SK515087A3

SK515087A3 - Methot for producing hematopoietin il-6

Info

Publication number: SK515087A3
Application number: SK5150-87A
Authority: SK
Inventors: Steven C Clark; Gordon G Wong; Paul Schendel; John Mccoy
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1986-07-08
Filing date: 1987-07-07
Publication date: 1998-07-08
Also published as: JPH01503354A; IL83137A; MY102865A; DE3751922D1; EP0574955B1; GR871027B; PT85285A; KR960013601B1; ES2006776A6; DE3751406T2; EP0316319A4; ATE124959T1; IE871726L; EP0316319A1; ATE143811T1; PL159182B1; JP2664698B2; DK121788A; EP0316319B1; DE3751406D1

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka spôsobu výroby hematopoetínu IL-6. Táto rekombinantná bielkovina IL-6 sa môže podielať na imunologických pochodoch u ludí.

Doterajší stav techniky

Hematopoetíny alebo hematopoetické rastové faktory sú bielkoviny, ktoré podporujú prežívanie, rast a diferenciáciu krvotvorných buniek. Biochemická a biologická identifikácia a stanovenie vlastností určitých hematopoetínov boli až doteraz brzdené malým množstvom týchto faktorov, získavaných z prírodných zdrojov, napríklad z krvi a z moču. Pri použití rekombinatnej techniky a genetického inžinierstva bolo možné niektoré z týchto hematopoetínov molekulárne klonovať, dosiahnuť ich heterológnu expresiu a potom čistiť až po homológny stav. Z týchto hematopoetických faktorov je možné uviesť napríklad faktory, ktoré stimulujú tvorbu kolónií (CFS), ktoré majú schopnosť podporovať in vitro rast kolónií hematopoetických buniek zo zárodočných buniek kostnej drene, fetálnej pečene a ďalších orgánov, napríklad GM-CSF, G-CSF, CSF-1 a IL-3 (porovnaj napríklad D. Metcalf, Blood 67 (2), 257 - 267 (1986), Y. C. Yang a kol., Celí. 47 (1), 3-10 (1986) a R. Donahue a kol., Náture 321, 872 - 875 (1986)).

Jeden z hematopoetínov tohto typu už autori tohto vynálezu identifikovali ako CSF-309. Po uvedení tejto správy bolo zverejnených niekolko publikácií, ktoré opisovali bielkoviny iných názvov s biologickými účinkami, ktoré boli totožné s účinkami nami opísanej bielkoviny. V publikácii Haegman a kol., Eur. J. Biochem. 159, 625 - 632 (1986) a v citáciách, uvedených v tejto publikácii, sa bielkovina uvádza ako bielkovina s velkostou 26 k jednotiek, ktorej tvorbu je možné vyvolať v ludských fibroplastoch. V publikácii Zilberstein a kol., EMBO J. 5, 2529 - 2537 (1986) sa táto látka uvádza ako

IFN-beta-2 pre svoju slabú účinnost typu interferónu. V publikácii Hirano a kol., Náture 324, 73 - 76 (1986) sa táto látka uvádza ako stimulátor B-buniek a je pomenovaná BSDF alebo BCF-2. V niektorých z uvedených publikácií sa opisuje i čistenie prírodnej látky. Ako už navrhli niektorí pracovníci, zlúčenina v opise tohto vynálezu sa bude označovať ako IL-6 (porovnaj R. Germán a kol., 1987 (v tlači)).

Vynález bude podrobnejšie opísaný v súvislosti s priloženými výkresmi.

Na obr. 1 je znázornená úplná sekvencia cDNA a sekvencia aminokyselín pre IL-6.

Na obr. 2 je znázornená modifikovaná sekvencia cDNA, vhodná predovšetkým pre bakteriálnu expresiu IL-6.

Na obr. 3 je znázornená konštrukcia plazmidu pAL-Sec-IL-6-181.

Podstata vynálezu

Vynález sa týka spôsobu výroby ludského IL-6, v podstate bez obsahu iných ludských bielkovín. Spôsob podlá vynálezu spočíva v tom, že sa kultivuje hostitelská bunka, transformovaná sekvenciou DNA, ktorá je kódom pre bielkovinu IL-6 za riadenia vhodnou riadiacou sekvenciou pre expresiu. Sekvencia DNA, ktorá je kódom pre bielkovinu IL-6 obsahuje tú istú alebo v podstate tú istú sekvenciu nukleotidov ako sekvencia od nukleotidu 132 po nukleotid 689 alebo od nukleotidu 51 po nukleotid 1139 na obr. 1. Jedna zo sekvencií DNA pre použitie pri uskutočňovaní spôsobu podlá vynálezu zahrňuje úplnú nukleotidovú sekvenciu z obr. 1. Sekvencia DNA z obr. 1 s velkostou približne 1,1 kb je uložená v plazmide pCSF309 v E. coli MC1061, ktorý bol uložený v zbierke American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 11. júla 1986 pod Číslom ATCC 67153.

Predmetom predloženého vynálezu je spôsob výroby hematopoetínu IL-6, ktorý spočíva v tom, že sa kultivuje eukaryotická alebo prokaryotická bunková línia, transformovaná vektorom obsahujúcim sekvenciu DNA, tak ako je uvedené na obr.

1, v operatívnom spojení s riadiacou sekvenciou pre expresiu.

'Pri výhodnom uskutočnení postupu podlá vynálezu obsahuje vektor používaný na transformáciu sekvenciu cDNA, ktorá je kódom pre bielkovinu a obsahuje peptidovú sekvenciu, ktorá je zhodná so sekvenciou aminokyselín od aminokyseliny 28 po aminokyselinu 212 na obr. 1, pričom táto sekvencia je v operatívnom spojení s riadiacou sekvenciou pre expresiu

Výhodným uskutočnením sekvencie DNA, ktorá je kódom pre bielkovinu IL-6 je sekvencia, ktorá je znázornená na obr. 2, a ktorá bola modifikovaná pre expresiu v bakteriálnych bunkách. Alelové varianty (t.j. prírodné sa vyskytujúce zmeny v bázach sekvencie, ktoré sa vyskytujú v rámci čelade a môžu alebo nemusia meniť sekvenciu aminokyselín) nukleotidu a zodpovedajúce peptidové sekvencie a varianty nukleotidovej sekvencie, ktoré sú dôsledkom degenerácie genetického kódu sa taktiež môžu použiť v prípade, že sú kódom pre polypeptid s účinnosťou IL-6.

