CN101245109B - 一种聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高活性的聚乙二醇单修饰重组人粒细胞集落刺激因子突变体(PEG-rmhG-CSF)及其制备方法和医疗用途。将重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)游离的半胱氨酸(Cys)经聚乙二醇巯基反应试剂定点化学修饰，获得活性更高结构更均一的PEG-rmhG-CSF产物。该产物可以用来治疗治疗因放疗、化疗等引起的中性粒细胞减少症。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质聚乙二醇化修饰技术，具体的说，涉及一种高活性的聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(PEG-rmhG-CSF)及其制备方法和医疗用途。
发明背景
重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)成熟蛋白具有175个氨基酸，分子量为19KDa，可诱导造血干细胞的增值和分化，导致血液中的中性粒细胞数增加；另外还能刺激成熟中性粒细胞数从骨髓中释出并激活中性粒细胞的功能。因此自1991年起rhG-CSF已经广泛用于治疗癌症化疗导致的骨髓抑制，可以显著改善化疗所引起的中性粒细胞减少症的严重性和持续时间。
但是，作为重组蛋白药物，rhG-CSF血清半衰期短，只有2-4小时，每个化疗周期需要每天注射1-2次，持续注射5-7天(Welte K等，ProcNat Acad Sci，82：1526-1530(1985)；Frampton JE等，Drugs，48(5)：731-60(1994))，这不仅增加了病人的痛苦，也增加了医疗费用。
用聚乙二醇(PEG)进行蛋白质修饰的方法已经证明是延长蛋白药物体内半衰期的一个有效办法，蛋白质药物通过和PEG结合来延长蛋白质药物的血药浓度，同时还可降低免疫原性，如聚乙二醇单修饰重 组人干扰素α2a(PEG-IFNα2a)(Bailon P等，BioconjugateChem.，12：195-202(2001))、聚乙二醇单修饰重组人粒细胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF)(Harris JM，Clin Pharmacokinet，40:539-551(2001))。PEG-rhG-CSF描述的是利用活化的20KD PEG-丙醛对rhG-CSF中N端的α-氨基进行修饰(美国专利US5824784；Kinstler OB等，Pharm Res，13：996-1002(1996))。通过对其N端进行PEG修饰，增大了rhG-CSF蛋白的分子量，显著提高其在体内的半衰期，每个化疗周期只需注射给药一次。
然而，这种修饰方式对rhG-CSF来说并非最优，因为除了N端的α-氨基外，rhG-CSF结构中其余的四个Lys残基的氨基也可能与活化的PEG结合，但是N端α-氨基和这四个Lys残基都是和G-CSF受体结合有关，因此，用现有方法进行PEG修饰以后，rhG-CSF的生物学活性都会下降，根据不同修饰位点和修饰数目，其体外活性可能下降几倍到几十倍。而且，所获得最终产物可能是不同修饰位点的混合物，还可能有多修饰产物，这些对于PEG-rhG-CSF的后续纯化及临床应用等都是不利的。因此，制备一种活性更高结构更均一的PEG化rhG-CSF产物，具有很重要的临床和经济意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种聚乙二醇(PEG)单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(PEG-rmhG-CSF)，其活性更高且结构更均一。
本发明的另一个目的是提供一种聚乙二醇(PEG)单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(PEG-rmhG-CSF)的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种包含上述聚乙二醇(PEG)单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(PEG-rmhG-CSF)的药物制剂及其在制备治疗因放疗、化疗等引起的中性粒细胞减少症药物中的应用。
重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)含有形成两个二硫键的五个半胱氨酸(Cys)残基，其中rhG-CSF成熟蛋白序列的第37和43位Cys形成二硫键，第65和75位Cys形成二硫键，而rhG-CSF的18位的半胱氨酸(Cys)残基处于蛋白三维空间结构的疏水区域中心，因此不易与其他半胱氨酸(Cys)残基反应生成二硫键，它是游离的。
