CN112316120A - 使用低动员型g-csf有效且安全治疗粒细胞减少症的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一个通过降低动员而加强促粒细胞生成作用治疗或预防发热性粒细胞减少症和3/4度粒细胞减少症的方法。这个方法,将低动员型重组人粒细胞集落刺激因子(De‑mobilized G‑CSF),在所选择的给药时间、模式和控制剂量下,应用于化疗所致的粒细胞减少症并具发热性粒细胞减少症发生风险的病人。本发明还提供了分辨低动员型G‑CSF和高动员型G‑CSF的证据,以及制备一种低动员型G‑CSF的方法。
Description
发明领域
本发明专利涉及一种使用低动员型G-CSF治疗和预防粒细胞减少症的新方法,低动员型G-CSF是一种动 员功能降低的粒细胞刺激因子。本发明专利还涉及从长效型G-CSF中鉴别低动员型和高动员型G-CSF的 方法。本发明还包括一种单一、定点修饰蛋白及其类似物的新方法;在一方面,这种方法涉及单一、蛋白 氮端、或蛋白碳端聚乙二醇修饰G-CSF的方法。
背景技术
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种生长因子,可促进骨髓粒系祖细胞增值和分化,增加成熟中性粒细 胞的数量和活性,并参与骨髓中性粒细胞动员释放入血循环的调节。中性粒细胞是血循环白细胞的主要组 成细胞,是机体抵御细菌等感染的重要防线,中性粒细胞也参与过继免疫反应。
粒细胞减少症是肿瘤化疗所致的常见而严重的并发症。3/4度严重粒细胞减少症可导致发热性粒细胞减少 症(Febrile Neutropenia,FN),可致很高的死亡率。非格司亭(Filgrastim,商标名:)是第一个批 准上市的重组人G-CSF,培非格司亭(Pegfilgrastim,商品名:)是第一个批准上市的长效G-CSF, 它们的应用指证是降低发热性粒细胞减少症及其感染发生率,即应用于实体肿瘤接受骨髓抑制性抗肿瘤化 疗药物伴随较高的FN发生率的病人。
临床上,批准的给药模式是一个化疗疗程注射一次,给药剂量为6mg;批准给药模式为 每天注射一次,连续7-12天,给药剂量为5μg/kg/day。和均用于预计FN发生率超过 20%以上的化疗病人,在化疗结束24小时预防性给药。然而,FN预计发生率从20%到60%的病人,化疗 所致粒细胞减少症(chemotherapyinduced neutropenia,CIN)的严重程度与持续时间显著不同。对于预计 FN的发生率大于40%的病人,所批准的培非格司亭和非格司亭治疗方法仅可减少50%的FN发生率和显 著减少3/4度粒细胞减少症的持续时间,而FN的住院死亡率仍为10%,与安慰剂组相比并无显著改善。 对于预计FN发生率低于20%的病人,并不推荐使用培非格司亭,存在尚未满足的医学需求。因此,G-CSF 类药物应用的临床安全性和有效性有待提高,需提高治疗方法的针对性和个体化。
发明内容
本发明涉及一种治疗和预防发热性粒细胞减少症(FN)和3/4度粒细胞减少症的方法,即给接受化疗的 病人注射一种低动员的重组人粒细胞集落刺激因子(低动员型G-CSF),依据发生FN的风险,选择 给药时间和控制给药剂量。
其中,接受化疗的病人患有化疗所致的粒细胞减少症。依据发生FN的风险,选择给药时间为ANC最 低值日之前3-9天;选择时间为化疗所致的粒细胞释放峰后并且或者ANC回复到1.5×109-4.0×109 cells/L.之间。CIN病人预计FN的发生风险为10-40%之间,优选于10%,和/或者预计发生3/4度粒 细胞减少症的风险大于50%,给药时间选择在ANC最低值日前5-7天,优选在ANC最低值日前3-5 天。所述控制剂量是控制疗程剂量,要不超过50μg/kg,优选不超过25μg/kg,一个化疗周期注射一 次,为Once-per-cycle模式。
如果计划给药日ANC测定值高于4.0×109cells/L,所选给药时间应顺延至ANC降到1.5-4.0×109cells/L 之间。如果计划给药日ANC测定值低于1.5×109cells/L,所选给药剂量应提高;如果计划给药日ANC 测定值高于8.0×109cells/L和/或所选给药时间已推迟超过4天,所选给药剂量应降低。
所述CIN病人预计FN的发生风险超过40%,给药时间选择在ANC最低值日前7-9天。控制给药单剂 为0.83μg/kg/day-5μg/kg/day之间,一个化疗周期注射3-10天,即每日注射模式。病人患4度粒细 胞减少症超过5天,所选给药时间为化疗结束一天。
Once-per-cycle、Every-3-day、Every-day和CCD四种给药模式,药效依次增强。如果前次化疗周期出现 FN或4度粒细胞减少症,则本次给药模式要选择更有效的一个给药模式。CCD模式可替代任何剂 量注射模式,例如Once-per-cycle、Every-3-day和Every-day,并可显著改善在靶药理作用和药效。
低动员型G-CSF的每天给药模式和CCD模式可应用于各种rhG-CSF给药指证,除了动员和收集外周血 干细胞(PBPC)。
所述低动员型G-CSF的特征是:i)、由聚乙二醇(PEG)偶联或者抗体Fc片段或白蛋白融合或偶联于 G-CSF的N端;ii)、所述聚合体或融合蛋白的分子量在18800-66000道尔顿(18.8-66kDa);iii)、与 rhG-CSF或C端连接的G-CSF大分子相比,显著增加CXCR4的表达;vi)与rhG-CSF或C端G-CSF 大分子相比,显著降低中性粒细胞和CD34+细胞的释放峰。其中,低动员型G-CSF包括 PEG20-rhG-CSF、PEG30-rhG-CSF、PEG40-rhG-CSF、Fc融合G-CSF和albumin融合G-CSF。一类 低动员型G-CSF是N端单一聚乙二醇化G-CSF,即一个PEG多聚体偶联在G-CSF的N端氨基上, 包括PEG20-rhG-CSF和PEG30-rhG-CSF。
其中一类C端连接G-CSF的大分子被鉴定为高动员型G-CSF;所述高动员型G-CSF的特征是:i)、由 聚乙二醇(PEG)偶联或者抗体Fc片段或白蛋白融合或偶联于G-CSF的C端;ii)、所述聚合体或 融合蛋白的分子量在18800-66000道尔顿(18.8-66kDa);iii)、与rhG-CSF或低动员型G-CSF相比, 显著降低CXCR4的表达;vi)与rhG-CSF或低动员型G-CSF相比,如PEG30-rhG-CSF,显著增高 中性粒细胞和CD34+细胞的释放峰。
附图说明
图1是离子交换层析分离聚乙二醇修饰rhG-CSF的反应混合物的模拟图。
图2是免疫印记的整合图,揭示着N端连接的G-CSF和C端连接的G-CSF对人骨髓CD33+细胞CXC4趋 化受体4(CXCR4)表达的作用。
图3A显示,在大鼠化疗所致粒细胞减少症(CIN)模型上,PEG30-rhG-CSF或Neulasta不同给药时间对 中性粒细胞反应曲线(ANC-RC)的影响
图3B显示,在大鼠CIN模型上,培非格司亭(Neulasta)在化疗周期第2天或第3天给药对ANC-RC的 影响。化疗周期第3天给药为ANC最低值日前3天。
图3C显示,一个化疗周期注射两次,不同给药间隔对ANC-RC的影响。即在大鼠CIN模型上, PEG30-rhG-CSF采用一个化疗周期注射两次的给药模式,两个给药剂量在间隔1、2、3或4天给药,对 ANC-RC的影响。其中间隔3天给药的模式,即“Every-3-day”所获ANC-RC的波动最小。
图3D显示,在大鼠CIN模型上,Neulasta采用“Once-per-cycle”(300μg/kg或600μg/kg,一次/周期) 和“Every-3-days”(90μg/kg,两次/周期)给药模式,对ANC-RC的影响。Neulasta采用“Every-3-days” 可实现有效且安全的中性粒细胞反应曲线标准(esANC-RC)。
图3E显示,在大鼠CIN模型上,PEG30-rhG-CSF采用“Once-per-cycle”(300μg/kg或600μg/kg,一次/ 周期)和“Every-3-day”(60μg/kg,两次/周期)给药模式,对ANC-RC的影响。PEG30-rhG-CSF采用 “Once-per-cycle”模式、疗程剂量(cycle-dosage)为600μg/kg,一次/周期和采用“Every-3-day”模式、 单剂剂量(single-dose)为60μg/kg(两次/周期)均可实现esANC-RC的标准。
图3F显示,在大鼠CIN模型上,PEG30-rhG-CSF采用“Once-per-cycle”(150μg/kg或300μg/kg,一次/ 周期)和“Every-day”(15μg/kg/day连续5天)给药模式,对ANC-RC的影响。PEG30-rhG-CSF采用 “Every-day”模式、单剂剂量15μg/kg/day连续5天可实现esANC-RC的标准。
图3G显示,在大鼠CIN模型上,PEG30-rhG-CSF采用“Every-day”模式(30μg/kg/day连续5天或15μg/kg/day 连续10天)和“Every-3-day”给药模式(150μg/kg,2次/周期),对ANC-RC的影响。PEG30-rhG-CSF采 用“Every-day”模式可获得更为降低的中性粒细胞释放峰以及更高的中性粒细胞恢复峰值。
图3H显示,在大鼠CIN模型上,采用“Every-day”给药模式,rhG-CSF(50μg/kg/day连续10天)和Neulasta (5μg/kg/day连续10天)或PEG30-rhG-CSF(5μg/kg/day连续10天)对ANC-RC的影响。由Neulasta或 PEG30-rhG-CSF单剂剂量5μg/kg/day所致的esANC-RC关键参数相当于或优于rhG-CSF单剂剂量 50μg/kg/day。
图4显示,在猕猴CIN的模型上,PEG30-rhG-CSF或Pegfilgrastim采用“连续控制给药(CCD)持续3 天(3-day-CCD,120μg/kg for 3days)或5天(5-day-CCD,120μg/kg for5days)”与“Once-per-cycle”(120μg/kg, once,化疗周期第4天给药)给药模式相比对ANC-RC的影响。PEG30-rhG-CSF或Pegfilgrastim采用持续 5天连续控制给药(5-day CCD)的模式,疗程剂量为120μg/kg,可实现esANC-RC的标准。
图5显示,在预计发热性粒细胞减少症(FN)发生风险为10%的CIN病人,采用“Once-per-cycle”给药 模式,注射不同给药时间和剂量的培非格司亭对ANC-RC的影响。在化疗周期第7天注射培非格司亭 50μg/kg一次可实现esANC-RC的标准,而在化疗周期第3天、注射100μg/kg一次所致ANC-RC达不到 esANC-RC的标准。图5还显示,采用每天给药模式,注射不同给药剂量(2.5μg/kg/day or 5μg/kg/day连续 10天)的非格司亭对ANC-RC的影响。注射单剂剂量为2.5μg/kg/day的非格司亭可实现esANC-RC的标 准,而注射单剂剂量为5μg/kg/day的非格司亭所获ANC-RC不能达到esANC-RC的标准。
图6A显示,在预计FN发生风险为20%的CIN病人,采用“Once-per-cycle”给药模式,在化疗周期第5 天给药一次,PEG30-rhG-CSF不同疗程剂量(12.5,25,50,75,100μg/kg)对ANC-RC的影响。注射50μg/kg 或75μg/kg疗程剂量的PEG30-rhG-CSF可获得接近esANC-RC标准的关键参数。
图6B显示,在预计FN发生风险为20%的CIN病人,Filgrastim采用每天注射模式不同给药剂量对ANC-RC 的影响。单剂剂量为2.5μg/kg/day的非格司亭所获ANC-RC更接近于达到esANC-RC的标准。
图6C显示,在预计FN发生风险为20%的CIN病人,PEG30-rhG-CSF采用“Once-per-cycle”给药模式或 Filgrastim采用每天注射模式不同疗程剂量(12.5μg/kg-100μg/kg)或不同单剂剂量(1.25,2.5 and 5μg/kg/day for Day 5-14)对外周血造血干细胞反应曲线(PBPC-RC)的影响。PEG30-rhG-CSF采用“Once-per-cycle” 给药模式、给药剂量为50μg/kg或以下,可实现安全的外周血造血干细胞反应曲线(sPBPC-RC)的标准。
图6D显示,在预计FN发生风险为20%的CIN病人,PEG30-rhG-CSF或培非格司亭采用“Once-per-cycle” 给药模式,不同分子、不同给药时间和不同疗程给药剂量对外周血造血干细胞反应曲线(PBPC-RC)的影 响。PEG30-rhG-CSF在化疗周期第5天给药、疗程给药剂量为50μg/kg或100μg/kg所获CD34+细胞释放峰 值较培非格司亭在化疗周期第2天给药、疗程给药剂量为60μg/kg或100μg/kg所获CD34+细胞释放峰值分 别显著降低75倍或7倍。
