JP2664698B2 - Ｉｌ‐６の製造および用途 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、組換え体IL−６蛋白質の製造および免疫調
節に関与する本ヒト蛋白質新規使用方法に関するもので
ある。 発明の背景 ヘマトポイエチンまたは造血成長因子は造血性細胞の
生存、成長および分化を推進する蛋白質である。あるヘ
マトポイエチンの生物化学的および生物学的同定および
確認は天然源、たとえば血液および尿から入手できる因
子が少量であることにより妨げられてきた。しかし、組
換え体遺伝子工学技術により、これらのヘマトポイエチ
ンのいくつかは分子的にクローン化され、異種的に発現
され、均質なものに精製された。これらのヘマトポイエ
チンの中には、骨髄、胎児肝および他の器官の幹細胞か
ら発生する造血性細胞のコロニーの試験管内成長を支持
する能力により特徴づけられるコロニー刺激因子、たと
えばGM−CSF、Ｇ−CSF、CSF−１およびIL−３がある。
〔たとえばメトカルフ（D.Metcalf）、ブラッド（Bloo
d）、第67巻（２）:257−267頁（1986年）；ヤングら
（Y.C.Yang et al）、セル（Cell）、第45巻（１）、３
−10頁（1986年）；ドナハウエら（R.Donahaue et a
l）、ネーチャー（Nature）、第321巻、872−875頁（19
86年）参照〕。 本発明者の米国優先権出願の出願日の後に、他の生物
学的活性および名称で特徴づけられる蛋白質を記述して
いるいくつかの特許が他の研究者により出願されたが、
それは本明細書および優先権出願に記述されたIL−６と
命名された新規蛋白質と同一であった。ハエゲマンら
（Haegeman et al）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ
・バイオケミストリー（Eur.J.Biochem.）、第159巻、6
25−632頁（1986年）およびその中に引用された参考文
献〔ヒト線維芽細胞に誘導可能な26kd蛋白質〕；ジルベ
ルスタインら（Zilberstein et al）、ヨーロピアン・
モレキュラー・バイオロジー・オーガナイゼイション・
ジャーナル（EMBO.J.）、第５巻、2529−2537頁（1986
年）〔弱いインターフェロン活性をもつインターフェロ
ン（INF）−β−２〕および平野ら（Hirano et al）、
ネーチャー（Nature）、第324巻、73−76頁（1986年）
〔Ｂ細胞刺激活性に関するBCDFまたはBSF−２〕参照。
さらに、公開されたヨーロッパ特許出願第220574号参
照。これらの報文のいくつかは天然物質の精製を報告し
た。 図面の簡単な説明 第１図はIL−６の全cDNAおよびアミノ酸配列を示す。 第２図はIL−６の細菌発現に特に適しいる修飾された
cDNAを示す。 第３図はプラスミドPAL−Sec−IL6−181の構築を示
す。 第４図は分泌過多の細菌発現に対するCI対立遺伝子を
示す。 発明の概要 １つの態様として、本発明は、第１図のアミノ酸28番
−アミノ酸212番の配列と実質的に同じ配列を含有して
いるペプチド配列を含有するという特徴をもつ蛋白質を
コード化するcDNAで形質転換された適当な細胞を培養す
ること含むIL−６の製造方法を開示する。本方法中のcD
NA配列はその発現制御配列に作動可能に結合している。
IL−６の製造方法は、また第１図の完全なヌクレオチド
配列と実質的に同じcDNA配列を使用し得るものである。 他の態様として非グリコシル化IL−６の製造方法を提
供するものである。本方法は、第２図のアミノ酸28番−
アミノ酸212番の配列と実質的に同じ配列を含むペプチ
ド配列を含有するという特徴をもつ蛋白質をコード化し
ているcDNAで形質転換された適当な細菌細胞を培養する
ことを含む。本方法に用いられるcDNA配列は、また適当
な発現制御配列に作動可能に結合している。 さらに他の態様として、本発明は本発明の方法に有用
な形質転換ベクターを提供するものである。これらのベ
クターは適当な発現制御配列の制御下にある第１図また
は第２図のものと同じか実質的に同じDNA配列を含む。 さらに別の態様として、本発明は他の蛋白質を実質的
に随伴しないヒト蛋白質IL−６を含む。IL−６は上記の
方法のいずれかによって製造され得、それ故グリコシル
化蛋白質または非グリコシル化蛋白質であり得る。 さらなる態様として、有効量の本発明のIL−６を含む
医薬組成物を提供するものである。この組成物は、有効
量のヘマトポイエチン、インターロイキン、成長因子ま
たは抗体の少なくとも１つ、さらに好ましくは蛋白質IL
−３またはIL−２のいずれかをさらに含む。IL−６を含
んでいる治療組成物は、特にIL−２と併用し、さらにγ
−インターフェロンと併用して、癌の処置に有用であり
得る。 本発明の治療組成物は、有効量のIL−６ペプチドを患
者に投与することにより、損傷をうけた免疫組織機能に
よって特徴づけられた疾病をもつヒト患者を処置するの
に用いられ得る。本治療法はさらに有効量のIL−２また
はIL−３を平行投与することを含み得る。癌の処置にお
いて、治療法はさらに有効量のIL−６およびIL−２とγ
−インターフェロンと平行投与することを含み得る。他
のヘマトポイエチン、成長因子または抗体および他の既
知の治療薬もまたIL−６と組み合わせられ得る。 本発明の他の特徴や利点は、その実施方法を説明する
実施例を含めて本発明の下記の詳細な説明を考慮すると
明瞭である。 発明の詳細な記載 本発明は、実質的に他のヒト蛋白質を随伴しないヒト
IL−６の制御方法を提供するものである。本発明の製造
法は、適当な発現制御配列の制御下にあるIL−６蛋白質
をコード化しているDNA配列により形質転換された宿主
細胞を培養することを含む。IL−６蛋白質をコード化し
ているDNA配列は、第１図に示されたように、ヌクレオ
チド132番−ヌクレオチド689番またはヌクレオチド51番
−ヌクレオチド1139番と同じヌクレオチド配列または実
質的に同じヌクレオチド配列を含む。本方法で用いるcD
NAの一つは第１図の完全なヌクレオチド配列を含む。第
１図の約1.1kb DNA配列は、アメリカ合衆国メリーラン
ド、ロックビル、パクローン・ドライブ12301、アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（American T
ype Culture Collection）に、1986年７月11日付で寄託
され、寄託番号ATCC第67153号を付与されたエシエリヒ
ア・コリ（E.Coli）MC1061のプラスミドPCSF309に潜在
される。 本方法で用いるIL−６をコード化しているDNA配列の
好ましい具体例は、細菌細胞における発現を考慮してデ
ザインされた第２図の配列である。第１図および第２図
のヌクレオチドおよび対応しているペプチド配列の対立
遺伝子変種（すなわち、アミノ酸配列を変化し得るかし
得ない、種中で起る天然の塩基配列変化）および遺伝暗
号の縮重によって得られるヌクレオチド配列中の変異
は、それらがIL−６活性を有するポリペプチドをコード
化する場合、本発明で用いるもの包含される。 点突然変異または誘発された修飾により起る、蛋白質
の活性または産生を増進する第１図の1.1kb配列中の変
異は、発現時にコード化する機能的蛋白質を変化しては
ならない。それ故、配列中の上記の変異は本発明中に包
含される。たとえば、第２図の修飾された配列は細菌宿
主細胞中に発現に現在好ましい。DNA配列中にまたは既
知の方法により人工的に製造された配列中に意図的に組
み込まれた上記のヌクレオチド修飾は、当業者が既知の
技法を用いて実施し得る。上記の修飾はIL−６のペプチ
ド配列中のアミノ酸の欠失、挿入または変換を起し得
る。たとえばコード化配列中の一つまたはそれ以上のシ
ステイン残基の置き換えは、対応しているジスルフィド
架橋を消去し得る。さらに、一つまたはそれ以上のトリ
ペプチドのアスパラギンに結合したグリコシル化認識部
位でのアミノ酸の変換、挿入または欠失は、その部位で
の非グリコシル化をもたらし得る。上記の置き換えまた
は欠失の突然変異技法は当業者によく知られている〔米
国特許第4518584号参照〕。 本発明の方法は、上記のように修飾され、第１図およ
び第２図に示された配列を含んでいる、IL−６をコード
化するcDNAにより形質転換された適当な細胞または細胞
系を培養することを含む。形質転換された細胞中のIL−
６をコード化するDNA配列は適当な発現制御配列と作動
可能に結合している。 適当な宿主細胞の選択および形質転換、培養、遺伝子
増幅、スクリーニングおよび生成物の製造および精製の
方法は当業界では既知である。たとえば、ゲチングおよ
びサンブロク（Gething and Sambrook）、ネーチャー
（Nature）、第293巻、620−625頁（1981年）、または
別法として、カウフマン（Kaufman et al）、モレキュ
ーラー・アンド・セルラー・バイオケイストリー（Mol.
Cell.Biol.）、第５巻（７）、1750−1759頁（1985年）
またはハウレイら（Howley et al）、米国特許第441944
6号参照。 細菌細胞は現在IL−６の製造方法における宿主細胞と
して好ましい具体例である。細菌産生は大量の活性非グ
リコシル化IL−６をもたらす。蛋白質の細菌発現に現在
好ましいIL−６配列は第２図の修飾された配列である。
IL−６が細菌細胞中で発現される場合、それは細胞内に
発現され、活性型に折りたたまれ得るかまたはそれは活
性型で細菌細胞から分泌され得る。バイオテクノロジー
の分野で宿主細胞として周知のエシエリヒア・コリの種
々の株〔たとえば、MC1061株および実施例に記述された
株〕は生物学的に活性なIL−６の製造を可能にする宿主
細胞として好都合に用いられる。IL−６発現に適当な種
々の菌株の一般的なリストはバチルス・サブチリス（B.
