CS228591A3 - Pharmaceutical composition with a continuous liberation physiologically active component being stable in acid medium - Google Patents

Pharmaceutical composition with a continuous liberation physiologically active component being stable in acid medium Download PDF

Info

Publication number
CS228591A3
CS228591A3 CS912285A CS228591A CS228591A3 CS 228591 A3 CS228591 A3 CS 228591A3 CS 912285 A CS912285 A CS 912285A CS 228591 A CS228591 A CS 228591A CS 228591 A3 CS228591 A3 CS 228591A3
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
csf
solution
polypeptide
pharmaceutical composition
replaced
Prior art date
Application number
CS912285A
Other languages
English (en)
Inventor
Roger Camble
David Timms
Anthony James Wilkinson
Original Assignee
Ici Plc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB909016138A external-priority patent/GB9016138D0/en
Priority claimed from GB909018416A external-priority patent/GB9018416D0/en
Priority claimed from GB909018418A external-priority patent/GB9018418D0/en
Priority claimed from GB909018415A external-priority patent/GB9018415D0/en
Priority claimed from GB909018417A external-priority patent/GB9018417D0/en
Priority claimed from GB909018414A external-priority patent/GB9018414D0/en
Application filed by Ici Plc filed Critical Ici Plc
Publication of CS228591A3 publication Critical patent/CS228591A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2022—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/2031—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyethylene oxide, poloxamers
    • A61K9/204—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

