ES2302402B1 - Uso de una citoquina de la familia de interleuquina-6 en la preparacion de una composicion para administracion combinada con interferon-alfa. - Google Patents
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Abstract
Uso de una citoquina de la familia de
interleuquina-6 en la preparación de una composición
para administración combinada con
interferón-alfa.
La presente invención se refiere al uso de al
menos una citoquina de la familia IL-6 -familia
gp130 - o una secuencia de ADN que la codifica, en la preparación
de una composición farmacéutica para la administración combinada con
al menos un interferón-alfa o una secuencia de ADN
que lo codifica, en el tratamiento de enfermedades virales; a una
composición farmacéutica que comprende una cantidad
farmacéuticamente aceptable de al menos una citoquina de la
familia IL-6 - familia gp130 -, o una secuencia de
ADN que la codifica, y una cantidad farmacéuticamente aceptable de
al menos un interferón-alfa, o una secuencia de
ADN que lo codifica, a un kit farmacéutico y a un método para tratar
enfermedades virales mediante la administración combinada de las
citoquinas mencionadas y el interferón-alfa.
Description
Uso de una citoquina de la familia de
interleuquina-6 en la preparación de una composición
para administración combinada con
interferón-alfa.
La presente invención se refiere al uso de una
citoquina en combinación con un interferón para la preparación de
composiciones para el tratamiento de enfermedades virales.
El sistema interferón (IFN) es la primera línea
de defensa contra infecciones víricas en mamíferos. Los
interferones de tipo I (que incluye varios subtipos de
IFN-alfa así como IFN-beta) son
moléculas con actividad antiviral que son inducidas en células de
mamífero en respuesta a infecciones víricas. La acción del
IFN-alfa es mediada por la interacción con una
multisubunidad de receptor celular de superficie, que consiste en
dos subunidades receptoras, receptor 1 IFN-alfa
(IFNAR1) y IFNAR2. Se ha identificado sólo una forma de cadena de
IFNAR1; y tres variantes de la subunidad IFNAR2 han sido
reconocidas: una de longitud total, IFNAR2c, y dos isoformas
truncadas IFNAR2b y IFNAR2a. La variante IFNAR2c está implicada en
uniones a ligandos y transducción de señales, mientras que las dos
formas truncadas IFNAR2b y IFNAR2a - que no tienen dominios
intracelulares - inhiben la señal de IFN-alfa,
mediante la competencia con IFNAR2c por la unión a
IFN-alfa.
La cascada de señalización de
IFN-alfa se inicia cuando IFN-alfa
se une al receptor. La unión de IFN-alfa al
receptor conduce a la activación de tirosín-quinasas
asociadas a IFNAR (Janus quinasa 1 (Jak1) y
tirosín-quinasa 2 (Tyk2)), las cuales fosforilan
ambas subunidades IFNAR1 y IFNAR2. IFNAR1 fosforilada proporciona un
sitio de unión para el activador del factor de transcripción 2 y
transductor de la señal que contiene un dominio de homología 2 con
Src (STAT2), cuando es fosforilado por Tyk2 o Jak1. Los otros
STATs, incluyendo STAT1, STAT3 y STAT5, consiguientemente son
reclutados al receptor para su fosforilación y activación. Los
monómeros activados STAT1 y STAT2 son luego liberados de nuevo al
citosol, donde forman heterodímeros y se unen al factor 9 de
regulación del interferón/Proteína p48, para formar un complejo
activo de factores de transcripción conocido como factor génico 3
estimulado por interferón (ISGF3). El complejo se transloca al
núcleo y se une al elemento de respuesta a la estimulación con IFN
(ISRE) para iniciar la transcripción de los genes diana, incluyendo
algunas proteínas antivirales e inmunorreguladoras.
IFN-alfa también induce la formación de otros
complejos STAT, incluyendo STAT1/STAT1, STAT1/STAT3 y STAT3/STAT3,
los cuales se unen a la secuencia \gamma activada en las regiones
promotoras de genes sensibles. En los hepatocitos humanos
primarios, el IFN-alfa activa STAT1, STAT2, STAT3 y
STAT5, seguido de la inducción de una amplia variedad de genes
antivirales y proapoptóticos que pueden contribuir a la actividad
antitumoral y antiviral de IFN-alfa en hígados
humanos.
En contraste con IFN-alfa que
activa STAT1, STAT2 y STAT3, en el caso de IFN de tipo II (IFN
\gamma), la unión al receptor conduce a la fosforilación
exclusiva de STAT1 por Jak1 y Jak2, y esto es seguido por la
homodimerización de STAT1 y la translocación nuclear del
homodímero.
Las infecciones víricas representan un enorme
problema de salud en todo el mundo. Entre los virus que causan
infecciones crónicas, son importantes el causante de hepatitis B
(HBV) y el causante de hepatitis C (HCV), como los factores
etiológicos principales de hepatitis crónica vírica y cirrosis
hepática, trastornos que afectan a más de 500 millones de personas
en el mundo (alrededor de 300 millones afectados por HBV y 200
millones por HCV). El HBV causa infección crónica principalmente en
casos de transmisión vertical e individuos inmunodeprimidos. La
infección por HCV, por otro lado, es notable por la tendencia a
desarrollar cronicidad en la mayor parte de los casos, indicando
que este virus ha desarrollado mecanismos particularmente eficaces
para evadir el sistema interferón. Los pacientes con infección
crónica por HCV así como los pacientes con hepatitis crónica B
fallan en la respuesta a la terapia con interferón. En la hepatitis
crónica B, la respuesta antivírica sostenida ocurre en menos del
40% de los casos [1]. En el caso de hepatitis crónica C, aunque la
mayoría de los pacientes infectados con genotipos HCV 2 ó 3,
exhiben respuesta virológica sostenida (SVR) después de 24 o 48
semanas de terapia de combinación con IFN-alfa
pegilado y ribavirina [2], sólo 50% de aquéllos infectados con
genotipo 1 alcanzó SVR con este régimen de tratamiento [2]. Puesto
que más del 80% de los pacientes infectados con HCV en el mundo
occidental y Asia corresponden al genotipo 1, se necesitan
urgentemente medios más eficaces para aumentar la eficacia
antivírica de IFN-alfa. Los mecanismos subyacentes
de la resistencia al IFN-alfa observados en HCV y
otras enfermedades víricas crónicas son todavía pobremente
comprendidos y hay una necesidad enorme de encontrar estrategias
terapéuticas capaces de superar la resistencia a la terapia con
IFN-alfa en estas enfermedades.
La respuesta de la célula infectada por el virus
al interferón-alfa depende de varios factores
determinantes, incluyendo aquéllos relacionados con el virus y
aquéllos específicos relacionados con el huésped. Diversos
productos génicos de HCV han demostrado modular la respuesta del
huésped a la terapia con IFN e influenciar la gravedad de la
enfermedad vírica, en particular hepática. Se ha divulgado que
proteínas no-estructurales (NS5A) y proteínas
estructurales (E2) de HCV interaccionan con PKR, una de las
moléculas clave implicadas en el desarrollo de un estado antiviral
en respuesta al IFN [3, 4]. Esto podría bloquear la PKR dando como
resultado una inhibición de la actividad de IFN en células
infectadas por HCV. Por otro lado, varios estudios han demostrado
que la señal de STAT1 inducida por IFN-alfa está
afectada tanto en ratones transgénicos con HCV como en biopsias
hepáticas de pacientes con HCV crónicos [5, 6].
