JPH04218000A - 修飾ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、インターロイキン６（以下ＩＬ−６という）
活性を有する糖蛋白質またはポリペプチドにおいて、ポ
リペプチド分子中の少なくとも１個のアミノ基またはカ
ルボキシル基を化学修飾して得られる化学修飾ＩＬ−６
、その製造方法、およびこの化学修飾ＩＬ−６の血小板
形成促進剤としての用途に関する。

ここでＩＬ−６活性とは、Ｂリンパ球の最後の分化に関
わる活性であり、同時にＴリンパ球１）、形質細胞．多
発性骨髄腫細胞２）、肝細胞３）、神経細胞４）、造血
幹細胞５）の細胞系列に対する刺激作用あるいは急性期
反応の制御６）などを総合したものである。

１）Ｇａｒｍａｎ，Ｒ．Ｄ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７６２９
，１９８７． ２）Ｖａｎ　Ｓｎｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．，１６５：６４１，１９８７． ３）Ｇａｕｌｄｉｅ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７２５１，
１９８７． ４）Ｓｅｅｄ，Ｂ．ａｎｄ　Ａｒｕｆｆｏ，Ａ．，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｌ．ＵＳＡ，８４：３
３６５，１９８７．５）Ｉｋｅｂｕｔｉ，Ｋ．，実験医
学，第７巻，Ｎｏ．１：３１，１９８９． ６）Ａｎｄｕｓ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，実験医学，第７巻
，Ｎｏ．１：３７，１９８９． また造血細胞系への作用に関しては、最近報告された血
小板形成促進作用も、本発明のＩＬ−６活性として挙げ
ることができる（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ，Ｔ．ｅｔａｌ．
，ＢＬＯＯＤ，７４，Ｎｏ．４，１９８９）。抗ガン剤
を高投与された担ガン患者においては血中の血小板数が
極度に低下することがあり、このような場合血小板数低
下に起因する種々の障害、例えば異常出血（出血過多等
）がおこり易くなる。ＩＬ−６の血小板形成能は、これ
らの抗ガン剤の投与に伴う副作用を軽減させることが期
待される（ＭｃＮｉｅｃｅ，Ｉ．Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｅ
ｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１６：８０７，１９８８）。

本発明の化学修飾ＩＬ−６は、既知のＩＬ−６活性を有
する糖蛋白質またはポリペプチドより優れた機能を有し
ており、医薬品として利用できる。

［従来の技術］ ＩＬ−６活性を有する糖蛋白質またはポリペプチドの一
例として、ヒトＩＬ−６（以下ｈＩＬ−６という）の製
造技術については、既に多くの報告がある。例えば、遺
伝子組換え技術によらない方法としては、ヒトＴ細胞と
ヒト癌細胞とのヒトＴ融合細胞による生産方法（Ｏｋａ
ｄａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５７：
５８３，１９８３）、あるいはヒトＴ細胞白血球ウィル
スにより形質転換されたヒトＴ細胞による生産方法（特
開昭６１−１１５０２４号）が挙げられる。また遺伝子
組換え技術による方法としては、ｈＩＬ−６をコードす
るＤＮＡにより形質転換された哺乳動物細胞あるいは細
菌による生産方法も確立されている（特開昭６３−４２
６８８号、特開昭６３−１５７９９６号、特表平１−５
０３３５４号）。これらの方法で生産されるｈＩＬ−６
は、生産細胞が哺乳動物細胞である場合には糖蛋白質と
して、細菌細胞である場合にはポリペプチドとして、そ
れぞれ生産されるが、いずれのものもＩＬ−６活性を有
している（特開昭６３−４２６８８号、特開昭６３−１
５７９９６号、特表平１−５０３３５４号）。

ｈＩＬ−６のｃＤＮＡ塩基配列より決定した成熟ポリペ
プチド部分は本来１８４個のアミノ酸残基からなってい
るが、そのＮ末端において１以上のアミノ酸残基の付加
あるいは２７アミノ酸残基の欠失があるもの、またはそ
のＣ末端において約５０アミノ酸残基の欠失（あるいは
有害とならない置、）があるものも、依然として活性を
有していることが知られている（特開昭６３−１５７９
９６号、特表平１−５０３３５４号、欧州特許公開０３
６３０８３号、Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆ，Ｊ．Ｐ．Ｊ．，
Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３：１７５，１９８９）。

一般に高分子のポリペプチドを医薬として用いる場合に
その血中滞留時間を増加させるための方法としては、ポ
リエチレングリコール化、デキストラン修飾、グルタミ
ン酸とリジンのポリマー７）、プルラン化、ガンマグロ
ブリン化、ポリアスパラギン酸誘導体修飾８）、スマン
クス化９）、脂肪酸修飾１０）などが知られている。ま
たアスパラギナーゼ、スーパーオキサイドディスムター
ゼ、ウリカーゼなどのヒト以外の由来の酵素類について
、ポリエチレングリコールで化学修飾を行うことにより
血中クリアランス値の延長が認められている。

７）Ｌｉｕ，Ｆ．Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ，１８：６９０，１９７９． ８）Ｏｋａｄａ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．．Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ
ｓ．ＡｌｌｅｒｇｙＡｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎ．，６６：１
８９，１９８１．９）前田浩ら、癌と化学療法、１１：
８１４，１９８４．１０）Ｓａｇａｗａ，Ａ．ｅｔ　ａ
ｌ．，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈｓ．ＡｌｌｅｒｇｙＡｐｐｌ．
Ｉｍｍｕｎ．，７６：７９，１９８５．［発明が解決し
ようとする課題］ ＩＬ−６を生体に投与した場合、血中半減期が非常に短
いことが明らかとなっている（Ｃａｓｔｅｌｌ，Ｊ．Ｖ
．ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７
７：３５７，１９８８）。

したがって、ＩＬ−６の血中での半減期を延長させ、そ
の薬効の持続をはかることが望ましいが、しかしながら
、そのような性質を持つＩＬ−６活性を有する分子は、
いまだ開発されていない。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、ＩＬ−６活性を有するポリペプチドの分
子中の少なくとも１個のアミノ基を化学修飾することに
より、未修飾のＩＬ−６に比較して生体内に投与される
際の血小板形成促進活性が増強されることを見い出し、
この知見を基礎として本発明を完成するに至った。すな
わち、本発明は、霊長類、特にヒトにおけるＩＬ−６活
性を有する糖蛋白質またはポリペプチド（好ましくはポ
リペプチド）にポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧ
という）を結合してなる化学修飾ＩＬ−６、その製造方
法、およびこの化学修飾ＩＬ−６の血小板形成促進剤と
しての用途に関するものである。

以下に本発明を詳細に説明する。

ＩＬ−６活性を有する分子にＰＥＧを結合させる態様と
しては、ポリペプチドのアミノ酸のアミノ基を介する態
様と、アミノ酸のカルボキシル基を介する態様があり、
いずれでもよいが、特に前者が好ましい。このアミノ基
を介する態様においては、ＩＬ−６活性を有する分子中
の少なくとも１個のアミノ基の水素原子を、以下に示す
式［Ｉ］または式［ＩＩ］で表される基で置換する。