图6E显示,在预计FN发生风险为20%的CIN病人,PEG30-rhG-CSF或培非格司亭采用“Once-per-cycle” 给药模式,不同分子、不同给药时间、相同疗程给药剂量对ANC-RC的影响。与应用培非格司亭相比,应 用PEG30-rhG-CSF所致的ANC释放峰显著降低,而ANC的最低值显著提高了4.3倍。
图7显示,在预计FN发生风险等于或大于40%的CIN病人,培非格司亭采用“Once-per-cycle”(疗程剂 量100μg/kg,第2天给药,为FDA批准的给药方法)或PEG30-rhG-CSF采用“Every-3-day”给药模式(单 剂剂量25μg/kg,在第3天和第6天各给药一次),不同分子、给药模式、剂量和时间对ANC-RC的影响。 PEG30-rhG-CSF采用“Every-3-day”给药模式可以实现esANC-RC标准。PEG30-rhG-CSF采用“Every-3-day” 给药模式所获ANC最低值显著高于培非格司亭批准给药方法所致ANC最低值50多倍,而两者所致的ANC 释放峰值相差仅为1.9倍。
具体实施方式
本文所述“均一性”是指两个核酸或氨基酸序列之间的相似性。可从两个序列一个或多个位置的比较中获 得。两个序列的“均一性”可由百分比(如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%) 表示。
本文所述“治疗”包括治疗和预防措施,其目的是治愈、预防或减轻病理生理紊乱,如粒细胞减少症。理 想的临床效果是治愈、或预防疾病、减轻疾病、稳定疾病或延缓疾病的进展。治疗用于已发生的病症、预 防用于未发病症,并避免其发生。
本文所述“中性粒细胞”是白细胞或粒细胞的一类,保护机体避免感染。中性粒细胞是第一个到达细菌感 染病灶的细胞。通过吞噬或内吞作用处理机体外来入侵者。通常,中性粒细胞也帮助调节免疫反应。
本文所述“ANC反应曲线”或“中性粒细胞反应曲线”(ANC-RC)是一个化疗周期ANC动态的记录。 ANC,即绝对中性粒细胞计数,反映循环池成熟中性粒细胞的数目。许多因素,包括抗癌药物和rhG-CSF 药物都会引起中性粒细胞反应。“ANC-RC”反映一个化疗周期血循环中性粒细胞计数每天动态变化。有几 个关键参数可以展现ANC-RC的特征,例如ANC最低值、ANC释放峰、ANC恢复峰以及ANC释放峰与 ANC最低值的比值等等。
目前粒细胞减少症治疗方法尚未揭示的风险
培非格司亭(Pegfilgrastim,or Neulasta)和非格司亭(Filgrastim,orNeupogen)治疗化疗所致的粒细胞减少 症(CIN)可检测到两种基本的药理性质,即促粒细胞生成和骨髓细胞动员作用。
培非格司亭或非格司亭促粒细胞生成的性质(granulopoiesis),通过刺激骨髓粒系增值与分化、缩短分化时 间、以及增加血循环中性粒细胞绝对值(absolute neutrophilcount,ANC)而实现。与单纯化疗相比,粒细 胞生成性质包括用药后中性粒细胞的最低值(ANC nadir point)提前出现并显著升高,并在用药后5-10天 出现中性粒细胞生成峰;这是化疗后促进粒细胞加速恢复过程的主要药理作用。
然而,应用培非格司亭或非格司亭后,还可促进骨髓成熟中性粒细胞和各系祖细胞或造血干细胞释放入外 周血。中性粒细胞释放峰在用药后4小时出现,12小时达峰值,4天之内恢复至正常值范围。造血干细胞 释放峰在用药后的5-8天出现。两种释放峰的出现都是G-CSF类药物促进骨髓动员释放作用(mobilization) 的结果,这是化疗后促进粒细胞加速恢复过程中主要的脱靶药理作用(off-target pharmacological effect)。
对于实体肿瘤的化疗病人,应用培非格司亭或非格司亭可导致巨大的中性粒细胞和造血干细胞释放峰,所 批准治疗方法的安全和有效性引起本专利发明人的关注和担忧。
注射6毫克培非格司亭所导致的中性粒细胞释放峰值为32×109cells/L,高出ANC正常值上限5倍之多。 这是化疗早期巨大的成熟中性粒细胞的消耗和浪费。理论上讲,这些损失的成熟中性粒细胞可维持外周血 ANC在正常范围6-9天。
巨大的中性粒细胞释放峰通过持续增高的血循环粒细胞,还可加速培非格司亭分子的清除。证据表明:受 体介导的清除是培非格司亭分子以及其他聚乙二醇化G-CSF分子,如PEG30-rhG-CSF or PEG40-rhG-CSF 等血药浓度的主要清除机制。而加速的培非格司亭分子的清除又进一步导致血浆半衰期、生物利用度和药 效的缩短与降低。
过高的ANC还可能是导致发生脾破裂或急性呼吸窘迫综合症的诱因之一,后者是G-CSF类药物应用可导 致的致死性的并发症。
巨大的中性粒细胞释放峰由骨髓粒细胞储存池加速清除释放其中成熟粒细胞所致。本专利发明者确认,化 疗周期ANC最低值点实际是粒细胞释放的“间歇点”,即反映新生成的粒细胞释放替代化疗后残存粒细胞 释放。本发明重大而意外地发现之一是:骨髓粒细胞巨大的释放峰导致ANC最低值的降低与延续(如图 3A、3B和6A所示)。而且,巨大的释放峰严重损伤骨髓中性粒细胞的储存功能。
因此,巨大的中性粒细胞释放峰是培非格司亭或非格司亭临床应用不可接受的副作用或毒性。临床上,培 非格司亭应用后并不常规监测病人外周血ANC水平,故这是一种无症状、易被忽视的毒性。
动员骨髓造血干细胞释放入外周血是G-CSF类药物及其批准的治疗方法所致另一种且更为严重的安全风 险。造血干细胞由流式细胞分析技术检测,为CD34+细胞。培非格司亭或非格司亭临床应用后4天可从外 周血中检测到CD34+细胞的增加,峰值常出现在用药后6-7天。
培非格司亭6毫克注射一次和连续5-7天注射非格司亭10μg/kg/day所致的CD34+细胞峰值相当。连续5-7 天注射非格司亭10μg/kg/day所获外周血造血干细胞(PBSC)可达到或超过4x107cells/L,这一数量的造血 干细胞是保证外周血干细胞收集和移植成功的标准。
对于实体肿瘤接受骨髓抑制性化疗的病人,动员骨髓造血干细胞释放入外周血循环是严重的毒性。在连续 多次的肿瘤化疗周期中,骨髓造血干细胞的动员加重化疗所致的骨髓造血功能的损伤,导致更为严重而持 久的粒细胞减少症,增加发生血小板减少症甚或全血细胞减少症的风险。血小板减少症是少见而危险的化 疗并发症,可导致致死性脑出血。在G-CSF类药物治疗CIN过程中并不常规检测外周血CD34+细胞计数, 在临床实验中,这一严重的毒性也为无症状、被忽视的毒性。
总之,实体肿瘤病人接受细胞毒性化疗,应用目前批准的G-CSF类药物(特别是培非格司亭)的治疗方法, 可导致在化疗早期出现巨大的外周血中性粒细胞以及造血干细胞的释放峰,由此而带来的严重安全和药效 问题尚未引起注意。本发明专利意外发现,一类氮端连接大分子的G-CSF(N-terminally linked G-CSF)表 现出动员作用的减弱或降低,被称为低动员型G-CSF(De-mobilized G-CSF);通过选择合适的给药时间、 控制给药剂量、采用现有或创新的给药模式,应用低动员型G-CSF治疗不同FN发生率的CIN病人,可实 现:(A)显著提高粒细胞生成作用,(B)显著降低外周血中性粒细胞释放峰,(C)有效降低外周血CD34+释放峰。换句话讲,低动员型G-CSF新的治疗方法重塑了G-CSF的两个基本的药理性质,通过降低骨髓 中性粒细胞和CD34+细胞的动员释放显著提高促粒细胞生成作用。而且,通过这种药理性质的“重塑”, 新的治疗目标以及集安全、有效和成本效益于一体的临床疗效得以实现。
重塑G-CSF的药理性质
为了提高治疗实体肿瘤CIN的临床药效和安全性,G-CSF的促粒细胞生成功能和动员骨髓造血干细胞和成 熟中性粒细胞释放功能需要分离并致相反的方向,即通过显著降低动员释放功能,提升促粒细胞生成功能, 这一过程即为重塑G-CSF药理性质。
实践上,应用G-CSF类药物后,整个化疗周期中外周血“中性粒细胞有效且安全的反应曲线”(esANC-RC) 以及“安全的造血干细胞反应曲线”(sPBPC-RC)能够全面展现这种重塑的G-CSF药理性质。通常,中性 粒细胞反应曲线(ANC-RC)就是化疗周期各天ANC的记录连线,外周血造血干细胞反应曲线(PBPC-RC) 就是化疗周期各天CD34+细胞记录连线。因此,新的临床治疗目标就是达到esANC-RC和sPBPC-RC的标 准。
本发明专利发现,反应曲线的一些关键参数可以反映esANC-RC和sPBPC-RC的特征。基于临床数据本专 利发明者提炼出esANC-RC和sPBPC-RC参数标准。应用低动员型G-CSF、采用新方法治CIN的目标就 是要实现esANC-RC和sPBPC-RC参数标准。
所述加强促粒细胞生成作用的关键参数之一是ANC最低值,此值是应用培非格司亭唯一的治疗目标。当 ANC最低值低于1.0×109cells/L、或者低于0.5×109cells/L,病人易患感染、或患FN的风险甚高,后者伴 随很高的并发症率和死亡率。
另一个加强促粒细胞生成作用的关键参数是ANC恢复峰的峰值。过高的ANC恢复峰对骨髓造血功能也具 危害,尤其对于需要进行连续多个化疗周期的病人。ANC恢复峰的上限值控制意味着下一个化疗周期较少 的粒系祖细胞的杀伤。
总之,体现加强的促粒细胞生成作用的esANC-RC关键参数包括:i)ANC最低值大于1.5×109cells/L,优 选大于2.0×109cells/L;ii)ANC恢复峰的峰值在5.0-15×109cells/L范围之内,优选在5.0-10×109cells/L范 围之内。
在不延缓、甚或加强ANC恢复的同时,实现ANC释放峰的控制与安全水平是治疗目标之一。所述降低粒 细胞动员与释放作用就是外周血ANC释放峰的峰值显著低于培非格司亭标准给药方法所致的ANC释放峰 的峰值。另一方面,降低ANC释放峰的目的在于提高ANC最低值。因此,为达此目标,将ANC释放峰 峰值与ANC最低值相比,以ANC释放P/B比值(P/Bratio)反映外周血中性粒细胞反应曲线的波动性。
所述降低粒细胞动员作用的esANC-RC关键参数为:i)ANC释放峰的峰值低于24×109cells/L,或 18×109cells/L,优选为12×109cells/L;ii)P/B ratio小于12,优选为小于6。
显著降低外周血CD34+细胞释放峰也是治疗目标之一。CD34+细胞释放峰的峰值应显著低于非格司亭标准 给药方法所致的CD34+细胞释放峰值,也应显著低于常规动员和收集外周血造血干细胞所需CD34+细胞计 数的标准。
实践上,所述降低造血干细胞动员的sPBPC-RC关键参数是外周血CD34+细胞不高于5×106cells/L,4×106 cells/L,3×106cells/L,2×106cells/L,或者优选为不高于1×106cells/L。
因此,esANC-RC的标准包括加强促粒细胞生成作用和降低粒细胞动员作用的各个关键参数。esANC-RC 标准和sPBPC-RC标准都是低动员型G-CSF新的治疗方法的治疗目标。
实现esANC-RC标准和sPBPC-RC标准需满足前述ANC或CD34+细胞计数各个“优选”指标。
完全预防FN和/或3/4度粒细胞减少症的发生是应用低动员型G-CSF治疗CIN病人的终极治疗目标。
本发明专利意外证实esANC-RC和sPBPC-RC的标准与化疗动物的死亡率和临床病人的药效显著相关(如 表5和7所示)。在大鼠化疗所致的粒细胞减少症模式上,连续三个化疗周期应用培非格司亭,危害大鼠 生存,大鼠的死亡率显著高于单纯化疗的动物;而使用低动员型G-CSF,采用新的治疗方法,有利于大鼠 的生存,显著提高了试验动物的生存率。临床试验表明,使用PEG30-rhG-CSF,病人外周血ANC和CD34+细胞计数达到esANC-RC和sPBPC-RC标准,病人可完全预防FN和3/4度粒细胞减少症的发生,且无需 抗菌素的使用,治疗CIN的临床治疗目标得以实现。
低动员型G-CSF分子和性质
本专利发现了一类动员功能降低的长效G-CSF和一类动员功能增强的长效型G-CSF,并提供了鉴别的依据。 动员功能降低的长效G-CSF称为低动员型G-CSF(De-mobilizedG-CSF),是一类氮端连接大分子的G-CSF (N-terminally linked G-CSF),例如PEG30-rhG-CSF,即一种蛋白氮端、单一偶联聚乙二醇多聚体的G-CSF。 而动员功能增强的长效G-CSF称为高动员型G-CSF(High-mobilized G-CSF),是一类碳端连接大分子的 G-CSF(C-terminally linked G-CSF),例如GCSF-C-P30,即一种蛋白碳端、单一偶联聚乙二醇多聚体的G-CSF。