Se ha observado que en muestras hepáticas con
HCV, y en células hepáticas portadoras de un replicón de HCV
genómico (longitud completa), hay una disminución marcada en la
cantidad de ARNm de IFNAR2 y de STAT3. Es relevante el hecho de
haber encontrado que la activación de STAT1, STAT2 y STAT3 por
IFN-alfa se bloqueó en células hepáticas que
contenían un replicón de HCV de longitud completa, indicando así
que la replicación de HCV puede bloquear la señalización de
IFN-alfa en las células infectadas. Es también
interesante el hecho de que en estas células no se ve afectada la
activación de STAT1 cuando se incubaron con la molécula
proinflamatoria IFN-gamma, indicando así que el
bloqueo de la activación de STAT1 producido por HCV es específico
para la cascada de señalización de IFN de tipo I, y que no afecta a
la vía de señalización del IFN de tipo II.
Hay otras citoquinas que activan la vía de
señalización de Jak-STAT, en particular, miembros de
la familia de la IL-6, que comprende
IL-6, IL-11, factor inhibidor de la
leucemia (LIF), oncostatina (OSM), cardiotrofina-1
(CT-1), el factor neurotrófico ciliar (CNTF) y
citoquina similar a la cardiotrofina (CLC) [7]. Estas citoquinas se
unen a los complejos receptores de la membrana plasmática que
comprenden la cadena receptora de transducción de señales común
gp130 [7]. La transducción de señales implica la activación de los
miembros de la familia de tirosín-quinasas Jak,
conduciendo a la activación de los factores de transcripción STAT1
y STAT3. Estas citoquinas potencialmente activan STAT3 y en menor
medida STAT1 a través de su subunidad receptora común gp130. Sin
embargo, aunque se ha mostrado que IL-6 induce
algunos efectos antivirales [8], la actividad antiviral de esta
citoquina es mucho menor que la del
interferón-alfa.
La presente invención se refiere al uso de una
interleuquina de la familia de la IL-6,
preferentemente, la cardiotrofina-1
(CT-1) u oncostatina M (OSM):
(1) para potenciar la actividad antiviral del
interferón alfa (IFN-alfa);
(2) para superar la resistencia al interferón
observada en pacientes con infección vírica crónica, que no
responden a la terapia de IFN-alfa (solo o asociado
con otros compuestos antivirales);
(3) para conseguir un tratamiento combinado de
interleuquina de la familia IL-6, preferentemente
CT-1 u OSM, más IFN-alfa como
terapia antiviral mejorada en cualquier forma de infección vírica,
y en particular en infección por virus de hepatitis C (HCV), en el
que la combinación preferente de
CT-1-IFN-alfa u
OSM-IFN-alfa ha resultado ser
especialmente potente en la inhibición de la replicación de
HCV.
La presente invención ha conseguido los
siguientes objetivos:
(1) mostrar que la combinación de
interferón-alfa y una interleuquina de la familia
de IL-6, y de manera preferente la
CT-1 y la OSM, produce un efecto antiviral más
potente que aquel inducido por una citoquina (IFN o citoquina de la
familia IL-6) únicamente; y
(2) mostrar que el
interferón-alfa asociado a una citoquina de la
familia IL-6, en particular, la CT-1
o la oncostatina M, es capaz de superar el bloqueo de la cascada
de señalización del interferón-alfa (y
consecuentemente, la atenuación del efecto del
interferón-alfa que se produce cuando el virus,
preferentemente HCV, se replica en la célula
infectada).
infectada).
La presente invención se refiere en primer lugar
al uso de al menos una citoquina de la familia IL-6
-familia gp130 - o una secuencia de ADN que la codifica, en la
preparación de una composición farmacéutica para la administración
combinada con al menos un interferón-alfa o una
secuencia de ADN que lo codifica, en el tratamiento de enfermedades
virales.
Según la presente invención la citoquina de la
familia IL-6 está seleccionada preferentemente del
grupo formado por la IL-6, la
cardiotrofina-1, la IL-11, el
factor inhibidor de la leucemia, la oncostatina M, factor
neurotrófico ciliar, la citoquina semejante a la cardiotrofina, y
combinaciones de ellas; y de modo más preferente aún, dicha
citoquina es la cardiotrofina-1 o la oncostatina
M.
Tal y como se utiliza en la presente invención,
la citoquina de la "familia IL-6", por ejemplo
CT-1 se refiere a:
- -
- la forma nativa completa de dicha citoquina;
- -
- cualquier fracción activa de dicha citoquina, es decir, cualquier secuencia polipeptídica parcial de dicha citoquina que mantenga los efectos fisiológicos de la citoquina completa reivindicados en la presente invención; y
- -
- cualquier derivado polipeptídico de dicha citoquina, es decir, cualquier secuencia polipeptídica que tenga una homología con dicha citoquina nativa superior al 80% y que mantenga los efectos fisiológicos de la citoquina completa reivindicados en la presente invención.
\newpage
La citoquina de la familia IL6 (bien sea
completa, una fracción activa o un derivado polipeptídico) puede
proceder tanto de la forma nativa, como de cualquier forma de
citoquina recombinante, a partir de cualquier forma
polinucleotídica que codifica para la citoquina completa, la
fracción activa o el derivado polipeptídico.
Por otra parte, según la presente invención, el
interferón-alfa de la invención es cualquier tipo de
interferón-alfa. En una realización particular
dicho interferón-alfa está seleccionado entre el
interferón-alfa-2a,
interferón-alfa-2b,
interferón-alfa-5, interferón
consenso, interferón-alfa purificado,
interferón-alfa pegilado y combinaciones de los
mismos; En otra realización particular el
interferón-alfa está seleccionado entre
interferón-alfa-2b pegilado,
interferón-alfa-2a pegilado,
interferón-alfa-5 pegilado y
combinaciones de los mismos.
El uso combinado de un
interferón-alfa y de una citoquina de la familia de
la interleuquina-6 está dirigido al tratamiento de
una enfermedad preferentemente viral. Como ejemplo de enfermedades
virales que pueden ser tratadas mediante el uso combinado del
interferón y una citoquina de la familia
interleuquina-6 se pueden citar, sin que el uso se
limite a ellas, las enfermedades producidas por el virus de la
encefalomiocarditis, hepatitis B y C, VIH, infecciones virales
cutáneas (varicela, herpes zoster, sarampión), infecciones virales
respiratorias, enfermedades virales del sistema nervioso central,
enfermedades virales hepáticas, enfermedades virales de las
glándulas salivares, mononucleosis infecciosas y verrugas
genitales.
De manera preferida, la enfermedad viral es una
hepatitis C.
Además, de acuerdo con la presente invención, la
citoquina - o citoquinas - de la familia de IL-6 y
el interferón-alfa pueden ser administrados
separadamente estando presentes en composiciones farmacéuticas
distintas; o pueden ser administrados conjuntamente, estando
presentes en una misma composición farmacéutica.
Un objeto adicional de la presente invención es
por lo tanto una composición farmacéutica que comprende una
cantidad farmacéuticamente aceptable de al menos una citoquina de
la familia IL-6 - familia gp130 -, o una secuencia
de ADN que la codifica, y una cantidad farmacéuticamente aceptable
de al menos un interferón-alfa, o una secuencia de
ADN que lo codifica.
En dicha composición farmacéutica que comprende
al menos un interferón-alfa, o una secuencia de ADN
que lo codifica, y al menos una citoquina de la familia de
IL-6, o una secuencia de ADN que lo codifica, la
citoquina de la familia IL-6 está seleccionada
preferentemente entre la IL-6, la
IL-11, el factor inhibidor de la leucemia,
oncostatina M, cardiotrofina-1, factor neurotrófico
ciliar, la citoquina semejante a la cardiotrofina y combinaciones
de las mismas; y de manera más preferente aún, dicha citoquina de
la familia IL-6 es cardiotrofina-1 o
la oncostatina M.
