DK173279B1 - Rekombinant IL-6, fremgangsmåde til dets fremstilling og vektor til brug ved denne fremstilling samt dets anvendelse - Google Patents

Description

i DK 173279 B1

Opfindelsen angår rekombinant IL-6, fremstillingen af dette stof og en vektor til brug ved denne fremgangsmåde samt nye fremgangsmåder til anvendelse af dette humane protein, som deltager i immunregulering.

5 Hæmatopoietiner eller hæmatopoietiske vækstfaktorer er proteiner, der fremmer overlevelsen, væksten og differentieringen af hæmatopoietiske celler. Den biokemiske og biologiske identifikation og karakterisering af visse hæmatopoietiner er blevet hæmmet af små mængder faktorer, der kan 10 fås fra naturlige kilder, f.eks. blod og urin. Nogle af disse hæmatopoietiner er imidlertid blevet klonet molekylært med rekombinant genmanipulationsteknik, udtrykt heterologt og renset til homogenitet. Blandt disse hæmatopoietiner er kolonistimulerende faktorer (CSF'er) karakteriseret ved 15 evnen til at understøtte væksten in vitro af kolonier af hæmatopoietiske celler, der stammer fra stamceller i knoglemarv, fosterlever og andre organer, f.eks. GM-CSF, G-SCF, CSF-1 og IL-3, jfr. f.eks. D. Metcalf. Blood. £7(2), s. 257-267 (1986), Y. C. Yant m.fl. Cell. £(1) , s. 3-10 (1986), 20 og R. Donahue m.fl. Nature. 321. s. 872-875 (1986).

Efter indleveringsdatoen for prioritetsansøgningerne i USA er der udgivet adskillige publikationer af andre forskere, der beskriver proteiner karakteriseret ved andre biologiske aktiviteter og navne, der er identiske med det 25 hidtil ukendte protein, betegnet IL-6, beskrevet heri og i prioritetsansøgningerne, jfr. Haegemanm.fi., Eur. J. Bio-chem., 159. s. 625-632 (1986) og de deri citerede referencer [26 kD proteinet, der kan indføres i humane fibroblaster]; Zilbersteinm.fi. EMBOJ., 5, s. 2529-2537, (1986) [IFN-B-2 30 med svag interferonvirkning]; og Hirano m.fl., Nature, 324. s. 73-76 (1986) [BCDF eller BSF-2 for dets B-celle-stimule-rende virkning], og endvidere europæisk offentliggørelsesskrift nr. 220.574. Adskillige af disse skrifter omhandler rensning af det naturlige stof.

35 Fig. 1 illustrerer den fuldstændige cDNA- og amino syre -sekvens for IL-6.

2 DK 173279 B1

Fig. 2 illustrerer en modificeret cDNA-sekvens, der er særlig egnet til bakterieekspression af IL-6.

Fig. 3 illustrerer konstruktionen af plasmidet pAL-Sec-IL6-181.

5 Fig. 4 illustrerer den CI-allele for det hyperse- kreterende bakterieekspressionssystem.

Et aspekt af opfindelsen angår en fremgangsmåde til I fremstilling af IL-6, ved hvilken en passende celle trans formeret med en cDNA-sekvens, der koder for et protein, der 10 er ejendommeligt ved, at det indeholder en peptidsekvens, der omfatter i hovedsagen den samme sekvens som den fra aminosyre nr. 2 8 til aminosyre nr. 212 i fig 1, dyrkes. cDNA-sekvensen er ved denne fremgangsmåde i operativ forbindelse med en ekspressionskontrolsekvens for denne. Frem-15 gangsmåden til fremstilling af IL-6 kan også anvende en cDNA-sekvens, der i hovedsagen er den samme som den fuldstændige nucleotidsekvens i fig. 1.

Et andet aspekt tilvejebringer en fremgangsmåde til fremstilling af ikke-glycosyleret IL-6. Denne fremgangsmåde 20 omfatter dyrkning af en passende bakteriecelle transformeret med en cDNA-sekvens, der koder for et protein, som er ejen- tt dommeligt ved, at det indeholder en peptidsekvens, der i hovedsagen omfatter den samme sekvens som den for aminosyre nr. 28 til aminosyre nr. 211 på fig. 2. cDNA-sekvensen, der 25 anvendes ved denne fremgangsmåde står, også i operativ forbindelse med en passende ekspressionskontrolsekvens.

Endnu et aspekt af opfindelsen tilvejebringer transformationsvektorer, der er nyttige ved fremgangsmåderne ifølge opfindelsen. Disse vektorer indeholder DNA-sekvenser, 3 0 der er de samme som eller så godt som de samme som dem i fig. 1 eller fig. 2 under kontrol af passende ekspressionskontrolsekvenser.

Som endnu et aspekt omfatter opfindelsen det humane IL-6-protein, i det væsentlige frit for associering med 35 andre proteiner. IL-6 kan fremstilles ved en vilkårlig af de ovenfor beskrevne fremgangsmåder og kan således være et * 3 DK 173279 B1 glycosyleret protein eller et ikke-glycosyleret protein.

Ved endnu et aspekt tilvejebringes der et farmaceutisk præparat, der omfatter en effektiv mængde IL-6 ifølge opfindelsen, Opfindelsen kan yderligere indeholde en effektiv 5 mængde af mindst ét hæmotopoietin, interleukin, vækstfaktor eller antistof, mest foretrukket et af de to proteiner IL-3 og IL-2. Det terapeutiske præparat, som indeholder IL-6, især i kombination med IL-2 og yderligere i kombination med -r--interferon, kan være nyttigt til behandling af cancer.

10 De terapeutiske præparater ifølge opfindelsen kan anvendes til behandling af humane patienter med sygdomme, der er karakteristiske ved ødelagte immunsystemfunktioner, ved indgivelse til patienten af en effektiv mængde af IL-6--peptidet. Denne terapeutiske fremgangsmåde kan yderligere 15 medføre co-administrering til en patient af en effektiv mængde IL-2 eller IL-3. Ved behandlingen af cancere kan den terapeutiske metode yderligere omfatte co-administrering af en effektiv mængde ύ-interferon sammen med IL-6 og IL-2. Andre hæmatopoietiner, vækstfaktorer eller antistoffer samt 20 andre gængse terapeutiske midler kan også kombineres med IL-6.