本专利意外发现(如表3所示),健康小鼠应用氮端连接大分子的G-CSF即N-terminally linkedG-CSF所获 外周血造血干细胞释放峰的峰值显著低于碳端连接大分子的G-CSF即C-terminally linkedG-CSF所获造血 干细胞释放峰值3.5-14倍,同时显著低于连续应用rhG-CSF所致外周血造血干细胞的峰值。实验表明,外 周血造血干细胞动员作用与骨髓细胞CXCR4表达呈负相关,如图2所示。
如表4所示,与C-terminally linked G-CSF相比,应用N-terminally linked G-CSF所致外周血ANC释放峰 的峰值显著降低近2倍,所致的ANC最低值显著升高2.8-11倍,所致ANC恢复峰显著增高1.4-3.6倍。
与rhG-CSF或C-terminally linked G-CSF相比,所选N-terminally linked G-CSF明显降低了骨髓中性粒细胞 和造血干细胞的动员,显著提高了促粒细胞生成作用。因此,在本专利中,这类N-terminally linked G-CSF 是一类动员功能降低的G-CSF,称为低动员型G-CSF,即De-mobilized G-CSF。
与rhG-CSF或N-terminally linked G-CSF相比,所选C-terminally linked G-CSF明显增加了骨髓中性粒细胞 和造血干细胞的动员,显著降低了促粒细胞生成作用。因此,在本专利中,这类C-terminally linked G-CSF 是一类动员功能增高的G-CSF,称为高动员型G-CSF(High-mobilized G-CSF)。
氮端单点聚乙二醇化偶联G-CSF(N-terminallymono-pegylated G-CSF)是一类氮端连接大分子的G-CSF (N-terminally linked G-CSF)分子中的一种。一个聚乙二醇(PEG)多聚体分子可定点偶联于G-CSF分子 的氮端形成氮端聚乙二醇化偶联的G-CSF。PEG多聚体的分子量等于或大于G-CSF蛋白的分子量,即 18.8kDa,或分子量限制在18.8-66kDa之间。优选分子量为30kDa,或40kDa,或在30kDa到40kDa之间。 PEG30-rhG-CSF就是一种氮端单点聚乙二醇化偶联G-CSF或低动员型G-CSF,并作为此类分子的代表, 应用于实施例中的许多试验。
PEG多聚体可以为单链或支链PEG多聚体。优选一个G-CSF分子偶联一个PEG多聚体分子。PEG多聚体 分子可以偶联在G-CSF蛋白N末端氨基酸上;也可偶联在G-CSF蛋白N末端部位,或距N末端100、50、 30、20、10或5个氨基酸上。PEG多聚体分子还可以偶联在G-CSF蛋白N末端糖链上。
G-CSF蛋白N末端融合或偶联抗体Fc片段或白蛋白分子是另一种氮端连接大分子的G-CSF。抗体Fc片段 或白蛋白的分子量在18.8kDa-66kDa。所述Fc片段可选自抗体IgG、IgA、IgD、IgE或IgM。抗体Fc片 段可包括Fc片段全分子或部分分子,如由CH2-CH3结构域或仅由CH3结构域组成。Fc片段或其部分结构 域可为二聚体或单体。可突变Fc片段或其部分结构域的氨基酸序列,以增加分子的水溶性、二聚体化、 亲和性(如对FcRn,FcγRI,FcγRII)或者半衰期。也可融合Fc片段的类似物分子,包括在Fc片段氨基酸 序列上添加、敲除或置换某些氨基酸。白蛋白由6个结构域组成,分子量约66kDa。可融合或偶联白蛋白 分子或其中的部分结构域于G-CSF分子。可突变白蛋白或其结构域蛋白,以提高分子的水溶性、亲和力(如 FcRn)和半衰期。
G-CSF是一种治疗性蛋白,可用于治疗粒细胞减少症、感染、糖尿病和肿瘤。G-CSF或G-CSF突变体 (G-CSFm)可以是糖蛋白或非糖基化蛋白,包括N-末端起始氨基酸为甲硫氨酸的G-CSF。G-CSFm包括 在G-CSF氨基酸序列上添加、或敲除、或替换某些氨基酸。
G-CSFm还包括在G-CSF蛋白N端或起始部分融合一个底物肽段,如作为转氨酶底物肽段的序列 AQQIVM,或作为糖基化位点的连接肽段的序列Asn-Xxx-Ser/Thr,以及作为巯基聚乙二醇化的或者糖链 偶联的多肽ASGCGPE。还包括那些与天然人G-CSF相比,降低了CXCR4表达抑制的G-CSF突变,或 者降低了动员骨髓CD34+细胞和/或中性粒细胞释放入外周血循环的突变体。
所述低动员型G-CSF的特征是:i)PEG多聚体偶联、或抗体Fc片段或白蛋白融合或偶联在G-CSF蛋白 氮端;ii)PEG多聚体或所融合的蛋白分子量在18.8kDa-66kDa;iii)与G-CSF和C-terminally linked G-CSF 相比,显著增加CXCR4的表达;iv)与rhG-CSF和高动员型G-CSF如G-CSF-C-P30(碳端偶联30kDaPEG 的G-CSF)相比,极显著降低中性粒细胞和造血干细胞的释放峰值。
所述高动员型G-CSF的特征是:i)PEG多聚体偶联、或抗体Fc片段或白蛋白融合或偶联在G-CSF蛋白 碳端;ii)PEG多聚体或所融合的蛋白分子量在18.8kDa-66kDa;iii)与G-CSF和N-terminally linked G-CSF 相比,抑制CXCR4的表达;iv)与rhG-CSF和低动员型G-CSF如P30-N-G-CSF(PEG30-rhG-CSF,氮端 偶联30kDaPEG的G-CSF)相比,极显著增高中性粒细胞和造血干细胞的释放峰值。
本专利发现,高动员型G-CSF抑制CXCR4的表达,促进骨髓CD34+细胞的动员和释放。高动员型G-CSF 更适合应用于外周血干细胞的动员和收集指证。
应用低动员型G-CSF实现esANC-RC和sPBPC-RC标准的新方法
有证据表明低动员型G-CSF新分子具有提高促粒细胞生成作用和降低造血干细胞和中性粒细胞动员作用。 但是,还需要为“Once-per-cycle”给药模式选择合适的给药时间和给药剂量,还要应用新的给药模式,低 动员型G-CSF的应用才能达到esANC-RC和sPBPC-RC的标准。
本专利意外发现,降低中性粒细胞释放峰可显著提高ANC的最低值(如图6E所示)。有限的ANC释放峰 峰值的下降,可带来数倍放大的ANC最低值的增高(如表4、图3B和6E所示)。
因此,降低粒细胞和造血干细胞的动员与释放可以加强促粒细胞生成作用。通过选择合适的给药时间和控 制给药剂量,可实现粒细胞动员与释放作用的降低;通过控制给药剂量,可以实现造血干细胞动员与释放 作用的降低。通过选择合适的给药时间和给药模式、以及控制的给药剂量,可以实现esANC-RC和 sPBPC-RC的标准。
给药时间
所选合适的给药时间应能避免刺激或加重粒细胞的释放。骨髓成熟粒细胞储存池的大小也是调节外周血中 性粒细胞释放峰的高低机制之一。
骨髓中性粒细胞的释放是一种生理反应。但许多药物,如抗癌药和皮质类固醇药物可促发粒细胞释放峰。 为避免刺激或加重中性粒细胞的释放,低动员型G-CSF的给药时间应选择在化疗药所致粒细胞释放峰之后 (如图3A和6E所示),和/或ANC回复至1.5-3.0×109cells/L范围时,后者提示骨髓成熟中性粒细胞池的 大小已有限。
若抗癌药使用后未产生中性粒细胞释放峰或有证据表明骨髓粒细胞池已枯竭,低动员型G-CSF可在化疗后 24小时注射。因此,化疗周期几个重要的时间节点需要检测ANC,如化疗前、化疗后12小时、计划注射 低动员型G-CSF时、注射后12小时、以及预计ANC最低值时。
通常,实体肿瘤病人应用各种化疗方案出现ANC最低值的时间是相对固定的,有经验的执业医师可预估 这时间点,也可通过测定获得。所述合适的低动员型G-CSF给药时间选择在距离ANC最低值出现日期前 至少3天(如图3B和图5所示),这是预防性注射低动员型G-CSF最短的提前给药时间。
例如,对于一个化疗周期注射一次的给药模式(Once-per-cycle),注射低动员型G-CSF的时间可以是化疗周 期第3天(预计ANC最低值前3天,如图4所示)、或是化疗周期第5天(即ANC最低值前7天,如图 6B所示)、或是化疗周期第7天(预计ANC最低值前4天,如图5所示);这几个所选给药时间均可实现 esANC-RC的标准,而培非格司亭批准的给药时间即化疗周期第2天(预计ANC最低值前10天,如图3B 和5所示),未达到esANC-RC的标准。化疗周期Day 2或Day 3注射培非格司
低动员型G-CSF合适的给药时间是在预计ANC最低值前3-9天。当预计CIN病人发生FN的几率在10-40% 之间,合适的给药时间是在ANC最低值前5-7天(如图6A和6B所示);当预计CIN病人发生FN的几率 大于40%,合适的给药时间是在ANC最低值前7-9天(如图7所示);当预计CIN病人发生FN的几率小 于10%和/或发生3/4度粒细胞减少症的几率超过50%,合适的给药时间是在ANC最低值前3-5天(如图 5所示)。
当计划给药当日ANC大于4.0×109cells/L,给药时间应推迟,直到ANC在1.5-3.0×109cells/L之间。
为避免引起巨大的ANC释放峰,所述优化的给药时间适合于低动员型G-CSF各种非连续给药模式的启始 注射时间的选择。
根据ANC的测定值选择给药时。当所测ANC低于1.5×109cells/L,应在4小时之内注射;当所测ANC在 1.5-3.0×109cells/L之间,应在24小时之内注射;当所测ANC大于4.0×109cells/L,应在2-5天之间注射。
注射剂量
为了使外周血CD34+细胞的释放峰达到sPBPC-RC标准,需要控制各种给药模式的剂量。CD34+细胞的释 放峰的降低,不仅取决于所选低动员型G-CSF分子,更取决于其给药剂量。
要实现sPBPC-RC标准,在一个化疗周期注射一次的给药模式下,培非格司亭的给药剂量需要控制在 30μg/kg或以下(如图6D所示);在一个化疗周期注射2-3次每次间隔3天的给药模式下,培非格司亭的 给药剂量需要控制在15μg/kg或以下(如图3H所示);在每天注射的给药模式下,培非格司亭的给药剂量 需要控制在5μg/kg/day或以下(如表3所示);在皮下持续控制给药模式下,培非格司亭的给药剂量在 7μg/kg/day持续7天或以下(如表6所示)。
要实现sPBPC-RC标准,在一个化疗周期注射一次的给药模式下,PEG30-rhG-CSF的给药剂量需要控制在 50μg/kg或以下(如图6D所示);在一个化疗周期注射2-3次每次间隔3天的给药模式下,PEG30-rhG-CSF 的给药剂量需要控制在25μg/kg或以下(见实施例6);在每天注射的给药模式下,PEG30-rhG-CSF的给药 剂量需要控制在5μg/kg/day或以下(如表3所示);在皮下持续控制给药模式下,PEG30-rhG-CSF的给药 剂量在10μg/kg/day持续5天或以下(如表6所示)。
当计划给药日ANC超过8.0×109cells/L和/或当给药日需推迟四天ANC方能达1.5-3.0×109cells/L之间,所 选模式的给药剂量应下调一个给药档次。
当计划给药当日ANC低于1.0×109cells/L,所选模式的给药剂量应升高一个给药档次。
一个化疗周期注射一次的模式
一个化疗周期注射一次的模式是应用低动员型G-CSF最简单、方便的给药模式,但给药时间、或剂量、或 指证需要选择和控制以期达到esANC-RC和sPBPC-RC的标准。
在“Once-per-cycle”给药模式下,基于所测定的ANC控制给药剂量是改善药效的最简单的方法之一(详 见实施例5)。当化疗结束后24小时所测ANC大于8.0×109cells/L,应控制给药剂量在0.15mg-1.5mg (2.5-25μg/kg)之间;当化疗结束后24小时所测ANC大于4.0×109cells/L,应控制给药剂量在0.3mg-3mg (5-50μg/kg)之间。
本发明发现,“once-per-cycle”模式更适合于预计FN发生率在10-40%的CIN病人,优选FN发生风险低 于20%的CIN病人,和/或4度粒细胞减少症的持续时间短于5天;给药时间在ANC最低值前5-7天;给 药剂量不超过50μg/kg。
Once-per-cycle模式也适用于预计FN发生率低于10%或预计3/4度粒细胞减少症的发生风险超过50%的 CIN病人;给药时间在ANC最低值前3-5天;给药剂量不超过50μg/kg,优选不超过25μg/kg。
为了实现esANC-RC和sPBPC-RC标准,如果计划注射当日ANC低于1.0×109cells/L,或ANC高于4.0×109 cells/L,可增加给药剂量、或延长给药时间。如果注射当日ANC高于8.0×109cells/L和/或延长给药时间超 过4天,可降低给药剂量。
低动员型G-CSF应用“Once-per-cycle”给药模式,在新选的病人、给药时间和给药剂量条件下,可以实 现esANC-RC和sPBPC-RC标准(如表4,图3F、5、6C和6D所示);依据计划给药当日所测ANC的数 值调节给药时间和/或给药剂量,也可实现esANC-RC和sPBPC-RC标准(如表7,实施例5所示)。
间隔3天给药模式