En la composición farmacéutica de la invención,
el interferón-alfa es cualquier tipo de
interferón-alfa. En una realización preferida el
interferón-alfa se ha seleccionado entre el
interferón-alfa-2a,
interferón-alfa-2b,
interferón-alfa-5, interferón
consenso, interferón-alfa purificado,
interferón-alfa pegilado y combinaciones de los
mismos. En otra realización preferida adicional el
interferón-alfa está seleccionado entre
interferón-alfa-2b pegilado,
interferón-alfa-2a pegilado,
interferón-alfa-5 pegilado y
combinaciones de los mismos.
En una realización particular, la secuencia de
ADN que codifica la citoquina de la familia IL-6
(bien sea completa, una fracción activa o un derivado
polipeptídico) o el interferón-alfa está incorporada
en un vector de expresión, por ejemplo, un plásmido o un vector
viral, preferentemente operativamente unido a una secuencia de
control que regula la expresión de la citoquina o el
interferón-alfa. La construcción de dicho vector de
expresión con la secuencia de ADN puede realizarse por métodos
convencionales de tecnología recombinante recogidos en manuales
como por ejemplo "Molecular Cloning: a Laboratory manual" de
J. Sambrook, D.W. Russel Eds. 2001, 3rd ed. Cold Spring Harbor, New
York. Estas formas de realización de la composición farmacéutica
resultan de interés para terapias mediante transferencia génica
(terapia génica).
La composición farmacéutica de la invención
puede comprender además, al menos un excipiente farmacéuticamente
compatible con la citoquina de la familia IL-6, o
con la secuencia de ADN que la codifica, y es farmacéuticamente
compatible con el interferón-alfa o la secuencia de
ADN que lo codifica.
Además, en la composición farmacéutica, la
citoquina de la familia IL-6 - o la secuencia de
ADN que la codifica - y el interferón-alfa - o la
secuencia de ADN que lo codifica - pueden estar vehiculizados en
sendos agentes vehiculizantes.
Son ejemplos válidos de la composición
farmacéutica de la invención, sin que estos deban tomarse como una
limitación de la misma, cualquier composición sólida (por ejemplo,
comprimidos, cápsulas, gránulos, etc.) o líquida (por ejemplo,
soluciones, suspensiones, emulsiones, etc.) para su administración
por cualquier vía de administración apropiada, por ejemplo oral,
nasal, parenteral, tópica, transdérmica, rectal, etc.
En una realización particular, dicha composición
farmacéutica puede estar en una forma farmacéutica de
administración por vía oral, bien en forma sólida o líquida.
Ejemplos ilustrativos de formas farmacéuticas de administración por
vía oral incluyen comprimidos, cápsulas, granulados, soluciones,
suspensiones, etc., y pueden contener los excipientes
convencionales, tales como aglutinantes, diluyentes,
desintegrantes, lubricantes, humectantes, etc., y pueden ser
preparadas por métodos convencionales. La composición farmacéutica
también puede ser adaptada para su administración parenteral, en
forma de, por ejemplo, soluciones, suspensiones o productos
liofilizados, estériles, en la forma de dosificación apropiada; en
este caso, dicha composición farmacéutica incluirá los excipientes
adecuados, tales como tampones, tensioactivos, etc. En cualquier
caso, los excipientes se elegirán en función de la forma
farmacéutica de administración seleccionada. Una revisión de las
distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos, para
estas y otras vías alternativas posibles, y de su preparación puede
encontrarse por ejemplo en el libro "Tecnología
farmacéutica", de J. L. Vila Jato, 1997 Vols I y II, Ed.
Síntesis, Madrid; o en "Handbook of pharmaceutical manufacturing
formulations", de S. K. Niazi, 2004 Vols I a VI, CRC Press, Boca
Raton.
En una realización particular la composición
farmacéutica es para administración parenteral, preferentemente por
vía subcutánea, intravenosa, intramuscular o intraperitoneal.
En una realización particular de la composición
farmacéutica de la invención el interferón-alfa se
encuentra en forma pegilada. Algunos ejemplos para la preparación
de composiciones con formas pegiladas de
interferón-alfa pueden encontrarse en US5.762.923 y
US5.766.582. También es posible adquirir algunas de estas formas
pegiladas comercialmente, como por ejemplo
PEG-Intron
(interferón-alfa-2b pegilado) de
Schering Corporation (Kenilworth, N.J. EE.UU.) y
PEGASYS(interferón-alfa-2a)
de Hoffmann La Roche (Nutley, N. J., EE.UU.).
Para su aplicación en terapia, tanto la
citoquina de familia IL-6 como el
interferón-alfa se encontrarán preferiblemente en
una forma farmacéuticamente aceptable o sustancialmente pura, es
decir, que tendrán un nivel de pureza farmacéuticamente aceptable
excluyendo los excipientes farmacéuticamente aceptables y no
incluyendo material considerado tóxico a los niveles de
dosificación normales. Los niveles de pureza para la citoquina de
familia IL-6 y el interferón-alfa
son preferiblemente superiores al 50%, más preferiblemente,
superiores al 70%, más preferiblemente, superiores al 90%. En una
realización preferida, son superiores al 95%.
En general, la cantidad terapéuticamente
efectiva de la citoquina de familia IL-6 y del
interferón-alfa a administrar dependerán, entre
otros factores, del individuo que vaya a ser tratado, de la
severidad de la enfermedad que padezca dicho individuo, de la forma
de administración elegida, etc. Por este motivo, las dosis
mencionadas en esta invención deben ser consideradas tan solo como
guías para el experto en la materia, y éste debe ajustar las dosis
en función de las variables citadas anteriormente. No obstante, se
pueden administrar citoquina de familia IL-6 y el
interferón-alfa, una o más veces al día, por
ejemplo, 1, 2, 3 ó 4 veces al día.
A título ilustrativo, y sin que esto suponga una
limitación del ámbito de protección, en una realización particular
en la que se combinan cardiotrofina-1 e
interferón-alfa-2a (ó 2b), la
cantidad típica total diaria de cardiotrofina-1
está comprendida entre 1 \mug/Kg y 10 mg/kg de peso corporal; y
la cantidad típica total diaria de
interferón-alfa-2a está comprendida
entre 1,5 y 10 MUI diarias o entre 40 y 300 microgramos semanales
de interferón-alfa pegilado. Normalmente el nivel
de dosificación será más alto en las primeras semanas de
tratamiento, reduciéndose la dosis en etapas posteriores. Asimismo
el régimen de administración puede ser diario, de 3 veces por
semana, o también semanal. Por otra parte, la
cardiotrofina-1 y el interferón-alfa
pueden ser administrados según diferentes regímenes de
administración (por ejemplo, distinta vía de administración o
distinta frecuencia).
La presente invención tiene como objeto
adicional un kit farmacéutico para el tratamiento de una enfermedad
viral que comprende al menos:
- un primer componente que comprende al menos
una citoquina de la familia IL-6 -familia gp130-
(bien sea completa, una fracción activa o un derivado
polipeptídico, tal como se han definido anteriormente) o una
secuencia de ADN que codifica dicha citoquina; y
- un segundo componente que comprende al menos
un interferón-alfa o una secuencia de ADN que
codifica dicho interferón-alfa.
