JPH0532559A - 医薬組成物及びその製造方法 - Google Patents

医薬組成物及びその製造方法

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JPH0532559A
JPH0532559A JP3271743A JP27174391A JPH0532559A JP H0532559 A JPH0532559 A JP H0532559A JP 3271743 A JP3271743 A JP 3271743A JP 27174391 A JP27174391 A JP 27174391A JP H0532559 A JPH0532559 A JP H0532559A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 水性の生理学的環境に置かれたとき、活性成
分である生理学的活性ポリペプチドを長期間に亘って連
続的に放出できる該ポリペプチドを含む医薬組成物を提
供する。 【構成】 酸安定性の生理学的活性ペプチド（具体的に
は、ヒトカルシトニン、インターロイキン−２、インタ
ーフェロン及びヒト生長ホルモン）をポリエチレングリ
コール、ポリプロピレングリコール等の水溶性重合体に
共有結合させた活性成分を含有する医薬組成物。本組成
物水性の生理学的環境に置かれた場合、少くとも１週間
に亘って一段階的に該ペプチドを放式できるものであ
る。 【効果】 本医薬組成物は組成物表面からの拡散による
放出及び組成物構成成分の分解による放出との連続的二
段階放出システムを提供し、患者への一回投与により、
治療活性ポリペプチドの長時間、連続的放出を可能にす
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は生理学的活性ポリペプチ
ドを含有する医薬組成物であって、該組成物を水性生理
学的環境(aqueous physiological-type environment)
（後に定義する）中に置いた場合に、ポリペプチドを長
期間に亘って連続的に放出する医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術及び解決すべき課題】ある種の医薬を一回
の投与後、長期間に亘って連続的に放出させることは、
臨床的実施において大きな実際的な利点を有し得ること
は以前から知られており、多数の臨床的に有用な医薬を
投与後、長期間に亘って放出させるための組成物がすで
に開発されている（経口投与後については、例えば、米
国、ペンシルバニア州、イーストン、Mack Publishing
社発行、Remington 著、“PharmaceuticalSciences”、
第15版；1975、第1618〜1631頁参照；非経口投与後につ
いては、上記文献の第1631〜1643頁参照；局所投与後に
ついては、英国特許第1,351,409 号明細書参照）。非経
口投与を行うための適当な方法は、医薬を含有する固
体、例えばペレット又はフィルムの皮下注射又は注入
（implantation）であり、多種のかかる注入装置が知ら
れている。特に、多くの医薬について、医薬を長期間、
放出させるのに適当な挿入装置又は注入可能な微細粒子
懸濁物は、医薬を生分解性重合体中に封入することによ
り、あるいは、医薬をかかる重合体のマトリックス中に
分散させることにより得ることができ、その結果、医薬
は重合体マトリックスの分解が進むにつれて放出され
る。
【０００３】持続放出型製剤(sustained release formu
lation) で使用するのに適当な生分解性重合体は周知で
あり、かかる重合体としてポリエステルが挙げられる；
このポリエステルは、水性生理学的環境下に置かれた場
合、加水分解により徐々に分解される。使用されている
特定のポリエステルはヒドロキシカルボン酸から誘導さ
れたものであり、多くの公知技術は、α−ヒドロキシカ
ルボン酸、特にラセミ形及び光学活性形の乳酸及びグリ
コール酸から誘導された重合体及び共重合体に向けられ
ている；例えば米国特許第3,773,919 号及び同第3,887,
699 号明細書；Jackanicz 等、“Contraception ”、19
73、８、227 〜 234；Anderson等、同上文献、1976、1
1, 375 〜 384；Wise等、“Life Sciences ”、1976、1
9, 867 〜874 ；Woodland等、“Journal of Medicinal
Chemistry”、1973、16、897 〜901 ；Yolles等、“Bul
letin of Parenteral Drug Association ”、1976、3
0、306 〜312 ；Wise等、“Journal of Pharmacy and P
harmacology”、1978、30、686 〜 689及び1979, 31, 2
01 〜 204；参照。
【０００４】医薬の“持続的な”（“sustained ”）又
は“長期間の”（“extended”）放出は連続的であるか
又は非連続的であることを理解すべきである。例えば、
英国特許第1,325,209 号明細書に記載されるごときポリ
ラクチド重合体からのポリペプチドの放出の場合には、
その放出前に、ポリペプチドが放出されないかなりの長
さの誘導期間があるか、又は、二段階的であり(biphasi
c)、そして、このポリペプチドの放出は、若干のポリペ
プチドが放出される初期期間と、ポリペプチドが少しだ
け放出されるか又は全く放出されない第２の期間と、ポ
リペプチドの大部分が放出される第３の期間とからな
る。これに対して、本発明の目的は、場合により存在す
る比較的短い初期誘導期間は別として、ポリペプチドが
連続的に放出されるかつポリペプチドが少ししか又は全
く放出されない期間を伴うことのない、ポリペプチドの
組成物を提供することにある。本明細書においては、
“連続的放出”（“continuos release ”）という用語
は、本質的に一段階的な(monophasic)放出形式(release
profile) を述べのためにのみ使用される；しかしなが
ら、この連続的放出形式は、医薬の累積放出量を時間の
関数としてプロットした場合、変曲点(point of inflec
tion) は有し得るが、“プラトー”段階（“plateau ”
phase)は確実に有していない。
【０００５】本出願人の欧州特許第58,481号明細書に
は、酸安定性ポリペプチドの本質的に一段階的放出を可
能にする、連続放出型医薬組成物が記載されている。こ
の組成物は、一般的には、乳酸単独の重合体、乳酸とグ
リコール酸の共重合体、上記の重合体の混合物、上記の
共重合体の混合物又は上記の重合体と共重合体の混合物
であるポリラクチドと、意図する使用期間中に組成物内
で遭遇する条件下で著しく加水分解されることのない酸
安定性の（後に定義する）ポリペプチドとからなる；こ
の組成物は、水性生理学的環境（後に定義する）中に置
いた場合、ポリペプチドを水性生理学的環境中に連続的
な形式で放出する；この組成物は本質的に一段階的な放
出形式であってかつ変曲点は有し得るが、“プラトー”
段階は確実に有していない放出形式を、少なくとも１週
間に亘って与える。
【０００６】前記したごとく、欧州特許公告第58,481号
明細書は、同明細書に記載の製剤中で遭遇する条件下で
安定なポリペプチドの製剤に関する。しかしながら、自
然産生(native)[Met-1] ヒトG-CSF のごときある種のポ
リペプチドはかかる条件下においては本来、不安定であ
り、ある種の不安定性の問題、例えば、特に、凝集する
傾向を有する。本発明は水溶性重合体との結合により、
製剤(depot) 内で遭遇する条件下で不安定であり従って
適切に放出されないある種のポリペプチドに存在する不
安定性の問題を克服し得るか又は少なくとも改善し得る
という発見に基づくものである。本発明は、また、生理
学的に活性なポリペプチドが水溶性重合体に共有結合し
ている、生理学的活性物質の使用により、連続放出型製
剤組成物中の対応する非結合ポリペプチドと比較して、
放出形式が改善されるという発見に基づくものである。
【０００７】最近、インターロイキン−２の制御放出型
(controlled release)微小球製剤の開発についてHora
M.S. 等によりProceed. Intern Sym. Control. Rel. Bi
oact.Meter. 16, (1989) 、No 268、509 〜 510頁に発
表されている。Hora等によれば、ウシ胎児血清の存在下
でポリエチレングリコール(PEG) と共有結合させた、ペ
ギル化( ポリエチレングリコール化) された(pegylate
d) インターロイキン−２(IL-2)（以下においてはPEG I
L-2と称する）をポリ(DL-ラクチド−コ−グリコライド
(DL-Lactide-co-glycolide) 微小球から放出させた場合
には三段階放出形式(triphasic release pattern）が得
られること及び５〜15日間の遅れ(lag) 又は誘導期間に
遭遇することが示されている。Hora M.S. 等はヒト血清
アルブミン(HSA) を使用してPEG IL-2の湿潤と再溶解を
改善することを試みることにより、上記の問題の解決を
計った。しかしながら、この試みにより、別の問題、す
なわち、溶解タンパク質(solubilising protein)の存在
という問題が生じた。医薬組成物中にかかるタンパク質
が存在することは、特に、このタンパク質によって有害
な副反応が生起しかつ分析精度を低下させるという理由
で不利なことである。
【０００８】更に、Hora M.S. 等による前記文献では、
ポリ(DL-ラクチド−コ−グリコライド）重合体の溶解特
性（特に、重合体がベンゼンに可溶性であるか又は不溶
性であるかという点）及び多分散性(polydispersibilit
y)（後に定義する）が規定されていない。これらの要因
が記載されていない場合及び製剤方法が記載されていな
い場合には、報告された研究を追試することができず従
って前記文献は利用することができない。更に、上記文
献では、ポリエチレングリコールの分子又はペギル化
（ポリエチレングリコール化）(pegylation)の程度が規
定されていないことも注目される；これらの要因は両者
共、発表された研究を追試する場合に必要なものであ
る。
【０００９】Hora M.S. 等によってペギル化IL-2を用い
て得られた連続的放出についての結果が不良であること
から見て、本発明に従って水溶性重合体と共有結合した
(covalently conjugated) 生理学的活性ポリペプチドを
使用することにより、良好な放出形式が得られることは
全く驚くべきことである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明の第１の要旨によ
れば、酸安定性の生理学的活性物質を医薬組成物の構成
成分から水性生理学的環境中に連続的に放出させるため
の医薬組成物であって、上記生理学的活性物質は水溶性
重合体と共有結合されているポリペプチドであってかつ
意図された使用期間中に医薬組成物内で遭遇する条件下
で著しく加水分解されないものであること；そして ｉ）上記医薬組成物は、水性生理学的環境下に置いた場
合、ポリペプチドを水性生理学的環境中に連続的な方式
で放出して、少なくとも１週間に亘って、本質的に一段
階的である放出形式を与えること； ii）上記組成物は、ポリペプチドの放出を２つの連続的
段階で行い；第１段階の放出は表面からの拡散によって
生起し、第２段階の放出は医薬組成物の構成成分の分解
の結果として生起しそして拡散段階と分解により誘導さ
れる段階とは時間的に重なり合うことを特徴とし、ま
た、ポリペプチドの放出は少なくとも１週間に亘って生
起すること；又は iii)上記組成物は、水を連続的に吸収し、そして該組成
物が分解しかつ実質的に全てのポリペプチドが水性生理
学的環境中に放出されるまで、少なくとも１週間に亘っ
て、実質的に一段階的である水吸収形式を与えること；
を特徴とする医薬組成物が提供される。
【００１１】本発明の別の要旨によれば、本発明の医薬
組成物を哺乳動物に投与し、それによって、水溶性重合
体に共有結合されたポリペプチドの有効量を供給する(d
eliver) こと、そして、上記ポリペプチドは自然産生G-
CSF の生物学的性質の少なくとも１つを有するものであ
ることを特徴とする、哺乳動物に造血治療を施す方法が
提供される。
【００１２】本発明の更に別の要旨によれば、本発明の
医薬組成物を哺乳動物に投与し、それによって、水溶性
重合体に共有結合されたポリペプチドの有効量を供与す
ること、そして、上記ポリペプチドは自然産生G-CSF の
生物学的性質の少なくとも１つを有するものであること
を特徴とする、哺乳動物の白血病性細胞の増殖の抑制方
法が提供される。
【００１３】本発明の医薬組成物をヒトに投与し、それ
によって、水溶性重合体に共有結合されたヒトカルシト
ニンの有効量を供与することによりヒトの骨粗ショウ症
又はページェット病(Paget's disease) を治療し得る。
【００１４】本発明の更に別の要旨によれば、本発明の
医薬組成物を哺乳動物に投与し、それによって、水溶性
重合体に共有結合されたインターロイキン−２の有効量
を供与することを特徴とする、哺乳動物の新生物又は免
疫不全症の処置方法が提供される。
【００１５】本発明の更に別の要旨によれば、本発明の
医薬組成物を哺乳動物に投与し、それによって、水溶性
重合体に共有結合されたインターフェロン（好ましくは
インターフェロンα、特に、インターフェロンα2 ）の
有効量を供与することを特徴とする、哺乳動物の新生物
又はウイルスの処置方法が提供される。
【００１６】本発明の医薬組成物をヒトに投与し、それ
によって、水溶性重合体に共有結合されたヒト生長ホル
モンの有効量を供与することにより、ヒトの生長を促進
し得る。
【００１７】本発明の更に別の要旨によれば、医薬組成
物の構成成分と生理学的活性物質とをこれらに対する有
機溶剤中に溶解させるか、又は、医薬組成物の構成成分
と生理学的活性物質とを有機媒体又は水性媒体中に均一
に分散させ；ついで乾燥させそして動物体内に挿入する
か又は注入するのに適当な組成物に製剤することを特徴
とする本発明の医薬組成物の製造方法が提供される。
【００１８】かかる組成物は挿入(implanation) するの
に適当な固体、好都合であるためには、固体円筒形デポ
ット(depot) に製剤するか、又は、例えば微粉砕(commi
nution) 又は超微粉砕(micronisation) により、注入(i
njection) するのに適当な多粒子形製剤(pultiparticul
ate form) に製剤し得る。多粒子形製剤は注入するため
に溶液又はエマルジョンに調製し得る。調剤は例えば水
性媒体中で、又は、アラキス(arackis) 油のごとき油又
はクレモフォル（Cremophor)(Martindale,“The Extra
Pharmacopoeia ”，第28版、第694 頁参照）中で行い得
る。注入用ビヒクルとしてはカルボキシメチルセルロー
スが挙げられる(Martindale,“The Extra Pharmacopoei
a ”第28版、第947 頁参照）。
【００１９】分散体を形成させる場合には水性媒体を使
用することが好ましい。
【００２０】この方法は挿入のための棒状、球状、フィ
ルム状又はペレット状の医薬を製造するのに使用し得
る。医薬組成物の構成成分は例えばポリラクチド（後に
定義する）であることができ、かつ、平均して少なくと
も２つの同一の単量体単位を有するブロックであること
が好都合な、少なくとも25モル％、好ましくは40モル％
の乳酸単位と75モル％までのグリコール酸単位とを有す
ることが有利であり得る。ポリラクチドはベンゼンに可
溶性でかつ 0.3以下の固有粘度（ベンゼン100 ml中のポ
リラクチド１ｇの溶液）を有するか又はベンゼンに不溶
性でかつ４以下の固有粘度（クロロホルム又はジオキサ
ン100 ml中のポリラクチド１ｇの溶液）であることが好
ましい。
【００２１】本発明の方法は例えば酢酸（好ましくは氷
酢酸）のごとき凍結乾燥可能な共通溶剤を使用して、凍
結させついで凍結乾燥させることにより行うことが好ま
しい。医薬組成物の構成成分(material of the composi
tion) とこれに対する有機溶剤とからなる第１溶液及び
生物学的活性物質とこれに対する有機溶剤とからなる第
２溶液を調製しついでこの２つの溶液を混合することが
好都合である。使用する溶剤は第１と第２の溶液に共通
であることが好ましくそして凍結乾燥し得るものである
ことが好都合である。この方法は欧州特許第58,481号明
細書に記載されている。しかしながら、所望ならば、医
薬組成物の構成成分と生物学的活性物質との均密な固体
混合物を溶融加工することにより医薬組成物を調製し得
る。
【００２２】本発明の別の要旨によれば、生理学的活性
物質を、少なくとも25モル％、好ましくは、40モル％の
乳酸単位と75モル％までのグリコール酸単位とを有する
ポリラクチドからなるマトリックス中に配合すること及
び更に、生理学的活性物質と医薬組成物の構成成分との
均密な固体混合物を溶融加工することにより、生理学的
活性物質と医薬組成物の構成成分とを均一に混合するこ
とを特徴とする、医薬組成物の構成成分がポリラクチド
からなる医薬組成物の製造方法が提供される。
【００２３】一般的説明 Ａ．生理学的活性物質 一般に、ポリペプチドの分子量が大きければ大きい程、
最適な放出形式を得るためにポリペプチドに結合させる
べき水溶性重合体の数も大きくなる。少なくとも１モル
の水溶性重合体をDa分子量が8000までのポリペプチドに
結合させることが好ましく、そして、少なくとも１モル
の水溶性重合体を、3000〜8000Da、特に4000〜6500Daの
分子量のポリペプチドの各々について使用することが好
ましい。一分子のポリペプチドは所望の水準の生理学的
活性の保留と一致するような多数の分子の水溶性重合体
を担持し得る。実際に、この条件に従う限り、ポリペプ
チドに最大数の水溶性重合体を結合させることが有利で
ある。所与のポリペプチド上に水溶性重合体を結合させ
るための多数の部位が存在する場合には、結合を最大限
に行うことにより化合物の不均質な混合物が得られるこ
とは理解されるであろう。従って、例えば、ポリペプチ
ドが水溶性重合体を結合させるための部位を４個有する
場合には、得られるポリペプチドと水溶性重合体の最大
の比率は例えば3.9 以下であり得る。
【００２４】A.1.ポリペプチド 本発明の医薬組成物中で使用される生物学的活性物質
は、水溶性重合体に共有結合されたヒトカルシトニン、
インターロイキン−２、ヒト生長ホルモン又はインター
フェロンα、例えばインターフェロンα2 のごときイン
ターフェロンであり得るか又は、好ましくは、水溶性重
合体に共有結合されたポリペプチドであってかつ自然産
生G-CSF の生物学的性質の少なくとも１つ及び好都合に
は、自然産生G-CSF のアミノ酸配列の一部又は全部を有
するポリペプチドであり得る。このペプチドは遊離のチ
オール基を有していないことが好ましく、従って、天然
産生G-CSF の生物学的性質の少なくとも１つを有するポ
リペプチドについては、17位のシスティンが存在しない
か又はアラニン又は好ましく例えばセリンのごとき他の
アミノ酸によって置換されていることが好ましいであろ
う。
【００２５】A.1.1. G-CSFの生物学的性質の少なくとも
１つを有するポリペプチド 自然産生G-CSF の生物学的性質の少なくとも１つを有す
るポリペプチドを使用することを希望する場合には、か
かる性質を有する任意の誘導体を使用し得るが、使用す
るポリペプチドは本出願人の欧州特許出願第91303868.3
号明細書に記載されるG-CSF 誘導体であることが有利で
ある；同明細書には改善された溶液安定度(solution st
ability)を有するG-CSF 誘導体が記載されている。すな
わち、上記欧州特許出願第91303868.3号明細書には、自
然産生G-CSF の生物学的活性の少なくとも１つを有する
かつ５mg／mlにおいて少なくとも35％の溶液安定度（後
に定義する）を有する、自然産生G-CSF の誘導体が記載
されている；この誘導体においては自然配列の少なくと
も Cys17が Ser17残基によって置換されており、また、
自然配列の Asp27が Ser27残基によって置換されてい
る。
【００２６】上記の自然産生G-CSF の誘導体は下記のも
のから選ばれた追加の修飾(modification)の少なくとも
１つを有することが好ましい： ａ）自然配列の Glu11の、 Arg11残基による置換； ｂ）自然配列の Leu15の、 Glu15残基による置換； ｃ）自然配残の Lys23の、 Arg23残基による置換； ｄ）自然配列の Gly26の、 Ala26残基による置換； ｅ）自然配列の Gly28の、 Ala28残基による置換； ｆ）自然配列の Ala30の、 Lys30または Arg30残基によ
る置換； ｇ）自然配列の Lys34の、 Arg34残基による置換； ｈ）自然配列の Lys40の、 Arg40残基による置換； ｉ）自然配列の Pro44の、 Ala44残基による置換； ｊ）自然配列の Leu49の、 Lys49残基による置換； ｋ）自然配列の Gly51の、 Ala51残基による置換： ｌ）自然配列の Gly51の、 Ala55残基による置換； ｍ）自然配列の Trp58の、 LyS58残基による置換； ｎ）自然配列の Pro60の、 Ser60残基による置換； ｏ）自然配列の Pro65の、 Ser65残基による置換； ｐ）自然配列の Pro111 の、 Glu111 残基による置換； ｑ）自然配列の Thr115 の、 Ser115 残基による置換； ｒ）自然配列の Thr116 の、 Ser116 残基による置換；
及び ｓ）自然配列の Tyr165 の、 Arg165 残基による置換；
【００２７】(b) 〜(s) から選ばれた追加の修飾の少な
くとも１つを存在させることが好ましいが、(b) 、(d)
、(e) 、(f) 、(n) 及び(o) から選ばれた追加の修飾
の少なくとも１つ、特に追加の修飾(o) を存在させるこ
とが特に好ましい。追加の修飾が下記に示すものの少な
くとも１つからなることがより好ましい： i) 自然配列の Gln11,Pro60,65 の、 Arg11， Ser
60,65 による置換； ii) 自然配列の Ala111 ,Thr115,116 の、 Glu11， Ser
115,116 による置換； iii)自然配列の Gln11,Trp58,Tyr165 の、 Arg11,165,L
ys58による置換； iv) 自然配列の Leu15,Gly26,28 、 Ala30の、 Glu15,A
la26,28 ,Lys30による置換；又は v) 自然配列の Pro44,Leu49,Gly51,55 ,Trp58の、 Lys
49,58 ,Ala44, 51,55 よる置換；
【００２８】追加の修飾は、また、下記のものの少なく
とも１つからなることが好ましい： vi) 自然配列の Leu15,Gly26,28 ,Ala30の、 Glu15,Ala
26,28 ,Arg30による置換； vii)自然配列の Pro65の、 Ser65による置換； viii) 自然配列の Pro60,65 の、 Ser60,65 による置
換；又は ix) 自然配列の Glu11,Pro65の、 Arg11,Ser65による置
換；
【００２９】従って、所望ならば、上記の修飾を、自然
産生G-CSF の生物学的性質の少なくとも一つを有する任
意のポリペプチド中に導入して、ポリペプチド分子の溶
液安定度を改善することができる。例えば、上記の修飾
は１つ又はそれ以上の残基の同一性又は位置（例えば置
換、末端及び内部付加及び削除）の点で、自然産生G-CS
Fs について本明細書中で規定したものとアミノ酸配列
の異る、上記ポリペプチドに適用し得る。例えばかかる
ポリペプチドは例えば削除（欠失）(deletion)により前
方短縮された(foreshortened) もの；又は加水分解に対
してより安定なもの（及び、従って、天然に産生するも
のに比べて、より顕著な又はより長い持続効果を有する
もの）；又はＯ−グリコシル化(O-glycosylation) のた
めの１個又はそれ以上の潜在的部位を削除するために
（その結果、酵母産生生成物に対するより高い活性が得
られる) 変更したもの；１個又はそれ以上のシステイン
残基が削除されているか又は例えばアラニン又はセリン
残基によって置換されておりそして微生物系から活性な
形でより容易に単離されるもの；又はフェニルアラニン
によって１個又はそれ以上のトリシン残基が置換されて
いるかつターゲット細胞上のヒトG-CSF リセプターに多
かれ少なかれ容易に結合し得るものが挙げられる。前記
欧州特許出願第91303868.3号明細書において提案されて
いる修飾は、例えば、自然配列の Cys17が Ser17によっ
て置換されているもの、又は、自然産生G-CSF の生物学
的性質の少なくとも１つを有することが知られている、
上記G-CSF の対立遺伝子的変種(allericvariant) 及び
その同族体、例えば、ＰＣＴ特許公告WO87/01132号明細
書、欧州特許公告第243,153 号明細書、欧州特許公告第
256,843 号明細書、欧州特許公告第272,603 号明細書、
“Biochemical andBiophysical Research Communicatio
ns ”、(1989)，Vol.159 ，No.1,103〜111頁、Kuga T.
他及び米国特許第4,904,584 号明細書に記載されている
ものに適用し得る。
【００３０】かかるG-CSF 誘導体について試験を行った
結果から、これらの誘導体は、対応する非修飾ポリペプ
チドよりすぐれた溶液安定度を有しており、しかも、生
物学的活性において顕著な差異を有していないか又は改
善された生物学的活性を有することが認められた。
【００３１】溶液安定度は１mg／ml，５mg／ml及び／又
は10mg／mlの初期濃度を有する、G-CSF 誘導体の燐酸緩
衝溶液(phosphate buffered saline) 中の溶液を37℃で
14日間放置した後に溶液中に溶解しているG-CSF 誘導体
の％を測定することにより決定される。溶液安定度の測
定法は後記参考例26に詳細に記載されている。本発明の
医薬組成物中で使用されるG-CSF 誘導体は初期濃度５mg
／mlの溶液においては少なくとも35％の溶液安定度を有
することが好都合であり、少なくとも50％の溶液安定度
を有することが有利であり、少なくとも75％の溶液安定
度を有することが好ましいであろう。本発明で使用する
ポリペプチドは初期濃度10mg／mlの溶液においては少な
くとも75％、特に、少なくとも85％の溶液安定度を有す
ることが好ましい。
【００３２】本発明の医薬組成物中で使用されるG-CSF
誘導体は前記したごとき追加の修飾(i) 、(ii)、(iii)
、(iv)、(v) 、(vi)、(vii) 、(viii)又は(ix)の一
つ、好ましくは、追加の修飾(i) 、(ii)、(vi)、(vii)
、(viii)又は(ix)の１つ、特に、追加の修飾(ii)、(i
v)、(vi)、(vii) 、(viii)又は（ix）の１つを有するよ
うに選択することが好ましい。
【００３３】溶液安定度が良好であるため、本発明の医
薬組成物中で使用するのに特に好ましいG-CSF 誘導体と
しては下記のものが挙げられる： [Arg11,Ser17,27,60,65 ] G-CSF; [Glu15,Ser17,27 ,Ala26,28 ,Lys30] G-CSF; [Arg11,Clu15,Ser17,27,60,65,Ala26,28 ,Lys30] G-CSF [Arg11,23 ,Ser17,27,60,65 ] G-CSF [Arg11,34 ,Ser17,27,60,65 ] G-CSF [Arg11,40 ,Ser17,27,60,65 ] G-CSF [Ala1 ,Thr3 ,Tyr4 ,Arg5,11,Ser17,27,60,65 ] G-CSF [Arg11,Glu15,111,Ser17,27,60,65,115,116 ,Al
a26,28 ,Lys30] G-CSF [Arg11,165,Glu15,Ser17,27,60,65 ,Ala26,28 ， Lys
30,58 ]G-CSF [Arg11,Glu15,Ser17,27,60,65 ,Ala26,28,44,51,55,Lys
30,49,58] G-CSF [Arg11,165,Glu15,111,Ser17,27,60,65,115,116 ,Ala
26,28,44,51,55,Lys30,49,58] G-CSF [Glu15,Ser17,27 ,Ala26,28 ,Arg30] hu G-CSF
【００３４】溶液安定度がすぐれておりかつ良好な比活
性(specificactivity) を有するため、本発明の医薬組
成物中で使用するのに特に好ましいG-CSF 誘導体として
は下記のものが挙げられる： i) [Arg11,Ser17,27,60,65 ] G-CSF ， ii) [Glu15,Ser17,27 ,Ala26,28 ,Lys30] G-CSF ， iii)[Arg11,Glu15,Ser17,27,60,65 ,Ala26,28 ,Lys30]
G-CSF ， iv) [Arg11,40 ,Ser17,27,60,65 ] G-CSF ， V) [Arg11,23 ,Ser17,27,60,65] G-CSF ， vi) [Arg11,165,Glu15,Ser17,27,60,65 ,Ala26,28 ,Lys
30,58 ] G-CSF vii)[Arg11,Glu15,111,Ser17,27,60,65,115,116 ,Ala
26,28 ,Lys30] G-CSF ， viii) [Glu15,Ser17,27 ,Ala26,28 ,Arg30] G-CSF ， ix) [Ala1 ,Thr3 ,Tyr4 ,Arg5,11,Ser17,27,60,65 ] G-
CSF ， x) [Ser17,27,60,65 ] G-CSF ， xi)[Arg11,Ser17,27,65] G-CSF ，及び xii)[Ser17,27,65] G-CSF これらの内、(i）、（ii）、（iii)、（vi）、(vii）、
(viii)、(x）、(xi)及び(xii）が最も好ましい。
【００３５】これらの後者のヒトG-CSF 誘導体はすぐれ
た溶液安定度を示すばかりでなしに、自然産生ヒトG-CS
F に比べて改善された比活性を有する。
【００３６】本発明のポリペプチド中にプリシークェン
ス（presequence)メチオニンを存在させるかあるいは存
在させないことができるが、これを存在させることが好
都合である。
【００３７】本発明の医薬組成物中で使用される G-CSF
誘導体の製造に関して、下記ｉ）〜viii）、すなわち、 ｉ）プロモーター及び適当である場合にはこのプロモー
ターに対するオペレーター、例えば trpプロモーター又
はT7A3プロモーター。T7A3プロモーターはバクテリオフ
ァージT7のA3プロモーターである［Dunn J. J.及びStud
ier F. W.,“J.Mol. Biol.” 166， 477〜535(1983) 参
照］。バクテリオファージT7 DNAの完全なヌクレオチド
塩基配列及びT7遺伝要素（genetic element)の位置は上
記文献に記載されている； ii）リボソーム結合部位配列、例えば trpリーダーリボ
ソーム結合部位配列； iii)発現させるべき遺伝子に対するクローニング部位； iv）aT4 転写終結配列（SEQ ID No51 及び図６参照）； ｖ）cer 配列（Summer D等、MGG, 201, P334-338, 1985
参照）； vi）テトラサイクリンリプレッサー遺伝子（Tet R)； vii)テトラサイクリン耐性遺伝子（Tet A)； viii）多重制限酵素配列（multiple restriction enzym
e sequence）； からなる、PAT153に基づく産生ベクター（production v
ector)を使用することが有利であることが認められた。
【００３８】SEQ ID No47 には EcoRI制限エンドヌクレ
アーゼ部位（ヌクレオチド1-6)、A3プロモーター配列
（ヌクレオチド７〜52）、 trpリーダーリボソーム結合
部位配列（ヌクレオチド53−78）及び翻訳開始コドン
（ヌクレオチド79−81）を包含する塩基配列が記載され
ている。
【００３９】本発明の G-CSF誘導体（先に定義）を発現
することのできる宿主を増殖培地で培養しそして培養中
に酵母エキスを含有する補充液（supplement）を増殖培
地に添加することが有利である。酵母エキスを含有する
補充液の添加は、培養の開始後、所定の時期に開始する
ことが好ましい。酵母エキスを含有する補充液の添加速
度は増殖培地が酵母エキスを消費した状態になることの
ないような速度であることが好ましい。このことは産生
ベクターをT7A3プロモーターと共に使用した場合に特に
有利である。
【００４０】前記で定義したごとき G-CSFの誘導体につ
いてコードする遺伝物質（geneticmaterial）を担持す
る組換え体ベクターを用いて形質転換された宿主を、G-
CSF誘導体の蓄積（accumlation)を改善するのに十分な
量のロイシン及び／又はスレオニンの存在下で培養する
ことも有利であり得る。例えば、産生ベクターをtrpプ
ロモーターと共に使用した場合には、この発酵（又は培
養)(fermentation）をロイシンの存在下で行うことが特
に好ましい。
【００４１】G-CSF 誘導体の精製はＰＣＴ特許出願公告
第WO87／001132号明細書に記載の方法で行い得るが、上
記ＰＣＴ公告明細書には、同明細書に記載の方法で調製
された G-CSF同族体から表面活性剤（detergent)、特
に、塩の形のN-ラウロイルサルコシン［例えば、サルコ
シル（Sarkosyl）〕を除去することは記載されていな
い。表面活性剤の除去は燐酸緩衝溶液（phosphate buff
ered salinｅ)(pH＝7.2 〜7.5)中で行うことが好まし
い。緩衝溶液は等張食塩水（isotonic saline)から好都
合に調製することができ、例えば、参考３に記載するご
とき組成を有する。この点に関して、他の緩衝液は、表
面活性剤の除去、特に、N-ラウロイルサルコシン（塩の
形）の除去が遅くかつより多量のタンパク質が沈澱する
という理由で余り好ましくないことが認められた。タン
パク質の沈澱を増大させることなしに除去効率が改善さ
れるという理由から、好ましくはこの工程でダイアフィ
ルタレーション（透析濾過）（diafilteration）を行う
ことが更に好ましい。例えばダイアフィルタレーション
は慣用の拡散透析（diffusion dialysis）に対して好ま
しいことが認められた。更に、表面活性剤の濃度、特
に、塩の形のN-ラウロイルサルコシン（例えばサルコシ
ル）の濃度を、クロマトグラフィー中の分解能（resolu
tion）を保持しながら、１％以下に低下させ得ることが
認められた。初期表面活性剤濃度を低下させることによ
り表面活性剤の除去が促進され、従って、クロマトグラ
フィー中の分解能の保持に一致する、最少の表面活性剤
濃度、例えばN-ラウロイルサルコシン（塩の形、例えば
サルコシル）濃度を使用することが好ましい。表面活性
剤、例えばN-ラウロイルサルコシン（塩の形）、例えば
サルコシルの特定の濃度は例えば 0.8〜0.2 ％、好まし
くは0.5 〜0.2 ％、特に約0.3 ％である。
【００４２】上記したことの他に、N-ラウロイルサルコ
シン（塩の形）、例えばサルコシルのごとき表面活性剤
を除去することにより、産生物の評価を複雑にする痕跡
のタンパク分解活性（proteolytic activity）を活性化
することが認められた。更に、ダイアフィルタレーショ
ンによる表面活性剤の除去後、好都合にはダイアフィル
タレーションにより、好ましくは透析により、実質的な
タンパク質の加水分解の生ずる前にpHを7.0 以下に低下
させた場合には、上記タンパク分解活性を著しく減少さ
せ、排除することさえできることが認められた。例え
ば、痕跡のタンパク分解活性の減少又は除去は、 7.0以
下のpHであるが、ポリペプチドの顕著な加水分解を回避
するのに十分な高さのpHで行い得る。このpHは 6.0〜4.