低动员型G-CSF一个化疗周期多剂注射最适给药间隔不仅与药物的血浆清除半衰期有关,还与药物所致的 粒细胞反应轨迹有关。本专利意外发现,与间隔1-2天或4天以上给药相比,间隔3天给药、一个化疗周 期给药2-3次可带来最低的粒细胞反应曲线的波动(如图3C所示)。ANC最低值的增高和释放峰的降低导 致这种粒细胞反应曲线波动的降低。
间隔三天给药模式称为“Every-3-day”(或“Every-3rd-day”)。给药剂量为25μg/kg或15μg/kg,比批准的培 非格司亭给药剂量6mg低约6倍,可显著降低ANC和CD34+释放峰。根据4度粒细胞减少症持续的时间, Every-3-day模式一个化疗周期可注射2-3次。
Every-3-day模式可用于预计FN发生风险不高于40%的CIN病人和/或4度粒细胞减少症持续5天的病人, 首剂给药时间在ANC最低值前5-7天。
低动员型G-CSF采用Every-3-day模式、给药剂量在10-25μg/kg可达到esANC-RC和sPBPC-RC的标准(如 表6和图6C和6D所示)。这种给药方式所致ANC-RC和PBPC-RC的波动性明显弱于给药剂量为100μg/kg、 Once-per-cycle的给药方式(如图3C-3E所示)。且临床试验表明,PEG30-rhG-CSF在10μg/kg-25μg/kg给 药剂量动员骨髓造血干细胞释放的能力很弱,甚或未见外周血明显的CD34+细胞释放峰的出现。
每日给药模式
进一步控制低动员型G-CSF的给药剂量达5-30μg/kg/day(相当于人体用量0.83-5μg/kg/day),连续每天给 药3-10天,意外发现伴随着ANC最低值的显著提高,骨髓中性粒细胞或造血干细胞的释放峰却显著降低 (如图3F-3H和表3所示)。低动员型G-CSF每日给药模式下,有效给药剂量和次数均低于和少于批准的 非格司亭的给药剂量和次数。
在大鼠CIN模型上,与Once-per-cycle模式一次注射300μg/kg相比,PEG30-rhG-CSF15μg/kg/day连续5 天所获粒细胞反应曲线的波动更低(如图3F所示)。与Every-3-days模式注射150μg/kg两次相比,连续每 天注射15μg/kg/day 10次或30μg/kg/day 5次可致更低的动员作用和更高的粒细胞恢复峰(如图3G所示)。 小鼠连续5天注射30μg/kg/day低动员型G-CSF未见粒细胞和造血干细胞释放峰(如表3所示)。这些结 果提示每天给药模式比Once-per-cycle和Every-3-day模式在促粒细胞生成作用上更有效。
本专利意外发现,在大鼠CIN模型上,应用每天给药模式,使ANC最低值达到同等幅度的升高,低动员 型G-CSF的用量显著低于rhG-CSF十倍(如图3H所示)。因此,低动员型G-CSF每天给药模式可以替代 Neupogen除外周血干细胞动员和收集以外所有批准的应用指证。
曾有报道证实,Neulasta的最低有效浓度为2ng/mL。每天连续应用的低动员型G-CSF给药剂量低,停药 后血药浓度很快可以低于2ng/mL浓度。因此,每天连续应用的低动员型G-CSF可应用于疗程为一周或两 周的化疗方案,且可在化疗结束后24小时给药。
持续控制递药模式(CCD)
本发明意外发现,通过注射泵控制低动员型G-CSF皮下递药的速率可显著降低甚或完全消除粒细胞和造血 干细胞的释放峰、并使ANC最低值显著提升。故低动员型G-CSF的CCD给药模式可完全达到esANC-RC 和sPBPC的标准(如图4和表6所示)。
对于长效药物如长效型G-CSF,持续控制递药模式是一种创新的给药模式。通过递药速率控制与长效药物 长半衰期的结合,极显著改善了低动员型G-CSF药效特异性。由此而带来的粒细胞反应曲线波动很小, ANC几乎在正常值的波动范围之内,且未见CD34+细胞的释放峰。
使用CCD模式,低动员型G-CSF可实现在化疗结束后24小时应用而不促发粒细胞释放峰。持续皮下递药 可由胰岛素泵或其他连续递药装置、或持续释放的递药系统控制实现。持续递药的时间在1-10天,优选 3-7天。CCD模式的给药剂量在300μg/周期-3000μg/周期、或者5μg/kg/周期-50μg/kg/周期。
低动员型G-CSF 120μg/kg持续控制递药3天或5天可达到esANC-RC和sPBPC-RC标准。整个化疗周期 ANC均在正常值范围内波动,粒细胞释放峰显著降低甚或消失(如图4和表6所示)。采用Once-per-cycle 模式,注射Neulasta300μg/kg不能达到esANC-RC的标准。在CCD模式下,控制持续给药剂量在 24μg/kg/day,使用PEG30-rhG-CSF或Neulasta在粒细胞释放峰、ANC最低值和P/B比率等指标上未见显 著差异。
猕猴300μg/kg剂量相当于人体应用的剂量为100μg/kg。如图4所示,在猕猴CIN模型上,低动员型G-CSF 采用CCD模式、给药剂量为40μg/kg可以达到esANC-RC标准,药效显著优于Once-per-cycle模式、给药 剂量为100μg/kg。PEG30-rhG-CSF采用5天CCD模式、给药剂量在50μg/kg,或Neulasta采用7天CCD 模式、给药剂量在50μg/kg均可达到sPBPC-RC的标准(如表6所示)。
CCD给药模式可用于其他长效药物的控制给药,例如白蛋白融合的G-CSF、Fc融合的G-CSF、白蛋白/Fc 融合的干扰素、白蛋白/Fc融合的红细胞生成素、PEG化红细胞生成素、白蛋白/Fc融合的GLP-1、白蛋白 /Fc融合的生长激素以及PEG化红细胞生成素、PEG化GLP-1、PEG化Fabs、PEG化尿酸酶、PEG化尿 酸氧化酶、以及前述药用蛋白的突变体及其PEG化或白蛋白/Fc融合产物、以及各种抗体药物。
预防发热性和3/4度粒细胞减少症
本发明所述技术可显著改善外周血粒细胞和造血干细胞的反应曲线,低动员型G-CSF在更专一的病人上, 通过选择合适的给药时间、模式和/或控制给药剂量,可以实现esANC-RC和sPBPC-RC的标准。因此, 发热性和/或3/4度粒细胞减少症可完全预防。
化疗所致的粒细胞减少症(CIN)发生发热性粒细胞减少症(FN)的风险与粒细胞减少症的严重程度和持 续时间相关。一个化疗方案,如果预计发生FN的风险超过60%,那么实际上将有超过90%的病人发生4 度粒细胞减少症。而如果预计发生FN的风险在20%左右,那么实际上将有超过60%的病人发生3度或以 下粒细胞减少症。显然,采用固定剂量和时间给药的Neulasta并不适合所有这些病人。
依据粒细胞减少症的严重程度和持续时间,CIN可进一步分为三类,即1)第一类为预计FN的发生风险 大于40%和/或4度粒细胞减少症的持续时间超过5天;2)第二类为预计FN的发生风险在10-40%和/或4 度粒细胞减少症的持续时间小于5天;3)第三类为预计FN的发生风险小于10%和/或预计3/4度粒细胞 减少症的发生率大于50%。
为实现完全预防FN和4度粒细胞减少症的发生,“Once-per-cycle”模式可选择预计FN的发生风险在 10%-40%之间,优选FN的发生风险低于20%和/或4度粒细胞减少症持续时间短于5天的CIN病人;给药 剂量不超过50μg/kg,给药时间在ANC最低值前5-7天。
“Once-per-cycle”模式还可选择预计FN的发生风险低于10%和/或3/4度粒细胞减少症的发生风险大于 50%的CIN病人;给药剂量不超过50μg/kg,优选25μg/kg,给药时间在ANC最低值前3-5天。如图5所 示,这种新的给药方法达到了esANC-RC的标准,完全预防了3/4度粒细胞减少症的发生。
“Once-per-cycle”模式,可以依据所测ANC值调节给药剂量和时间。例如,初选给药剂量为25μg/kg,给药 时间为化疗周期第五天(Day 5)。如果在Day 5所测ANC在1.5-3.0×109cells/L之间,注射25μg/kg剂量; 如果在Day 5所测ANC低于1.0×109cells/L,注射剂量升高至50μg/kg;如果在Day 5所测ANC高于8.0×109 cells/L,或者注射时间推迟超过4天,ANC才达1.5-3.0×109cells/L之间,注射剂量降至12.5μg/kg。如表7 所示,这种方法可达到esANC-RC and sPBPC标准,且完全预防了病人3/4度粒细胞减少症的发生。
改善现有Neulasta已批准应用方法药效的最简单方式之一是依据所测ANC值调节“Once-per-cycle”模式的 给药剂量。选择预计FN发生风险为10%-40%的CIN病人;初选和控制的给药剂量为50μg/kg,给药时间 为化疗周期第2天(Day 2,化疗结束后24小时)。如果在Day 2所测ANC在1.5-4.0×109cells/L之间,注 射50μg/kg剂量;如果在Day 2所测ANC低于1.5×109cells/L,注射剂量升高至75μg/kg;如果在Day 2 所测ANC高于4.0×109cells/L,注射剂量降至25μg/kg;如果在Day 2所测ANC高于8.0×109cells/L,注 射剂量降至12.5μg/kg。这种方法可改善ANC-RC的重要参数使之更接近达到esANC-RC的标准(如实施 例5所示)。
“Every-3-Day”模式适用于预计FN发生风险在10%-40%和/或4度粒细胞减少症持续时间超过5天的CIN 病人;给药剂量在10μg/kg-25μg/kg;给药时间在ANC最低值前5-7天;给药次数为一个化疗周期注射3 次。当给药当日ANC低于1.5×109cells/L或者优选低于1.0×109cells/L,第二或第三给药剂量也可以升高 至50μg/kg-75μg/kg。
“Every-3-Day”模式、一个化疗周期给药2次,也可用于预计FN发生率在10%-40%之间且4度粒细胞减 少症持续时间短于5天的CIN病人。当给药当日ANC低于1.5×109cells/L或者低于1.0×109cells/L,第二 给药剂量也可以升高至50μg/kg。新的给药模式可实现esANC-RC和sPBPC-RC标准,与“Once-per-cycle” 一次注射100μg/kg相比,显著提升了ANC最低值(如图7所示)。
“Every-Day”给药模式适用于预计FN发生风险大于40%的CIN病人。给药剂量为等于或小于5μg/kg/day; 给药时间为ANC最低值前7-9天。新的给药方法可以实现esANC-RC和sPBPC-RC标准。在动物CIN模 型上,2.5μg/kg/day连续注射5天,与“once-per-cycle”模式注射50μg/kg一次相比,显著降低粒细胞反应 曲线的波动性,显著提高ANC最低值;与“Every-3-days”模式25μg/kg注射二次相比,每天注射0.83μg/kg/day 连续10天或5μg/kg/day连续5天,动员释放作用降低、粒细胞生成作用升高。
在“CCD”给药模式下,低动员型G-CSF的皮下吸收速率受到控制,且其吸收速率可低于皮下注射给药模 式。因此,“CCD”可以在较高的疗程给药剂量下,不会加速中性粒细胞和CD34+细胞的释放。要达到esANC-RC和sPBPC-RC的标准,PEG30-rhG-CSF在CCD模式下的疗程有效剂量低于Neulasta在 Once-per-cycle模式下10倍(如表6所示)。
CCD给药模式适用于预计FN发生风险超过40%和/或4度粒细胞减少症持续时间超过5天的CIN病人, 给药剂量在10μg/kg-50μg/kg之间,持续3-7天。
CCD给药模式也适用于预计FN发生风险低于40%或在20%-40%之间的CIN病人,给药剂量在 5μg/kg-10μg/kg之间。因此,CCD给药模式可用于预计FN发生风险大于20%和/或大于40%和/或4度粒 细胞减少症持续时间超过5天的CIN病人,给药剂量在5μg/kg-50μg/kg或300μg/周期-3000μg/周期,持续 时间为3-7天。
CCD给药模式的给药时间为化疗结束后24小时、或者化疗周期第1-3天。CCD给药模式由胰岛素泵、或 连续递药装置、或药物的缓释系统递药。
低动员型G-CSF的CCD给药模式可取代各种注射给药模式,如once-per-cycle、Every-3-days和Every-day 等,并可显著改善粒细胞生成作用。前述各种给药模式,呈现如下不断增强的临床药效,依次为 Once-per-cycle、Every-3-day、Every-day和CCD。如果前一次化疗周期应用低动员型G-CSF后仍发生FN 或4度粒细胞减少症,需要选取更有效的给药模式。
低动员型G-CSF的Every-day和CCD给药模式可以应用于除外周血干细胞动员以外的各种批准的rhG-CSF 指证。
低动员型G-CSF的Every-day和CCD给药模式可以取代Neupogen或非格司亭应用于接受骨髓抑制性化疗 的实体肿瘤病人、急性髓样白血病接受化疗的病人、接受骨髓移植的肿瘤病人、灌输外周血干细胞治疗病 人和严重的慢性粒细胞减少症的病人。
低动员型G-CSF的Every-day和CCD给药模式可用于1-2周为一个周期的化疗方案,因为停药后G-CSF 的血药浓度很快可以降至2ng/ml以下。