Variácie v sekvencii z obr. 1 s 1,1 kb, ktoré sú spôsobené bodovými mutáciami alebo indukovanými modifikáciami na zdôraznenie účinnosti alebo zvýšenie produkcie bielkoviny by nemali meniť funkčnú bielkovinu, pre ktorú je sekvencia pri expresii kódom. Tieto variácie teda spadajú do odboru vynálezu. Napríklad modifikovaná sekvencia z obr. 2 je v súčasnom období výhodná pre dosiahnutie expresie v bakteriálnych hostiteľských bunkách. Tieto nukleotidové modifikácie, zámerne zavedené do sekvencie DNA môže uskutočniť odborník známym spôsobom. Tieto modifikácie môžu potom spôsobiť deléciu, včlenenie alebo substitúciu aminokyselín v peptidovej sekvencii IL-6. Napríklad pri náhrade jedného alebo väčšieho počtu cysteínových zvyškov v kódovej sekvencii je možné odstrániť disulfidové mostíky, zodpovedajúce týmto zvyškom. Okrem toho je možné napríklad substitúciou, včlenením alebo deléciou aminokyselín v jednom alebo vo väčšom počte tripeptidových miest pre glykozyláciu, viazaných na asparagín dosiahnuť: to, že výsledná bielkovina nie je glykozylovaná. Technika spôsobujúca mutácie v zmysle substitúcie alebo delécie je v odbore dobre známa a je uvedená napríklad v US patentovom spise 4 518 584.

Spôsob pódia vynálezu spočíva v tom, že sa kultivuje vhodná bunka alebo vhodná bunková línia, transformovaná sekvenciou cDNA, ktorá je kódom pre IL-6 vrátane modifikovanej sekvencie, tak ako bola opísaná vyššie na obr. 1 a 2. Sekvencia DNA, ktorá je kódom pre bielkovinu IL-6 v transformovanej bunke, je v operatívnom spojení s vhodnou riadiacou sekvenciou pre expresiu.

Výber vhodných hostiteiských buniek a spôsoby transformácie, kultivácie, amplifikácie, systematického sledovania transformántov produkcie požadovanej bielkoviny a jej čistenia sú v odbore známe a opísané napríklad v publikáciách Gething a Sambrook, Náture 293, 620 - 325 (1981), Kaufman a kol., Mol. Cel. Biol. 5 (7), 1750 - 1759 (1985) alebo Howley a kol., US patentový spis č. 4 419 446.

Bakteriálne bunky sú v súčasnom období výhodnými hostiteľskými bunkami pri preparatívnych postupoch pri kultivácii a produkcii IL-6. Pri bakteriálnej produkcii sa dajú získať: veľké množstvá účinného IL-6, predovšetkým v prípade, že pri expresii je možné použitie modifikovanej sekvencie z obr. 2. Rôzne kmene E. coli, ktoré sú dobre známe ako hostiteľské bunky o odbore biotechnológie (napríklad kmeň MC1061 a kmene, ktoré budú opísané v jednotlivých príkladoch) sú vhodnými hostiteľskými kmeňmi, ktoré umožňujú produkciu biologicky účinného IL-6. Ďalšie vhodné kmene vhodné pre použitie pre expresiu IL-6 zahrňujú B. subtilis, rôzne kmene Pseudomonas, ďalšie bacily a podobne.

Ako hostiteľské bunky pre produkciu IL-6 sa v zásade môžu použií tiež bunky cicavcov. Predovšetkým vhodnou bunkovou líniou cicavcov sú bunky ovárií čínskeho škrečka (bunky CHO).

Ďalšou vhodnou líniou buniek cicavcov, ktorá je tiež opísaná v nasledujúcich príkladoch je línia buniek opíc COS-1. Obdobne použiteľnou bunkovou líniou cicavcov je tiež bunková línia CV-1.

Celý rad kvasinkových kmeňov, ktoré sú v odbore známe sa taktiež dajú použit ako hostiteľské bunky na dosiahnutie expresie IL-6. Okrem toho sa v prípade potreby môžu pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu použit ako hostiteľské bunky tiež bunky hmyzu, ako bolo opísané napríklad v publikácii Millera a kol., Genetic Engeneering, 8, 277 - 298 (Plénum Press 1986) a v publikáciách, ktoré sú v nej citované.

umoznu^u obsahujú expresiu sekvencie modifikovanú alebo

Vynález sa tiež týka spôsobu výroby vektora, vhodného na použitie pri expresii bielkoviny IL-6. Tento vektor obsahuje rovnakú alebo v podstate rovnakú sekvenciu, ako bolo opísané vyššie. S výhodou obsahujú vektory tohto typu úplnú sekvenciu DNA, tak ako je uvedené na obr. 1 alebo 2. Vektory tiež obsahujú príslušné riadiace sekvencie pre expresiu, ktoré DNA pre IL-6. Vektory, ktoré prírodné sa vyskytujúcu alelovú sekvenciu vo vyššie uvedenom význame sa môžu použit pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu na produkciu IL-6. Vektor sa môže použit pri transformácii bunkových línií a môže obsahovat zvolené riadiace sekvencie v operatívnom spojení s vyššie uvedenou sekvenciou DNA, ktorá je kódom pre IL-6 a je schopná riadit replikáciu a expresiu vo zvolených hostiteľských bunkách. Riadiace sekvencie použitelné pre tieto typy vektorov sú známe a môžu sa volit v závislosti od použitej hostiteľskej bunky. Táto selekcia je rutinná a netvorí čast spôsobu podľa vynálezu. Výhodnými vektormi sú bakteriálne vektory.

