KR100248111B1 - N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 g-csf 또는 그의 유사체 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 g-csf 또는 그의 유사체 조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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낸시 이. 가브리엘
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스티븐 엠. 오드레
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Abstract

본 발명은 단백질에 대한 수용성 중합체의 부가와 관련된 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 N-말단을 변형시킨 단백질이나 그의 유사체에 대한 새로운 방법, 및 새로운 N-말단을 화학적으로 변형시킨 G-CSF 조성물을 함유하는 결과적인 조성물 및 관련된 제제의 제조방법에 관한 것이다. 또한 화학적으로 변형시킨 칸센서스 인터페론도 제공한다.

Description

[발명의 명칭]
N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF 또는 칸센서스 인터페론 및 그 제조방법.
[발명의 분야]
본 발명은 광범위하게 단백질 변형 분야에 관한 것으로, 단백질이나 그의 유사체에 수용성 중합체를 부가시키는 것에 관한 것이며, 특히 G-CSF나 그의 유사체에 폴리에틸렌 글리콜을 부가시키는 것에 관한 것이다(본원에서 사용한 용어 "단백질"은 다른 지시가 없는 한 "폴리펩티드"나 "펩티드"와 동의어이다). 또한 본 발명은 N-말단 변형된 단백질이나 그의 유사체의 새로운 제조방법, 및 결과적인 조성물에 관한 것이다. 다른 양상에 있어서, 본 발명은 새로운 N-말단 화학 변형된 G-CSF 나 그의 유사체 조성물 및 관련된 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 화학 변형된 칸센서스 인터페론에 관한 것이다.
[배경]
치료학적 용도를 위한 단백질은 일반적으로 재조합 DNA 기술의 진보 결과로서 적당한 양을 적합한 형태로 대규모로 이용될 수 있다. 재조합 단백질의 유용성은 단백질 제형화 및 화학변형에서의 진보를 초래한다. 그러한 변형의 한 가지 목적은 단백질 보호이다. 화학적 부가(chemical attachment)는 단백질 골격 자체와의 물리적 접촉으로부터 단백질 가수분해 효소를 효과적으로 차단함으로써 단백질의 분해를 방지한다. 특정 환경하에서, 치료학적 단백질의 안정성 및 순환시간을 증가시키고 면역원성을 감소시키는 부가적인 잇점을 포함한다. 단백질 변형 및 융합 단백질에 대해 기술한 평론지로는 Francis의 Focus on Growth Factors 3 : 4 - 10(1992. 5)이 있다(영국 오엘디 런던 엔20 프리에른 바네트 레인 마운트뷰 코트 메디스크립트에서 발행).
폴리에틸렌 글리콜("PEG")이 치료학적 단백질 산물의 제조에 사용되는 상기 화학 성분이 하나이다(동사 "pegylate ; 폴리에틸렌 글리콜화하다" 란 적어도 하나의 PEG 분자를 부가시킴을 의미한다). Adagen의 예로서, 아데노신디아미나제의 폴리에틸렌 글리콜화된 제제형은 심한 복합 면역부전증으로 치료하는데 가치가 있으며 ; 폴리에틸렌 글리콜화된 과산화물 불균화효소(superoxide dismutase)는 머리 손상 치료용으로 임상실험되었으며 ; 폴리에틸렌 글리콜화된 알파 인테페론은 간염 치료를 위한 1단계 임상실험에서 시험되었으며 ; 폴리에틸렌 글리콜화된 글루코세레브로시다제 및 폴리에틸렌 글리콜화된 헤모글로빈은 예비 임상실험되었음이 보고되어 있다. 폴리에틸렌 글리콜의 부가가 단백질 가수분해를 보호한다고 밝혀져 있으며 [Sada 등의 J. Fermentation Bioengineering 71 : 137-139(1991)], 특정 폴리에틸렌 글리콜 성분의 부가방법이 이용가능하다. 1979년 12월 18일에 특허된 미국 특허 번호 제 4,179,337 호인, Davis 등의 "Non-lmmunogenic Pilypeptides" ; 및 1977년 1월 11일에 특허된 미국 특허 번호 제 4,002,531 호인, Royer의 "Modifying enzymes with Polyethlene Glycol and Product Poduced Thereby"를 참조하시오. 평론지로는 Abuchowski 등의 in Enzymes as Drug를 참조하시오[J.S. Holcerberg and J. Roberts, eds. pp. 367-383 (1981)]. 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/무수 말레인산 공중합체, 폴리아미노산(동종중합체나 랜덤 공중합체 중 선택)과 같은 그외 수용성 중합체도 사용되어 왔다.
폴리에틸렌 글리콜에 있어서, 단백질에 폴리에틸렌 글리콜 분자를 부가시키기 위해 다양한 수단이 사용되었다. 일반적으로 폴리에틸렌 글리콜 분자는 단백질 상에서 발견되는 반응기를 통하여 단백질에 결합된다. 리신 잔기 상이나 N-말단에서와 같은 아미노기가 상기 부가에 적합하다. 예를들면, Royer(상기 미국 특허 번호 제 4,002,531 호 참조)는 효소에 폴리에틸렌 글리콜 분자를 부가시키기 위해 환원성 알킬화를 사용하였음을 밝히고 있다. 1993년 4월 28일에 공개된 제 EP 0 539 167 호인, Wright의 "Peg lmidates and Protein Derivates Thereof"는 유리 아미노기를 수반한 펩티드 및 유기화합물이 PEG나 관련된 수용성 유기 중합체의 즉시형 유도체를 변형됨을 기술하고 있다. 1990년 2월 27일에 특허된 Shaw의 미국 특허 번호 제 4,904,584호는 반응 아미노기를 통하여 폴리에틸렌 글리콜 분자를 부가시키기 위해 단백질내 리신 잔기의 수를 변형시키는 것에 관한 것이다.
화학 변형된, 하나의 특이한 치료학적 단백질은 과립구 군체 자극 인자, 즉 G-CSF이다. G-CSF는 혈류에 대한 호중구 과립구의 신속한 증식 및 방출을 유도하며, 이로써 감염에 대항하는 치료학적 효과를 제공한다.
발명의 명칭이 "화학 변형된 과립구 군체 자극 인자" 인, 1990년 12월 12일에 공개된 유럽 특허 공개 번호 제 EP 0 401 384 호는 폴리에틸렌 글리콜 분자가 부가된 G-CSF의 제조를 위한 물질 및 방법에 관하여 기술하고 있다.
변형된 G-CSF 및 이의 유사체에 관하여도 발명의 명칭이 "수용성 중합체에 공유결합된 폴리펩티드로 구성되는 연속방출 제약학적 조성물"인, 1992년 3월 4일에 공개된 제 EP 0 473 268 호에 보고되어 있으며, 이는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 수용성 입자 중합체에 공유 결합된 다양한 G-CSF 및 유도체의 용도에 대해 기술하고 있다. 인체 과립구 군체 자극 인자 활성도를 가지는 변형된 폴리펩티드에 관하여는 1989년 10월 4일에 공개된 제 EP 0 335 423 호에 기술되어 있다.
또 다른 예로는 폴리에틸렌 글리콜화된 IL-6이 있으며, 발명의 명칭이 "변형된 hIL-6"인 제 EP 0 442 724 호(공동계류중인 미국 특허 출원 번호 제 07/632,070 호 참조)에는 IL-6에 부가된 폴리에틸렌 글리콜 분자에 대해 기술되어 있다.
단백질에 중합체를 부가시키는 많은 방법은 결합기(linking group)로서 작용하는 성분을 사용하는 것에 관한 것이다. 그러나 그러한 성분은 항원성일 수도 있다. 결합기와 관련되지 않은 트레실 염화물(tresyl chloride) 방법을 이용할 수 있으나, 이 방법은 트레실 염화물이 독성 부산물을 생성할 수 있으므로 치료학적 산물 생성에 이용하기에는 어려울 수도 있다. Francis등의 in : Stability of protein pharmaceuticals : in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization 참조(Eds. Ahern., T. 및 Manning, M.C., Plenum, New York, 1991). 또한 Delgado 등의 "Coupling of PEG to Protein By Activation With Tresyl Chloride, Application in lmmunoaffinity Cell Preparation", in Fisher 등의, eds., Separations Using Aqueous Phase Systems, Application in Cell Biology and Biotechnology, Plenum Press, N.Y.N.Y., 1989, pp. 211-213 참조.
Chamow 등의, Bioconjugate Chem. 5 : 133-140(1994) 문헌은 반응 알킬화를 통하여 모노메톡실폴리(에틸렌 글리콜) 알데히드를 수반한 CD4 이뮤노아드헤진의 변형에 관하여 기술하고 있다. 출원인은 50%의 CDS-lg가 폴리에틸렌 글리콜화의 정도 이상의 조절을 허용하는 조건하에서 MePEG-변형되었음을 밝히고 있다. 상기 문헌 137면 참조. 또한 출원인은 변형된 CD4-lg의 시험관내 결합능력(단백질 gp 120에 대하여) 이 MePEG화의 정도와 상호 관련된 비율에서 감소되었음을 기술하였다. 동일문헌 참조. 또한, 단백질 기질(인슐린)의 C-말단 카르복실기에 대한 결합기 카보하이드라지드(carbohydrazide)의 선택적 부가에 대해 기술한 Rose등의 Bioconjgate chemistry 2 : 154-159(1991) 문헌을 참조하시오.
그러나, 본 기술분야의 일반적 상태 또는 특정 단백질과 관련된 기술 분야에서의 방법 모두 G-CSF와 같은 단백질의 N-말단에 수용성 중합체를 선택적으로 부가시키지는 않는다. 오히려, 현행하는 방법은 리신 측면기와 같은, 단백질 내부에 위치해 있는 어떠한 반응기에서나 N-말단에서의 비-선택적 부가를 제공한다. 이것으로 인해 결과적으로 불균질한 집단이 생성된다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF 분자에 있어서 어떤 분자를 그 밖의 분자와 다른 수의 폴리에틸렌 글리콜 성분을 갖는다. 실례로서, 상기 방법에서 5개의 반응 리신 잔기를 갖는 단백질 분자를 불균질한 혼합물을 생성하는데 어떤 것은 6개의 폴리에틸렌 글리콜 성분을 가지고, 어떤 것은 5개, 어떤 것은 4개, 어떤 것은 3개, 어떤 것은 2개, 어떤 것은 1개 및 어떤 것은 0개를 가질 수도 있다. 또한 몇 개를 가지는 분자 중에서, 폴리에틸렌 글리콜 성분은 상이한 분자상의 동일 위치에 부가되지 않을 수도 있다. 이것은 폴리에틸렌 글리콜화된 치료학적 단백질 산물을 개발할 때의 단점이다. 이러한 생성에 있어서는 생물학적 활성도의 예측 가능성이 결정적이다. 예를들어, 폴리에틸렌 글리콜과 과산화물 불균화효소의 비선택적 결합의 경우에 변형된 효소의 몇몇 분획은 완전히 불활성이었음이 밝혀졌다[P. McGoff 등의 Chem. Pharm. Bull. 36 : 3079-3091(1988) 참조]. 만일 치료학적 단백질이 롯(lot)에서 롯(lot)까지 조성이 다르다면 상기와 같은 예측가능성을 지닐 수는 없다. 폴리에틸렌 글리콜 성분 중 일부는 다소의 위치에서 그 밖의 것들과 같이 안전하게 결합될 수 없으며, 이는 상기 성분이 단백질과 함께 분리되는 결과를 초래한다. 물론, 상기 성분이 무작위하게 부가되어 무작위로 분리된다면, 치료학적 단백질의 약동력학은 명확하게 예상될 수 없다. 소비자의 관점에서 보면 순환시간이 롯에서 롯까지 다양하므로 투여량은 부정확하게된다. 생산자의 관점에서 보면 치료학적 단백질 척도에 대한 규정 승인을 얻기가 더 복잡할 수도 있다. 또한, 상기 방법 중 어떤 방법도 결합성분(단백질과 중합체 사이에서)없이 선택적인 N-말단의 화학적 변형을 제공하지 않는다. 만일 결합성분이 사용된다면, 있을 수 있는 항원성으로 인해 손해를 볼 수 있다.