位点特异单一聚乙二醇化修饰G-CSF的方法
位点特异单一聚乙二醇化修饰G-CSF的方法由以下几步组成:1)在G-CSF溶液中加入助溶剂,以利蛋白 溶液浓缩,获得超过4mg/ml以上浓度的溶液;2)按摩尔浓度比在(0.7-3.0):1比例、或不超过3:1的 比例,将活化的聚乙二醇多聚体(PEG)加入G-CSF蛋白浓缩液中,在合适pH条件下,进行G-CSF蛋白 N-末端氨基或C-末端巯基位点特异性偶联反应;3)控制二个位点修饰PEG-G-CSF的生成率低于5%,保 证N末端氨基或C末端巯基位点特异单一聚乙二醇修饰的G-CSF占95%或以上。
本发明提供了一种蛋白质修饰的新方法,活化的PEG多聚体以位点特异性、单一修饰蛋白的方式与蛋白偶 联。通常,在这种PEG化修饰方法中,PEG多聚体与蛋白质分子的摩尔浓度比值在数倍至数十倍,这样 可以提高反应率,多修饰PEG化蛋白也增加,如果一个蛋白质分子上有多个反应位点。在本发明所述方法 中,通过提高蛋白质的摩尔浓度,制备位点特异、单一聚乙二醇化蛋白。降低PEG多聚体和蛋白分子的摩 尔浓度比、延长反应时间与适宜pH条件,可显著提高单一、特异位点的偶联率。
经超滤浓缩G-CSF溶液。浓度在4-20mg/ml。助溶剂包括二羟乙基甘氨酸、非活化PEG多聚体和山梨醇。 带有一个醛基分子的单甲氧基PEG或带有一个马来酰亚胺分子的单甲氧基PEG是活化的PEG多聚体之 一,可特异性修饰蛋白氮端氨基或碳端巯基。反应时间通常在12-36小时。
氮端氨基聚乙二醇化修饰反应的适宜条件之一是pH值在2.0-6.0之间,优选3.0-5.0之间。碳端巯基聚乙二 醇化反应的适宜条件之一是pH值在5.5-8.5之间,优选6.5-8.5之间。
位点特异单一聚乙二醇化修饰G-CSF就是一个分子PEG多聚体偶联于蛋白质的一个特异位点。可与蛋白 氮端氨基定点偶联的PEG多聚体还包括:PEG羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG-SCM)、PEG琥珀酰亚胺丙酸酯 (mPEG-SPA)、PEG琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)、PEG琥珀酰亚胺甲基丁酸酯(mPEG-SMB)、PEG 琥珀酰亚胺琥珀酸酯(mPEG-SS)、PEG琥珀酰亚胺戊二酸酯(mPEG-SG)、PEG硝基苯基碳酸酯 (mPEG-NPC)和PEG异氰酸酯(mPEG-isocyanate)。可与蛋白碳端巯基定点偶联的PEG多聚体还包括: PEG马来酰亚胺(mPEG-maleimides)、PEG邻吡啶基二硫化物(mPEG-OPSS)、PEG乙烯基砜(mPEG-VS) 和PEG硫醇(mPEG-thiols)。与G-CSF氮端定点偶联的活化PEG多聚体还包括PEG炔(PEG-alkyne)和 PEG叠氮(PEG-azide),即PEGalkyne和PEG azide的“点击”偶联(“click”conjugation)。与G-CSF羰 基偶联的PEG胺(PEG-amine)、PEG肼(PEG-hydrazide)和PEG氨氧基(PEG-aminoxy)。活化PEG多 聚体分子的分子量在1.88-6.6万道尔顿(18.8kDa~66kDa)。蛋白质可包括干扰素、红细胞生成素、胰高血 糖素肽-1(GLP-1)人生长激素、Fab、尿酸酶或尿酸氧化酶以及这些分子的突变体。
G-CSF氮端融合蛋白的制备方法
G-CSF氮端Fc融合蛋白(Fc-N-GCSF)由G-CSF N末端融合抗体IgG1的Fc片断的C-末端而成。抗体IgG1 的Fc片断的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。Fc-N-GCSF基因由CHO细胞表达和分泌,经Protein A亲 和层析和分子筛层析分离纯化。Fc-N-GCSF蛋白体外活性与G-CSF分子相当;Fc-N-GCSF蛋白的大鼠血 浆半衰期为24小时,比G-CSF分子长十余倍。
G-CSF氮端白蛋白融合蛋白(HSA-N-GCSF)由G-CSF N末端融合人血浆白蛋白(HSA)的C-末端而成。
HSA的氨基酸序列详见UniProtKB-P02768(ALBU_HUMAN)。HSA-N-GCSF基因由CHO细胞表达和分泌, 经离子交换层析和分子筛层析分离纯化。HSA-N-GCSF蛋白体外活性比G-CSF分子低10余倍;
HSA-N-GCSF蛋白的大鼠血浆半衰期为56小时,比G-CSF分子长二十余倍。
实施例1G-CSF氮端偶联产物的制备和性质
1、重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的制备方法
常规分子克隆与表达方法构建含人G-CSF基因或G-CSF突变体基因的基因工程表达载体。人G-CSF氨基 酸序列如序列1(SEQ ID NO.1)所示。表达载体转染大肠杆菌,构建基因工程高表达菌株。
G-CSF工程菌发酵培养(BIOSTAT CB.Braun,德国)生产重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)。4度下 5000rpm离心30分钟收集菌体(Sorvall RC3B,DuPont,USA),TE缓冲液(50mM Tris,1mM EDTA,pH 7.5) 悬浮菌体,高压破碎菌体(APV 2000,美国),11000rpm转速离心20分钟(Sorvall RC5B,DuPont,USA), 收集包涵体(IB)沉淀。用洗涤液(50mM Tris,1mM EDTA,2.5%Triton X100,pH7.5)悬浮、搅拌IB沉淀, 再高速离心11000rpm 50分钟;如此重复3遍,获得纯化的IB蛋白。使用变性液(50mM Tris,1mM EDTA, 8M盐酸胍,10mg/mL二硫赤鲜醇,pH 8.0)溶解IB蛋白沉淀,置4度下12小时。4度下11000rpm高速离 心40分钟,收取上清。将所收集的上清缓慢滴入复性液(20mMTris,1mM EDTA,0.5M尿素,pH 8.5,0.2g/L氧化型谷胱甘肽),稀释50-100倍,4度下静置24小时。所获rhG-CSF复性液经阳离子交换层析(SP Sepharose FF,GE Healthcare,USA)粗提,再经分子筛层析(Superdex 75,GEHealthcare,USA)精提,获得rhG-CSF 原液(20mM醋酸钠缓冲液,pH 4.5)。
2、制备rhG-CSF融合蛋白的方法
重组融合蛋白,如Fc-N-GCSF,GCSF-C-Fc,HSA-N-GCSF或GCSF-C-HSA,由G-CSF N端基因序列或C 端基因序列与IgG-Fc片断C端基因序列或经添加的EPKSSDKTHTAP铰链N端基因序列连接形成 Fc-N-GCSF或GCSF-C-Fc融合蛋白。同样的方法构建形成HSA-N-GCSF或GCSF-C-HSA融合蛋白。IgG1-Fc 的氨基酸序列如序列2(SEQ ID NO.2)所示。中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO)表达和分泌Fc-N-GCSF或 GCSF-C-Fc蛋白,Protein A亲和和分子筛层析纯化融合蛋白。NFS60细胞体外增殖试验测得Fc-N-GCSF 或GCSF-C-Fc蛋白的体外活性在2-5×107IU/mg。按摩尔浓度计算,与G-CSF的体外活性相当。Fc-N-GCSF 或GCSF-C-Fc蛋白大鼠血浆半衰期约为24小时,比G-CSF的半衰期长约10倍左右。
人血白蛋白的氨基酸序列详见UniProtKB-P02768(ALBU_HUMAN)。CHO细胞表达和分泌HSA-N-GCSF or GCSF-C-HSA融合蛋白,离子交换和分子筛层析纯化蛋白。HSA-N-GCSFor GCSF-C-HSA蛋白的体外 活性为5-20×105IU/mg。比GCSF的体外活性低约10倍,而大鼠血浆半衰期为56小时,比GCSF长约20 倍。
3、N末端或C末端点特异单一聚乙二醇化G-CSF的制备方法
按3比1的摩尔浓度比,向rhG-CSF溶液中加入无活性PEG多聚体,浓缩rhG-CSF溶液至浓度4-6mg/ml。 加入30kDa单甲氧基PEG丙醛(mPEG-ALD,NOF,日本)和硼氰化钠于浓缩的rhG-CSF溶液中,mPEG-ALD 和rhG-CSF的摩尔浓度比为2.5比1;反应体系的pH值控制在3.5-5.0之间;4度下连续搅拌反应混合物 12至16小时。用Biosep S2000柱、高压液相色谱(HPLC)法监测反应混合物中双修饰PEG化G-CSF (di-pegylated G-CSF)的含量,当双修饰PEG化G-CSF的形成率接近5%时,向反应体系中加入20倍体 积的1mM HCl溶液(pH 4.0),终止偶联反应,获反应终产物混合液。
将30kDa mPEG-马来酰亚胺(键凯,中国)加入含10mg/mlrhG-CSFmC18A&P175C的100mM二羟乙基甘 氨酸溶液(pH 7.5)中,mPEG-maleimide比rhG-CSF的摩尔浓度比为1.5比1;反应体系pH值为7.0-8.5; 4度下连续搅拌3-5小时;采用HPLC Biosep S2000分析柱监测反应混合物中双修饰PEG化G-CSF的形成 率,当双修饰PEG化G-CSF的形成率接近5%时,向反应体系中添加10倍纯水终止反应,稀盐酸调节pH 达4.0,获反应终产物混合液。
4、N末端或C末端点特异单一聚乙二醇化G-CSF的纯化方法
使用AKTA纯化仪(AKTA purifier 100,GE Healthcare,USA),离子交换(Sepharose FF)层析分离纯化N 端点特异单一PEG化G-CSF或C端点特异单一PEG化G-CSF。上样反应终产物混合液;rhG-CSF和PEG 化rhG-CSF经梯度洗脱分离,洗脱液A为10mM醋酸钠缓冲液(pH 4.0),洗脱液B为10mM醋酸钠和1M 氯化钠(pH 4.0),洗脱液B的浓度梯度分别为8%、20%和40%。图1为N末端点特异单一PEG化G-CSF 的反应终产物混合液的离子交换层析图。图1中可以看到三个洗脱峰,第一个峰含双修饰和单修饰PEG 化G-CSF,第二个峰为单修饰PEG化G-CSF,第三个峰为游离rhG-CSF,三个峰的组成由HPLC和 SDS-PAGE电泳分析(资料未提供)。
如表1所示,在4.0-6.0mg/ml的浓度范围内,随着rhG-CSF浓度的增高,N末端定点、单一偶联PEG的 G-CSF比率增加。而在较高的G-CSF的浓度溶液中,较低PEG比rhG-CSF的摩尔浓度比,如0.8-1.5:1的 比率,也可获得较高的N末端点特异、单一修饰PEG化G-CSF。
表1 rhG-CSF浓度对位点特异、单一PEG化rhG-CSF比率的作用
a:“PEG30”表示一个具有30000Da(30kDa)分子量的mPEG-ALD.
5、各种PEG化G-CSF的药代动力学参数
表2是化疗所致粒细胞减少症病人(详见实施例5)注射各种不同分子量的PEG化rhG-CSF所获药代动力 学参数。PEG30-rhG-CSF的血浆清除半衰期是PEG20-rhG-CSF的2倍,且与PEG40-rhG-CSF相比,变化 不大。
Table 2 Clinical Pharmacokinetic Parameters of PEGylated rhG-CSF★
Abbreviations:Cmax,maximum observed plasma concentration;Tmax,time ofCmax;t1/2,terminal half-life;AUC0-∞,area under the plasma concentration-timecurve from time zero to infinity;CL/F,apparent serum clearance after SCadministration of dose;MRT,Mean residence time; Tc<2ng/ml,time of plasmaconcentration less than 2ng/ml which supposed to be as the lowest drugeffective concentration.The Tc<2ng/ml for the dose 12.5μg/kg of PEG30-rhG-CSF is 72hr.
★PEGylated rhG-CSF are PEG20-rhG-CSF(Neulasta),PEG30-rhG-CSF andPEG40-rhG-CSF,which are the N-terminally PEGylated rhG-CSF with differentmolecular weights such as 20-kd PEG moiety(PEG20),30-kd PEG moiety(PEG30)and40-kd PEG moiety(PEG40).