已有研究发现，rhG-CSF蛋白与细胞受体的结合位点主要位于N-末端，因此在N-末端PEG修饰rhG-CSF将引起rhG-CSF蛋白生物学活性的降低。本发明的一个目的是使重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)游离的半胱氨酸(Cys)与带有巯基反应基团的半胱氨酸反应性聚乙二醇(PEG)进行反应，得到结构均一的聚乙二醇(PEG)单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(PEG-rmhG-CSF)。rhG-CSF在其N端具有一游离的半胱氨酸(Cys)残基，由于在N-末端PEG修饰修饰将降低修饰后蛋白的生物学活性，并且第18位的半胱氨酸(Cys)残基处于蛋白三维空间结构的疏水区域中心，因此不易与巯基反应基团发生反应，因此有必要对rhG-CSF进行结构改造。
为达到上述目的，本发明人采用了如下的技术方案：
对rhG-CSF进行定点突变，该rhG-CSF突变体(rmhG-CSF)可与 带有巯基反应基团的半胱氨酸反应性聚乙二醇(PEG)进行定点反应，得到结构均一的聚乙二醇(PEG)单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体，其结构形式为PEG-rmhG-CSF。其中，所述的rmhG-CSF的氨基酸序列与rhG-CSF具有至少95％的同源性，其中的一个突变位点为将rhG-CSF第18位的游离半胱氨酸(Cys)突变为丝氨酸(Ser)或者苏氨酸(Thr)，并在远离N端的部位引入另一个半胱氨酸(Cys)(例如在rhG-CSF第76-175位氨基酸引入一个Cys)；所述的PEG为带有巯基反应基团的聚乙二醇分子，该聚乙二醇分子通过巯基与rmhG-CSF中的游离半胱氨酸(Cys)结合。
优选的，发明人在实验中发现，将rhG-CSF蛋白N端第18位的半胱氨酸(Cys)突变为丝氨酸，同时将第2(Thr)、4(Leu)、5(Gly)、6(Pro)位氨基酸突变为Ala、Thr、Tyr和Arg，所得到的突变体G-CSF其体外生物学活性要比未突变的rhG-CSF蛋白高1.5-4倍，有关点突变的技术方案可参考Mark DF等人的文章(Mark DF，et al.Site-specific mutagenesis of the human fibroblast interferon gene.ProcNalt Acad Sci USA，1984，81：5662-5666)。考虑到rhG-CSF中原有的另外两对成键的Cys(第37和43位Cys成键，第65和75位Cys成键)，为不影响原有半胱氨酸间二硫键的形成，新添加的游离半胱氨酸(Cys)应当在高活性突变体G-CSF第75位Cys残基之后，例如可以替换突变体G-CSF中76-175位氨基酸中任一现存的氨基酸为Cys，或者将Cys插入到第76-175氨基酸中两个正常相连的氨基酸之间，或者将Cys插入到突变体G-CSF成熟蛋白C-末端之后。
考虑到游离Cys的引入有可能影响rmhG-CSF的生物学活性和PEG修饰反应的进行，因此，Cys的引入位点还需要进行优化。根据HillC.P等人报道的rhG-CSF的三维结构(Hill CP等，PNAS，90:5167-5171(1993))，G-CSF具有4个α螺旋结构，分别为A(11-39)，B(71-91)，C(100-123)和D(143-172)，这4个螺旋结构和G-CSF的生物学活性密切相关。因此，为不影响蛋白活性，游离Cys的引入位点最好是在上述得到的高活性的G-CSF突变体α螺旋结构外，其中引入的游离Cys优选位于突变体G-CSF的C-D环，即在突变体G-CSF蛋白序列的第123-143位，或插入到突变体G-CSF成熟蛋白C-末端之后。
表1rhG-CSF和各种rmhG-CSF修饰前后的活性
| G-CSF突变蛋白 | Cys突变位点 | 活性 ×108IU/mg | 相对值 | mPEG-Mal20000修饰后 ×108IU/mg | 相对值 |
| rmhG-CSF | rhG-CSF第2、4、5、6、18位突变为Ala、Thr、 Tyr、Arg和Ser，无游 离Cys | 1.21 | 100％ | 无修饰 | 100％ |
| rmhG-CSF-Cys176 | rmhG-CSF第175位(C端)插入Cys(176位) | 1.23 | 102％ | 1.25 | 103％ |
| rmhG-CSF-Ala140->rmhG-CSF-Cys140 | rmhG-CSF Ala140(位于C-D环)突变为Cys140 | 1.20 | 99％ | 1.17 | 96％ |
| rmhG-CSF-Gly136->rmhG-CSF-Cys136 | rmhG-CSF Gly136(位于C-D环)突变为Cys136 | 1.12 | 91％ | 1.01 | 83％ |
| rmhG-CSF-Pro3->rmhG-CSF-Cys3 | rmhG-CSF Pro3(N端)突变为Cys3 | 1.09 | 90％ | 0.67 | 55％ |