Andre aspekter og fordele ved den foreliggende opfindelse vil fremgå ved betragtning af den følgende detaljerede beskrivelse af opfindelsen, herunder udførelseseksempler 25 til at illustrere den.

Opfindelsen tilvejebringer en fremgangsmåde til fremstilling af humant IL-6, der i hovedsagen er frit for associering med andre humane proteiner. Fremstillingsmetoden ifølge opfindelsen omfatter dyrkning af en værtscelle, der 30 er transformeret med en DNA-sekvens, der koder for IL-6- -proteinet, og som er under kontrol af passende ekspressionskontrolsekvenser. DNA-sekvensen, der koder for IL-6-prote-inet, indeholder den samme nucleotidsekvens eller så godt som den samme nucleotidsekvens som nucleotid nr. 132 til 35 nucleotid nr. 689 eller nucleotid nr. 51 til nucleotid nr.

1139 som afbildet i fig. 1. En cDNA-sekvens til anvendelse 4 DK 173279 B1 af denne fremgangsmåde omfatter den fuldstændige nucleotid-sekvens i fig. 1. DNA-sekvensen i fig. l på ca. 1,1 kb DNA er skjult i plasmidet pCSF309 i E. coli MC1061, der blev deponeret i American Type Culture Collection, 12301 Parklawn 5 Dr., Rockville, MD den 11. juli 1986 og fig. tildelt deponeringsnummer ATCC 67153.

En foretrukken udførelsesform for en DNA-sekvens, der koder for IL-6, til anvendelse ved denne fremgangsmåde er sekvensen i fig. 2, der på tilsigtet måde er tilpasset 10 til ekspression i bakterieceller. Anvendelse af allele varianter (dvs. naturligt forekommende forandringer i baser i sekvensen, der forekommer indenfor en art, og som eventuelt kan ændre aminosyresekvensen) af nucleotidsekvenserne og de tilsvarende peptidsekvenser i fig. 1 og 2 og varianter i 15 nucleotidsekvensen, der er resultat af degeneration af den genetiske kode, omfattes også af opfindelsen, når de koder for et polypeptid med IL-6-virkning.

Variationer i sekvensen på 1,1 kb i fig. 1, der er forårsaget af punktmutationer eller af inducerede modifika-1 20 tioner til forbedring af proteinets virkning eller fremstil ling, bør ikke forandre det funktionelle protein, for hvilket sekvensen koder. Derfor er sådanne variationer i sekvensen omfattet af opfindelsen. Således foretrækkes den modificerede sekvens i fig. 2 for tiden til ekspression i bakterieværts-25 celler. Sådanne nucleotidmodifikationer, der på tilsigtet måde er indført i DNA-sekvensen eller indført i en ved kendte fremgangsmåder syntetisk fremstillet sekvens, kan udføres af en fagmand ved anvendelse af kendt teknik. En sådan modifikation kan bevirke fjernelse, indsættelse eller udskiftning 30 af aminosyrer i peptidsekvensen i IL-6. Således kan udskiftningen af en eller flere cysteingrupper i den kodende sekvens eliminere en tilsvarende disulfidbro. Desuden kan udskiftning, indsættes eller fjernes af en aminosyre på et eller flere af de tripeptid-asparaginbundne glycosylerings-genken-35 delsessteder føre til ikke-glycosylering på det sted. Muta-z genteknik til sådan udskiftning eller fjernelse er velkendt DK 173279 B1 - 5 for en fagmand, jfr. USA-patentskrift nr. 4.518.584.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter dyrkning af en passende celle, eller cellelinie, der er transformeret med en cDNA-sekvens, der koder for 11-6, herunder modifice-5 rede sekvenser som beskrevet ovenfor og som repræsenteret i fig. 1 og 2. DNA-sekvensen, der koder for IL-6 i den transformerede celle er i operativ forbindelse med en passende ekspressionskontrolsekvens.

Valget af passende værtsceller og fremgangsmåder til 10 transformering, dyrkning, formering, screening og fremstilling og rensning af produkt er kendt teknik, jfr. f.eks. Gething og Sambrook, Nature, %93 620-625 (1981), eller alternativt, Kaufman m.fl., Mol. Cell. Biol., 5(7), 1750- -1759 (1985) eller USA-patentskrift nr. 4.419.446.

15 Bakterieceller er den for tiden foretrukne form for værtsceller i fremgangsmåden til fremstilling af IL-6. Bakteriel produktion fører til store mængder aktivt, ikke-gly-cosyleret IL-6. Den for tiden foretrukne IL-6-sekvens til bakteriel ekspression af proteinet er den modificerede se-20 kvens i fig. 2. Når IL-6 udtrykkes i bakterieceller, kan det udtrykkes intracellulært og foldes tilbage i aktiv form, eller det kan udskilles fra bakterieceller i aktiv form. Forskellige stammer af E. coli, der er velkendte som værtsceller på det bioteknologiske område, f.eks. stammen MC1061 25 og stammerne beskrevet i eksemplerne, må ønskes anvendt som værtsceller, der muliggør fremstillingen af biologisk aktivt IL-6. En ikke-udelukkende liste over forskellige bakteriestammer, der er egnet til ekspression af IL-6, omfatter B. subtilis, forskellige stammer af Pseudomonas, andre bacil-30 ler og lignende.

Pattedyrsceller kan også anvendes som værtsceller til fremstilling af IL-6. En særlig egnet pattedyrscellelinie er ovariecellelinien fra kinesisk hamster (CHO). En anden egnet pattedyrscellelinie, der beskrives i de følgende ek-35 sempler, er abe-COS-l-cellelinien. En tilsvarende nyttig pattedyrscellelinie er CV-1-cellelinien.

6 DK 173279 B1

Mange stammer af gærceller, som kendes af fagmænd, er også tilgængelige som værtsceller til ekspression af IL-6. Endvidere kan insektceller om ønsket anvendes som værtsceller ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, jfr.

