CZ302155B6

CZ302155B6 - Sloucenina, která se váže na mpl receptor, zpusob její výroby, farmaceutická kompozice s jejím obsahem, polynukleotid, vektor a hostitelská bunka

Info

Publication number: CZ302155B6
Application number: CZ20011287A
Authority: CZ
Inventors: Liu@Chuan-Fa; Feige@Ulrich; Cheetham@Janet
Original assignee: Kirin-Amgen Inc.
Priority date: 1998-10-23
Filing date: 1999-10-22
Publication date: 2010-11-18
Also published as: DK2319928T3; BR9914698B1; NL300398I2; FR09C0030I2; DK1783222T3; SI1124961T1; PT1124961E; US20120034657A1; NO20011962L; HU228582B1; US8044174B2; TWI250988B; BG65663B1; EP1124961B9; EP2319928B9; TW200606175A; US9145450B2; US7994117B2; DE122009000039I1; CY1113107T1

Abstract

Rešení se týká sloucenin, které se vážou na mpl receptor, zpusobu jejich výroby, farmaceutických kompozic s jejich obsahem, kódujících polynukleotidu, vektoru jejich obsahem a hostitelských bunek obsahujících tyto vektory. Slouceniny podle tohoto rešení mohou být použity pro zvýšení poctu trombocytu a prekurzoru trombocytu (napríklad megakaryocytu) u savce. Farmaceutické kompozice obsahující tyto slouceniny.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká sloučenin, které se vážou na mpl receptor, způsobu jejich výroby, farmaceutických kompozic s jejich obsahem, kódujících polynukleotidů, vektorů jejich obsahem a hostitelských buněk obsahujících tyto vektory. Sloučeniny podle vynálezu mohou být použity pro zvýšení io počtu trombocytů a prekurzorů trombocytů (například megakaryocytů) u savce. Dále se vynález týká farmaceutických kompozic obsahujících tyto sloučeniny. Sloučeniny podle vynálezu, které jsou zejména peptidy nebo polypeptidy, mají schopnost in vitro a in vivo stimulovat produkci trombocytů ajejich prekurzorových buněk, jako jsou megakaryocyty,

Dosavadní stav techniky

Ze známých proteinů majících trombopoetickou aktivitu je možno uvést trombopoetin (TPO) a megakaryocytámí růstový a diferenciační faktor (MGDF).

Klonování endogenního trombopoetinu (TPO) (Lok et al., Nátuře 369:568571 (1994); Bartley et al., Cell 77:1117-1124 (1994); Kuter et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91:11104-11108 (1994); de Sauvage et al., Nátuře 369:533-538 (1994); Kato et al., Journal of Biochemistry 119:229-236 (1995); Chang et al., Journal of Biological Chemistry 270:511-514 (1995) rychle zlepšilo naše znalosti o megakaryopoese (tvorbě megakaryocytů) a trombopoese (tvorbě trombocytů).

Endogenní lidský TPO, 60 až 70 kDa glykosylovaný protein primárně produkovaný v játrech a ledvinách, se skládá z 332 aminokyselin (Bartley et al., Cell 77:1117-1124 (1994); Chang et al., Journal of Biological Chemistry 270:511-514 (1995). Protein je značně konzervován mezi růz30 nými druhy a má 23% homologii s lidským erytropoetinem (Gumey et al., Blood 85:981-988 (1995)) na amino konci (aminokyseliny 1 až 172) (Bartley et al., Cell 77:1117-1124 (1994)). Bylo prokázáno, že endogenní TPO má všechny charakteristiky klíčového biologického regulátoru trombopoesy. Mezi jeho účinky in vitro patří specifická indukce megakaryocytových kolonií jak z přečištěných myších hematopoetických kmenových buněk (Zeigler et al., Blood 84:404535 4052 (1994)), tak z lidských CD34+ buněk (Lok et al., Nátuře 369:568571 (1994); Raško et al.,

Stem Cells 15:33-42 (1997)), tvorba megakaryocytů s vyšší ploidií (Broudy et al., Blood 85:402413 (1995)), a indukce konečného vyzrávání megakaryocytů a produkce trombocytů (Zeigler et al., Blood 84:4045-4052 (1994); Choi et al., Blood 85:402-413 (1995)). Naopak syntetické protismyslné oligodeoxynukleotidy k TPO receptoru (c-Mpl) statisticky významně inhibují schop40 nost megakaryocytámích progenitorů tvořit kolonie (Methia et al., Blood 82:1395-1401 (1993)). Dále, myši s vyházením c-Mpl genu mají závažnou trombocytopenii a deficit megakaryocytů (Alexander et al., Blood 87:21622170 (1996)).

Rekombinantní lidský MGDF (rHuMGDF, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) je dalším trombo45 poetickým peptidem příbuzným s TPO. Je produkován v E. coli transformovaných plasmidem obsahujícím cDNA bodující zkrácený protein zahrnující amino-koncovou doménu pro vazbu na receptor lidského TPO (Ulich et al., Blood 86:971-976 (1995)). Polypeptid se extrahuje, složí a přečistí a na amino-konec se kovalentně naváže poly[ethylenglykolová] (PEG) skupina. Výsledná molekula se zde potom označuje PEG-rHuMGDF nebo krátce MGDF.

Různé studie na zvířecích modelech (Ulich, T. R. et al, Blood 86:971-976 (1995); Hokom, Μ. M. et al., Blood 86:4486-4492 (1995)) jasně prokázaly terapeutickou účinnost TPO a MGDF pri transplantaci kostní dřeně a při léčbě trombocytopenie, kteráje často důsledkem chemoterapie nebo aktinoterapie. Předběžná data u lidí potvrdila použitelnost MGDF pro zvýšení počtu trom55 bocytů v různých situacích (Basser et al., Lancet 348: 1279-81 (1996); Kato et al., Journal of

- 1 CZ 302155 B6

Biochemistry 119:229-236 (1996); Ulich et al., Blood 86:971-976 (1995)). MGDF může být použit pro zvýšení výtěžku trombocytů při dárcovství krve, protože podání MGDF zvyšuje počet cirkulujících trombocytů u zdravých dárců přibližně 3krát.

TPO a MGDF působí prostřednictvím vazby na c-Mpl receptor, který je exprimován primárně na povrchu některých hematopoetických buněk, jako jsou megakaryocyty, trombocyty, CD34+ buňky a primitivní progenitorové buňky (Debili, N. et al., Blood 85:391401 (1995); de Sauvage, F. J. et al, Nátuře 369:533-538 (1994); Bartley, T. D., et al., Cell 77: 1117-1124 (1994); Lok, S. et al.. Nátuře 369: 565-8 (1994). Jako většina receptorů pro interleukiny a proteinové hormony io náleží cMPl ke třídě I superrodíny cytokinových receptorů (Vigon, 1. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:56405644 (1992)). Aktivace této třídy receptorů zahrnuje homodimerizaci indukovanou vazbou ligandů, která spouští kaskádu přenosu signálu.

Obecně, interakce proteinového ligandů sjeho receptorem probíhá na relativně velkém rozhraní.

Nicméně, jak je prokázáno v případě lidského růstového hormonu navázaného na svůj receptor, většina vazebné energie je získána od několika klíčových zbytků (Clackson, T. et al., Science 267:383-386 (1995). Toto a skutečnost, že zbytek proteinového ligandů slouží pouze pro dosažení správné homologie vazebných epitopů umožňuje přípravu aktivních ligandů mnohem menší velikosti.