따라서, G-CSF 및 칸센서스 인터페론을 포함하는 단백질 및 그의 유사체를 선택적으로 N-말단 화학 변형되도록 하는 방법이 필요하다(2개의 화학적으로 변형시킨 단백질이 하기에 예시되어 있음). 본 발명은 다수의 양상에서 이러한 필요를 제시한다.
[발명의 요약]
본 발명은 N-말단 화학 변형된 단백질의 실질적으로 균질한 제제, 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 뜻밖에도, G-CSF의 N-말단에서의 화학적 변형은, 이 분자상의 다른 위치에서 하나의 화학적 변형을 포함하는 그외 G-CSF 종에서는 나타나지 않는 안정성의 잇점을 입증하였다. 또한 뜻밖에도, N-말단 화학 변형된 G-CSF를 제조하는 본 과정에서 환원성 알킬화의 이용으로 N-말단을 선택적으로 변형시키기 위한 조건이 제공될 수 있음이 밝혀졌으며, 이러한 방법은 G-CSF 뿐만 아니라 다른 단백질(또는 이의 유사체)에서도 광범위하게 이용될 수 있다. 더욱 놀랍게도, 환원성 알킬화의 이용으로 최종 산물 -- 수용성 중합체에 대한 아민 결합을 갖고 있는 단백질 -- 이 아미드 결합을 갖는 동일한 중합체/단백질 결합체 보다 훨씬 더 안정하다는 것이 밝혀졌다. 그와 같이 변형된(하기 실시예에서 기술한 바와 같음) 하나의 다른 단백질은 칸센서스 인터페론이다. 보다 상세히 하기한 바와 같이, 본 발명은 화학 변형된 단백질(또는 그의 유사체) 뿐만 아니라 특이 단백질의 특히 변형과 관련되는 다수의 양상을 가진다.
한 양상에 있어서, 본 발명은 N-말단 화학 변형된 G-CSF(또는 그의 유사체)의 실질적으로 균질한 제제 및 관련된 제조방법에 관한 것이다. 하기의 한 실시예는 N-말단 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF가 다른 유형의 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF 보다 더 안정하다는 것을 입증한다. 부가적으로, G-CSF 분자의 N-말단은 폴리에틸렌 글리콜과 반응하는 동안 더 유용하므로 보다 많은 비율의 N-말단이 폴리에틸렌 글리콜화되며, 따라서 이러한 종은 과정상의 잇점을 제공한다.
또한 본 발명은 단백질 또는 그의 유사체의 N-말단 잔기의 α-아미노기를 선택적으로 활성화시켜 N-말단에서 수용성 중합체 성분이 부가되도록 하는 환원성 알킬화 유형에 관한 것이다. 이것은 중합체/단백질 결합체 분자의 실질적으로 균질한 제제 뿐만 아니라(만일 폴리에틸렌 글리콜이 사용된다면) 단백질 성분에 직접 결합된 폴리에틸렌 글리콜 성분을 갖는 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질 분자의 제제를 제공한다. 이러한 방법은 G-CSF 및 칸센서스 인터페론에 대해 하기되어 있으며, 이들 본 발명의 부가적 양상을 제공한다.
[도면의 간단한 설명]
제1a도는 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF의 이온 교환 크로마토 그래피의 피이크 크로마토그램을 나타낸 것이다.
제1b도는 다양한 종의 모노-폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF의 SDS-PAGE 이다.
제2도는 (A선) 재조합 인체 메티오닐 G-CSF 표준 ; (B선) SCM-PEG-GCSF 반응 혼합물 ; (C선) N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF ; (D선) 리신 35 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF ; (E선) 리신 41 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF의 SEC-HPLC 종단면도이다.
제3a,b도 및 c도는 (3A) N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF ; (3B) 리신 35 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF ; (3C) 리신 41 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF의 HPLC 엔도프로테이나제 SV8 펩티드 지도화 트레이싱이다.
제4도는 비폴리에틸렌 글리콜화된 표준과 비교하는 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF 종의 시험관 내 생물활성도의 비교를 나타내는 막대 그래프이다.
제5a도 및제5b도는 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF 유도체의 생체내 생물활성도 측정 결과를 설명한 그래프인데, 제5a도는 N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF, 리신 35 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF, 또는 리신 41 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF의 단일 피하주사 후 평균 햄스터 백혈구계수를 나타내고, 제5b도는 상이한 여러 가지 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF유도체의 단일 피하주사 후 곡선하면적 실평균 백혈구계수를 나타낸다.
제6a,b도 및 6c도는 N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF 또는 리신 35 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF의 안정성 연구에 대한 SEC-HPLC 종단면도이다. 제6a 및 제6b도는 (6A) N-말단 모노폴레에틸렌 글리콜화된 G-CSF 또는 (6B) 리신 35 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF에 대한 4℃, pH 6.0에서 수행한 안정성 연구의 종단면도이다. 제6c도는 리신 35 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF에 대한 4℃, pH 6.0에서 연장된 안정성 연구에 대한 종단면도를 나타낸다. 시간("T")은 일(day)을 가리킨다.
제7도는 메톡시폴리에틸렌 글리콜 알데히드(MW 6 kDa)를 사용하는 rh-G-CSF의 환원성 알킬화 과정에서 반응 혼합물의 크기 배제 HPLC 분석을 나타낸 것이다.
제8도는 MW - 6 kDa인, MPEG의 N-하이드록시숙시니미딜 에스테르를 사용하는 환원 혼합물의 크기 배제 HPLC 분석을 나타낸 것이다.
제9도는 상이한 분자량(6 kDa, 12 kDa 및 20 kDa)의 MPEG 알데히드를 사용하는 rh-G-CSF의 환원성 알킬화에 의해 제조된 모노 N-말단 MPEG-GCSF 결합체에 대한 단일 피하투여 후의 총 백혈구 반응을 나타낸 것이다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 N-말단 화학 변형된 단백질의 실질적으로 균질한 제제 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
한 양상에 있어서, 본 발명은 N-말단 화학 변형된 G-CSF 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
본 방법(N-말단 변형된 G-CSF뿐만 아니라 본 환원성 알킬화 방법 둘 다를 위한 방법임)은 모노중합체/단백질 결합체의 실질적으로 균질한 혼합물을 제공한다. 본원에서 사용한 "실질적으로 균질한" 이란 단지 관찰되는 중합체/단백질 결합체 분자가 하나의 중합체 성분을 가지는 분자임을 의미한다. 제제는 비반응된 (즉, 중합체 성분이 결여된) 단백질을 함유할 수도 있다. 펩티드 지도화 및 N-말단 서열결정으로 확인되는 바와 같이, 하기의 한 실시예는 적어도 90%의 모노중합체/단백질 결합체 및 적어도 10%의 비반응된 단백질의 제제를 제공한다. 바람직하게, N-말단 모노폴리에틸렌 글리콜화된 물질은 적어도 제제의 95%이며(하기 실시예에서와 같음), N-말단 모노폴리에틸렌 글리콜화된 물질이 제제의 99% 또는 그 이상이면 더욱 바람직하다. 모노중합체/단백질 결합체는 생물학적 활성을 갖는다. 본원에서 제공한 "실질적으로 균질한" N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF 제제는 균질한 제제의 잇점, 예를들어 롯에서 롯가지 약력학을 예상할 수 있는 임상 적용시 용이함을 나타내기에 충분히 균질한 제제이다.
중합체/단백질 결합체 분자의 혼합물 제조는 선택적일 수 있는데, 본원에서 제공하는 잇점은 혼합물내에 포함되는 모노중합체/단백질 결합체의 비율을 선택할 수 있다는 것이다. 따라서, 원한다면, 다양한 수의 중합체 성분(즉, 디-, 트리- 테트라-, 등)을 부가시킨 다양한 단백질의 혼합물을 제조할 수 있고, 본 방법을 이용하여 제조한 모노중합체/단백질 결합체 물질과 혼합할 수 있으며, 모노중합체/단백질 결합체의 예측 비율을 갖는 혼합물을 가질 수도 있다.
하기한 실시예는 상기한 바와 같이 조혈장애를 치료하는데 사용되는 치료학적 단백질인 G-CSF를 이용하는 실시예이다. 일반적으로, 본 발명의 실시에 유용한 G-CSF는 포유동물 유기체로부터 분리한 형태이거나, 택일적으로, 화학 합성 과정의 산물이거나, 게놈 또는 cDNA 클로닝에 의해서나 DNA 합성에 의해 수득한 외인성 DNA 서열의 원핵 또는 진핵 숙주 발현 산물일 수 있다. 적합한 원핵 숙주는 다양한 박테리아(예를들어, E. coli)를 포함하고 ; 적합한 진핵 숙주는 효모(예를들어, 에스. 세레비시애) 및 포유동물 세포(예를들어, 중국 햄스터 난소세포, 원숭이 세포)를 포함한다. 사용한 숙주에 따라, G-CSF 발현 산물은 포유동물 또는 다른 진핵 탄수화물과 글리코실화될 수 있거나, 비-글리코실화될 수 있다. 또한 G-CSF 발현 산물은 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(위치 - 1에서). 제조합 G-CSF, 특히 E. coli에서 유도된 G-CSF가 다른 G-CSF중에서 최대의 상업적 실용을 위해 바람직할지라도, 본 발명은 상기 G-CSF형태 중 임의의 G-CSF 및 모든 G-CSF의 사용을 포함한다.
특정 G-CSF 유사체가 생물학적 기능을 지니고 있음이 보고되었으며, 이들은 예를들어, 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자의 부가에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. G-CSF 유사체는 미국 특허 번호 제 4,810, 643 호에 기술되어 있다. 비록 전하는 바에 의하면 기술된 각 유사체의 활성도에 관한 설명은 없지만, 생물학적 활성을 갖는다고 보고되어진 다른 G-CSF의 예는 제 AU-A-76380/91 호, EP 0 459 630 호, 제 EP 0 272 703 호, 제 EP 0 473 268 호 및 EP 0 335 423 호에 기술되어 있다. 또한 제 AU-A-10948/92 호, 제 PCT US94/00913 호 및 제 EP 0 243 153 호 참조.