5 であることが有利であり、好ましくは 5.8〜5.0、特
に、約5.4 である。本発明のこの態様の別の利点は、こ
のpHの低下を行うことにより、大腸菌混入物及び／又は
分解された又は不正確に折りたたまれた（incorrectly
folded）タンパク質を沈澱させ得ることである。精製の
際にサイズ排除クロマトグラフィー工程を包含させるこ
とが好ましい；その理由はこれを行わない場合には、タ
ンパク質の加水分解による分解の問題が増大するのに対
し、本発明のこの態様においては、タンパク質の除去を
困難にせしめる、かかるタンパク質の分解が減少するこ
とにある。
【００４３】上記の方法の他に、 G-CSF又はその誘導体
の溶液安定度を向上させることにより、抽出操作が実質
的に単純化される。例えば、前記で定義したごとき本発
明の活性誘導体をその封入体（包含体)(inclusion bod
y）から抽出する方法は、この封入体を表面活性剤、特
に、塩の形のN-ラウロイルサルコシン（例えばサルコシ
ル）中に懸濁させ、2)酸化し、3)表面活性剤を除去し、
ついで4)表面活性剤を除去して得られた溶液を、高めら
れた温度例えば30〜45℃、有利には34〜42℃に保持し、
それによって、混入バクテリアタンパク質、生成物オリ
ゴマー及び／又は分解生成物を沈澱させることからな
る。上記の溶液は前記したごとき高められた温度で６〜
24時間、有利には８〜18時間、好ましくは10〜14時間、
特に、約12時間、保持することが好都合である。
【００４４】抽出は、例えば、宿主細胞を溶解し（lys
e）ついで遠心分離を行って封入体を例えばペレットの
形で得ることにより行い得る。ついで封入体を表面活性
剤、例えば塩の形のN-ラウロイルサルコシン（例えばサ
ルコシル）、好ましくは、１〜３％、特に、約２％の、
塩の形のＮ−ラウロイルサルコシン（例えばサルコシ
ル）中に懸濁させ得る。表面活性剤中の懸濁物をついで
硫酸銅（CuSO4 ）の存在下で酸化しついて遠心分離し得
る。封入体を洗浄することが可能な場合には、例えばデ
オキシコール酸塩より尿素を使用することが好ましい。
【００４５】上記の抽出法によれば、例えばサイズ排除
カラム（size exclusion column)を使用する必要が排除
されるため、生産方法が単純化され得る。更に、熱処理
工程からの生産物の回収率が高いことは、G-CSF誘導体
の改善された溶液安定度によってもたらされる利点の一
つであると考えられる。実際に、溶液安定度が大きけれ
ば大きい程、タンパク質は上記の新規な抽出法に対して
より適するものになる。従って例えば、この抽出法を10
mg／mlにおいて少なくとも85％の溶液安定度を有する G
-CSFの誘導体の抽出に適用することが好ましい。既知の
同族体〔Met-1，Ser 17〕G-CSFを上記の抽出法により抽
出した場合、rpHPLCは、１mg／mlの全タンパク質を含有
する滞留物（retentate ）を熱処理した後に、溶液中に
所望の生成物が40％しか残留していないことを示した。
３mg／mlの全タンパク質濃度においては、前記同族体は
19％しか溶液中に残存していないことを示した。
【００４６】A.1.2 他のポリペプチド ヒトカルシトニンは英国特許第1,270,595 号明細書に記
載されており、例えばペプチド合成又は組換え技術によ
って調製し得る（例えば、欧州特許公告第77,689；70,6
75；95,351；197,794 ；201,511 及び308,067 号明細書
及び米国特許第3,891,614 及び3,926,938 号明細書参
照）。水溶性重合体に共有結合されたヒトカルシトニン
のペプチド合成による製造は、水溶性重合体を共有結合
させるための、単一のリシン残基上の遊離のN-末端アミ
ノ基及び別の遊離アミノ基の利用性という点から好まし
い。水溶性重合体との共有結合を行う前にペプチド合成
によるか又は組換え技術によってヒトカルシトニンを形
成させることにより生成物の均質な混合物が得られ得
る。しかしながら、所望の、適切なアミノ酸残基を全ペ
プチド合成において組込む前に水溶性重合体に共有結合
させることを希望する場合には、均質混合物を形成させ
る代りに単一分子物質(single molecular entity）を形
成させ得る。しかしながら、勿論、ヒトカルシニンを、
ペプチド合成又は組換え技術によって製造しついでかく
形成されたヒトカルシトニンを水溶性重合体に結合させ
得る。
【００４７】インターロイキン-2はインターロイキン-1
の存在下での抗原又はマイトジエンによる活性化によっ
てT-リンパ球によって産生される、可溶性の免疫増強性
（immunoenhancing)グリコプロテイン（糖タンパク質）
である。インターロイキン-2はT-細胞の生長と増殖を誘
発し、γ−インターフエロン、β−細胞生長因子及びβ
−細胞分化因子の放出を可能にし、天然キラー細胞の活
性を増大させそして免疫不全症状態にあるＴ−細胞の機
能を回復させる。ヒトIL-2（インターロイキン-2）の分
離はS.Mita等により“Biochem, Biophys, Res. Commu
n.” 117, 114(1983) に記載されており、インターロイ
キン-2の微生物による製造は例えば欧州特許公告第142,
268 号明細書に記載されている。更に、des-アラニル S
er125 IL-2のごときインターロイキン-2の種々の同族体
は例えば米国特許第4,518,584号及び4,530,787 号明細
書に記載されている。des-アラニル Ser125 IL-2のごと
きIL-2活性を有するポリペプチドのポリエチレングリコ
ールの結合もＰＣＴ特許公告WO87／00056 号明細書に記
載されている。インターロイキン-2活性を有するポリペ
プチド、例えばIL-2それ自体及びその同族体並びにポリ
エチレングリコールのごとき水溶性重合体に共有結合さ
れたかかるポリペプチドは癌の治療において潜在的重要
性を有する。
【００４８】ヒト生長ホルモン(HGH）は身体の生長を促
進し、タンパク質合成を刺激し、炭水化物及び脂質代謝
を調節しそしてソマトメジンの血清中の水準を増大させ
る、種特異性の（species specific）アンボリックプロ
テインである。 HGHのアミノ酸配列及びバクテリア中で
のHGH についての DNAのクローニングと発現はD. V. Go
eddel 等、“Natural ”, 281, 544(1979)及びベルギー
特許第884,012号明細書及び米国特許第4,342,832 号明
細書に記載されている。哺乳動物細胞内でのHGH につい
ての DNAのクローニングと発現はG. N. Pavakis 等、
“Proc.Natl. Acad, Sci ”，USA. 78, 7398(1981) 及
びフランス特許第2,534,278 号明細書に記載されてい
る。
【００４９】HGH は２種のタンパク質を含有しているこ
とは理解されるであろう；その一方は22 kDaの分子量を
有するものであり、他方は20 kDaの分子量を有するもの
である（U. J. Lewis 等，J. Biol Chem 253, 2679〜26
87 (1978) 及びR. N. P.Singh 及びU. J. Lewis,“Pre
p. Biochem. 11, 559〜570(1981)参照）。20 kDa型変種
の生長ホルモン(20K-HGH）はヒト下垂体前葉腺、血漿及
び尿中の全HGH の５〜10％を構成する。アミノ酸配列分
析から20K-HGH はアミノ酸配列32〜46が欠けているとい
う点においてだけ22K-HGH と異ることが示されている。
20K-HGH は生長促進活性と他の活性を有するが、インシ
ュリンと同様の活性は示さないか、少ししか示さない。
20K-HGH 変種をコードする DNAの分子クローニングは、
Masuda等により“Biochemica et Biophysica Acta ”,
949,(1988)、 125〜131に記載されている。
【００５０】インターフエロンは広範囲のウイルスの感
染に対する非特異的耐性を付与し、細胞の増殖に作用し
そして免疫応答を調節する、一系列の種特異性の脊椎動
物タンパク質（vertebrate Protein）に与えられた名称
である。インターフエロンは文献に広範囲のものが記載
されている（例えばC. Weissmann, H. Weber,“Prog. N
ucl. Acid. Res. Mol. Biol. 33, 251 〜300(1986）及
びK. C. Zoon,“Interferon”9, 1〜12（1987）参
照）。インターフエロン系の３つの主要成分は消化され
た（digested）α, β及びγであり、その抗原的及び物
理化学的性質、誘導物質（inducer)の種類及びこれを誘
導した細胞源に基づいて分類される（“Nature” 286，
110(1980）参照）。インターフエロンは例えば組換え体
DNA製造技術のごとき任意、所望の方法により製造し得
る。インターフエロンαの製造はS. Nagata 等により
“Nature”, 284, 316(1980)及びD. V. Goeddel 等によ
り“Nature”，287, 411 (1980）に記載されているが、
インターフエロンα2 の製造についての特に良好な説明
は、M. D. Edge等により“Nucleic Acids Research”、
Vol.11，No.18, 6419 〜6435（1983）に記載されてい
る。インターフエロン−βの組換え体製造技術による製
造はT. Taniguchi等、“Proc. Natl, Acad.Sci. USA, 7
7，5230（1980）及びR. Derynck等、“Nature”，285,
542 (1980）に記載されている。インターフエロン−γ
の組換え体製造法による製造はP. W.Gray等により“Nat
ure”，295, 503 (1982）に記載されており、ヒトイン
ターフエロン−γ遺伝子の構造はP. W. Gray及びD.V. G
oddelにより“Nature”、298,859, (1982）に記載され
ている。インターフエロンは更に、M. D.Edge及びR.Cam
bleにより“Biotechnology and Genetic Engenering Re
view ”，Vol.2,p215 (1984) に記載されている。少な
くともある種のインターフエロンは約pH 8.5では不安定
であることを理解すべきである。使用されるインターフ
エロンはインターフエロンα又はインターフエロンβで
あることが有利であり、好ましくは、インターフエロン
α、特に、インターフエロンα2 である。
【００５１】一般的には、本発明で使用されるポリペプ
チドは組換え体製造技術又はペプチド合成法によって製
造し得る。ペプチドの寸法が許容される場合及び２個又
はそれ以上の遊離アミノ基（例えばN-末端アミノ基又は
１個又はそれ以上のリシン残基）が前記で例示したごと
き水溶性重合体との共有結合のために存在する場合に
は、ペプチド合成法は好ましい製造技術である。かかる
製造技術は水溶性重合体と共有結合されるリシン残基を
分子中の特定の部位に導入することになり、多数の遊離
アミノ基を有するペプチドに水溶性重合体を共有結合さ
せることにより得られ得る生成物の不均質な混合物の代
りに、単一分子物質を形成させ得ると云う利点を有す
る。
【００５２】使用される製造技術に拘わりなしに、i)水
溶性重合体を結合させるために、存在する残基をリシン
残基のごとき他の残基により置換することにより、ii）
水溶性重合体分子を結合させるための新しいかかる残基
を、例えば、N-及び／又はC-端部に付加するか又は、活
性が失われるか又は許容し得ない程度まで減少すること
がないことを条件として分子中に付加することにより及
び／又は１個又はそれ以上のかかる残基、例えばリシン
残基を置換するか又は除去することによってペプチドを
変性して水溶性重合体分子の結合の程度を減少させ、そ
れによって、かかる水溶性重合体の結合によってペプチ
ドの活性が減少するか又は消失する場合に、生成物の不
均質性を減少させること及び／又はポリペプチド分子中
のある部位における水溶性重合体の結合を排除すること
が有利であり得る。
【００５３】ポリエチレングリコールのごとき水溶性重
合体の、形成されたペプチドへの結合又はポリペプチド
が形成される前の特定のアミノ酸への結合は、本明細書
中に記載されるごとき慣用の方法によって行い得る。
【００５４】A.2 水溶性重合体 ポリペプチドに共有結合させる水溶性重合体は例えばデ
キストラン又はポリ（N-ビニルピロリドン）であり得る
が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコー
ル単独重合体、ポリオキシエチル化（polyoxyethylate
d）ポリオール及びポリビニルアルコール（上記単独重
合体は一方の端部がアルキル基で置換されているか又は
置換されていない）から選ぶことが好ましい。
【００５５】ポリペプチドを結合させる特定の重合体と
してはポリエチレングリコール(PEG）の単独重合体又は
ポリオキシエチレン化ポリオールが挙げられるが、但
し、重合体が室温で水溶性であることを条件とする。ポ
リオキシエチル化ポリオールの例としては、例えばポリ
オキシエチル化グリセリン、ポリオキシエチル化ソルビ
トール又はポリオキシエチル化グルコースが挙げられ
る。
【００５６】ポリオキシエチル化グリセリンのグリセリ
ン主鎖は、天然において、例えば動物又はヒトにおいて
産生する、モノ−，ジ−及びトリグリセリド中の主鎖と
同一である。従って、この分岐（branching)は体内にお
いて必ずしも異物（foreignagent)とは見られないであ
ろう。
【００５７】重合体は非置換ポリエチレングリコール
（PEG)、モノメチルPEG(mPEG）又はポリオキシエチル化
グリセリン（POG)、特に、モノメチルPEG (mPEG)である
ことが好ましく、そして、この重合体は、例えば、PEG
、mPEG又はPOG カルボン酸の4-ヒドロキシ-3- ニトロ
ベンゼンスルホネートエステル又はN-ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル、又は、PEG 、mPEG又はPOG のp-ニト
ロフェニルカーボネート又は2,4,5-トリクロルフェニル
カーボネートから形成されるアミド結合又はウレタン結
合により、好都合にポリペプチドに結合される。所望な
らば、ポリペプチドをスペーサーアーム(Spacer arm)と
してのアミノ酸又はペプチドを介してmPEGに結合させ得
る(L.Sartore等、“Appl. Biochem. Biotechnol. 27, 4
5-54 (1991）参照）。
【００５８】重合体の分子量は例えば、使用される特定
のペプチドに応じて、約 300〜100,000 であることが好
ましく、 350〜40,000であることがより好ましい。この
点に関して、水溶性重合体に関して引用される分子量は
数平均分子量であるが、かかる重合体は約１の多分散性
(polydispersity)（後に定義する）を有するので、数平
均分子量は重量平均分子量に近似しているであろう。
【００５９】PEG 単独重合体は置換されていないが、そ
の一方の端部がアルキル基で置換されていてもよい。ア
ルキル基は好ましくは C1-4 アルキル基であり、最も好
ましくはメチル基である。重合体はPEG の非置換単独重
合体、PEG のモノメチル置換単独重合体又はポリオキシ
エチル化グリセリンであることが有利であり、そして、
好ましくは1000、より好ましくは1250、特に1500の分子
量の下限値及び例えば20,000の分子量の上限値を有する
ことが有利である。所望ならば、分子量の上限値は40,0
00と云う高さであり得るが、15,000であることが有利で
あり、好ましくは10,000である。分子量は1000〜15,00
0、例えば2000〜10,000、特に2000〜5000の範囲である
ことが好ましい。
【００６０】ポリペプチドが自然産生G-CSF の生物学的
性質の少なくとも１つを有しておりそして水溶性重合体
としてPEG の非置換単独重合体又はPEG のモノメチル置
換単独重合体を使用した場合には、水溶性重合体の分子
量の下限値は750 と云う低い値であり得るが、通常、10
00であり、1250であることが有利であり、好ましくは15
00、特に、約2000である。
【００６１】ポリペプチドはポリエチレングリコール、
ポリプロピレングリコール単独重合体（これらの単独重
合体は一方の端部がアルキル基で置換されていないか又
は置換されている）、ポリオキシエチル化ポリオール又
はポリビニルアルコールに共有結合されるであろう。
【００６２】上記したポリペプチドは、例えば、天然分
子中に存在するか又は天然分子中に組み込まれた、(1)
遊離アミノ基、(2) タンパク質上の少なくとも１個の炭
水化物部分又は(3) 遊離スルフヒドリル（メルカプト）
基を介して水溶性重合体に共有結合され得る。
【００６３】かかる技術はM-CSF に関するPCT 特許公告
WO89/06546号明細書に詳細に記載されている。特に本発
明によれば、過剰のポリエチレングリコール(PEG) 又は
ポリオキシエチル化ポリオール(POP) の活性化エステル
又はカーボネートと、前記したごときG-CSF ポリペプチ
ドとを接触させ、それによって、PEG 又はPOP に実質的
に最大に共有結合されたG-CSF ポリペプチドを形成させ
ることを特徴とする、ポリエチレングリコールに共有結
合されたG-CSF ポリペプチド又はポリオキシエチル化ポ
リオールに共有結合されたG-CSG ポリペプチドの製造方
法が提供される。PEG の活性化カーボネート又はPOP の
活性化カーボネートは、少なくとも１個の水酸基を有す
るPEG 又はPOP とクロルギ酸塩とを接触させ、それによ
って、上記活性化カーボネートを形成させることにより
調製することが好ましい。
【００６４】PEG 又はPOP の活性化エステル又はカーボ
ネートとG-CSF ポリペプチドのモル比は 200：１〜50：
１であることが好ましく、より好ましくは 150：１〜5
0：１、特に約 100：１である。
【００６５】使用される方法はVeronese等により“Appl
ied Biochem. and Biotech. ”，11： 141-152 (1985)
に開示された方法であって、後に、CetusCorporation
によりIL-2に適用されたかつその米国特許第4,902,502
号明細書に記載された方法に類似している。
【００６６】水溶性重合体をポリペプチドに結合させる
ことによって結合体(conjugate) の生物学的性質が所望
の水準以下まで低下する場合には、これは、例えば、下
記の方法によって克服し得る；すなわち、１）ポリペプ
チドと水溶性重合体との間で開裂し得る(cleavable) 結
合を使用し、その結果、生体内での結合体の放出の後、
水溶性重合体をポリペプチドから開裂させて、良好な生
物学的活性を有するポリペプチドを得る方法；又は２）
水溶性重合体の結合が、結合体の生物学的活性に有害な
影響を与えることのない、ポリペプチド上の部位で生ず
るようなポリペプチド分子を形成させる方法（例えば米
国特許第4,904,584 号明細書に記載の方法）。しかしな
がら、所望ならば、ポリペプチドの生物学的活性の減少
は、単に、本発明の医薬組成物中に存在させる結合体の
量を増大させることによって排除し得るか又は少なくと
も最小限にし得る。
【００６７】Ｂ．医薬組成物の構成成分 医薬組成物の構成成分(material of the composition)
は、任意の好都合な重合体又はその混合物、例えば、ポ
リラクチド（前記で定義）又は両親媒性共重合体（例え
ば欧州特許第92,918号明細書に記載のもの）から誘導さ
れた生分解性ヒドロゲル及びポリラクチドとかかるヒド
ロゲルとの混合物であり得る。ヒドロゲルは特別な有用
性を有するが、これは、このヒドロゲルは線状又は分岐
鎖ブロック共重合体の成分がポリペプチドに結合してい
る親水性単位（水溶性重合体）に類似する熱力学的性質
(thermodynamic identity)を有するように構成し得ると
いう理由に基づくものである。従って例えば、ベギル化
ポリペプチドをポリエチレングリコールを含有する両親
媒性物質(amphipath) と共に使用することが特に有用で
ある。
【００６８】従って、医薬組成物の構成成分は、例え
ば、欧州特許公告第58,481号明細書に記載されるごとき
ポリラクチドであり得る。
【００６９】ポリラクチドからの高分子薬剤(macromole
culardrug) の放出は、ポリラクチドの構造（すなわ
ち、乳酸／グリコール酸の共重合体中の共単量体の分布
及び長さ）、乳酸／グリコール酸の単独重合体及び共重
合体の分子量及び該単独重合体又は共重合体の分子量分
布又は多分散度に応じて変動する。従って、好ましいポ
リラクチドはベンゼンに不溶性でありかつ１w/v%クロロ
ホルム中で25℃において0.09dl/g以上、但し、４dl/g以
下の固有粘度を有するか、又は、ベンゼンに可溶性であ
りかつ１w/v%クロロホルム中で0.09dl/g以上、但し、0.
5dl/ｇ以下、好ましくは、0.3dl/ｇ以下の固有粘度を有
するものである。他の好ましい種類のポリラクチドは20
00以上の数平均分子量を有するかつ2000〜10,000の数平
均分子量については多分散度が 1.2〜50であり、5000〜
30000 の数平均分子量については多分散度が 1.4〜15で
あるような制御された多分散度を有するものである。好
ましい数平均分子量の範囲は2000〜20,000である。溶液
粘度特性とその測定及び分子量の測定は“Preparative
Methods of Polymer Chemistry”，第２版、第43〜52
頁、W. R. Serenson及びTod W. Campbell 著，1968年、
Intersciencepublishers発行に記載されている。重合体
のこれらの種々の性質によってポリラクチド自体及びこ
れに基づく医薬組成物の分解のプロフィールが決定され
る。分解プロフィールには分解しているポリラクチド中
での微孔の形成、分解しているポリラクチドの水の吸収
及び分解しているポリラクチドの腐蝕又は重量損失が挙
げられる。これに関して、重合体自体中への生物学的活
性物質の拡散は生物学的活性物質の、放出速度制御重合
体(rate controlling polymer)中への溶解性又は該重合
体との相溶性及び生物学的活性物質の分子寸法によって
変動する。これらの理由の一方又は両者のために、生物
学的活性物質（先に定義）は重合体中に拡散し得ないも
のであり得る。このような場合には、放出を他のメカニ
ズムによって、例えば重合体マトリックス中の水性相を
介することによって生起させなければならない。従っ
て、時間の経過と共に連続的に水を吸収する重合体を製
造することが望ましくそしてこの連続的な水の吸収は、
最終的には分解して水溶性フラグメント又は浸食生成物
(erode) になる分解中のマトリックス中に水性微孔(aqu
eous micropore) の生成を伴っている。
【００７０】ポリペプチドを水溶性重合体、特に、ポリ
オキシエチレン重合体に共有結合させて生物学的活性物
質を形成させることにより、連続放出型医薬組成物の浸
透（パーコレーション）限界(percolation threshold)
(先に定義）が有利な影響を受けるものと思われる。浸
透限界は無水医薬組成物中の重合体マトリックス中への
生物学的活性物質の配合量及び上記重合体マトリックス
と生物学的活性物質との相溶性並びに試薬組成物の水和
の際の相分離の性質及び程度によって変動する。ポリペ
プチドの鎖長、水溶性重合体の分子量及び水溶性重合体
の配合割合は、いずれも、生物学的活性物質の相溶性に
影響を与える要因である。
【００７１】所望ならば、本発明の連続放出型医薬組成
物は生物学的活性物質の放出が開始する前に、短い誘導
期間を有し得る。誘導期間の長さは放出させるべき生物
学的活性物質の量及び生物学的活性物質を放出させる期
間によって変動し得る。
【００７２】本発明の連続放出型医薬組成物はマイクロ
カプセル形以外の形、例えば、生物学的活性物質が重合
体表面まで及び重合体表面を含めて重合体全体に分散し
ている微小球の形あるいは生物学的活性物質が表面まで
達している他の微細粒子の形であることが好ましい。
【００７３】本発明の連続放出型医薬組成物は、例え
ば、慣用の臨床的又は獣医学的方法で筋肉内又は皮下注
射することによりあるいは外科的に皮下挿入することに
より、ペプチドで処理することを希望する動物（例えば
ヒト）の体内に挿入し得る。
【００７４】B.1. 連続放出型医薬組成物の調製方法 本発明の連続放出型医薬組成物は任意の好都合な方法で
調製し得る。すなわち、例えば、欧州特許第58,481号明
細書に記載される方法に従って、例えば前記したごとき
医薬組成物の構成成分は氷酢酸のごとき有機溶剤中の溶
液として提供することができ、この溶液中に生物学的活
性物質を分散させることができる。
【００７５】B.2. 水性調製法 本発明の連続放出型医薬組成物は、例えば、重合体又は
共重合体が少なくとも約3000の重量平均分子量を有しか
つそのアンモニウム塩又はアルカリ金属塩の形であるこ
と及び分散体の固形分の少なくとも80重量％が200m-9の
孔寸法を有する細菌濾過器を通過することができること
を特徴とする、１個又はそれ以上のカルボン酸末端基を
有する重合体又は共重合体の水性分散体を製造すること
により調製し得る。
【００７６】かかる水性分散体の製造は、水混和性有機
溶剤中の重合体又は共重合体の溶液と、少なくとも化学
量論量の、水溶性アンモニウム又はアルカリ金属塩又は
水酸化物の溶液とを混合して、本質的に中性pHの混合水
性／有機溶剤中の重合体又は共重合体の対応するアンモ
ニウム塩又はアルカリ金属塩の分散体を形成させついで
水混和性有機溶剤を蒸発させて、固形分の少なくとも80
重量％が200m-9の孔寸法を有する細菌濾過器を通過する
ことができる、重合体又は共重合体塩の水性分散体を形
成させることにより行い得る。
【００７７】上記の方法で使用される重合体又は共重合
体は、例えば、単独重合体、すなわち、ポリ（D-，L-及
びDL−乳酸）、ポリ（D-，L-及びDL−ラクチド）、ポリ
グリコール酸、ポリグリコライド、ポリ−Ｅ−カプロラ
クトン及びポリ（ヒドロキシ酪酸）；これらの単独重合
体が誘導される単量体の２種又はそれ以上から誘導され
た共重合体；上記の単独重合体又は共重合体の１つと、
ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリド
ン）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレングリ
コール）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミ
ド、デキストラン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウ
ム、ゼラチン又はこれらの重合体が誘導される単量体の
２種又はそれ以上の共重合体から選ばれた親水性重合体
とからなるグラフト又は枝分れ重合体；から選択し得
る。
【００７８】この水性調製法で使用するのに好ましい重
合体又は共重合体は、単独重合体のポリ（D-，L-及びDL
−乳酸）及びポリ（D-，L-及びDL−ラクチド）；及び共
重合体のポリ（D-，L-又はDL−乳酸−コ−グリコール
酸）及びポリ（D-，L-又はDL−ラクチド−コ−グリコラ
イド）である。
【００７９】この水性調製法で使用するのに好ましい水
混和性溶剤はアセトン、2-ブタノン（メチルエチルケト
ン）、ジオキサン、ヘキサフルオルイソプロパノール、
テトラヒドロフラン、メタノール又はエタノール、特に
アセトンである；好ましい水溶性アンモニウム又はアル
カリ金属塩又は水酸化物は炭酸水素ナトリウム、カリウ
ム又はアンモニウム、炭酸ナトリウム、カリウム又はア
ンモニウム又は水酸化ナトリウム、カリウム又はアンモ
ニウムである。
【００８０】水性調製法で使用される他の溶剤はジクロ
ルメタンのごとき水と非混和性の溶剤である。かかる溶
剤を使用することにより、大きな粒度を有する共重合体
の水性分散体が得られる。
【００８１】水溶性アンモニウム又はアルカリ金属塩又
は水酸化物の溶液は、水溶液であるか又は水と水混和性
有機溶剤、例えばメタノール又はエタノールとの混合物
中の溶液であり得る。
【００８２】水混和性溶剤の蒸発は減圧下でかつ周囲温
度より可能な限り少しだけ高い温度で行うことが好まし
い。
【００８３】有機溶剤中の重合体又は共重合体の溶液を
水性相に添加しそしてこの添加を有機溶剤を蒸発させる
前に完了させた場合には、有機溶剤中の重合体又は共重
合体の濃度が約1.5w/v％を超えないときは、200m-9の孔
寸法を有するフィルターを通過することのできる粒子が
高い収量で得られる。
【００８４】この方法においては、重合体又は共重合体
の水混和性溶剤中の溶液と水溶性アンモニウム又はアル
カリ金属塩又は水酸化物の溶液との混合は、高い剪断力
下で攪拌することにより、例えば、25,000 rpm（１分当
りの回転数）までの攪拌を行うことのできるイストラル
（Ystral）ホモジナイザーを使用して行うことが好まし
い。
【００８５】ウシ胎児血清(FCS）及びヒト血清アルブミ
ンのごとき可溶化タンパク質(solubilising protein)は
医薬組成物中に存在しないことが好ましい。
【００８６】本発明の医薬組成物を調製するに当って
は、所与の組成物についての好ましいパラメーターは指
針として上記で詳細に述べたことに基づいて実験的に決
定し得る。インターロイキン−２(IL-2)、ヒト生長ホル
モン(HGH) 及びインターフェロンα2 (IFNα2 ）のごと
きある種のポリペプチドについては、所望の放出プロフ
ィルを得るために変更することが有利な一つのパラメー
ターは、医薬組成物中のタンパク質含有量であり、これ
は、IL-2、HGH 及び IFNα2 の場合には、通常、５〜20
重量％であり、10〜18重量％、特に約12.5〜16重量％で
あることが好ましい。
【００８７】従来、ポリエチレングリコールのごとき水
溶性重合体については、高い生物学的活性を保持するこ
とを希望する場合には、所望のポリペプチドの修飾の程
度を制限することが必要であることが認められていたこ
とは強張されるべきである。従って、過剰の水溶性重合
体と生物学的活性ポリペプチドとを結合させた場合に
は、生物学的活性が実質的に減少するか又は完全に失わ
れていた。ポリペプチドの修飾の程度を制限することが
必要であることにより、ある数、通常、多数の修飾のた
めの潜在的部位の周囲において、所与の数の水溶性重合
体分子の不均質な分布が増大する。かかる高度の不均質
性は溶解度及び半減期のごときパラメーターに対しては
僅かしか影響を及ぼさないが、異性体の不均質な集団(p
oputation)は、医薬組成物からの放出の均一性（consis
tency)と完全性を低下させるため、連続放出型医薬組成
物からの制御されたかつ完全な放出を行わせることに対
しては不利である。驚くべきことに、本出願人の欧州特
許出願第91303868.3に記載されるG-CSF 誘導体、特に、
[Arg11,ser17,27,60,65] G-CSF(これはプレシークエン
スメチオニンを有しているか又は有していないが、かか
る配列を有することが好都合である）は、前記したごと
き水溶性重合体、特に、モノメチルポリエチレングリコ
ール(mPEG)のごときポリエチレングリコール(PEG) によ
る徹底的修飾を行うことができ、しかも、自然産生G-CS
F の生物学的性質の少なくとも１つを保持していること
が認められた。すなわち、例えば、ベギル化G-CSF につ
いて行った試験結果から、自然産生G-CSF のG-CSF 活性
が生体内で約２の倍率(factor)の範囲で保持されている
ことが認められた。実際に、ペギル化[Arg11,ser
17,27,60,65 ] G-CSF を用いて生体内試験を行って得ら
れた投与量応答曲線(dose responce curve) は、自然産
生G-CSFの活性の約２倍の活性を示す。かかる徹底的修
飾を行った場合、異性体の不均質集団が実質的に減少
し、これによって、医薬組成物において該組成物からの
放出の均一性と完全性が増大する。
【００８８】本発明の医薬組成物中で使用するのに最も
好ましい生物学的活性物質はペギル化[Arg11,ser
17,27,60,65 ]ヒトG-CSF である；このG-CSF においては
G-CSF部分にプレシークエンスヌチオニンが存在してい
るかあるいは存在していないが、この配列が存在してい
ることが好都合でありそして各ポリエチレングリコール
(PEG) 部分は2000〜5000Daの分子量を有しており、G-CS
F 部分とPEG 部分の比率は１：３〜１：４、特に約１：
3.9 である。
【００８９】Ｃ． 用語の説明 本明細書中で使用されている用語について以下に説明す
る。“水性生物学型環境”（“aqueous physiological-
type environment”という用語は、温血動物の身体部
分、特に筋組織又は皮下組織又は循環系を意味するが、
実験室的研究においては、場合により生理学的pHに緩衝
された35〜40℃の温度の水性液体がかかる環境に似てい
る。
【００９０】本明細書においては、“連続放出”（“co
ntinuous release”）と云う用語は、本質的に一段階的
(monophasic)である放出形式を意味するが、この形式は
生物学的活性物質の蓄積的放出量を時間の関数としてプ
ロットした場合、変曲点(point of inflection）を有し
得るが、“プラトー”（“plateu”）段階は確実に有し
ていない。
【００９１】本明細書において使用される“一段階的”
（“monophasic”）という用語は、ある時間的間隔に亘
っての連続的な放出であって、その間に、生物学的活性
物質の蓄積的放出量を時間の関数としてプロットした場
合、変曲点は存在し得るがプラトー段階は確実に存在し
ないものを意味する。
【００９２】“ポリラクチド”という用語は、乳酸単独
の重合体、乳酸とグリコール酸の共重合体、上記重合体
の混合物、上記共重合体の混合物及び上記重合体と共重
合体との混合物を包含させるために一般的な意味で使用
されている；乳酸はラセミ型であるか又は光学的活性型
である。
【００９３】“酸安定性”（“acid-stable ”）という
用語は、生物学的活性物質が意図する用途での使用中に
医薬組成物内で遭遇する条件下で安定であることを意味
することを理解すべきである。医薬組成物内のpHは変化
するが、通常、pH８より高くないが、pH２より低くはな
いであろう。このpH値は両極端を表わしており、所与の
医薬組成物内のpHは2.5 又は３より低いものでは決して
あり得ない。関連する温度は、通常、哺乳動物の体温で
あり、通常、約40℃までであろう。意図される使用期間
は例えば１週間〜６ヶ月である。
【００９４】“多分散性”（“polydispersity”）とい
う用語はMw／Mn（ここでMwは重量平均分子量であり、Mn
は数平均分子量である）と定義される。数平均分子量の
絶対測定は末端基定量法又は蒸気浸透圧法によって行い
得る。数平均及び重量平均分子量及び多分散性の測定は
ポリスチレン標準についてのサイズ排除クロマトグラフ
ィーによっても行い得る。
【００９５】“パーコレーション（浸透）限界”（“pe
rcolationthreshold ”）という用語は、水性薬剤（生
物学的活性物質）相が外部環境及び本発明の連続放出型
医薬組成物内の水性薬剤（生物学的活性物質）の他のド
メイン（領域）(domain)との連続性(continuity)を達成
したときに得られる状態を意味する。
【００９６】本明細書中で使用されている“自然産生
（又は天然に産生する）G-CSF ”（“naturally occuri
ng G-CSF”）と云う用語は、天然に存在することが知ら
れているG-CSF を意味しそしてSEQ ID No 32に記載され
ているアミノ酸配列を有する２種のポリペプチドを包含
する。これらの２種のポリペプチドは、トリペプチドイ
ンサート(tripeptide insert) Val-Ser-Glu が一方のポ
リペプチドにおいては35と36の位置の間に存在するが、
他方のポリペプチドにおいては存在しないことおいて相
違するに過ぎない。本明細書中で使用される位置番号系
（numberingsystem) はVal-Ser-Glu インサートを含有
していない、天然に産生するポリペプチドに基づくもの
であり、従って、本明細書中で使用される“自然”
（“native”）という用語はVal-Ser-Glu インサートを
含有していないこのポリペプチドを意味する。前記した
ごとき修飾は、前記したごとき天然に産生する形のG-CS
F 及びその同族体の全てに適用可能であること及び修飾
のために選択された、天然に産生するG-CSF の形に応じ
て、ポリペプチドの位置番号の修正(revision)が必然的
に必要であることは理解されるであろう。
【００９７】ポリペプチドに適用される“自然産生G-CS
F の生物学的活性の少なくとも１つを有する”と云う用
語は、ポリペプチドがＰＣＴ特許公告WO87/01132号明細
書に記載されるごとき生物学的定量法の少なくとも１つ
において活性を示すことを意味する。
【００９８】“溶液安定度”（“solution stablity
”）と云う用語は、pH、温度及びイオン濃度からなる
生物学的条件下で、ある物質がその溶液から沈澱する傾
向の減少の程度を意味する。従って、溶液安定度は溶解
度とは異なるものである。
【００９９】下記の物質が以下の実施例及び参考例で言
及されており、その構成はつぎの通りである： 制限酵素に対する緩衝液 安定性：−20℃で安定 緩衝液組成 緩衝液成分 最終濃度(mmol/l) [1：10稀釈設定緩衝液(set buffer)］ Ａ Ｂ Ｌ Ｍ Ｈ トリス−アセテート 33 − − − − トリス−HCl − 10 10 10 50 Mg−アセテート 10 − − − − MgCl2 − ５ 10 10 10 K-アセテート 66 − − − − NaCl − 100 − 50 100 ジチオエリスリトール(DTE) − − 1 1 1 ジチオトレイトール(DTT) 0.5 − − − − 2-メルカプトエタノール − １ − − − 37℃でのpH 7.9 8.0 7.5 7.5 7.5 上記緩衝液はBoehringer Mankeim社から入手される。
【０１００】特定部位の突然変異誘発法において−参考
例４
【０１０１】ヌクレオチド混合物１：各々250 μM のdA
TP, dGTP, dCTP=S(dCTP のホスホロチオエート誘導
体）、dTTP及び１mMのATP ヌクレオチド混合物２：各々250 μM のdATP, dGTP, dC
TP, dTTP及び350 μM のATP.
【０１０２】ジェネクリーン(Geneclean）（商標） このキット(kit) は1) 6M沃化ナトリウム、2) 塩化ナ
トリウム／エタノール／水洗浄液を調製するための、塩
化ナトリウム、トリス及びEDTAの濃厚溶液；3)ガラスミ
ルク(Glassmilk)(商標）−シリカマトリックスの水中の
懸濁液1.25mlを含有する1.5 mlビン−；を含有してい
る。これは、“Proceedings of the National Academy
of Science USA”（1979),Vol.76, p615に記載されたVo
gelstein及びGillespie の方法に基づくDNA 精製技術で
ある。
【０１０３】別法として、“Molecular Cloning - a la
boratory Manual ”、第２版、Sambrook, Fritsch 及び
Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory;1989) に記
載される任意の方法を使用し得る。ファルマシア(Pharmacia) No 27-9250のランダムラベル
キットプロダクト (Landom Labe Kit Product) この方法は“Molecular Cloning - a Laboratory Manua
l ”、第２版、Sambrook, Fritsch 及びManiatis, p.p.
10.13-10.17 (ColdSpring HarborLaboratory, 1989) に
記載されている。シクイナーゼ（Sequenase)（商標） 化学的に修飾されたT7 DNAポリメラーゼ。“Proceeding
s of the National Academy of ScienceUSA”（1987),
Vol.84,pp.4767-4771に記載されるTabor 及びRichardso
nの方法に基づく。
【０１０４】ウルトロゲルACA ゲル（Ultrogel ACA gel
s) ポリアクリルアミドとアガロースの混合マトリックス：
これは２種の成分の相剰的係合（synergistic associat
ion ）によりポリアクリルアミドの高い再溶解アガロー
スの剛性を提供する。ウルトロゲルAcA は５％のポリア
クリルアミドと４％のアガロースを含有する。Ｍ９最小培地 塩化アンモニウム 1 ｇ オルソ燐酸水素二ナトリウム 6 ｇ オルソ燐酸水素カリウム 3 ｇ 塩化ナトリウム 0.5 ｇ 蒸留水 1 ｌ補充剤／75ml 300 μl 50％グルコース 75 μl 1M MgSO4 75 μl 0.1M CaCl2 75 μl 4mg/mlチアミン 75 μl 20％カゼインアミノ酸
【０１０５】微量元素溶液（TES) TES は下記の組成を有しかつ0.5ml/l の濃度で増殖培地
に添加される： AlCl3 6H2 O 0.1mg ｌ-1 100 μg ｌ-1 CoCl2 6H2 O 0.04mg l-1 40 μg ｌ-1 KCr(SO4 ）2 12 H2 O 0.01mg l-1 10 μg ｌ-1 CuCl2 2H2 O 0.01mg l-1 10 μg ｌ-1 H 3 BO3 0.005mg ｌ-1 5 μg ｌ-1 KI 0.1mg l-1 100 μg ｌ-1 MnSO4 H2 O 0.1mg l-1 100 μg ｌ-1 NiSO4 6H2 O 0.0045ng l-1 4.5 μg ｌ-1 Na2 MoO4 2H2 O 0.02mg l-1 20 μg ｌ-1 ZnSO4 7H2 O 0.02mg l-1 20 μg ｌ-1
【０１０６】T4DNA リガーゼ “Molecular Cloning-a Laboratory Manual ”第２版、
Sambrook, Fritsch 及びManiatis, 5.60〜5.64（Cold S
pring Harbor Laboratory 1989）及びWeiss B.他J. Bio
l. Chem. Vol 243, p 4543（1968）に記載
【０１０７】OXOID 燐酸緩衝液 本明細書中で使用されているOXOID 燐酸緩衝液はDulbec
co“Ａ”tablets によって提供されるものであり、下記
の組成を有する： 塩化ナトリウム 8.0 g／l 塩化カリウム 0.2 〃 リン酸二水素ナトリウム 1.15 〃 リン酸二水素カリウム 0.2 〃 pH＝7.3 10錠を１ｌの蒸留水に溶解しついで10分間115 ℃でオー
トクレーブ処理して、不溶性物質を含有していない溶液
を得る。上記の溶液はカルシウムとマグネシウムが省略
されていること以外、Dulbecco及びVogt（1954）, J. E
xp. Med. 99(2), 167-182 の原組成物に相当する。本明
細書中で言及されている全てのヌクレオチド配列は5'−
3'センス(sense）内で特定されている。本発明の誘導体
はhu G-CSFとも称されるヒトG-CSFに基づくものであ
る。実施例で調製された誘導体は、全て、大腸菌を使用
して調製されているので、プレシークエンスヌチオニン
が、通常、存在するであろう。“N-ラウロイルサルコシ
ン”という用語は塩の形でのこの物質の使用を意味す
る。すなわち、実施例及び参考例においてはN-ラウロイ
ルサルコシンはナトリウム塩の形で使用されている。
【０１０８】モノメチルポリエチレングリコール5000は
本明細書中ではメチルポリエチレングリコール5000とも
称されており、また、研究化学のあるカタログにおいて
はメトキシポリエチレングリコール5000とも称されてい
る。以下に本発明の実施例を示す。
【０１０９】実施例１ PEG 5000-[ Met-1,Ser17,27 ] hu G-CSFを含有する連続
放出型製薬組成物氷酢酸法 組成物Ａ（蛋白質20％装填率） 27.7mgのポリラクチド（50重量％のd,l-ラクチド／50重
量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量7673, 多分
散度2.59）を1.0 mlの氷酢酸に溶解させた。参考例３で
調製したPEG 5000-[ Met-1,Ser17,27 ] hu G-CSFの水溶
液（９mg/ml)１mlを凍結乾燥させ次いで別量１ml分の氷
酢酸に溶解させた。これら２種類の溶液を混合し、別量
２×0.5ml 分の氷酢酸を用いてガラス容器をゆすいだ。
得られた溶液をジクロロメタン／ドリコールドの浴中で
直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。85℃に加熱した定
盤を有する油圧プレスを用いて、凍結乾燥した粉末を完
全に混合し、次いでこの温度で成形して厚さ１mmのスラ
ブ板を得た。このスラブ板を切断して大体10mgの重量を
有するデポ（depots）とした。次いで２mlのオキソイド
（OXOID)燐酸緩衝液と0.02％のナトリウムアジドとを含
有するプラスチックの小ビンにデポを入れ、37℃で貯蔵
した。一定の間隔で水性媒体を取出し、新鮮な緩衝液を
補充した。PEG 5000-[ Met-1,Ser17,27 ]hu G-CSFの放
出は媒体のhplc分析によって測定し、蛋白質の累積放出
を算出した（図15参照）。
【０１１０】実施例２ PEG 5000-[ Met-1,Ser17,27 ] hu G-CSFを含有する連続
放出型製薬組成物 氷酢酸法 組成物Ｂ（15.36 ％の蛋白質装填率） 155.43mgのポリラクチド（50重量％のd, lラクチド／50
重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量7791.2,
多分散度2.65）を2.0ml の氷酢酸に溶解させた。参考例
３で調製したPEG 5000-[ Met-1,Ser17,27 ] hu G-CSFの
水溶液(10.56mg/ml) 3.79 mlを凍結乾燥させ（凍結乾燥
後の重量は104.94mgである）次いで別量2.0 ml分の氷酢
酸に溶解させた。これら２種類の溶液を混合し、別量４
×0.5 ml分の氷酢酸を用いてガラス容器をゆすいだ。得
られた溶液をジクロロメタン／ドリコールドの浴中で直
ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。70℃に加熱した定盤
を有する油圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を完全に混合
し、次いでこの温度で成形して厚さ１mmのスラブ板とし
た。このスラブ板を切断して大体70mgの重量を有するデ
ポとした。次いで２mlのオキソイド燐酸緩衝液と0.02％
のナトリウムアジドとを含有するプラスチックの小ビン
にデポを入れ、37℃で貯蔵した。一定の間隔で水性媒体
を取出し、新鮮な緩衝液を補充した。PEG 5000-[ Me
t-1,Ser17,27 ]hu G-CSFの放出は媒体のhplc分析により
測定し、蛋白質の累積放出を算出した（図15参照）。
【０１１１】比較例１ [Met-1,Ser17,27 ] hu G-CSFを単独で含有する連続放出
型製薬組成物 氷酢酸法 組成物Ｃ（20％の蛋白質装填率） 160.73mgのポリラクチド（50重量％のd,l-ラクチド／50
重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量7673，多
分散度2.59）を2.0 mlの氷酢酸に溶解させた。[Met-1,S
er17,27 ] hu G-CSFの水溶液(10.0mg/ml）の4.088 mlを
凍結乾燥させ次いで別量2.0 ml分の氷酢酸に溶解させ
た。これら２種類の溶液を混合し、別量２×0.5 ml分の
氷酢酸を用いてガラス容器をゆすいだ。ジクロロメタン
／ドリコールドの浴中で該溶液を直ちに凍結させ、一夜
凍結乾燥した。95℃に加熱した定盤を有する油圧プレス
を用いて凍結乾燥粉末を完全に混合し次いでこの温度で
成形して厚さ１mmのスラブ板を得た。このスラブ板を切
断して大体74mgの重量を有するデポとした。２mlのオキ
ソイド燐酸緩衝液と0.02％のナトリウムアジドとを含有
するプラスチックの小ビンにデポを入れ、37℃で貯蔵し
た。一定の間隔で水性媒体を取出し、新たな緩衝液を補
充した。[Met-1,Ser17,27 ] hu G-CSFの放出は媒体のhp
lc分析により測定し、蛋白質の累積放出を算出した（図
16参照）。
【０１１２】比較例２ [Met-1,Ser17,27 ] hu G-CSFとメチルPEG 5000とを含有
する連続放出型製薬組成物 氷酢酸法 組成物Ｄ（20％の蛋白質装填率） 120.66mgのポリラクチド（50重量％のd,l-ラクチド／50
重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量7673，多
分散度2.59）を2.0 mlの氷酢酸に溶解させた。[Met-1,S
er17,27 ] hu G-CSFの水溶液(10.0mg/ml）の3.935 mlを
凍結乾燥させ次いで氷酢酸に入れた40.82 mgのメチルPE
G 5000を含有する溶液2.0 mlに溶解した。これら２種類
の溶液を混合し、別量２×0.5 mlの氷酢酸を用いてガラ
ス容器をゆすいだ。
【０１１３】得られた溶液を、ジクロロメタン／ドリコ
ールドの浴中で直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。95
℃に加熱した定盤を有する油圧プレスを用いて凍結乾燥
粉末を完全に混合し、次いでこの温度で成形して厚さ１
mmのスラブ板を得た。このスラブ板を切断して大体74mg
の重量を有するデポとした。２mlのオキソイド燐酸緩衝
液と0.02％のナトリウムアジドとを含有するプラスチッ
ク製の小ビンにデポを入れ、37℃で貯蔵した。一定の間
隔で水性媒体を取出し、新たな緩衝液を補充した。[Met
-1,Ser17,27 ] hu G-CSFの放出は媒体のhplc分析により
測定し、蛋白質の累積放出を算出した（図16参照）。
【０１１４】実施例３ PEG 5000-[ Met-1,Glu15,Ser17,27 ,Ala26,28 ,Lys30]
hu G-CSFを含有する連続放出型製薬組成物氷酢酸法 組成物Ｅ（20％の蛋白質装填率） 120.34mgのポリラクチド（50重量％のd,l-ラクチド／50
重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量7673，多
分散度2.59）を2.0ml の氷酢酸に溶解させた。参考例８
で調製したPEG 5000-[ Met-1,Glu15,Ser17,27 ,Ala
26,28 ,Lys30] hu G-CSFの水溶液（10.7mg／ml）3.738
mlを凍結乾燥させ、次いで別量2.0 ml分の氷酢酸に溶解
した。これら２種類の溶液を混合し、別量２×0.5 ml分
の氷酢酸を用いてガラス容器をゆすいだ。得られた溶液
をジクロロメタン／ドリコールドの浴中で直ちに凍結さ
せ、一夜凍結乾燥した。85℃に加熱した定盤を有する油
圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を完全に混合し、次いで
この温度で成形して厚さ１mmのスラブ板を得た。このス
ラブ板を切断して約70mgの重量を有するデポとした。次
いでこれらのデポを、２mlのオキソイド燐酸緩衝液と0.