Pro provedení této přípravy se systém fágové peptidové zobrazovací knihovny ukázal jako účinný systém pro identifikaci malých peptidových mimetik větších proteinových ligandů (Scott, J. K. et al.. Science 249:386 (1990); Devlin, J. J. et al., Science 249:404 (1990). Pomocí této techniky byly objeveny malé peptidové molekuly, které působí jako agonisté c-MPl receptoru (Cwirla, S. E. etal.. Science276: 1696-1699(1997)).

V takových technikách jsou malé peptidové sekvence zobrazené jako fúze s obalovými proteiny filamentózního fágu afinitně eluovány proti protilátkou imob i I izované extracelulámí doméně cMPI a zachycené fágy se zpracují v dalším kolem afinitního přečištění. Tato vazebná selekce a proces repropagace mohou být opakovány mnohokrát za získání souboru peptidových sekvencí se silnou vazbou. Takto byly nejprve identifikovány dvě rodiny c-Mpl-vazebných peptidu, navzájem nepříbuzných v sekvenci. Potom byly připraveny mutagenní knihovny, které sloužily pro další optimalizaci nej lepších vazebných činidel, což nakonec vedlo k izolaci velmi aktivního peptidu s lC₅o = 2 nm a EC₅₀ = 400 nM (Cwirla, S. E. et al., Science 276:1696-1699 (1997)).

Tento 14 aminokyselinový peptid, označený jako TMP (TPO Mimetic Peptide), neměl zřejmou homologii sekvence k TPO nebo MGDF, Vzorek této TMP sloučeniny je:

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala SEQ ID NO: 1; nebo

IEGFTLRQWLAARA při použití jednopísmenných aminokyselinových zkratek.

Dříve byl v podobné studii zaměřené ne EPO mimetické peptidy objeven EPO mimetický peptid (EMP), který byl objeven za použití stejné techniky (Wrighton, N. C. et al., Science 273:458-463 (1996)) a bylo zjištěno, že působí jako dimer ve vazbě na EPO receptor (EPOR). Takto vytvoře45 ný komplex ligand/receptor má podle rentgenové krystalografie C2 symetrii (Livnah, O. et al., Science 273464-471 (1996)). Podle této informace o struktuře byl navržen = kovalentně vázaný dimer EMP, ve kterém byly C-konce dvou EMP monomerů zesítěný flexibilní oddělující skupi. ? CZ 302155 B6 nou a bylo zjištěno, že tato sloučenina má značně vyšší vazbu, stejně jako biologickou aktivitu in vitro i ín vivo (Wrighton, N. C., et al·, Nátuře Biotechnology 15:1261-1265 (1997).

Podobná strategie dimerizace na C-konci byla použita pro TPO mimetický peptid (TMP) 5 (Cwirla, S. E. et al.. Science 276:1696-1699 (1997)). Bylo zjištěno, že C-koncově vázaný dimer (C-C vazba) TMP má lepší vazebnou afinitu 0,5 nM a zřetelně vyšší aktivitu in vitro (EC₅₀ = 0,1 nM) v testech proliferace buněk (Cwirla, S. E. et al., Science 276: 1696-1699 (1997)). Struktura tohoto TMP C-C dimeru je uvedena dále:

V jiném aspektu předkládaného vynálezu mohou být tandemové dimery dále navázány na jednu nebo více skupin, které jsou odvozeny od imunoglobulinových proteinů a které jsou obecně označovány jako Fc regiony imunoglobulinu. Výsledné sloučeniny jsou zde označovány jako Fc fúze TMP tandemových dimerů.

Dále je uvedena krátká část týkající se Fc regionů protilátek, které jsou použitelné v souvislosti se sloučeninami podle předkládaného vynálezu.

Protilátky obsahují dvě funkčně nezávislé části, variabilní doménu, známou jako „Fab“, která váže antigen, a konstantní doménu, známou jako „Fc“, která umožňuje napojení na efektorové funkce, jako je fixace komplementu nebo fagocytóza. Fc část imunoglobulinu má dlouhý plazmatický poločas, zatímco Fab má krátký (Capon et al., Nátuře 337: 525-531 (1989)).

Terapeutické proteinové produkty byly připraveny s Fc doménou za účelem prodloužení poločasu nebo vložení funkcí jako je vazba na Fc receptor, vazba na protein A, fixace komplementu a placentami přenos, kde tyto funkce jsou všechny vlastní Fc regionu imunoglobulinu (Capon et al., Nátuře 337: 525-531 (1989)), Například, Fc region IgGl protilátky byl fúzován na CD30-L, molekulu, které se váže na CD30 receptory exprimované na buňkách Hodgkinova lymfomu, anaplastického lymfomu, T-lymfocytární leukemie a jiných typech malignit. Viz US Patent 5480981. IL10, protizánětlivé a antirejekční činidlo, byl fúzován na myší Fcy2a pro prodloužení krátkého poločasu cytokinů v cirkulaci (Zheng, X- et al., The Journal of Immunology, 154: 5599-5600 (1995)). Studie také hodnotily použití receptoru pro faktor nekrózy nádorů navázané35 ho na Fc protein lidského IgGl pro v léčbě pacientů se septickým šokem (Fisher, C. et al., NEngl. J. Med. 334: 1697-1702 (1996); VanZee, K. etal., The Journal of Immunology 156: 22212230 (1996)). Fc byl také fúzován s CD4 receptorem za zisku terapeutického proteinu pro léčbu AIDS. Viz Capon et ak, Nátuře 337: 525-531 (1989). Dále byl interleukin 2 fúzován na Fc část IgGl nebo IgG3 pro prodloužení krátkého poločasu interleukinu 2 a pro překonání jeho systémo40 vé toxicity. Viz Harvill et ak, Immunotechnology 1: 95-105 (1995).

I přes dostupnost TPO a MGDF proto existuje potřeba dalších sloučenin, které stimulují produkci trombocytů (mají trombopoetickou aktivitu) a/nebo prekurzorových buněk trombocytů, zejména megakaryocytů (mají megakaryopoetickou aktivitu). Předkládaný vynález poskytuje nové slou45 čeniny mající tyto aktivity a související aspekty.

-3CZ 302155 B6

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje skupinu sloučenin, které jsou schopné vazby c-Mpl receptor a spuštění signálu prostřednictvím c-Mpl receptoru, což je stejný receptor, který zprostředkuje aktivitu endogenního trombopoctinu (TPO). Proto mají sloučeniny podle předkládaného vynálezu Irombopoetickou aktivitu, tj. schopnost stimulovat, in vivo a in vitro, produkci trombocytů, a/nebo megakaryotiopoetickou aktivitu, tj. schopnost stimulovat, in vivo a in vitro, produkci prekurzor ů trombocytů.