| rmhG-CSF-Ala8->rmhG-CSF-Cys8 | rmhG-CSF Ala8(位于螺旋A)突变为Cys8 | 1.07 | 88％ | 0.64 | 52％ |
| rhG-CSF | - | 0.82 | 68％ | 无修饰 | 68％ |
根据这一方案，本发明人设计了一系列的点突变实验，来确定合适的Cys引入位点，其结果列在表1中。从表中我们发现引入在176位、140和136位的Cys都没有影响原来高活性的rmhG-CSF的活性，其突变体蛋白序列分别和附图1中的Seq ID No.2、Seq ID No.4和Seq ID No.6描述的序列一致。而在N-端附近引入Cys却使rmhG-CSF的活性降低，PEG修饰后的rmhG-CSF的活性明显下降，这也验证了先前的讨论。
rmhG-CSF可以通过原核生物或真核生物宿主基因重组技术表达外源性DNA序列而得到，合适的原核生物宿主包括各种细菌(如Ecoli.)；合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)。依据所用的宿主的不同，rmhG-CSF表达产物可能会被哺乳动物或其它真核细胞中的碳水化合物所糖基化修饰。对于本发明所用的人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)突变体，优选的采用原核表达系统或酵母表达系统的产物，例如E.coli或甲醇酵母表达系统。
这些改构的rmhG-CSF，由于蛋白序列中只存在一个游离的Cys，因此，带有巯基反应基团的半胱氨酸反应性聚乙二醇(PEG)如聚乙二醇马来酞亚胺基(mPEG-Maleimide，mPEG-Mal)和聚乙二醇正吡啶二硫化物(mPEG-Ortho-pyridyldisulfide，mPEG-OPSS)等聚乙二醇巯基反应试剂可以和rmhG-CSF的Cys基团特异性的结合，获得聚乙二醇定点单修饰的产物。这些活性聚乙二醇可以是分子量大于5kDa的任意大小的PEG，其形状可以是单链或者分支状，其中优选分子量在5kDa到40kDa之间的分枝或线性PEGs，更优选分子量为20kDa的聚乙二醇马来酞亚胺基(mPEG-Mal20000)。
如前所述，由于G-CSF突变体rmhG-CSF-Cys的蛋白序列中只存在一个游离的Cys，因此，带有巯基反应基团的PEG只能和rmhG-CSF的Cys基团特异性的结合，获得聚乙二醇定点单修饰的产物，这克服了背景技术中PEG修饰N端的α-氨基所带来的反应位点不一和多修饰产生等缺陷，简化了后续纯化过程，提高了蛋白收率。此外，半胱氨酸反应性PEGs和游离Cys的结合是在rmhG-CSF活性区以外的位置，如表1的C末端和C-D环上，因此修饰后的蛋白活性基本未受影响。由于突变体G-CSF的活性要比未突变的G-CSF的活性高1.5-4倍，加上PEG修饰后对蛋白活性的影响，总体而言，PEG修饰G-CSF蛋白游离Cys后的产物要比PEG修饰G-CSF蛋白游离氨基后的产物的活性要高1.5-4倍，经动物实验证实，其体内半衰期延长到了14.2小时，比未修饰的G-CSF(T1/2＝2.1小时)提高了7倍，达到了长效、减少给药次数的目的。
本发明还提供了一种半胱氨酸反应性PEGs修饰rmhG-CSF的方法，其包括如下步骤：
(1)在中性或碱性的含水介质中，带有巯基反应基团的聚乙二醇分子与人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)中的游离Cys反应；
(2)任选地从反应混合物中分离聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)的产物。
较合适的修饰反应条件是rmhG-CSF浓度至少为1毫克/毫升，蛋白质:PEG分子的比例在1:1-1:20之间，pH条件为中性到碱性，优选为pH7-9.5。经修饰反应后获得的为含有PEG-rmhG-CSF的混合物，其中含有PEG-rmhG-CSF、未反应的活性PEG分子和rmhG-CSF等。需要通过合适的分离纯化方法，例如通过离子交换层析和分子筛层析的组合来纯化上述混合物体系，最终获得的制品含有至少90％以上的PEG-rmhG-CSF和至多10％的未发生聚乙二醇化的rmhG-CSF，优选制品含有至少95％以上的PEG-rmhG-CSF和至多5％的未发生聚乙二醇化的rmhG-CSF。本发明所制备的PEG-rmhG-CSF，与以前的方法相比，生物学活性更高而且修饰性专一，纯化工艺相对简单，从而达到降低剂量和工艺复杂性，最终达到提高疗效和降低生产成本的目的。
本发明还提供了一种含有聚乙二醇单修饰重组人粒细胞集落刺激因子突变体(PEG-rmhG-CSF)的药物组合物，该药物组合物含有上述的有效量的生物制品和药用稀释剂、佐剂或载体等。该药物组合物可用于治疗因放疗、化疗等引起的中性粒细胞减少症，由于半衰期延长，因此可实现每周只给药1次。优选制剂为注射水针，每毫升含6mg mPEG-Mal20000-rmhG-CSF-Cys176，0.35mg乙酸钠，30.0mg山梨醇，0.02mg聚山梨醇酯20和0.02mg的氯化钠，pH为4.0。
