、これを通常1
日1 〜3 回にわけて投与する。

【００１４】本発明化合物を製剤化するためには、製剤
の技術分野における慣用的手法により、注射剤、座薬、
舌下錠、錠剤、カプセル剤などの剤型とする。

【００１５】注射剤を調製する場合には、主薬に必要に
よりpH調整剤、緩衝剤、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化
剤、等張化剤、保存剤などを添加し、常法により静脈、
皮下、筋肉内注射剤とする。その際必要により常法によ
る凍結乾燥物とすることも可能である。

【００１６】懸濁化剤としての例を挙げれば、例えばメ
チルセルロース、ポリソルベート80、ヒドロキシエチル
セルロース、アラビアゴム、トラガカント末、カルボキ
シメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノラウレートなどを挙げることができる。

【００１７】溶解補助剤としては、例えばポリオキシエ
チレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート80、ニコチン酸ア
ミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、
マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステルなどを挙
げることができる。

【００１８】また安定化剤としては、例えば亜硫酸ナト
リウム、メタ亜硫酸ナトリウム、エーテルなど、また保
存剤としては、例えばパラオキシ安息香酸メチル、パラ
オキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレ
ゾール、クロロクレゾールなどを挙げることができる。

【００１９】SCF について放射線防護効果を有するとし
た報告は存在する(WO91/05795)。しかしながら、その効
果は放射線を被爆した動物の平均生存日数を、対照群に
比べ約2 日延長し得たにすぎず、放射線照射後2 週間以
内にはSCF 投与群も全て死亡した。これに対して、本発
明は、以下の試験例に示すように、致死線量の放射線を
被爆した動物を100%生存させる、従来の方法では得られ
なかった優れた効果を有する。

【００２０】

【実施例】以下、本発明を更に実施例により説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。

【００２１】〔実施例１〕マウスＳＣＦの調製本実施例は、[Met^-1] マウス SCF^2-164（以下マウスＳ
ＣＦという）をコードするSCF ポリペプチドの大腸菌で
の発現と精製に関するものである。

【００２２】（１）アミノ酸配列及びDNA 配列の情報
（Zsebo ら、Cell,63 ：213, 1990 ）をもとに、プロー
ブＡ［配列番号１］及びプローブＢ［配列番号２］を化
学合成した。今回得ようとしたマウスＳＣＦのアミノ酸
配列は、配列番号３に示すようなシグナルペプチドと１
番目のLys を除いたＮ末端側分泌型ＳＣＦである。

【００２３】上記両プローブを使用して、ホスホリラー
ゼ連鎖反応（PCR ）法（Mullisら、Methods in Enzymo
l.,155 ：335, 1987 ）によりBalb/cマウス由来のｃDNA
ライブラリーからＳＣＦの遺伝子を単離した。この断
片を発現させるため、特表平4-502628明細書の方法に準
じて組換え大腸菌を作成し、マウスSCF を発現させた。

【００２４】挿入された遺伝子の塩基配列を、ダイデオ
キシ法（Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 74：546
3, 1977) によって、開始コドン(ATG) より上流15bp、
下流210bp について調べたところ、配列番号４と一致
し、予想通りの塩基配列が挿入できたと考えられた。