（式中、ｎは７ないし６００の正の整数を、Ｒ１は炭素
数１ないし３のアルキル基を示す。）（式中、ｎ，ｍは
同一または異なる７ないし６００の正の整数を、Ｒ１，
Ｒ２は同一または異なる炭素数１ないし３のアルキル基
を示す。） 本発明におけるＩＬ−６活性を有する糖蛋白質あるいは
ポリペプチドとして好ましいのは、実質的に次のアミノ
酸配列を有するヒトＩＬ−６であり、その生産にあたっ
ては、遺伝子組換えによる方法あるいはそれによらない
方法のいずれをも用いることができる。

ＡＬＡ　ＰＲＯ　ＶＡＬ　ＰＲＯ　ＰＲＯ　ＧＬＹ　Ｇ
ＬＵ　ＡＳＰ　ＳＥＲ　ＬＹＳＡＳＰ　ＶＡＬ　ＡＬＡ
　ＡＬＡ　ＰＲＯ　ＨＩＳ　ＡＲＧ　ＧＬＮ　ＰＲＯ　
ＬＥＵＴＨＲ　ＳＥＲ　ＳＥＲ　ＧＬＵ　ＡＲＧ　ＩＬ
Ｅ　ＡＳＰ　ＬＹＳ　ＧＬＮ　ＩＬＥＡＲＧ　ＴＹＲ　
ＩＬＥ　ＬＥＵ　ＡＳＰ　ＧＬＹ　ＩＬＥ　ＳＥＲ　Ａ
ＬＡ　ＬＥＵＡＲＧ　ＬＹＳ　ＧＬＵ　ＴＨＲ　ＣＹＳ
　ＡＳＮ　ＬＹＳ　ＳＥＲ　ＡＳＮ　ＭＥＴＣＹＳ　Ｇ
ＬＵ　ＳＥＲ　ＳＥＲ　ＬＹＳ　ＧＬＵ　ＡＬＡ　ＬＥ
Ｕ　ＡＬＡ　ＧＬＵＡＳＮ　ＡＳＮ　ＬＥＵ　ＡＳＮ　
ＬＥＵ　ＰＲＯ　ＬＹＳ　ＭＥＴ　ＡＬＡ　ＧＬＵＬＹ
Ｓ　ＡＳＰ　ＧＬＹ　ＣＹＳ　ＰＨＥ　ＧＬＮ　ＳＥＲ
　ＧＬＹ　ＰＨＥ　ＡＳＮＧＬＵ　ＧＬＵ　ＴＨＲ　Ｃ
ＹＳ　ＬＥＵ　ＶＡＬ　ＬＹＳ　ＩＬＥ　ＩＬＥ　ＴＨ
ＲＧＬＹ　ＬＥＵ　ＬＥＵ　ＧＬＵ　ＰＨＥ　ＧＬＵ　
ＶＡＬ　ＴＹＲ　ＬＥＵ　ＧＬＵＴＹＲ　ＬＥＵ　ＧＬ
Ｎ　ＡＳＮ　ＡＲＧ　ＰＨＥ　ＧＬＵ　ＳＥＲ　ＳＥＲ
　ＧＬＵＧＬＵ　ＧＬＮ　ＡＬＡ　ＡＲＧ　ＡＬＡ　Ｖ
ＡＬ　ＧＬＮ　ＭＥＴ　ＳＥＲ　ＴＨＲＬＹＳ　ＶＡＬ
　ＬＥＵ　ＩＬＥ　ＧＬＮ　ＰＨＥ　ＬＥＵ　ＧＬＮ　
ＬＹＳ　ＬＹＳＡＬＡ　ＬＹＳ　ＡＳＮ　ＬＥＵ　ＡＳ
Ｐ　ＡＬＡ　ＩＬＥ　ＴＨＲ　ＴＨＲ　ＰＲＯＡＳＰ　
ＰＲＯ　ＴＨＲ　ＴＨＲ　ＡＳＮ　ＡＬＡ　ＳＥＲ　Ｌ
ＥＵ　ＬＥＵ　ＴＨＲＬＹＳ　ＬＥＵ　ＧＬＮ　ＡＬＡ
　ＧＬＮ　ＡＳＮ　ＧＬＮ　ＴＲＰ　ＬＥＵ　ＧＬＮＡ
ＳＰ　ＭＥＴ　ＴＨＲ　ＴＨＲ　ＨＩＳ　ＬＥＵ　ＩＬ
Ｅ　ＬＥＵ　ＡＲＧ　ＳＥＲＰＨＥ　ＬＹＳ　ＧＬＵ　
ＰＨＥ　ＬＥＵ　ＧＬＮ　ＳＥＲ　ＳＥＲ　ＬＥＵ　Ａ
ＲＧＡＬＡ　ＬＥＵ　ＡＲＧ　ＧＬＮ　ＭＥＴここで「
実質的」とは、アミノ酸配列が同一である場合のほかに
、天然ｈＩＬ−６タンパクとの間に有害な機能的非類似
性を生じさせないような１以上のアミノ酸変化（すなわ
ち欠失、付加、挿入、置換）を含みうることを意味する
。このようなアミノ酸変化の例としては、前述の従来技
術に挙げたｈＩＬ−６（特開昭６３−１５７９９６号、
特表平１−５０３３５４号および欧州特許公開０３６３
０８３号参照）がある。

それらの中でも、遺伝子組換え大腸菌により産生された
ｈＩＬ−６が、純度よく均質大量に入手できるので好ま
しい。特に、前記アミノ酸配列あるいはそのＮ末端にメ
チオニン残基又はメチオニン−リジン・ジペプチドが付
加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがさらに好
ましい。

上記のｈＩＬ−６は、例えば特表平１−５０３３５４（
ジェネティックス・インスティテュート・インコーポレ
イテッド）に開示の方法に従い得ることができ、またｈ
ＩＬ−６遺伝子の塩基配列（例えばＨａｅｇｅｍａｎ，
Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１
５９：６２５，１９８６）を参考に、Ｓｏｕｚａらの方
法（特表昭６３−５００６３６号）に準じて、ｈＩＬ−
６のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを化学合成し、大
腸菌に組み込み発現させて得ることができる。

本発明に用いられる化学修飾基に関し、上式中、ｍ、ｎ
はそれぞれの平均値を示す。ｍおよびｎは同一でも異な
っていてもよいが、ｍとｎが同一であって約７ないし６
００、好ましくは約７ないし２５０、さらに好ましくは
約３０ないし１５０であるのがよい。

本発明で用いられるＰＥＧとしては、平均分子量３００
ないし３００００のものが好ましい。中でも平均分子量
１０００ないし２００００のものがさらに好ましい。

上式中、Ｒ１、Ｒ２、で示される水酸基の保護基として
は、例えば炭素数１ないし３のアルキル基（例えば、メ
チル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基な
ど）が挙げられ、とりわけメチル基が好ましい。