Prvním aspektem předmětu vynálezu v základním provedení i) je sloučenina, která se váže na mpl receptor a obsahuje strukturu (Fc)_m-(L₂)_qTMP,-(L|)_n-TMP₂-(L₃)r-(Fc)_p kde TMP] a TMP₂ jsou každý nezávisle vybrány ze skupiny základních sloučenin obsahujících strukturu

Xj-Xí-X^Xs-Xé-Xr-Xs-Xo-X i kde

X₂ je vybrán ze souboru sestávajícího z Glu, Asp, Lys a Val;

Xi je vybrán ze souboru sestávajícího z Gly a Ala;

X₄ je Pro;

X₅ je vybrán ze souboru sestávajícího z Thr a Ser;

X₆ je vybrán ze souboru sestávajícího z Leu, Ile, Val, Ala, a Phe;

X? je vybrán ze souboru sestávajícího z Arg a Lys;

X« je vybrán ze souboru sestávajícího z Gin, Asn, a Glu;

X₉ je vybrán ze souboru sestávajícího z Trp, Tyr, Cys, Ala a Phe;

Xio je vybrán ze souboru sestávajícího z Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met, a Lys;

L|, L₂ a Li jsou spojovací skupiny nezávisle zvolené ze souboru sestávajícího z Y_n, kde Y je přirozená aminokyselina nebo její stereoizomer a n je 1 až 20;

(Gly)_n, kde n je 1 až 20 a kde je-li n větší než 1, tak může být až polovina Gly zbytků nahrazena zbytky jiné aminokyseliny vybrané ze zbývajících 19 přirozených aminokyselin nebo jejich stereo izomerů;

(Gly)₃Lys(Gly)₄ (SEQ ID NO: 6);

(Gly)₃AsnGlySer(Gly)₂ (SEQ ID NO: 7);

(Gly)₃Cys(Gly)₄ (SEQ ID NO: 8);

GlyProAsnGly (SEQ ID NO: 9);

Zbytku Cys a (CH₂)_n, kde n představuje číslo 1 až 20;

Fc je Fc region imunoglobulinu; n je 0 nebo 1;

-4CZ 302155 B6 m, p, qa r jsou každý nezávisle zvolen ze souboru sestávajícího z 0 a 1, přičemž alespoň jeden z m nebo p je 1 a dále když mje 0, potom q je 0, a když p je 0, potom rje 0; ajejí farmaceuticky přijatelné soli.

Výhodná provedení prvního aspektu předmětu vynálezu zahrnují zejména tato provedení:

ii) Sloučeninu podle základního provedení i), kde TMPj a TMP₂ jsou nezávisle vybrány ze souboru sestávajícího z

X2-X3-X4-X5-X₆-X7-Xe-X9“Xio-Xn;

X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12;

X2--X3-X4-X5-X6-X7-Xs - X9-Xi0-Xll-Xl2 - X13 ;

X2-X3-X4-X5-X6-X7-XB-X9-X10-X11-X12-X13-X14;

x₁-x₂-x₃-x₄-x₅-X6-X7-X9-X9-Xio;

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10--XU; Χι-Χ₂-Χ₃-Χ₄-Χ5-Χ6-Χ7-Χ8-Χ9-Χιο-Χιι“Χΐ2; Xi-X₂-X3-X₄-X5-X6“X7-Xe-X9-Xio-Xii-Xi2-Xi3; a XÍ-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14;

kde

X₂ až X10 mají výše uvedený význam;

X, je vybrán ze souboru sestávajícího z Ile, Ala, Val, Leu, Ser, a Arg;

X11 je vybrán ze souboru sestávajícího z Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His, a Glu;

X_l2 je vybrán ze souboru sestávajícího z Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Gly, Ser a Gin;

X13 je vybrán ze souboru sestávajícího z Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gin, a Gly; a

X14 je vybrán ze souboru sestávajícího z Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu a Gly.

iii) Sloučeninu podle základního provedení i), kde TMP_t a/nebo TMP₂ jsou derivatizovány jedním nebo více z následujících způsobů:

jedna nebo více peptidylových vazeb [-C(O)NR-] je nahrazena nepeptidylovou vazbou zvolenou ze souboru sestávajícího z -CH₂-karbamátové vazby [-CH₂-OC(O)NR-]; fosfonátové vazby; CHr-sulfonamidové vazby [-CH₂-S(O)₂NR-]; močovinové vazby [-NHC(O)NH-]; -CH₂sekundární aminové vazby; a alkylované peptidové vazby [~C(O)NR⁶- kde R⁶ je nižší alkyl];

N-konec je -NRR¹; na -NRC(O)R skupinu; -NRC(O)OR- skupinu; -NRS(O)₂R skupinu; NHC(O)NHR skupinu, kde R a R¹ jsou vodík nebo nižší alkyl, s podmínkou, že R a R¹ nejsou oba vodík; sukcinimidovou skupinu; benzy loxykarbony 1-N H-(CBZ-NH-) skupinu; nebo benzy loxykarbony 1-N H-skupinu obsahující 1 až 3 substituenty na fenylovém kruhu vybrané ze souboru sestávajícího z nižší alkylskupiny, nižší alkoxy skupiny, chloru a bromu; a

C konec je -C(O)R², kde R² je vybrán ze skupiny sestávající z nižší alkoxyskupiny a-NR³R⁴, kde R³ a R⁴ jsou nezávisle vybrány ze souboru sestávajícího z vodíku a nižší alkylskupiny.

_ 5 .

iv) Sloučeninu podle základního provedení i), která je cyklická.

v) Sloučeninu podle základního provedení i), kde TMP| a TMP₂ jsou oba

S

1le-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala (SEQ ID NO: 1).

vi) Sloučeninu podle kteréhokoliv z výše uvedených provedení i) až v), kde L|, L? a L₅ je každý nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z Y„, přičemž Y je vybrán z přirozených amino-kyselin io nebo jejich stereoizomerů a n představuje I až 20.

vii) Sloučeninu podle kteréhokoliv z výše uvedených provedení i) až vi), kde L_b L₂ a L₍ obsahuje (Gly),,, kde n je 1 až 20 a kde je-li n větší než 1, tak může být až polovina Gly zbytků nahrazena zbytky jiné aminokyseliny vybrané ze zbývajících 19 přirozených aminokyselin nebo jejich ste15 reoizomerů.

viii) Sloučeninu podle kteréhokoliv z výše uvedených provedení i) až vii), kde Li je (Gly)_s a L? je (Gly)».

:o ix) Sloučeninu podle kteréhokoliv z výše uvedených provedení i) až viii) zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 46.

x) Sloučeninu podle provedení vi), kde L₍, L₂ a L, je každý nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z

(Gly)₃Lys(Gly)₄	(SEQ	ID	NO:	6)
(Gly) ₃AsnGlySer (Gly) ₂	(SEQ	ID	NO:	7)
(Gly)₃Cys(Gly)₄	(SEQ	ID	NO:	8)
GlyProAsnGly	(SEQ	ID	NO:	9)

xi) Sloučeninu podle provedení vi), kde L,, L₂ nebo L₃ obsahuje zbytek Cys.

so xii) Sloučeninu podle kteréhokoliv z výše uvedených provedení i) až xi), kterou je dimer.

xiii) Sloučeninu podle kteréhokoliv zvýše uvedených provedení i) až v), kde L₍, L₂ nebo L_sobsahuje (CH₂)_n, kde n představuje 1 až 20.