【００２５】（２）培養で得た菌体（湿潤重量55ｇ）を
500ml の蒸留水に懸濁し、氷冷下に8000psi の圧力下、
実験室用ホモジナイザー（ラニー社、MINI-LAB,type8.3
0H）に５回通液して破砕した。遠心（5000×ｇ、10分
間、４℃）により破砕した細胞ペレット画分を得、２度
水洗（再懸濁と再遠心）した。不溶性マウスSCF を含む
ペレット画分に、44mlの10Ｍ尿素、2.75mlの1 Ｍトリス
塩酸(pH8.5) 、8.25mlの蒸留水、0.84ｇのDTT を加え溶
解した。遠心分離（10000 ×ｇ、４℃、10分間）により
不溶物を除去した。可溶化したマウスSCF の上澄液を、
8 Ｍ尿素を含む50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.5 ）に対し
て透析した。充分に透析した後、再度遠心分離（16000
×ｇ、４℃、15分間）し不溶物を除いた。可溶化したマ
ウスSCF をリフォールディングするために、5.5 Ｌの溶
液A （50mMトリス塩酸（pH8.5)、2 Ｍ尿素、2mM 還元型
グルタチオン、0.2mM 酸化型グルタチオン、1mM PMSF塩
酸塩）を加え、室温で１昼夜放置した。この液を分画分
子量10000 のポリスルホン製限外瀘過膜（ミリポア社）
により１Ｌまで濃縮し、さらに酢酸によりpHを4 に調整
した。析出した沈殿物を除去するため遠心分離（10000
×ｇ、4 ℃、20分間）を行った。この上澄液のpHを8 に
調整するために、粉末のトリスを添加した。この液をあ
らかじめ20mMのトリス塩酸緩衝液（pH8.0 ）で平衡化し
たDEAEセファロースFF樹脂（ファルマシア社）を充填し
たカラムにアプライし、0 から150mM のNaClを含む20mM
トリス塩酸緩衝液の直線濃度勾配により溶出した。得ら
れた溶出液に終濃度として1.2 Ｍになるように硫酸アン
モニウムを加え、あらかじめ1.2 Ｍ硫酸アンモニウムを
含む20mMトリス塩酸緩衝液で平衡化したフェニルトヨパ
ール樹脂を充填したカラムに供した。溶出液の硫酸アン
モニウム濃度を直線的に減少させマウスSCF を溶出させ
た。この溶出液を限外瀘過膜により40mlまで濃縮し、セ
ファクリルＳ-200（ファルマシア社）を充填したカラム
に供した。溶出液はダルベッコPBS （日水製薬社製）で
あった。ここで得られたマウスSCF を孔径0.22μm のメ
ンブレンフィルターで無菌的に瀘過したものを、精製標
品として各種の試験に用いた。このときの収量は約40mg
であった。精製されたマウスSCF をSDS-PAGEで調べたと
ころ、アミノ酸配列から予想された分子量約18 kD の位
置に単一のバンドを示した。また得られたマウスSCF
は、肥満細胞の増殖活性を保持していた(Anderson,M.D.
ら,Cell ,63 :235, 1990) 。

【００２６】〔実施例２〕マウスＩＬ３の調製本実施例は、[Met^-1] マウスIL3 （以下マウスIL3 ）の
大腸菌での発現と精製に関するものである。

【００２７】（１）マウスIL3 のアミノ酸配列（Schrad
erら,Ann.Rev.Immunol. 4:205, 1986)をコードする遺伝
子を配列番号５のように合成した。

【００２８】この合成DNA を特開昭63-269983 の方法に
準じて組換え大腸菌を作成しマウスIL3 を発現させた。

【００２９】（２）培養で得た菌体10.5ｇ（湿重量）を
20mlの1mM DTT を含む20mMトリス塩酸緩衝液に懸濁し
た。これをフレンチプレス細胞破砕機で8000psi の圧力
下、菌体を破砕した。この破砕液を5000×ｇ、４℃で10
分間の条件で遠心分離し沈殿画分を得た。この画分を蒸
留水で3 回洗浄し以後の操作に供した。得られた沈殿画
分に１mlの1Mトリス塩酸緩衝液（pH9.2 ）11.5mlの蒸留
水を加え、充分に懸濁した。37.5mlの8 Ｍ塩酸グアニジ
ンを加え、1 時間穏やかに攪拌した。この可溶化液に15
0ml の20mMトリス塩酸緩衝液（pH9.2)を徐々に加えた。
さらに還元型グルタチオン、酸化型グルタチオンを各々
2 、0.2mM になるように加えた。３日間放置した後、20
mMトリス塩酸緩衝液（pH7.3 ）に対して充分透析し遠心
分離により不溶物を除去した。この液をあらかじめ20mM
トリス塩酸緩衝液（pH7.3 ）で平衡化したDEAEセファロ
ースFF（ファルマシア社）にアプライし、その非吸着画
分を回収した。この画分を20mM酢酸ナトリウム緩衝液
（pH5.4)に対して透析し、あらかじめ透析液で平衡化し
たCMセファロースFFカラムにアプライした。100 から25
0mM のNaClを含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.4)の
直線濃度勾配により溶出し、マウスIL3 を含む画分を無
菌瀘過し精製標品とした。なお収量は約0.5mg であっ
た。

【００３０】この標品をマウスの骨髄細胞を用いたコロ
ニー法でその比活性を測定したところ、4.6 ×10⁹U/mg
であった。またSDS-PAGEで調べたところアミノ酸配列か
ら予想される分子量である約14kDのところに単一のバン
ドを認めた。

【００３１】〔実施例３〕マウスGM-CSFの調製本実施例は、[Met^-1] マウスGM-CSF（以下マウスGM-CS
F）の大腸菌での発現と精製に関するものである。