6、N端点特异单一PEG化G-CSF的制剂组成
N端点特异单一PEG化G-CSF如PEG30-rhG-CSF的制剂组成包括10mM~20mM醋酸钠、0.004%吐温80 和2.5%-5%山梨醇,PEG30-rhG-CSF的浓度在1.5-6mg/ml,pH值3.0-4.5之间。
7、rhG-CSF、N端或C端连接的G-CSF对骨髓造血干细胞CXCR4表达的影响
如图2所示,免疫印迹的结果展示出N端偶联的G-CSF和C端偶联的G-CSF在人骨髓干细胞CXC趋化 因子受体4(CXCR4)表达上的不同作用。G-CSF抑制CXCR4在CD33+骨髓造血干细胞表面的表达,C 端连接的G-CSF(C-terminally linked G-CSF)也抑制CXCR4蛋白的表达,例如GCSF-C-P20、GCSF-C-P30、 GCSF-C-Fc和GCSF-C-HSA。N端连接的G-CSF(N-terminally linked G-CSF)却可显著增加CXCR4在CD33+骨髓造血干细胞表面的表达,例如P30-N-GCSF(PEG30-rhG-CSF)、P40-N-GCSF、Fc-N-GCSF和 HSA-N-GCSF;而培非格司亭(P20-N-GCSF或Neulasta)也具促CXCR4表达的作用,但P10-N-GCSF(10kDa PEG多聚体偶联于G-CSF的N端)不具促CXCR4表达的作用。因此,结果表明在rhG-CSF的N末端偶 联大分子PEG多聚体或者连接融合蛋白可显著促进CXCR4蛋白表达(或者显著降低对CXCR4蛋白表达 的抑制作用)。所述偶联的PEG多聚体或者融合的蛋白的分子量等于或大于G-CSF蛋白的分子量,即 18.8kDa。
8、rhG-CSF、N端或C端连接G-CSF动员小鼠造血干细胞的作用
BALB/c小鼠腹腔注射N-terminally linked G-CSF或C-terminally linked G-CSF(6μg或12μg或24μg/一次/ 只),以每天注射rhG-CSF(03μg/天/只)、连续五天注射为阳性对照,以每天注射等体积生理盐水、连续 五天注射为阴性对照。rhG-CSF注射结束后24小时或第6天取外周血(PB)。小鼠眼眶取血,置于肝素抗 凝管中。按1∶4比例添加PBS,稀释全血,Ficoll液不连续梯度离心分离(280×g,30分钟)收获外周血单 形核细胞(MNCs)。用含10%FBS、2mM L谷氨酰胺和抗菌素改良Dulbecco培养基洗涤细胞两次。
标准甲基纤维素培养基培养MNC细胞,计数集落形成细胞的总数(total CFC),包括粒-巨细胞集落形成单 位(CFU-GM)、红细胞系爆式集落形成单位(BFU-E)和多能造血祖细胞集落形成单位(CFU-GEMM)。 实验简述如下:1mlMNCs(5×104-2×105细胞)平铺在35毫米直径的甲基纤维素基础培养基上(MethoCultTM GF M3434,STEMCELL Technologies,Canada)。37度下5%CO2培养12-14天,根据集落细胞标准,计数集 落单位总数,详细的计数结果如表3所示。
表3 rhG-CSF、N末端或C末端连接G-CSF处理的小鼠中的CFC数量
连续5天注射rhG-CSF 5μg/day对照ap≤0.05
连续5天注射rhG-CSF 5μg/day对照bp≤0.001
如表3所示,与N端连接G-CSF(N-terminally linked G-CSF)相比,C端连接G-CSF(C-terminally linked G-CSF)致集落形成细胞的总数显著增高3.5~14倍,也比rhG-CSF显著增加;N端连接G-CSF致集落形 成细胞的总数也显著低于rhG-CSF。结果提示,外周血造血干细胞的动员作用与骨髓造血干细胞CXCR4 表达呈负相关。
9、在大鼠CIN模型上N端或C端连接G-CSF动员粒细胞的释放作用
如表4所示,与C端连接G-CSF相比,N端连接G-CSF导致ANC的释放峰的峰值降低约2倍、ANC最 低值显著增高2.8-11倍以及ANC的恢复峰的峰值显著增加1.4-3.6倍。
10、低动员型G-CSF和高动员型G-CSF的特点
如表3和表4所示,N端连接G-CSF与rhG-CSF和C端连接G-CSF相比,显著降低中性粒细胞和造血干 细胞的动员作用,显著提升粒细胞生成作用。因此,N端连接G-CSF是一种低动员型G-CSF(De-mobilized G-CSF)。低动员型G-CSF的特征如下:i)一个PEG多聚体偶联于或一个Fc片段或白蛋白融合到G-CSF 的N末端;ii)所述PEG多聚体或融合蛋白的分子量范围为18.8-66kDa;iii)与rhG-CSF或C-terminally mono-pegylated G-CSF相比,显著增高CXCR4的表达;iv)与rhG-CSF或High-mobilized G-CSF(如 G-CSF-C-P30)相比,显著降低中性粒细胞和CD34+细胞的动员释放。
如表3和表4所示,C末端连接G-CSF与rhG-CSF和N末端连接G-CSF相比,显著增高中性粒细胞和造 血干细胞的动员作用,显著降低粒细胞生成作用。因此,C末端连接G-CSF是一种高动员型G-CSF (High-mobilized G-CSF)。高动员型G-CSF的特征如下:i)一个PEG多聚体偶联于或一个Fc片段或白蛋 白融合到G-CSF的C末端;ii)所述PEG多聚体或融合蛋白的分子量范围为18.8-66kDa;iii)与rhG-CSF或 N-terminally mono-pegylated G-CSF相比,显著降低CXCR4的表达;iv)与rhG-CSF或De-mobilized G-CSF (如P30-NG-CSF orPEG30-rhG-CSF)相比,显著增加中性粒细胞和CD34+细胞的动员释放。
实施例2,低动员型G-CSF在环磷酰胺所致大鼠粒细胞减少症模型上的应用
SD大鼠,雄性,体重150-200克,购自北京维通利华实验动物有限公司。适应约5天实验,依据Day 0 的ANC值随机分组,每组7只,4-6组动物,一个实验含4-6组动物。除一组动物外,所有受试大鼠在试 验开始当天(Day 0)均腹腔注射110mg/kg环磷酰胺(CPA,江苏盛迪,中国)造成粒细胞减少症模型, 即化疗所致的粒细胞减少症(CIN)模型。一组动物为不接受CPA的健康对照组。依据试验设计,受试动 物接受不同给药时间、或不同给药模式、或不同给药剂量的PEG30-rhG-CSF(天津派格,中国)、培非格司亭 (Neulasta,安进,美国)或非格司亭(Neupogen,安进,美国)、或制剂配方溶液(10mM醋酸钠,5%山梨 醇,pH 4.0)的皮下注射。PEG30-rhG-CSF、Neulasta或Neupogen蛋白定量采用中国药典所述改良Lowry 氏法。化疗周期第0天、1-9天、第12和15天大鼠尾静脉微量采血,EDTA抗凝血管收集,在SysmexpocH-100i 设备上,进行全血细胞分析(CBC)。试验两组或多组间ANC反应曲线各参数间的比较,采用t检验或协 方差分析。试验结果如表4、表5和图3A-3H所示。
表4.在大鼠CIN模型的ANC-RC上的N末端或C末端连接G-CSF的作用
1、PEG30-rhG-CSF或Neulasta不同给药时间对CIN大鼠粒细胞反应曲线(ANC-RC)的影响
如图3A所示,两种低动员型G-CSF,即PEG30-rhG-CSF和Neulasta,分别在化疗周期第1天(D1)或第 2天(D2)给药。D1给药是在化疗后24小时给药,也是在化疗药所致的粒细胞释放峰之内给药;D2给 药是在化疗药所致的粒细胞释放峰结束后给药。
给药时间为D1时,PEG30-rhG-CSF或Neulasta致粒细胞释放峰值分别是5.46x106或8.19x106cells/ml、ANC 的最低值分别是0.6±0.2x106或0.3±0.1x106cells/ml、粒细胞释放峰值与ANC的最低值的比率(P/B ratio) 分别是9.1或27.3和粒细胞恢复峰的峰值分别为3.6x106或2.9x106cells/ml。给药时间为D2时,PEG30-rhG-CSF或Neulasta致粒细胞释放峰值分别是4.96x106或6.08x106cells/ml、ANC的最低值分别是 1.6±0.6x106或0.8±0.2x106cells/ml、P/B ratio分别是3.1或7.6和粒细胞恢复峰的峰值分别为4.3x106或3.6x106cells/ml。
PEG30-rhG-CSF在一个化疗周期注射一次模式下、给药时间为化疗周期第2天、注射剂量为300μg/kg(相 当于人体用量50μg/kg)时,可达到有效和安全的粒细胞反应曲线(esANC-RC)的标准。
2、N端连接G-CSF和C端连接G-CSF对CIN大鼠ANC-RC的作用
如表4所示,Once-per-cycle模式、D2注射、给药剂量相当于人体剂量50μg/kg条件下,N端连接G-CSF 所致粒细胞释放峰的峰值低于C端连接G-CSF所致粒细胞释放峰的峰值不到2倍,但是与C端连接G-CSF 相比,N端连接G-CSF可提高ANC最低值2.8-11倍。试验结果提示,降低释放峰可以提升ANC最低值, 且有限的释放峰峰值的降低,即可导致数倍的ANC最低值的增高。
3、Neulasta化疗周期第2天或第3天给药对ANC-RC的影响
如图3B所示,Neulasta在化疗周期第2天或第3天注射600μg/kg一次所获ANC-RC。第2天或第3天给 药,ANC最低值分别是1.1±0.3×106or或2.0±0.6×106cells/ml,释放峰的峰值分别是8.03±1.7或6.3±1.3×106 cells/ml,P/B ratio分别是7.3或3.15。第3天注射为预计ANC最低值前3天。在第3天注射Neulasta600μg/kg 一次可以达到esANC-RC的标准,且有限的ANC释放峰的降低,可显著提升ANC最低值。
4、一个化疗周期注射两针的模式下不同间隔给药对CIN大鼠ANC-RC的影响
如图3C所示,采用“一个化疗周期注射两针”(twice per cycle)的模式,注射间隔依次为0、1、2、3或 4天,即连续两天、间隔1天(Every-2-day)、间隔3天(Every-3-day)或间隔4天(Every-4-day)。PEG30-rhG-CSF 按此给药间隔依次注射60μg/kg结果表明:粒细胞释放峰的峰值依次为6.3±1.9、5.2±1.7、4.5±0.7或 4.3±1.4×106cells/ml,ANC最低值依次为1.1±0.3、2.5±0.8、2.7±0.3或1.3±0.4×106cells/ml,P/B ratio依次为 5.7、2.1、1.7或3.3。因此,“Every-3-day”给药模式可获较低的ANC-RC波动性。降低的ANC-RC波动 性意味着最高的ANC最低值和最低的P/B ratio。
5、Neulasta采用“Every-3-day”和“Once-per-cycle”模式对CIN大鼠ANC-RC的影响
如图3D所示,与“Once-per-cycle”注射600μg/kg相比,“Every-3-days”注射90μg/kg两次所致粒细胞释 放峰和P/B ratio显著降低(5.03±1.3×106vs.8.03±1.7×106,ttest,p<0.05;3.3vs.7.3,t test,p<0.01),而ANC 最低值显著升高(1.9±0.5vs.1.1±0.5,t test,p<0.01)。Neulasta采用“Every-3-day”模式、注射剂量90μg/kg (相当于人体剂量15μg/kg)、给药时间在第2天和第5天可达到esANC-RC的标准。试验结果表明, “Every-3-day”给药模式、注射剂量为90μg/kg、一个疗程注射两次的给药方法,比“Once-per-cycle”给 药模式、注射剂量为600μg/kg(相当于人体剂量100μg/kg)的给药方法更具高效潜力。
6、PEG30-rhG-CSF采用“Every-3-day”和“Once-per-cycle”模式对CIN大鼠ANC-RC的影响
如图3E所示,PEG30-rhG-CSF采用“Every-3-day”模式、注射剂量60μg/kg(相当于人体剂量10μg/kg)、 给药时间在第2天和第5天或者采用“Once-per-cycle”、注射剂量600μg/kg、给药时间在第2天均可达到 esANC-RC的标准。但是,“Every-3-day”模式疗程给药剂量低于“Once-per-cycle”5倍,且各ANC-RC 的关键参数均在ANC的正常值范围之内。
“Every-3-day”可以替代“Once-per-cycle”给药模式,并显著降低粒细胞动员和显著提高促粒细胞生成作 用。在临床实践中,低动员型G-CSF如果在前次化疗周期使用“Once-per-cycle”模式后发生FN或4度粒 细胞减少症,则本次化疗可以使用“Every-3-days”替代。
7、PEG30-rhG-CSF采用“Every-day”和“Once-per-cycle”模式对CIN大鼠ANC-RC的影响
如图3F所示,PEG30-rhG-CSF采用“Every-day”给药模式、给药剂量为15μg/kg/day(相当于人体用量 2.5μg/kg/day)、连续给药5天,结果显示:粒细胞释放峰的峰值为4.6±0.9×106cells/ml、ANC最低值为 2.5±0.9×106cells/ml、P/B ratio为1.4。PEG30-rhG-CSF采用每天给药模式、15μg/kg/day剂量5天可实现 esANC-RC的标准。
esANC-RC标准中关键参数,即ANC最低值,应用15μg/kg/day“Every-day”模式连续5天比“Once-per-cycle” 模式注射150μg/kg或300μg/kg显著提升。
8、PEG30-rhG-CSF采用“Every-day”和“Every-3-day”模式对CIN大鼠ANC-RC的影响
如图3G所示,PEG30-rhG-CSF采用“Every-day”模式、给药剂量30μg/kg/day连续5天或15μg/kg/day连 续10天,粒细胞释放峰的峰值为4.0±1.4x106或3.6±0.9x106cells/ml、ANC最低值为3.2±0.9x106或 2.5±0.9x106cells/ml、P/B ratio为1.25或1.44以及粒细胞恢复峰的峰值为5.8±1.0x106或3.5±1.1x106cells/ml。 PEG30-rhG-CSF采用“Every-3-day”模式、给药剂量150μg/kg、一个疗程注射2次,结果是:粒细胞释放 峰的峰值为4.8±1.3x106cells/ml、ANC最低值为2.2±0.9x106cells/ml、P/B ratio为2.2以及粒细胞恢复峰的 峰值为4.3±1.4x106cells/ml。“Every-day”或“Every-3-day”模式在所选的剂量下均可实现esANC-RC的标 准。“Every-day”模式、剂量15μg/kg/day连续10天显示出的动员作用更小、ANC的波动更接近正常值范 围。Neulasta在前述的给药模式和剂量下,也可获相同结论,具体数据未提供。试验结果表明,低动员型 G-CSF应用“Every-Day”模式较“Every-3-Day”更具高效潜力。
实验证据表明,低动员型G-CSF“Every-day”模式、剂量在5μg/kg/day连续5天给药下,不会促进骨髓成 熟粒细胞和造血干细胞的动员和释放(如表3所示)。
低动员型G-CSF“Every-day”模式可以替代“Every-3-day”给药模式,并可显著降低粒细胞和造血干细胞 动员、显著提高粒细胞生成作用。在临床实践中,低动员型G-CSF如果前次化疗周期使用“Every-3-day” 模式后发生FN或4度粒细胞减少症,则本次化疗可以使用“Every-day”替代。
9、低动员型G-CSF和Neupogen采用“Every-day”模式对CIN大鼠ANC-RC的影响
rhG-CSF和低动员型G-CSF采用“Every-day”给药模式对ANC-RC的影响详见图3H。CIN大鼠注射 Neupogen 50μg/kg/day(相当于人体剂量8.3μg/kg/day)连续10天,粒细胞释放峰的峰值为 7.4±2.9x106cells/ml、ANC最低值为2.5±0.5x106cells/ml、P/B ratio为2.9。CIN大鼠注射PEG30-rhG-CSF 或Neulasta 5μg/kg/day(相当于人体剂量0.83μg/kg/day)连续10天,粒细胞释放峰的峰值为3.8±1.4x106或4.4±0.9x106cells/ml、ANC最低值为2.9±0.8x106或2.1±0.5x106cells/ml、P/B ratio为1.3或2.1。结果表 明,CIN大鼠注射PEG30-rhG-CSF或Neulasta 5μg/kg/天连续10天所致药效相当于或优于注射 Neupogen50μg/kg/天连续10天的药效。试验结果还提示,低动员型G-CSF可以取代Neupogen应用于除外周血干细胞动员以外的各种批准的指征。
10、低动员型G-CSF不同给药方式致CIN大鼠的死亡率
为测定各种治疗方法的低动员型G-CSF导致CIN大鼠的死亡率,所有大鼠分别在第0、第16和第32天腹 腔注射110mg/kg环磷酰胺三次。每组12只动物,一组为阴性对照组,动物皮下注射制剂配方缓冲液3 次,其他各组动物按实验设计注射PEG30-rhG-CSF或Neulasta。t检验统计分析两组间死亡率的差异,p 小于0.05判断为差别显著,试验结果详见表5。
表5低动员型G-CSF不同给药方式致CIN大鼠的死亡率
与阴性对照组的死亡率相比ap﹤0.05。.