El kit de acuerdo con la invención comprende
preferentemente una citoquina de la familia IL-6
seleccionada entre la IL-6, la
IL-11, el factor inhibidor de la leucemia,
oncostatina M, cardiotrofina-1, factor neurotrófico
ciliar, la citoquina semejante a la cardiotrofina y combinaciones
de las mismas, y de manera más preferente aún la citoquina de la
familia IL-6 es cardiotrofina-1 u
oncostatina M.
El kit de acuerdo con la invención comprende un
interferón-alfa de cualquier tipo, preferentemente
uno seleccionado entre el
interferón-alfa-2a, interferón-
alfa-2b,
interferón-alfa-5, interferón
consenso, interferón-alfa purificado,
interferón-alfa pegilado y combinaciones de los
mismos. En otra realización preferente, el
interferón-alfa está seleccionado entre
interferón-alfa-2b pegilado,
interferón-alfa-2a pegilado,
interferón-alfa-5 pegilado y
combinaciones de los mismos.
En una realización particular la secuencia de
ADN que codifica la citoquina de la familia IL-6
(bien sea completa, una fracción activa o un derivado
polipeptídico) o el interferón-alfa del kit está
incorporado en un vector de expresión.
En el kit de la presente invención, el primer
componente y el segundo componente pueden comprender además al
menos un excipiente farmacéuticamente aceptable y compatible con la
citoquina de la familia IL-6 - o una secuencia de
ADN que la codifica - y con el interferón-alfa- o
una secuencia de ADN que lo codifica -.
Según la presente invención el kit definido
anteriormente puede comprender el primer y el segundo componente en
composiciones farmacéuticas separadas; o bien el primer y el
segundo componente pueden estar presentes en el kit en una misma
composición farmacéutica.
Dicho kit puede comprender además un tercer
componente que comprende uno o más excipientes farmacéuticamente
compatibles con la citoquina de la familia IL-6 - o
una secuencia de ADN que la codifica - y con el
interferón-alfa - o una secuencia de ADN que lo
codifica -.
Dicho tercer componente puede comprender además
uno o más agentes vehiculizantes farmacéuticamente compatibles con
la citoquina de la familia IL-6 - o una secuencia
de ADN que la codifica - y con el interferón-alfa -
o una secuencia de ADN que lo codifica.
La presente invención tiene como objeto
adicional un método para el tratamiento de una enfermedad viral que
comprende administrar de manera combinada una cantidad
terapéuticamente eficaz de al menos una citoquina de la familia
IL-6 - familia gp130 - (bien sea completa, una
fracción activa o un derivado polipeptídico, tal como se han
definido anteriormente), o una secuencia de ADN que la codifica, y
una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un
interferón-alfa, o una secuencia de ADN que lo
codifica.
En una realización particular la secuencia de
ADN que codifica la citoquina de la familia IL-6 o
el interferón-alfa del método está incorporado en
un vector de expresión.
En el método definido anteriormente, la
enfermedad viral puede ser producida por el virus de la
encefalomiocarditis, hepatitis B y C, VIH, infecciones virales
cutáneas (varicela, herpes zoster, sarampión), infecciones virales
respiratorias, enfermedades virales del sistema nervioso central,
enfermedades virales hepáticas, enfermedades virales de las
glándulas salivares, mononucleosis infecciosas y verrugas
genitales.
Según una realización preferida del método de la
invención, la enfermedad viral es una hepatitis C.
De acuerdo con el método de la invención, la
citoquina de la familia IL-6 está preferentemente
seleccionada entre la IL-6, la
IL-11, el factor inhibidor de la leucemia,
oncostatina M, cardiotrofina-1, factor neurotrófico
ciliar, la citoquina semejante a la cardiotrofina y combinaciones
de ellas, de manera más preferente aún, la citoquina de la familia
IL-6 es la cardiotrofina-1 u
oncostatina M.
En el método definido según la invención, el
interferón-alfa es cualquier tipo de
interferón-alfa. En una realización preferente está
seleccionado entre el
interferón-alfa-2a,
interferón-alfa-2b,
interferón-alfa-5, interferón
consenso, interferón-alfa purificado,
interferón-alfa pegilado y combinaciones de los
mismos; en otra realización preferida adicional el
interferón-alfa está seleccionado entre
interferón-alfa-2b pegilado,
interferón-alfa-2a pegilado,
interferón-alfa-5 pegilado y
combinaciones de los mismos.
Además según el método de la invención, éste
puede comprender la administración combinada y simultánea de la
citoquina de la familia de la interleuquina, preferentemente,
cardiotrofina-1, e
interferón-alfa.
En el método presente la citoquina de la familia
IL-6 (bien sea completa, una fracción activa o un
derivado polipeptídico) y el interferón-alfa pueden
estar presentes en una misma composición farmacéutica que se
administra al paciente; o bien la citoquina de la familia
IL-6 y el interferón-alfa se pueden
administrar en composiciones farmacéuticas separadas.
La presente invención muestra que cuando se
estimulan las células hepáticas que comprenden un replicón completo
de HCV con interferón-alfa y una interleuquina de
la familia de IL-6, en particular, la
cardiotrofina-1:
(1) se supera el efecto inhibidor de HCV sobre
la fosforilación de STAT3, que se produce cuando las células son
incubadas con interferón-alfa solo o con una
citoquina de la familia IL-6 (por ejemplo
CT-1) sola.
(2) se genera una inducción más elevada de genes
sensibles al interferón (ISGs) tales como
2'-5'-oligoadenilato sintasa
(2'-5'OAS) y niveles más elevados de STAT1 y STAT3
que cuando las células son incubadas con citoquina únicamente, y
(3) se inhibe la replicación del virus más
eficazmente que cuando se usa la citoquina únicamente.
La figura 1 muestra un análisis de la
fosforilación de STAT1, STAT2 y STAT3. Células Huh7 (Huh7) y
células Huh7 que contienen un replicón genómico completo de HCV
(Core-3') fueron tratadas durante 15, 60 y 120
minutos con 50 UI/ml de IFN-alfa-2
(IFN\alpha) o con 20 ng/ml de cardiotrofina-1
(CT1), o con una combinación de
IFN-alfa-2 y CT-1, y
se analizó la cantidad de STAT1, STAT2 y STAT3 fosforilados
presentes en los extractos celulares mediante
Western-blot.
\newpage
La figura 2 muestra un análisis cuantitativo de
ARNm mediante RT-PCR en tiempo real de STAT1, STAT3
y 2'-5'OAS, presente en células Huh7 que contienen
un replicón completo de HCV, tratadas durante 3 días con 5 ó 50
UI/ml de IFN-alfa-2 y 20 ng/ml de
CT-1. Control: control no tratado.
La figura 3 muestra un análisis cuantitativo,
mediante RT-PCR en tiempo real, de ARN de HCV
presente en células Huh7 que contienen un replicón completo de HCV,
tratadas durante 3 días con 5 ó 50 UI/ml de
IFN-alfa-2 y 20 ng/ml de
CT-1.
La figura 4 muestra el porcentaje de células
Huh7 protegidas frente a la infección con el virus de la
encefalomiocarditis. Células Huh7 fueron pretratadas durante 24
horas con 5 ng/ml o 50 ng/ml de CT-1 y diferentes
cantidades de IFN-alfa-2, y fueron
infectadas con 10^{5} UFP del virus de encéfalomiocarditis
(EMCV), y después de 24 horas, las células fueron teñidas con
colorante cristal violeta para medir la cantidad de células
viables.