5 f.eks. Miller m.fl., Genetic Engineering, 8,, s. 277-298 (Plenum Press 1988) og de deri citerede referencer.

Opfindelsen tilvejebringer desuden vektorer og DNA--sekvenser til anvendelse ved fremgangsmåden til ekspression af IL-6-protein. Vektorerne indeholder de samme eller så ; 10 godt som de samme nucleotidsekvenser som nævnt ovenfor.

Fortrinsvis indeholder vektorerne den fuldstændige DNA-sekvens, som gengives i fig. l eller fig. 2. Vektorerne kan også indeholde passende ekspressionskontrolsekvenser, som tillader ekspression af DNA-sekvensen for IL-6. Alternativt 15 er vektorer med inkorporerede modificerede eller naturligt forekommende allele sekvenser som beskrevet heri også udførelsesformer for opfindelsen og nyttige ved fremstillingen af 11-6. Vektoren kan anvendes ved fremgangsmåden til transformering af cellelinier og kan indeholde udvalgte regule-20 ringssekvenser i operativ forbindelse med de ovenfor beskrevne DNA-sekvenser, der koder for IL-6, og som er i stand til at styre replikationen og ekspressionen deraf i udvalgte værtsceller. Nyttige reguleringssekvenser til sådanne vektorer er kendt af en fagmand og kan vælges afhængigt af de 25 valgte værtsceller. Et sådant valg er rutine og betragtes ikke som en del af den foreliggende opfindelse. Foretrukne vektorer er bakterievektorer.

Proteinet IL-6 er i sig selv et andet aspekt af opfindelsen. Proteinet IL-6 fås så godt som frit for associe-30 ring med andre humane proteiner på grund af tilvejebringelsen af dets peptid- og nucleotidsekvenser, der muliggør syntesen af peptidet ved gængse gelmanipulationsmetoder eller fremstillingen deraf i rekombinante mikroorganismer. En ønskelig udførelsesform for proteinet IL-6 er ikke-glycosyleret 35 IL-6, der kan fremstilles ved bakteriel ekspression af genet.

^ IL-6 er ejendommeligt ved en peptidsekvens, der indeholder 7 DK 173279 B1 den samme eller hovedsagelig den samme peptidsekvens som aminosyre nr. 28 til aminosyre nr. 212, afbildet i fig. 1.

IL-6, som fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, karakteriseres ved en tilsyneladende molvægt på ca. 20 til 5 35 kD, når det analyseres ved polyacrylamid-SDS-gelelektro- forese under ikke-reducerende betingelser. I pCSF309-kon-ditionerede medier bevirker proteinet dannelse af små kolonier af granulocyt-type i museknoglemarvsanalyser in vitro ved koncentrationer på 10 til 100 picomolær.

10 Fig. 1 afbilder den fuldstændige DNA-sekvens på 1,1 kb, der koder for IL-6-proteinet og muliggør ekspression i passende værtsceller. Denne sekvens indeholder en lang åben translations-læseramme på 636 nucleotider, der koder for et polypeptid på 212 aminosyrer, herunder en gængs signal-se-15 kretionssekvens på ca. 50 nucleotider. Det område af sekvensen på 1,1 kb, der koder for protein, strækker sig fra nu-cleotid nr. 132 (guaninet i alanin-kodonet, aminosyre nr.

28) til nucleotid nr. 686, der efterfølges af en stopkodon TAG. Der er to potentielle asparaginbundne glycosylerings-20 steder illustreret ved den karakteristiske sekvens, Asn-X--Ser, der kan glycosyleres efter ekspression af genet i pattedyrsekspressionssystemer. Det kodende område indeholder også fire cysteiner, hvilket antyder to disulfidbindinger.

De øvrige 453 nucleotider i den 31-ikke-kodende sekvens af 25 området på 1,1 kb kan have en regulerende rolle ved tran-skriptionen i den naturlige vært. Sekvensens 3'-ende indeholder også et AT-rigt segment, der omfatter adskillige gentagelser af sekvensen ATTTA, der menes at stå i forhold til stabiliteten af RNA-budskabet, jfr. G. Shaw og R. Kamen, 30 Cell, 46(5), S. 659-677 (1986).

Den foretrukne sekvens til bakteriel ekspression, som vises i fig. 2, har den samme peptidsekvens som fig. 1, men har en selektivt modificeret nucleotidsekvens til forbedring af produktionen af IL-6 i bakterielle ekspressions-35 systemer. Desuden har denne foretrukne sekvens slettet meget af signalsekvensen og den 31-ikke-kodende sekvens, der ses 8 DK 173279 B1 i fig. l.

En foretrukken udførelsesform af opfindelsen er bakterielt fremstillet ikke-glycosyleret IL-6. Når det fremstilles i bakterieceller skæres alaninet i stilling 28 i 5 den protein-kodende sekvens generelt fra af bakterieenzymer. Derfor har ca. 80% af det bakterielt fremstillede IL-6-pro-tein prolin, stilling 29, som sin 5-initiale aminosyre. Bakterielt fremstillet IL-6 er ikke-glycosyleret og har som følge deraf en mere homogen tilsyneladende molvægt end IL-6 10 fremstillet i andre ekspressionssystemer. Desuden fås bakterielt fremstillet IL-6, når der kodes af DNA-sekvensen i fig. 2, i høje bytter.