..........·γ·......η.( ........ jUDr. J. TRAPLOVÁ advokátní kcncciařPatenty, ochranní zr.r.kyprůmyslové vzory, lizcnce 11505 Prahal,Štěpánská 16 ra
TJ
Λ• > O ! o < c·-OJI ; »«, i- - > m »·□< f-< m
N -< hj r\j· o> c.
O C-ř co 2Í&amp;5' P*
Farmaceutické kompozice s plynulým uvolňováním fyziologic-ky účinné látky
Oblast techniky
Vynález se týká farmaceutických kompozic fyzilogic-ky účinných polypeptidů, které zajistují plynulé uvolňová-ní polypeptidu v průběhu delšího časového úseku v případě,jsou tyto farmaceutické kompozice umístěny do vodného pro-středí fyziologického typu /jak bude definováno dále/.
Dosavadní stav technik?/
Je již dlouho známo, že plynulé uvolňování někte-rých fyziologicky účinných látek v průběhu delšího časo-vého úseku po jediném podání odpovídající farmaceutické kom-pozice představuje v klinické praxi významnou praktickouvýhodu a že již byly připraveny farmaceutické kompozice,které dlouhodobě uvolňují celou řadu klinicky použitelnýchléčiv po perorálním podání /viz například Remington s Phar-maceutical Sciences, Iéack Publishing Company, Saston, Pen-nsylvania, USA, 15·vydání, 1975, str.1618-1631/, po paren-terálním podání /tamtéž, str. 1631-1643/ a po topickém po-dání /viz například patent GB 1 351 409/. Vhodnou metodouparenterálního podání je subdermální injekce nebo implan-tace pevného tělíska, například pilulky nebo folie obsahu-jící příslušné léčivo, přičemž již bylo v odborné litera-tuře popsáno velké množství takových implantovatelnýchústrojí.
Zejména je známo, že vhodná implantovatelné ústrojínebo injikovatelné suspenze mikročástic s dlouhodobým uvol- v novamm fyziologicky účinné látky mohou být v případě mno-ha léčiv získány zapouzdřením léčiva do biologicky degra-dovatelného polymeru nebo dispergováním léčiva do matricetakového polymeru tak, že s postupnému uvolňování léčivadochází současně s postupnou biologickou degradací matricepoužitého polymeru.
Vhodné biologicky degradovatelné polymery pro po-
užití ve farmaceutických formulacích s trvalým uvolňová-ním fyziologicky účinné látky jsou známé a zahrnují poly-estery, které jsou v případě umístění do vodného prostře-dí fyziologického typu postupně degradovatelné hydrolýzou.Zvláštní skupinu takových polyesterů, použitých k tomutoúčelu, tvoří polyestery odvozené od hydroxykarboxylovýchkyselin a mnoho z dosud takto použitých polyesterů se týkápolymerů odvozených od alfa-hydroxykarboxylových kyselin,zejména od kyseliny mléčné jak v racemické, tak i optickyaktivní formě, a od kyseliny glykolové, přičemž rovněž při-chází v úvahu i jejich kopolymery; o tom viz napříkladpatenty US 3 773 919 a 3 887 699; Jackanicz a kol., Contra-ception, 1973, 8, 227-234; Anderson a kol., tamtéž, 1976,11, 375-384; Wise a kol., Life Sciences, 1976, 19, 867-874;Woodland a kol., Journal of Kedicinal Chemistry, 1973, 16,897-901; Yolles a kol., Bulletin of the Parenteral DrugAssociation, 1976, 30, 306-312; '.Vise a kol., Journal ofPharmacy and Pharmacology, 1978, 30, 686-689 a 1979, 31 ,201 -204.
Je třeba poznamenat, že "trvalé" nebo "dlouhodobé"uvolňování léčiva může být buď kontinuální .nebo diskonti-nuólní. Tak například uvolňování polypeptidu z polylakti-dového polymeru, popsaného v patentu GB 1 325 209 častopředchází výrazná indukční perioda, v průběhu které nedo-chází k uvolňování žádného polypeptidu, anebo je takovéuvolňování polypeptidu dvoufázové a zahrnuje výchozí perio-du, v průběhu které dochází k uvolnění určitého množství v polypeptidu, druhou periodu, v průběhu které se uvolňujepouze malé množství nebo vůbec žádné množství polypeptidu,a konečně třetí periodu, během které se uvolní podstatnáčást zbývajícího množství polypeptidu. Na rozdíl od tohototypu uvolňování polypeptidu je předmětem vynálezu farma-ceutická kompozice polypeptidu, ze které se snad kromerelativně krátké počáteční indukční periody polypeptiduvolňuje kontinuálně a v průběhu tohoto kontinuálníhouvolňování polypeptidu neexistuje časová perioda, v průbě-hu které by se uvolňovalo pouze malé množství nebe dokonce i - 3 - vůbec žádné množství polypeptidu. Výraz "kontinuální uvol-ňování" zde tedy pouze definuje profil uvolňování fyziolo-gicky účinné látky, který je v podstatě monofázový, i kdyžmůže mít inflexní bod, avšak v žádném případě nemá "plo-šinovou" fázi /plateau chase/ v grafu, ve kterém je kumu-lativní uvolňování účinné látky vyneseno v závislosti načase. V evropském patentu 58 481 jsou popsány farmaceutic-ké kompozice s kontinuálním uvolňováním účinné látky, ukterých se dosahuje v podstatě monofázového uvolňování vkyselém prostředí stabilních polypeptidů. Tyto farmaceutic-ké kompozice obecně obsahují colylaktid, který je polyme-rem samotná kyseliny mléčné, kopolymer kyseliny mléčné akyseliny glykolové, směs takových polymerů, směs takovýchkopolymerů nebo směs takových polymerů a kopolymerů a vkyselém prostředí stabilní /jak bude dále definováno/ poly-peptid, který není výrazněji hydrolyzován za podmínek, vekterých se bude farmaceutická kompozice nalézat v průběhuperiody jejího zamýšleného použití; je-li tato komp°ziceumístěna do vodného prostředí fyziologického typu /jak budedále definováno/,potom uvolňuje uvedený polypeptid do uve-deného vodného prostředí fyziologického typu kontinuálnímzpůsobem při profilu uvolňování polypeptidu, který je vpodstatě monofázový, ikdyž může mít inflexní bod, avšak vžádném případě nemá plošinovou fázi,v průběhu alespoň jed-noho týdne.
Jak je to uvedeno ve zmíněném evropském patentu 58481, týkají se uvedené formulace polypeptidů, které jsoustabilní za podmínek přicházejících v úvahu v případě ná-rokované formulace. Avšak některá polypeptidy, jako napří-klad nativní / Met 1 _7 lidský G-CSF, jsou inherentně zatakových podmínek nestabilní a dochází u nich k celé řaděproblémů pramenících z táto nestability, přičemž mezi tytoproblémy mezi jinými patří i tendence k agregaci.
Vynález je založen na objevu, že konjugace s ve vo-dě rozpustným polymerem může eliminovat nebo alespoň řěduko- vat problémy nestability některých polypeptidů, které byjinak za uvedených podmínek nebyly stabilní a které by pro-to nebyly uvolňovány adekvátním způsobem.
Vynález je rovněž založen na objevu spočívajícím vtom, že použití fyziologicky účinné Jatky, ve které je fy-ziologicky účinný polypeptid kovalentně konjugován s vevodě rozpustným polymerem, zlepšuje profil uvolňování po-lypeptidu ve srovnání · s odpovídajícím nekonjugovaným po-lypeptidem ve farmaceutických kompozicích s kontinuálním uvolňováním účinná látky. V nedávné době M.S. Hora a kol. publikovali v Pro-ceed. Intern Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 16, /1989/č. 268'na str. 509-510 přípravu mikrosférické formulace sregulovaným uvolňováním interleukinu-2. M.S. Hora a kol.demonstrují, že se dosáhne třífázového profilu uvolňovániv případě, kdy se pegylovaný interleukin-2 /IL-2 kovalent-ně konjugovaný s polyethylenglykolem /PEG/, který je dáleuváděn jako PEG IL-2; výraz pegylovaný je zde použit jakozkratka výrazu polyethylenglykolovaný/ v přítomnosti fetál-ního telecího séra uvolňuje z poly/DL-laktido-ko-glykolido/-vých mikrosfér, a že v tomto případě existuje 5 až 15 dnůdlouhá zpoždění představující výše zmíněnou indukční perio-du. M.S. Hora a kol. se snaží překonat uvedené problémypokusy zlepšit smáčení a resolubilizaci PEG IL-2 použitímlidského sérového albuminu /HSA-human sérum albumin/.
Tyto pokusy však vedou k dalšímu problému, kterýmje přítomnost solubilizujíčího proteinu. Přítomnost tako-vého proteinu ve farmaceutická formulaci je nevýhodná mimojiné také proto, že zvyšuje riziko nepříznivé vedlejšíreakce a zhoršuje analytickou přesnost.
Navíc ve výše uvedené publikaci /M.S. Hora a kol./nejsou definovány ani rozpouštěcí charakteristiky uvedenéhopoly/EL-laktido-ko-glykolido/vého polymeru /zejména, je-lirozpustný nebo nerozpustný v benzenu/ ani polydisperzita/jak bude definována dále/. Bez těchto údajů a bez popisu —r.w;···/·*»/-A' - 5 - preparativní metody nemůže být uvedená práce reproduková-na a obsaz publikace je takto nevyužitelný. Dále je třebapoznamenat, že v uvedené publikaci není definována ani mo-lekulová hmotnost polyethylenglykolu /PEG/ ani stupeň pe-gylace, přičemž oba tyto údaje jsou nezbytné v případě,že by obsah publikace měl být reprodukován.
Vzhledem k chabým výsledkům týkajícím se kontinuál-mho uvolňování účinná látky a získaným V.S.Horou a kol.s pegylovaným IL-2 se jeví obzvláště překvapivou skutečnost,že v souladu s vynálezem může být dosaženo tak příznivéhoprofilu uvolňováni účinné látky použitím fyziologicky účin-ných polypeptidů kovalentně konjugovaných s ve vodě rozpust-ným polymerem.
Podstata vynálezu Předmětem vynálezu je farmaceutická kompozice konti-nuálně uvolňující v kyselém prostředí stabilní /jak budedále definováno/ fyziologicky účinnou látku z materiálutéto kompozice do vodného prostředí fyziologického typu/jak bude dále definováno/, jejíž podstata spočívá v tom,že uvedenou v kyselém prostředí stabilní fyziologicky účin-nou látkou je polypeptid kovalentně konjugovaný s ve voděrozpustným polymerem, přičemž uvedená látka není výrazněhydrolyzována za podmínek přicházejících v úvahu v kompo-zici během periody zamýšleného použití a kompozice 1/ je-li umístěna do vodného prostředí fyziologic-kého typu, uvolňuje polypeptid do uvedeného vod-ného prostředí fyziologického typu kontinuálnímzpůsobem s profilem uvolňování polypetidu, kte-rý je v podstatě mono-fázový /jak bude defino-váno dále/, po dobu alespoň jednoho týdne; 2/ realizuje dvě následné fáze uvolňování polypep- tidu, přičemž první fáze zahrnuje uvolňování po- lypeptidu difúzí z povrchu a druhá fáze uvolňování - 6 v zahrnuje uvolňování polypeptidu nesledující podegradaci materiálu kompozice, přičemž uvedenádifuzní fáze a uvedená degradací-indukovaná fáze v se časově překrývají a uvolňování polypeptiduprobíhá v průběhu časové periody rovné alespoňjednomu týdnu; nebo 3/ absorbuje vodu kontinuálním způsobem s profilemabsorpce vody, který je v podstatě mono-fázový,až do okamžiku, kdy byl materiál kompozice degra-dován a v podstatě veškeré množství polypeptidubylo uvolněno do vodného prostředí fyziologické- v ho typu v průběhu časové periody rovné alespoňjednomu týdnu. Předmětem vynálezu je rovněž způsob léčení poruchkrvetvorby u savců, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje podaní farmaceutická kompozice podle vynálezu savcům,čímž se poskytne účinné množství polypetidu konjugovanéhos ve vodě rozpustným polymerem, přičemž uvedený polypeptidmá alespoň jednu biologickou vlastnost přirozeně se vysky-tujícího G-CSF. Předmětem vynálezu je rovněž způsob zastavení pro-liferace leukemických buněk u savců, jehož podstata spo-čívá v tom, že se savcům podá farmaceutická kompozice po-dle vynálezu, čímž se poskytne účinné množství polypepti-du konjugovaného s ve vodě rozpustným polymerem, přičemžuvedený polypeptid má alespoň jednu z biologických vlast-ností přirozeně se vyskytujícího G-CSF. Předmětem vynálezu je rovněž způsob léčení osteo-porosy nebo Pagetovy nemoci u člověka trpícího těmitoonemocněními, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnujepodání farmaceutické kompozice podle vynálezu, čímž seposkytne účinné množství lidského calcitóninu konjugova-ného s ve vodě rozpustným polymerem. Předmětem vynálezu je rovněž způsob léčení nádorůnebo nedostatečnosti imunitního systému u savců, jehož podstata spočívá v tom, že se savcům podá farmaceutická kom-pozice podle vynálezu, čímž se poskytne účinné množstvíinterleukinu-2 konjugovaného s ve vodě rozpustným poly-merem. Předmětem vynálezu je rovněž způsob léčení nádorů nebovirové infekce u savců, jehož podstata spočívá v tom, že sesavcům podá farmaceutická kompozice podle vynálezu, čímž seposkytne účinné množství interferonu /výhodně interferonualfa, zejména interferonu alfa2/ konjugovaného s ve vodě roz-pustným polymere^. Předmětem vynálezu je rovněž způsob stimulace růstu ulidí, jehož podstata spočívá v tom, že se lidem podá far-maceutická kompozice podle vynálezu, čímž se poskytne účinnémnožství lidského růstového hormonu konjugovaného s ve voděrozpustným polymerem. Předmětem vynálezu je rovněž způsob přípravy farmaceu-tické kompozice podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom,že se materiál kompozice a fyziologicky účinná látka rozpustív organickém rozpouštědle rozpouštějícím tyto látky nebo semateriál kompozice a fyziologicky účinná látka jednotnědispergují v organickém nebo vodném médiu, načež se uvedenásměs vysuší a upraví do formy vhodné pro implantaci do tělaživočicha.
Tak je možno s výhodou vyrobit například pevný prostře-dek vhodný pro implantaci, účelně pevný depotní preparát veformě válečku, nebo lze připravit, například rozemletím nebomikronizací, preparát ve formě jemných částic pro injekěrrH—g^aplikaci. Tento preparát ve formě jemných částic je mo^Esny.Λ OHdzpracovat na roztok nebo emulzi vhodnou pro injekční aplika-0^^^ci. Toto zpracování je možno uskutečnit například ve vodnémprostředí nebo v oleji, jako v podzemnicovém oleji, ijiefe<$ 'Μkremoforu (viz rovněž Martindale "The Extra Pharmacopoeia", ES9028. vydání, str. 694). Mezi nosná prostředí pro přípravu injekcí náleží karboxymethylcelulóza (viz rovněž Martinda- T , . S F l 0 F υ le "The Extra Pharmacopoeia", 28. vydání, str. 947). -iiyT) - 7a - V případě dispergování materiálu kompozice a fyziolo-gicky účinné látky se tyto látky výhodně dispergují ve vodnémmédiu.
Uvedený způsob podle vynálezu může být použit pro pří-pravu ústrojí uvolňujících léčivo ve formě prutu, kuličky,fólie nebo pilulky vhodných pro implantaci do těla živočicha.Materiálem kompozice může být například polyaktid /napří-klad definovaný výše/ a může mít výhodně alespoň 25 % mo-lárních, výhodně 40 % molárních, jednotek kyseliny mléčné anejvýše 75 % molárních jednotek kyseliny t 1 λΛ3Γ90ν |AZ31VK AOfcd i a'v$n * - - j L 6 ΙΊΙΛ 6 2t Cgo o
’ 8 Η 0 M •f-5 - 8 - glykolové, výhodně ve formě bloků obsahujících v průměrualespoň dvě identické monomerní jednotky. Uvedený polylak-tid je výhodně bud rozpustný v benzenu a má vnitřní visko-zitu /lg/100 ml roztoku v benzenu/ menší než 0,3 nebo jev benzenu nerozpustný a má vnitřní viskozitu /lg/103 mlroztoku v chloroformu nebo dioxar.u/ menší než 4. Při způsobu podle vynálezu se s výhodou používajíobvyklá lyofilizovatelné rozpouštědla, jako například ky-selina octová /výhodně ledová kyselina octová/, která sezmrazí a následně odlyofilizují. Může být výhodné odděleněpřipravit první roztok materiálu kompozice v organickémrozpouštědle rozpouštějícím tento materiál a druhý roztokfyziologicky účinné látky v organickém rozpouštědle roz-pouštějícím tuto látku a teprve potom smísit oba taktopřipravená roztoky. S výhodou se pro přípravu uvedenéhoprvního roztoku a uvedeného druhého roztoku použije stejnérozpouštědlo, které je s výhodou lyofilizovatelné. Tentopostup je ilustrován v evropském patentu 58 481. Je-li tovšak žádoucí, může být použito tavné zpracování intimnípevné směsi materiálu kompozice a fyziologicky účinné lát-ky. Předmětem vynálezu je rovněž způsob přípravy farma-ceutické kompozice podle vynálezu, při kterém materiálkompozice obsahuje polylaktid /jak byl definován výše/,který může být ve formě hydrogelu, přičemž podstata toho-to způsobu spočívá v tom, že se fyziologicky účinná látkainkorporuje do matrice, obsahující polylaktid, který máalespoň 25 % molárních, výhodně 40 % molárních, jednotekkyseliny mléčné a nejvýše 75 molárních jednotek kyselinyglykolové, přičemž způsob dále zahrnuje jednotné smísenífyziologicky účinné látky a materiálu kompozice tavnýmzpracováním intimní pevné směsi fyziologicky účinné látkya materiálu komoozice. Předmětem vynálezu je rovněž použití fyziologickyúčinné látky, která zahrnuje polypeptid kovalentně konju-govaný s ve vodě rozpustným polymerem, při přípravě farma- ceutické kompozice podle vynálezu. A/ Fyziologicky účinná látka
Obecně platí, že čím větší je molekulová hmotnostpolypeptidu, tím větší počet molekul ve vodě rozpustnéhopolymeru může být konjugován s polypeptidem za účelem za-jištění optimálního profilu uvolňování účinné látky. S vý-hodou je alespoň jedna molekula ve vodě rozpustného poly-meru konjugována s polypeptidem s molekulovou hmotností v až 8000 Da a alespoň jedna molekula ve vodě rozpustnéhopolymeru je použita pro každou 3000 - 8000 fa, zejména4000 - 65ΟΟ fa molekulovou hmotnost polypeptidu. Jedna mo-lekula polypeptidu může nést tolik molekul ve vodě rozpust-ného polymeru, kolik je jich konzistentních s retencí po-žadovaného stupně biologické aktivity. Pod tímto tlakemje polypeptid skutečně s výhodou konjugován s maximálnímpočtem molekul ve vodě rozpustného polymeru. Je třeba uvéstže jestliže na daném polypeptidu existuje více míst prokonjugaci s ve vodě rozpustným polymerem, potom může tatomaximální konjugace mít za následek heterogenní směs pro-duktů. Tak například, má-li polypeptid 4 .místa pro konju-gaci s ve vodě rozpustnými molekulami, potom dosažený maxi-mální poměr polypeptidu k ve vodě rozpustnému polymerunesmí být vyšší než například 3,9- A.1/ Polypeptid
Fyziologicky účinná látka použitá ve farmaceutickékompozici podle vynálezu může například zahrnovat lidskýcalcitonin, interleukin-2, lidský růstový hormon nebo interferon, jakým je interferon alfa, například interferonalfa?, kovalentně konjugovaný s ve vodě rozpustným póly-merem, nebo výhodně polypeptid, mající alespoň jednu zbiologických vlastností přirozeně se vyskytujícího G-CSFa výhodně část nebo celou aminokyselinovou sekvenci přiro-zeně se vyskytujícího C—CSF,. kovalentně konjugovaný s ve vodě rozpustným polymerem. Uvedený peptid s výhodou nepo-nese _·. šr.ou volnou thiolovou skupinu a tudíž vzhledem kpolype^tidam majícím alespoň jednu z biologických vlastnos-tí přirozeně se vyskytujícího G-CSF bude cystein v poloze17 výhodně nepřítomen nebo nahrazen jinou aminokyselinou,jakou je například alanin nebo výhodně serin. A.1.1/ Polypeptidv mající alespoň jednu z biologických
vlastnosti G-CSF D? D^dě 2—* l ku tx , že je žádoucí použít polypeptid mající alespoň jednu z biologických vlastností přirozeně se vysky-tujícího G-CSF, potom může být použit libovolný derivátmající takové vlastnosti, avšak výhodně je použitým poly-peptidem derivát G-CSF popsaný v 'evropské patentová při-hlášce 91303268.3, ve které jsou uvedeny deriváty G-CSFmající zlepšenou stabilitu roztoku. Uvedená evropská pa-tentová přihláška popisuje deriváty přirozeně se vyskytu-jícího G-CSF, mající alespoň jednu z biologických vlast-ností přirozeně se vyskytujícího G-OSF s alespoň 35% sta-bilitou roztoku /jak bude dále definována/ při koncentra- 17 i čusbáun 17 27 nativní sekvence nahrazen residuem Ser a Aso nativní ci 5 mg/ml, přičemž uvedené deriváty mají alespoň Cys .du,27 sekvence nahrazen residuem Ser Výhodně mají uvedené deriváty alespoň jednu dalšímodifikaci ze skupiny zahrnující: a/ Glu1 1 nativní sekvence je nahrazen residuem Arg" b/ Leu15 nativní sekvence υθ nahrazen residuem Glu'5 c/ Lys^ nativní sekvence ΰθ nahrazen residuem Arg23 d/ Gly26 nativní sekvence je nahrazen residuem Ala26 e/ Gly28 nativní sekvence je nahrazen residuem 2S Ala f/ AlaJ° nativní sekvence je nahrazen residui L 31 ' •ys r. g/ τ 34Lys" nativní frekvence je nahrazen i residuem , Id ‘ nrg- ' h/ γ toLys nativní frekvence je nahrazen . residueo , dli Arg 30 i/ Pro44 nativní frekvence je /o ( nahrazen residuem Ala i/ Leu49 nativní frekvence Je 49 ! nahrazen residuem Lys k/ Gly51 nativní sekvence de nahrazen residuem Ala5’ 1/ Gly55 nativní sekvence je nahrazen residuem Ala55 m/ Trp58 nativní sekvence de nahrazen residuem Lys58 n/ p 60 Pro nativní sekvence de nahrazen residuem Ser60 o/ 6ς Proc> nativní sekvence ”> a nahrazen residuem Ser65 p/ Pro111 nativní sekvence de nahrazen residuem Glu111 q/ Thr115 nativní sekvence de nahrazen residuem Ser”5 r/ Thr116 nativní sekvence “1 v *-· nahrazen residuem Ser”6 s/ Tyr185 nativní sekvence HP o nahrazen residuem Arg’65 Výhodná je přítomnost alespoň jedné další modifi-kace zvolené ze skupiny zahrnující modifikace b/ až s/,přičemž výhodnější je přítomnost alespoň jedné další mo-difikace zvolené se skupiny zahrnující modifikace b/, d/,e/, f/, n/ a o/ a obzvláště je výhodná přítomnost dalšímodifikace o/.
Další modifikace je výhodněji zvolena ze skupinyzahrnující následující modifikace: i/ Gin11, Pro80’85 nativní sekvence jsou nahrazeny Arg11,60,65 se: ii/ Ala1'1, Thr115’1'8 nativní sekvence jsou nahrazenyGlu111, Ser115’116, .58 65 iii/ Gin11, TrpyC, nativní sekvence jsou nahrazeny 11 ’165, Lys58, i v/ Leu15, Gly26,2c, Ala30Glu15, Ala26’28, Lys30, nativní sekvence jsou nahrazeny 12 /-44v/ ?ΓΟ .eu σι/51’55, ,58
Trp" nativní sekvence jsounahrazeny Ala^^^1p^.
Uvedená další modifikace může rovněž výhodně zahrno-vat alespoň jednu modifikaci z následujících modifikací: vi/ Leu^, Gly2^’2^, Αίο^θ nativní sekvence jsou nahra- :eny Glu'5, Ala26,2°, Arg30, vii/ Pro"2" nativní sekvence je nahrazen SerD:?, 65 vi ii/ Pro^’65 nativní sekvence je nahrazen Ser22’2^ nebo ,n..11 ^65 ix/ Glu , Pro nativní sekvence je nahrazen Arg^1, 65 :er '. Výše definované modifikace mohou být, pokud je topožadováno, zavedeny do jakéhokoliv polypeptidového řetězce,který má alespoň jednu z biologických vlastností přiroze-ně se vyskytujícího G-CSP tak, aby se zlepšila stabilitamolekuly v roztoku. Modifikace, které byly definované výše,mohou být použity u takových polypeptidů, které se lišív aminokyselinovém složení od toho složení, jež je zde po-psáno pro přirozeně se vyskytující G-CSF, a to ve složenínebo umístění jednoho nebo více residuí /například vzniksubstitucemi, terminálními či vnitřními adicemi a delecemi/. Příkladem takových polypeptidů mohou být ty, ježbyly zkráceny například delecí, takové, které se projevujívyšší resistencí k hydrolýze /a tudíž se déle projevuje je-jich efekt, než u přirozeně se vyskytujících/; dále ty,které byly pozměněny tak, aby bylo odstraněno místo pro po-tenciální O-glykosylaci /což může vyústit ve vyšší aktivi-tu pro látky produkované kvasinkami/ nebo takové, kde je-den Či více cysteinových residuí bylo odstraněno nebo na-hrazeno například alaninovými nebo serinovými residuí ajsou snadněji izolovatelné v aktivní formě z mikrobiálních 13 systému. Eále sem patří polypeptidy, které mají jeden, čivíce tyrosinových residuí nahrazeny fenylalaninem a mohoubýt více či méně vázaný k lidských G-CSF buněčným recepto-rům. Navržené modifikace z výše uvedené evropské patento-vé přihlášky 91303868.3 mohou být takto například apliko- vány na bud nativní G-CSF mající Cys nativní sekvence17 nahrazen residuem Ser nebo Qeho alelické varianty a ana-loga, o kterých je známo, že mají alespoň jednu z biolo-gických vlastností přirozeně se vyskytujícího G-CSF a kte-ré jsou například popsány v patentovém dokumentu FCT WO67/01132, v evropském patentovém dokumentu 243 153» v evrops-kém patentovém dokumentu 256 843, v evropském patentovémdokumentu 272 6Ο3, v Siochemical and Biophysical ResearchCommunications /~1989_7, sv. 159, č.1, str.103-111, Kuga T.a kol. a v patentu US 4 904,584. , že takové G-CSF deriváty mají lepšíž odpovídající nemodifikované peotidynezměněné biologické účinnosti nebozlepšené biologické účinnosti.
Bylo zjištěnostabilitu roztoku nea to při v podstatědokonce při dosažení
Stabilita roztoku je zde měřena stanovením procen-tického množství derivátu G-CSF, které zůstane v roztokuve fosfátem pufrovanám fyziologickém roztoku po 14 dnechpři teplotě 37 °C při počáteční koncentraci 1mg/ml, 5 mg/mla/nebo 10 mg/ml. Měření stability roztoku je detailně po-psáno v referenčním příkladu 26. Výhodně budou mít deri-váty G-CSF použité ve farmaceutických kompozicích podlevynálezu stabilitu roztoku při koncentraci 5 mg/ml rovnoualespoň 35 %, výhodněji alespoň 50 % a obzvláště výhodněalespoň 75 Výhodně budou mít polypeptidy podle vynálezustabilitu roztoku při koncentraci 10 mg/ml rovnou alespoň 75 zejména alespoň 85 použité ve farmaceutickýchtak, aby měli jednu ziv/, v/, vi/, vii/, viii/, výhodněji jednu z dal-, vii/, viii/ nebo ix/ a Výhodně se deriváty G-CSFkompozicích podle vynálezu zvolídalších modifikací i/, ii/, iii/,nebo- ix/, které byly uvedeny výšeších modifikací i/, ii/> iv/, vi/ - 14 - obzvláště výhodně další modifikaci ii/, iv/, vi/, vii/,viii/ nebo ix/.
Obzvláště výhodné deriváty G-CSF pro použití vefarmaceutických kompozicích podle vynálezu z hlediska dobréstability roztoku zahrnují: / Arg11, Ser17’27’60’65_7G-CSF, /“Olu15, Ser17’27, Ala26’28, Lys3°_7G-CSF, CArg11, Glu15, Ser17’27’60’65, Ala26’28, Lys3°_7G-CSF,/"Arg1 1 ’34, Ser17’27’00’o5_7G-CSF, ΓArg11 ,4°, Ser17527’60’657g-CSF,
3 .T_4 iv,,5,11 ci7,27,60,65 T L Ala' , Thr , Tyr\ '_/G-CSF, /Arg11, Glu15’11', Ser17,27,60’65,115,116. Ala26’28, Lys3£7-G-CSF, /"Arg11’165, Glu15, Ser17’27’60565, Ala26’28, Lys30,58_7-G-CSF, /W1, Glu15, Ser17 ’27 ’ 60 ’ 65 , Ala26’28’44’51’55,-Lys30’49 ’ 58_7G-CSF, /"^σ11,ι65 nlu15,1H Sor17,27,60,65,115,116
Ala26,2S,44;51,55} Lys3^49,5S_7G_CSFj /""Glu15, Ser17,27, Ala26’28, Arg3°_7hu G-CSF. mimořádně výhodné deriváty G-CSF pro použiti vefarmaceutických kompozicích podle vynálezu z hlediska zna-menité stability roztoku a dobré specifické aktivity za-hrnují: - 15 - i/ / Arg11, Ser1^’2^’^O’6^_7G-CS?, li/ /Glu1^, Ser1^’27, Ala^6’20, Lys3°_7G-CSF, iii/ iv/ v/ vi/ /"Arg” , C-lu'5, ser'7’27’63’65’ Ala26’28, Lsy3°_7g-CSF/Άγ8" ’40, Ser1 7 >27 ’ 63 65_7g-CSF, /""Arg1 ',23, Ser’7’z7’60’65_7g-CSF,
<Arg"’165, Olu17’27’63’65, Al226,28, Lys30,58j7Q_CSF vii/ /Arg11, Glu1^’111, 36^7^7,60,65,115,116 ^^26,28 _
Lys^^G-CSF, viii/ / Glu1y, S? /7,27 ,Ίο26,28 Λτ>,30 > Λ-LcÍ
, ArgJ\_7G-CSI ix/ / Ala , Thr , 4 5 1 i v" - > --- to ,
Ser17’27> 6°,65_/G_CSF) x/ / Ser 7 >27,60,65 7, xi/ /“Arg'1 , Ser17’27>°5_7g_CSF a kii/ /~Ser17’27>65_7G_cs? , přičemž z těchto derivátů jsou nejvýhodnější deriváty i/,ii/, iii/, vi/, vii/, viii/, x/, xi/ a xii/.
Tyto posledně uvedené deriváty lidského G-CSF majínejen znamenitou stabilitu roztoku, ale také zlepšenouspecifickou aktivitu vzhledem k přirozeně se vyskytujícímulidskému G-CSF. V polypeptidech podle vynálezu může být nebo nemusíbýt přítomna methioninová presekvence, i když přítomnosttéto presekvence je výhodná.
Pokud jde o přípravu derivátů C—CSF pro použití vefarmaceutických kompozicích podle vynálezu, ukázalo se vý- hodným použití produkčního vektoru odvozeného od pAT153,obsahujíčího: i/ promotor a k němu operátor, například trp promotornebo T7A3 promotor. T7A3 je A3 promotor bakterio-fégu T7 /vz. Dunn J.J. a Studier F.W.: J.Dol. Siol.166, 477-535 /1583/. Úplná nukleotidová sekvenceDNA bakteriofágu T7 a umístění genetických částíT7 je popsáno ve výre uvedeném odkazu; ii/ sekvenci pro vazebné místo ribosomu, například va-zebné místo pro vedoucí trp ribosom; iii/ kionovací místo pro gen, jež má být exprimován; iv/ T4 transkripční terminálni sekvenci /viz SEQ ID č. 51 a obr.4/; v/ cer sekvenci /Summers D. a kol. EGG, 201, str.334-33&amp;, I5b5/; vi/ tetracyklinový represorový gen /gen pro represitetracyklinem/ Tet R; vii/ gen odpovědný za resistenci k tetracyklinu Tet A; viii/ mnohačetné rozpoznávací sekvence restrikčních enzymu SSQ ID č.50 uvádí sekvenci, která obsahuje místopro štěpení restrikční endonukleasou EcoRI /nukleotidy 1-6/, sekvenci promotoru A3 /nukleotidy 7-52/, vedoucí sekvenci pro vazebné místo trp na ribosomu /nukleotidy 53-7S/a translační iniciační kodon /nukleotidy 75-81/. Výhodná může být kultivace hostitelských buněk,schopných exprimovat derivát G-C5F /jak byl definován vý-še/ , v růstovém médiu s obohacením kultivačního media pří-davkem obsahujícím kvasničný extrakt. Je výhodné, aby k ®K3SX^£V»-»V4\V.'-Í'/xZ.'$».«z'»S'Vi- ,,.'λΓ, .·'.·. 17 přídavku látek s kvasničným extraktem došlo po začátkukultivace, ale v době před počátkem sledovaní produkce.Dávkovaní musí být přizpůsobeno tak, aby nedošlo běhemkultivace k vyčerpání kvasničného extraktu v mediu. Dáleje obzvláště výhodné použití produkčního vektoru s promo-torem T7A3.
Současně výhodná může být kultivace hostitele trans-formovaného rekombinantním vektorem, jež nese genetickýmateriál pro derivát G-C3F /jak byl definován výše/, vpřítomnosti leucinu a/nebo threoninu v množství dostateč-ném pro zlepšení akumulace derivátu G-CSF. Obzvláště vý-hodné je pak ovlivnění fermentace přítomností leucinu,kdy použitý produkční vektor obsahuje trp promotor. Čištění derivátu G-CSF by mohlo být provedeno po-stupem popsaným v patentovém dokumentu PCT WO S7/01132,avšak v tomto dokumentu není žádný odkaz týkající seodstranění detergentu, zejména N-lauroylsarkosinu ve forměsoli /například Sarkosyl/, z analogů G-CSF připravenýchv uvedeném dokumentu PCT. Odstranění detergentu se výhod-ně provádí v přítomnosti fosfátem pufrovaného fysiologic-kého roztoku /pH 7,2 - 7,5/.
Fosfátový pufr může být připraven z isotonickýchsolí a může mít složení popsané v příkladu 3· Méně použi-telné jsou v tomto ohledu jiné pufry vzhledem k tomu, žebuď dochází k menšímu odstranění detergentu, obzvláště seto pak týká N-lauroylsarkosinu, nebo se zvyšuje vysrázenémnožství bílkovin z roztoku. V tomto stupni se dále s vý-hodou využívá učinku diafiltrace, protože bylo zjištěno,že dochází ke zvýšení účinnost bez vyvolání zvýšené pre-cipitace proteinu. Diafiltrací se například dává přednostpřed běžnou difuzní dialýzou. Dále bylo zjištěno, že kon-centraci detergentu, obzvláště N-lauroylsarkosinu ve forměsoli, lze snížit pod 1x> koncentraci, jestliže dochází kjeho rozkladu během chromatografie. Vzhledem k tomu, želze zvýšit možnost odstranění detergentu ~<·. sníženímjeho počáteční koncentrace, používá se tíetergent již v mi-nimální původní koncentraci; například u N-lauroylsarkosinu 18 je to stejná koncentrace, která se rozkládá během chroma-tografie.
Jednotlivé koncentrace detergentu se pohybují od0,8 do 0,2 %, lépe pak od 0,5 do 0,2%, v nejlepším přípa-dě je koncentrace 0,3%. K výše uvedeným poznatkům je třeba dodat, že bylozjištěno, že odstranění detergentu, jakým je N-lauroylsar-kosin ve formě soli /například Sarkosyl/, aktivuje stopyproteolytické aktivity, která může komplikovat vznik pro-duktu. Dále bylo zjištěno, že tato proteolytická aktivitamůže být výrazně snížena či eliminována, jestliže po odstranení detergentu diafiltrací dojde ke snížení pH pod hodno-tu pH 7,0, a to diafiltrací či lépe dialýzou. Snížení ne-bo eliminace proteolytické aktivity může být dosaženo připH, jež je nižší než 7,0, ale je naopak dostatečně vysoké,aby se vyloučila určitá možná hydrolýza polypeptidu. Vhod-né pH se pohybuje v rozmezí od 6,0 do 4,5, lepší je pakpH od 5,S do 5,0, obzvláště pak pH 5,4. Výhodou je též to,že kontaminanty<, produkované E.coli a nebo vzniklé přítom-ností degradovaného či nesprávně syntetizovaného proteinu,mohou být při působení nižšího pH vyloučeny vysrážením.
Je výhodné, jestliže při purifikaci je použita chromato-grafie založená na principu dělení podle velikosti /gelováchromatografie/ vzhledem k tomu, že jinak se zvyšuje ne-bezpečí proteolytické degradace a zatímco předešlé opatře-ní /snížení pH/ snižuje možnost takové degradace, bez po-užití chromatografie je těžké ji vyloučit. Dále je nutné uvést, že již zmiňovaná stabilitaG-CSF a jeho derivátů v roztoku umožňuje zjednodušit pro-ces extrakce. Metoda pro extrakci výše definovaného deri-vátu spočívá v : 1/ suspendaci uvedených inkluzních částic v deter-gentu, jakým je zejména N-lauroylsarkosin veformě soli /Sarkosyl/, 2/ oxidaci 3/ odstranění detergentu dříve popsaným způsobem, 4/ zachování roztoku získaného následným odstraněním 20 A. 1.2/ Ostatní polypeptidy
Lidský calcitonin je popsán v patentu GB 1 270 595a může být připraven například peptidovou syntézou neborekombinantními technikami / viz například zveřejněnéevropské patentové přihlášky 77 689, 70 675, 95 351, 197794, 201 511 a 308 067 a patenty US 3 891 614 a 3 926 9387.S výhodou se může lidský calcitonin kovalentně konjugovanýs ve vodě rozpustným polymerem připravit peptidovou synté-zou vzhledem k dostupnosti volné N-terminální aminové sku-piny a další volné aminové skupiny na jediném lysinovémresiduu, které jsou využitelné pro kovalentní konjugacive vodě rozpustného polymeru. Příprava lidského calcitoni-ru bud peptidovou syntézou nebo rekombinantními technikamiještě před konjugací s ve vodě rozpustným polymerem můžemít za následek vytvoření heterogenní směsi produktů.Jestliže je však relevantní aminokyselinový zbytek /nebozbytky/ kovalentně konjugován s ve vodě rozpustným poly-merem ještě před inkorporací do celkové peptidové synézy,potom nevzniká heterogenní směs produktů ale jako produktsyntézy vzniká jediná molekulární jednotka. Jestliže jeto však žádoucí, může být lidský calcitonin samozřejměpřipraven buď peptidovou syntézou nebo rekombinantnímitechnikami a teprve potom může být takto připravený lidskýcalcitonin kovalentně konjugován s vě vodě rozpustným po-lymerem.
Interleukin-2 je rozpustným glykoproteinem, zlepšu-jícím kvalitu imunitního systému a produkovaný T-lymfocytypo aktivaci antigeny nebo mitogeny v přítomnosti inter-leukinu-1 . Interleukin-2 indukuje růst T-buněk a jejichproliferaci, potenciuje uvolňování gama-interferonu, růsto-vý faktor 3-buněk a diferenciační faktor B-buněk, zlepšujepřirozenou hubící aktivitu buněk a restauruje funkci T-bu-něk při onemocněních souvisejících s nedostatečností imu-nitního systému. Izolace lidského IL-2 genu byla popsána S. Mita a kol v 3iochem, Res. Commun. 117, 114 /1983/ a mikrobiální produkce interleukinu-2 byla popsána například - 21 - „t ς η f ϊ < μ A .;'V. v evropském patentovém dokumentu 142 268. Kromě toho byly rovněž popsény různá analogy interleukinu-2, jako například1 25 des-alanyl Ser IL-2; tyto analogy jsou například popsá-ny v patentech US 4 518 584 a 4 533 787. V patentovém do-kumentu PCT WO 87/00056 byla rovněž popsána konjugace po-lypeptidu majícího IL-2 aktivitu, jakým je například uve-děný analog des-alanyl Ser "iL-2, k polyethylenglykolu.Peptidy mající aktivitu interleukinu-2, jakými jsou samot-ný interleukin-iť a jeho analogy, stejně jako tyto peptidykovalentně konjugované s ve vodě rozpustným polymerem, ja-kým je například polyethylenglykol, jsou potenciálně použi-telné při léčení rakoviny.
Lidský růstový hormon /HGH-human growth hormone/ jespecifickým anabolickým proteinem, který podporuje somatic-ký růst, stimuluje syntézu proteinů, reguluje metabolismuscukrů a tuků a zvyšuje hladinu somatomedinů v séru. Amino-kyselinová sekvence lidského růstového hormonu, jakož iklonování a exprese DNA pro lidský růstový faktor v bakte-riích jsou popsané D.V. Goeddel-em a kol. v Nátuře 281, 544/1979/, dále v belgickém patentu 884 012 a v patentu US4 342 832. Klonování a exprese DNA pro lidský růstový hor-mon v buňkách savců jsou popsané G.N. Pavakis-em a kol. vProč. Nati. Acad, Sci, USA 78. 7398 /1981/ a rovněž ve fran-couzském patentu 2 534 273·
Je třeba uvédt, že lidský růstový hormon obsahujedva druhy proteinu, přičemž jeden z nich má molekulovouhmotnost 22 kDa a druhý má molekulovou hmotnost 20 kDa/viz U.J.Lewis a kol. J.Siol. Chem. 253j 2679-2687 /1978/a R.N.P.Singh a U.J.Lewis, Prep. Biochem. 11 559-570 /1981//.Varianta lidského růstového hormonu s molekulovou hmotnos-tí 20 kDa /20K-HGH/ tvoří 5 až 10 % z celkového množstvílidského růstového hormonu v lidském předním podvěsku moz- kovém, krevní plasmě a moči. Analýza provedená za účelemzjištění aminokyselinové sekvence ukázala, že variantalidského růstového hormonu s molekulovou hmotností 20 kDase od varianty lidského růstového hormonu s molekulovou - 22 - hmotností 22 kDa liší pouze v tom, že ji chybí sekvenceaminokyselin 32-46· Varianta lidského růstového hormonus molekulovou hmotnosti 23 kDa má jinak srovnatelnourůst-podporující aktivitu a veškerou jinou biologickouaktivitu s výjimkou, že nevykazuje žádnou anebo vykazujepouze redukovanou insulinovou aktivitu. Molekulární klo-nování DNA kódující variantu lidského růstového hormonus molekulovou hmotností 20 kDa je popsáno v 3iochimica etBiophysica Acta 949 /1988/ 125-131 N.Masuda-em a kol..
Interferon je název pro skupinu specifických pro-teinů obratlovců, poskytujících nespecifickou resistencivůči širokému spektru virových infekcí, ovlivňujících pro-liferaci buněk a modulujících imunitní odezvy. Interferonybyly rozsáhle popsány v odborné literatuře /”viz napříkladC. Weissman, H. Weber, Prog. Nucl. Acid. Res. Mol. 3iol. 33,251-300 /1986/ a K.C. Zoon, Interfero 9, 1-12 /l987/_7. Tři hlavní složky skupiny interferonu jsou označeny jakoalfa-interferon, beta-interferon a gama-interferon, při-čemž jsou identifikovatelné na základě jejich indukčníchfaktorů a buněčného zdroje, ze kterého jsou odvozeny /Nátuře286, 110 /1980/. Tyto interferony mohou být připraveny li-bovolnou požadovanou technikou, například pomocí rekombi-nantní DNA technologie. Příprava interferonu alfa byla po-psána S. Nagata-em a kol, Nátuře 284, 316 /1980/ a D.V.Goeddel-em a kol., Nátuře 287, 411 /1980/, i když obzvláštědobře popsal přípravu interferonu alfa2 M.D.Sdge a kol.,Nucleic Acids Research, sv. 11, č. 18, 6419-6435 /1983/.
Rekombinantní příprava interferonu beta byla popsá-na T.Taniguchi-em a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77, 523Ο /1980/ a R.Derynck-em a kol., Nátuře 285, 542 /1980/.Rekombinantní příprava interferonu gama je popsána F.W.Gray-em a kol., Nátuře 295» 5^3 /1982/ a struktura genulidského interferonu gama byla popsána P.W.Gray-em a D.V.Goeddel-em, Nátuře 296, 859, 1982. Interferony jsou dálepopsány v Biotechnology and Genetic Sngineering Rewiews,sv.2, str. 215 /1984/ M.D.Edge-m a R. Camble-m. - 23 - v
Je třeba uvést, že alespoň některé interferony mo-hou být labilní při pH asi 8,5·
Použitým interferonem je s výhodou interferon alfanebo interferon beta, výhodněji interferon alfa a zejménavýhodně interferon alf·
Obecně mohou být peptidy vhodné pro použití v rámcivynálezu připraveny rekombinantními technikami nebo pepti-dovou syntézou. Peptidové syntéza může představovat výhod-nou preparativní techniku všude tam, kde to velikost pep-tidu dovolí a kde je přítomna více než jedna volná aminováskupina /například N-terminélní aminová skupina a jedennebo více lysinových zbytků/ pro kovalentní konjugaci s vevodě rozpustným polymerem, jehož příklady byly uvedeny výšeVýhoda takové preparativní techniky spočívá v tom, že ly-sinový zbytek nebo lysinové zbytky konjugované s ve voděrozpustným polymerem mohou být zavedeny na specifická místav molekule, důsledku čehož vznikne jediné chemické indivi-duum a nevznikne heterogenní směs produktů, které by vznik-ly při kovalentním konjugovéní ve vodě rozpustného polymerus peptidem majícím několik volných aminových skupin.
Bez ohledu na použitou preparativní techniku můžebýt výhodné modifikovat peptid : i/ substitucí existujících zbytků jinými zbytky,například lysinovými zbytky, pro fixování mo-lekul ve vodě rozpustného polymeru, ii/ adicí nových takových zbytků pro fixování molekul ve vodě rozpustného polymeru, napří-kladVN- a/nebo C-ukončeních nebo kdekolivjinde v molekule za předpokladu, že tato adicenezruší nebo nepřijatelně neredukuje aktivitupeptidu a/nebo iii/ substitucí nebo odstraněním jednoho nebo vícetakových zbytků, například lysinových zbytkůza ůčelen snížení stupně fixování molekul vevodě rozpustného polymeru, čímž dojde i k re- - 24 dukci heterogenního charakteru produktu a/ne-bo k zabránění fixování ve vodě rozpustného po-lymeru v místech molekuly, ve kterých by fixo-vání ve vodě rozpustného polymeru způsobilozrušení nebo redukci aktivity peptidu.
Kovalentni konjugování molekul ve vodě rozpustnéhopolymeru, jakým je například polyethylenglykol, k již vy-tvořenému peptidu nebo ke specifickým aminokyselinám ještěpřed vytvořením peptidu, může být provedeno libovolnýmvhodným způsobem, například dále uvedenými metodami. A. 2/ Ve vodě rozpustný polymer
Ve vodě rozpustným polymerem kovalentně konjugova-ným s polypeptidem může být například dextran nebo poiy/N-vinylpyrroiidon/, i když výhodným ve vodě rozpustným poly-merem je s výhodou polymer zvolený ze skupiny zahrnujícípolyethylenglykol, polypropylenglykolové homopolymery, po-lyoxyethylované poiyoiy a poiyvinylalkohol, přičemž uve-dený homopolymer je nesubstituován nebo substituován najednom konci alkylovou skupinou.
Specifickými polymery, se kterými je polypeptid ko-valentně konjugován, jsou homopolymer polyethylenglykolu/PEG/ nebo polyoxyethylovaný polyoi za předpokladu, že ty-to polymery jsou ve vodě rozpustné při pokojové teplotě.Příklady poiyoxyethylováných polyolů zahrnují napříkladpolyoxyethylovaný glycerol, polyoxyethylovaný sorbitol ne-bo poiyoxyethylovanou glukózu. Základní glycerolový řetězec polyoxyethylovanéhoglycerolu je shodný s glycerolovým řetězcem, který se při-rozeně vyskytuje například v živočišných a lidských mono-,di- a triglyceridech. Vzhledem k tomu se na tuto poiymerníčást konjugátu polymer-peptid nelze dívat jako na faktor,který je pro tělo cizí. Výhodně je uvedeným polymerem nesubstituovaný póly- - 26 avšak výhodně je rovna 15 000 a obzvláště výhodně je rovna10 000. S výhodou leží molekulová hmotnost polymeru v roz-mezí mezi 1000 a 15 000, například mezi 2000 a 10 000 azejména mezi 2000 a 5000.
Jestliže má polypeptid alespoň jednu z biologickýchvlastností přirozeně se vyskytujícího G-C3F a jestliže sejako ve vodě rozpustný polymer použije homopolymer poly-ethylenglykolu nebo mono-methvlem substituovaný homopoly-mer polyethylenglykolu, potom nejnizáí molekulová hmotnostve vodě rozpustného polymeru bude normálně 1000, výhodně1250, obzvláště výhodně 1500 a nejvýhodněji asi 2000.
Polypeptid bude kovalentně konjugován s vě voděrozpustným polymerem, jakým je polyethylenglykol, polypro-pylenglykolové homopolymery, polyoxyethylováné polyoly apolyvinylalkohol, kde uvedený homopolymer je nesubstituo-ván nebo substituován na jednom konci alkylovou skupinou. Výše popsané polypeptidy mohou být například kon-jugovány s uvedeným polymerem prostřednictvím : 1/ volné aminové skupiny nebo volným aminových sku-pin, 2/ alespoň jednoho uhlohydrátového zbytku na pro-teinu nebo 3/ volné sulfhydrylové skupiny nebo volných sulf-hydrylových skupin, která je, popřípadě kteréjsou přítomné v nativní molekule nebo která je,popřípadě které jsou zabudovány do molekuly.
Takové techniky jsou detailně popsány v patentovémdokumentu PCT WO 89/06546 ve spojitosti s fc-CSF.
Vynález konkrétně poskytuje způsob přípravy G-CSFpolypeptidu /jak byl definován výše/ kovalentně konjugo-vaného s polyethylenglykolem nebo G-CSF polypeptidu kova-lentně konjugovaného s polyoxyethylováným polyolem, kterýspočívá v tom, že se přebytek aktivovaného esteru nebokarbonátu polyethylenglykolu nebo polyoxyethylovaného po- lyolu,s G-CSF polypeptidem. který byl definován výše, čímžATvede do styku - 25 - ethylenglykol /PEG/, monomethylpolyethylenglykol /mPEG/nebo polyoxyethylováný glycerol /POG/, zejména monomethyl-polyoxyethylenglykol /mPEG/, přičemž tento polymer je vý-hodně spojen s uvedeným poiypeptidem přes amidovou nebouretanovou vazbu vytvořenou například z 4-hydroxy-3nitro-benzensulfonátového esteru nebo N-hydroxysukcinimidovéhoesteru polyoxyethylovane glycerolové karboxylové kyseliny,polyethylenglykolové karboxylové kyseliny nebo monomethyl-polyethylenglykolové karboxylové kyseliny nebo z p-nitro-fenylkarbonátu nebo 2,4,5-trichlorfenylkarbonátu polyethy-lenglykolu, monomethylpolyethylengiykolu nebo polyoxyethy-lovaného glycerolu. Je-li to žádoucí, může být polypeptidpřipojen k monomethylpolyethylengiykolu přes aminokyseli-nu nebo peptid způsobem popsaným L. Sartore-m a kol. vAppl. Biochem. Biotechnol. 27 45-54 /1991/.
Je výhodné, aby molekulová hmotnost polymeru bylamezi asi 300 a 100 000, výhodněji mezi 350 a 40 000, cožje například závislé na konkrétním použitém peptidu. V tom-to případě je molekulová hmotnost uvedená ve spojitostis ve vodě rozpustným polymerem střední číselnou molekulo-vou hmotností, ale vzhledem k tomu, že by uvedené polyme-ry měly mít polydispersitu /jak bude dále definována/ rov-nou asi 1, odpovídá uvedená střední číselná molekulováhmotnost přibližně střední hmotnostní molekulové hmotnos-ti.
Polyethylenglykolový homopolymer může být nesubsti-tuován, ale může být rovněž substituován na jednom koncialkylovou skupinou. S výhodou je tato alkylová skupinaalkylovou skupinou obsahující 1 až 4 atomy uhlíku a nej-výhodněji je touto alkylovou skupinou methylová skupina.Výhodně je polymer nesubstituovaným polyethylenglykolovýmhomopolymerem, mono-methylsubstituovaným polyethylenglyko-lovým homopolymerem nebo polyoxyethyiovaným glycerolem amá spodní hranici molekulové hmotnosti výhodně asi 1000,výhodněji 1250 a obzvláště výhodně 1500, a horní hranicimolekulové hmotnosti rovnou například 20 000. Tato horníhranice molekulové hmotnosti může být rovna až 40 000, - 27 se vytvoří C—CSF polypeptid, který je v podstatě maximál-ně konjugovaný s polyethylenglykolem nebo polyoxyethylo-vaným polyolem. Uvedený aktivovaný karbonát polyethylen-glykolu nebo uvedený aktivovaný karbonát polyoxyethylova-ného polyolu se s výhodou připraví uvedením do styku po-lyethylenglykolu nebo polyoxyethylovaného polyolu, který v má alespoň jednu hydroxylovou skupinu, s chlormravenčanem. S výhodou je molérní poměr aktivního esteru nebokarbonátu polyethylenglykolu nebo polyoxyethylovaného kar-bonátu k G-CSF polypeptidu roven 200:1 až 50:1 , výhodněji150:1 až 50:1 a nejvýhodněji asi 100:1.
Použitý postup je shodný s postupem popsaným Vero-nese-m a kol. v Applied Biochem. and Biotech., 11:141-152/1985/, následně použitým firmou Cetus Corporation pro příprávu interleukinu-2 a přihlášeným v patentu US 4 902 502/datun podání: 23.1.1989/. 7 případě, že konjugace ve vodě rozpustného poly-meru k polypeptidu snižuje fyziologickou účinnost poly-peptidu a že tedy biologická aktivita rezultujícího konju-gátu je nižší než biologická aktivita výchozího polypepti-du a především nižší než určitá přijatelná mez, potom mů-že být tenoo nedostatek překonán : 1/ použitím štěpitelné vazby mezi polypeptidem ave vodě rozpustným polymerem, takže po uvolněníkonjugátu polypeptid-ve vodě rozpustný polymerz materiálu kompozice in vivo, dochází k opětné-mu odštěpení ve vodě rozpustného polymeru od po-lypeptidu, který takto samotný má opět svojípůvodní dobrou fyziologickou účinnost, nebo 2/ konstrukcí molekuly polypeptidu /jak je to na-příklad popsáno v patentu US 4 904 584/ takovýmzpůsobem, aby ke konjugaci ve vodě rozpustnéhopolymeru došlo v místech polypeptidu, které vý-razněji nepříznivě neovlivňují fysiologickouúčinnost konjugátu. 28
Je-li to žádoucí múze být uvedené sníženi fysiologickéúčinnosti polypeptidu jednoduše eliminováno nebo alespoňomezeno na minimum zvýšením množství konjugátu přítomnéhove farmaceutické kompozici podle vynálezu. B. Materiál kompozice
Materiálem kompozice může být libovolný vhodný typpolymeru nebo libovolná vhodná směs polymerů, jako napří-klad polylaktid /jak již byl definován výše/ nebo biolo-gicky degradovatelný hydrogel odvozený od amfipatickéhobloku kopolymerů /například hydrogel popsaný v evropskémpatentu 92 918/ a směsi polylaktidů a uvedených hydrogelů.Zejména mohou být použity hydrogely, jejichž složka lineár-ního nebo rozvětveného blokového kopolymerů má termodyna-mickou identitu shodnou s termodynamickou identitou hydro-fiiní jednotky /ve vodě rozpustný polymer/ připojené k po-lypeptidu. Tak může být například obzvláště užitečné po-užít pegylované /poiyethylenglykolované/ polypeptidy samfipaty obsahujícími polyethylenglykol.
Materiálem kompozice může být takto například poly-laktid /jak byl definován výše/, který je například popsánv evropském patentovém dokumentu 58 481 .
Uvolnění makromolekulárních léčiv z polylaktidůje závislé na struktuře polylaktidů /tj. na distribuci adélce komonomerních jednotek v kopolymerech kyseliny mléčnéa kyseliny glykolové/, molekulové hmotnosti homo- a kopo-lymerů kyseliny mléčné a kyseliny glykolové a na distri-buci molekulových hmotností nebo polydispersitě uvedenýchhomo- a kopolymerů. V důsledku toho jsou výhodnými poly-laktidy /avšak výběr polylaktidů není omezen pouze na tytovýhodné polylaktidy/ ty polylaktidy, které jsou nerozpust-né v benzenu a mají vnitřní viskozitu 1% /hmotn./obj./ roz-toku v chloroformu při teplotě 25 C vyšší než 0,09 dl/gavšak nižší než 4 dl/g, nebo jsou rozpustné v benzenu amají vnitřní viskozitu Eé /hmotn./obj./ roztoku v chloro- 29 formu vyšší než 0,09 dl/g avšak nižší než 0,5 dl/g a vý-hodněji nižší než 0,3 dl/g.
Jinou výhodnou skupinou polylaktidů jsou polylakti-dy, které mají střední číselnou molekulovou hmotnost vyššínež 2000 a které mají regulovanou dispersitu tak, že prostřední číselnou molekulovou hmotnost 2000 až 1 0000 činípolydispersita 1,2 až 5θ a pro střední číselnou molekulo-vou 5θ00 až 30000 se polydispersita pohybuje v rozmezí od 1,4 do 15· Výhodná střední číselná molekulová hmotnost sepohybuje v rozmezí od 2000 do 20000. Viskozitní vlastnostiroztoku a jejich měření a měření molekulových hmotností jepopsáno v "Preparative í.íethods of Polymer Chemistry", 2.vydání, str. 43 až 52, W.R. Sorenson a Tod W. Campbell, 1968, Interscience Publishers.
Tyto různé vlastnosti polymeru stanovují profildegradace jak samotného polylaktidů, tak i farmaceutickékompozice vytvořené na bázi takového polylaktidů.
Uvedený profil degradace polylaktidů zahrnuje tvor-bu mikropórů v degradujícím polylaktidů, přijímání vodydegradujícím polylaktidem a konečně erozi nebo ztrátu hmot-nosti degradujícího polylaktidů. V tomto ohledu je difúzefysiologicky účinné látky skrze samotný polymer funkcírozpustnosti fysiologicky účinné látky a velikosti moleku-ly fysiologicky účinné látky. Z jednoho nebo z obou uve-dených důvodů nemusí být fysiologicky účinná látka schopnadifúze skrze polymerní fázi. V tomto případě může k uvol-ňování fysiologicky účinné látky dojít některým jiným me-chanismem, například skrze vodné póry v polymerní matrici.Může být proto žádoucí použít polymery, které mají plynulýpříjem vody s časem, přičemž tento plynulý příjem vody másouvislost s tvorbou vodných mikroporů v degradující matri-ci, která potom degraduje na rozpustné fragmenty a eroduje. I když není snaha vázat skutkovou podstatu vynálezuna nějákou teorii, předpokládá se, že kovalentní konjugacepolypeptidu s ve vodě rozpustným polymerem, zejména s poly-oxyethylenovými polymery za vzniku fysiologicky účinné látky - JO - /jak byla definována výše/ výhodně ovlivňuje perkoiačnípráh /jak bude definován dále/ farmaceutické kompozice skontinuálním uvolňováním účinné látky. Uvedený perkoiačnípráh je funkcí stupně inkorporace fysiologicky účinné lát-ky do polymerní matrice v bezvodé kompozici a stupně kom-patibility fysiologicky účinné látky s polymerní matricí,a charakteru a stupně fázové separace při hydrataci uvede-né kompozice. Délka řetězce polypeptidu, molekulová hmotnost vevodě rozpustného polymeru a stupen inkorporace ve voděrozpustného polymeru jsou znaky, které ovlivňuji kompati-bilitu fysiologicky účinných látek. V případě, kdy je to žádoucí, mohou mít farmaceutic- v ké kompozice s kontinuálním uvolňováním účinné látky podlevynálezu krátkou indukční periodu probíhající ještě předtímnež započne uvolňování fysiologicky účinné látky. Délkatéto indukční periody se muže měnit v závislosti na množst-ví fysiologicky účinné látky, které má být uvolněno, a nadobě, během které má být toto množství fysiologicky účinnélátky uvolněno.
Farmacetické kompozice s kontinuálním uvolňovánímúčinné látky podle vynálezu jsou s výhodou v jiné než mikrokapslové formě, například ve formě mikrosfér, ve kterýchje fysiologicky účinná látka dispergovaná v celé hmotě po-lymeru a rovněž na povrchu, anebo v jiné mikropartikulárníformě, ve které fysiologicky účinná látka vybíhá až k po-vrchu.
Farmaceutické kompozice s kontinuálním uvolňovánímúčinné látky podle vynálezu mohou být deponovány do tělaživočicha /například člověka/, u kterého je žádoucí léčbapolypeptidem, například intramuskulární nebo subkutánniinjekcí nebo subdermální chirurgickou implantaci, běžnouv klinické nebo veterinářské praxi. B.1/ Způsob přípravy farmaceutické kompozice s kontinuál- ním uvolňováním účinné látky - ji
Farmacetické kompozice s kontinuálním uvolňovánímúčinné látky podle vynálezu mohou být připraveny libovol-ným vhodným způsobem. Materiál pro kompozici, který bylnapříklad definován výše, může být například použit veformě roztoku v organickém rozpouštědle, jakým je kyseli-na octová /ledová/, ve kterém může být rozpuštěna fysiolo-gicky účinná látka definovaná v předcházejícím textu, jakje to například popsáno v evropském patentu 58 481. B.2/ Vodný způsob
Farmaceutické kompozice s kontinuálním uvolňovánímúčinné látky podle vynálezu mohou být rovněž například při-praveny vytvořením vodné disperze polymeru nebo kopolyme-ru majícího jednu nebo více koncových karboxylových sku-pin, přičemž uvedený polymer nebo kopolymer je dále cha-rakterizován tím, že má hmotnostní střední molekulovouhmotnost alespoň rovnou asi 3000 a že je ve formě amonnésoli nebo soli alkalického kovu, přičemž alespoň 80 % hmot-nostních pevného obsahu /sušiny/ disperze je schopno pro-jít bakteriálním filtrem s velikostí pórů 200 m . Příprava takové vodné disperze polymeru nebo kopo-lymeru může být provedena smíšením roztoku polymeru nebokopolymeru v organickém rozpouštědle mlsitelném s vodoua alespoň stechiometrického množství roztoku ve vodě roz-pustné amonné soli nebo soli alkalického kovu nebo hydro-xidu amonného nebo hydroxidu alkalického kovu za vznikudisperze odpovídající amonné soli nebo soli alkalickéhokovu polymeru nebo kopolymeru ve směsném vodně-organickémrozpouštědle, mající v podstatě neutrální pH, a následnýmodpařením organického rozpouštědla mísitelného s vodouza vzniku vodné disperze uvedené soli polymeru nebo kopo-lymeru, přičemž alespoň 60 % hmotnostních pevného podílutéto disperze je schopno projít bakteriálním filtrem svelikostí pórů 200 m-\
Polymer nebo kopolymer použitý pří výše popsanémzpůsobu může být například zvolen ze skupiny zahrnující - 32 jak homopolymery tvořené polymerem kyseliny D-mléčné, po-lymerem kyseliny L-mléčné, polymerem kyseliny DL-mléčné,poly-D-laktidem, poly-L-laktidem a poly-DL-laktidem, po-lymerem kyseliny glykolové, polyglykolide, poly-2-kapro-laktonem a polymerem kyseliny hydroxymáselné, tak i kopo-lymery odvozené od dvou nebo více monomeru, ze kterýchďsou odvozené uvedené homopolymery, roubované nebo rozvět-vené blokové kopolymery obsahující jedenz uvedených homo-polymerů nebo kopolymerů a hydrofilní polymer zvolený zeskupiny zahrnující polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon,polyethylenoxid, polyethylenglykol, polyakrylamid, poly-methakrylamid, dextran, kyselina alginová, alginét sodný,želatinu, nebo kopolymer libovolných dvou nebo více uve-dených monomeru. Výhodnými polymery nebo kopolymery pro použití vtomto vodném způsobu jsou homopolymery, tvořené polymeremkyseliny D-mléčné, polymerem kyseliny L-mléčné, polymeremkyseliny DL-mléčné, poly-L-laktidem, poly-L-laktidem a po-ly-DL-laktidem, a kopolymery, tvořeném kopolymerem kyseli-ny D-mléčné a kyseliny glykolové, kopolymerem kyseliny L-mléčné a kyseliny glykolové, kopolymerem kyselinyLL-mléčnéa kyseliny glykolové, poly-L-laktid-glykolidem, poly-L-laktid-glykolidem a poly-DL-laktid-glykolidem. Výhodným rozpouštědlem mísitelným s vodou pro po-užití při tomto způsobu je aceton, 2-butanon /methylethyl-keton/, dioxan, hexafluorisopropanol, tetrahydrofuran,methanol nebo ethanol, přičemž obzvláště -výhodným uvedenýmrozpouštědlem mísitelným s vodou je aceton. Výhodnou vevodě rozpustnou amoiPou solí nebo solí alkalického kovunebo ve vodě rozpustným hydroxidem amonným nebo hydroxidemalkalického kovu je hydrogenuhličitan sodný, hydrogenuhli-čitan draselný nebo hydrogenuhličitan amonný, uhličitansodný, uhličitan draselný nebo uhličitan amonný nebo hy-droxid sodný, hydroxid draselný nebo hydroxid amonný.
Alternativním rozpouštědlem pro použití při tomtovodném způsobu je s vodou nemísitelná rozpouštědlo, jakým - JJ - je zejména čichlořmethan. Použiti takového rozpouštědlamá za následek vytvoření vodné disperze soli kopolymeru,která má větší velikost částic.
Roztok ve vodě rozpustné amonné soli nebo soli alka-lického kovu nebo hydroxidu amonného nebo hydroxidu alka-lického kovu může být vodným roztokem nebo roztokem, vekterém bylo jako rozpouštědlo použito směsné rozpouštědlotvořené vodou a organickým rozpouštědlem mísitelným s vo-vou, jakým je například methanol nebo ethanol.
Odpařování rozpouštědla mísitelného s vodou se vý-hodně provádí za sníženého tlaku a při teplotě pokud možnoco nejméně vyšší než je okolní teplota.
Jestliže se roztok polymeru nebo kopolymeru v orga-nickém rozpouštědle přidá k uvedené vodné fázi a jestližeje tento přídavek dokončen před započetím odpařování roz-pouštědla, potom se vysokého výtěžku částic schopných pro-jít filtrem s velikostí pórů 200 m dosáhne pouze tehdy, jest-liže koncentrace polymeru nebo kopolymeru v organickémrozpouštědle nepřesahneasi 1,5% /hmotn./obj./. Při tomto způsobu se smíšení roztoku polymeru nebokopolymeru v organickém rozpouštědle mísitelném s vodou sroztokem ve vodě rozpustné amonné soli, soli alkalickéhokovu, hydroxidu amonného nebo hydroxidu alkalického kovus výhodou provádí při míchání s vysokými smykovými silami,například v homogenizátoru Ystral, který je schopen mícháníaž při 25 000 téčkách za minutu, nebo v obdobných zaříze-ních. S výhodou uvedená farmaceutická kompozice nebudeobsahovat solubilizující protein, jakým je například fetál-ní telecí sérum /FCS-foetal calf sérum/ nebo lidský séro-vý albumin /HSA-human sérum albumin/. Při přípravě farmaceutických kompozic podle vyná-lezu mohou být výhodné parametry pro danou konkrétní kom-pozici určeny metodou postupného přibližování /zkusmá me-toda/, založenou na skutečnostech, které byly v předchá-
- 34 - zejícím textu detailně rozebrány a které mohou takto slou-žit jako důležité vodítko. V případě některých polypepti-dů, mezi které patří zejména interleukin-2 /IL-2/, lidskýrůstový hormon /HGH/ a interferon alf 82 /IFNalí^/, jejediným parametrem, který může být výhodně modifikován zaúčelem získání požadovaného profilu uvolňování účinné lát-ky, zatížení kompozice proteinem, které může v případěinterleukinu-2, lidského růstového hormonu a interferonu
X alfa2 výhodncínit 5 až 20 # hmotnostních, výhodněji 10 až18 % a obzvláště výhodně asi 12,5 až 16 % hmotnosti.
Je třeba zdůraznit, že při pracech s ve vodě roz-pustnými polymery, jakým je například polyethylenglykol,bylo shledáno nezbytným omezit míru modifikace požadované-ho polypeptidu v případě, kdy je žádoucí zachovat vysokoufysioiogickou účinnost uvedeného polypeptidu. konjugace vevodě rozpustného polymeru, použitého v nadměrném množ stí,s fysiologicky účinným polypeptidem měla až dosud za ná-sledek podstatnou redukci nebo dokonce úplnou ztrátu účin-nosti polypeptidu. Potřeba omezit míru modifikace poly-peptidu má za následek zvýšení heterogenní distribuce da-ného počtu molekul ve vodě rozpustného polymeru okolo poč-tu /obvykle velkého počtu/ potenciálních míst pro modifi-kaci. Takový vysoký stupeň heterogenity může mít sice pou-ze malý vliv na takové parametry, jakými jsou rozpustnosta poločas, avšak může nevýhodně ovlivňovat plynulost a v úplnost uvolňování účinné látky z farmaceutické kompozices kontinuálním uvolňováním účinné látky, nebot heterogennísměs isomerů může omezit konsistenci a úplnost uvolněnífysiologicky účinné látky z kompozice. 8 překvapením.'bylo nyní zjištěno, že deriváty G-CSF,popsané v evropské patentové přihlášce 51303668.3 a ze-hména / Arg^ , Se^ ’ ’ θθ’ ^^_7'G-CSF /buď bez methioninové presekvence nebo s methioninovou presekvenci, výhodně 3methioninovou presekvenci/ mohou podstoupit úplnou modifi-kaci kovalentní konjugaci s ve vodě rozpustným polymerem,který byl definován v předcházejícím textu, zejména 5 polv- - 35 - ethylenglykolem /P2G/, jakým je monome thylpolyethyl engly-kol /m?2G/, a šachovat si přitom ve významné míře alespoňjednu z biologických vlastností přirozeně se vyskytující-ho G-CSF. Tak například u pegylovaných /polyethylenglyko-lovaných/ derivátů G-CSF bylo testy prokázáno, že si zacho-vávají aktivitu nativního G-CSF in vitro v míře odpovída-jící faktoru asi 2. ?Zřivky odezvy na dávku získané přistudiu in vivo pegylovaného /~Arg1 1 , Ser1?’’^^_7G-CSFskutečně ukázaly, že uvedený derivát má asi dvojnásobnouaktivitu nativního G-CSF. Taková úplná modifikace poly-peptidu má za následek podstatně nižší počet zástupců vheterogenní směsi isomerů, což u odpovídající farmaceutic-ké kompozice s kontinuálním uvolňováním účinné látky pod-statně zvýší konsistenci a úplnost úvolňovéní fysiologickyúčinné látky z farmaceutické kompozice.
Nejvýhodnější fysiologicky účinnou látkou pro po-užití ve farmaceutické kompozici podle vynálezu je v tomtoohledu tedy pegylovaný /~Arg11, Ser1 ,6O,ó5y. lidskýG-CSF, ve kterém může být přítomna nebo nepřítomna methio-ninová presekvence, i když je tato methioninová presekven-ce s výhodou přítomna, ve zbytku G-CSF a ve kterém každýpolyethylenglykolový zbytek má molekulovou hmotnost 2000až 5000 Fa, přičemž poměr zbytku G-CSF k polyethylenglyko-lovým zbytkům je roven 1:3 až 1:4, zejména asi 1:3,9. C./ Definice pojmů