La figura 5A muestra un análisis cuantitativo,
mediante RT-PCR en tiempo real, de ARN de HCV
presente en células Huh7 que contienen un replicón completo de HCV,
tratadas durante 3 días con 5 ó 50 UI/ml de
IFN-alfa-2 ó con 20 ng/ml de
diferentes citoquinas de la familia IL-6. Las
figuras 5 B y 5 C muestran un análisis cuantitativo, mediante
RT-PCR en tiempo real, de ARN de HCV presente en
células Huh7 que contienen un replicón completo de HCV, tratadas
durante 3 días con 50 UI/ml de
IFN-alfa-2 y 20 ng/ml de
oncostatina M (figura 5B), ó 50 UI/ml de
IFN-alfa-2 y 20 ng/ml de
Interleuquina 6 (Figura 5C).
Experimento
1
En células Huh7 (una línea celular de hepatoma)
no transfectadas la adición de 50 UI/ml de
IFN-alfa-2
(interferón-alfa-2) indujo
fosforilación de STAT1, STAT2 y STAT3 con activación máxima de
STAT1 y STAT2 a 1 hora y 2 horas y de STAT3 a 1 hora (ver figura
1A). Sin embargo en células Huh7 transfectadas con un replicón HCV
de longitud completa, se observó que había una marcada inhibición
en la fosforilación de STAT1, STAT2 y STAT3 después de la
incubación con IFN-alfa-2. Por lo
tanto, se produjo una ausencia completa de STAT3 y STAT1 activadas
y se produjo una inhibición marcada de la activación de STAT2 (ver
figura 1A).
Por otro lado, en células Huh7 no transfectadas,
se encontró que la adición de 20 ng/ml de CT-1 dio
como resultado la activación tanto de STAT3 como de STAT1 (más
intensamente la de STAT3), con valores máximos a los 15 minutos y 1
hora, y una disminución sustancial a las 2 horas (figura 1B). Como
se esperaba, CT-1 no indujo ninguna activación de
STAT2. En células Huh7 transfectadas con un replicón completo de
HCV, la activación de STAT3 por CT-1 resultó
marcadamente disminuida, mientras que la fosforilación de STAT1 se
vio sólo ligeramente afectada (figura
1B).
1B).
Cuando se incubaron células Huh7 no
transfectadas con una mezcla de 50 UI/ml de
IFN-alfa-2 y 20 ng/ml de
CT-1, se detectó una fosforilación más intensa y
duradera de STAT3 y STAT1, que cuando las células se incubaron con
cada una de las citoquinas solas. La activación de STAT2 fue
similar a la encontrada con
IFN-alfa-2 solo. Es importante el
hecho de que cuando las células Huh7 transfectadas con un replicón
completo de HCV se incubaron con la mezcla
IFN-alfa-2 (50 UI/ml) más
CT-1 (20 ng/ml) se encontró que la fosforilación de
STAT3 se produjo sin ningún daño, siendo la activación de STAT3 no
sólo más intensa, sino también más duradera que cuando las células
no transfectadas se incubaron con
IFN-alfa-2 solo (figura 3C). Este
hecho es notable, puesto que, como se ha mencionado, (y se muestra
en la figura 1A y 1B) la replicación de HCV en células Huh7 reduce
seriamente la activación de STAT3, tanto por
IFN-alfa-2 como por
CT-1 por separado, y por ello, es sorprendente que
este bloqueo desaparezca por incubación de las células con las dos
citoquinas juntas, abriendo así una nueva perspectiva para una
estrategia prometedora en el tratamiento de las enfermedades
virales. Se debe de notar también que cuando se combina
IFN-alfa-2 y CT-1
para tratar células con replicación de HCV, no sólo se produce una
activación de STAT3 potente y sostenida, sino que también se
produce una activación de STAT1 de manera similar a aquélla
encontrada cuando se incuban células no transfectadas con
CT-1 sola y más intensamente que cuando células no
transfectadas se incuban con
IFN-alfa-2 solo (comparar figura 1A
y 1B). Es importante notar que
IFN-alfa-2 fue incapaz de activar
STAT1 en células con replicación sostenida de HCV, mientras que la
combinación de CT-1 más
IFN-alfa-2 fue capaz de activar de
manera muy eficaz este importante factor antiviral en células con
replicación de HCV. Esto muestra claramente que hay una mejora en
la actividad antiviral combinando
IFN-alfa-2 y CT-1,
permitiendo la fosforilación de STAT2, aunque a niveles claramente
inferiores que cuando se usan células sin replicación de HCV (ver
figura 1C).
En conclusión, cuando las células con
replicación sostenida de HCV fueron tratadas con
IFN-alfa-2 de modo aislado no hubo
activación de STAT1 y STAT3, y únicamente se observaron bajos
niveles de STAT2. La falta de STAT1 y STAT3 activados - dos
inductores importantes del estado antiviral de la célula podría
prevenir la formación de heterodímeros STAT1-STAT2,
de heterodímeros STAT1-STAT3 y de homodímeros STAT1
y STAT3, colapsando así la defensa antiviral de la célula. El uso
de CT-1 en combinación con
IFN-alfa-2 permite la formación de
altos niveles de STAT1 y STAT3 activados, restaurando así el
mecanismo de resistencia viral de la célula.
En los experimentos que se muestran en la figura
1, se puede ver que la infección por HCV determina no sólo una
activación defectuosa de STAT1, sino también una reducción de los
niveles de las proteínas STAT3 y STAT2. Los estudios que se
representan en la figura 1 muestran los efectos a corto plazo de la
incubación bien con IFN-alfa-2 o con
CT-1, o con la combinación de los dos. En los
experimentos que se describen a continuación se muestra que con la
incubación durante 72 horas, se puede observar que el tratamiento
combinado de CT-1 e
IFN-alfa-2 dio como resultado una
expresión aumentada de STAT3, contrarrestando así el efecto de HCV
en las células infectadas (ver figura 2).
Método experimental
1
Establecimiento de líneas celulares Huh7
portadoras del replicón del HCV de longitud completa. Se
establecieron células Huh7 que expresaban el replicón del HCV de
longitud completa como se ha descrito [9]. Resumiendo, se
linealizaron pI_{389}/Core-3'/5.1 con ScaI (New
England Biolabs, USA) y se utilizaron como plantillas para la
síntesis de ARN usando la ARN polimerasa T7 (Promega, USA). Se
usaron 20 \mug de ARN sintetizado para electroporar 10^{7}
células Huh7 y, a las 24 horas, se añadieron 500 \mug/ml de G418
(Gibco, USA). Dos veces por semana, se reemplazó el medio de
cultivo suplementado con G418 y, a las 4 semanas de la
transfección, se recogieron las colonias resistentes a G418
mezcladas y se usaron para posterior análisis.
Análisis por transferencia Western. Se
sembraron células Huh7 que expresaban o no expresaban el replicón
del HCV de longitud completa a 200.000/pocillo en placas de 6
pocillos en D-MEM (Gibco) con un 10% de FCS (Gibco).
Se añadieron 50 UI/ml de IFN-alfa-2
(Intron A, Schering-Plough), ó 20 ng/ml de
CT-1 (R&D Systems, UK), o una combinación de
IFN-alfa-2 (50 UI/ml) más
CT-1 (20 ng/ml) durante diferentes períodos de
tiempo: 15 minutos, 1 hora y 2 horas. Después, se lisaron las
células Huh7 en tampón de lisis (Tris-HCl 60 mM pH
6,8, SDS 2%, glicerol 2,5%, 2-mercaptoetanol 0,7 M
y azul de bromofenol 0,02%). Se resolvieron las muestras en geles
de SDS-poliacrilamida (Bio-Rad
Laboratories, CA) al 7,5% en condiciones reductoras. Después de la
electroforesis, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa
(Bio-Rad Laboratories) y se tiñeron con solución
roja de Ponceau (Sigma-Aldrich, Alemania), para
verificar que había una carga igual de proteínas. Se incubaron las
membranas en TBS-T (Tris-HCl 50 mM
(pH 7,6), NaCl 200 mM y 0,1% de Tween-20) con leche
deshidratada al 5%. Se detectaron las proteínas por incubación con
el anticuerpo primario específico en TBS-T durante
1 hora. Después se lavaron las membranas en TBS-T y
se añadió anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa durante 1
hora. Se sometieron las membranas a lavados extensos en
TBS-T y se visualizaron las bandas proteicas
específicas usando el sistema de detección de quimioluminiscencia
"Western Lightning chemiluminescence reagent plus" (Perkin
Elmer, USA), según las instrucciones del fabricante.