Spôsobom podľa vynálezu sa teda môže získat bielkovina IL-6, ktorá v podstate neobsahuje ďalšie bielkoviny ludského pôvodu. Bielkovina IL-6 je charakterizovaná peptidovou sekvenciou, ktorá obsahuje rovnakú alebo v podstate rovnakú peptidovú sekvenciu od aminokyseliny 28 po aminokyselinu 212, ako je znázornené na obr. 1. Bielkovina IL-6, získaná spôsobom podía vynálezu, je charakterizovaná zjavnou molekulovou hmotnosťou približne 20 až 35 k jednotiek pri analýze elektroforézou na SDS-polyakrylamidovom géle pri neredukčných podmienkach. V prostrediach, pri ktorých sa použil plazmid pCSF309, vyvoláva , táto bielkovina tvorbu malých kolónií buniek granulocytárneho typu in vitro pri použití myšacej kostnej drene v koncentrácii 10 až 100 pikomólov.

Na obr. 1 je znázornená úplná sekvencia DNA s veľkosťou 1,1 kb, ktorá je pri expresii kódom pre bielkovinu IL-6 a umožňuje jej expresiu v príslušných hostiteľských bunkách. Táto sekvencia obsahuje dlhú otvorenú translačnú sekvenciu so 636 nukleotidmi, ktorá je kódom pre polypeptid s 212 aminokyselinami, vrátane signálnej sekrečnej sekvencie s približne 50 nukleotidmi. Kódová oblasť pre bielkovinu v oblasti 11, kb má rozsah od nukleotidu 132 (guanín v alanínovom kodóne, poloha aminokyseliny 28) ku nukleotidu 686, po ktorom nasleduje stop kodón TAG. V slede sú dve potencionálne miesta pre glykozyláciu, viazané na asparagín, vytvorené charakteristickou sekvenciou Asn-X-Ser. Kódová oblasť taktiež obsahuje štyri cysteínové zvyšky, čo dovoľuje predpokladať dve sulfidové väzby. Zostávajúcich 453 nukleotidov v 3'-nekódovej oblasti sekvencie s 1,1 kb môže mať riadiacu úlohu pri transkripcii v prírodnom hostiteľovi. 3'-zakončenie sekvencie taktiež obsahuje segment, bohatý na skupiny AT, vrátane niekoľkonásobného opakovania sekvencie ATTTA, ktorá pravdepodobne zabezpečuje stálosť genetickej informácie, obsiahnutej v RNA, ako bolo opísané napríklad v publikácii G. Shaw a R. Kameň, Celí, 46 (5), 659 - 667 (1986).

Výhodná sekvencia, tak ako je znázornená na obr. 2 pre bakteriálnu expresiu, má rovnakú peptidovú sekvenciu ako na obr. 1, avšak má selektívne modifikovanú nukleotidovú sekvenciu pre umožnenie a podporu produkcie bielkoviny IL-6 v bakteriálnom systéme pre expresiu. Okrem toho bola v tejto sekvencii vynechanú väčšia čast signálnej sekvencie a 3'-nekódová oblasť, ktorá je prítomná v sekvencii na obr. 1.

Pri výhodnom uskutočnení spôsobu podía vynálezu je možné získat bakteriálne produkovaný IL-6. Pri produkcii bakteriálnymi bunkami sa zvyčajne alanín v polohe 28 odštiepi bakteriálnymi enzýmami. Z tohto dôvodu má približne 80 % bakteriálne vyprodukovaného IL-6 v polohe 29 prolín ako svoju 5'-počiatočnú aminokyselinu. Bakteriálne produkovaný IL-6 tiež nie je glykolyzovaný. V dôsledku toho má IL-6 bakteriálneho pôvodu ovela homogénnejšiu zrejmú molekulovú hmotnosť ako IL-6, produkovaný ostatnými systémami pre expresiu. Okrem toho, v prípade, že sa pre expresiu použila sekvencia DNA znázornená na obr. 2, dajú sa pri bakteriálnej produkcii tejto látky dosiahnuť vysoké výťažky.

IL-6, získaný spôsobom podlá vynálezu, sa môže použit ako účinná zložka pri rôznych liečebných postupoch. Táto látka sa môže použiť ako taká alebo v kombinácii s inými účinnými látkami, napríklad pri liečbe ochorení charakterizovaných zníženým počtom myeloidných alebo lymfoidných buniek, hematopoetického systému alebo kombinácii oboch týchto porúch. Táto bielkovina sa môže tiež použiť na stimuláciu prídavných a zrelých buniek, napríklad monocytov, a na produkciu ďalších hematopoetických faktorov, ktoré stimulujú tvorbu kolónií iných hematopoetických buniek alebo majú ďalšie účinky na hematopoetický systém. Okrem toho podporuje IL-6 i účinnosť iných hematopoetínov. Napríklad IL-6 má schopnosť pri pokuse na kostnej dreni myši po predchádzajúcom pôsobení 5-fluóruracilu podporovať schopnosť ďalších hematopoetínov, predovšetkým IL-3 a CSF-1 stimulovať proliferáciu hematopoetických buniek, menej diferencovaných ako po pôsobení samotného CSF-1 alebo IL-3. Táto vlastnosť sa v minulosti pripisovala bielkovine, nazývanej IL-l-alfa alebo Hematopoetín 1, ktorý môže indukovať expresiu IL-6. Podobne i pri pokusoch s ludskými blastovými bunkami pri súčasnom použití IL-3 a IL-6 bolo možné pozorovať proliferáciu kolónií včasných štádií krvotvorných buniek. Bielkovina IL-6 má teda potencionálne farmaceutické použitie v kombinácii s IL-3 pri liečbe celého radu chorobných stavov, pri ktorých dochádza k deficiencii imunologického systému.