以下实例将进一步说明本发明。
附图说明
附图1为各种重组人粒细胞集落刺激因子突变体的DNA核苷酸序列和氨基酸序列
附图2为纯化过程中的SDS-PAGE电泳图
附图3为Source S分离纯化PEG-rmhG-CSF-Cys176的层析图
附图4为小鼠皮下给药后rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF-Cys176的血药浓度-时间曲线
附图5为小鼠皮下给药后rhG-CSF、PEG-rmhG-CSF-Cys176和空白对照组的白细胞总数变化情况
具体实施方式
实施例1由原核表达系统表达的重组rmhG-CSF-Cys176的制备
rmhG-CSF-Cys176是把rhG-CSF第2，4，5，6，18位氨基酸分别突变为Ala、Thr、Tyr、Arg和Ser，并且在C-末端额外引入了一个半胱氨酸(Cys)，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如附图1中的SeqID No.1和Seq ID No.2所述。rhG-CSF基因的克隆方法可参考中国专利CN96106418.8，以此为模板，为了得到预期的突变体G-CSF基因，设计引物如下：
上游引物：5‘-ACTAGCCATATGGCACCAACATACCGTGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCTGCTCAAGTCCTTAGAGCAAGTGAGG-3’；
下游引物：5‘-AAAGGATCCTTAACAGGGCTGGGCAAGG-3’；
用常规PCR方法进行目的基因的扩增。PCR产物经回收、纯化，装到pGEM-T载体(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)，转化DH5α感受态细胞，做蓝白斑筛选，将阳性克隆送测序检测。将测序正确的克隆基因用ndeI和BamH I(Gibco BRL公司)从pGEM-T上切割回收，然后装到经同样酶切处理的pET32a(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)，T4 DNA连接酶(Gibco BRL公司)，12.5℃连接过夜，转化BL21感受态细胞，挑选单菌落，用柱式质粒小提试剂盒小提质粒(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)，然后用ndeI和BamHI酶切鉴定。构建成功的菌株参考文献(Welte K等，Proc NatAcad Sci，82：1526-1530(1985)进行表达和纯化，其蛋白复性条件为：rmhG-CSF-Cys176的包含体溶解于200ml增溶液中(8M尿素、10mmol/L DTT、25mmol/L半胱氨酸，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0)，室温搅拌30分钟后用复性缓冲液(15％甘油，40μmol/L硫酸铜，40mmol/L磷酸钠缓冲液，pH8.0)稀释到1000ml，4℃搅拌复性48小时。然后用稀盐酸调节pH到4.0，经Resource S离子交换柱层析，以0-0.5mol/L NaCl(含20mmol/L NaAc，pH4.0)梯度洗脱，目标峰在0.3mol/L NaCl时被洗脱，经检测，所得的目标缝收集液中rmhG-CSF-Cys176蛋白纯度大于95％。
实施例2由原核表达系统表达的重组rmhG-CSF-Cys140的制备
rmhG-CSF-Cys140是把rhG-CSF第2，4，5，6，18位氨基酸分别突变为Ala、Thr、Tyr、Arg和Ser，并且在140位突变了一个半胱 氨酸(Cys)，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如附图1中的Seq IDNo.3和Seq ID No.4所述。rhG-CSF基因的克隆方法可参考中国专利CN96106418.8，以此为模板，为了得到预期的突变体G-CSF基因，设计引物如下：
上游引物：5‘-ACTAGCCATATGGCACCAACATACCGTGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCTGCTCAAGTCCTTAGAGCAAGTGAGG-3’；
下游引物：引物1：
5‘AAGGATCCGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGAACGCGGTACGACACCTCCAGGAAGC3’；
引物2：5‘TCCAGGAAGCTCTGCAGATGGGAGGCAACCAGGACCCCTCCGCACCGGCGC3’；