Posteriormente se autorradiografiaron las membranas y se
cuantificaron las bandas por análisis densitométrico realizado
mediante el programa Molecular Analyst/PC (Bio-Rad
Laboratories).
Anticuerpos. Se compraron los anticuerpos
anti-fosfo-STAT1^{tyr701} y
anti-fosfo-STAT3^{tyr705} y el
anticuerpo IgG anti-conejo unido a HRP, a Cell
Signaling Technology (USA). Se obtuvieron los anticuerpos
anti-STAT3,
anti-fosfo-STAT1^{ser727},
anti-STAT2 y
anti-fosfo-STAT2^{tyr689} de
Upstate Biotechnology (USA). El anticuerpo
anti-STAT1 era de Santa Cruz Biotechnology (Santa
Cruz, CA). El anticuerpo anti-actina era de
Sigma-Aldrich (Alemania).
Para ver si la combinación de
CT-1 con IFN-alfa-2
da lugar a un estado antivírico más fuerte de la célula,
realizamos experimentos adicionales dirigidos a: a) la evaluación
de si la terapia de combinación de
IFN-alfa-2 más CT-1
puede aumentar la expresión de genes sensibles al interferón más
intensamente que cualquiera de las citoquinas sola; b) la
determinación de si la terapia de combinación de
IFN-alfa-2 más CT-1
podría ser más potente en la inhibición de la replicación del HCV
que cada citoquina por aislado, y c) la evaluación de si la
terapia de combinación de IFN-alfa-2
más CT-1 podría ser más eficiente a la hora de
defender las células frente a los efectos citopáticos de un virus
no relacionado con el HCV.
Experimento
2
Se estudió la expresión de los ISGs,
2'-5'OAS, STAT1 y STAT3, en células Huh7 portadoras
del replicón del HCV tras incubar durante 72 horas con
IFN-alfa-2 (5 ó 50 UI/ml) o
CT-1 (20 ng/ml) o ambas citoquinas conjuntamente
(véanse las Fig. 2A, 2B y 2C). Observamos que, mientras
CT-1 sola no era capaz de aumentar la expresión de
estos ISGs, la adición de CT-1 a dosis bajas o
altas de IFN-alfa-2 daba lugar a un
marcado aumento de la expresión de los ISGs, lo que indica que
CT-1 puede aumentar marcadamente la capacidad de
IFN-alfa-2 para regular de forma
creciente los genes antivíricos en células que soportan la
replicación vírica. Aunque los tres ISGs aquí analizados tienen
efectos antivíricos significativos, el aumento de la expresión de
STAT3 combinando CT-1 y
IFN-alfa-2 es de particular
relevancia, ya que este factor no sólo posee propiedades
antivíricas, sino que también exhibe una potente actividad
citoprotectora y antiinflamatoria.
Método experimental
2
Análisis de la expresión del ARNm de los ISGs
por RT-PCR en tiempo real. Se sembraron células
Huh7 que expresaban el replicón del HCV de longitud completa a
100.000/pocillo en placas de 6 pocillos en D-MEM
(Gibco), con un 10% de FCS (Gibco). Se añadieron 50 ó 5 UI/ml de
IFN-alfa-2 solo o en combinación con
20 ng/ml de CT-1. Se mantuvo el cultivo celular
durante tres días. Se reemplazó a diario el medio de cultivo
suplementado con las citoquinas anteriores. Se obtuvo el ARN total
siguiendo el protocolo de "Ultraspec RNA isolation system"
(Biotech, USA), que se basa en el método descrito por Chomczynski y
Sacchi [10]. Se trataron dos microgramos de ARN total con ADNasa
(Gibco-BRL, UK) antes de la transcripción inversa
con M-MLV Reverse Transcriptase (Gibco BRL) en
presencia de RNaseOUT (Gibco-BRL). Se midió la
expresión de los STAT, del 2'-5' OAS y de la
\beta-actina por PCR en tiempo real usando un
ICycler y la IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad
Laboratories, CA). Se usaron alícuotas de 2 \mul del pool de ADNc
para cada PCR, que contenía cebadores sentido y antisentido
específicos para cada gen (Tabla 1) en un volumen final de 20
\mul. Para determinar la especificidad de los productos de PCR
obtenidos, se analizó la temperatura de disociación de los mismos.
Se normalizaron los resultados según la cuantificación de
\beta-actina en la misma muestra. Se expresó la
cantidad de cada transcrito por la fórmula
2^{ct(actina)-ct(gen)}, siendo ct el
punto al cual la fluorescencia sube apreciablemente por encima de
la fluorescencia de fondo.
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento
3
Debido a la más fuerte inducción de los ISGs
observada al combinar IFN-alfa-2 más
CT-1, se deseaba analizar si esta combinación era
superior al IFN-alfa-2 solo, o a la
CT-1 sola en la reducción de la carga vírica en
células con el replicón del HCV de longitud completa. Así, se
incubaron células Huh7 portadoras del replicón del HCV con
IFN-alfa-2 (5 ó 50 UI/ml) más o
menos CT-1 (20 ng/ml) o con CT-1
sola y se midió la cantidad de ARN HCV después de 72 horas de
cultivo (Fig. 3). En la Figura 3, puede verse que la
CT-1 por sí sola tiene un modesto efecto
antivírico, que es similar al observado con el
IFN-alfa-2 a dosis bajas (5 UI/ml).
Sin embargo, la CT-1 potenció fuertemente el efecto
antivírico del IFN-alfa-2 cuando se
usó esta citoquina a dosis baja (5 UI/ml) o alta (50 UI/ml). Así,
la carga vírica cayó de aproximadamente 300 unidades arbitrarias
con dosis baja de IFN-alfa-2 solo a
30 con la combinación de dosis baja de
IFN-alfa-2 más CT-1.
Habría que hacer notar (véase la Fig. 3) que esta carga vírica era
incluso inferior a la obtenida con la dosis alta de
IFN-alfa-2 solo. En otras palabras,
la terapia de combinación aumenta en un factor de 10 ó más, el
efecto antivírico del IFN-alfa-2. Es
interesante el hecho de que la asociación de 50 UI/ml de
IFN-alfa-2 y CT-1
redujera la carga vírica a menos de 1, mientras que la dosis alta
de IFN-alfa-2 solo dio lugar a una
carga vírica superior a 30. Estos datos muestran claramente que el
efecto antivírico del IFN-alfa-2
aumenta marcadamente por su asociación a CT-1.
Método experimental
3
Análisis del ARN HCV por PCR cuantitativa en
tiempo real. Se sembraron células Huh7 que expresaban el
replicón del HCV de longitud completa a 100.000/pocillo en placas
de 6 pocillos en D-MEM con un 10% de FCS. Se
añadieron 50 ó 5 UI/ml de IFN-alfa-2
solo o en combinación con 20 ng/ml de CT-1. Se
mantuvo el cultivo celular durante tres días. Se reemplazó el medio
de cultivo suplementado con las anteriores citoquinas a
diario.