Subtilis）、シュードモナス（Psendomonas）の種々の
株、他の細菌などを包含する。 哺乳動物細胞もまたIL−６の製造用の宿主細胞として
用いられ得る。特に適当な哺乳動物細胞の１つは、チャ
イニズ・ハムスター卵巣〔CHO〕細胞系である。添付し
ている実施例に記載されている他の適当な哺乳動物細胞
系はサルのCOS−１細胞系である。同じく有用な哺乳動
物細胞系はCV−１細胞系である。 当業者に既知の酵母の多くの株もまたIL−６の発現用
の宿主細胞として利用できる。また、所望により昆虫細
胞も本発明の方法に宿主細胞として用いられ得る。たと
えばミラーら（Miller et al）、ジェネティク・エンジ
ニアリング（Genetic Engineering）、第８巻、277−29
8（プリナム・プレス1986年）およびその中に引用され
た参照文献参照。 本発明はまたIL−６蛋白質の発現方法に用いるベクタ
ーおよびDNA配列を提供するものである。ベクターは先
に列挙されたヌクレオチド配列と同じかまたは実質的に
同じものを含む。好ましくはベクターは第１図または第
２図に列挙された完全なDNA配列を含む。ベクターはま
たIL−6DNA配列の発現を可能にする適当な発現制御配列
を含む。別法として本明細書に記載されたように修飾さ
れるかまたは自然発生する対立遺伝子配列が組み込まれ
ているベクターも、IL−６の製造に有用なものに含まれ
る。ベクターは、細胞系を形質転換する方法に用いられ
得、選択された宿主細胞中でその複製および発現を指示
し得る上記のIL−6DNAをコード化する配列に作動上関連
している選択された調節配列を含み得る。上記のベクタ
ーに有用な調節配列は当業者に既知で、選択された宿主
細胞に応じて選択され得る。上記の選択は日常的で、本
発明の重要な部分ではない。好ましいベクターは細菌ベ
クターである。 蛋白質IL−６はそれ自体本発明の他の特徴である。蛋
白質IL−６は、既知の遺伝子工学方法によるペプチドの
合成および組み換え体微生物によるペプチドの製造を可
能にするようなペプチド配列およびヌクレオチド配列が
供給されたことにより、他のヒト蛋白質を実質的に随伴
しない形で提供されるものである。蛋白質IL−６の好ま
しい具体例は遺伝子の細菌発現により生産され得る非グ
リコシル化IL−６である。IL−６は、第１図に示された
アミノ酸28番−アミノ酸212番と同じかまたは実質的に
同じペプチド配列を含有するという特徴をもっている。
本発明の方法により製造されたIL−６は、非還元状態下
でSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析さ
れた場合、約20−35kbの見掛けの分子量という特徴をも
っている。pCSF309順化培地において、蛋白質は10−100
ピコモルの濃度で試験管内のマウス骨髄検定による小さ
い顆粒球型コロニーの形成を引き起す。 第１図はIL−６蛋白質をコード化し、適当な宿主細胞
中での発現を可能にする完全な1.1kb DNA配列を描いて
いる。本配列は、約50ヌクレオチドの既知のリーダー分
泌配列を含んでいる212アミノ酸ポリペプチドをコード
化している636ヌクレオチドの長い翻訳解読枠を含む。
1.1kb配列の領域をコード化している蛋白質は、ヌクレ
オチド132番（アラニン コドンのグアニン、アミノ酸2
8位）−ヌクレオチド686番にさたり、その後にTAG転写
停止コドンが続く。哺乳動物発現系中で遺伝子が発現さ
れたときグリコシル化され得る、特徴的配列、Asn−Ｘ
−Serにより例示される２つの可能なアスパラギン結合
グリコシル化部位が存在する。コード化領域はまた２つ
のジスルフィド結合を示唆している４つのシステインを
含む。1.1kb領域の３′非コード化配列の他の453ヌクレ
オチドは、天然の宿主中での転写において調節の役割を
有し得る。配列の３′末端は、またRNA伝令の安定度に
関連していると考えられる配列ATTTAのいくつかの反復
を含んでいるATリッチ部分を含む。〔シァウおよびカメ
ン（G.Shaw and R.Kamen）、セル（Cell）、第45巻
（５）、659−677頁（1986年）さん証〕。 第２図に示された細菌発現に好ましい配列は、第１図
と同じペプチド配列を有しているが、細菌発現組織でIL
−６の製造を増進する選択的に修飾されたヌクレオチド
配列を有している。さらに、この好ましい配列は第１図
に存在するリーダー配列の大部分および３′非コード化
配列を欠失している。 本発明の１つの好ましい具体例は、細菌により産生さ
れた非−グリコシル化IL−６である。細菌細胞で産生さ
れた場合、蛋白質の28位アラニンのコード化の配列は一
般に細菌酵素で切断される。それ故、細菌で産生された
IL−６蛋白質の約80％はその５′開始アミノ酸として、
29位、プロリンを有している。細菌で産生されたIL−６
は非グリコシル化された、したがって他の発現系で製造
されたIL−６よりもより均質の見掛け分子量を有してい
る。さらに、第２図のDNAによりコード化される場合、
細菌産生IL−６は高収率で製造される。 本方法および治療組成物は、少なくとも−１つの有効
成分としてIL−６を用い得る。IL−６は、造血組織の骨
髄球様またはリンパ球様細胞のいずれか、またはそれら
の組み合せの濃度が減少するという特徴をもつ疾病の処
置において、単独または他の治療物質との併用投与で用
いられ得る。本蛋白質は、またアクセサリーおよび成熟
細胞たとえば単核細胞を刺激して他の造血様因子を産生
させることができ、ついでこれは他の造血細胞のコロニ
ー形成および他の造血様活性を刺激し得る。別法とし
て、IL−６は他のヘマトポイエチンの活性を増進し得
る。たとえば、IL−６は、他のヘマトポイエチンすなわ
ちIL−３およびCSF−１の能力を増進し、CSF−１または
IL−３単独の場合よりもより未成熟の造血細胞の増殖を
刺激する能力が、５−フルオロウラシル処理マウス骨髄
検定で証明された。この特徴は、以前、IL−６の発現を
誘導し得るIL−１−αまたはヘマトポイエチン１と命名
された蛋白質によるものとされた。同じく、ヒト芽細胞
検定において、IL−６およびIL−３の併用は初期のヒト
幹細胞コロニーの増殖を引き起す。かくして、IL−６
は、免疫不全を含む多くの症状の処置、たとえば放射能
または化学治療への過度のばく露を受けたヒトを処置す
るのに、IL−３との併用による可能な医学的用途を有し
ている。 種々の免疫不全たとえばＴおよびＢリンパ球の双方ま
たはいずれか一方の不全、または免疫障害たとえばリウ
マチ性関節炎もまたIL−６による処置により有利な効果
があり得る。白血球減少症、すなわち静脈血液に循環し
ている白血球数の減少のような免疫不全はウイルス感
染、たとえばHTLV I、HTLV II、HIV、放射線への強いば
く露、癌治療の側面的効果の結果または他の医学的処置
の結果であり得る。IL−６組成物による白血球減少症の
治療処置は現在入手できる薬剤による処置により引き起
される好ましくない副作用を回避し得る。IL−６処置に
感受性のある他の症状は、骨髄移植組織から回復してい
る患者を包含する。 上記の症状を処置するのに用いる組成物は医学的に許
可可能な担体との混合物中にIL−６の治療上効果的な量
を含む。本組成物は全身的に、非経口的、静脈内または
皮下に投与され得る。全身的に投与される場合、本発明
に用いる治療組成物は勿論発熱物質無含有の、非経口的
に許容可能な水溶液の形である。pH、等張性、安全性な
どを考慮した上記の非経口的に許容可能な蛋白質溶液の
調剤は当業者の技術範囲内にある。 上記の症状の処理法に含まれる用量用法は薬剤の作
用、たとえば患者の症状、体重、性、食餌、何らかの感
染の重度、投与の時間および他の臨床的作用を変える種
々の因子を考慮して診察する医師により決定され得る。
一般に、毎日の用法は、ポリペプチド200−1000ミクロ
グラムの範囲内または体重キログラム当りのポリペプチ
ド50−500単位（すなわち、単位は標準ネズミ骨髄検定
により最高の刺激の半分にあたるポリペプチドの濃度）
へ範囲内になければなない。 １つの好ましい具体例として、IL−６は他の薬品と併
用して使用し、成熟リンパ様細胞を活性化する。具体的
には、IL−６が既知の検定法においてCDF活性を有する
ことが見い出された〔高井ら（Takai et al）、ジャー
ナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.）、第137巻（1
1）、3494−3500頁（1986年）〕。すなわち、IL−２単
独と併用の、IL−２およびγ−インターフェロンと併用
のIL−６は成熟リンパ様細胞を活性化する。この特定の
併用は抗癌および抗ウイルス治療処置に用いられ得る。
〔高井ら（Takai et al）、サイエンス（Science）（19
86年）投稿中参照〕。この効用は、一部分は、IL−６に
より示される細胞溶解性Ｔ細胞活性によるものとされ
る。かくして、IL−６およびIL−２およびγ−インター
フェロンによる患者の同時または連続処理が転移性癌の
処置に特に有効であり得ることが予想される。同じく、
IL−６はLAK治療にIL−２と併用して用いられ得る。IL
−６と同時または連続併用投与用の他の適当なヘマトポ
イエチン、CSFおよびインターロイキンの一般的なリス
トは、GM−CSF、CSF−１、Ｇ−CSF、Meg−CSF、エリス
ロ蛋白質（EPO）、IL−１、IL−３、Ｂ−細胞成長因子
および好酸性分化因子を包含する。上記の併用は他のヘ
マトポイエチン単独での処置の活性または効果を増進し
得る。 IL−６は、また他の治療薬と併用投与して生体内の体
液または細胞の免疫応答を増大し得る。たとえば、IL−
６は、HTVなどのようなウイルス抗原ワクチンまたは腫
瘍抗原ワクチンの効果を増進し得る。 これらの併用投与用法でのIL−６の用量は、IL−６単
独の投与で列挙された用量に治療組成物中の別の成分、
たとえばIL−２を補償するように調整する。処置された
患者の経過は造血学的性質の周期的評価、たとえば白血
球計算値などにより追跡され得る。 IL−６はまた周知の方法により、診断および治療用の
ヒトおよびネズミのポリクローンおよびモノクローン抗
体を生成するのに使用され得る。上記のモノクローンま
たはポリクローン抗体は標的または毒性薬、標識などへ
の付着により治療上用いられ得る。IL−６はまたハイブ
リドーマ細胞系の培地中でハイブリドーマ成長因子とし
て機能して、それらの収率を増大する。 下記の実施例はIL−６をコード化しているcDNAを用い
ている本発明の方法を示す。第１図の完全なDNA配列