- 6 CZ 302155 B6 xiv) Sloučeninu podle základního provedení í) zvolenou ze souboru sestávajícího z

Fc-IEGFfLRQWLAARA-GPNG-IEGPTlJRQWlJkARA (SEQ. ID NO: 22)

Ρο-ΙΕΟΡΤΕΡΟΧνΕΑΛΚΛ-ΟΡΝΟ-ΙΕΟΡΤΕΚς^νΕΛΑΚΑ-Ρο (SEQ, ID NO: 23)

IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA-Fc (SEQ. ID NO: 24)

Fc-GG-IEGPTERQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 25)

Fc-IEGPTERQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 26)

Fc-IEGPTLRQCEAARA-GGGGGGGG-IEGPTERQCLAARA (cyklické)

!................| (SEQ. ID NO: 27)

Fc-lEGPTLRQCL A ARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (lineární) (SEQ. ID NO: 28)

Fc-IEGPTERQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA

Fc-1EGP'I7.RQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA

Fc-IEGFrLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWEAARA (SEQ. ID NO; 29) (SEQ. ID NO: 30) (SEQ. ID NO: 31) (SEQ. ID NO: 32)

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-I£GPTLRQWLAARA *

Fc-1EGP3’LRQWLAARA-GGGCGGGG-1EGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 33)

Fc-GGGGG-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 34).

Dalším aspektem předmětu vynálezu je farmaceutická kompozice, která obsahuje sloučeninu podle kteréhokoliv z provedení i) až xiv) ve směsi s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Ještě dalším aspektem předmětu vynálezu je polynukleotid, který kóduje sloučeninu podle kteréhokoliv z provedení i) až xiv).

o

Ještě dalším aspektem předmětu vynálezu je vektor, který obsahuje polynukleotid uvedený v předchozím odstavci.

Ještě dalším aspektem předmětu vynálezu je hostitelská buňka, která obsahuje takový vektor.

-7CZ 302155 B6

Jiným aspektem předmětu vynálezu je způsob výroby sloučeniny podle kteréhokoliv z provedení i) až xiv), který zahrnuje kultivaci výše uvedené hostitelské buňky podle vynálezu ve vhodném živném médiu a izolaci sloučeniny z buňky nebo živného média.

Předmět vynálezu dále také zahrnuje

- sloučeninu podle kteréhokoliv z provedení i) až xiv) pro použití jako léčivo;

- použití sloučeniny podle kteréhokoliv z provedení i) až xiv) pro výrobu léčiva k použití pro zvyšování megakaryocytů nebo destiček u pacienta;

- použití sloučeniny podle kteréhokoliv z provedení i) až xiv) pro výrobu léčiva k použití pro způsob léčení thrombocytopenie u pacienta, který takové léčení potřebuje, přičemž takovému pacientovi se podává účinné množství sloučeniny;

- použití sloučeniny podle kteréhokoliv z provedení i) až xiv) pro výrobu léčiva pro líčení idiopatické nebo imunitní thrombocytopenie, ITP, u pacienta, který takové léčení potřebuje, přičemž takovému pacientovi se podává účinné množství sloučeniny; a

- použití sloučeniny podle kteréhokoliv z provedení i) až xiv) pro výrobu léčiva pro léčení myelodysplastického syndromu u pacienta, který takové léčení potřebuje, přičemž takovému pacientovi se podává účinné množství sloučeniny.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou výhodně peptidy a mohou být připraveny standardními způsoby syntézy nebo jinými způsoby pro přípravu peptídů. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu, které obsahují nepeptidové části, mohou být syntetizovány standardními reakcemi organické chemie, kromě standardních reakcí peptidové syntézy, pokud jsou použitelné.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro terapeutické nebo profylaktické účely po přípravě s vhodnými farmaceutickými nosiči a mohou být podány v účinné dávce jedinci, jako je člověk (nebo jiný savec). Další související aspekty jsou také součásti předkládaného vynálezu.

Přehled obrázků na připojených výkresech

Mnoho dalších aspektů a výhod předkládaného vynálezu bude jasných po prostudování následujícího podrobného popisu, ve kterém jsou uvedeny odkazy na následující obrázky, kde:

Obr. 1 znázorňuje příkladné Fc polynukleotidové a proteinové sekvence (SEQ ID NO: 3 je bodující řetězec čtený 5'->3', SEQ ID NO: 4 je komplementární řetězec čtený 3'->5'; a SEQ ID NO: 5 je kódovaná aminokyselinová sekvence), které mohou být použity v Fc fúzních sloučeninách podle předkládaného vynálezu.

Obr. 2 znázorňuje schéma syntézy pro přípravu pegylovaného peptidu 19 (SEQ ID NO: 17).

Obr. 3 znázorňuje schéma syntézy pro přípravu pegylovaného peptidu 20 (SEQ ID NO: 18).

Obr. 4 ukazuje počet trombocytů generovaných in vivo u normální samice BDF1 myši ošetřené jednou 100 pg/kg bolusovou injekcí různých sloučenin: PEG-MGDF označuje PEG s průměrnou molekulovou hmotností 20kDa navázaný na N-koncovou aminoskupinu redukční aminací na aminokyseliny 1-163 přirozeného lidského TPO, který je exprimován v E. coli (takže není glykosylovaný) (viz WO 95/26746 nazvaná „Prostředky a způsoby pro stimulaci růstu a diferenciace megakaryocytů“); TMP označuje sloučeninu SEQ ID NO: 1; TMP-TMP označuje sloučeninu SEQ ID NO: 21; PEG-TMP-TMP označuje sloučeninu SEQ ID NO: 18, kde PEG skupinou je PEG průměrné molekulové hmotnosti 5 kDa navázaný způsobem podle obr. 3; TMP-TMP-Fc je definován dále a Fc-TMP-TMP je stejný jako TMP-TMP-Fc s tím rozdílem, že Fc skupina je navázaná naN-konec místo C-konce TMP-TMP peptidu.

-8CZ 302155 B6

Obr. 5 ukazuje počet trombocytú generovaných in vivo u normální BDF1 myši léčené různými sloučeninami podanými implantovanou osmotickou pumpou během 7 dnů. Sloučeniny jsou stejné, jako na obr. 4.

Obr. 6A, 6B a 6C jsou schematické diagramy výhodných sloučenin podle předkládaného vynálezu. Obr. 6A ukazuje Fc fúzní sloučeninu, ve které je Fc skupina fúzovaná na N-konec TMP dimeru a ve které je Fc část v monomerní (jednořetězcové) formě. Obr. 6B ukazuje Fc fúzní sloučeninu, ve které je Fc skupina fúzovaná na N-konec TMP dimeru a ve které je Fc část dimemí a jeden Fc monomer je navázán na TMP dimer. Obr. 6C ukazuje Fc fúzní sloučeninu, ve které je Fc skupina fúzovaná na N-konec TMP dimeru a ve které je Fc část dimemí a oba Fc monomery jsou navázány na TMP dimer.

Podrobný popis výhodných provedení

Při vyhledávání malých struktur jako vedoucích sloučenin při vývoji terapeutických činidel s výhodnějšími vlastnostmi byly navrženy různé typy dimeru TMP a příbuzných struktur, ve kterých byl C-konec jednoho TMP peptidů navázán na N-konec druhého TMP peptidů, buď přímo, nebo prostřednictvím spojovací skupiny, a potom byl zkoumán vliv této dimerizace na biologickou aktivitu vzniklých dimerů. V některých případech byly navrženy takzvané tandemové dimery (C-N vazba) obsahující spojovací skupiny mezi dvěma monomery, kde tyto spojovací skupiny byly výhodně tvořeny přirozenými aminokyselinami, takže jejich syntéza byla možná pomocí rekombinantních technik.