Se obtuvo el ARN total de células Huh7
transfectadas con el replicón del HCV de longitud completa
siguiendo el protocolo de "Ultraspec RNA isolation system"
(Biotech, USA), que se basa en el método descrito por Chomczynski y
Sacchi [10]. Se trataron dos microgramos de ARN total con ADNasa
(Gibco-BRL) antes de la transcripción inversa con
M-MLV Reverse Transcriptase
(Gibco-BRL) en presencia de RNaseOUT
(Gibco-BRL). Se midió la expresión del ARN HCV y
del ARNm de la \beta-actina por PCR cuantitativa
en tiempo real usando un ICycler y la IQ SYBR Green Supermix
(Bio-Rad Laboratories). Se usaron alícuotas de 2
\mul del pool de ADNc para cada PCR, que contenía cebadores
sentido y antisentido específicos de la región no traducida 5' del
HCV o para el gen de la \beta-actina (Tabla 1) en
un volumen final de 20 \mul. Para determinar la especificidad de
los productos de PCR, se analizó la temperatura de disociación de
los mismos. Se normalizaron los resultados según la cuantificación
de \beta-actina en la misma muestra. Se expresó
la cantidad de ARN HCV por la fórmula 2^{ct (actina) -ct (HCV)},
siendo ct el punto al cual la fluorescencia sube apreciablemente por
encima de la fluorescencia de fondo.
Experimento
4
Con objeto de determinar si el efecto sinérgico
de la terapia de combinación se produce también en otras
infecciones víricas diferentes del HCV, hemos analizado la
protección obtenida mediante este tratamiento contra el efecto
citopático del EMCV en células Huh7. Se incubaron células Huh7 con
dosis decrecientes de IFN-alfa-2 de
250 a 1 UI/ml en presencia o ausencia de una: dosis baja (5 ng/ml)
o alta (50 ng/ml) de CT-1 y se infectaron 24 horas
después con EMCV. Observamos que la CT-1 por sí
sola (a dosis baja o alta) tenía poco efecto citoprotector sobre
células infectadas por EMCV, ya que la adición de esta citoquina a
dosis muy bajas de IFN-alfa-2 no
mejoraba la viabilidad celular. Sin embargo, la
CT-1, tanto a dosis baja como alta, aumentaba
marcadamente la protección inducida por el
IFN-alfa-2 contra el efecto
citopático del EMCV. Se vio esta sinergia al usar dosis de
IFN-alfa-2 de entre 250 y 28 UI/ml,
siendo la sinergia más pronunciada a una dosis de
IFN-alfa-2 de 83 y de 28 UI/ml.
Estos datos muestran que la sinergia antivírica del
IFN-alfa-2 y de la
CT-1 no se restringe al HCV, sino que se aplica a
un amplio espectro de enfermedades víricas.
Método experimental
4
Ensayo cítoprotector de
IFN-alfa-2 y CT-1
frente al EMCV en células Huh7. Se determinó la actividad
citoprotectora de IFN-alfa-2 y
CT-1 midiendo la capacidad de estas citoquinas para
proteger células Huh7 contra el efecto citopático del virus de la
encefalomiocarditis. Se realizó el ensayo en una placa de
microtitulación de 96 pocillos. Primeramente, se sembraron
2x10^{4} células Huh7 por pocillo en 150 \mul de medio que
contenía diluciones seriadas de
IFN-alfa-2 solo (de 250 a 1 UI/ml) o
estas diluciones seriadas de
IFN-alfa-2 más 50 ó 5 ng/ml de
CT-1 y se incubaron durante 24 horas. Se añadieron
10^{5} UFP de virus EMC por pocillo y se midió el efecto
citopático a las 24 horas como sigue: tras eliminar el medio, se
lavaron los pocillos dos veces con PBS y se tiñeron con solución
colorante de cristal violeta (0,5% en metanol-agua
1:4 v/v). Se leyó la densidad óptica a 540 nm. Se expresan los
resultados como porcentaje de células protegidas contra el efecto
citopático del EMCV.
Experimento
5
Quisimos estudiar si otras citoquinas de la
familia de la interleuquina 6, además de la CT-1,
poseían efecto frente a la replicación del virus C y si la
combinación de IFN-alfa-2 más
alguna de ellas también reducía la carga vírica de HCV con mayor
intensidad que la administración de
IFN-alfa-2 solo. Así, se incubaron
células Huh7 portadoras del replicón del HCV con 20 ng/ml de
diversas citoquinas de la familia de interleuquina 6 como son
IL-6, IL-11, OSM y LIF. Además, se
cultivaron células Huh7 portadoras del replicón del HCV con 50
UI/ml de IFN-alfa-2 más o menos OSM
ó IL-6 (20 ng/ml) y se midió la cantidad de ARN HCV
después de 72 horas de cultivo (Fig. 5). En la Figura 5A, puede
verse que todas las citoquinas de la familia de
IL-6 testadas (CT-1,
IL-6, IL-11, OSM y LIF) tienen un
modesto efecto antivírico por sí solas.
Por otra parte, también se observó que la
combinación de OSM ó IL-6 (20 ng/ml) con
IFN-alfa-2 (50 UI/ml) potenciaba el
efecto antivírico del IFN-alfa-2
(Figuras 5B y 5C).
Estos datos muestran que el efecto antivírico
del IFN-alfa-2 aumenta por su
asociación con otras citoquinas de la familia de IL6, además de
CT-1.
Método experimental
5
Análisis del ARN HCV por PCR cuantitativa en
tiempo real. Se sembraron células Huh7 que expresaban el
replicón del HCV de longitud completa a 100.000/pocillo en placas
de 6 pocillos en D-MEM con un 10% de FCS. Se
añadieron 50 ó 5 UI/ml de IFN-alfa-2
solo o 20 ng/ml de CT ó IL6 (R&D Systems, UK)ó IL11 (R&D
Systems, UK), ó OSM (R&D Systems, UK)ó LIF (Chemicon
International, USA). Por otro lado, se añadió 50 UI/ml de
IFN-alfa-2 solo ó en combinación
con 20 ng/ml de OSM ó IL-6. Se mantuvo el cultivo
celular durante tres días. Se reemplazó el medio de cultivo
suplementado con las anteriores citoquinas a diario.
Se obtuvo el ARN total de células Huh7
transfectadas con el replicón del HCV de longitud completa
siguiendo el protocolo de "Ultraspec RNA isolation system"
(Biotech, USA), que se basa en el método descrito por Chomczynski y
Sacchi [10]. Se trataron dos microgramos de ARN total con ADNasa
(Gibco-BRL) antes de la transcripción inversa con
M-MLV Reverse Transcriptase
(Gibco-BRL) en presencia de RNaseOUT
(Gibco-BRL). Se midió la expresión del ARN HCV y
del ARNm de la \beta-actina por PCR cuantitativa
en tiempo real usando un ICycler y la IQ SYBR Green Supermix
(Bio-Rad Laboratories). Se usaron alícuotas de 2
\mul del pool de ADNc para cada PCR, que contenía cebadores
sentido y antisentido específicos de la región no traducida 5' del
HCV o para el gen de la \beta-actina (Tabla 1) en
un volumen final de 20 \mul. Para determinar la especificidad de
los productos de PCR, se analizó la temperatura de disociación de
los mismos. Se normalizaron los resultados según la cuantificación
de \beta-actina en la misma muestra. Se expresó
la cantidad de ARN HCV por la fórmula 2^{ct (actina) -ct (HCV)},
siendo ct el punto al cual la fluorescencia sube apreciablemente por
encima de la fluorescencia de fondo.