Rôzne ochorenia, pri ktorých dochádza k nedostatočnosti napríklad v lymfocytoch T a/alebo B, imunologického charakteru, napríklad je taktiež možné priaznivo ovplyvniť Deficiencia imunologického systému, imunologického systému, alebo rôzne poruchy reumatoidná artritída, podávaním bielkoviny IL-6 napríklad leukopénia (zníženie počtu cirkulujúcich leukocytov v periférnej krvi) môže byť dôsledkom vírusovej infekcie, napríklad HTLVI, HTLVII, HIV, velkého vystavenia pôsobeniu žiarenia, vedlajších účinkov liečby zhubných nádorov alebo výsledkom iného typu liečenia. Pri liečbe leukopénia bielkovinou IL-6 je možné vyvarovať sa vedlajších účinkov, ku ktorým zvyčajne dochádza pri liečbe látkami, ktoré sú v súčasnom období dostupné. Ďalšie použitie môže mat IL-6 u chorých, ktorí sa zotavujú po transplantáciách kostnej drene.

Liekové formy, ktoré obsahujú IL-6, obsahujú túto látku v dávke, ktorá je účinná pre použitie pri vyššie uvedených poruchách v zmesi s nosičom, prijatelným z farmakologického hladiska. Tieto prostriedky sa môžu podávať parenterálne, predovšetkým vnútrožilovo alebo podkožné. Pri tomto podaní sa však uvedená látka nachádza vo forme bezpyrogénneho, parenterálne prijatelného vodného roztoku. Príprava uvedených prostriedkov vrátane podmienok pH, izotonicity, stálosť a podobne je v odbore známa.

Dávku, ktorú je potrebné použiť v danom prípade, môže určiť každý lekár v závislosti od rôznych faktorov, ako sú okolnosti, ktoré môžu zmeniť pôsobenie látky, napríklad stav chorého, hmotnosť, pohlavie, výživa, závažnosť infekcie, čas podania a ďalšie klinické faktory. Zvyčajne sa podáva denne 200 až 1000 mikrogramov polypeptidu alebo 50 až 5000 jednotiek polypeptidu/kg (jedna jednotka je koncentrácia polypeptidu, ktorá zabezpečí polovicu maximálnej stimulácie pri štandardnom pokuse s kostnou dreňou myši).

Je tiež výhodné použiť bielkovinu IL-6 spolu s ďalšími účinnými látkami na aktiváciu zrelých lymfoidných buniek. Predovšetkým sa dokázalo, že IL-6 má účinnosť CDF V' pokuse, ktorý bol uvedený v publikácii Y. Takai a kol., J. Immunol. 137, (11), 3494 - 3500 (1986). IL-6 v kombinácii s IL-2 alebo v kombinácii s IL-2 a s gamma-interferónom aktivuje zrelé lymfoidné bunky. Táto kombinácia môže byť užitočná i pri protirakovinovej a protivírusovej liečbe. Táto účinnosť sa sčasti pripisuje cytolytickej aktivite T-buniek, podporovanej IL-6. Dá sa teda očakávať, že súčasná liečba IL-6 a IL-2 a gamma-interferónom alebo pôsobenie týchto látok po sebe môže mať priaznivý účinok predovšetkým pri metastázujúcich zhubných nádoroch. Podobne sa môže použiť IL-6 v kombinácii s IL-2 pri liečbe LAK.

Pre súčasnému podanie s IL-6 sú vhodné napríklad hematopoetiny, látky typu CSF a interleukíny ako GM-CSF, CSF-1, G-CSF, Meg-CSF, erytropoetín (EPO), IL-1, IL-3, rastový faktor B-buniek a diferenciačný faktor eozinofilov. Tieto kombinácie môžu zvýšiť účinnosť alebo liečebný efekt v porovnaní s použitím jednotlivých hematopoetínov samotných.

Bielkovina IL-6 môže taktiež zvýšiť humorálnu alebo bunkovú imunologickú odozvu in vivo pri súčasnom podaní s ostatnými liečivami. IL-6 môže napríklad zvýšiť účinnosť vírusových antigénnych vakcín, napríklad HIV a ďalších, alebo protinádorových vakcín s obsahom antigénu.

Dávkovanie IL-6 pri tomto súbežnom podávaní sa dá odvodiť z dávok, ktoré sú uvedené pre podávanie samotného IL-6 kompenzáciou vzhladom na ostatné zložky, napríklad IL-2. Výsledky liečby chorého sa dajú sledovať periodickým stanovením hematologických hodnôt, napríklad počtu bielych krviniek a podobne.

Bielkovina IL-6 sa taktiež môže podať pri dobre známom postupe na vyvolanie tvorby monoklonálnych alebo polyklonálnych protilátok ludského i myšacieho pôvodu pre diagnostické a liečebné použitie. Získané monoklonálne alebo polyklonálne protilátky sa môžu použiť na liečebné účely spojením s delovými činidlami alebo toxínmi, je možné tiež ich označiť a po10 dobne. Bielkovina IL-6 pôsobí tiež ako rastový faktor hybridómu v bunkových líniách hybridómu, kde zvyšuje výťažky produkovaných buniek.

Príklady uskutočnenia vynálezu

V nasledujúcich príkladoch je ozrejmený spôsob podlá vynálezu pri použití cDNA, ktorá je kódom pre bielkovinu IL-6. Úplná sekvencia DNA z obr. 1 bola izolovaná zo skupiny A + mRNA z bunkovej línie ludských T-buniek, C10MJ2, transformovanej HTLVI (National Inštitúte of Health: S. K. Arya a kol., Science 223, 1086 (1984)), pričom sa použije technika klonovania, tak ako bola opísaná v US patentovej prihláške SN 652 316 (US patentový spis č. 4 675 285).