Pojmy použité v popisné části a definici patento-vých nároků mají následující významy: Výraz "vodné prostředí fysiologického typu" zdeznamená tělo, zejména svalstvo nebo podkožní tkáň, nebooběhový systém teplokrevného živočicha, přičemž při labo-ratorních výzkumech může být takového prostředí imitovánovodnými kapalinami, případně pufrovanými na fysiologicképH, s teplotou z rozmezí mezi 35 a 40 °C. - 36 - Výraz "kontinuální uvolňování" je zde použit pouzeza účelem definice profilu uvolňování účinné látky, kte-rý je v podstatě monofázový, i když může mít inflexní bod,avšak v žádném případě nemá "plošinovou fázi" /plateauphase/ v diagramu, ve kterém je vyneseno kumulativní uvol-ňování fysiologicky účinné látky v závislosti na čase/pro každý časový okamžik na ose pořadnic je na ose úsečekvyneseno celkové,již uvolněné množství fysiologicky účin-né látky/. Výraz "monofázový" zde znamená kontinuální uvolňo-vání v určitém časovém úseku, ve kterém může existovatinflexní bod ale v žádném případě neexistuje plošinováfáze v diagramu, ve kterém je vyneseno kumulativní uvol-ňování fysiologicky účinné látky v závislosti na čase. Výraz "polylaktid" je zde použit v generickém smys-lu a zahrnuje polymery samotné kyseliny mléčné, kopolyme-ry kyseliny mléčné a glykolové kyseliny, směsi takovýchkopolymerů a směsi takových polymerů a kopolymerů, přičemžkyselina mléčná se nachází buď v racemické nebo optickyaktivní formě. Výraz "v kyselém prostředí stabilní" je třeba chá-pat tak, že znamená fysiologicky účinnou látku stabilníza podmínek panujících v nárokované formulaci během perio-dy zamýšleného použití. Hodnota pH v nárokované formulacise bude měnit, avšak obecně nebude vyšší než 8 a normálněbude nižší než 2. Tyto hodnoty pH obecně znamenají extrém-ní hodnoty a pH v dané formulaci nebude zpravidla nikdynižší než 2,5 nebo 3. Relevantní teplotou bude normálnětělesná teplota savců, obecně až asi 40 °C. Perioda za-mýšleného použití se může měnit například od 1 týdne do6 měsíců. Výraz "polydispersita" je definován jako líw/ICn,kde í.l·/; je hmotnostní střední molekulová hmotnost a Lín ječíselná střední molekulová hmotnost. Absolutní měřeníčíselné střední molekulové hmotnosti může být provedenoanalýzou koncových skupin nebo parní osmometrií. kěření - 37 číselné a hmotnostní střední molekulové hmotnosti a poly-dispersity může být rovněž provedeno chromatografií zalo-ženou na principu dělení podle velikosti /gelová chromatografie/ vzhledem k polystyrénovým standardům. Výraz "perkolační práh" je zde použit pro defino-vání stavu dosaženého, když vodné léčivo /výše definovanáfysiologicky účinná látka/, resp. fáze tohoto léčiva do-sáhne kontinuity s vnějším prostředím a s ostatními zá-kladními složkami vodného léčiva /výše definovaná fysio-logicky účinná látka/ farmaceutické kompozice s kontinuálním uvolňováním účinná látky podle vynálezu. Výraz "přirozeně se vyskytující G-CSF" se zde vztahuje na ty G-CSF, o kterých je známo, že existují v prírodě, a zahrnuje dva polypeptidy mající aminokyselinovousekvenci uvedenou v SSQ ID No 32 /jak bude definována po-zději/. Tyto dva polypeptidy se liší pouze v tom, že tri-peptidová insertní část Val-Ser-Glu je v jednom polypeptidu přítomna mezi polohami 35 a 36 a ve druhém polypeptidunení přítomna vůbec. Systém číslování poloh, který je zdepoužit, je založen na přirozeně se vyskytujícím polypeptidu bez insertní části Val-Ser-Glu a výraz "nativní" sevztahuje na tento polypeptid bez uvedené insertní částiVal-Ser-Glu. Je třeba uvést, že zde popsané modifikace jsaplikovatelné na všechny přirozeně se vyskytující G-CSFformy a jejich analogy, které byly popsány výše, a kon-sekvenčnl revize čísel poloh polypeptidu může být nezbyt-ně závislá na formě přirozeně se vyskytujícího G-CSF zvo-leného pro modifikaci. Výraz "mající alespoň jednu z biologických vlastnotí přirozeně se vyskytujícího G-CSF", který je zde použitpro polypeptid, znamená, že polypeptid je aktivní při alepoň jednom z biologických testů, které jsou detailně po-psané v patentovém dokumentu wO 87/01132.
Stručný popis obrázků - 38 -
Obr. 1 obr .2 obr. 3 obr .4 obr. 5 obr. b obr. 7 obr .8 obr .9 obr.10 obr.11 obr.12 obr.13 ukazuje nukleotidovou sekvenci fragmentu167 bp, přičemž odkaz na tuto sekvencise nachází v referenčním příkladu 5; ukazuje aminokyselinou sekvenci a odpo-vídající nukleotidovou sekvenci nativní-ho lidského /hu/ G-CSF a restrikční mís-ta; ukazuje aminokyselinovou sekvenci a odpo-vídající nukleotidovou frekvenci / Ser ’ __/hu G-CSF a restrikční místa; ukazuje nukleotidovou sekvenci T4 trans-kripčního zakončení, které obsahuje a/koncová /terminálnl/ restrikční místapro Sáli a HindlII a b/ koncová restrikč-ní místa pro Sáli a Styl; ukazuje restrikční mapu pT3357 /zde uvá-děného také jako pLB004/; ukazuje nukleotidovou sekvenci fragmentuEcoRI-SaiI, uvedenou v referenčním při-kladu b/b/ avšak bez genové sekvenceinterferonu alf0.½> ukazuje restrikční mapu pL3015 /zde uvá-děného také jako pICI 0083/;ukazuje restrikční mapu pICI 1079; ukazuje restrikční mapu pICI 54 /zde uvá-děného také jako pCC-54/;ukazuje restrikční mapu pCGbl; ukazuje restrikční mapu pICI1107, kdevystínovaná plocha představuje genovousekvenci kódující / Ser^’^7hu G-CSF; ukazuje restrikční mapu pCG300 /zde uvá-děného také jako pICI 1295/,ukazuje uvolňování FbG 500 0/-met-1 , Ser1 ’ ^^.7 - 39 - obr.14 obr.16
hu G-CSF z farmaceutických kompozic A a B /viz příklady 4 a 5/ s kontinuálním v uvolňováním účinné látky na bázi kopo-lymeru 50 % d,l-laktidu a 50 % glykoli-du, přičemž obě tyto farmaceutické kom-pozice jsou připraveny postupem s ledo-vou kyselinou octovou; ukazuje uvolňování nepegylovaného /^Fet""1 , i *7 *7 v —”
Ser _7hu G-CSF z farmaceutických kom-pozic C a D /viz srovnávací příklady 1a 2/ s kontinuálním uvolňováním účinnélátky na bázi kopolymeru 50 % d,l-laktidua 50 % glykolidu, přičemž kompozice C obsahuje samotný neoegylováný /“Met-1, 17 27 - ~~
Ser ’ _/hu G-CSF a komposice D obsahu-je směs nepegylovaného /—met-1,Ser1^’^^7-hu G-CSF a methyl-PEC- 5000, a obě kompo-zice se připraví postupem s ledovou ky-selinou octovou; ukazuje kumulativní uvolňování PEG 5000-/""ífet 1 , Ser1 ’ ^2.7hu G-CSF ze dvou odliš-ných farmaceutických kompozic G a H /vizpříklad 24/ s kontinuálním uvolňovánímúčinné látky na bázi kopolymeru 50 yó d,l-laktidu a 50 % glykolidu, přičemž oběkompozice jsou připraveny vodným způso-bem; w — -L 1 ukazuje kumulativní uvolňování / Met ,Ser17 ’ 2?__7hu G-CSF z farmaceutické kom-pozice s kontinuálním účinkem na bázi ko-polymeru 50 % d,l-laktidu a 50 % glyko-lidu /viz srovnávací příklad 3/, kteráobsahuje samotný / Met-1 ,Ser1?’^/hu G-CSFa z farmaceutické kompozice s kontinál-ním uvolňováním účinné látky na bázi ko-polymetu 50 ;ó d,l-laktidu a 50 % glykolidu - 43 - obr.17 obr.18 /viz srovnávací příklad 4/, která obsa-huje směs / Met-1,Ser17’277hu G-CSF amethyl-PEG, přičemž obě kompozice bylypřipraveny vodným způsobem; ukazuje kumulativní uvolňování PEG 5000- .-1 m 15 c 17,27 .π 26,28 , 307, / met ,C-lu ,Ser ’ ,Ala ’ ,Lys _/huG-CSP z farmaceutické kompozice Ξ s kon- v tinuálním uvolňováním účinné látky nabázi kopolymeru 50 % d,l-laktidu a 50 %glykolidu /viz srovnávací příklad 3/, ztéže kompozice K /viz příklad 25/ a ztéže kompozice M /viz srovnávací příklad‘5/, přičemž kompozice Ξ byla připrave-na postupem s ledovou kyselinou octovoua kompozice K a M byly připraveny vodnýmzpůsobem; a ukazuje kumulativní uvolňování PEG 5000/fMet"1,Arg11, Ser17’27’60,6^7hu C-CSFz farmaceutické kompozice s kontinuál-ním uvolňováním účinné látky F /viz pří-klad 4/, L /viz příklad 26/ a K /srovná-vací příklad 6/ na bázi kopolymeru 50 %d,l-laktidu a 50 % glykolidu, přičemžkompozice F je připravena postupem s le-dovou kyselinou octovou a kompozice L aN jsou připraveny vodným způsobem. V dále uvedených referenčních příkladech a příkla-dech jsou učiněny odkazy na následující materiály násle-dujícího složení:
Pufr.y pro restrikčnl enzymy
Stabilita: stabilní při -20 °CSložení pufrů: - 41 -
Složky Výsledná koncentrace /~’mmol/l_7zředění 1:13 A B L Μ H Tris acetát 33 — — — — Tris-HCl - 1 3 1 3 1 0 50 íig-acetét 1 3 - - - - MgCl 2 - 5 1 3 1 3 1 3 K-acetát 66 KaCl - 1 33 - 53 1 03 Dithioerythritol/BTE/ - - 1 1 1 Díthiothreitol/DTT/ 0,5 - - - - Merkaptoethanol - 1 - - - pH při 37 °C 7,9 8,0 7,5 7,5 7,5 Výše uvedené pufry jsou komerčně dostupná u firmy
Boehringer Liannheim.
Postup procesu mtageneze řízené v určitém místě /odkazv příkladu 4·
Pufr 1 1 30 1 00 20 mři Tris-HCl ph 8,0mři NaCl mři HgCK Pufr 2 1 0 mři Tris-HCl ?H c,0 23 mři NaCl 1 mři BDTA i u - 42 -
Pufr 3 12 míč 30 mM 1 0 mlč 8 mM Pufr 4 60 mlč 90 míč 6 míč 1 0 mM Nukleotidová směs 1 : 250 ^uM /fosfothioná
Tris-HCl pH 7,7
NaCl
LgCl2 2-merkaptoethanol
Tris-HCl ph 8,0
NaCl
MgCl2
DTT
dATP, dGTP, dCT?=Sderivát dCTP/, dTTP a 1 mM ATP
Nukleotidová směs 2 : 250/uM dATP, dGTP, dCTP, dTTP a350/uM ATP Čištění genu /TM/
Souprava obsahuje 1/ 6M jodid sodný 2/ koncentrovaný roztok chloridu sodného, Tris a EDTA pro přípravu promývacího roztoku chloridu sodného/ethanolu/vo-dy 3/ ampulku z mléčného skla o objemu 1,5 ml, obsahující 1,25 ml suspenze křemičité matrice ve vodě.
Tato technika purifikace DNA je založena na metoděpopsané Vogelsteinem a Gillespiem, publikované v časopiseProceedings of the National Academy of Sciences USA /1979/,roč. 76, str. 61 5 · Může však být použita jakákoliv jiná metoda popsanáv publikaci "Molecular cloning - Laboratory Manual", druhévydání, Sambrook, Fritsch and Maniatis /Cold Spring HarborLaboratory, 1989/. Náhodně značená souprava - Produkt firmy Pharmacia č.27-9250 - 43
Postup je popsán v publikaci "Molecular Cloning -Laboratory Manual", druhé vydání, Sambrook, Fritsch andManiatis, str. 10.13-10.17 /vydáno nakladatelstvím ColdSpring Harbor Laboratory, 1569/.
Sekvenasa /TL'/
Chemicky modifikovaná T7 DNA polymerasa
Modifikace je založena na postupu popsaném Táborema Richardsonem v časopise "Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA", /1967/, roč. 64, str. 4767-4771
Ultrogelové AcA gely
Směsná matrice polyakrylamidu a agarosy, která po-skytuje v synergickém spojení vysokou resoluci polyakryl-amidu a tuhost agarosy. Ultrogel AcA 54 obsahuje 5 % pólyakrylamidu a 4 % agarosy. M9 minimální medium
Chlorid sodný 0,5
Hydrogenfosforečnan sodný 6
Lihydrogenfosforečnan draselný3
Chlorid amonný 1
Destilovaná voda na 1
Další složky / 75 ml 300.,ul 50/ó glukosy 75/Ul 1M MgSO4 75/ul 0,1M CaCl2 75/ul 4 mg/ml thiaminu 75/ul 20-/O aminokyselin kaseinu Zásobní roztok stopových prvků /TES/ bWV;'.';·Ά;'Ρ'*’1 ' 1 " "s - 44 - Zásobní roztok stopových prvků má následující složení: A1C13.ÓH2O 0,1 mg/1 100/Ug/l CoC12.6H20 0,04 mg/1 40/Ug/1 KCr/SO /o. 1 2H. 0 4 2 ά 0,01 mg/1 10/Ug/l CuCl2.kH2O 0,01 mg/1 10/Ug/1 H3B°3 0,005 mg/1 5/Ug/1 KJ 0,1 mg/1 1 00/Ug/l NnSO, .H.,0 4 2 0,1 mg/1 100/Ug/1 NiSU..6Ho0 4 2 0,0045 ng/1 4,5/Ug/1 NaoMo0.2Ho0 2 4 2 0,02 mg/1 20/Ug/1 ZnSU. *7H.O 4 2 0,02 mg/1 20/Ug/l a je přidán do růstového media v koncentraci 0,5 ml/1 T4 DNA ligasa T4 DNA ligasa je popsana v publikaci ”I»lolecular C-lo-ning - Laboratory Manual”, druhé vydání, Sambrook, Fritdchand ííaniatis 5*60-5,64 /publikováno nakladatelstvím ColdSpring Harbor Laboratory 1989/ a dále v článku: Weiss 3.a kol., J.Biol.Chem., roč. 243, str.4543 /1968/. OXOIL-fosfátem pufrovaný fysiologický roztok
Zde použitý OXuID-fosfátem roztok se získá z tablet složení: Dulbecco Chlorid sodný 6,0 g/1 Chlorid draselný 0,2 g/1 Hydrogenfosforečnan sodný 1,15 g/1 Dihydrogenfosforečnandraselný 0,2 g/1 pH 7,3* pufrovaný fysiologickýA majících následující - 46 27,7 mg polylaktidu /50 % hmotnostních d,l-laktidua 50 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 7673; polydispersita2,59/ se rozpustí v 1,0 ml ledové kyseliny octové. Vedletoho se 1 ml vodného roztoku PEG 5000-/~L'et~^ , Ser1 7’_7-hu G-CSF /9 mg/ml//z referenčního příkladu 3/ zlyofilizujea potom rozpustí v dalším 1 ml alikvotu ledové kyselinyoctové. Oba tyto roztoky se potom smísí a použité skleně-né nádobky se propláchnou 2 krát 0,5 ml alikvoty ledovékyseliny octové. Získaný roztok se bezprostředně zmrazína lázni dichlormethan/Lrikold a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný lyofilizací se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 85 °C a potom při této teplotě formuje dotvaru destičky o tlouštce 1 mm. Tato destička se potomrozseká na frakce vážící přibližně 10 mg. Tyto frakce sepotom umístí do plastikových lékovek obsahujících 2 mlOXOID-fosfátem pufrovaného fysiologického roztoku a 0,02 %azidu sodného a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné mediuma nahradí se čerstvým pufrem. Uvolňování PEG 5000-/”l<et~ ,Ser ’ _7hu G-CSF se stanoví vysokotlakou kapalinovouchromatografií odebraného media a ze získaných výsledkůse vypočte pro jednotlivé časové okamžiky kumulovanémnožstvi uvolněného proteinu /viz obr.13/· Přiklad 2
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnélátky obsahující PEG 5030-/“Met"1, Ser17,27_7hu G-CSF
Postup s ledovou kyselinou octovou
Formulace B /15,36% obsah proteinu/ 155,43 mg polylaktidu /50 % d,l-laktidu a 50 % gly- ín n >ι .·< · t v.Cuj í h,-, >r, - - 47 - kolidu ve formě kopoiymeru; hmotnostní střední molekulováhmotnost 7791,2; polydispersita 2,65/ se rozpustí ve 2,0 mlledové kyseliny octové. Vedle toho se 3,79 ml vodného roz-toku PPG 5000-/. met"1, Ser^^^J/hu G-CSF/ /z referenční-ho příkladu 3/ zlyofilizuje /hmotnost zbytku po lyofili-zaci činí 104,94 mg/ a potom rozpustí v dalším 2,0 ml ali-kvotu ledové kyseliny octové. Oba tyto roztoky se potomsmísí a použité skleněné nádobky se opláchnou 4 krát 0,5 mlalikvoty ledová kyseliny octové. Získaný roztok se bezpro-středně zmrací na lázni dichlormethan/Brikold a lyofilizu-je přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 70 °C a potom formuje do tvaru destičky ma-jící tlouštku 1 mm. Tato destička se potom rozseká na frak-ce mající hmotnost přibližně 70 mg. Tyto frakce se potomumístí do plastikových lékovek obsahujících 2 ml OXOIL-fosfstem puf r o váný fysiologický roztok a 0,02 -í azidu sod-ného a takto skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se vodné medium oddělía nahradí čerstvým pufrem. Uvolňování PPG 5000-/ ket ,
Ser í,<r _7hu G-CSF se stanový vysokotlakou kapalinovouchromatografií odebraného media a ze získaných výsledkůse vypočte pro jednotlivá časové okamžiky kumulované množst-ví uvolněného proteinu /viz obr.13/·
Srovnávací příklad 1
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnélátky obsahující samotný /"met 1, Ser1^_7hu G-CSF
Postup s ledovou kyselinou octovou
Formulace C /20-,¾ obsah proteinu/ ,73 mg polylaktidu /50 k hmotnostních d,l-laktidu - 48 - a 50 ’= hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 7673; polydispersita2,59/ se rozpustí ve 2,0 ml ledové kyseliny octové. Vedletoho se 4,068 ml vodného roztoku /-Met-"1 , Ser^’^^_7hu G-037 /10,0 mg/ml/ zlyofilizuje a potom rozpustí v dalším2,0 ml alikvotu ledové kyseliny octové. Oba tyto roztokyse potom smísí a pro opláchnutí použitých skleněných ná-dobek se použijí další dva 0,5 ml alikvoty ledové kyselinyoctové. Získaný roztok se bezprostředně zmrazí na láznidichlormethan/Erikold a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se potom důkladně pro-mísí za použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vy-hřívanými na teplotu 95 °C a formuje do tvaru destičky otlouštce 1 mm. Rovněž formovaní se provádí při teplotě95 °C. Tato destička se potom rozseká na frakce majícíhmotnost asi 74 mg. Tyto frakce se potom umístí do plas-tikových lékovek obsahujících 2 ml OXOID-fosfátem pufrova-ného fysiologického roztoku a 0,12 >6 azidu sodného a skla-dují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se vodné prostředí oddě-lí a nahradí čerstvým pufrem. Uvolňování / Met- , Ser ’ _7- hu G-CSF se stanoví.analýzou na bázi vysokotlaké kapalino-vé chromatografie odebraného media a ze získaných výsled-ků se vypočte pro jednotlivé časové okamžiky kumulovanémnožství uvolněného proteinu /viz obr.14/.
Srovnávací příklad 2
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnélátky obsahující /""Met \ Serir^’2^_7hu G-CSF a methyl-PPG5000
Postup s ledovou kyselinou octovou
Formulace E /20½ obsah proteinu/ 120,66 mg polylaktidu /50 hmotnostních d,l-laktidu - 49 a 50 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 7673; polydispersita2,59/ se rozpustí ve 2,0 ml ledové kyseliny octové. Vedletoho se 3,935 ml vodného roztoku / Ket”\ Ser^’2^_7hu G-CSF /10,0 mg/ml/ zlyofilizuje a potom rozpustí ve 2,0 mlroztoku obsahujícího 40,82 mg methyl-PEG 5000 v ledovékyselině octové. Oba tyto roztoky se potom smísí a k oplách-nutí použitých skleněných nádobek se použijí další dva0,5 ml alikvoty ledové kyseliny octové. Získaný roztokse bezprostředně zmrazí na lázni dichlormethan/Drikold alyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se potom důkladněpromísí za použití hydraulického lisu s tlačnými deskamivyhřívanými na teplotu 95 °C a formuje do tvaru destičkyo tlouštce 1 mm při téže teplotě. Tato destička se potomrozseká na frakce mající hmotnost asi 74 mg. Tyto frakcese potom umístí do plastikových lékovek obsahujících 2 mlOXOIP-fosfatem pufrovaného fysiologického roztoku a 0,02 %azidu sodného a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se odděluje vodné medium __ -i a nahražuje vždy znovu čerstvým pufrem. Uvolňování /_ Diet ,Ser ’ _/hu G-CSF se stanoví analýzou na bázi vysokotlakékapalinové chromatografie odebraného media a ze získanýchvýsledků se vypočte pro jednotlivé časové okamžiky kumu-lované množství uvolněného proteinu /viz obr.14/. Přiklad 3 v
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnélátky obsahující PEG 5000-/ met 1,Glu1^’2^,Ala2^’2^,Lys^°_7-hu G-CSF
Postup s ledovou kyselinou octovou
Formulace Ξ /20% obsah proteinu/ 120,34 jpolylaktidu /50 % hmotnostních d,l-laktidu - 50 - a 50 % glykolidu ve formě kopolymeru; hmotnostní střednímolekulová hmotnost 7673; polydispersita 2,59/ se rozpus-tí ve 2,0 ml ledové kyseliny octové. Vedle toho se 3,738 ml vodného roztoku PEG 5'000-/~L:et-1 , Glu1 , Ser1 ? ’ , Ala2^ ’2S, 30— ~~ 1
Lys _/hu G-CSP /10,7 mg/ml/ /ze srovnávacího příkladu 8/zlyofilizuje a potom rozpustí v dalším 2,0 ml alikvotu le-dové kyseliny octové. Tyto dva roztoky se smísí a proopláchnutí použitých skleněných nádobek se použijí dalšídva 0,5 ml alikvoty ledové kyseliny octová. Získaný roz-tok se bezprostředně zmrazí na lázni dichlormethan/Drikolda lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilize se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 85 °C a potom při téže teplotě formuje dotvaru destičky o tlouštce 1 mm. Tato destička se rozsekána frakce mající hmotnost přibližně 70 mg. Získané frakcese potom umístí do plastikových lékovek obsahujících 2 mlOXUlD-forfátem pufrovaného fysiologického roztoku a 0,02 %azidu sodného a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se vodné prostředí oddě-luje a nahrazuje vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PEG 5000-/~Met Glu1 ^,Ser1^’^,Ala^^’2^,Lys^^_7hu G-CSF se stanovíanalýzou na bázi vysokotlaké kapalinové chromatografieodebraného prostředí a ze získaných výsledků se vypočtepro každý časový okamžik kumulované množství uvolněnéhoproteinu. Přiklad 4
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnélátky obsahující PEG 5000-/”Vet_1,Arg11jSer17,27’60’65_7huG-CSF
Postup s ledovou kyselinou octovou
Formulace F /20¾ obsah proteinu/ - 51 120,40 mg polylaktidu /5 % hmotnostních d,l-laktidua 50 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolyaeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 7673, polydispersita2,59/ se rozpustí ve 2,0 ml ledové kyseliny octové. Vedletoho se 3»478 ml vodného roztoku PSG 5000-/~í.Cet-1 ,Arg^ ,Ser^^^^^^^ýhu 3_csp /1 1,5 mg/ml//z referenčního pří-kladu 7/ zlyofilizuje a potom rozpustí v dalším 2,0 ml ali-kvotu ledové kyseliny octové. Oba tyto roztoky se potomsmísí a k opláchnutí použitých skleněných nádobek se po-užijí další dva 0,5 ml alikvoty ledové kyseliny octová.Získaný roztok se bezprostředně zmrazí na lázni dichlor-methan/Brikold a lyofilizují přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladné promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu £5 °C a potom při téže teplotě formujedo tvaru destičky o tlouštce 1 mm. Tato destička se potomrozseká na frakce mající hmotnost asi 72 mg. Tyto frakcese vloží do plastikových lékovek obsahujících 2 ml OXOID-fosfátem pufrovaného fysiologického roztoku a 0,02 % azidusodného a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře- dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňovaní PEG 5000-/ l:et~l ,Arg^ ,Ser^7g-CSF se stanoví analýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chromatografií oddě-leného vodného prostředí a ze získaných výsledků se projednotlivé oasové okamžiky, ve kterých bylo vodné prostře-dí odebráno, stanoví kumulované množství uvolněného pro- teinu /viz obr. 1£/. - Přiklad 5
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňovánímlátky obsahující PEG 500ů-/'""l'et_',_7hu G-CSF účinné A. Postup s ledovou kyselinou octovou 120,11 mg polylaktidu /?0 hmotnostních d,l-laktidu - 52 - a 50 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot- ; nostní střední molekulová hmotnost 5429; polydispersita 2,32/ se rozpustí ve 20 ml ledové kyseliny octové prosté i anhydridu. Vedle toho se 3,736 ml vodného roztoku PEG 5000- : /-"í4et ^Zhu G-CSF zlyofilizuje a potom rozpustí v dalším 2,0 ml alikvotu ledové kyseliny octové. Oba tyto roztoky - se potom smísí a k opláchnutí použitých skleněných nádobek se použiji další čtyři 0,5 ml alikvoty ledové kyseliny octové. Získaný roztok se bezprostředně zmrazí na lázni dichlormethan/Drikold a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilize se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na 65 °C a potom formuje do tvaru destičky o tloušt-ce 1 mm. Tato destička se rozseká na frakce mající hmot-nost přibližně 70 mg. Získané frakce se umístí do plasti-kových lékovek obsahujících 2,0 ml 0,02% /hmotn./obj./roztoku azidu sodného v GXOID-fosfátem pufrovaném fysiolo- 1 gickém roztoku a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se vodné prostředí oddě-lí a vždy nahradí čerstvým pufrem. Uvolňování PEG 5300-/ iiiiet” 1_Z G-CSF se stanoví analýzou provedenou vysokotla-kou kapalinovou chromatografií odděleného vodného prostře- ;?. dí a ze získaných výsledků se pro jednotlivé časová oka- |
’V mžiky, ve kterých bylo odebráno vodné prostředí, vypočte | kumulované množství uvolněného proteinu /viz dále uvedená | tabulka 1/. | V» B. Vodný způsob í h, 4,0 g polylaktidu /50 % hmotnostních d,l-laktidu £ a 50 » hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot- 2 nostní střední molekulová hmotnost 9429; polydispersita 2,02/ se rozpustí v 16,3 ml dichlormethanu a roztok se y míchá za podmínek vysokého smykového napětí /homogenizá- \ tor Ystral 1500/. X tomuto roztoku se po kapkách přidají 4 ml vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného /20 mg/ml/. - 53 -
Potom se přidá 40 ml destilované vody a vytvoří se jemnábílá disperse. Dichlormethan se potom odpaří v rotačníodparce. Získaná disperze se bezprostředně zmrazí na láz-ni dichlormethan/Drikold a lyofilizuje přes noc. Tatosodná sůl polymeru se před vlastní použitím skladuje zavakua při pokojové teplotě. 120,87 mg sodné soli polymeru se disperguje ve 2,0 mldestilované vody. Vedle toho se 3>738 ml vodného roztokuPPG 5000-/ I.Cet 1_/hu G-CSF /10,7 mg/ml/ zlyofilizuje a po-tom rozpustí v dalších 2,0 ml destilované vody. Získaníroztok se přidá k uvedené suspensi a směs se promísí. Kopláchnutí použitých skleněných nádobek se použijí dalšíčtyři 0,5 ml alikvoty destilované vody. Roztok se bezpro-středně zmrazí na lázni dichlormethan/Brikold a lyofilizu-je přes noc.
Prášek získaný po lyofilize se důkladně promísí zapoužití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhřívanýmina teplotu 65 °C a potom formuje do tvaru destičky majícítlouštku 1 mm. Tato destička se rozseká na frakce majícíhmotnost přibližně 80 mg. Tyto frakce se potom umístí doplastikových lékovek obsahujících 2,0 ml 0,02% /hmotn./obj./roztoku azidu sodného v OXOID-fosfátem pufrovaném fysio-logickém roztoku a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí čerstvým pufrem. Uvolňování PEG 5000-/ Met”^_7-hu G-CSF se stanoví analýzou provedenou vysokotlakou ka-palinovou chromatografií odděleného vodného prostředí aze získaných výsledků se pro jednotlivé časové okamžiky,ve kterých bylo vodné prostředí odebráno, vypočte kumulo-vané množství uvolněného proteinu /viz dále uvedená tabul-ka 1/. Příklad 6
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnélátky obsahující PEG 5'000-/~Fet-1 , Ser1?_7hu G-CSF 54
«BMS A. Postup s ledovou kyselinou octovou l 119,75 mg polylaktidu /50 %> hmotnostních d,l-laktidua 50 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot- ·· nostní střední molekulová hmotnost 9429; polydispersita í 2,02/ se rozpustí ve 20 ml ledová kyseliny octové prosté í anhydridu. Vedle toho se 4,95 ml vodného roztoku PEG 5000- /_ Met , Ser _7hu G-CSF /viz referenční příklad 13/ /8,08 i mg/ml/ zlyofilizuje a potom rozpustí v dalších 2,0 ml le-dové kyseliny octové. Oba tyto roztoky se smísí a k promy-tí použitých skleněných nádobek se použijí další čtyři0,5 ml alikvoty ledové kyseliny octové. Získaný roztok sebezprostředně zmrazí na lázni dichlormethan/Erikold a lyo- > filizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísí L za použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 65 °C a potom formuje do tvaru destičkymající tlouštku 1 mm. Tato destička se potom rozseká nafrakce mající hmotnost přibližně 70 mg. Získané frakce seumístí do plastikových lékovek obsahujících 2,0 ml 0,02½ : /hmotn./obj./ roztoku azidu sodného v OXOID-fosfátem pufro-vaném fysiologickém roztoku a skladují při teplotě 37 °C. ·?. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře- δ dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PEG 5000- £ /~Met 1, Ser1?_7hu G-CSF se stanoví analýzou provedenou | vysokotlakou kapalinovou chromatografií a ze získaných výsledku se pro jednotlivá časové okamžiky, ve kterých -í bylo vodné prostředí odděleno, vypočte kumulované množství í uvolněného proteinu /viz dále uvedená tabulka 1/.
S • k' v' B. Vodný způsob Ý 1’; 4,0 g polylaktidu /50 "G hmotnostních d,l-laktidu t; a 50 :/o hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot- nostní střední molekulová hmotnost 9429; polydispersita 2,02/ se rozpustí v 16 ml dichlormethanu a roztok se míchá § η ΊΡ ‘ > " -- - 55 za podmínek vysokého smykového napětí /homogenizátor Ystral1500/. K roztoku se po kapkách přidají 4 ml vodného roz-toku hydrogenuhličitanu sodného /^0 mg/ml/. Přidá se dal-ších 40 ml destilované vody a získá se jemná bílá disper-se. Dichlormethan se odežene v rotační odparce. Získanádisperze se bezprostředně zmrazí na lázni dichlormethan/Bri-kold a lyofilizuje přes noc. Tato sodná sil polymeru sepřed vlastním použitím skladuje za vakua při pokojové te- plotě. 120,80 mg sodné soli polymeru se disperguje ve 2,0ml destilované vody. Vedle toho se 4,55 ml vodného roztokuPEG 5000-/ met”1 ,Ser1^_7hu G-CSF /8,08 mg/ml/ zlyofilizu-je a potom rozpustí v dalších 2,0 ml destilované vody.
Tento roztok se přidá k uvedené suspenzi a směs se promí-sí. K opláchnutí použitých skleněných nádobek se použijídalší čtyři 0,5 ml alikvoty destilovaná vody. Získaný roz-tok se bezprostředně zmrazí na lázni dichlormethan/Brikolda lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 65 °C a potom formuje do tvaru destičkyo tlouštce 1 mm. Tato destička se potom rozseká na frakcemající hmotnost přibližně 80 mg. Tyto frakce se umístí doplastikových lekovek obsahujících 2,0 ml 0,02>&amp; /hmotn./obj./roztoku azidu sodného v OXOIL.fosfátem pufrovaném fysio-logickem roztoku a potom skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a vždy nahradí čerstvým pufrem. Uvolňování PEG 5000-/f~Ket~1 , Ser1^_7hu G-CSF se stanoví analýzou provedenouvysokotlakou kapalinovou chromatografií a ze získaných vý-sledků se pro jednotlivé časové úseky, ve kterých byloodděleno vodné prostředí, vypočte kumulovaná množstvíuvolněného'proteinu /viz dále uvedená tabulka 1/. Příklad 7
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinné - 56 -
obsahující PEG 50θθ-/ Met-^G-CSF ^rg"’’6, ser’7.27.60.65 7hu A. Postup s ledovou kyselinou octovou 120,72 mg polylaktidu /50 % hmotnostních d,l-lakti-du a 50 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 9429; polydispersita2,02/ se rozpustí ve 2,0 ml ledové kyseliny octové prostéanhydridu. Vedle toho se 3,47 ml vodného roztoku PEG 5000-/ Met \ Arg^’^, Ser7’2*7 ’>65~7hu G-CS? /viz referenč-ní příklad 19/ /11,53 mg/ml/ zlyofilizuje a potom rozpus-tí v dalších 2,0 ml ledové kyseliny octové. Oba tyto roz-toky se smísí a k opláchnutí použitých skleněných nádobekse použijí další čtyři 0,5 ml alikvoty ledové kyselinyoctové. Získaný roztok se bezprostředně zmrazí na láznídichlormethan/Drikold a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 65 Ca potom formují do tvaru destičkyo tlouštce 1 mm. Tato destička se rozseká na frakce mají-cí hmotnost přibližně 65 mg. Tyto frakce se potom umístído plastikových lékovek obsahujících 2,0 ml 0,02% /hmotn./obj./ roztoku azidu sodného v OXOID-fosfátem pufrovanémfysiologickém roztoku a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se vodná prostředí oddě-lí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PEG 5OOO-/ Met 1, Arg1^’^, ger 17,27,60,65^7^ G-CSF se stanovíanalýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chromatogra-fií odděleného vodného prostředí a ze získaných výsledkůse pro každý časový okamžik, ve kterém bylo odebráno vod-né prostředí, vypočte kumulované množství uvolněného pro-teinu /viz dále uvedená tabulka 1/. 3. Vodný způsob i;
I
I G.·' v; 4,0 g polylaktidu /53 % hmotnostních d,l-laktidu - 57 a 50 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 9429; polydispersita2,02/ se rozpustí v 16,0 ml dichlormethanu a získaný roz-tok se míchá za podmínek vysokého smykového napětí /homo-genizátor Ystral 1500/· K roztoku se po kapkách přidají4 ml vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného /20 mg/ml/.Fotom se přidá dalších 40 ml destilované vody a vytvoříse jemná bílá disperse. Dichlormethan se odežene v rotač-ní odparce. Disperze se bezprostředně znrací na láznidichlormethan/Drikold a lyofilizuje přes noc. Tato sodnásůl polymeru se před vlastním použitím skladuje za vakuapři pokojové teplotě. 119,71 mg uvedené sodné soli polymeru se dispergu-je ve 2,0 ml destilované vody. Vedle toho se 3,47 ml vod-ného roztoku PEG 5000-/~Met \ Arg11’1^, Ser^’^^’^^’^5_7-hu G-CSF /11,53 mg/ml/ zlyofilizuje a potom rozpustí vdalších 2,0 ml destilované vody. Tento roztok se přidá kuvedené suspenzi a směs se promísí. K opláchnutí použitýchskleněných nádobek se použijí další čtyři 0,5 ml alikvotydestilované vody. Získaný roztok se bezprostředně zmrazína lázni dichlormethan/Drikold a lyofilizuje pres noc.
Frašek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 65 °C a potom formuje do tvaru destičkyo tlouštce 1 mm. Tato destička se rozseká na frakce mají-cí hmotnost asi 70 mg. Tyto frakce se umístí do plastiko-vých lékovek obsahujících 2,0 ml 0,02% /hmotn./obj./ roz-toku azidu sodného v OXOID-fosfátem pufrovaném fysiologic-kém roztoku a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PEG 5000-/ klet \ Arg11 ’ , Ser17’’63>65~7hu G-CSF se stanoví analýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chromatogra-fií odděleného vodného prostředí a ze získaných výsledkůse pro každý časový okamžik, ve kterém bylo odděleno vodnéprostředí, vypočte kumulované množství uvolněného proteinu - 58 - /viz dále uvedená tabulka 1/. Přiklad 8
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnélátky obsahující PEG 5000-/“Met-1, Arg11’23, 3θΓ17,27,63,65hu G-CSF A. Postup s ledovou kyselinou octovou 120,11 mg polylaktidu /50 % hmotnostních d,l-lakti~du a 5θ % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 9429; polydispersita2,02/ se rozpustí ve 2,0 ml ledová kyseliny octové prostéanhydridu. Vedle toho se 3>66 ml vodného roztoku PEG 5000-/""Met \ Arg11’23, Ser^ »27,60,65^7^ /viz referenč- ní příklad 14/ /10,93 mg/ml/ zlyofilizuje a potom rozpustív dalších 2,0 ml ledové kyseliny octové. Oba tyto roztokyse smísí a k opláchnutí použitých skleněných nádobek sepoužijí další čtyři 0,5 ml alikvoty ledové kyseliny octové.Získaný roztok se bezprostředně zmrazí na lázni dichlor-methan/Lrikold a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 65 °C a potom formuje do tvaru destičky otlouštce 1 mm. Tato destička se rozseká na frakce majícíhmotnost přibližně 80 mg. Tyto frakce se potom umístí doplastikových lékovek obsahujících 2,0 ml 0,029© /hmotn./obj./roztoku azidu sodného v OXOID-fosfátem pufrovanám fysio-logickém roztoku a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PEG 5^00-/TMet“1, Arg11’23, Ser17’27’60’65_7hu G-CSF se stanovíanalýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chromatografiíodděleného vodného prostředí a ze získaných výsledků sepro každý časový okamžik, ve kterém bylo odděleno vodné v, , ·,...... - 59 - >,.»> ι.·ι· «,hh »*.·-?·'·: ι» V;?. prostředí, vypočte kumulované množství uvolněného protei-nu /viz dále uvedená tabulka 1/. S. Vodný způsob 4,3 g polylaktidu /51 % hmotnostních glykolidu a50 % hmotnostních d,l-laktidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 9429; polydispersita2,02/ se rozpustí v 16 ml dichlormethanu a roztok se mícháza podmínek vysokého smykového napětí /homogenizátor Ystral1500/. Z roztoku se po kapkách přidají 4 ml vodného rozto-ku hydrogenuhličitanu sodného /20 mg/ml/. Přidá se dalších40 ml destilovaná vody a vytvoří se jemná bílá disperze.Dichlormethan se potom odežene v rotační odparce. Disper-ze se bezprostředně zmrazí na lázni dichlormethan/Drikolda lyofilizuje přes noc. Tato sodná súl polymeru se předvlastním použití skladuje za vakua oři pokojové teplotě. 120,71 mg teto sodné soli polymeru se dispergujeve 2,0 ml destilované vody. Vedle toho se 3,66 ml vodnéhoroztoku PEG 5000-/~~l’et-1 , Arg11’23, Ser17’27’60’°5_7huG-CS? /10,93 mg/ml/ zlyofilizuje a potom rozpustí v dal-ších 2,0 ml destilované vody. Tento roztok se přidá k uve-dené suspenzi a směs se promísí. K opláchnutí použitýchskleněných nádobek se použijí další čtyři 0,5 ml alikvotydestilované vody. Získaný roztok se bezprostředně zmrazína lázni dichlormethan/Drikold a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického.lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 65 Ca potom formuje do tvaru destičky o v tloužtce 1 mm. Tato destička se potom rozseká na frakcemající hmotnost přibližně 70 mg. Tyto frakce se potomumístí do plastikových lékovek obsahujících 1,0 ml 0,02?ó/hmotn./obj. / roztoku azidu sodného v OXOID-fosfétem pu-frovaném fysiologickém roztoku a skladují při teplotě 37 °C. se oddělí vodné prostře-Uvolnování PEG 5000- V pravidelných intervalech dí a vždy nahradí čerstvým pufrem. - 60 - /Met 1, Arg11’23, Ser17,27,60’65_/hu G-CSF se stanovíanalýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chromatogra-fií odděleného vodného prostředí a ze získaných výsledkůse pro každý časový okamžik, ve kterém bylo odděleno vod-né prostředí, vypočte kumulované množství uvolněného pro-teinu /viz dála uvedena tabulka 1/. Přiklad 9
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnélátky obsahující PEG 5000 /“Met"1, Arg11’34, Ser17’27’60’6^7-hu G-CSF A. Postup s ledovou kyselinou octovou 120,65 mg polylaktidu /50 % hmotnostních d,l-lakti-du a 50 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 10691; polydispersita1,75/ se rozpustí ve 2,0 ml ledové kyseliny octové prostéanhydridu. Vedle toho se 3,810 ml vodného roztoku PEG 5000-/ Met 1, Arg11’34, Ser17’27’’^^_7hu G-CSF /viz referenč-ní příklad 20/ /10,5 mg/ml/ zlyofilizuje a potom rozpustív dalších 2,0 ml ledové kyseliny octové. Oba tyto roztokyse smísí a k opláchnutí použitých skleněných nádobek sepoužijí další čtyři 0,5 ml alikvoty ledové kyseliny octo-vé. Získaný roztok se bezprostředně zmrazí na lázni dichlor-metan/Drikold a lyofilizují přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického,lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 90 °C a potom formuje do tvaru destičkyo tlouštce 1 mm. Tato destička se potom rozseká na frakcemající hmotnost přibližně 70 mg. Tyto frakce se potom umís-tí do plastikových lékovek obsahujících 2,0 ml 0,02% /hmotn./obj./ roztoku azidu sodného v OXOID-fosfátem pufrovanémfysiologickém roztoku a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostředí - 61 - a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PPG 5000-/”L'et ,
Arg11’·^^, Ser17 ’ 27 > 60,65_7hu j.ggp se stanoví analýzouprovedenou vysokotlakou kapalinovou chromatografií odděle-ného vodného prostředí a ze získaných výsledků se pro kaž-dý časový okamžik, ve kterém bylo odděleno vodné prostře-dí, vypočte kumulované množství uvolněného proteinu /vizdále uvedená tabulka 1/. 3. Vodný způsob 5,0 g polylaktidu /50 /ó hmotnostních d,l-laktidu a50 ?ó hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmotnost-ní střední molekulová hmotnost 10691; polydispersita 1,75/se rozpustí ve 20 ml dichlořmethanu a získaný roztok semíchá za podmínek vysokého smykového napětí /homogenizátorYstral 1500/. K roztoku se po kapkách přidá 5 ml vodnéhoroztoku hydrogenuhličitanu sodného /20 mg/ml/. Přidá se dalších 50 ml vody vytvoří se temna e. Disperze se bez-n/Drikold a lyofili-se před vlastním chlormethan se odežene v rotační odparcprostředně zmrazí na lázni dichlormethazuje přes noc. Tato sodná sůl polymeru použití skladuje za vakua při pokojové teplotě. 120,15 mg této sodné soli polymeru se dispergujeve 2,0 ml destilované vody. Vedle toho se 3,610 ml vodné-ho roztoku PEG 5000-/-léet 1, Arg11’^^, Ser1 ? ’ ’ ^^_7hu G-CSP /10,5 mg/ml/ zlyofilizuje a potom rozpustí v dalších2,0 ml destilované vody. Tento roztok se potom přidá kuvedené suspenzi a směs se promísí. Pro opláchnutí použi-tého chemického skla se použijí další čtyři 0,5 ml alikvo-ty destilované vody. Získaný roztok se bezprostředně zmra-zí na lázni dichlormethan/Drikold a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 90 °C a potom formuje do tvaru destičky otlouštce 1 mm. Tato destička se potom rozseká na frakcemající hmotnost přibližně 75 mg. Tyto frakce se potom umístí - 62 do plastikových lékovek obsahujících 2,3 ml 3,32% /hmotn./obj./ roztoku azidu sodného v OXGIL-fosfátem pufrovanémfysiologickém roztoku a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PEG 5330-/""fcet 1, Arg11’34, ger17’27’’^^_7hu G-CSF se stanovíanalýzou provedeno vysokotlakou kapalinovou chromatografiíodděleného vodného prostředí a ze získaných výsledků sepro každý časový okamžik, ve kterém bylo odděleno vodnéprostředí, vypočte kumulovaná množství uvolněného protei-nu /viz dále uvedená tabulka 1/. Příklad 10
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnélátky obsahující PEG 5000-/“Met-1, Arg11’40, Ser17’27’60’6 ^7-hu G-CSF A. Postup s ledovou kyselinou octovou í 123,74 mg polylaktidu /50 % hmotnosti d,l-laktidua 50 % hmotnosti glykolidu ve formě kopolymeru; hmotnost- . ní střední molekulová hmotnost 10691; polydispersita 1,75/ £ se rozpustí ve 2,0 ml ledové kyseliny octové prosté anhy-dridu. Vedle toho se 3,77 ml vodného roztoku PEG 5000- .Ji /“Meť1, Arg11’40, Ser17,27’to0’65_7hu G-CSF /viz referenč- 1
ní příklad 21/ /10,6 mg/ml/ zlyofilizuje a potom rozpustí K v dalších 2,0 ml ledové kyseliny octové. Oba tyto roztoky . se smísí a k opláchnutí použitého chemického skla se po- £ užijí další čtyři 3,5 ml alikvcty ledové kyseliny octové. . £ Získaný roztok se bezprostředně zmrazí na lázni dichlor- - < methan/Drikold a lyofilizuje přes noc. v
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 95 °C a potom formuje do tvaru destičky o ; tlouštce 1 mm. Tato destička se potom rozseká na frakce - 63 - mašíci hmotnost přibližně 35 mg. Tyto frakce se potomumístí do plastikových lékovek obsahujících 2,0 ml 0,02'^/hmotn./obj./ roztoku azidu sodného v GXGID-fosfátem pufro-váném fysiologickám roztoku a skladují při teplotě 37 C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PEG 5000-/~léet \ Arg11’4^, ser17, 27 , o 0, θ5_7ιτα q_qsF se stanovíanalýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chromatografiíodděleného vodného prostředí a ze získaných výsledků sepro každý časový okamžik, ve kterém bylo odebráno vodnéprostředí, vypočte kumulované množství uvolněného proteinu/viz dále uvedená tabulka 1/. S. Vodný způsob 5,0 g polylaktidu /50 £ hmotnosti d,l-laktidu a50 7o hmotnosti glykolidu ve formě kopolymeru; hmotnostnístřední molekulová hmotnost 10691; polydispersita 1,75/se rozpustí ve 20 ml dichlormethanu a získaný roztok semíchá za podmínek vysokého smykového napětí /homogenizátorYstral 1500/. K roztoku se po kapkách přidá 5 ml vodnéhoroztoku hydrogenuhličitanu sodného /20 mg/ml/. Přidá sedalších 50 ml destilované vody a vytvoří se jemná bíládisperze. Dichlormethan se odežene v rotační odparce. Dis-perze se bezprostředně zmrazí na lázni dichlormethan/Bri-kold a lyofilizuje přes noc. Tato sodná sůl polymeru sepřed vlastním použitím skladuje za vakua při pokojovéteplotě. 120,20 mg sodné soli polymeru se disperguje ve 2,0ml destilované vody. Vedle toho se 3,77 ml vodného roztokuPEG 5000 /“čet“1, Arg11’40, Ser17’27’°3’65_7hu G-CSP /10,6mg/ml/ zlyofilizuje a potom rozpustí v dalších 2,0 mldestilované vody. Tento roztok se potom přidá k uvedenésuspenzi a směs se důkladně promísí. X opláchnutí použité-ho chemického skla se použijí další Čtyři 0,5 ml alikvotydestilované vody. Získaný roztok se bezprostředně zmrazí - 64 na lázni dichlormethan/Drikold a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 95 °C a potom formuje do tvaru destičkyo tlouštce 1 mm. Tato destička se potom rozseká na frakcemající hmotnost přibližně 72 mg. Tyto frakce se potomumístí do plastikových lékovek obsahujících 2,3 ml 0,32¾roztoku /hmotn./obj./ azidu sodného v OXOID-fosfátem pu-frovaném fysioiogickém roztoku a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PEG 5000-/ Met \ Arg11’40, Ser17 ’27 ’60 ’ 65__7hu G-CSF se stanovíanalýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chromatogra-fií odděleného vodného prostředí a ze získaných, výsledkůse pro každý časový okamžik, ve kterém bylo odděleno vodnéprostředí, vypočte kumulované množství uvolněného protei-nu /viz dále uvedená tabulka 1/. Příklad 11
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnélátky obsahující PEG' 5000-/""Met 1, Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5,11Ser17,27,60,65 7hu G-CSF A. Postup s ledovou kyselinou octovou 119,79 mg polylaktidu /60 % hmotnostních d,l-lakti-du a 50 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 10691; polydispersita1,75/ se rozpustí ve 2,0 ml ledové kyseliny octové prostéanhydridu. Vedle toho se 3» 175 cil vodného roztoku PEG 5330-/“Met“1, Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5’11, Ser17’27’60’65_7hu G-CSF /viz ^referenční příklad 22/ /12,6 mg/ml/ zlyofilizujea potom rozpustí v dalších 2,0 ml ledové kyseliny octové. K opláchnuti použitého chemického skla se použijí dalšíčtyři 0,5 ml alikvoty ledové kyseliny octové. Získaný roz- - 65 - tok se bezprostředně zmrazí na lázni dichlormethan/Trikolda lyofilizuje přes noc. frašek získaný po.lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 95 °C a potom formuje do tvaru destičky otloustce 1 mm. Tato destička se potom naseká na frakce ma-jící hmotnost přibližně čO mg. Tyto frakce se potom umís-tí do plastikových lékovek obsahujících 2,0 ml 0,02,0 roz-toku /hmotn./obj./ azidu sodného v OXOIT-fo státem pufrova-ném fysiologickém roztoku a skladují při teplotě 37 UC. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PEC- 5000-/“iáet"1 , Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5’11, Ser17’27’60’ó37hu G-CSE se stanoví analýzou provedenou vysokotlakou kapalino-vou chromatografií odděleného vodného prostředí a ze získáných výsledků se pro každý časový okamžik, ve kterém byloodděleno vodné prostředí, vypočte kumulované množství uvolněného proteinu /viz dále uvedena tabulka 1/. B. Vocný způsob 5,0 g polylaktidu /50 ;’ó hmotnostních d,l-laktidu a50 ;ó hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmotnost-ní střední molekulová hmotnost 10691; polydispersita 1,75/se rozpustí ve 20 ml dichlormethanu a získaný roztok semíchá za podmínek vysokého smykového napětí /homogenizátorYstral 1500/. K tomuto roztoku se po kapkách přidá 5 mlvodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného /20 mg/ml/.Přidá se dalších p0 ml destilované vody a vytvoří se jemnábílá disperse. Eichlormethan se potom odežene v rotačníodparce. Tisperze se bezprostředně zmrazí na lázni dichlormethan/Lrikold a lyofilizuje přes noc. Tato sodná sůl po-lymeru se před vlastním použitím skladuje za vakua při te-plotě okolí. 119,67 mg této sodné soli polymeru se dispergujeve 2,0 ml destilované vody. Vedle toho se 3,175 ml vodného - 66 roztoku PEG 5030-/ Zet"1, Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5’11,Ser17’27’60’65_7hu G-CS? /12,6 mg/ml/ zlyofilizuje a po-tom rozpustí v dalších 2,0 ml destilované vody. Tento roz-tok se přidá k uvedené suspenzi a směs se promísí. K pro-pláchnutí použitého chemického skla se použijí další čty-ři 0,5 ml alikvoty destilovaná vody. Získaný roztok sebezprostředně zmrazí na lázni dichlormethan/Erikold a lyo-filizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 95 °C a potom formuje do tvaru destičky v o tlouštce 1 mm. Tato destička se potom rozseká na frakcemající hmotnost přibližně 90 mg. Tyto frakce se potom umís-tí do plastikových lékovek obsahujících 2,0 ml 0,02» roz-toku /hmotn.-obj./ azidu sodného v OXOIB-fosfátovém pufrova-ném fysiologickém roztoku a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a «nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PSG 5000-/~~Met”1 , Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5’11, Ser17’27’60’G-CSF se stanoví analýzou provedenou vysokotlakou kapalino-vou chromatografií odděleného vodného prostředí a ze zís-kaných výsledků se pro každý časový okamžik, ve kterém by-lo vodné prostředí odděleno, vypočte kumulované množstvíuvolněného proteinu /viz dále uvedená tabulka 1/. Přiklad 12
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnélátky obsahující PEC- 5030-/“Zet_1 , Clu15, Ser17’^7, Ala26’28Arg3°_7hu G-CSF A. Postup s ledovou kyselinou octovou 120,25 mg polylaktidu /50 ;o hmotnostních d,l-laktidua 50 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 10691; polydispersita - 67 - -·Λ 1,75/ se rozpust! ve 2,0 ml ledové kyseliny octové prostéanhydridu. Vedle toho se 2,599 ml vodného roztoku PkG 5000-/“íéet"1 , Glu15, Ser17,27, Ala26’28, Arg3°_/hu G-CSF /vizreferenční příklad 15/ /13,S mg/ml/ zlyofilizuje a potomrozpustí v dalších 2,0 ml ledové kyseliny octové. Oba tytoroztoky se smísí a k propláchnutí použitého chemického sklase použijí další čtyři 0,5 ml alikvoty ledové kyselinyoctové. Získaný roztok se bezprostředně zmrazí na láznidichlormethan/Erikold a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 90 °C a potom formuje do tvaru destičky otlouštce 1 mm. Tato destička se potom rozseká na frakcemající hmotnost přibližně 100 mg. Tyto frakce se potomumístí do plastikových lékovek obsahujících 2,0 ml 0,02%/hmotn./obj./ azidu sodného v OXUIE-fosfátem pufrovanémfysiologickém roztoku a skladují při teplotě 37 UC. V pravidelných intervalech se vodné prostředí oddě-lí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PkG 5000-<Met“1, Glu15, Ser17’27, Ala26’28, Arg3°_7hu G-CSF sestanoví analýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chro-matografií odděleného vodného prostředí a ze získaných vý-sledku se pro každý časový okamžik, ve kterém bylo oddě-leno vodné prostředí, vypočte množství kumulovaného uvolně-ného proteinu /viz dále uvedená tabulka 1/. 3. Vodný způsob 5,3 g polylaktidu /50 % hmotnostních d,l-laktidua 50 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní středni molekulová hmotnost 10691; polydispersita1,75/ se rozpustí ve 20 ml dichlormethanu a získaný roz-tok se míchá za podmínek vysokého smykového napětí /homo-genizátor Ystral 1500/. K tomuto roztoku se po kapkáchpřidá 5 ml vodného roztoku hydrogenuhličítar.u sodného /20 mg/ml/. Přidá se dalších 5- ! es t .ován·; 68 tvoři se jemná bílá disperze. Lichlormethan se potom ode-žene v rotační odparce. Tisperze se bezprostředně zmrazína lázni áichlzrmíthan/Prikold a lyofilizuje přes noc. Ta-to sodná sál se před vlastní použitím skladuje za vakuapři pokojová teplotě. 121,37 mg této sodné soli polymeru se disperguje ve 2,1 ml destilované vody. Vedle toho se 2,899 ml vodného . cλ λ /—+ — 1 r" 15 e 17,27 *-1 26,28 , 3Ο-7 roztoku Pie 5101-/ met , G±u , Ser ’ , Ala ’ , Arg _/hu G-CS? /13,8 mg/ml/ zlyoíilizuje a potom rozpustí v dal- ších 2,1 ml destilované vody. Tento roztok se přidá k uve-dené suspenzi a získaná směs se promísí. K opláchnutí po-užitého chemického skla se použijí další čtyři 1,5 ml ali-kvoty destilované vody. Roztok se bezprostředně zmrazí nalázni dichlormethan/Trikold a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 95 °C a potom formuje do tvaru destičky otlouštce 1 mm. Tato destička se potom rozseká na frakcemající hmotnost přibližně 111 mg. Tyto frakce se potomumístí do plastikových lékovek obsahujících 2,1 ml 1,02»roztoku /hmotn.Obj./ azidu sodného v QXOID-fosfátem pufro-vaném fysiologickém roztoku a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a vždy nahradí čerstvým pufrem. Uvolňování PEG 5OH-/“tíet"1 , Glu15, Ser17’27, Ala26’28, Arg3°_7hu G-CS? sestanoví analýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chro-matografií a ze získaných výsledků se pro každý časovýokamžik, ve kterém bylo odděleno vodné prostředí, se vypoč-te kumulované množství uvolněného proteinu /viz dále uve-dená tabulka 1/. Příklad 13
Farmaceutická kompozice s kontinuální uvolňováním účinné látky obsahující PEGhu G-CS? ser’7 >27 >1 ' 5-'' 6, Glu"' 69 A. Postup s ledovou kyselinou octovou 120,80 mg polylaktidu /50 % hmotnostních d,l-lakti-du a 50 hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulové hmotnost 10691; polydispersita1,75/ se rozpustí ve 2,0 ml ledové kyseliny octové prostéanhydridu. Vedle toho se 3,333 nil vodného roztoku PEG 5000-/“heť1 , Ser17 ’27 ’11 5’11 6, Glu111_7hu G-CSF /viz referenč-ní příklad 16/ /12,0 mg/ml/ zlyofilizuje a potom rozpustív dalších 2,0 ml ledové kyseliny octové. Oba tyto roztokyse smísí a k propláchnutí použitého chemického skla se po-užijí další čtyři 0,5 ml alikvoty ledové kyseliny octové.Získaný roztok se bezprostředně zmrazí na lázni dichlorme-tan/Drikold a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizování se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s vyhřívanými tlačnými deska-mi na teplotu 90 °C a potom formuje do tvaru destičky otlouštce 1 mm. Tato destička se potom rozseká na frakcemající hmotnost přibližně 95 mg. Tyto frakce se potom umís-tí do plastikových lékovek obsahujících 2,0 ol 0,02/ roz-toku /hmotn./obj./ azidu sodného v OXOID-fosfátem pufrova-ném fysiologickém roztoku a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PEG 5000-/"Met“1 , ser17’27’115’116, Glu111 _7hu G-CSF se stanovíanalýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chromatografiíodděleného vodného prostředí a ze získaných výsledků sepro každý časový okamžik, ve kterém bylo,odděleno vodnéprostředí, vypočte kumulované množství uvolněného proteinu/viz dále uvedená tabulka 1/. B. Vodný způsob 5,0 g polylaktidu /50 '/ hmotnostních d,l-laktidua 50 / hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 10691; polydispersita - 70 - 1,75/ se rozpustí ve 20 ml dichlormethanu a roztok se mí-chá za podmínek vysokého smykového napětí /honogenizátorYstral 1530/. K roztoku se po kapkách přidá 5,0 ml vodnéhoroztoku hydrogenuhličitanu sodného /20 mg/ml/. Přidá sedalších 50 ml destilované vody a vytvoří se jemná bíládisperze. Eichlormethan se odežene za sníženého tlaku vrotační odparce. Disperze se bezprostředně zmrazí na láz-ni dichlormethan/Drikold a lyofilizuje přes noc. Tato sod-ná sál polymeru se před vlastním použitím skladuje za va-kua při pokojové teplotě. 119,83 mg této sodné soli polymeru se dispergujeve 2,0 ml destilované vody. Vedle toho se 3,333 ml vodné-ho roztoku PEG 5000-/“Κίβΐ-1 , Ser1 7’27’11 5 ’1 1 6 , Glu11l_7huG-CSF /12,0 mg/ml/ zlyofilizuje a potom rozpustí v dalších2,0 ml destilované vody. Tento roztok se potom přidá kuvedené suspenzi a získaná směs se promísí. K opláchnutípoužitého chemického skla se použijí další čtyři 0,5 mlalikvoty destilované vody. Roztok se potom bezprostřednězmrazí na lázni dichlormethan/Drikold a lyofilizuje přesnoc.
Práše získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 95 °C a potom formuje do tvaru destičky otlouštce 1 mm. Tato destička se potom rozseká na frakcemající hmotnost přibližně 95 mg. Tyto frakce se potom umís-tí do plastikových lékovek obsahujících 2,0 ml 0,02% roz-toku /hmotn./obj./ azidu sodného v OXOID-fosfátem pufro-vaném fysiologickém roztoku a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PEG 5300-/_ Met , Ser^ ? > 27,115 >116 > 1 1 _7hu G-CSF se stanoví analýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chromatografíodděleného vodného prostředí a ze získaných výsledků sepro každý časový okamžik, ve kterém bylo,odděleno vodnéprostředí, vypočte kumulované množství uvolněného protei-nu /viz dále uvedená tabulka 1/. - 71 - Příklad 14 látky obsahující FEG 5OOO-/”jtet“1 , Arg11,l°5, ber17,27,
farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnélátky obsahujícíLys5S_7hu G-CSF A.. Postup s ledovou kyselinou octovou 119,28 mg polylaktidu /50 % hmotnostních d,l-lakti-du a 50 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 10691; polydispersita1,75/ se rozpustí ve 2,0 ml ledové kyseliny octové prostéanhydridu. Vedle toho se 2,224 ml vodného roztoku PEG 5000-/~vlet"1, Arg11’165, Ser17’27, Lys?8_7hu G-CSF /17,905 mg/ml/zlyofilizuje a potom rozpustí v dalších 2,0 ml ledové ky-seliny octové. Oba tyto dva roztoky se smísí a k proplách-nutí použitého chemického skla se použijí další čtyři 0,5 mlalikvoty ledová kyseliny octové. Získaný roztok se bezpro-středně zmrazí na lázni dichlormethan/Zrikold a lyofilizu-je přes noc.
Frašek získaný po lyofilizaci se důkladné promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 90 °C a potom formuje do tvaru destičky otlouštce 1 mm. Tato destička se potom rozseká na frakcemající hmotnost přibližně 100 mg. Tyto frakce se potomumístí do plastikových lákovek obsahujících 2,0 ml 0,02%roztoku /hmotn./obj./ azidu sodného v OXOID-fosfátem pufro-váném fysiologickém roztoku a skladují při teplotě 37 C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PEG 5000-zfMet"1, Arg11’165, Ser17’27, Lys5b_7hu G-CSF se stanovíanalýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chromátogra-fií odděleného vodného prostředí a ze získaných výsledkůse pro každý časový okamžik, ve kterém bylo odděleno vodnéprostředí, vypočte kumulované množství uvolněného protei-nu /viz dále uvedená tabulka 1/. - 72 B. Vodný způsob 5,0 g polylaktidu /50 n> hmotnostních d,l-laktidu a50 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmotnost-ní střední molekulová hmotnost 10691; polydispersita 1,75/se rozpustí ve 20 ml dichlormethanu a umístí do směšovačepracujícího za podmínek vysokého smykového namáhání /homo-genizátor Ystral 1500/. K roztoku se po kapkách přidá 5>0ml vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného /20 mg/ml/.Přidá se dalších 50 ml destilované vody a vytvoří se jemnábílá disperze. Pichlormethan se odežene v rotační odparce.Disperze se bezprostředně zmrazí na lázni dichlormethan/Dri-kold a lyofilizuje přes noc. Tato sodná sůl polymeru sepřed vlastním použitím skladuje za vakua při pokojové te-plotě. 119,82 této sodné soli polymeru se disperguje ve2,0 ml destilované vody. Vedle toho se 2,224 ml vodnéhohoroztoku PEC- 5000 / Yet \ Arg1^*1^^, Ser1?’2?, Lys?\_7huG-CS? /17,985 mg/ml/ zlyofilizuje a potom rozpustí v dal-ších 2,0 ml destilované vody. Tento roztok se přidá k uve-dené suspenzi a směs se promísí. K opláchnutí použitéhochemického skla se použijí další čtyři 0,5 ml alikvotydestilované vody. Roztok se bezprostředně zmrazí na láznidichlormethan/Drikold a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 95 °C a potom formuje do tvaru destičky stlouštkou asi 1 mm. Tato destička se potom rozseká na frak-ce mající hmotnost přibližně 90 mg. Tyto frakce se potomumístí do plastikových lékovek obsahujících 2,0 ml 0,02¾roztoku /hmotn./obj./ v OXOID-fosfátem pufrovaném fysiolo-gickém roztoku a skladují při teplotě 37 C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PEG 5OOO-/"Yet"1, Arg11’165, Ser17’27, Lys5&amp;_7hu G-CSF se stanovíanalýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou cnromatografií - 73 - odděleného vodného prostředí a ze získaných výsledků sepro každý časový okamžik, ve kterém bylo odděleno vodnéprostředí, vypočte kumulované množství uvolněného protei-nu /viz dále uvedena tabulka 1/. Příklad 15
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnélátky obsahující FEG 5000-/7žet_1, Ser17’27, Lys49,5°,Ala44’51’55 7hu G-CSF A. Postup s ledovou kyselinou octovou 119,83 mg polylaktidu /50 % hmotnostních d,l-lakti-du a 50 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 10691; polydispersita1,75/ se rozpustí ve 2,0 ml ledové kyseliny octové prostéanhydridu. Vedle toho se 2,317 ml vodného roztoku PEG 5000-zfldet“1, Ser17»27, Lys49,58, Ala44’51 ’55_7hu G-CSF /vizreferenční příklad 18/ /17,262 mg/ml/ zlyofilizuje a potomrozpustí v dalších 2,0 ml ledová kyseliny octová. Oba tytodva roztoky se smísí a k opláchnuti použitého chemickeh oskla se použijí další čtyři 0,5 ml alikvoty ledové kyselinyoctové. Roztok se bezprostředně zmrazí na lázni dichlor-methan/Drikoid a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 90 °C a potom formuje do tvaru destičkymající tlouštku 1 mm. Tato destička se rozseká na frakcemající hmotnost přibližně 100 mg. Tyto frakce se potomumístí do plastikových lékovek obsahujících 2,0 ml 0,02:óroztoku /hmotn./obj./ v OXOTD-fosfátem pufrovaném fysiolo-gickém roztoku a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-
dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PEG / ú;et~1 , >er 17,27 T 49,55Lys ’' ,
Ala 44’51,55 7hu G-C: 5OOO-F se 'Z-/'.'· - 74 - stanoví analýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chro-matografií odděleného vodného prostředí a ze získaných vý-sledků se pro každý časový okamžik, ve kterém bylo odděle-no vodné prostředí, vypočte kumulované množství uvolněnéhoproteinu /viz dále uvedená tabulka 1/. 3. Vodný způsob 5,0 g polylaktidu /50 % hmotnostních d,l-laktidu a50 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmotnost-ní střední molekulová hmotnost 10691; polydispersita 1,75/se rozpustí ve 20 ml dichlormethanu a získaný roztok semíchá za podmínek vysokého smykového napětí /homogenizátorYstral 1500/. K roztoku se po kapkách přidá 5,0 ml vodné-ho roztoku hydrogenuhličitanu sodného /20 mg/ml/. Přidáse dalších 50 ml destilované vody a vytvoří se jemná bíládisperse. Pichlormethan se odežene v rotační odparce. Dis-perze se bezprostředně zmrazí na lázni dichlormethan/Pri-kold a lyofilizuje přes noc. Tato sodná sůl polymeru sepřed vlastní použitím skladuje za vakua při teplotě okolí. 120,82 mg uvedené sodné soli polymeru se dispergujeve 2,0 ml destilované vody. Vedle toho se 2,J17 ml vodnéhoroztoku PPG 50OO-/-Met”\ Ser17’27, Lys49,58, Ala44,51’55_7-hu G-CSF /17,262 mg/ml/ zlyofilizuje a potom rozpustí vdalších 2,0 ml destilované vody. Tento roztok se přidá kuvedené suspenzi a směs se promisí. K opláchnutí použité-ho chemického skla se použiji další čtyři 0,5 ml alikvotydestilované vody. Roztok se bezprostředně zmrazí na láznidichlormethan/Drikold a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promisíza použití hydraulického tlaku s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 95 °C a potom formují do tvaru destičkymající tlouštku 1 mm. Tato destička se potom rozseká nafrakce mající hmotnost přibližně 100 mg. Tyto frakce sepotom umístí do plastikových lékovek obsahujících 2,0 ml0,02% roztoku /hmotn./obj./ azidu sodného v GXOlD-fosfstem - 75 - pufrovaném fysiologickém roztoku a skladují při teplota37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pudrem. Uvolňování PPG 5000-/“ket"1, Ser17’27, Lys45’53, Ala44’51’55_7hu G-GSF se sta-noví analýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chroma-tográfií odděleného vodného prostředí a ze získaných vý-sledku se pro každý časový okamžik, ve kterém bylo oddě-leno vodné prostředí, vypočte kumulované množství uvolně-ného proteinu /viz dále uvedená tabulka 1/. Příklad 16
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňování účinnélátky obsahující PPG 750-Zl.’et"1 , Arg11, Ser17’275č0’ó5_7-hu G-CSP
Postup s ledovou kyselinou octovou 150,11 mg polylaktidu /50 G hmotnostních d,l-laktidua 50 ;ó hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 10691; polydispersita1,75/ se rozpustí ve 2,0 ml ledové kyseliny octové prosteanhydridu. Vedle toho se 4,676 ml vodného roztoku PEG 750-/ Ilet 1, Arg11, Ser1 7 ’27 ’’ 3;>_7hu G-CSP /viz referenčnípříklad 24/ /6,55 mg/ml/ zlyofilizuje a potom rozpustí vdalších 2,0 ml ledové kyseliny octové. Oba tyto roztokyse smísí a k opláchnutí použitého chemického skla se po-užijí další čtyři 0,5 ml alikvoty ledové kyseliny octové.Roztok se bezprostředně zmrazí na lázni dichlormethan/Pri-kold a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 90 °r a doťot + , * · u a povom xormuQe do tvaru destičkymající tloštku 1 mm. Tato destička se rozseká na frakcemající hmotnost přibližně 75 mg. Tyto frakce se potom - 76 -
umístí do plastikových lákovek obsahujících 2,0 sl 3,02½roztoku /hmotn./obj./ asidu sodného v OXOIB-fosíátem pu-covaném fysiologickém roztoku a skladují při teplotě 37 °C V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování FEG 750-/"\et \ Arg11, Ser^7>27,60,o5_7hu g-qsf se stanoví analý-zou provedenou vysokotlakou kapalinovou chromatografiíodděleného vodného prostředí a ze získaných výsledků sepro jednotlivá časové okamžiky, ve kterých bylo oddělenovodné prostředí, vypočte kumulované množství uvolněnéhoproteinu /viz dále uvedená tabulka 1/. Příklad 17