先用下游引物2和上游引物对rhG-CSF基因进行PCR的扩增，再用下游引物1和上游引物，以第一次扩增产物作为模板进行目的基因扩增。PCR产物经回收、纯化，装到pGEM-T载体(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)，转化DH5α感受态细胞，做蓝白斑筛选，将阳性克隆送测序检测。将测序正确的克隆基因用NdeI和BamHI(GibcoBRL公司)从pGEM-T上切割回收，然后装到经同样酶切处理的pET32a(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)，T4DNA连接酶(Gibco BRL公司)，12.5℃连接过夜，转化BL21感受态细胞，挑选单菌落，用柱式质粒小提试剂盒小提质粒(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)，然后用NdeI和BamH I酶切鉴定。构建成功的菌株参考文献(Welte K等，Proc Nat Acad Sci，82：1526-1530(1985)进行表达和纯化，其蛋白复性条件为：rmhG-CSF-Cys140的包含体溶解于200ml增溶液中(8M尿素、10mmol/L DTT、25mmol/L半胱氨酸，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0)，室温搅拌30分钟后用复性缓冲液 (15％甘油，40μmol/L硫酸铜，40mmol/L磷酸钠缓冲液，pH8.0)稀释到1000ml，4℃搅拌复性48小时。然后用稀盐酸调节pH到4.0，经Resource S离子交换柱层析，以0-0.5mol/L NaCl(含20mmol/LNaAc，pH4.0)梯度洗脱，目标峰在0.3mol/L NaCl时被洗脱，经检测，蛋白纯度为95％以上。
实施例3PEG-rmhG-CSF-Cys176的制备
rmhG-CSF-Cys176的修饰反应和分离：准备50ml lmg/ml的rmhG-CSF-Cys，含100mM Bicine(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)(pH8.5)，然后加入5倍摩尔比的PEG-MAL20000(Nektar)。在室温下搅拌反应24小时，反应产物用水稀释到蛋白浓度为0.1mg/ml，稀盐酸调pH至4.0，过离子交换柱Resource S，在0-0.5MNaCl，20mM NaAc(pH4.0)中以阶段梯度洗脱，其中单修饰的PEG-rmhG-CSF-Cys176在20％梯度洗脱下，目标峰再经Sephadex G25脱盐层析。
由于PEG-MAL只能特异性地与rmhG-CSF-Cys176末端的Cys反应，因此修饰后不同于常规的PEG修饰存在多修饰情况，被修饰的rmhG-CSF-Cys176与PEG均是1：1结合，但是也存在部分未被修饰的rmhG-CSF-Cys176。由于PEG修饰后，蛋白质的电荷性质发生显著改变，因此利用离子交换层析可以有效地把修饰蛋白，PEG-MAL20000，rmhG-CSF-Cys176进行有效地分离。分离产物的电泳图如附图2所示，其中1、6道为蛋白质分子量标准，分子量从下到上分别为14.4、21、31、43、67和96kDa；2道为纯化的rmhG-CSF-Cys176；3道为PEG 修饰反应混合物；4道为Resource S洗脱峰1，亦即PEG-rmhG-CSF-Cys176，分子量约为40kDa，与预期相符；5道为Resource S洗脱峰2，为未参与反应的rmhG-CSF-Cys176。经薄层扫描分析，2，4，5道的蛋白纯度均在95％以上。
图3所示为Resource S离子交换层析分离修饰PEG-rmhG-CSF-Cys176的层析图谱。由于PEG修饰后rmhG-CSF176等电点下降，因此PEG-rmhG-CSF-Cys176先被洗脱，最后洗脱的为rmhG-CSF-Cys176。通过离子交换层析，PEG-rmhG-CSF-Cys176可以获得有效的分离。而且，由于PEG-MAL与rmhG-CSF-Cys176只有一个Cys反应位点，避免了一般PEG修饰中很难分离的多个单修饰异构体的存在，因此分离纯化工艺也得以简化。
实施例4PEG-rmhG-CSF-Cys176等生物学活性的分析
体外生物活性的测定：采用MTT方法((Welte K等，Proc Nat AcadSci，82：1526-1530(1985))。具体步骤为：在96孔细胞培养板中接种一定浓度的细胞悬液(50μL/孔)，将rhG-CSF标准品(中国药品生物制品检定所)和修饰rhG-CSF样品系列稀释，各50μL加入培养板相应孔中。设阳性对照、阴性对照(不含rhG-CSF)和空白对照(只含培养液)，37℃，5％CO2培养36-48h，加MTT溶解液100μL/孔，次日测定各孔A570/A630值。