ＩＬ−６活性を有するポリペプチド（以下ＩＬ−６ポリ
ペプチドという）のアミノ基をＰＥＧで修飾するには、
ＰＥＧをスクシニルイミドを介して結合させる方法（式
［Ｉ］）とトリアジンを介して結合させる方法（式［Ｉ
Ｉ］）との２種類の方法が考えられるが、前者がより好
ましい。

スクシニルイミドを介する修飾方法としては、一般式 （式中、ｎおよびＲ１は前記と同じ意味である）で表さ
れるＰＥＧと、式 で表される化合物を反応させ、 （式中、ｎおよびＲ１は前記と同じ意味である）で表さ
れる化合物を得、ついでこれにＩＬ−６ポリペプチドを
反応させることにより行われる。化合物［ＩＩＩ］と［
ＩＶ］を反応させ［Ｖ］を得る操作は、ほぼ１００％反
応の終了した形態で化学試薬活性型ＰＥＧ（日本油脂）
として販売されているため、これを使用することができ
る。

活性型ＰＥＧすなわち化合物［Ｖ］とＩＬ−６ポリペプ
チドを反応させ、修飾ＩＬ−６を得るためには、例えば
０．２５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０−８．
５）中で化合物［Ｖ］と４℃で１時間〜２時間反応させ
る。この場合、活性型ＰＥＧの分解を避けるために、活
性型ＰＥＧを数度に分けて添加してもよい。反応終了後
、修飾ＩＬ−６を得るため、例えば水溶液中でのゲル濾
過およびイオン交換クロマトグラフィーを用いて未反応
の化合物［Ｖ］および未反応のＩＬ−６ポリペプチドを
分離除去する。

次にトリアジンを介して修飾する方法としては、一般式 ［ＩＩＩ］ （式中、ｎおよびＲ１は前記と同じ意味である）で表さ
れるＰＥＧと、 で表される化合物を反応させ、一般式 （式中、ｎ，ｍは同一または異なる７ないし６００のの
正の整数を、Ｒ１、Ｒ２は同一または異なる炭素数１な
いし３のアルキル基を示す。） で表される化合物を得、ついでこれにＩＬ−６ポリペプ
チドを反応させることにより行われる。化合物［ＩＩＩ
］と［ＶＩ］を反応させ［ＶＩＩ］を得る操作は、ほぼ
１００％反応の終了した形態で化学試薬（生化学工業）
活性型ＰＥＧとして販売されているため、これを使用す
ることができる。

活性型ＰＥＧすなわち化合物［ＶＩＩ］とＩＬ−６ポリ
ペプチドを反応させ、修飾ＩＬ−６を得るためには、例
えば０．２５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０
）中で化合物［ＩＩＩ］と４０℃〜室温で２〜２０時間
反応させる。この場合、活性型ＰＥＧの分解を避けるた
めに、数度に分けて活性型ＰＥＧを添加してもよい。反
応終了後、修飾ＩＬ−６を得るため、例えば水溶液中で
のゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーを用い
て未反応の化合物［ＶＩＩ］および未反応のＩＬ−６ポ
リペプチドを分離除去する。

ＩＬ−６ポリペプチドのカルボキシル基をＰＥＧで修飾
するには、例えば、 一般式 （式中、ｎは前記と同じ意味である） で表される活性ＰＥＧを反応させればよい。

本発明のＰＥＧ修飾ＩＬ−６は、マウスに投与した時、
もとの未修飾のＩＬ−６ポリペプチドあるいは糖鎖の付
加したＩＬ−６よりもはるかに優れた血小板増加活性を
有し、しかも毒性は低いので血小板形成促進剤として有
効に用いることができる。

本発明のＰＥＧ修飾ＩＬ−６を血小板形成促進剤として
用いるには、例えば哺乳動物の各種急性もしくは亜急性
の血球低下の治療を目的として経口的もしくは非経口的
に投与する。

投与するにあたっては、ＰＥＧ修飾ＩＬ−６を薬理学的
に許容しうる賦形剤、希釈剤などと混合し、それ自体公
知の方法で、すなわち経口剤として例えば錠剤、カプセ
ル剤として、あるいは注射剤として上記哺乳動物に投与
する。

ＰＥＧ修飾ＩＬ−６の１日投与量は、修飾ＩＬ−６中の
タンパク質量として約５μｇないし５００ｍｇ／ヒト、
さらに好ましくは約２００μｇないし５０ｍｇ／ヒトと
なる修飾ＩＬ−６の量である。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するがこ
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。

実施例１ ｈＩＬ−６遺伝子の塩基配列（例えばＨａｅｇｅｍａｎ
，Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
１５９：６２５，１９８６）を参考に、Ｓｏｕｚａらの
方法（特表昭６３−５００６３６号）に準して、下記の
アミノ酸配列をコードするＤＮＡを化学合成し、大腸菌
に組み込み発現させた。