일반적으로, 본 발명에 유용한 G-CSFs 및 그의 유사체는, N-말단 α-아미노기를 선택적으로 화학 변형시키기 위해 본원에서 제공하는 바와 같은 화학 변형 과정을 실시하고, 본원에서 제공한 생물학적 활성도 측정과 같이 원하는 생물학적 특성에 대하여 결과적인 산물을 시험함으로써 확인될 수 있다. 물론 비-인체 포유동물의 치료를 원한다면, 재조합 쥐, 소, 개 등과 같은 비-인체 G-CSFs를 사용할 수도 있다. 예를들어 제 PCT WO 9105798 호 및 제 PCT WO 8910932 호 참조.
따라서, 본 발명의 다른 양산은 N-말단 화학 변형된 G-CSF 유사체 조성물을 포함한다. 상기한 바와 같이, G-CSF 유사체는 아미노산 부가, 삭제 및/또는 치환을 갖는 유사체를 포함한다(하기 실시예 1에 제시한 G-CSF 아미노산 서열과 비교). 호중구의 생성을 선택적으로 자극하도록 N-말단을 폴리에틸렌 글리콜화시킬 때의 기능이 예상되는 이들 G-CSF 유사체는 G-CSF 수용체와의 결합에 필요하지 않는 N-말단을 지닌 G-CSF 유사체이다. Hill 등의 PNAS-USA 90 : 5167-5171(1993) 참조 ; 또한 PCT US94/00913호 참조.
사용한 중합체 분자는 수용성 중합체 중에서 선택할 수 있다 (본원에서 기술한 환원성 알킬화 과정을 위한 것임, 중합체는 단일 환원 알데히드를 가져야 함). 선택된 중합체는 부가되는 단백질이 생리적 환경과 같은 수성 환경에서 침전되지 않도록 수용성이어야 한다. 환원성 알킬화에 있어서, 선택된 중합체는 중합 반응의 정도가 본 발명에서 제공한 바와 같이 조절될 수 있도록 단일 반응 알데히드를 가져야 한다. 중합체는 가지난 것이거나 가지나지 않은 것일 수 있다. 바람직하게, 최종 생성물 제제의 치료학적 이용을 위한 중합체는 제약학적으로 용인가능한 것이다. 본 분야의 숙련된 기술자들은 중합체/단백질 결합체가 치료학적으로 이용될지의 여부에 따라 상기 사항을 근거로 원하는 중합체를 선택할 수 있으며, 만일 치료학적으로 이용된다면, 원하는 투여량, 순환시킨, 단백질 가수분해에 대한 저항성 및 그 밖의 사항들을 선택할 수 있을 것이다. G-CSF는 본원에서 제공한 측정법을 사용하여 확인할 수 있는데, 본 분야의 숙련된 기술자들은 다른 치료학적 단백질에 대해서는 적당한 측정법을 선택해야 한다. 수용성 중합체는 예를들어, 상기한 중합체들(발명의 배경 부분에 제시됨), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 폴리산화 프로필렌/산화에틸렌 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 및 폴리비닐 알콜로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
하기한 바와 같이 최적조건을 고려한다면, 중합체는 어떠한 분자량일 수 있으며, 가지난 것이거나 가지나지 않은 것일 수도 있다. 폴리에틸렌 글리콜에 있어서 바람직한 분자량은 약 2 kDa 내지 약 100 kDa 이다(용어 "약"은 폴리에틸렌 글리콜 제제에 있어 어떤 분자가 상태 분자량보다 많거나, 조금 작은 분자량 임을 의미함). 하기 실시예 1 및 2는 적절한 모델 시스템을 제공하며 정제를 용이하게 하기 위해 선택한 PEG 6000을 사용한다. 원하는 치료학적 프로필에 따라 다른 크기를 사용할 수도 있다(예를들어, 지속 방출의 원하는 지속기간, 효과, 가령 존재한다면 생물학적 활성도, 취금의 용이, 항원성의 정도 또는 부족 및 치료학적 단백질이나 유사체에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 다른 공지효과).
본 발명의 한 특이적 양상은 폴리에틸렌 글리콜 성분 및 G-CSF 성분으로 구성되는 N-말단 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF이다. 다양한 폴리에틸렌 글리콜 분자(분자량, 가지남 등에 의함), 반응 혼합물내의 G-CSF 단백질 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 비율, 수행할 폴리에틸렌 글리콜화 반응 유형, 선택된 N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF의 수득방법 및 사용할 G-CSF의 유형을 선택할 수 있다. 또한, 본 조성물 및 방법은 제약학적 조성물의 제제형, 치료방법 및 약제의 제조방법을 포함한다.
단백질 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 비율은 반응 혼합물 내의 그들의 농도에 따라서 다양할 것이다. 일반적으로, 최적 비율(비반응된 단백질이나 중합체의 초과량이 없다는 점에서의 반응의 효능면에서)은 선택된 폴리에틸렌 글리콜의 분자량에 의해 결정될 것이다. 또한, 본 발명의 한 실시예는 비-특이 폴리에틸렌 글리콜화 및 이후의 N-말단 모노폴리에틸렌 글리콜화된 종의 정제와 관련된 것으로서, 그 비율은 유용한 반응기(전형적으로 ∝ 또는 ∋ 아미노기)의 수에 달려있다. 본원의 한 실시예는 일반적으로 모노폴리에틸렌 글리콜화된 물질을 수득하기 위한 단백질 : PEG 분자의 상당히 낮은 반응 비율에 관한 것이다(단백질 분자당 1.5 PEG 분자).
N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF를 수득하기 위한 폴리에틸렌 글리콜화 방법은 상기한 바와 같은 다양한 방법 중에서 선택할 수 있거나, 하기 실시예 2에서 기술한 본 환원성 알킬화 방법일 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜 성분과 단백질 성분 사이에 결합기가 결여된 것과 관련된 방법은 Francis 등의 In : Stability of protein pharmaceuticals : in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization (Eds, Ahern., T. 및 Manning M.C. Plenum, New York, 1991) 문헌에 기술되어 있다. 또한, Delgado 등의 "Coupling of PEG to Protein By Activation With Tresyl Chloride, Applications In lmmunoaffinith Cell Preparation", In : Fisher 등의 eds., Sepearations Using Aqueous Phase Systems, Applications in Cell Biology and Biotechnology, Plenum Press, N.Y.N.Y., 1989 pp. 211-213 문헌은 폴리에틸렌 글리콜 성분과 단백질 성분 사이에 결합기가 존재하지 않는 결과를 초래하는 트래실 염화물의 사용에 관한 것이다. 이 방법은 트레실 염화물의 사용이 독성 부산물을 생산할 수도 있으므로 치료학적 산물 생성에 사용하기는 곤란하다. 본 실시예 중의 하나는 카르복시메틸 메톡시 폴리에틸렌 글리콜의 N-히드록시숙시니미딜 에스테르의 사용에 관한 것이다. 하기에 보다 상세히 기술된 바와 같이, 또 다른 실시예는 본 환원성 알킬화 방법의 이용에 관한 것이다.
N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF 제제를 수득하는 방법(즉, 필요하다면 다른 모노 폴리에틸렌 글리콜화된 성분으로 부터 이 성분을 분리함)은 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF 분자 집단으로부터 N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 물질을 정제하는 것이다. 예를들어, 하기한 실시예는 모노폴리에틸렌 글리콜화된 물질의 전하 특성을 갖는 물질(동일한 겉보기 전하를 가지는 그 밖의 다-폴리에틸렌 글리콜화된 물질)을 수득하기 위해 이온 교환 크로마토그래피로 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF를 먼저 분리한 다음, 모노폴리에틸렌 글리콜화된 물질을 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분리한다. 이와 같은 방법으로 N-말단 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF를 다른 모노폴리에틸렌 글리콜화된 종 뿐만 아니라 다른 다-폴리에틸렌 글리콜화된 종으로부터 분리하였다. 그 밖의 방법도 보고되어 있다. 예를들어, 1990년 5월 3일에 공개된 제 PCT WO 90/04606 호는 PET- 함유 수성 이상성계내의 PEG/단백질 부가물을 분리함을 포함하는, PEG-단백질 부가물의 혼합물을 분획화하는 과정을 기술하고 있다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 N-말단 화학 변형된 단백질(또는 유사체)을 선택적으로 수득하는 방법을 제공한다. 하기 제공된 방법은, 특정 단백질 유도체화에 유용한 여러 유형의 1차 아미노기(리신 대 N-말단)의 차별적인 반응성을 이용하는 환원성 알킬화에 의한 단밸질 변형 방법이다. 적당한 반응 조건하에서, N-말단에서 단백질의 실질적인 선택적 유도체화는 카르보닐기 함유 중합체로 수행된다. 이 반응은 단백질의 N-말단 잔기의 α-아미노기와 리신 잔기의 ε-아미노기 사이의 pKa 차이의 잇점을 얻을 수 있는 pH에서 수행한다. 그와 같은 선택적 유도체화에 의해 단백질에 대한 수용성 중합체의 부가가 조절된다 : 중합체를 수반한 결합체는 단밸질의 N-말단에서 우세하게 발생하되 리신 곁사슬 아미노기와 같은 다른 반응기의 유의 변형은 일어나지 않는다.
중요하고 놀랍게도, 본 발명은 다른 화학 변형 과정을 이용하는 보다 광범위한 정제가 필요하지 않는, 모노중합체/단백질 결합체 분자의 실질적으로 균질한 제제를 제조하는 방법을 제공한다. 부가적으로, 아민 결합을 갖는 산물은 뜻밖에도 아미드 결합으로 생성된 산물보다 더 안정한데, 이는 하기 전체 실험에 설명되어 있다. 특히, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하면, 또한 본 발명은 아마 항원성 결합기가 결여되어 있으며, 독성 부산물 없이 단밸직 성분에 직접 결합되는 폴리에틸렌 글리콜 성분을 가지는 N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질을 제공한다.