Fremgangsmåder og terapeutiske præparater kan anvende IL-6 som mindst én aktiv bestanddel. IL-6 kan anvendes alene 15 eller indgives sammen med andre terapeutiske midler ved behandling af sygdomme, der er karakteristiske ved et forringet niveau af enten marv- eller lymfeceller i det hæma-topoietiske system eller kombinationer deraf. Dette protein kan også være i stand til at stimulere underordnede og modne 20 celler, f.eks. monocytter, til fremstilling af andre hæma-topoietinlignende faktorer, som videre stimulerer dannelsen af kolonier af andre hæmatopoietiske celler og andre hæma-topoietinlignende virkninger. Alternativt kan IL-6 forbedre virkningen af andre hæmatopoietiner. Således har IL-6 i en 25 5-fluoruracilbehandlet museknoglemarvsanalyse vist evne til at forbedre evnen af andre hæmatopoietiner, især IL-3 og CSF-1, til stimulering af proliferationen af hæmatopoietiske celler, der er mere primitive end de af CSF-1 eller IL-3 alene inducerede. Denne karakteristik er tidligere blevet 30 tilordnet et protein betegnet IL-1-α eller hæmatopoietin 1, der kan indføre ekspression af IL-6. Tilsvarende bevirker IL-6 og IL-3 i kombination i en human blastcelleanalyse proliferationen af tidlige humane stamcellekolonier. Således har IL-6 en potentiel farmaceutisk anvendelse i kom-35 bination med IL-3 ved behandlingen af mange sygdomstilstande, der omfatter immunsystemdefekter, f.eks. ved behandling af 9 DK 173279 B1 personer, der lider af overeksponering af radioaktivitet eller kemoterapi.

Forskellige immundefekter, f.eks. i T- og/eller B--lymfocytter, eller immunforstyrrelser, f.eks. rheumatoid 5 arthritis, kan også med fordel udføres ved behandling med IL-6. Immundefekter, såsom leukopeni, en nedsættelse af antallet af cirkulerende leukocytter i det perifere blod, kan være resultatet af virusinfektioner, f.eks. HTLVI, HTLVII, HIV, alvorlig udsættelse for bestråling, bivirkninger 10 af cancerterapi eller resultatet af anden medicinsk behandling. Ved terapeutisk behandling af leukopeni med IL-6-præ-parater kan uønskede bivirkninger, der forårsages af behandling med de for tiden tilgængelige midler, undgås. Andre forhold, der er modtagelige for behandling med IL-6, omfatter 15 patienter, der er ved at komme sig efter knoglemarvstrans-plantationer.

Præparater til anvendelse ved behandling af de ovenfor beskrevne tilfælde omfatter en terapeutisk effektiv mængde IL-6 i blanding med en farmaceutisk acceptabel bærer. Dette 20 præparat kan indgives systemisk, enten parenteralt, intravenøst eller subcutant. Når det terapeutiske præparat, der anvendes ifølge opfindelsen, indgives systemisk, er det naturligvis i form af en pyrogenfri, parenteral acceptabel vandig opløsning. Fremstillingen af en sådan parenteralt 25 acceptabel proteinopløsning med tilbørlig hensyntagen til pH, isotonicitet, stabilitet og lignende ligger indenfor den kendte teknik.

Doseringsforskriften, der anvendes ved en fremgangsmåde til behandling af de ovenfor beskrevne tilfælde, fast-30 lægges af den behandlende læge, idet han tager hensyn til forskellige faktorer, som modificerer stoffers virkning, f.eks. patientens tilstand, legemsvægt, køn og kost, graden af enhver infektion, indgivelsestiden og andre kliniske faktorer. Generelt bør den daglige dosis ligge i området fra 35 200 til 1000 μ<^ polypeptid eller 50 til 5000 enheder (dvs., idet en enhed er den polypeptidkoncentration, der fører til 10 DK 173279 B1 den halve maksimale stimulering i en standard-muse-knoglemarvsanalyse) polypeptid pr. kg legemsvægt.

Som en foretrukken udførelsesform anvendes IL-6 i kombination med andre midler til aktivering af modne lym-5 feceller. Specielt har det vist sig, at IL-6 har CDF-virkning i et offentliggjort forsøg, jfr. Y. Takai m.fl., J. Immunol., 112(11), s. 3493-3500 (1986). Således aktiverer IL-6 i kombination med IL-2 alene og i kombination med IL-2 og τ-interferon modne lymfeceller. Denne særlige kombination kan an-10 vendes til terapeutiske anti-cancerbehandlinger og anti- -virusbehandlinger, jfr. endvidere Takai m.fl., Science (1986) under trykning. Denne anvendelighed tilskrives til dels den cytolytiske T-cellevirkning, som IL-6 udviser. Det forventes således, at samtidig eller fortløbende behandling 15 af en patient med IL-6 og IL-2 og τ-interferon især kan være effektiv ved behandling af metastatiske cancere. Tilsvarende kan IL-6 anvendes i kombination med IL-2 til LAK-behandling.

En ikke-udelukkende liste over andre passende hæma-topoietiner, CFS'er og interleukiner til samtidig eller 20 fortløbende indgivelse sammen med IL-6 omfatter GM-CSF, CSF-1, G-CSF, Meg-CSF, erythropoietin (EPO), IL-1, IL-3, B-celle-vækstfaktor og eosinophil differentieringsfaktor. Sådanne kombinationer kan forbedre aktiviteten eller virkningen af behandlingen med andre hæmatopoietiner alene.

25 IL-6 kan også forøge det humorale eller cellulære immunrespons in vivo ved indgivelse sammen med andre terapeutiske midler. Således kan IL-6 f .eks. forstærke virkningen af virale antigenvacciner, såsom HIV og lignende, eller tumor-antigenvacciner.

30 Doseringen af IL-6 i disse co-administreringsfor- skrifter må indstilles ud fra de nævnte doseringer for indgivelse af IL-6 alene til kompensation for de yderligere komponenter, f.eks. IL-2, i det terapeutiske præparat. Fremskridt hos den behandlede patient kan følges ved periodisk 35 bedømmelse af den hæmatologiske profil, f.eks. tælling af hvide blodlegemer og lignende.

11 DK 173279 B1 IL-6 kan også anvendes ved velkendte fremgangsmåder til dannelse af polyklone og monoklone antistoffer, både humane og murine, til diagnostisk og terapeutisk anvendelse. Sådanne monoklone eller polyklone antistoffer kan anvendes 5 terapeutisk ved tilknytning til de tilsigtede eller toxine midler, mærker og lignende. IL-6 fungerer også som hybridom--vækstfaktor i kulturmediet for hybridomcellelinier til forøgelse af udbytterne deraf.