Príklad 1

Konštrukcia bakteriálneho vektora pre expresiu na dosiahnutie intracelulárnej expresie

Sekvenciu, znázornenú na obr. 1, uloženú v plazmide pCSF309 (ATCC 67153) ako vyčlenenú sekvenciu v mieste pôsobenia enzýmu EcoRI (príklad 3) je možné z uvedeného plazmidu vybrat pôsobením enzýmu EcoRI a včleniť do vhodného bakteriálneho vektora a hostitela a dosiahnuť tak produkciu IL-6. Avšak výhodným systémom pre bakteriálnu expresiu IL-6, pri ktorej sa potom dajú dosiahnuť vysoké výťažky bielkoviny pri pozmenení 5'-kódovanej sekvencie pre IL-6 je systém, v ktorom sa použije sekvencia znázornená na obr. 2.

Táto výhodná sekvencia sa použila pre konštrukciu plazmidu pre bakteriálnu expresiu bielkoviny IL-6 nasledujúcim spôsobom za vzniku plazmidu pAL309C-781.

Kloň cDNA pre IL-6 (obr. 1), nesený fragmentom pre štiepenie EcoRI bol prenesený do M13mpl9 spôsobom opísaným v publikáciách S. Messing, Methods in Enzymology, 101, 20 - 78 (1983) a J. Norrander a kol., Gene 26, 101 - 106, (1983) v takej orientácii, že nekódovaný reťazec bol zobratý do fágu. Potom sa pripravila DNA s jediným reťazcom a spojila sa s oligonukleotidom d(GCCCCAGTACCCCCAGGAGAAG). Oligonukleotid sa nadstavil Klenowovým fragmentom DNA-polymerázy z E. coli a zostávajúca oblasť s jediným reťazcom sa odštiepila Sl-nukleázou. Na konce sa znova naviazala Klenowova DNA-polymeráza a napokon sa pripravila cDNA s dvojitým reťazcom pre IL-6 rozštiepením enzýmom HindlII. Zakončenie, ktoré nebolo možné naviazať na zakončenie po pôsobení enzýmu HindlII bolo naviazané na plazmid pAL-181 (ATCC 40134), ktorý sa rozštiepil pôsobením enzýmu KpnI, potom sa naviazal Klenowov fragment DNA-polymerázy a napokon sa materiál rozštiepil pôsobením enzýmu HindlII.

Výsledný plazmid pAL309-181 sa modifikoval najskôr tak, že sa odstránil fragment sekvencie báz v rozmedzí párov báz 149 až 169 na obr. 1 cielenou mutagenézou in vitro podľa publikácie Morinaga a kol., Biotechnology 2, 636 - 639 (1984). Touto deléciou vzniklo jediné miesto pôsobenia enzýmu NarI v sekvencii pre IL-6. Získaný plazmid sa rozštiepil enzýmom NarI. Zakončenie sekvencie s jednoduchým reťazcom sa vyplnil Klenowovým fragmentom DNA-polymerázy I a potom sa na štiepenie použil enzým HindlII. Fragment po tomto štiepení, nesúci 3'-zakončenie génu pre IL-6 sa izoloval. Tento fragment sa potom zmiešal so syntetickým dvojitým reťazcom so 42 pármi báz, ktorý na jednom konci nebol schopný väzby a niesol 5'-TA-sekvenciu na druhom konci. Zmes sa podrobila väzbe a pre väzbu sa použil plazmid pAL181, rozštiepený enzýmami Ndel a HindlII. Touto trojcestnou väzbou sa získal modifikovaný gén pre bielkovinu IL-6, tak ako je znázornený na obr. 2 a plazmid pre expresiu, ktorý bol označený pAL309B-181.

čenie s jediným reťazcom sa DNA-polymerázy I. Plazmid sa a izoloval sa kloň IL-6. Tento

Plazmid pAL309B-181 sa rozštiepil enzýmom Bani a zakonvyplnilo Klenowovým fragmentom potom rozštiepil enzýmom Ndel fragment DNA sa potom včlenil medzi zakončenie po pôsobení enzýmu Ndel a uložil do miesta, po štiepení enzýmom Xbal v plazmide pAL-181, v ktorom bola predtým klonovaná syntetická sekvencia DNA, nesúca terminačnú sekvenciu pre transkripciu zo zakončenia 3'kódovanej sekvencie E. coli do miesta aspA.

Tento pAL309C-781 pri použití nový plazmid, ktorý bol nazvaný plazmidom sa môže použiť pre transformáciu bežným spôsobom vhodnej bakteriálnej hostiteľskej bunky s obsahom a prostriedkom pre riadenie promótora PL (podrobnosti v príklade 5) pre riadenie expresie IL-6.

Je možné tiež postupovať tak, že sa modifikovaná kódová sekvencia pre IL-6 odstráni z plazmidu pAL309C-781 štiepením enzýmom Ndel a HindlII alebo z plazmidu pCSF309 štiepením EcoRI a potom sa včlení do akéhokoľvek požadovaného bakteriálneho vektora pri použití metód, opísaných v publikácii T.Maniatis a kol., Molecular Clining, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Tieto bakteriálne vektory sa potom môžu použiť pre transformáciu bakteriálnych hostiteľských buniek a dosiahnutie expresie IL-6 týmito bunkami.

Príklad 2

Konštrukcia príkladu bakteriálneho vektora pre extracelulárnu sekréciu a expresiu

IL-6 sa môže získať sekréciou tejto bielkoviny do periplazmy E. coli. Týmto spôsobom sa môže získať úplne oxidovaná bielkovina s vysokou špecifickou účinnosťou pri biologických skúškach in vitro, Je opísaný vektor, pri použití ktorého sa dá dosiahnuť expresia IL-6 uvedeným spôsobom.

Plazmid pUC18, opísaný v publikácii Yanisch-Perron a kol., Gene 33, 103 (1985) sa rozštiepi pôsobením reštrikčnej endonukleázy Ndel, výsledné väzbové konce sa zaslepia pôsobením Klenowovho fragmentu DNA-polymerázy I z E. coli a pôsobením deoxynukleozidtrifosfátov a potom sa plazmid recirkularizuje pôsobením T4-DNA-ligázy. Výsledný plazmid I sa čiastočne rozštiepil enzýmom PvuII a enzýmom EcoRI a konce sa zaslepili pôsobením Klenowovho fragmentu DNA-polymerázy. Príslušné fragmenty sa prečistili a znovu naviazali za vzniku plazmidu 2, z ktorého sa odstránil fragment medzi miestami pôsobenia enzýmov EcoRI a PvuII s obsahom lac-promótora. Plazmid 2 sa rozštiepil enzýmom EcoRI a potom sa podrobil pôsobeniu SI nukleázy pre odstránenie zakončenia s jedným reťazcom. Potom sa plazmid rozštiepil pôsobením enzýmu KpnI.