02％のナトリウムアジドとを含有するプラスチック製の
小ビンに入れ、37℃で貯蔵した。一定の間隔で水性媒体
を取出し、新たな緩衝液を補充した。PEG 5000-[ Me
t-1,Glu15,Ser17,27,Ala26,28 ,Lys30] hu G-CSFの放出
は媒体のhplc分析により測定し、蛋白質の累積放出を算
出した（図19参照）。
【０１１５】実施例４ PEG 5000-[ Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSFを
含有する連続放出型製薬組成物氷酢酸法 組成物Ｆ（20％の蛋白質装填率ポリペプチド） 120.40mgのポリラクチド（50重量％のd,l-ラクチド／50
重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量7673，多
分散度2.59）を2.0 mlの氷酢酸に溶解させた。参考例７
で調製したPEG 5000-[ Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ]
hu G-CSF（11.5mg/ml)の水溶液3.478 mlを凍結乾燥させ
次いで別量2.0 ml分の氷酢酸に溶解した。これら２種類
の溶液を混合し、別量２×0.5 ml分の氷酢酸を用いてガ
ラス容器をゆすいだ。得られた溶液をジクロロメタン／
ドリコールドの浴中で直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥し
た。85℃に加熱した定盤を有する油圧プレスを用いて凍
結乾燥粉末を完全に混合し、次いでこの温度で成形して
厚さ１mmのスラブ板を得た。このスラブ板を切断して約
72mgの重量を有するデポとした。次いでこれらのデポ
を、２mlのオキソイド燐酸緩衝液と0.02％のナトリウム
アジドとを含有するプラスチック製の小ビンに入れ、37
℃で貯蔵した。一定の間隔で水性媒体を取出し、新たな
緩衝液を補充した。PEG 5000-[ Met-1,Arg11,Ser
17,27,60,65 ] hu G-CSFの放出は媒体のhplcにより測定
し、蛋白質の累積放出を算出した（図20参照）。
【０１１６】実施例５ PEG 5000-[ Met-1] hu G-CSFを含有する連続放出型製薬
組成物 Ａ．氷酢酸法 120.11mgのポリラクチド（50重量％のd,l-ラクチド／50
重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量9429, 多
分散度2.02）を20mlの無水物無含有氷酢酸に溶解させ
た。PEG 5000-[ Met-1] hu G-CSF（10.7mg/ml)の水溶液
3.738mlを凍結乾燥させ、次いで別量2.0mlの氷酢酸に
溶解した。これら２種類の溶液を混合し、別量４×0.5
ml分の氷酢酸を用いてガラス容器をゆすいだ。得られた
溶液をジクロロメタン／ドリコールドの浴中で直ちに凍
結させ、一夜凍結乾燥した。65℃に加熱した定盤を有す
る油圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を完全に混合し、次
いで成形して厚さ１mmのスラブ板を得た。このスラブ板
を切断して約70mgの重量を有するデポとした。次いでこ
れらのデポを、オキソイド燐酸緩衝液に入れた0.02重量
／容量％のナトリウムアジドの溶液2.0 mlを含むプラス
チック製の小ビンに入れ、37℃で貯蔵した。一定の間隔
で水性媒体を取出し、新たな緩衝液を補充した。PEG 50
00-[ Met-1] G-CSF の放出は媒体のhplc分析により測定
し、蛋白質の累積放出を算出した（以下の表１参照）。
【０１１７】Ｂ．水性法 4.0gのポリラクチド（50重量％のd,l-ラクチド／50重量
％のグリコリド共重合体、重量平均分子量9429, 多分散
度2.02）を16.0mlのジクロロメタンに溶解させ、高剪断
下に配置した（イストラル1500ホモジナイザー）。この
溶液に重炭酸ナトリウム水溶液（20mg/ml)の４mlを滴加
した。別量40mlの蒸留水を添加し、微細な白色分散物が
生成した。次いで回転蒸発器を用いてジクロロメタンを
除去した。得られた分散物をジクロロメタン／ドリコー
ルドの浴中で直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。続い
てこの重合体のナトリウム塩を使用前に室温で真空下に
貯蔵した。
【０１１８】得られた重合体のナトリウム塩120.87mgを
2.0mlの蒸留水に分散させた。PEG5000-[ Met-1] hu G-
CSF（10.7mg/l）の水溶液3.738 mlを凍結乾燥させ、次
いで別量 2.0mlの蒸留水に溶解した。得られた溶液を懸
濁物に添加し、混合した。別量４×0.5ml 分の蒸留水を
用いてガラス容器をゆすいだ。得られた溶液をジクロロ
メタン／ドリコールドの浴中で直ちに凍結させ、一夜凍
結乾燥した。65℃に加熱した定盤を有する油圧プレスを
用いて凍結乾燥粉末を完全に混合し次いで成形して厚さ
１mmのスラブ板を得た。このスラブ板を切断して約80mg
の重量を有するデポとした。次いでこれらのデポを、オ
キソイド燐酸緩衝液に入れた0.02重量／容量％のナトリ
ウムアジド溶液の2.0 mlを含有するプラスチック製の小
ビンに入れ、37℃で貯蔵した。一定の間隔で水性媒体を
取出し、新たな緩衝液を補充した。PEG 5000-[ Met-1]
hu G-CSFの放出は媒体のhplc分析により測定し、蛋白質
の累積放出を算出した（以下の表１参照）。
【０１１９】実施例６ PEG 5000-[ Met-1,Ser17] hu G-CSFを含有する連続放出
型製薬組成物 Ａ．氷酢酸法 119.75mgのポリラクチド（50重量％のd,l-ラクチド／50
重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量9429, 多
分散度2.02）を20mlの無水物無含有氷酢酸に溶解させ
た。参考例13で調製したPEG 5000-[ Met-1,Ser17] hu G
-CSF（8.08mg/ml)の水溶液4.95mlを凍結乾燥させ、次い
で別量2.0 ml分の氷酢酸に溶解した。これら２種類の溶
液を混合し、別量４×0.5ml 分の氷酢酸を用いてガラス
容器をゆすいだ。得られた溶液をジクロロメタン／ドリ
コールドの浴中で直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。
65℃に加熱した定盤を有する油圧プレスを用いて凍結乾
燥粉末を完全に混合し次いで成形して厚さ１mmのスラブ
板を得た。このスラブ板を切断して約70mgの重量を有す
るデポとした。次いでこれらのデポを、オキソイド燐酸
緩衝液の0.02重量／容量％ナトリウムアジド溶液2.0 ml
を含有するプラスチック製の小ビンに入れ、37℃で貯蔵
した。一定の間隔で水性媒体を取出し、新たな緩衝液を
補充した。PEG 5000-[ Met-1,Ser17] hu G-CSFの放出は
媒体のhplc分析により測定し、蛋白質の累積放出を算出
した（以下の表１参照）。
【０１２０】Ｂ．水性法 4.0gのポリラクチド（50重量％のd,l-ラクチド／50重量
％のグリコリド共重合体、重量平均分子量9429, 多分散
度2.02）を16.0mlのジクロロメタンに溶解させ、高剪断
下に配置した（イストラル1500ホモジナイザー）。この
溶液に重炭酸ナトリウムの水溶液（20mg/ml)の４mlを滴
加した。別量40mlの蒸留水を添加し、微細な白色分散物
が生成した。次いで回転蒸発器を用いてジクロロメタン
を除去した。該分散物をジクロロメタン／ドリコールド
の浴中で直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。続いてこ
の重合体のナトリウム塩を使用前に室温で真空下に貯蔵
した。
【０１２１】120.80mgの該重合体のナトリウム塩を2.0
mlの蒸留水に分散させた。PEG 5000-[ Met-1,Ser17] hu
G-CSF（8.08mg/l）の水溶液4.95mlを凍結乾燥させ次い
で別量2.0 mlの蒸留水に溶解した。得られた溶液を懸濁
物に添加し、混合した。別量４×0.5ml 分の蒸留水を用
いてガラス容器をゆすいだ。得られた溶液をジクロロメ
タン／ドリコールドの浴中で直ちに冷凍させ、一夜凍結
乾燥した。65℃に加熱した定盤を有する油圧プレスを用
いて凍結乾燥粉末を完全に混合し次いで成形して厚さ１
mmのスラブ板を得た。このスラブ板を切断して約80mgの
重量を有するデポとした。次いでこれらのデポをオキソ
イド燐酸緩衝液に入れた0.02重量／容量％のナトリウム
アジド溶液2.0ml を含有するプラスチック製の小ビンに
入れ、37℃で貯蔵した。一定の間隔で水性媒体を取出
し、新たな緩衝液を補充した。PEG5000-[ Met-1,Ser17]
hu G-CSFの放出は媒体のhplc分析により測定し、蛋白
質の累積放出を算出した（以下の表１参照）。
【０１２２】実施例７ PEG 5000-[ Met-1,Arg11,16 ,Ser17,27,60,65 ] hu G-C
SFを含有する連続放出型製薬組成物 Ａ．氷酢酸法 120.72mgのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／
50重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量9429、
多分散度2.02）を2.0ml の無水酢酸無含有氷酢酸に溶解
させた。参考例19で調製したPEG 5000-[ Met-1,Arg
11,16 ,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSF(11.53mg/ml)の水溶
液3.47mlを凍結乾燥させ次いで別量2.0ml の氷酢酸に溶
解した。これら２種類の溶液を混合し、別量４×0.5ml
分の氷酢酸を用いてガラス容器をゆすいだ。得られた溶
液をジクロロメタン／ドリコールドの浴中で直ちに冷凍
させ、一夜凍結乾燥した。65℃に加熱した定盤を有する
油圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を完全に混合し、次い
で成形して厚さ１mmのスラブ板を得た。このスラブ板を
切断して約65mgの重量を有するデポとした。次いでこれ
らのデポを、オキソイド燐酸緩衝液に入れた0.02重量／
容量％のナトリウムアジド溶液2.0 mlを含有するプラス
チック製の小ビンに入れ、37℃に貯蔵した。一定の間隔
で水性媒体を取出し、新たな緩衝液を補充した。PEG 50
00-[Met-1,Arg11,16 ,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSFの放
出は媒体のhplc分析により測定し、蛋白質の累積放出を
算出した（以下の表１参照）。
【０１２３】Ｂ．水性法 4.0gのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／50重
量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量9429、多分
散度2.02）を16.0mlのジクロロメタンに溶解させ、高剪
断下に配置した（イストラル1500ホモジナイザー）。こ
の溶液に重炭酸ナトリウム水溶液(20mg/ml) の４mlを滴
加した。別量40mlの蒸留水を添加し、微細な白色分散物
が生成した。次いで回転蒸発器を用いてジクロロメタン
を除去した。得られた分散物をジクロロメタン／ドリコ
ールドの浴中で直ちに冷凍させ、一夜凍結乾燥した。続
いてこの重合体のナトリウム塩を使用前に室温で真空下
に貯蔵した。
【０１２４】119.71mgの重合体のナトリウム塩を2.0 ml
の蒸留水に分散させた。PEG 5000-[Met-1,Arg11,16 ,Se
r17,27,60,65 ] hu G-CSF(11.53mg/ml)の水溶液3.47ml
を凍結乾燥させ、次いで別量2.0 mlの蒸留水に溶解し
た。得られた溶液を前記懸濁物に添加した。別量４×0.
5 ml分の蒸留水を用いてガラス容器をゆすいだ。得られ
た溶液をジクロロメタン／ドリコールドの浴中で直ちに
冷凍させ、一夜凍結乾燥した。凍結乾燥した粉末を、65
℃に加熱した定盤を有する油圧プレスを用いて完全に混
合し、次いで成形して厚さ１mmのスラブ板とした。この
スラブ板を切断して約70mgの重量を有するデポとした。
これらのデポを次いで、オキソイド燐酸緩衝液に溶かし
た0.02重量／容量％のナトリウムアジドの溶液2.0 mlを
含有するプラスチック製の小ビンに入れ、37℃で貯蔵し
た。一定の間隔で水性媒体を取出し、新たな緩衝液を補
充した。PEG 5000-[ Met-1,Arg11,16 ,Se
r17,27,60,65 ] huG-CSF の放出は媒体のhplc分析によ
り測定し、蛋白質の累積放出を算出した（以下の表１参
照）。
【０１２５】実施例８ PEG 5000-[ Met-1,Arg11,23 ,Ser17,27,60,65 ] hu G-C
SFを含有する連続放出型製薬組成物 Ａ．氷酢酸法 120.11mgのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／
50重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量9429、
多分散度2.02）を2.0ml の無水酢酸無含有氷酢酸に溶解
させた。参考例14で調製したPEG 5000-[ Met-1,Arg
11,23 ,Ser 17,27,60,65 ] hu G-CSFの水溶液(10.93mg/
ml)の3.66mlを凍結乾燥させ次いで別量2.0ml の氷酢酸
に溶解した。これら２種類の溶液を混合し、別量４×0.
5ml分の氷酢酸を用いてガラス容器をゆすいだ。得られ
た溶液をジクロロメタン／ドリコールドの浴中で直ちに
冷凍させ、一夜凍結乾燥した。65℃に加熱した定盤を有
する油圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を完全に混合し、
次いで成形して厚さ１mmのスラブ板とした。このスラブ
板を切断して約80mgの重量を有するデポとした。次いで
これらのデポを、オキソイド燐酸緩衝液に溶かした0.02
重量／容量％のナトリウムアジドの溶液2.0 mlを含有す
るプラスチック製の小ビンに装入し、37℃で貯蔵した。
一定の間隔で水性媒体を取出し、新たな緩衝液を補充し
た。PEG 5000-[ Met-1,Arg11,23 ,Ser17,27,60,65 ] hu
G-CSFの放出は媒体のhplc分析により測定し、蛋白質の
累積放出を算出した（以下の表１参照）。
【０１２６】Ｂ．水性法 4.0gのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／50重
量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量9429、多分
散度2.02）を16mlのジクロロメタンに溶解させ、高剪断
下に配置した（イストラル1500ホモジナイザー）。この
溶液に重炭酸ナトリウムの水溶液(20mg/ml) ４mlを滴加
した。別量40mlの蒸留水を添加し、微細な白色分散物が
生成した。次いで回転蒸発器を用いてジクロロメタンを
除去した。得られた分散物をジクロロメタン／ドリコー
ルドの浴中で直ちに冷凍させ、一夜凍結乾燥した。この
重合体のナトリウム塩を続いて使用前に室温で真空下に
貯蔵した。
【０１２７】120.71mgの重合体のナトリウム塩を2.0 ml
の蒸留水に分散させた。PEG 5000-[Met-1,Arg11,23 ,Se
r17,27,60,65 ] hu G-CSFの水溶液(10.93mg/ml)の3.66m
lを凍結乾燥させ次いで別量2.0 mlの蒸留水に溶解し
た。得られた溶液を前記懸濁物に添加し、混合した。別
量４×0.5 ml分の蒸留水を用いてガラス容器をゆすい
だ。得られた溶液をジクロロメタン／ドリコールドの浴
中で直ちに冷凍させ、一夜凍結乾燥した。65℃に加熱し
た定盤を有する油圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を完全
に混合し、次いで成形して厚さ１mmのスラブ板とした。
このスラブ板を切断して約70mgの重量を有するデポとし
た。次いでこれらのデポを、オキソイド燐酸緩衝液に溶
かした0.02重量／容量％のナトリウムアジドの溶液2.0
mlを含有するプラスチック製の小ビンに装入し、37℃で
貯蔵した。一定の間隔で水性媒体を取出し、新たな緩衝
液を補充した。PEG 5000-[ Met-1,Arg11,23 ,Ser
17,27,60,65 ] hu G-CSFの放出は媒体のhplc分析により
測定し、蛋白質の累積放出を算出した（以下の表１参
照）。
【０１２８】実施例９ PEG 5000-[ Met-1,Arg11,34 ,Ser17,27,60,65 ] hu G-C
SFを含有する連続放出型製薬組成物 Ａ．氷酢酸法 120.65mgのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／
50重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量10691,
多分散度1.75）を2.0 mlの無水酢酸無含有氷酢酸に溶解
した。参考例20で調製したPEG 5000-[ Met-1,Ar
g11,34 ,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSFの水溶液(10.5mg/m
l) の3.810 mlを凍結乾燥させ次いで別量2.0 mlの氷酢
酸に溶解した。これら２種類の溶液を混合し、別量４×
0.5 ml分の氷酢酸を用いてガラス容器をゆすいだ。得ら
れた溶液をジクロロメタン／ドリコールドの浴中で直ち
に冷凍させ、一夜凍結乾燥した。90℃に加熱した定盤を
有する油圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を完全に混合
し、次いで成形して厚さ１mmのスラブ板とした。このス
ラブ板を切断して約70mgの重量のデポとした。次いでこ
れらのデポを、オキソイド燐酸緩衝液に溶かした0.02重
量／容量％のナトリウムアジドの溶液2.0 mlを含有する
プラスチック製の小ビンに装入し、37℃で貯蔵した。一
定の間隔で水性媒体を取出し、新たな緩衝液を補充し
た。PEG5000-[ Met-1,Arg11,34 ,Ser17,27,60,65 ] hu
G-CSFの放出は媒体のhplc分析により測定し、蛋白質の
累積放出を算出した（以下の表１参照）。
【０１２９】Ｂ．水性法 5.0gのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／50重
量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量10691,多分
散度1.75）を20mlのジクロロメタンに溶解させ、高剪断
下に配置した（イストラル1500ホモジナイザー）。この
溶液に重炭酸ナトリウムの水溶液(20mg/ml) の５mlを滴
加した。別量50mlの蒸留水を添加し、微細な白色分散物
が生成した。ジクロロメタンを回転蒸発器の使用により
除去した。分散物をジクロロメタン／ドリコールドの浴
中で直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。得られた重合
体のナトリウム塩を使用前に室温で真空下に貯蔵した。
【０１３０】120.15mgの重合体のナトリウム塩を2.0 ml
の蒸留水に分散させた。PEG 5000-[Met-1,Arg11,34 ,Se
r17,27,60,65 ] hu G-CSF(10.5mg/ml) の水溶液3.810 m
lを凍結乾燥させ次いで別量2.0 mlの蒸留水に溶解し
た。得られた溶液を前記の懸濁物に添加し、混合した。
別量４×0.5 ml分の蒸留水を用いてガラス容器をゆすい
だ。得られた溶液をジクロロメタン／ドリコールドの浴
中で直ちに冷凍させ、一夜凍結乾燥した。90℃に加熱し
た定盤を有する油圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を完全
に混合し、次いで成形して厚さ１mmのスラブ板とした。
このスラブ板を切断して約75mgの重量を有するデポとし
た。これらのデポを次いで、オキソイド燐酸緩衝液に溶
かした0.02重量／容量％のナトリウムアジドの溶液2.0
mlを含有するプラスチック製の小ビンに装入し、37℃で
貯蔵した。一定の間隔で水性媒体を除去し、新たな緩衝
液を補充した。PEG 5000-[ Met-1,Arg11,34 ,Ser
17,27,60,65 ] hu G-CSFの放出は媒体のhplc分析により
測定し、蛋白質の累積放出を算出した（以下の表１参
照）。
【０１３１】実施例10 PEG 5000-[ Met-1,Arg11,40 ,Ser17,27,60,65 ] hu G -
CSF を含有する連続放出型製薬組成物 Ａ．氷酢酸法 120.74mgのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／
50重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量10691,
多分散度1.75）を2.0 mlの無水酢酸無含有氷酢酸に溶解
させた。参考例21で調製したPEG 5000-[ Met-1,Arg
11,40 ,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSF(10.6mg/ml) の水溶
液3.77mlを凍結乾燥させ次いで別量2.0 mlの氷酢酸に溶
解した。これら２種類の溶液を混合し、別量４×0.5 ml
分の氷酢酸を用いてガラス容器をゆすいだ。得られた溶
液をジクロロメタン／ドリコールドの浴中で直ちに冷凍
させ、一夜凍結乾燥した。95℃に加熱した定盤を有する
油圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を完全に混合させ、次
いで成形して厚さ１mmのスラブ板を得た。このスラブ板
を切断して約85mgの重量を有するデポとした。次いでこ
れらのデポを、オキソイド燐酸緩衝液に溶かした0.02重
量／容量％のナトリウムアジドの溶液2.0 mlを含有する
プラスチック製の小ビンに装入し、37℃で貯蔵した。一
定の間隔で水性媒体を除去し新たな緩衝液を補充した。
PEG5000-[ Met-1,Arg11,40 ,Ser17,27,60,65 ] hu G-CS
Fの放出は媒体のhplc分析により測定し、蛋白質の累積
放出を算出した（以下の表１参照）。
【０１３２】Ｂ．水性法 5.0gのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／50重
量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量10691,多分
散度1.75）を20mlのジクロロメタンに溶解させ、高剪断
下に配置した（イストラル1500ホモジナイザー）。この
溶液に重炭酸ナトリウムの水溶液(20mg/ml) の５mlを滴
加した。別量50mlの蒸留水を添加し、微細な白色分散物
が生成した。次いで回転蒸発器を用いてジクロロメタン
を除去した。得られた分散物をジクロロメタン／ドリコ
ールドの浴中で直ちに冷凍させ、一夜凍結乾燥した。続
いてこの重合体のナトリウム塩を使用前に室温で真空下
に貯蔵した。
【０１３３】120.20mgの該重合体のナトリウム塩を2.0
mlの蒸留水に分散させた。PEG 5000-[ Met-1,Ar
g11,40 ,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSF(10.6mg/ml) の水
溶液3.77mlを凍結乾燥させ次いで別量2.0 mlの蒸留水に
溶解した。得られた溶液を前記懸濁物に添加し、混合し
た。別量４×0.5 ml分の蒸留水を用いてガラス容器をゆ
すいだ。得られた溶液をジクロロメタン／ドリコールド
の浴中で直ちに冷凍させ、一夜凍結乾燥した。95℃に加
熱した定盤を有する油圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を
完全に混合し、次いで成形して厚さ１mmのスラブ板を得
た。このスラブ板を切断して約72mgの重量を有するデポ
とした。次いでこれらのデポを、オキソイド燐酸緩衝液
に溶かした0.02重量／容量％のナトリウムアジドの溶液
2.0 mlを含有するプラスチックの小ビンに装入し、37℃
で貯蔵した。一定の間隔で水性媒体を取出し、新たな緩
衝液を補充した。PEG 5000-[ Met-1,Arg11,40 ,Ser
17,27,60,65 ]hu G-CSFの放出は媒体のhplc分析により
測定し、蛋白質の累積放出を算出した（以下の表１参
照）。
【０１３４】実施例11 PEG 5000-[ Met-1,Ala1 ,Thr3 ,Tyr4 ,Arg5,11,Ser
17,27,60,65 ] hu G-CSFを含有する連続放出型製薬組成
物 Ａ．氷酢酸法 119.79mgのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／
50重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量10691,
多分散度1.75）を2.0 mlの無水酢酸無含有氷酢酸に溶解
させた。参考例22で調製したPEG 5000-[ Met-1,Ala1 ,T
hr3 ,Tyr4 ,Arg5,11,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSF(12.6m
g/ml) の水溶液3.175 mlを凍結乾燥させ次いで別量2.0
mlの氷酢酸に溶解した。これら２種の溶液を混合し、別
量４×0.5 ml分の氷酢酸を用いてガラス容器をゆすい
だ。得られた溶液をジクロロメタン／ドリコールドの浴
中で直ちに冷凍させ、一夜凍結乾燥した。95℃に加熱し
た定盤を有する油圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を完全
に混合し、次いで成形して厚さ１mmのスラブ板を得た。
このスラブ板を切断して約80mgの重量を有するデポとし
た。次いでこれらのデポを、オキソイド燐酸緩衝液に溶
かした0.02重量／容量％のナトリウムアジドの溶液2.0
mlを含有するプラスチック製の小ビンに装入し37℃で貯
蔵した。一定の間隔で水性媒体を取出し、新たな緩衝液
を補充した。PEG 5000-[ Met-1,Ala1 ,Thr3 ,Tyr4 ,Arg
5,11,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSFの放出は媒体のhplc分
析により測定し、蛋白質の累積放出を算出した（以下の
表１参照）。
【０１３５】Ｂ．水性法 5.0gのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／50重
量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量10691,多分
散度1.75）を20mlのジクロロメタンに溶解させ、高剪断
下で配置した（イストラル1500ホモジナイザー）。この
溶液に重炭酸ナトリウムの水溶液(20mg/ml) を５ml滴加
した。別量50mlの蒸留水を添加し、微細な白色分散物が
生成した。次いで回転蒸発器を用いてジクロロメタンを
除去した。得られる分散物をジクロロメタン／ドリコー
ルドの浴中で直ちに冷凍させ、一夜凍結乾燥した。この
重合体のナトリウム塩を続いて使用前に室温で真空下に
貯蔵した。
【０１３６】119.67mgの該重合体のナトリウム塩を2.0
mlの蒸留水に分散させた。PEG 5000-[ Met-1,Ala1 ,Thr
3 ,Tyr4 ,Arg5,11,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSF(12.6mg/
ml)の水溶液3.175 mlを凍結乾燥させ次いで別量2.0 ml
の蒸留水に溶解した。得られた溶液を前記懸濁物に添加
し、混合した。別量４×0.5 ml分の蒸留水を用いてガラ
ス容器をゆすいだ。得られた溶液をジクロロメタン／ド
リコールドの浴中で直ちに冷凍させ、一夜凍結乾燥し
た。95℃に加熱した定盤を有する油圧プレスを用いて凍
結乾燥粉末を完全に混合し次いで成形して厚さ１mmのス
ラブ板を得た。このスラブ板を切断して約90mgの重量を
有するデポとした。次いでこれらのデポを、オキソイド
燐酸緩衝液に溶かした0.02重量／容量％のナトリウムア
ジドの溶液2.0 mlを含有するプラスチック製の小ビンに
装入し、37℃で貯蔵した。一定の間隔で水性媒体を取出
し、新たな緩衝液を補充した。PEG 5000-[ Met-1,Al
a1 ,Thr3 ,Tyr4 ,Arg5,11,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSF
の放出は水性媒体のhplc分析により測定し、蛋白質の累
積放出を算出した（以下の表１参照）。
【０１３７】実施例12 PEG 5000-[ Met-1,Glu15,Ser17,27 ,Ala26,28 ,Arg30]
hu G-CSFを含有する連続放出型製薬組成物 Ａ．氷酢酸法 120.25mgのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／
50重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量10691,
多分散度1.75）を2.0 mlの無水酢酸無含有氷酢酸に溶解
させた。参考例15で調製したPEG 5000-[ Met-1,Glu15,S
er17,27 ,Ala26,28 ,Arg30] hu G-CSF(13.8mg/ml) の水
溶液2.899 mlを凍結乾燥させ、次いで別量2.0 mlの氷酢
酸に溶解した。これら２種の溶液を混合し、別量４×0.
5ml分の氷酢酸を用いてガラス容器をゆすいだ。得られ
た溶液をジクロロメタン／ドリコールドの浴中で直ちに
冷凍させ、一夜凍結乾燥した。90℃に加熱した定盤を有
する油圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を完全に混合させ
次いで成形して厚さ１mmのスラブ板を得た。このスラブ
板を切断して約100 mgの重量を有するデポとした。次い
でこれらのデポを、オキソイド燐酸緩衝液に溶かした0.
02重量／容量％のナトリウムアジドの溶液2.0 mlを含有
するプラスチック製の小ビンに装入し、37℃で貯蔵し
た。一定の間隔で水性媒体を取出し、新たな緩衝液を補
充した。PEG 5000-[ Met-1,Glu15,Ser17,27 ,Al
a26,28 ,Arg30] hu G-CSFの放出は媒体のhplc分析によ
り測定し、蛋白質の累積放出を算出した（以下の表１参
照）。
【０１３８】Ｂ．水性法 5.0gのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／50重
量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量10691,多分
散度1.75）を20mlのジクロロメタンに溶解させ、高剪断
下に配置した（イストラル1500ホモジナイザー）。この
溶液に重炭酸ナトリウムの水溶液(20mg/ml) ５mlを滴加
した。別量50mlの蒸留水を添加し、微細な白色分散物が
生成した。次いで回転蒸発器を用いてジクロロメタンを
除去した。得られた分散物をジクロロメタン／ドリコー
ルドの浴中で直ちに冷凍させ、一夜凍結乾燥した。この
重合体のナトリウム塩を続いて使用前に室温で真空下に
貯蔵した。
【０１３９】120.37mgの該重合体のナトリウム塩を2.0
mlの蒸留水に分散させた。PEG 5000-[ Met-1,Glu15,Ser
17,27 ,Ala26,28 ,Arg30] hu G-CSF(13.8mg/ml) の水溶
液2.899 mlを凍結乾燥させ次いで別量2.0 mlの蒸留水に
溶解した。得られた溶液を前記懸濁物に添加し、混合し
た。別量４×0.5 ml分の蒸留水を用いてガラス容器をゆ
すいだ。得られた溶液をジクロロメタン／ドリコールド
の浴中で直ちに冷凍させ、一夜凍結乾燥した。95℃に加
熱した定盤を有する油圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を
完全に混合し、次いで成形して厚さ１mmのスラブ板を得
た。このスラブ板を切断して約100 mgの重量を有するデ
ポとした。次いでこれらのデポを、オキソイド燐酸緩衝
液に溶かした0.02重量／容量％のナトリウムアジドの溶
液2.0 mlを含有するプラスチック製の小ビンに装入し、
37℃で貯蔵した。一定の間隔で水性媒体を取出し、新た
な緩衝液を補充した。PEG 5000-[ Met-1,Glu15,Ser
17,27 ,Ala26,28 ,Arg30] hu G-CSFの放出は水性媒体の
hplc分析により測定し、蛋白質の累積放出を算出した
（以下の表１参照）。
【０１４０】実施例13 PEG 5000-[ Met-1,Ser17,27,115,116 ,Glu111 ] hu G-C
SFを含有する連続放出型製薬組成物 Ａ．氷酢酸法 120.80mgのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／
50重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量10691,
多分散度1.75）を2.0 mlの無水酢酸無含有氷酢酸に溶解
させた。参考例16で調製したPEG 5000-[ Met-1,Ser
17,27,115,116 ,Glu111 ] hu G-CSF(12.0mg/ml）の水溶
液3.333 mlを凍結乾燥させ、次いで別量2.0 mlの氷酢酸
に溶解させた。これら２種の溶液を混合し、別量４×0.
5 ml分の氷酢酸を用いてガラス容器をゆすいだ。得られ
た溶液をジクロロメタン／ドリコールドの浴中で直ちに
冷凍させ、一夜凍結乾燥した。90℃に加熱した定盤を有
する油圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を完全に混合し、
次いで成形して厚さ１mmのスラブ板を得た。このスラブ
板を切断して約95mgの重量を有するデポとした。次いで
これらのデポを、オキソイド燐酸緩衝液に溶かした0.02
重量／容量％のナトリウムアジドの溶液2.0 mlを含有す
るプラスチック製の小ビンに装入し、37℃で貯蔵した。
一定の間隔で水性媒体を取出し、新たな緩衝液を補充し
た。PEG 5000-[ Met-1,Ser17,27,115,116 ,Glu111 ] hu
G-CSFの放出は水性媒体のhplc分析により測定し、蛋白
質の累積放出を算出した（以下の表１参照）。
【０１４１】Ｂ．水性法 5.0gのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／50重
量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量10691,多分
散度1.75）を20mlのジクロロメタンに溶解させ、高剪断
下に配置した（イストラル1500ホモジナイザー）。この
溶液に重炭酸ナトリウムの水溶液(20mg/ml）の5.0 mlを
滴加した。別量50mlの蒸留水を添加し、微細な白色分散
物が生成した。次いで回転蒸発器を用いてジクロロメタ
ンを除去した。得られる分散物をジクロロメタン／ドリ
コールドの浴中で直ちに冷凍させ、一夜凍結乾燥した。
この重合体のナトリウム塩を続いて使用前に室温で真空
下に貯蔵した。
【０１４２】119.83mgの該重合体のナトリウム塩を2.0
mlの蒸留水に分散させた。PEG 5000-[ Met-1,Ser
17,27,115,116 ,Glu111 ] hu G-CSF(12.0mg/ml）の水溶
液3.333 mlを凍結乾燥させ次いで別量2.0 mlの蒸留水に
溶解した。得られた溶液を前記懸濁物に添加し、混合し
た。別量４×0.5 ml分の蒸留水を用いてガラス容器をゆ
すいだ。得られた溶液をジクロロメタン／ドリコールド
の浴中で直ちに冷凍させ、一夜凍結乾燥した。95℃に加
熱した定盤を有する油圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を
完全に混合し、次いで成形して厚さ１mmのスラブ板を得
た。このスラブ板を切断して約95mgの重量を有するデポ
とした。次いでこれらのデポを、オキソイド燐酸緩衝液
に溶かした0.02重量／容量％のナトリウムアジドの溶液
2.0 mlを含有するプラスチック製の小ビンに装入し、37
℃で貯蔵した。一定の間隔で水性媒体を取出し、新たな
緩衝液を補充した。PEG 5000-[ Met-1,Ser
17,27,115,116 ,Glu111 ] hu G-CSFの放出は水性媒体の
hplcにより測定し、蛋白質の累積放出を算出した（以下
の表１参照）。
【０１４３】実施例14 PEG 5000-[ Met-1,Arg11,165,Ser17,27 ,Lys58] hu G-C
SFを含有する連続放出型製薬組成物 Ａ．氷酢酸法 119.28mgのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／
50重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量10691,
多分散度1.75）を2.0 mlの無水酢酸無含有氷酢酸に溶解
させた。PEG 5000-[ Met-1,Arg11,165,Ser17,27 ,Ly
s58] hu G-CSF(17.905mg/ml）の水溶液2.224 mlを凍結
乾燥させ、次いで別量2.0 mlの氷酢酸に溶解した。これ
ら２種の溶液を混合し、別量４×0.5 ml分の氷酢酸を用
いてガラス容器をゆすいだ。得られた溶液をジクロロメ
タン／ドリコールドの浴中で直ちに冷凍させ、一夜凍結
乾燥した。90℃に加熱した定盤を有する油圧プレスを用
いて凍結乾燥粉末を完全に混合し、次いで成形して厚さ
１mmのスラブ板を得た。このスラブ板を切断して約100
mgの重量を有するデポとした。次いでこれらのデポを、
オキソイド燐酸緩衝液に溶かした0.02重量／容量％のナ
トリウムアジドの溶液2.0 mlを含有するプラスチック製
の小ビンに装入し、37℃で貯蔵した。一定の間隔で水性
媒体を取出し、新たな緩衝液を補充した。PEG 5000-[ M
et-1,Arg11,165,Ser17,27 ,Lys58] hu G-CSFの放出は水
性媒体のhplc分析により測定し、蛋白質の累積放出を算
出した（以下の表１参照）。
【０１４４】Ｂ．水性法 5.0gのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／50重
量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量10691,多分
散度1.75）を20mlのジクロロメタンに溶解させ高剪断下
に配置した（イストラル1500ホモジナイザー）。この溶
液に重炭酸ナトリウムの水溶液(20mg/ml) の5.0 mlを滴
加した。別量50mlの蒸留水を添加し、微細な白色分散物
が生成した。次いで回転蒸発器を用いてジクロロメタン
を除去した。得られた分散物をジクロロメタン／ドリコ
ールドの浴中で直ちに冷凍させ、一夜凍結乾燥した。こ
の重合体のナトリウム塩を続いて使用前に室温で真空下
に貯蔵した。
【０１４５】119.82mgの該重合体のナトリウム塩を2.0
mlの蒸留水に分散させた。PEG 5000-[ Met-1,Ar
g11,165,Ser17,27 ,Lys58] hu G-CSF(17.985mg/ml) の
水溶液2.224mlを凍結乾燥させ、次いで別量2.0 mlの蒸
留水に溶解した。得られた溶液を前記懸濁物に添加し混
合した。別量４×0.5 ml分の蒸留水を用いてガラス容器
をゆすいだ。得られた溶液をジクロロメタン／ドリコー
ルドの浴中で直ちに冷凍させ、一夜凍結乾燥した。95℃
に加熱した定盤を有する油圧プレスを用いて凍結乾燥粉
末を完全に混合し、次いで成形して厚さ１mmのスラブ板
を得た。このスラブ板を切断して約90mgの重量を有する
デポとした。次いでこれらのデポを、オキソイド燐酸緩
衝液に溶かした0.02重量／容量％のナトリウムアジドの
溶液2.0 mlを含有するプラスチック製の小ビンに装入
し、37℃で貯蔵した。一定の間隔で水性媒体を取出し、
新たな緩衝液を補充した。PEG 5000-[ Met-1,Ar
g11,165,Ser17,27 ,Lys58] hu G-CSFの放出は水性媒体
のhplc分析により測定し、蛋白質の累積放出を算出した
（以下の表１参照）。
【０１４６】実施例15 PEG 5000-[ Met-1,Ser17,27 ,Lys49,58 ,Ala44,51,55]
hu G-CSFを含有する連続放出型製薬組成物 Ａ．氷酢酸法 119.83mgのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／
50重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量10691,
多分散度1.75）を2.0 mlの無水酢酸無含有氷酢酸に溶解
させた。参考例18で調製したPEG 5000-[ Met-1,Ser
17,27 ,Lys49,58 ,Ala44,51,55] hu G-CSF(17.262mg/m
l）の水溶液2.317 mlを凍結乾燥させ、次いで別量2.0 m
lの氷酢酸に溶解した。これら２種の溶液を混合し、別
量４×0.5 ml分の氷酢酸を用いてガラス容器をゆすい
だ。得られた溶液をジグロロメタン／ドリコールドの浴
中で直ちに冷凍させ、一夜凍結乾燥した。90℃に加熱し
た定盤を有する油圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を完全
に混合し、次いで成形して厚さ１mmのスラブ板を得た。
このスラブ板を切断して約100 mgの重量を有するデポと
した。次いでこれらのデボを、オキソイド燐酸緩衝液に
溶かした0.02重量／容量％のナトリウムアジドの溶液2.