は、米国特許第4675285号に記載された発現クローニン
グ法を用いて、HTLV Iで形質転換されたヒトＴ−細胞系
C10MJ2〔ナショナル・インスティテュト・オブ・ヘルス
（National Institute）；アリヤら（S.K.Arya et a
l）、サイエンス（Science）、第222巻、1086頁（1984
年）〕のpoly＋mRNAライブラリーから分離された。 実施例１ 細胞内発現用の典型的な細菌発現ベクターの構築 EcoR I挿入物〔実施例３参照〕としてのpCSF309（ATC
C番号67153）に含まれた第１図の配列をIL−６の製造用
にEcoR Iによる消化によりそれから切断し、適当な細菌
のベクターおよび宿主に挿入し得る。しかし、IL−６の
５′コード化配列を変更することにより蛋白質の高収率
をもたらすIL−６に好ましい細菌発現は第２図の配列を
用いる。 この好ましい配列を次のように細菌発現プラスミドpA
L309C−781を構築するのに用いた： EcoR I断片を保有するIL−６のcDNAクローン〔第１
図〕を非コード化鎖がファージに組み込むような配向で
M13mp19〔メシング（S.Messing）、メンズ・イン・エン
ザイモロジー（Methods in Enzymology）、第101巻、20
−78頁（1983年）；ノランダら（J.Norrander et a
l）、ジーン（Gene）、第26巻、101−106頁（1983年）
参照〕に移した。一本鎖ファージDNAをオリゴヌクレオ
チドｄ（GCCCCAGTACCCCCAGGAGAAG）で製造し、アニーリ
ングした。オリゴヌクレオチドをエシエリヒア・コリ
（E.Coli）のDNAポリメラーゼＩのクレナウ（Klenow）
断片で身長し、残余の１本鎖領域をS1ヌクレアーゼで消
化した。末端をDNAポリメラーゼのクレナウ断片による
再度の処理により二本鎖にし、最終的に二本鎖IL−6cDN
AをHind IIIによる消化により製造した。二本鎖末端−H
ind III断片をkpn Iで消化し、DNAポリメラーゼ・クレ
ナウ断片で処理し、Hind IIIで消化したpAL−181（ATCC
番号40134）に連結した。生成するプラスミドpAL309−1
81を試験管内で部位を指示するループアウト突然変異生
成により、第１図のpb148番−169番の間の塩基配列断片
を除去することにより先ず修飾した。〔森永ら（Morina
ga et al）、バイオテクノロジー（Biotechnology）、
第２巻、636−639頁（1984年）参照〕。この欠失はIL−
６配列中に１個しかないNar I部位を作り出した。一本
鎖末端をDNAポリメラーゼＩのクレナウ断片で充填し、
次いでHind IIIで消化した。IL−６遺伝子の３′末端を
保有しているこの消化物からの断片を分離した。この断
片を一方の末端を二本鎖にし、他の末端に５′一本鎖TA
配列を保有させる42pb人工的二重体と混合した。混合物
をNde IおよびHind IIで切断したpAL181と連結した。こ
の３通りの連結は第２図に示した修飾したIL−６遺伝子
配列およびpAL309B−181と呼ばれる発現プラスミドを生
産した。 プラスミドpAL309B−181をBan Iで切断し、一本鎖末
端をDNAポリメラーゼＩのクレナウ断片を用いて充填さ
せた。プラスミドは次にNde Iで切断し、IL−６クロー
ンを分離した。この断片を配列をコード化しているエシ
エリヒア・コリ（E.Coli）aspAの３′から末端に見い出
す推定の転写終止配列を保有している人工的DNA配列を
先にクローンしたpAL−181ベクターのNde Iおよび占め
させたXba I部位の間に挿入した。 pAL309C−781と呼ばれるこの新規のプラスミドをIL−
６蛋白質の発現によってPLプロモーター（たとえば実施
例５参照）を制御する方法を含んでいる適当な細菌宿主
細胞に既知の技法により形質転換させ得る。 別法として、配列をコード化している修飾したIL−６
をNde Iによる切断によりpAL309C−781から、またはEco
R Iによる切断によりpCSF309から除去させ、マニアティ
スら（T.Maniatis et al）、モレキュラー・クローニン
グ・ア・ラボラトリー・マニアル（Molecular Cloning
A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー（Cold Spring Habor Laboratory）
（1982年）記載の方法とベクターを用いて任意の細菌ベ
クターに挿入する。これらの典型的な細菌ベクターを次
に細菌宿主細菌に形質転換させ、それによってIL−６は
発現した。 実施例２ 細胞外分泌および発現用の典型的な細菌発現ベクターの
構築 IL−６をエシエリヒア・コリ（E.Coli）のペリプラズ
ム（Periplasm:内膜と外膜のすき間）への蛋白質の分泌
により産生され得る。この生成物は、試験管内の生物検
定において高い比活性を有している完全に酸化された非
グリコシル化蛋白質を産生した。細菌からの分泌による
IL−６の製造用の２つの典型的なベクターを記述する。
（１）プラスミドpUC18〔ヤニシ−ペロンら（Yanisch−
Perron et al）、ジーン（Gene）、第33巻、103頁（198
5年）〕を制限エンドヌクレアーゼNde Iで切断させ、生
成する付着末端をエシエリヒア・コリ（E.Coli）DNAポ
リメラーゼのクレナウ断片および３リン酸デオキシヌク
レオシドによる処理により二本鎖にさせ、プラスミドを
T4−DNAリガーゼにより再環状化させた。生成するプラ
スミド１番を次にPvu II（部分的消化）およびEcoR Iの
両方で切断させ、末端をDNAポリメラーゼのクレナウ断
片により二本鎖にさせた。適当な断片を精製し、再連結
して、lacプロモーターを含んでいるEcoR IからPvu II
までの断片を除去したプラスミド２番を製造した。プラ
スミド２番をEcoR Iにより消化させ、S1ヌクレアーゼに
より処理させて、一本鎖末端を除去した。プラスミドを
次にKpn Iにより切断した。 プラスミドpAS1〔ローゼンベルグ、ホーおよびシヤツ
マン（Rosenberg.Ho and Shartzman）、メンズ・イン・
エンザイモロジー（Methods in Enzymology）、第101
巻、123頁（1983年）〕をBamH1により切断させ、一本鎖
末端をS1ヌクレアーゼによる消化により除去した。配列
ｄ（GTACCCGGGTAC）をもつリンカー（linker）をこの消
去させたpAS1 DNAにより連結して、pAS1中のBamH1部位
を置き換えているKpn Iを有するプラスミドpAS2を得
た。pAS2をBgl IIにより切断し、末端をDNAポリメラー
ゼのクレナウ断片の作用により二本鎖にさせ、DNAをKpn
Iにより切断した。pLプロモーターを含んでいるBgl II
（二本鎖）−Kpn I断片をプラスミド２番のEcoR I（二
本鎖）−Kpn Iベクター配列と連結して、pAL−181、pL
プロモーターを保有しているプラスミド、リボゾーム結
合部位およびKpn I部位およびpUC18のポリリンカー領域
により直ちに起るATG開始コドンを作り出した。プラス
ミドpAL−181を取得番号40134で1984年８月28日に、ア
メリカ合衆国メリーランド、ロックビル、パークローン
・ドライブ12301、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（American Type Culture Collection）に
寄託した。 プラスミドpAL−181をNde IおよびKpn Iにより切断
し、次の合成DNA分泌前駆体配列を挿入した： この配列は代表的分泌前駆体配列をコード化する。こ
の構成から生成するプラスミドをpAL−Sec−181と称し
た。 pAL−Sec−181をKpn Iにより切断し、DNAポリメラー
ゼのクレナウ断片により処理して、一本鎖末端を除去し
た。プラスミトをHind IIIにより再切断し、実施例１お
よび３に記載のDNA断片を含んでいるIL−６に連結し
た。この断片は、成熟IL−６のアラニンコドンをコード
化する配列GCCCCAGTACCCCCAGGAGAAGから始まって、それ
がM13mp19ポリリンカー中のHind III部位に達するま
で、完全なIL−６配列および３′−非翻訳性領域まで続
いた。生成するプラスミド、pAL−Sec−IL−６−118
は、その合成をpLプロモーターより制御し、成熟IL−６
蛋白質に融合した分泌前駆体から成る淡白質をコード化
する。 （２）過剰の分泌発現系を得るため、サンガーら（F.Sa
nger et al）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー（J.Mol.Biol.）、第162巻、729頁（1982年）
により、報告されたヌクレオチド34499−38214に含有さ
れるバクタリオファージλのCI、rexおよびＮ領域をlac
Z遺伝子のCla I部位に挿入し、これを常用のプラスミド
にクローン化させる。用いたCI遺伝子は第４図に示した
配列を有している対立遺伝子であった。この遺伝子の配
列を、48位のグリシンをセリンに変換した既知の方法、
すなわち、コドンの最初の配位におけるＧをＡに転換す
ることにより変化した。このCI857Ser−48対立遺伝子を
次に細胞のlacZ遺伝子への相同性組み換えによってエシ
エリヒア・コリ（E.Coli）ゲノムに挿入した。いったん
挿入させると、それはlacZ、λ免疫性エシエリヒア・コ
リ（E.Coli）を得た。 ヒトIL−６に対する遺伝子を分泌前駆体をコード化し
ている既知の配列に融合した。これらの配列を、既知の
プラスミドの野生型pLプロモーター配列により操作上連
鎖し、CI857Ser−48を保有しているγ免疫性エシエリヒ
ア・コリ（E.Coli）細胞に形質転換した。CI857Ser−48
遺伝子をもつ細胞はペリプラスム中に活性形で著しい量
のIL−６蛋白質を生産した。 実施例３ 典型的哺乳動物発現ベクターpCSF309の構築 第１図に叙述した完全なcDNA配列をEcoR Iで消化した
COS細胞発現ベクターp91023B〔Eco IによりpCSF−１（A
TCC番号39754）を消化することにより得て、約750塩基
対挿入物を除去させた〕に連結して、IL−６の発現用哺
乳動物ベクターを構築した。p91023Bは、SV40増進因
子、主要なアデノ関連ウイルス後期プロモーター、配列
をコード化しているDHFR、SV40伝令poly−Ａ付加部位お