이 반응은 다음과 같이 도시될 수 있다(실례가 되는 환원제로서 시아노수소화붕소화물 나트륨을 표시함) :
따라서, 본 발명의 한 양상은 (a) α-아미노기에 수용성 중합체가 선택적으로 부가되도록 단밸직 성분의 아미노 말단의 α-아미노기를 선택적으로 활성화시키기에 적합한 pH의 환원성 알킬화 조건하에서, 수용성 중합체 성분을 하나 이상의 아미노기를 가지는 단백질 성분과 반응시키고, ; 및 (b) 반응 산물을 수득하는 단계를 포함하는 중합체/단백질 결합체의 제조방법이다. 임의적으로, 비반응 성분으로부터 반응 산물을 분리할 수도 있는데, 이것은 치료학적 산물용으로 바람직하다. 본 발명의 다른 양상은 상기 환원성 알킬화가 아미노 말단의 α-아미노기를 가지는 어떠한 단백질에 대하여도 중합체를 선택적으로 부가시켜 모노중합체/단백질 결합체의 실질적으로 균질한 제제를 제공하는 것이다. 용어 "모노중합체/단백질 결합체"는 단백질 성분에 부가된 단일의 중합체 성분으로 구성된 조성물을 의미한다(본원에 기술한 바와 같은 단백질 유사체를 이용하는 결합체도 포함). 모노중합체/단백질 결합체는 N-말단에 위치하는 중합체 성분을 가질 것이지만, 리신에 대한 아미노 측면기에 위치하는 중합체 성분은 가지지 않는다. 제제는 80% 보다 큰 모노중합체/단백질 결합체가 바람직하며, 95%보다 큰 모노중합체/단백질 결합체가 더 바람직할 것이다.
모노중합체/단백질 결합체 분자의 실질적으로 균질한 집단에 있어서, 반응 조건은 원하는 단백질의 N-말단에 대한 수용성 중합체 성분의 선택적 부가를 수행하는 조건이다. 상기 반응조건은 일반적으로 리신 아미노기와 N-말단의 α-아미노기 사이의 pKa 차이를 제공한다(pKa는 아미노기의 50%는 양성자 첨가되고 50%는 양성자 첨가되지 않았을 때의 pH이다). 일반적으로, 상이한 단백질에 있어서 상이한 pH's가 N-말단의 α-아미노기를 최적으로 변형시키는데 사용될 수 있다.
또한 pH는 사용되는 단백질에 대한 중합체의 비율에 영향을 미친다. 일반적으로, pH가 pK보다 낮으면, 단백질에 대해 보다 많은 과량의 중합체가 필요할 것이다(즉, N-말단 α-아미노기가 더 적게 반응할 수록 최적조건을 획득하게 위해 더 많은 중합체가 필요하다). 만일 pH가 pK보다 높으면, 중합체 : 단백질 비율은 많이 필요하지 않다(즉, 더 많은 반응기가 유용하므로, 더 적은 중합체 분자가 필요하다).
또 다른 중요한 사항은 중합체의 분자량이다. 일반적으로 중합체의 분자량이 더 클수록, 단백질에 부가될 수 있는 중합체 분자의 수는 더 적다. 유사하게, 이들 변수를 효과적으로 이용할 때 중합체의 분지(branching)를 고려해야 한다. 일반 적으로, 분자량이 더 클 수록(또는 더 많이 분지될 수록)중합체 : 단백질 비율은 더 높다.
본 환원성 알킬화에 있어서, 환원제는 수성용액에서 안정해야 하며 바람직하게는 환원성 알킬화의 초기 과정에서 형성된 쉬프 염기(schiff base)만을 환원시킬 수 있어야 한다. 바람직한 환원제는 수소화붕소나트륨, 수소화시아노붕소나트륨, 디메틸아민 붕산염, 티메틸아민 붕산염 및 피리딘 붕산염으로 구성된 그룹으로부터 선택할 수 있다. 수소화 시아노붕소나트륨이 하기 실시예에서 이용되었다.
수용성 중합체는 상기한 유형일 수도 있으나, 단백질에 결합하기 위한 단일의 반응 알데히드기를 가져야 한다. 폴리에틸렌 글리콜에 있어서, G-CSF의 결합용으로 PEG 6000 및 칸센서스 인터페론용으로 PEG 12000을 사용하였다. G-CSF용으로 PEG 12000, 20000 및 25000도 본 방법에 성공적으로 사용된다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온 알데히드(예를들어 미국 특허 번호 제 5,252,714 호 참조)가 물내의 안정성을 위해 유리하다.
상기한 바와 같이, 본 방법은 N-말단 α-아미노기를 가지는 어떠한 단백질 또는 그의 유사체에도 광범위하게 이용될 수 있다.
예를들어, 박테리아내에서 발현된 외인성 DNA 서열 산물인 단백질은 박테리아에 의한 발현의 결과로서, α-아미노기를 지니는 N-말단 메티오닐 잔기를 가진다. 상기한 바와 같이, 펩티드는 펩티도미메틱스(peptidomimetics)로서 다른 변형된 단백질을 포함한다. 상기한 G-CSF 유사체와 같은 단백질 유사체 및 비-자연 발생적인 칸센선스 인터페론 또한 본 방법에 적합하다.
따라서, 본 N-말단 화학 변형된 G-CSF에 있어서, 본원에서 기술한 바와 같은 어떠한 G-CSF's 또는 유사체도 사용될 수 있다(예를들어, 상기문헌 참조). 하기 실시예는 174개 아미노산 및 N-말단 메티오닌 잔기 이외의 것을 가지는, 박테리아내에서 생성된 재조합 G-CSF를 사용한다. 본원에서 기술한 바와, 같이, 화학 변형은 본원에서 기술한 어떠한 수용성 중합체로도 수행될 수 있으며, 본 실시예는 폴리에틸렌 글리콜의 이용을 기술한 것이다.
칸센서스 인터페론은 본 실시예에 사용한 또 다른 단백질이다. 하기의 설명은 N-말단 모노폴리에틸렌 글리콜화를 위한 본 환원성 알킬화 방법을 이용하여 화학적으로 변형시킨 칸센서스 인터페론 제제이다. 따라서, 본 발명의 다른 양상은 이들 제제에 관한 것이다. 본원에서 사용한 바와 같이, "칸센서스 인터페론", 또는 "IFN-con"으로서 언급한 칸센서스 인체 백혈구 인터페론은 모든 자연 발생적인 인체 백혈구 인터페론 아형(subtype) 서열과 공통적인 그들의 아미노산 잔기를 주로 포함하고, 모든 아형에 공통적이지 않는 아미노산이 존재하는 하나 이상의 위치에서 우선적으로 발생하는 아미노산을 포함하며 적어도 하나의 자연 발생적인 아형의 위치에 잔존하고 있지 않는 어떠한 아미노산 잔기도 포함하지 않는 비자연 발생적인 폴리펩티드를 의미한다. IFN-con은 본원에서 참고문헌으로 인용한 공동 소유의 미국 특허 제 4,695, 623호 및 제 4,897,471호에 기술되어 있는 IFN-con1, IFN-con2, 및 IFN-con3로 명명된 아미노산 서열을 포함한다(미국 특허 번호 제 4,897,471호 및 제 4,695,623호는 명칭 "α"를 사용하지만 본원에서는 사용하지 않음). IFN-con을 암호화하는 DNA 서열은 상기 언급한 특허 문헌이나 그 밖의 표준 방법에서 기술한 바에 따라 합성할 수 있다. IFN-con 폴리펩티드는 박테리아 숙주, 특히 E. coli 내로 형질전환되거나 형질감염된, 제조된 DNA 서열 발현 산물이 바람직하다. 즉, IFN-con은 재조합 IFN-con이다. E. coli 내에서 바람직하게 생성된 IFN-con은 본 분야의 숙련된 기술자들에게 공지된 방법 및 IFN-con1에 대한, klein 등의 J. Chromatog. 454 : 205-215(1988)문헌에 일반적으로 기술된 방법에 의해 정제할 수 있다. 정제된 IFN-con은 동형(isoform) 혼합물을 포함할 수 있는데, 예를들어, 정제된 IFN-con1은 메틸오닐 IFN-con1, 데스-메티오닐 IFN-con1및 차단된 N-말단을 지닌 데스-메티오닐 IFN-con1의 혼합물을 포함한다(Klein 등의 Arc. Biochem. Biophys. 276 : 531 - 537(1990) 참조). 택일적으로, IFN-con은 분리된 특이 동형을 포함할 수 있다. IFN-con의 동형은 본 분야의 기술자들에게 공지된 등전점전기 이동과 같은 기술에 의해 서로 분리된다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양상은 화학 변형된 칸센서스 인터페론이며, 여기서 칸센서스 인터페론 성분은 IFN-con1, IFN-con2및 IFN-con3로 구성된 그룹으로 부터 선택한 것이다. 화학 변형은 PEG와 같은 본원에서 기술한 수용성 중합체를 사용하며, 본 환원성 알킬화 방법은 선택적 N-말단 화학 변형을 위해 이용될 수도 있다. 본원의 실시예 3은 폴리에틸렌 글리콜 성분(PEG 12000)이 N-말단 결합된 IFN con1성분으로 구성되는 화학 변형된 IFN con1을 설명한 것이다.
또 다른 양상에 있어서, 본 방법은 폴리에틸렌 글리콜 성분이 개별 결합기가 결여되고 독성 부산물이 존재하지 않는 단백질 성분에 직접 부가된 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질을 생산한다. 이 예로서 본원에서 기술한 G-CSF 및 칸센서스 인터페론을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF 단백질 분자의 집단에 있어서 폴리에틸렌 글리콜 성분은 G-CSF 단백질 성분에 직접 부가되며 (N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF분자의 집단이 필연적이지는 않음), 산성 pH를 수반하거나 수반하지 않고서 상기 환원성 알킬화를 수행할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 양상에 있어서, 상기의 제약학적 조성물을 제공한다. 이와 같은 제약학적 조성물은 주사로 투여하거나, 경구, 폐, 비측 또는 다른 형태로 투여할 수 있다. 일반적으로, 본 발명은 제약학적으로 용인 가능한 희석제, 방부제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 담체와 함께 본 발명의 모노중합체/단백질 산물의 유효량을 함유하는 제약학적 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 다양한 완충제 함량(예를들어, 트리스-HCl, 아세테이트, 인산염), pH 및 이온 강도로 된 희석제 ; 세정제, 가용화제(예를들어, 트윈 80, 폴리소르베이트 80), 항-산화제(예를들어, 아스코르브산, 메타중아황산 나트륨), 방부제(예를들어, 타이메로살, 벤질 알콜) 및 부피조정 물질(예를들어, 락토스, 만니톨)과 같은 부가제 ; 폴리락트산, 폴리글리콜산 등과 같은 중합체 화합물의 특정 제제형 내로, 또는 리포좀 내로 상기 물질이 삽입된 것을 포함한다. 상기 조성물은 물리적 상태, 안정성, 생체 내 방출 속도 및 본 N-말단 화학 변형된 단백질의 생체 내 정화 속도에 영향을 미칠 수도 있다. 본원에서 참고문헌으로 인용한 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. 참조(펜실베니아 18042 이스톤에 소재하는 맥 퍼블리싱 코포레이션, 1990).