Předkládaný vynález je založen na objevu skupiny sloučenin, které mají trombopoetickou aktivitu a o kterých se předpokládá, že zprostředkují svou aktivitu prostřednictvím vazby na endogenní TPO receptor, c-Mpl.

Sloučeniny a deriváty

V prvním výhodném provedení mají sloučeniny podle předkládaného vynálezu následující obecný vzorec:

TMP_t-<L₁)_n-TMP₂ kde TMPj a TMP₂ jsou každý nezávisle vybrány ze skupiny sloučenin obsahujících základní strukturu:

Xz^- X3—X4-X5“X&-X7— Χχ·-Χ<ΓX|0, kde

X₂ je vybrán ze skupiny zahrnující Glu, Asp, Lys, a Val;

X₃ je vybrán ze skupiny zahrnující Gly a Ala;

X₄ je Pro;

X₅ je vybrán ze skupiny zahrnující Thr a Ser;

X₆ je vybrán ze skupiny zahrnující Leu, Ale, Val, Ala, a Phe; X₇ je vybrán ze skupiny zahrnující Arg a Lys;

X₈ je vybrán ze skupiny zahrnující Gin, Asn, a Glu;

-9CZ 302155 B6

Xt> je vybrán ze skupiny zahrnující Trp, Tyr, Cys, Ala a Phe;

Xi» je vybrán ze skupiny zahrnující Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met, a Lys;

L) je spojovací skupina, jak je zde definována; a n je 0 nebo I;

io a patří mezi ně také fyziologicky přijatelné soli takových sloučenin.

V jednom provedení je L, (Gly)_n, kde n je l až 20 a kde je-li n větší než l, tak může být až polovina Gly zbytků substituována jinou aminokyselinou vybranou ze zbývajících 19 přirozených aminokyselin nebo jejich stereoizomerů.

Kromě základní struktury X2-X10 uvedené výše pro TMP| a TM P₂ jsou také možné jiné základní struktury, ve kterých je jedna nebo více následujících skupin přidána k základní struktuře TMP| a/nebo TMP₂: X, je navázán na N-konec a/nebo jsou X_N, X_t2, X_n a/nebo X|₄ navázány na Ckonec, kde X|, X₁₂, Xp a X₎₄ mají následující významy:

X, vybrán ze skupiny zahrnující Ile, Ala, Val, Leu, Ser, a Arg;

X11 je vybrán ze skupiny zahrnující Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His, a Glu;

X_t2 je vybrán ze skupiny zahrnující Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Gly, Ser a Gin;

Xn je vybrán ze skupiny zahrnující Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gin, a Gly; a

X_t4 je vybrán ze skupiny zahrnující Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu a Gly.

Termín „TMP“ označuje skupinu tvořenou, tj. obsahující, alespoň 9 podjednotek (X₂-X|₀), kde X₂-Xi₀ tvoří základní strukturu. Podjednotky X₂-X|₄ jsou výhodně aminokyseliny nezávisle vybrané z 20 přirozených aminokyselin; nicméně, vynález také zahrnuje sloučeniny, ve kterých jsou X₂—X14 nezávisle vybrány ze skupiny atypických, přirozeně se nevyskytujících aminokyselin dobře známých v oboru. Pro každou pozici jsou uvedeny výhodné aminokyseliny. Například, X₂může být Glu, Asp, Lys nebo Val. Jsou použity jak trojpísmenné, tak jednopísmenné zkratky aminokyselin; v každém případě jsou zkratky standardními zkratkami používanými pro 20 přirozených aminokyselin nebo jejich dobře známé variace. Tyto aminokyseliny mají L nebo D stereochem ickou konfiguraci (kromě Gly, který není ani L, ani D), a TMP může obsahovat kombinaci stereochem ických konfigurací. Nicméně, L konfigurace je výhodná pro všechny aminokyseliny v TMP řetězci. Vynález také poskytuje reverzní TMP molekuly, ve kterých je aminokoncová až karboxy-koncová sekvence aminokyselin obrácena. Například, reverzní molekula k molekule mající sekvenci X|-X₂-X₃ bude mít sekvenci Χ₂-Χ₂-Χ]. Vynález také poskytuje retro-reverzní TMP molekuly, ve kterých je - podobně jako v reverzní TMP molekule - sek45 vence aminokyselin obrácena a ve které jsou dále zbytky, které jsou normálně L-enantiomery, změněny na D-stereoizomerické formy.

Vynález také zahrnuje fyziologicky přijatelné soli TMP. Termín „fyziologicky přijatelná sůl“ označuje soli, o kterých je nebo bude známo, že jsou farmaceuticky přijatelné. Některými kon50 krétními příklady jsou octan, trifluoracetát, hydrochlorid, hydrobromid, síran, citrát, vinan, glykolat, šťavelan.

Také se předpokládá, že za výše popsané TMP mohou být substituovány deriváty TMP. Takové deriváty TMP obsahují skupiny, ve kterých byla provedena jedna z následujících modifikací:

- 10CZ 302155 B6 jedna nebo více peptidylových vazeb [-C(O)NR-] byla nahrazena nepeptidylovou vazbou, jako je -CH2_karbamátová vazba [-CH2-OC(O)NR-]; fosfonátovou vazbou; -CFT-sulfonamidovou [-CHr-S(O)₂NR-] vazbou; močoví novou [NHC(O)NH-] vazbou; -CH₂-sekundámí amin- vazbou; nebo alkylovanou peptidylovou vazbou [-C(O)NR⁶-, kde R⁶ je nižší alkyl];

peptidy, ve kterých je N-konec derivatizován na -NRR¹ skupinu; na -NRC(O)R skupinu; na NRC(O)OR- skupinu; na -NRS(O)₂R skupinu; na -NHC(O)NHR skupinu, kde R a R¹ jsou vodík nebo nižší alkyl, s podmínkou, že R a R¹ nejsou oba vodík; na sukcinimidovou skupinu; na benzyloxykarbonyl-NH-(CBZ-NH_) skupinu; nebo na benzy loxykarbony l-NH-skupinu obsahující 1 až 3 substituenty na fenylovém kruhu vybrané ze skupiny zahrnující nižší alkyl, nižší io alkoxy, chlor a brom; a peptidy, ve kterých je volný C-konec derivatizován na -C(O)R², kde R² je vybrán ze skupiny zahrnující nižší alkoxy a-NR³R⁴, kde R³ a R⁴ jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík a nižší alkyl. Termín „nižší“ označuje skupinu obsahující od 1 do 6 atomů uhlíku.

Dále, modifikace jednotlivých aminokyselin mohou být vloženy do ŤMP molekuly reakcí cílových aminokyselinových zbytků peptidu s organickým derivatizačním činidlem, které může reagovat s vybranými vedlejšími řetězci nebo koncovými zbytky. Příklady jsou následující:

Lysinyl a aminokoncové zbytky mohou reagovat s anhydridem kyseliny jantarové nebo jiné kar20 boxy lové kyseliny. Derivatízace s těmito činidly vede k obrácení náboje lysinových zbytků. Dalšími vhodnými činidly pro derivatizaci zbytků obsahujících alfa-amino skupinu jsou imidoestery, jako je methylpikolinimidat; pyridoxal fosfát; pyridoxal; chlorborohydrid; kyselina trinitrobenzensulfonová; O-methylisomočovina; 2,4-pentandion; a může být provedena reakce s glyoxalatem katalyzovaná transaminázou.