Plazmid pASl, opísaný v publikácii Rosengerg, Ho a Shatzman, Meth. Enzymol. 101, 123 (1983) sa rozštiepil enzýmom BamHI a jednoduché reťazce sa odstránili odštiepením SI nukleázou. Potom sa na rozštiepený enzým pASl naviazala sekvencia d(GTACCCGGGTAC) za vzniku plazmidu pAS2, ktorý má miesto pre pôsobenie enzýmu KpnI, ktoré nahradzuje miesto pôsobenia enzýmu BamHI v enzýme pASl. Plazmid pAS2 sa rozštiepil enzýmom BglII, konce sa vyplnili pôsobením Klenowovej polymerázy a potom sa DNA rozštiepila enzýmom KpnI. Fragment od miesta pôsobenia BglII (vyplnený) k miestu pôsobenia KpnI s obsahom pL promótora sa naviazal na sekvenciu vektora (plazmidu) 2 pre štiepenie KpnI za vzniku plazmidu pAL-181 s obsahom promótora pL, miesta pre väzbu ribozómu a ATG iniciačného kodónu, za ktorým nasleduje miesto pôsobenia enzýmu KpnI a väzbová oblasť plazmidu pUC18. Plazmid pAL-181 sa uložil v The American Type Culture Collection, 12301 Parklaw Dr., Rockville, Maryland dňa 28. augusta 1984 pod číslom 40 134.

Plazmid pAl-181 sa rozštiepil pôsobením enzýmov Ndel a KpnI a včlenila sa nasledujúca signálna sekvencia pre sekréciu DNA:

TATG AAA AAT ATA ACT TTC ATT TTT TTT ATT TTA TTA AC TTT TTA TAT TGA AAG TAA AAA AAA TAA AAT AAT

GCA TCG CCA TTA TAT GCGGTAC

CGT AGG GGT AAT ATA CGC

Táto sekvencia je kódom pre typickú signálnu sekrečnú sekvenciu. Plazmid, ktorý sa získal touto konštrukciou sa nazval pAL-Sec-181.

Plazmid pAL-Sec-181 sa rozštiepil pôsobením KpnI a podrobil sa pôsobeniu Klenowovho fragmentu DNA-polymerázy pre odstránenie koncov s jedným reťazcom. Potom sa plazmid znova rozštiepil pôsobením HindlII a potom sa naviazal na fragment DNA s obsahom kódu IL-6, opísaný v príkladoch 1 a 3. Tento fragment začína sledom GCCCCAGTACCCCCAGGAGAAG, ktorý je kódom pre prvý alanínový kodón zrelého IL-6 a potom pokračuje celou sekvenciou pre IL-6 a 3·-neprenášanú oblasť až k miestu štiepenia enzýmom HindlII a väzbovým retazcom M13mpl9. Výsledný plazmid pAL-Sec-IL-6-181 je kódom pre bielkovinu, syntéza ktorej je riadená pL promótorom, ktorý pozostáva zo sekrečnej signálnej sekvencie spojenej s úplnou bielkovinou IL-6.

Príklad 3

Konštrukcia vektora pre expresiu u cicavcov (pCSF309)

Pri konštrukcii vektora pre expresiu bielkoviny IL-6 u cicavcov bola úplná sekvencia cDNA, tak ako je znázornená na obr. 1 naviazaná na vektor peor expresi u COS buniek p91023B, rozštiepená enzýmom EcoRI (vektor sa môže získat tak, že sa rozštiepi plazmid pCSF-1 ATCC 39754 enzýmom EcoRI pre odstránenie včlenenej sekvencie s približne 750 pármi báz). Plazmid p91023B obsahuje sekvenciu SV40, ulahčujúcu expresiu, promótor adenovírusu, DHFR kódovú sekvenciu, SV40 poly-A-adičné miesto a gén Val. Plazmid, ktorý sa získa štiepením plazmidu p91023B enzýmom EcoRI a včlenením sekvencie DNA z obr. 1, ktorá je kódom pre IL-6, sa označil pCSF309. Plazmid pCSF309 (ATCC č. 67 153) sa môže transformovať bežným spôsobom pri použití príslušného hostiteľa z buniek cicavcov a dosiahnuť tak expresia IL-6.

Príkladom vhodných hostiteľských buniek cicavcov sú predovšetkým bunkové línie primátov, bunkové línie hlodavcov a podobne, napríklad bunky COS.

Odborník môže ľahko skonštruovať ďalšie vhodné vektory pre expresiu u cicavcov, porovnateľné s plazmidom pCSF309, avšak s obsahom menších častí sekvencie z obr. 1. Napríklad je možné oddeliť krajové zakončenie 3'- a 5'- v prípade potreby, alebo sa môže použiť na tvorbu výslednej sekvencie modifikovaná sekvencia alebo alelová variácia sekvencie z obr. 1. DNA z obr. 1 sa môže vybrať z plazmidu pôsobením enzýmu EcoRl a známych postupov s cielom modifikovania sekvencie a pre jej začlenenie do ďalších známych vektorov, napríklad do plazmidu pCD (Okayama a kol., Mol. Celí. Biol. 2, 161 - 170 (1982)) a pJL3, pJL4, ktoré boli opísané v publikácii Gough a kol., EMBO J., 4, 645 - 653 (1985). Použitím týchto vektorov na transformáciu príslušných hostiteľských buniek sa dá dosiahnuť expresia IL-6.