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnálátky obsahují PEC- 2000-/” íet“1 , Arg11, Ser17 ’27 ’60 ’ 65_7-hu G-CS? A. Postup s ledovou kyselinou octovou 140,32 mg polylaktidu /p0 % hmotnostních d,l-lakti-du a 50 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmotnostní střední molekulová hmotnost 10691; polydispersita1,75/ se rozpustí ve 2,0 ml ledové kyseliny octové prostéanhydridu. Vedle toho se 4,695 ml vodného roztoku PEC- 2000/fkeť1, Arg11, Ser17,27,60,65_7hu G-CSF /6,52 mg/ml/ zlyofilizuje a potom rozpustí v dalších 2,0 ml ledové kyseli-ny octové. Oba tyto roztoky se smísí a k opláchnutí použi-tého chemického skla se použijí další čtyři 0,5 ml alikvo-ty ledové kyseliny octové. Roztok se bezprostředně zmrazína lázni dichlormethan/Brikold a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísía použití hyd.radlického lisu s tlačnými deskami vyhřívaný-mi na teplotu 90 °c a potom formuje do tvaru destličky otloustce 1 mm. Tato destička se potom rozseká na frakcemající hmotnost přibližně 70 mg. Tyto frakce se umístí do - 77 plastikových lékovek obsahujících 2,3 ml 0,02% roztoku/hmotn./obj./ azidu sodného v OXOIO-fosfátem pufrovanémfysiologickém roztoku a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvím pufrem. Uvolňování PEG 2000-/_ Klet”1, Arg11 , Ser^ ’ ’ ^^_7hu G-CSF se stanoví ana- lýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chromatografiíodděleného vodného prostředí a ze získaných výsledků sepro každý časový okamžik, ve kterém bylo odděleno vodnéprostředí, vypočte kumulované množství uvolněného protei-nu /viz dále uvedená tabulka 1/. 3. Vodný způsob 5,0 g polylaktidu /50 % hmotnostních d,l-laktidua 50 '% hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 10691; polydispersita1,75/ se rozpustí ve 20 ml dichlořmethanu a roztok semíchá za podmínek vysokého smykového napětí /homogenizátorYstral 1500/. K roztoku se po kapkách přidá 5,0 ml vod-ného roztoku hydrogenuhličitanu sodného /20 mg/ml/. Při-dá se dalších 50 ml destilované vody a vytvoří se jemnábílá disperse. Dichlormethan se odežene v rotační odparce.Disperze se bezprostředně zmrazí na lázni dichlormethan/Dri-kold a lyofilizuje přes noc. Tato sodná sůl se před vlast-ním použitím skladuje za vakua při pokojové teplotě. 140,85 mg uvedené sodné soli polymeru se dispergujeve 2,0 ml destilované vody. Vedle toho se 4,695 ml vodné-ho roztoku PEG 20O0-/“iíet-1 , Arg11, Ser17 ’27 ’ 60 ’ °5_7huG-CSF /0,25 mg/ml/ zlyofilizuje a potom rozpustí v dalších2,0 ml destilované vody. Tento roztok se přidá k uvedenásuspenzi a směs se promísí. X opláchnutí použitého chemic-kého skla se použijí další čtyři 0,5 ml alikvoty destilo-vané vody. Roztok se bezprostředně zmrazí na lázni dichlor-methan/Drikold a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísí - 7δ - za použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhří-vanými na teplotu 90 °C a potom formuje do tvaru destičkys tlouštkou 1 mm. Tato destička se rozseká na frakce mají-cí hmotnost přiblžně 70 mg. Tyto frakce se potom umístído plastikových lékovek obsahujících 2,0 ml 0,02% roztoku/hmotn./obj./ azidu sodného v OXOID-fosfátem pufrovanémfysioiogickém roztoku a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PSG 2000-/ Met 1, Arg11 , Ser1^^_7hu G-CSF se stanoví ana-lýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chromatografiía ze získaných výsledků se pro každý časový okamžik, vekterém bylo odděleno vodné prostředí, vypočte kumulovanémnožství uvolněného proteinu /viz následující tabulka 1/. - 79 -
Tabulka ΤΑ
Uvolňováni analogů G-CSP z farmaceutických formulací obsa- hujících laktido-glykolidový kopolymer 1:1 Příklad c · Proces Obsah proteinu /'A hrcotn. Obsah polymeru//% hmotn. Číslo polymeru / Teplota lisovaní/° C/ 5A GAA 16,26 48,81 310 65 53 Aq 1 6,1 6 48,83 310 65 6A GAA 1 b, 89 53,56 310 65 63 Aq 16,84 50,87 310 65 7A GAA 17,49 52,79 310 65 73 Aq 17,65 52,82 310 65 O Ať;i GAA 16,94 50,88 310 65 33 Aq 1 6,88 50,95 310 65 9A GAA 16,54 49,87 312 0 Λ✓ v 93 Aq 16,60 49,87 312 90 1 OA GAA 16,49 49,77 312 95 1 OB Aq 15,73 47,27 312 95 1 1A GAA 15,23 45,60 312 95 11B Aq 14,87 44,48 312 95 12A GAA 1 6,08 48,35 312 90 123 Aq 16,12 48,52 3'2 8 5 13A GAA 16,51 Z C '> X. > J > 31 2 C A 1 33 Aq 16,38 49,06 312 95 14A GAA 16,19 48,27 312 r· λ 7 1 43 Aq 15,92 47,66 312 9 5 60
Tabulka TA /pokračování/ 1 5A GAA 15,63 46,81 312 90 1 53 Aq 15,06 45,48 312 95 16 GAA 19,17 71 ,95 312 90 17A GAA 17,30 60,93 312 90 173 Aq 17,56 62,82 312 90
Zkratky C-AA a Aq se vztahují k postupu s ledo-vou kyselinou octovou a k vodnému způsobu.
Tabulka 13
Rychlost uvolňování proteinu z výše uvedených far maceutic- kých kompozic Příklad Procentické mnošstv í proteinu uvolněné č. ke dni 1 4 6 11 16 18 5A 27,1 36,5 37,1 37,5 37,5 37,5 53 33,3 37,5 36,6 39,1 40,1 40,1 6A 77,0 96,4 102,7 106,7 111,3 112,9 7A 42,5 55,9 60,4 64,5 67,9 70,8 73 46,5 59,5 65,3 74,5 60,7 61,5 8A 50,3 66,4 72,4 78,2 65,2 86,6 83 55,5 76,4 64,6 87,6 59,5 90,1 - 81 -
Tabulka 13 /pokračovaní/
Procentické množství proteinu uvolněné ke čni 1 4 8 1 1 15 18 9A 16,2 21 ,8 24,6 40,1 43,9 93 27,2 37,3 41,6 45,0 54,1 1 OA 29,6 41 ,3 46,2 1 03 33,8 51 ,1 59,9 64,6 69,3 1 1A 45,9 60,1 65,7 113 42,0 66,0 72,9 74,6 Proceň tické množství proteinu uvolněného ke dni 1 3 8 1 1 15 18 1 2A+ 56,3 84,4 99,4 99,4 123+ 51,7 74,9 89,3 93,8 99,2 13A+ 37,3 67,7 85,8 1 08,6 133 36,2 75,7 95,2 104,0 105,2 1 4A+ 28,6 47,2 55,6 74,3 1 43+ 24,2 48,3 61 ,0 77,8 81 ,6 1 5A+ 58,1 84,4 96,0 96,2 1 53+ 50,3 111,3 127,2 129,7 131 ,9 132,3 Procentické ano ž s’t ví proteinu uvolněného ke čni 1 /1 T 8 1 1 15 18 16 6,2 6,7 6,8 6,9 6,9 6,9 17A 22,6 32,7 41 ,0 43,1 45,6 46,5 173 26,2 36,3 42,8 44,8 48,2 49,3 - 82 - +/ Příklad 18
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnélátky obsahující PEG 5000-/“:.et-1 , Arg11, Ser17’27’60’65_7-hu G-CSF /laktid:glykolid=80:20/ A. Postup s ledovou kyselinou octovou /obsah proteinu 5,52 // 158,91 mg polylaktidu /80 % hmotnostních d,l-lakti-du a 20 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulové hmotnost 7952; polydispersita2,01/ se rozpustí ve 2,0 ml ledové kyseliny octové prostéanhydridu. Vedle toho se 41,90 mg lyofilizovaného prepa-rátu PEG 5000-/“Eet_1, Arg11, Ser17’27’60’č5_7hu G-CSFrozpustí v dalších 2,0 ml ledové kyseliny octové. Oba tytoroztoky se smísí a κ opláchnutí použitého chemického sklase použijí další čtyři 0,5 ml alikvoty ledové kyselinyoctové. Roztok se bezprostředně zmrazí ponořením do kapal-ného dusíku a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 75 °C a potom formuje do tvaru uvedenýchtestovacích frakcí majících hmotnost přibližně 80 mg. Tytofrakce se potom umístí do plastikových lékovek obsahují-cích 2,0 ml 0,02¾ roztoku /hmotn./obj./ v OXOID-fosfátempufrovaném fysiologickém roztoku a skladují při teplotě37 °C. V pravidelných intervalech se vodné prostředí oddě-lí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PEG 5000-/ met-1, Arg11, Ser1 7 ’27 ’ ’ ^>>_7hu G-CSF se stanoví ana- lýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chromatografiíodděleného vodného prostředí a ze získaných výsledku sepro každý časový okamžik, ve kterém bylo odděleno vodné - 83 prostředí, vypočte kumulované množství uvolněného protei-nu.
Uvolňovaní proteinu z farmaceutická formulace
Den_Uvolněné množství /%>/ 1 10,41 4 17,36 7 21 ,73 1 1 24,47 14 27,67 18 30,69 Příklad 19
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinné .11 látky obsahující PEG 5001-/ ;«'et 1 ,
Arg' ^7,27,60/05/. hu G-CSF / SO % polylaktido-glykolidu 50:50 a 20 % methyl-polyethylenglykolu k000_/ A.Postup s ledovou kyselinou octovou /5,23^ obsah proteinu/ 159,87 hydrogelu /80,7 % hmotnostního d,l-laktido-glykolidového kopolymeru, 19,3 % hmotnostního MePEG 2000/se rozpustí ve 2,0 ml ledová kyseliny octové prosté anhy-dridu. Vedle toho se 4'J,26 mg lyofilitovaného preparátuPEG 5000-/“Met"1, Arg11, Ser17’27’60’b5_7hu G-CSF /25,46% hmotnostního proteinu/ rozpustí v dalších 2,0 ml ledo-vá kyseliny octové. Oba tyto roztoky se smísí a k opláchnu-tí použitého chemického skla se použijí další čtyři 0,5 nilalikvoty ledové kyseliny octové. Roztok se bezprostřednězmrací ponořením do kapalného dusíku a lyofilizuje přesnoc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 60 °C a potom formuje do tvaru výše popsa-ných testovacích frakcí majících hmotnost přibližně 80 mg. - 84
Tyto frakce se potom umístí do plastikových lékovek obsa-hujících 2,3 ml 0,02/á roztoku /hmotn./obj./ azidu sodnéhov OXOID-fosíátem pufrovaném fysiologickém roztoku a skla-dují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se vodné prostředí oddě-lí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PEG 5000-/ I.:et 1, Arg11, Ser1^’^^’^^’^^_7hu G-CSF se stanoví ana-lýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chromatografiía ze získaných výsledků se pro každý časový okamžik, vekterém bylo odděleno vodné prostředí, vypočte kumulovanémnožství uvolněného proteinu.
Uvolňování proteinu z farmaceutické kompozice
Den_Uvolněné množství /%/ 1 481115 24,5743,θ567,16 79,9191 ,57 Příklad 20
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnélátky obsahující PEG 5OOO-/J4et-1, Arg11, Ser17’27’60’65_7-hu G-CSF /80:4 laktido-glykolidového kopolymeru 100:0 a20 % methylpolyethylglykolu 2000/ A. Postup s ledovou kyselinou octovou /5 j 2396 obsah proteinu/ 159,70 g hydrogelu /82,5 % hmotnostního poly-d,l-laktidu, 17,5 -6 hmotnostního r/ePEG 2000/ se rozpustí ve’ 2,0 ml ledové kyseliny octové prosté anhydridu. Vedle tohose 39,50 mg lyofilizovaného preparátu PEG 5000-/”Uet-1,
Arg11 , Ser1 ? ’ ’ ^^_7hu G-CSF /26,46 :;’o hmotnostního pro- - 85 - teinu/ rozpustí v dalších 2,0 ml ledové kyseliny octové.Oba tyto roztoky se smísí a k opláchnutí použitého chemic-kého skla se použijí další čtyři 0,5 ml alikvoty ledovékyseliny octové. Roztok se bezprostředně zmrazí ponořenímdo kapalného dusíku a lyofilizuje přes noc.
Prásek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 60 °C a potom formuje do výše popsanýchtestovacích frakcí majících mnotnost přibližně 70 mg. Ty-to frakce se potom umístí do plastikových lékovek obsahu-jících 2,0 ml 0,02;6 roztoku /hmotn./obj./ azidu sodnéhov OXOID-fosfátem pufrovaném fysiologickém roztoku a skla-dují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PSG 5000-/~ičet 1 , Arg11, Ser17,27’^^’^^_7hu G-C3F se stanoví analý-zou provedenou vysokotlakou kapalinovou chromatografiía ze získaných výsledků se pro každý časový okamžik, veKterém bylo odděleno vodná prostředí, vypočte kumulovanémnožství uvolněného proteinu.
Uvolňování proteinu z farmaceutické kompozice
Den_Uvolněné množství /%/ 25,19 481 11518 63,52 86,20 93,67 97,50 98,88 Příklad 21
Farmaceutická kompoziclátky obsahující PSU 5 e s kontinuálním uvolňováním000-/“;'et“1 , Arg1 1 , Ser17’27 účinné S Λ r —
Ov',00 y. - 86 hu G-CSF /laktido-glykolidový kopolymer 50:50/ A. Postup s ledovou kyselinou octovou /4,1obsah proteinu/ 160,34 mg polylaktidu /50 ·% hmotnostních d,l-lakti-du a 50 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 9627; polydispersita2,18/ se rozpustí ve 2,0 ml ledové kyseliny octové prostéanhydridu. Vedle toho se 40,73 mg lyofilizovaného prepa-rátu PFG 5000 /“liet"1, Arg11, Ser17’27’60’65_7hu G-CS? roz-pustí v dalších 2,0 ml ledové kyseliny octové. Oba tytoroztoky se smísí a k opláchnutí použitého chemického sklase použijí další čtyři 0,5 ml alikvoty ledové kyselinyoctové. Roztok se bezprostředně zmrazí ponořením do ka-palného dusíku a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 60 C a potom formuje do výše popsanýchtestovacích frakcí majících hmotnost přibližně 60 mg. Tytofrakce se potom umístí do plastikových lékovek obsahují-cích 2,0 ml 0,02% roztoku /hmotn./obj./ azidu sodného vUXOIL-fosfátem pufrovaném fysiologickém roztoku a skladu-jí při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování P3G ρΟθθ-/Tvíet""1 , Arg11, Ser17 ’27 ’ 6° ’ 65_/hu G-CS? se stanoví analý-zou provedenou vysokotlakou kapalinovou chromatografiíodděleného vodného prostředí a ze získaných výsledků sepro každý časový okamžik, ve kterém bylo vodná prostředíodděleno, vypočte kumulované množství uvolněného protei-nu.
Uvolňování .proteinu z farmaceutické kompozice
Den_Uvolněné množství /%/ 1 18,05 - 87 4 8 1 114 18 40,0357,4766,1 872,0677,77 Přiklad 22
hu G-CSF /laktido-glykolidový kopolymer 75^25/
Postup s ledovou kyselinou octovou 161,46 mg polylaktidu /75 % hmotnostních d,l-lakti-du a 25 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmotnostní střední molekulová hmotnost 12y38; polydispersita1,81/ se rozpustí ve 2,0 ml ledové kyseliny octová prostáanhydridu. Vedle toho se 39,Oj mg lyofilizovanáho prepa-rátu PEG TG50 rozpustí v dalších 2,0 ml ledové kyselinyoctové. Oba tyto roztoky se smísí a k opláchnutí použité-ho chemického skla se použijí další čtyři 0,5 ml alikvotyledové kyseliny octové. Roztok se bezprostředně zmrazí po-nořením do kapalného dusíku a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísiza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 75 °C a potom formují do tvaru výše po-psaných testovacích frakcí majících hmotnost přibližně 80mg. Tyto frakce se potom umístí do plastikových lékovekobsahujících 2,0 ml 0,02% roztoku /hmotn./obj./ azidu sod-ného v OXGlD-fosfátem pufrovaném fysiologickém roztoku. V pravidelných intervalech se oddělí vodná prostře-
íýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chromatografií
fl; 68 prostředí, vypočte kumulované množství uvolněného protei-nu.
Uvolňování proteinu z farmaceutické kompozice
Den_Uvolněné množství /17 1 7,82 λ *T 12,27 r*> í 15,46 1 1 17,25 14 15,3ο 18 21 ,06 Příklad 23
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnékompozice obsahující FUG 5330-/-let Arg'1, Ser1 ? ’ :hu G-CSF /laktid:glykolid=1 00:0/ op 7-
Postup s ledovou kyselinou octovou /5,37¾ obsah proteinu/ 150,67 polylaktidu /100 x> hmotnostních d,l-laktidua 0 % hmotnostních glykolidu; hmotnostní střední molekulo-vá hmotnost 9042; polydispersita/ se rozpustí ve 2,0 mlledové kyseliny octové prosté anhydridu. Vedle toho se 40,42 mg lyofilizovaného preparátu P2G 5000-/-met-1, Arg11,Ser1’^7,60,65_yhu G-CSF rozpustí v dalších 2,0 ml ledovákyseliny octové. Oba tyto roztoky se smísí a k opláchnutípoužitého chemického skla se použijí další čtyři 0,5 mlalikvoty ledové kyseliny octové. Roztok se bezprostřednězmrazí ponořením do kapalného dusíku a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísí za použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhřívá-/·> nými na teplotu 75 ®Ca potom formují do tvaru výše popsa-ných testovacích frakcí majících hmotnost přibližně 70 mg.Tyto frakce se potom umístí do plastikových lékovek obsa- - 89 bujících 2,0 ml 0,02/ roztoku /hmotn./obj./ azidu sodnéhov OXOID-fosf&amp;tem pufrovaném fysiologickém roztoku a skla-dují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PEG 5θ0θ-/-Líet-1 , Arg11, Ser17’2'’^3’^^_7hu G-CSF se stanoví analý- zou provedenou vysokotlakou kapalinovou chromatografiíodděleného vodného prostředí a ze získaných výsledku sepro každý časový okamžik, ve kterém bylo odděleno vodnéprostředí, vypočte kumulované množství uvolněného proteinu.
Uvolňování proteinu z farmaceutické kompozice
Den_Uvolněné množství /%/ 1 13,02 4 22,46 7 29,44 11 33,15 14 36,34 18 41 ,31 Příklad 24
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnélátky obsahující PEG 5000-/“^et“1, Ser17,27_7hu G-CSFVodný způsob i/ Formulace G /20% obsah proteinu/ 4,0 g polylaktidu /50 % hmotnostních d,l-laktidua 50 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 7673; polydispersita2,55/ se rozpustí ve 12 ml dichlormethanu a roztok se mí-chá za podmínek vysokého smykového napětí /homogenizátorYstral 1500/. X tomuto roztoku se po kapkách přidají 4 ml - 90 vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného /20 mg/ml/.Přidá se dalších 60 ml destilované vody a vytvoří se jem-ná bílá disperze. Dichlormethan se odežene v rotační odpařce. Roztok se bezprostředně zmrazí na lázni dichlormethan/Drikold a lyofilizuje přes noc. Tato sodná sál polymeruse před vlastním použitím skladuje za vakua při pokojovéteplotě. 160,3 této sodné soli polymeru se disperguje ve '2 ml destilované vody. Vedle toho se 4,396 ml vodnéhoroztoku PSG 5 330-/“l.:et"1 , Ser17,27_7hu G-CSF /9,1 mg/ml/se zředí destilovanou na koncentraci uvedeného analogu G-CSF 5 mg/ml a přidá k uvedené suspenzi soli polymeru. Kopláchnutí použitého chemického skla se použijí další čty-ři 3,5 ml alikvoty destilované vody. Roztok se bezprostřed-ně zmrazí na lázni dichlormethan/Lrikold a lyofilizujepřes noc.
Frašek získaný po lyořilizaci se důkladně promísíza použití hydralického lisu s tlačnými deskami vyhřívaný-mi na teplotu 93 °C a potom formuje do tvaru destičky o tlouštce 1 mm. Tato destička se potom rozseká mající hmotnost přibližně 135 mg. Tyto frakceumístí do plastikových lákovek obsahujících 2fosfátem pufrovaného fysiologického roztoku asodného a skladují při teplotě 37 °C. rámce se potomml OXOIE-0,02 % azidu V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PSG 5000-/ met , Ser ’ _/hu G-CSF se stanoví analýzou provedenouvysokotlakou kapalinovou chromatografií odděleného vodnéhoprostředí a ze získaných výsledků se pro každý časový oka-mžik, ve kterém bylo odděleno vodné prostředí, vypočtekumulované množství uvolněného proteinu. ii/ Formulace H /23% obsah proteinu/ 4,3 g polylaktidu /53 % hmotnostních d,l-laktidua 53 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot- - 91 nostní střední molekulová hmotnost 7791,2; polydispersita2,65/ se rozpustí v 16 ml dichlormethanu a získaný roztokse míchá za podmínek vysokého smykového napětí /homogeni-zátor Ystral 1590/· X tomuto roztoku se po kapkách přida-jí 4 ml vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného /20mg/ml/. Fřidá se dalších 40 ml destilované vody a vytvoříse jemná bílá disperze. Pichlormethan se odežene v rotačníodparce. Roztok se bezprostředně zmrazí na lázni dichlor-methan/Rrikold a lyofilizuje přes noc. Tato sodná sůl po-lymeru se před vlastním použitím skladuje za vakua připokojové teplotě. 89,54 mg uvedené sodné soli polymeru se dispergu-je ve 2 ml destilované vody. 3,33 ml vodného roztoku FkG 5θ9θ-/ t.et \ Ser^’^^_/hu G-CSF /9 mg/ml/ sepřidá k uvedené disperzi soli polymeru. X opláchnutí po-užitého chemického skla se použijí další čtyři 0,5 ml ali-kvoty destilované vody. Roztok se bezprostředně zmrazí nalázni dichlormethan/urikold a lyofilizuje přes noc.
Prásek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 95 °C a potom formuje do tvaru destičky stlouštkou 1 mm. Tato destička se rozseká na frakce majícíhmotnost přibližně 63 mg. Tyto frakce se potom umístí aoplastikových lékovek obsahujících 2 ml OXOID-fosfátem pu-frovaného fysiologického roztoku a 0,02 % azidu sodného askladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PSG 5009-/ Xet \ Ser^’^^_7hu G-CSF se stanoví analýzou provede-nou vysokotlakou kapalinovou chromatografií oddělenéhovodného prostředí a ze získaných výsledků se pro každýčasový okamžik, ve kterém bylo odděleno vodné prostředí,vypočte kumulované množství uvolněného proteinu. Srovnáníkumulovaných množství uvolněného proteinu z formulací Ga H je zobrazeno na obr. 15. - 92
Srovnávací příklad 3
Farmaceutická komposice s kontinuálním uvolňováním účinnálátky obsahující šamotný /”Ižet-1 , Ser1^’2^_7hu G-CSFVodný způsob
Formulace ΐ /20&amp; obsah proteinu/ 4,0 g polylaktidu /50 Y hmotnostních d,l-laktidua 50 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 7791,2; polydispersita2,65/ se rozpustí v 16 ml dichlormethanu a získaný roztokse míchá za podmínek vysokého smykového napětí /homogeni-zátor Ystral 1 500/. K tomuto roztoku se po kapkách přida-jí 4 ml vodného roztoku hycirogenuhličitanu sodného /20mg/ml/. Přidá se dalších 40 ml destilované vody a vytvoříse jemná bílá disperze. Dichlormethan se odežene v rotač-ní odparce. Roztok se bezprostředně zmrazí na lázni dichlormethan/Drikold a lyofilizuje přes noc. Tato sodná sůl po-lymeru se potom skladuje za vakua při pokojové teplotě. 160,20 mg táto sodné soli polymeru se disperguje -í ve 2 ml destilované vody. 4,0 ml vodného roztoku / Met-1,Ser^’^7j g-CSF /10,0 mg/ml/ se zředí destilovanou vodouna koncentraci 5 mg/ml a takto zředěný roztok se potompřidá k suspenzi soli polymeru. K opláchnutí použitéhochemického skla se použijí další čtyři 0,5 El alikvotydestilované vody. Roztok se bezprostředně zmrazí na láznidichlormethan/Brikold a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 95 °C a potom formuje při téže teplotědo tvaru destičky s tlouštkou 1 mm. Tato destička se potomrozseká na frakce mající hmotnost přibližně 61 mg. Tytofrakce se potom umístí do plastikových lékovek obsahujících2ml OXOID-fosfátem pufrovaného fysiologického roztoku a 93 0,02 .¾ azidu sodného a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování /~ř.íet-1 , 17 27
Ser'1’ _7hu G-CSF se stanoví analýzou provedenou vysoko-tlakou kapalinovou chromatografíí odděleného vodného pro-středí a ze získaných výsledků se pro každý časový okamžik,ve kterém bylo odděleno vodné médium, vypočte kumulovanémnožství uvolněného proteinu, přičemž uvolňování proteinupro farmaceutickou formulaci I je zobrazeno na obr.lč.
Srovnávací příklad 4
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnélátky obsahující /""Met \ Ser^7,27_7hu G-CSF a methyl-PEG-5000
Vodný způsob
Formulace J /20% obsah proteinu/ 4,0 g polylaktidu /50 % hmotnostních d,l-laktidua 50 » hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 7791,2; polydispersita2,6p/ se rozpustí v 16 ml dichlormethanu a získaný roztokse míchá za podmínek vysokého smykového napětí /homogeni-zátor Ystral 1500/« h tomuto roztoku se po kapkách přida-jí 4 ml vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného /20mg/ml/. Přidá se dalších 40 ml destilované vody a vytvoříse jemná bílá disperse. Eichlormethan se odežene v rotač-ní odparce. Roztok se bezprostředně zmrazí na lázni di-chlormethan/Grikold a lyofilizuje přes noc. Tato sodnásůl polymeru se potom skladuje za vakua při pokojové te-plotě. 119,77 mg uvedené sodné soli póly.ve 2 ml destilované vody. 4,0 ml vodného3er17,27_7hu G-CSF /10,0 mg/ml/ se zředí .eru se dispergujeroztoku /~I;et-1 ,na koncentraci 5 mg/ml vodným roztokem obsahujícím 4: / λ > mg metnyl-rFa- - 94 5300 a takto zředěný roztok se přidá k suspenzi soli po-lymeru. K opláchnutí použitého chemického skla se použijídalší čtyři 0,5 ml alikvoty destilované vody. Roztok sebezprostředně zmrazí na lázni čichlormethan/Prikold a lyo-filizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhřívaný-mi na teplotu 95 °C o potom formuje do tvaru destičky stlouštkou 1 mm. Tuto destička se rozseká na frakce majícíhmotnost přibližně S3 mg. Tyto destičky se potom umístído plastikových lékovek obsahujících 2 ml OXOID-fosfátempufrovaného fysiologického roztoku a 3,32 % azidu sodnéhoa skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře- dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování / Ižet , 1 7 27 —
Ser ’ _/hu G-CSF se stanoví analýzou provedenou vysoko-tlakovou kapalinovou chromatografií odděleného vodného vod-ného prostředí a ze získaných výsledků se pro každý časo-vý okamžik, ve kterém bylo odděleno vodné prostředí, vy-počte kumulované množství uvolněného proteinu. Uvolňováníproteinu z formulace J je zobrazeno na obr. 16. Příklad 25
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnélátky obsahující PEG 5330-/ ket \ Glu^3, Ser^’^^,Lýs3°_7hu G-CSF
Vodný způsob
Formulace K /23% obsah proteinu/ 4,3 g polylaktidu /53 % hmotnostních d,l-laktidua 53 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 7791,2; polydispersita2,65/ se rozpustí v 16 ml dichlormethanu a získaný roztok - 95 se míchá za podmínek vysokého smykového napětí /homogeni-zátor Ystral 1530/· K tomuto roztoku se po kapkách přidají4 ml vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného /23 mg/ml/.Přidá se dalších 40 ml destilované vody a vytvoří se jem-ná bílá disperze. Čichlormethan se odežene v rotační odpar-ce. Roztok se bezprostředně zmrazí na lázni dichlormethan/-Crikold a lyofilizuje přes noc. Tato sodná sůl polymeruse potom skladuje za vakua při pokojové teplotě. 120,8 mg uvedené sodné soli polymeru se dispergujeve 2 ml destilované vody. K suspenzi soli polymeru se při-dá 3>738 ml vodného roztoku PPG 5300-/ met \ Glu^, 3er^*’27,Ala28’28, Lys^^/hu G-CSP /10,7 mg/ml/. X opláchnutí po-užitého chemického skla se použijí další čtyři 3,5 cl ali-kvoty destilované vody. Roztok-se bezprostředně zmrazí nalázni dichlormethan/Crikold a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyořilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 80 Ca potom formuje při téže-teplotě do v tvaru destičky s tlouštkou 1 mm. Tato destička se potomrozseká na frakce mající hmotnost přibližně 95 mg. Tytofrakce se potom umístí do plastikových lékovek obsahují-cích 2 ml OXUID-fosfátem pufrovaného fysiologického rozto-ku a 0,32 % azidu sodného a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PPG 5300-/“íet“1, C-lu15, Ser17’27, Ala26’28, Lys33_7hu G-CSF sestanoví analýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chro-matografií odděleného vodného prostředí a ze získaných vý-sledků se pro každý časový okamžik, ve kterém bylo oddě-leno vodné;prostředí, vypočte kumulované množství uvolně-ného proteinu. Uvolňování proteinu z formulace K je zobra-zeno na obr. 17· Příklad 26 farmaceutická komoozice s kon .v o lne - 56 látky obsahujícíhu G-CS? Z-/ .Vet-1. Ary11, Ser1 7 ’27 ’60 ’ 55 /- A.Vodný způsob i/ Formulace L /20:5 obsah proteinu/ ,w a polylaktidu /50 á hmotnostních d,l-laktidua 53 "é hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 7791,2; polydispersita2,65/ se rozpustí v 16 ml dichlormethanu a roztok se mícháza podmínek vysokého smykového napětí /homogenizátor Ystral15ΟΟ/. K tomuto roztoku se po kapkách přidají 4 ml vodné-ho roztoku hydrogenuhličitanu sodného /20 mg/ml/. Přidáse dalších 40 ml destilované vody a vytvoří se jemná bíládisperse. Lichiormethan se odežene v rotační odparce. Roz-tok se bezprostředně zmrazí na lázni dichlormethan/Drokolda lyofilizuje přes noc. Tato sodná sůl polymeru se potompřed vlastním použitím skladuje za vakua při teplotě okolí. 120,5 mg této sodné soli polymeru se disperguje ve2 ml destilované vody X získané suspenzi soli polymeruse přidá 3,478 ml vodného roztoku PPG 5000-/“";.:'et_1 , Arg11,Ser17’27,60’65_7hu G-CS? /11,5 mg/ml/. Přidá se dalších4 x 0,5 ml destilované vody použité k opláchnutí použitéhochemického skla. Roztok se bezprostředně zmrazí na láznidichlormethan/Drikold a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 90 °C a potom formuje při téže teplotě dotvaru destičky s tlouštkou 1 mm. Tato destička se rozsekána frakce mající hmotnost přibližně 84 mg. Tyto frakce sepotom umístí do plastikových lékovek obsahujících 2 mlOXOID-fosfátem pufrovaného fysiologického roztoku a 0,02 %azidu sodného a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře- v dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PEG 5000- - 97 - / Let"1
Arg ser 17,27,60,65 yhu G_c< se stanoví ana- lýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chromátografiíodděleného vodného prostředí a ze získaných výsledků sepro jednotlivé časové úseky, ve kterých bylo odděleno vod-né prostředí, vypočte kumulované množství uvolněného pro-teinu. Uvolňování proteinu z formulace L je zobrazeno naobr. 16.
Srovnávací Příklad 5
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňovánímlátky obsahující samotný /“"Met”1, Glu1^, Ser17,27,Lys3°_7hu G-CSF
Li a mne 26,28
Vodný způsob
Formulace /20% obsah proteinu/ 4,0 g polylaktidu /50 hmotnostních d,l-laktidua 50 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 7673; polydispersita2,59/ se rozpustí ve 12 ml dichlormethanu a roztok se mí-chá za podmínek vysokého smykového napětí /homogenizátorYstral 1500/. K tomuto roztoku se po kapkách přidají 4 mlvodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného /20 mg/ml/.Přidá se dalších 60 ml destilované vody a vytvoří se jem-ná bílá disperse. Dichlormetham se odežene za použití ro-tační odparky. Roztok se bezprostředně zmrazí na láznidichlormethan/Brikold a lyofilizuje přes noc. Tato sodnásůl polymeru se potom před vlastním použitím skladuje zavakua při pokojové teplotě. 160,93 mg uvedené sodné soli polymeru se dispergujeve 2 ml destilované vody. 4,124 ml vodného roztoku /~Met”1Glu1?, Ser17’27, Ála2o,2£, Lys33_7hu G-GSF /9,7 mg/ml/ sezředí destilovanou vodou na koncentraci 5,0 mg/ml a taktozředěný roztok se potom přidá k suspenzi polymerní soli. K opláchnutí použitého chemického skla se použijí další čtyři 0,5 πΰ. alikvoty destilovaná vody. Koztok se bezpro-středně zmrazí na lázni dichlormethan/Trikold a lyofili-zuje přes noc.
Prášek získaný po lyofiiizaci se dokladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 75 °C a potom formuje při téže teplotědo tvaru destičky s tlouštkou 1 mm. Tato destička se potomrozseká na frakce mající hmotnost přibližně Sl mg. Tytofrakce se potom umístí do plastikových lékovek obsahují-cích 2 ml OXOID-fosfétem pufrovaného fysiologického rozto-ku a 0,02 ,ú azidu sodného a skladují při teplotě.37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování / Met ,Glu1^, Ser1?’^?, Α1η^°’^θ, Lys^v__/hu G-CSF se stanovíanalýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chromatografiía ze získaných výsledků se pro každý časový okamžik, vekterém bylo odděleno vodné prostředí, vypočte kumulovanémnožství uvolněného proteinu. Uvolňování proteinu z formu-lace Id je zobrazeno na obr. 17.
Srovnávací ořiklad 6
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnélátky obsahující / met 1, Arg11, Ser1?’’°^_7hu G-CSFFormulace N /20m obsah proteinu/ 2,0 g polylaktidu /50 / hmotnostních d,l-laktidua 50 hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 7o73j polydíspersita2,55/ se rozpustí v 3 ml dichlormethanu a roztok se mícháza podmínek vysokého smykového napětí /homogenizátor xstral1 500/. K tomuto..roztoku se po kapkách přidají 2 ml vod-ného roztoku hydrogenuhličitanu sodného /20 mg/ml/. Přidáse dalších 30 ml destilované vody a vytvoří se jemná bíládisDerze. Dichlormethan se odežene v rotační odparce. Koz- - 99 tok se bezprostředně z.mrazí na lázni čichlormethan/Brikolda lyofilizuje přes noc. Tato sodná sál polymeru se potompřed vlastním použitím skladuje za vakua při pokojová te-plotě. 159,99 mg uvedené sodné soli polymeru se dispergujeve k ml destilované vody. 3,9G&amp; ml vodného roztoku / Let-'',Arg" , 3er^’^”'"^_7hu G-CS? /10,33 mg/ml/ se zředí des-tilovanou vodou na koncentraci 5,1 mg/ml a takto zředěnýroztok se přidá k suspenzi soli polymeru. K opláchnutípoužitého chemického skla se použijí další čtyři 1,5 mlalikvoty destilované vody. Roztok se bezprostředně zmrazína lázni dichlormethan/lrikold a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilisaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 95 Ca potom formuje při téže teplotě dotvaru destičky s tlouétkou 1 mm. Tato destička se rozsekána frakce mající hmotnost přibližně S1 mg. Tyto frakcese potom umístí do plastikových lékovek obsahujících á mlUXUID-fosfátem pufrovaného fysiologického roztoku a O,Jk %azidu sodného a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře- V . , 1 dí a nahradí vždy čerst-vým pufrem. Uvolňování / Let ,Arg'', Ser'”’’°^_/hu G-CS? se stanoví analýzou pro-vedenou vysokotlakou kapalinovou chromatografií a ze zís-kaných výsledků se pro každý časový okamžik, ve kterém seoddělí vodné prostředí, vypočte kumulované množství uvol-něného proteinu. Uvolňování proteinu z formulace U je zobrazeno na obr. 11. Příklad 27
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnélátky obsahující P2G plCl-lidský calcitonin A. Postup s ledovou kyselinou octovou /5,11 obsah proteinu/356,23 mg polylaktidu /51 hmotnostních d,l-laktidu 10 0 glykolidu v; kopolymeru; hmotnostní střední; polydispersita 1,75/ se rozpus- /691 molekulové hmotnost 1 Jftí ve 4,3 ml ledové kyseliny octové prosté anhydridu.
Vedle toho se 2,955 mi vodného roztoku P3G 5300-1idskéhocalcitoninu /8,46 mg/ml/ zlyofilizuje a potom rozpustív dalších 2,0 ml ledové kyseliny octové. Oba tyto roztokyse smísí a k opláchnutí použitého chemického skla se po-užijí další 4 1,0 ml alikvoty ledové kyseliny octové. Roz-tok se bezprostředně zmrazí ponořením do kapalného dusíkua lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 75 °C a potom vytlačuje kalibračním prů-vlakem 16. SxtruSát se potom nakrájí na frakce majícíhmotnost přibližně 10 mg. Tyto frakce se potom umístí doplastikových lékovek obsahujících 2,0 ml 0,02% roztoku/hmotn./obj./ azidu sodného v OXQIL-fosfátem pufrovanémfysiologickém roztoku a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře- v dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňováni PEG 5000-ličského calcitoninu se stanoví analýzou provedenou vyso-kotlakou kapalinovou chromatografií a ze získaných výsled-ků se pro každý časový okamžik, ve kterém bylo oddělenovodné prostředí, vypočte kumulované množství uvolněnéhoproteinu /viz dále uvedená tabulka 2/. 3. Vodný způsob 5,0 g polylaktidu /50 % hmotnostních d,l-laktidua 50 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 10691; polydispersita1,75/ se rozpustí ve 20,0 ml dichlorraethanu a roztok semíchá za podmínek vysokého smykového napětí /homogenizá-tor Ystral 1500/. X tomuto roztoku se po kapkách přidá5,0 ml vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného /20 mg/ml/.Přidá se dalších 50 ml destilované vody a vytvoří se jemná - 101 - bíle disperze. Dichlormethan se odežene v rotační odpar-ce. Disperze se bezprostředně zmrazí na lázni dichiorme-than/Lrikol a lyofilizuje přes noc. Tato sodná sůl poly-meru se potom před vlastním použitím skladuje za vakua připokojové teplotě· 392,62 mg uvedené sodné soli polymeru se dispergu-je ve 4,0 ml destilované vody. Vedle toho se 2,955 ml vod-ného roztoku PPG 5'000-lidského calcitoninu /6,46 mg/ml/zlyofilizuje a potom rozpustí v dalších 2,0 mi destilova-né vody. Tento roztok se potom přidá k uvedené suspenzia směs se smísí. K opláchnutí použitého chemického sklase použijí další čtyři 1 , 0 ml alikvoty destilované vody.Roztok se bezprostředně zmrazí ponořením do kapalnéhodusíku a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se důkladně promísíza použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vyhříva-nými na teplotu 60 °C a potom vytlačuje skrze kalibračníprůvlak 16. Txtrudát se potom nakrájí na frakce majícíhmotnost přibližně 10 mg. Tyto frakce se potom umístí doplastikových lékovek obsahujících 2,0 ml 0,02-c roztoku/hmotn./obj./ azidu sodného v OXOIL-fosfatem pufrovanámfysiologickém roztoku a skladují při teplotě 37 °C· V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PPG 5000-lidského calcitoninu se stanoví analýzou provedenou vyso-kotlakou kapalinovou chromatografií odděleného vodnéhoprostředí a ze získaných výsledků se pro každý časový oka-mžik, ve kterém bylo odděleno vodné prostředí, vypočte ku-mulované množství uvolněného proteinu/viz následující ta-bulka 2/.
I 1 02
Tabulka 2
Uvolňování peptidu in vitro /postup s ledovou kyselinouoctovou/
Den Frakce A Kumulované množství /%/ Frakce 3 kumulované množství /%/ 1 15,4 10,9 2 15,4 10,9 7 15,4 10,9 S 5b, 5 41 ,3 1 6 66,5 57,2 Len Frakce C kumulované množství /%/ Frakce L kumulované množství /%/ 1 6,9 7,9 2 6,9 7,9 7 6,9 7,9 Q 27,9 27,9 16 45,4 31 ,6 Uvolňování peptidu in vitro /vodný způsob Den Frakce A kumulované množství /96/ Frakce 3 kumulované množství /%/ 1 20,9 24,7 2 30,5 35,6 7 41,5 57,1 ε 51,3 . 72,3 16 65,0 SS,3 103
Den Frakce C kumulované množství /%/ Frakce D kumulované množství /%/ 1 26,3 2 0,5 2 32,0 25,2 7 46,6 36,4 6 53,9 42,2 1 6 60,6 49,9 Příklad 28
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnélátky obsahující nepegylovaný lidský calcitonin A. Postup s ledovou kyselinou octovou /5% obsah proteinu/ 473,50 mg polylaktidu /50 % hmotnostních d,l-lakti-du a 50 /o hmotnostních glykolidu.ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 10691; polydispersita1,75/ se rozpustí ve 4,0 ml ledové kyseliny octové prostéanhydridu. Vedle toho se 25,56 mg lyofilizovaného prepa-rátu lidského calcitoninu rovněž rozpustí v dalších 2,0 mlledové kyseliny octové. Oba tyto roztoky se smísí a k opláchnutí použitého chemického nádobí se použijí další čtyři2,0 ml alikvoty ledové kyseliny octová. Roztok se bezpro-středně zmrazí ponořením do kapalného dusíku a lyofilizujepřes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se potom důkladněpromísí za použití hydraulického lisu s tlačnými deskamivyhřívanými na teplotu 75 °C a potom vytlačuje skrze ka-librační průvlak 16. Získaný extrudát se nařeže na frakcemající hmotnost přibližně 19 mg. Tyto frakce se potomumístí do plastikových lékovek obsahujících 2,0 ml 0,02ϋroztoku azidu sodného v 0X0ID fosfátem pufrováném fysio-logickém roztoku a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodná prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování lidskéhocalcitoninu se stanoví analýzou provedenou vysokotlakoukapalinovou chromatografií odděleného vodného prostředía ze získaných výsledku se pro každý časový okamžik, vekterém bylo odděleno vodná prostředí, vypočte kumulovanámnožství uvolněného proteinu. Analýza byla provedena k 1., 2. 7. c. a 16 dni a v průběhu této časové periodynebylo pozorováno žádná výrazné uvolňování proteinu. 3. Vodný způsob /5,37 obsah proteinu/ 5,3 g polylaktidu /51 U hmotnostních d,l-laktidua 51 7 hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 11691; polydispersita1,75/ se rozpustí ve 23,3 ml dichlormethanu a roztok semíchá za podmínek vysokého smykového napětí /homogenizá-tor Ystral 1533/. K tomuto roztoku se po kapkách přidá5,00 ml vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného /21mg/ml/. Přidá se dalších 53 ml destilované vody a vytvo-ří se jemná bílá disperze. Dichlormethan se odežene v ro-tační odparce. Disperze se bezprostředně zmrazí na láznidichlormethan/Drikold a lyofilizuje přes noc. Tato sodnásůl polymeru se před vlastním použitím skladuje za vakuapři pokojové teplotě. 474,84 mg uvedená sodné soli polymeru se dispergujeve 4,3 ml destilované vody. Vedle toho se 25,65 lyofili-zovaného preparátu lidského calcitoninu rozpustí ve 2,3 mldestilované vody. Tento roztok se přidá k uvedené suspenzia směs se promísí. K opláchnutí použitého chemického sklase použijí další čtyři 1,3 ml alikvoty destilovaná vody.Roztok se bezprostředně zmrazí ponořením do kapalného du-síku a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se potom důkladně promísí za použití hydraulického lisu s tlačnými deskami vy-hřívanými na teplotu 55 3C a potom vytlačuje skrze kali-brační průvlak 16. Získaný extrudát se potom nařeže na 135 frakce mající hmotnost přibližně 13 mg. Tyto frakce sepotom umístí do plastikových lékovek obsahujících 2,0 ml0,02v roztoku /hmotn./obj./ azidu sodného v OXOID fosfátempufrovaném fysiologickém roztoku a skladují při teplotě37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování lidskéhocalcitoninu se stanoví analýzou provedenou vysokotlakoukapalinovou chromatografií odděleného vodného prostředía ze získaných výsledků se pro každý časový okamžik, vekterém bylo odděleno vodné prostředí, vypočte kumulovanámnožství uvolněného proteinu. Analýza byla provedena k 1., 2., 7., č. a 16. dni, přičemž v průběhu této časové perio-dy nebylo pozorováno žádné významné uvolňování uvedenéhoproteinu. Příklad 26
Farmaceutická kompozice s kontinuálnímlátky obsahující PEG 5000-interleukin-2
Postup s ledovou kyselinou octovou /20.¾ uvolňováním účine/PEG 5000-IL-2/ obsah proteini/ 113,42 mg polylaktidu /pO a hmotnostních d,l-lakti-du a 50 hmotnostních glykclidu ve formě kopolymeru; hmot-nostní střední molekulová hmotnost 10691; polydispersita 1,75/ se rozpustí ve 2,0 ml ledové kyseliny octové prostéanhydridu. Vedle toho se 4,£6 ml vodného roztoku PEG 5000-IL-2 /7,35 mg/ml/ zlyofilizuje a potom rozpustí v dalším1,0 ml ledové kyseliny octové. Oba tyto roztoky se smísía k opláchnutí použitého chemického skla se použijí dalšíčtyři 0,5 ml alikvoty ledové kyseliny octové. Roztok sebezprostředně zmrazí ponořením do kapalného dusíku a lyo-fiiizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofil.izaci se důkladněza použití hydraulického lisu 3 tlačnými deskami promísí vyhřívá-
I ϋ:Μ'·ίν.^>ι’ίνί; - 106 - 0 nými na teplotu 75 Ca formuje do výše popsaných frakcímajících hmotnost přibližně 30 mg. Tyto frakce se potomumístí do plastikových lékovek obsahujících 2,0 ml 0,02%roztoku /hmotn./obj./ azidu sodného v OXOIB-fosfátem pufro-vaném fysiologickém roztoku a skladují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy čerstvým pufrem. Uvolňování PEG 5000-IL-2 se stanoví analýzou provedenou vysokotlakou kapalino- vou chromatografiíčasový okamžik, vestanoví kumulované a ze získaných výsledků se pro kaž'kterém bylo odděleno vodné prostře'množství uvolněného proteinu /viz : 3/. Tabulka 3 sledující tabulka Uvolňování peptidu in vitro Den Frakce A Frakce 3 kumulované kumulované množství množství /%/ /%/ 1 31 ,3 37,7 2 41 ,8 41,1 4 43,9 45,8 8 45,5 47,0 16 46,5 47,7 Příklad 3θ
Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňováním účinnélátky obsahující nepegylovaný interleukin-2 /IL-2/
Postup s ledovou kyselinou octovou /20% obsah proteinu/ 54,90 mg polylaktidu /50 % hmotnostních d,l-laktidua 50 % hmotnostních glykolidu ve formě kopolymeru; hmot- »<rs -11 - ' - 137 - nostní střední molekulová hmotnost 13691; oolydispersita1,75/ se rozpustí ve 4,3 ml ledové kyseliny octové prostéanhydridu. Vedle toho se 45,39 mg lyoíilizovaného prepa-rátu IL-2 rovněž rozpustí v dalším 1,3 ml ledové kyselinyoctové. Oba tyto roztoky se smísí a k opláchnutí použité-ho chemického skla se použijí další 4 3,5 ml alikvoty le-dové kyseliny octové. Roztok se bezprostředně zmrazí po-nořením do kapalného dusíku a lyofilizuje přes noc.
Prášek získaný po lyofilizaci se potom dokladněpromísí za použití hydraulického lisu s tlačnými deskamivyhřívanými na teplotu 50 °C a potom formuje do výše po-psaných frakcí majících hmotnost přibližně 33 mg. Tytofrakce se potom umístí do plastikových lékovek obsahují-cích 2,0 ml 3,02?ó roztoku /hmotn./obj./ azidu sodnéhov OXOIf-fosfatempufrovaném fysiologickém roztoku a skla-dují při teplotě 37 °C. V pravidelných intervalech se oddělí vodné prostře-dí a nahradí vždy pufrem. Uvolňování IL-2 se stanoví ana-lýzou provedenou vysokotlakou kapalinovou chromatografiíodděleného vodného prostředí a ze získaných výsledků sepro každý časový okamžik, ve kterém bylo odděleno vodnéprostředí, vypočte kumulované množství uvolněného protei-nu. Analýza byla provedena k 1., 2., 4., £. a 16. dni,přičemž nebylo v této časová periodě pozorováno žádné vý-znamné uvolňování uvedeného proteinu.
Referenční přiklad 1 Příprava / léet _7 lidského G—C$F modifikovaného methyl- polyethylenglykolu 5300
A. Příprava /~het“1_7 lidského G-CSF
a/ Příprava syntetického genu pro / ket_1_7 lidský G-CSF DNA sekvence /obr.2 a STU TD No 4?/ kódující amino-kyselinou sekvenci polypetidu z obr.2 /lidský 3-257/ bvla -108 - navržena podle následujících požadavků : 1/ Jednovláknový kohezivní konec, který dovolujeligaci na vhodných místech plasmidu; 2/ řadu míst v genu pro restrkční endonukleasypro usnadnění následující genetické manipulace; 3/ překlad terminačního kodonu; 4/ kodony na 5 konci kódovací oblasti, vybranétak, aby měly hodně A/T; další kodony vybranépodle jejich schopnosti preference exprese vE.coli.
Qen byl sestaven z 18 nukleotidů označených jako SEQ IDč.1 - SEQ ID č. 18 a uvedených dále. Příprava oligonukleotidů
Oligonukleotidová sekvence uvedená dále byla při-pravena pomocí Applied Biosystems 380A DNA syntetizátoruz nukleosid-2-kyanoethyl-N,N-diisopropylfosformamidu sbází chráněnou 5 -dimethoxytritylem, kdy chráněné nukleo-sidy byly vázané na kontrolní nosič z porézního skla orozsahu 0,2 mikromolu, podle metodiky uváděné AppliedBiosystem lne..
Alternativně mohou být oligonukleotidové sekvencepřipraveny metodou popsanou Atkinsonem a Smithem v "Oli-gonucleotide Synthesis, a Practical Approach" /M.T. Gait,Editor, IRL press, Oxford, Washinton DC, str.35-81/. Příprava oligonukleotidových sekvencí byla násled-ně zefektivněna použitím Applied Biosystem 380A DNA syn-tetizátoru : každý oligonukleotid, po vyštěpení z pevného nosiče aodstranění všech ochranných skupin, byl rozpuštěn ve vo-dě /1 ml/. K oligonukleotidovému roztoku /400/ul/ bylpřidán 3M roztok octanu sodného /pH 5,6; 40/ul/ a ethanol ,·» λ * * v- · ••-Λ- -109- /1 ml/ a směs byla uchována při teplotě -70 °C po dobu 20hodin. Vzniklá sraženina byla odstředěna /13 000 otáčekza minutu, 10 minut/ a pelety promyty směsí ethanolu avody v objemovém poměru 7:3 /200yUl/ a potom rychle usu-šeny za vakua a rozpuštěny ve vodě /15/ul/ a v 1 O^ul smě-si formamid-barvivo /10 mM NaOH, 0,5 mM EDTA, 0,01 % brom-fenolové modři, 0,01 % xylenkyanolu, 80 % formamidu/.
Oligonukleotidy byly purifikovány na 10% polyakryl-amidovém gelu v 50 mM Tris-borátu /pH 8,3/> obsahujícím 8,3 M močoviny.
Oligonukleotidy požadované délky byly identifiko-vány v UV záření /Narang a kol., 1979, Methods in Enzymo-logy, sv. 68, 90-98/. Nejžádanější pruh byl z gelu vyříz-nut, elektroeluován v 5 mM Tris-borátu /pH 8,3/ při 300 mVpo 3-4 hodiny. Vodné roztoky byly zkoncentrovány na 200/ulpůsobením n-butanolu /po zamíchání a rozvíření se odstraní horní organická vrstva/. Purifikované nukleotidy byly srá-ženy při teplotě -70 °C po dobu 20 hodin v 3 M roztokuoctanu sodného přidáním ethanolu.
Sestavování gelu
Oligonukleotidy SEQ ID č.2 - SEQ ID č.17 /400 pM každého/ /podle dále uvedené definice/ byly fosforylovény T4 polynukleotidkinasou /3,6 jednotek/ po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C v 25/Ul roztoku, který obsahoval ATP /800/ ->2 pM obsahujících 25 pM gamaJ P ATP/, 100/uM spermidinu, 20 mM chloridu hořečnatého, 50 nM Tris-HCl /pH 9,0/ a 0,1mM EDTA. Roztoky byly zahřívány na teplotu 100 °C po dobu5 minut za účelem ukončení reakce, načež byly smíchánypáry tak, jak je ukázáno v tabulce 1, tak, aby tvořilydvoušroubovice /duplexy/ od A do I.
Oligonukleotidy SEQ ID č.1 a SEQ ID č.18 /400 mMve 25/Ul/ byly používány nefosforylované. Dále byl přidán0,3 M roztok octanu sodného /pH 5,6, 200/ul/ a ethanolu/850/Ul/ a duplexy byly sráženy při teplotě -20 °C po dobu 20 hodin. Získané sraženiny byly izolovány odstředěníma promyty směsí ethanolu a vody v objemovém poměru 7:3a potom rozpuštěny ve vodě /50yul/. Páry nukleotidů by-ly spojeny dohromady prvním zahřátím roztoků na teplotu100 °C po dobu 2 minut v lázni s vroucí vodou. Lázeň by-la potom pozvolna chlazena na teplotu 40 °C /po dobu asi4 hodin/. Roztoky obsahující 3 páry dvoušroubovic bylyspojeny tak, jak je uvedeno v tabulce 1, vytvořené skupi-ny byly /jedná se o skupiny I-III/ lyofilizovány a potomrozpuštěny ve 30/ul roztoku obsahujícího T4 DNA ligasu/1 jednotku, BRL/, 50 mM Tris /pH 7,6/, 10 mM chloriduhořečnatého, 5 % /hmotn./obj./ PEG 8000, 1 mM ATP, 1 mMDTT /BRL, Focus, sv.8, č.1, 1986/ a DNA byla ligovánapři teplotě 30 °C po dobu 5 minut a dále při teplotě 16 °Cpo dobu 20 hodin. Potom byl přidán 3 M roztok octanu sod-ného /20/ul/ a voda /150/ul/ a produkt byl srážen přidá-ním ethanolu /750/ul/ a chlazen na teplotu -20 °C po do-bu 20 hodin. Sraženina byly izolována odstředěním, pro-myta ethanolem /1 ml/, potom rozpuštěna ve vodě /15^ul/a směsi formamidu a barviva a čištěna na 10% polyakrylami-dovém gelu v 50 mM Tris-borátu /pH 8,3/, 1 mM EDTA a 8*3 Mmočovině.
Proužky odpovídající vláknům o přibližné délce173-186 baží byly identifikovány autoradiografickou meto-dou a společně izolovány elektroelucí z jednotlivých prouž-ků gelu, jak již bylo dříve popsáno pro jednotlivé oligo-nukleotidové sekvence.
Vlákna DNA byla spojena prvním zahřátím vodného roz-toku /50/Ul/ na teplotu 100 °C po dobu 2 minut a potomnásledujícím chlazením na teplotu 40 °C po dobu 4 hodin.
Skupiny I, II a III byly spojeny dohromady, jakbylo již popsáno, přičemž genová sekvence je ukázána naobr.8. Po vysrážení byl gen fosforylovén T4 polynukleotid-kinasou, jak to již bylo dříve popsáno pro jednotlivé oli-gonukleotidy, a potom rozpuštěn ve vodě. ·»/«*·"/·
Tabulka 1
Duplex Oligonukleotid Počet baží vrchním v řetězci spodním A SEQ ID Č.1+SEQ ID č.2 62 64 B SEQ ID Č.3+SEQ ID č.4 60 60 C SEQ ID Č.5+SEQ ID č.6 48 51 D SEQ ID Č.7+SEQ ID č.8 63 60 Τ-» SEQ ID Č.9+SEQ ID č.10 63 63 F SEQ ID δ.11+SEQ ID č. 1 2 60 63 G SEQ ID Č.13+SEQ ID č. 14 63 60 H SEQ ID Č.15+SEQ ID č.16 60 60 I SEQ ID Č.17+SEQ ID č.1 8 55 53 I A + B + C 170 175 II D + E + F 186 186 III G + Η + I 178 173
b/ Klonování syntetického genu pro /“Met”1_7 lidský G-CSF
Syntetický výše popsaný gen byl klonován do plas-midového vektoru pSTPl /Windass a kol., Nuclei Acid Re-search /1983/, sv. 10, str. 6639/.
Za účelem přípravy vektoru bylo 10^ug pSTPl roz-puštěno ve vodě /37,7/ul/ a 10 x B restrikčním pufru /4,5/U1//BCL/. Dále byla přidána restrikční endonukleasa Sáli/^ul/ /BCL, 8 jednotek/yul/ a směs byla inkubována po dobu 112 u .v.<tvx -~·π -:. 1 hodiny při teplotě 37 °C, kdy převládal ve směsi linea-rizovaný plasmid nad nadšroubovicovou a rozštěpenou kru-hovou formou plasmidu. DNA byla srážena ethanolem při te-plotě 4 °C po dobu 30 minut, promyta směsí ethanolu a vo-dy v objemovém poměru 7:3 a potom rozpuštěna ve vodě /39,5/Ul/, 1 ΟΧ H pufru /4,5/Ul/ /BCL/. Ke směsi byla přidánarestrikční endonukleasa EcoRI /2/Ul/ /BCL, 90 jednotek/^ul/,inkubace probíhala 1 hodinu při teplotě 37 °C, kdy převlá-dal velký EcoRI-SalI fragment. DNA byla srážena při teplo-tě -20 °C po dobu 20 hodin, promyta směsí ethanolu a vody v objemovém poměru 7:3 a potom rozpuštěna ve vodě /20yul/.
Velký EcoRI-SalI fragment byl přečištěn na pre-parativním agarosovém gelu a potom elektroeluován a srá-žen, jak již bylo popsáno dříve, a nakonec rozpuštěn vevodě /20/ul/.
Po ligaci syntetického genu byla následující směsinkubována po dobu 4 hodin při teplotě 16 °C: vektor DNA /2^ul roztoku fragmentu EcoRI-SalI/, syntetický gen /5^ul vodného roztoku, který již byl výšepopsán/, 5X ligasový pufr /6^-250 mM Tris pH 7,6, 50 mM chloriduhořečnatého, 25% /hmotn./obj./ PEG 800, 0,5 mM DTT exBRL/,voda /15/ul/ a T4 DNA ligasa /2/ul, 1 jednotka/^ul/.
Směs DNA /nebo 1/Ul upravené ligačni směsi nebo2yul ligačni směsi 5X ředěné vodou/, byla použita přímok transformaci buněk E.coli kmen HB101. Směs DNA /1 nebo2/ul/ byla přidána ke kompetentním buňkám kmene E.coliRB101 /20/ul, BRL/ v ledu a směs byla inkubována v ledo-vé lázni po dobu 45 minut a potom podrobena tepelnému šokuzahřátím na teplotu 42 °C po dobu 45 sekund. Po dalších 2 minutách v ledu bylo přidáno 100/ul SOC pufru /2 % bacto-tryptonu, 0,5 % kvasničného extraktu, 10 mM chloridu sod-ného, 2,5 mM chloridu draselného, 10 mM chloridu hořečna-tého, 10 mlZ síranu hořečnatého a 20 mM glukosy/ a směsbyla inkubována při teplotě 37 °C po dobu jedné hodiny. - 113 -
Alikvoty suspense byly vyočkovány na misky s L-agarem obsa-hujícím 50/Ul/ml ampicilinu. Transformované buňky bylytestovány na přítomnost klonovaného syntetického genu zapoužití standardní hybridizační metody popsané v "Molecu-lar Cloning : A Laboratory Manual", Maniatis a kol. /ColdSpring Harbor/ a v pristské patentové přihlášce 8502605·Celkem bylo 100 kolonií přeneseno na filtry /Schleicher aSchuell/, kultivováno při teplotě 37 °C po dobu 20 hodin,lysováno a zahřáto.
Hybridizace probíhala při teplotě 65 °C po dobu20 hodin, kdy filtr byl v kontaktu s radioaktivním testempřipraveným značením oligonukleotidové sekvence SEQ ID č.1setem pro náhodné značení /Pharmacia/. Pět kolonií, ozna-čených jako 1 až 5, které dávaly pozitivní hybridizačnísignál, bylo kultivováno v L mediu /100 ml/ při teplotě37 °C po dobu 20 hodin a potom byl připraven DNA plasmidcentrifugací v hustotním gradientu chloridu česného, jakbylo popsáno v "Molecular Cloning : A Laboratory Manual",Manitas a kol. /Cold Spring Harbor/. DNA byla sekvenována standardní metodou Sangeraa kol., popsanou v Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 /1977/, založenou na terminaci řetězců pomocí dideo-xy-derivátů nukleotidů, za použití Sequenase setu /UnitedStates Biochemical Corporation/. Oligonukleotidy od SEQID 19 do SEQ ID č.23 /viz dále/ byly používány jako sekve-novací primery.
Tabulka 2 Kód Místo vazby primeru 214-234 vrchní vlákno333-353 vrchní vlákno SEQ ID č.19 SEQ ID č.20 114
Tabulka 2 /pokračování/ SEQ ID č.21 SEQ ID č.22 SEQ ID č.23 375-395 spodní vlákno207-227 spodní vlákno 69- 93 spodní vlákno
Plasmidová DNA z klonu 5 obsahuje DNA sekvence,uvedené na obr.6. Plasmid /pAG88/ byl použit k transfor-maci kompetentních buněk následujícího kmene E.coli zapoužití standardního postupu : HB101 CGSC 6300 /dále také uváděna jako MSD 522/.
Kmeny E.coli HB101 a MSD$22 /CGSC 6300/ jsou volnědostupné. Například mohou být získány z E.coli GeneticStock Centra, Yale University, USA. Dále E.coli H3101 mů-že být následně získána například z BRL, GIBCOO LimitedUnit 4, Cowley Milí Trading Estate, Longbridge Wax, Uxbridge,UB8 2ZG, Middlesex, GB nebo GIBCO Laboratories, Life Tech-nologies lne., 3175 Staley Road, Gand Island, NY 14072, USA. pro , c/ Klonování genu /"Met” _7 lidský G-CSF do expresníhovektoru Výše uvedený gen byl klonován do plsmidu pICI 0020,jak je to popsáno v referenčním příkladu 3/c/, za účelemzískání expresního plasmidu pICI 1056. d/ Fermentace
Plasmid pICI 1056 byl transformován a byla provede-na fermentace, jak je to popsáno v referenčním příkladu3/e/, za účelem získání Met 7 lidského G-CSF. 115 - e/ Purifikace
Purifikace byla provedena tak, jak je to popsánove druhém purifikačním postupu, umožňujícím získání většíchmnožstvích /~Met”1_7hu G-CSF, který byl popsán na str. 48a 49 patentového spisu PCT WO 87/01132, který končí dia-lýzou proti fosfátovému pufru. B. Příprava /~Met”^_7hu G-CSF modifikovaného methylpoly-ethylenglykolem 5000
Roztok /~Met~1_7hu G-CSF /300 mg/ připravený postu-pem popsaným v odstavci A se zkoncentruje na koncentraci8 mg/ml ve 20 mM octanu sodném, 37 mM chloridu sodném,pH 5,4 ultrafiltrací na membráně Amicon YM1 0 /separačnípráh: mol. hmotn. 10 kLa/. K tomuto roztoku se potom při-dá stejný objem 0,8 M roztoku boritanu sodného /pH 8,8/ adále methylpolyethylenglykol-p-nitrofenylkarbonát s při-bližnou molekulovou hmotností 5000 /Sigma Chemical Co. Ltd//100 ekvivalentů na jeden mol /~"Met”^_7hu G-CSF/ rozpuště-ný ve vodě. Reakce probíhá při teplotě 20 °C po dobu 3 ho-din za mírného míchání a k reakční směsi se přidá 1 Methanolaminhydrochloridu /pH 8,0/ /10 ekvivalentů na je-den mol aktivního methylpolyethylenglykolu/. pH reakčnísměsi se bezprostředně nastaví na 5>4 titrací 1 M kyseli-nou octovou a reakční směs se zředí na objem 500 ml 20 mMoctanem sodným a 100 mM chloridem sodným /pH 5>4/·
Reakční směs se potom dialyzuje proti 10 litrůmtéhož pufru za použití spirálového zásobníkového systémuAmicon CH2A-1S opatřeného membránou SIY30 /separační práh:mol.hmotn. 30 kDa/ až do okamžiku, kdy žlutý p-nitrofenoljiž není v retentátu patrný.
Retentát se potom zahustí na objem asi 300 ml aumístí se do míchané cely Amicon 8400 opatřené membránouYM30 /separační práh: 30 kDa/. Retentát se zahustí na objem50 ml a opětovně se zředí na objem 300 ml 20 mM octanem 116 sodným a 100 mM chloridem sodným /pH 4,5/· Tento postupse opakuje čtyřikrát a produkt se nakonec zkoncentruje naobjem asi 25 ml. Tento koncentrát se chromatografuje nasloupci /5 x 90 cm/ Ultrogelu AcA54, který je v rovnovázes 20 mM octanem sodným a 100 mM chloridem sodným /pH 5,4/·
Frakce obsahujíc! modifikovaný protein se identifi-kují monitorováním světlem vlnové délky 280 nm za účelemdetekce proteinu a titrací jod/jodid draselný za účelemdetekce methylpolyethylenglykolu /CR Acad. Sci. Paříž 2741617, 1972/. Finální produkt se zkoncentruje na koncentra-ci vyšší než 11,5 mg/ml ultrafiltrací přes membránu AmiconYM30, zfiltruje přes 0,22/um filtr za sterilních podmíneka skladuje pro další studie při teplotě 4 °C. SDS-PAGEfinálního modifikovaného produktu ukazuje, že nezůstalžádný nezreagovaný /f~Met“1_7hu G-CSF a že veškerý produktmá vysokomolekulární charakter. Titrace filtrátů a reten-tátů systémem jod/jodid draselný ukázala, že opakovanádiafiltrace při pH 5,4 na membráně YM30 /separační práh:mol.hmotn. 30 kDa/ účinně odstranila veškerý methylpoly-ethylenglykol, který nebyl vázán na protein.
Finální produkt obsahoval asi 4 moly methylpoly-ethylenglykolu kovalentně vázaného na mol proteinu. Spe-
Q cifická aktivita nemodifikovaného derivátu 0,8 x 10 U/mgklesla na 0,2 x 10^ U/mg /25 %/ u modifikovaného produktu.Získaný produkt byl zcela stabilní a nevykazoval žádnézměny ve specifické aktivitě v roztoku až do 10 mg/ml/protein/ po dobu 14 dnů při teplotě 37 °C. V tomto referenčním příkladu se před pegylací peč-livě kontroluje kontrolu pH roztoku /~Met ^_7hu G-CSF zaúčelem zabránění nebo alespoň omezení na minimum dimeri-zace.
Referenční příklad 2 Příprava /~Met~'_7 lidského G-CSF modifikovaného methyl-polyethylenglykolem 5000 117 -
Opakuje se postup uvedený v referenčním příkladu1 s výjimkou spočívající v tom, že purifikace /~~Met-1_7huG-CSF se provádí následujícím způsobem.
Zmražená buněčná pasta se /500 g/ lýzuje a surovápeletová frakce se oddělí, promyje a solubilizuje postu-pem uvedeným v dále zařazeném referenčním příkladu 4. VSarkosylu rozpustný extrakt se vyčiří odstředěním při30 000 xg po dobu 3θ minut. K 1 litru supernatantu se po kapkách přidá 1 litracetonu, přičemž tento přídavek se provádí za míchání apři teplotě 4 °C. Vyloučený protein se po 10 minutách izo-luje odstředěním při 15 000 xg po dobu 30 minut a super-natant se odlije. Rezultující pelety se resolubilizujíve 40 mM octanu sodném, 6 M guanidinhydrochloridu, pH 4,0/500 ml/ za použití homogenizátoru Polytron PT1O-35, na-čež se solubilizát míchá po dobu jedné hodiny při teplotě4 Ca potom podrobí úplné dialýze v dialzačním zařízeníSpectrapor /separační práh: mol.hmotn. 6 až 8 kDa/ proti20 mM octanu sodném, pH 5,4.
Vyloučený protein se oddělí odstředěním při 15 000xg po dobu 30 minut a supernatant se zavede na 50 ml slou-pec CM celulosy /Whatman CM52/, který je v rovnováze s20 mM octaném sodným, pH 5,4. Sloupec se eluuje stejnýmpufrem až do okamžiku, kdy E28O e-^u^tu klesne na hodnotupozadí, načež se promyje/čtyřnásobným objemem sloupce/20mM octaném sodným, pH 5,4, obsahujícím 20 mM chloridu sod-ného. Produktová frakce obsahující /“Met“1_7hu G-CSF seeluuje 37 mM NaCl ve 20 mM octanu sodného, pH 5,4, načežse získané frakce sloučí a buď bezprostředně modifikujímethylpolyethylenglykolem 5000 nebo skladují před dalšímpoužitím při teplotě -20 °C.
Referenční příklad 3 Příprava /~Met \ Ser1^,^^_7 lidského G-CSF modifikované-ho methylpolyethylenglykolem 5000 118 A. Příprava /“Met"1, Ser17’27_7G-CSF /lidského/
Opakuje se postup popsaný ve stupních A a/ a A b/referenčního příkladu 1 s následujícími modifikacemi: oligonukleotidy SEQ ID č.24, 25, 26 a 27 /detailně uvede-ny dále/ nahradí oligonukleotidy SEQ ID č.1, 2, 3 a 4. c/ Klonování genu pro /""Met"1 , Ser1^’^^_7 lidský G-CSFdo expresního vektoru Výše popsaný gen /viz obr.3/ byl klonován do plas-midového vektoru pICI0020. Tento vektor je odvozen odplasmidu pAT153, ve kterém oblast 651 bp EciRI-AccI jenahrazena fragmentem 167 bp EcoRI - Clal skládajícím sez : 1/ syntetického E.coli trp promotoru a vedoucísekvence pro vazebné místo trp na ribosomu, 2/ translačního iniciačního kodonu, 3/ mnohonásobné rozpoznávací sekvence restrikčníchenzymů odvozené od M13mp18, obsahující místapro KpnI, BamHI, Sáli, Pstl, Sphl a HindlII, 4/ syntetické transkripční terminační sekvence. DNA sekvence této oblasti je uvedena na obr.1 /viz takéSEQ ID č.44/.
Expresní vektor pICI0020 byl pro následné doplněninaštěpen KpnI /BCL/ v 10 mM Tris-HCl /pH 7,5/, 10 mM chlo-ridu hořečnatého. DNA byla srážena ethanolem při teplotě-20 °C z roztoku, obsahujícím 0,3 M octan sodný a dále 3kohezní konce byly odstraněny po působení T4 DNA polyme-rasou po dobu 10 minut při teplotě 37 °C v následující re-akční směsi: DNA /1/Ug/ ve vodě /16/ul/ pufr pro 1 ΟΧ T4 polymerasu /2yul/ 0,33 M Tris-acetát pH 7,9 0,1 M octan hořečnatý 119 0,66 M octan draselný 5 mM dithiothreitol 1 mg/ml hovězí sérový albumin /BSA PENTAX frakce V/ 2 mM směs dNTP /1/ul/ T4 DNA polymerasa /1yul; 2,5 jednotek//Ul BCL/.
Byla přidána voda /80/ul/ a směs byla extrahována1 00/Ul směsi fenolu a chloroformu a dále chloroformem/lOO^ul/. DNA se srážela ethanolem /250/Ul/ při teplotě-20 C po přídavku octanu sodného /lO^ul/ a dále bylaštěpena s Sáli /BCL/ ve 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl /pH7,5/· Vektor Kpn-tupý konec byl purifikován na 0,7# agaro-sovém gelu a izolován metodou Geneclean /čištění gelu/ po-dle postupu doporučovaného výrobcem /Bio101, USA/.
Syntetický gen byl izolován z pSTP1 vektoru, jakje uvedeno dále. Vektory byly štěpeny Seal a Sáli /oba po-cházejí z BCL/ ve 100 mM NaCl, 10 mM MgClg a 10 mM Tris-HCl /pH 7,5/· Fragment 530 bp byl purifikován z 0,7# aga-rosového gelu a izolován metodou Geneclean podle postupudoporučovaného výrobcem /Bio10l/. Před působením ligasami byla směs genového fragmen-tu Scal-Sall /50 ng/ a fragmentu vektoru pICI0020 /100 ng/ve 20/ul roztoku, obsahujícím 50 mM Tris-HCl /pH 7,6/, 10mM MgClg, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5# /hmotn./obj./ PEG 8000a T4 DNA ligasu /2 jednotky; BRL/ inkubována po dobu 20hodin při teplotě 16 °C. Výsledná směs byla použita ktransformaci příslušných buněk E.colu HB101. Transformo-vané buňky byly selektovány růstem na L-agaru obsahujícím50/Ug/ml ampicilinu a dále testovány na přítomnost genuhybridizací kolonií se značeným ^2P /SEQ ID č.24/. DNAplasmid byl připraven ze 6 pozitivně hybridizujících kolo-nií, purifikován odstřelováním v gradientu chloridu čes-ného a sekvence byla určena dideoxy-sekvenací.
Plasmid, který obsahoval tento gen, byl označenjako pICI 1080. - 120 - d/ Subklonování expresivního souboru genů, obsahujícíhogen pro /“Met"1, Ser17’27_7G-C3F, do M13mp18 Následující subklonování bylo provedeno proto, abybyl poskytnut startovní materiál pro přípravu derivátůG-CSF podrobně popsaných v referenčních příkladech 7 a 8.
Flasmid DNA, odvozený z pICI1080 /purifikovaný v odstředováním v hustotním gradientu chloridu česného/, bylnaštěpen restriktasami EcoRI a Sáli /BCL/ podle návodu výrobce. Malý fragment EcoRI-SalI, obsahující trp promotora /“Met \ Ser17’27_7G-CSF gen, byl izolován z 0,7% agaro-soveho gelu za použití metody Geneclean. Tento fragmentbyl včleněn do vektoru Ml3mp18 /DNA dodána firmou AmershamInternational/ po jeho předchozím naštěpení FcoRI-SalI/dodané BCL/. Fragmenty byly ligovány v 5x BRL pufru zapoužití dříve popsané BRL T4 DNA ligasy. Směs byla použi-ta k transfekci příslušných TG1 buněk E.coli /tyto buňkybyly vybrány na základě kalcium-chloridové metody popsanéMandelem a Higem v publikaci Molecular Cloning - A Labo-ratory Manual - Maniatis a kol., Cold Spring Harbor/.