ＭＥＴ　ＡＬＡ　ＰＲＯ　ＶＡＬ　ＰＲＯ　ＰＲＯ　Ｇ
ＬＹ　ＧＬＵ　ＡＳＰ　ＳＥＲＬＹＳ　ＡＳＰ　ＶＡＬ
　ＡＬＡ　ＡＬＡ　ＰＲＯ　ＨＩＳ　ＡＲＧ　ＧＬＮ　
ＰＲＯＬＥＵ　ＴＨＲ　ＳＥＲ　ＳＥＲ　ＧＬＵ　ＡＲ
Ｇ　ＩＬＥ　ＡＳＰ　ＬＹＳ　ＧＬＮＩＬＥ　ＡＲＧ　
ＴＹＲ　ＩＬＥ　ＬＥＵ　ＡＳＰ　ＧＬＹ　ＩＬＥ　Ｓ
ＥＲ　ＡＬＡＬＥＵ　ＡＲＧ　ＬＹＳ　ＧＬＵ　ＴＨＲ
　ＣＹＳ　ＡＳＮ　ＬＹＳ　ＳＥＲ　ＡＳＮＭＥＴ　Ｃ
ＹＳ　ＧＬＵ　ＳＥＲ　ＳＥＲ　ＬＹＳ　ＧＬＵ　ＡＬ
Ａ　ＬＥＵ　ＡＬＡＧＬＵ　ＡＳＮ　ＡＳＮ　ＬＥＵ　
ＡＳＮ　ＬＥＵ　ＰＲＯ　ＬＹＳ　ＭＥＴ　ＡＬＡＧＬ
Ｕ　ＬＹＳ　ＡＳＰ　ＧＬＹ　ＣＹＳ　ＰＨＥ　ＧＬＮ
　ＳＥＲ　ＧＬＹ　ＰＨＥＡＳＮ　ＧＬＵ　ＧＬＵ　Ｔ
ＨＲ　ＣＹＳ　ＬＥＵ　ＶＡＬ　ＬＹＳ　ＩＬＥ　ＩＬ
ＥＴＨＲ　ＧＬＹ　ＬＥＵ　ＬＥＵ　ＧＬＵ　ＰＨＥ　
ＧＬＵ　ＶＡＬ　ＴＹＲ　ＬＥＵＧＬＵ　ＴＹＲ　ＬＥ
Ｕ　ＧＬＮ　ＡＳＮ　ＡＲＧ　ＰＨＥ　ＧＬＵ　ＳＥＲ
　ＳＥＲＧＬＵ　ＧＬＵ　ＧＬＮ　ＡＬＡ　ＡＲＧ　Ａ
ＬＡ　ＶＡＬ　ＧＬＮ　ＭＥＴ　ＳＥＲＴＨＲ　ＬＹＳ
　ＶＡＬ　ＬＥＵ　ＩＬＥ　ＧＬＮ　ＰＨＥ　ＬＥＵ　
ＧＬＮ　ＬＹＳＬＹＳ　ＡＬＡ　ＬＹＳ　ＡＳＮ　ＬＥ
Ｕ　ＡＳＰ　ＡＬＡ　ＩＬＥ　ＴＨＲ　ＴＨＲＰＲＯ　
ＡＳＰ　ＰＲＯ　ＴＨＲ　ＴＨＲ　ＡＳＮ　ＡＬＡ　Ｓ
ＥＲ　ＬＥＵ　ＬＥＵＴＨＲ　ＬＹＳ　ＬＥＵ　ＧＬＮ
　ＡＬＡ　ＧＬＮ　ＡＳＮ　ＧＬＮ　ＴＲＰ　ＬＥＵＧ
ＬＮ　ＡＳＰ　ＭＥＴ　ＴＨＲ　ＴＨＲ　ＨＩＳ　ＬＥ
Ｕ　ＩＬＥ　ＬＥＵ　ＡＲＧＳＥＲ　ＰＨＥ　ＬＹＳ　
ＧＬＵ　ＰＨＥ　ＬＥＵ　ＧＬＮ　ＳＥＲ　ＳＥＲ　Ｌ
ＥＵＡＲＧ　ＡＬＡ　ＬＥＵ　ＡＲＧ　ＧＬＮ　ＭＥＴ
上記ｈＩＬ−６を菌体内に蓄積した大腸菌の細胞を、３
５００×ｇで１０分間遠心分離して３００ｇ回収し、特
開昭６３−１５７９９６号の方法に従ってｈＩＬ−６の
抽出、可溶化、リフォールディングを行い、ｈＩＬ−６
約２．９ｇを得た。得られたｈＩＬ−６をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで調べたところ、単一バンドであり、かつアミノ酸
組成から計算された分子量２１Ｋとほぼ一致していた。

ＰＥＧとしては、平均分子量が約４５００のＰＥＧのコ
ハク酸エステルをＮ−ヒドロキシスクシニルイミドによ
り活性化したＮ−ヒドロキシスクシニルイミドポリエチ
レングリコール（サンブライトＭ−４１０１、日本油脂
製）（以下活性型ＰＥＧ１という）を使用した。

ｈＩＬ−６の２００μｇを０．２５Ｍホウ酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ８．５）３７０μｌ中で、活性型ＰＥＧ１
．５ｍｇと４℃で２時間反応させ、２Ｎ塩酸でｐＨを低
下させて反応を停止した。活性型ＰＥＧの量は、ｈＩＬ
−６の遊離アミノ基の量に対して２倍量を用いた。

生成物をＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で平衡化したゲル
濾過カラムに適用して緩衝液交換を行い、以下の分離操
作に供した。

ゲル濾過後のサンプル３．５ｍｌを高速液体クロマトグ
ラフィーのゲル濾過用カラムに適用した。１分子ないし
３分子のＰＥＧが１分子のｈＩＬ−６に結合したＰＥＧ
修飾ＩＬ−６ポリペプチドは第一ピークに溶出され、そ
の収量は２０μｇであった。

上記の分離工程で得られた第一ピークのＰＥＧ修飾ｈＩ
Ｌ−６ポリペプチドを、ＰＥＧ（４５００）ＩＬ−６と
呼ぶ。

実施例２ 実施例１で作製したＰＥＧ（４５００）ＩＬ−６の特徴
付けをＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の推定によって行
った。

反応物の分子量測定は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ファースト
システム；ファルマシア社製、１０−１５％グラジエン
トゲル、銀染色）上で行った。分子量マーカーには、バ
イオラット社製を使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を
第１図に示す。ＰＥＧ（４５００）ＩＬ−６の見かけ上
の分子量は（結合数の少ないものから）２３Ｋ、３７Ｋ
，５０Ｋであった。

実施例３ 修飾に用いたＩＬ−６ポリペプチドは、実施例１に示し
たものと同じである。ＰＥＧは、平均分子量５，０００
のポリエチレングリコールモノメチルエーテル２分子と
塩化シアヌルより合成された平均分子量１００００の活
性型ポリエチレングリコール（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｐ
ＥＧ２，生化学工業社製）（以下活性型ＰＥＧ２という
）を使用した。ｈＩＬ−６の２００μｇを０．２５Ｍホ
ウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）３７０μｌ中で
活性型ＰＥＧ２３．５ｍｇと室温で２時間反応させ、２
Ｎ塩酸によってｐＨを低下させて反応を停止した。

活性型ＰＥＧ２の量は、ｈＩＬ−６の遊離アミノ基の量
に対して約２倍量を用いた。生成物をＰＢＳで平衡化し
たゲル濾過カラムに適用して緩衝液交換を行い実施例１
と同様の分離操作の後、１分子ないし２分子のＰＥＧが
結合したＩＬ−６２０μｇを分離し、生理活性測定用の
サンプルとして使用した。

実施例２と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にて分子量の推定
を行ったところ、その分子量は２８Ｋ、４２Ｋであった
。（第１図参照）上記の分離操作で得られた第一ピーク
のＰＥＧ修飾ｈＩＬ−６をＰＥＧ（１００００）ＩＬ−
６と呼ぶ。

実施例４ （１）ｈＩＬ−６遺伝子の塩基配列（例えばＨａｅｇｅ
ｍａｎ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，１５９：６２５，１９８６）を参考に、Ｓｏｕｚ
ａらの方法（特表昭６３−５００６３６号）に準じて、
下記のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを化学合成し、
大腸菌に組み込み発現させた。なお、このアミノ酸配列
の特徴として、そのＮ末端のアミノ酸配列がＭｅｔ　Ｌ
ｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ…となっており、後述するように
カテプシンＣ処理によりＭｅｔ　Ｌｙｓを切除すること
によって、Ｎ末端がＡｌａから始まるｈＩＬ−６を製造
できる。