De følgende eksempler illustrerer fremgangsmåden 10 ifølge opfindelsen ved anvendelse af cDNA-sekvenser, der koder for IL-6. Den fuldstændige DNA-sekvens i fig. 1 blev isoleret fra poly-A+ mRNA samlingen i HTLV I- transformeret human T-cellelinie C10MJ2 (National Institute of Health, S., K. Arya m.fl. Science, 223. s. 1086 (1984) ved anvendelse 15 af den i USA-patentskrift nr. 4.675.285 beskrevne ekspressionskloningsteknik .

Eksempel 1 20 Konstruktion af et eksempel på en bakteriel ekspressionsvektor til intracellular ekspression

Sekvensen i fig. 1, der indeholdes i pCF309 (ATCC 67153) somen EcoRI-indsætning (jfr. eksempel 3), kan fjernes derfra ved udskæring med EcoRI og indsættes i en passende 25 bakteriel vektor og vært til fremstilling af IL-6. Et foretrukket bakterieekspressionssystem for IL-6, der giver bedre udbytter af proteinet ved ændring af den 5'-kodende sekvens for IL-6, anvender imidlertid sekvensen i fig. 2.

Denne foretrukne sekvens anvendes til konstruktion 30 af det bakterielle ekspressionspiasmid pAL309C-781 på følgende måde: cDNA-klonen for IL-6 (fig. 1) , som bæres på et EcoRI--fragment, overføres i M13mpl9, jfr. S. Messing, Methods in Enzymology, 101. s. 20-78 (1983), og J. Norrander m.fl.

35 Gene, 26, s. 101-106 (1983), i en sådan orientering, at den ikke-kodende streng pakkes ind i phagen. Enkeltstrenget 12 DK 173279 B1 phag-DNA fremstilles og forbindes med oligonucleotidet d(GCCCCAGTACCCCCAGGAGAAG). Oligonucletidet udstrækkes med Klenow-fragmentet af DNA-polymerase I fra E. coli, og det resterende enkeltstrengede område skæres med SI-nuclease.

5 Enderne afstumpes ved behandling endnu engang med Klenow--fragmentet af DNA-polymerase, og endelig fremstilles den dobbeltstrengende IL-6-cDNA ved skæring med Hindlll. Hindlll--fragmentets stumpe ende ligeres ind i pAL-181 (ATCC nr. 40134), der er blevet skåret med Kpnl, behandlet med Klenow-10 -fragmentet af DNA-polymerase og skåret med Hindlll.

Det dannede plasmid pAL309-181 modificeres først ved fjernelse af basesegmentfragmentet mellem bp nr. 149 af 169 i fig. 1 ved in vitro sted-dirigeret nloop-out-mutagenese", jfr. Morinaga m.fl., Biotechnology 2, s. 636-639 (1984).

15 Denne fjernelse danner et enkeltstående Narl-sted i IL-6-sekvensen. Dette plasmid skæres med Narl. De enkeltstrengede : ender udfyldes med Klenow-fragmentet af DNA-polymerase I

og skæres derpå med Hindlll. Det fragment fra dette snit, som bærer 3'-enden af IL-6-genet, isoleres. Dette fragment 20 blandes med en syntetisk duplex af DNA på 42 bp, som er fremstillet til at afstumpes på den ene ende og bære en 5'--enkeltstrenget TA-sekvens på den anden. Blandingen forbindes med pAL181-snit med Ndel og Hindlll. Denne trevejsforbindelse fremstiller den modificerede IL6-gensekvens, som vises i 25 fig. 2, og et ekspressionsplasmid, der kaldes pAL309B-181.

Plasmidet pAL309B-181 skæres med BanI, og den enkeltstrengede ende udfyldes ved anvendelse af Klenow-fragmentet af DNA-polymerase I. Plasmidet skæres derpå med Ndel, og lL-6-klonen isoleres. Dette DNA-fragment indsættes mellem 30 Ndel og et udfyldt Xbal-sted i en pAL-181-vektor, i hvilken en syntetisk DNA-sekvens, der bærer den putative transkrip-tiontermineringssekvens, der findes 3' til enden af den kodende sekvens i E. coli aspA, tidligere er blevet klonet.

Dette nye plasmid, betegnet pAL309C-781, kan ved 35 gængs teknik transformeres ind i en passende bakterieværtscelle, der indeholder midler til kontrol af PL-promotoren 13 DK 173279 B1 (jfr. f.eks. eksempel 5) til ekspression af IL-6-proteinet.

Alternativt kan den modificerede IL6-kodende sekvens fjernes fra pAL309C-781 ved udskæring med Ndel og Hindlll eller fra pCSF309 ved udskæring med EcoRI og indsættes i 5 enhver ønsket bakterievektor ved anvendelse af fremgangsmåder og vektorer som beskrevne i T. Maniatis m.fl., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Disse eksempler på bakterievektorer kan derpå transformeres ind i bakterielle værtsceller, og IL-6 kan derved 10 udtrykkes.

Eksempel 2

Konstruktion af eksempelvise bakterielle ekspressionsvektorer 15 til ekstracellulær sekretion oo ekspression.

IL-6 kan fremstilles ved sekretion af proteinet i periplasmaet i E. coli. Dette giver et fuldstændigt oxideret, ikke-glycosyleret protein med en høj specifik aktivitet i bioanalyser in vitro. To eksempler på vektorer til fremstil-20 ling af IL-6 ved sekretion fra bakterier beskrives.

(1) Plasmid pUC18 (Yanisch-Perron m.fl., Gene 22, s.

103 (1985) skæres med restriktionsendonuclease Ndel, de dannede klæbrige ender afstumpes ved behandling med Klenow--fragmentet af E. coli DNA-polymerase I og desoxynucleosid-25 -triphosphater, og plasmidet cirkulariseres igen med T4- -DNA-ligase. Det dannede plasmid nr. 1 skæres derpå både med PvuII (partielt snit) og EcoRI, og enderne afstumpes ved indvirkning af Klenow-fragmentet af DNA-polymerase. De tilsvarende fragmenter renses og genforbindes til fremstil-3 0 ling af et plasmid nr. 2, hvori EcoRI- til PvuII-fragmentet, der indeholder lac-promotoren, er blevet fjernet. Plasmid nr. 2 skæres med EcoRI og behandles med Sl-nuclease til fjernelse af de enkeltstrengede ender. Plasmidet skæres derpå med Kpnl.