Transfektováné buňky byly suspendovány ve vrchnívrstvě TY agaru /trypton-yeast agar/, obsahujícího 2% X-Gal v dimethylformamidu a 200yul TG1 buněk E.coli, odebra-ných v logaritmické fázi růstu, a dále byly transfektova-né buňky zaočkovány na misky s TY agarem /obsahujícím 8 gtryptonu, 5 g kvasničného extraktu, 5 g NaCl, 3,75 g bakto-agaru v 500 ml sterilní vody, misky s TY agarem o složení: 8 g baktotryptonu, 5 g kvasničného extraktu, 5 g NaCl, 7,5 g baktoagaru v 500 ml sterilní vody/. Čtyři bílé pla-ky byly odebrány a smíchány se .4 x 2 ml 1% suspenze TG1buněk E.coli v TY kultivační půdě /8 g tryptonu, 5 g kvas-ničného extraktu, 5 g NaCl v 500 ml sterilní vody/ a po-nechány růst po dobu 6 hodin při teplotě 37 °C . 2 ml části pak byly rozděleny na dva díly o objemech0,5 ml a 1,5 ml. Bakteriální buňky byly potom odstředěnyv mikrokyvetách Eppendorf a supernatanty byly po odstře- 121 dění převedeny do sterilních mikrozkumavek. Alikvoty oobjemu 0,5 ml byly zmrazený na teplotu -20 °C a ponechányjako fágová zásoba. Alikvoty o objemu 1,5 ml byly použityk přípravě jednovláknové DNA podle metody popsané v publi-kaci Amersham International M1 3 sequencing handbook /vizdále/. Tyto vzorky DNA byly dále sekvenovány za použitíoligonukleótidú SSQ ID č.22, SSQ ID ě.23 a Ml3 universál-ního sekvenčního primeru. Reakce byly provedeny podle ná-vodu výrobce se soupravou Sequenase. Všechny štyři klonyobsahovaly správnou DNA sekvenci pro /~Ser ’’ _7G-CSF. Příprava jednovláknové DNA ve velkém měřítku K přípravě jednovláknové DNA v množství 200-500/Ug DNA/ml byla použita metoda uvedená v Amersham Inter-national "Oligonucleotide Directed Mutagenesis". Dále jepopsán detailní postup práce.
Postup přípravy jednovláknové DNA: A. Příprava 1 ml fágového materiálu /zásoby/ 1/ jednotlivá kolonie TG1 E.coli narostlá na mi-nimálním glukosovém mediu se nechá růst přesnoc v 10 ml 2x TY mediu při teplotě 37 °C zastálého třepání; do 20 ml čerstvého media sezaočkuje 1OyUl nárůstu, načež se provede třepá-ní po dobu 3 hodin při .teplotě 37 °C; 2/ 1 ml 2x TY media v 10 ml sterilní kultivačnízkumavce se zaočkuje 100/ul kultury připravenépodle bodu 1, která je stará 3 hodiny; 3/ zaočkuje se 1 ml kultury s rekombinačním plakem;4/ provede se inkubace za stálého třepání při teplotě 37 °C a převedení do odstředivkové mi-krokyvety; 5/ odstřeďuje se 5 minut při laboratorní teplotě;supernatant se slije do čisté zkumavky a ponechá 122 pres noc při teplotě 4 °C; připraví se kulturaTG1 E.coli kultivovanou přes noc pro následují-cí stupen. B. Růst 100 ml fágové kultury 1/ zaočkuje se 100 ml 2x TY media 1 ml kultury Tg1a nechá se třepat do té doby, než absorbancezákalu kultivačního media dosáhne hodnoty 0,3při vlnové délce 500 nm; 2/ do 100 ml kultury se přidá 1 ml řégového super-natantu připraveného podle návodu /viz A5/; 3/ inkubuje se 5 hodin za stálého třepání při te-plotě 37 °C; 4/ odstřeďuje se při 5000 g za teploty 4 °C po dobu30 minut; 5/ supernatant se převede do čisté odstředivkovémikrokyvety; ponechají se buňky pro přípravuRF LNA; 6/ do supernatantu se přidá 0,2 % objemu 20% /hmotn./obj./ PEG 6000 ve 2,5 M NaCl, dobře se promícháa nechá stát při teplotě 4 °C po dobu 1 hodiny; 7/ odstřeďuje se při 5000 g a teplotě 4 °C po dobu20 minut; supernatant se slije; 8/ odstřeďuje se při 5000 g a odstraní se všechenzbývající PEG/dextran; 9/ virální pelety se resuspendují v 500yul redesti-lované vody a suspense se převede do odstředivko-vé mikrokyvety /1,5 ml/; 10/ odstřeďuje se 5 minut a supernatant se oddělíod zbylých buněk a převede do čisté odstředivko-vé mikrokyvety; 11/ k supernatantu se přidá 200/ul 20% PEG 12,5 MNaCl, dobře se promíchá a nechá stát při labora-torní teplotě po dobu 15 minut; 12/ odstřeďuje se 5 minut, načež se slije superna-tant; - 123 - 13/ odstředuje se po dobu 2 minut a pečlivě se odstra ní všechny zbytky PEG/NaCl; 14/ virální pelety se resuspendují v 500/Ul redesti- lované vody; 15/ přidá se 200/ul fenolu saturovaného 10 mM Tris-HC1 pH 8,0, 2 mM EDTA; provede se krátké inten-zivní míchání; 16/ obsah kyvety se nechá stát po dobu 15 minut přilaboratorní teplotě; 17/ odstředuje se po dobu 3 minut; 18/ supernatant se převede do čisté odstředivkové kyvety; 19/ opakují se kroky 15/ až 18/; 20/ přidá se 500^ul chloroformu a vodná fáze se dvakrát extrahuje; 21/ přidá se 50/Ul 3M octanu sodného a 1 ml čistéhoethanolu a směs se zamíchá; 22/ směs se uloží na 20 minut do lázně suchý led-ethanol; 23/ odstředuje se po dobu 15 minut; 24/ každá peleta se promyje 1 ml ethanolu o teplo- tě -20 °C; 25/ pelety se vysuší na zakua a solubilizují v 50yul redestilované vody. Tímto způsobem lze připravit 100-200/ug jednovléknové DNA. e/ Fermentace pICI 1080 byl transformován do buněk E.coli kmeneMSD 522 /CGSC 6300//uveden v referenčním příkladu 1A/b//.Rekombinantní buňky byly purifikovány a uchovány v glyce-rolu při teplotě -80 °C. Část kultury byla odebrána a naočkována roztěrem naagar s L-ampicilinem s cílem oddělit jednotlivé koloniepři růstu přes noc při teplotě 37 °C. Narostlá kolonie,vyskytující se samostatně na agarové půdě, byla odebrána 124 a resuspendovéna v 10 ml půdy s L-ampicilinem a 100/ulbylo ihned naočkováno do 10 Erlenmayerových baněk o obje-mu 250 ml, obsahujících 75 ml kultivačního media s L-ampi-cilinem. Po 16 hodinovém růstu při teplotě 37 °C na reci-proční třepačce byl obsah baněk spojen a použit jako ino-kulum pro fermentor, který obsahoval 20 1 kultivačníhomedia, LCM50.
Složení kultivačního media LCM50 solubilizováno v destilovanéSložka vodě /g/1/ kh2p°4 3,0 Na2HP04 6,0 NaCl 0,5 Hydrolyzát kaseinu /Oxoid L41/ 2,0 /NH,/oS0. 4 2 4 10,0 Kvasničný extrakt /Difco/ 10,0 Glycerol 35,0 L-leucin 2,5 L-threonin 0,9 MgSO4· 7H20 0,5 CaCl2.2H2O 0,03 Thiamin 0,008 FeSO4/kyselina citrónová 0,94/0,02 Roztok stopových prvků /TES/ 0,5 ml
Fermentace byly prováděny při teplotě 37 °C a pH 6,7.pH bylo kontrolováno a automaticky regulováno přdavky 6 Mhydroxidu sodného. Parciální tlak kyslíku /dOT/ byl nasta- fy - 125 - ven na 50 % vzdušné saturace a zpočátku byl regulován auto-matickým zvyšováním otáček míchadla fermentoru. Průtokvzduchu byl zpočátku 20 1/min, což odpovídá průtoku 1 obje-mu vzduchu vztaženého na objem media za minutu /VVM/, abyl zvýšen na průtok 50 1/min /2,5 VVM/, ve chvíli,kdyse rychlost míchadla přiblížila 80 až 90 % svého maxima.Vzhledem k tomu, že rychlost přenosu kyslíku /OTR/ vefermentorech nebyla schopna uspokojit spotřebu kyslíku OUR/bakterií při hustotě buněk v mediu vyšší než je ta, kteréodpovídá absorbance rovná 50 při vlnové délce 550 nm zapopsaných podmínek, byl parciální tlak kyslíku /dOT/ vefermentoru udržován při vyšších hustotách buněk na hodnotěodpovídající 50 % vzdušné saturace. Toho bylo dosaženopři kultivaci buněk, jejichž hustota odpovídala hodnotěabsorbance 50 při vlnové délce 550 nm v mediu s limitova-ným množstvím zdroje uhlíku s následným dodáním stopovéhomnožství zdroje uhlíku spolu se síranem amonným a kvas-ničným extraktem v množství, omezujícím rychlost růstubakterií.
Fermentace trvaly 16 hodin a během této doby bylyodebírány vzorky pro měření absorbance zákalu při vlnovédélce 550 nm, sušiny buněk a množství G-CSF v buňkách.Množství vznikajícího G-CSF bylo sledováno SDS-PAGE elektro-forézou celých buněčných lysátů po obarvení gelů Coomassieblue. V době, kdy absorbance zákalu dosáhla při vlnovédélce 550 nm hodnoty 25, byl do fermentoru přidán roztokhydrolyzétu kaseinu /100 g/1 Oxoid L41/ v množství 1,5 g/1za hodinu.
Když absorbance při vlnové délce 550 nm dosáhlapřiblžně hodnoty 50, došlo k vyčerpání zdroje uhlíku,vedoucí k rychlému vzrůstu parciálního tlaku kyslíku/dOT/ z hodnoty 50 % vzdušné saturace. V tomto okamžikubyly do media přidány glycerol /470 g/1/, kvasničný extrakt/118 g/1/ a síran amonný /118 g/1/ rychlostí, která způ-sobila obrat a návrat k zpětnému udržování dOT na hodnotě 126 50 % vzdušné saturace při míchání, dosahujícím přibližně80 % maxima. Po 13 až 14 hodinách byl opakován přídavekněkterých látek. Do media byl přidán pouze glycerol /715g/1/ a síran amonný /143 g/1/· Rychlost přídavku hydroly-zétu kaseinu byla udržována na hodnotě 1,5 g/1 za hodinu.Přibližně po 16 hodinách, když byla mikroskopicky identi-fikována přítomnost velkého množství inkluzních částic uvětšiny buněk, byly buňky odstředěny v odstředivce SorvalRC3B /7000 g, 3θ minut, 4 °C/ a zmrazený na teplotu -80 °C. f/ Purifikace
Zmražené buňky /500 g/ byly resuspendovány v 50 mMTris-HCl, 25 mM SDTA, pH 8,0 /5 1/ při teplotě 4 °C v ho-mogenizétoru typu Silverson model AXR. Lýze buněk v sus-penzi byla provedena v homogenizátoru Manton-Gaulin při6000 psi /42 MPa/ trojnásobným protlačením suspenze. Ná-sledovalo odstředění po dobu 30 minut při 5000 g na odstře-divce Sorvall RC3C s rotorem H6000A. Supernatant byl poodstředění slit a peleta byla zmražena před další purifi-kací na teplotu -20 °C. 60 až 100 g pelet bylo po rozmražení resuspendová-no v roztoku 1 % /hmotn./obj,/ deoxycholové kyseliny /sod-ná sůl/ v 5 mM EDTA, s 5 mM dithiothreitolem, 5θ mM Tris-HCl, pH 9,0 /1200 ml/ obsahujícím 1 mg/ml azidu sodného,v homogenizátoru zn. Polytron, s čidlem PTA 20, při rych-losti nastavené na hodnotu 5. Suspenze byla promíchávánapo dobu 30 minut za laboratorní teploty a odstředěna při65ΟΟ g po dobu 30 minut v odstředivce zn. Sorvall RC 5C srotorem GSA. Supernatant byl opět odstraněn a pelety bylyzpracovány stejným způsobem, jaký již byl popsán výše. Dále byly pelety dvakrát resuspendovány v 1 1 vody a odstře-děny při 15ΟΟΟ g po dobu 20 minut. Výsledná sraženina obsa-hující inkluzní částice byla dále solubilisována v 2%/hmotn./obj./ sodné soli N-lauroylsarkosinu v 50 mM Tris-HCl pufru 8,0 /150 ml/ s 1 mg/ml azidu sodného. Síran sod-ný byl přidán tak, aby jeho výsledné koncentrace byla 20 - 127 - /UM, a směs byla potom odstředěna při 30000 g po dobu 33minut na odstředivce Sorvall RC5C s SS34 rotorem. Super-natant obsahující požadovaný derivát byl před další puri-fikací zmražen v 5θ ml alikvotech.
Solubilisovaný derivát /20 ml/ byl rozmražen a pře-filtrován přes filtr s póry o velikosti 5/um, aby došlo kodstranění všech pevných částeček. Filtrát byl aplikovánna kolonu o velikosti 5 x 90 cm /Ultrogel AcA54/, kteráje v rovnováze s 0,3% /hmotn./obj./ N-lauroylsarkosinem/sodnou solí/ v Tris-HCl pufru o koncentraci 50 mM a pH8,0, obsahujícím 1 mg/ml azidu sodného. Celý postup bylprováděn při teplotě 4 °C. Následovala eluce stejným pufremo průtoku 2,5 ml/min. Sluét byl jímán v 10 ml frakcích.Frakce obsahující derivát byly spojeny /přibližně 100 ml/a uchovány při teplotě 4 °C. Frakce s požadovaným derivá-tem eluované z několika kolon byly spojeny a dialyzoványproti 10 mM fosfátovému pufru se 150 mM chloridu sodnéhopH 7,4 /3 až 5 1/, obsahujícím 1 mg/ml azidu sodného vdiafiltračním zařízení Amicon CH2A-1S, vybaveném membránouS1Y10 /separační práh 10 kLa/. Retentát byl odstředěn při30000 g po dobu 3θ minut v odstředivce Sorvall RC5C s ro-torem SS34 a supernatant po odstředění byl 24 hodin dia-lyzován proti vodě, obsahující 1 mg/ml azidu sodného. Ná-sledovala další 72 hodinová dialýza s šestinásobnou obmě-nou vody. Výsledný retentát byl odstředěn 30 minutovoucentrifugací při 30000 g a zmražen na teplotu -20 °C přikoncentraci bílkovin 1 mg/ml nebo podroben lyofilizaci.
Koncentrace N-lauroylsarkosinu se po diafiltracisnížila pod hranici 0,001 % /hmotn./obj./ a po dialýzeproti vodě koncentrace této látky klesla pod hranici sta-novitelnou metodou rpHPLC /0,0001 %/. B. Příprava /""Met \ Ser^’^^_7hu G-CSF modifikovanéhomethylpolyethylenglykolem 5000
Tento produkt se připraví postupem popsaným v re- 128 ferenčním příkladu 7. Finální produkt obsahoval asi 4,1molu methylpolyethylenglykolu kovalentně vázaného na je-den mol proteinu. Specifická biologická aktivita /""Met-1 ,Ser17,27_7hu G-CSF /1,4 x 1 O9 U/mg/ klesla po modifikaci
Q pouze na 2,4 x 10 U/mg /17 %/. Tento produkt byl zcelastabilní a nevykazoval žádnou změnu specifické aktivityv roztoku až do 10 mg/ml /protein/ v PBS při teplotě 37 °Cpo dobu 14 dnů. Tyto výsledky jsou shodné s výsledky na-lezenými v referenčním příkladu 7 a ukazují konsistencizískaných výsledků s daným uspořádáním aminových skupin.
Referenční přiklad 4 Příprava /""Met""1 , Arg11 , Ser17’27’^°’^^_7 lidského G-CSFmodifikovaného methylpolyethylenglykolem 5000
Opakuje se postup uvedený v referenčním příkladu7 s následujícími výjimkami: zmražená buněčná pasta /500 g/ se resuspenduje při teplo-tě 4 °C v 50 mM Tris-HCl, 25 mM EDTA pH 8,0 /5 litrů/ zapoužiti homogenizátoru Polytron PT6000. Lýze buněk v sus-penzi byla provedena v homogenizátoru Manton-Gaulin při6000 psi /42 IvíPa/ trojnásobným protlačením suspenze. Ná-sledovalo odstředění po dobu 30 minut při teplotě 4 °C a5000 g na odstředivce Sorvall RG3C vybavené rotorem H6000A.Supernatant byl odlit a peletová frakce byla pře purifi-kací skladována při teplotě -20 °C.
Peletová frakce /200 až 250 g/ byla rozmražena aresuspendována v \% /hmotn./obj./ kyselině deoxycholové/ve formě sodné soli/ v 5 mM EDTA, 5 mM dithiothreitolu, 50 mM Tris-HCl pH 9,0, obsahujícím 1 mg/ml azidu sodného/3 litry/ za použití homogenizátoru Polytron PT10-35 vy-baveného čidlem PTA20. Suspense se potom míchá po dobu30 minut při teplotě 20 °C a odstřeďuje při 5000 g po do-bu 30 minut na odstředivce Sorvall RC3C vybavené rotoremH6000A. Supernatant se slije a peleta se dvakrát zpracuje •1» -η» - 129 - stejným způsobem. Peleta se dvakrát resuspenduje ve vodě/3 litry/ a odstřeďuje při 5000 g po dobu 30 minut. Finál-ní peleta obsahující inkluzní částice se solubilisuje v2% /hmotn./obj./ sodné soli N-lauroylsarkosinu /Sarkosyl/v 50 mM Tris-HCl pH 8,0 /300 ml/ obsahujícím 1 mg/ml azidusodného. Přidá se síran mednatý /20/uM/ a směs se míchápo dobu 16 hodin při teplotě 20 °C před odstřeďováním při3OOOO g v odstředivce Sorvall RC5C za použití rotoru SS34.Supernatant obsahující derivát se dále bezprostředně čistínebo skladuje při teplotě -20 °C až do okamžiku jeho po-užití.
Solubilizovaný derivát se nastaví na obsah celko-vého proteinu 15 mg/ml /pomocí ve /km0*-11 ♦/°hj./
Sarkosylu v 50 mM Tris-HCl pH 8,0 obsahujícím 1 mg/ml azi-du sodného a nechá se protéci 5/UM litrem za účelem odstra-nění veškerých částiček. 80 ml alikvot filtrátu se zave-de na sloupec /10 x 90 cm/ Sephacrylu S200 HR v rovnovázes 0,3$ /hmotn./obj./ Sarkosylu /sodná sůl/ v 5θ mM Tris-HCl pH 8,0 obsahujícím 1 mg/ml azidu sodného při teplotě4 °C. Sloupec se potom eluuje stejným pufrem při průtoku10 ml/minutu a jímají se 40 ml frakce. Frakce obsahujícíproteinový derivát se sloučí a skladují při teplotě 4 °C.
Spojené derivétové frakce z několika běhů se slou-čí /asi 1000 ml/ a dialyzují proti 10 litrům 10 mM fosfo-rečnanu sodnémo, 150 mM chloridu sodného, pH 7,4 obsahu-jícím 1 mg/ml azidu sodného za použití diafiltračního za-řízení Amicon CH2A-IS vybaveného membránou STY10 /separač-ní práh 10 kDa/. Retentét se případně odstředí při 15000gpo dobu 30 minut na odstředivce Sorvall RC5C za použitírotoru GSA a vyčiřený retentát se dialyzuje v dialyzačnítrubici Spectrapor 6-8 kDa po dobu 24 hodin proti třemobměnám /8 litrů/300 ml tetentátu/ 20 mM octanu sodného, 100 mM chloridu sodného, pH 5,4 při teplotě 4 °C. Vylouče-ná sraženina se oddělí odstředěním při 15000 g po dobu 30minut a supernatant se dialyzuje proti čtyřem obměnámvody /8 litrů/300 ml supernatantu/. Finální retentát se - 130 - vyčiří odstředěním při 15000 g po dobu 30 minut a nastaví0,1 M boritanem sodný© na pH 8,0. Purifikovaný derivát semodifikuje methylpolyethylenglykolem nebo skladuje předdalším použitím při teplotě -20 °C.
Referenční přiklad 5 Příprava /~Met 1 , Ser1^’2^_7 lidského G-CSF modifikované-ho methylpolyethylenglykolem 5000
Opakuje se postup popsaný v odstavci A referenční-ho příkladu 3 s následujícími výjimkami: duplex I se fosforyluje T4 polynukleotidkinasou a naštěpís Mstil /10 jednotek/ v 1 X H pufru /ScL; 30/ul/ po dobu2 hodin při teplotě 37 °C.
Po precipitaci ethanolem se fragment 143 bp EcoRI-MstlI p^istí na 10% polyakrylamidovém gelu obsahujícím7 M močovinu, izoluje elektroeluci z gelového proužku aDNA vlákna se spojí,jak to bylo popsáno v referenčním pří-kladu 1 . Výše popsaný syntetický fragment EcoRI-MstlI seklonuje do plasmidového vektoru pAG88 popsaného v referenč-ním příkladu 1. Za účelem přípravy vektoru se pAG88 /10yug/ naštěpí s Mstil /20 jednotek; BCL/ v 1 X H pufru /BCL;100/Ul/ po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C. DNA se potomvysráží ethanolem z 0,3 M octanu sodného při teplotě -20 °Ca potom štěpí s EcoRI /20 jednotek; BCL/ v 1 X H pufru/BCL; 100/ul/ po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C. Po pre-cipitaci ethanolem se velký fragment EcoRI-MstlI přečistína 1% agarosovém gelu a purifikuje za. použití Genecleanpostupem doporučeným výrobcem /Bio 101, USA/. Ligace 143bp genového fragmentu do velkého fragmentu EcoRI-MstlIbyla provedena postupem popsaným v referenčním příkladu1/b/. Kolonie obsahující syntetický fragment byly potvrze-ny monitorováním s radioaktivním detekčním činidlem při-praveným z oligonukleotidu /SEQ 1D č.24/ a správná sekven- -131- ce byla potvrzena DNA sekvenací, jak to bylo popsáno vreferenčním příkladu 1 . Plasmid obsahující gen pro /^"Met 1 ,Ser^^Jfc-CSF byl označen jako pICI1107. Tento gen bylklonován do expresního vektoru pICI 0020, přičemž purifi-fikace byla provedena postupem, popsaným v referenčnímpříkladu 3·
Referenční přiklad 6 Příprava genů pro deriváty lidského G-CSF za použití bo-dových mutací
Byla použita fosfothionátová methoda podle Eckstein-a akol.:
Taylor, J. W. a kol., Nucleic Acids Research /1985/ sv. ,str. 8749-8764;
Taylor, J. W. a kol., Nucleic Acids Research /1985/ sV.,str. 8765-8785;
Nakamaye, K. a kol., Nucleic acids Research /1986/ sv.,str. 9679-9698;
Sayers, J. R. a kol., Nucleic Acids Research /1988/ sv.,str. 791-802.
Postup byl proveden za použití setu dodaného firmouAmershan International. Metoda je uvedena dále a zahrnujezměny původní metody s ohledem na použití více než jedno-ho mutagemního oligonukleotidu a na inkubační teplotu prooligonukleotidy delší než 30 baží. 1/ Spojení mutantního oligonukleotidu s templátem jedno-vláknové DNA:
Templát jednovláknové DNA /1 /Ug/^ul/ 5>0/Ul
Fosforylovaný mutantní oligonukleotid /1,6 pmolna 1/U1/ 2,5/ul
Pufr 1 3,5/ul
Voda 6,0/ul 132
Když byly používány najednou dva mutagenní oligo-nukleotidy, bylo 2,5/ul /1,6 pmol/^ul/ každého fosforylo-vaného oligonukleotidu přidáno k 5/ul templátu jednovlák-nové DNA /1/ug/^ul/ v 3,5/ul pufru 1 a 3,5/ul vody. Kdyžbyly použity 3 mutagenní oligonukleotidy, 2,5/ul /1,6 pmolna /ul/ každého fosforylovaného oligonukleotidu bylo při-dáno k 5yul jednovláknové LNA /1yug/^ul v pufru 1 a 1 /ulvody/. V případě, že se jednalo o oligonukleotidy kratšínež 30 baží, byly výše uvedené složky dány do uzavřenézkumavky a zahřívány na vodní lázni o teplotě 70 °C podobu 3 minut. Oligonukleotidy delší než 30 baží byly po-nořeny do vroucí vodní lázně na dobu 3 minut. Potom bylyzkumavky přeneseny na vodní lázeň o teplotě 37 °C na dobu30 minut. 2/ Syntéza a ligace mutantních vláken DNA:
Spojení vláken DNA probíhalo v následující reakční směsi:
Chlorid hořečnatý /roztok/ 5/ulSměs nukleotidů 1 19/ul/obsahující dCTP alfa S/
Voda 6/ulKlenowův fragment /6 jednotek/ 1,5/UlT4 DNA ligasa /5 jednotek/ 2/ul Výše uvedené složky byly ponechány přes noc na vodní láz-ni o teplotě 16 °C. 3/ Odstranění nezmutované jednovláknové DNA za použitíodstředivých filtračních jednotek K reakční směsi z bodu 2 bylo přidáno:
Voda 5 M chlorid sodný 170/ul 39/ul. 133 250/ul vzorku bylo přidáno do horní poloviny fil-trační jednotky a centrifugováno při 1500 otáček za minpo dobu 10 minut při pokojové teplotě v odstředivce Sor-vall RT6000B za použití rotoru Sorvall H1000B swing out.Vzorky procházejí přes dvě nitrocelosové membrány, na kte-rých se zachytí jednovláknová DNA a dvouvláknová DNA jepo průchodu membránou zachycena ve sběrné zkumavce.
Za účelem odstranění zbývající RF DNA bylo 1 OO^ul500 mM NaCl přidáno ke vzorku a ponecháno 10 minut. Kfiltrátu byly přidány následující složky: 3M octan sodný /pH 6,0/ 28/ul ledový ethanol /-20 °C/ 700/ul.
Směs byla potom ponechána na lázni suchý led/ethanol apotom odstředěna v Eppendorfových mikrokyvetéch po dobu15 minut. Sraženina byla resuspendována v 1O^ul pufru 2.
4/ Štěpení nezmutovaných vláken pomocí Nci I K reakční směsi uvedené v bodě 3 bylo přidáno 65/ulpufru 3 a 8 jednotek Nci I /1 /Ul/. Směs byla dána na 90minut na vodní lázeň o teplotě 37 C.
5/ Štěpení nezmutovaných vláken pomocí exonukleasy III K reakční směsi z bodu 4 bylo přidáno: 500 mM NaCl 12/Ul pufr 4 10/Ul exonukleasa III /50 jednotek/ 2/Ul.
Směs byla přenesena na vodní lázeň o teplotě 37 °C a inku-bovéna po dobu 30 minut, přičemž 50 jednotek exonukleasyIII rozložilo přibližně 3000 baží za 30 minut. Směs bylapotom přenesena na vodní lázeň o teplotě 70 °C na dobu 15minut za účelem inaktivace enzymu. 134 6/ Polymerace a ligace DNA s mezerami /"gapped"/K reakční směsi z bodu 5 bylo přidáno: nukleotidové směs 2 1 3/ulMgClg /rotrok/ 5/ulDNA polymerasa I /4 jednotky/ 1yulT4 DNA ligása /2,5 jednotky/ 1/ul
Směs byla přenesena na dobu 3 hodin do vodní lázně o te-plotě 16 °C.
7/ Transformace kompetentních hostitelských buněk E.coliTG1 DNA 300yul čerstvě připravené buněčné suspenze kompe-tentních buněk E.coli /připravených metodou podle Mandelaa Higa/ bylo transformováno 20yul reakční směsi popsanév bodě 6 /dvakrát/.
Transformované buňky v pozdní logaritmické fázihyly přeneseny na TY agar a inkupace probíhala přes nocpři teplotě 37 °C.
Kmen S.coli TG1 je volně dostupný například z Ge-netic Stock Centre, Yale University, USA a Amersham Inter-national plc Amersham Plače, Little Chalfont, Amersham,Buckinhamshire H07 9NA, GB je dodavatelem jejich "in vitro"mutagenního systému, oligonukleotidového setu /kód výrobkuje RPN 1523/.
Referenční příklad 7 Příprava /"Met”^, Arg1 \ Ser1 >^7,60,65^7 lidského G-CSFmodifikovaného methylpolyethylenglykolem 5000
A. Příprava /""Met \ Arg^ , Ser_J lidského G-CSF
Postup popsaný v referenčním příkladu 6 byl opako-ván se zmutovaným templátem Ml3mpl8, obsahujícím gen pro 135 /""Met“1, Ser1^’2^_7G-CSF, popsaný v referenčním příkladu3 nebo 5. Použité zmutované oligonukleotidy byly označenyjako SEQ 1D č.28 a SEQ 1D č.29 /jak je déle uvedeno/.
Triplet ACG v SEQ ID č.28 slouží k přeměně Gin vpozici 11 na Arg, první a poslední AGA triplety v SEQ IDč.29 kódují přeměnu Pro v pozicích 65 a 60 na Ser. Muta-geneze byla provedena způsobem, popsaným v referenčnímpříkladu 6, s použitím SEQ. ID č.29, jako mutagenního pří-měru. Byl získán samostatný plak, který obsahoval Pro 60Ser, a Pro 65 Ser změny. Jednovléknová DNA byla připrave-na z tohoto materiálu postupem, popsaným v referenčnímpříkladu 6. Tato DNA byla použita jako templát pro jedno-rázovou mutagenrzi využívající SEQ ID č.28 jako mutačníhoprimeru.
Tento postup vedl k výtěžku plaku většího než 100. U 3 byl proveden screening DNA sekvenováním tak, jak bylodříve popsáno. U všech 3 byly zcela inkorporovány všechnyzměny. Dvoušroubovicová RF DNA byla připravena z jednohoz plaků postupem pro přípravu jednovláknové DNA ve velkémměřítku /krok d v referenčním příkladu 3/ až po krok S5· RFDNA byla extrahována z bakteriálních pelet alkalickou lýzípodle Birnboima a Dolyho /Nucleic Acids Research /1979/ 7, 1513-1523/ a purifikována odstřelováním v hustotnímgradientu chloridu česného, popsaným v publikaci "Molecu-lar cloning - a Laboratory Manual” autorů Sambrooka, Frit-sche a Maniatise /Cold Spring Harbor Publication/.
Purifikované RF DNA byla Štěpena EcoRI a Sáli vpufru H dříve popsaným způsobem a malý fragment 619 bpobsahující trp promotor, vazebné místo pro ribosom, trans-lační iniciační kodon a gen pro /f~Met_1 , Ser1? ’2?_7 G-CSFbyl izolován z 0,7% agarosového gelu za použití metodyGeneclean /TM/. Fragment byl ligován T4 DNA ligasou /BRL/v příslušném pufru na pICI0020 vektor, štěpitelný restrikč-ními enzymi ScoRI-SalI, za použití 2:1 molárního přebytkuinsertní části vůči vektoru v podstatě tak, jak bylo dřívepopsáno. Ligační směs byla použita k transformaci buněk - 136 - kmene E.coli HB101. Transformované buňky byly selektoványrůstem na miskách s L-agarem, obsahujícím 50/Ug/ml ampi-cilinu. U kolonií byl potom proveden screening na přítom-nost insertní DNA metodou restrikční analýzy plasmidu DNA,připraveného metodou podle Birnboima a Dolyho, jak je po-psána v publikaci "Molecular Cloning a Laboratory Manual"autorů Sambrooka, Fritsche a Maniatise /Cold Spring HarborPublication/. Plasmid LNA,pocházející z kolonií a obsahu-jící očekávanou 6l9bp EcoRI-SalI insertní část, byl použitpro transformaci kmene MSL522 S.coli a vektoru pICII239.
Fermentace a purifikace byly provedeny postupem po-psaným dříve v referenčním příkladu 3. B. Příprava /"Met-1, Arg11, Ser1^’^^,^°’^^_7 hu G-CSF mo-difikovaného methylpolyethylenglykolem 5000 pH roztoku /~Met“1, Arg11, Ser1^^^_7hu G-CSF /418 mg/ ve vodě /400 ml/ bylo nastaveno na hodnotu8,0 přídavkem 0,8 M boritanu sodného, pH 8,8 a roztok bylzkoncentrován na objem 50 ml /8 mg/ml/ ultrafiltrací přesmembránu Amicon YM1 0 /mez propustnosti 10 kDa/. K tomutoroztoku byl přidán stejný objem 0,·8 M boritanu sodného,pH 8,8 a potom methylpolyethylenglykol-p-nitrofenylkarbo-nát, který je produktem firmy Sigma Chemical Co. Ltd. amá přibližnou molekulovou hmotnost 5000 /11,3 g, 100 ekvi-valentů, 20 ekvivalentů na aminovou skupinu v /7”Met”1 ,Arg11, Ser1^,27,60,65^ hu Q-Qgp/, rozpuštěný ve vodě /100ml/. Reakce byla provedena při pokojové teplotě za mírné-ho míchání po dobu 3 hodin a ukončena přídavkem ethanol-aminhydrochloridu, pH 8,0 /10 ekvivalentů na mol aktivníhomethylpolyethylenglykolu/.
Reakční směs se zkoncentruje průchodem membránouAmicon YM30 /mez propustnosti 30 kDa/ při teplotě 4 °Cna finální objem retentátu 50 ml. Tento retentát se zře-dí 0,1 M hydrogenuhličitanem amonným, pH 8,0 /200 ml/ aopětovně zkoncentruje na objem 50 ml opakovanou ultrafiltrací. Tento postup se opakuje čtyřikrát a produkt se nakonec - 137 - zkoncentruje na finální objem asi 25 ml. Koncentrovaný roztok produktu se potom chromatografuje na sloupci /5x90 cm/ Ultrogelu AcA54, který je v rovnováze s 10 mM fos-forečnanem sodným, 150 mM chloridem sodným, pH 7,4, obsa-hujícím 1 mg/ml azidu sodného /PBS-azid/. Frakce obsahu-jící modifikovaný protein se identifikují monitorovánímproteinu při 280 nm a polyethylenglykolu titraci systémemjod/jodid draselný /C.R. Acad. Sci. ,Paříž 274 1617, 1972/,sloučí a dialyzují kompletně proti vodě. Finální produktse zkoncentruje ultrafiltrací přes membránu Amicon YM30na koncentraci vyšší než 11,5 mg/ml, zfiltruje přes 0,22/um filtr za sterilních podmínek a skladuje před dalšímpoužitím při teplotě 4 °C.
Aminokyselinová analýza proteinu po kyselé hydro-lýze ukazuje, že ve finálním modifikovaném produktu jecelkem obsaženo 51 % výchozího /""Met 1, Arg11, Ser17’27’8θ’^7-hu G-CSF. PAGS-SDS-analýza reakční směsi prokazuje, ženezůstal žádný nezreagovaný /""Met“1, Arg11, Ser17’27’^^^-hu G-CSF a že veškerý produkt má vysokomolekulární charak-ter. Titrace filtrátu a retentátu systémem jod/jodid dra-selný ukazuje, že opakovaná ultrafiltrace přes membránuYM 30 při pH 8,0 účinně odstraní veškeré deriváty methyl-polyethylenglykolu, které nejsou vázány na protein. Tobylo potvrzeno chromatografií na sloupci Ultrogelu Ac54.
Titrace /“Met“1, Arg11, Ser17’27’60’65_7hu-G-CSF kovalent-ně vázaného k methylpolyethylenglykolu v systému jod/jodiddraselný v kombinaci se stanovením proteinu aminokyselino-vou analýzou po kyselé hydrolýze ukazuje, že na jeden molproteinu je vázáno 3,9 molu methylpolyethylenglykolu.
Specifická biologická aktivita /""Met”1 , Arg11,Ser17,27,60’65_7hu G-CSF /1,2 x 109U/mg/ klesla po modi-fikaci methylpolyethylenglykolem na 2,2 x 108U/mg /19 %/.Produkt byl zcela stabilní a nevykazoval žádnou změnuspecifické aktivity v roztoku až do 10 mg/ml /protein/ vPBS při teplotě 37 °C v průběhu 14 dnů. - 138 -
Referenční přiklad 8 Příprava /“Met"1, Glu15, Ser17’27, Ala26’28, Lys3°_7 lids-kého G-CSF modifikovaného methylpolyethylglykolem 5000
A. Příprava /“Met"1, Glu15, Ser17»27, Ala 26’28, Lys3£7lidského G-CSF a/ Postup popsaný v referenčním příkladu 7 byl opako-ván za použití mutagenního templátu M13mp18, obsahujícíhogen pro /"Met , Ser ’ _7 G-CSF popsaného v referenčním příkladu 3 nebo 5· Oligonukleotidy použité k mutagenezibyly označeny jako SEQ ID č.33 a SEQ ID č.34.
Triplet TTC v SEQ ID č.33 poskytuje změnu Leu vpozici 15 na Glu. V sekvenci SEQ ID č.34 první TTT tripletzavádí změnu Ala v pozici 30 za Lys a triplety AGC posky-tují změny Gly v pozicích 28 a 26 na Ala. Proces mutagene-ze byl proveden v podstatě tak, jak je popsáno v referenč-ním příkladu 6 jako "double priming” postup a expresnísoubor genů byl přeměněn na expresní plasmid, který poskytlpICI 1266. b/ Purifikace v
Zmrazené buňky byly podrobeny lýzy a surové frakcepelet byly separovány stejným způsobem, který je uveden vreferenčním příkladu 3· Inkluzní částice přítomné v pele-tách a obsahující žádaný protein byly solubilisovány vpufru připraveném ze sodné soli deoxycholové kyseliny tak,jak je to popsáno v referenčním příkladu 3. Pro izolaciproteinu pak byla použita následující modifikovaná metoda.
Surové frakce pelet /60-100 g/ byly rozmraženy aresuspendovány v 25 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 /1200ml/ v homogenizátoru Polytron s PTA 20 sondou s rychlostíotáček nastavenou na hodnotu 5· Suspenze byla míchána podobu 30 minut při laboratorní teplotě a odstředována při - 139 -
»Λ· r -(* -**JVV 6500 g po dobu 30 minut v odstředivce Sorvall RC5C za po-užití rotoru GSA. Po slití supernatantu byly pelety ještědvakrát zpracovány stejným, výše uvedeným způsobem. Dálebyly pelety dvakrát resuspendovány ve vodě /1 litr/ aodstředěny tak, jak je uvedeno v referenčním příkladu 3·Následující purifikace byla provedena také stekným způso-bem jako v referenčním příkladu 3· B. Příprava /""Met-1, Glu1^, Ser^’2?, Ala28’28, Lys^°_7-hu G-CSF modifikovaného methylpolyethylenglykolem 5000
Tento produkt byl připraven postupem popsaným vreferenčním příkladu 7 rovněž za použití 100 molárníchekvivalentů činidla i když tento derivát obsahuje ještělysinový zbytek v poloze 30. Finální produkt obsahovalasi 4,7 molu methylpolyethylenglykolu kovalentně vázanéhona jeden mol proteinu. Zvýšená míra zabudování methylpoly-ethylenglykolu je v souvislosti s přítomností mimořádněpotentního místa pro modifikaci, což se odráží v mírnězvýšené molekulové hmotnosti při PAGE-SDS-analýze. Spéci-
Q ficka aktivita nemodifikovaného derivátu /1,2 x 10 U/mg/η klesne u modifikovaného produktu na 4,4 x 10 U/mg /3 %/.Získaný produkt je naprosto stabilní a nevykazuje žádnouzměnu specifické aktivity až do 10 mg/ml /protein/ v PBSpři teplotě 37 °C v průběhu 14 dnů.
Referenční přiklad 9
Postupy podle referenčních příkladů 1, 3 a 5 bylyopakovány s výjimkou, že při fermentačním stupni /viz na-příklad referenční příklad 3/e// bylo namísto kmene E.coliMSD 522 použito kmene E.coli TG1.
Referenční přiklad 10
Alternativní extrakční postup /"Met”1, Arg11, Ser1 ?’27 »60,65-7lidského G-CSF 140
Opakuje se postup popsaný v referenčním příkladu 7 s vý-jimkou spočívající v tom, že extrakční proces se provedenásledujícím způsobem: zmražené buňky /640 g/ byly resuspendovány při teplotě4 °C v 50 mM Tris-HCl, 5 mM ELTA, 5 mM dithiothreitolu, 2 M močovině, pH 8,0, obsahující 1 mg/ml azidu sodného vhomogenizátoru Polytron se sondou PTA20 při rychlosti otá-ček nastavené na hodnotu 7/8. Buňky byly v suspenzi po-drobeny lýzy trojnásobným protlačením v Manton-Gaulin Lab60/60- homogenizátoru při 6000 psi /42 MPa/ a promyty 1litrem pufru. Ochlazení bylo provedeno v Conair-chladičipři teplotě -20 °C. Lyžované buňky byly déle odstředěnypři 5000 g po dobu 30 min v odstředivce Sorvall RC3C srotorem H6000A.
Po slití supernatantu byly pelety /asi 450 g/ re-suspendovány ve stejném, výše uvedeném pufru /10 litrů/.
Po následném 30 minutovém míchání při laboratorní teplotěbyla suspenze odstředěna po dobu 30 minut při teplotě 5000otářek za minutu na odstředivce Sorvall RC3C s rotoremH6000A. Supernatant byl opět slit a pelety byly ošetřenydvakrát stejným výše popsaným způsobem. Dále byly peletydvakrát suspendovány ve vodě /10 litrů/ a odstřeďovány podobu 30 minut při 5000 otáčkách za minutu. Takto zpraco-vané pelety obsahující promyté inkluzní částice byly re-suspendovány v Tris-HCl pufru pH 8,0 /1 litr/ s 2% /hmotn./obj./ sodnou solí N-lauroylsarkosinu, obsahujícím 1 mg/mlazidu sodného, v homogenizátoru Polytron s rychlostí otá-ček nastavenou na hodnotu 7. Byl přidán roztok 20 mM sí-ranu mědnatého ve vodě /1,5 ml/ a směs byla míchána přilaboratorní teplotě přes noc. Potom následovalo odstředě-ní při 10000 otáčkách za minutu po dobu 30 minut na odstře-divce Sorvall RC5C s rotorem GSA.
Supernatant, který obsahoval zadaný derivát, bylfiltrován přes filtr s velikostí pórů 5^um, aby byly odstra-něny případné nečistoty a tuhé částice, dále byl šestkrátzředěn 50 mM Tris.HCl pufrem pH 8,0, obsahujícím 1 mg/ml 141 azidu sodného /při 4 °C/. Dále byla provedena diafiltracena ultrafiltračním zařízení Amicon DC20 vybaveném filtremS1 0Y10 s mezí propustnosti 10 kDa při maximálním tlakuproti roztoku obsahujícím 10 mM fosforečnan sodný, 150 mMchlorid sodný pH 7,4 /90 litrů/ s 1 mg/ml azidu sodného.
Ke konci diafiltrace se vytvořila sraženina.
Retentát /celkový obsah bílkovin 2,1 mg/ml, obsahproduktu 1,7 mg/ml/ byl shromážděn v polypropylenovýchnádobách se šroubovacím uzávěrem o objemu 41a inkubovánpřes noc při teplotě 37 °C. Vzniklá sraženina byla odstře-děna odstředěním při 5000 otáčkách za minutu na odstřediv-ce Sorvall RC3C a supernatant byl uchován při 4 C.
Provedením SDS-PAGE a rpHPLC bylo prokázáno, žebehem závěrečného postupu, zahrnujícího působení zvýšenéteploty, byly selektivně vysráženy kontaminující bílkovinymikroorganismu E.coli, oligomerní produkty a produkty de-gradace s určitým podílem žádaného produktu, z nějž 85 %zůstalo v roztoku. Vysoce obohacený přečištěný roztok pro-duktu po tepelném zpracování byl plně biologicky aktivnía stabilní v koncentraci 20 mg/ml při teplotě 37 °C vícenež dva týdny bez jakéhokoliv náznaku možnosti proteoly-tické degradace. Během této doby se vysráželo méně než 20 %produktu. Tak byl získán vynikající meiorodukt pro dalšíchromatografiťkou purifikaci.
Referenční přiklad 11 Příprava /""Met”1, Arg^ , Ser1^’^7’θθ*^^_7 n^g^ého G-CSFs použitím produkčního vektoru včetně trp promotoru a/ Plasmid pICI1239 /uvedený v referenčním příkladu 7/byl štěpen enzymy EcoRI a Sáli v U pufru, jak již bylodříve popsáno. Malý fragment EcoRI-SalI, obsahující trppromotor, místo pro vazbu ribosomu a gen pro /""Met-1, Arg11Ser^ »27,60,65_y G-CSF, byl izolován z 0,7# agaroso- 142 vého gelu metodou Geneclean /TV/. Vektorový fragment bylpřipraven z plasmidu pICI 0080 /viz referenční příklad 6/,štěpením enzymy EcoRI a Xhol v H pufru a velký EcoRI-Xholfragment byl izolován z 0,7^ agarosového gelu metodou Gene-clean. Malý fragment EcoRI-SalI byl ligovén do vektorové-ho fragmentu EcoRI-Xhol, přičemž byl použit 2:1 molérnípřebytek insertní části oproti vektoru tak, jak bylo dří-ve popsáno, a ligační směs byla potom použita k transfor-maci buněk kmene E.coli MSD 522. Transformované buňky by-ly selektovány růstem na miskách s L-agarem, obsahujícímtetracyklin /15/Ug/ml/. Tři kolonie byly vybrány a pone-chány růst v minimálním mediu M9 /75 ml/, které obsahova-lo příslušné složky a tetracyklin /I5yug/ml/, 20 hodin přiteplotě 37 °C na třepačce. Akumulace bílkoviny byla sle-dována vyhodnocováním výsledků po SDS-PAGE, kdy gel bylbarven Coomassie blue.
Pro SDS-PAGE byly používány vzorky celách buněčnýchlyzátů. Všechny tři klony obsahovaly exprimovaný /""Met-^ ,Ser17,27,60,65_7 lidský G-CSF. Plasmid DNA jedné z koloniíbyl označen jako pICI1327 a sekvence promotoru a genu by-ly ověřeny standardní metodou dideoxy-sekvenace, popsanouv předcházejícím textu. b/ Fermentace
Plasmid pICI 1237 byl transformován do buněk kmeneE.coli MSD 522 a výsledné rekombinantní buňky byly puri-fikovány a udržovány v glycerolu při teplotě -80 °C. Část kultury byla odebrána ze zásobní směsi a ro-zetřena na misky s agarem, obsahujícím tetracyklin, abydošlo přes noc při teplotě 37 °C k nárůstu jednotlivýchkolonií. Po nárůstu byla odebrána samostatně narostlá ko-lonie, která byla resuspendována v 10 ml kultivačního me-dia s tetracyklinem a 100/ul bylo ihned použito k inoku-laci 3 Erlenmayerových baněk /250 ml/, obsahujících 75 mlkultivačního media s tetracyklinem. Po 16 hodinovém růstu - 143 - na třepačce při teplotě 37 °C byl obsah baněk s narostlý-mi buňkami použit k inokulaci fermentoru, obsahujícího20 litrů kultivačního media.
Složení kultivačního media
Složka Obsah /g/1/ kh2po4 3,0 Na2H?0 6,0 NaCl 0,5 Hydrolyzát kaseinu /Oxoid L41/ 2,0 /nh4/2so4 10,0 Kvasničný extrakt /Lifco/ 10,0 Glycerol 35,0 L-leucin 0,625 MgSO4.7H2O 0,5 CaCl2.2H2O 0,03 Thiamin 0,008 FeSO^/kyselina citrónová 0,04/0,02 Roztok stopových prvků /TES/ 0,5 ml/1 Tetracyklin 10 mg/1 solubilisováno v destilované vodě
Fermentace probíhaly při teplotě 37 °C a pH 6,7,které bylo automaticky regulováno přídavky roztoku 6 Mhydroxidu sodného. Parciální tlak kyslíku /dOT/ byl nasta-ven na hodnotu 50¾ vzdušné saturace a zpočátku byl auto-maticky regulován úpravou rychlosti otáček míchadla. Prů-tok vzduchu byl zpočátku 201/min, což odpovídá průtoku 144 jednoho objemu vzduchu, vztaženého na objem media za mi-nutu /WM/, a byl zvýšen na hodnotu 50 1/min /2,5 WM/ vokamžiku, kdy rychlost otáček míchadla dosáhla 80 až 90'%svého maxima. Vzhledem k tomu, že rychlost přenosu kyslí-ku /OTR/ ve fermentorech nebyla schopna uspokojit spotře-bu bakterií při hustotě buněk v mediu vyšší než je ta,které odpovídá absorbance 50 při vlnové délce 55θ nm zapopsaných podmínek, byl přírůstek rychlosti přenosu kyslí-ku /dOT/ ve fermentoru při vyšších hustotách buněk udržo-ván na hodnotě 5θ vzdušné aerace při saturaci. Tohotoefektu bylo dosaženo při kultivaci buněk, jejichž hustotav mediu odpovídala hodnotě 50 absorbance zákalu, měřenémpři vlnové délce 550 nm, v mediu s limitovaným množstvímzdroje uhlíku s následným dodáním stopového množství zdro-je uhlíku spolu se síranem amonným a kvasničným extraktemrychlostí, která omezovala rychlost růstu bakterií.
Fermentace probíhaly po dobu 18 hodin, přičemž vprůběhu kultivace byly odebírány vzorky a byla měřenaabsorbance zákalu při vlnové délce 550 nm, sušina buněk amnožství /“Met"1, Arg11, Ser17’27’60’°5_7 lidského G-CSFuvnitř buněk. Množství /""Met"1, Arg11, Ser17’27^5 7lidského G-CSF byla sledována po zbarvení gelů Coomassiimodří po SDS-PAGE /elektroforéza v polyakrylovém gelu sSES/, která byla provedena vždy s celými buněčnými lyzátyvzorků bakterií. V okamžiku, kdy absorbance zákalu při vlnové dél-ce 550 nm dosáhla hodnoty 35 /8,^ódiny/, byl do fermentorupřidáván roztok hydrolyzátu kaseinu /100 g/1 Oxoid L41/ vmnožství 0,75 g/1 za hodinu. V průběhu kultivace, kdy absorbance zákalu přivlnové délce 550 nm dosáhla přibližně hodnoty 50, došlok vyčerpání zdroje uhlíku, což vedlo k rychlému vzrůstuparciálního tlaku kyslíku /dOT/ z hodnoty 50 % vzdušnésaturace. V tomto okamžiku byly do media přidány glycerol/470 g/1/, kvasničný extrakt /118 g/l/ a síran amonný/118 g/1/ v množství, které způsobilo obrat a návrat k 145 zpětnému udržování dOT na hodnotě 5θ X vzdušné saturacepři míchání, dosahujícím přibližně 70 až 80 X maxima.Rychlost přídavku hydrolyzátu kaseinu byla stále udržová-na na hodnotě 0,75 g/l/h. Přibližně po 18 hodinách, kdyžbyla mikroskopicky identifikována přítomnost velkého množství inkluzních Částic u většiny buněk, byly buňky bakteriíodstředěny v odstředivce Sorvall RC3B při 7000 g po dobu30 minut při teplotě 4 °C a zmraženy na teplotu -80 °C. c/ Purifikace
Purifikace byla provedena způsobem popsaným v re-ferenčním příkladu 3/b/.
Referenční přiklad 12 Příprava /“Met“1, Ser17,27,6°,65_7lidského G-CSF s použi-tím produkčního vektoru včetně promotoru T7A3 a/ Fragment EcoRI-SalI, obsahující T7A3 promotor a ve-doucí sekvenci pro vazebné místo na ribosomu a gen pro/“Met”1, Ser17’27_7 lidského G-CSF byl klonován do plasmi-du M13 mp18, jak je popsáno v části d/ referenčního příkla-du 3· Sekvenci EcoRI-SalI fragmentu je vyjádřena v SEQID č.47 a uvedena na obr.3; SEQ ID č.47 obsahuje EcoRIrestrikční místo /nukleotidy 1-6/, sekvenci pro A4 promo-tor bakteriofágu T7 /nukleotidy 7-52/, vedoucí sekvencipro vazebné místo trp na ribosomu /nukleotidy 53-78/ atranslační kodon /nukleotidy 79-81/. Obr.3 vyjadřuje nukleotidovou sekvenci /~Met 1, Ser17,27_7 lidského G-CSF, kte-rá končí v Sáli restrikčním místě. Bude výhodné, když 3terminélní ATG kodon sekvence SEQ ID č.47 ihned následujeza ACT kodonem, který kóduje threonin /aminokyselina 1/na obr.3· Z toho pak vyplývá, že 5 'nukleotidové sekvenceAATTCAGT není přítomna ve fragmentu EcoRI-SalI. FragmentEcoRI-SalI může být tak připraven sestřihem z plasmidupICI 1295 /viz referenční příklad 31/.Bodová mutageneze 146 - byla provedena na jednovláknové LNA, jak je popsáno v re-ferenčním příkladu 6, s použitím oligonukleotidu SEQ IDČ.28 s cílem změnit kodon pro Gin v pozici 11 na kodonpro Arg. Lvouvláknové RF DNA byla připravena z plaku, kte-rý obsahoval změnu Gin11—> Arg11, popsanou v referenčnímpříkladu 7,s výjimkou kroku B3, inkubace probíhala 3 ho-diny místo 5 hodin, dále byla DNA štěpena EcoRI /jak bylodříve popsáno/ a SnáBI /jak bylo popsáno v referenčnímpříkladu 13/· Výsledný 144 bp EcoRI-SnaBI fragment, obsahujícíT7A3 promotor, vedoucí sekvenci pro vazebné místo trp naribosomu a genový fragment s Arg11 kodonem byl isolována ligován s EcoRI-SnaBI vektorem, vyštěpeným z pICI 1327/který obsahoval kodony pro Ser a Ser 5 a je popsán vreferenčním příkladu 11/. Ligační směs byla použita k trans-formaci buněk E.coli kmene MSD522, transformované buňkybyly selektovány růstem na miskách s L-agarem, který obsa-hoval tetracyklin /1 5/Ug/ml/. Rlasmid DNA, pocházející zkolonie, obsahující předpokládaný T7A3 promotor a genovásekvence /“Met"1 , Arg11, Ser17,27’60’65_7 lidského G-CSF,byly identifikovány sekvenováním DNA izolovaného plasmidua označeny jako pICI 1386.
Fermentace byla provedena na základě dvou alterna-tivních procesů b/ a c/ viz níže. Postup b/ probíhal přiteplotě 37 °C a po 16 hodinách fermentace, jak bylo uvede-no, bylo získáno 35 g/1 mikrobiální biomasy a množstvívzniklého /"Met“1, Arg11, Ser17,27’6°’65_7 lidského G-CSFbylo stanoveno na 7 g/1 kultivačního media. Proces c/ bylprováděn při teplotě 30 °C a fermentace, v souladu s použi-tím nižší kultivační teploty, probíhala pomaleji. Při tétokultivaci označené c/ bylo po 35 hodinách získáno 55 g/1mikrobiální biomasy a výtěžek /“Met”1, Arg11, Ser17’27’60,65ylidského G-CSF byl 15 g/1 kultivační půdy. b/ Kmen E coli CGSC 6300 /genotyp F“, X , lac+/, získa-ný z bakterií E.coli sbírky Genetic Stock Centre, byl trans- - 147 - formován plasmidem pICI 1386. Výsledný kmen CGSC 6300/pICI 1 386/ byl purifikován a uchován v glycerolu při te-plotě -80 °C. Část kultury byla odebrána ze zásobní směsia vyočkovéna na misky s agarem, obsahujícím L-tetracyklin,aby mohly být po nárůstu /přes noc asi 16 hodin při teplo-tě 37 °C/ izolovány jednotlivé kolonie.
Samostatně narostlá kolonie CGSC 6300 /pICI13S6/byla odebrána a resuspendována v 10 ml kultivačního media,které obsahovalo L-tetracyklin a bezprostředně potom bylo100/ul tohoto roztoku použito k inokulaci každé z dvacetiErlenmayerových baněk /250 ml/, obsahujících 75 ml růsto-vého media s L-tetracyklinem. Po 16 hodinovém růstu přiteplotě 37 °C na třepačce, byl obsah všech baněk spojena použit k inokulaci fermentoru, který obsahoval 20 litrůmodifikovaného kultivačního media LCM50. Složení kultivač-ního media LCM50 je uvedeno v tabulce 1.
Tabulka 1
Složení kultivačního media
Modifikované kultivační medium LCM50 /A/ Složky Složka lované jsou rozpuštěny v desti-vodě /g/1/ KHoP0. 2 4 3,0 Na2HP04 6,0 NaCl 0,5 Hydrolyzát kaseinu /Oxoid L41/ 2,0 /NH.ASO, 4 2 4 10,0 Kvasničný extrakt /d¥co/ 20,0 Glycerol 35,0 MgSO4.7H2O 0,5 148 -
Tabulka 1 /pokračování/
CaCl2.2H2O
Thiamin
FeSO^/kyselina citrónováRoztok stopových prvků /TES/Tetracyklin 0,03 0,008 0,04/0,02 /0,5 ml/1//10 mg/1/
Fermentace probíhala při teplotě 37 °C a při pH 6,7, které bylo automaticky regulováno přídavkem 6 M roz-toku hydroxidu sodného. Parciální tlak kyslíku /dOT/ bylustálen na 50 % vzdušné saturace a zpočátku byl automatic-ky regulován úpravou rychlosti otáček míchadla. Frůtokvzduchu byl zpočátku 20 1/min, což odpovídá průtoku jedno-ho objemu vzduchu vztaženého na objem media za minutu/VVM/ a byl ručně zvýšen na hodnotu 45 1/min v okamžiku,kdy rychlost otáček míchadla dosáhla svého maxima /1000otáček za minutu/.
Fermentace probíhala 1 6 hodin a během této doby byly odebrány vzorky na měření absorbance zákalu kultury /ODcj-r,/» koncentraci biomasy, koncentraci celkové mikro-u — —111 biální bílkoviny a množství akumulovaného / Met , Arg ,Ser^ 7 >27,60,65_7 i^g^ho G-CSF v bakteriálních buňkách.Množství akumulace / Met-1, Arg11, Ser1?j60,657 lidské-ho G-CSF bylo sledováno po zbarvení gelů Coomassie bluepo SDS-PAGE-elektrofořeze, která byla provedena vždy scelými lyzáty vzorků bakterií, jak bylo popsáno. Celkovýobsah mikrobiálních bílkovin byl stanoven Lowryho metodou.Roztok kvasničného extraktu /225 g/1/ byl přidáván do fer-mentoru 4,5 hodiny po začátku inokulace rychlostí 1,7 g/l/h.
Když byl v růstovém mediu vyčerpán zdroj uhlíku/glycerol/, dOT rychle poklesl z 5θ vzdušné saturace. V této fázi byly přidány živiny, obsahující glycerol/714 g/1/ a síran amonný /143 g/1/· Protože rychlost spo- - 149 - třeby kyslíku /OUR/ dosáhla maximální rychlosti spotřebykyslíku ve fermentoru /OTR/ těsně předtím, než byl vyčer-pán zdroj uhlíku, byly do fermentoru přidány živiny v množství, které ovlivnilo růst bakterií do té míry, že rychlostspotřeby kyslíku /OUR/ dosahovala přibližně 80-90 % maxi-mální rychlosti spotřeby kyslíku ve fermentoru /OTR/. Rych-lost přidávání živin byla ručně upravena na původní rych-lost a potom bylo udržováno dOT při maximálně 50% vzdušně-ní za již výše popsaných podmínek. c/ Fermentační proces popsaný v /b/ byl opakován, avšakpři teplotě 30 °C po dobu 35 hodin. Kromě fermentační te-ploty 30 °C bylo medium a fermentační podmínky stejné jakov bodě /b/. d/ Purifikace byla prováděna postupem popsaným v refe-renčním příkladu 3/f/»
Referenční příklad 13
Příprava /~Met~\ Ser^_7 hu G-CSF
Postup popsaný v referenčním příkladu 5 pro přípravu/—Met-1, Ser17’27_7 g_csF byl zopakován s následujícímivýjimkami : 1/ Dvoušróubovicová LNA pro fosforylaci byla při-pravena z oligonukleotidových sekvencí S2Q IDč.24, 25, 3 a 4, přičemž SEQ IL č.3 a 4 mohoubýt nahrazeny sekvencemi SEQ ID č.26 a 27, kte-ré byly použity v referenčních příkladech 3, 4a 5; 2/ DvouŠroubovicová DNA popsaná v /1/ byla fosfory-lována T4 polynukleotidkinasou, ale byla štěpe-na pomocí SnaBI /10 jednotek/ v 1 x M pufru 150 '/BCL, 30/ul/ při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin; 3/ následovala purifikace ethanolem, kdy 72 bpfragment EcoRI-SnaBI byl purifikovén místo 143bp fragmentu EcoRI-MstlI; 4/ syntetický fragment EcoRI-SnaBI byl klonován doplasmidového vektoru pAG88, jak bylo popsáno vreferenčním příkladu 1, a pro přípravu vektorubyl pAG88 štěpen pomocí SnaBI /20 jednotek,BCL/v 1 x M pufru /BCL, 100/Ul/ při teplotě 37 °Cpo dobu 2 hodin místo Mstil v 1 x H pufru; 5/ následovalo srážení ethanolem, kdy velký frag-ment EcoRI-SnaBI byl purifikován na 1% agaroso-vém gelu místo velkého fragmentu EcoRI-MstlI; 6/ plasmid obsahující gen pro /“"Met , Ser _7huG-CSF byl označen pICI 1105. B. Příprava /""Met”\ Ser^_7hu G-CSF modifikovaného methylpolyethylenglykolem 5000
Roztok /""Met”1 , Ser^_7hu G-CSF /300mg, 6,25 mg/ml/ve vodě se zředí na objem 75 ml 1,1 M boritanen sodným pH8,9 za vzniku roztoku proteinu /4 mg/ml/ v 0,4 M boritanusodném, pH 8,7. K tomuto roztoku se za míchání po kapkáchpřidá vodný roztok /75 ml/ methylpólyethylenglykol-p-nitrofenylkarbonát s přibližnou molekulovou hmotností 5000/Sigma Chemical Co. Ltd/ /100 ekvivalentů na jeden molproteinu; 20 ekvivalentů na jednu aminovou skupinu/. Re-akční směs se míchá při pokojové teplotě po dobu 3 hodin,načež se ukončí přídavkem po kapkách ethanolaminhydrochlo-ridu pH 8 /10 ekvivalentů na jeden mol aktivního methyl-polyethylenglykolu/. Reakční směs se zředí na objem 350 ml0,1 M hydrogenuhličitanem amonným pH 8 a střídavě zkoncen-truje a zředí tímto rozpouštědlem v míchané cele Amiconvybavené membránou YM30 /mez propustnosti 30 kDa/ až dookamžiku, když již není pozorovatelné žluté zbarvení.
Finální koncentrát /25 ml/ se potom chromatografuje 151 na sloupci /5 x 90 cm/ Ultrogelu AcA54 v rovnováze s PBS-azidero, který je také elučním činidlem. Frakce obsahujícímodifikovaný protein byly identifikovány monitorovánímproteinu při 280 nm a methylpolyethylenglykolu titracísystémem jod/jodid draselný; tyto frakce se sloučí a totál-ně dialyzují proti vodě. Tento produkt byl zkoncentrovánv zařízení Amicon s membránou YM30 /mez propustnosti 30kDa/ na koncentraci 5 mg/ml a zkoncentrovaný roztok bylpotom zfiltrován za sterilních podmínek skrze 0,22/umfiltr a skladován před dalším použitím při teplotě 4 °C. SLS-PAGE-elektroforéza finálního modifikovanéhoproduktu ukazuje, že nzůstal žádný nezreagovaný /^"Met 1,Serl7_7hu G-CSF a že veškerý produkt má vysokomolekulárnícharakter. Titrace retentátů a filtrátů systémem jod/jodiddraselný prokazuje, že opakovaná ultrafiltrace při pH 8,0na membráně YM30 účinně odstranila veškerý methylpolyethy-lenglykol, který není vázán k proteinu. Finální produktobsahuje asi 3,5 molu methylpolyethylenglykolu kovalentněvázaného na protein. Specifická aktivita nemodifikovaného Q · derivátu /0,8 x 10 U/mg/ klesla v modifikovaném produktuo na 0,8 x 10 /10 %/. Produkt je naprosto stabilní a nevy- kazuje žádnou změnu specifické aktivity v roztoku až do10 mg/ml /protein/ při teplotě 37 °C v průběhu 14 dnů.
Referenční přiklad 14 Příprava /“Met“1, Arg11’23, Ser17,27’60’65_7 lidského G-CSFmodifikovaného methylpolyethylglykolem 5000 A. Příprava / Met“1, Arg11’23, Ser17’27’θ°’^^_7hu G-
CSF
Mutagenní templát M13mp18 obsahující gen pro /“Met”1,Arg11, Ser17’27’6°’65_7hu G-CSF byl připraven postupem po-psaným v části /d/ referenčního příkladu 3 s plasmidem pICI1239 nahrazeným pICI 1080. Postup popsaný v referenčním - 152 - příkladu 7 byl opakován za použití výše uvedeného templátus mutagenním oligonukleotidem nazvaným SEQ ID č.38. Tentopostup způsobil změnu kodonu pro Lys v pozici 23 za kodonpro Arg. Dvoušroubovicová FFDNA byla připravena z jednohofágu, obsahujícího žádanou změnu a expresní soubor genůbyl izolován a klonován, jak bylo popsáno v referenčnímpříkladu 15 /viz dále/, čímž byl získán pICI 1388·
Další postup používaný pro získání nadepsané látkyje stejný jako postup uvedený v referenčních příkladech 3a 4. B. Příprava /"Met"1, Arg11 ’23, Ser17’27’’^^_7hu G-CSFmodifikovaného methylpolyethylenglykolem 5000
Roztok /"Met"1, Arg11’23, Ser17’27’60’65_7hu G-CSF/300 mg/ v 0,1 M boritanu sodném, pH 6,0 se zkoncentrujena objem 37,5 ml ultrafiltraci přes membránu Amicon YM1 0/mez propustnosti 10 kDa/. K tomuto roztoku se přidá stej-ný objem 0,8 M boritanu sodného pH 8,8 a potom methylpoly-ethylenglykol-p-nitrofenylkarbonát s přibližnou molekulo-vou hmotností 5000 /Sigma Chemical Company Lfd//1GO ekvi-valentů na jeden mol /"Met"1, Arg11’23, Serl7,27’°^’^^7huG-CSF/ rozpuštěný ve vodě /75 ml/. Reakce se provádí přiteplotě 20 °C za mírného míchání po dobu 3 hodin, načež seukončí přidáním 1 M ethanolaminhydrochloridu pH 8,0 /15 ml,10 ekvivalentů na jeden mol aktivního methylpolyethylen-glykolu/. Reakční směs se zředí na objem 500 ml 0,1 M hy-drogenuhličitanem amonným pH 3,0, načež se diafiltrujeproti 10 litrům stejného pufru za použití spirálového pa-tronového systému Amicon CH2A-IS vybaveného membránouS1Y30 /mez propustnosti 30 kDa/ až do okamžiku, kdy v re-tentátu již není viditelné žluté zbarvení p-nitrofenolu.
Retentát se zkoncentruje na objem 300 ml a umístíse do míchané cely Amicon 8400 vybavené membránou YM30/mez propustnosti 30 kDa/. Retentát se zkoncentruje naobjem 50 ml a opětovně zředí na objem 300 ml 0,1 M hydro- 153 genuhličitaném amonným pH 8,0. Tento postup se opakuječtyřikrát a produkt se nakonec zkoncentruje na objem asi25 ml. Koncentrovaný roztok produktu se potom chromatogra-fuje na sloupci /5 x 90 vm/ Ultrogelu AcA54 v rovnovázes 10 mtó fosforečnanu sodného, 150 mM chloridu sodného, pH7,1 s obsahem 1 mg/ml azidu sodného /PBS-azid/. Frakceobsahující modifikovaný protein byly identifikovány moni-torováním proteinu při 280 nm a methylpolyethylenglykolutitrací systémem jod/jodid draselný /CR Acad. Sci., Paříž274, 1617, 1972/; tyto frakce se sloučí a totálně dialyzu-jí proti vodě. Finální produkt se zkoncentruje ultrafil-trací na membráně Amicon YM30 na koncentraci vyšší než 11,5 mg/ml, zfiltruje skrze 0,22/um filtr za sterilníchpodmínek a skladuje před dalším použitím při teplotě 4 °C. SDS-PAGE-elektroforéza modifikovaného produktu uká-zala, že nezbyl žádný nezreagovaný /~Met-1, Arg11’^,
Ser1?’27>65_7hu G-CSF a že veškerý produkt se při elek-troforáze nachází ve vysokomolekulárním pruhu. Titracefiltrátů a retentátů systémem jod/jodid draselný ukázala,že opakovanou diafiltraci při pH 8,0 došlo na membráněYM30 k účinnému odstraněni veškerého methylpolyethylen-glykolu, který nebyl vázán na protein.
Finální produkt obsahoval asi 3,5 molu methylpoly-ethylenglykolu kovalentně vázaného na protein. Specifická
Q aktivita nemodifikovaného derivátu /2,5 x 107U/mg/ klesla
Q u modifikovaného derivátu na 3,5 x 10 U/mg /14 %/· Získa-ný produkt byl naprosto stabilní a nevykazoval změnu spe-cifické aktivity v roztoku až do 10 mg/ml /protein/ přiteplotě 37 °C po dobu 14 dnů.
Referenční příklad 15 Příprava /""Met 1, Glu1^, Ala^0’^, Ser1?’^?, Arg^_7lids-kého G-CSF modifikovaného methylpolyethylenglykolem 5000A/ Příprava > Glu1^, Ser1?, Ala^’2®, Arg^_7hu - 154 -
Mutagenní templét M13mp18 obsahující gen pro zfMet-1,Glu1^, Ser17’27, Ala2^’2®, Lys3^_7hu G-CSF byl připravenpostupem popsaným v části /d/ referenčního příkladu 3,kdy plasmid pICI1266 byl nahražen plasmidem pICI1080.
Postup popsaný v referenčním přikladu 7 byl opakován zapoužití výše uvedeného templétu s mutagenním oligonukleo-tidem označeným jako SEQ ID č.37. Tím došlo ke změně ko-donu pro Lys v pozici 30 za kodon pro Arg. Dvoušroubovi-cová RF DNA byla připravena z jednoho fágu, který obsaho-val požadované změny. Expresivní soubor genů EcoRI-SalIbyl izolován a klonován do pICI 0080 postupem popsanýmv referenčním příkladu 11, čimž byl získán pICI 1343.
Další zpracování za účelem získání nadepsané slou-čeniny bylo provedeno postupem popsaným v referenčním pří-kladu 7 a purifikace byla provedena postupem popsaným vreferenčním příkladu 8. B/ Příprava /“Met"1, Glu15, Ala26’28, Ser17’27, Arg3°_7huG-CSF modifikovaného methylpolyethylenglykolem
Tento produkt byl připraven postupem popsaným v re-ferenčním příkladu 14. Finální produkt obsahoval 4 molymethylpolyethylenglykolu kovalentně vázaného na jeden molproteinu. Specifická aktivita nemodifikovaného derivátu/0,9 x 1 U/mg/ klesla u modifikovaného produktu na 0,6 x g 10 U/mg /7 %/. Získaný produkt byl naprosto stabilní anevykazoval žádnou změnu specifické aktivity v roztokuaž do 10 mg/ml /protein/ při teplotě 37 °C po dobu 14 dnů.
Referenční příklad 16 Příprava /~~Met~1 , Ser17’27’115’118, Glu111_7 lidskéhoG-CSF modifikovaného methylpolyethylenglykolem 5000
A/ Příprava /"Met“1, Ser17’27’115’116, Glu111_7lidskéhoG-CSF
-Λ?» A L(‘Zí·-. - 155 -
Opakuje se postup popsaný v referenčním příkladu7 za použití mutagenního templátu M13mp18 obsahujícíhogen pro / Met”1, Serl7,27_7 G-CSF popsaný v referenčnímpříkladu 3 nebo 5. Použitý mutagenní oligonukleotid jeoznačen jako SEQ ID 30 /bude definován dále/.
Triplet GCT slouží ke konverzi Thr v pozici 116na Ser, triplet AGA slouží ke konverzi Thr v pozici 115na Ser a triplet TTC slouží ke konverzi Ala v pozici 111na Glu. Použije se mutagenezní postup, který je v podsta-tě popsán v referenčním příkladu 7 a expresivní souborgenů se transferuje do expresivního plasmidu za vznikupICI 1243· Fermentace a purifikace byly provedeny postupypopsanými v referenčních příkladech 3 a 4. B/ Příprava /“Met”1, Ser17’27’115’116, Glu111 7hu G-CSFy modifikovaného methylopolethylenglykolem 5000
Tento produkt byl připraven postupem popsaným v re-ferenčním příkladu 14. Finální produkt obsahoval asi 4moly methylpolyethylenglykolu kovalentně vázaného na mol proteinu. Specifická aktivita modifikovaného derivátu /0,7
9 S x 10 U/mg/ klesla u modifikovaného produktu na 0,8 x10U/mg /11 %/. Získaný produkt byl naprosto stabilní a nevy-kazoval žádnou změnu specifické aktivity v roztoku až do10 mg/ml /protein/ při teplotě 37 0 po dobu 14 dnů.
Referenční přiklad 17 Příprava /"Met”1, Arg11’1^^, Ser17’27, Lys^®_7hu G-CSFmodifikovaného methylpolyethylenglykolem 5000
A/ Příprava /""Met”1, Arg11 , Ser17’27, Lys^, Arg1^^_7lidského G-CSF
Opakuje se postup popsaný v referenčním příkladu. m 7 za použití mutagenního teplátu Ml 3mp1 8 obsahujícího genpro / Met”1, Serl7,27_7 G-CSF popsaný v referenčních pří- - 156 - kladech 3 a 5< Použité mutagenní oligonukleotidy jsouoznačeny jako SEQ ID č.28, SEQ ID č.31 a SSQ ID č.32 /bu-dou definovány dále/.
Triplet TTT v SEQ ID č.31 slouží ke konverzi Trpv pozici 58 na Lys, zatímco v SEQ ID č.32 druhý tripletGCG slouží ke konverzi Tyr v pozici 165 na Arg.
Mutagenezní postup byl zpočátku prováděn jako"double priming" experiment za použití SSQ ID č.31 a SEQID č.32 jako mutagenních oligonukleotidů, jak je to po-psáno v referenčním příkladu 6. Získají se dva plaky,přičemž oba mají změnu SEQ ID č.32 /Tyr 165 Arg/, avšaknemají změnu SEQ ID č.31· Jednovláknová DNA byla připra-vena z jednoho z těchto plaků postupem popsaným v referenč-ním příkladu 3· Tato DNA byla použita jako mutagenní tem-plát v "double priming" mutagenezi za použití SEQ ID Č.28a SEQ ID č.31 jako mutagenních primeru. Získají se dvaplaky, přičemž oba tyto plaky mají kompletní soubor změna expresivní soubor byl transferován do expresivního plas-midu za vzniku pICI 1246. Fermentace a purifikace byly pro-vedeny postupy popsanými v referenčních příkladech 3 a 4. B/ Příprava /“Met~1, Arg11’165, Ser17’27, Lys58_7hu G-CSFmodifikovaného methylpolyethylenglykolem 5000
Tento produkt byl připraven postupem popsaným vreferenčním příkladu 14. Finální produkt obsahoval asi 4,5 molu methylpolyethylenglykolu kovalentně vázaného namol proteinu. Specifická aktivita nemodifikovaného deri-vátu /0,8 x 1 O^U/mg/ klesla u modifikovaného produktu na0,1 x 109 U/mg /13 %/· Získaný produkt by naprosto stálýa nevykazoval žádnou změnu specifické aktivity v roztokuaž do 10 mg/ml /protein/ při teplotě 37 °C po dobu 14 dnů.
Referenční přiklad 18 Příprava /“Met"1, Ser17’27, Ala44’51’55, Lys49,58_7 lids-kého G-CSF modifikovaného methylpolyethylenglykolem 5000 157
A/ Příprava /fMet"1 , Ser17’27, Ala44’91’99, Lys49,98_7lidského G-CSF
Opakuje se postup popsaný v referenčním příkladu7 za použití mutagenního templátu M13mp18 obsahujícího příkladu 3 nebo 5· Použité oligonukleotidy jsou označenyjako SSQ ID č.35 a SSQ ID č.36 /budou definovány déle/. V SSQ ID č.35 triplety AGC slouží ke konverzi Gly na Alav pozici 51 a Pro na Ala v pozici 44 a triplet TTT sloužíke konverzi Leu na Lys v pozici 49. V SSQ ID Č.36 tripletTTT slouží ke konverzi Trp na Lys v pozici 58 a druhý tri-plet AGC slouží ke konverzi Gly na Aln v pozici 55»
Mutageneze byla provedena jako double primingexperiment popsaný v referenčním příkladu 6. Bylo získáno16 plaků. Osm plaků bylo screenováno DNA sekvenací postu-pem popsaným v referenčním příkladu 7. Všechny plaky mělyzměny SSQ ID č.36 /Gly 55 Ala, Trp 58 Lys/, avšak nemělyzměny SSQ ID č.35· Jednovláknová DNA byla připravena zjednoho z těchto plaků postupem popsaným v referenčnímpříkladu 3/d/ a použita jako mutagenní templát při singlepriming mutagenezi za použití SEQ ID č.35 jako mutagennhopromeru. Tento poskytuje 50 plaků, přičemž 3 z těchto pla-ků byly screenovány DNA sekvenací a dva z nich měly kompltní soubor změn. Tento expresivní soubor genů byl tranfero-ván do expresivního plasmidu za vzniku pICI 1297. Fermen-tace a purifikace byly provedeny postupy popsanými v refe-renčních příkladech 3 a 4. B/ Příprava /“Met"1, Ser17»27, Ala44’51’55, Lys49,98_7huG-CSF modifikovaného methylpolyethylenglykolem 5000
Tento produkt byl připravem popsaným postupem v re-ferenčním příkladu 14. Finální produkt obsahoval asi 3,5molu methylpolyethylenglykolu kovalentně vázaného na molproteinu. Specifická aktivita nemodifikovaného derivátu/0,75 x 1 O9 U/mg/ klesla u modifikovaného produktu na 158 -
Q 0,32 x 107 U/mg /47 %/. Získaný produkt byl naprosto sta-bilní a nevykazoval žádnou změnu specifické aktivity vroztoku až do 10 mg/ml /protein/ při teplotě 37 °C po dobu14 dnů.
Referenční přiklad 19
Příprava /“Met“1, Arg11’16, Ser17’27’60,6^_7lidského G-CSF modifikovaného methylpolyethylenglykolem 5000A/ Příprava /“Met-1, Arg11’16, Ser17’27’63’6^_7 hu G-CSF
Opakuje se postup popsaný v referenčním příkladu14 za použití oligonukleotidu označeného jako SEQ IDč.42, který zde nahradil oligonukleotid SEQ ID č.38 /uve-dený nukleotid slouží ke konverzi kodonu pro Lys v pozici16 na Arg/,za vzniku pICI 1387.
Další zpracování za účelem získání /“Met“1, Arg11*1^,Ser17’27’60’65_7hu G-CSF a purifikace této sloučeniny by-ly provedeny postupy popsanými v referenčních příkladech3 a 4. B/ Příprava /“Met 1, Arg11’1^, Ser17’27’^^_7hu G-CSFmodifikovaného methylpolyethylenglykolem 5000
Tento protein se vyloučí při totální dialýze protivodě v průběhu finálního stupně purifikačního postupu po-psaného v referenčním příkladu 4. Precipitát se opětovněrozpustí v 0,1 M boritanu sodném pH 8,0 a modifikuje me-thylpolyethylenglykolem 5000 postupem popsaným v referenč-ním příkladu 14. Finální produkt obsahoval 3,5 molu methyl-polyethylenglykolu kovalentně vázaného na mol proteinu.Specifická aktivita nemodifikovaného derivátu /2,3 x 10^