よびVal遺伝子を含む。p91023BのEco Iの消化およびIL
−６によりコード化している第１図のDNA配列の挿入よ
り生成するプラスミドをpCSF309と称した、pCSF309（AT
CC番号67153）をIL−６の発現用の適当な哺乳動物宿主
細胞に、既知の技法により形質転換した。 哺乳動物細胞発現用の典型的宿主細胞は、特に霊長類
動物細胞系、ゲツ歯類動物細胞系など、たとえば、COS
細胞を包含する。 当業者は、またpCSF309に比敵するが、第１図の完全
な配列以上に含有しない他の哺乳動物発現ベクターを構
築することができる。たとえば、５′および３′の両方
に接する配列を所望により第１図の配列から切り離し得
るか、または第１図の修飾性または対立遺伝子変異をそ
の配列を操作することにより用い得る。 第１図のDNA配列をEco Iにより切断させ得、周知の組
み換え遺伝工学的技法をpCD〔岡山ら（Okayama et a
l）、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
（Mol.Cell.Biol.）、第２巻、161−170頁（1982年）〕
およびpJL3、pJL4〔ガウフら（Gough et al）、ヨーロ
ピアン・モレキュラー・バイオロジー・オーガナイゼー
ション・ジャーナル BMBO.J.）、第４巻、645−653頁
（1985年）〕のような他の既知のベクターにそれを挿入
するのに用いた。適当な宿主細胞へのこれらのベクター
の形質転換はIL−６の発現をもたらすことができる。 実施例４ 酵母および昆虫ベクターの構築 実施例１と同じ方法により、当業者は、他の発現制御
配列とコード化している配列の両方に接している哺乳動
物調節配列を消去または置き換えることにより第１図の
配列を操作して、酵母または他の菌類のベクターを作り
出し得る。かくして、この配列を菌類宿主細胞に発現で
きるようにし得る。菌類細胞の一般的なリストはサッカ
ロミセス（Sacchromyces）属、アスペルギルス（Asperg
illus）属およびペヒア（Pichia）属の株および他の既
知の株を包含する。酵母のベクターおよび酵母細胞中の
蛋白質の発現の構築については、たとえば公開した国際
出願公開WO8600639に記載した方法を参照。 昆虫細胞を、また所望により、宿主細胞として用い
得、第１図および第２図の配列を上記の発現系に変え得
た。たとえば、第１図のコード化している配列をEco I
によりpCSF309から切断し、さらに操作し得た（たとえ
ば、他の既知のリンカーに連結するか、またはその中の
非コード化の配列を欠失すること、または他の既知の技
法によりその中のヌクレオチドを変えることにより修飾
して）。昆虫ベクターの構築については、たとえば公開
したヨーロッパ特許出願第155476号を参照。 実施例５ IL−６蛋白質の発現 A.細菌発現−細胞内 実施例１からのプラスミドpAL309C−781をエシエリヒ
ア・コリ（E.Coli）K12GI455株、CI857対立遺伝子を保
有しているバクテリオファージλのCIおよびRex領域を
細菌ゲノムのlacZ遺伝子のCla I部位に挿入したW3110株
の誘導体に形質転換した。この挿入物はファージゲノム
のヌクレオチド35711および38104の間の全てのDNA配列
から成っている〔サンガーら（F.Sanger et al）、ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Bi
ol.）、第162巻、729頁（1982年）参照〕。 pAL309C−781により形質転換したGI455を高細胞濃度
に30℃で成育させ、次いで40℃に温める場合、IL−６を
急速に製造し、次の２または３時間で増大して、全細胞
蛋白質の10％以上に達する。この蛋白質を既知の方法に
より不溶化し、再びおりたたまなければならない不溶性
形で製造する。〔たとえばクレィトン（T.E.Creighto
n）、プログレス・イン・バイオフィジクス・アンド・
モレキュラー・バイオロジー（Prog.Biophys.Molec.Bio
l.）、第33巻、231−297頁（1978年）参照〕。この細菌
的に製造したIL−６は蛋白質mg当り約106−２×107単位
のネズミ骨髄検定による比活性を有していると予想させ
る。 B.細菌分泌 実施例２からのプラスミドpAL−Sec−IL−６−181を
エシエリヒア・コリ（E.Coli）Ｋ−12 GI400株に形質転
換した。この株は、バクテリオファージλのCI、Rexお
よびＮ領域（ファージゲノムのヌクレオチド33498−382
14）〔サンガーら（Sanger et al）、ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）、第162
巻、729巻（1982年）〕を細菌のlacZ遺伝子のCla I部位
に挿入したW3110〔バハマン（Bachmann）、バクテリア
ル・レヴュー（Bacterial.Rev）、第36巻、525頁（1972
年）〕の誘導体である。この挿入でのCI遺伝子は温度感
受性CI857対立遺伝子である。 pAL−Sec−IL−６−181をGI400に形質転換した後、細
胞を好ましい細胞濃度に30℃で成育させ、温度を40℃に
増大させて、IL−６の分泌を開始させ得た。これらの細
胞のペリプラスムから分離した生成物は分子量が均質で
あった。プロセシングは前駆体配列を除去する。Ｎ−末
端アラニンを、多くの場合にそのＮ−末端アミノ酸とし
てプロリンと共に生成物を生産している分泌蛋白質から
また除去する。物質は蛋白質mg当り１−20×106単位に
より示している骨髄コロニー検定によると高比活性を有
している。 C.哺乳動物発現 前掲のマニアテイスら（Maniatis et al）の記述のよ
うに、pCSF309を含有しているエシエリヒア・コリ（E.C
oli）MC1061から製造したプラスミドDNAを塩基セシウム
密度勾配平衡遠心法を含んでいる既知の方法により精製
した。COS細胞（ATCC CRL番号1650）をCOS細胞106当り
プラスミド約5ugの濃度で精製したDNAと感染させ、ウオ
ンら（G.G.Wong et al）、サイエンス（Science）、第2
80巻、810−815頁（1985年）およびカウフマン（R.J.Ka
ufman et al）、モレキュラー・アンド・セルラー・バ
イオロジー（Mol.Cell.Biol.）、第２巻、1304頁（1982
年）に記載した方法のクロロキンで処理した。感染後72
時間経て、pCSF309を含有するCOS細胞条件付培地を実施
例５記載の通り、標準ネズミ骨髄検定により活性を示す
蛋白質を含有して、収穫し得る。 実施例６ 試験管内マウス骨髄検定によるIL−６活性 マウス骨髄検定を、下記の修正により、メトカルフ
（D.Metcalf）、造血性コロニー刺激因子（The Hemopoi
etic Colony Stimulating Factor）、エルセビア出版
（Elsevier Press）、ニューヨーク（1984年）に記載の
通り行った： （ａ） ml当り２×105骨髄細胞を検定に使用した。 （ｂ） 最終検定量は100μであった、および （ｃ） 検定を標準96ウエル微量滴定板でセットした。 骨髄を生後６−25週間の雌のBalb−ｃマウス〔ジャク
ソン（Jackson）〕の大腿骨から得た。標準対照とし
て、マウス・インターロイキン−３を含有するWEHI3条
件付培地〔リーら（J.C.Lee et al）、ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー（J.Immunol.）、第128巻、2393−239
8頁（1982年）〕を用いて、活性の１希釈単位を、この
骨髄検定において最高の反応、すなわち２×104マウス
骨髄細胞当り約25−35コロニーに帰着する蛋白質の濃度
として定義した。 pCSF309Cを含有しているCOS細胞がもとでの条件付培
地はマウス骨髄検定により少なくとも、10-4希釈単位で
活性であることを見い出し、小さな顆粒球型コロニーを
生成した。最高の反応における細胞の数および型はマウ
ス供与体の株および年齢により変化し得る。 pAL309C−781を含有しているエシエリヒア・コリ（E.
Coli）細胞がもとでの条件付培地はこの検定による蛋白
質mg当り少なくとも106−２×107単位の比活性を有し得
る。細菌的に製造したIL−６はまた顆粒球型コロニーを
生成した。 実施例７ IL−６の分子量分析 カウフマンおよびシャープ（R.J.Kaufman and P.A.Sh
arp）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー（J.Mol.Biol.）、第159巻、601−629頁（1982年）の
方法により、35SメチオニンをpCSF309DNAによるCOS細胞
感染により作られたIL−６蛋白質に代謝的に組み込れ得
る。35Sメチオニンで標識したpCSF309を含有しているCO
S細胞条件付培地をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により非還元性条件下で分析し、ラェンリー（U.K.La
emmli）、ネーチャー（Nature）、第227巻、680−685頁
（1970年）〕幅広いバンド、グリコシル化のしるしを約
20−35kdの見掛けの分子量で検定し得る。 実施例８ 高濃度のIL−６を発現しているCHO細胞系の構築 哺乳動物細胞からの高濃度のIL−６の１つの製造方法
は異型のIL−６遺伝子の多重コピーを含んでいる細胞の
構築を含む。異型遺伝子を増幅可能なマーカー、たとえ
ば増加した遺伝子コピー含んでいる細胞をカウフマンお
よびシャープ（Kaufman ＆ Sharp）、ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）、前掲
の方法のメソトレキセート（MTX）の濃度の増大による
増殖により分泌し得るジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）を
連鎖し得る。この方法をいくつかの異なる細胞型に用い
得る。 pCSF309およびDHFR発現プラスミドpAdA263V（Ａ）３
〔カウフマンおよびシャープ（Kaufman ＆ Sharp）、モ
レキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Ce
ll.Biol.）前掲〕をりん酸カルシウム共沈および感染に
より、DHFR欠除のCHO細胞、DUKX−BIIに同時感染する。