ＭＥＴ　ＬＹＳ　ＡＬＡ　ＰＲＯ　ＶＡＬ　ＰＲＯ　Ｐ
ＲＯ　ＧＬＹ　ＧＬＵ　ＡＳＰＳＥＲ　ＬＹＳ　ＡＳＰ
　ＶＡＬ　ＡＬＡ　ＡＬＡ　ＰＲＯ　ＨＩＳ　ＡＲＧ　
ＧＬＮＰＲＯ　ＬＥＵ　ＴＨＲ　ＳＥＲ　ＳＥＲ　ＧＬ
Ｕ　ＡＲＧ　ＩＬＥ　ＡＳＰ　ＬＹＳＧＬＮ　ＩＬＥ　
ＡＲＧ　ＴＹＲ　ＩＬＥ　ＬＥＵ　ＡＳＰ　ＧＬＹ　Ｉ
ＬＥ　ＳＥＲＡＬＡ　ＬＥＵ　ＡＲＧ　ＬＹＳ　ＧＬＵ
　ＴＨＲ　ＣＹＳ　ＡＳＮ　ＬＹＳ　ＳＥＲＡＳＮ　Ｍ
ＥＴ　ＣＹＳ　ＧＬＵ　ＳＥＲ　ＳＥＲ　ＬＹＳ　ＧＬ
Ｕ　ＡＬＡ　ＬＥＵＡＬＡ　ＧＬＵ　ＡＳＮ　ＡＳＮ　
ＬＥＵ　ＡＳＮ　ＬＥＵ　ＰＲＯ　ＬＹＳ　ＭＥＴＡＬ
Ａ　ＧＬＵ　ＬＹＳ　ＡＳＰ　ＧＬＹ　ＣＹＳ　ＰＨＥ
　ＧＬＮ　ＳＥＲ　ＧＬＹＰＨＥ　ＡＳＮ　ＧＬＵ　Ｇ
ＬＵ　ＴＨＲ　ＣＹＳ　ＬＥＵ　ＶＡＬ　ＬＹＳ　ＩＬ
ＥＩＬＥ　ＴＨＲ　ＧＬＹ　ＬＥＵ　ＬＥＵ　ＧＬＵ　
ＰＨＥ　ＧＬＵ　ＶＡＬ　ＴＹＲＬＥＵ　ＧＬＵ　ＴＹ
Ｒ　ＬＥＵ　ＧＬＮ　ＡＳＮ　ＡＲＧ　ＰＨＥ　ＧＬＵ
　ＳＥＲＳＥＲ　ＧＬＵ　ＧＬＵ　ＧＬＮ　ＡＬＡ　Ａ
ＲＧ　ＡＬＡ　ＶＡＬ　ＧＬＮ　ＶＥＴＳＥＲ　ＴＨＲ
　ＬＹＳ　ＶＡＬ　ＬＥＵ　ＩＬＥ　ＧＬＮ　ＰＨＥ　
ＬＥＵ　ＧＬＮＬＹＳ　ＬＹＳ　ＡＬＡ　ＬＹＳ　ＡＳ
Ｎ　ＬＥＵ　ＡＳＰ　ＡＬＡ　ＩＬＥ　ＴＨＲＴＨＲ　
ＰＲＯ　ＡＳＰ　ＰＲＯ　ＴＨＲ　ＴＨＲ　ＡＳＮ　Ａ
ＬＡ　ＳＥＲ　ＬＥＵＬＥＵ　ＴＨＲ　ＬＹＳ　ＬＥＵ
　ＧＬＮ　ＡＬＡ　ＧＬＮ　ＡＳＮ　ＧＬＮ　ＴＲＰＬ
ＥＵ　ＧＬＮ　ＡＳＰ　ＭＥＴ　ＴＨＲ　ＴＨＲ　ＨＩ
Ｓ　ＬＥＵ　ＩＬＥ　ＬＥＵＡＲＧ　ＳＥＲ　ＰＨＥ　
ＬＹＳ　ＧＬＵ　ＰＨＥ　ＬＥＵ　ＧＬＮ　ＳＥＲ　Ｓ
ＥＲＬＥＵ　ＡＲＧ　ＡＬＡ　ＬＥＵ　ＡＲＧ　ＧＬＮ
　ＭＥＴ上記ｈＩＬ−６を菌体内に蓄積した大腸菌の細
胞を、３５００×ｇで１０分間遠心分離して３００ｇ回
収し、特開昭６３−１５７９９６号の方法に従ってｈＩ
Ｌ−６の抽出、可溶化、リフォールディングを行なった
。２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に対し緩衝液交換を行
った後、カテプシンＣ（ベーリンガーマンハイム社）を
６単位加えて、室温で１時間混合した。急冷した後、最
終２ｍＭになるようにリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６
．０）を添加し、ヒドロキシアパタイトカラムクロマト
グラフィーで処理した。ヒドロキシアパタイトカラムは
２ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（１３００ｍｍｈｏ、ｐ
Ｈ６．０）で予め平衡化しておき、同緩衝液で溶出を行
ってピーク画分１２００ｍｌを分取した。次にこの画分
を、ＣＭセファロースカラムクロマトグラフィーで処理
した。ＣＭセファロースカラムは２０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化しておき、試料を
加え同緩衝液で洗浄したのち、０−０．３Ｍ　ＮａＣｌ
、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の直線
勾配で溶出させ、ピーク画分５８０ｍｌを分取した。

得られたピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べたところ
、単一バンドであり、かつアミノ酸組成から計算された
分子量２１Ｋとほぼ一致していた。またアミノ酸配列分
析により、予想されたＮ末端アミノ酸配列（すなわちＡ
ｌａ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ…）を確認した。

得られたｈＩＬ−６の収量は約１．５ｇであった。

（２）活性型ＰＥＧ１を使用して、上記（１）で調製し
たｈＩＬ−６のＰＥＧ修飾を行った。

０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）１００
ｍｌに溶解したｈＩＬ−６（１００ｍｇ）溶液に、氷浴
中で攪はんしなから、１１２５ｍｇの活性型ＰＥＧ１を
加えて反応させた。活性型ＰＥＧ１を全量一度あるいは
５回に分けて３０分毎に加えて比較したところ、分けて
加えた場合の方がＰＥＧ修飾の効率が高いことが観察さ
れた。そこで以下の精製過程には活性型ＰＥＧ１を分け
て加えて得た反応生成物を用いた。反応終了後、ＹＭ１
０限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて反応液を１０ｍ
ｌに濃縮し、これを予め２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ１００カ
ラムに適用した。同緩衝液を用いて溶離を行い、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ分析で見かけ上の分子量９１Ｋ、６８Ｋ、４
１Ｋ、２６Ｋを各々主バンドとする４つの画分を得た（
以下、これらの画分を順に、Ｆｒ４５−１、Ｆｒ４５−
２、Ｆｒ４５−３、Ｆｒ４５−４という）。各画分の収
量は、それぞれ２．９ｍｇ、４．０ｍｇ、２．９ｍｇ、
２．５ｍｇであった。

実施例５ 実施例４で調製した４つの画分についての特徴付けを、
未修飾アミノ基数測定およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分
子量測定によって行った。