Príklad 4

Konštrukcia vektorov, použitelných v bunkách hmyzu alebo v bunkách kvasiniek

Spôsobom, podobným spôsobu podlá príkladu 1, sa môže meniť sekvencia uvedená na obr. 1, odstraňovaním alebo zamieňaním riadiacich sekvencií pre cicavce, tesne susediacich s kódovou sekvenciou, inými sekvenciami pre riadenie expresie, za vzniku vektorov pre kvasinky alebo iné huby. Takáto sekvencia bude potom schopná expresie v hostiteľských bunkách húb. Môže sa jednať napríklad o kmene Saccharomyces, Aspergillus a Pichia a ďalšie kmene. Pre konštrukciu vektorov pre kvasinkové bunky a pre expresiu bielkovín v kvasinkových bunkách je možné odkázať napríklad na postupy, ktoré boli opísané vo zverejnenej PCT prihláške WO 86 00639.

Bunky hmyzu možno v prípade potreby taktiež použiť ako hostiteľské bunky, pričom sa môžu sekvencie, znázornené na obr. la 2 pozmeniť na systém, vhodný pre tento typ expresie. Napríklad je možné rozštiepiť kódovú sekvenciu, znázornenú na obr. 1 po jej vybraní z plazmidu pCSF309 pôsobením enzýmu EcoRl rôznymi spôsobmi, napríklad jej naviazaním na iné väzbové reťazce alebo vypustením nekódových úsekov sekvencie známym spôsobom. Pri konštrukcii vektora, vhodného pre bunky hmyzieho pôvodu, je možné odkázať na postupy, uvedené v Európskej patentovej prihláške č. 155 476.

Príklad 5

Expresia bielkoviny IL-6

A. Bakteriálna expresia - intraceleulárna

Plazmid pAL309C-781 z príkladu 1 sa použil na transformáciu v E. coli K12, kmeň GI455. Jedná sa o derivát kmeňa W3110, v ktorom boli oblasti Cj a Rex z bakteriofágu lambda, nesúceho C_I857-alelu včlenené do miesta pôsobenia enzýmu Clal génu lacZ bakteriálneho genómu. Táto včlenená sekvencia obsahuje celú sekvenciu DNA medzi nukleotidmi 35 711 a 38 104 genómu fágu, ako bolo opísané v publikácii F. Sanger a kol., J. Biol. 162, 729 (1982).

Ak sa kmeň GI455, transformovaný plazmidom pAL309C-781 kultivuje pri teplote 30 “C do vysokej hustoty buniek a potom sa zahreje na teplotu 40 C, nastáva rýchla produkcia bielkoviny IL-6, ktorá sa potom nahromadí počas ďalších dvoch alebo troch hodín tak, že tvorí viac ako 10 % celkovej bunečnej bielkoviny. Táto bielkovina sa vytvára v nerozpustnej forme, ktorá sa môže solubilizovať bežným spôsobom, opísaným napríklad v publikácii T. E. Creighton, Prog. Biophys. Molec. Biol. 33, 231 - 297 (1987). Tento bakteriálne produkovaný IL-6 má špecifickú účinnosť pri pokuse s kostnou dreňou myši v rozmedzí od približne 10⁶ až 2 x 10⁷ jednotiek na mg bielkoviny.

B. Bakteriálna sekrécia

Plazmid pAL-Sec-IL-6-181 z príkladu 2 sa použil na transformáciu E. coli kmeňa K12 GI400. Tento kmeň je derivátom kmeňa W3110, opísaného v publikácii Bachmann, Bacterial Rev. 36, 525 (1972), v ktorom sú oblasti t.j. nukleotidy 33 498 až v publikácii Sanger a kol.,

Cj, Rex a N bakteriofágu lambda, 38 214 genómu fágu, opísaného

J. Mol. Biol. 162, 729 (1982) včlenené do miesta pre pôsobenie enzýmu Clal génu lacZ bakteriálneho genómu. Gén Cj je alela Cj857, citlivá na pôsobenie zvýšenej teploty.

Akonáhle nastane transformácia plazmidu pAL-Sec-IL-6-181 v kmeni GI400, je potrebné kultivovať bunky pri teplote 30 ’C až po dosiahnutie dostatočnej hustoty a potom sa teplota zvýši na 40 °C, pre zahájenie produkcie IL-6. Produkt izolovaný z periplazmy týchto buniek mal homogénnu molekulovú hmotnosť. Pri spracovaní nastáva odstránenie signálnej sekvencie. N-terminálny alanín sa z vylučovanej bielkoviny taktiež odstraňuje za vzniku produktu, v ktorom je vo väčšine prípadov N-terminálnou aminokyselinou prolín. Materiál má vysokú špecifickú účinnosť pri skúškach na kolóniách buniek z kostnej drene, a to približne 1 až 20 x 10⁶ jednotiek v jednom mg bielkoviny.

C. Expresia u cicavcov

DNA, pripravená z E. coli MC1061 s obsahom plazmidu pCSF309, opísaného v publikácii Maniatisa a kol., uvedenej vyššie, sa čistila spôsobmi, ktoré zahrňovali napríklad odstreďovania pri použití gradientu cézneho s obsahom etidiumbromidu. Bunky COS (ATCC CRL 1650) sa podrobili transfekcii čistenou DNA pri koncentrácii približne 5 μg plazmidu na 10⁶ buniek COS a potom sa podrobili pôsobeniu chlorochínu spôsobom opísaným v publikácii G. G. Wonga a kol., Science 280, 810 - 815 (1985) a R. J. Kaufmana a kol., Mol Celí. Biol. 2, 1304 (1982). Po 72 hodinách po transfekcii sa prostredie po kultivácii buniek COS s obsahom plazmidu pCSF309 oddelilo. Prostredie obsahovalo bielkovinu, ktorá má pri štandardnom pokuse s kostnou dreňou myší účinnosť, ktorá bola opísaná v príklade 5.