Arginylové zbytky mohou být modifikovány reakcí s jedním nebo více běžnými činidly, jako je fenylglyoxal, 2,3-butandion, 1,2-cyklohexandion a ninhydrin. Derivatízace argininových zbytků vyžaduje, aby byla provedena za alkalických podmínek z důvodu vysoké pKa guanidinové funkční skupiny. Dále mohou tato činidla reagovat se skupinami lysinu, stejně jako s guanidino skupinami argininu.

Specifické modifikace tyrosylových zbytků byly důkladně studovány, zejména s ohledem na vkládání spektrálních značkovacích činidel do tyrosylových zbytků reakcí s aromatickými diazoniovými sloučeninami nebo tetranitromethanem. Nejčastěji jsou N-acetyl imidazol a tetranitro35 methan použity pro přípravu O-acetylovaných tyrosylových zbytků a 3-nitro-derivátů, v příslušném pořadí.

Karboxylové vedlejší skupiny (aspartylu nebo glutamylu) mohou být selektivně modifikovány reakcí s karbodiimidy (R'-N=C=N-R), jako je l-cyklohexyl-3-(2-morfoiinyl-(4-ethyl)40 karbodiimid nebo 1 -ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylfenyl)karbodiimid. Dále, aspartylové a glutamylové zbytky mohou být přeměněny na asparaginylové a glutaminylové zbytky reakcí s amoniovými ionty.

Glutaminylové a asparaginylové zbytky jsou často deaminovány na příslušné glutamylové a aspartylové zbytky. Alternativně mohou být tyto zbytky deaminovány za mírně kyselých podmínek. Všechny formy těchto zbytků spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

Derivatízace s bi funkčním i činidly je použitelná pro zesítění peptidů nebo jejich funkčních derivátů na matrici nerozpustné ve vodě nebo na jiných makromolekulových nosičích. Mezi běžně používaná zesíťovací činidla patří, například, l,l-bis(diazoacetyl)-2-fenylethan, glutaraldehyd, N-hydroxysukcinimidové estery, například estery s kyselinou 4—azidosalicylovou, homobifunkční imidoestery, včetně disukcinimidy lových esterů jako je 3,3'—dithiobis( suke in imidy Ipropionat), a bifunkční maleímidy, jako je bis-N-maleimido-1,8-oktan. Derivatizační činidla jako je tnethyl-3~[(p-azidofenyl)dithio]propioimidat vedou k zisku fotoaktivovatelných meziproduktů,

-11CZ 302155 B6 které mohou vytvářet zesítění za přítomnosti světla. Alternativně mohou být pro i mobil izaci proteinu použity reaktivní matrice nerozpustné ve vodě, jako jsou karbohydráty aktivované bromkyanem a reaktivní substráty popsané v U.S. patentech 3969287; 3691016; 4195128; 4247642; 4229537 a 4330440.

Dalšími možnými modifikacemi jsou hydroxy láce prolinu a lysinu, fosfory láce hydroxylových skupin serylových a threony lových zbytků, oxidace atomu síry v Cys, methy láce alfa-amino skupin vedlejších řetězců lysinu, argininu a histidinu (Creighton, T. E.: Proteins: Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman and Co., San Francisko, str. 79-86 (1983)), acetylace Nkoncového aminu a, v některých případech, amidace C-koncových karboxylových skupin.

Takové derivatizované skupiny výhodně zlepšuj í jednu nebo více charakteristik, včetně trombopoetické aktivity, rozpustnosti, absorpce, biologického poločasu a podobně, sloučenin podle předkládaného vynálezu. Alternativně vedou derivatizované skupiny ke vzniku sloučenin, které mají stejné ~ nebo v podstatě stejné - charakteristiky a/nebo vlastnosti jako nederivatizované sloučeniny. Skupiny mohou alternativně eliminovat nebo oslabovat jakékoliv nežádoucí účinky sloučenin a podobně.

Kromě základní struktury X₂-Xio uvedené výše jsou vhodnými strukturami ty, které mají další X skupiny navázané na základní strukturu, na základní strukturu může tak být navázán X₍ a/nebo Xi i, X i2, X13 a X|₄. Některými příklady dalších struktur jsou:

X₂-X3-X4-X5^-Xg^-X7~X8“X9“Xi0“Xi1 ;

X2--X3-X4 - X5-X6-X7-X8-X9-XlO-Xll-Xl2 ; X2-X3-X4“X5-X6“X7-X8-X9-Xl0-Xll”Xl2-Xl3;

X2-X3-X4-Xs-X6-X7-Xa-X9“Xio-Xii-Xi2-Xn-X14 ; Xi-X2-X3“X4“X5-X6-X7-Xs-X9-Xio;

Xi-X₂-X3-X4’X5-X6-X7-X8-X9-Xio-Xh;

X L-Χ2-Χ3-Χ4 -Χ5-Χ6-X7-ΧΘ-Χ9-Χ10-Xu-X12;

Xl-X2-X3-X4“X5-X6“X7-X8-X9“XlO-Xll“Xl2-Xl3;

Χι-Χ2-Χ3-Χ4-Χ5-Χ6-Χ7-Χ8^Χ9-Χ10“Χι1-Χι2“Χι3“Χη;

kde Xj až X_t4 jsou stejné, jak byly popsány výše. Každý z TMPi a TMP₂ může být stejný nebo různý v sekvenci a/nebo délce. V některých výhodných provedeních jsou TMPi a TMP₂ stejné. Zejména výhodný TMP je:

Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-ArgGln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala (SEQ (DNO: 1).

Termín „obsahující“, jak je zde použit, znamená, mimo jiné, že sloučenina může obsahovat další aminokyseliny na N- a/nebo C-konci dané sekvence. Nicméně, protože je přítomna struktura jako například X₂ až X_t0, X₍ až X_i4 a podobně, je ostatní chemická struktura relativně méně významná. Je samozřejmé, že jakákoliv vnější struktura mimo X₂-X_lfl nebo Xi-X|₄, by neměla významněji interferovat s trombopoetickou aktivitou sloučeniny. Například, N-koncový Met zbytek spadá do rozsahu předkládaného vynálezu. Dále, ačkoliv je mnoho výhodných sloučenin podle předkládaného vynálezu tandemovými dimery, protože obsahují dvě TMP skupiny, jsou jiné sloučeniny podle předkládaného vynálezu tandemovými multímery TMP, tj. sloučeninami majícími následující struktury:

TMP1-L-TMP2-L-TMP3;

TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4;

TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-L--TMP5;

kde TMP,. TMP₂, TMP₃, TMP₄ a TMP₅ mohou být stejné nebo odlišné a kde TMP a L jsou stejné, jak je zde definováno a spojovací skupiny L jsou volitelné. Výhodně obsahují sloučeniny podle předkládaného vynálezu od 2 do 5 TMP skupin, lépe 2-3 a nejlépe 2. Sloučeniny podle prvního provedení předkládaného vynálezu budou výhodně obsahovat celkem méně než 60, lépe méně než 40 aminokyselin (tj. bude se jednat o peptidy).