最终获得产物的比活见表2，测定显示rmhG-CSF-Cys176的生物学活性为1.23x108IU/mg，rhG-CSF为0.82x108IU/mg，rmhG-CSF-Cys176的活性比rhG-CSF高50％，说明我们获得了高活性的rmhG-CSF。而且 PEG修饰前后的rmhG-CSF-Cys176的生物学活性分别为1.23x108IU/mg和1.25x108IU/mg，可见经PEG修饰后对蛋白活性没有影响，而N端PEG修饰的阳性对照PEG-rhG-CSF(Neulasta，Amgen公司)生物活性为0.58x108/mg，表明C末端定点修饰较N端优越，它不影响生物活性。综合以上实例，表明我们制备的PEG-rmhG-CSF-Cys176是活性更高和结构更均一的制品。
表2.各种G-CSF体外生物学活性比较
实施例5PEG-rmhG-CSF-Cys176体内药物代谢动力学和药效动力学的分析
药代动力学的测定：采用双抗体夹心ELISA法检测样品中rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF-Cys176的血药浓度。每组三只来自中科院上海动物试验中心的18～22g雄性SPF级ICR小鼠，参照表3进行注射和采集血样后，再将血样离心30min后分离血清，-20℃保存待测。用双抗体夹心ELISA法检测样品中rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF-Cys176的血药浓度，具体操作参见Human G-CSF DuoSet试剂盒(R&DSystems)的操作手册。得到标准品的数据用MicroCal Origin软件中的四参数逻辑曲线绘制标准曲线，并求回归方程及相关统计参数；用Microsoft Excel 2003软件将样品数据代入标准曲线的回归方程计算 相关数值并作图；最后用3P87软件进行曲线拟合并计算主要药代动力学参数。
表3皮下给药和取样方法
*SC＝subcutaneous；D1＝first day
结果：rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF-Cys176小鼠皮下给药(subcutaneous，SC)后的血药浓度-时间数据主要药动学参数见表4，PEG-rmhG-CSF-Cys176与rhG-CSF在小鼠体内的血药浓度-时间曲线比较见图4。从表4中可看到：rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF-Cys176血清中药物的半衰期(T1/2)分别为2.1h和14.2h，后者是前者的7倍；PEG-rmhG-CSF-Cys176的AUC值为143280ng·h·ml-1，是rhG-CSF的16倍；从图4的血药浓度-时间曲线图可直观看出，达峰时间PEG-rmhG-CSF-Cys176明显大于rhG-CSF，并且在70h后在血液中可以检测到PEG-rmhG-CSF-Cys176的血药浓度，血药浓度的波动显著减少。从上述药代参数对比来看，PEG修饰技术确实可以延长rhG-CSF的半衰期，从而达到长效的目的。
表4小鼠皮下给药后rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF-Cys176的药代参数
Abbreviations：SC＝subcutaneous；T1/2＝terminal half+life；T(peak)＝time of maximum concentration；C(max)＝maximum concentration；AUC＝area under the curve；CL/f(s)＝clearance over bioavailability；V/f＝volume ofdistribution using the terminal phase.
药效动力学的分析：自中科院上海实验动物中心购入19～23gICR小鼠245只(125只雄性，120只为雌性)，除正常对照组注射等量的生理盐水外，其余小鼠注射环磷酰胺1mg/10g体重，连续3天，随机取正常和造模小鼠5只，经测试造模成功。将造模成功小鼠随机分成3组，分组和给药见下表5，给药剂型为水针，每毫升含6mg的mPEG-Mal20000-rmhG-CSF-Cys176，0.35mg乙酸钠，30.0mg山梨醇，0.02mg聚山梨醇酯20，和0.02mg的氯化钠，pH为4.0。采集各组给药后D2、D4、D6、D8天各5只小鼠血样进行血细胞计数和白细胞分类计数和评价。
表5分组和给药
结果如下：表6、图5分别为小鼠皮下给药后rhG-CSF、PEG-rmhG-CSF-Cys176和对照的白细胞总数表和图。从中可看出 PEG-rmhG-CSF-Cys176对环磷酰胺引起的小鼠白细胞减少症有升白作用，其5天一次注射的效果与每天注射的rhG-CSF效果相当。
表6小鼠皮下给药后rhG-CSF、PEG-rmhG-CSF-Cys176和对照的的白细胞总数
| 组别 | 剂量 | WBC(k/ul)(第2天) | WBC(k/ul)(第4天) | WBC(k/ul)(第6天) | WBC(k/ul)(第8天) |