Q U/mg/ klesla u modifikovaného produktu na 3,6 x 10 U/mg/16 %/. Získaný produkt byl naprosto stabilní a nevykazo-val žádnou změnu specifické aktivity v roztoku až do 10mg/ml /protein/ při teplotě 37 °C po dobu 14 dnů. 159 -
Referenční příklad 20
Příprava /fMet"1, Arg11,34, Ser17’27’60’65_7 lidského G-CSF modifikovaného methylpolyethylenglykolem 5000A/ Příprava /""Met"1, Arg11’34, Ser17’27 ’ hu G-CSF
Opakuje se postup popsaný v referenčním příkladu14 za použití oligonukleotidu označeného jako S£Q ID č.39,který zde nahradil oligonukleotid SEQ ID č.38· Uvedený oli-gonukleotid slouží ke konverzi kodonu pro Lys v pozici 34za Arg za vzniku pICI1389.
Další zpracování za účelem získání nadepsané slou-čeniny a purifikace této sloučeniny byly provedeny postu-py popsanými v referenčních příkladech 3 a 4. B/ Příprava /fmet"1 , Arg11’34, Ser17’27’60’č5_7 hu G-CSFmodifikovaného methylpolyethylenglykolem 5000
Tento produkt byl připraven postupem popsaným v re-ferenčním příkladu 14. Finální produkt obsahoval asi 4moly methylpolyethylenglykolu kovalentnš vázaného na molproteinu. Specifická aktivita nemodifikovaného derivátu
Q /1,4 x 10 U/mg/ klesla umodifikováného produktu na 2,0
Q x 10 U/mg /14 %/. Získaný produkt byl naprosto stabilnía nevykazoval žádnou změnu specifické aktivity v roztokuaž do 10 mg/ml /protein/ při teplotě 37 °C po dobu 14 dnů.
Referenční příklad 21
Příprava /”Met”1, Arg11’4^, Ser17’27’’^^_7 lidského G-CSF modifikovaného methylpolyethyleglykolem 5000A/ Příprava f~Met”1, Arg11’4^, Ser17,27hu G-CSF
Opakuje se postup popsaný v referenčním příkladu14 za použití oligonukleotidu SEQ ID č.40, který zde na- 160 hrázuje oligonukleotid SZQ ID č.38. Uvedený oligonukleo-tid slouží ke konverzi kodonu pro Lys v pozici 40 na Argza vzniku pICI 1390.
Další zpracování za účelem získání nadepsané slou-čeniny a purifikace této sloučeniny byly provedeny postu-py popsanými v referenčních příkladech 3 a 4. B/ Příprava /“Met-1, Arg11’40, Ser17’27’60’65_7 hu G-CSFmodifikovaného methyl polyethylenglykolem 5000
Tento produkt byl připraven postupem popsaným v re-ferenčním příkladu 14· Finální produkt obsahoval asi 4moly methylpolyethylenglykolu kovalentně vázaného na mol proteinu. Specifická aktivita nemodifikovaného derivátuq /1,3 x 10 U/mg/ klesla u modifikovaného produktu na 3,0 xθ 1 0 U/mg /23 %/. Získaný produkt byl naprosto stabilní anevykazoval žádnou změnu specifické aktivity v roztokuaž do 13 mg/ml /protein/ při teplotě 37 °C po dobu 14 dnu.
Referenční příklad 22 Příprava /""Met 1, Ala1, Thr\ Tyr4, Arg^’11, Ser1?’2?>60ylidského G-CSF modifikovaného methylpolyethylenglykolem5000
A/ Příprava / Met-1, Ala1, Thr\ Tyr4, Arg^’11, Ser1^hu G-CSF
Opakuje se postup popsaný v referenčním příkladu14 za použití oligonukleotidu SSQ ID č.41, který zde na-hradil oligonukleotid č.38 a který zde slouží ke konverzikodonu pro Thr, Leu, Gly a Pro v pozicích 1, 3, 4 a 5 naAla, Thr, Tyr resp. Arg za vzniku pICI 1391· Polypeptidpodle tohoto příkladu ilustruje, že modifikace podle vy-nález může být použita pro polypeptid, o kterém je známo,že má G-CSF aktivitu, za účelem zlepšení stability v roz- 161 toku uvedeného polypeptidu. Známým polypeptidem je /""Met 1 ,Ala1, Thr\ Tyr^, Arg^, Ser1^_7hu G-CSF, který je popsánv evropském patentu 272,703 /Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd./.
Ealší zpracování za účelem získání nadepsané slou-čeniny a purifikace byly provedeny postupy popsanými vreferenčních příkladech 3 a 4. B/ Příprava /""Met-1 , Ala1, THr^, Tyr^, Arg^, Ser1>60,657hu G-CSF modifikovaného methylpolyethylenglykolem 5000
Tento produkt byl připraven postupem popsaným v re-ferenčním příkladu 14· Finální produkt obsahoval asi 4moly polyethylenglykolu kovalentně vázaného na mol protei-nu. Specifická aktivita nemodifikovaného derivátu /1,5 x 9 8 107 U/mg/ klesla u modifikovaného produktu na 2,0 x 10U/mg /14 %/. Získaný produkt byl naprosto stabilní a ne-vykazoval žádné změny specifické aktivity v roztoku až do10 mg/ml /protein/ při teplotě 37 °C po dobu 14 dnů.
Referenční příklad 23 Příprava /""Met-1, Arg11 , Ser1^’2^’^0,^5_7 lidského G-CSFmodifikovaného methyl polyethylenglykolem 2000 a/ Příprava methylpolyethylenglykol-p-nitrofenylkarbonétus přibližnou molekulovou hmotností 2000 K roztoku p-nitrofenylchlorformiátu /2,32 g, 11,5mmolu/ v acetonitrilu /250 ml/o teplotě 0 až 5 °C se zamíchání přidá methylpolyethylenglykol se střední moleku-lovou hmotností 2000 /Sigma Chemical Co.Lzd.; 20 g, 10mmolo/ a potom ještě po kapkách triethylamin /1,11 g; 1,53ml, 11 molu/. Směs se potom nechá ohřát na pokojovou te-plotu a míchá se po dobu 24 hodin při teplotě 20 °C. Vy-loučený triethylamoniumchlorid se oddělí filtrací /0,46 gz teoretického množství 1,375 g/ a filtrát se po zředění 162 1 litrem diethyletheru /bezvodého/ nechá stát při teplotě0 až 5 °C po dobu 24 hodin. Bílá sraženina se izoluje fil-trací a opětovně vysráží rozpuštěním v minimálním objemuethanolu při teplotě 35 až 40 °C a ochlazením na teplotu0 °C. Tento produkt se přesráží ze směsi acetonitrilu adiethyletheru v objemovém poměru 1:5 za vzniku finálníhoproduktu, který se promyje etherem a vysuší za vakua, při-čemž se získá 15»5 g bílého pevného produktu. Elementárnímikroanalýza: 53,5 % C, 9,1 % H, 0,4 % N a 0 % Cl, což prokazuje nepřítomnost chlorformiátu ve finálním produktu. b/ Příprava /~*Met-1 , Arg11, Ser17’27,6^7 hu G-CSF mo-difikovaného methylopolyethylenglykolem 2000
Roztok /"Met”1, Arg11, Ser17’27’60’65_7hu G-CSF/1,5 g/ v PBS-azidu /300 ml, 5 mg/ml/ se dialyzuje proti0,4 M boritanu sodnému pH 8,8 /7 x 7 1/ na finální objem375 ml /4 mg/ml/. K tomuto roztoku se za míchání a pokapkách přidá vodný roztok /375 ml/ methylpolyethylengly-kol-p-nitrofenylkarbonátu s přibližnou molekulovou hmot-ností 2000 /10,0 g, 60 ekvivalentu, 12 ekvivalentů na jed-nu aminovou skupinu v / Met-1, Arg11, Ser17,27’^^’^5_7huG-CSF/. Reakce se provádí po dobu 3 hodin při pokojovéteplotě za mírného mícháni a ukončí přídavkem, provedenýmpo kapkách, ethanolaminhydrochloridu, pH 8,0 /10 ekviva-lentů na mol aktivního methylpolyethylenglykolu/.
Reakční směs se zahustí na membráně YM10 v míchanécele Amicon /mez propustnosti 10 kLa/ při teplotě 4 °C nafinální objem retentátu 50 ml. Tento retentát se zředí 0,1M hydrogenuhličitanem amonným pH 8,0 /450 ml/ a opětovnězahustí na předešlý objem 50 ml. Tato operace se opakujesedmkrát. Finální koncentrát se zavede do druhé míchanécely Amicon s membránou YM30 /mez propustnosti 30 kLa/,zředí na objem 500 ml a zahustí na objem 50 ml. Tento po-stup se opakuje dvakrát a produkt se zahustí na finálníobjem 50 ml. Zahuštěný roztok produktu se chromatografujeve dvou stejných porcích na sloupci /5 x 90 cm/ Ultrogelu - 163 -
AcA54 v rovnováze s P3S-azidem.
Frakce obsahující modifikovaný protein byly identi-fikovány monotorovéním proteinu při 280 nm a methylpoly-ethylenglykolu titrací systémem jod/jodid draselný /C.R.
Acad. Sci. Paříž 274, 1617, 1972/; tyto frakce se sloučía totálně dialyzují proti vodě. Finální vodný roztok sezahustí v míchané cele Amicon s membránou ΪΜ3θ na objem50 ml. Tento koncentrát se zředí vodou na objem 500 ml,opět zahustí a tento postup se opakuje pětkrát. Finálníkoncentrát se zfiltruje skrze 0,22/um filtr za sterilníchpodmínek a skladuje před dalším použitím při teplotě 4 °C.
Vyhodnocení proteinu aminokyselinovou analýzou pokyselé hydrolýze prokazuje celkový obsah 47 % /f~Met_1 ,
Arg11, 3er17*27>60,65_7hu G-CSF ve finálním modifikovanémproduktu. Elektroforéza SDS-PAGE reakční směsi po 3 hodi-nách a finálního vodného roztoku produktu ukazuje, že ne-zůstal žádný nezreagovaný protein a že veškerý produktse nachází ve vysokomolekulárním pruhu.
Titrace filtrátů a retentátů systémem jod/jodiddraselný ukázala, že opakovaná ultrafiltrace na membráněYM30 odstranila v podstatě všechen methylpolyethylenglykolnevázaný na protein. To bylo potvrzeno chromatografickouanalýzou HPLC na rpC4 /Dynamax 3θΟΑ 12/um/, při kterébylo použito eluce s gradientem 40 až 90 % acetonitrilu-0,1 % TFA ve vodě-0,1 % TFA, a monitorování UV absorpcepři 280 nm, při kterém byl detekován jediný pík. Frakcebyly zlyofilizovány, rekonstituovány vodou a monitoroványna protein při 280 nm a na polyethylenglykol titrací systé-mem jod/jodid draselný, přičemž byl detekován jeden koinci-dentní pík. Jakýkoliv zbytkový methylpolyethylenglykolnevázaný na protein by jinak byl detekován jako zřetelněoddělený preeluovaný pozitivní pík.
Titrace jod/jodid draselný / Met”1, Arg11 , Ser1?’^ >^0,657 hu G-CSF kovalentně vázaného na methylpolyethylenglykol 2000 poskytla neurčité výsledky a neumožnila tedy provést vyhodnocení poměrů PEG:protein. Specifická aktivita nemo- - 164 -
Q difikovaného derivátu /1,2 x 10 u/mg/ klesla u modifiko-
O váného produktu na 1,5 x 10 U/mg /13 £/. Získaný produktbyl naprosto stabilní a nevykazoval žádnou změnu specific-ké aktivity v PBS roztoku až do 1 0 mg/ml /protein/ přiteplotě 37 °C po dobu 14 dnů.
Referenční přiklad 24 Příprava /“Met"1, Arg11, Ser17’27’63’65_7 lidského G-CSFmodifikovaného methylpolyethylenglykolem 750 a/ Příprava methylpolyethylenglykol-p-nitrofenylkarbonátus přibližnou molekulovou hmotností 750 K roztoku p-nitrofenylchlorformiátu /5,1 g, 25,3mmolu/ a cetonitrilu /50 ml/ při teplotě 0 až 5 °C se zamíchání přidá methylopolyethylenglykol se střední moleku-lovou hmotnostní 750 /Sigma Chemical Co. Ltd; 20 g, 26,67mmolu/ a potom po kapkách v průběhu 30 minut triethylamin/2,69 g, 3,71 ml, 26,63 mmolu/. Reakční směs se nechá ohřátna pokojovou teplotu a míchá po dobu 8 hodin. Vyloučenýtriethylamoniumhydrochlorid se odstraní filtrací z reakč-ní směsi a filtrát se zředí diethyletherem /bezvodým; 1 1/,ochlazeným na teplotu 0 °C po dobu čtyř hodin a opětovnězfiltruje. Celkem se izoluje 3,4 g triethylamoniumhydro-chloridu. Filtrát se odpaří za sníženého tlaku a vysušíza vakua, přičemž se získá 23,5 g žlutého voskovitého pro-duktu .
Elementární mikroanalýza zjistila nulový obsahchloru, což dokazuje nepřítomnost chlorformiátu ve finál-ním produktu.
Roztok /“Met"1, Arg11, Ser17’27’63’65_7 hu G-CSF/250 mg/ v PBS-azidu /50 ml/ byl dialyzován proti voděa potom proti 0,4 M boritanu sodnému pH δ,8. K finálnímuroztoku /50 ml/ se při pokojové teplotě přidá za míchánia po kapkách vodný roztok /50 ml/ methylpolyethylenglykol- - 165 - p-nitrofenylkarbonátu s přibližnou molekulovou hmotností750 /100 ekvivalentů, 20 ekvivalentů na aminoskupinu v/“í-íet“1, Arg11, Ser17,27’6°’65_7hu G-G-CSF/. Keakční směsse míchá při pokojové teplotě po dobu 3 hodin a reakce sepřeruší přídavkem, provedeným po kapkách, ethanolaminhy-drochloridu pH 8 /10 ekvivalentů na mol aktivního methyl-polyethylenglykolu/. R-Reakční směs se potom zavede do míchané cely Ami-con s membránou YM10 /mez propustnosti 10 kDa/ a zahustí.Koncentrát /25 ml/ se zředí na objem 350 ml 0,1 M hydro-genuhličitanem amonným pH 8 a zahustí na objem přibližně25 ml. Tento postup se opakuje pětkrát. Finální koncentrát - /27 ml/ se chromatografuje na sloupci /5 x 90 cm/ Ultro-gelu Ac54 v rovnováze s PBS-azidem, který rovněž sloužíjako eluční soustava. Frakce obsahující modifikovaný pro-tein byly identifikovány monitorováním proteinu při 280 nma methylpolyethylenglykolu titrací jod/jodid draselný;tyto frakce se sloučí a totálně dialyzují proti vodě. Fi-nální produkt se zahustí v míchané cele Amicon s membránouYM10. Finální koncentrát se za sterilních podmínek zfiltru-je přes 0,2yum litr a skladuje před dalším použitím přiteplotě 4 °C.
Vyhodnocení proteinu aminokyselinovou analýzou pokyselé hydrolýze ukazuje celkový výtěžek asi 80 % /-Met 1,Arg11, Ser17’27,6Q’65_7hu G-CSF ve finálním modifikovanémproduktu. Elektroforéza SDS-PAGE produktu vykazuje jedenostrý pás a ukazuje tedy, že nezůstal žádný nezreagovaný/“Met“1, Arg11, Ser17,27’60,65_7hu G-CSF.
Titrace filtrátů a retentétů systémem jod/jodid dra-selný ukazuje, že opakovaná ultrafiltrace při pH 8 přesmembránu YM10 odstranila v podstatě všechny methylpolyethy-lenglykolové deriváty, které nejsou vázané na protein.Titrace jod/jodid draselný Arg11, Ser17’27 ’ ^77- hu G-CSF kovalentně vázaného na methylpolyethylenglykolposkytla velmi neurčité výsledky a neumožnila tedy vyhodno-tit poměry PEG:protein. Specifická biologická aktivita ne-
- 166 -
Q modifikovaného derivátu /1,2 x 10 U/mg/ klesla u močifi-
O kovaného produktu na 4 x 10 U/mg /33^/· Získaný produktbyl naprosto stabilní a nevykazoval žádnou změnu specific-ké aktivity v PBS-roztoku až do 10 mg/ml /protein/ při te-plotě 37 °C po dobu 14 dnů.
Referenční příklad 25
Charakteristika G-CSF derivátů před modifikací methylpo-lyethylenglykolem
Vodný roztok derivátů z referenčních příkladů 1,3,7, δ a 13 až 24 /koncentrace proteinu asi 1 mg/ml/ bylyzahuštovány na koncentraci alespoň 11 mg/ml proteinu namemráně Amicon YM10 při teplotě 4 °C. Aby se zabránilosrážení v průběhu zahuštováni, bylo pH výchozího roztoku 5,5 nejdříve nastaveno na pH 8,5 přídavkem hydroxidu amon-ného k dosažení finální koncentrace asi 0,25 mlA. Po zahuš-tění kleslo pH roztoku na asi 8,0.
Koncentrace proteinu v roztoku byla nastavena na10 mg/ml /stanovená z 1 mg/ml roztoku poskytující při A£gQhodnotu 1,0/ přídavkem 2é násobně koncentrovaného fosfá-tem pufrovaného fysiologického roztoku. Tento 10 mg/mlroztok derivátu v 10 mlvl fosforečnanu sodném, 150 mM chlo-ridu sodném, pH 7,4 /PBS/ představuje zásobní roztok prostanovení homogenity, identity, biologické aktivity a sta-bility v roztoku prosteinu. v U každého derivátu se ukázalo, že je tvořen alespoň95^ jedinou složkou při elektroforeze SDS-PAGE za redukč-ních a neredukčních podmínek a při vysokotlaké kapalinovéchromatografii s reverzní fázi. Opakovaná aminokyselinováanalýza po kyselé hydrolýze v 6 N HC1 při teplotě 110 °Cposkytla poměry aminokyselin v každém derivátu a přesnézměření koncentrace proteinu v zásobním roztoku. Tato kon-centrace proteinu společně s průměrnou hodnotou titrů bio-stanovení, získaných v alespoň šesti různých dnech, byla - 167 - použita pro stanovení specifické aktivity uvedených deri-vátů. Analýza N-terminálních sekvencí a elektrosprayováhmotová spektrometrická analýza selektovaných derivátůpotvrdila očekávané sekvence a molekulové hmotnosti. Zásobní roztoky G-CSF derivátů modifikovaných me-thylpolyethylenglykolem /referenční příklady 1 , 3, 7, 8a13 až 24/ byly připraveny stejným způsobem za účelem zís-kání dat uvedených v těchto referenčních příkladech.
Referenční příklad 26
Stabilita v roztoku G-CSF a jeho derivátů
Aproximativní ředění zásobního roztoku G-CSF, jehoderivátů a těchto G-CSF derivátů modifikovaných methylpo-lyethylenglykolem ve fosfátem pufrovaném fysiologickémroztoku /PBS/ při teplotě 4 °C, popsaného v referenčnímpříkladu 25 byla testována na stabilitu roztoku. Roztokyo koncentraci 1 mg/ml, 5 mg/ml a někdy 10 mg/ml proteinuv PBS byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 14 dnů.
Tyto roztoky byly v pravidelných intervalech vizuálně kon-trolovány za účelem zjištění příznaků srážení. Po 14 dnechbyl každý roztok odstředěn při 14 000 otáčkách za minutupo dobu 20 minut, supernatant byl odstraněn dekantací areziduální peleta byla opětovně rozpuštěna v PBS obsahu-jícím 1 % /hmotn./obj./ N-lauroylsarkosinu. Celkový obsahproteinu v každém supernatantu a opětovně rozpuštěný pre-cipitá byl vyhodnocen meřením absorbance při 280 nm aobsah monomeru v nemodifikovaném G-CSF a jeho derivátechbyl stanoven vysokotlakou kapalinovou chromatografií sreverzní fází. Získané výsledky byly vyjádřeny v procentechz odpovídajících výsledků získaných pro roztoky na počát-ku inkubace a roztoky s koncentrací 1 mg/ml inkubovanépři teplotě 4 °C po dobu 14 dnů. Rozdíly v celkovém obsahuproteinu a monomeru byly pozorovány pouze u některých zopětovně rozpuštěných pelet. Tímto způsobem může být sta-noven pro každou výchozí koncentraci procentický obsah - 168 - proteinu zůstávající v roztoku v supernatantech. Následující modifikace G-CSF a všech derivátů me-thylpolyethylenglykolem prokazuje úplnou stabilitu v roz-toku až do koncentrace 10 mg/ml, jak to bylo uvedeno vreferenčních příkladech 1, 3, 7, 8a 13 až 24.
Rovněž bylo prokázáno, že specifická aktivita pro-duktu v každém supernatantu po inkubaci je stejná jako vevýchozím roztoku, přičemž nebyly pozorovány žádné rozdílypři elektroforéze SDS-FAGE za redukujících nebo nereduku-jících podmínek.
Referenční přiklad 27
Bio-stanovení
1/ Bio-stanovení G-CSF
Faktor závislosti buněčné linie, Paterson-G-CSF/FDCP-C-/, získaný z Patersonova ústavu v Manchesteru, GB,byl klonován limitujícím ředěním v přítomnosti G-CSF.
G-CSF citlivý klon, označený jako klon EZ, byl použit kestanovení aktivity lidského rekombinovaného G-CSF. 2,5 x103 buněk FDCP-G klonu E7 v 100/Ul RPMI 1640 + 10 % FCSbylo přidáno ke stejnému objemu RPMI 164Ο + 10 % FCS,obsahujícím G-CSF. Každý vzorek G-CSF byl měřen dvakrátve více než 10 ředěních. Konečný objem RPMI 1640 /vizMoore, G.E. a kol., /1967/, JAMA, 199, 519/ + 10 % FCSzárodečné telecí sérum/ v každé jamce mikrotitrační destič-ky /96 jamek/, byl 200/ul. Mikrotitrační destička bylainkubována při teplotě 37 °C v 5# CO2 ve vlhčeném inku-bátoru po dobu 4 dnů. 1,0 /uCi titrovaného thimidinubylo přidáno do každé jamky a inkubováno po dobu 6 hodin.Buňky byly zachyceny na filtr ze skleněných vláken a hla-dina radioaktivity byla stanovena scintilačně. Bylo zjiš-těno, že hladina inkorporovaného triciovaného thymidinuje přímo úměrná množství přítomného G-CSF. Stanovení FDCP-G - 169 - klonu 17 bylo kalibrováno za použití rekombinovaného lids-kého G-CSF, získaného od formy Amershan International s g deklarovanou specifickou aktivitou 10 jednotek/mg bílko-vin.
Aktivita G-CSF vzorků byla stanovena srovnáním seznámou standardní aktivitou.
Jednotky G-CSF aktivity na ml byly vypočteny podlenásledujícího vzorce : Ředění vzorkudávající 50 %
Ředění standardu G-CSFdávající 50 % nejvyšší-ho přírůstku inkorporo—nejvyššího pří-Jx G-CSF
Jednotky/ml aktivity váného 3H-thymidinu růstku inkorpo-rovaného ^H-thy-midinu standardu 2/ Interleukin-2-/IL-2/-bio-stanovení
Interleukin-2 byl testován za účelem stanovení bio-logie é aktivity monitorováním růstu myší IL-2 dependentníbuněčné linie CTL, popsané Robb-em a kol. v J. fixp. Med. 160 1126 1986 s výjimkou, spočívající v tom, že buňky bylyinkubovány s IL-2 po dobu 48 hodin a modulovány ^H-thymi-dinem po dobu 6 až 8 hodin.
3/ Bio-stanovení calcitoninu za použití buněk T47D
Toto bio-stanovení calcitoninu je založeno na prin-cipu, spočívajícím v tom, že buněčná linie T47D rakovinylidského prsu nese receptory spojené adenylat cyklasou procalcitonin /Martin a kol. /1980/ Biochem. Biophys. Res.Commun. 98: 150-156/. Stimulace buněk T47D kalcitoninemmá za následek vytvoření zvýšené intracelulární hladinycyklického AMR, který může být kvantifikován radioimuno-logickým testem. Množství calcitoninu nebo pegylovanéhopolyethylenglykolem modifikovaného/ calcitoninu může býtv neznámých vzorcích kvantifikováno srovnáním se standardní - 170 - křivkou připravenou za použití známých standardních vzor-ků caicitoninu nebo pegylovaného calcitoninu. Při tomto bio-stanovení byly buňky T47D připravenyjako suspenze v seru-prostém mediu nebo ve fosfátem pufro-vaném fyzilogickém roztoku. Tyto buňky byly alikvotoványdo testovacích zkumavek a stimulovány standardním calci-toninem nebo pegylovaným calcitoninem nebo se vzorky obsa-hujícími calcitonin nebo pegylovaný calcitonin v přítom-nosti 10 M isobutylmethylxanthinu po dobu 20 minut. Inku-bace byla přerušena umístěním buněčných suspenzí na lázeňvroucí vody po dobu pěti minut. Buňky byly lýzovány dvěmacykly zmražení-rozmražení v přítomnosti 0,01 % TritonuX-100 a zbytky mrtvých buněk byly sedimentovány odstředě-ním při 10 000 g po dobu 5 minut.
Cyklický AMP byl v supernatantu kvantifikován radio-imunologickým testem za použití komerčně dostupné soupravyTRK432 /Amersham International/. Standardní křivka bylazískána vynesením množství standardního calcitoninu nebopegylovaného calcitoninu proti kvantifikovaným hladinámcyklického AMP. Množství calcitoninu nebo pegylovanéhocalcitoninu v neznámých vzorcích se stanoví interpolací zodpovídající standardní křivky.
Referenční příklad 28 Příprava lidského calcitoninu /hCT/ modifikovaného methyl-polyethylenglykolem 5000
Lyofilizovaný chemicky syntetizovaný hCT byl zís-kán u firmy Cambridge Research Biochemicals, Gadbrook Park,Rudheath, Northwich, Cheshire, GB. Analýza tohoto produk-tu pomocí iontoměnné vysokotlaké kapalinové chromatografiea chromatografie s reverzní fázi poskytly jediný plk. 300 mg tohoto produktu v 75 ml vody bylo modifikováno methylpolyethylenglykolem postupem popsaným v referenčním příkladu 3 s výjimkou spočívající v tom, že na jednu amino- vou skupinu v hCT bylo použito 5 ekvivalentů modifikačního 171 činidla. Reakční směs byla zdiafiltrována pres membránuAmicon YK10 /mez propustnosti 10 kDa/ při teplotě 4 °Cproti 0,1 M hydrogenuhličitanu amonnému pH 8,0 za účelemodstranění nezreagovaného hCT. Retentát byl zahuštěn naobjem 36 ml, načež jeho objem byl zvětšen na 60 ml 50 mMfosforečnanem sodným pH 7,0, obsahujícím 1,7 M síranuamonného. Tento roztok byl chromatografován v pěti 12 mlšaržích na 8 ml fenyl-superosovém sloupci /Pharmacia/LKB/v rovnováze s 50 mM fosforečnanem sodným pH 7,0, obsahují-cím 0,68 M síranu amonného. Volný methylpolyethylenglykolse za těchto podmínek na sloupec nefixuje a je ze sloupcevymýván. hCT modifikovaný methylpolyethylenglykolem se po-tom eluuje za použití 50 mM fosforečnanu sodného pH 7,0.
Eluovaný peptid se dialyzuje do vody za použitídialyzové membrány Spectrapor /mez propustnosti 6 až 8 kDa/a zahustí za použití membrány Amicon YM10 při teplotě 4 °Cna finální koncentraci 11 mg/ml, což bylo stanoveno ami-nokyselinovou analýzou po kyselé hydrolýze. Tento produkt,který obsahoval 1,5 molu methylpolyethylenglykolu kovalent-ně vázaného na mol hCT, si podržel biologickou aktivitua byl prost nemodifikovaného výchozího materiálu.
Referenční přiklad 29 Příprava lidského interleukinu-2 /IL-2/ modifikovanéhomethylpolyethylenglykolem 5 000
Lyofilizovaný rekombinantní lidský IL-2 produkova-ný E.coli byl získán od 3iosource International, KalifornieElektroforézou SDS-PAGE bylo stanoveno, že má více než98.¾ čistotu. Metody pro produkci IL-2 v E.coli a jeho ná-sledná purifikace již byly popsány /Kato a kol., Biochem.Biophys. Res. Commun. 130, 692 /1988/; Liang a kol. Bio-chem J. 229 429 /1985/, Koths a kol. patent US 4569790/1986//. Roztok 211 mg IL-2 ve 30 ml vody byl modifikovánmethylpolyethylenglykolem s přibližnou molekulovou hmotnos- 172 tí 5000 a purifikován postupy popsanými v referenčnímpříkladu 3 za použití 20 ekvivalentů modifikačního činid-la na Aminovou skupinu v IL-2. Finální produkt obsahoval 3,4 molu methylpolyethylenglykolu na mol proteinu a bylprostý nemodifikovaného výchozího produktu. Rovněž si za-choval biologickou aktivitu.
Referenční příklad 30
Konstrukce pICI 0080 a/ Konstrukce pTB357 /také uváděný jako pLB 004/
Plasmid pTB357 využívá reprimovaný faktor, určujícíresistenci k tetracyklinu. Tento faktor se nachází na plas-midu RP4, který se vyskytuje v přírodě. Tento systém re-prese zastavuje expresi tetA genu v nepřítomnosti tetra-cyklinu na rodil od většiny mechanismů resistence protilékům, které mají konstituticní expresi.
Tet lokus byl poprvé zmapován ha RP4> Barthem aGrinterem /J.Mol.Biol. 113, 455-474, 1977/. Bylo zjištěno,že se skládá ze sousedních genů: tetA, strukturální genresistence a tetR, represorový gen a tato oblast bylasekvenována /Klock a kol., J.Bacteriol., 161, 326-332,1985/. Tyto geny jsou umístěny na sousedních fragmentechBglII-Smal a Smal-Snmal. RP4 má jediné místo pro BglII,ale má pět míst pro štěpení Smál /Lanka, Lurz a Furste,Plasmid, 10, 303-307, 1983/. i/ Klonování tetA + tetR genů
Plasmid RP4 je dobře popsán /Datta a kol., J.Bac-teriolog., 108, 1244, 1971/ a je volně dostupný. Pále jeplasmid RP4 uchováván v National Collection of Type Cul-tures, 61 Colindale Avenue, London, NW 5HT pod čísly50078 a 50437. Kmeny S.coli, obsahující tento plasmid,rostly na selektivních kultivačních médiích a plasmidová 173 - LNA byla izolována ve větším měřítku /scale up/ podle me-tody Holmese a Quigleyho /Holmes a Quigley, Anal. Biochem.114, 193-197, 1981/. Byla zbavena bílkovin působením 2,5 Moctanu amonného a znovu vysrážena isopropanolem. Tatoplasmidová DNA byla ošetřena na základě doporučení výrob-ce restrikční endonukleasou BglII. Dále byla částečně na-átěpena Xmal za použití neředěného enzymu a krátké inku-bační doby. Xmal je isoschizomer Smál, který produkuje 4-nukleotidové kohezivní konce v místě štěpení.
Velkorový plasmid pUC8 /Yanisch-Perron, Vieira aMessing, Gene, 33, 103-119, 1985/ byl připraven obdobnýmzpůsobem, přičemž konečná forma byla získána štěpenímBamHI a Xmal. RP4 fragmenty byly klonovány do tohoto vektoru ligací s T4 ligasou při teplotě 12 °C po dobu 16 hodin.Rekombinovaný vektor byl použit k transformaci kompetent-ních buněk E.coli C600 upraveným chloridem vápenatým /Ma-niatis a kol., Cold Spring Harbor Laboratory, 1982/. Kul-tury buněk byly potom vyočkovány na medium selektivní naresistenci vůči tetracyklinu. E.coli CóOO je volně dostupná z mnoha zdrojů, za-hrnujících několik sbírek mikroorganismů jako je E.coliGenetik Stock Centre, Yale Univisity, USA pod číslem GCSC3004. Genotyp E.coli CóOO je K12 thr-1 leuBó thi-1 hsdS1laccYI tonA21 X’supE44· Několik kolonií s touto resistenci bylo testovánona předpokládaný fenotyp /ampicilin a tetracyklin resis-tence, ale ne kanamycin resistence, která je vlastně RP4samotnému/. Kolonie se správnou resistenci byly podrobenyklonovací analýze isolovanou plasmidovou DNA /Holmes aQuigley/. Tyto preparáty byly štěpeny EcoRI a HindlII aanalyzovány gelovou elektroforézou. Velikost klonovanýchinsertů byla stanovena 2,45 kb, což ukazuje na fragmentBglII-Xmal-Xmal z RP4. Klon nesoucí tento fragment, obsa-hující tetA a tetR geny byl označen jako pTB344. 174 ii/ Odstranění tet genu z pAT153
Bylo nezbytné odstranit tet gen z vektorového plas-midu pAT153 před vložením tetA a tetR souboru genů z RP4do převládající genové duplikace, která by mohla být zdro-jem genetické nestability. Tedy tet gen nemůže být účinněpotlačen nepříbuzným etR. Odstranění bylo provedeno iso-lací plasmidové DNA pAT1 53 a jejím štěpením pomocí EcoRIa Aval. Mezi tato místa byl klonován syntetický oligonukleotid se sekvencí SSQ ID č.56: 5' AATTCGCATGCGGATCCATCGATC 3' 3' GCGTACGCCTAGGTAGCTAGAGCC 5 '
Tyto kohezivní konce jsou komplementární s EcoRIa Aval kohezivníini konci a obsahují dále Sphl, 3amHI aClal místa. Po transformaci a selekci byly kolonie testo-vány na ztrátu faktoru určujícího resistenci vůči tetra-cyklinu. Plasmidová DNA z jednoho klonu byla sekvenována,aby se potvrdilo, že obsahuje předpokládanou správnousekvenci. Tento plasmid byl označen pCH!9. iii/ Vložení tetA + tetR genu
TetA a tetR geny byly isolovány z pTB344 na frag-mentu EcoRI-Pstl. Vektor pUC8 byl rozložen působením SspI,protože nese stejný selekční faktor /ampicilin resistence/jako pCH19. Plasmidová DNA pCH19 byla štěpena EcoRI a Pstla potom ligována s 2,45 kb fragmentem, nesoucím tet geny.Vzniklý rekombinovaný plasmid pak byl použit pro transfor-maci buněk E.coli C600 a kultura transformovaných buněkpotom byla selektována na resistenci vůči tetracyklinu.Inserce tet genů byla určena jako náhrada většiny bia genův pCHl9, což by mohlo způsobit ztrátu faktoru ampicilino-vé resistence. Tato ztráta ampicilinové resistence z trans-formovaných buněk byla potvrzena. Několik klonů bylo potom - 175 - použito k izolaci plasmidové DNA, která byla podrobenarestrikční analýze. To potvrdilo, že konstruovaný plasmidměl požadovanou strukturu. Plasmid byl označen pTB351· iv/ Vložení cer sekvence V přírodě se vyskytující plasmid ColSI je velmistabilní v S.coli, zatímco jeho deriváty pBR322 a pAT1 53stabilní v E.coli nejsou. Summers a Sherratt /Cell, 36,1097-1103, 1984/ zjistili, že je to způsobeno tím, že de-riváty neobsahují krátkou /283 bp/ sekvenci zvanou cer,která je přítomna v rodičovském plsmidu. Tato sekvenceobsahuje specifické místo zodpovědné za rozklad plasmido-vých multimerů, které zabraňuje akumulaci těchto multimerůvznikajících homologních rekombinací. Tyto multimerymají zhoubný vliv na proces dělení, který normálně zajiš-tuje stabilní vlastnosti dceřiných plasmidů během bakte-riálního dělení.
Cer sekvence /Summers, D. a kol., MGG,201, 334-338,1985/ byla izolována z plasmidů pKS492 /umožněno D. She-rratem/ jako 289 bp fragment štěpením BamHI a Taql. Plas-mid pTB351 byl izolován jako DNA z dam kmene E.coli, abyse zabránilo blokování jeho Clal místa dam+ methylačnímsystémem. Tato DNA byla štěpena BamHI a Clal /obě tatomísta byla zavedena do syntetického oligonukleotidu prototo klonování/. Cer fragment byl ligován s roštěpenýmvektorem a potom použit k transformaci buněk E.coli C600.Selekce byla provedena na resistenci vůči tetracyklinu.Transformované buňky byly podrobeny klonovací analýze po-mocí restrikční endonukleasy Aval a gelové elektroforézy.Přítomnost dalších zon DNA znamená přírůstek cer fragmentu.Pro potvrzení správné struktury vznikajících plasmidů by-ly prováděny další restrikční analýzy. Jeden z těchto plas-midů byl označen pTB357 /obr.5/ a také byl označen pLBOO4. b/ Plasmid pCHlOl 176
Plasmid pCHIOI odpovídá plasmidu pICI 0020 /vizpříklad 1c/ kromě toho, že fragment ScoRI-SalI /viz obr.l/ · je nahrazen fragmentem, který se skládá z SEQ ID č.50 /viztaké obr.6/ a genové sekvence interferonu alfa2, jak bylopopsáno Edgem M.D. a kol., Nucleic Acids Research 1983,
sv. 11, 6419-6435· 2 tohoto pohledu 3'-koncový kodon ATG SEQ ID Č.50 ihned následuje TGT kodon, který kóduje cystein/aminokyselinu 1/ v sekvenci interferonu alfa2, jak bylopopsáno v již dříve zmíněném odkazu Edge, M.D. a kol.:
Nucleic Acids Research. 5 nukleotidové sekvence GATCCATGa komplementární 3'nukleotidové sekvence GTAC jsou potomvypuštěny z nukleotidové sekvence podle dříve uvedenéhoodkazu. c/ Vložení expresivního souboru genů do pTB357
Expresivní soubor genů skládající se z trp promoto-ru, vazebného místa pro ribosom a genu pro interferonalfa2 byl izolován z plasmidu pCHIOI /viz předcházejícíbod b/ na restrikčním fragmentu EcoRI-SphI. Potom byl li-gován do produkčního vektoru /pTB357/ /viz předcházejícíbod a/ štěpeného také EcoRI a SphI. Tato DNA byla použitak transformaci kompetentních buněk E.coli C600 a po trans-formaci byly izolovány buňky resistentní vůči tetracyklinu.Několik z nich bylo podrobeno analýze klonované DNA zaúčelem zjištění, zda přibylo restrikční místo pro Sstl,které bylo obsaženo na expresivním souboru genů. Klony,které z tohoto hlediska vykazovaly pozitivní výsledek,byly podrobeny restrikční analýze za účelem zjištění, zdapředpokládané složení konstruovaného genu jsou správné. Dále byly klony testovány na schopnost produkovat bílko-vinu interferonu alfa2 za použití elektroforézy na poly-akrylamid-SDS gelu obarveném Coomassie modří. Jeden z klo-nů byl označen pLB035· d/ Vložení T4 terminátoru transkripce do pTB244 177
Sekvence T4 terminátoru transkripce ve formě frag-mentu od Sáli do HindlII /67 bp/ /viz SEQ ID č.48 a obr. 4a/ byla vložena do multiklonovacího místa intermediatuvektoru pTB244 mezi místa Sáli a HindlII, Na potvrzenísložení tohoto konstruovaného genu /pTB244.T4 ter./ bylapoužita klonovací analýza. Z tohoto vektoru byl izolovánfragment Sstl-Sphl, obsahující většinu multiklonovacíhomísta a T4 terminátor. Ty potom byly vloženy do pLB005>štěpeného také Sstl a Sphl, čímž nahradily gen pro inter-feron alfag, ale ponechaly soubor genu zahrnující trp pro-motor. Tento konstruovaný gen byl podroben klonovací ana_lýze a plasmid byl označen pLBO!3· e/ Substituce multiklonovacího místa Přítomnost multiklonovacího místa není v plasmidupBL013 ideální z několika důvodů: Sáli, BamHI a Smál mís-ta nejsou na plasmidu jediná, ale vyskytuje se jich tamněkolik. Tento fragment byl tedy vyštípnut pomocí Ssl aXbal /obě místa jsou na vektoru pouze v jedné kopii/ anahrazen syntetickým oligonukleotidem se sekvencí SEQ IDč.51:
5 ' AGCTCCATATGGTACCAGATCTCTCGAGAGTACTT GGTATACCATGGTCTAGAGAGCTCTCATGAAGATc 5'·
Klony byly analyzovány z hlediska přítomnosti no-vých restrikčních míst a potom byly podrobeny sekvenování.Jeden z takových plasmidů byl označen pL30l4. Nová vloženáklonovací místa jsou: Ndel, KpnI, BglII, Whol a Seal, dálepak Xbal a Sáli, která je následují. f/ Další modifikace
Bylo zjištěno, že sousední místa Ssl a Ndel v pLB114nemohou být pro svojí blízkost štěpena oběma příslušnými 176 - restrikčními endonukleasami ani najednou ani postupně.
Proto byla vložena mezi ně další sekvence. To bylo pro-vedeno štěpením pLB014 pomocí Sstl a KpnI a potom vlože-ním syntetického oligonukleotidu SEQ ID č.52.
5 ' AGCTCAGCTGCAGCATATGGTAC GTCGACGTCGTATAC 5'
Klony byly testovány na přítomnost nových míst PvuIInebo Pstl a byly podrobeny sekvenování. Jeden z těchtoplasmidú byl označen jako pLB015 /=pICI 1080/ /viz obr.7/.Tento plasmid je oproti plasmidú pLB014 účinně štěpen po-mocí Sstl a Ndel. Tím se získalo místo pro vložení různýchsekvencí pro vazebná místa ribosomů, správně umístěná sohledem na polohu trp promotoru po směru replikace a Ndeldále zajištuje to, že ATG iniciační kodon genu bude expri-mován.
Referenční přiklad 31
Konstrukce plasmidú pICI 1295 /také označeného jako pCG300/ a/ Produkce pCG54 z pICH 079 pICI1079 je resistentní vůči ampicilinu, odvozenýod pATI53 a obsahuje následující prvky mezi restrikčnímimísty EcoRI a StylI : i/ CI857 z fágu λ-ii/ A-P^ promotor iii/ syntetická místo pro vazbu ribosomů iv/ syntetickou genovou sekvenci pro interferon alfa2 v/ syntetickou sekvenci pro terminátor transkrip-ce, odvozený z fágu T4 mezi restrikčními mís-ty Sáli a StylI; DNA sekvence pro tento termi- 179 nátor transkripce je uveden na obr.4 a vS2Q ID č.53. pICII079 je znázorněn na obr.8. pICI1079 je na základě Budapeštstké smlouvy V NationalCollection of Industrial and Marině Bacteria Limited/NCIMB/, 23, St. Machar Drive, Aberdeen, AB2 1 RZ, GB/NCIMB č. 40370, datum uložení 19.2.1991/. pCG54 byl kon-struován tak, aby byl vhodným expresním vektorem, obsahu-jícím stejný promotor, sekvence pro vazebné místo riboso-mu a sekvence pro terminátor transkripce, jak bylo uvedenojiž dříve, tj. : Xp^, R3S7 a T4, ale postrádající genovousekvenci kódující produkci specifického proteinu. Taktozkonstruovaný plasmid by mohl zajištovat činnost základ-ního expresního vektoru, obsahujícího nezbytné prvky, umož-nující transkripci a translaci pro produkci požadovanébílkoviny, které by mohly být zavedeny do tohoto vektorunásledujícími klonovacími postupy.
Konstrukce vektoru byla iniciována štěpením pICI1079 restrikčními endonukleasami na místech pro 2coRI aSáli. Při tomto štěpení byl uvolněn fragment vektoru,obsahující základ genového vybavení plasmidu pICI1079 sgeny pro replikaci plasmidu a geny s resistencí proti anti-biotikům a navíc T4 sekvenci pro terminátor transkripce,fragment byl izolován na agarosovem gelu purifikačním kro-kem používajícím metodu Geneclean pro závěrečné vyčištěníDNA fragmentu.
Do tohoto vektorového fragmentu byl zaveden druhýmalý fragment DNA o přibližné velikosti 1,2 kb. Tentodruhý fragment může být získán například syntézou DNA nebobodovou nebo PCR mutagenezí malého restrikčního fragmentuEcoRI-SalI, získaného z pICI1079 popsaného výše. Tentodruhý fragment obsahuje stejný promotor a sekvence proribozomální vazebné místo, jako původní plasmid pICII079a navíc má ScoRI a Sáli místa dostupná na 5 "a 3 "koncíchresp., takže tím zajištuje kompatibilní konce pro ligaci 1 60 fragmentu pICI1079. Výsledkem ligační reakce za přítomnos-ti Gibco-BRL T4 DNA ligasy a příslušného pufru je konstruo-vaný plasmid pCG54.
Klony obsahující tento konstruovaný plasmid bylyizolovány transformací části ligační reakční směsi do kom-petentních buněk E.coli kmene HB101.
Konstruovaný plasmid pCG54 měl velikost 3,682 kba obsahoval nezbytné znaky tak, jak jsou uvedeny na mapězobrazené na obr.9. b/ Produkce pCG6l z pCG54 /také uváděného jako pICI54/
Syntetické oligonukleotidové sekvence byly navrženytak, aby zahrnovaly jak přírodní sekvence pro T7A3 promo-tor, tak i sekvence, které by mohly zajištovat účinnoutranslaci iniciační oblasti, což umožňuje bezchybné klono-vání jakéhokoli polypeptidového genu v jejich sousedství.Jako vhodné sekvence pro oblast jmenovanou na druhém mís-tě byla vybrána RBS1, trp sekvence pro vazbu ribozomu.Proto byly syntetizovány dva komplementární oligonukleo-tidy, označené jako SEQ ID č.54 a SEQ ID č.55, k vytvo-ření kinkeru dvouvláknové DMA, inkorporujícího sekvenceT7A3 promotor a pro RBS1.
Oligonukleotidy byly připraveny jako 84-mery stan-dardní metodou, používající ABI genový syntetizátor. By-ly navrženy tak, aby ve dvouvláknové formě měly syntetickéfragmenty restrikční místa pro endonukleasy EcoRI a KpnIna 5' a 3' koncích. Vzhledem k jejich délce by oligomerynemohly být purifikovény pomocí HPLC a na jejich purifi-kaci byla využita elektroforéza v akrylamidovém geluobsahujícím 10» akrylamid a 7 Í.Í močovinu. Při purifikaci byly oligomery nejdříve podrobenygelové chromatografii nejen kvůli zjištění, zda majísprávnou délku, ale také proto, aby se zjistilo, zda pu-rifikovaná frakce obsahuje převážně požadované oligomery - 181 - ‘ Z-"'·’·"' s požadovanou délkou a zda nemá vysoký obsah kontaminují-cích oligonukleotidú malé velikosti, která vznikají jakovedlejší produkty při syntéze.
Akrylamidové gely byly připraveny standardní meto-dou s persíranem amonným a Ν,Ν,Ν ,N -tetramethylendiami-nem, používaným jako katalyzátor pro polymeraci gelu.
Velikost požadovaných nukleotidu vyžaduje jejichvizualizaci po proběhnutí elektroforázy. Bylo proto nutnéradioaktivní značení vzorků pomocí J ?. To umožňuje odhad-nout kvalitu vzorku po ukončení elektroforézy autoradio-grafií.
Vzorky oligonukleotidú byly dostupné v surová for-mě nefosforylované. Ty pak byly používané pro radioaktiv-ní značení na 5 konci fosforylací za použití enzymu T4 po-lynukleotidkinasy.
Oligomery byly získány po syntéze v nefosforylovanéformě a po purifikaci byl každý oligomer individuálně po-droben fosforylační reakci za účasti AT? na fosforylací z 5 konce každé molekuly v přítomnosti T4 polynukleotidki-nasy /viz Molecular Cloning: A Laboratory Eanual. 2.vyd.,Sambrook, Fritsch a Maniatis, str.5,68-5,71/. Po fosfory-laci byly spojeny dva komplementární oligonukleotidy do-hromady tak, že vytvořily dvoušroubovicovou DNA, obsahují-cí T7A3 promotor a RBS1 sekvence.
Vektorová molekula pCG54 byla štěpena restrikčnímiendonukleasami EcoRI a KpnI. Tím se uvolnil fragment vekto-ru o velikosti 2,3 kb, fragment o velikosti 1,1 kb, obsa-hující A-p^-promotor a RBS1 sekvenci. Tento klonovací krokbyl naplánován proto, aby odstranil λ-p^-RBSI sekvence syn-tetickým fragmentem EcoRI-KpnI, obsahující T7A3-B3S1 sek-venci. Fragment vektoru o velikosti 2,3 kb, získaný přištěpeni pCG54 byl purifikován obvyklým postupem za použitígelové elektroforézy a metody Geneclean pro odstraněníDNA z agarosových fragmentů.
Syntetický fragment FcoRI-KpnI o velikosti 84 bp 182 byl ligován do vektorové molekuly připravené výše a ligo-vané DNA byla použita pro transformaci buněk E.coli HB131.Selekčním markrem pro rekombinované klony byla resistencek ampicilinu. Po transformaci byla vybrána řada koloniíobsahující rekombinantní plasmid pro další testování.
Syntetický fragment o velikosti 84 mer, vložený dovektoru během klonování, byl jako takový nevhodný pro jed-noduché testovací metody restrikční analýzy vzorků rekom-binovaných plasmidových DNA. Inserty malých velikostí ne-jsou viditelné na agarosovém gelu po elektroforéze. Frag-ment sám o sobě oeobsahuje žádné restrikční místo pro endo-nukleasy, které by mohlo být vhodným diagnostickým důka-zem jeho přítomnosti. Testování rekombinantních klonůbylo proto prováděno metodou hybridizace kolonií /vizGrunstein a Hognes, proč. Nati. Acad. Sci., 72, 3961, 1975/· Nitrocelulosové filtry obsahující imobilizovanouplasmidovou DNA z rekombinantních klonů byly hybridizovényproti setu připraveném náhodným radioaktivním značenímspojených syntetických oligonukleotidů SEQ ID č.54 a SEQID č.55. DNA byla značena za pomocí alfa^P-dCTP a inku-bací s Klenowovou polymerasou při teplotě 37 °C po dobu2 hodin.
Rekombinantní kolonie, která vykazovaly pozitivníhybridizační reakci, byly vybrány pro přípravu plasmidovéDNA. Plasmidové DNA byla připravena v každém z případův poměrně velkém množství metodou centrifugace v hustot-ním gradientu chloridu česného, aby byla zajištěna poža-dovaná čistota /viz "Molecular Cloning - A Laboratory Ma-nuál", 2.vyd., Sambrook, Fritsch a Maniatis, Cold SpringHarbor Laboratory, 1989, str. 1,42-1,52. Příprava DNAtouto metodou zajištuje vysokou kvalitu materiálu, vhodné-ho potom pro další klonování a sekvenční analýzu. Všechna plasmidové DNA, izolovaná z rekombinantníchklonů, byla zařazena do druhého výběrového stupně sekvenč-ní analýzy, aby se potvrdilo, že oligonukleotidová sekvence 183 klonovaného spojení samotného fragmentu T7A3-RBS1 je abso-lutně správná. Sekvenovací postup používal Sequenasu a ja-ko sekvenovací primer byl vybrán například pBR322 UP /pBR322 universální primer/. Sekvenovéní bylo prováděno Lange-rovou metodou, využívající terminaci řetězců pomoci dideo-xy-derivatů nukleotidů.
Klony obsahující správné sekvence, byly označenyjako nový expresivní konstruovaný plasmid pCGól, kterýobsahuje T7A3 promotor, RBS1 sekvenci a T4 terminátorovousekvenci /viz obr.10/. c/ Produkce pCG300 /také uváděný jako pICI1295/
Sekvenační a syntetické postupy, využité při kon-strukci analoga G-CSF, /~Ser^’^^_7hu G-CSF jsou popsányv referenčním příkladu 3 /viz obr.3/· Tato sekvence analo-ga byla izolována z konstruovaného plasmidu, ve kterémgen byl inkorporován do plasmidu pSTPI tak, že vznikl pICI1107 /viz příklad 2/. pICI1107 byl štěpen Seal a potombyl velký fragment isolován následující elektroforézou naagarosovém gelu a metodou Geneclean. Tento fragment bylpotom štěpen restrikční endonukleasou Sáli, aby byl získángen /"Met 1 , Ser’^^_7hu G-CSF na fragmentu Scal-Sall,vhodném pro klonování do pCG6l /viz obr.10/.
Po následnérestrikcipomocí Sáli byl žádaný fragmentznovu izolován za použití purifikační techniky na agaroso-vém gelu.
Vektorová molekula pCGól byla štěpena restrikčnímenzymem KpnI. Štěpení tímto enzymem dává 3 přečnívajícíkonec, který byl potom zarovnán použitím enzymu T4 poly-merasy /viz "Molecular Cloning - A Laboratory Manuel", 2.vyd., Sambrook, Fritsch a Maniatis, str. 5.44-5.47. T4polymerasová aktivita byla tepelně inaktivována inkubacípři teplotě 70 °C po dobu 30 minut a LNA byla vysráženaethanolem. Sraženina byla rozpuštěna ve sterilní destilo-vané vodě a rozpuštěná DNA byla štěpena Sáli. Fragment KpnI
184 /nový tupý konec/-SalI byl vysréžen ethanolem a potom pře- čištěn gelovou elektrofořežou a další purifikační techni- kou.
Fragment Scal-Sall /“Met"1, Serl7,27_7hu G-CSF bylpotom ligován na tupý konec vektoru KpnI-SalI. LigovanáDNA byla transformována do F.coli, kmen HB101. Selekce re-kombinantních klonů byla provedena s ohledem na resistencik ampicilinu.
Vyhledávání potenciálních rekombinantních klonůbylo prováděno hybridizací. Radioaktivně značený test bylpřipraven náhodným značením fragmentu EcoRI-SalI /obsahu-jící genovou sekvenci /“Met” , Ser ’ _7hu G-CSF/ připra-vený z plasmidu pICI1107. To bylo použito pro hybridizaciproti koloniím obsahujícím DNA, která byla imobilizovanána povrchu nitrocelulosového filtru. Následně byla plasmi-dová DNA připravena z 24 klonů, které hybridizovaly přitomto testu. Všechna DNA byla připravena rychlou mini-prepmetodou /viz 3irnboim a Doly, Nucleic Acid Research, 7, 1513» 1979/. Tyto rekombinantní DNA byly podrobeny druhémustupni restrikční analýzy. Linearisace DNA pomocí BamHI,které má jediné restrikční místo na expresním souboru genů,je důkazem přítomnosti /f~Met”1 , Serl7,27_7hu G-CSF sekvence.
Sekvenční analýza byla provedena na potvrzení pří-tomnosti /""Met”1 , Ser17,27_7hu G-CSF genu a na ověření,že sekvence baží na klonovacím spojení a všude v / Met 1,Ser17,27_7hu G-CSF genu byla správná. Pro tyto účely vět-ší množství vzorku plasmidové DNA bylo připraveno z 16 re-kombinantních klonů za použití techniky centrifugace vhustotním gradientu chloridu česného. Sekvenční postupybyly prováděny s ohledem na sekvenační postup a jako sekve-nační primer byl vybrán universální primer pBR322 /ScoRI/.Dva z rekombinovaných klonů obsahovaly správnou sekvencina Seal konci fragmentu / Met \ Ser17,27_7hu G-CSF a všudev G-CSF peptidové sekvenci samé. Klony byly identifiková-ny jako expresivní konstruovaný plasmid pCG3'10 /viz obr. 12/. 185 -
Informace
Sekvenční délka: typ: spirála: topologie sekvenční pro sekvenci ID č.1: charakteristiky: 62 nukleové kyselina jednoduchá lineární deskripce: SSQ ID č.1: AATTCAGT ACT CCA CTG GGT CCA GCA AGC TCT CTG CCG CAG TCT TTC 47CTG CTG AAG TGT CTC 62
Informace pro sekvenci ID č.2:
Sekvenční charakteristiky: délka: 64 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SSQ ID č.2: CTG TTC GAG ACA CTT CAG CAG GAA AGA CTG CGG CAG AGA GCT TGC 45TGG ACC CAG TGG AGT ACTG 64
Informace
Sekvenční délka: typ: spirála: topologie sekvenční pro sekvenci ID č.3: charakteristiky: 63 nukleová kyselina jednoduchá lineární deskripce: SSQ ID č.3: GAA CAG GTA CGT AAA ATT CAA GGC GAT GGT GCG GCT CTG CAG GAA 45AAG CTG TGC GCA ACC 60 1 66
Informace pro sekvenci ID Č.4:Sekvenční charakteristiky:délka: 60 typ: spirála: topologie: sekvenční deskripce: nukleová kyselinajednoduchálineárníSEQ ID č.4: TTT GTA GGT TGC CAG CTT TTC CTG CAG AGC CGC ACC ATC GCC 45’ TTG AAT TTT ATG TAC 60
Informace pro sekvenci ID č.5:
Sekvenční charakteristiky: délka: 48 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.5: TAC AAA CTG TGC CAC CCT GAG GAA CTG GTG CTG CTC GGT CAC TCT CTG 46
Informace
Sekvenční délka: tyo: spirála: topologie sekvenční pro sekvenci ID č.6: charakteristiky: 51 nukleová kyselina jednoduchá lineární deskripce: SEQ ID č.6:
CGG GAT CCC CAG AGA GTG ACC GAG CAG CAC CAGGCA CAG TTC CTC AGG GTG 4551 187
Informace pro sekvenci ID č.7:
Sekvenční charakteristiky: délka: 63 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduché topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.7: GGG ATC CCG TGG GCT CCA CTG AGC TCT TGC CCG TCC CAA GCT TTA 45CAA CTG GCA GGC TGC TTG 63
Informace pro sekvenci ID č.8:
Sekvenční charakteristiky: délka: 60 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.8: CTG GCT CAA GCA GCC TGC CAG TTG TAA AGC TTG GGA CGG GCA AGA 45GCT CAG TGG AGC CCA 60
Informace pro sekvenci ID č.9:
Sekvenční charakteristiky: délka: 63 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID Č.9: AGC CAG CTG CAC TCC GGT CTG TTC CTG TAC CAG GGT CTG CTG CAG 45GCT CTA GAA GGC ATC TCT 63 - 188 -
Informace pro sekvenci ID č. 10:
Sekvenční charakteristiky: .délka: 63 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.10: TTC AGG AGA GAT GCC TTC TAG AGC CTG CAG CAG ACC CTG GTA CAG 45CAA CAG ACC GGA GTC CAG 63
Informace pro sekvenci ID č-11 : Sekvenční charakteristiky: délka: 60 tyo: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční. deskripce: SEQ ID č-11:
CCT GAA TTG GGG CCC ACCGAC TTC GCT ACT ACC
CTG GAC ACA CTG CAG CTG
GAC
GTT GCC 45 .60
Informace
Sekvenční délka: typ: spirála: topologie sekvenční pro sekvenci ID č.12: charakteristiky: 63 nukleová kyselina jednoduchá lineární deskripce: SEQ ID č.12: TTG CCA TAT GGT AGT AGC GAA GTC GGC AAC GTC CAG CTG CAG TGT 45GTC CAG GGT GGG CCC CAA 63 - 159 - •Wu-
Informace pro sekvenci ID č· 13
Sekvenční charakteristiky: délka: 63 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.13: ATA TGG CAA CAG ATG GAG GAA CTG GGT ATG GCT CCG GCA CTG CAG 45CCG ACT CAG GGT GCG ATG 63
Informace pro sekvenci ID č,14:
Sekvenční charakteristiky: délka: 60 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č-14: TGC TGG CAT CGC ACC CTG AGT CGG CTG CAG TGC CGG AGC CAT ACC 45CAG TTC CTC CAT CTG 60
Informace pro sekvenci ID č. 1 5: Sekvenční charakteristiky: délka: 60 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: : lineární sekvenční deskripce: SSQIDč.15: CCA GCA TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGG CGC GCA GGC GGT GTT CTG 45GTT GCC TCC CAT CTT 60 - 190 -
Informace pro sekvenci ID č.16:
Sekvenční charakteristiky: délka: 60 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.16: GCT CTG AAG ATG GGA GGC AAC CAG AAC ACC GCC TGC GCG CCG CTG 45GAA AGC AGA GGC GAA 60
Informace pro sekvenci ID č.17:
Sekvenční charakteristiky: délka: 55 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.17: CAG AGC TTC CTC GAG GTG TCT TAC CGC GTT CTG CGT CAC CTG GCC 45CAG CCG TTAG 55
Informace pro sekvenci ID č.18:
Sekvenční charakteristiky: délka: 53 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: jednoduchá sekvenční deskripce: SEQ ID č.18: TCGACTTA CGG CTG GGC CAG GTG ACG CAG AAC GCG GTA AGA CAC CTC 47 GAG GAA 53 -.i·' • - 191 - Informace pro sekvenci ID č.19: sekvenční charakteristiky: délka: 21 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.19: TACAACTGGC AGGCTGCTTG A 2
Informace pro sekvenci ID Č.23:
Sekvenční charakteristiky: délka: 21 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.23:
GACGTTGCCG ACTTCGCTAC T
Informace pro sekvenci ID č.21: Sekvenční charakteristiky: délka: 21 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.21: TGCCGGAGCC ata cccagtt c 21
iOS - 192 -
Informace pro sekvenci ID č.22:
Sekvenční charakteristiky: délka: 21 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.22: GCCTGCCAGT TGTAAAGCTT G 21
Informace
Sekvenční délka: typ: spirála: topologie sekvenční pro sekvenci ID č.23: charakteristiky: 26 nukleová kyselina jednoduchá lineární deskripce: SEQ ID č.23: GCACCATCGC CTTGAATTTT ACGTAG 26
Informace pro sekvenci ID č.24:
Sekvenční charakteristiky: délka: 62 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SSQ ID č.24: AATTCAGT ACT CCA CTG GGT CCA GCA AGC TCT CTG CCG CAG TCT TTC 47CTG CTG AAG TCT CTC 62 1 1 ~s ' ? .0 - 193 - Informace pro sekvenci ID č.22: Sekvenční charakteristiky: délka: 21 ty?·· nukleová kyselina . spirála: jednoduchá topologie: : lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.22: GCCTGCCAGT TGTAAAGCTT G 21
Informace pro sekvenci ID č.23:
Sekvenční charakteristiky: délka: 26 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.23: GCACCATCGC CTTGAATTTT ACGTAG 26
Informace pro sekvenci ID č.24:
Sekvenční charakteristiky: délka: 62 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.24: AATTCAGT ACT CCA CTG GGT CCA GCA AGC TCT CTG CCG CAG TCT TTC 47 CTG CTG AAG TCT CTC 62 194
Informace pro sekvenci ID č.25:Sekvenční charakteristiky: délka: 64 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce; ; SEQ ID č.25: - CTG TTC GAG AGA CTT CAG CAG GAA AGA CTG CGG CAG AGA GCT TGC 45 TGG ACC CAG TGG AGT ACTG 64
Informace pro sekvenci ID č.26:
Sekvenční charakteristiky: délka: 60 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.26: GAA CAG GTA CGT AAA ATT CAA GGT GCG GCT CTG CAG GAA 45 AAG CTG TGC GCA ACC 60 -
Informace
Sekvenční délka: typ: spirála: topologie sekvenční pro sekvenci ID č.27 charakteristiky: 60 nukleová kyselina jednoduchá lineární deskripce: SEQ ID č.27 TTT GTA GGT TGC GCA CAG CTT TTC CTG CAG AGC CGC ACC GCT GCC 45TTG AAT TTT ACG TAC 60
195 -
Informace pro sekvenci ID č.28:Sekvenční charakteristiky: délka: typ: spirála: topologie: sekvenční deskripce: 29 nukleová kyselinajednoduchálineárníSEQ ID č.28:
CTT CAG CAG GAA AGA ACG CGG CAG AGA GC
Informace pro sekvenci ID č.29Sekvenční charakteristiky: délka: typ: spirála: topologie: sekvenční deskripce:
GC TTG GGA AGA GCA AGA 33 nukleová kyselinajednoduchálineárníSEQ ID č.29:
GCT CAG AGA AGC CCA C
Informace pro sekvenci ID č.30
Sekvenční charakteristiky: délka: 40 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.30:
CTG TTG CCA TAT GCT AGA AGC GAA GTC TTC AAG GTC CAG C 29 33 40 - 196 -
Informace pro sekvenci ID č.31:
Sekvenční charakteristiky: délka: 27 typ· nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č-31:
GCT CAG TGG AGC TTT CGG GAT CCC CAG 27
Informace pro sekvenci ID č.32:
Sekvenční charakteristiky: délka: 27 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.32: 27
ACG CAG AAC GCG GCG AGA CAC CTC GAG
Informace pro sekvenci ID č.33: Sekvenční charakteristiky: délka: 29 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: : lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.33:
G TTC GAG AGA CTT TTC CAG GAA AGA CTG C 29 - 197 -
Informace pro sekvenci ID č.34Sekvenční charakteristiky: délka: typ: spirála: topologie: sekvenční deskripce: 33 nukleová kyselinajednoduchálineárníSEQ ID č.34:
C CTG CAG TTT CGC AGC GCT AGC TTG AAT TTT AC 33
Informace pro sekvenci ID č.35:Sekvenční charakteristiky: délka: typ: spirála: topoloie: sekvenční deskripce: 37 nukleová kyselinajednoduchálineárníSEQ ID č.35:
CAG AGA GTG AGC GAG CTT CAC CAG TTC CTC AGC GTG G 37
Informace pro sekvenci ID č.36: Sekvenční charakteristiky: délka: 29 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.36:
GCT CAG TGG AGC TTT CGG GAT AGC CAG AG 29 ·Λλ·Λι·Λ' ,ΛΖ,νν. 198 -
Informace pro sekvenci ΙΌ δ.37:
Sekvenční charakteristiky: délka: 30 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.37: CAG CTT TTC CTG CAG ACG CGC AGC GCT AGC 30
Informace pro sekvenci ID č.38: Sekvenční charakteristiky: délka: 29 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: : lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.38:
CC GCT GCC TTG AAT ACG ACG TAC CTG TTC 29 ; \ % i i
Informace pro sekvenci ID č.39: Sekvenční charakteristiky: délka: 30 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: : lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.39: j; §
GGT TGC GCA CAG ACG TTC CTG CAG AGC CGC 30 - 199 -
Informace pro sekvenci ID č.40: Sekvenční charakteristiky: délka: 29 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SSQ ID č.43:
G GTG GCA CAG ACG GTA GGT TGC GCA
CAG C 29
Informace pro sekvenci ID č.4-1 :Sekvenční charakteristiky: délka: typ: spirála: topologie: sekvenční deskripce: 45 nukleová kyselinajednoduchálineárníSSQ ID č- 41:
CG CGG CAG AGA GCT TGC
ACG GTA GGT TGG AGG CAT TGTCGATACC 45
Informace pro sekvenci ID č.42: Sekvenční charakteristiky: délka: 31 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.42:
G TAC CTG TTC GAG AGA ACG CAG CAG GAA AGA 31 203
Informace
Sekvenční délka: typ: topologie sekvenční
Thr Pro1
Ser Phe
Lys Ile
Lys Leu35
Cys His
Ser Leu
Cys Pro65
Leu Ser75
Gin Gly pro sekvenci ID č.43: charakteristiky: 174/177 aminokyselin aminokyselina lineární deskripce: SEQ ID č.43: Leu Gly Pro 5 Ala Ser Ser Leu Pro 1 0 Leu Leu 15 Lys Cys Leu Glu Gin 20 Val Gin 25 Gly Asp Gly Ala Ala 30 Leu Gin /Val Ser Glu/ Cysm v Ala Thr Tyr Lys 40 Pro Glu 45 Glu Leu Val Leu Leu 50 Gly Gly 55 Ile Pro Trp Ala Pro 60 Leu Ser Ser Gin Ala Leu Gin 70 Leu Ala Gly Gin Leu His Ser 80 Gly Leu Phe Leu Leu Leu Gin 90 Ala Leu Glu Gly Ile 95
Gin
Arg
Glu
Leu
His
Ser
Cys
Tyr 85
Ser
Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin100 105 - 201 -
Leu Asp Val 11 0 Ala Asp Phe Ala Thr 115 Thr Ile Trp Gin Gin 120 Met Glu Glu Leu Gly 125 Met Ala Pro Ala Leu 130 Gin Pro Thr Gin Gly 135 Ala Met Pro Ala Phe 140 Ala Ser Ala Phe Gin 145 Arg Arg Ala Gly Gly 150 Val Leu Val Ala Ser 155 His Leu Gin Ser Phe 160 Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gin 165 170
Pro /kde m je rovno 0 nebo 1/.
Informace pro sekvenci ID č.44:
Sekvenční charakteristiky: délka: 168 + 166 typ: nukleová kyselina spirála: dvojitá topologie: lineární sekvenční deskripce: S3Q ID č.44: AATTCTGGCA AATATTCTGA AATGAGCTGT TGACAATTAA TCATCGAACT 50 GACCGT TTATAAGACT TTACTCGACA ACTGTTAATT AGTAGCTTGA 46
AGTTAACTAG TACGCAAGTT CACGTAAAAA GGGTATCGACTCAATTGATC ATGCGTTCAA GTGCATTTTT CCCATAGCTG 90 86 - 202 - AATGGTACCC GGGGATCCTC TAGAGTCGAC CTGCAGGCAT GCAAGCTTAG Í40 TTACCATGGG CCCCTAGGAG ATCTCAGCTG GACGTCCGTA CGTTCGAATC 136 CCCGCCTAAT GAGCGGGCTT TTTTTTAT 168 GGGCGGATTA CTCGCCCGAA AAAAAATAGC 166
Informace pro sekvenci ID č.45:
Sekvenční charakteristiky: délka: 534 "tyP*· nukleotid s odpovídajícím proteinem spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.45: AATTCAGT ACT CCA CTG GGT CCA GCA AGC TCT CTG CCG CAG TCT TTC CTG 50Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin ’ Ser Phe Leu 15 10 CTG Leu 15 AAG TGT CTC GAALys Cys Leu Glu CAG GTA CGT AAA ATT CAA GGC GAT GGT GCG GCT 98 Gin Val 20 Arg Lys Ile Gin 25 Gly Asp Gly Ala Ala 30 CTG CAG GAA AAG CTG TGC GCA ACC TAC AAA CTG TGC CAC CCT GAG GAA 146 Leu Gin Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu 35 40 45 CTG GTG CTG CTC GGT CAC TCT CTG GGG ATC CCG TGG GCT CCA CTG AGC 194 Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser 50 55 60 TCT TGC CCG TCC CAA GČT TTA CAA CTG GCA GGC TGC TTG AGC CAG CTG 242 Ser Cys Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gin Leu 65 70 75 CAC TCC GGT CTG TTC CTG TAC CAG GGT CTG CTG CAG GCT CTA GAA GGC 290 His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gly A 80 85 90 - 203 - ATC TCT Ile Ser 95 CCT Pro GAA TTG Glu Leu GGG CCC ACC CTG GAC ACA CTG CAG CTG GAC GTT Val 1 1 0 338 Cly 1 00 Pro Thr Leu Asp Thr 105 Leu Gin Leu Asp GCC GAC TTC GCT ACT ACC ATA TGG CAA CAG ATG GAG GAA CTG GGT ATG 386 Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gly Met 115 1 20 125 GCT CCG GCA CTG CAG CCG ACT CAG GGT GCG ATG CCA GCA TTC GCC TCT 434 Ala Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser 130 135 140 GCT TTC CAG CGG CGC GCA GGC GGT GTT CTG GTT GCC TCC CAT CTT CAG 482 Ala Phe Gin Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gin 145 150 155 AGC TTC CTC GAG GTG TCT TAC CGC GTT CTG CGT CAC CTG GCC CAG CCG 530 Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala C-ln Pro 160 165 170 174 TAA G 534 Informace pro sekvenci ID č.46: Sekvenční charakteristiky: Délka 534 typ: nukleotid s odpovídajícím proteinem spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: S2Q ID č.46: 204 AATTCAGT ACT CCA CTG GGT CCA GCA AGC TCT CTG CCG CAG TCT TTC CTG 50
Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu 1 5 10 CTG AAG TCT CTC GAA CAG GTA CGT AAA ATT CAA GGC AGC GGT GCG GCT 98 Leu 15 Lys, Ser Leu Glu Gin 20 Val Arg Lys Ile Gin 25 Gly Ser Gly Ala Ala 30 CTG CAG GAA AAG CTG TGC GCA ACC TAC AAA CTG TGC CAC CCT GAu GAA 146 Leu Gin Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu 35 40 45 CTG GTG CTG CTC GGT CAC TCT CTG GGG ATC CCG TGG GCT CCA CTG AGC 194 Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser 50 55 60 TCT TGC CCG TCC CAA GCT TTA CAA CTG GCA GGC TGC TTG AGC CAG CTG 242 Ser Cys Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gin Leu 65 70 75 CAC TCC GGT CTG TTC CTG TAC CAG GGT CTG CTG CAG GCT CTA GAA GGC 290 His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gly 80 85 90 ATC TCT CCT GAA TTG GGG CCC ACC CTG GAC ACA CTG CAG CTG GAC GTT 338 Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Val 95 100 105 110 GCC GAC TTC GCT ACT ACC ATA TGG CAA CAG ATG GAG GAA CTG GGT ATG 386 Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gly Met 115 120 125 GCT CCG GCA CTG CAG CCG ACT CAG GGT GCG ATG CCA GCA TTC GCC TCT 434 Ala Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser 130 135 140 - 205 - GCT Ala TTC Phe CAG CGG Gin Arg 145 CGC Arg GCA GGC GGT GTT CTG GTT GCC TCC CAT CTT CAG 482 Ala Gly Gly 150 Val Leu Val Ala Ser 155 His Leu Gin AGC TTC CTC GAG GTG TCT TAC CGC GTT CTG CGT CAC CTG GCC CAG CCG 530 Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 160 165 170 174 TAA G 534
Informace pro sekvenci ID č.47: sekvenční charakteristiky: délka: 81 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární GAATTCAACA AAACGGTTGA CAACATGAAG TAAACACGGT ACGATGTACC 50 ACAAGTTCAC GTAAAAAGGG TATCGACAATG 81
Informace pro sekvenci ID č.48: sekvenční charakteristiky: délka: 67 + 67 baží typ: nukleotid spirála: dvojitá topologie: lineární TCGACATTAT ATTACTAATT AATTGGGGAC CCTAGAGGTC CCCTTTTTTA TTTTAAAAAG 60GTAATA TAATGATTAA TTAACCCCTG GGATCTCCAG GGGAAAAAAT AAAATTTTTC 56
CATGCGA
GTACGCTTCGA 67 67 206
Informace pro sekvenci ID Č.49:
Sekvenční charakteristiky: délka: 72 + 72 baží typ: nukleová kyselina spirála: dvojitá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.49: TCGACATTAT ATTACTAATT AATTGGGGAC CCTAGAGGTC CCCTTTTTTA TTTTAAAAG 60GTAATA TAATGATTAA TTAACCCCTG GGATCTCCAG GGGAAAAAAT AAAATTTTC 56 CATGCGGATC CC 72 GTACGCCTAG GGGAAC '72
Informace pro sekvenci ID č.50:
Sekvenční charakteristiky: délka: 118 baží typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.50:
AATTCTGGCA AATATTCTGA AATGAGCTGT TGACAATTAA TCATCGAACTAGTTAACTAG TACGCAGAGC TCAATCTAGA GGGTATTAAT AATGTTCCCATTGGAGGATG ATTAAATG 50 100 ·1 1 8
Informace
Sekvenční délka: typ: spirála: topologie sekvenční pro sekvenci ID č.51 · charakteristiky: 35 + 35 bažínukleová kyselinadvojitálineární deskripce: SEQ ID č.51: 35 35 Ý V’-'? W* . λ—-». - n>··· - i’ ·—- - 2 07 -
AGCTCCATAT GGTACCAGAT CTCTCGAGAG TACTT
GGTATA CCATGGTCTA GAGAGCTCTC ATGAAGATC
Informace pro sekvenci ID č.52:
Sekvenční charakteristiky: délka: 23+15 baží typ: nukleová kyselina spirála: dvojitá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.52:
AGCTCAGCTG CAGGATATGG TACGTCGAC GTCC-TATAC 23 15
Informace sekvenční délka: typ: spirála: topologie sekvenční pro sekvenci ID č.53: charakteristiky: 72 + 72 nukleová kyselina dvojitá lineární deskripce: SEQ ID č.53: TCGACATTAT ATTACTAATT AATTGGGGAC CCTAGAGGTC CCCTTTTTTA TTTTAAAAAG60 GTAATA TAATGATTAA TTAACCCCTG GGATCTCCAG GGGAAAAAAT AAAATTTTTC56 CATGCGGATC CC 72 GTACGCCTAG GGGAAC 72
Informace pro sekvenci ID č.54: sekvenční charakteristiky: délka: 84 typ: nukleová kyselina 208 - spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.54: AAT TCA ACA AAA CGG TTG ACA ACA TGA AGT AAA CAC GGT ACG ATG 45TAC CAC AAG TTC ACG TAA AAA GGG TAT CGA CAA TGG TAC 84
Informace pro sekvenci ID č.55:
Sekvenční charakteristiky: délka: 76 typ: nukleová kyselina spirála: jednoduchá topologie: lineární sekvenční deskripce: SEQ ID č.55: CAT TGT CGA TAC CCT TTT TAC GTG AAC TTG TAC ATC GTA CCG 45 TGT TTA CTT CAT GTT GTC AAC CGT TTT GTT G 76
Informace
Sekvenční délka: typ: spirála: topologie sekvenční pro sekvenci ID č.56: charakteristiky: 24 + 24 nukleová kyselina dvojitá lineární deskripce: SEQ ID č.56:
AATTCGCATG CGGATCCATC GATC
GCGTAC GCCTAGGTAG CTAGAGCC
24 24