【００３２】（１）既に公表されているマウスGM-CSFの
アミノ酸配列(Miyatake ら.,EMBO J.,4:2561, 1985）を
参考に、マウスGM-CSFの構造遺伝子〔配列番号６〕を化
学合成した。

【００３３】合成した遺伝子を常法に従い、クローニン
グ用ベクターpUC18 のHindIII-BamHI 間に挿入した。こ
こで塩基配列を確認したあと、特開昭63-269983 明細書
の方法に準じて大腸菌に組み込みマウスGM-CSFを発現さ
せた。

【００３４】（２）培養で得た菌体20ｇを45mlの蒸留水
に懸濁し、8000psi の圧力下、菌体を破砕した。破砕液
を10000 ×ｇ、４℃、10分間遠心分離し不溶物を得た。
これを100ml の蒸留水で2 回洗浄したのち、20mlの蒸留
水、6.7ml の１M トリス塩酸（pH9.7)、107ml の10M 尿
素を添加し、完全に溶解した。この溶液に400ml の50mM
トリス塩酸(pH9.7) を添加し、還元型グルタチオン319m
g 、酸化型グルタチオン97mgを添加し、４℃に放置し
た。１昼夜ののち、26mlの1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH
5.4 ）を添加し、50％酢酸でpHを5.4 に調整した。不溶
化した不純物を除去するため、10000 ×ｇ、４℃、10分
間の条件で遠心分離し、マウスGM-CSFを含む上澄液を得
た。この上澄液を20mM酢酸ナトリウム緩衝液で平衡化し
たCMセファロースFFカラムに供した。溶出は0 から200m
M のNaClを含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.4) の直
線濃度勾配により行なった。ここで得られたマウスGM-C
SFを含む溶出液を限外瀘過膜（アミコン社) で濃縮し
た。これをあらかじめ塩酸でｐＨを6 に調整したダルベ
ッコPBS で平衡化したセファクリルＳ200 （ファルマシ
ア社）に供した。溶出は平衡化に用いたものと同じであ
る。得られたマウスGM-CSFを孔径0.22μm のメンブレン
フィルターで無菌的に瀘過したものを、精製標品として
各種の試験に用いた。また最終収量は56mgであった。

【００３５】ここで得られたマウスGM-CSFは、マウスの
骨髄細胞を用いたコロニー形成試験により活性が確認さ
れた。さらに、電気泳動試験で調べたところアミノ酸配
列から予想された分子量の位置に単一のバンドを認め
た。

【００３６】〔実施例４〕IL6 の調製本実施例は、[Met^-1 Lys^-2] ヒトIL6 （以下ヒトIL6 ）
の大腸菌での発現と精製に関するものである。

【００３７】（１）既に公表されているヒトIL6 のアミ
ノ酸配列（Haegemanら,Eur.J.Biochem.,159:625, 1986
）を参考に、Souza 等の方法（特表昭63-500636 ）に
準じてヒトIL6 アミノ酸をコードするＤＮＡを化学合成
し、大腸菌に組み込み、特開平4-218000と同様にヒトIL
6 を発現させた。調製した組換え大腸菌で発現されるヒ
トIL6 の特徴は、タンパク分解酵素の一種であるカテプ
シンＣでN 末端のMet Lysを切除することにより、Ｎ末
端がAla から始まるヒトIL6 を製造できることである。
但し、今回はこの処理は行なっていない。

【００３８】（２）ヒトIL6 の抽出、可溶化、リフォー
ルディングは特開昭63-157996 の方法に従って行なっ
た。

【００３９】大腸菌（50ｇ；湿重量）を50mlの蒸留水に
懸濁し、フレンチプレス破砕機により8000psi の加圧下
で破砕した。この破砕液を４℃、5000×ｇで遠心分離
し、沈殿画分を回収した。この沈殿を35mlの蒸留水で懸
濁し、さらに12mlの1 Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.5
）、180ml の8 Ｍグアニジン塩酸液を加えてゆっくり
攪拌した。ヒトIL6 を含む沈殿画分が完全に溶解してか
ら、2500mlの20mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.5 ）をさら
に加え、希釈した。この液を４℃でゆっくり18時間攪拌
した。この液をペリコンカセットシステム（ミリポア
社）で400ml まで濃縮したあと、20mMのトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ9.0 ）で透析した。この液をＱセファロースＦ
Ｆカラム（ファルマシア社）（長さ10cm, 直径3cm ）に
アプライし、20mMトリス塩酸緩衝液に300mM のNaClを含
む溶出緩衝液で溶出した。ヒトIL6 を含む画分を20mM酢
酸ナトリウム緩衝液で透析し、CMセファロースFF（ファ
ルマシア社）カラム（高さ10cm, 直径3cm ）にアプライ
した。溶出は0 から300mM のNaClを含む、20mM酢酸ナト
リウム緩衝液の直線濃度勾配法により行なった。ヒトIL
6 を含む画分を集めこれをメンブレンフィルター（孔径
0.22μm ）で無菌化した後、各種の動物試験に用いた。
なお最終的な収量は約45mgであった。この標品をSDS-PA
GE分析したところ、アミノ酸配列から予想される分子量
である21Kdあたりに単一のバンドを認めた。