본 발명의 또 다른 양상은 제공된 약제의 제조 및 치료 방법이다. 본 중합체/G-CSF 결합체(또는 자연 발생적인 G-CSF의 조혈 생물학적 특성을 가지는 유사체)의 투여에 의해 경감되거나 조절된 증상은 전형적으로 감소된 조혈 또는 면역 기능, 및 특히, 감소된 호중구계수에 의해 특정화되는 증상이다. 이러한 증상은 화학요법이나 방사선 치료와 같은 다른 목적을 위한 치료 과정으로서 유도될 수도 있다. 이와 같은 증상은 박테리아, 바이러스, 곰팡이와 같은 감염성 질병 또는 그 밖의 감염성 질병의 결과일 수 있다. 예를들어, 패혈증은 박테리아 감염의 결과이다. 또는, 이러한 증상은 중증인 만성 호중구감소증 또는 백혈병과 같이 유전성이거나 환경적 원인일 수도 있다. 노인병에서와 같이 연령이 요인이 될 수도 있는데, 부모가 감소된 호중구계수나 감소된 호중구 가동화를 지닐 수도 있다. 상기 증상의 다소는 Filgrastim(r-met Hu G-CSF) in clinical Practice, Morstyn, G. 및 T.M. Dexter, eds., Marcel Dekker, Inc., N.Y.,N.Y. (1993), 351pp에 평론되어 있다. 본 중합체/G-CSF 결합체의 투여에 의해 경감되거나 조절될 수 있는 덜 연구된 다른 증상은 G-CSF가 플라스미노겐 활성화 인자의 생성을 유도할 수 있는 바와 같이, 혈류내 지질(또는 콜레스테롤)의 감소 및 특정 심장혈관 증상을 포함할 수 있다. 이와 같은 경우에 G-CSF(또는 유사체)의 작용방식은 현재 잘 이해되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜과 같은 수용성 중합체가 부가됨으로써 생물학적 활성도의 지속시간이 지속되어 치료과정당 G-CSF를 더 적게 주사할 수 있다는 점에서 환자에게 실제적인 잇점을 제공한다.
일반적으로, 본 중합체/칸센서스 인터페론의 투여로써 경감되거나 조절될 수 있는 증상은 칸센서스 인터페론이 이용될 수 있는 증상으로서 세포 증식성 질병, 바이러스성 감염, 및 다발성 경화증과 같은 자가면역 질병을 포함한다. McManus Balmer의 DICP, The Annals of Pharmacotherapy 24 : 761 - 767(1990) (Clinical use of biologic response modifiers in cancer treatment : an overview. Part I. The Interferons). 칸센서스 인터페론을 사용하여 세포 증식성 질병을 치료하는 방법 및 조성물은 본원에서 참고문헌으로 인용한, 1992년 4월 30일자로 공개된 제 PCT WO 92/06707 호에 기술되어 있다. 예를들어, 감염(A, B, C, D, E)은 본 폴리에틸렌 글리콜화된 칸센서스 인터페론 분자를 사용하여 치료할 수 있다. 하기 실시예는 시험관내에서, 화학적으로 변형된 칸센서스 인터페론이 비-화학적으로 변형된 칸센서스 인터페론의 20%의 생물학적 활성도를 가짐을 입증한다.
상기 모든 분자에 대한 연구를 더 수행함으로써 다양한 환자의 다양한 증상을 치료하기에 적당한 투여량 수준에 관한 정보를 발견할 수 있을 것이며, 통상의 기술자들은 수용자의 치료학적 환경, 연령 및 일반적인 건강을 고려하여 적당한 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 일반적으로, 주사나 주입을 위한 투여량은 0.01㎍/kg 체중(화학적 변형없이 단백질만의 질량을 계산한 것임) 내지 100㎍/kg(상기와 동일함)일 것이다.
하기 실시예는 상기한 여러 가지 양상을 설명한다. 실시예 1에서, N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF의 잇점은 리신-35 또는 리신-41 (G-CSF met + 174개 아미노산 변형체)에서 G-CSF 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF와 비교함으로써 입증된다. 실시예 2는 N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF의 본 환원성 알킬화를 설명한다. 이 방법은 N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF의 실질적으로 균질한 제제를 제공한다. 실시예 3은 N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 칸센서스 인터페론의 본 환원성 알킬화를 설명한다.
[실시예 1]
A. 재조합 인체 met-G-CSF의 제조
재조합 인체 met-G-CSF (본원에서는 종종 "rhG-CSF" 또는 "r-met-hu-G-CSF"라 함)는 본원에서 참고문헌으로 인용한 Souza의 특허, 미국 특허 번호 제 4,810,643 호의 방법에 따라 상기한 바와 같이 제조하였다. 사용된 rhG-CSF는 하기의 아미노산 서열(DNA 서열에 의해 암호화됨) (서열번호 : 1 및 2)를 갖는 E.coli 유도 재조합 발현 산물이었다. :
(이것은 또한 대조 동물에 사용되는 비-폴리에틸렌 글리콜화된 조성물이었다). 다음의 폴리에틸렌 글리콜화 과정을 위해 구입한 Neupogen (본원에서 참고문헌으로 인용한 패키지 삽입물)을 선택적으로 사용할 수 있다.
B. 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF의 제조
100mM 비신(Bicine) pH 8.0 내의 상기 rh-G-CSF 10mg/ml 용액을 6000달톤의 평균 분자량을 갖는 고체 SCM-MPEG(카르복시메틸 메톡시 폴리에틸렌 글리콜의 N-히드록시 숙시니미딜 에스테르)(카바이드 화합물)에 가하였다. 이것은 rh-G-CSF에 1.5 몰 과량의 SCM-MPEG를 제공한다. 1시간 동안 서서히 교반한 후, 혼합물을 멸균수로 2mg/ml까지 희석하고, 묽은 HCl로 pH를 4.0으로 맞추었다. 반응은 실온에서 실시하였다. 이 단계에서, 반응 혼합물은 주로 모노-폴리에틸렌 글리콜화된 rh-G-CSF의 세 유형으로 구성되어 있고 일부는 디-폴리에틸렌 글리콜화된 rh-G-CSF, 비변형된 rh-G-CSF 및 반응 이산물(N-히드록시 숙시니미드)로 이루어졌다.
C. N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 rh-G-CSF의 제조
이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 모노-폴리에틸렌 글리콜화된 rh-G-CSF의 세 유형을 서로 분리하였다. 완충용액 A(20mM 아세트산 나트륨, pH 4.0)로 평형화시킨 파마시아 S 세파로스 FF 컬럼(파마시아 XK 50/30 저장기, 440ml의 지지체 부피)에 반응 혼합물을 부하하였다. 3컬럼 부피의 완충용액 A로 컬럼을 세척하였다. 15컬럼 부피의 완충용액 B(20mM 아세트산 나트륨, pH 4.0, 1 M NaCl)를 0 - 23% 선형 기울기를 사용하여 단백질을 용리하였다. 1 컬럼 부피 만큼의 100% 완충용액 B로 컬럼을 세척한 다음 3 컬럼 부피의 완충용액 A로 재평형화시켰다.
전체 흐름에 대한 유출량은 8ml/분을 유지하였다. 280nm에서 용리액을 모니터하고 5ml 분획을 수집하였다. 각각의 모노폴리에틸렌 글리콜화된 종을 포함하는 분획하는 제 1a 도와 같이 풀로 제조하였다. YM10 76mm 막을 이용하여 350mL 아미콘 교반 셀로 이들 풀을 농축하였다.
모노폴리에틸렌 글리콜화된 종으로부터 디-폴리에틸렌 글리콜화된 종을 분리하기 위해 이온 교환 크로마토그래피의 풀로 제조된 분획을 크기 배제 크로마토그래피에 가하였다. 전형적으로, 2-5ml 용액 내의 5-10mg을 20mM 아세트산 나트륨 pH 4.0으로 평형화시킨 120ml 파마시아 수퍼덱스 75 HR 16/60 컬럼에 부하하였다. 100분 동안 1.5ml/분씩 컬럼을 유출시켰다. 2ml 분획을 수집하였다. 용리액의 단백질 함량은 280nm에서 모니터하였다. 분리된 피크로부터의 분획을 풀로 제조하여 분석 결과를 나타내었다. 하기 표는 각 피크에 대한 상대적인 수득량을 비교한 것이다.
이러한 조건하에서, 위치 17 및 24의 리신은 대체로 거의 폴리에틸렌 글리콜화되지 않았다.
D. 특정화
각각의 시료를 특정화하기 위해 다섯 가지 분석을 실시하였다 :
(10 SDS-Page(제 1b 도 참조), (2) 크기 배제 크로마토그래피 HPLC("SEC HPLC")(제 2 도 참조), (3) 펩티드 지도화 분석(제 3a, 3b 및 3c 도 참조), (4) 시험관내 G-CSF 생물 검정(제 4 도 참조) 및 (5) 햄스터의 생체내 시험(제 5a 및 5b 도 참조).
N-말단 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF의 각 시료 조성물에 대한 결과는 시료가 95% 이상의 N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 조성물이고 그 잔여물이 대체로 비폴리에틸렌 글리콜화된 물질임을 설명한다(시료의 잔여물은 검정의 검출 한도보다 낮음). 모노폴리에틸렌 글리콜화된 물질의 세유형(N-말단, 리신 35 및 리신 41에서의 폴리에틸렌 글리콜화) 각각에 대한 모노폴리에틸렌 글리콜화된 비율에 관하여, N-말단 및 리신 41은 97% 이상 모노폴리에틸렌 글리콜화되었고, 리신 35 폴리에틸렌 글리콜화된 물질은 검정 조건중 분자의 불안정성에 기인하여 다소 낮은 것으로 나타났다. 대략적으로 다음 결과를 얻었다 :
* 하기한 바와 같이, N-말단 서열결정은 서열결정 과정중에 단백질의 N-말단으로부터 폴리에틸렌 글리콜 분자가 인위적으로 분리되기 때문에 양적인 것으로 간주하지 않는다.
* R1/UV는 굴절지수/자외선 흡광도의 비를 말하며, 단백질 분자당 폴리에틸렌 글리콜 분자의 수를 측정하는데 사용하였다. 폴리에틸렌 글리콜에 대한 굴절 지수 및 단백질에 대한 자외선 흡광도를 이용한 SEC HPLC 자료로부터 계산한다.
** 이 형태가 본 검정 조건하에서는 불안정함을 주의하시오.
[방법]
1. SDS-PAGE. 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 염료를 사용하여, 일본 도쿄 캄파니 아이에스에스 다이이찌 퓨어 케미컬스에서 구입한 4 - 20% 비-환원된 미니겔로 SDS-PAGE를 실시하였다. 이미지 퀀트(Image Quant)를 지닌 분자 다이나믹스 덴스토미터(Dynamics Densitometer)를 이용하여 겔을 스캐닝하였다.
결과 : 결과는 제 1b 도에 나타나 있다. 레인 번호 1(왼쪽에서 부터)은 분자량 단백질 표준[노벡스마크 12 몰레큘라 웨이트 스탠다드]을 포함한다. 레인 2는 3㎍의 rh-G-CSF 표준을 포함한다. 레인 3은 부하시킨 10㎍의 SCM-PEG-GCSF 반응 혼합물을 포함한다. 레인 4는 부하시킨 10㎍의 N-말단 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF를 포함한다. 레인 5는 N-말단의 메티오닌으로 부터 35번째 잔기에서 발견되는 리신에 폴리에틸렌 글리콜화 부위를 갖는 10㎍의 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF를 포함한다. 레인 6은 N-말단의 메티오닌으로부터 41번째 잔기에서 발견되는 리신에 폴리에틸렌 글리콜화 부위를 갖는 10㎍의 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF를 포함한다. N-말단 모노폴리에틸렌 글리콜화된 물질을 포함하는 레인 3은 볼 수 있는 바와 같이 단일 밴드가 나타난다.