Claims (20)

- 209 PATENTOVÉ nároky
1. Farmaceutická kompozice s kontinuálním uvolňovánímv kyselém prostředí stabilní fysiologicky účinné látky zmateriálu kompozice do vodného prostředí fysiologickéhotypu, vyznačená tím, že uvedenou fysiologic-ky účinnou látkou je polypeptid kovalentně kon^ugovaný sve vodě rozpustným polymerem, přičemž tato fysilogickyúčinná látka není významně hydrolyzována za podmínek, vysky-tujících se v kompozici během periody použití kompozice, a je-li kompozice umístěna do vodného prostředí fysiologické-ho typu, potom uvolňuje polypeptid do vodného prostředífysiologického typu kontinuálním způsobem, přičemž toto v uvolňování má v podstatě monofázový profil v průběhu ales-pon jednoho týdne a k uvolňování polypeptidu dochází vedvou následných fázích, kde v první fázi dochází k uvolňo-vání difúzí z povrchu a v druhé fázi dochází k uvolňovánív důsledku degradace materiálu kompozice, přičemž difuznífáze a degradací indukovaná fáze se časově překrývají a v> v k uvolňování polypeptidu dochází v průběhu alespoň jednohotýdne nebo kompozice absorbuje vodu kontinuálním způsobema její absorpční profil je v podstatě monofázový, až dookamžiku, kdy došlo k degradaci materiálu kompozice a kdybyl v podstatě veškerý polypeptid uvolněn do vodného pro-středí fysiologického typu v průběhu alespoň jednoho týdne.
2. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyzna-čená tím, že jedna molekula fysiologicky účinnálátky obsahuje alespoň jednu molekulu ve vodě rozpustnéhopolymeru na 3000 - 8030 Da molekulovou hmotnost polypepti-du.
3· Farmaceutická kompozice podle nároku 1 nebo 2, v y-značená tím, že polypeptid má alespoň jednu z ^·\<.;. '··?<'·,;λ2·‘SS·;<·.·'· - 210 - biologických vlastní přírodně se vyskytujícího G-CSF.
4. Farmaceutická kompozice podle nároku 3, vyzna-čená t í m, že polypeptid je derivátem přírodně sevyskytujícího G-CSF, který má alespoň jednu z biologickýchvlastností přírodně se vyskytujícího G-CSF a stabilitu v roztoku alespoň 35½ při 5 mg/ml, přičemž tento derivát w 17 17 má alespoň Cys nativní sekvence nahrazen zbytkem Ser 2? 27a Asp nativní sekvence nahrazen zbytkem Ser .
5· Farmaceutická kompozice podle nároku 4, vyzna-čená tím, že polypeptid obsahuje alespoň jednudalší modifikaci zvolenou ze skupiny zahrnující: a/ Glu11 nativní b/ Leu y nativní2 7 c/ Lys J nativníd/ Gly^ nativníe/ Gly^S nativníf/ Ala3^ nativní Arg30, g/ Lys3^ nativníh/ Lys^° nativníi/ Pro^ nativníj/ Leu nativník/ Gly^1 nativní1/ Gly55 nativním/ Trp^S nativnín/ Pro^° nativní0/ Pro^ nativníp/ Pro111 nativníq/ Thr11^nativnír/ Thr11^nativnís/ Tyr1 ^nativní sekvence sekvence sekvence sekvence sekvence sekvence sekvence sekvence sekvence sekvence sekvence sekvence sekvence sekvence sekvence sekvence sekvence sekvence sekvence je nahrazenje nahrazenje nahrazenje nahrazenje nahrazenje nahrazen je nahrazenje nahrazenje nahrazenje nahrazenje nahrazenje nahrazenje nahrazenje nahrazenje nahrazenje nahrazenje nahrazenje nahrazenje nahrazen zbytkem Argzbytkem Gluzbytkem Arg'zbytkem Alazbytkem Ala 1 11523262830 zbytkem LysJ nebo zbytkem zbytkem zbytkem zbytkem zbytkem zbytkem zbytkem zbytkem zbytkem zbytkem zbytkem zbytkem zbytkem Arg Arg Ala Lys Ala Ala Lys Ser Ser Glu Ser Ser Arg 3440444951555860651 1 1 1151 16165
6. Farmaceutická kompozice podle nároku 4 nebo 5, vy- značená tím, že polypeptid je zvolen ze skupiny - 211 - zahrnující: i/ /“Arg11,Ser17,27’60,6^7 lidský G-CSF, ii/ /“Glu15,Ser17,27,Ala26,28,Lys3£7lidský G-CSF, iii/zfArg11,Glu15,Ser17’27’60’65,Ala26’28,Lys3£7lidský G-CSF iv/ /~Arg11’47,Ser17’27’60’6^7lidský G-CSF, v/ /"Arg11’23,Ser17,27’60,6£7lidský G-CSF, vi/ r"Arg11,l65,Glu15,Serl7,27,60,65,Ala26,28,Lys30,^7-lidský G-CSF, vii//7Arg1'1Glu,5>,,l)Ser’7-27-60>65-”5.''6)Ala26,28jLys307 lidský G-CSF, viii/ ΓGlu1 5, Ser1 7’27 , Ala26 ’28, Arg^lidský G-CSF,ix/ /"Ala1,Thr3,Tyr4,Arg5,11,Ser17,27,60,6^7lidský G-CSF,x/ /“Ser17’27,6°’6£7lidský G-CSF, xi/ /~Arg11,Ser17,27,627lidský G-CSF a xii//“Ser17,27,65_7lidský G-CSF.
7. Farmaceutická kompozice podle nároku 1 nebo 2, vyznáč e n é t í m, že polypeptid je zvolen ze skupiny zahrnu-jící G-CSF, lidský calcitonin, interleukin-2, interferona lidský růstový hormon.
8. Farmaceutická kompozice podle některého z předcháze- jících nároků, vyznačená tím, že ve vodě roz- pustný polymer je zvolen ze skupiny zahrnující polyethylen- glykolový nebo polypropylenglykolový homopolymer, polyoxy- 212 ethylovaný polyol nebo polyvinylalkohol, přičemž uvedenýhomopolymer je nesubstituovaný nebo substituovaný na jed-nom konci alkylovou skupinou.
9. Farmaceutické kompozice podle nároku 7» vyzna-čená t í m , že ve vodě rozpustný polymer je zvolenze skupiny zahrnující nesubstituovaný polyethylenglykol,monomethylpolyethylenglykol a polyoxyethylovaný glycerol.
10. Farmaceutická kompozice podle nároku 8 nebo 9, v y-značená tím, že ve vodě rozpustný polymer mámolekulovou hmotnost 1000 až 15000.
11. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 1až 6 a 8 až 10, vyznačená tím, že fysiologic-ky účinnou látkou je /”Arg1 1 , Ser1? ’2? >60,65-7 lidský G-CSFs methioninovou presekvenci nebo bez této presekvence, kon-jugovaný s monomethylpolyethylenglykolem, přičemž monome-thylpolyethylenglykol má molekulovou hmotnost 2000 až 5000.
12. Způsob přípravy farmaceutické kompozice podle ně-kterého z předcházejících nároků, vyznačený tím,že se materiál kompozice a fysiologicky účinná látka roz-pustí v organickém rozpouštědle nebo jednotně dispergujtev organickém nebo vodném médiu, načež se získaný roztok-—nebo disperze vysuší a formulují do lékové formy, ktek-£3Ty·.λΛ Ohdrá je vhodná pro implantaci do těla živočicha. I gvA2 "Ί l 6 ΙΙΙΛ 6 l Cfipa
13· Způsob přípravy farmaceutické kompozice podle ně··kterého z nároků 1 až 11, ve které materiálem kompoziceje polylaktid, vyznačený tím, že se fysiolc-gicky účinná látka inkorporuje do matrice obsahující poijy- v laktid, který obsahuje alespoň 25 % molárních jednotekkyseliny mléčné a nejvýše 75 % molárních jednotek kyselinyglykolové, přičemž se fysiologicky účinná látka a materiál-
- 213 - kompozice jednotně promlsí tavným zpracováním intimnípevné směsi fysiologicky účinné látky a materiálu kompo-zice .
14·. Použití fysiologicky účinné látky, která obsahujepolypeptid kovalentně konjugovaný s ve vodě rozpustnýmpolymerem, při přípravě farmaceutické kompozice podle ně-kterého z nároků 1 až 11.
15· Způsob léčení poruch krvetvorby u savců, vyzna-čený tím, že zahrnuje podání farmaceutické kompo-zice podle některého z nároků 1 až 11 savců, čímž se po-skytne účinné množství polypeptidu konjugovaného s ve vo-dě rozpustným polymerem, přičemž uvedený polypeptid má v alespoň jednu z biologických vlastností přirozeně se vysky-tujícího G-CSF.
16. Způsob zastavení proliferace leukemických buněk usavců, vyznačen tím, že se savcům podá farma-ceutická kompozice podle některého z nároků 1 až 11, čímžse poskytne účinné množství polypeptidu konjugovaného sve vodě rozpustným polymerem, přičemž uvedený polypeptidmá alespoň jednu z biologických vlastností přirozeně sevyskytujícího G-CSF.
17. Způsob léčení osteoporosy nebo Pagetovy nemoci učlověka trpícího těmito onemocněními, vyznačenýt í m, že zahrnuje podání farmaceutické kompozice podleněkterého z nároků 1 až 11, čímž se poskytne účinné množst-ví lidského calcitoninu konjugovaného s ve vodě rozpust-ným polymerem.
18. Způsob léčení nádorů nebo nedostatečnosti imunit-ního systému u savců, vyznačený tím, že sesavcům podá farmaceutická kompozice podle některého z ná-roků 1 až 11, čímž se poskytne účinné množství interleukinu2 konjugovaného s ve vodě rozpustným polymerem. 214
19. Způsob léčení nádorů nebo virové infekce u savců,vyznačený tím, že se savcům podá farmaceutic-ká kompozice podle některého z nároků 1 až 11, čímž seposkytne účinné množství interferonu konjugovaného s vevodě rozpustným polymerem.
20. Způsob stimulace růstu u lidí, vyznačenýtím, že se lidem podá farmaceutická kompozice podleněkterého z nároků 1 až 11, čímž se poskytne účinné množst-ví lidského růstového hormonu konjugovaného s ve vodě roz-pustným polymerem. Zastupuje
» i
CS912285A 1990-07-23 1991-07-22 Pharmaceutical composition with a continuous liberation physiologically active component being stable in acid medium CS228591A3 (en)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB909016138A GB9016138D0 (en) 1990-07-23 1990-07-23 Continuous release pharmaceutical compositions
GB909018416A GB9018416D0 (en) 1990-08-23 1990-08-23 Continuous release pharmaceutical compositions
GB909018418A GB9018418D0 (en) 1990-08-23 1990-08-23 Continuous release pharmaceutical compositions
GB909018415A GB9018415D0 (en) 1990-08-23 1990-08-23 Continuous release pharmaceutical compositions
GB909018417A GB9018417D0 (en) 1990-08-23 1990-08-23 Continuous release pharmaceutical compositions
GB909018414A GB9018414D0 (en) 1990-08-23 1990-08-23 Continuous release pharmaceutical compositions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CS228591A3 true CS228591A3 (en) 1992-03-18