35 Plasmid pASl (Rosenberg, Ho og Shatzman, Meth. En zymo 1 . 101. 123 (1983), skæres med BamHI, og de enkeltstren- 14 DK 173279 B1 gede ender fjernes ved skæring med Sl-nuclease. Et stykke med sekvensen d(GTACCCGGGTAC) forbindes med dette udskårne pASl-DNA, hvilket giver et plasmid pAS2, der har et kpnl--sted til erstatning for BamHl-stedet i pASl. pAS2 skæres 5 med Bglll, enderne afstumpes ved indvirkning af Klenow-fragmentet af DNA-polymerase, og DNA skæres med KpnI. Bglll-(afstumpet) til KpnI-fragmentet, der indeholder pL-promotor-frekvensen forbindes med EcoRI-(afstumpet) til kpnl-vektorf rekvensen i plasmid nr. 2 til dannelse af pAL-181, et 10 plasmid, der bærer pL-promotoren, ribosombindingssted og en initierende kodon ATG umiddelbart efterfulgt af et Kpnl-sted og polylinkerområdet i pUC18. Plasmid pAL-181 blev deponeret i American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, Maryland den 28. august 1984 under tilgangs-15 nummer 40134.

Plasmid pAL-181 skæres med Ndel og KpnI og følgende syntetiske DNA-sekretionssignalsekvens indsættes.

TATG AAA AAT ATA ACT TTC ATT TTT TTT ATT TTA TTA 20 AC TTT TTA TAT TGA AAG TAA AAA AAA TAA AAT AAT GCA TCG CCA TTA TAT GCGGTAC CGT AGC GGT AAT ATA CGC

Denne sekvens indkoder en typisk sekretionssignal-25 sekvens. Plasmidet, der er resultatet af denne konstruktion, betegnes pAL-Sec-181.

pAL-Sec-181 skæres med KpnI og behandles med Klenow-- fragmentet af DNA-polymerase til fjernelse af de enkelt-strengede ender. Plasmidet skæres igen med HindiII og for-30 bindes med DNA-fragmentet, der indeholder IL-6, og som er beskrevet i eksemplerne 1 og 3. Dette fragment begynder med sekvensen GCCCCAGTACCCCCAGGAGAAG, der indkoder den første alaninkodon af modent IL-6, og fortsætter gennem hele IL-6--sekvensen og det 3'-ikke-oversatte område, indtil det når 35 Hindlll-stedet inden for M13mpl9-polylinkeren. Det dannede plasmid, pAL-Sec-IL6-181, koder for et protein, hvis syntese 15 DK 173279 B1 reguleres af pL-promotoren, der er sammensat af sekretionssignalet, som er smeltet sammen med det modne IL-6-protein.

(2) For at opnå et hypersekreterende ekspressionssystem for bakterielt fremstillet IL-6 indsættes Cj, rex og 5 N-områder af bakteriophag-λ indeholdt i nucleotiderne 34499 til 38214, som beskrevet af F. Sanger m.fl., J. Mol. Biol., 162. s. 729 (1982) i Clal-stedet i LacZ-genet, der klones på et konventionelt plasmid. Det anvendte Cj-gen er en allel med den i fig. 4 viste sekvens. Dette gens sekvens ændres 10 ved gængse metoder, således at glycerinet i stilling 48 ændres til serin, dvs. en overgang fra G til A i kodonens første stilling. Denne Cj 857 Ser-48 allel indsættes derpå i E. coli genomet via heterolog rekombination i LacZ-genet i cellen. Når det først er indsat, giver det en lacZ, λ-15 -immun E. coli.

Genet for humant IL-6 fusioneres til en konventionel sekvens, der indkoder et sekretionssignal. Disse sekvenser er operativt forbundet til den vilde type pL promotor-sekvens på et konventionelt plasmid og transformeres ind i de X--20 immune E. coli-celler, der bærer Cj857 Ser-48. Cellerne med Cjq57 Ser-48-genet fremstiller en betydelig mængde af IL-6-proteinet i aktiv form i periplasmaet.

25

Konstruktion af en eksempelvis pattedvrsekspressionsvektor PCSF309

Til konstruktion af en pattedyrsvektor til ekspression af IL-6 forbindes den fuldstændige cDNA-sekvens afbildet i 30 fig. 1 i den EcoRI-skårne COS-celleekspressionsvektor p91023B (der kan være opnået ved skæring af pCSF-1 (ATCC 39754) med EcoRI til fjernelse af en indsats på ca. 750 basebar). p91023B indeholder SV40-forstærkeren, større adenovirus sen promotor, DHFR-kodende sekvens, SV40 sent budskab poly-A 35 additionssted og Val-gen. Plasmidet, der er resultat af EcoRI-snittet af p91023B og indsættelsen af DNA-sekvensen i 16 DK 173279 B1 fig. 1, som koder for IL-6, betegnes pCSF309. pCSF309 (ATCC nr. 67153) kan ved gængs teknik transformeres ind i en passende pattedyrsværtscelle til ekspression af IL-6.

Eksempler på værtsceller for pattedyrscelleekspression 5 omfatter især primatcellelinier, gnavercellelinier og lignende, f.eks. COS-celler.

En fagmand kan også konstruere andre pattedyrsekspressionsvektorer, der er sammenlignelige med pCSF309, men indeholder mindre end den fuldstændige sekvens i fig. 1. F.eks.

10 kan de 5'- og 3'-flankerende sekvenser om ønsket skæres fra sekvensen i fig. 1, eller der kan anvendes modificerede eller allele varianter af fig. 1 ved manipulering af sekvensen deraf. DNA-sekvensen i fig. 1 kan skæres fra plasmidet med EcoRI og velkendt rekombinant genmanipulationsteknik, 15 der anvendes til at modificere sekvensen og at indsætte den i andre kendte vektorer, såsom pCD (Okayama m.fl., Mol.