0 mlを含有するプラスチック製の小ビンに装入し、37℃
で貯蔵した。一定の間隔で、水性媒体を取出し、新たな
緩衝液を補充した。PEG 5000-[ Met-1,Ser17,27 ,Lys
49,58 ,Ala44,51,55] hu G-CSFの放出は水性媒体のhplc
分析により測定し、蛋白質の累積放出を算出した（以下
の表１参照）。
【０１４７】Ｂ．水性法 5.0gのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／50重
量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量10691,多分
散度1.75）を20mlのジクロロメタンに溶解させ、高剪断
下に配置した（イストラル1500ホモジナイザー）。この
溶液に重炭酸ナトリウムの水溶液(20mg/ml）の5.0 mlを
滴加した。別量50mlの蒸留水を添加し、微細な白色分散
物が生成した。次いで回転蒸発器を用いてジクロロメタ
ンを除去した。得られる分散物をジクロロメタン／ドリ
コールドの浴中で直ちに冷凍させ、一夜凍結乾燥した。
この重合体のナトリウム塩を続いて使用前に室温で真空
下に貯蔵した。
【０１４８】120.82mgの該重合体のナトリウム塩を2.0
mlの蒸留水に分散させた。PEG 5000-[ Met-1,Se
r17,27 ,Lys49,58 ,Ala44,51,55] hu G-CSF(17.262mg/m
l）の水溶液2.317 mlを凍結乾燥させ次いで別量2.0 ml
の蒸留水に溶解した。得られた溶液を前記懸濁物に添加
し、混合した。別量４×0.5 ml分の蒸留水を用いてガラ
ス容器をゆすいだ。得られた溶液をジクロロメタン／ド
リコールドの浴中で直ちに冷凍させ、一夜凍結乾燥し
た。95℃に加熱した定盤を有する油圧プレスを用いて凍
結乾燥粉末を完全に混合し、次いで成形して厚さ１mmの
スラブ板を得た。このスラブ板を切断して約100 mgの重
量を有するデポとした。次いでこれらのデポを、オキソ
イド燐酸緩衝液に溶かした0.02重量／容量％のナトリウ
ムアジドの溶液2.0mlを含有するプラスチック製の小ビ
ンに装入し、37℃で貯蔵した。一定の間隔で水性媒体を
取出し、新たな緩衝液を補充した。PEG 5000-[ Met-1,S
er17,27 ,Lys49,58 ,Ala44,51,55] hu G-CSFの放出は水
性媒体のhplc分析により測定し、蛋白質の累積放出を算
出した（以下の表１参照）。
【０１４９】実施例16 PEG 750- [ Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSFを
含有する連続放出型製薬組成物 氷酢酸法 150.11mgのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／
50重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量10691,
多分散度1.75）を2.0 mlの無水酢酸無含有氷酢酸に溶解
させた。参考例24で調製したPEG 750-[Met-1,Arg11,Ser
17,27,60,65 ]hu G-CSF(8.55mg/ml）の水溶液4.678 ml
を凍結乾燥させ次いで別量2.0 mlの氷酢酸に溶解した。
これら２種の溶液を混合し別量４×0.5 ml分の氷酢酸を
用いてガラス容器をゆすいだ。得られた溶液をジクロロ
メタン／ドリコールドの浴中で直ちに冷凍させ、一夜凍
結乾燥した。90℃に加熱した定盤を有する油圧プレスを
用いて凍結乾燥粉末を完全に混合し次いで成形して厚さ
１mmのスラブ板を得た。このスラブ板を切断して約75mg
の重量を有するデポとした。次いでこれらのデポを、オ
キソイド燐酸緩衝液に溶かした0.02重量／容量％のナト
リウムアジドの溶液2.0 mlを含有するプラスチック製の
小ビンに装入し、37℃で貯蔵した。一定の間隔で水性媒
体を取出し、新たな緩衝液を補充した。PEG 750-[Me
t-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSFの放出は水性媒
体のhplc分析により測定し、蛋白質の累積放出を算出し
た（以下の表１参照）。
【０１５０】実施例17 PEG 2000-[ Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSFを
含有する連続放出型製薬組成物 Ａ．氷酢酸法 140.32mgのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／
50重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量10691,
多分散度1.75）を2.0 mlの無水酢酸無含有氷酢酸に溶解
させた。参考例23で調製したPEG 2000-[ Met-1,Arg11,S
er17,27,60,65 ] hu G-CSF(8.52mg/ml）の水溶液4.695
mlを凍結乾燥させ次いで別量2.0 mlの氷酢酸に溶解し
た。これら２種の溶液を混合し、別量４×0.5 ml分の氷
酢酸を用いてガラス容器をゆすいだ。得られた溶液をジ
グロロメタン／ドリコールドの浴中で直ちに冷凍させ、
一夜凍結乾燥した。90℃に加熱した定盤を有する油圧プ
レスを用いて凍結乾燥粉末を完全に混合し、次いで成形
して厚さ１mmのスラブ板を得た。このスラブ板を切断し
て約70mgの重量を有するデポとした。次いでこれらのデ
ポを、オキソイド燐酸緩衝液に溶かした0.02重量／容量
％のナトリウムアジドの溶液2.0 mlを含有するプラスチ
ック製の小ビンに装入し、37℃で貯蔵した。一定の間隔
で水性媒体を取出し、新たな緩衝液を補充した。PEG 20
00-[ Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSFの放出は
水性媒体のhplc分析により測定し、蛋白質の累積放出を
算出した（以下の表１参照）。
【０１５１】Ｂ．水性法 5.0gのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／50重
量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量10691,多分
散度1.75）を20mlのジクロロメタンに溶解させ、高剪断
下に配置した（イストラル1500ホモジナイザー）。この
溶液に重炭酸ナトリウムの水溶液（20mg/ml)の5.0 mlを
滴加した。別量50mlの蒸留水を添加し、微細な白色分散
物が生成した。次いで回転蒸発器を用いてジクロロメタ
ンを除去した。得られる分散物をジクロロメタン／ドリ
コールドの浴中で直ちに冷凍させ、一夜凍結乾燥した。
この重合体のナトリウム塩を続いて使用前に室温で真空
下に貯蔵した。
【０１５２】140.85mgの該重合体のナトリウム塩を2.0
mlの蒸留水に分散させた。PEG 2000-[ Met-1,Arg11,Ser
17,27,60,65 ] hu G-CSF(8.25mg/ml)の水溶液4.695 ml
を凍結乾燥させ次いで別量2.0 mlの蒸留水に溶解した。
得られた溶液を前記懸濁物に添加し、混合した。別量４
×0.5 ml分の蒸留水を用いてガラス容器をゆすいだ。得
られる溶液をジクロロメタン／ドリコールドの浴中で直
ちに冷凍させ、一夜凍結乾燥した。90℃に加熱した定盤
を有する油圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を完全に混合
し次いで成形して厚さ１mmのスラブ板を得た。このスラ
ブ板を切断して約70mgの重量を有するデポとした。次い
でこれらのデポを、オキソイド燐酸緩衝液に溶かした0.
02重量／容量％のナトリウムアジドの溶液2.0 mlを含有
するプラスチック製の小ビンに装入し、37℃で貯蔵し
た。一定の間隔で水性媒質を取出し、新たな緩衝液を補
充した。PEG 2000-[ Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ］hu
G-CSFの放出は水性媒体のhplc分析により測定し、蛋白
質の累積放出を算出した（以下の表１参照）。
【０１５３】 表 １ Ａ ラクチド−グリコリド：Ｇ １：１組成物からG-CSF 同族体の放出 実施例 方 法 蛋白質の装填率 重合体装填率 重合体 プレス温度 No （重量％） （重量％） No. （℃） ------------------------------------------------------------------ 5A GAA 16.26 48.81 310 65 5B Aq 16.16 48.83 310 65 6A GAA 16.89 50.56 310 65 6B Aq 16.84 50.87 310 65 7A GAA 17.49 52.79 310 65 7B Aq 17.65 52.82 310 65 8A GAA 16.94 50.88 310 65 8B Aq 16.88 50.95 310 65 9A GAA 16.54 49.87 312 90 9B Aq 16.60 49.87 312 90 10A GAA 16.49 49.77 312 95 10B Aq 15.73 47.27 312 95 11A GAA 15.23 45.60 312 95 11B Aq 14.87 44.48 312 95 12A GAA 16.08 48.35 312 90 12B Aq 16.12 48.52 312 95 13A GAA 16.51 49.85 312 90 13B Aq 16.38 49.06 312 95 14A GAA 16.19 48.27 312 90 14B Aq 15.92 47.68 312 95 15A GAA 15.63 46.81 312 90 15B Aq 15.06 45.48 312 95 16 GAA 19.17 71.95 312 90 17A GAA 17.30 60.93 312 90 17B Aq 17.56 62.82 312 90 前記の用語“GAA ”及び“Aq”はそれぞれ処方する際の
氷酢酸法及び水性法を記載する
【０１５４】 表 １ Ｂ 前記組成物からの蛋白質の放出率 実施例 以下の日数での蛋白質放出率（％） No 1 4 6 11 16 18 ------------------------------------------------------------------ 5A 27.1 36.5 37.1 37.5 37.5 37.5 5B 33.3 37.5 38.6 39.1 40.1 40.1 6A 77.0 96.4 102.7 106.7 111.3 112.9 6B 56.8 86.6 98.3 103.9 109.4 7A 42.5 55.9 60.4 64.5 67.9 70.8 7B 46.5 59.5 65.3 74.5 80.7 81.5 8A 50.3 66.4 72.4 78.2 85.2 86.6 8B 55.5 78.4 84.8 87.8 89.5 90.1
【０１５５】 以下の日数での蛋白質放出率（％） 1 4 8 11 15 18 ------------------------------------------------------------------ 9A 16.2 21.8 24.6 40.1 43.9 9B 27.2 37.3 41.6 45.0 54.1 10A 29.6 41.3 46.2 10B 33.8 51.1 59.9 64.6 69.3 11A 45.9 60.1 65.7 11B 42.0 66.0 72.9 74.6
【０１５６】 以下の日数での蛋白質放出率 1 3 8 11 15 18 ------------------------------------------------------------------ 12A* 56.3 84.4 99.4 99.4 12B* 51.7 74.9 89.3 93.8 99.2 13A* 37.3 67.7 85.8 108.6 13B* 36.2 75.7 95.2 104.0 105.2 14A* 28.6 47.2 55.6 74.3 14B* 24.2 48.3 61.0 77.8 81.6 15A* 58.1 84.4 96.0 96.2 15B* 50.3 111.3 127.2 129.7 131.9 132.3
【０１５７】 以下の日数での蛋白質放出率 1 4 8 11 15 18 ------------------------------------------------------------------ 16 6.2 6.7 6.8 6.9 6.9 6.9 17A 22.6 32.7 41.0 43.1 45.6 46.5 17B 26.2 36.3 42.8 44.8 48.2 49.3 ＊放出値はアミノ酸分析でなく重量で計算した組成物の
蛋白質含量を用いて算出した。
【０１５８】実施例18 PEG 5000-[ Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSF
（ラクチド：グリコリド80：20）を含有する連続放出型
製薬組成物 Ａ．氷酢酸法（5.52％の蛋白質装填率） 158.91mgのポリラクチド（80重量％のd, l−ラクチド／
20重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量7952，
多分散度2.01）を2.0ml の無水酢酸無含有氷酢酸に溶解
させた。41.90 mgのPEG 5000-[ Met-1,Arg11,Ser
17,27,60,65 ] hu G-CSFの凍結乾燥製剤を別量2.0 mlの
氷酢酸に溶解させた。これら２種の溶液を混合し、別量
４×0.5 ml分の氷酢酸を用いてガラス容器をゆすいだ。
得られる溶液を液体窒素中に落下させることにより直ち
に凍結させ、一夜凍結乾燥した。75℃に加熱した定盤を
有する油圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を完全に混合
し、成形して約80mgの重量を有するデポとした。次いで
これらのデポを、オキソイド燐酸緩衝液に溶かした0.02
重量／容量％のナトリウムアジドの溶液2.0ml を含有す
るプラスチック製の小ビンに装入し、37℃で貯蔵した。
一定の間隔で水性媒体を取出し、新たな緩衝液を補充し
た。PEG 5000-[ Met-1,Arg11,ser17,27,60,65 ] hu G-C
SFの放出は水性媒体のhplc分析により測定し、蛋白質の
累積放出を算出した。
【０１５９】実施例19 PEG 5000-[ Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSF
［80％（ラクチド：グリコリド50：50）／20％メチルポ
リエチレングリコール2000］を含有する連続放出型製薬
組成物 Ａ．氷酢酸法（5.23％の蛋白質装填率） 159.87mgのハイドロゲル（80.7重量％のd, l−ラクチド
／グリコリド共重合体、19.3重量％の2000MePEG)を2.0
mlの無水酢酸無含有氷酢酸に溶解させた。40.26mg のPE
G 5000-[ Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSFの凍
結乾燥製剤(26.46重量％の蛋白質）を別量2.0 mlの氷酢
酸に溶解させた。これら２種の溶液を混合し、別量４×
0.5ml 分の氷酢酸を用いてガラス容器をゆすいだ。得ら
れる溶液を液体窒素に落として直ちに凍結させ、一夜凍
結乾燥した。60℃に加熱した定盤を有する油圧プレスを
用いて凍結乾燥粉末を完全に混合し、次いで成形して約
80mgの重量を有するデポとした。次いでこれらのデポ
を、オキソイド燐酸緩衝液に溶かした0.02重量／容量％
のナトリウムアジドの溶液2.0ml を含有するプラスチッ
ク製の小ビンに装入し、37℃で貯蔵した。一定の間隔で
水性媒体を取出し、新たな緩衝液を補充した。PEG 5000
-[ Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSFの放出は水
性媒体のhplc分析により測定し、蛋白質の累積放出を算
出した。
【０１６０】実施例20 PEG 5000-[ Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSF
［80％（ラクチド／グリコリド 100：0)／20％メチルポ
リエチレングリコール2000］を含有する連続放出型製薬
組成物 Ａ． 氷酢酸法（5.23％の蛋白質装填率） 159.70ｇのハイドロゲル（82.5重量％のポリd, l−ラク
チド、17.5重量％の2000MePEG)を2.0ml の無水酢酸無含
有氷酢酸に溶解させた。39.50 mgのPEG 5000-[Met-1,Ar
g11,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSFの凍結乾燥製剤(26.46
重量％の蛋白質）を別量2.0 mlの氷酢酸に溶解させた。
これら２種の溶液を混合し、別量４×0.5 ml分の氷酢酸
を用いてガラス容器をゆすいだ。得られた溶液を液体窒
素に落として直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。60℃
に加熱した定盤を有する油圧プレスを用いて凍結乾燥粉
末を完全に混合し、次いで成形して約70mgの重量を有す
るデポとした。次いでこれらのデポを、オキソイド燐酸
緩衝液に溶かした0.02重量／容量％のナトリウムアジド
の溶液2.0 mlを含有するプラスチック製の小ビンに装入
し、37℃で貯蔵した。一定の間隔で水性媒体を取出し、
新たな緩衝液を補充した。PEG 5000-[ Met-1,Arg11,Ser
17,27,60,65 ] hu G-CSFの放出は水性媒体のhplc分析に
より測定し、蛋白質の累積放出を算出した。
【０１６１】実施例21 PEG 5000-[ Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSF
（ラクチド：グリコリド50：50）を含有する連続放出型
製薬組成物 Ａ． 氷酢酸法（4.14％の蛋白質装填率） 160.34mgのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／
50重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量9827，
多分散度2.18）を2.0ml の無水酢酸無含有氷酢酸に溶解
させた。40.73 mgのPEG 5000-[ Met-1,Arg11,Ser
17,27,60,65 ] hu G-CSFの凍結乾燥製剤を別量2.0 mlの
氷酢酸に溶解させた。これら２種の溶液を混合し、別量
４×0.5 ml分の氷酢酸を用いてガラス容器をゆすいだ。
得られた溶液を液体窒素に落として直ちに凍結させ、一
夜凍結乾燥した。60℃に加熱した定盤を有する油圧プレ
スを用いて凍結乾燥粉末を完全に混合し、成形して約60
mgの重量を有するデポとした。次いでこれらのデポを、
オキソイド燐酸緩衝液に溶かした0.02重量／容量％のナ
トリウムアジドの溶液2.0ml を含有するプラスチック製
の小ビンに装入し、37℃で貯蔵した。一定の間隔で水性
媒体を取出し、新たな緩衝液を補充した。PEG 5000-[ M
et-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSFの放出は水性媒
体のhplc分析により測定し、蛋白質の累積放出を算出し
た。
【０１６２】実施例22 PEG 5000-[ Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSF
（ラクチド：グリコリド75 : 25)を含有する連続放出型
製薬組成物 氷酢酸法 161.46mgのポリラクチド（75重量％のd, l−ラクチド／
25重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量12938,
多分散度1.81）を2.0 mlの無水酢酸無含有氷酢酸に溶解
させた。39.03 mgのPEG TG50の凍結乾燥製剤を別量2.0m
lの氷酢酸に溶解させた。これら２種の溶液を混合し、
別量４×0.5 ml分の氷酢酸を用いてガラス容器をゆすい
だ。得られた溶液を液体窒素に落として直ちに凍結さ
せ、一夜凍結乾燥した。75℃に加熱した定盤を有する油
圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を完全に混合し、成形し
て約80mgの重量を有するデポとした。次いでこれらのデ
ポを、オキソイド燐酸緩衝液に溶かした0.02重量／容量
％のナトリウムアジドの溶液2.0 mlを含有するプラスチ
ック製の小ビンに装入し、37℃で貯蔵した。一定の間隔
で水性媒体を取出し、新たな緩衝液を補充した。PEG 50
00-[ Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSFの放出を
水性媒体のhplc分析により測定し、蛋白質の累積放出を
算出した。
【０１６３】実施例23 PEG 5000-[ Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSF
（ラクチド：グリコリド100 : 0)を含有する連続放出型
製薬組成物 氷酢酸法（5.37％の蛋白質装填率) 158.67mgのポリラクチド(100重量％のd, l−ラクチド／
０重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量9042,
多分散度1.96) を2.0 mlの無水酢酸無含有氷酢酸に溶解
させた。40.42 mgのPEG 5000-[ Met-1,Arg11,Ser
17,27,60,65 ] hu G-CSFの凍結乾燥製剤を別量2.0 mlの
氷酢酸に溶解させた。これら２種の溶液を混合し、別量
４×0.5 ml分の氷酢酸を用いてガラス容器をゆすいだ。
得られる溶液を液体窒素に落として直ちに凍結させ、一
夜凍結乾燥した。75℃に加熱した定盤を有する油圧プレ
スを用いて凍結乾燥粉末を完全に混合し、成形して約70
mgの重量を有するデポとした。次いでこれらのデポを、
オキソイド燐酸緩衝液に溶かした0.02重量／容量％のナ
トリウムアジドの溶液2.0 mlを含有するプラスチック製
の小ビンに装入し、37℃で貯蔵した。一定の間隔で水性
媒体を取出し、新たな緩衝液を補充した。PEG 5000-[ M
et-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSFの放出は水性媒
体のhplc分析により測定し、蛋白質の累積放出を算出し
た。
【０１６４】実施例24 PEG 5000-[ Met-1,Ser17,27 ] hu G-CSFを含有する連続
放出型製薬組成物−水性法 ｉ）組成物Ｇ（20％の蛋白質装填率) 4.0gのポリラクチド（50重量％のd, l- ラクチド／50重
量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量7673、多分
散度2.59) を12mlのジクロロメタンに溶解させ、高剪断
下に配置した（イストラル1500ホモジナイザー）。この
溶液に重炭酸ナトリウムの水溶液（20mg/ml)の４mlを滴
加した。別量60mlの蒸留水を添加し、微細な白色分散物
が生成した。回転蒸発器を用いてジクロロメタンを除去
した。得られる溶液をジクロロメタン／ドリコールドの
浴中で直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。この重合体
のナトリウム塩を続いて室温で真空下に貯蔵した。
【０１６５】160.31mgの該重合体のナトリウム塩を２ml
の蒸留水に分散させた。4.396 mlのPEG 5000-[ Met-1,S
er17,27 ] hu G-CSF(9.1mg/ml)の水溶液を蒸留水で５mg
／mlにまで希釈し、重合体の塩懸濁物に添加した。別量
４×0.5 ml分の蒸留水を用いてガラス容器をゆすいだ。
得られる溶液をジクロロメタン／ドリコールドの浴中で
直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。90℃に加熱した定
盤を有する油圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を完全に混
合させ、次いでこの温度で成形して厚さ１mmのスラブ板
を得た。このスラブ板を切断して約105 mgの重量を有す
るデポとした。次いでこれらのデポを、0.02％のナトリ
ウムアジド含有のオキソイド燐酸緩衝液２mlを含有する
プラスチック製の小ビンに装入し、37℃で貯蔵した。一
定の間隔で水性媒体を取出し、新たな緩衝液を補充し
た。PEG 5000-[ Met-1,Ser17,27 ]hu G-CSFの放出は水
性媒体のhplc分析により測定し、蛋白質の累積放出を算
出した。
【０１６６】ii）組成物Ｈ（20％の蛋白質装填率） 4.0gのポリラクチド（50重量％のd,l-ラクチド／50重量
％のグリコリド共重合体、重量平均分子量7791.2，多分
散度2.65) を16mlのジクロロメタンに溶解させ、高剪断
下に配置した（イストラル1500ホモジナイザー）。この
溶液に重炭酸ナトリウムの水溶液（20mg/ml)の４mlを滴
加した。別量40mlの蒸留水を添加し、微細な白色分散物
が生成した。回転蒸発器を用いてジクロロメタンを除去
した。得られる溶液をジクロロメタン／ドリコールドの
浴中で直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。この重合体
のナトリウム塩を続いて室温で真空下に貯蔵した。
【０１６７】89.84 mgの該重合体のナトリウム塩を２ml
の蒸留水に分散させた。3.33mlのPEG 5000-[ Met-1,Ser
17,27 ] hu G-CSF(9mg/ml)の水溶液を重合体の塩懸濁物
に添加した。別量４×0.5 ml分の蒸留水を用いてガラス
容器をゆすいだ。得られる溶液をジクロロメタン／ドリ
コールドの浴中で直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。
95℃に加熱した定盤を有する油圧プレスを用いて凍結乾
燥粉末を完全に混合し、次いでこの温度で成形して厚さ
１mmのスラブ板を得た。このスラブ板を切断して約63mg
の重量を有するデポとした。次いでこれらのデポを、0.
02％のナトリウムアジド含有オキソイド燐酸緩衝液２ml
を含有するプラスチック製の小ビンに装入し、37℃で貯
蔵した。一定の間隔で水性媒体を取出し、新たな緩衝液
を補充した。PEG 5000-[ Met-1,Ser17,27 ] hu G-CSFの
放出は水性媒体のhplc分析により測定し、蛋白質の累積
放出を算出した。組成物Ｇ及びＨについて累積放出の比
較を図17に示す。
【０１６８】比較例３ [Met-1,Ser17,27 ] hu G-CSFを単独で含有する連続放出
型製薬組成物−水性法 組成物Ｉ（20％の蛋白質装填率） 4.0gのポリラクチド（50重量％のd,l-ラクチド／50重量
％のグリコリド共重合体、重量平均分子量7791.2，多分
散度2.65) を16mlのジクロロメタンに溶解させ、高剪断
下に配置した（イストラル1500ホモジナイザー）。この
溶液に重炭酸ナトリウムの水溶液（20mg/ml)の４mlを滴
加した。別量40mlの蒸留水を添加し、微細な白色分散物
が生成した。回転蒸発器を用いてジクロロメタンを除去
した。得られる溶液をジクロロメタン／ドリコールドの
浴中で直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。この重合体
のナトリウム塩を続いて室温で真空下に貯蔵した。
【０１６９】160.20mgの該重合体のナトリウム塩を２ml
の蒸留水に分散させた。4,000 mlの[Met-1,Ser17,27 ］
hu G-CSF(10.0mg/ml) の水溶液を蒸留水で５mg/ml まで
希釈し、重合体の塩懸濁物に添加した。別量４×0.5 ml
分の蒸留水を用いてガラス容器をゆすいだ。得られる溶
液をジクロロメタン／ドリコールドの浴中で直ちに凍結
させ、一夜凍結乾燥した。95℃に加熱した定盤を有する
油圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を完全に混合させ、次
いでこの温度で成形して厚さ１mmのスラブ板を得た。こ
のスラブ板を切断して約81mgの重量を有するデポとし
た。次いでこれらのデポを、0.02％のナトリウムアジド
含有オキソイド燐酸緩衝液の２mlを含有するプラスチッ
ク製の小ビンに装入し、37℃で貯蔵した。一定の間隔で
水性媒体を取出し、新たな緩衝液を補充した。[Met-1,S
er17,27 ］hu G-CSFの放出は水性媒体のhplc分析により
測定し、蛋白質の累積放出を算出した。組成物Ｉについ
ての蛋白質の累積放出を図18に示す。
【０１７０】比較例４ ［ Met-1,Ser17,27 ］hu G-CSFとメチルPEG 5000とを含
有する連続放出型製薬組成物−水性法 組成物Ｊ（20％の蛋白質装填率） 4.0gのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／50重
量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量7791.2，多
分散度2.65) を16mlのジクロロメタンに溶解させ、高剪
断下に配置した（イストラル1500ホモジナイザー）。こ
の溶液に重炭酸ナトリウムの水溶液（20mg/ml)の４mlを
滴加した。別量40mlの蒸留水を添加し、微細な白色分散
物が生成した。回転蒸発器を用いてジクロロメタンを除
去した。得られる溶液をジクロロメタン／ドリコールド
の浴中で直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。この重合
体のナトリウム塩を続いて室温で真空下に貯蔵した。
【０１７１】119.77mgの該重合体のナトリウム塩を２ml
の蒸留水に分散させた。4,000 mlの[Met-1,Ser17,27 ］
hu G-CSF(10.0mg/ml) の水溶液を、40.43 mgのメチルPE
G 5000含有水溶液で５mg/ml にまで希釈し、重合体の塩
懸濁物に添加した。別量４×0.5 ml分の蒸留水を用いて
ガラス容器をゆすいだ。得られる溶液をジクロロメタン
／ドリコールドの浴中で直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥
した。95℃に加熱した定盤を有する油圧プレスを用いて
凍結乾燥粉末を完全に混合し次いでこの温度で成形して
厚さ１mmのスラブ板を得た。このスラブ板を切断して約
83mgの重量を有するデポとした。次いでこれらのデポ
を、0.02％のナトリウムアジド含有オキソイド燐酸緩衝
液２mlを含有するプラスチック製の小ビンに装入し、37
℃で貯蔵した。一定の間隔で水性媒体を取出し、新たな
緩衝液を補充した。[Met-1,Ser17,27 ] hu G-CSFの放出
は水性媒体のhplc分析により測定し、蛋白質の累積放出
を算出した。組成物Ｊについての蛋白質累積放出を図18
に示す。
【０１７２】実施例25 PEG 5000-[ Met-1,Glu15,Ser17,27 ,Ala26,28 ,Lys30]
hu G-CSFを含有する連続放出型製薬組成物−水性法 組成物Ｋ（20％の蛋白質装填率） 4.0gのポリラクチド（50重量％のd, l- ラクチド／50重
量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量7791.2, 多
分散度2.65）を16mlのジクロロメタンに溶解させ、高剪
断下に配置した（イストラル1500ホモジナイザー）。こ
の溶液に重炭酸ナトリウムの水溶液（20mg/ml)の４mlを
滴加した。別量40mlの蒸留水を添加し、微細な白色分散
物が生成した。回転蒸発器を用いてジクロロメタンを除
去した。得られる溶液をジクロロメタン／ドリコールド
の浴中で直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。この重合
体のナトリウム塩を続いて室温で真空下に貯蔵した。
【０１７３】120.8 mgの該重合体のナトリウム塩を２ml
の蒸留水に分散させた。3.738 mlのPEG 5000-[ Met-1,G
lu15,Ser17,27 ,Ala26,28 ,Lys30] hu G-CSF(10.7mg/m
l) の水溶液を重合体の塩懸濁物に添加した。別量４×
0.5 ml分の蒸留水を用いてガラス容器をゆすいだ。得ら
れる溶液をジクロロメタン／ドリコールドの浴中で直ち
に凍結させ、一夜凍結乾燥した。80℃に加熱した定盤を
有する油圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を完全に混合
し、次いでこの温度で成形して厚さ１mmのスラブ板を得
た。このスラブ板を切断して約95mgの重量を有するデポ
とした。次いでこれらのデポを、0.02％のナトリウムア
ジド含有オキソイド燐酸緩衝液２mlを含有するプラスチ
ック製の小ビンに装入し、37℃で貯蔵した。一定の間隔
で水性媒体を取出し、新たな緩衝液を補充した。PEG 50
00-[ Met-1,Glu15,Ser17,27 ,Ala26,28 ,Lys30] hu G-C
SFの放出は水性媒体のhplc分析により測定し、蛋白質の
累積放出を算出した。組成物Ｋについての蛋白質累積放
出を図19に示す。
【０１７４】実施例26 PEG 5000-[ Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ] hu G-CSFを
含有する連続放出型製薬組成物−水性法 Ａ．水性法 ｉ）組成物Ｌ（20％の蛋白質装填率） 4.0gのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／50重
量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量7791.2, 多
分散度2.65）を16mlのジクロロメタンに溶解させ、高剪
断下に配置した（イストラル1500ホモジナイザー）。こ
の溶液に重炭酸ナトリウムの水溶液（20mg/ml)の４mlを
滴加した。別量40mlの蒸留水を添加して、微細な白色分
散物が生成した。回転蒸発器を用いてジクロロメタンを
除去した。得られる溶液をジクロロメタン／ドリコール
ドの浴中で直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。この重
合体のナトリウム塩を続いて室温で真空下に貯蔵した。
120.5 mgの該重合体のナトリウム塩を２mlの蒸留水に分
散した。3.478 mlのPEG 5000-[ Met-1,Arg11,Ser
17,27,60,65 ] hu G-CSF(11.5mg/ml) の水溶液を重合体
の塩懸濁物に添加した。別量４×0.5 ml分の蒸留水を用
いてガラス容器をゆすいだ。得られる溶液をジクロロメ
タン／ドリコールドの浴中で直ちに凍結させ、一夜凍結
乾燥した。90℃に加熱した定盤を有する油圧プレスを用
いて凍結乾燥粉末を完全に混合し、次いでこの温度で成
形して厚さ１mmのスラブ板を得た。このスラブ板を切断
して約84mgの重量を有するデポとした。次いでこれらの
デポを、0.02％のナトリウムアジド含有オキソイド燐酸
緩衝液２mlを含有するプラスチック製の小ビンに装入
し、37℃で貯蔵した。一定の間隔で水性媒体を取出し、
新たな緩衝液を補充した。PEG 5000-[ Met-1,Arg11,Ser
17,27,60,65 ] hu G-CSFの放出は水性媒体のhplc分析に
より測定し、蛋白質の累積放出を算出した。組成物Ｌに
ついて蛋白質累積放出を図20に示す。
【０１７５】比較例５ [Met-1,Glu15,Ser17,27 ,Ala26,28 ,Lys30］hu G-CSFを
単独で含有する連続放出型製薬組成物−水性法 組成物Ｍ（20％の蛋白質装填率） 4.0gのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／50重
量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量7673，多分
散度2.59）を12mlのジクロロメタンに溶解させ、高剪断
下に配置した（イストラル1500ホモジナイザー）。この
溶液に重炭酸ナトリウムの水溶液（20mg/ml)の４mlを滴
加した。別量60mlの蒸留水を添加し、微細な白色分散物
が生成した。回転蒸発器を用いてジクロロメタンを除去
した。得られる溶液をジクロロメタン／ドリコールドの
浴中で直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。この重合体
のナトリウム塩を続いて室温で真空下に貯蔵した。
【０１７６】160.98mgの該重合体のナトリウム塩を２ml
の蒸留水に分散させた。4.124 mlの[Met-1,Glu15,Ser
17,27 ,Ala26,28 ,Lys30］hu G-CSF(9.7mg/ml)の水溶液
を蒸留水で5.0mg/mlにまで希釈し、重合体の塩懸濁物に
添加した。別量４×0.5ml分の蒸留水を用いてガラス容
器をゆすいだ。得られる溶液をジクロロメタン／ドリコ
ールドの浴中で直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。75
℃に加熱した定盤を有する油圧プレスを用いて凍結乾燥
粉末を完全に混合し、次いでこの温度で成形して厚さ１
mmのスラブ板を得た。このスラブ板を切断して約81mgの
重量を有するデポとした。次いでこれらのデポを、0.02
％のナトリウムアジド含有オキソイド燐酸緩衝液の２ml
を含有するプラスチック製の小ビンに装入し、37℃で貯
蔵した。一定の間隔で水性媒体を取出し、新たな緩衝液
を補充した。[Met-1,Glu15,Ser17,27 ,Ala26,28 ,Ly
s30］hu G-CSFの放出は水性媒体のhplc分析により測定
し、蛋白質の累積放出を算出した。組成物Ｍについての
蛋白質累積放出を図19に示す。
【０１７７】比較例６ [Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65］hu G-CSFを含有する連
続放出型製薬組成物 組成物Ｎ（20％の蛋白質装填率） 2.0gのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／50重
量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量7673，多分
散度2.59）を８mlのジクロロメタンに溶解させ高剪断下
に配置した（イストラル1500ホモジナイザー）。この溶
液に重炭酸ナトリウムの水溶液（20mg/ml)の２mlを滴加
した。別量30mlの蒸留水を添加し、微細な白色分散物が
生成した。回転蒸発器を用いてジクロロメタンを除去し
た。得られる溶液をジクロロメタン／ドリコールドの浴
中で直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。この重合体の
ナトリウム塩を続いて室温で真空下に貯蔵した。
【０１７８】159.99mgの該重合体のナトリウム塩を２ml
の蒸留水に分散させた。3.988 mlの[Met-1,Arg11,Ser
17,27,60,65 ］hu G-CSF(10.03mg/ml)の水溶液を蒸留水
で 5.0mg/ml にまで希釈し、重合体の塩懸濁物に添加し
た。別量４×0.5 ml分の蒸留水を用いてガラス容器をゆ
すいだ。得られる溶液をジクロロメタン／ドリコールド
の浴中で直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。95℃に加
熱した定盤を有する油圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を
完全に混合し、次いでこの温度で成形して厚さ１mmのス
ラブ板を得た。このスラブ板を切断して約81mgの重量を
有するデポとした。次いでこれらのデポを、0.02％ナト
リウムアジド含有オキソイド燐酸緩衝液２mlを含有する
プラスチック製の小ビンに装入し、37℃で貯蔵した。一
定の間隔で水性媒体を取出し、新たな緩衝液を補充し
た。[Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ]hu G-CSFの放出は
水性媒体のhplc分析により測定し、蛋白質の累積放出を
算出した。組成物Ｊについての蛋白質累積放出を図20に
示す。
【０１７９】実施例27 PEG 5000 ヒト カルチトニンを含有する連続放出型製
薬組成物 Ａ．氷酢酸法(5.0重量／重量％の蛋白質装填率） 396.23mgのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／
50重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量10691,
多分散度1.75）を4.0 mlの無水酢酸無含有氷酢酸に溶解
させた。2.955 mlのPEG 5000 ヒト カルチトニン（8.
46mg/ml)の水溶液を凍結乾燥させ次いで別量2.0 mlの氷
酢酸に溶解した。これら２種の溶液を混合し、別量４×
1.0 ml分の氷酢酸を用いてガラス容器をゆすいだ。得ら
れる溶液を液体窒素に落として直ちに凍結させ、一夜凍
結乾燥した。75℃に加熱した定盤を有する油圧プレスを
用いて凍結乾燥粉末を完全に混合し、次いで16ゲージの
出口を介して押出した。押出物を切断して約10mgの重量
を有するデポとした。次いでこれらのデポを、オキソイ
ド燐酸緩衝液中の0.02重量／容量％のナトリウムアジド
溶液2.0 mlを含有するプラスチック製の小ビンに装入
し、37℃で貯蔵した。一定の間隔で水性媒体を取出し、
新たな緩衝液を補充した。PEG 5000 ヒト カルチトニ
ンの放出は水性媒体のhplc分析により測定し、蛋白質の
累積放出を算出した（以下の表２参照）。
【０１８０】Ｂ．水性法 5.0gのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／50重
量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量10691,多分
散度1.75）を20.0mlのジクロロメタンに溶解させ、高剪
断下に配置した（イストラル1500ホモジナイザー）。こ
の溶液に重炭酸ナトリウムの水溶液（20mg/ml)の5.00ml
を滴加した。別量50mlの蒸留水を添加し微細な白色分散
物が生成した。次いで回転蒸発器を用いてジクロロメタ
ンを除去した。得られる分散物をジクロロメタン／ドリ
コールドの浴中で直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。
この重合体のナトリウム塩を続いて使用前に室温で真空
下に貯蔵した。
【０１８１】392.62mgの該重合体のナトリウム塩を4.0
mlの蒸留水に分散させた。2.955 mlのPEG 5000 ヒトカ
ルチトニン（8.46mg/ml)の水溶液を凍結乾燥させ次いで
別量2.0 mlの蒸留水に溶解した。別量４×1.0 ml分の蒸
留水を用いてガラス容器をゆすいだ。得られる溶液を液
体窒素に落として直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。
60℃に加熱した定盤を有する油圧プレスを用いて凍結乾
燥粉末を完全に混合し次いでゲージ16の開口を介して押
出した。押出物を切断して約10mgの重量を有するデポと
した。次いでこれらのデポを、オキソイド燐酸緩衝液に
溶かした0.02重量／容量％のナトリウムアジドの溶液2.