形質転換体を発現している初期のDHFRを、透析した胎児
のふくらはぎ血清をもつアルファ培地の成育により分泌
し、カウフマンら（Kaufman et al）、モレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）、
第５巻、1750頁（1983年）に記載通りMTX（0.02、0.2、
1.0および5mM MTXの連続的段階）の濃度の増大による成
育により分泌する。形質転換体をクローンし、生物学的
に活性なIL−６蛋白質発現を、ネズミ骨髄検定により追
跡する。IL−６発現はMTX耐性のレベルの増大につれて
増大する。 本発明の実施態様の多数の修飾および変異を、その好
ましい具体例の先の説明を考慮して当業者が想到しうる
と予想される。上記の修飾および変異は添付の請求の範
囲に包含されていると考える。
節に関与する本ヒト蛋白質新規使用方法に関するもので
ある。 発明の背景 ヘマトポイエチンまたは造血成長因子は造血性細胞の
生存、成長および分化を推進する蛋白質である。あるヘ
マトポイエチンの生物化学的および生物学的同定および
確認は天然源、たとえば血液および尿から入手できる因
子が少量であることにより妨げられてきた。しかし、組
換え体遺伝子工学技術により、これらのヘマトポイエチ
ンのいくつかは分子的にクローン化され、異種的に発現
され、均質なものに精製された。これらのヘマトポイエ
チンの中には、骨髄、胎児肝および他の器官の幹細胞か
ら発生する造血性細胞のコロニーの試験管内成長を支持
する能力により特徴づけられるコロニー刺激因子、たと
えばGM−CSF、Ｇ−CSF、CSF−１およびIL−３がある。
〔たとえばメトカルフ（D.Metcalf）、ブラッド（Bloo
d）、第67巻（２）:257−267頁（1986年）；ヤングら
（Y.C.Yang et al）、セル（Cell）、第45巻（１）、３
−10頁（1986年）；ドナハウエら（R.Donahaue et a
l）、ネーチャー（Nature）、第321巻、872−875頁（19
86年）参照〕。 本発明者の米国優先権出願の出願日の後に、他の生物
学的活性および名称で特徴づけられる蛋白質を記述して
いるいくつかの特許が他の研究者により出願されたが、
それは本明細書および優先権出願に記述されたIL−６と
命名された新規蛋白質と同一であった。ハエゲマンら
（Haegeman et al）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ
・バイオケミストリー（Eur.J.Biochem.）、第159巻、6
25−632頁（1986年）およびその中に引用された参考文
献〔ヒト線維芽細胞に誘導可能な26kd蛋白質〕；ジルベ
ルスタインら（Zilberstein et al）、ヨーロピアン・
モレキュラー・バイオロジー・オーガナイゼイション・
ジャーナル（EMBO.J.）、第５巻、2529−2537頁（1986
年）〔弱いインターフェロン活性をもつインターフェロ
ン（INF）−β−２〕および平野ら（Hirano et al）、
ネーチャー（Nature）、第324巻、73−76頁（1986年）
〔Ｂ細胞刺激活性に関するBCDFまたはBSF−２〕参照。
さらに、公開されたヨーロッパ特許出願第220574号参
照。これらの報文のいくつかは天然物質の精製を報告し
た。 図面の簡単な説明 第１図はIL−６の全cDNAおよびアミノ酸配列を示す。 第２図はIL−６の細菌発現に特に適しいる修飾された
cDNAを示す。 第３図はプラスミドPAL−Sec−IL6−181の構築を示
す。 第４図は分泌過多の細菌発現に対するCI対立遺伝子を
示す。 発明の概要 １つの態様として、本発明は、第１図のアミノ酸28番
−アミノ酸212番の配列と実質的に同じ配列を含有して
いるペプチド配列を含有するという特徴をもつ蛋白質を
コード化するcDNAで形質転換された適当な細胞を培養す
ること含むIL−６の製造方法を開示する。本方法中のcD
NA配列はその発現制御配列に作動可能に結合している。
IL−６の製造方法は、また第１図の完全なヌクレオチド
配列と実質的に同じcDNA配列を使用し得るものである。 他の態様として非グリコシル化IL−６の製造方法を提
供するものである。本方法は、第２図のアミノ酸28番−
アミノ酸212番の配列と実質的に同じ配列を含むペプチ
ド配列を含有するという特徴をもつ蛋白質をコード化し
ているcDNAで形質転換された適当な細菌細胞を培養する
ことを含む。本方法に用いられるcDNA配列は、また適当
な発現制御配列に作動可能に結合している。 さらに他の態様として、本発明は本発明の方法に有用
な形質転換ベクターを提供するものである。これらのベ
クターは適当な発現制御配列の制御下にある第１図また
は第２図のものと同じか実質的に同じDNA配列を含む。 さらに別の態様として、本発明は他の蛋白質を実質的
に随伴しないヒト蛋白質IL−６を含む。IL−６は上記の
方法のいずれかによって製造され得、それ故グリコシル
化蛋白質または非グリコシル化蛋白質であり得る。 さらなる態様として、有効量の本発明のIL−６を含む
医薬組成物を提供するものである。この組成物は、有効
量のヘマトポイエチン、インターロイキン、成長因子ま
たは抗体の少なくとも１つ、さらに好ましくは蛋白質IL
−３またはIL−２のいずれかをさらに含む。IL−６を含
んでいる治療組成物は、特にIL−２と併用し、さらにγ
−インターフェロンと併用して、癌の処置に有用であり
得る。 本発明の治療組成物は、有効量のIL−６ペプチドを患
者に投与することにより、損傷をうけた免疫組織機能に
よって特徴づけられた疾病をもつヒト患者を処置するの
に用いられ得る。本治療法はさらに有効量のIL−２また
はIL−３を平行投与することを含み得る。癌の処置にお
いて、治療法はさらに有効量のIL−６およびIL−２とγ
−インターフェロンと平行投与することを含み得る。他
のヘマトポイエチン、成長因子または抗体および他の既
知の治療薬もまたIL−６と組み合わせられ得る。 本発明の他の特徴や利点は、その実施方法を説明する
実施例を含めて本発明の下記の詳細な説明を考慮すると
明瞭である。 発明の詳細な記載 本発明は、実質的に他のヒト蛋白質を随伴しないヒト
IL−６の制御方法を提供するものである。本発明の製造
法は、適当な発現制御配列の制御下にあるIL−６蛋白質
をコード化しているDNA配列により形質転換された宿主
細胞を培養することを含む。IL−６蛋白質をコード化し
ているDNA配列は、第１図に示されたように、ヌクレオ
チド132番−ヌクレオチド689番またはヌクレオチド51番
−ヌクレオチド1139番と同じヌクレオチド配列または実
質的に同じヌクレオチド配列を含む。本方法で用いるcD
NAの一つは第１図の完全なヌクレオチド配列を含む。第
１図の約1.1kb DNA配列は、アメリカ合衆国メリーラン
ド、ロックビル、パクローン・ドライブ12301、アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（American T
ype Culture Collection）に、1986年７月11日付で寄託
され、寄託番号ATCC第67153号を付与されたエシエリヒ
ア・コリ（E.Coli）MC1061のプラスミドPCSF309に潜在
される。 本方法で用いるIL−６をコード化しているDNA配列の
好ましい具体例は、細菌細胞における発現を考慮してデ
ザインされた第２図の配列である。第１図および第２図
のヌクレオチドおよび対応しているペプチド配列の対立
遺伝子変種（すなわち、アミノ酸配列を変化し得るかし
得ない、種中で起る天然の塩基配列変化）および遺伝暗
号の縮重によって得られるヌクレオチド配列中の変異
は、それらがIL−６活性を有するポリペプチドをコード
化する場合、本発明で用いるもの包含される。 点突然変異または誘発された修飾により起る、蛋白質
の活性または産生を増進する第１図の1.1kb配列中の変
異は、発現時にコード化する機能的蛋白質を変化しては
ならない。それ故、配列中の上記の変異は本発明中に包
含される。たとえば、第２図の修飾された配列は細菌宿
主細胞中に発現に現在好ましい。DNA配列中にまたは既
知の方法により人工的に製造された配列中に意図的に組
み込まれた上記のヌクレオチド修飾は、当業者が既知の
技法を用いて実施し得る。上記の修飾はIL−６のペプチ
ド配列中のアミノ酸の欠失、挿入または変換を起し得
る。たとえばコード化配列中の一つまたはそれ以上のシ
ステイン残基の置き換えは、対応しているジスルフィド
架橋を消去し得る。さらに、一つまたはそれ以上のトリ
ペプチドのアスパラギンに結合したグリコシル化認識部
位でのアミノ酸の変換、挿入または欠失は、その部位で
の非グリコシル化をもたらし得る。上記の置き換えまた
は欠失の突然変異技法は当業者によく知られている〔米
国特許第4518584号参照〕。 本発明の方法は、上記のように修飾され、第１図およ
び第２図に示された配列を含んでいる、IL−６をコード
化するcDNAにより形質転換された適当な細胞または細胞
系を培養することを含む。形質転換された細胞中のIL−
６をコード化するDNA配列は適当な発現制御配列と作動
可能に結合している。 適当な宿主細胞の選択および形質転換、培養、遺伝子
増幅、スクリーニングおよび生成物の製造および精製の
方法は当業界では既知である。たとえば、ゲチングおよ
びサンブロク（Gething and Sambrook）、ネーチャー
（Nature）、第293巻、620−625頁（1981年）、または
別法として、カウフマン（Kaufman et al）、モレキュ
ーラー・アンド・セルラー・バイオケイストリー（Mol.
Cell.Biol.）、第５巻（７）、1750−1759頁（1985年）
またはハウレイら（Howley et al）、米国特許第441944
6号参照。 細菌細胞は現在IL−６の製造方法における宿主細胞と
して好ましい具体例である。細菌産生は大量の活性非グ
リコシル化IL−６をもたらす。蛋白質の細菌発現に現在
好ましいIL−６配列は第２図の修飾された配列である。
IL−６が細菌細胞中で発現される場合、それは細胞内に
発現され、活性型に折りたたまれ得るかまたはそれは活
性型で細菌細胞から分泌され得る。バイオテクノロジー
の分野で宿主細胞として周知のエシエリヒア・コリの種
々の株〔たとえば、MC1061株および実施例に記述された
株〕は生物学的に活性なIL−６の製造を可能にする宿主
細胞として好都合に用いられる。IL−６発現に適当な種
々の菌株の一般的なリストはバチルス・サブチリス（B.