Cell Biol. 2, s. 161-170 (1982)) og pJL3, pJL4 (Gough m.fl., EMBO J. , A, s. 645-653 (1985). Transformationen af disse vektorer ind i passende værtsceller kan føre til ekspression 20 af IL-6.

Eksempel 4

Konstruktion af aær- eller insektvektorer 25 På lignende måde som i eksempel 1 kan en fagmand manipulere sekvensen i fig. 1 ved at fjerne eller udskifte pattedyrsreguleringssekvenserne, der flankerer kodesekvenserne, med andre ekspressionskontrolsekvenser til at danne gær- eller andre svampevektorer. Således vil denne sekvens 30 kunne udtrykkes i svampeværtsceller. En ikke-udelukkende liste over svampeceller omfatter stammer af slægterne Sac-charomyces, Aspergillus og Pichia samt andre kendte stammer.

Til konstruktionen af en gærvektor og ekspression af proteinet i gærceller, se f.eks. de i internationalt offentlig-35 gørelsesskrift nr. WO 86/00639 offentliggjorte fremgangsmåder .

17 DK 173279 B1

Insektceller kan også om ønsket anvendes som værtsceller, og sekvensen 1 fig. 1 og 2 forandres til et sådant ekspressionssystem. F.eks. kan kodesekvensen i fig. 1 skæres fra pCSF309 med EcoRI og manipuleres videre (f.eks. forbindes 5 til andre kendte forbindelsesstykker eller modificeres ved fjernelse af ikke-kodende sekvenser derfra eller forandring af nucleotider deri ved anden kendt teknik). Til konstruktionen af en insektvektor, se f.eks. de i europæisk offentliggørelsesskrift nr. 155.476 beskrevne fremgangsmåder.

10

Eksempel 5

Ekspression af IL-6-proteip A. Bakterieekspression - intracellulær 15 Plasmid pAL309C-781 fra eksempel 1 transformeres i en E. coli K12 stamme GI455, et derivat af stammen W3110, hvori Cj- og Rex-områderne i bakteriophag-λ, som bærer den Cj857 allele, er blevet indsat i Clal-stedet på lacZ-genet i det bakterielle genom. Denne indsætning består af alle DNA-20 -sekvenserne mellem nucleotiderne nr. 35711 og 38104 i phag-genomet, jfr. F. Sanger m.fl., J. Mol. Biol. 162. s. 729 (1982) .

Når GI455 transformeret med pAL309C-781 dyrkes ved 30®C til høj celletæthed og derpå opvarmes til 40°C, produ-25 ceres 11.-6 hurtigt og akkumuleres i de næste to eller tre timer til at nå mere end 10% af det totale cellulære protein.

Dette protein produceres i en uopløselig form, der må so-lubiliseres og genfoldes ved gængse metoder, jfr. f.eks.

T.E. Creighton, Prog. Biophys. Molec. Biol., s. 231-297 30 (1978). Dette bakterielt fremstillede IL-6 forudsiges af have en specifik virkning i museknoglemarvsforsøget mellem ca. 106 og indtil 2 x 107 enheder pr. mg protein.

B. Bakteriel sekretion 35 Plasmid pAL-Sec-IL6-181 fra eksempel 2 transformeres ind i E. coli K-12 stamme GI400. Denne stamme er et derivat 18 DK 173279 B1 af W3110, jfr. Bachmann, Bacterial. Rev. 525 (1972), hvori Cj-, Rex- og N-områderne i bakteriophag λ (nucleo-tiderne 33498 til 38214 i phaggenomet) , jfr. Sanger m.fl.

J. Mol. Biol. 162. 729 (1982), er blevet indsat i Clal-stedet 5 i lacZ-genet i bakterien. Cj-genet på denne indsætning er den temperaturfølsomme Cj857-allele.

Når først pAL-Sec-IL6-181 er transformeret ind i GI400, kan cellerne dyrkes ved 30°C til en ønsket celletæt-hed, og temperaturen forøges til 40°C for at sætte sekre-10 tionen af IL-6 igang. Det isolerede produkt fra disse cellers periplasma er homogent i molvægt. Forarbejdningen fjerner signalsekvensen. Den N-terminale alanin fjernes også fra det udskilte protein, hvilket giver et produkt med prolin som dets N-terminale aminosyre i de fleste tilfælde. Mate-15 rialet har en høj specifik aktivitet ved en knoglemarvskolonianalyse, der udviser fra 1 til 20 x 106 enheder pr. mg protein.

C. Pattedyrsekspression 20 Plasmid-DNA, fremstillet ud fra E. coli MC1061, som indeholder pCSF309 som beskrevet af Maniatis m.fl., jfr. ovenfor, renses ved gængse metoder, der omfatter ligevægtscentrifugering i cesiumchloridgradienter med indhold af ethi-diumbromid. COS-celler (ATCC CRL 1650) transficeres med det 25 rensede DNA ved en koncentration på ca. 5 μg plasmid-DNA 106 COS-celler og behandles med chloroquin i overensstemmelse med de af G.G. Wong m.fl. Science, 280. s. 810-815 (1985) og R.J. Kaufman m.fl. Mol. Cell. Biol., 2., s. 1304 (1982) beskrevne fremgangsmåder. 72 timer efter transficeringen kan 30 et pCSF309-holdigt COS-cellekonditioneret medium høstes med indhold af et protein, der viser virkningen i standard-muse-knoglemarvsforsøg som beskrevet i eksempel 5.

IL-6 aktivitet i museknoglemarvsforsøq in vitro 35 19 DK 173279 B1

Museknoglemarvsforsøg udføres som beskrevet i D. Metcalf, The Hemopoietic Colony Stimulating Factors, Elsevier Press, New York (1984) med følgende modifikationer: a) 2 x 10^ knoglemarvsceller pr. ml anvendes i for- 5 søget, b) det endelige forsøgsrumfang er 100 μΐ, og c) analyserne anbringes i standardmikrotiterplader med 96 fordybninger.