0ml を含有するプラスチック製の小ビンに装入し、37℃
で貯蔵した。一定の間隔で水性媒体を取出し、新たな緩
衝液を補充した。PEG 5000 ヒト カルチトニンの放出
は水性媒体のhplc分析により測定し、蛋白質の累積放出
を算出した（以下の表２参照）。
【０１８２】 表 ２ ペプチドの試験管内放出率(GAA法） 日 数 デポＡ デポＢ 累積放出率（％） 累積放出率（％） 1 15.4 10.9 2 15.4 10.9 7 15.4 10.9 8 56.5 41.3 16 66.5 57.2
【０１８３】 日 数 デポＣ デポＤ 累積放出率 累積放出率 1 6.9 7.9 2 6.9 7.9 7 6.9 7.9 9 27.9 27.9 16 45.4 31.6
【０１８４】 ペプチドの試験管内放出率（水性法） 日 数 デポＡ デポＢ 累積放出率（％） 累積放出率（％） 1 20.9 24.7 2 30.5 35.6 7 41.5 57.1 8 51.3 72.3 16 65.0 88.3
【０１８５】 デポＣ デポＤ 累積放出率（％） 累積放出率（％） 1 26.3 20.5 2 32.0 25.2 7 46.6 36.4 8 53.9 42.2 16 60.6 49.9
【０１８６】実施例28 非ペギル化のヒト カルチトニンを含有する連続放出型
製薬組成物 Ａ．氷酢酸法（５重量／重量％の蛋白質装填率） 473.50mgのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／
50重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量10691,
多分散度1.75）を4.0 mlの無水酢酸無含有氷酢酸に溶解
させた。25.56 mgのヒト カルチトニンの凍結乾燥製剤
もまた別量2.0mlの氷酢酸に溶解させた。これら２種の
溶液を混合し、別量４×2.0 ml分の氷酢酸を用いてガラ
ス容器をゆすいだ。得られる溶液を液体窒素に落とすこ
とにより直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。75℃に加
熱した定盤を有する油圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を
完全に混合し、次いで16ゲージの開口を通して押出成形
した。押出物を切断して約10mgの重量を有するデポとし
た。次いでこれらのデポを、オキソイド燐酸緩衝液に溶
かした0.02重量／容量％のナトリウムアジドの溶液２ml
を含有するプラスチック製の小ビンに装入し、37℃で貯
蔵した。一定の間隔で水性媒体を取出し、新たな緩衝液
を補充した。ヒトカルチトニンの放出は水性媒体のhplc
分析により測定し、蛋白質の累積放出を算出した。分析
は１日、２日、７日、８日及び16日目に行ったがこの期
間に亘って有意な程の放出の徴候は検出されなかった。
【０１８７】Ｂ．水性法（5.0 重量／重量％の蛋白質装
填率） 5.0gのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／50重
量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量10691,多分
散度1.75）を20.0mlのジクロロメタンに溶解させ、高剪
断下に配置した（イストラル1500ホモジナイザー）。こ
の溶液に重炭酸ナトリウムの水溶液(20mg/ml) の5.00ml
を滴加した。別量50mlの蒸留水を添加し、微細な白色分
散物が生成した。次いで回転蒸発器を用いてジクロロメ
タンを除去した。得られる分散物をジクロロメタン／ド
リコールドの浴中で直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥し
た。この重合体のナトリウム塩を続いて使用前に室温で
真空下に貯蔵した。
【０１８８】474.84mgの該重合体のナトリウム塩を4.0
mlの蒸留水に分散させた。25.65 mgのヒトカルチトニン
の凍結乾燥製剤も2.0 mlの蒸留水に溶解させた。得られ
る溶液を前記懸濁物に添加し、混合した。別量４×1.0
ml分の蒸留水を用いてガラス容器をゆすいだ。得られる
溶液を液体窒素中に落下させて直ちに凍結させ、一夜凍
結乾燥した。55℃に加熱した定盤を有する油圧プレスを
用いて凍結乾燥粉末を完全に混合し、次いでゲージ16の
開口を介して押出成形した。抽出物を切断して約10mgの
重量を有するデポとした。次いでこれらのデポを、オキ
ソイド燐酸緩衝液に入れた0.02重量／容量％のナトリウ
ムアジドの溶液2.0 mlを含有するプラスチック製の小ビ
ンに装入し、37℃で貯蔵した。一定の間隔で水性媒体を
取出し、新たな緩衝液を補充した。ヒトカルチトニンの
放出は水性媒体のhplc分析により測定し、蛋白質の累積
放出を算出した。分析は１日、２日、７日、８日及び16
日目に行ったが、この期間に亘って有意な程の放出の徴
候は検出されなかった。
【０１８９】実施例29 PEG 5000インターロイキン-2（PEG 5000 IL-2)を含有す
る連続放出型製薬組成物 氷酢酸法（20重量／重量％の蛋白質装填率） 113.42mgのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／
50重量％グリコリド共重合体、重量平均分子量10691,多
分散度1.75）を2.0 mlの無水酢酸無含有氷酢酸に溶解さ
せた。4.88mlのPEG 5000 IL-2 (7.35mg/ml) の水溶液を
凍結乾燥させ次いで別量1.0 mlの氷酢酸に溶解した。こ
れら２種の溶液を混合し、別量４×0.5ml分の氷酢酸を
用いてガラス容器をゆすいだ。得られる溶液を液体窒素
中に落下させて直ちに凍結させ、一夜凍結乾燥した。75
℃に加熱した定盤を有する油圧プレスを用いて凍結乾燥
粉末を完全に混合し、成形して約30mgの重量を有するデ
ポとした。次いでこれらのデポを、オキソイド燐酸緩衝
液中の0.02重量／容量％のナトリウムアジド溶液2.0 ml
を含有するプラスチック製の小ビンに装入し、37℃で貯
蔵した。一定の間隔で水性媒体を取出し、新たな緩衝液
を補充した。PEG 5000IL-2の放出は水性媒体のhplc分析
により測定し、蛋白質の累積放出を算出した（以下の表
３参照）。
【０１９０】 表 ３ ペプチドの試験管内放出率 日 数 デ ポ Ａ デ ポ Ｂ 累積放出率（％） 累積放出率（％） 1 31.3 37.7 2 41.8 41.1 4 43.9 45.8 8 45.5 47.0 16 46.5 47.7
【０１９１】実施例30 非ペギル化インターロイキン-2（IL-2）を含有する連続
放出型製薬組成物氷酢酸法（20重量／重量％の蛋白質装
填率） 54.90 mgのポリラクチド（50重量％のd, l−ラクチド／
50重量％のグリコリド共重合体、重量平均分子量10691,
多分散度1.75）を4.0 mlの無水酢酸無含有氷酢酸に溶解
させた。45.09 mgのIL-2の凍結乾燥製剤も別量1.0 mlの
氷酢酸に溶解させた。これら２種の溶液を混合し、別量
４×0.5 ml分の氷酢酸を用いてガラス容器をゆすいだ。
得られる溶液を液体窒素中に落下させて直ちに凍結さ
せ、一夜凍結乾燥した。80℃に加熱した定盤を有する油
圧プレスを用いて凍結乾燥粉末を完全に混合し、次いで
成形して約30mgの重量を有するデポとした。次いでこれ
らのデポを、オキソイド燐酸緩衝液中の0.02重量／容量
％のナトリウムアジドの溶液2.0 mlを含有するプラスチ
ックの小ビンに装入し、37℃で貯蔵した。一定の間隔で
水性媒体を取出し、新たな緩衝液を補充した。IL-2の放
出は水性媒体のhplc分析により測定し、蛋白質の累積放
出を算出した。１、２、４、８及び16日目に分析を行っ
たが、この期間に亘って顕著な放出は検出されなかっ
た。
【０１９２】参考例１ メチルポリエチレングリコール5000で変性された[Me
t-1] ヒト G-CSFの調製 Ａ．[Met-1] ヒト G-CSFの調製 ａ）[Met-1] ヒト G-CSFについての遺伝子の調製 図２及び図３のポリペプチド（ヒト G-CSF）のアミノ酸
配列をエンコードするDNA 塩基配列（図２及び図３及び
SEQ ID No 45) を下記の点を考慮して設計した：
【０１９３】1) プラスミド中の適当な部位での連結を
可能にするための一重鎖粘着末端。 2) 後続の遺伝子操作を促進するための、遺伝子全体に
ついての一連の制限エンドヌクレアーゼ配列。 3) 翻訳停止コドン。 4) コード領域の5′−末端のコドンはA/T が豊富にな
るように選択した。他のコドンはE.coliの発現に好まし
いコドンとして普通に選択した。遺伝子は18個のオリゴ
ヌクレオチド(SEQ IDNo 1-SEQ ID No 18)から集成し、
これを後記する。
【０１９４】オリゴヌクレオチドの調製 後に示すオリゴヌクレオチド配列をApplied Biosystems
380A DNA シンセサイザー上で、5′−ジメトキシトリ
チル塩基−保護ヌクレオシド−2-シアノエチル−N,N-ジ
イソプロピルホスホルアミダイトと0.2 ミクロモルスケ
ール上で孔径制御（pore-controlled)ガラス支持体に連
結された保護ヌクレオチドからAppliedBiosystems Inc
によって提供されるプロトコールに従って調製した。
【０１９５】別法として、オリゴヌクレオチド配列は
“Oligonucleotide Synthesis, a Practical Approach
”（M. T. Gait編、IRL Press, Oxford, Washington D
C, 35〜81頁）にAtkinson及びSmith によって記載され
たマニュアル法によって調製し得る。
【０１９６】詳しくは、Applied Biosystems 380A DNA
シンセサイザーを使用するオリゴヌクレオチド配列の調
製は下記のごとく行われる：各オリゴヌクレオチドを固
体支持体から剥離しついで全ての保護基を除去した後、
水（１ml）に溶解した。３Ｍ酢酸ナトリウム（pH5.6 :
40μl)とエタノール（１ml）の溶液をオリゴヌクレオチ
ド溶液(400μl)に添加しついで混合物を−70℃で20時間
貯蔵した。得られた沈澱を遠心分離（13,000rpm,10分
間）により回収しついでペレットをエタノール：水
（７：３）(200μl)で洗浄しついで真空下で短時間乾燥
した後、水（15μl)及びホルムアルデヒド／染料混合物
(10mM NaOH，0.5mM EDTA，0.01％ブロムフエノールブル
ー，0.01％キシレンシアノール，80％ホルムアルデヒ
ド）中に溶解した。
【０１９７】オリゴヌクレオチドを8.3Mの尿素を含有す
る50mMトリス−硼酸塩(pH8.3）中の10％ポリアクリルア
ミドゲル上で精製した。正しい長さのオリゴヌクレオチ
ドをUV射影（UV shadowing）（Narang等、1979，“Meth
od inEnzymology ”，Vol60，90-98)−通常、最も顕著
なバンドーにより同定し、ゲルから切り取りついで５mM
トリス硼酸塩(pH8.3）中で300mV で３〜４時間、電気溶
離した。水溶液をn-ブタノールで処理することにより
（混合、回転及び上部有機層の除去）、約200μl まで
濃縮した。精製オリゴヌクレオチドをエタノール(2.5容
量）を添加することにより0.3M酢酸ナトリウム溶液から
−70℃で20時間沈澱させた。
【０１９８】遺伝子の集成(assembly of gene) オリゴヌクレオチドSEQ ID No 2-SEQ ID No 17（各々、
400pM)（後に定義）を、ATP(800pM,25pMのガンマ−−32
P ATP を含有）、100 μM のスペルミジン、20mMのMgCl
2 、50mMのトリス−HCl(pH9.0)及び0.1 mMのEDTAを含有
する溶液25μl中で、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ(3.
6単位）を使用して37℃で２時間燐酸化(phosphorylate)
した。溶液を100 ℃で５分間加熱して反応を終結させ
ついで表１に示すごとき対にして(in pair) 混合して、
重復体(duplex)Ａ〜Ｉを得た（オリゴヌクレオチドSEQ
ID No 1 及びSEQ ID No 18(25 μl 中、400mM)は燐酸化
しないで使用した）。0.3Mの酢酸ナトリウム(pH 5.6, 2
00μl)とエタノール (850μl)を添加し、重復体を−20
℃で20時間沈澱させた。得られた沈澱を遠心分離により
回収し、エタノール：水(7：3)で洗浄しついで水（50μ
l)に溶解した。オリゴヌクレオチドの対を、最初、溶液
を沸騰水浴中で100 ℃で２分間加熱することによりアニ
ーリングした。ついで浴を40℃までゆっくり（約４時
間）冷却させた。３対の重復体を含有する溶液を一緒に
してグループＩ〜III を得（表１参照）、凍結乾燥しつ
いでＴ４ DNAリガーゼ（１単位；BRL)、50mMのトリス(p
H 7.6)、10mM塩化マグネシウム、５％(w/v) PEG 8000，
１mm ATP、１mm DTT (BRL,“Focus ”，Vol. 8，No 1，
Winter 1986)を含有する溶液30μlに溶解しついでDNA
を30℃で５分間ついで16℃で20時間連結した。３Ｍ酢酸
ナトリウム（20μl)と水(150μl)を添加しついでエタノ
ール(750μl)を添加することにより生成物を沈澱させつ
いで−20℃で20時間冷却した。沈澱を遠心分離により捕
集し、エタノール（１ml）で洗浄し、水（15μl)及びホ
ルムアルデヒド／染料混合物（10μl)中に溶解しついで
50mMトリス硼酸塩(pH8.3）、１mM EDTA 及び8.3M尿素中
の10％ポリアクリルアミドゲル上で精製した。適当な長
さのストランド(173〜186 塩基）についてのバンドをオ
ートラジオグラフィーにより同定しついで個々のオリゴ
ヌクレオチド配列について述べたごとき方法で単一ゲル
スライスから電気溶離することにより単離した。DNA 鎖
を最初、水溶液（50μl)を100 ℃で２分間加熱しついで
40℃で４時間、放冷することによりアニーリングした。
【０１９９】グループＩ、II及びIII を、これらのグル
ープの調製について述べたものと本質的に同一の方法で
連結して、図10に示す遺伝子配列を生成物として得た。
沈澱後、遺伝子を、T4ポリヌクレオチドキナーゼを使用
して、先に個々のオリゴヌクレオチドについて述べたと
同様の方法で燐酸化しついで水（20μl)に溶解した。 表 １ 重復体 オリゴヌクレオチド 塩基の数 トップストランド ボトムストランド Ａ SEQ ID No 1 + SEQ ID No 2 62 64 Ｂ SEQ ID No 3 + SEQ ID No 4 60 60 Ｃ SEQ ID No 5 + SEQ ID No 6 48 51 Ｄ SEQ ID No 7 + SEQ ID No 8 63 60 Ｅ SEQ ID No 9 + SEQ ID No 10 63 63 Ｆ SEQ ID No 11 + SEQ ID No 12 60 63 Ｇ SEQ ID No 13 + SEQ ID No 14 63 60 Ｈ SEQ ID No 15 + SEQ ID No 16 60 60 Ｉ SEQ ID No 17 + SEQ ID No 18 55 53 Ｉ A+B+C 170 175 II D+E+F 186 186 III G+H+I 178 173
【０２００】ｂ）[Met-1] ヒトG-CSF についての合成遺
伝子のクローニング。 上記の合成遺伝子をプラスミドベクター pSTP1(Windass
等、 Nucleic AcidResearch(1983), Vol10, p6639)中に
クローンした。ベクターを調製するために、10μg のST
P1を水 (37.5μl)及び10xB制限緩衝液(restriction buf
fer)(4.5μl) (BCL)中に溶解した。制限エンドヌクレア
ーゼSalI (３μl)(BCL, ８単位／μl)を添加しついで混
合物を37℃で１時間、超らせん及びニック型（supercoi
led and nickedform)プラスミドと比べて線状化(linear
ised)プラスミドが主成分になるまでインキュベートし
た。DNA をエタノールを用いて４℃で30分間沈澱させ、
エタノール：水(7：3)で洗浄しついで水(39.5μl)及び1
0XH緩衝液(4.5μl)(BCL) 中に溶解した。制限エンドヌ
クレアーゼEcoRI(１μl)(BCL, 90単位／μl)を添加しつ
いで混合物を、大きなEcoRI-SalI断片が主成分になるま
で37℃で１時間インキュベートした。DNA を−20℃で20
時間沈澱させ、エタノール：水(7：3)で洗浄しついで水
（20μl)に溶解した。
【０２０１】大きなRcoRI-SalI断片を１％調製アガロー
スゲル上で精製し、電気溶離し、前記したごとき方法で
沈澱させついで水（20μl)に溶解させた。合成遺伝子を
連結させるために、ベクターDNA(EcoRI-SalI断片溶液，
２μl), 合成遺伝子（前記の水溶液５μl)、５×リガー
ゼ緩衝液(6μl −250mM トリスpH 7.6、50 mM MgCl2 、
2.5w/V％ PEG8000、5MM ATP, 5mM DTT、BRL 製) 、水
(15μl)及びT4DNA リガーゼ（２μl,１U/μl)の混合物
を16℃で４時間インキュベートした。DNA 混合物（非稀
釈連結混合物１μｌ又は水で５倍に稀釈した連結混合物
２μl)を直接使用して、E.coli菌株HB101 を形質転換し
た。ＤＮＡ混合物（１又は２μl)を氷上のコンピテント
E.coli HB 101 細胞 (20μl, BRL) に添加し、混合物を
氷上で45分間インキュベートしついで42℃で45秒、熱衝
撃処理を行った。氷上で２分後、100 μl のSOC 緩衝液
（バクトトリプトン２％；酵母エキス0.5 ％；NaCl10m
M;KCl 2.5mm ；MgCl2 , MgSO4 20mm (各々10mm）；グル
コース20mm）を添加しついで混合物を37℃で１時間イン
キュベートした。懸濁液のアリコートを50μl/mlのアン
ピシリンを含有するL-プレート上に載置したManiatis等
による“MolecularCloning; A Laboratory Manual” (C
old Spring Harbor) に記載されまた英国特許出願第850
2605 号明細書に記載されている標準的方法を使用し
て、形質転換細胞をコロニーハイブリダイゼーション分
析により、クローンされた合成遺伝子についてスクリー
ニングした。全部で100 個のコロニーをフィルター(Sch
leicher及びSchuell)上にストリークし、37℃で20時間
生長させ、溶菌しついでベーキング(bake)した。オリゴ
ヌクレオチド配列SEQ ID No1からランダム−ラベルキッ
ト(landom-label kit)(Pharmacia) を使用して調製した
放射性プローブを使用して、フィルターを65℃で20時
間、ハイブリダイドした。正のハイブリダイゼーション
シグナルを与える５個のコロニー１〜５を、L-ブイヨン
中で37℃で20時間、小規模で(100ml) 生長させついでプ
ラスミドDNA を、Maniatis等による“Molecular Clonin
g ：A Laboratory Manual ”(Cold Spring Harbor)に記
載される方法と実質的に同一の方法で塩化セシウム密度
勾配遠心により調製した。
【０２０２】DNA の塩基配列の決定はSanger等により、
“Proc. Nat. Acad. Sci. USA ”．74, 5463-5467(197
7) に記載される標準チェインターミネーター法によ
り、シクイナーゼ(Sequinase）（商標）キット(United
State Biochemical Corporation)を使用して行った。オ
リゴヌクレオチドSEQ ID No 19〜SEQID No 23（後に定
義；表２参照）を塩基配列決定プライマー(sequencing
primer) として使用した。 表 ２ コード 開始部位(priming site) SEQ ID No 19 214-234 トップストランド SEQ ID No 20 333-353 トップストランド SEQ ID No 21 375-395 ボトムストランド SEQ ID No 22 207-227 ボトムストランド SEQ ID No 23 69-93 ボトムストランド
【０２０３】クローン５からのプラスミドDNA は図６に
示すDNA 塩基配列を含有していた。このプラスミド(pAG
88) を使用して標準的手順に従って下記のE.coli菌株の
コンピテント細胞を形質転換した： HB101 CGCS 6300(以下においてはMSD522とも称する)
【０２０４】E.coli菌株HB101 及びMSD522(CGSC 6300)
は自由に入手し得る。すなわち例えばこれらの菌株は米
国エール大学のE.coli Genetic Stock Centreから入手
し得る。更にE.coli HB101は例えばGIBCO Limited (Uni
t 4, Cowley Mill TradingEstate, Longbridge Way, Ux
bridge, UB8 2YG, Middlesex, England)又はGIBCOLabor
atories, Life Technologies Inc., 3175 Staley Road,
Grand Island, NY14072, USA. により供給されるBRL
から得られる。
【０２０５】菌株HB101 の遺伝子型は前記“Molecular
Cloning - A Laboratory Manual ”にSup E44 hsd S20
(rB- mB- )rec A 13 ara-14 F- leu 6 Thi-1 pro A2
lacY 1 gal K2 rps L20 xyl- 5 mtl - と記載いれてい
る。MSD522(CGCS 6300) の遺伝子型は参考例12に記載さ
れている。
【０２０６】ｃ）[Met-1] ヒトG-CSF の遺伝子の発現ベ
クター中へのクローニング 上記遺伝子を参考例３(c）に記載の方法でプラスミドPI
CI0020中にクローンして、発現プラスミドPICI1056を得
た。
【０２０７】ｄ）発 酵(fermentation) プラスミドpICI1056を参照例3(e)に記載の方法で形質転
換しかつ発酵を行って、[Met-1] ヒトG-CSF を発現させ
た。 ｅ）精 製 ＰＣＴ特許公告第WO87/01132号の第48頁及び第49頁に記
載される[Met-1] ヒトG-CSF を大量に生成させるために
開発された第２の精製法に記載の方法に従って精製を行
い最後の透析を燐酸緩衝溶液に対して行った。
【０２０８】Ｂ．メチルポリエチレングリコールで変性
された[Met-1] ヒトG-CSF の調製 前記Ａに記載の方法で調製した[Met-1] ヒトG-CSF の、
20mM酢酸ナトリウム、37mM塩化ナトリウム、pH 4中の溶
液を、アミコン(Amicon)YM10膜(MW カットオフ10kDa)上
での限外濾過により、８mg／mlになるまで濃縮した。こ
の溶液に等容量の0.8M硼酸ナトリウム(pH8.8) を添加し
ついでMW＝約5000のメチルポリエチレングリコール p-
ニトロフェニルカーボネート(Sigma Chemicals社製)([M
et-1] ヒトG-CSF １モル当り100 等量）を水に溶解して
添加した。穏やかに攪拌しながら20℃で３時間反応を行
いついで1Mエタノールアミン塩酸塩pH 8.0（活性化メチ
ルポリエチレングリコール１モル当り、10等量）を添加
することにより反応を停止した。１M 酢酸を添加するこ
とにより反応混合物を直ちにpH 5.4に調整しついで20mM
酢酸ナトリウム及び100mM NaCl(pH5.4) により500 mlに
稀釈した。混合物を、SIY30 膜(MW カットオフ30kDa)を
取付けたアミコン(Amicon)CH2A-IS スパイラルカートリ
ッジシステムを使用して、黄色p-ニトロフェノールが残
留液(retentate) 中に認められなくなるまで、10ｌの同
一の緩衝液に対して透析濾過(diafilter) した。残留液
を約300ml に濃縮しついでYM30膜(MW カットオフ30kD
ａ) を取付けたアミコン8400攪拌セル中に装入した。残
留液を50mlに濃縮しついで20mM酢酸ナトリウム、100mM
NaCl, NaCl, pH5.4を用いて300ml に再稀釈した。この
操作を４回繰返しそして生成物を最後に約25mlに濃縮し
た。濃縮物を20mM酢酸ナトリウム、100mM NaCl, pH 5.4
で平衡化したウルトロゲルAcA54 のカラム(5×90cm) 上
でクロマトグラフィーにかけた。変性タンパク質を含有
するフラクションを、沃素／沃化カリウム滴定(CR Aca
d. Sci. Paris 274, 1617, 1972) により280nm におけ
るタンパク質とメチルポリエチレングリコールを監視す
ることによって同定し、プールしついで水に対して徹底
的に透析した。最終生成物をアミコンYM30膜上で限外濾
過し、無菌状態で0.22μm フィルターを通して濾過しつ
いで後に使用するために４℃で貯蔵した。
【０２０９】最終変性生成物についてのSDS-PAGEは未変
性の［ Met-1］ヒトG-CSF は残留していないことを示し
た; 全ての生成物は高いMWストリーク(high MW streak)
として行動する。沃素／沃化カリウム滴定による濾液と
残留液の分析結果は、YM30膜(MW カットオフ30kDa)上で
pH 5.4で透析濾過を反復することにより、タンパク質非
結合メチルポリエチレングリコールの全てが効果的に除
去されることを示した。最終生成物はタンパク質１モル
当り、共有結合したメチルポリエチレングリコールを約
４モル含有していた。非変性誘導体の比活性、 0.8×10
9 U/mgは、変性生成物においては 0.2×109 U/mg (25
％) に低下していた。この生成物は完全に安定であり、
10mg/ml(タンパク質による) までにおいて、溶解した状
態で、37℃で14日間に亘って、比活性に変化は認められ
なかった。この参考例においては、二量体化を防止する
か又は少なくとも最小限にするために、[Met-1］ヒトG-
CSF の溶液のpHは、ペグリル化を行う前は注意深く制御
した。
【０２１０】参考例２ メチルポリエチレングリコール5000で変性した[Met-1］
ヒトG-CSF の調製 下記の方法で[Met-1］ヒトG-CSF の精製を行ったこと以
外、参考例１と同様の方法を繰返した。凍結細胞ペース
ト(500g)を溶解しついで粗ペレットフラクションを分離
し、洗浄しついで参考例４（後記参照) に述べる方法で
可溶化した。サルコシル可溶性抽出物を30,000xgで30分
間遠心分離することにより清澄化した。１ｌの上澄液に
攪拌しながら、４℃で１ｌのアセトンを添加した。10分
後、沈澱したタンパク質を15,000xgで30分間遠心分離す
ることにより捕集し、上澄液を廃棄した。ペレットをPT
A20 プローブを取付けたポリトロン(Polytron)PT10-35
ホモジナイザーを使用して、40mM酢酸ナトリウム、6Mグ
アニジン塩酸塩,pH4.0(500ml) 中に再溶解しついで４℃
で１時間攪拌しついでコロジオンチューブ(Spectrapor,
MW カットオフ ６〜８kDa)中で20mM酢酸, pH 5.4に対
する徹底透析を行った。沈澱したタンパク質を15,000xg
で３分間の遠心分離により除去し、上澄液を20mM酢酸ナ
トリウム，pH 5.4で平衡化したCMセルロース(Whatman C
M52)の50mlカラム上に通送した。カラムを溶離液の E
280 が基準線(baseline)に降下するまで同一の緩衝液で
洗浄しついでカラム容量の４倍の量の、20mMのNaClを含
有する20mM酢酸ナトリウム，pH 5.4で洗浄した。[Me
t-1］ヒトG-CSF を含有する生成物フラクションを20mM
酢酸ナトリウム中の37mM NaCl, pH5.4で溶離し、フラク
ションをプールしついで直ちにメチルポリエチレングリ
コール5000で変性するか又は後に使用するまで−20℃で
貯蔵した。
【０２１１】参考例３ メチルポリエチレングリコール5000で変性した[Met-1,S
er17,27 ］ヒトG-CSFの調製 Ａ．ヒト[Met-1,Ser17,27 ] G-CSF の調製 参考例１の工程a)及びb)を繰返した；但し下記のごとき
変更を行った；オリゴヌクレオチドSEQ ID No.1, 2, 3
及び 4の代りに、それぞれ、SEQ IDNo.24, 25, 26 及び
27（後記参照）を使用した。
【０２１２】Ｃ）[Met-1,Ser17,27 ］ヒトG-CSF につい
ての遺伝子の発現ベクター中へのクローニング。 前記した遺伝子（図４及び図５参照）をプラスミドベク
ターpICI0020中にクローンした。このベクターはPAT153
ベースプラスミドであり、651bp EcoRI-AccI領域が、 (1) 合成E.coli trpプロモーター及びtrp リーダーリボ
ソーム結合部位 (2) 翻訳開始コドン、 (3) KpnI、 BamHI、XbaI、SalI、PstI、SphI及びHind I
IIについての部位を含有する、M13mp18 から誘導された
多重制限酵素認識配列（multiple restrictionenzyme r
ecognition sequence) 、 (4) 合成転写停止配列、 からなる167 bp EcoRI-ClaI 断片（SEQ ID No47)によっ
て置換されている。この領域のDNA 塩基配列は図１に示
されている(SEQ ID No44も参照）。
【０２１３】pICI0020発現ベクターを10mMトリスHCl(pH
7.5)、10mM塩化マグネシウム中でKpnI(BCL）を使用して
完全に切断(digest)した。このDNA を0.3Mの酢酸ナトリ
ウムを含有する溶液から、エタノールを使用して-20 ℃
で沈澱させついでT4DNA ポリメラーゼを用いて37℃で10
分間、下記のごとく処理することにより３' −粘性末端
を除去した。： 水（16μl)中のDNA(１μg ） 10XT4 ポリメラーゼ緩衝液（２μl) 0.33M トリスアセテートpH7.9 0.1M酢酸マグネシウム 0.66M 酢酸カリウム 5 mMジチオトレイトール 1 mg/ml ウシ血清アルブミン(BSA PENTAX フラクション
Ｖ） 2 mM dNTP 混合物（１μl) T4 DNAポリメラーゼ（１μl;2.5 単位／μl BCL)
【０２１４】水（80μl)を添加し、混合物をフェノール
／クロロホルム(100μl)で抽出しついでクロロホルム(1
00μl)で抽出した。3M酢酸ナトリウム（10μl)を添加し
た後、DNA をエタノール(250μl)を用いて-20 ℃で沈澱
させついで150mM NaCl, 10mMMgcl2 及び10mMトリスHCl
(pH7.5) 中でSalI(BCL) を用いて完全に切断した。Kpn-
ブラント末端SalIベクター(Kpn-blunt ended to SalI v
ector)を0.7 ％のアガロースゲルから精製しついで製造
業者(Biol 01 USA) の推奨している操作法に従ってジェ
ネクリーン（商標）を使用することにより単離した。
【０２１５】合成遺伝子を下記の方法によりpSTP1 ベク
ターから単離した。ベクターを100mM NaCl 、 10mM MgC
l2 及び10mMトリスHCl(pH7.5)中でScaI及びSalI（両方
共BCL 製）で切断した。530bp 断片を0.7 ％アガロース
ゲルから精製しついで製造業者(Biol01)の推奨する方法
に従ってジェネクリーン（商標）を使用して単離した。
【０２１６】連結(ligation)を行うために、50mMトリス
HCl(pH7.6)、 10mM MgCl2 、1mM ATP 、1mM DTT 、5w/v
％ PEG 8000 及びT4 DNA リガーゼ（２単位；BRL)を含
有する溶液20μl 中の、ScaI-SalI 遺伝子断片(50ng)と
pICI0020ベクター断片（100ng) の混合物を16℃で20時
間インキュベートした。得られた混合物をコンピテント
E.coli HB101細胞(BRLより供給）を形質転換するのに使
用した。形質転換細胞(trans formant) を50μg/mlのア
ンピシリンを含有するＬ−アガープレート上での生長に
より選択しそして32P 標識プローブ(SEQ ID No.24)を使
用するコロニーハイブリダイゼーションにより、遺伝子
の存在についてスクリーンした(screen)。プラスミドDN
A を６個の正にハイブリダイドしている(positivelyhyb
ridising)コロニーから調製し、塩化セシウム密度勾配
遠心法(centrifugation in a caecium chloride gradie
nt) により精製しそして塩基配列をチェインターミネー
ター法(dideoxy sequencing)により確認した。この遺伝
子を含有するプラスミドをpICI 1080 と命名した。
【０２１７】ｄ）[Met-1,Ser17,27 ] G-CSF についての
遺伝子を含有する発現カセット (expression cassette)
のM13mp18 中へのサブクローニング。 参考例７及び８に詳述されているG-CSF 誘導体の調製の
ための開始点を提供するために、下記のサブクローニン
グを行った。
【０２１８】pICI1080からのプラスミドDNA(塩化セシウ
ム密度勾配遠心分離法により精製）をEcoRI 及びSalI(B
CL)を使用して、製造業者の指示に従って完全に切断し
た。trp プロモーターと[Met-1,Ser17,27 ] G-CSF 遺伝
子を含有する小さいEcoRI-SalI断片をジェネクリーン
（商標）を使用して0.7 ％アガロースゲルから単離し
た。この断片をEcoRI-SalI切断M13mp18 ベクター(Amers
ham International により供給されるDNA; BCLからの酵
素）中にクローンした。断片をBRL T4 DNAリガーゼ（前
記したもの）を使用して5X BRLリゲーションバッファー
中で連結した。連結混合物を使用してコンピテントE.co
li TGl 細胞（“Molecular Cloning-ALaboratory Manu
al ” - Maniatis 等、Cold Spring Harborに記載され
るMandel及びHigaの塩化カルシウム法に従ってコンピテ
ントにせしめた）をトランスフェクトした。トランスフ
ェクトされた細胞を、DMF 中の２％ X-Galと200 μl の
ロッグフェーズ(log phase) E.coli TGl 細胞を含有す
るTYトップアガー(topagar) 中に懸濁させ、2xTYアガー
プレート上に載置した［TYトップアガー−８ｇのバクト
トリプトン(Bactotryptone) 、５ｇの酵母エキス、５ｇ
のNaCl、3.75ｇのバクトーアガー(Bacto-agar)及び500m
l の殺菌水；TYプレート−８ｇバクトトリプトン，５ｇ
酵母エキス、5g NaCl, 7.5ｇバクトアガー，500ml 殺菌
水）４個の白色プラークをTYブロス（８ｇのバクトトリ
プトン、５ｇの酵母エキス、５ｇのNaCl及び500ml の殺
菌水）のアリコート中の４×２mlの１％E.coli TGl細胞
中に装入し、37℃で６時間、生長させた。２mlの培養基
を0.5ml と1.5ml のアリコートに分割した。バクテリア
をエッペンドルフ（Eppendorf)（商標）マイクロヒュー
ジ（microfuge)中で溶液から遠心分離し、上澄液を殺菌
エッペンドルフ（商標）チューブに移した。0.5ml のア
リコートをファージストック(pharge stock)として−20
℃に貯蔵した。1.5ml のアリコートはAmersham Interna
tional M13sequencing handbook に記載の方法（後記参
照）に従って一重鎖DNA を調製するのに使用した。これ
らのDNA 試料の塩基配列の決定をオリゴヌクレオチドSE
Q IDNo.22, SEQ ID No23及びM13 ユニバーザーサルシー
クエンシングプライマー(Universal sequencing prime
r) を使用して行った。反応はシクイナーゼキット(Sequ
enase kit)(商標）を使用して、製造業者の指示に従っ
て行った。４個のクローンは全て、[Met-1,Ser17,27 ］
G-CSF についての正しいDNA 配列を有していた。
【０２１９】大規模な一重鎖DNA の調製 １ml当り 200〜500 μg の一重鎖DNA を調製するため
に、AmershamInternational “Oligonucleotide Direct
ed Mutagenesis”に記載の方法を使用した。詳細な手順
は下記の通りである。大規模な一重鎖DNA の調製： Ａ．１mlファージストックの調製 １．グルコース／最小培地プレートから単一のTGl E.co
liコロニーを採取する。10mlの2xTY培地中で37℃で振盪
しながら一夜生長させる。10μl 〜20mlの新しい培地を
添加し、37℃で３時間振盪する。 ２．10ml殺菌培養チューブ内の１mlの2xTY培地に、工程
１からの３時間培養株（culture) 100μl を接種する(i
noculate) 。 ３．１mlの培養株（culture)に組換え体プラーク(recom
binant plaque)を接種する。 ４．振盪しながら37℃でインキュベートする。マイクロ
遠心分離チューブ(microcentrifuge tube)に移す。 ５．周囲温度で５分間遠心分離する。上澄液を新しいチ
ューブに移す。４℃で一夜貯蔵する。一夜貯蔵したTGl
E.coliの培養株を次の工程に供給する。
【０２２０】Ｂ．100ml ファージ培養株（phage cultur
e)の生長 １．100ml の２χTY培地に一夜放置したTGl 培養株（TG
l culture)，１mlを接種しついでO.D.500 が0.3 になる
まで37℃で振盪する。 ２．A5（上記参照）からのファージ上澄液１mlを100ml
培養株（culture)に添加する。 ３．振盪しながら37℃で５時間インキュベートする。つ
いで遠心分離チューブに移す。 ４．４℃で30分間、5000×ｇで遠心分離する。 ５．上澄液を清浄な遠心分離チューブに移す。細胞が搬
出される(carryover)ことがないように注意する（RF DN
Aの調製のためのバクテリアペレット(bacterial pelle
t)を残留させる）。 ６．2.5M NaCl 中の20w/v ％のPEG 6000を0.2 容量、上
澄液に添加する。十分に混合した後、４℃で１時間放置
する。 ７．４℃で20分間、 5000xｇで遠心分離する。上澄液を
廃棄する。 ８．5000×ｇで５分間遠心分離し、残留するPEG/NaClの
全てを取出用パスツールピペットを使用して除去する。 ９．ウイルスペレットを 500μl の水（二段蒸留）に再
懸濁させついでマイクロ遠心チューブ（1.5ml)に移す。 10．マイクロ遠心分離機中で５分間遠心分離して、残留
細胞を除去する。上澄液を新しいマイクロ遠心分離チュ
ーブに移す。 11．上澄液に12.5M NaCl中の20％PEG 200μl を添加
し、十分に混合しついで周囲温度で15分間放置する。 12．５分間遠心分離し、上澄液を廃棄する。 13．２分間遠心分離する。取出用パスツールピペットを
使用して、痕跡のPEG/NaClを全て除去する。 14．ウイルスペレットを二段蒸留水500 μl 中に再懸濁
させる。 15．10mMトリス HCl pH8.0で飽和させたフェノール 200
μl と１mMのEDTAを添加。短時間攪拌する(vortex)。 16．室温で15分間、放置する。 17．３分間遠心分離する。 18．上澄液を新しいチューブに移す。 19．工程15〜18を繰返す。 20．500 μl のクロロホルムを添加し、水性相を２回抽
出する。 21．3M酢酸ナトリウム50μl と１mlの無水エタノールを
添加し、混合する。 22．ドライアイス及びエタノール浴中に20分間、置く。 23．15分間、遠心分離する。 24．各ペレットを１mlの−20℃のエタノールで洗浄。注
ぎ出す。 25．ペレットを真空乾燥しついで50μl の二段蒸留水中
に添加する。 この方法により100 〜200 μg の一重鎖DNA が得られ
た。
【０２２１】ｅ）発酵（培養）(fermentation) pICI 1080 をE. coli 菌株MSD 522 (CGSC 6300）（参考
例1A(b）で参照されている）に形質転換し、得られた組
換え体を精製しそしてグリセリンストック上で−80℃に
保持した。培養株(culture) のアリコートをストックか
ら取り出し、L-アンピシリンのアガープレート上にスト
リークし(streak)、37℃で一夜生長後、単一コロニーを
分離した。単一の所望のコロニーを取出しついで10mlの
L-アンピシリンブロスに再懸濁させ、直ちにその100 μ
l を、75mlのL-アンピシリンブロスを含有する、10個の
250 mlエルレンマイヤーフラスコの各々に接種した。往
復振盪機上で37℃で16時間生長させた後、フラスコの内
容物をプールし、20l LCM50 生長培地を含有する発酵器
に接種するのに使用した。
【０２２２】LCM50 の組成 蒸留水中の濃度 g／l KH2 PO4 3.0 Na2 HPO 4 6.0 NaCl 0.5 カゼイン加水分解物 (Oxoid L41) 2.0 (NH4 ) 2 SO4 10.00 酵母エキス (Difco) 10.00 グリセリン 35.00 L-ロイシン 2.5 L-スレオニン 0.9 MgSO4 ・7H2 0 0.5 CaCl2 ・2H2 O 0.03 チアミン 0.008 FeSO4 ／クエン酸 0.94/0.02 微量元素溶液 (TES) 0.5ml ついで発酵を37℃の温度でかつ6M水酸化ナトリウム溶液
を自動的に添加することによって制御されている、6.7
のpHで行った。溶解酸素張力 (dissolvedoxygen tensio
n)(dOT)の設定点は50％空気飽和率(air saturation)で
あり、当初、発酵器の攪拌速度を自動調節することによ
り制御した。１分当り、容量当り、１容量（VVM)に相当
する発酵器への空気流率を、当初の20ｌ／分から、発酵
器攪拌速度がその最大値の80〜90％に到達したとき、50
ｌ／分(2.5VVM)に増大させた。発酵器の酵素移行速度(o
xygen transfer rate)(OTR) は、記載される条件下で50
のOD550 に相当する細胞濃度(cell density)より大きい
細胞濃度においては、バクテリアの酵素吸収速度(oxyge
n uptake rate)(OUR) を満足させることができないの
で、この細胞濃度より大きい細胞濃度における発酵器内
のdOT は、バクテリアの酸素吸収速度を制限することに
より、50％の空気飽和率に保持した。これは培地を炭素
が50のOD550 に制限されるように調製しついで制限炭素
源(limiting carbon source)の栄養(feed)を硫酸アンモ
ニウム及び酵母エキスと共に、バクテリアの生長を制限
する速度で供給することにより達成した。
【０２２３】発酵は16時間行い、この間に、光学密度
（OD550 ) 、細胞の乾燥重量及び細胞内のG-CSF の蓄積
を測定するためにサンプルを採取した。G-CSF の蓄積
は、当業者に周知のごとく、試料バクテリアの全細胞溶
解物(lysate)のクーマシブルー染色SDS-PAGEゲルを走査
することにより測定した。OD550 が25に到達したとき、
カゼイン加水分解物溶液（100g/lのOxozoid L41)を1.5g
／ｌ／時の割合で発酵器に注入した。
【０２２４】OD550 が約50に到達したとき、発酵バッチ
中の炭素源の供給物が消費され、dOT が50％空気飽和率
から急速に上昇した。この時点で、グリセリン(470g/
l)、酵母エキス(118g/l)及び硫酸アンモニウム(118g/l)
を含有する栄養を、元の速度で発酵器に供給しついで発
酵器を最大値の約80％で攪拌しながら、dOT を50％空気
飽和率に保持した。約13〜14時間後、この栄養−バッチ
供給を行う代りに、グリセリン(715g/l)及び硫酸アンモ
ニウム(143g/l)だけからなる栄養を供給した。カゼイン
加水分解物供給率は全体を通じて1.5g／ｌ／時に保持し
た。約16時間後、培養液の顕微鏡検査により大部分の細
胞内に大きな封入体(inclusion body)の存在が認められ
たとき、バクテリアをソルバル(Sorval)RC3B遠心分離器
上で捕集し(7000g、30分、 4℃) 、−80℃で冷凍して保
存した。
【０２２５】ｆ）精 製 冷凍細胞ペースト(500ｇ）をシルバーソン(Silverson)
AXR 型ホモジナイザーを使用して50mMトリス HCl、25mM
EDTA, pH8.0(5ｌ) 中に４℃で再懸濁させた。懸濁液を
マントン−ガウリン(Manton - Gaulin) ホモジナイザー
を6000 psiで３回通過させることにより溶菌し(lyse)つ
いでソルバルRC3C遠心分離器内でH6000Aローターを使用
して5000ｇで30分間、遠心分離した。上澄液を廃棄し、
ペレットフラクションを更に精製する前、−20℃で貯蔵
した。
【０２２６】ペレットフラクション（60〜100g）を解凍
しついで5mM EDTA中の１w/v%のデオキシコール酸（ナト
リウム塩）、５mMのジチオトレイトール、１mg／mlのナ
トリウムアジドを含有する50mMのトリスHCl, pH9.0 (12
00ml）中に、PTA 20プローブを有するポリトロン(Polyt
ron)ホモジナイザーを使用して設定速度５で再懸濁させ
た。懸濁物を室温で30分間混合しついでソルバルRC5C遠
心分離器中でGSA ローターを使用して6500ｇで30分間遠
心分離した。上澄液を廃棄しついでペレットを上記と同
じ方法で２回再処理した。次にペレットを水（１l)に２
回再懸濁させ、15000gで20分間、遠心分離した。洗浄封
入体（inclusion body）を含有する最終ペレットを１mg
/ml のナトリウムアジドを含有する50mMトリス HCl, pH
8.0 (150ml) 中の２w/v%N-ラウロイルサルコシンナトリ
ウム塩（サルコシル）中で可溶化した。硫酸第２銅を20
μM に添加し、混合物を20℃で16時間攪拌しついでソル
バルRC5C遠心分離器中でSS34ローターを使用して30,000
ｇで30分間遠心分離した。誘導体を含有する上澄液を、
更に精製する前、50mlのアリコートとして−20℃で貯蔵
した。可溶化された誘導体(20ml)を解凍し、５μm フィ
ルターを通過させて粒状物質を除去した。濾液を、１mg
／mlのナトリウムアジドを含有する50mMトリスHCl,pH
8.0中の0.3w/v％N-ラウロイルサルコシン（Na塩）で平
衡化した(eguilibrate) ウルトロゲル(Ultrogel) AcA54
のカラム(5×90cm）に４℃で通送した。カラムを同一の
緩衝液を用いて2.5ml/分の流率で溶離し、10mlのフラク
ションを捕集した。誘導体タンパク質を含有するフラク
ションを捕集し（約100ml)、４℃で貯蔵した。数個のカ