Family

ID=27547094

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS912285A CS228591A3 (en) 1990-07-23 1991-07-22 Pharmaceutical composition with a continuous liberation physiologically active component being stable in acid medium

Country Status (18)

Country Link
US (2) US5320840A (cs)
EP (1) EP0473268B1 (cs)
JP (1) JP3188292B2 (cs)
KR (1) KR920002164A (cs)
AT (1) ATE251641T1 (cs)
AU (1) AU655187B2 (cs)
BG (1) BG94861A (cs)
CA (1) CA2047540A1 (cs)
CS (1) CS228591A3 (cs)
DE (1) DE69133324T2 (cs)
FI (1) FI913410A (cs)
GB (1) GB2246295B (cs)
HU (1) HUT60632A (cs)
IE (1) IE912365A1 (cs)
IL (1) IL98831A0 (cs)
NZ (1) NZ238889A (cs)
PT (1) PT98410A (cs)
ZW (1) ZW9391A1 (cs)

Families Citing this family (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5718893A (en) * 1984-04-15 1998-02-17 Foster; Preston F. Use of G-CSF to reduce acute rejection
IE912365A1 (en) * 1990-07-23 1992-01-29 Zeneca Ltd Continuous release pharmaceutical compositions
US6565841B1 (en) 1991-03-15 2003-05-20 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
US5876452A (en) * 1992-02-14 1999-03-02 Board Of Regents, University Of Texas System Biodegradable implant
US6013853A (en) * 1992-02-14 2000-01-11 The University Of Texas System Continuous release polymeric implant carrier
US5581476A (en) 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
US5981719A (en) 1993-03-09 1999-11-09 Epic Therapeutics, Inc. Macromolecular microparticles and methods of production and use
US6090925A (en) 1993-03-09 2000-07-18 Epic Therapeutics, Inc. Macromolecular microparticles and methods of production and use
US6284727B1 (en) 1993-04-07 2001-09-04 Scios, Inc. Prolonged delivery of peptides
US6191105B1 (en) * 1993-05-10 2001-02-20 Protein Delivery, Inc. Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin
US20050181976A1 (en) * 1993-05-10 2005-08-18 Ekwuribe Nnochiri N. Amphiphilic oligomers
NZ260909A (en) * 1993-07-05 1995-04-27 Takeda Chemical Industries Ltd Production of sustained release preparation by allowing a water-soluble polypeptide to permeate into a biodegradable matrix in an aqueous solution
IL110787A0 (en) 1993-08-27 1994-11-11 Sandoz Ag Biodegradable polymer, its preparation and pharmaceutical composition containing it
DE69521880T2 (de) * 1994-02-08 2002-01-03 Amgen Inc Orales verabreichungssystem von chemischmodifizierten proteinen g-csf
CA2183871C (en) 1994-02-23 2008-11-04 Motoo Yamasaki Platelet growth accelerator
US5795569A (en) * 1994-03-31 1998-08-18 Amgen Inc. Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
WO1995026746A1 (en) * 1994-03-31 1995-10-12 Amgen Inc. Compositions and methods for stimulating megakaryocyte growth and differentiation
US5536495A (en) * 1994-04-15 1996-07-16 Foster; Preston F. Use of G-CSF to reduce acute rejection
EP0782633A4 (en) * 1994-09-23 2002-01-02 Sydney D Finkelstein TOPOGRAPHIC GENOTYPING
US20030053982A1 (en) 1994-09-26 2003-03-20 Kinstler Olaf B. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5770577A (en) * 1994-11-14 1998-06-23 Amgen Inc. BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol
US5576197A (en) * 1995-04-07 1996-11-19 Molecular Bio-Products Polymerase chain reaction container and methods of using the same
EP0832220A1 (en) * 1995-06-07 1998-04-01 Amgen Inc. Ob protein compositions and method
FR2738827B1 (fr) * 1995-09-18 1997-10-17 Bio Merieux Detection des enterobacteries
US20020064546A1 (en) 1996-09-13 2002-05-30 J. Milton Harris Degradable poly(ethylene glycol) hydrogels with controlled half-life and precursors therefor
US6258351B1 (en) 1996-11-06 2001-07-10 Shearwater Corporation Delivery of poly(ethylene glycol)-modified molecules from degradable hydrogels
SE9704186D0 (sv) * 1997-11-14 1997-11-14 Astra Ab New composition of matter
CZ302155B6 (cs) 1998-10-23 2010-11-18 Kirin-Amgen Inc. Sloucenina, která se váže na mpl receptor, zpusob její výroby, farmaceutická kompozice s jejím obsahem, polynukleotid, vektor a hostitelská bunka
US6245740B1 (en) 1998-12-23 2001-06-12 Amgen Inc. Polyol:oil suspensions for the sustained release of proteins
US6319510B1 (en) 1999-04-20 2001-11-20 Alayne Yates Gum pad for delivery of medication to mucosal tissues
US7169889B1 (en) * 1999-06-19 2007-01-30 Biocon Limited Insulin prodrugs hydrolyzable in vivo to yield peglylated insulin
US6638906B1 (en) * 1999-12-13 2003-10-28 Nobex Corporation Amphiphilic polymers and polypeptide conjugates comprising same
US6646110B2 (en) * 2000-01-10 2003-11-11 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF polypeptides and conjugates
US6831158B2 (en) * 2000-01-10 2004-12-14 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
US6555660B2 (en) * 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
TR200401573T4 (tr) 2000-02-29 2004-08-23 Pfizer Products Inc. Stabilize edilmiş granülosit koloni uyarıcı faktör
US6716811B1 (en) 2000-07-20 2004-04-06 Affymax, Inc. Compounds having affinity for the granulocyte-colony stimulating factor receptor (G-CSFR) and associated uses
US8435939B2 (en) 2000-09-05 2013-05-07 Biokine Therapeutics Ltd. Polypeptide anti-HIV agent containing the same
GB0022877D0 (en) * 2000-09-18 2000-11-01 Isis Innovation Analogues
AU2002220002B2 (en) 2000-10-31 2006-12-14 Evonik Corporation Methods and compositions for enhanced delivery of bioactive molecules
AU2001298061A1 (en) 2000-12-13 2003-07-09 Purdue Research Foundation Microencapsulation of drugs by solvent exchange
KR20030005204A (ko) * 2000-12-25 2003-01-17 가부시키가이샤 시세이도 교감신경 활성화 향료 조성물
TWI246524B (en) 2001-01-19 2006-01-01 Shearwater Corp Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles
US7265186B2 (en) 2001-01-19 2007-09-04 Nektar Therapeutics Al, Corporation Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles
US6867183B2 (en) * 2001-02-15 2005-03-15 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US6835802B2 (en) 2001-06-04 2004-12-28 Nobex Corporation Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties
US6858580B2 (en) 2001-06-04 2005-02-22 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US7713932B2 (en) * 2001-06-04 2010-05-11 Biocon Limited Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof
US6828305B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
WO2005004792A2 (en) * 2003-06-24 2005-01-20 Nobex Corporation Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates and methods of use in pain treatment
US6713452B2 (en) 2001-06-04 2004-03-30 Nobex Corporation Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6828297B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
PL371781A1 (en) 2001-07-11 2005-06-27 Maxygen Holdings, Ltd. G-csf conjugates
US6488952B1 (en) * 2001-08-28 2002-12-03 John P. Kennedy Semisolid therapeutic delivery system and combination semisolid, multiparticulate, therapeutic delivery system
US7196059B2 (en) 2001-09-07 2007-03-27 Biocon Limited Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US7557195B2 (en) 2002-03-20 2009-07-07 Biopolymed, Inc. Stoichiometric conjugates of biocompatible polymers at the unpaired cysteine residue of the wild-type G-CSF
US20030199464A1 (en) * 2002-04-23 2003-10-23 Silviu Itescu Regeneration of endogenous myocardial tissue by induction of neovascularization
AU2003236521A1 (en) * 2002-06-13 2003-12-31 Nobex Corporation Methods of reducing hypoglycemic episodes in the treatment of diabetes mellitus
SI21273A (sl) * 2002-07-31 2004-02-29 LEK farmacevtska dru�ba d.d. Priprava inkluzijskih teles z visokim deležem pravilno zvitega prekurzorja heterolognega proteina
EP1541585B1 (en) 2002-08-27 2013-01-30 Biokine Therapeutics Ltd. Cxcr4 antagonist and use thereof
ATE466085T1 (de) * 2002-09-09 2010-05-15 Hanall Pharmaceutical Co Ltd Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide
WO2004043396A2 (en) * 2002-11-09 2004-05-27 Nobex Corporation Modified carbamate-containing prodrugs and methods of synthesizing same
CN100558398C (zh) * 2002-11-26 2009-11-11 拜奥康有限公司 修饰的钠尿化合物、缀合物及其应用
US7648962B2 (en) * 2002-11-26 2010-01-19 Biocon Limited Natriuretic compounds, conjugates, and uses thereof
WO2004091494A2 (en) 2003-04-11 2004-10-28 Pr Pharmaceuticals Inc. Method for preparation of site-specific protein conjugates
US20070041937A1 (en) * 2003-08-22 2007-02-22 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research G-csf derivative for inducing immunological tolerance
US8338373B2 (en) 2003-10-24 2012-12-25 Nora Therapeutics, Inc. Method for reducing the risk of spontaneous abortion in a human female subject
EP2198875A1 (en) * 2003-10-24 2010-06-23 Nora, LLC A method for reducing the likelihood of preterm labour in a subject in need thereof
US20090226397A1 (en) * 2003-10-24 2009-09-10 Nora Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing the likelihood of implantation failure or miscarriage in recipients of artificial insemination
US7220407B2 (en) 2003-10-27 2007-05-22 Amgen Inc. G-CSF therapy as an adjunct to reperfusion therapy in the treatment of acute myocardial infarction
US20060182692A1 (en) 2003-12-16 2006-08-17 Fishburn C S Chemically modified small molecules
CN102895666B (zh) * 2003-12-16 2015-08-19 尼克塔治疗公司 化学改性的小分子
MX2007000216A (es) 2004-07-08 2007-03-15 Amgen Inc Peptidos terapeuticos.
AU2005269753B2 (en) * 2004-07-19 2011-08-18 Biocon Limited Insulin-oligomer conjugates, formulations and uses thereof
US20060115844A1 (en) 2004-10-22 2006-06-01 Finkelstein Sydney D Enhanced amplifiability of minute fixative-treated tissue samples, minute stained cytology samples, and other minute sources of DNA
AU2005306894B2 (en) 2004-11-05 2011-11-24 Northwestern University Use of SCF and G-CSF in the treatment of cerebral ischemia and neurological disorders
WO2006076471A2 (en) * 2005-01-12 2006-07-20 Nobex Corporation Bnp conjugates and methods of use
TW200640492A (en) * 2005-02-21 2006-12-01 Lg Life Sciences Ltd Sustained release composition of protein drug
MX2007015156A (es) * 2005-06-01 2008-02-15 Maxygen Holdings Ltd Polipeptidos g-csf pegilados y metodos para la produccion de los mismos.
EP1926768B1 (en) 2005-07-18 2011-09-14 Nektar Therapeutics Branched functionalized polymers using branched polyol cores
US20080214480A1 (en) * 2005-07-22 2008-09-04 Trf Pharma, Inc. Method for Treating Sickle Cell Disease and Sickle Cell Disease Sequalae
SI1984009T1 (sl) * 2006-01-18 2013-02-28 Qps, Llc Farmacevtski sestavki z izboljĺ ano stabilnostjo
US7678838B2 (en) * 2006-08-04 2010-03-16 University Of Memphis Research Foundation Nanothin polymer films with selective pores and method of use thereof
US7829155B1 (en) 2006-11-22 2010-11-09 The University Of Memphis Research Foundation Nanothin polymer coatings containing thiol and methods of use thereof
FR2909560B1 (fr) * 2006-12-06 2012-12-28 Fabre Pierre Dermo Cosmetique Gel d'acide hyaluronique pour injection intradermique
EP3011961B1 (en) 2006-12-21 2020-11-11 Biokine Therapeutics LTD. 4f-benzoyl-tn14003 for the mobilisation of hematopoietic progenitor cells in view of transplantation
MX2010003979A (es) 2007-10-16 2010-06-02 Biocon Ltd Composicion farmaceutica oralmente administrable y proceso para su preparacion.
NZ586947A (en) 2008-02-08 2012-11-30 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
US20110171168A1 (en) * 2008-05-13 2011-07-14 Nora Therapeutics, Inc. Human g-csf analogs and methods of making and using thereof
US10138283B2 (en) 2008-07-23 2018-11-27 Ambrx, Inc. Modified bovine G-CSF polypeptides and their uses
WO2010079340A2 (en) 2009-01-08 2010-07-15 Eisai R & D Management Co., Ltd. Assay
EP2396023A2 (en) 2009-02-11 2011-12-21 Yeda Research and Development Co. Ltd. Short beta-defensin-derived peptides
WO2010146578A2 (en) 2009-06-14 2010-12-23 Biokine Therapeutics Ltd. Peptide therapy for increasing platelet levels
US20120201873A1 (en) 2009-08-05 2012-08-09 Pieris Ag Controlled release formulations of lipocalin muteins
MX349301B (es) 2009-12-21 2017-07-21 Ambrx Inc Polipéptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos.
GB0922438D0 (en) 2009-12-22 2010-02-03 Ucl Business Plc Agents having tissue generative activity
CA2791361C (en) 2010-03-04 2018-06-12 Pfenex Inc. Method for producing soluble recombinant interferon protein without denaturing
CA2794740C (en) 2010-04-01 2019-12-31 Pfenex Inc. Methods for g-csf production in a pseudomonas host cell
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
JP2014506116A (ja) 2010-11-12 2014-03-13 ウェルズ ファーゴ バンク ナショナル アソシエイション Ｉｌ−２部分とポリマーとのコンジュゲート
US8440309B2 (en) 2011-01-31 2013-05-14 Confluent Surgical, Inc. Crosslinked polymers with the crosslinker as therapeutic for sustained release
EP2841084B1 (en) 2012-04-24 2018-05-30 Biokine Therapeutics Ltd. Cxcr4 antagonist peptide for use in the treatment of large cell lung cancer
US9341628B2 (en) 2012-11-30 2016-05-17 Interpace Diagnostics Corporation Methods for measuring carcinoembryonic antigen
WO2015057724A1 (en) 2013-10-14 2015-04-23 Nora Therapeutics, Inc. Use of g-csf for treating or preventing villitis of unknown etiology in a human female
KR20210089270A (ko) 2015-07-16 2021-07-15 바이오카인 테라퓨틱스 리미티드 암 치료용 조성물 및 방법
KR102231217B1 (ko) * 2015-09-24 2021-03-24 한미약품 주식회사 면역글로불린 단편의 특정 위치를 연결 부위로 이용한 단백질 결합체
KR101763644B1 (ko) * 2015-12-03 2017-08-02 윤안구 폐 생리대 수거함
BR112018016924A2 (pt) 2016-02-23 2019-01-02 Biokine Therapeutics Ltd método de seleção de regime de tratamento para indivíduo que tem leucemia mieloide aguda (lma), método de maximização de resposta ao tratamento de leucemia mieloide aguda (lma), método de tratamento de lma, antagonista de cxcr4 e agente quimioterápico no tratamento de lma
WO2018138267A1 (en) 2017-01-27 2018-08-02 Cinfa Biotech S.L. Method for determining the efficacy of a g-csf containing composition
US11267858B2 (en) 2019-05-31 2022-03-08 Spectrum Pharmaceuticals, Inc. Methods of treatment using G-CSF protein complex
US11684655B2 (en) 2019-05-31 2023-06-27 Spectrum Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neutorpenia using G-CSF protein complex
US10758329B1 (en) 2019-08-20 2020-09-01 Raymond L. Wright, III Hydrating mouth guard

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL6812443A (cs) * 1968-08-31 1970-03-03
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
IE52535B1 (en) * 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4414147A (en) * 1981-04-17 1983-11-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods of decreasing the hydrophobicity of fibroblast and other interferons
EP0092918B1 (en) * 1982-04-22 1988-10-19 Imperial Chemical Industries Plc Continuous release formulations
US4609546A (en) * 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
EP0154316B1 (en) * 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
GB8430252D0 (en) * 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
US4732863A (en) * 1984-12-31 1988-03-22 University Of New Mexico PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) * 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
DE3676670D1 (de) * 1985-06-26 1991-02-07 Cetus Corp Solubilisierung von proteinen fuer pharmazeutische zusammensetzungen mittels polymerkonjugierung.
US4810643A (en) * 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
US4818769A (en) * 1985-09-20 1989-04-04 Cetus Corporation Method of controlling stress-related disease in livestock by administration of human IL-2
JP2514950B2 (ja) * 1986-03-10 1996-07-10 エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体
US4894226A (en) * 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
GB2209937B (en) * 1987-09-21 1991-07-03 Depiopharm S A Water insoluble polypeptides
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
ES2058351T3 (es) * 1988-01-29 1994-11-01 Sumitomo Pharma Un procedimiento para producir una formulacion de liberacion sostenida que es adecuada para el uso humano y veterinario.
CA1340810C (en) * 1988-03-31 1999-11-02 Motoo Yamasaki Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
FR2630329B1 (fr) * 1988-04-20 1991-07-05 Merieux Inst Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
GB8824591D0 (en) * 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
CA2006596C (en) * 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US5055555A (en) * 1989-01-05 1991-10-08 Helmut Sassenfeld Purification of G-CSF
GB9107846D0 (en) * 1990-04-30 1991-05-29 Ici Plc Polypeptides
IE912365A1 (en) * 1990-07-23 1992-01-29 Zeneca Ltd Continuous release pharmaceutical compositions

Also Published As

Publication number Publication date
HU912442D0 (en) 1991-12-30
ATE251641T1 (de) 2003-10-15
AU655187B2 (en) 1994-12-08
JP3188292B2 (ja) 2001-07-16
GB2246295A (en) 1992-01-29
FI913410A (fi) 1992-01-24
HUT60632A (en) 1992-10-28
GB9115207D0 (en) 1991-08-28
JPH0532559A (ja) 1993-02-09
PT98410A (pt) 1992-06-30
DE69133324T2 (de) 2004-07-29
AU8123891A (en) 1992-01-30
NZ238889A (en) 1993-08-26
GB2246295B (en) 1994-05-11
BG94861A (en) 1994-03-24
IL98831A0 (en) 1992-07-15
IE912365A1 (en) 1992-01-29
US5320840A (en) 1994-06-14
ZW9391A1 (en) 1992-03-25
DE69133324D1 (de) 2003-11-13
EP0473268B1 (en) 2003-10-08
EP0473268A3 (en) 1992-09-16
EP0473268A2 (en) 1992-03-04
KR920002164A (ko) 1992-02-28
CA2047540A1 (en) 1992-01-24
US5773581A (en) 1998-06-30
FI913410A0 (fi) 1991-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CS228591A3 (en) Pharmaceutical composition with a continuous liberation physiologically active component being stable in acid medium
AU644647B2 (en) Polypeptides
EP0088540A2 (en) DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human immune interferon-like polypeptides
EP0425482B1 (en) Human insulin analogs and preparations containing them
US5004689A (en) DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human gamma interferon-like polypeptides in high yields
FI100972B (fi) Pesäkkeitä stimuloivaa tekijä-1:tä (CSF-1) koodaava DNA-sekvenssi ja m enetelmä CSF-1-proteiinin valmistamiseksi
HU202287B (en) Process for producing human immune interferon
IE66689B1 (en) Recombinant fibroblast growth factors
EP0118977A1 (en) DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human interleukin two-like polypeptides
CN1020473C (zh) 编码表现有人粒性巨噬细胞和嗜伊红细胞生长因子活性之多肽的cDNA克隆
CA2232264C (en) Variants of human recombinant interferon-.gamma. (rhu-ifn-.gamma.) with increased thermal stability
AU627477B2 (en) Interleukin ii analogs
EP0811064B1 (en) Mpl ligand analogs
AU727978B2 (en) MPL ligand analogs
CN101245109B (zh) 一种聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体及其制备方法
JP3288373B2 (ja) 安定および生体活性改変ソマトトロピン類
WO2002081519A9 (fr) Nouvelle proteine hybride ifn-thy, preparation et utilisation
Otto et al. Expression of recombinant feline tumor necrosis factor is toxic to Escherichia coli
AU599891B2 (en) CDNA clones coding for polypeptides exhibiting murine interleukin-2 activity
CZ443885A3 (en) Dna sequence used for assuring expression of polypeptide product
HU204086B (en) Process for producing non-human mammal animal interferons, dna sequemces coding form them and pharmaceutical compositions comprising sand interferons
IE66691B1 (en) Human insulin analoga and preparations containing them