与阴性对照组的死亡率相比bp﹤0.001a.
如表5所示,连续三个周期化疗CIN大鼠的死亡率与低动员G-CSF的给药方式显著相关。各种低动员G-CSF 的给药方法并非都有利于CIN大鼠的生存;令人意外的发现是,按批准的给药方法注射Neulasta或在化疗 药注射后12小时注射PEG30-rhG-CSF,均危害大鼠的生存,导致死亡率显著增高。试验结果表明,应用后 可达到esANC-RC标准的给药方法有利于CIN大鼠的生存。
实施例3低动员型G-CSF在猕猴粒细胞减少症模型上的应用
健康猕猴、35只、5-9kg购自苏州西山中科。实验猕猴在GLP条件下驯养7天。依起始日动物ANC分组, 每组5只动物。所有猕猴按6mg/m2(每平米体表面积6毫克)剂量应用盐酸氮芥(上海旭东海浦,中国), 将盐酸氮芥溶解于50毫升生理盐水中静脉点滴给药。根据试验设计,各组受试动物或以皮下注射一次、 或以皮下连续控制递药(CCD)方式注射低动员型G-CSF或制剂溶液。使用NADA胰岛素泵IIS(SOOIL, 韩国)实现CCD,设置匀速3或5天完成控制给药(3-Day-CCD or 5-Day-CCD)。在化疗周期第0、第1-12 天、第14、16、18、21天自尾静脉抗凝取血。Sysmex XN-1000血球分析仪测定全血细胞计数。低动员型 G-CSF注射后第1、3、5、7、9、11、13和15天取血,流式细胞分析测得外周血造血干细胞计数。ANC-RC 各参数组间比较使用t检验,设置p值小于0.05为显著性差异标准。试验结果详见图4和表6。
如图4所示,低动员型G-CSF采用CCD给药模式5天递药120μg/kg可达到esANC-RC和sPBPC-RC的标准。 给药时间为化疗结束后24小时。整个化疗周期ANC均在正常2.5-6.5×109cells/L之内波动,显著降低或几乎消 除粒细胞释放峰。而且,两种低动员型G-CSF,即PEG30-rhG-CSF和Neulasta,在这种给药模式下所致粒细胞 释放峰的峰值、ANC最低值或P/B ratio均差异不显著。如表6所示,PEG30-rhG-CSF采用CCD给药模式、注 射剂量在30μg/kg-150μg/kg范围、持续给药时间为3-5天条件下,均可达到esANC-RC和sPBPC-RC的标准;Neulasta采用CCD给药模式、注射剂量为150μg/kg范围、持续给药时间为7天条件下,也可达到esANC-RC和 sPBPC-RC的标准(如表6所示)。
如图4所示,ANC-RC是由PEG30-rhG-CSF或Neulasta应用CCD模式、给药剂量为120μg/kg、从化疗周期第4 天起胰岛素泵持续递药3天所致。由PEG30-rhG-CSF或Neulasta这种给药方法所致的ANC释放峰值分别是 3.84±0.73或13.80±2.31×109cells/L、ANC最低值分别是2.5±0.61×109或1.5±0.82×109cells/L、P/B ratio分别是1.5 或9.2。仅PEG30-rhG-CSF的这个给药模式、剂量和时间可实现esANC-RC标准。
Neulasta或PEG30-rhG-CSF采用Once-per-cycle模式、注射剂量为300μg/kg所致ANC-RC不能满足esANC-RC 标准。与此Once-per-cycle给药模式相比,Neulasta或PEG30-rhG-CSF采用CCD给药模式、给药剂量为120μg/kg、 给药时间为化疗后24小时可显著降低粒细胞释放峰4.47或2.11倍,可显著提升ANC最低值36.21或8.95倍, 可显著降低P/Bratio161.42倍或18.79倍。因此,低动员型G-CSF的CCD给药模式比Once-per-cycle模式更有 效。
如表6所示,PEG30-rhG-CSF采用5-Day-CCD的给药模式、给药剂量为150μg/kg(相当于人体用量的50μg/kg), 或者Neulasta采用7-Day-CCD的给药模式、给药剂量为150μg/kg,可以达到sPBPC-RC的标准。
表6低动员型G-CSF采用CCD模式的更多结果(×109cells/L)
实施例4在预计发热性粒细胞减少症风险低于10%病人中应用Neulasta或Neupogen
一个前瞻性、多中心、随机和开放标签的临床试验,比较在“Once-per-cycle”的给药模式下,Neulasta在 化疗周期第7天注射、给药剂量为50μg/kg条件下与Neulasta在化疗周期第3天注射、给药剂量为100μg/kg, 或者与Neupogen在“Every-day”的给药模式、给药时间为化疗周期第3天、给药剂量为5μg/kg/day或 2.5μg/kg/day条件下,对化疗周期粒细胞反应曲线(ANC-RC)的影响。Neulasta在化疗周期第7天或第3 天皮下注射,或者Neupogen自化疗周期第3天(化疗结束后48小时)起每天注射5μg/kg/day或2.5μg/kg/day 连续10天。乳腺癌病人接受AC化疗方案(化疗周期第一天静脉点滴输注阿霉素60mg/m2或表阿霉素100mg/m2和环磷酰胺600mg/m2)。入选病人的标准包括年龄需18岁以上、Karnofsky积分超过70%、ANC 大于1.5×109cells/L和血小板100×109cells/L。入选病人如有下列情况则排除入组包括经历过全身化疗或强 化放疗、出现未能控制的感染、或除乳癌以外的其他肿瘤、或骨髓转移癌。在化疗周期第0-第9天以及第 11、13、15、17、19和21天抽血测全血细胞计数(CBC);CBC由Sysmex自动血液分析仪测定。组间 ANC的比较采用t检验方法统计(p<0.05设定为显著性差异)。所选病人预计发生FN的风险低于10%而 发生3/4度粒细胞减少症的风险超过50%。
与注射100μg/kg、给药时间为Day 3相比,培非格司亭注射50μg/kg、给药时间为Day 7可显著影响FN发 生风险低于10%病人的ANC-RC的关键参数,中性粒细胞释放峰值显著降低(14.4×109vs.32.1×109cells/L, t test,p<0.01=,ANC最低值显著提升(4.7×109vs.2.0×109cells/L,t test,p<0.01=,而P/B ratio显著降低 5倍(3.1 vs.16)。培非格司亭注射50μg/kg、给药时间为Day 7可以达到esANC-RC的标准,且无3/4度粒 细胞减少症的发生;而给药剂量增加为100μg/kg、给药时间提前在Day 3则无法实现esANC-RC的标准和 药效。化疗周期第7天为预计ANC最低点前4天。
如图5所示,对于给药时间在化疗周期第3天、给药模式为Every-day,注射非格司亭2.5μg/kg/day连续 10天与5μg/kg/day连续10天相比,所致ANC释放峰(17.6×109vs.23.2×109cells/L,t test,p<0.05)、恢复峰 (11.5±4.7×109vs.27.4±15×109cells/L,t test,p<0.01)均显著降低;而两者的ANC最低值差别不显著 (5.7±2.5×109vs.7.0±8.1×109cells/L,t test,p>0.05)。因此,对于此类病人,每天注射2.5μg/kg/day可达到 esANC-RC标准。
已批准的培非格司亭和非格司亭的给药模式、剂量和时间不能使所选病人实现esANC-RC的标准。
如图5所示,应用获批准的培非格司亭给药方法可导致此类病人最高的粒细胞释放峰值和最低的ANC最 低值。异常增高的粒细胞释放峰源自骨髓成熟粒细胞的加速释放,也可加速培非格司亭的清除,进而加重 ANC最低值的降低。本试验结果表明,控制粒细胞释放峰可以显著提升ANC最低值。
实施例5,在预计FN的发生风险为20%病人中应用PEG30-rhG-CSF或Neupogen
如图6A、6B和6C所示,采用单中心、开放和剂量爬坡临床试验评估PEG30-rhG-CSF。入组病人是病理 诊断为非小细胞肺癌(NSCLC),其他入组条件和排除条件同实施例4。入组病人接受TC化疗方案,即化 疗周期第一天给予紫杉醇175mg/m2和AUC 6的卡铂治疗。PEG30-rhG-CSF或非格司亭在化疗周期第5 天给药,即预计ANC最低值前7天给药。入组病人在第一化疗周期依次应用PEG30-rhG-CSF12.5μg/kg、 25μg/kg、50μg/kg、75μg/kg或100μg/kg一次。在第二化疗周期依次应用非格司亭1.25μg/kg/day、2.5μg/kg/day 或5μg/kg/day连续10天,其中在第一化疗周期应用50μg/kg、75μg/kg和100μg/kg三组病人,第二化疗周期均使用5μg/kg/day的给药剂量。Neulasta在化疗周期第3天给药,即预计ANC最低值前9天给药。入 组病人依次应用Neulasta 50μg/kg或100μg/kg一次。于化疗周期第1-13天、15、17、19和21天取血测全 血细胞计数(CBC)。CBC由Sysmex全自动血细胞分析仪测定。CD34+细胞计数由流式细胞分析方法测定。 使用t检验或方差分析比较两组间或多组间ANC-RC和PBPC-RC的参数比较,设定p小于0.05为显著性 差异。预计所选病人发生FN的风险在20%左右,且100%病人发生3/4度粒细胞减少症。
如图6A所示,化疗周期第5天注射PEG30-rhG-CSF12.5μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、75μg/kg或100μg/kg, ANC释放峰的峰值(平均值±标准差)分别为18.60±3.86、17.92±11.75、22.05±6.18、19.28±6.03或 21.37±5.15×109cells/L,ANC最低值分别为1.60±1.23、1.39±0.98、2.34±1.52、5.06±2.47或8.51±6.0×109cells/L, P/B ratio分别为11.65、12.89、9.0、3.8或2.6。注射50μg/kg或75μg/kgPEG30-rhG-CSF所获ANC-RC关 键参数最接近达到有效和安全粒细胞反应曲线(esANC-RC)的标准。
如图6B所示,化疗周期第5天注射非格司亭2.5μg/kg/d或5μg/kg/d,ANC释放峰的峰值为10.35±3.77或 13.17±3.0×109cells/L,ANC最低值为3.54±2.50或4.76±2.06×109cells/L,P/B ratio为2.9或2.5,而ANC的 恢复峰为13.54±2.98或16.34±6.90×109cells/L。注射2.5μg/kg/d所获ANC-RC关键参数最接近达到 esANC-RC的标准。
为了进一步优化ANC-RC的关键参数,开展了进一步的临床试验,在预计给药的当日测定ANC,根据所 测ANC值调整剂量或给药时间或者两者都调整,这里提供了进一步试验两组的结果。
时间和剂量调节组的结果
PEG30-rhG-CSF采用Once-per-cycle模式,计划在化疗周期第5天给药,如果当日所测ANC在1.5-4.0×109 cells/L之间,给药剂量为25μg/kg;如果当日所测ANC大于4.0×109cells/L,给药时间错后,直到ANC回 到在1.5-4.0×109cells/L之间;如果当日所测ANC小于1.5×109cells/L,给药剂量升至50μg/kg;如果当日 所测ANC大于8.0×109cells/L和/或给药时间错后超过4天,ANC才回到在1.5-4.0×109cells/L之间,则给 药剂量降至12.5μg/kg。初步结果表明:粒细胞释放峰的峰值为12.35±3.31×109cells/L,ANC最低值为4.36±1.22×109cells/L,P/B ratio为2.83和粒细胞恢复峰的峰值为6.32±3.24×109cells/L。采用这种基于实测 ANC值进行给药时间和剂量的调整方法,PEG30-rhG-CSF在“Once-per-cycle”模式下、基础给药剂量为 25μg/kg、给药时间为化疗周期第5天条件下,可实现esANC-RC和PBPC-RC的标准。
剂量调节组的结果
PEG30-rhG-CSF采用Once-per-cycle模式,计划在化疗周期第2天给药(化疗结束后24小时),如果预 注射当日所测ANC在1.5-4.0×109cells/L之间,给药剂量为50μg/kg;如果预注射当日所测ANC大于4.0×109 cells/L,则给药剂量降至25μg/kg;如果预注射当日所测ANC小于1.5×109cells/L,给药剂量升至75μg/kg; 如果预注射当日所测ANC大于8.0×109cells/L,则给药剂量降至12.5μg/kg。初步结果表明:粒细胞释放峰 的峰值为14.27±6.23×109cells/L,ANC最低值为2.45±1.17×109cells/L,P/B ratio为5.82和粒细胞恢复峰的 峰值为3.61±2.75×109cells/L。采用这种基于实测ANC的给药剂量的调整,PEG30-rhG-CSF在 “Once-per-cycle”模式下、基础给药剂量为50μg/kg、给药时间为化疗周期第2天条件下,基本实现 esANC-RC的标准。
如表7所示,临床疗效与ANC-RC和PBPC-RC的关键参数相关。与达到esANC-RC和sPBPC-RC参数指 标的临床试验结果相比,升高的粒细胞释放峰、降低的ANC最低值、加大的P/B ratio以及较高的CD34+细胞计数可导致较高粒细胞减少症发生率、4度粒细胞减少症或FN的发生率以及较高的抗菌素使用率。 PEG30-rhG-CSF采用once-per-cycle模式、于第5天给药、基础给药剂量为25μg/kg可实现esANC-RC和 sPBPC-RC的标准,临床上未见FN或4度粒细胞减少症的发生,也无应用抗菌素的病人。
在本试验所选的病人上应用Neulasta或Neupogen已批准的给药方法所致ANC-RC的参数远不能达到 esANC-RC标准。
表7 PEG30-rhG-CSF,Filgrastim和Pegfilgrastim治疗CIN的临床疗效
★化疗周期的第5天是ANC最低点之前约7天。
○化疗周期的第2天是完成化疗后的24小时
◆中性粒细胞释放的P/B比率是嗜中性粒细胞释放峰值与ANC最低点的比率。
如图6C所示,在化疗周期第5天注射PEG30-rhG-CSF 12.5μg/kg、25μg/kg,、50μg/kg或100μg/kg一次, 所致CD34+细胞计数分别为1.93±0.71、0.68±0.36、0.76±0.58或6.87±1.04x106cells/L。在化疗周期第5天 注射非格司亭1.25μg/kg/d、2.5μg/kg/d或5μg/kg/d连续10天,所获CD34+细胞计数分别为7.34±1.35、 5.97±3.38或9.59±1.55x106cells/L。尽管CD34+细胞释放峰值计数并非与剂量完全相关,但注射100μg/kg剂量的PEG30-rhG-CSF所致CD34+细胞释放峰值与每天注射1.25μg/kg/d或2.5μg/kg/d非格司亭基本相当。 通常,注射小于或等于50μg/kg的PEG30-rhG-CSF所致的CD34+细胞释放峰值可以满足sPBPC-RC的标准。 所述优选的CD34+细胞释放峰值等于或小于1×106cells/L。