Jak bylo uvedeno výše, sloučeniny podle prvního provedení předkládaného vynálezu jsou výhodně TMP dimery, které jsou navázané buď přímo nebo prostřednictvím spojovací skupiny. Monomemí TMP skupiny jsou uvedeny v běžné orientaci od N k C-konci a čtou se zleva doprava. Tak je vidět, že všechny sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou orientovány tak, že C-konec TMP| je navázán buď přímo, nebo prostřednictvím spojovací skupiny, na N-konec TMP₂. Toto uspořádání se označuje jako tandemové uspořádání a sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být označovány jako „tandemové dimery“. Tyto sloučeniny jsou označovány jako dimery i tehdy, jsou-li TMP| a TMP₂ strukturálně odlišné. Vynález tedy zahrnuje jak homodimery, tak heterodimery.

„Spojovací“ skupina („L₍“) je volitelná. Pokud je přítomna, tak není její chemická struktura zásadní, protože slouží primárně jako oddělovací skupina. Spojovací skupina by měla být vybrána tak, aby ne interferovala s biologickou aktivitou konečné sloučeniny a také aby významně nezvyšovala imunogenicitu konečné sloučeniny. Spojovací skupina je výhodně tvořena aminokyselinami vázanými navzájem peptidovou vazbou. Ve výhodných provedeních je tedy spojovací skupina tvořena Y_n, kde Y je přirozená aminokyselina nebo její stereoizomer a „n“ je 1 až 20. Spojovací skupina je tak tvořena 1 až 20 aminokyselinami vázanými peptidovými vazbami, kde tyto aminokyseliny jsou vybrány z 20 přirozených aminokyselin. Ve výhodném provedení je 1 až 20 aminokyselin vybráno z Gly, Ala, Pro, Asn, Gin, Cys, Lys. Ještě lépe je spojovací skupina tvořena z většiny aminokyselinami bez sterického omezení, jako je Gly, Gly-Gly-[(Gly)₂], Gly-GlyGly-[(Gly)₃], Ala, Gly-Ala, Ala-GIy, Ala-Ala, atd. Jinými konkrétními příklady spojovacích skupin jsou:

(Gly}₃Lys (Gly) 4 (SEQ ID NO: 6);

(Gly) ₃AsnGlySer (Gly) 2 (SEQ ID NO: 7);

(tato sloučenina poskytuje místa pro glykosylaci, když je produkována rekombinantně v savčím buněčném systému, který může glykosylovat taková místa);

(Gly) ₃Cys (Gly) 4 (SEQ ID NO: 8); a

GlyProAsnGly (SEQ ID NO: 9).

Pro vysvětlení výše uvedeného názvosloví například (Gly)₃Lys(Gly)₄ označuje Gly-Gly-GlyLys-Gly-Gly-Gly-Gly. Výhodné jsou také kombinace Gly a Ala.

Je také možno použít nepeptidových spojovacích skupin. Mohou být použity například alkylové spojovací skupiny, jako je -HN-(CH₂)4-CO-, kde s = 2-20. Tyto alkylové spojovací skupiny mohou být dále substituované jakoukoliv skupinou bez sterického omezení, jako je nižší alkyl (například C|-C₆), nižší acyl, halogen (například Cl, Br), CN, NH₂, fenyl atd.

Jiným typem nepeptidové spojovací skupiny je polyethylenglykolová skupina, jako je:

- 13CZ 302155 B6

-UN-CIT-CTI₂-(O-CH₂CH₂)_n-O-CH₂-CO kde n je takové, že celková molekulová hmotnost spojovací skupiny je v rozsahu od přibližně 101 do 5000, lépe 101 až 500.

Obecně, bylo zjištěno, že pro trombopoetické sloučeniny podle prvního provedení předkládaného vynálezu jsou výhodné spojovací skupiny tvořené 0-14 podjednotkami (například aminokyselinami).

Peptidové spojovací skupiny mohou být přeměněny za vzniku derivátů stejným způsobem jak bylo uvedeno výše pro TMP.

Sloučeniny této první skupiny mohou být lineární nebo cyklické. „Cyklické“ označuje to, že alespoň dvě samostatné, tj. nekontinuální, části molekuly jsou vázány jedna na druhou. Například mohou být amino- a karboxylový konec molekuly navázány na sebe kovalentní vazbou za vzniku cyklické molekuly. Alternativně může molekula obsahovat dva nebo více Cys zbytků (například ve spojovací skupině), které mohou cyklizovat prostřednictvím tvorby disulfidových můstků. Dále se předpokládá, že více než jeden tandemový peptidový dimer se může vázat za vzniku dimeru dimerů. Například, tandemový dimer obsahující Cys zbytek může tvořit disulfidovou vazbu s Cys jiného dímeru.Viz, například, sloučeninu SEQ ID NO: 20 uvedenou dále.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být také kovalentně nebo nekovalentně asociovány s molekulou nosiče, jako je lineární polymer (například polyethylenglykol, polylysin, dextran atd.), polymer s rozvětveným řetězcem (viz například US patent 4289872, Denkenwalter et al., udělený 15. 9. 1981; 5229490, Tam, udělený 20. 1. 1993; WO 93/21259, Frechet et a!., publikovaný 28. 10. 1993); lipid; cholesterol ová skupina (jakoje steroid); nebo karbohydrát nebo oligosacharid. Dalšími možnými nosiči jsou polymery rozpustné ve vodě, jakoje po lyoxyethy lenglykol nebo propylenglykol, jak jsou popsány v US patentech 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192 a 4179337. Ještě jinými použitelnými polymery známými v oboru jsou monomethoxy-polyethylenglykol, dextran, celulóza nebo jiné polymery na bázi karbohydrátů, póly(N-vinylpyrrolidoný-polyethylenglykol, homopolymery propy lenglykolu, kopolymer polypropylenoxid/ethylenoxid, polyoxyethylované polyoly (například glycerol) a polyvinylalkohol, stejně jako směsi těchto polymerů.

Výhodným nosičem je polyethylenglykol (PEG). PEG skupina může mít jakoukoliv vhodnou molekulovou hmotnost a může být přímá nebo rozvětvená. Průměrná molekulová hmotnost PEG je výhodně v rozmezí od přibližně 2 kDa do přibližně 100 kDa, lépe od přibližně 5 kDa do přibližně 50 kDa, nejlépe od přibližně 5 kDa do přibližně 10 kDa.

PEG skupiny jsou obvykle navázány na sloučeniny podle předkládaného vynálezu acylací, redukční alkylaci, Michaelovou adicí, thiolovou alkylaci nebo jinými chemoselektivními konjugačními/ligačními metodami prostřednictvím reaktivní skupiny na PEG molekule (například aldehydové skupině, aminoskupiné, esterové skupině, thiolu, α-halogenacetylové, maleimidoskupině nebo hydrazino- skupině) a reaktivní skupiny na cílové sloučenině (například aldehydové skupině, amino-skupině, esterové skupině, thiolové skupině, α-halogenacetylové, maleimidoskupině nebo hydrazino- skupině).