2. 크기 배제 크로마토그래피 - 고압 액체 크로마토그래피.
100mM 인산나트륨염, pH 6.9를 20분간 1ml/분씩 유출시키는 바이오셉 SEC 3000 컬럼을 갖는 워터스 HPLC 시스템(Waters HPLC system)을 사용하여 SEC-HPLC를 실시하였다. 280nm에서 시그널을 모니터하였다. 제 2 도에서 볼 수 있는 바와 같이, N-말단 모노폴리에틸렌 글리콜화된 rh-G-CSF를 함유하는 "C"선은 단일 피크를 가지며 "D" 선(Lys-35 모노폴리에틸렌 글리콜화된 물질) 및 "E" 선(Lys-41 모노폴리에틸렌 글리콜화된 물질)도 단일 피크를 갖는다. 이것은 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF의 분리된 분획들이 상당한 순도를 가짐을 나타내는 것이다.
3. 펩티드 지도화.
다음의 방법을 사용하였다. "모노-PEG-1", "모노-PEG-2", "모노-PEG-3"라 명명한 세 시료를 분석하였다.
(a) 환원성 알킬화. 모노-PEG G-CSF의 500㎍ 분취량을 스피드 진공 건조하여 농도가 6M 구아니디늄 HCl 및 1mM EDTA pH 8.4를 함유하는 0.3M 트리스-HCl 950 μl 내의 1mg이 되도록 재조정하였다. 시료에 요오드아세트산을 가하여 S-카르복시메틸화시킨 다음 37℃에서 20분간 항온 하였다. 세파덱스 G-25퀵 스핀 단백질 컬럼을 사용하여 시료를 탈염시킨 다음 완충용액을 교환하였다. 탈염 및 완충용액 교환후, 첨가한 완충용액을 이용하여 시료 농도를 0.5mg/ml까지 맞추었다.
(b) 핵산단백질 분해효소 SV8 절단. 25℃에서 26시간 동안 시료를 SV8(기질에 대한 효소 비율이 1 : 25)로 절단 하였다.
(c) HPLC 펩티드 지도화, 단백질 절단물을 바이닥 C4 컬럼(4.6 × 250mm, 5μ 입자 크기, 300Å 소공 크기)에 주입하고, 0.1% TFA 내의 아세토니트릴 선형 기울기를 사용한 HPLC에 의해 펩티드를 지도화하였다. 펩티드를 수동으로 수집하여 서열 분석을 위해 스피드 진공건조하였다.
결과 : 표준시료와 비교한 바와 같이, (i) (제 3a 도)"모노 PEG-1"의 경우, 57.3분에서 피크가 감소하여 77.5분에 새 피크가 나타났다. ; (ii) (제 3b 도)"모노-PEG-2" (리신 35 폴리에틸렌 글리콜화된 물질)의 경우, 30.3분의 보유시간을 갖는 펩티드의 피크 높이가 감소하여, 66.3분에 새로운 피크가 용리되었다 ; (iii) (제 3c 도)"모노-PEG-3" (리신 41 폴리에틸렌 글리콜화된 물질)의 경우, 30.3분의 보유시간을 갖는 피크가 사라지고 66.4분에 새로운 피크가 나타났다. 이들 펩티드는 시료 지도에서 현저한 차이를 나타내었다. 86.1분에서 펩티드 양측에 나타나는, 대수롭지 않은 절단 차이에서 기인하는 작고 불완전한 홈이 일부 존재하였다.
(b) N-말단 서열 분석. 상기 지도에 나타난 새로운 펩티드 각각을 확인하기 위해 N-말단 서열결정하였다. 건조된 펩티드를 0.1% TFA로 재조정하고 ABl 단백질 서열결정기로 서열 결정하였다. "모노-PEG-1" (N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 물질)의 경우, 새로운 피크(77.5분)의 60%의 서열이 10순환 동안 결정되었다. 초기 수득율은 N-말단 메티오닌 잔기가 폴리에틸렌 글리콜 분자에 의해 차단되었음을 나타내는 5% 미만이었다. 초기 펩티드는 결과적으로 초기 수득율이 0 이어야 하는데, 〈 5% 수득율은 서열 분석 중에 N-말단 메티오닐로부터 폴리에틸렌 글리콜이 분리됨으로써 관찰된 것임이 주목된다. 검출한 서열은 N-말단 펩티드의 서열인 M-T-P-L-G-P-A-S-S였다. "모노-PEG-2"(리신 35 폴리에틸렌 글리콜화된 물질)의 경우, 전체 피크 부피의 80%가 66.3분의 피크에서 수집되었고, 9순환 동안 서열이 결정되었다. 리신 35의 회복은 현저히 낮아 위치 35에서의 폴리에틸렌 글리콜화를 나타낸다. 리신 41의 회복은 다른 잔기와 일치하여 이 위치에서는 변형되지 않았음을 나타낸다. 30.3분의 펩티드는 표준 시료 지도의 상응 피크와 필적하는 피크 높이가 감소하였다. 30.3분의 펩티드는 상응하는 펩티드 피크 면적의 57.5%에 불과하다. 이러한 형태에서 검출한 서열은 K-L-C-A-T-Y-K-L이었다. "모노-PEG-3" 즉, 리신 41 물질의 경우, 66.4분에서 용리된 펩티드에 대해 수집한 전체 피크 부피의 80%의 서열이 9순환 동안 결정되었다. 검출한 서열은 K-L-C-A-T'-Y-K-L이었고, 리신 잔기 35 및 41을 함유하였다. 리신 35의 회복은 다른 잔기의 회복과 일치하였다. 리신 41의 회복은 현저히 낮은데, 이것은 위치 41에서의 폴리에틸렌 글리콜화를 나타낸다.
결과 : "모노-PEG1"은 N-말단 모노폴리에틸렌 글리콜화된 물질이다 ; "모노-PEG-2"는 리신 35가 부분적으로 폴리에틸렌 글리콜화된 것이다 ; "모노-PEG-3"은 리신 41 폴리에틸렌 글리콜화된 물질이다. 표준 시료(비-폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF) 및 GCSF 모노폴리에틸렌 글리콜화된 1,2 및 3 펩티드 지도를 비교함으로써, "모노-PEG-2(리신 35)" 및 "모노-PEG-3(리신 41)" 지도는 N-말단 펩티드의 피크 높이가 약간 감소한 것으로 나타났다. 이것은 리신 35 및 리신 41 물질이 N-말단 폴리에틸렌 글리콜화 물질의 소량 함유하거나 N-말단 메티오닌이 적은 비율로 폴리에틸렌 글리콜화됨을 나타낸다.
4. 시험관내 활성도. 물질은 활성이었다. 제 4 도는 시험관내 검정의 결과를 나타낸다. 볼 수 있는 바와 같이, N-말단 모노폴리에틸렌 글리콜화된 물질은 비-변형 rhG-CSF 활성도의 68%를 갖는다.
방법 : G-CSF 시험관내 생물검정은 마우스 32D 세포의 G-CSF 의존 클론을 사용하는 유사 분열 검정이다. 5% FBS 및 20ng/ml의 rhG-CSF를 함유하는 이스코브 배지(lscoves medium)에서 세포를 배양하였다. 시료를 가하기 전에, 세포를 rhG-CSF가 결핍된 성장 배지로 2회 세척해 두었다. 48 내지 .5ng/ml (4800 내지 50lU/ml) 범위에 걸쳐 12개의 점을 가진 rhG-CSF 표준 곡선을 산출하였다. 표준 곡선의 직선 부분(1000 내지 3000lU/ml)에 포함되는 것으로 추정되는 네 개의 희석액을 각 시료에 대해 3개씩 준비하여 이동시켰다. 시험관내 겉보기 활성도가 낮기 때문에, 폴리에틸렌 글리콜화된, rhG-CSF 시료를 약 4 - 10배 이하로 희석하였다. 10,000세포/웰을 함유하는 96웰 미량역가 평판의 적당한 웰에 시료 또는 표준 희석액 40μl를 각각 가한다. 37℃ 및 5.5% CO2에서 48시간 후, 0.5μmCi의 메틸-3H-티미딘을 각 웰에 가하였다. 18시간 후, 평판을 수확한 다음 수를 세었다. 선량 반응 곡선(rhG-CSF로 그 농도 대 CPM-기저치)을 산출하고, 표준 곡선의 직선 부분에 포함되는 점의 선형 회귀 분석을 실시하였다. 희석 인자에 대해 결과적인 선형 방정식 및 보정을 사용하여 미지의 실험 시료의 농도를 결정하였다.
결과 : 결과는 제 4 도에 나타나 있다. 제 4 도에서 볼 수 있는 바와 같이, 3개의 모노폴리에틸렌 글리콜화된 종 중에서 N-말단 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF가 최고의 시험관내 생물학적 활성도를 나타낸다.
5. 생체내 활성도. 생체내 실험으로 N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 물질의 활성도를 확인하였다. 0.1mg/kg의 시료를 수컷 골든 햄스터에 1회 피하 주사함으로써 생체내 시험을 실시하였다. 4마리의 동물을 각 시점마다 그룹 당 말단 출혈시켰다. 시료를 수집한 날에 혈청 시료의 완전한 혈액 수를 세었다. 평군 백혈구 수를 계산하였다. 제 5a 도 및 5b 도에서 볼 수 있는 바와 같이, 0.1mg/kg을 1회 피하주사한지 1일 후에 각 물질로부터의 반응을 체크하였다. 모노폴리에틸렌 글리콜화된 물질 중 2개(N-말단 및 Lys-35)가 장기적인 반응을 보이는 반면, 리신-41 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질에 대한 반응은 비변형된 rhG-CSF 이상으로 생체내 활성도가 증가하지 않는 것으로 나타났다(실제로 제 5b 도에서는 더 낮게 나타남). 이러한 결과는 단일 폴리에틸렌 글리콜 분자의 결합이 단백질의 치료학적 측면을 극적으로 변화시킬 수 있고, 단백질을 폴리에틸렌 글리콜화시키는 잇점은 변형 부위에 좌우될 수 있다는 것을 나타내는 것이다[1회 피하 주사 후 곡선하 평균 WBC 총 면적(CRC Standard Mathematical Tables, 26th Ed. (Beyer, W.H., Ed.)CRC Press Inc., Boca Raton, FL 1981, P. 125 문헌에 의해 계산됨)은 Lys-35 및 N-말단 모노폴리에틸렌 글리콜화된 종과 유사하였다].