Subtilis）、シュードモナス（Psendomonas）の種々の
株、他の細菌などを包含する。 哺乳動物細胞もまたIL−６の製造用の宿主細胞として
用いられ得る。特に適当な哺乳動物細胞の１つは、チャ
イニズ・ハムスター卵巣〔CHO〕細胞系である。添付し
ている実施例に記載されている他の適当な哺乳動物細胞
系はサルのCOS−１細胞系である。同じく有用な哺乳動
物細胞系はCV−１細胞系である。 当業者に既知の酵母の多くの株もまたIL−６の発現用
の宿主細胞として利用できる。また、所望により昆虫細
胞も本発明の方法に宿主細胞として用いられ得る。たと
えばミラーら（Miller et al）、ジェネティク・エンジ
ニアリング（Genetic Engineering）、第８巻、277−29
8（プリナム・プレス1986年）およびその中に引用され
た参照文献参照。 本発明はまたIL−６蛋白質の発現方法に用いるベクタ
ーおよびDNA配列を提供するものである。ベクターは先
に列挙されたヌクレオチド配列と同じかまたは実質的に
同じものを含む。好ましくはベクターは第１図または第
２図に列挙された完全なDNA配列を含む。ベクターはま
たIL−6DNA配列の発現を可能にする適当な発現制御配列
を含む。別法として本明細書に記載されたように修飾さ
れるかまたは自然発生する対立遺伝子配列が組み込まれ
ているベクターも、IL−６の製造に有用なものに含まれ
る。ベクターは、細胞系を形質転換する方法に用いられ
得、選択された宿主細胞中でその複製および発現を指示
し得る上記のIL−6DNAをコード化する配列に作動上関連
している選択された調節配列を含み得る。上記のベクタ
ーに有用な調節配列は当業者に既知で、選択された宿主
細胞に応じて選択され得る。上記の選択は日常的で、本
発明の重要な部分ではない。好ましいベクターは細菌ベ
クターである。 蛋白質IL−６はそれ自体本発明の他の特徴である。蛋
白質IL−６は、既知の遺伝子工学方法によるペプチドの
合成および組み換え体微生物によるペプチドの製造を可
能にするようなペプチド配列およびヌクレオチド配列が
供給されたことにより、他のヒト蛋白質を実質的に随伴
しない形で提供されるものである。蛋白質IL−６の好ま
しい具体例は遺伝子の細菌発現により生産され得る非グ
リコシル化IL−６である。IL−６は、第１図に示された
アミノ酸28番−アミノ酸212番と同じかまたは実質的に
同じペプチド配列を含有するという特徴をもっている。
本発明の方法により製造されたIL−６は、非還元状態下
でSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析さ
れた場合、約20−35kbの見掛けの分子量という特徴をも
っている。pCSF309順化培地において、蛋白質は10−100
ピコモルの濃度で試験管内のマウス骨髄検定による小さ
い顆粒球型コロニーの形成を引き起す。 第１図はIL−６蛋白質をコード化し、適当な宿主細胞
中での発現を可能にする完全な1.1kb DNA配列を描いて
いる。本配列は、約50ヌクレオチドの既知のリーダー分
泌配列を含んでいる212アミノ酸ポリペプチドをコード
化している636ヌクレオチドの長い翻訳解読枠を含む。
1.1kb配列の領域をコード化している蛋白質は、ヌクレ
オチド132番（アラニン コドンのグアニン、アミノ酸2
8位）−ヌクレオチド686番にさたり、その後にTAG転写
停止コドンが続く。哺乳動物発現系中で遺伝子が発現さ
れたときグリコシル化され得る、特徴的配列、Asn−Ｘ
−Serにより例示される２つの可能なアスパラギン結合
グリコシル化部位が存在する。コード化領域はまた２つ
のジスルフィド結合を示唆している４つのシステインを
含む。1.1kb領域の３′非コード化配列の他の453ヌクレ
オチドは、天然の宿主中での転写において調節の役割を
有し得る。配列の３′末端は、またRNA伝令の安定度に
関連していると考えられる配列ATTTAのいくつかの反復
を含んでいるATリッチ部分を含む。〔シァウおよびカメ
ン（G.Shaw and R.Kamen）、セル（Cell）、第45巻
（５）、659−677頁（1986年）さん証〕。 第２図に示された細菌発現に好ましい配列は、第１図
と同じペプチド配列を有しているが、細菌発現組織でIL
−６の製造を増進する選択的に修飾されたヌクレオチド
配列を有している。さらに、この好ましい配列は第１図
に存在するリーダー配列の大部分および３′非コード化
配列を欠失している。 本発明の１つの好ましい具体例は、細菌により産生さ
れた非−グリコシル化IL−６である。細菌細胞で産生さ
れた場合、蛋白質の28位アラニンのコード化の配列は一
般に細菌酵素で切断される。それ故、細菌で産生された
IL−６蛋白質の約80％はその５′開始アミノ酸として、
29位、プロリンを有している。細菌で産生されたIL−６
は非グリコシル化された、したがって他の発現系で製造
されたIL−６よりもより均質の見掛け分子量を有してい
る。さらに、第２図のDNAによりコード化される場合、
細菌産生IL−６は高収率で製造される。 本方法および治療組成物は、少なくとも−１つの有効
成分としてIL−６を用い得る。IL−６は、造血組織の骨
髄球様またはリンパ球様細胞のいずれか、またはそれら
の組み合せの濃度が減少するという特徴をもつ疾病の処
置において、単独または他の治療物質との併用投与で用
いられ得る。本蛋白質は、またアクセサリーおよび成熟
細胞たとえば単核細胞を刺激して他の造血様因子を産生
させることができ、ついでこれは他の造血細胞のコロニ
ー形成および他の造血様活性を刺激し得る。別法とし
て、IL−６は他のヘマトポイエチンの活性を増進し得
る。たとえば、IL−６は、他のヘマトポイエチンすなわ
ちIL−３およびCSF−１の能力を増進し、CSF−１または
IL−３単独の場合よりもより未成熟の造血細胞の増殖を
刺激する能力が、５−フルオロウラシル処理マウス骨髄
検定で証明された。この特徴は、以前、IL−６の発現を
誘導し得るIL−１−αまたはヘマトポイエチン１と命名
された蛋白質によるものとされた。同じく、ヒト芽細胞
検定において、IL−６およびIL−３の併用は初期のヒト
幹細胞コロニーの増殖を引き起す。かくして、IL−６
は、免疫不全を含む多くの症状の処置、たとえば放射能
または化学治療への過度のばく露を受けたヒトを処置す
るのに、IL−３との併用による可能な医学的用途を有し
ている。 種々の免疫不全たとえばＴおよびＢリンパ球の双方ま
たはいずれか一方の不全、または免疫障害たとえばリウ
マチ性関節炎もまたIL−６による処置により有利な効果
があり得る。白血球減少症、すなわち静脈血液に循環し
ている白血球数の減少のような免疫不全はウイルス感
染、たとえばHTLV I、HTLV II、HIV、放射線への強いば
く露、癌治療の側面的効果の結果または他の医学的処置
の結果であり得る。IL−６組成物による白血球減少症の
治療処置は現在入手できる薬剤による処置により引き起
される好ましくない副作用を回避し得る。IL−６処置に
感受性のある他の症状は、骨髄移植組織から回復してい
る患者を包含する。 上記の症状を処置するのに用いる組成物は医学的に許
可可能な担体との混合物中にIL−６の治療上効果的な量
を含む。本組成物は全身的に、非経口的、静脈内または
皮下に投与され得る。全身的に投与される場合、本発明
に用いる治療組成物は勿論発熱物質無含有の、非経口的
に許容可能な水溶液の形である。pH、等張性、安全性な
どを考慮した上記の非経口的に許容可能な蛋白質溶液の
調剤は当業者の技術範囲内にある。 上記の症状の処理法に含まれる用量用法は薬剤の作
用、たとえば患者の症状、体重、性、食餌、何らかの感
染の重度、投与の時間および他の臨床的作用を変える種
々の因子を考慮して診察する医師により決定され得る。
一般に、毎日の用法は、ポリペプチド200−1000ミクロ
グラムの範囲内または体重キログラム当りのポリペプチ
ド50−500単位（すなわち、単位は標準ネズミ骨髄検定
により最高の刺激の半分にあたるポリペプチドの濃度）
へ範囲内になければなない。 １つの好ましい具体例として、IL−６は他の薬品と併
用して使用し、成熟リンパ様細胞を活性化する。具体的
には、IL−６が既知の検定法においてCDF活性を有する
ことが見い出された〔高井ら（Takai et al）、ジャー
ナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.）、第137巻（1
1）、3494−3500頁（1986年）〕。すなわち、IL−２単
独と併用の、IL−２およびγ−インターフェロンと併用
のIL−６は成熟リンパ様細胞を活性化する。この特定の
併用は抗癌および抗ウイルス治療処置に用いられ得る。
〔高井ら（Takai et al）、サイエンス（Science）（19
86年）投稿中参照〕。この効用は、一部分は、IL−６に
より示される細胞溶解性Ｔ細胞活性によるものとされ
る。かくして、IL−６およびIL−２およびγ−インター
フェロンによる患者の同時または連続処理が転移性癌の
処置に特に有効であり得ることが予想される。同じく、
IL−６はLAK治療にIL−２と併用して用いられ得る。IL
−６と同時または連続併用投与用の他の適当なヘマトポ
イエチン、CSFおよびインターロイキンの一般的なリス
トは、GM−CSF、CSF−１、Ｇ−CSF、Meg−CSF、エリス
ロ蛋白質（EPO）、IL−１、IL−３、Ｂ−細胞成長因子
および好酸性分化因子を包含する。上記の併用は他のヘ
マトポイエチン単独での処置の活性または効果を増進し
得る。 IL−６は、また他の治療薬と併用投与して生体内の体
液または細胞の免疫応答を増大し得る。たとえば、IL−
６は、HTVなどのようなウイルス抗原ワクチンまたは腫
瘍抗原ワクチンの効果を増進し得る。 これらの併用投与用法でのIL−６の用量は、IL−６単
独の投与で列挙された用量に治療組成物中の別の成分、
たとえばIL−２を補償するように調整する。処置された
患者の経過は造血学的性質の周期的評価、たとえば白血
球計算値などにより追跡され得る。 IL−６はまた周知の方法により、診断および治療用の
ヒトおよびネズミのポリクローンおよびモノクローン抗
体を生成するのに使用され得る。上記のモノクローンま
たはポリクローン抗体は標的または毒性薬、標識などへ
の付着により治療上用いられ得る。IL−６はまたハイブ
リドーマ細胞系の培地中でハイブリドーマ成長因子とし
て機能して、それらの収率を増大する。 下記の実施例はIL−６をコード化しているcDNAを用い
ている本発明の方法を示す。第１図の完全なDNA配列
は、米国特許第4675285号に記載された発現クローニン
グ法を用いて、HTLV Iで形質転換されたヒトＴ−細胞系
C10MJ2〔ナショナル・インスティテュト・オブ・ヘルス
（National Institute）；アリヤら（S.K.Arya et a
l）、サイエンス（Science）、第222巻、1086頁（1984
年）〕のpoly＋mRNAライブラリーから分離された。 実施例１ 細胞内発現用の典型的な細菌発現ベクターの構築 EcoR I挿入物〔実施例３参照〕としてのpCSF309（ATC
C番号67153）に含まれた第１図の配列をIL−６の製造用
にEcoR Iによる消化によりそれから切断し、適当な細菌
のベクターおよび宿主に挿入し得る。しかし、IL−６の
５′コード化配列を変更することにより蛋白質の高収率
をもたらすIL−６に好ましい細菌発現は第２図の配列を
用いる。 この好ましい配列を次のように細菌発現プラスミドpA
L309C−781を構築するのに用いた： EcoR I断片を保有するIL−６のcDNAクローン〔第１
図〕を非コード化鎖がファージに組み込むような配向で
M13mp19〔メシング（S.Messing）、メンズ・イン・エン
ザイモロジー（Methods in Enzymology）、第101巻、20
−78頁（1983年）；ノランダら（J.Norrander et a