ラムから捕集した誘導体含有フラクションを一緒にし(3
00〜500ml)、SIY10 膜(10kD カットーオフ）を取付けた
アミコン（Amicon) CH2A-1S スパイラルカートリッジダ
イアフィルタレーション装置を使用して、１mg/ml のナ
トリウムアジドを含有する10mM燐酸ナトリウム、150mM
塩化ナトリウムに対して透析した。滞留物（retentate)
をソルバルRC5C遠心分離器内でSS34ローターを使用して
30000xｇで30分間遠心分離しついで上澄液をスペクトロ
ポール（Spectropor) 6-8kD カット−オフ透析チューブ
内で40時間、１mg／mlのナトリウムアジドを含有する10
0 mM塩化ナトリウム、20mM酢酸ナトリウム、pH5.4 に対
して、この溶液を３回交換して透析した（上澄液300 ml
当り、８ｌ）。形成された沈澱を30,000xgで30分間の遠
心分離により除去しついで上澄液を１mg／mlのナトリウ
ムアジドを含有する水に対して24時間透析しついで水に
対して、水を６回交換して72時間透析した。最終滞留物
を30,000xgで30分間遠心分離することにより清澄化し、
−20℃で冷凍貯蔵する（タンパク質濃度約１mg／ml）か
又は４℃で凍結乾燥した。
【０２２７】N-ラウロイルサルコシン（Na塩）の濃度は
ダイアフイルタレーションの後には0.001w/v％以下に低
下しそして水に対する透析の後に使用したrpHPLC法の検
出限界値（約0.0001％）以下であった。
【０２２８】Ｂ．メチルポリエチレングリコールで変性
した[Met-1,Ser17,27 ] ヒトG-CSF の調製。 参考例７と同一の方法を繰返した。最終生成物はタンパ
ク質１モル当り、共有結合したメチルポリエチレングリ
コール約4.1 モル含有していた。[Met-1,Ser17,27 ] ヒ
トG-CSF の比生物学的活性(specific biological activ
ity)(1.4×109 U/mg) は、変性後、 2.4×108 U/mg (17
％) にしか低下しなかった。生成物は完全に安定であ
り、PBS 中で10mg／ml（タンパク質による）までの溶解
状態での比活性は37℃で14日間に亘って変化しなかっ
た。これらの結果は比較例７の場合と厳密に類似してお
り、所与のアミノ基の配列について得られる結果の一致
性を示している。
【０２２９】参考例４ メチルポリエチレングリコール5000で変性された[Me
t-1,Arg,Ser17,27,60,65 ] ヒトG-CSFの調製。 下記の操作を行ったこと以外、参考例７と同一の方法を
繰返した：冷凍細胞ペースト(500g)をポリトロンPT 600
0 ホモジナイザーを使用して50mMトリスHCl 、25mM EDT
A 、pH8.0(５l)中に４℃に再懸濁させた。懸濁液をマン
トン−ガウリン(Manton-Gaulin) ホモジナイザーを6000
psi で３回通過させることにより溶菌し(lyse)ついでソ
ルバルRC3C遠心分離器内でH6000A−ローターを使用して
5000ｇで30分間、遠心分離した。上澄液を廃棄し、ペレ
ットフラクションを更に精製する前、−20℃で貯蔵し
た。
【０２３０】ペレットフラクション(200〜250)を解凍し
ついで５mM EDTA 中の１w/v ％のデオキシコール酸（ナ
トリウム塩）、５mMのジチオトレイトール、１mg/ml の
ナトリウムアジドを含有する50mMのトリス HCl, pH9.0
(3 l)中に、PTA20 プローブを有するポリトロン(Polytr
on) PT10-35型ホモジナイザーを使用して再懸濁させ
た。懸濁物を20℃で30分間混合しついでソルバルRC3C遠
心分離器中でH6000Aローターを使用して5000ｇで30分間
遠心分離した。上澄液を廃棄しついでペレットを上記と
同じ方法で２回再処理した。次にペレットを水（3 l)に
２回、再懸濁させ、5000ｇで30分間、遠心分離した。洗
浄封入体(inclusion body)を含有する最終ペレットを１
mg／mlのナトリウムアジドを含有する50 mM トリスHCl,
pH8.0 (300ml) 中の2w/v％N-ラウロイルサルコシンナ
トリウム塩（サルコシル）中で可溶化した。硫酸第２銅
を20μM に添加し、混合物を20℃で16時間攪拌しついで
ソルバルRC5C遠心分離器中でSS34ローターを使用して3
0,000g で遠心分離した。誘導体を含有する上澄液を、
更に直ちに精製するか、使用することが必要になるまで
−20℃で貯蔵した。
【０２３１】可溶化された誘導体を１mg／mlのナトリウ
ムアシドを含有する50mMトリスHCl,pH 8.0中の2w/v％サ
ルコシル中で15mg／mlのタンパク質含有量(E280 により
評価）に調整しついで５μＭフィルターを通過させて粒
状物質を除去した。濾液の80mlのアリコートを、１mg／
mlのナトリウムアジドを含有する50mMトリスHCl,pH 8.0
中の0.3w/v％N-ラウロイルサルコシン（Na塩）で平衡化
した(equilibrate) セファクリル(Sephacryl) S200HRの
カラム（10×90cm）に通送した。カラムを同一の緩衝液
を用いて2.5ml/分の流率で溶離し、10mlのフラクション
を捕集した。誘導体タンパク質を含有するフラクション
を捕集し（約100ml)、４℃で貯蔵した。数個のカラムか
ら捕集した、誘導体含有フラクションを一緒にし（約10
00ml）、SIY10 膜(10kD カット−オフ) を取付けたアミ
コン(Amicon)CH2A-1S ダイアフィルタレーション装置を
使用して、1mg/mlのナトリウムアジトを含有する10mM燐
酸ナトリウム、150mM 塩化ナトリウム(pH7.4) に対して
透析した。残留液(retentate) を、必要に応じて、ソル
バルRC5C遠心分離器内で GSAローターを使用して15,000
xgで30分間遠心分離しついで清澄化された残留液をスペ
クトラポール６−８ kDaカットオフチューブ内で、20mM
酢酸ナトリウム、100mM 塩化ナトリウムに対して、これ
を３回交換して（残留液300 ml当り、８ｌ）、pH 5.4，
４℃で24時間透析を行った。形成された沈澱を15,000xg
で30分間遠心分離しついで上澄液を水（上澄液300 ml当
り８ｌ）で３回透析した。最終残留液を15,000xgで30分
間、遠心分離しついで0.1M硼酸ナトリウムpH 8.0にせし
めた。精製された誘導体を直ちにメチルポリエチレング
リコールで変性するか、必要になるまで−20℃で貯蔵し
た。
【０２３２】参考例５ メチルポリエチレングリコール5000で変性されたヒト[M
et-1,Ser17,27 ］G-CSF の調製 下記の操作を行ったこと以外、参考例３のＡと同一の方
法を繰返した。重復体(duplex)I をT4ポリヌクレオチド
キナーゼでホスホリル化しついで1XH緩衝液(BCL;30 μ
ｌ) 中でMst II(10 単位) を使用して37℃で２時間切断
した。エタノールで沈澱させた後、143bp EcoRI-Mst II
断片を７M の尿素を含有する10％ポリアクリルアミドゲ
ル上で精製し、電気溶離(electroelution)によりゲルス
ライスから単離しついでDNA鎖を参考例１で述べた方法
でアンニールした。
【０２３３】上記した合成RcoRI-Mst II断片を参考例１
に記載されるプラスミドベクターpAG88 中にクローンし
た。ベクターを調製するためには、pAG88(10μg)を１XH
緩衝液(BCL;100μl ) 中でMst II (２単位,BCL) を使用
して37℃で２時間切断した。DNA をエタノールを使用し
て0.3M酢酸ナトリウムから−20℃で沈澱させついで1XH
緩衝液(BCL;100μl)中でEco.RI(20 単位;BCL) を使用し
て37℃で２時間切断した。エタノールを使用して沈澱さ
せた後、大きなRcoRI-Mst II切断を１％アガロースゲル
上で、ジェネクリーン（商標）を使用して、製造業者(B
io 101 USA)の指示に従って精製した。143bp 断片の大
きなRcoRI-Mst断片への連結は参考例１(b) に述べた方
法で行った。合成断片を含有するコロニーをオリゴヌク
レオチド(SEQ ID No24) から調製した放射性プローブを
使用するスクリーニングにより確認し、正しい塩基配列
は参考例１に述べるDNA 塩基配列決定法により確認し
た。[Met-1， Ser17,27 ］G-CSF についての遺伝子を含
有するプラスミドをpICI11107 と命名した。この遺伝子
を発現ベクターpICI0020中にクローンしついで参考例と
同様の方法で精製を行った。
【０２３４】参考例６ 特定部位の突然変異誘発によるヒトG-CSF の誘導体の遺
伝子の調製Eckstein及び共同研究者によるホスホロチオ
エート法を使用した: Taylor, J W et al Nucleic Acids Research (1985) Vol pp 8749-8764 Taylor, J W et al Nucleic Acids Research (1985) Vol pp 8765-8785 Nakamaye, K et al Nucleic Acids Research (1986) Vol pp 9679-9698 Sayers, J R et al Nucleic Acids Research (1988) Vol pp 791-802
【０２３５】この方法はAmersham Internationalによっ
て提供されるキットを使用して行い得る。この方法は以
下に概略述べられておりそして２種以上の突然変異誘発
オリゴヌクレオチドを使用すること及び長さが30塩基よ
り大きいオリゴヌクレオチドについてのインキュベーシ
ョン温度を使用するという点で原法と異る。
【０２３６】 １．突然変異体オリゴヌクレオチドの一重鎖DNA 鋳型へのアニーリング： 一重鎖DNA 鋳型 (１μg/μl) 5 μl 燐酸化突然変異誘発オリゴヌクレオチド(1.6pmol／μl) 2.5 μl 緩衝液Ｉ 3.5 μl 水 6 μl （２種の突然変異誘発オリゴヌクレオチドを同時に使用
した場合、各々の燐酸化オリゴヌクレオチド(1.6pmol/1
μl) 2.5μl を、 3.5μl の緩衝液Ｉ及び 3.5μl の水
中の５μl の一重鎖DNA 鋳型 (１μg/μl)に添加した。
３種の突然変異誘発オリゴヌクレオチドを使用した場
合、各々の燐酸化オリゴヌクレオチド(1.6pmol/ μl)
2.5μl を、５μl の一重鎖DNA (3.5μl の緩衝液Ｉ及
び１μlの水中の溶液１μg/μl)に添加した。）上記成
分をキャップ付チューブに装入し、オリゴヌクレオチド
が30塩基以下の長さである場合には、70℃の水浴中に３
時間、また、オリゴヌクレオチドが30塩基以上の長さの
場合には、沸騰水浴中に３分間、放置した。ついでチュ
ーブを37℃の水浴中に30分、放置した。
【０２３７】２．突然変異体DNA 鎖(mutant DNA stran
d) の合成と連結 アニーリング反応溶液に下記の成分を添加した: MgCl2 溶液 5 μl ヌクレオチド混合物１(dCTP アルファーS 含有) 19 μl 水 6 μl クレナウ(Klenow)断片 (６単位) 1.5 μl T4DNA リガーゼ 2 μl 上記成分を16℃の水浴中に装入し、一夜放置した。
【０２３８】３．使い捨て遠心分離フィルター装置を使
用する。一重鎖（非突然変異体）(non-mutant)DNA の除
去。 工程２からの反応溶液に水170 μl 及び５MNaCl 30μl
を添加した。250 μl の試料を前記フィルター装置の上
部の半分に添加し、ソルバルRT6000B ベンチトップ(ben
ch top) 遠心分離器内でソルバルH1000Bスイングアウト
ローターを使用して、室温で10分間、1500rpm で遠心分
離した。試料相を２枚のニトロセルロース膜を通過さ
せ、これによって、単一一重鎖DNA を結合させ、二重鎖
DNA を以下に述べる捕集チューブに通送した。
【０２３９】100 μl の50mMNaClを添加してから、再び
10分間回転させて、残留RF DNAを完全に洗浄した。
【０２４０】下記の成分を濾液に添加した: ３Ｍ酢酸ナトリウム(pH6.0) 28μl 冷エタノール(-20℃) 700μl
【０２４１】混合物をドライアイス−エタノール浴中に
20分装入しついでエッペンドルフマイクロフュージ(Epp
endorf microfuge) 中で遠心分離した。ついでペレット
を10μl の緩衝液２に再懸濁させた。
【０２４２】４．Nci I を使用する非突然変異体DNA 鎖
のニッキング。 工程３からの反応混合物に65μl の緩衝液３及び８単位
のNicI(１μl)を添加した。混合物を37℃の水浴中に90
分間、放置した。
【０２４３】５．エキソヌクレアーゼIII を使用する非
突然変異体DNA 鎖の切断。 工程４からの反応混合物に、下記の成分を添加した： 500mM NaCl 12μl 緩衝液４ 10μl エキソヌクレアーゼIII(50単位) 2μl
【０２４４】混合物を37℃の水浴中に装入し、37℃で30
分間インキュベートした(50 単位のエキソヌクレアーゼ
III は30分間で約3000塩基を切断するであろう) 。つい
で混合物を70℃の水浴中に15分間装入して酵素を不活性
化した。
【０２４５】６．ギャップト(gapped)DNA の再重合及び
連結 工程５からの反応混合物に ヌクレオチド混合物２ 13μl MgCl2 溶液 5μl DNA ポリメラーゼI(４単位) 1μl T4 DNA リガーゼ(2.5単位) 1μl を添加した。混合物を16℃の浴中に３時間、放置した。
【０２４６】７．上記DNA を使用するコンピテント宿主
E.coli TG1 細胞の形質転換。 300 μl の調製直後のコンピテントE.coli TG1細胞(Man
del 及びHigaの方法に従って調製) を工程６からの反応
混合物20μl を用いて形質転換した（二回)(in duplica
te)。形質転換体をTYプレート上のTYトップアガー中の
ロッグフェーズ(log phase)TG1のローン(lawn)上に載
せ、37℃で一夜インキュベートした。
【０２４７】E.coli菌株TG1 は米国、エール大学、E. c
oli Genetic Stock Centre及び英国、Buckinghamshire
HP7, 9NA, Amersham, Little Chalfont, Amersham plac
e,Amersham International plcから、“試験管内”突然
変異誘発システム、オリゴヌクレオチドダイレクテッド
キッド(Oligonucleotide directed kit) (製品コードPR
N1523)として自由に入手し得る。
【０２４８】参考例７ メチルポリエチレングリコール5000で変性された[Me
t-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の調製。 Ａ．ヒト[Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の
調製。 参考例３又は５で述べた[Met-1,Ser17,27 ］G-CSF につ
いての遺伝子を含有する突然変異鋳型(mutagenic templ
ate)を使用して、参考例６に記載した方法を繰返した。
使用した突然変異誘発オリゴヌクレオチドは指定の(des
ignated)SEQ ID No28 及びSEQ ID 29 であり、後に定義
されている。
【０２４９】SEQ ID No 28中のトリプレットACG は11位
のGln をArg に転化する作用を行い、SEQ ID No29 中の
最初と最後のAGA トリプレットは65及び60位のPro をSe
r に転化する作用を行う。突然変異誘発(mutagenesis)
は単一プライミング突然変異誘発(single priming muta
genesis)においてSEQ ID No29 を使用して参考例６で述
べる方法で行った。これによってPro 60 Ser及びPro 65
ser変異(change)を包含する単一プラークが得られた。
このプラークから比較例６に述べた方法に従って一重鎖
DNA を調製した。このDNA を、SEQ ID No28 を突然変異
プライマー(mutagenic primer)として使用する単一プラ
イミング突然変異誘発における突然変異鋳型として使用
した。これによって100 以上のプラークが得られ、その
中の３個を前記したごときDNA 塩基配列決定法によりス
クリーンした。３個のプラークの全てが組込まれた変異
(change)の完全なセットを有していた。二重鎖RF DNAを
プラークの一つから、一重鎖DNA を大量に製造する方法
（実施例１の工程ｄ〜工程B5) に従って調製した。RF D
NAをBirnboim及びDolyのアルカリ溶菌法（“Nucleic Ac
id Research ”(1979), 7, 1513〜1523) によりバクテ
リアペレットから抽出しついでSambrook, Fritsch 及び
Maniatisにより“MolecularCloning a Laboratory Manu
al ”(Cold Spring Harbor Publication)に記載される
塩化セシウム密度勾配遠心分離により精製した。精製し
たRF DNAを前記したごとき緩衝液Ｈ中でEcoRI とSal I
を使用して切断しついでtrp プロモーター、リボソーム
結合部位、翻訳開始コドン及び[Met-1,Arg11 Se
r17,27 ］G-CSF についての遺伝子を有する619bp 断片
を0.7 ％アガロースゲルからジェネクリーン（商標）を
使用して単離した。断片を、前記した方法と実質的に同
一の方法に従って、2:1 より過剰のインサート：ベクタ
ーのモル比を使用してかつT4DNA リガーゼ(BRL) とリガ
ーゼ緩衝液(ligase buffer) を使用して、EcoRI-SalI切
断pICI0020ベクター中に連結した。連結混合物を使用し
て、E.coli菌株HB101 を形質転換した。形質転換細胞を
50μg/mlのアンピシリンを含有するL-アガープレート上
での生長により選択した。“Molecular Cloning-a Labo
ratory Manual", Sambrook,Fitsch及びManiatis (Cold
Spring Harbar Publication) に記載のBirnboim及びDol
yの方法により調製されたプラスミドDNA の制限分析に
より、コロニーを挿入DNA の存在についてスクリーンし
た。所期の619bp EcoRI-SalIインサートを含有するコロ
ニーからのプラスミドDNA を使用して、E.coli菌株MSD5
22と指定の(designated)pICI1239とを形質転換した。発
酵と精製は実施例３と同様の方法で行った。
【０２５０】Ｂ．メチルポリエチレングリコール5000で
変性された[Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65］ヒトG-CSF
の調製。 水(400ml) 中の[Met-1,Arg11 Ser17,27,60,65 ］ヒトG-
CSF の溶液を、0.8M硼酸ナトリウムpH 8.8を添加するこ
とによりpHを8.0に上昇させついでアミコンYM10膜(MW
カットオフ10kDa)上での限外濾過により50ml(8mg／ｌ）
に濃縮した。この溶液に等容量の0.8M硼酸ナトリウム，
pH8.8 を添加しついでMW＝約5000のメチルポリエチレン
グリコール(Sigma Chemicals)(11.3g, 100等量; [Me
t-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF 上のアミノ基
１個当り、20等量) を水(100ml）に溶解して添加した。
穏やかに攪拌しながら室温で３時間反応を行いついでエ
タノールアミン塩酸塩pH8.0(活性化メチルポリエチレン
グリコール１モル当り10等量) を添加することにより反
応を停止した。反応混合物をアミコンYM30膜(MW カット
オフ30kDa)上で４℃で濃縮して、最終残留液容量を50ml
とした。残留液を1.0M炭酸水素ナトリウム，pH8.0(200m
l)で稀釈しついで限外濾過により前記したごとく50mlに
再濃縮した。この操作を４回繰返しそして生成物を最終
的に約25mlに濃縮した。生成物の濃縮溶液を10mM燐酸ナ
トリウム,1mg／mlのナトリウムアジド(PBS−アジド) を
含有する150mM 塩化ナトリウムpH 7.4で平衡化したウル
トロゲルAcA54 のカラム(5×90cm) 上でのクロマトグラ
フィーにかけた。タンパク質を含有するフラクション
を、沃素／沃化カリウム滴定(CR Acad. Sci. Paris 27
4,1617, 1972) により280 nmにおけるタンパク質とメチ
ルポリエチレングリコールを監視することによって同定
し、プールしついで水に対して徹底的に透析した。最終
生成物をアミコンYM30膜上での限外濾過により11.5mg/m
l 以上まで濃縮し、無菌状態で0.22μmフィルターを通
して濾過しそして後に使用するために４℃で貯蔵した。
【０２５１】酸加水分解後のアミノ酸分析によるタンパ
ク質の評価の結果は、最終変性生成物中に[Met-1,Arg11
Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の51％が全体として回収
されていることを示した。反応混合物についてのPAGE-S
DSは未反応の[Met-1,Arg11Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF
が残留していないことを示した; 全ての生成物は高いM
Wストリーク(high MW streak)として行動する。沃素／
沃化カリウム滴定による濾液と残留液の分析結果は、YM
30膜上でpH 8.0で透析濾過を反復することにより、タン
パク質非結合メチルポリエチレングリコールの全てが効
果的に除去されることを示した。このことをウルトロゲ
ルAcA54 のカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィー
を行いついでブランクエタノールアミン反応停止(blank
ethanol amine quenched）活性化メチルポリエチレング
リコールで検量(calibrate) を行うことにより確認し
た。メチルポリエチレングリコールに共有結合した[Met
-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の沃素／沃化カ
リウム滴定と、酸加水分解後のアミノ酸分析によるタン
パク質の評価とを組合せて行った結果は、タンパク質１
モル当り、約3.9 モルのメチルポリエチレングリコール
が結合していることを示した。[Met-1,Arg11,Ser
17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の比生物学的活性(1.2×109
U/mg) はメチルポリエチレングリコールによる変性後、
2.2×108 U/mg (19％) に低下していた。この生成物は
完全に安定であり、10mg/ml(タンパク質による) までに
おいて、PBS 中に溶解した状態で、37℃で14日間に亘っ
て比活性に変化は認められなかった。
【０２５２】参考例８ メチルポリエチレングリコールで変性した[Met-1,Gl
u15,Ser17,27 ,Ala26,28 ,Lys30］ヒトG-CSF の調製。 Ａ．[Met-1,Glu15,Ser17,27 ,Ala26,28 ,Lys30］ヒトG-
CSF の調製。 参考例３又は５で述べた[Met-1,Ser17,27 ］G-CSF につ
いての遺伝子を含有する突然変異鋳型M13mp18 を使用し
て参考例７の方法を繰返した。使用した突然変異誘発オ
リゴヌクレオチドはSEQ ID No33 及びSEQ ID No34 であ
り後に定義されている。
【０２５３】SEQ ID No33 中のトリプレットTTC は15位
のLeu をGlu に転化する作用を行う。SEQ ID No34 にお
いては、最初のTTT トリプレットは30位のAla をLys に
転化する作用を行い、トリプレットAGC は28及び26位の
Gly をAla に転化する作用を行う。
【０２５４】突然変異誘発操作は二重プライミング実験
として参考例６で述べたものと実質的に同一であり、発
現カセットを発現プラスミドに転移させてpICI 1266 を
得た。
【０２５５】ｂ）精 製 冷凍細胞ペーストを溶解し、粗ペレットフラクションを
参考例３に記載の方法で分離した。このタンパク質を含
有するペレット中の封入体を参考例３に記載の方法でデ
オキシコール酸（Na塩）緩衝液により可溶化した。この
タンパク質を下記の方法で変性した。 Ｂ．メチルポリエチレングリコール5000で変性された[M
et-1,Glu15,Ser17,27 ,Ala26,28 ,Lys30］ヒトG-CSF の
調製。 この化合物は30位に追加のLys 残基を有するが、同様に
100モル等量の反応剤を使用して参考例７に記載の方法
で調製した。最終生成物はタンパク質１モル当り、共有
結合したメチルポリエチレングリコールを約4.7 モル含
有していた。この結合量の増加は変性のための潜在的部
位が余剰に存在することと一致し、PAGE-SDSにおいてMW
が若干増大することに反映されている。未変性誘導体の
比生物学的活性、 1.2×109 U/mgは変性生成物において
は 4.4×107 U/mg (３％) に低下している。この生成物
は完全に安定であり、PBS 中で10mg/ml(タンパク質によ
る) までの溶解状態において、37℃で14日間、比活性に
変化は認められなかった。
【０２５６】参考例９ 発酵工程（例えば参考例３(e) 参照) においてE.coli菌
株MSD522の代りに、E.coli TG 1 を使用して、参考例
１，３及び５の方法を繰返した。
【０２５７】参考例10 ヒト[Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ］G-CSF の別の抽出
法。 冷凍細胞ペースト(640g)を１mg／mlのナトリウムアジド
を含有する50mMトリスHCl, 5mM EDTA, 5mMジチオトレイ
トール及び２M 尿素からなる緩衝液（pH 8.0)（５ｌ）
中に、PTA20 プローブを備えたポリトロンホモジナイザ
ーを使用して設定速度 7／8 で４℃で懸濁させた。懸濁
物をマントン−ガウリンラブ(Manton-Gaulin Lab）60／
60ホモジナイザーを6000 psiで３回通過させることによ
り溶菌しついで更に１ｌの追加の緩衝液でフラッシュし
た。−20℃のシングルパスコネイルチラー(single pass
Conair chiller)により冷却した。溶菌液（lysate) を
ソルバルRC3C遠心分離器中で5000xgでH6000Aローターを
使用して30分間遠心分離した。
【０２５８】上澄液を廃棄しついでペレット（約450g）
を上記と同一の緩衝液（10ｌ）に再懸濁させた。懸濁液
を室温で30分間混合した後、２基のソルバルRC3C遠心分
離器中でH6000Aローターを使用して5000 rpmで30分間遠
心分離した。上澄液を廃棄し、ペレットを上記と同一の
方法で２回処理した。ペレットを２回、水（10ｌ）に再
懸濁しついで5000 rpmで30分間遠心分離した。洗浄封入
体を含有する最終ペレットを１mg／mlのナトリウムアジ
ドを含有する50mMトリスHCl, pH8.0 (１ｌ）中の2w/v％
のN-ラウロイルサルコシンNa塩中にポリトロンホモジナ
イザーを使用して設定速度７で再懸濁させた。水(1.5m
l) 中の20mMの硫酸第２銅を添加した後、混合物を室温
で一夜攪拌しついでソルバルRC3C遠心分離器中でGSA ロ
ーターを使用して10,000 rpmで30分間遠心分離した。
【０２５９】誘導体を含有する上澄液を５μm フィルタ
ーを通して濾過して粒状物質を除去し、１mg／mlのナト
リウムアジドを含有する50mMトリスHCl, pH8.0 (４℃)
で６倍に稀釈しついでS10Y10カートリッジ(10kDaカット
−オフ) を取付けたアミコン(Amicon)DC20限外濾過装置
内で、１mg／mlのナトリウムアジドを含有する10mM燐酸
ナトリウム、150mM 塩化ナトリウムからなる溶液pH 7.4
（90ｌ）に対して最大圧力下で限外濾過した(diafilte
r) 。限外濾過の終了が近づくにつれて沈澱が生成し
た。
【０２６０】滞留物(2.1mg／mlの全タンパク質、 1.7mg
／mlの生成物）を容量４ｌのネジブタ(screw top) 付ポ
リプロピレン容器内に捕集し、37℃で一夜インキュベー
トした。生成した沈澱をソルバルRC3C遠心分離器内で50
00 rpmで45分間遠心分離することにより除去し、上澄液
を４℃で貯蔵した。
【０２６１】SDS-PAGE及びrpHPLCにより監視した結果か
ら、最終の熱処理中に、混入E.coliタンパク質、生成物
オリゴマー及び分解生成物が選択的に沈澱し、所望の生
成物の約85％が溶解していることが認められた。高度に
富化された、清澄化された熱処理生成物溶液は十分に生
物学的に活性であり、20mg／mlの濃度において37℃で２
週間に亘って安定であり、かつタンパク質加水分解の生
起している証拠は認められず、沈澱の生成は20％以下で
あった。この生成物は更にクロマトグラフィー精製を行
うためのすぐれた中間体である。
【０２６２】参考例11 trp プロモーターを含有する生産ベクターを使用する[M
et-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の調製。 ａ）プラスミドpICI1239（参考例７に記載）を前記した
ごとき方法で緩衝液Ｈ中でEcoRI-Sal I により切断し
た。trp プロモーター、リボソーム結合部位及び[Me
t-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ］hu G-CSFについての遺伝
子を含有する小さいRcoRI-Sal I 断片をジエネクリーン
（商標）を使用して 0.7％アガロースゲルから単離し
た。pICI 0080(比較例６参照) から緩衝液H 中でEcoRI
及びXho I で切断することによりベクター断片を調製し
ついで大きなEcoRI-Xho I 断片をジエネクリーンを使用
して0.7 ％アガロースゲルから単離した。小EcoRI-Sal
I 断片を前記したごとく2:1 よりモル過剰のインサー
ト：ベクターのモル比を使用してEcoRI-Xho I ベクター
断片に連結しついで連結混合物を使用してE.coli菌株MS
D522を形質転換した。テトラサイクリン (15μg/ml) を
含有するL-アガープレート上で生長させるための形質転
換細胞(transformant)を選択した。３個のコロニーを選
択し、補充剤(supplement)とテトラサイクリン (15μg/
ml) を含有するM9最小培地(75ml)中で37℃で20時間往復
振盪器上で生長させた。全細胞溶解物のクーマシーブル
染色SDS-PAGEゲルを走査することにより、タンパク質の
蓄積(protein accumulation)を測定した。３つのコロニ
ーの全てが[Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ］hu G-CSFを
発現した。これらのコロニーの一つからのプラスミドDN
A は指定されたpICI1327であり、プロモーターと遺伝子
の配列を前記した標準チェインターミネーター法により
確認した。
【０２６３】ｂ）発 酵 pICI1327をE.coli菌株MSD522に形質転換させ、得られた
組換え体を精製し、グリセリンストック上に−80℃で保
持した。培養株のアリコートをストックから取り出し、
テトラサイクリンのアガープレート上でストリークし
て、37℃で一夜生長させた後、単一コロニーを分離し
た。単一の所望のコロニーを取り出しついで10mlのテト
ラサイクリンブロスに再懸濁させついで直ちに 100μl
を75mlのテトラサイクリンブロスを含有する容量250ml
の３個のエルレンマイヤーフラスコの各々に接種した。
37℃で16時間往復振盪器上で生成させた後、フラスコの
内容物をプールし、20L 増殖培地を含有する発酵器に接
種するのに使用した。増殖培地の組成 蒸留水を用いて調製 g/l KH2 PO4 3.0 Na2 HPO 4 6.0 NaCl 0.5 カゼイン加水分解物（Oxoid L41) 2.0 (NH 4 ) 2 SO4 10.00 酵母エキス（Difco) 10.00 グリセリン 35.00 Ｌ−ロイシン 0.625 MgSO4 ・ 7H2 O 0.5 CaCl2 ・ 2H2 O 0.03 チアミン 0.008 FeSO4 ／クエン酸 0.04/0.02 微量元素溶液（TES ） 0.5 ml ｌ-1 テトラサイクリン 10 mg ｌ-1 ついで発酵を37℃の温度でかつ6M水酸化ナトリウム溶液
を自動的に添加することによって制御されている、6.7
のpHで行った。溶解酸素張力（dissolvedoxygen tensio
n) (dOT) の設定点は50％空気飽和率(air saturation)
であり、発酵器の攪拌速度を自動調節することにより当
初に制御した。１分当り、容量当り、１容量(VVM) に相
当する発酵器への空気流率を当初の20ｌ／分から、発酵
器攪拌速度がその最大値の80〜90％に到達したとき、50
ｌ／分(2.5VVM)に増大させた。発酵器の酸素移行速度(o
xygen transfer rate) (OTR)は、記載される条件下で50
のOD550 に相当する細胞濃度(cell density)より大きい
細胞濃度においては、バクテリアの酸素吸収速度(oxyge
n uptake rate) (OUR)を満足させることができないの
で、この細胞濃度より大きい細胞濃度における発酵器内
のdOT は、バクテリアの酸素吸収速度を制限することに
より、50％の空気飽和率に保持した。これは培地を炭素
が50のOD550 に制限されるように調製しついで制限炭素
源(limiting carbon source)の栄養(feed)を硫酸アンモ
ニウム及び酵母エキスと共に、バクテリアの生長を制限
する速度で供給することにより達成した。
【０２６４】発酵は18時間行い、この間に光学密度 (OD
550 ）、細胞の乾燥重量及び細胞内の[Met-1,Arg11,Ser
17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の蓄積を測定するためのサン
プル採取した。[Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-
CSF の蓄積は、当業者に周知のごとく、試料バクテリア
の全細胞溶解物(lysate)のクーマシーブルー染色SDS-PA
GEゲルを走査することにより測定した。OD550 が35に到
達したとき(8.5時間）、カゼイン加水分解物溶液（100g
／ｌのOxzoid L41）を0.75g/l/時の割合で発酵器に注入
した。
【０２６５】OD550 が約50に到達したとき、発酵バッケ
中の炭素源の供給物が消費され、dOT が50％空気飽和率
から急速に上昇した。この時点で、グリセリン（470g／
l)、酵母エキス（118g／l)及び硫酸アンモニウム（118g
／l)を含有する栄養を、元の速度で発酵器に供給しつい
で発酵器を最大値の約70〜80％で攪拌しながら、dOT を
50％空気飽和率に保持した。カゼイン加水分解物供給率
は全体を通じて0.75g/l/時に保持した。約18時間後、培
養液の顕微鏡検査により大部分の細胞内に大きな封入体
(inclusion body)の存在が認められたとき、バクテリア
をソルバル(Sorval)RC3B遠心分離器上で捕集し(7000g、
30分、４℃）、−80℃で冷凍して保存した。
【０２６６】ｃ）精 製 精製は参考例３(f) に記載したごとき方法で行った。
【０２６７】参考例12 TA3 プロモーターを含有する生産ベクターを使用する[M
et-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の調製。 ａ）T7A3プロモーター、trp リーダーリボソーム結合部
位配列及び[Met-1,Ser17,27 ］hu G-CSFについての遺伝
子を含有するEcoRI-SalI断片を、参考例３のｄ）で述べ
たごとくM 13mp18中にサブ−クローンした。EcoRI-SalI
断片の塩基配列はSEQ ID No47 及び図４及び図５に記載
されており、SEQ ID No47 はEcoRI制限部位（ヌクレオ
チド１〜６）、バクテリオファージT7のA3プロモーター
配列（ヌクレオチド７〜52）、trp リーダーリボソーム
結合部位配列（ヌクレオチド53-78)及び翻訳開始コド
ン、（ヌクレオチド79-81)からなる。図４及び図５には
SalI制限部位で終結する[Met-1,Ser17,27 ］ヒトG-CSF
のヌクレオチド配列が記載されている。SEQ ID No47 の
３′末端ATG コドンは、図４及び図５においてスレオニ
ン（アミノ酸１）をコードする ACTコドンの直前にある
ことは理解されるであろう。従って５′ヌクレオチド配
列AATTCAGTはEcoRI-SalI断片から欠けている。EcoRI-Sa
lI断片はpICI1295から切り出し(excision)によっても調
製し得る（参考例31参照）。特定部位の突然変異誘発
（site-directed mutagenesis)を、オリゴヌクレオチド
SEQ IDNo 28 を使用して参考例６に記載されるごとき一
重鎖DNA について行って、11位のGln をArg に転化し
た。二重鎖RF DNAは、 Gln11→ Arg11変異を含有するプ
ラークから、工程Ｂ３においてインキュベーションを５
時間の代りに３時間行ったこと以外、参考例７に記載と
同一の方法で調製しついでRcoRI(前記したもの）及びSn
aBI(参考例13に記載）で切断した。かく得られた、T7A3
プロモーター、trpリーダーリボソーム結合部位配列及
び Arg11コドンを有する遺伝子断片を含有する144bp Ec
oRI-SnaBI 断片を単離しついでpICI 1327 からのEcoRI-
SnaBI 切断ベクター（これは Ser60及び Ser65について
のコドンを含有しており、参考例11に記載されている）
に連結した。連結混合物を使用してE.Coli菌株MSD522及
びテトラサイクリン（15μg/mg）を含有するＬ−アガー
プレート上での生長のために選択された形質転換細胞を
形質転換した。所期のT7A3プロモーター及び[Met-1,Arg
11,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF 遺伝子配列を含有する
コロニーからのプラスミドDNA を、単離されたプラスミ
ドと指定のpICI 1386 からのDNA の塩基配列決定によっ
て同定した。
【０２６８】発酵は異る２種の方法(b) 及び(C) に従っ
て行った。方法(b) は37℃で行い、16時間発酵後におい
ては微生物バイオマス（micrabial biomass)は 35g／l
であり、[Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF は
発酵ブロス（fermentationbroth ）１ｌ当り７ｇまで蓄
積されていることが認められた。方法(C) は30℃で行
い、従って、発酵温度が低いため、発酵はより遅かっ
た。方法(C) については、35時間後、微生物バイオマス
は 55g/lであり、[Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ］ヒト
G-CSF の収量は発酵ブロス１ｌ当り15ｇまで蓄積されて
いることが認められた。 ｂ）E.coli Genetic Stock Center から入手されたE.co
li菌株CGCS 6300(遺伝子型 F- ,X- ,lac+ ) をプラスミ
ドpICI 1386 で形質転換した。得られた菌株CGCS6300(p
ICI 1386)を精製し、グリセリンストック中に−80℃で
保持した。培養株のアリコートをストックから取り出し
ついでL-テトラサイクリンのアガープレート上でストリ
ークし、37℃で一夜（16時間）生長後、単一コロニーを
単離した。
【０２６９】CGSC 6300(pICI 1386)の単一コロニーを取
出し、10mlのＬ−テトラサイクリンブロス中に再懸濁さ
せ、その 100μl を75mlのＬ−テトラサイクリンブロス
を含有する20個の250 mlエルレンマイヤーフラスコの各
々に接種した。往復振盪器上で37℃で16時間生長後、フ
ラスコの内容物をプールし、20ｌの変性LCM50 増殖培地
を含有する発酵器に接種した。増殖培地の組成を表１に
示す。
【０２７０】 表１ 増殖培地の組成 変性LCM50 増殖培地(A) 蒸留水を用いて調製 g/l KH2 PO4 3.0 Na2 HPO 4 6.0 NaCl 0.5 カゼイン加水分解物（Oxoid L41) 2.0 (NH 4 ) 2 SO4 10.0 酵母エキス（Difco) 20.0 グリセリン 35.0 MgSO4 ・7H2 O 0.5 CaCl2 ・2H2 O 0.03 チアミン 0.008 FeSO4 ／クエン酸 0.04/0.02 微量元素溶液（TES) (0.5ml/l) テトラサイクリン (10ml/l) ついで発酵を37℃の温度でかつ6M水酸化ナトリウム溶液
を自動的に添加することによって制御されている、6.7
のpHで行った。溶解酸素張力(dOT）の設定点は50％空気
飽和率であり、当初、発酵器の攪拌速度を自動調節する
ことにより制御した。１分当り、容量当り、１容量(VV
M) に相当する発酵器への空気流率を当初の20l/分か
ら、発酵器攪拌速度がその最大値（1000rpm)に到達した
とき、45l/分(2.5VVM)に増大させた。発酵は16時間行
い、その間に培養液の光学密度 (OD550 ）、バイオマス
濃度、全微生物タンパク濃度及びバクテリア細胞内の[M
et-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の蓄積を測定
するためのサンプルを採取した。G-CSF の蓄積の測定は
当業者に周知のごとく試料バクテリアの全細胞溶解物の
クーマシーブルー染色SDS-PAGEゲルを走査することによ
り行った。全微生物タンパク質はlowry の方法で測定し
た。接種してから4.5 時間後に、酵母エキス(225g/l)を
1.7g/l/時の割合で発酵器に注入した。
【０２７１】増殖培地中の炭素源（グリセリン）の供給
物が消費されたとき、dOT が50％空気飽和率から急速に
上昇した。この時点で、グリセリン（714g／l)及び硫酸
アンモニウム（143g／l)を含有する栄養（feed）を注入
した。バクテリア酸素吸収速度(OUR) は、バッチ増殖培
地中の炭素源が消費される直前に、発酵器の最大酸素移
行速度(OTR) に接近したので、バクテリアのOUR を発酵
器の最大OTR の約80〜90％に制限する速度で栄養を発酵
器に注入した。供給速度を手動的に調節して元の値にも
どしついでdOT を記載された条件下で50％空気飽和率に
保持した。
【０２７２】ｃ）30℃で35時間、発酵を行ったこと以
外、ｂ）と同一の方法を繰返した。発酵温度を30℃とし
たこと以外、培地及び発酵条件は(b) と同一であった。
【０２７３】精製は参考例３(f) に記載の方法で行っ
た。
【０２７４】参考例13 Ａ）[Met-1,Ser17］ヒトG-CSF の調製。 下記の操作を行ったこと以外、[Met-1,Ser17,27 ］ヒト
G-CSF を調製するための参考例５で述べたものと同一の
方法を繰返した： １） 燐酸化するための重復体をオリゴヌクレオチド配
列SEQ ID NO24, 25,３及び４から調製した；オリゴヌク
レオチド配列SEQ ID NO ３及び４は、それぞれ、参考例
３、４及び５で使用した配列SEQ ID NO 26及び27の代り
に使用した。 ２） １）で述べた重復体をT4ポリヌクレチドキナーゼ
で燐酸化したが、１xM緩衝液（BC; 30μl)中で37℃で２
時間、SnaBI(10単位）を使用して切断した。 ３） エタノールを用いて精製した後、143bpEcoRI-Mst
IIフラグメント断片の代りに、72bpEcoRI-SnaBI 断片を
精製した。 ４） 合成EcoRI-SnaBI 断片を参考例１に記載した方法
でプラスミドベクターpAG88 中にクローンしそしてベク
ターを調製するために、pAG88 を１xH緩衝液中のMstII
の代りに１xM緩衝液（BCL; 100μl)中のSnaBI(20単位;
BCL)を使用して切断した。 ５） エタノールを使用して精製した後、大きなEcoRI-
MstII 断片の代りに大きなEcoRI-SnaBI 断片を１％アガ
ロースゲル上で精製した。 ６） [Met-1,Ser17］ヒトG-CSF についての遺伝子を含
有するプラスミドをpICI 1105 と命名した。
【０２７５】Ｂ．メチルポリエチレングリコール5000で
変性した[Met-1,Ser17］ヒトG-CSF の調製 水中の[Met-1,Ser17］ヒトG-CSF の溶液(300mg, 6.25mg
/l）を1.1M硼酸ナトリウム，pH 8.9を用いて75mlに稀釈
して0.4 Ｍ硼酸液中のタンパク質の溶液（４mg／ml）を
得た。この溶液にメチルポリエチレングリコール p-ニ
トロフェニルカーボネート（MW＝約5000）（Sigma Chem
icals)の水溶液（75ml）（タンパク質１モル当り、100
当量；アミノ基１個当り、20当量）を攪拌しながら滴下
した。反応混合物を室温で３時間攪拌しついでエタノー
ルアミン塩酸塩、pH8(活性化メチルポリエチレングリコ
ール１モル当り、10当量）を滴下することにより反応を
停止した。反応混合物を0.1M炭素水素アンモニウム，pH
8で350 mlに稀釈しついで濃縮しついでYM30膜（MWカッ
トオフ30kDa)を取付けたアミコン攪拌セル中で、黄色が
残留しなくなるまで上記溶剤で稀釈した。最終濃縮液
（25ml）を平衡化されたウルトロゲルACA54 のカラム(5
×90cm）上でクロマトグラフィーにかけ、PBS-アジドで
溶離した。280nm でのタンパク質とメチルポリエチレン
グリコールを沃素／沃化カリウム滴定によって監視する
ことにより、変性プロテインを含有するフラクションを
同定し、プールしついで水に対して徹底的に透析した。
この生成物をアミコンYM30膜（MWカットオフ 30kDa）上
で濃縮し、無菌状態で0.22μフィルターを通して濾過し
ついで後に使用するため、４℃で保存した。
【０２７６】最終変性生成物についてのSDS-PAGEは未反
応の[Met-1,Ser17］ヒトG-CSF が残留していないことを
示した；全ての生成物は高分子量ストリークとして行動
する。残留液と濾液について沃素／沃化カリウムを使用
して行った分析の結果は、YM30膜上でのpH 8.0で限外濾
過を反復することにより、タンパク質を結合していない
メチルポリエチレングリコールの全てが効果的に除去さ
れることを示した。最終生成物はタンパク質１モル当
り、共有結合したメチルポリエチレングリコールを約3.