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Claims (29)
1. Uso de al menos una citoquina de la familia
IL-6 - familia gp130 - o una secuencia de ADN que
la codifica, en la preparación de una composición farmacéutica para
la administración combinada con al menos un
interferón-alfa o una secuencia de ADN que lo
codifica, en el tratamiento de enfermedades virales.
2. Uso según la reivindicación 1
caracterizado porque la citoquina de la familia
IL-6 se ha seleccionado entre la
IL-6, la IL-11, el factor inhibidor
de la leucemia, oncostatina M, cardiotrofina-1,
factor neurotrófico ciliar, la citoquina semejante a la
cardiotrofina, y combinaciones de ellas.
3. Uso según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque la citoquina es la
cardiotrofina-1 o la oncostatina M.
4. Uso según la reivindicación 1,
caracterizado porque el interferón-alfa se
ha seleccionado entre el
interferón-alfa-2a,
interferón-alfa-2b,
interferón-alfa-5, interferón
consenso, interferón-alfa purificado,
interferón-alfa pegilado y combinaciones de los
mismos.
5. Uso según una de las reivindicaciones 1 ó 4,
caracterizado porque el interferón-alfa está
seleccionado entre
interferón-alfa-2b pegilado,
interferón-alfa-2a pegilado,
interferón-alfa-5 pegilado y
combinaciones de los mismos.
6. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque la citoquina de la familia
IL-6 está seleccionada entre la proteína nativa
completa, una secuencia polipeptídica parcial de dicha citoquina
que mantiene los efectos fisiológicos de la citoquina completa y
una secuencia polipeptídica que tenga una homología con dicha
citoquina nativa superior al 80% y que mantenga los efectos
fisiológicos de la citoquina completa.
7. Uso según la reivindicación 1,
caracterizado porque la enfermedad viral es una hepatitis
C.
8. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la
citoquina de la familia IL-6 y el
interferón-alfa son administrados separadamente en
composiciones farmacéuticas distintas.
9. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la
citoquina de la familia IL-6 y el
interferón-alfa son administrados conjuntamente en
una misma composición farmacéutica.
10. Una composición farmacéutica
caracterizada porque comprende una cantidad
farmacéuticamente aceptable de al menos una citoquina de la familia
IL-6 - familia gp130 -, o una secuencia de ADN que
la codifica, y una cantidad farmacéuticamente aceptable de al menos
un interferón-alfa, o una secuencia de ADN que lo
codifica.
11. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 10, caracterizada porque la citoquina de la
familia IL-6 se ha seleccionado entre la
IL-6, la IL-11, el factor inhibidor
de la leucemia, oncostatina M, cardiotrofina-1,
factor neurotrófico ciliar, la citoquina semejante a la
cardiotrofina y combinaciones de las mismas.
12. Una composición farmacéutica según una de
las reivindicaciones 10 ó 11, caracterizada porque la
citoquina de la familia IL-6 es
cardiotrofina-1 u oncostatina M.
13. Una composición farmacéutica según una de
las reivindicaciones 10 a 12, caracterizada porque la
citoquina de la familia IL-6 está seleccionada entre
la proteína nativa completa, una secuencia polipeptídica parcial
de dicha citoquina que mantiene los efectos fisiológicos de la
citoquina completa y una secuencia polipeptídica que tenga una
homología con dicha citoquina nativa superior al 80% y que mantenga
los efectos fisiológicos de la citoquina completa.
14. Una composición farmacéutica según una de
las reivindicaciones 10 a 13, caracterizada porque el
interferón-alfa se ha seleccionado entre el
interferón-alfa-2a,
interferón-alfa-2b,
interferón-alfa-5, interferón
consenso, interferón-alfa purificado,
interferón-alfa pegilado y combinaciones de los
mismos.
15. Una composición farmacéutica según una de
las reivindicaciones 10 a 14, caracterizada porque el
interferón-alfa está seleccionado entre
interferón-alfa-2b pegilado,
interferón-alfa-2a pegilado,
interferón-alfa-5 pegilado y
combinaciones de los mismos.
16. Una composición farmacéutica según una de
las reivindicaciones 10 a 15, caracterizada porque además
comprende al menos un excipiente farmacéuticamente compatible con
la citoquina de la familia IL-6, o con la secuencia
de ADN que la codifica, y con el interferón-alfa, o
con la secuencia de ADN que lo codifica.
17. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 10, caracterizada porque la citoquina de la
familia IL-6 y el interferón-alfa
están vehiculizados en sendos agentes vehiculizantes.
18. Un kit farmacéutico para el tratamiento de
una enfermedad viral, caracterizado porque comprende al
menos:
- un primer componente que comprende al menos
una citoquina de la familia IL-6 -familia gp130- o
una secuencia de ADN que codifica dicha citoquina; y
- un segundo componente que comprende al menos
un interferón-alfa o una secuencia que codifica
dicho interferón-alfa.
19. Un kit según la reivindicación 18,
caracterizado porque la citoquina de la familia
IL-6 se ha seleccionado entre la
IL-6, la IL-11, el factor inhibidor
de la leucemia, oncostatina M, cardiotrofina-1,
factor neurotrófico ciliar, la citoquina semejante a la
cardiotrofina y combinaciones de las mismas.
20. Un kit según la reivindicación 18 ó 19,
caracterizado porque la citoquina de la familia
IL-6 es cardiotrofina-1 u
oncostatina M.
21. Un kit según una de las reivindicaciones 18
a 20, caracterizado porque la citoquina de la familia
IL-6 está seleccionada entre la proteína nativa
completa, una secuencia polipeptídica parcial de dicha citoquina
que mantiene los efectos fisiológicos de la citoquina completa y
una secuencia polipeptídica que tenga una homología con dicha
citoquina nativa superior al 80% y que mantenga los efectos
fisiológicos de la citoquina completa.
22. Un kit según la reivindicación 18,
caracterizado porque el interferón-alfa se ha
seleccionado entre el
interferón-alfa-2a,
interferón-alfa-2b,
interferón-alfa-5, interferón
consenso, interferón-alfa purificado,
interferón-alfa pegilado y combinaciones de los
mismos.
23. Un kit según la reivindicación 18,
caracterizado porque el interferón-alfa se
ha seleccionado entre
interferón-alfa-2b pegilado,
interferón-alfa-2a pegilado,
interferón-alfa-5 pegilado y
combinaciones de los mismos.
24. Un kit según una de las reivindicaciones 18
a 23, caracterizado porque comprende además un tercer
componente que comprende uno o más excipientes farmacéuticamente
compatibles con la citoquina de la familia IL-6, o
la secuencia de ADN que la codifica, y con el
interferón-alfa o la secuencia de ADN que lo
codifica.
25. Un kit según una de las reivindicaciones 18
a 24, caracterizado porque comprende además un tercer
componente que comprende uno o más agentes vehiculizantes
farmacéuticamente compatibles con la citoquina de la familia
IL-6 y con el interferón-alfa.
26. Un kit según la reivindicación 18,
caracterizado porque el primer componente comprende además
al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable y compatible con
la citoquina de la familia IL-6 y con el
interferón-alfa.
27. Un kit según la reivindicación 18,
caracterizado porque el segundo componente comprende además
uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y compatibles
con la citoquina de la familia IL-6 y con el
interferón-alfa.
28. Un kit según la reivindicación 18,
caracterizado porque el primer y el segundo componente están
presentes en composiciones farmacéuticas separadas.
29. Un kit según la reivindicación 18,
caracterizado porque el primer y el segundo componente están
presentes en una misma composición farmacéutica.
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