l）、ジーン（Gene）、第26巻、101−106頁（1983年）
参照〕に移した。一本鎖ファージDNAをオリゴヌクレオ
チドｄ（GCCCCAGTACCCCCAGGAGAAG）で製造し、アニーリ
ングした。オリゴヌクレオチドをエシエリヒア・コリ
（E.Coli）のDNAポリメラーゼＩのクレナウ（Klenow）
断片で身長し、残余の１本鎖領域をS1ヌクレアーゼで消
化した。末端をDNAポリメラーゼのクレナウ断片による
再度の処理により二本鎖にし、最終的に二本鎖IL−6cDN
AをHind IIIによる消化により製造した。二本鎖末端−H
ind III断片をkpn Iで消化し、DNAポリメラーゼ・クレ
ナウ断片で処理し、Hind IIIで消化したpAL−181（ATCC
番号40134）に連結した。生成するプラスミドpAL309−1
81を試験管内で部位を指示するループアウト突然変異生
成により、第１図のpb148番−169番の間の塩基配列断片
を除去することにより先ず修飾した。〔森永ら（Morina
ga et al）、バイオテクノロジー（Biotechnology）、
第２巻、636−639頁（1984年）参照〕。この欠失はIL−
６配列中に１個しかないNar I部位を作り出した。一本
鎖末端をDNAポリメラーゼＩのクレナウ断片で充填し、
次いでHind IIIで消化した。IL−６遺伝子の３′末端を
保有しているこの消化物からの断片を分離した。この断
片を一方の末端を二本鎖にし、他の末端に５′一本鎖TA
配列を保有させる42pb人工的二重体と混合した。混合物
をNde IおよびHind IIで切断したpAL181と連結した。こ
の３通りの連結は第２図に示した修飾したIL−６遺伝子
配列およびpAL309B−181と呼ばれる発現プラスミドを生
産した。 プラスミドpAL309B−181をBan Iで切断し、一本鎖末
端をDNAポリメラーゼＩのクレナウ断片を用いて充填さ
せた。プラスミドは次にNde Iで切断し、IL−６クロー
ンを分離した。この断片を配列をコード化しているエシ
エリヒア・コリ（E.Coli）aspAの３′から末端に見い出
す推定の転写終止配列を保有している人工的DNA配列を
先にクローンしたpAL−181ベクターのNde Iおよび占め
させたXba I部位の間に挿入した。 pAL309C−781と呼ばれるこの新規のプラスミドをIL−
６蛋白質の発現によってPLプロモーター（たとえば実施
例５参照）を制御する方法を含んでいる適当な細菌宿主
細胞に既知の技法により形質転換させ得る。 別法として、配列をコード化している修飾したIL−６
をNde Iによる切断によりpAL309C−781から、またはEco
R Iによる切断によりpCSF309から除去させ、マニアティ
スら（T.Maniatis et al）、モレキュラー・クローニン
グ・ア・ラボラトリー・マニアル（Molecular Cloning
A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー（Cold Spring Habor Laboratory）
（1982年）記載の方法とベクターを用いて任意の細菌ベ
クターに挿入する。これらの典型的な細菌ベクターを次
に細菌宿主細菌に形質転換させ、それによってIL−６は
発現した。 実施例２ 細胞外分泌および発現用の典型的な細菌発現ベクターの
構築 IL−６をエシエリヒア・コリ（E.Coli）のペリプラズ
ム（Periplasm:内膜と外膜のすき間）への蛋白質の分泌
により産生され得る。この生成物は、試験管内の生物検
定において高い比活性を有している完全に酸化された非
グリコシル化蛋白質を産生した。細菌からの分泌による
IL−６の製造用の２つの典型的なベクターを記述する。
（１）プラスミドpUC18〔ヤニシ−ペロンら（Yanisch−
Perron et al）、ジーン（Gene）、第33巻、103頁（198
5年）〕を制限エンドヌクレアーゼNde Iで切断させ、生
成する付着末端をエシエリヒア・コリ（E.Coli）DNAポ
リメラーゼのクレナウ断片および３リン酸デオキシヌク
レオシドによる処理により二本鎖にさせ、プラスミドを
T4−DNAリガーゼにより再環状化させた。生成するプラ
スミド１番を次にPvu II（部分的消化）およびEcoR Iの
両方で切断させ、末端をDNAポリメラーゼのクレナウ断
片により二本鎖にさせた。適当な断片を精製し、再連結
して、lacプロモーターを含んでいるEcoR IからPvu II
までの断片を除去したプラスミド２番を製造した。プラ
スミド２番をEcoR Iにより消化させ、S1ヌクレアーゼに
より処理させて、一本鎖末端を除去した。プラスミドを
次にKpn Iにより切断した。 プラスミドpAS1〔ローゼンベルグ、ホーおよびシヤツ
マン（Rosenberg.Ho and Shartzman）、メンズ・イン・
エンザイモロジー（Methods in Enzymology）、第101
巻、123頁（1983年）〕をBamH1により切断させ、一本鎖
末端をS1ヌクレアーゼによる消化により除去した。配列
ｄ（GTACCCGGGTAC）をもつリンカー（linker）をこの消
去させたpAS1 DNAにより連結して、pAS1中のBamH1部位
を置き換えているKpn Iを有するプラスミドpAS2を得
た。pAS2をBgl IIにより切断し、末端をDNAポリメラー
ゼのクレナウ断片の作用により二本鎖にさせ、DNAをKpn
Iにより切断した。pLプロモーターを含んでいるBgl II
（二本鎖）−Kpn I断片をプラスミド２番のEcoR I（二
本鎖）−Kpn Iベクター配列と連結して、pAL−181、pL
プロモーターを保有しているプラスミド、リボゾーム結
合部位およびKpn I部位およびpUC18のポリリンカー領域
により直ちに起るATG開始コドンを作り出した。プラス
ミドpAL−181を取得番号40134で1984年８月28日に、ア
メリカ合衆国メリーランド、ロックビル、パークローン
・ドライブ12301、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（American Type Culture Collection）に
寄託した。 プラスミドpAL−181をNde IおよびKpn Iにより切断
し、次の合成DNA分泌前駆体配列を挿入した： この配列は代表的分泌前駆体配列をコード化する。こ
の構成から生成するプラスミドをpAL−Sec−181と称し
た。 pAL−Sec−181をKpn Iにより切断し、DNAポリメラー
ゼのクレナウ断片により処理して、一本鎖末端を除去し
た。プラスミトをHind IIIにより再切断し、実施例１お
よび３に記載のDNA断片を含んでいるIL−６に連結し
た。この断片は、成熟IL−６のアラニンコドンをコード
化する配列GCCCCAGTACCCCCAGGAGAAGから始まって、それ
がM13mp19ポリリンカー中のHind III部位に達するま
で、完全なIL−６配列および３′−非翻訳性領域まで続
いた。生成するプラスミド、pAL−Sec−IL−６−118
は、その合成をpLプロモーターより制御し、成熟IL−６
蛋白質に融合した分泌前駆体から成る淡白質をコード化
する。 （２）過剰の分泌発現系を得るため、サンガーら（F.Sa
nger et al）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー（J.Mol.Biol.）、第162巻、729頁（1982年）
により、報告されたヌクレオチド34499−38214に含有さ
れるバクタリオファージλのCI、rexおよびＮ領域をlac
Z遺伝子のCla I部位に挿入し、これを常用のプラスミド
にクローン化させる。用いたCI遺伝子は第４図に示した
配列を有している対立遺伝子であった。この遺伝子の配
列を、48位のグリシンをセリンに変換した既知の方法、
すなわち、コドンの最初の配位におけるＧをＡに転換す
ることにより変化した。このCI857Ser−48対立遺伝子を
次に細胞のlacZ遺伝子への相同性組み換えによってエシ
エリヒア・コリ（E.Coli）ゲノムに挿入した。いったん
挿入させると、それはlacZ、λ免疫性エシエリヒア・コ
リ（E.Coli）を得た。 ヒトIL−６に対する遺伝子を分泌前駆体をコード化し
ている既知の配列に融合した。これらの配列を、既知の
プラスミドの野生型pLプロモーター配列により操作上連
鎖し、CI857Ser−48を保有しているγ免疫性エシエリヒ
ア・コリ（E.Coli）細胞に形質転換した。CI857Ser−48
遺伝子をもつ細胞はペリプラスム中に活性形で著しい量
のIL−６蛋白質を生産した。 実施例３ 典型的哺乳動物発現ベクターpCSF309の構築 第１図に叙述した完全なcDNA配列をEcoR Iで消化した
COS細胞発現ベクターp91023B〔Eco IによりpCSF−１（A
TCC番号39754）を消化することにより得て、約750塩基
対挿入物を除去させた〕に連結して、IL−６の発現用哺
乳動物ベクターを構築した。p91023Bは、SV40増進因
子、主要なアデノ関連ウイルス後期プロモーター、配列
をコード化しているDHFR、SV40伝令poly−Ａ付加部位お
よびVal遺伝子を含む。p91023BのEco Iの消化およびIL
−６によりコード化している第１図のDNA配列の挿入よ
り生成するプラスミドをpCSF309と称した、pCSF309（AT
CC番号67153）をIL−６の発現用の適当な哺乳動物宿主
細胞に、既知の技法により形質転換した。 哺乳動物細胞発現用の典型的宿主細胞は、特に霊長類
動物細胞系、ゲツ歯類動物細胞系など、たとえば、COS
細胞を包含する。 当業者は、またpCSF309に比敵するが、第１図の完全
な配列以上に含有しない他の哺乳動物発現ベクターを構
築することができる。たとえば、５′および３′の両方
に接する配列を所望により第１図の配列から切り離し得
るか、または第１図の修飾性または対立遺伝子変異をそ
の配列を操作することにより用い得る。 第１図のDNA配列をEco Iにより切断させ得、周知の組
み換え遺伝工学的技法をpCD〔岡山ら（Okayama et a
l）、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
（Mol.Cell.Biol.）、第２巻、161−170頁（1982年）〕
およびpJL3、pJL4〔ガウフら（Gough et al）、ヨーロ
ピアン・モレキュラー・バイオロジー・オーガナイゼー
ション・ジャーナル BMBO.J.）、第４巻、645−653頁
（1985年）〕のような他の既知のベクターにそれを挿入
するのに用いた。適当な宿主細胞へのこれらのベクター
の形質転換はIL−６の発現をもたらすことができる。 実施例４ 酵母および昆虫ベクターの構築 実施例１と同じ方法により、当業者は、他の発現制御
配列とコード化している配列の両方に接している哺乳動
物調節配列を消去または置き換えることにより第１図の
配列を操作して、酵母または他の菌類のベクターを作り
出し得る。かくして、この配列を菌類宿主細胞に発現で
きるようにし得る。菌類細胞の一般的なリストはサッカ
ロミセス（Sacchromyces）属、アスペルギルス（Asperg
illus）属およびペヒア（Pichia）属の株および他の既
知の株を包含する。酵母のベクターおよび酵母細胞中の
蛋白質の発現の構築については、たとえば公開した国際
出願公開WO8600639に記載した方法を参照。 昆虫細胞を、また所望により、宿主細胞として用い
得、第１図および第２図の配列を上記の発現系に変え得
た。たとえば、第１図のコード化している配列をEco I
によりpCSF309から切断し、さらに操作し得た（たとえ
ば、他の既知のリンカーに連結するか、またはその中の
非コード化の配列を欠失すること、または他の既知の技
法によりその中のヌクレオチドを変えることにより修飾
して）。昆虫ベクターの構築については、たとえば公開