如图6D所示,注射培非格司亭60μg/kg或100μg/kg所致CD34+细胞释放峰为58.18±28.31或 45.98±33.25×106cells/L。与注射60μg/kg培非格司亭相比,注射50μg/kg的PEG30-rhG-CSF所致CD34+细胞释放峰显著低于75倍;与注射100μg/kg培非格司亭相比,注射相同剂量的PEG30-rhG-CSF所致CD34+细胞释放峰显著低于近7倍;注射100μg/kg的PEG30-rhG-CSF所致CD34+细胞释放峰也显著低于每天注 射非格司亭5μg/kg/d连续十天所致的CD34+细胞释放峰值(9.59±2.9×106cells/L)。这些结果表明 PEG30-rhG-CSF显著降低了动员骨髓造血干细胞释放入外周血的作用。
如图6E所示,应用PEG30-rhG-CSF(剂量100μg/kg、注射一次、第5天给药)或者培非格司亭(剂量100μg/kg、 注射一次、第3天给药),所致粒细胞释放峰的峰值为21.4±0.52×109cells/L或33.6±10.6×109cells/L,两者 相差1.6倍;所致ANC最低值为8.5±6.0×109cells/L或2.0±0.55×109cells/L,两者相差4.3倍;所致the P/B ratio为2.5或6.8,两者相差6.7倍。这些结果证明,粒细胞释放峰的有限降低可导致ANC最低值数倍的 增高。
如图6D和6E所示,PEG30-rhG-CSF可显著降低动员骨髓造血干细胞和中性粒细胞释放入外周血的作用。 因此,与培非格司亭相比,PEG30-rhG-CSF可有效保护实体肿瘤病人化疗病人骨髓造血干能,加速粒细胞 的生成作用。
由培非格司亭或非格司亭采用已批准的给药模式、剂量和时间所导致的外周血造血干细胞反应关键参数远 远超过sPBPC-RC的标准。
实施例6,在预计FN的发生风险为40%的病人上应用PEG30-rhG-CSF的“Every-3-day”模式
如图7所示,为评估PEG30-rhG-CSF的多中心、随机、对照的临床研究。入组标准和排除标准与实施例4 相同。乳腺癌病人接受多烯紫杉醇和阿霉素化疗(多烯紫杉醇75mg/m2和阿霉素60mg/m2)。入组病人随 机接受PEG30-rhG-CSF“间隔三日”给药模式(Every-3-day)一个化疗周期注射2-3次,或者接受培非格 司亭“一个疗程一次”(Once-per-cycle)给药模式,或者非格司亭每日给药模式。PEG30-rhG-CSF“间隔 三日”模式的给药剂量为25μg/kg,一化疗周期给药2次,给药时间为化疗周期第3天(Day 3)和第6天 (Day 6),或者一化疗周期给药3次,即在化疗周期Day 3、Day 6和Day 9给药,如果Day 9测定ANC 低于1.5x109cells/L。作为阳性对照,培非格司亭给药剂量为100μg/kg、非格司亭给药剂量为5μg/kg/d连续 10天,均在Day 2给药。所选病人预计FN的发生风险在40%左右,且100%病人均会发生3/4度粒细胞减 少症。
PEG30-rhG-CSF采用Every-3-day模式、给药剂量为25μg/kg、给药次数为一个疗程注射2-3次,所获粒细 胞释放峰值为14.6±5.8×109cells/L、ANC最低值为2.3±0.4×109cells/L、P/B ratio为6.3以及CD34+细胞释 放峰值小于1×106cells/L(详细数据未提供)。PEG30-rhG-CSF采用前述给药模式、剂量和时间可以实现 esANC-RC和sPBPC-RC标准。没有发生FN或4度粒细胞减少症的病人。
培非格司亭或非格司亭采用前述批准的给药模式、剂量和时间,粒细胞释放峰为27.4±7.2x109或 26.5±5.5x109cells/L、ANC最低值为0.05±0.02×109或0.50±0.20×109cells/L、P/B ratio为548或53、以及粒 细胞恢复峰为6.2±2.0x109或28.5±10.3x109cells/L。在预计FN的发生率大于40%的病人,应用批准的培非 格司亭或非格司亭治疗方法所致ANC-RC的关键参数远未达到esANC-RC标准。
综上所述,应用批准的培非格司亭或非格司亭治疗方法所致ANC-RC和PBPC-RC的关键参数远未达到 esANC-RC和sPBPC-RC标准;而使用“一周期一次”或“间隔三日”的给药模式,低动员型G-CSF在选 定的时间和控制的剂量条件下,可实现esANC-RC和sPBPC-RC标准,且未见3/4度或发热性粒细胞减少 症的发生。
Claims (18)
1.一种治疗和预防发热性粒细胞减少症(FN)和3/4度粒细胞减少症的方法,包括:
a)测定化疗的病人外周血中的绝对粒细胞计数(ANC)和CD34+细胞计数,以获得化疗周期外周血粒细胞和造血干细胞的反应曲线(ANC-RC和PBPC-RC),
b)注射一种长效重组人粒细胞集落刺激因子(低动员型G-CSF),基于FN发生风险的分类和/或计划注射日ANC的测定值,计算给药时间和给药剂量,以获得有效且安全的ANC-RC和PBPC-RC,接受化疗的病人患有化疗所致的粒细胞减少症(CIN)。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,CIN病人,当FN的发生几率为大于40%、或在10%-40%之间、或小于10%时,给药时间为ANC最低值日之前7-9天、或5-7、或3-5天。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,当计划给药日的ANC为1.5×109-4.0×109cells/L之间,给药时间为计划给药日当日;当计划给药日的ANC大于4.0×109cells/L,给药时间要推迟2-5天,以便ANC降到1.5-4.0×109cells/L之间。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,对于CIN病人,当FN发生几率在10%-40%、优选不超过20%时,所述给药剂量应不超过50μg/kg,优选不超过25μg/kg,一个化疗周期注射一次,为一周期注射一次给药模式(Once-per-cycle)。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,对于CIN病人,当FN发生几率不超过40%时,给药剂量为10μg/kg/dose-25μg/kg/dose,一个化疗周期注射2-3次,为间隔3日给药模式(Every-3-day)。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,对于CIN病人,当FN发生几率超过40%时,给药剂量为0.83μg/kg/天-5μg/kg/天,每天给药3-10次,为每天注射给药模式(Every-day)。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,对于CIN病人,当FN发生几率超过20%时,给药剂量为10μg/kg-50μg/kg,且持续控制递药速率3-7天,为连续控制给药模式(CCD)。
8.如权利要求4-7所述,相同疗程剂量下,Once-per-cycle、Every-3-day、Every-day和CCD给药模式表现出药效上的依次提升,且如果前次化疗周期发生FN或3/4度粒细胞减少症,则本次化疗周期选用更有效的给药模式。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,如果计划注射日ANC测定值低于1.5×109cells/L,所述给药剂量升高一级剂量,给药剂量为10μg/kg-75μg/kg或0.6mg-4.5mg疗程剂量。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于,如果计划注射日ANC测定值高于8.5×109cells/L,或者原给药时间已推迟4天,所述给药剂量应降低一级剂量,给药剂量为5μg/kg-50μg/kg或0.3mg-3.0mg疗程剂量。
11.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述长效重组人粒细胞集落刺激因子被鉴定为一种动员作用降低的G-CSF(低动员型G-CSF),也是一类N端连接G-CSF的大分子。
12.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述低动员型G-CSF的特征是:i)由聚乙二醇(PEG)偶联或者抗体Fc片段或白蛋白融合或偶联于G-CSF的N端;ii)所述聚合体或融合蛋白的分子量在18800-66000道尔顿(18.8-66kDa);iii)与rhG-CSF或C端连接的G-CSF大分子相比,显著增加CXCR4的表达;vi)与rhG-CSF或C端G-CSF大分子相比,显著降低中性粒细胞和CD34+细胞的释放峰。
13.如权利要求1所述的方法,其特征在于,低动员型G-CSF包括PEG20-rhG-CSF、PEG30-rhG-CSF、PEG40-rhG-CSF、Fc融合G-CSF和albumin融合G-CSF。
14.如权利要求1所述的方法,其特征在于,一类低动员型G-CSF是N端单一聚乙二醇化G-CSF,即一个PEG多聚体偶联在G-CSF的N端氨基上,包括PEG20-rhG-CSF和PEG30-rhG-CSF。
15.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述G-CSF包括G-CSF片段或突变体,其中,G-CSF突变体包括一个或多个氨基酸的添加、敲除和/或替代,或者小肽融合;而这些G-CSF片段或突变体性质的改变包括与G-CSF相比,溶解性、稳定性、促粒细胞生成活性或者半衰期等的增加,以及动员活性的降低。
16.一种制备点特异、单一PEG偶联G-CSF分子的方法,由以下步骤组成:
i)、在rhG-CSF溶液中混合助溶剂以利溶液浓缩达4mg/ml以上;
ii)、按PEG多聚体与rhG-CSF的分子摩尔浓度比0.7-3倍的比例,加入活化的PEG多聚体于rhG-CSF溶液中,在pH为3.5-5或7.0-8.5的条件下,进行点特异性偶联反应;
iii)、通过监测二PEG偶联的G-CSF的形成率,控制反应时间;
所获95%以上点特异性、单一PEG偶联的G-CSF为均一N端或者C端单一PEG偶联G-CSF。
17.如权利要求16所述的方法,其特征在于,所述助溶剂是非活化PEG多聚体、二甘氨酸和山梨醇。
18.如权利要求16所述的方法,其特征在于,采用高效液相色谱层析法控制反应混合液中二个分子PEG偶联的G-CSF的形成率低于5%。
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Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101245109A (zh) * | 2007-02-12 | 2008-08-20 | 杭州九源基因工程有限公司 | 一种聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体及其制备方法 |
CN101503457A (zh) * | 2009-01-05 | 2009-08-12 | 天津派格生物技术有限公司 | 柱层析peg与干扰素类似物蛋白氮端定点偶联方法及其产物 |
CN101585864A (zh) * | 2009-01-05 | 2009-11-25 | 天津派格生物技术有限公司 | 柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联方法及其产物 |
US20100029555A1 (en) * | 2006-08-11 | 2010-02-04 | Bio-Ker S.r.l | G-csf site-specific mono-conjugates |
CN101824091A (zh) * | 2009-11-25 | 2010-09-08 | 泰州贝今生物技术有限公司 | G-csf融合蛋白突变体及其制备与应用 |
CN102395379A (zh) * | 2009-01-16 | 2012-03-28 | 特瓦制药工业有限公司 | 重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的新稳定制剂 |
-
2019
- 2019-08-05 CN CN201910719064.XA patent/CN112316120A/zh active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100029555A1 (en) * | 2006-08-11 | 2010-02-04 | Bio-Ker S.r.l | G-csf site-specific mono-conjugates |
CN101245109A (zh) * | 2007-02-12 | 2008-08-20 | 杭州九源基因工程有限公司 | 一种聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体及其制备方法 |
CN101503457A (zh) * | 2009-01-05 | 2009-08-12 | 天津派格生物技术有限公司 | 柱层析peg与干扰素类似物蛋白氮端定点偶联方法及其产物 |
CN101585864A (zh) * | 2009-01-05 | 2009-11-25 | 天津派格生物技术有限公司 | 柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联方法及其产物 |
CN102395379A (zh) * | 2009-01-16 | 2012-03-28 | 特瓦制药工业有限公司 | 重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的新稳定制剂 |
CN101824091A (zh) * | 2009-11-25 | 2010-09-08 | 泰州贝今生物技术有限公司 | G-csf融合蛋白突变体及其制备与应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
YANQIN ZHAI等: "Enhanced circulation half-life of site-specific PEGylated rhG-CSF: Optimization of PEG molecular weight", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》, vol. 142, 31 December 2009 (2009-12-31), pages 259 - 266, XP026305468, DOI: 10.1016/j.jbiotec.2009.05.012 * |
蔡永明等: "聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子大鼠和Beagle犬的免疫原性", 《药物评价研究》, vol. 33, no. 4, 31 August 2010 (2010-08-31), pages 272 - 274 * |
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