| rhG-CSF | 0.1mg/kg*5 | 2.58±1.38 | 2.70±1.27 | 12.34±9.36 | 4.70±2.52 |
| PEG-rmhG- CSF-Cys176 | 0.5mg/kg | 1.42±0.65 | 13.16±3.45 | 12.70±13.50 | 4.30±1.47 |
| NS组 | 0.1ml/10g | 1.38±0.59 | 2.40±1.39 | 6.18±5.12 | 7.82±4.20 |
序列表
<110>杭州九源基因工程有限公司
<120>一种聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体及其制备方法
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>528
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
atggcaccaa cataccgtgc cagctccctg ccccagagct tcctgctcaa gtccttagag 60
caagtgagga agatccaggg cgatggcgca gcgctccagg agaagctgtg tgccacctac 120
aagctgtgcc accccgagga gctggtgctg ctcggacact ctctgggcat cccctgggct 180
cccctgagca gctgccccag ccaggccctg cagctggcag gctgcttgag ccaactccat 240
agcggccttt tcctctacca ggggctcctg caggccctgg aagggatctc ccccgagttg 300
ggtcccacct tggacacact gcagctggac gtcgccgact ttgccaccac catctggcag 360
cagatggaag aactgggaat ggcccctgcc ctgcagccca cccagggtgc catgccggcc 420
ttcgcctctg ctttccagcg ccgggcagga ggggtcctgg ttgcctccca tctgcagagc 480
ttcctggagg tgtcgtaccg cgttctacgc caccttgccc agccctgc 528
<210>2
<211>176
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
Met Ala Pro Thr Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu
1 5 10 15
Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu
20 25 30
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu
35 40 45
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser
50 55 60
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His
65 70 75 80
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile
85 90 95
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp val Ala
100 105 110
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala
115 120 125
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala
130 135 140
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser
145 150 155 160
Phe Leu Glu val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Cys
165 170 175<210>3
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<211>175
<212>PRT
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Claims (21)