5 モル含有していた。未変性誘導体の比活性 0.8×109
U/mgは変性生成物については 0.8×108 U/mg（10％）に
低下していた。生成物は完全に安定であり、10mg/ml(タ
ンパク質による）までの溶解状態で、37℃で14日間、比
活性は変化を示さなかった。
【０２７７】参考例14 メチルポリエチレングリコール5000で変性された[Me
t-1,Arg11,23 ,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の調製 Ａ．[Met-1,Arg11,23 ,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の
調製。 [Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65］ヒトG-CSF についての
遺伝子を含有する突然変異鋳型M13mp18 を、pICI 1080
の代りにプラスミドpICI 1239 を使用して参考例３(d)
に述べた方法によって調製した。上記の突然変異鋳型と
突然変異誘発オリゴヌクレオチドとしての、指定のSEQI
D No 38を使用して、参考例７の方法を繰返した。この
オリゴヌクレオチドは23位のLyS についてのコドンをAr
g に変換する作用をする。二重鎖RF DNAを所望の変異を
含有する一つのファージから調製し、そして参考例15
（後記参照）に記載の方法に従って発現カセットを単離
しついでクローンしてpICI 1388 を得た。標題化合物を
得るために、更に、参考例３及び４に記載の方法を行っ
た。
【０２７８】Ｂ．メチルポリエチレングリコール5000で
変性された[Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65］ヒトG-CSF
の調製。 0.1M硼酸ナトリウム, pH8.0 中の[Met-1,Arg11,23 ,Ser
17,27,60,65 ］ヒトG-CSF(300mg)の溶液をアミコンYM10
膜（MWカットオフ10kDa)上での限外濾過により37.5mlに
濃縮した。この溶液に等容量の0.8M硼酸ナトリウム(pH
8.8) を添加しついでMW＝約5000のメチルポリエチレン
グリコール p-ニトロフェニルカーボネート(sigma Che
micals社製）（[Met-1,Arg11,23 ,Ser17,27,60,65 ］ヒ
トG-CSF １モル当り100 等量）を水（75ml）に溶解して
添加した。穏やかに攪拌しながら20℃で３時間反応を行
いついで1Mエタノールアミン塩酸塩pH8.0(15ml，活性化
メチルポリエチレングリコール１モル当り、10等量）を
添加することにより反応を停止した。0.1M炭酸水素アン
モニウムを添加することにより反応混合物を500 mlに稀
釈しついでSIY30 膜（MWカットオフ30kDa)を取付けたア
ミコンCH2A-IS スパイラルカートリッジシステムを使用
して、黄色ｐ−ニトロフェノールが残留液(retentate）
中に認められなくなるまで、10l の同一の緩衝液に対し
て透析濾過(diafilter）した。残留液を約300ml に濃縮
しついでYM30膜（MWカットオフ30kDa)を取付けたアミコ
ン8400攪拌セル中に装入した。残留液を50mlに濃縮しつ
いで0.1M炭酸水素アンモニウム，pH 8.0を用いて300 ml
に再稀釈した。この操作を４回繰返しそして生成物を最
後に約25mlに濃縮した。濃縮物溶液を１mg／mlのナトリ
ウムアジド（PBS-アジド）を含有する10mM燐酸ナトリウ
ム， 150mM塩化ナトリウム，pH 7.1で平衡化したウルト
ロゲルACA 54のカラム(5×90cm）上でクロマトグラフィ
ーにかけた。変性タンパク質を含有するフラクション
を、沃素／沃化カリウム滴定(CR Acad. Sci. Paris 27
4, 1617, 1972）により280 nmにおけるタンパク質とメ
チルポリエチングリコールを監視することによって同定
し、プールしついで水に対して徹底的に透析した。最終
生成物をアミコンYM30膜上で限外濾過し、無菌状態で0.
22μm フィルターを通して濾過しついで後に使用するた
めに４℃で貯蔵した。
【０２７９】最終変性生成物についてのSDS-PAGEは未変
性の[Met-1,Arg11,23 ,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF は
残留していないことを示した；全ての生成物は高いMWス
トリーク(high MW streak)として行動する。沃素／沃化
カリウム滴定による濾液と残留液の分析結果は、YM30膜
（MWカットオフ30kDa)上でpH 8.0で透析濾過を反復する
ことにより、タンパク質非結合メチルポリエチレングリ
コールの全てが効果的に除去されることを示した。最終
生成物はタンパク質１モル当り、共有結合したメチルポ
リエチレングリコールを約3.5 モル含有していた。非変
性誘導体の比活性、 2.5×109 U/mgは、変性生成物にお
いては 3.5×108 U/mg（14％）に低下していた。この生
成物は完全に安定であり、10mg/ml(タンパク質による）
までにおいて、溶解した状態で、37℃で14日間に亘って
比活性に変化は認められなかった。
【０２８０】参考例15 メチルポリエチレングリコール5000で変性された[Me
t-1,Glu15,Ala26,28 ,Arg30］ヒトG-CSF の調製 Ａ）[Met-1,Glu15,Ser17,27 ,Arg30］ヒトG-CSF の調
製。 [Met-1,Glu15,Ser17,27 ,Ala26,28 ,Lys30］ヒトG-CSF
についての遺伝子を含有する突然変異鋳型M13mp18 を、
pICI1080の代りにプラスミドpICI1266を使用して参考例
３(d) に述べた方法によって調製した。上記の突然変異
誘発鋳型と突然変異誘発オリコヌクレオチドとしての、
指定のSEQ ID No 37を使用して、参考例7 に記載の方法
を繰返した。このオリゴヌクレオチドは30位のLysにつ
いてのコドンをArg に変換する作用を有する。二重鎖RF
DNAを所望の変異を含有する一つのファージから調製し
た。参考例11に記載の方法に従ってEcoRI-SalI発現カセ
ットを単離し、pICI0080中にクローンしてpICI11343 を
得た。標題化合物を得るために、更に参考例７の方法を
行い、精製は参考例８に記載の方法で行った。 Ｂ）メチルポリエチレングリコール5000で変性された[M
et-1,Glu15,Ala26,28 ,Ser17,27 ,Arg30］ヒトG-CSF の
調製。 この化合物は参考例14に記載の方法で調製した。最終生
成物は共有結合されたメチルポリエチレングリコールを
タンパク質１モル当り、約４モル含有していた。未変性
誘導体の比活性 0.9×109 U/mgは変性生成物においては
0.6×108 U/mg（７％）に低下していた。生成物は完全
に安定であり、10mg／ml（タンパク質による）までの溶
解状態において、37℃で14日間、比活性変化を示さなか
った。
【０２８１】参考例16 メチルポリエチレングリコール5000で変性された[Me
t-1,Ser17,27,115,116 ,Glu111 ］ヒトG-CSF の調製。 参考例３又は５で述べたごとき[Met-1,Ser17,27 ］G-CS
F についての遺伝子を含有する突然変異鋳型M13mp18 を
使用して参考例７で述べた方法を繰返した。使用した突
然変異誘発オリゴヌクレオチドは、指定のSEQ ID No 30
（後に定義）である。
【０２８２】トリプレットGCT は116 位のThr をSer に
転化する作用を行い、トリプレットAGA は115 位のThr
をSer に転化する作用を行いそしてトリップレットTTC
は111 位のAla をGlu に転化する作用を行う。突然変異
誘発法(mutagenesis）は参考例７に述べたものと実質的
と同一であり、発現カセットを発現プラスミドに転移さ
せて（transfer）pICI 1243 を得た。発酵と精製は参考
例３及び４に述べたものと同一の方法で行った。
【０２８３】Ｂ）メチルポリエチレングリコール5000で
変性された[Met-1,Ser17,27,115,116 ,Glu111 ］ヒトG-
CSF の調製 この化合物は参考例14に記載の方法で調製した。最終生
成物は共有結合されたメチルポリエチレングリコールを
タンパク質１モル当り、約４モル含有していた。未変性
誘導体の比活性 0.7×109 U/mgは変性化合物においては
0.8×108 U/mg（11％）に低下していた。この化合物は
完全に安定であり、10mg／ml（タンパク質による）まで
の溶解状態において、37℃で14日間、比活性は変化を示
さなかった。
【０２８４】参考例17 メチルポリエチレングリコール5000で変性された[Me
t-1,Arg11,165,Ser17,27 ,Lys58］ヒトG-CSF の調製。 Ａ）[Met-1,Arg11,Ser17,27 ,Lys58,Arg165 ］ヒトG-CS
F の調製。 参考例３又は５で述べたごとき[Met-1,Ser17,27 ］ヒト
G-CSF についての遺伝子を含有する突然変異誘発鋳型M1
3mp18 を使用して参考例７で述べた方法を繰返した。使
用した突然変異誘発オリゴヌクレオチドは指定のSEQ ID
No 28, SEQ IDNo 31 及びSEQ ID No32 （後に定義）で
ある。
【０２８５】SEQ ID No.31中のトリプレットTTT は58位
のTrp をLys に転化する作用を行いそしてSEQ ID No 32
においては第２のGCG トリプレットは165 位のTyr を A
rgに転化する作用を行う。
【０２８６】突然変異誘発操作は、当初、参考例６で述
べたごとき突然変異誘発オリゴヌクレオチドとしてSEQ
ID No 31及びSEQ ID No 32を使用して二重プライミング
実験（double priming experiment ）として行った。こ
れによって２個のプラークが得られ、その両者がSEQ ID
No 32変異(Tyr165Arg）を有していたが、SEQ ID No31
変異を有していなかった。一重鎖DNA を参考例３で述べ
たことき方法で３個のプラークの１つから調製した。こ
のDNA を、突然変異誘発プライマーとしてSEQID No 28
及びSEQ ID No 31を使用する二重プライミング突然変
異誘発における突然変異鋳型として使用した。これによ
って２個のプラークが得られその一つは組込まれる変異
の完全なセットを有しており、この発現カセットを発現
プラスミドに転移させてpICI 1246 を得た。発酵と精製
は参考例３及び４で述べたものと同一の方法で行った。
【０２８７】Ｂ）メチルポリエチレングリコール5000で
変性された[Met-1,Arg11,165,Ser17,27 ,Lys58］ヒトG-
CSF の調製。 この化合物は参考例14に記載の方法で調製した。最終生
成物は共有結合されたメチルポリエチレングリコールを
タンパク質１モル当り、約4.5 モル含有していた。未変
性誘導体の比活性 0.8×109 U/mgは変性生成物において
は 0.1×109 U/mg（13％）に低下していた。この化合物
は完全に安定であり、10mg/ml(タンパク質による）まで
の溶解状態において37℃で14日間、比活性は変化を示さ
なかった。
【０２８８】参考例18 メチルポリエチレングリコール5000で変性された[Me
t-1,Ser17,27 ,Ala44,51,55,Lys49,58 ］ヒトG-CSF の
調製。 Ａ）[Met-1,Ser17,27 ,Ala44,51,55,Lys49,58 ］ヒトG-
CSF の調製。 参考例３又は５に記載したごとき[Met-1,Ser17,27］G-C
SF についての遺伝子を含有する突然変異鋳型M13mp18
を使用して実施例３に述べた方法を繰返した。使用した
突然変異誘発オリゴヌクレオチドは指定のSEQ ID No35
及びSEQ ID No36（後に定義）である。
【０２８９】SEQ ID No.35においては、トリップレット
AGC は51位のGly をAla に、また、44位のPro をAla に
転化する作用を行い、トリプレットTTT は49位のLeu を
Lysに転化する作用をする。SED ID No 36においては、
トリプレットTTT は58位のTrp をLys に転化する作用を
行い、第２のAGC トリプレットは55位のGly をAlnに転
化する作用を行う。
【０２９０】突然変異誘発は参考例６で述べたごとき二
重プライミング実験として行った。これによって16個の
プラークが得られた。８個のプラークは参考例７で述べ
たごときDNA 塩基配列決定によりスクリーンした。全て
のプラークがSEQ ID No 36変異(Gyl55 Ala, Trp58 Lys)
を有していたが、いずれもSEQ ID No.35変異を有してい
なかった。参考例３(d) に記載の方法に従ってこれらの
プラークの一から一重鎖DNA を調製し、突然変異誘発プ
ライマーとしてSEQ ID No 35を使用する単一プライミン
グ突然変異誘発における突然変異鋳型として使用した。
これによって50個のプラークが得られ、その中の３個を
DNA 塩基配列決定によりスクリーンし、２個は変異の完
全なセットを有していた。発現カセットを発現プラスミ
ドに転移させてpICI1297 を得た。発酵と精製は実施例
参考例３及び４に記載の方法で行った。
【０２９１】Ｂ）メチルポリエチレングリコール5000で
変性された[Met-1,Ser17,27 ,Ala44,51,55,Lys49,58 ］
ヒトG-CSF の調製。 この化合物は参考例14に記載の方法で調製した。最終生
成物は共有結合されたメチルポリエチレングリコールを
タンパク質１モル当り、約3.5 モル含有していた。未変
性誘導体の比活性0.75×109 U/mgは変性生成物において
は0.32×109 U/mg（47％) に低下していた。この化合物
は完全に安定であり、10mg／ml（タンパク質による）ま
での溶解状態において37℃で14日間、比活性は変化を示
さなかった。
【０２９２】参考例19 メチルポリエチレングリコール5000で変性された[Me
t-1,Aer11,16 ,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の調製。 Ａ）[Met-1,Arg11,16 ,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の
調製。 オリゴヌクレオチドとして、指定のSEQ ID No.38の代り
にSEQ ID No.42（これは16位のLys についてのコドンを
Arg に転化する作用を行う）を使用して参考例14に記載
の方法を繰返してpICI 1387 を得た。[Met-1,Ar
g11,16 ,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF を得るための他
の工程及びこの化合物の精製は参考例３及び４に記載の
方法で行った。
【０２９３】メチルポリエチレングリコール5000で変性
された[Met-1,Arg11,16 ,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF
の調製。 このタンパク質は参考例４に記載される精製法の最終工
程で水に対して徹底的に透析したとき、沈澱した。沈澱
を0.1M硼酸ナトリウムpH 8.0に溶解しついで参考例14に
記載の方法によりメチルポリエチレングリコール5000で
変性した。最終生成物は共有結合されたメチルポリエチ
レングリコールをタンパク質１モル当り、約3.5 モル含
有していた。未変性誘導体の比活性2.3 ×109 U/mgは変
性生成物においては3.6 ×108 U/mg（16％）に低下して
いた。この化合物は完全に安定であり、10mg／ml（タン
パク質による）までの溶解状態において37℃で14日間、
比活性は変化を示さなかった。
【０２９４】参考例20 メチルポリエチレングリコール5000で変性された[Me
t-1,Arg11,34 ,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の調製。 Ａ）[Met-1,Arg11,34 ,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の
調製。 オリゴヌクレオチドとして、指定のSEQ ID No.38の代り
に、SEQ ID No.39（これは34位の Lysについてのコドン
を Argに転化する作用をする）を使用して参考例14の方
法を繰返して、pICI 1389 を得た。標題化合物を得るた
めの他の工程及びこの化合物の精製は参考例３及び４に
記載の方法で行った。
【０２９５】Ｂ）メチルポリエチレングリコール5000で
変性された[Met-1,Arg11,34 ,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-
CSF の調製。 この化合物は参考例14に記載の方法で調製した。最終生
成物は共有結合されたメチルポリエチレングリコールを
タンパク質１モル当り、約４モル含有していた。未変性
誘導体の比活性 1.4×109 U/mgは変性生成物においては
2.0×108 U/mg（14％) に低下していた。この化合物は
完全に安定であり、10mg／ml（タンパク質による）まで
の溶解状態において37℃で14日間、比活性は変化を示さ
なかった。
【０２９６】参考例21 Ａ）メチルポリエチレングリコール5000で変性された[M
et-1,Arg11,40 ,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の調製。 Ａ）[Met-1,Arg11,40 ,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の
調製。 オリゴヌクレオチドSEQ ID No.38の代りに、SEQ ID No.
40（これは40位のLysについてのコドンをArg に転化す
る作用を有する）を使用して参考例14の方法を繰返して
pICI 1930 を得た。標題化合物を得るための他の工程及
びこの化合物の精製は参考例３及び４に記載の方法で行
った。
【０２９７】Ｂ）メチルポリエチレングリコール5000で
変性された[Met-1,Arg11,40 ,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-
CSF の調製。 この化合物は参考例14に記載の方法で調製した。最終生
成物は共有結合されたメチルポリエチレングリコールを
タンパク質１モル当り、約４モル含有していた。未変性
誘導体の比活性 1.3×109 U/mgは変性生成物においては
3.0×108 U/mg（32％）に低下していた。この化合物は
完全に安定であり、10mg/ml （タンパク質による）まで
の溶解状態において37℃で14日間、比活性は変化を示さ
なかった。
【０２９８】参考例22 メチルポリエチレングリコール5000で変性された[Me
t-1,Ala1 ,Thr3 ,Tyr4 ,Arg5,11,Ser17,27,60,65 ］ヒ
トG-CSF の調製。 オリゴヌクレオチドSEQ ID No.38の代りにSEQ IDNo.41
（これは１，３，４及び５位のThr, Leu,Gly及び Proに
ついてのコドンを、それぞれ、Ala, Thr, Try及び Arg
に転化する作用を有する）を使用して参考例14の方法を
繰返して、pICI1391 を得た。
【０２９９】この実施例のポリペプチドは本発明の修飾
は既知のポリペプチドの溶液安定性を改善するために、
G-CSF 活性を有する既知のポリペプチドに適用し得るこ
とを示している。既知のポリペプチドは[Met-1,Ala1 ,T
hr3 ,Tyr4 ,Arg5 ,Ser17］huG-CSF であり、これは欧州
特許公開第272,703 号公報（協和醗酵化学工業）に記載
されている。標題化合物を得るための他の工程及び標題
化合物の精製は参考例３及び４に記載の方法で行った。
【０３００】メチルポリエチレングリコール5000で変性
された[Met-1,Ala1 ,Thr3 ,Tyr4 ,Arg5,11,Ser
17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の調製。 この化合物は参考例14に記載の方法で調製した。最終生
成物は共有結合されたメチルポリエチレングリコールを
タンパク質１モル当り、約４モル含有していた。未変性
誘導体の比活性 1.5×109 U/mgは変性生成物においては
2.0×108 U/mg（14％）に低下していた。この化合物は
完全に安定であり、10mg／ml（タンパク質による）まで
の溶解状態において37℃で14日間、比活性は変化を示さ
なかった。
【０３０１】参考例23 メチルポリエチレングリコール2000で変性された[Me
t-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の調製。 ａ）メチルポリエチレングリコール p-ニトロフェニル
カーボネート、近似MW2000の調製。
【０３０２】アセトニトリル(250ml）中のp-ニトロフェ
ニルクロロホルメート(2.32g, 11.5ミリモル）の溶液
に、攪拌しながら０〜５℃でメチルポリエチレングリコ
ール、平均分子量2000（Sigma Chemicals )(20g, 10 ミ
リモル）を添加しついでトリエチルアミン（1.11g, 1.5
3 ml, 11ミリモル）を滴下した。混合物を室温まで昇温
させ、20℃で24時間攪拌した。沈澱したトリエチルアミ
ン塩酸塩（0.46g, 理論値1.375g）を濾過により除去
し、濾液を１ｌジエチルエーテル（無水）で稀釈した
後、０〜５℃で24時間放置した。白色沈澱を濾過により
回収しついで最小容量のエタノールに35〜40℃で溶解し
ついで０℃に冷却することにより再沈澱させた。生成物
をアセトニトリル／ジエチルエーテル（１：５v/v ）か
ら再沈澱させて最終生成物を取得し、これをエーテルで
洗浄しついで真空下で乾燥して白色固体15.5g を得た。
微量分析の実測値はC, 53.5; H, 9.1; N, 0.4; Cl, 0で
あり、生成物中にクロロホルメートが存在しないことを
示している。 ｂ）メチルポリエチレングリコールで変性された[Me
t-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の調製。 PBS-アジド（300ml, 5mg／ml）中の[Met-1,Arg11,Ser
17,27,60,65 ］ヒトG-CSF （1.5g）の溶液を0.4M硼酸ナ
トリウム、pH 8.8(7×7 ｌ）に対して透析して最終容量
375ml （４mg／ml）とした。この溶液に、近似MW2000の
メチルポリエチレングリコール p-ニトロフェニルカー
ボネート(10.0g, 60当量，[Met-1,Arg11,Ser
17,27,60,65 ］ヒトG-CSF 上のアミノ基１個当り12等
量）を攪拌しながら滴下した。穏やかに攪拌しながら室
温で３時間反応させついでエタノール塩酸塩、pH 8.0
（活性化メチルポリエチレングリコール１モル当り、10
当量）を滴下することにより反応を停止させた。反応混
合物をアミコン攪拌セル中のYM10膜（MWカットオフ10 k
Da）上で４℃で濃縮して、最終残留液容量を50mlとし
た。残留液を0.1M炭酸水素アンモニウム、pH 8.0（450
ml）で稀釈しついで前記と同様の方法で50mlに濃縮し
た。この操作を７回繰返した。最終濃縮物をYM30膜（MW
カットオフ30 kDa）を取付けた第２のアミコン攪拌セル
に移送し、500 mlに稀釈しついで50mlに再濃縮した。こ
の操作を２回繰返し、生成物を最終容量の50mlに濃縮し
た。生成物の濃縮溶液を２つの等部分に分けて、PBS-ア
ジドで平衡化したウルトロゲルAcA54 のカラム(5×90c
m）上でクロマトグラフィーにかけた。沃素／沃化カリ
ウム滴定（C. R. Acad. Sci. Paris. 274, 1617, 1972)
により280 nmでのタンパク質とメチルポリエチレングリ
コールを監視することによって、変性タンパク質を含有
するフラクションを同定した。最終水溶液をYM30膜を取
付けたアミコン攪拌セル中で50mlの容量に濃縮した。濃
縮液を水で500 mlの容量まで稀釈し、再濃縮しついでこ
の操作を更に５回繰返した。最終濃縮液を無菌状態で0.
22ミクロンフィルターを通して濾過し、後に使用するた
めに４℃で保存した。
【０３０３】酸加水分解後のアミノ酸分析によるタンパ
ク質の評価結果は、全体として、[Met-1,Arg11,Ser
17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の47％が最終変性生成物中に
回収されていることを示した。３時間後の反応混合物に
ついてのPAGE-SDS及び最終生成物水溶液についてのPAGE
-SDSの結果は未反応タンパク質が存在しないことを示し
た。濾液及び残留液についての沃素／沃化カリウムを用
いる分析結果はYM30膜上での限外濾過を反復することに
より、非タンパク質結合メチルポリエチレングリコール
の実質的に全てが除去されることを示した。このことを
rpC4（Dynamax 300A, 12μ）上でのHPLCによるかつ40〜
90％の濃度勾配のアセトニトリル−水中の0.1 ％TFA-,
0.1 ％TFA を用いる溶離を行うクロマトグラフィー分析
及び単一のピークを与える280nm でのUV吸収の監視を行
うことによって確認した。フラクションを凍結乾燥し、
水中に再溶解しついで沃素／沃化カリウムを用いる分析
による280nm でのタンパク質及びメチルポリエチレング
リコールを監視した；フラクションは１個の一致する
（coincident）ピークを示した。タンパク質非結合メチ
ルポリエチレングリコールは、明瞭な、早期に溶離する
沃素／沃化カリウム・陽性ピークとして検出されるであ
ろう。
【０３０４】メチルポリエチレングリコール2000に共有
結合された[Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ] ヒトG-CSF
の沃素／沃化カリウム分析の結果は変動があり、PEG ：
タンパク比を評価することができない。未変性誘導体の
比活性 1.2×109 U/mgは変性生成物においては、 1.5×
108 U/mg（13％）に低下していた。この化合物は完全に
安定であり、10mg／ml（タンパク質による）までの溶解
状態において37℃で14日間、比活性は変化を示さなかっ
た。
【０３０５】参考例24 メチルポリエチレングリコール750 で変性された[Me
t-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の調製。 ａ）メチルポリエチレングリコール p-ニトロフェニル
カーボネート、近似MW750 の調製。 アセトニトリル（50ml）中のp-ニトロフェニルクロロホ
ルメート（5.1g, 25.3ミリモル）の溶液に０〜５℃で攪
拌しながら、メチルポリエチレングリコール、平均分子
量750(Sigma Chemicals)(20g, 26.67ml)を添加しついで
トリエチルアミン（2.69g, 3.71ml, 26.63ミリモル）を
30分間に亘って滴下した。反応混合物を室温まで昇温さ
せそして８時間攪拌した。沈澱したトリエチルアンモニ
ウムハイドロクロライドを濾過により反応混合物から除
去しついで濾液をジエチルエーテル（無水）（１ｌ）で
稀釈し、４時間で０℃に冷却しついで再び濾過した。全
体で3.4gのトリエチルアンモニウムハイドロクロライド
を捕集した。濾液を減圧下で蒸発させついで真空下で乾
燥させて23.5g の黄色ワックス状固体を得た。微量分析
の実測値においてはClは０％であり、これは生成物中に
クロルギ酸塩が存在しないことを示している。
【０３０６】PBS-アジド（50ml）中の[Met-1,Arg11,Ser
17,27,60,65 ］ヒトG-CSF(250mg)の溶液を水及びついで
0.4M硼酸ナトリウム、pH8.8に対して透析した。最終溶
液（50ml) に室温で攪拌しながらメチルポリエチレング
リコール p-ニトロフェニルカーボネート、近似分子量
750 (100当量、[Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ]G-CSF上
のアミノ基１個当り、20当量）の水溶液（50ml）を滴下
した。反応混合物を室温で３時間攪拌しついでエタノー
ルアミン塩酸塩、pH８（活性化メチルポリエチレングリ
コール１モル当り、10当量）を添加することにより反応
を停止した。
【０３０７】反応混合物をYM10膜（MWカットオフ10kDa
）を取付けたアミコン攪拌セルに移送し、濃縮した。
濃縮液（25ml）を0.1M炭酸水素ナトリウム、pH８で350m
l に稀釈しついで約25mlに濃縮した。この操作を５回繰
返した。最終濃縮液（27ml）を平衡化したウルトロゲル
AcA54 のカラム（５×90cm）上でクロマトグラフィーに
かけ、PBS-アジドで溶離した。変性タンパク質を含有す
るフラクションを、沃素／沃化カリウム滴定により280n
mにおけるタンパク質とメチルポリエチレングリコール
を監視することにより同定し、プールしついで水に対し
て徹底的に透析した。最終生成物をYM10膜を取付けたア
ミコン攪拌セル中で濃縮した。最終濃縮液を無菌状態で
0.2μフィルターを通して濾過しついで後に使用するた
めに４℃で保存した。
【０３０８】酸加水分解後のアミノ酸分析によるタンパ
ク質の評価結果は、全体として、[Met-1,Arg11,Ser
17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の約80％が最終変性生成物中
に回収されていることを示した。生成物についてのPAGE
-SDSの結果は明瞭なバンドを与え、未反応の[Met-1,Arg
11,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF が残留していないこと
を示した。
【０３０９】沃素／沃化カリウムを用いる濾液と残留液
の滴定の結果は、YM10上でpH 8.0で限外濾過を繰返すこ
とにより、非タンパク質結合メチルポリエチレングリコ
ール誘導体の実質的に全てが効果的に除去されることを
示した。メチルポリエチレングリコールに共有結合され
た[Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF の沃素／
沃化カリウム滴定では結果に変動があり、PEG ：タンパ
ク質比を評価することはできなかった。未変性誘導体の
比活性 1.2×109 U/mgは変性生成物においては４×108
U/mg（33％）に低下していた。この化合物は完全に安定
であり、10mg／ml（タンパク質による）までの溶解状態
において、37℃で14日間、比活性は変化を示さなかっ
た。
【０３１０】参考例25 メチルポリエチレングリコールで変性する前のC-GSF の
特性 参考例１，３，７，８及び13〜24の誘導体の水溶液（タ
ンパク質濃度１mg／ml）をアミコンYM10膜上でタンパク
質濃度が少なくとも11mg/ml になるまで濃縮した。濃縮
中の沈澱を防止するために、原料溶液のpHを、最初、約
0.25mMの水酸化ナトリウムを最終濃縮液に添加すること
により8.5 に調整した。濃縮後、溶液のpHは約8.0 に低
下した。
【０３１１】20倍の濃厚燐酸緩衝溶液を添加することに
より、濃縮タンパク質溶液を10mg／mlのタンパク質濃度
（1.0 のＡ280 を与える１mg／ml溶液から評価）に調整
した。10mM燐酸ナトリウム、150mM 塩化ナトリウム、pH
7.4（PBS ）中の、この誘導体の10mg／ml溶液を共通原
液とし、この溶液を用いてタンパク質の均質性（homoge
neity)、同一性、生物学的活性及び溶液安定度を評価し
た。
【０３１２】各誘導体について、減圧下及び非減圧下で
のPAGE-SDS分析及び逆相HPLCにより、少なくとも95％は
一つの成分であることが示された。6N HCl中、110 ℃で
の酸加水分解後に繰返して行ったアミノ酸組成分析によ
り、各誘導体についてのアミノ酸及び原液中のタンパク
質濃度の正確な測定値が得られた。このタンパク質濃度
と、少なくとも６日の異る日に得られた生物学的定量の
平均値を使用して誘導体の比活性を測定した。選択され
た誘導体についてのＮ−末端アミノ酸配列分析（N-term
inal sequence analysis）及びエレクトロスプレイ質量
スペクトル分析（electrospray mass spectrometric an
alysis）により、所期の配列と分子量が得られた。
【０３１３】メチルポリエチレングリコールで変性した
G-CSF 誘導体（参考例１，３，７，８及び13〜24）の原
液（stock solution）を同様に調製して、これらの参考
例で示したデーターを得た。
【０３１４】参考例26 G-CSF 及びその誘導体の溶液安定度 G-CSF 、その誘導体及びメチルポリエチレングリコール
で変性したかかる誘導体を燐酸緩衝液（PBS)に４℃で溶
解して調製した参考例25に記載される原料溶液を適当に
稀釈して得られる稀釈液を溶液安定度について試験し
た。タンパク質をPBS 中に１mg／ml，５mg／ml及び、通
常、10mg／mlの濃度で溶解した溶液を37℃で14日間、イ
ンキュベートした。沈澱の生成について一定の間隔で肉
眼で溶液を検査した。14日後に各々の溶液を14,000rpm
で20分間遠心分離し、上澄液を傾シャにより除去し、得
られたペレットを１重量／容量％のN-ラウロイルサルコ
シンを含有する PBSに再溶解させた。各々の上澄液及び
再溶解した沈澱物中の全蛋白質含量はＡ280 測定法によ
り評価し、未変性G-CSF 及びその誘導体中の単量体含量
は逆相HPLCにより評価した。これらの測定値はインキュ
ベーションの開始時の溶液及び４℃で14日間インキュベ
ートした１mg／ml溶液により与えられた対応のデータの
百分率として表わした。全蛋白質の評価値と単量体の評
価値との間の偏差（variation)は再溶解したペレットの
若干においてのみ見出された。かくして、各々の当初の
濃度から上澄み液に溶解して残留する蛋白質の割合を決
定し得る。
【０３１５】メチルポリエチレングリコールで変性した
後においては、参考例１，３，７，８及び13〜24に記載
したごとく G-CSF及び全ての誘導体は10mg／mlまでの濃
度で完全な溶液安定度を示した。インキュベーション後
の各上澄液中の生成物の比活性は原料溶液と同一であ
り、還元条件下及び非還元条件下でのPAGE-SDSについて
差異は認められなかった。
【０３１６】参考例27 生物学的定量 １）G-CSF の生物学的定量 英国パターソン研究所（Paterson Institute）から入手
した因子依存性細胞系、パターソン(Paterson)-G-CSF(F
DCP-G)をG-CSF の存在下に限界希釈法によりクローン化
した。クローンE7と呼ばれる G-CSF応答クローンを使用
してヒト組換え体G-CSF 活性を測定した。 100μl のRP
MI 1640 ＋10％FCS に入れた 2.5×103 FDCP-Gクローン
E7細胞を、G-CSF を含有する等容量のRPMI 1640 ＋10％
FCS に添加した。各々のG-CSF 試料は10回の倍加希釈に
よって測定した。96個のウェルを有する微量滴定板の各
々のウェル中のRPMI 1640 ［Moore GE等のJAMA 199 519
(1967)参照］＋10％FCS （子牛胎児の血清）の最終容量
は 200μl であった。微量滴定板を調湿インキュベータ
ー中で４日間５％CO2中で37℃でインキュベートした。
ウェル１個当りに1.0 μCiの滴定したチミジンを添加
し、最後に６時間に亘ってインキュベートした。細胞を
ガラス繊維の濾紙上に採取し、放射能の濃度は液体シン
チレーション計数によって測定した。滴定したチミジン
組込みの濃度は存在するG-CSF の量に正比例することが
見出された。FDCP-GクローンE7の検定は蛋白質１mg当り
108 単位の明示された比活性を有するアメルシャム イ
ンターナショナル社（Amersham International）から入
手される組換え体のヒトG-CSF を用いて検量した。
【０３１７】G-CSF 試料の効力は既知活性の標準品と対
比することにより測定された。１ml当りのG-CSF 活性の
単位は次式： ［ 3H −チミジン組込みにおける50％の最高増大を与え
るG-CSF 標準品の希釈率÷ 3H −チミジン組込みにおけ
る50％の最高増大を与える試料の希釈率］×G-CSF 標準
品の単位／ml活性 により算出した。
【０３１８】インターロイキン-2（IL-2）の生物学的定
量 Robb等によりJ. Exp. Med, 160, 1126,1986に記載され
るごときマウスIL-2依存性細胞系CTL の生長を監視する
ことにより、インターロイキン-2の生理学的活性を評価
した。但し上記細胞をIL-2と共に48時間インキュベート
しまた 3H-チミジンで６〜８時間パルス標識した（puls
ed）。T47D細胞を使用するカルシトニンの生物学的定量 カルシトニンについての生物学的定量法は、ヒト乳癌細
胞系T47Dはカルシトニンについての受容器に連結された
アデニル酸シクラーゼを担持しているという原理に基づ
くものである（Martin等、（1980）、Biochem Biophys
Res Commun 98：150-156 参照）。カルシトニンによるT
47D細胞の刺激によって、環式AMP の細胞内濃度が増大
し、これは放射性免疫検定（ラジオイムノアッセイ）に
より定量し得る。未知試料中のカルシトニン又はペクリ
ル化（PEGylated ）カルシトニンの量は、カルシトニン
又はペグリル化カルシトニンの、既知の標準試料を使用
して作成した標準曲線と比較することによって定量し得
る。
【０３１９】生物学的定量においては、T47D細胞を、血
清を含有していない媒体又は燐酸緩衝溶液中の懸濁物と
して調製した。細胞懸濁物の一部を試験管中に装入し、
10-4M イソブチルメチルキサンチンの存在下、標準カル
シトニン又はペグリル化カルシトニンにより、又は、カ
ルシトニン又はペグリル化カルシトニンを含有する試料
により20分間、刺激した。細胞懸濁物を沸騰水浴中に５
分間装入することによってインキュベーションを停止さ
せた。0.01％のトリトン（Triton）X-100 の存在下で２
サイクルの凍結−解凍を行うことによって細胞を溶解さ
せそして細胞残屑（cell debris)を10,000xgで５分間遠
心分離することにより沈降させた。
【０３２０】溶解物（lysate）上澄液中の環式AMP を市
販のキット（kit)（AmershamInternational,TRK432)を
使用して放射性免疫検定法により定量した。標準曲線は
環式AMP 濃度に対しての、標準カルシトニン又はペグリ
ル化カルシトニンの量をプロットすることによって作成
した。未知試料中のカルシトニン又はペグリル化カルシ
トニンの量は適当な標準曲線からの内挿（iterpolatio
n）により決定した。
【０３２１】参考例28 メチルポリエチレングリコール5000で変性したヒトカル
シトニン（hCT)の調製 凍結乾燥した、化学的に合成した hCTをケンブリッジ
リサーチ バイオケミカル（英国、チエシャイヤー）か
ら購入した。逆相及びイオン交換HPLCは単一のピークを
示した。 hCT上のアミノ基１個当り、５当量のメチルポ
リエチレングリコールを使用したこと以外、参考例３に
記載したものと同一の方法で、75mlＨ2 Ｏ中の300 mgの
hCTをメチルポリエチレングリコールで変性した。反応
混合物をアミコンYM10膜（分子量カットオフ10kDa)上で
４℃で0.1M炭酸水素アンモニウム、pH 8.0に対し透析濾
過して、未反応hCT を除去した。残留液を36mlに濃縮し
ついで1.7M硫酸アンモニウムを含有する50mM燐酸ナトリ
ウム、pH 7.0を用いて60mlにした。この溶液を0.68M 硫
酸アンモニウムを含有する50mM燐酸ナトリウム中で平衡
化した８mlのフェニル- スーパーローズ（phenyl-super
rose）カラム(Pharmacia／LKB)上で５×12mlのバッチと
してクロマトグラフィーにかけた。遊離のメチルポリエ
チレングリコールはこれらの条件下ではカラムに結合せ
ず、洗浄により除去された。メチルポリエチレングリコ
ールで変性されたhCT を50mM燐酸ナトリウムpH7.0 で溶
離した。溶離ペプチドをスペクトラポル(Spectrapor)透
析膜（MWカットオフ６〜８kDa)を使用して水中に透析し
ついでアミコンY10 膜を使用して４℃で濃縮することに
より、酸加水分解後のアミノ酸分析により測定して、11
mg／mlの最終ペプチド濃度とした。共有結合したメチル
ポリエチレングリコールをhCT １モル当り 1.5モル含有
する生成物は生物学的活性を保持しておりかつ未変性原
料物質を含有していなかった。
【０３２２】参考例29 メチルポリエチレングリコール5000で変性されたヒト
インターロイキン-2（IL-2）の調製 大腸菌中で製造された、凍結乾燥された組換え体IL-2を
バイオソースインターナショナル（カルフオルニア）か
ら入手した。大腸菌中でのIL-2の製造及びその後の精製
は文献に記載されている（Kato等、Biochem, Biophys.