したヨーロッパ特許出願第155476号を参照。 実施例５ IL−６蛋白質の発現 A.細菌発現−細胞内 実施例１からのプラスミドpAL309C−781をエシエリヒ
ア・コリ（E.Coli）K12GI455株、CI857対立遺伝子を保
有しているバクテリオファージλのCIおよびRex領域を
細菌ゲノムのlacZ遺伝子のCla I部位に挿入したW3110株
の誘導体に形質転換した。この挿入物はファージゲノム
のヌクレオチド35711および38104の間の全てのDNA配列
から成っている〔サンガーら（F.Sanger et al）、ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Bi
ol.）、第162巻、729頁（1982年）参照〕。 pAL309C−781により形質転換したGI455を高細胞濃度
に30℃で成育させ、次いで40℃に温める場合、IL−６を
急速に製造し、次の２または３時間で増大して、全細胞
蛋白質の10％以上に達する。この蛋白質を既知の方法に
より不溶化し、再びおりたたまなければならない不溶性
形で製造する。〔たとえばクレィトン（T.E.Creighto
n）、プログレス・イン・バイオフィジクス・アンド・
モレキュラー・バイオロジー（Prog.Biophys.Molec.Bio
l.）、第33巻、231−297頁（1978年）参照〕。この細菌
的に製造したIL−６は蛋白質mg当り約106−２×107単位
のネズミ骨髄検定による比活性を有していると予想させ
る。 B.細菌分泌 実施例２からのプラスミドpAL−Sec−IL−６−181を
エシエリヒア・コリ（E.Coli）Ｋ−12 GI400株に形質転
換した。この株は、バクテリオファージλのCI、Rexお
よびＮ領域（ファージゲノムのヌクレオチド33498−382
14）〔サンガーら（Sanger et al）、ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）、第162
巻、729巻（1982年）〕を細菌のlacZ遺伝子のCla I部位
に挿入したW3110〔バハマン（Bachmann）、バクテリア
ル・レヴュー（Bacterial.Rev）、第36巻、525頁（1972
年）〕の誘導体である。この挿入でのCI遺伝子は温度感
受性CI857対立遺伝子である。 pAL−Sec−IL−６−181をGI400に形質転換した後、細
胞を好ましい細胞濃度に30℃で成育させ、温度を40℃に
増大させて、IL−６の分泌を開始させ得た。これらの細
胞のペリプラスムから分離した生成物は分子量が均質で
あった。プロセシングは前駆体配列を除去する。Ｎ−末
端アラニンを、多くの場合にそのＮ−末端アミノ酸とし
てプロリンと共に生成物を生産している分泌蛋白質から
また除去する。物質は蛋白質mg当り１−20×106単位に
より示している骨髄コロニー検定によると高比活性を有
している。 C.哺乳動物発現 前掲のマニアテイスら（Maniatis et al）の記述のよ
うに、pCSF309を含有しているエシエリヒア・コリ（E.C
oli）MC1061から製造したプラスミドDNAを塩基セシウム
密度勾配平衡遠心法を含んでいる既知の方法により精製
した。COS細胞（ATCC CRL番号1650）をCOS細胞106当り
プラスミド約5ugの濃度で精製したDNAと感染させ、ウオ
ンら（G.G.Wong et al）、サイエンス（Science）、第2
80巻、810−815頁（1985年）およびカウフマン（R.J.Ka
ufman et al）、モレキュラー・アンド・セルラー・バ
イオロジー（Mol.Cell.Biol.）、第２巻、1304頁（1982
年）に記載した方法のクロロキンで処理した。感染後72
時間経て、pCSF309を含有するCOS細胞条件付培地を実施
例５記載の通り、標準ネズミ骨髄検定により活性を示す
蛋白質を含有して、収穫し得る。 実施例６ 試験管内マウス骨髄検定によるIL−６活性 マウス骨髄検定を、下記の修正により、メトカルフ
（D.Metcalf）、造血性コロニー刺激因子（The Hemopoi
etic Colony Stimulating Factor）、エルセビア出版
（Elsevier Press）、ニューヨーク（1984年）に記載の
通り行った： （ａ） ml当り２×105骨髄細胞を検定に使用した。 （ｂ） 最終検定量は100μであった、および （ｃ） 検定を標準96ウエル微量滴定板でセットした。 骨髄を生後６−25週間の雌のBalb−ｃマウス〔ジャク
ソン（Jackson）〕の大腿骨から得た。標準対照とし
て、マウス・インターロイキン−３を含有するWEHI3条
件付培地〔リーら（J.C.Lee et al）、ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー（J.Immunol.）、第128巻、2393−239
8頁（1982年）〕を用いて、活性の１希釈単位を、この
骨髄検定において最高の反応、すなわち２×104マウス
骨髄細胞当り約25−35コロニーに帰着する蛋白質の濃度
として定義した。 pCSF309Cを含有しているCOS細胞がもとでの条件付培
地はマウス骨髄検定により少なくとも、10-4希釈単位で
活性であることを見い出し、小さな顆粒球型コロニーを
生成した。最高の反応における細胞の数および型はマウ
ス供与体の株および年齢により変化し得る。 pAL309C−781を含有しているエシエリヒア・コリ（E.
Coli）細胞がもとでの条件付培地はこの検定による蛋白
質mg当り少なくとも106−２×107単位の比活性を有し得
る。細菌的に製造したIL−６はまた顆粒球型コロニーを
生成した。 実施例７ IL−６の分子量分析 カウフマンおよびシャープ（R.J.Kaufman and P.A.Sh
arp）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー（J.Mol.Biol.）、第159巻、601−629頁（1982年）の
方法により、35SメチオニンをpCSF309DNAによるCOS細胞
感染により作られたIL−６蛋白質に代謝的に組み込れ得
る。35Sメチオニンで標識したpCSF309を含有しているCO
S細胞条件付培地をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により非還元性条件下で分析し、ラェンリー（U.K.La
emmli）、ネーチャー（Nature）、第227巻、680−685頁
（1970年）〕幅広いバンド、グリコシル化のしるしを約
20−35kdの見掛けの分子量で検定し得る。 実施例８ 高濃度のIL−６を発現しているCHO細胞系の構築 哺乳動物細胞からの高濃度のIL−６の１つの製造方法
は異型のIL−６遺伝子の多重コピーを含んでいる細胞の
構築を含む。異型遺伝子を増幅可能なマーカー、たとえ
ば増加した遺伝子コピー含んでいる細胞をカウフマンお
よびシャープ（Kaufman ＆ Sharp）、ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）、前掲
の方法のメソトレキセート（MTX）の濃度の増大による
増殖により分泌し得るジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）を
連鎖し得る。この方法をいくつかの異なる細胞型に用い
得る。 pCSF309およびDHFR発現プラスミドpAdA263V（Ａ）３
〔カウフマンおよびシャープ（Kaufman ＆ Sharp）、モ
レキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Ce
ll.Biol.）前掲〕をりん酸カルシウム共沈および感染に
より、DHFR欠除のCHO細胞、DUKX−BIIに同時感染する。
形質転換体を発現している初期のDHFRを、透析した胎児
のふくらはぎ血清をもつアルファ培地の成育により分泌
し、カウフマンら（Kaufman et al）、モレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）、
第５巻、1750頁（1983年）に記載通りMTX（0.02、0.2、
1.0および5mM MTXの連続的段階）の濃度の増大による成
育により分泌する。形質転換体をクローンし、生物学的
に活性なIL−６蛋白質発現を、ネズミ骨髄検定により追
跡する。IL−６発現はMTX耐性のレベルの増大につれて
増大する。 本発明の実施態様の多数の修飾および変異を、その好
ましい具体例の先の説明を考慮して当業者が想到しうる
と予想される。上記の修飾および変異は添付の請求の範
囲に包含されていると考える。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＹ
//(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 シェンデル、ポール
アメリカ合衆国01778 マサチューセッ
ツ、ウエイランド、ジェフレイ・ロード
39番
(72)発明者 マッコイ、ジョン
アメリカ合衆国01867 マサチューセッ
ツ、リーディング、パイン・リッジ・ロ
ード 63番
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．（ａ）適当な細菌培養培地で、次のようなDNA配列
で形質転換された細菌細胞を培養し： 上記DNA配列は発現制御配列と作動上関連しており；お
よび （ｂ）（ａ）のアミノ酸28番からアミノ酸211番の配列
と実質的に同じアミノ酸配列であることを特徴とするIL
−６を上記培養培地から採取し、および （ｃ）マウス骨髄コロニー検定において１×106単位/mg
蛋白質より大きな特異活性になるまで上記IL−６を精製
する 段階によって製造される実質的に純粋な非グリコシル化
IL−６。 ２．（ａ）適当な細菌培養培地で、次のようなDNA配列
で形質転換された細菌細胞を培養し： 上記DNA配列は発現制御配列と作動上関連しており；お
よび （ｂ）（ａ）のアミノ酸28番からアミノ酸211番の配列
と実質的に同じアミノ酸配列であることを特徴とするIL
−６を上記培養培地から採取し、および （ｃ）マウス骨髄コロニー検定において１×106単位/mg
蛋白質より大きな特異活性になるまで上記IL−６を精製
する 段階を含む実質的に純粋な非グリコシル化IL−６の製造
方法。 ３．周辺質にIL−６蛋白質を分泌することのできる細菌
細胞中にある上記配列を培養することを特徴とする請求
項２記載の方法。 ４．（ａ）適当な細菌培養培地で、次のようなDNA配列
で形質転換された細菌細胞を培養し： 上記DNA配列は発現制御配列と作動上関連しており；お
よび （ｂ）（ａ）のアミノ酸28番からアミノ酸211番の配列
と実質的に同じアミノ酸配列であることを特徴とするIL
−６を上記培養培地から採取し、および （ｃ）マウス骨髄コロニー検定において１×106単位/mg
蛋白質より大きな特異活性になるまで上記IL−６を精製
する 段階によって製造される実質的に純粋な非グリコシル化
IL−６を含むことを特徴とする、増結組織の骨髄球様ま
たはリンパ球様細胞のいずれか、またはそれらの組合せ
の濃度が減少する症状の処置のための医薬組成物。 ５．IL−６およびヘマトポイエチン、インターロイキ
ン、成長因子または抗体の少なくとも１つを含む抗がん
剤として使用する、請求項４記載の医薬組成物。 ６．IL−６およびIL−３を含む請求項５記載の医薬組成
物。 ７．IL−６およびIL−２を含む請求項５記載の医薬組成
物。 ８．更にγ−インターフェロンを含む請求項７記載の医
薬組成物。 ９．IL−６を含む骨髄細胞の低レベルの処置に使用す
る、請求項４記載の医薬組成物。 １０．IL−６を含むリンパ球の低レベルの処置に使用す
る、請求項４記載の医薬組成物。
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