【００４０】このヒトIL6 のSKW6.4細胞からのIgM 放出
活性による比活性を調べたところ、1 ×10⁷U/mgであっ
た（Hiranoら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82:5490, 198
5 ）。

【００４１】SCF 、IL3 、GM-CSFについてはマウス型の
因子を実施例で使用したが、実際ヒトに適用する場合
は、当然ヒト型の各因子を用いることが望まれる。本発
明者は各々のヒト型因子も実際に調製しており、例えば
SCF に関しては、特表平4-502628明細書に準ずることに
より調製することができた。また、GM-CSFとIL3 に関し
てもそれぞれ、特開昭63-269983 、特開平2-482 明細書
に準じて調製することができた。

【００４２】〔調剤例〕遺伝子組換え型のマウスSCF 、
マウスIL3 、マウスGM-CSF及びヒトIL6 を、各因子の濃
度を6.7 μg/mlとして、5ml のPBS に混合し溶解させ調
剤した。同様に、遺伝子組換え型のヒトSCF 、ヒトIL3
、ヒトGM-CSF及びヒトIL6 を、各因子の濃度を6.7 μg
/mlとして5ml のPBS に混合し溶解させ調剤した。

【００４３】〔試験例〕5 〜6 週令の雄性BDF1マウス
（日本チャールズリバー）に対して、8.0 グレイのＸ線
を全身照射(MBR-1520R、日立メディコ製、管電圧:150K
V、管電流:20mA 、フィルター:0.5mmAl/0.1mmCu、焦点
距離:35cm 、線量率:3.6グレイ/min) した。Ｘ線照射直
後より、マウス尾静脈より調剤例に示した医薬組成物を
1 日3 回(1回50μl)（各因子1 μg/マウス/ 日）のスケ
ジュールで6 日間投与した。対照群として同量のPBS を
投与した。以上の3 群のそれぞれは5 匹のマウスから構
成された。マウスの生存状況は日々観察した。対照群が
Ｘ線照射後約2 週間目から死亡しはじめ、照射後30日内
に全て死亡したのに対して、投与群は照射後30日を過ぎ
ても100%生存した。