Res. Commun.130 , 692(1988) ；Liang 等、Biochem.J.
229 , 429(1985) ；Kaths 等、米国特許第4,569790号明
細書参照) 。30mlの水中の211mg のIL-2の溶液を参考例
３に記載の方法で分子量約5000のメチルポリエチレング
リコール（IL-2上のアミノ基１個当り20当量）で変性
し、精製した。最終生成物はタンパク質１モル当り、3.
4モルのメチルポリエチレングリコールを含有してお
り、未変性の原料物質を含有しておらずそして生物学的
活性を保持していた。
【０３２３】参考例30 pICIの構成
【０３２４】ａ）pTB357（ここではpLB004とも記載す
る）の構成 天然に産生するプラスミドRP4 に見出される如く、プラ
スミドpTB357は抑制したテトラサイクリン耐性決定基を
利用する。この抑制したプラスミド系ではテトラサイク
リンの不在下でtetA遺伝子の発現を遮断し然るに大抵の
薬剤耐性機構は構成発現を有する。
【０３２５】tet 遺伝子座はBarth 及びGrinter(J. Mo
l. Biol. 113 ； 455〜474,1977)によりRP4 上に先ず位
置付けられた。このtet 遺伝子座は隣接遺伝子：構造上
の耐性遺伝子及びtet R 、リプレッサー遺伝子よりなる
ことが示され、この領域を配列した(klock等、J.Bacter
iol : 161 ；326 〜332,1985)。これらの遺伝子は隣接
するBg1 II-SmaI 及びSmaI-SamI 断片上に配置された。
Bg1II の部位はRP4 で特異的であるが５個のSmaIの部位
(Lauka, Lurz及びFurste, Plasmid 10; 303-307,1983)
がある。
【０３２６】ｉ）tetA+tetR 遺伝子のクローン化 プラスミドRP4 は文書に十分記載されており(Datta等の
J.Bacteriol 108 :1244, 1971 ）、自由に入手し得る。
更にはプラスミドRP4 は承認番号第50078 及び50437 号
としてthe National Collection of Type Cultures, 61
ColindaleAvenue, London, NW9 5HT に対して寄託され
た。このプラスミドを含有するE.coli菌株は選択的な培
養液中で生長させ、プラスミドDNA をHolmes andQuigle
y 法(Holmes and Quigley, Anal. Biochem 114 ; 193 〜
197, 1981)を拡大して単離した。プラスミドDNA を2.5M
酢酸アンモニウムでの処理により除蛋白を行ないイソプ
ロパノールで再沈澱させた。このプラスミドDNA を供給
者の推奨する条件により制限酵素Bg1II で処理し、完全
に切断した。次いで希釈した酵素及び短かいインキュベ
ーション時間を使用することによりXmaIによって部分的
に切断した。XmaIはSmaIのイソシゾマーであるがその切
断部位で４−ヌクレオチド粘着末端を生ずる。
【０３２７】ベクタープラスミドpUC8 (Yanisch-Perro
n, Vieira and Messing, Gene 33;103 〜119 , 1985)
は同様に調製され、BamHI 及びXmaIで完全に切断した。
RP4断片は12℃で16時間T4リガーゼで連結することによ
りこのベクター中にクローン化された。このベクターを
使用して塩化カルシウム法 (Maniatis等のColdSpring H
arbor Laboratory, 1982) によりコンピテントとしたE.
coli C600 を形質転換した。次いで培養物をテトラサイ
クリン耐性用に選んだ媒質上に配置した。
【０３２８】E.coli C600 は承認番号第GCSC 3004 号と
してE.coli Genetic Stock Centre,Yale University,
米国の如き多数のカルチュア コレクションを含めて多
数の供給源から自由に入手し得る。E.coli C600 の遺伝
子型はK12 thr-1 leu B6 thi-1 hsd S1 lac Y1 ton A21
λ- sup E44である。
【０３２９】この耐性を有する若干のコロニーを予期し
た表現型について点検した（アンピシリン及びテトラサ
イクリン耐性であるがカナマイシン耐性ではなくRP4 そ
れ自体を表わす）。適当な耐性を有するコロニーをプラ
スミドDNA の単離によりクローン分析にかけた(Holmes
and Quigley 法）。これらの調製物をEcoRI 及びHind II
I で切断し、ゲル電気泳動により分析した。これによっ
てクローン化挿入物の寸法が確立されこれはRP4 からの
Bg1II- XmaI- XmaI断片について予測された2.45kbであ
ることが見出された。tetA及びtetR遺伝子を含有するこ
の断片を担持したクローンはpTB344と呼ばれた。
【０３３０】ii）pAT153からtet 遺伝子の取出し RP4 からtetA +tetRカセットを挿入する前にベクタープ
ラスミドpAT153からtet 遺伝子を取出して、遺伝的不安
定性の源となり得る遺伝子複製を防止することが必要で
あった。またtet 遺伝子は非同族tetRによっては有効に
抑制し得ない。取出しはプラスミドpAT153 DNAを単離し
これをEcoRI 及びAvaIで切断することにより行なった。
これらの部位の間で配列SEQ ID No.56: 5' AATTCGCATGCGGATCCATCGATC3' 3'GCGTACGCCTAGGTAGCTAGAGCC5' を有する合成オリゴヌクレオクチドをクローン化した。
これらの合成オリゴヌクレオチドはEcoRI 及びAvaI粘着
末端に適合し且つSphI, BamHI 及びClaI部位を更に含有
する。形質転換及び選択後に、コロニーはテトラサイク
リン耐性決定基の減損について試験した。１つのクロー
ンからのプラスミドDNA の配列を行なって予測した配列
が正しいことを確認した。このプラスミドをpCH19 と呼
んだ。
【０３３１】iii) tetA+tetR遺伝子の挿入 tetA 及びtetR遺伝子はEcoRI 乃至PstI断片上のpTB344か
ら単離された。pUC8ベクターはSspIで処理することによ
り破壊された。何故ならpCH19 と同じ選択決定基（アン
ピシリン耐性）を担持するからである。プラスミドpCH1
9 DNA をEcoRI及びPstIで切断し次いでtet 遺伝子を担
持する2.45kb断片で連結した。このプラスミドを使用し
てE.coli C600 を形質転換し、培養物はテトラサイクリ
ン耐性コロニーについて選択しながらプレートアウト(p
late out) するものである。tet遺伝子の挿入は、かく
してpCH19 のアンピシリン耐性決定基を失うべきpCH19
中のbla 遺伝子の大部分を置換するように意図された。
形質転換体からのアンピシリン耐性の減損は確認され
た。次いで数個のクローンを使用してプラスミドDNAを
単離し、これを制限分析にかけた。これによって、構成
したプラスミドは意図した構造を有することを確認し
た。このプラスミドをpTB351と呼んだ。
【０３３２】iv）cer 配列の挿入 天然に産生するプラスミドColEI はE.coli中にきわめて
安定に維持されるが、然るにその誘導体pBR322及びpAT1
53は安定に維持されない。Summers 及びSherratt (Cel
l, 36:1097 〜1103, 1984) が証明した所によればこれ
は親プラスミド中に存在するcer と呼ばれる短かい(283
bp) 配列を含有しない誘導体によるものである。この配
列は部位特異的プラスミドのマルチマーレゾルーション
(multimer-resolution) 系を含有しこれによって相同的
な組換えによって形成されたプラスミド マルチマーの
集積を防止する。かゝるマルチマーは細菌細胞の分割中
の娘プラスミドの安定な遺伝を普通確保する分配処理に
悪影響を有する。
【０３３３】cer 配列(Summers, D 等MGG, 201, p334〜
338, 1985)を、BamHI 及びTaqIで切り取ることにより28
9bp 断片としてプラスミドpKS492(D. Sherrattにより提
供された）から単離した。プラスミドpTB351をE.coliの
dam 菌株からDNA として単離してそのClaI部位がdam＋
メチル化系によってブロックされるのを防止した。この
DNA をBamHI 及びClaIで切取った（これらの部位の両方
共このクローン化用の合成オリゴヌクレオチド上に導入
されていた）。cer 断片を切断ベクターで連結し、次い
でこれを使用してE.coli C600 を形質転換し、選択はテ
トラサイクリンについて成された。形質転換体コロニー
はAvaI制限及びゲル電気泳動によりクローン分析を行な
った。約300bp の追加のDNA バンドの存在はcer 断片の
獲得を示した。別の制限分析を使用して得られるプラス
ミドが適当な構造を有することを確認した。これらのプ
ラスミドの１つはpTB357（図７）と呼び、またpLB004と
呼んだ。
【０３３４】ｂ）プラスミドpCH101 プラスミドpCH101はpICI0020（実施例1c参照）に相当す
るが、但しEcoRI-SalI断片（図１参照）はSEQ ID No50
(図８参照）及びEdge M.D. 等のNucleicAcidsResearch
1983, Vol 11, p6419〜6435によって記載される如くイ
ンターフェロンα2 遺伝子配列によって置換された。こ
の点において、SEQ ID No53 の3'−末端ATG コドンは、
前記のEdge M.D. 等のNucleic Acids Research referen
ceのインターフェロンα2 配列中のシステイン（アミノ
酸１）をコードするTGT コドンの直前に存在する。かく
して5'ヌクレオチド配列GATCCATG 及び相捕的な3'ヌク
レオチド配列GTACは前記文献のヌクレオチド配列から省
略される。
【０３３５】ｃ）pTB357中への表現カセットの挿入 trp プロモーター、リボソーム結合部位及びインターフ
ェロンα2 遺伝子よりなる表現カセットを、EcoRI 乃至
SphI制限断片上のプラスミドpCH101（前記の(b) 参照）
から単離した。この表現カセットをEcoRI 及びSphIで同
様に切り取った製造ベクター(pTB357)（前記の(a) 参
照）中に連結させた。このDNA を使用してE.coli C600
のコンピテント培養物を形質転換させ、テトラサイクリ
ン耐性コロニーを単離した。これらのコロニーの若干
を、表現カセット上に担持したSstI制限部位の獲得につ
いてDNA クローン分析により試験した。この点に関して
正のクローンは予期した構造が正確であるかを点検する
ために制限マッピング(mapping）により更に試験した。
クローンはまたクーマシーブルーで染色したポリアクリ
ルアミド−SPS ゲルについて分析した如くインターフェ
ロンα2 蛋白質を製造するための授与能力について点検
された。１つのかゝる確認したクローンをφLB005 と呼
んだ。
【０３３６】ｄ）pTB244中へのT4転写終結体の挿入 SalI 乃至HindIII 断片（長さ67個の塩基対）(SEQ ID No
48及び図６参照）の形のT4転写終結体（ターミネータ
ー）配列を、SalIとHindIII との部位同志間の中間ベク
ターpTB 244(欧州特許公告第237,269 号に記載）のマル
チクローン化部位中に挿入した。クローン分析を使用し
てこの構造物(pTB244 T4 ter) の構造を確認した。この
ベクターから、マルチクローン化部位の大部分とT4終結
体とを含有するSstI乃至SphI断片を次いで単離した。こ
の断片をSstI及びSphIで同様に切り取ったpLB005中に挿
入し、これによってインターフェロンα2 遺伝子を置換
するが、trp プロモーター、マルチクローン化部位及び
T4終結体よりなるカセットを残しておく。この構造物は
クローン分析によって確認され、該プラスミドをpLB013
と呼んだ。
【０３３７】ｅ）マルチクローン化部位の置換 pLB 013 中のマルチクローン化部位は若干の点でこのベ
クターには理想的ではない：SalI, BamHI 及びSmaIの部
位は特異的でなくプラスミド上の他の所にも存在する。
それ故この断片はSstI及びXbaI（両方共独特である）で
切断することにより切り出され、SEQ ID No.51の配列： 5' AGCTCCATATGGTACCAGATCTCTCGAGAGTACTT GGTATACCATGGTCTAGAGAGCTCTCATGAAGATC 5' を有する合成オリゴヌクレオチドをその場に挿入した。
クローンは新しい制限部位の獲得について分析し次いで
配列決定により確認した。１つのかゝるプラスミドをpL
B 014 と呼んだ。この仕方で挿入した新しいクローン化
部位は：NdeI,KpnI, BglII , XhoI及びScaIであり、こ
れらの部位に続いて先のXbaI及びSalIを有する。
【０３３８】ｆ）更なる修飾 pLB 014 中の隣接SstI及びNdeI部位は、恐らくはそれら
のきわめて接近した位置の故に同時には又は順次にはの
何れかでこれら両方の制限酵素によって切断できないこ
とが見いだされた。それ故追加の配列をこれらの間に挿
入した。これは、pLB 014 をSstI及びKpnIで切り取り次
いでSEQ ID No.52 の合成オリゴヌクレオチドを挿入することにより行なっ
た。クローンは追加のPvuII 又はPstI部位の獲得につい
て分析し次いで配列化により確認した。１つのかかるプ
ラスミドをpLB015(pICI 0080)(図９参照）と呼んだ。こ
のプラスミドはpLB 014 とは異なってSstI及びNdeIによ
って有効に切り取られる。これによって上流側のtrp プ
ロモーターに関して且つ予期すべき遺伝子のATG 開始コ
ドンを与えるのに意図されるNdeIに関して正確に配置さ
れた種々のリボソーム結合部位の配列を挿入する場所を
提供するものである。
【０３３９】参考例７ プラスミドpICI 1295(pCG 300 とも記載）の構成
【０３４０】ａ）pICI 1079 からpCG54 の調製 pICI 1079 はEcoRI とStylI との制限部位同志間に次の
要素： （ｉ）ファージλからのCI 857； （ii）λPLプロモーター； （iii)合成リボソーム結合部位； （iv) 合成インターフェロンα2 遺伝子配列； （ｖ）SalIとStyIとの制限部位の間でファージT4から誘
導された合成転写終結体配列； を収容するアンピシリン耐性の pAT153-誘導プラスミド
である。この転写終結体のDNA 配列を図６及びSEQ ID N
o.53に示す。
【０３４１】pICI 1079 を図10に例示する。pICI 1079
はブタペスト条約により英国のNational Collections o
fIndustrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB)に
寄託されている(NCIMBNo.40370,寄託日1991年２月19
日）。pCG54 は前記と同じプロモーター、リボソーム結
合部位及び転写終結体配列即ちλPL、RBS7及びT4を含有
するが特異な蛋白質を調製するのにコードする遺伝子配
列を欠いている表現ベクターを利用し得るために構成さ
れた。かゝる構造体は、次後のクローニング操作によっ
てこのベクター中に導入し得る何れかの有用な蛋白質を
調製するために転写及びホン訳を可能とする必須成分含
有の塩基性表現ベクターの才能を提供するものである。
【０３４２】表現ベクターの構成は、それぞれのEcoRI
及びSalI部位でpICI 1079 の制限エンドヌクレアーゼ開
裂によって開始された。この開裂工程によって、プラス
ミドの複製及び抗生物質耐性機能の遺伝子プラスT4転写
終結体配列で完成するpICI 1079 バックボーンを含有す
るベクター断片を放出した。該断片を、DNA 断片の最終
精製用のゼネクリーン(Geneclean) を使用してアガロー
スゲル精製工程によって単離した。
【０３４３】このベクター断片に、寸法が大体1.2kb の
より小さな別のDNA 断片を導入した。この別のDNA 断片
は例えばDNA 合成によって又は前記の如くpICI 1079 か
ら得られた小さなEcoRI-SalI制限断片の特定部位の突然
誘発又はPCR 突然変異誘発によって得ることができる。
この別の断片はpICI 1079 に当初から存在するのと正し
く当量のプロモーターとリボソーム結合部位配列とを含
有し且つ更にはそれぞれその5'及び3'末端で利用できる
EcoRI 及びSalI部位とを有し、こうしてpICI 1079 断片
に連結するための相溶性末端を提供するものである。Gi
bco-BRL酵素T4 DNAリガーゼ及びそのそれぞれの緩衝液
の存在下で連結反応を行なうと構成物pCG54 が形成され
た。
【０３４４】この構成物を含有するクローンは、或る分
量の連結反応混合物を菌株HB 101のE.coliコンピテント
細胞に形質転換させるのに続いて当初から単離された。
回収した構成物pCG54 は寸法が3.682kb であり、図11に
特徴付けたマップに概説した必須要件を含有した。
【０３４５】ｂ）pCG54 からpCG61 の調製（pICI54とも
記載） 合成オリゴヌクレオチド配列は、T7A3プロモーター用の
自然の配列と、これに隣接してクローン化した何れかの
ポリペプチド遺伝子配列の正確な処理を可能とする有効
なホン訳開始領域を提供する配列との両方を含有するよ
うに設計された。この後者領域用の適当な候補配列はRB
S1、trp リボソーム結合配列と同定された。それ故SEQ
ID No54 及びSEQID No.55として同定された２種の相補
的なオリゴヌクレオチドは、T7A3プロモーターとRBS1配
列とを組入れた二本鎖DNA リンカーを生成するのに合成
された。
【０３４６】オリゴヌクレオチドはABI 遺伝子シンセサ
イザーを用いて標準の記録書によって84量体(84mers)と
して調製された。オリゴヌクレオチドは、二本鎖形にお
いて合成断片がそれぞれ5'及び3'末端で制限エンドヌク
レアーゼ酵素の部位EcoRI 及びKpnIを有するように設計
された。それらの長さにより、オリゴマーはHPLCによっ
て精製できず、精製は10％アクリルアミド：7M尿素ゲル
を用いてアクリルアミドゲル電気泳動により行なった。
【０３４７】精製前に、オリゴマーはそれらが正確な寸
法を有するのみならずまた調製した試料がそれらの最大
割合として所要のオリゴマーを含有し、合成の副生物と
して生ずるより小さな二次的な汚染性オリゴヌクレオチ
ドを高割合で含有しないように確保するためにサイジン
グゲル(sizing gel)について先ず点検した。
【０３４８】アクリルアミドゲルはゲル重合用の触媒と
して使用した過硫酸アンモニウム及びN, N, N', N'- テ
トラメチルエチレンジアミンを用いての標準法により調
製した。オリゴヌクレオチドのサイジングは電気泳動後
にそれらが肉眼で見えるように必要とされる。それ故32
P を用いて試験を放射能で識別することが必要であっ
た。これによって電気泳動に続いてオートラジオグラフ
ィーにより試料の特性を評価することができた。
【０３４９】オリゴヌクレオチド試料は燐酸化せずに粗
製の形で供給された。酵素T4ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いて燐酸化により試料を5'末端で高温標識できる点
で放射能識別の目的でこの要因を使用した。
【０３５０】オリゴマーは燐酸化しない形での合成から
提供され、こうして精製後には各々のオリゴマーは燐酸
化反応を個々に受け、そこでATP を使用してT4ポリヌク
レオチドキナーゼの存在下に各々の分子の5'末端を燐酸
化した(Molecular Cloning ;A Laboratory manual 2版,
Sambrook, Fristch 及びManiatis, p5, 68〜5, 71参
照）。燐酸化したからには、２個の相補的なオリゴヌク
レオチドは互いにアニーリングされてT7A3プロモーター
とRBS1配列とを含有する二本鎖DNA 重複体を形成した。
【０３５１】ベクター分子pCG54 は制限酵素EcoRI 及び
KpnIで開裂された。制限切断により、λPLプロモーター
とRBS1配列とを含有する2.3kb ベクター断片と1.1kb 断
片とを生成した。このクローン化はλPL-RBS1 配列を、
T7A3-RBS1 配列含有EcoRI 〜KpnI合成断片で置換するよ
うに計画される。PCG 54の切断から得られる2.3kb ベク
ター断片は、アガロース断片からDNA を取出すためアガ
ロースゲル電気泳動及びゼネクリーン方法を用いて通常
の記録書により精製した。84bp EcoRI-KpnI 合成断片
を、前述の如く調製したベクター分子に連結させ、連結
したDNA を使用してE.coli HB 101 細胞を形質転換し
た。正の組換え体クローンの選択はアンピシリン耐性に
よるものであった。形質転換に続いて、組換えプラスミ
ドを含有する多数のコロニーをスクリーニングの目的に
選択した。
【０３５２】クローニング中にベクターに組込まれた合
成フラグメントは、簡単なスクリーニング方法として組
換えプラスミドDNA 試料の制限分析を不適当とさせるよ
うな寸法（84量体）を有するものであった。かゝる小さ
な寸法の挿入物はアガロースゲル電気泳動によっては容
易に明らかでない。断片それ自体は、その存在の診断と
なり得る内部制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含有し
ない。それ故組換えクローンの最初のスクリーニングは
コロニーハイブリダイゼーション(hybridisation) の方
法によるものであった（Gruustein 及びHozness Proc.N
atl Acad, Sci 72, 3961(1957)参照）。組換え体クロ
ーンからの不動化プラスミドDNA を含有するニトロセル
ロースフィルターは、合成アニール化オリゴヌクレオチ
ドSEQ ID No.54及びSEQ ID No.55の無作為放射性標識に
よって調製されたプローブに対してハイブリッド化し
た。DNA はα32P-dCTPを用いて標識し、37℃で２時間ク
レナウ（Klenow）ポリメラーゼを用いてインキュベーシ
ョンを行なった。正のハイブリダイゼーション反応を生
成する組換え体コロニーはプラスミドDNA 調製のために
選択された。プラスミドDNA は純度を確保するように、
CsCl勾配密度の遠心分離を組入れた比較的大規模の方法
によって各々の場合に調製された。“Molecular Clonin
g-A laboratory manual"第２版、Sambrook, Fritsch 及
びManiatis（Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 ）
p1.42 〜1.52参照。かかる方法によってDNAを調製する
と次後のクローン化操作及び配列分析に使用するのに適
当な高品質DNA 物質を確保する。
【０３５３】組換え体クローンから単離した全てのプラ
スミドDNA を配列分析により第２のスクリーン中に包含
させて、クローン化接合部でのオリゴヌクレオチド配列
及びT7A3-RBS1 断片それ自体のオリゴヌクレオチド配列
は絶対に正しいように確保する。使用した配列用の記録
書（プロトコール）はセクエナーゼ（Sequenase ）の記
録書であり、使用するのに選択した配列用プライマーは
例えばpBR322 UP(pBR322ユニバーサルプライマ）であっ
た。塩基配列決定はSangerジデオキシ連鎖終結配列技術
を用いて行なった。適当な配列を有するクローンは新規
な表現構成物pCG61 として表示され、T7A3プロモーター
とRBS1配列とT4ターミネーター配列とを含有した（図12
参照）。
【０３５４】ｃ）pCG61 からpCG300（pICI1295として記
載した）の調製 G-CSF 同族体[Ser17,27 ] hu G-CSFの構成に伴なう配列
工程及び合成工程は参考例３に記載される如くである
（図４及び図５参照）。このG-CSF 同族体配列は、遺伝
子をプラスミドpSTP1 に組入れてpICI1107を得た構造物
から単離された（実施例２参照）。pICI1107をSca Ｉで
切断し、大きな断片はアガロースゲル電気泳動及びゼネ
クリーン精製に続いて単離された。次いでこの断片を制
限酵素エンドヌクレアーゼSal Ｉで切断して、pCG61 に
クローン化するのに適当なScaI〜SalI制限断片上に[Met
-1,Ser17,27 ] hu G-CSF遺伝子を生成した（図12参
照）。
【０３５５】ScalI での制限に続いて所要の断片は再び
アガロースゲル精製技術を使用して単離した。ベクター
分子pCG61 は制限酵素Kpn1で切断した。この酵素を用い
ての開裂では3'- オーバーハング(overhang)を生成し次
いでこれを酵素T4ポリメラーゼの使用によりブラントエ
ンドとさせた“Molecular Cloning-aLaboratory manua
l"第２版、Sambrook, Fritsch 及びManiatis p5.44〜5.
47参照。T4ポリメラーゼ活性は70℃で30分間インキュベ
ーションすることにより熱不活性化され、DNA はエタノ
ール沈澱により回収された。得られるペレットを無菌蒸
留水に溶解させ、溶解したDNA をSal I で開裂した。Kp
n Ｉ（今やブラントエンドとした）〜Sal Iベクター断
面は、エタノール沈澱続いてのアガロースゲル電気泳動
及び精製技術により回収した。
【０３５６】次いでScaI〜SalI[Met-1,Ser17,27 ］hu G
-CSF] 断片を、ブラントエンドとさせたKpn Ｉ〜Sal Ｉ
ベクター中に連結させた。連結したDNA をE.coli菌株HB
101中に形質転換させた。組換え体クローンの選択はア
ンピシリン耐性についてであった。
【０３５７】強力な組換え体クローンの最初のスクリー
ニングはハイブリダイゼーションにより行なった。放射
能標識のプローブはプラスミドpICI1107から調製したEc
oRＩ〜Sal Ｉ断片（[Met-1,Ser17,27 ］hu G-CSF遺伝子
配列を含有する）を無作為に標識付けすることにより調
製された。このプローブを、DNA がニトロセルロースフ
ィルターの表面上に固定されたコロニーに対するハイブ
リダイゼーションで使用した。続いてプラスミドDNA は
このスクリーンでハイブリダイズされた24個のクローン
から調製した。全てのDNA 調製は迅速なミニ調製法によ
るものであった。Birnboim及びDolyのNucleic Acids Re
search, 7 , 1513, 1979参照。これらの組換え体DNA 調
製物は制限分析により別のスクリーンにかけた。表現カ
セット内で特異な部位である、BamHＩを有するDNA の線
状化（linearization)は[Met-1,Ser17,27 ］hu G-CSF配
列の存在を示すものである。
【０３５８】配列の分析を行なって[Met-1,Ser17,27 ］
hu G-CSF遺伝子の存在を確認し且つクローン化接合部の
塩基配列及び[Ser17,27 ］hu G-CSF遺伝子全体に亘って
の塩基配列は正しく適当であることを立証した。この目
的のために、純度を確保するCsCl勾配密度遠心分離技術
を用いて16個の組換え体クローンから大規模プラスミド
DNA 試料を調製した。配列決定工程は配列記録書により
行ない、選択した配列決定プライマーはpBR322ユニバー
サルプライマー（EcoRＩ）であった。組換え体クローン
の２種は[Met-1,Ser17,27 ］hu G-CSF断片のSca Ｉ末端
で且つG-CSF ペプチド配列それ自体に亘って正しい塩基
配列を含有した。クローンは表現構成物pCG300として同
定された（図14参照）。
【０３５９】
【０３６０】
【０３６１】
【０３６２】
【０３６３】
【０３６４】
【０３６５】
【０３６６】
【０３６７】
【０３６８】
【０３６９】
【０３７０】
【０３７１】
【０３７２】
【０３７３】
【０３７４】
【０３７５】
【０３７６】
【０３７７】
【０３７８】
【０３７９】
【０３８０】
【０３８１】
【０３８２】
【０３８３】
【０３８４】
【０３８５】
【０３８６】
【０３８７】
【０３８８】
【０３８９】
【０３９０】
【０３９１】
【０３９２】
【０３９３】
【０３９４】
【０３９５】
【０３９６】
【０３９７】
【０３９８】
【０３９９】
【０４００】
【０４０１】
【０４０２】
【０４０３】
【０４０４】
【０４０５】
【０４０６】
【０４０７】
【０４０８】
【０４０９】
【０４１０】
【０４１１】
【０４１２】
【０４１３】
【０４１４】
【図面の簡単な説明】
【図１】参考例５で述べられている167bp 断面のヌクレ
オチド配列を示す。
【図２】天然ヒトG-CSF 及び制限部位のアミノ酸配列及
び対応するヌクレオチド配列を示す。
【図３】天然ヒトG-CSF 及び制限部位のアミノ酸配列及
び対応するヌクレオチド配列を示す。
【図４】[Ser17,27 ] hu G-CSF及び制限部位のアミノ酸
配列及び対応するヌクレオチド配列を示す。
【図５】[Ser17,27 ] hu G-CSF及び制限部位のアミノ酸
配列及び対応するヌクレオチド配列を示す。
【図６】(a) 末端SalI及びHindIII 制限部位及び(b) 末
端SalI及びStyI制限部位を有する、T4転写ターミネータ
ーのヌクレオチド配列を示す。
【図７】pTB357（pLB004とも称する）の制限マップを示
す。
【図８】参考例６(b) 述べられているが、インターフェ
ロンα2 遺伝子配列は省略されているRcoRI-SalI断片の
ヌクレオチド配列を示す。
【図９】pLB015(pICI 0080とも称する）の制限マップを
示す。
【図１０】pICI 1079 の制限マップを示す。
【図１１】pICI 54(pCG54 とも称する）の制限マップを
示す。
【図１２】pCG 61の制限マップを示す。
【図１３】pICI 1107 の制限マップ（斜線部分は[Ser
17,27 ] hu G-CSFをコードする遺伝子配列を表わす）を
示す。
【図１４】pCG 300(pICI 1295 とも称する）の制限マッ
プを示す。
【図１５】50％d, l−ラクチド／50％クリコリド共重合
体連続放出型医薬組成物Ａ及びＢ（実施例４及び５参
照）からの PEG[Met-1,Ser17,27 ] hu G-CSFの放出量を
示す（これらの組成物は氷酢酸法で調製されている）。
【図１６】50％d, l−ラクチド／50％グリコリド共重合
体連続放出型医薬組成物Ｃ及びＤ（比較例１及び２参
照）からの非ペグリル化[Met-1,Ser17,27 ] hu G-CSFの
放出量を示す；組成物Ｃは非ペグリル化[Met-1,Ser
17,27] hu G-CSFだけを含有しており、組成物Ｄは非ペ
グリル化[Met-1,Ser17,27 ] hu G-CSFとメチルPEG 5000
との混合物を含有している（これらの組成物は氷酢酸法
で調製されている）。
【図１７】２つの異る50％d, l−ラクチド／50％グリコ
リド共重合体連続放出型医薬組成物Ｇ及びＨ（実施例24
参照）からの、PEG 5000[Met-1,Ser17,27 ] hu G-CSFの
累積放出量を示す（かかる組成物は水性製造法によって
調製されている）。
【図１８】[Met-1,Ser17,27 ] hu G-CSFだけを含有する
50％d, l−ラクチド／50％グリコリド共重合体連続放出
型医薬組成物（比較例３参照）及び[Met-1,Ser17,27 ]
huG-CSFとメチルPEG 5000との混合物を含有する50％d,
l−ラクチド／50％グリコリド共重合体連続放出型医薬
組成物（比較例４参照）（これらの組成物はいずれも水
性製造法によって調製）からの、[Met-1,Ser17,27 ] hu
G-CSFの累積放出量を示す。
【図１９】50％d, l−ラクチド／50％グリコリド共重合
体・連続放出型医薬組成物Ｅ（実施例３参照）、Ｋ（実
施例25参照）及びＭ（比較例５参照）（組成物Ｅは氷酢
酸法により、組成物Ｋ及びＭは水性製造法により調製）
からの、PEG 5000[Met-1,Glu15,Ser17,27 ,Ala26,28 ,L
ys30] hu G-CSFの累積放出量を示す。
【図２０】50％d, l−ラクチド／50％グリコリド共重合
体・連続放出型医薬組成物Ｆ（実施例４参照）、Ｌ（実
施例26参照）及びＮ（比較例６参照）（組成物Ｆは氷酢
酸法により、組成物Ｌ及びＮは水性製造法により調製）
からのPEG 5000[Met-1,Arg11,Ser17,27,60,65 ] hu G-C
SFの累積放出量を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成４年８月１７日
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図７】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１４】
【図１６】
【図１３】
【図１５】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 47/34 Ｂ 7329−4Ｃ 47/48 Ｂ 7329−4Ｃ (31)優先権主張番号 ９０１８４１６．９ (32)優先日 1990年８月23日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９０１８４１７．７ (32)優先日 1990年８月23日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９０１８４１８．５ (32)優先日 1990年８月23日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (72)発明者 テイムス，デービツド イギリス国．チエシヤー．マツクレスフイ ールド．オールダーレー・パーク（番地そ の他表示なし） (72)発明者 ウイルキンソン，アントニー・ジエームス イギリス国．チエシヤー．マツクレスフイ ールド．オールダーレー・パーク（番地そ の他表示なし）

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 酸安定性の生理学的活性物質を医薬組成
    物の構成成分から水性生理学的環境中に連続的に放出さ
    せるための医薬組成物であって、上記生理学的活性物質
    は水溶性重合体と共有結合されているポリペプチドであ
    ってかつ意図された使用期間中に医薬組成物内で遭遇す
    る条件下で著しく加水分解されないものであること；そ
    して ｉ）上記医薬組成物は、水性生理学的環境下に置いた場
    合、ポリペプチドを水性生理学的環境中に連続的な方式
    で放出して、少なくとも１週間に亘って、本質的に一段
    階的である放出形式を与えること； ii）上記組成物は、ポリペプチドの放出を２つの連続的
    段階で行い；第１段階の放出は表面からの拡散によって
    生起し、第２段階の放出は医薬組成物の構成成分の分解
    の結果として生起しそして拡散段階と分解により誘導さ
    れる段階とは時間的に重なり合うことを特徴とし、ま
    た、ポリペプチドの放出は少なくとも１週間に亘って生
    起すること；又は iii)上記組成物は水を連続的に吸収し、そして該組成物
    が分解しかつ実質的に全てのポリペプチドが水性生理学
    的環境中に放出されるまで、少なくとも１週間に亘っ
    て、実質的に一段階的である水吸収形式を与えること；
    を特徴とする医薬組成物。
  2. 【請求項２】 １分子の生理学的活性物質は、3000〜80
    00のDa分子量を有するポリペプチド１個当り、少なくと
    も１分子の水溶性重合体を含有する請求項１に記載の組
    成物。
  3. 【請求項３】 ポリペプチドは自然産生G-CSF の生物学
    的性質の少なくとも１つを有する請求項１又は２に記載
    の組成物。
  4. 【請求項４】 ポリペプチドは、自然産生G-CSF の生物
    学的性質の少なくとも１つと、５mg／mlにおいて少なく
    とも35％の溶液安定度とを有する、自然産生G-CSF の誘
    導体でありそして、該誘導体においては自然配列の少な
    くとも Cys17が Ser17残基によって置換されておりまた
    自然配列の Asp27が Ser27残基によって置換されている
    請求項３に記載の組成物。
  5. 【請求項５】 ポリペプチドは、 ａ）自然配列の Glu11の、 Arg11残基による置換； ｂ）自然配列の Leu15の、 Glu15残基による置換； ｃ）自然配残の Lys23の、 Arg23残基による置換； ｄ）自然配列の Gly26の、 Ala26残基による置換； ｅ）自然配列の Gly28の、 Ala28残基による置換； ｆ）自然配列の Ala30の、 Lys30又は Arg30残基による
    置換； ｇ）自然配列の Lys34の、 Arg34残基による置換； ｈ）自然配列の Lys40の、 Arg40残基による置換； ｉ）自然配列の Pro44の、 Ala44残基による置換； ｊ）自然配列の Leu49の、 Lys49残基による置換； ｋ）自然配列の Gly51の、 Ala51残基による置換； ｌ）自然配列の Gly55の、 Ala55残基による置換； ｍ）自然配列の Trp58の、 Lys58残基による置換； ｎ）自然配列の Pro60の、 Ser60残基による置換； ｏ）自然配列の Pro65の、 Ser65残基による置換； ｐ）自然配列の Pro111 の、 Glu111 残基による置換； ｑ）自然配列の Thr115 の、 Ser115 残基による置換； ｒ）自然配列の Thr116 の、 Ser116 残基による置換；
    及び ｓ）自然配列の Tyr165 の、 Arg165 残基による置換； から選ばれた少なくとも１つの追加の修飾を有する請求
    項４に記載の組成物。
  6. 【請求項６】 ポリペプチドは ｉ） [ Arg11,Ser17,27,60,65 ］ヒトG-CSF, ii） [ Glu15,Ser17,27 ,Ala26,28 ,Lys30] ヒトG-CSF, iii) [ Arg11,Glu15,Ser17,27,60,65 ,Ala26,28 ,Ly
    s30] ヒトG-CSF, iv） [ Arg11,40 ,Ser17,27,60,65 ] ヒトG-CSF, ｖ） [ Arg11,23 ,Ser17,27,60,65 ] ヒトG-CSF, vi） [ Arg11,165,Glu15,Ser17,27,60,65 ,Ala26,28 ,L
    ys30,58 ] ヒトG-CSF vii) [ Arg11,Glu15,111,Ser17,27,60,65,115,116 ,Ala
    26,28 ,Lys30] ヒトG-CSF, viii） [ Glu15,Ser17,27 ,Ala26,28 ,Arg30] ヒトG-CS
    F, ix） [ Ala1 ,Thr3 ,Tyr4 ,Arg5,11,Ser17,27,60,65 ]
    ヒトG-CSF ｘ） [ Ser17,27,60,65 ] ヒトG-CSF, xi） [ Arg11,Ser17,27,65] ヒトG-CSF,及び xii) [ Ser17,27,65] ヒトG-CSF から選ばれる請求項４又は５に記載の組成物。
  7. 【請求項７】 ポリペプチドは G-CSF、ヒトカルシトニ
    ン、インターロイキン−２、インターフェロン及びヒト
    生長ホルモンから選ばれる請求項１又は２に記載の組成
    物。
  8. 【請求項８】 水溶性重合体はポリエチレングリコール
    又はポリプロピレングリコール単独重合体、ポリオキシ
    エチル化ポリオール又はポリビニルアルコール（上記単
    独重合体はその一方の端部がアルキル基によって置換さ
    れているか又は置換されていないものである）から選ば
    れる請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
  9. 【請求項９】 水溶性重合体は非置換ポリエチレングリ
    コール、モノメチルポリエチレングリコール及びポリオ
    キシエチル化グリセリンから選ばれる請求項８に記載の
    組成物。
  10. 【請求項１０】 水溶性重合体は1000〜15,000の分子量
    を有する請求項８又は９に記載の組成物。
  11. 【請求項１１】 生理学的活性物質は、モノメチルポリ
    エチレングリコールと共有結合されたかつプレシークエ
    ンスメチオニンを有するか又は有していない[ Arg11,Se
    r17,27,60,65 ] ヒトG-CSF でありそして上記モノメチ
    ルポリエチレングリコールは2000〜5000の分子量を有す
    る請求項１〜６及び８〜10のいずれかに記載の組成物。
  12. 【請求項１２】 医薬組成物の構成成分と生理学的活性
    物質とをこれらに対する有機溶剤中に溶解させるか、又
    は、医薬組成物の構成成分と生理学的活性物質とを有機
    媒体又は水性媒体中に均一に分散させ；ついで乾燥させ
    そして動物体内に挿入するか又は動物体内に注入するの
    に適当な組成物に製剤することを特徴とする、請求項１
    〜11のいずれかに記載の医薬組成物の製造方法。
  13. 【請求項１３】 生理学的活性物質を、少なくとも25モ
    ル％の乳酸単位と75モル％までのグリコール酸単位とを
    有するポリラクチドからなるマトリックス中に配合する
    こと及び更に、生理学的活性物質と医薬組成物の構成成
    分との均密な固体混合物を溶融加工することにより、生
    理学的活性物質と医薬組成物の構成成分とを均一に混合
    することを特徴とする、医薬組成物の構成成分がポリラ
    クチドからなる請求項１〜11のいずれかに記載の医薬組
    成物の製造方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１〜11のいずれかに記載の医薬
    組成物を哺乳動物に投与し、それによって、水溶性重合
    体に共有結合されたポリペプチドの有効量を供与するこ
    と、そして、上記ポリペプチドは自然産生G-CSF の生物
    学的性質の少なくとも１つを有するものであることを特
    徴とする、哺乳動物に造血治療を施す方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜11のいずれかに記載の医薬
    組成物を哺乳動物に投与し、それによって、水溶性重合
    体に共有結合されたポリペプチドの有効量を供与するこ
    と、そして、上記ポリペプチドは自然産生G-CSF の生物
    学的性質の少なくとも１つを有するものであることを特
    徴とする、哺乳動物の白血病性細胞の増殖の抑制方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１〜11のいずれかに記載の医薬
    組成物を哺乳動物に投与し、それによって、水溶性重合
    体に共有結合されたインターロイキン−２の有効量を供
    与することを特徴とする、哺乳動物の新生物又は免疫不
    全症の処置方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１〜11のいずれかに記載の医薬
    組成物を哺乳動物に投与し、それによって、水溶性重合
    体に共有結合されたインターフェロンの有効量を供与す
    ることを特徴とする、哺乳動物の新生物又はウイルスの
    処置方法。
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