未修飾アミノ基数の測定は、Ｓｔｏｃｋｓらの方法（Ａ
ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５４：２３２，１９８６
）に従って、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８
．０）中で７．５％Ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ（４−
ｐｈｅｎｙｌｓｐｉｒｏ［ｆｕｒａｎ−２（３Ｈ），１
′−ｐｈｔｈａｌａｎ］−３，３′−ｄｉｏｎｅ）と反
応させ、蛍光強度（λｅｘ＝３９０ｎｍ、λｅｍ＝４７
５ｎｍ）を測定することによって行った。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定は、１０−２０％グ
ラジエントゲル（第一化学製）を用いて行った。なお、
分子量マーカーには、ファルマシア社製（ＬｏｗＭｏｌ
ｅｃｕｌａｒ　Ｗｅｉｇｈｔ　Ｍａｋｅｒ）を用いた。

蛋白質バンドの検出はＣＢＢ染色により行った。各画分
中の各バンド含量の測定は、画像処理システムＭｏｄｅ
ｌＴＩＦ−６４（イムノメディカ社）を用いて行った。

結果を第１表に示す。

実施例６ 実施例４で調製した４つの画分について、Ｂ細胞系白血
病細胞ＳＫＷ６−ＣＬ４に対するＩｇＭ産生促進活性（
Ｈｉｒａｎｏ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：７２５１，１９８
５）を測定した。結果を第２表に示す。化学修飾ｈＩＬ
−６は、上記ＳＫＷ６−ＣＬ４に対するＩｇＭ畜生促進
活性を有していた。

実施例７ 遺伝子組換えにより大腸菌中で生産された実施例１のｈ
ＩＬ−６と、実施例１および実施例３でそれぞれ作製さ
れたＰＥＧ（４５００）ＩＬ−６およびＰＥＧ（１００
００）ＩＬ−６について、マウスへの投与による血小板
増加効果を調べた。Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週令、雌）
にＰＥＧ（４５００）ＩＬ−６、ＰＥＧ（１００００）
ＩＬ−６、ＰＥＧ（４５００）とｈＩＬ−６の混合物、
およびｈＩＬ−６をそれぞれ蛋白量（プロテインアッセ
イ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製にて測定）として１０μｇ／マ
ウスずつ１日１回、５日間皮下投与し、６日目に採血し
て末梢血中の血小板数を計数した。その結果を第２図に
示した。

第２図において、棒線は３匹の標準偏差値を表し、（　
）内の数字は無投与群の血小板数を１００としたときの
、各サンプル投与群の血小板数の相対値を示す。

ｈＩＬ−６およびｈＩＬ−６とＰＥＧ（４５００）の混
合物では、いずれも対照群に比べ約１５０％の血小板数
の増加を示したのに対し、ＰＥＧ（４５００）ＩＬ−６
、ＰＥＧ（１００００）ＩＬ−６はいずれも約２２０％
の血小板数増加を示した。

実施例８ 遺伝子組換えにより大腸菌中て生産された実施例４のｈ
ＩＬ−６と、そのＰＥＧ修飾体（Ｆｒ４５−１からＦｒ
４５−４）を、Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週令、雌；ｎ＝
４）の皮下に１日１回５日間投与し、最終投与翌日に採
血して末梢血中の血小板数を計数した。その結果を第３
表に示した。

未修飾ｈＩＬ−６に比べそのＰＥＧ修飾体は、明らかに
有意な血小板増加効果を示した。

実施例９ （１）遺伝子組換えにより大腸菌中で生産された実施例
４のｈＩＬ−６とそのＰＥＧ修飾体（Ｆｒ４５−２）を
、Ｘ線照射（６００ｒａｄ）により血小板減少を誘発さ
せたマウスの皮下に、１日１回、５μｇずつ１０日間連
続投与（ｎ＝４）し、経日的に採血して末梢血中の血小
板数を計数した。その結果を第３図に示した。

未修飾ｈＩＬ−６投与群での血小板の正常レベルへの回
復は対照群に比べ１から２日早く認められたのに対し、
ＰＥＧ修飾ｈＩＬ−６投与群では約５日早い回復を示し
た。

（２）上記（１）と同様にして、ｈＩＬ−６とそのＰＥ
Ｇ修飾体（Ｆｒ４５−２）をＸ線照射したマウス（ｎ＝
５）の皮下に、１日１回、ｈＩＬ−６は５μｇまたは５
０μｇ、Ｆｒ４５−２は５μｇずつ７日間連続投与し、
８日目に採血して末梢血中の血小板数を計数した。

その結果を第４図に示した。

上記（１）の結果（第３図）よりわかるようにＸ線照射
後８日目は媒体投与群で血小板の減少が極小値をしめす
時点であるが、ＰＥＧ修飾体投与群では血小板数の減少
が観察されなかった。

これに対し未修飾ｈＩＬ−６投与群では、ＰＥＧ修飾体
の１０倍量を投与した場合でも有意な血小板数の回復が
見られなかった。

実施例１０ 遺伝子組換えにより大腸菌中で生産された実施例４のｈ
ｌＬ−６とそのＰＥＧ修飾体（Ｆｒ４５−２）を、化学
療法剤のサイクロフォスファミド（以下ＣＹという）を
２００ｍｇ／ｋｇ投与して血小板減少を誘発させたマウ
スに、ＣＹ投与翌日から、ｈＩＬ−６は５μｇずつ、Ｐ
ＥＧ修飾体は１μｇずつ１日１回７日間皮下投与し、経
日的に採血して末梢血中の血小板数を計数した。その結
果を第５図に示した。

ＰＥＧ修飾ｈＩＬ−６投与群では有意な血小板数の早期
回復が認められたのに対し、未修飾ｈＩＬ−６投与群で
は対照群の回復時期に血小板数の増加が認められたに過
ぎなかった。

実施例１１ 活性型ＰＥＧ２を使用して、実施例４の工程（１）で調
製したｈＩＬ−６のＰＥＧ修飾を行った。

０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）２００ｍ
ｌに溶解したｈＩＬ−６（１００ｍｇ）溶液に、室温で
撹はんしながら、２５００ｍｇの活性型ＰＥＧ２を５回
に分けて３０分目に添加し反応させた。反応終了後、Ｙ
Ｍ１０限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて反応液を８
ｍｌに濃縮した。濃縮液３．５ｍｌを予めＰＢＳで平衡
化したスーパーデックスＧ２００カラム（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）にのせ、同緩衝液を用いて溶離して５つの画分
を得た（以下、これらの画分を順に、Ｆｒ１００−１、
Ｆｒ１００−２、Ｆｒ１００−３、Ｆｒ１００−４、Ｆ
ｒ１００−５という）。各画分の収量は、それぞれ３．
８ｍｇ、５．９ｍｇ、５．８ｍｇ、４．８ｍｇ、４．５
ｍｇであった。

得られた５つの画分について、実施例５と同様にして未
修飾アミノ基数を測定して特徴付けを行った。各画分の
分子当りの平均未修飾アミノ基数は、順にそれぞれ５．
３個、７．４個、８．６個、９．４個、１０．０個であ
った。