【００４４】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：５６配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AACTCTAGAA AAAACCAAGG AGGTAATAAA TAATGGAGAT CTGCGGGAAT CCTGTG 56 配列番号：２配列の長さ：３６配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AACCTCGAGC TATTATGCAA CAGGGGGTAA CATAAA 36 配列番号：３配列の長さ：１６４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Glu Ile Cys Gly Asn Pro Val Thr Asp Asn Val Lys Asp Ile Thr 1 5 10 15 Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Asn Asp Tyr Met Ile Thr Leu Asn Tyr 20 25 30 Val Ala Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Leu Arg Asp Met 35 40 45 Val Ile Gln Leu Ser Leu Ser Leu Thr Thr Leu Leu Asp Lys Phe Ser 50 55 60 Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Gly 65 70 75 80 Lys Ile Val Asp Asp Leu Val Leu Cys Met Glu Glu Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Asn Ile Lys Glu Ser Pro Lys Arg Pro Glu Thr Arg Ser Phe Thr Pro 100 105 110 Glu Glu Phe Phe Ser Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp 115 120 125 Phe Met Val Ala Ser Asp Thr Ser Asp Cys Val Leu Ser Ser Thr Leu 130 135 140 Gly Pro Glu Lys Asp Ser Arg Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met Leu 145 150 155 160 Pro Pro Val Ala 配列番号：４配列の長さ：５３０配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 cＤＮＡ to genomic ＲＮＡ配列 CTAGAAAAAC CAAGGAGGTA ATAAATA ATG GAG ATC TGC GGG AAT CCT GTG 51 Met Glu Ile Cys Gly Asn Pro Val 1 5 ACT GAT AAT GTA AAA GAC ATT ACA AAA CTG GTG GCA AAT CTT CCA AAT 99 Thr Asp Asn Val Lys Asp Ile Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Asn 10 15 20 GAC TAT ATG ATA ACC CTC AAC TAT GTC GCC GGG ATG GAT GTT TTG CCT 147 Asp Tyr Met Ile Thr Leu Asn Tyr Val Ala Gly Met Asp Val Leu Pro 25 30 35 40 AGT CAT TGT TGG CTA CGA GAT ATG GTA ATA CAA TTA TCA CTC AGC TTG 195 Ser His Cys Trp Leu Arg Asp Met Val Ile Gln Leu Ser Leu Ser Leu 45 50 55 ACT ACT CTT CTG GAC AAG TTC TCA AAT ATT TCT GAA GGC TTG AGT AAT 243 Thr Thr Leu Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn 60 65 70 TAC TCC ATC ATA GAC AAA CTT GGG AAA ATA GTG GAT GAC CTC GTG TTA 291 Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Gly Lys Ile Val Asp Asp Leu Val Leu 75 80 85 TGC ATG GAA GAA AAC GCA CCG AAG AAT ATA AAA GAA TCT CCG AAG AGG 339 Cys Met Glu Glu Asn Ala Pro Lys Asn Ile Lys Glu Ser Pro Lys Arg 90 95 100 CCA GAA ACT AGA TCC TTT ACT CCT GAA GAA TTC TTT AGT ATT TTC AAT 387 Pro Glu Thr Arg Ser Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Ser Ile Phe Asn 105 110 115 120 AGA TCC ATT GAT GCC TTT AAG GAC TTT ATG GTG GCA TCT GAC ACT AGT 435 Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp Phe Met Val Ala Ser Asp Thr Ser 125 130 135 GAC TGT GTG CTC TCT TCA ACA TTA GGT CCC GAG AAA GAT TCC AGA GTC 483 Asp Cys Val Leu Ser Ser Thr Leu Gly Pro Glu Lys Asp Ser Arg Val 140 145 150 AGT GTC ACA AAA CCA TTT ATG TTA CCC CCT GTT GCA TAATAGCTCG A 530 Ser Val Thr Lys Pro Phe Met Leu Pro Pro Val Ala 155 160 配列番号：５配列の長さ：４５３配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AAGCTTAAGG AGGTATATTA TGGCAAGTAT TTCAGGACGC GATACCCATC GTCTGACCCG 60 TACCCTGAAC TGCAGCAGCA TCGTTAAAGA AATTATTGGC AAGTTGCCGG AACCTGAACT 120 GAAAACTGAC GACGAGGGCC CTAGCCTGCG TAACAAATCT TTTCGTCGTG TTAACCTGAG 180 CAAATTCGTT GAAAGCCAGG GTGAAGTCGA CCCTGAAGAT CGTTACGTAA TCAAATCTAA 240 TTTACAGAAA CTGAACTGTT GTCTGCCGAC CAGCGCTAAT GATTCTGCTT TACCTGGCGT 300 GTTTATTCGC GACCTGGATG ATTTCCGTAA AAAACTGCGC TTCTATATGG TTCACTTAAA 360 CGATCTTGAA ACCGTTCTGA CTTCTAGACC ACCTCAGCCG GCTAGCGGTT CTGTTTCTCC 420 GAACCGTGGT ACCGTTGAAT GCTAATTAGG ATC 453 配列番号：６配列の長さ：４０６配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AAGCTTAAGG AGGTATATTA TGGCACCAAC TCGATCACCC ATCACTGTCA CGCGTCCTTG 60 GAAGCATGTA GAGGCCATCA AAGAAGCCCT GAACCTCCTG GATGACATGC CTGTCACGTT 120 GAATGAAGAG GTAGAAGTCG TCTCTAACGA GTTCTCCTTC AAGAAGCTAA CATGTGTGCA 180 GACCCGCCTG AAGATATTCG AGCAGGGTCT ACGGGGCAAT TTCACCAAAC TCAAGGGCGC 240 CTTGAACATG ACAGCCAGCT ACTACCAGAC ATACTGCCCC CCAACTCCGG AAACGGACTG 300 TGAAACACAA GTTACCACCT ATGCGGATTT CATAGACAGC CTTAAAACCT TTCTGACTGA 360 TATCCCCTTT GAATGCAAAA AACCAGGCCA AAAATGATAA GGATCC 406

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ｘ線照射後日数とマウス生存率の関係
を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＳＣＦ、ＩＬ３、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ
６から成る、医薬組成物。
【請求項２】ＳＣＦ、ＩＬ３、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ
６から成る、放射線障害防護剤。