E. 안정성 연구
더욱이, 상기에서 제조한 바와 같이 N-말단 및 Lys-35 모노폴리에틸렌 글리콜화된 종의 안정성 연구를 실시하였다(Lys-41 물질은 비변형 G-CSF 이외의 부가적인 활성도를 나타내지 않으므로 사용하지 않았다). 이러한 연구는 N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF가 놀랍게도 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF의 다른 형태인 모노폴리에틸렌 글리콜화된 리신 35보다 저장시 더 안정성을 갖는다는 사실을 설명하고 있다. 안정성은 SEC-HPLC를 사용하여 가시화한 바와 같이 산물을 분석함으로써 측정하였다.
방법 : N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF 및 리신-35 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF는 16일에 이르기까지 4℃에서 pH 4.0 및 pH 6.0의 두 pH에서 연구하였다. pH 6.0 시료의 경우, 상기에서 제조한 N-말단 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF 및 리신 35 모노폴리에틸렌 글로콜화된 G-CSF는 20mM 인산나트륨, 5mM 아세트산나트륨, 2.5% 미니톨, 0.005% 트윈-80, 0.25mg/ml의 최종 단백질 농도에서 PH 6.0을 함유하는 완충 용액에 두었다. 1ml 분취량을 3ml의 멸균 주입 바이알에 저장하였다. 각각의 바이알을 16일 동안 4℃ 및 29℃에서 저장하였다. SEC-HPLC 트레이싱을 통해 안정성을 측정하였다. 후자의 측정치가 전자의 측정치(시간 =0)와 동일하다면(가시화 검사로 확인), 시료는 그 시간 동안 안정한 것으로 간주하였다.
결과 : 결과는 제 6a-6c 도에 기술하였다.
(a) 4℃, pH 6.0에서의 비교. 제 6a 도는 여러 시간에 걸쳐 pH 6에서 N-말단 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF에 대한 4℃ SEC-HPLC 종단면도를 나타내며, 제 6b 도는 여러 시간에 걸쳐 pH 6에서 리신-35 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF에 대한 4℃ SEC-HPLC 종단면도를 나타낸다. 한편의 해석은 Lys-35 물질이 비변형 G-CSF의 분자량과 유사한 분자량을 갖는 물질로 된다는 것이다.
(b) pH 4.0, 4℃에서의 장기간 지속. N-말단 형태가 분해되지 않는다는 점에서 pH 4.0 및 4℃는 상대적으로 안정한 조건을 나타내는 대조를 제공한다. Lys 35 종의 경우, 물질의 분해는 여전히 발생하지만, 훨씬 더 낮은 비율로 발생한다.
(c) pH 6.0, 4℃에서의 비교. 제 6c 도는 연장된 기간동안 이들 조건 하에서 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF에 대한 SEC-HPLC 종단면도를 나타낸 것이다. 제 6c 도에서 볼 수 있는 바와 같이, pH 6.0 및 4℃에서 리신-35 물질은 제 6b 도에서 6일 째에 볼 수 있었던 것 보다 16일 또는 35일에 탈폴리에틸렌 글리콜화가 감소하는 것으로 나타난다. 이것은 탈폴리에틸렌 글리콜화가 6일이 지난 후 이러한 조건하에서 변화되지 않음을 나타내는 것이다.
[실시예 2]
본 실시예는 환원성 알킬화를 이용하여 모노폴리에틸렌 글르콜화된 G-CSF의 실질적으로 균질한 집단을 제조하는 방법 및 이러한 집단의 특정화를 설명하는 것이다. 상기 실시예에 기술한 바와 같은 제조합 G-CSF를 사용하였다. 볼 수 있는 바와 같이, 본 방법은 수득량에 있어서 N-말단 화학 변형된 물질이 잇점을 제공할 뿐만 아니라, 본 발명의 환원성 알킬화 과정의 아민 결합은 저장시 집합체의 정도에서 큰 차이를 보이는 바와 같이 실질적으로 더욱 안정한 산물을 생성한다.
A. N-말단 α-아미노 잔기에서의 결합 부위를 가지는 모노-메톡시폴리에틸렌 글리콜-GCSF 결합체의 제조
20mM NACNBH3를 함유하는 100mM 인산나트륨, pH 5 내의 rhG-CSF(1ml, 상기 실시예에 기술한 바와 같이 5mg/ml)를 냉각(4℃)시켜서 교반한 용액에 5배 몰 과량의 메톡시폴리에틸렌 글리콜(MPEG) 알데히드(평균 분자량, 6 kDa)를 가하였다. 반응 혼합물은 같은 온도에서 계속 교반하였다.
0.05M NaH2PO4, 0.05 M Na2HPO4, 0.15M NaCl, 0.01M NaN3, pH 6.8로 1ml/분씩 용리한 바이오-실 SEC 250-5 컬럼(바이오-래드에서 구입)을 사용한 SEC-HPLC에 의해 반응 중에 단백질 변형의 정도를 모니터링하였다.
10시간 후 SEC HPLC 분석으로 단백질의 92%가 모노-MPEG-GCSF 유도체로 전환되었음을 알 수 있었다. 이것은 단백질 농도(A280의 흡광도로 결정)를 기록하고 있는 제 7 도에서 볼 수 있으며, 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF 처럼 8.72분에서 용리되는 피크와 9.78 분에서 용리되는 비반응 G-CSF의 작은 피크가 나타나 있다.
비교한 바와 같이, MPEG의 N-히드록시숙시니미딜 에스테르를 사용하였을 때 수득되는 피크는 제 8 도에 나타나 있다. 분자량은 역시 6 kDa 이었다. 볼 수 있는 바와 같이, 본 반응에서 수득한 혼합물은 다음과 같다. : 결합된 트리-MPEG-GCSF(약 7.25분에서의 어깨 모양의 돌출부), 디-MPEGP-GCSF 결합체(7.62분의 피크), 모노-MPEG-GCSF 결합체(8.43분의 피크) 및 비반응 G-CSF(9.87분의 피크).
단백질의 92%가 모노폴리에틸렌 물질로 전환되는 10시간의 시점에서, 100mM HCl로 반응 혼합물의 pH를 pH 4로 맞추고, 1mM HCl로 5배 희석하였다.
20mM 아세트산나트륨 완충용액, pH 4로 평형화시킨 하이로드 16/10 S 세파로스 HP 컬럼(파마시아에서 구입)을 이용한 이온 교환 크로마토그래피에 의해 모노-MPEG-GCSF 유도체를 정제하였다. 반응 혼합물을 1ml/분의 유속으로 컬럼에 적하하고, 비반응 MPEG 알데히드는 3 컬럼 부피의 동일 완충용액으로 용리하였다. 1M NaCl을 함유하는 20mM 아세트산나트륨, pH 4를 0% 내지 45%의 선형 400분 기울기로 4℃에서 단백질-중합체 결합체를 용리하는데 사용하였다. 모노-MPEG-GCSF 유도체를 포함하는 분획의 풀을 제조하여 농축하고 멸균여과하였다.
상이한 평균 분자량(12, 20 및 25 kDa)의 MPEG 알데히드와 rH-G-CSF를 변형하여 수득한 각각의 모노-MPEG-GCSF 결합체는 유사한 방법으로 제조하였다.
B. 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF의 분석
1. 분자량
모노폴리에틸렌 글리콜화된 결합체의 분자량은 SDS-PAGE, 겔여과, 매트릭스 원조 레이저 탈착 질량 분광법 및 평형 원심분리에 의해 결정하였다. 이들 결과는 하기 표 4에 나타나 있다.
N-말단 단백질의 서열결정 방법 및 펩티드 지도화 방법을 이용하여, 제조한 N-말단 모노-MPEG-GCSF 결합체의 구조를 확인하였다. N-말단 메티오닐의 시안화브롬이 분해되어 폴리에틸렌 글리콜이 제거되었다.
2. 생물학적 활성도.
마우스 골수 세포내로의 자극된3H 티미딘 흡수량을 측정함으로서 폴리에틸렌 글리콜화된 MPEG-GCSF 결합체의 시험관내 생물학적 활성도를 측정하였다. 햄스터에 MPEG-GCSF 결합체 또는 rhG-CSF(100mg/kg)를 피하주사하여 총 백혈구수를 측정함으로써 생체내 생물학적 활성도를 측정하였다. WBC/시간 곡선하 면적에서 부형제 대조 곡선을 공제함으로써 비-유도 G-CSF에 필적할만한 생물학적 활성도를 계산하였다. MPEG-GCSF 유도체의 상대적인 생물학적 활성도는 비변형 G-CSF에 대조되는 백분율 생물학적 활성도로 설명하였다.
이것은 제 9 도에 나타나 있는데, 제 9 도는 상이한 분자량(6 kDa, 12 kDa 및 20 kDa)의 MPEG 알데히드를 갖는 rhG-CSF의 환원성 알킬화에 의헤 제조된 모노-N-말단 MPEG-GCSF 결합체에 대한 총 백혈구 세포의 반응을 나타내는 그래프이다. 볼 수 있는 바와 같이, 모든 모노폴리에틸렌 글리콜화된 분자는 반응을 유도하였다. 2일 째에 20 kDa 보다 12 kDa이 조금 더 높은 수를 갖는 것을 제외하고는 사용된 폴리에틸렌 글리콜 성분의 분자량이 클수록 백혈구 세포수도 많아졌다.
3. 안정성 연구
두 개의 상이한 화학(본원에서는 환원성 알킬화의 아미드 대 아민)으로 제조한 N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF의 집합도를 비교하였다. 놀랍게도, 아민 화학을 이용한 N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF가 아미드 결합을 갖는 N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF(실시예 1에 기술한 NHS화학)보다 실질적으로 더 안정하다는 것이 밝혀졌다.
밥업 : 1mg 단백질/ml 농도에서 5% 소르비톨과 10mM NaOac pH 4.0 내에 N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF의 두 시료를 모았다. 각각에 대하여 PEG 6000으로 G-CSF를 폴리에틸렌 글리콜화시켰다. 아미드-결합 결합체는 실시예 1에 의해 제조하였고, 아민 결합 결합체는 실시예 2에 의해 제조하였다. 45℃에서 8주 동안 6개의 시료를 보관하였다. 8주 후에, 크기 배제 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래프를 이용하여 집합도를 측정하였다.
결과 : 8주 후 상승된 온도에서 의외로 더 작은 집합체를 가진 물질이 생성되었으므로 본 환원성 알킬화는 아세틸화에 바람직한 방법인 것으로 결과가 나타났다. 하기 표는 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 또는 이온 교환(IE)을 이용한 두 물질에 대한 비-집합 물질("메인 피크" 물질)의 비율을 나타내는 것이다 :
* 이온 교환은 집합체를 완전히 분석하지 못하므로 이 값이 상대적으로 높다.
[실시예 3]
본 실시예는 화학 변형된 칸센서스 안티페론을 설명하고 있다. 더욱 특별하게, 본 실시예는 모노폴리에틸렌 글리콜화된 IFN-con1의 실질적으로 균질한 집단을 제조하는 방법 및 이러한 집단의 특정화에 관한 것이다.