実施例１２ ＰＥＧ化試薬として、平均分子量が約１２０００のＰＥ
Ｇのコハク酸エステルをＮ−ヒドロキシスクシニルイミ
ドにより活性化したＮ−ヒドロキシスクシニルイミドポ
リエチレングリコール（日本油脂に合成を委託）（以下
活性型ＰＥＧ１２Ｍという）を使用して、実施例４の工
程（１）で調製したｈＩＬ−６のＰＥＧ修飾を行った。

０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）１８０
ｍｌに溶解したｈＩＬ−６（９０ｍｇ）溶液に、氷浴中
で撹はんしながら、１０００ｍｇの活性型ＰＥＧ１２Ｍ
を３回に分けて３０分目に添加し反応させた。反応終了
後、ＹＭ１０限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて反応
液を６ｍｌに濃縮し、これを予めＰＢＳで平衡化したス
ーパーデックスＧ２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
にのせ、同緩衝液を用いて溶離して５つの画分を得た（
以下、これらの画分を順に、Ｆｒ１２０−１、Ｆｒ１２
０−２、Ｆｒ１２０−３、Ｆｒ１２０−４、Ｆｒ１２０
−５という）。各画分の収量は、それぞれ１．６ｍｇ、
２．８ｍｇ、３．５ｍｇ、３．７ｍｇ、３．７ｍｇであ
った。

得られた５つの画分について、実施例５と同様にして未
修飾アミノ基数を測定して特徴付けを行った。各画分の
分子当りの平均未修飾アミノ基数は、順にそれぞれ５．
２個、７．６個、８．７個、９．２個、９．８個であっ
た。

実施例１３ 遺伝子組換えにより大腸菌中で生産された実施例４のｈ
ＩＬ−６と、実施例１１および１２で調製したそのＰＥ
Ｇ修飾体を、Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週令、雌；ｎ＝４
）の皮下に１日１回５日間投与し、最終投与翌日に採血
して末梢血中の血小板数を計数した。その結果を第４表
および第５表に示した。

未修飾ｈＩＬ−６に比べそのＰＥＧ修飾体は、明らかに
有意な血小板増加効果を示した。

（本頁以下余白） 実施例１４ 実施例９の工程（２）と同様にして、実施例１２で調製
したＰＥＧ修飾ｈＩＬ−６（Ｆｒ１２０−１からＦｒ１
２０−５）をＢａｌｂ／ｃマウス（８週令、雌；ｎ＝５
）の皮下に１日１回０．００５−５μｇずつ７日間連続
投与し、８日目に採血して末梢血中の血小板数を計数し
た。

その結果を第６図に示した。

ＰＥＧ修飾ｈＩＬ−６はいずれの画分も顕著な血小板数
回復効果を示し、０．１μｇ以上の投与量ではすべての
画分で媒体投与群に比べて有意（Ｐ＜０．０１）に血小
板が多かった。

実施例１５ 本発明のＰＥＧ修飾ｈＩＬ−６の血中滞留時間を推定す
るために、実施例４のｈＩＬ−６および実施例４および
１２で調製したそのＰＥＧ修飾体（Ｆｒ４５−２、Ｆｒ
１２０−１およびＦｒ１２０−２）をＢａｌｂ／ｃマウ
ス（８週齢、雌）に蛋白量として０．２μｇ皮下投与し
、経時的に採血して血清中のｈＩＬ−６量を測定した。

ｈＩＬ−６の定量はＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ　ｈＩＬ−６
（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて免疫化学的に行
った。その結果を第７図に示し未修飾ｈＩＬ−６が投与
５時間後までには血中より消失するのに対し、ＰＥＧ修
飾体では投与２４時間後でもｈＩＬ−６抗原が検出され
、血中滞留時間が長くなっていることが推定される。

実施例１６ 実施例４の工程（１）に示したアミノ酸配列を持つｈＩ
Ｌ−６を同工程に述べた方法で大腸菌中で生産し、カテ
プシンＣで処理することなくそのままＰＥＧ修飾に用い
た。得られたｈＩＬ−６（約２．９ｇ）はＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ上で単一バンドであり、かつアミノ酸組成から計算
された分子量２１Ｋとほぼ一致していた。Ｎ末端アミノ
酸配列を調べたところ、予想された配列（すなわちＭＥ
Ｔ　ＬＹＳ　ＡＬＡ　ＰＲＯ…）を持つ分子が９９％以
上であった。またこのＮ末端配列は保存に対して安定性
が高く、４℃で４カ月保存した後でも全く変化が見られ
なかった。

こうして得られたｈＩＬ−６ポリペプチドを、活性型Ｐ
ＥＧ１２ＭをＰＥＧ化試薬として実施例１２に従ってＰ
ＥＧ修飾した。得られた５つのＰＥＧ修飾ｈＩＬ−６画
分を以下Ｆｒ１２０′−１、Ｆｒ１２０′−２、Ｆｒ１
２０′−３，Ｆｒ１２０′−４、Ｆｒ１２０′−５と呼
ぶ。

実施例１３の方法でマウス（ｎ＝５）に上記Ｆｒ１２０
−２を１日１回１μｇずつ５日間投与し、最終投与翌日
の末梢血中の血小板数を計数したところ、媒体投与群に
対して２８５％の増加（Ｐ＜０．００１で有意）が観察
された。

実施例１７ ＰＥＧ修飾したｈＩＬ−６ポリペプチドの急性毒性を調
べるために、実施例４のｈＩＬ−６と実施例４、１１お
よび１２で調製したそのＰＥＧ修飾体（Ｆｒ４５−２、
Ｆｒ１００−２およびＦｒ１２０−２）をＢａｌｂ／ｃ
マウス（６週齢、雄、体重２１−２３ｇ；ｎ＝５）に蛋
白量として１、５あるいは１０ｍｇ／ｋｇ皮下投与し、
以後観察した。どの試験群においても投与後１０日目で
も死亡例は認められなかった。従って本発明のＰＥＧ修
飾ｈＩＬ−６の急性毒性はきわめて低く、そのＬＤ５０
値は１０ｍｇ／ｋｇよりも高い。

実施例１８ 本発明のｈＩＬ−６誘導体を生体に皮下投与するために
、０．１％の正常マウス血清を含むＰＢＳに溶解し、最
終投与容量が１００μｌとなるようにｈＩＬ−６誘導体
の濃度を調整した。