1.一种聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)，结构形式为PEG-rmhG-CSF，其特征在于：所述的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)的氨基酸序列和Seq IDNo.2、Seq ID No.4或Seq ID No.6所示序列一致；所述PEG为带有巯基反应基团的聚乙二醇分子，该聚乙二醇分子通过巯基与rmhG-CSF中的游离半胱氨酸(Cys)结合。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)，其特征在于：所述的聚乙二醇分子为聚乙二醇马来酞亚胺基或聚乙二醇正吡啶二硫化物。
3.根据权利要求2所述的聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)，其特征在于：所述的聚乙二醇分子分子量在5kDa到40kDa之间。
4.根据权利要求2所述的聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)，其特征在于：所述的聚乙二醇分子为单链或分枝状。
5.根据权利要求2所述的聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)，其特征在于：所述聚乙二醇分子为聚乙二醇马来酞亚胺基，分子量为20kDa。
6.一种含有如权利要求1所述的聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)的生物制品，其特征在于：所述制品含有至少90％以上的PEG-rmhG-CSF和至多10％的未发生聚乙二醇化的rmhG-CSF。
7.根据权利要求6所述的生物制品，其特征在于：所述制品含有至少95％以上的PEG-rmhG-CSF和至多5％的未发生聚乙二醇化的rmhG-CSF。
8.根据权利要求7所述的生物制品，其特征在于：所述的聚乙二醇分子为分子量20kDa的聚乙二醇马来酞亚胺基，所述的rmhG-CSF为rmhG-CSF-Cys176，其氨基酸序列与Seq ID No.2所示序列一致。
9.权利要求6-8中任一项的生物制品在制备治疗因放疗、化疗等引起的中性粒细胞减少症药物中的应用。
10.一种药用组合物，其含有有效量的选自权利要求6-8中任一项的生物制品，和药用稀释剂、佐剂或载体。
11.根据权利要求10所述的药用组合物，其特征在于：所述制剂为注射水针，每毫升溶液中含有6mg mPEG-Mal20000-rmhG-CSF-Cys176，0.35mg乙酸钠，30.0mg山梨醇，0.02mg聚山梨醇酯20和0.02mg的氯化钠。
12.一种制备如权利要求1所述的聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)的方法，其包括如下步骤：
(1)在中性或碱性的含水介质中，带有巯基反应基团的聚乙二醇分子与重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)中的游离Cys反应；
(2)任选地从反应混合物中分离聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)的产物。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述的聚乙二醇分子分子量在5kDa到40kDa之间。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述的聚乙二醇分子分子量为20kDa。
15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述的聚乙二醇分子为单链或分枝状。
16.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：rmhG-CSF蛋白浓度至少为1毫克/毫升，蛋白质∶PEG分子的比例在1∶1-1∶20之间。
17.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述的分离步骤包括离子交换层析和分子筛层析。
18.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：含水介质的pH范围为7.0-9.5。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于：含水介质的pH为8.5。
20.根据权利要求12-19任一项所述的方法，其特征在于：所述的聚乙二醇分子为聚乙二醇马来酞亚胺基或聚乙二醇正吡啶二硫化物。
21.一种重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)，其特征在于：所述的突变体的氨基酸序列和Seq ID No.2、Seq ID No.4或SeqID No.6所示序列一致。
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