Knoglemarv fås fra lårene af 6 til 25 uger gamle 10 hunlige Balb/c-mus (Jackson). Ved anvendelse af WEHI 3-konditioneret medium, jfr. J.C. Lee m.fl. J. Immunol., 128. s. 2392-2398 (1982), der indeholder muse-interleukin-3 som standardkontrol, defineres en fortyndingsenhed af aktivitet som den proteinkoncentration, der fører til maksimalt respons 15 i denne knoglemarvsanalyse, dvs. 25 til 35 kolonier pr. museknoglemarvsceller.

Konditioneret medium fra COS-celler indeholdende pCSF309 viser sig at være aktivt i mindst 10"4 fortynding i en museknoglemarvsanalyse og producerer små kolonier af 20 granulocyt-type. Antallet og typen af celler i et maksimalt respons vil variere med stammen og alderen af musedonorerne.

Konditioneret medium fra E. coli-celler, der indeholder pAL309C-781 kan have en specifik aktivitet på mindst 106 til 2 x 107 enheder pr. mg protein i denne analyse.

25 Bakterielt produceret IL-6 giver også granulocytkolonier.

Eksempel 7

Molvægtanalvse af IL-6 30 Ved fremgangsmåden ifølge R.J. Kaufman og P.A. Sharp, J. Mol. Biol. 159. s. 601-629 (1982) kan 35s-methionin inkorporeres metabolisk i IL-6-proteinet fremstillet ved COS--celletransfektion med pCSF309-DNA. Når 3^S-methionin-mærket pCSF309-holdigt COS-cellekonditioneret medium analyseres 35 under ikke-reducerede betingelser ved SDS-polyacrylamid--gelelektroforese, jfr. U.K. Laemmli, Nature 227, s. 680- 20 DK 173279 B1 -685 (1970) , kan der iagttages et bredt bånd som tegn på glycosylering ved en tilsyneladende molvægt på ca. 20 til 35 kD.

5 Eksempel 8

Konstruktion af CHO-cellelinier. der udtrykker høie niveauer af IL-6

En fremgangsmåde til fremstilling af høje niveauer 10 af IL-6 fra pattedyrsceller omfatter konstruktionen af celler, der indeholder flere kopier af det heterologe IL-6-gen. Det heterologe gen kan forbindes til en forstærkelig markør, f.eks. dihydrofolatreduktase-(DHFR)-genet, for hvilket celler med forøget indhold af genkopier kan udvælges 15 ved formering i tiltagende koncentrationer af methotrexat (MTX) ved fremgangsmåderne ifølge Kaufman & Sharp, J. Mol.

Biol., jfr. ovenfor. Denne tilnærmelse kan anvendes ved et antal forskellige celletyper.

pCSF309 og DHFR-ekspressionsplasmidet pAdA26SV-(A)3 20 (Kaufman & Sharp, Mol. Cel. Biol., jfr. ovenfor) co-trans-ficeret ind i DHFR-manglende CHO-celler, DUKX-BII, ved cal-ciumphosphat-coprecipitering og transficering. De oprindelige DHFR-eksprimerende transformanter udvælges til vækst i of-medier med dialyseret kalvefosterserum og udvælges derpå 25 til forstærkning ved vækst i tiltagende koncentrationer af MTX (påfølgende trin i 0,02, 0,1, 1,0 og 5 mM MTX) som beskrevet af Kaufman m.fl., et al., Mol. Cell Biol. s. £, s.

1750 (1983). Transformanter klones, og ekspression af biologisk aktivt IL-6-protein følges ved museknoglemarvsanaly-30 ser. IL-6-ekspression bør tiltage med tiltagende niveauer af MTX-resistens.

Talrige modifikationer og varianter ved udførelsen af denne opfindelse forventes at forekomme for fagmænd ved betragtning af de foregående beskrivelser af foretrukne ud-35 førelsesformer deraf. Sådanne modifikationer og varianter menes at være omfattet af kravene.

Claims (10)

1. Ikke-glycosyleret IL-6, kendetegnet ved, at det er fremstillet ved følgende trin: a) dyrkning i et passende bakteriekulturmedium af en 5 bakteriecelle transformeret med en cDNA-sekvens, der indeholder kodoner foretrukket for bakterieekspression i det væsentlige som vist i fig. 2, hvilken cDNA-sekvens står i operativ forbindelse med en ekspressionskontrolsekvens, og b) isolering af dette IL-6 i så godt som ren form.

2. Ikke-glycosyleret IL-6, kendetegnet ved en specifik aktivitet større end 1 x 106 enheder pr. mg protein i et museknoglemarvskoloniforsøg.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af ikke-glycosyleret IL-6 omfattende følgende trin: 15 a) dyrkning i et passende bakteriekulturmedium af en bakteriecelle transformeret med en cDNA-sekvens, kendetegnet ved kodoner, der foretrækkes til bakteriel ekspression i det væsentlige som vist i fig. 2, hvilken cDNA-sekvens står i operativ forbindelse med en ekspres- 20 sionskontrolsekvens, og b) isolering af dette ikke-glycosylerede IL-6 i så godt som ren form.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at sekvensen dyrkes i en bakteriecelle, der er i 25 stand til at udskille IL-6-proteinet i periplasmaet.

5. IL-6 i en farmaceutisk acceptabel bærer til anvendelse ved anti-cancerbehandling.

6. Farmaceutisk præparat ifølge krav 5 i forbindelse med en effektiv mængde af mindst et hæmatopoietin, inter- 30 leukin, vækstfaktor, antistof eller kemoterapeutisk middel.

7. IL-6 i et farmaceutisk præparat til anvendelse som anti-cancermiddel i kombination med et medlem af gruppen IL-3, IL-2 og IL-2 og ~t-interferon.

8. IL-6 i et farmaceutisk præparat til anvendelse 35 ved behandling af lave niveauer af marvceller.

9. IL-6 i et farmaceutisk præparat til anvendelse DK 173279 B1 ved behandling af lave niveauer af lymfeceller.

10. Vektor til anvendelse ved udskillelse af IL-6 i en bakteriel værtscelles periplasma omfattende en sekretionssignalsekvens og en DNA-sekvens, kendetegnet ved 5 kodoner, der foretrækkes til bakteriel ekspression, hovedsagelig som vist i fig. 2. i