Príklad 6

Účinnosť IL- in vitro na kostnú dreň myši

Pokusy s kostnou dreňou myší sa uskutočnili spôsobom, opísaným v publikácii D. Metcalf, The Hemopoietic Colony Stimulating Factors, Elsevier Press, New York 1984, s nasledujúcimi modifikáciami:

a) v pokuse sa použila koncentrácia buniek 2 x 10⁵ na ml,

b) konečný objem vzorky bol 100 μΐ a

c) všetky pokusy sa uskutočnili pri uložení vzoriek do mikrotitiračných dosiek s 96 jamkami.

Kostná dreň sa získala zo stehenných kostí 6 až 25 týždňov starých samíc myší kmeňa Balb/c (Jackson). Pri použití prostredia WEHI 3, opísaného v publikácii J. C. Lee a kol., J. Immunol. 128, 2393 - 2398 (1982), ktoré obsahuje myšací interleukín-3 ako štandardnú kontrolu, je jednotka účinnosti definovaná ako taká koncentrácia bielkoviny, ktorá vyvolá maximálnu odpoveď v uvedenom pokuse s kostnou dreňou, t.j. približne 25 až 35 kolónií na 2 x 10⁴ myšacích buniek kostnej drene.

Prostredie pre kultiváciu buniek COS s obsahom plazmidu pCSF309 bolo účinné po riedenie najmenej 10^-4 v pokuse s bunkami myšacej kostnej drene a vyvolávalo tvorbu kolónií malých buniek granulocytárneho typu. Počet a typ buniek pri dosiahnutí maximálnej odozvy sa bude meniť v závislosti od použitého kmeňa a veku myšacieho donora.

Upravené prostredie pre kultiváciu buniek E. coli s obsahom plazmidu pAL309C-781 malo špecifickú účinnosť najmenej 10 až 2 x 10 jednotiek v mg bielkoviny pri tom istom pokuse. Pri použití bakteriálne produkovaného IL-6 dochádzalo tiež ku tvorbe kolónií granulocytov.

Príklad 7

Analýza molekulovej hmotnosti IL-6

Spôsobom opísaným v publikácii R. J. Kaufmanna a P. A.

Sharpa, J. Mol. Biol. 159, 601 - 629 (1982) je možné včleniť metabolický ³⁵S-metionín do bielkoviny IL-6 získanej transfekciou buniek COS včlenením pCSF309. V prípade, že prostredie pre kultiváciu buniek COS s obsahom plazmidu pCSF309 sa ³⁵S-značeným metionínom analyzuje pri neredukčných podmienkach elektroforézou na SDS-polyakrylamidovom géle spôsobom, opísaným v publikácii U. K. Laemmliho, Náture 227, 680 - 685 (1970), je možné pozorovať široký pás hmotnosti 20 až 25 kjednotiek, ktorý indikuje glykozyláciu.

Príklad 8

Konštrukcia bunkových línií CHO, pri ktorých sa dosahuje expresia vysokých množstiev IL-6

Jedným zo spôsobov produkcie vysokých množstiev IL-6 z buniek cicavcov je konštrukcia buniek, ktoré obsahujú väčší počet kópií heterológneho génu IL-6. Heterológny gén sa môže viazať na značiacu sekvenciu, schopnú amplifikácie, napríklad na gén pre dihydrofolátreduktázu (DHFR), podlá ktorého sa potom môže uskutočňovať selekcia buniek s obsahom zvýšeného počtu kópií génu pre kultiváciu pri zvýšenej koncentrácii metotrexátu (MTX) spôsobom, ktorý opísal Kaufman a Sharpv publikácii uvedenej vyššie. Tento postup sa môže použiť pri celom rade rôznych typov buniek.

Plazmidy pCSF309 a pAsA26SV-(A)3 (plazmid pre expresiu DHFR) sa súčasne použijú na transfekciu pri DHFR-deficitných bunkách CHO, DUKX-BII súčasným zrážaním fosforečnanom vápenatým a transfekciou. Počiatočné transformanty, pri ktorých nastáva expresia DHFR sa vyberajú pre rast na prostredí alfa s dialyzovaným fetálnym telacím sérom a potom sa podrobia selekcii na amplifikáciu rastom pri zvyšujúcej sa koncentrácii MTX, a to postupne v 0,02, 0,2, 1,0 a 5 mM MTX, podlá publikácie Kaufmana a kol., Mol. Celí Biol. 5, 1750 (1983). Transformanty sa klonujú a expresia biologicky účinného IL-6 sa sleduje pokusom s myšacou kostnou dreňou. Expresia IL-6 by sa mala zvyšovať súčasne so zvyšujúcou sa odolnosťou voči MTX.

Je zrejmé, že odborník bude môcť navrhnúť celý rad modifikácií a variácií, ktoré budú taktiež patriť do oblasti vynálezu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob výroby hematopoetínu IL-6, vyznačuj úci sa tým, že sa kultivuje eukaryotická alebo prokaryotická bunková línia, transformovaná vektorom obsahujúcim sekvenciu DNA., tak ako je uvedená na obr. 1, v operatívnom spojení s riadiacou sekvenciou pre expresiu.
2. Spôsob podlá nároku 1,vyznačujúci sa tým, že vektor používaný pre transformáciu obsahuje sekvenciu £

cDNA, ktorá je kódom pre bielkovinu-# obsahuje- peptidov» 0<L/ sekvenciu, ktorá je zhodná so sekvenciou aminokyselín od aminokyseliny 28 po aminokyselinu 212 na obr. 1, pričom táto sekvencia cDNA je v operatívnom spojení s riadiacou sekvenciou pre expresiu.
3. Spôsob podlá nároku 2,vyznačujúci sa tým, že sa používa vektor, ktorého sekvencia cDNA je v podstate totožná s nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 1.
4. Spôsob podlá nároku 2,vyznačujúci sa tým, že sa používa vektor, ktorého sekvencia cDNA je v podstate totožná s nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 2.
5. Spôsob podlá ktoréhokolvek z nárokov 1 až 4, v y z n ačujúci sa tým, že ako bunková línia sa používa bakteriálna bunková línia.