본 실시예는 IFN-con1을 사용하는 한편, 상기에서 설명한 바와 같이 칸센서스 인터페론 중 어떤 인터페론도 화학적으로 변형시킬 수 있음을 주목해야 한다. 본원에서는 PEG를 사용하였지만, 이러한 화학 변형체는 상기와 같은 수용성 중합체 중 어느 것일 것이다. 폴리에틸렌 글리콜화의 경우, 모든 수용성 PEG 형태를 사용할 수 있지만, 본원에서는 PEG 12000을 사용하였다(PEG 12000 이 조작이 쉽고 편리하기 때문에 선택하였다). N-말단 폴리에틸렌 글리콜화 같은 선택적인 N-말단 화학 변형의 경우, 화학 변형의 다양한 방법(아세틸화 같은 방법)들이 유용하지만, 본 실시예에서 기술한 환원성 알킬화 방법이 바람직하다.
A. 칸센서스 인터페론의 제조
명세서 전체를 참고 문헌으로 인용한 미국 특허 번호 제 4,695,623호의 제 2 도에 기술되어 있는 바와 같이, IFN-αcon1을 모노폴리에틸렌 글리콜화된 칸센서스 인터페론의 제조에 사용하였다. 박테리아내 외인성 DNA의 발현으로 IFN-con1을 생산하였고, IFN-αcon1은 N-말단에 메티오닐 잔기를 함유한다.
B. 칸센서스 인터페론의 폴리에틸렌 글리콜화
차게하여(4℃) 교반한, 20mM NaCNBH3를 함유하는 100mM 인산나트륨, pH 4.0 내의 IFN-con1용액(3.45 mg/ml, N-말단이 차단된 유형을 35.25% 함유)에 8-배 몰 과량의 메톡시폴리에틸렌 글리콜(MPEG) 알데히드(평균 분자량 12 kDa)를 가하였다. 반응 중 단백질 변형의 정도를 PLRP-S(PL 세퍼레이션 사이언스 폴리머 라보라토리스)같은 중합체-기저 폴리(스티렌/디비닐벤젠) 컬럼을 사용한 역상 HPLC로 모니터하였다.
10시간 후 역상 HPLC 분석으로 N-말단의 비차단된 α-아미노기를 가진 단백질의 80%가 MPEG-IFN-con1유도체로 전환되었음을 알 수 있었다. 10시간 시점에서, 반응 혼합물을 물로 5배 희석하고, 20mM 아세트산나트륨 완충용액 pH 4.0으로 평형화시킨 하이로드 16/10 S 세파로스 HP 컬럼(파마시아에서 구입)을 사용한 이온 교환 크로마토그래피에 의해 모노-MPEG-IFN-con1유도체를 정제하였다. 반응 혼합물을 1ml/분의 유속으로 컬럼에 부하하고, 비반응 MPEG 알데히드는 3컬럼 부피의 동일 완충용액으로 용리하였다. 1 M NaCl을 함유하는 20mM 아세트산나트륨, pH 4.0을 0% 내지 75%의 선형 420분 기울기로 4℃에서 단백질-중합체 결합체를 용리하는데 사용하였다.
모노-MPEG-IFN-con1유도체를 포함하는 분획의 풀을 제조하여 농축하고 멸균여과하였다.
C. 모노폴리에틸렌 글리콜화된 칸센서스 인터페론의 분석
1. 균질성
10-20% 또는 4-20%로 미리 만든 기울기 겔(인테그레이티드 세퍼레이션 시스템스에서 구입)을 사용하여 SDS-PAGE로써 정제된 모노-MPEG-IFN-con1결합체의 균질성을 측정하였다. 겔은 분자량 35 kDa에서 메인 밴드를 보였다.
각각의 모노-MPEGP-IFN-con1형태의 효과적인 크기를 특정화하기 위하여 수퍼로스 6 HR 10/30 겔 여과 컬럼(파마시아에서 구입)을 사용하였다. 280nm에서 UV 흡광도를 측정하여 단백질을 검출하였다. 바이오-래드 겔 여과 표준이 구형 단백질 분자량 표식물로서의 역할을 하였다.
N-말단 단백질 서열결정 방법 및 펩티드 지도화 방법을 사용하여 정제된 N-말단 모노-MPEG-IFN-con1결합체의 구조를 확인하였다. N-말단의 일부가 차단된 물질을 함유하는 IFN-con1제제 및 이 물질은 폴리에틸렌 글리콜화되지 않았다. 그러나 폴리에틸렌 글리콜화된 물질은 N-말단이 모노폴리에틸렌 글리콜화되었다. 따라서 이러한 형태에 있어서, 비차단된 물질로부터 차단된 물질을 분리하기 위해 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 같은 다른 방법을 사용하고자 하는 이도 있을 것이다.
2. 생물학적 활성도.
모노-MPEG-IFN-con1결합체의 시험관내 생물학적 활성도는 인체 (헬라) 세포(ATCC WP CCL 2 호)에서 그것의 항바이러스성 생물학적 활성도를 측정함으로써 결정하였다.
모노-MPEG(12 kDa)-IFN-con1결합체는 비변형 형태와 비교하였을 때 20%의 시험관내 생물학적 활성도(U/mg의 단백질)를 보임을 발견하였다. 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF에 대해 상기한 바와 같이, 시험관내 검정은 생물학적 활성도를 나타내는 데에는 유용한 반면, 특유의 지속적 방출 때문에 화학적으로 변형시킨 단백질의 활성도는 오히려 낮다. 생체내 생물학적 활성도는 시험관내 생물학적 활성도보다 더 높을 것이다.
D. 제거된 N-말단 차단된 분자를 갖는 화학 변형된 칸센서스 인터페론
미리 제거된 N-말단 차단된 분자의 일부를 갖는 상기 IFN-con1상에 본 환원성 알킬화를 실시하였다. 상기한 환원성 알킬화에 PEG 12000 및 PEG 20000을 사용하였다.
분자의 겉보기 분자량은 다음과 같다 :
FPLC 이온 교환 크로마토그래프를 이용한 IFN-con120 kDa PEG 결합체의 분석으로 세 개의 피크가 나타났다 : 모노MPEG-IFN-con1: 전체 면적의 66%(265.93ml 용리) ; 단백질 집합체 및 올리고 MPEG-IFN-con1결합체 : 전체 면적의 24%(238.42ml 용리) ; 및 비반응 IFN-con1: 전체 면적의 10%(328.77ml 용리).
조건은 최적 상태는 아니었다. 크로마토그래피 방법이나 그외의 방법을 이용하여 모노폴리에틸렌 글리콜화된 물질을 더 분리할 수 있을 것이다.
본 발명을 바람직한 실시예로 기술한 반면, 본 분야의 숙련된 기술자들에 의한 변형 및 수정이 가능함은 물론이다. 따라서, 첨부된 특허청구 범위는 본 발명의 범주내의 상기 모든 대응 변형을 포함하고자 한다.
[서열 목록]
(1) 일반적인 정보 :
(i) 출원인 : 암젠 인코포레이티드
(ii) 발명의 명칭 : N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF나 그의 유사체 조성물 및 그 제조방법
(iii) 서열의 수 : 2
(iv) 통신 주소 :
(A) 수신인 : 암젠 인코포레이티드
(B) 가 : 디하빌랜드 드라이브 1840
(C) 시 : 사우전드 오크스
(D) 주 : 캘리포니아
(E) 국명 : 미국
(F) 우편번호 : 91320
(v) 컴퓨터 입력 형태 :
(A) 매개형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성
(C) 작동 시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : Pantentln Release # 1.0, Version # 1.25
(vi) 현재의 출원 자료 :
(A) 출원 번호 :
(B) 제출일 :
(C) 분류 :
(ⅷ) 대리인 정보 :
(A) 성명 : 페신, 캐롤 엠.
(B) 참고 번호 : A-286
(2) 서열번호 : 1 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 531 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자유형 : cDNA
(xi) 서열의 기술 : 서열번호 : 1 :
(2) 서열번호 : 2에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 ; 175 아미노산
(B) 유형 ; 아미노산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자 유형 : 단백질
(xi) 서열 기술 : 서열번호 : 2 :

Claims (13)

  1. 제약학적으로 용인가능한 희석제, 담체 또는 보조제내에 함유되어 있는, G-CSF나 그의 유사체에 부가된 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF나 그이 유사체의 실질적으로 균질한 제제.
  2. 제1항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜은 2 kDa 내지 100 kDa의 분자량을 가짐을 특징으로 하는 제제.
  3. 제2항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜은 6 kDa 내지 25 kDa의 분자량을 가짐을 특징으로 하는 제제.
  4. 제1항에 있어서, 제제는 적어도 90 %의 N-말단 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF나 그의 유사체 및 많아도 10 %의 비폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF나 그의 유사체로 구성된 것임을 특징으로 하는 제제.
  5. 제4항에 있어서, 제제는 적어도 95 %의 N-말단 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF나 그의 유사체 및 많아도 5 %의 비폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF나 그의 유사체로 구성된 것임을 특징으로 하는 제제.
  6. 제1항에 있어서, G-CSF는 서열 번호 1에 제시한 서열을 가짐을 특징으로 하는 제제.
  7. 제약학적으로 용인가능한 희석제, 담체 또는 보조제내에 함유되어 있는 N-말단 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF의 실질적으로 균질한 제제로서, (a) G-CSF는 서열 번호 1에 제시한 아미노산 서열을 가지며, (b) G-CSF는 12kDa의 분자량을 가지는 폴리에틸렌 글리콜 성분으로 모노폴리에틸렌 글리콜화된 것임을 특징으로 하는 제제.
  8. (a) 아민 결합을 통하여 오로지 G-CSF 성분의 N-말단에 결합된 12 kDa의 분자량을 가지는 폴리에틸렌 글리콜 성분으로 구성되는 모노폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF의 실질적으로 균질한 제제, (b) 5 %보다 적은 비-폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF 분자, 및 (c) 제약학적으로 용인가능한 희석제, 보조제 또는 담체로 구성되는 조혈 장애 치료용 제약학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제2-8항 중 어느 한 항의 제제의 치료학적 유효량을 사람을 제외한 포유동물에게 투여함을 포함하는 조혈 장애의 치료방법.
  10. 다음 단계를 포함하는, 단일 반응 알데히드기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 분자를 G-CSF나 그의 유사체에 부가하는 방법 :
    (a) G-CSF나 그의 유사체의 아미노 말단의 α-아미노기를 선택적으로 활성화시키기에 충분히 산성인 pH의 환원성 알킬화 조건하에서 폴리에틸렌 글리콜 분자를 G-CSF나 그의 유사체와 반응시키는 단계,
    (b) 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF나 그의 유사체를 수득하는 단계 및
    (c) 비-폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF나 그의 유사체로부터 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF나 그의 유사체를 분리하는 단계.
  11. 제10항에 있어서, 환원성 알킬화 반응은 수소화붕소나트륨, 수소화시아노붕소나트륨, 디메틸아민 붕산염, 티메틸아민 붕산염 및 피리딘 붕산염 중에서 선택한 환원제를 사용함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 분자는 6kDa 내지 25 kDa의 분자량을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  13. 제10항의 과정으로 생성되는 폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF 산물.
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