［発明の効果］ 本発明のＰＥＧ修飾ＩＬ−６は、未修飾のＩＬ−６活性
を有する糖蛋白質またはポリペプチドに比べて、生体で
の血中持続性が大幅に向上し、かつ顕著に優れた血小板
増加作用を示している。したがって、本発明のＰＥＧ修
飾ＩＬ−６は血小板畜生促進剤として臨床治療上有用で
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＰＥＧ（４５００）ＩＬ−６およびＰＥＧ（
１００００）ＩＬ−６のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す
図である。 第２図は、正常マウスにおけるＰＥＧ（４５００）ＩＬ
−６およびＰＥＧ（１００００）ＩＬ−６の血小板増加
効果を示す図である。第３図、第４図は、Ｘ線誘発血小
板減少マウスにおけるＦｒ４５−２の血小板回復促進効
果を示す図である。第５図は、化学療法剤誘発血小板減
少マウスにおけるＦｒ４５−２の血小板回復促進効果を
示す図である。第６図は、Ｘ線誘発血小板減少マウスに
おけるＦｒ１２０−１からＦｒ１２０−５の血小板回復
促進効果を示す図である。第７図はＰＥＧ修飾ｈＩＬ−
６のマウス血中滞留時間の延長を示す図である。 出願人　キリン−アムジエン・ インコーポレーテツド 代理人　弁理士　平木祐輔 同　弁理士　石井貞次 同　弁理士　早川康

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】インターロイキン６活性を有する糖蛋白質
   またはポリペプチドにポリエチレングリコールを結合し
   てなる修飾インターロイキン６。 【請求項２】ポリエチレングリコールが糖蛋白質または
   ポ リペプチドのアミノ酸残基の遊離アミノ基を介して結合
   している請求項１記載の修飾インターロイキン６。 【請求項３】糖蛋白質またはポリペプチドの少なくとも
   １ 個の遊離アミノ基の水素原子が式［Ｉ］、（式中、ｎは
   ７ないし６００の正の整数を、Ｒ１は炭素数１ないし３
   のアルキル基を示す。）または式ＩＩ、 （式中、ｎ，ｍは同一または異なる７ないし６００の正
   の整数を、Ｒ１，Ｒ２は同一または異なる炭素数１ない
   し３のアルキル基を示す。） を有する基で置換された請求項２記載の修飾インターロ
   イキン６。 【請求項４】ポリエチレングリコールが糖蛋白質または
   ポ リペプチドのアミノ酸残基の遊離カルボキシル基を介し
   て結合している請求項１記載の修飾インターロイキン６
   。 【請求項５】糖蛋白質またはポリペプチドが実質的に下
   記 のアミノ酸配列を有するヒトインターロイキン６である
   請求項１記載の修飾インターロイキン６。 ＡＬＡ　ＰＲＯ　ＶＡＬ　ＰＲＯ　ＰＲＯ　ＧＬＹ　Ｇ
   ＬＵ　ＡＳＰ　ＳＥＲ　ＬＹＳＡＳＰ　ＶＡＬ　ＡＬＡ
   　ＡＬＡ　ＰＲＯ　ＨＩＳ　ＡＲＧ　ＧＬＮ　ＰＲＯ　
   ＬＥＵＴＨＲ　ＳＥＲ　ＳＥＲ　ＧＬＵ　ＡＲＧ　ＩＬ
   Ｅ　ＡＳＰ　ＬＹＳ　ＧＬＮ　ＩＬＥＡＲＧ　ＴＹＲ　
   ＩＬＥ　ＬＥＵ　ＡＳＰ　ＧＬＹ　ＩＬＥ　ＳＥＲ　Ａ
   ＬＡ　ＬＥＵＡＲＧ　ＬＹＳ　ＧＬＵ　ＴＨＲ　ＣＹＳ
   　ＡＳＮ　ＬＹＳ　ＳＥＲ　ＡＳＮ　ＭＥＴＣＹＳ　Ｇ
   ＬＵ　ＳＥＲ　ＳＥＲ　ＬＹＳ　ＧＬＵ　ＡＬＡ　ＬＥ
   Ｕ　ＡＬＡ　ＧＬＵＡＳＮ　ＡＳＮ　ＬＥＵ　ＡＳＮ　
   ＬＥＵ　ＰＲＯ　ＬＹＳ　ＭＥＴ　ＡＬＡ　ＧＬＵＬＹ
   Ｓ　ＡＳＰ　ＧＬＹ　ＣＹＳ　ＰＨＥ　ＧＬＮ　ＳＥＲ
   　ＧＬＹ　ＰＨＥ　ＡＳＮＧＬＵ　ＧＬＵ　ＴＨＲ　Ｃ
   ＹＳ　ＬＥＵ　ＶＡＬ　ＬＹＳ　ＩＬＥ　ＩＬＥ　ＴＨ
   ＲＧＬＹ　ＬＥＵ　ＬＥＵ　ＧＬＵ　ＰＨＥ　ＧＬＵ　
   ＶＡＬ　ＴＹＲ　ＬＥＵ　ＧＬＵＴＹＲ　ＬＥＵ　ＧＬ
   Ｎ　ＡＳＮ　ＡＲＧ　ＰＨＥ　ＧＬＵ　ＳＥＲ　ＳＥＲ
   　ＧＬＵＧＬＵ　ＧＬＮ　ＡＬＡ　ＡＲＧ　ＡＬＡ　Ｖ
   ＡＬ　ＧＬＮ　ＭＥＴ　ＳＥＲ　ＴＨＲＬＹＳ　ＶＡＬ
   　ＬＥＵ　ＩＬＥ　ＧＬＮ　ＰＨＥ　ＬＥＵ　ＧＬＮ　
   ＬＹＳ　ＬＹＳＡＬＡ　ＬＹＳ　ＡＳＮ　ＬＥＵ　ＡＳ
   Ｐ　ＡＬＡ　ＩＬＥ　ＴＨＲ　ＴＨＲ　ＰＲＯＡＳＰ　
   ＰＲＯ　ＴＨＲ　ＴＨＲ　ＡＳＮ　ＡＬＡ　ＳＥＲ　Ｌ
   ＥＵ　ＬＥＵ　ＴＨＲＬＹＳ　ＬＥＵ　ＧＬＮ　ＡＬＡ
   　ＧＬＮ　ＡＳＮ　ＧＬＮ　ＴＲＰ　ＬＥＵ　ＧＬＮＡ
   ＳＰ　ＭＥＴ　ＴＨＲ　ＴＨＲ　ＨＩＳ　ＬＥＵ　ＩＬ
   Ｅ　ＬＥＵ　ＡＲＧ　ＳＥＲＰＨＥ　ＬＹＳ　ＧＬＵ　
   ＰＨＥ　ＬＥＵ　ＧＬＮ　ＳＥＲ　ＳＥＲ　ＬＥＵ　Ａ
   ＲＧＡＬＡ　ＬＥＵ　ＡＲＧ　ＧＬＮ　ＭＥＴ【請求項
   ６】ポリペプチドが大腸菌によって生産されたヒ トインターロイキン６ポリペプチドである請求項５記載
   の修飾インターロイキン６。 【請求項７】請求項１〜６のいずれか１項の修飾インタ
   ーロイキン６を有効成分として含有する血小板形成促進
   剤。 【請求項８】インターロイキン６活性を有する糖蛋白質
   またはポリペプチドにポリエチレングリコールを結合さ
   せることを特徴とする修飾インターロイキン６の製造方
   法。