Karbohydrátové (oligosacharidové) skupiny mohou být výhodně navázány na místa, která jsou známá jako glykosylační místa proteinů. Obecně, O-vázané oligosacharidy jsou navázány na serinové (Ser) nebo threoninové (Thr) zbytky, zatímco N-vázané oligosacharidy jsou navázané na asparaginové (Asn) zbytky, když jsou součástí sekvence Asn-X-Der/Thr, kde X může být jakákoliv aminokyselina s výjimkou prolinu. X je výhodně jedna s 19 přirozených aminokyselin kromě prolinu. Struktury N-vázaných a O-vázaných oligosacharidů a cukerných zbytků v každém typu jsou různé. Jedním běžným typem sacharidu je kyselina N-acetylneuraminová (zde označovaná jako kyselina sialová). Kyselina sialová je obvykle koncovým zbytkem N-vázaných

- 14 CZ 302155 B6 i O-vázaných oligosacharidů a může - díky svému negativnímu náboji - způsobovat kyselé vlastnosti glykosylované sloučeniny. Taková místa mohou být obsažena ve spojovací skupině sloučenin podle předkládaného vynálezu ajsou výhodně glykosylována buňkami během rekombinantní produkce polypeptidových sloučenin (například savčími buňkami jako jsou CHO, BHK, COS). Nicméně, taková místa mohou být glykosylována také během syntetických nebo semisyntetických postupů známých v oboru.

Některé příklady peptidů podle předkládaného vynálezu jsou uvedeny dále. Jsou použity jednopísmenné zkratky pro aminokyseliny a spojovací skupiny jsou odděleny pomlčkami pro jasný popis. Další zkratky: BrAc znamená bromacetyl BrCH₂C(O)) a PEG znamená polyethylenglykol.

IEGFTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 10)

IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (cyklický) |__| (SEQ ID NO: 11)

IEGPTLR QCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (lineární)

	(SEQ	ID	NO:	12)
IEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA	(SEQ	ID	NO:	13)
IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA	(SEQ	ID	NO:	14)
IEGPTLRQWLAARA-GGGK(BrAc)GGGG-IEGPTLRQWLAARA	(SEQ	ID	NO:	15)
IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA	(SEQ	ID	NO:	16)
IEGPTLRQWLAARA-GGGK(PEG)GGGG-IEGPTLRQWLAARA	(SEQ	ID	NO:	17)
IEGPTLRQWLAARA-GGGC(PEG)GGGG-IEGPTLRQWLAARA	(SEQ	ID	NO:	18)
IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA	(SEQ	ID	NO:	19)

IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA

IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 20) (SEQ ID NO: 21)

V každé sloučenině uvedené výše se také předpokládá N-koncový Met (nebo M- v jednopísmenném kódu). Multimery (například tandem a netándem, kovalentně vázaný a nekovalentně vázaný) výše uvedených sloučenin jsou také možné.

Ve druhém provedení předkládaného vynálezu mohou být sloučeniny popsané výše dále fúzovány na jednu nebo více Fc skupin, buď přímo, nebo prostřednictvím spojovacích skupin. Obecný vzorec pro tuto druhou skupinu sloučenin je:

(Fc)_m4L₂)_tl-TMP_t-(L,)n'-TMP₂-(L₃)r-{Fc)_p kde TMP|, TMP₂ a n jsou stejné, jak byly popsány výše; L_t, L₂ a L₃ jsou spojovací skupiny, které jsou vybrány nezávisle z výše definovaných spojovacích skupin; Fc je Fc region imunoglobulinů; m, p, q a r jsou každý nezávisle 0 nebo 1, kdy alespoň jeden z m nebo p je 1 a dále kdy pokud m je 0, tak q je 0, a pokud p je 0, tak r je 0; a mezi tyto sloučeniny patři také farmaceuticky přijatelné soli takových sloučenin.

- 15CZ 302155 B6

Sloučeniny této druhé skupiny mají struktury definované pro první skupinu sloučenin, jak byla popsána výše, ale tyto sloučeniny jsou dále fúzovány na alespoň jednu Fc skupinu buď přímo, nebo nepřímo prostřednictvím spojovacích skupin.

Fe sekvence sloučenin uvedených výše může být vybrána z lidského těžkého řetězce imunoglobulinu IgGl, viz Ellison, J. W. et al., Nucleic Acids Res. 10: 4071-4079 (1982), nebo jakákoliv jiná Fc sekvence známá v oboru (například jiná třída IgG včetně například lgG2, IgG3 a lgG4, nebojiných imunoglobulinu).

Je dobře známo, že Fc regiony protilátek jsou tvořeny monomerními polypeptidovými segmenty, které mohou být vázány do dimerních nebo multimerních forem disulfidovými vazbami nebo nekovalentními asociacemi. Počet intermolekulových disulfidových vazeb mezi monomerními podjednotkami přirozených Fc molekul je v rozsahu od 1 do 4 podle třídy (například IgA, IgG, IgE) nebo podtřídy (například IgGl, IgG2, IgG3, lgGAl, IgA2) použité protilátky. Termín „Fc“, jakje zde použit, označuje monomerní, dimemí a multimerní formy Fc molekul. Je třeba si uvědomit, že Fc monomery budou spontánně dimerizovat, když jsou přítomny vhodné Cys zbytky, pokud okolní podmínky nebrání dimerizaci prostřednictvím tvorby disulfidových můstků. 1 když jsou Cys zbytky, které normálně vytváří di sulfidové vazby v Fc dimeru, odstraněny nebo nahrazeny jinými zbytky, mohou monomerní řetězce dimerizovat prostřednictvím nekovalentních interakcí. Termín „Fc“, jakje zde použit, označuje jakoukoliv z těchto forem: přirozený monomer, přirozený dimer (vázaný disulfidovými vazbami), modifikované dimery (disulfidově a/nebo nekovalentně vázané) a modifikované monomery (tj. deriváty).

Varianty, analogy nebo deriváty Fc části mohou být připraveny, například, vytvořením různých substitucí zbytků nebo sekvencí.

Variantní (nebo analogické) polypeptidy zahrnují inserční varianty, ve kterých jeden nebo více aminokyselinových zbytků doplňuje aminokyselinovou sekvenci Fc. Inserce mohou být lokalizovány na jednom nebo na obou koncích proteinu, nebo mohou být umístěny ve vnitřních regionech aminokyselinové sekvence Fc. Inserční varianty s dalšími zbytky na jednom nebo obou koncích mohou zahrnovat, například, fúzní proteiny a proteiny obsahující aminokyselinové koncovky nebo značkovací skupiny. Například, Fc molekula může volitelně obsahovat N-koncový Met, zejména tehdy, je-li molekula exprimována rekombinantně v bakteriálních buňkách jako je E. coli.

V delečních variantách Fc je jeden nebo více aminokyselinových zbytků v Fc polypeptidu odstraněn. Delece mohou být provedeny na jednom nebo na obou koncích Fc polypeptidu, nebo mohou být odstraněny jeden nebo více zbytků v aminokyselinové sekvenci Fc. Deleční varianty proto zahrnují všechny fragmenty sekvence Fc polypeptidu.

V Fc substitučních variantách je jeden nebo více aminokyselinových zbytků Fc polypeptidu odstraněn a nahrazen alternativním zbytkem. V jednom aspektu jsou substituce konzervativní, vynález však zahrnuje také substituce, které jsou nekonzervativní.

Například, cysteinové zbytky mohou být deletovány nebo nahrazeny jinými aminokyselinami pro zabránění tvorby některých nebo všech disulfidových můstků v Fc sekvenci. Konkrétně, aminokyseliny v pozicích 7 a 10 SEQ ID NO: 5 jsou cysteinové zbytky. Je možné odstranit každý z těchto cysteinových zbytků nebo substituovat jeden nebo více takových cysteinových zbytků jinou aminokyselinou, jako je Ala nebo Ser. V jiném případě je možno provést substituce pro (1) odstranění vazebného místa pro Fc receptor; (2) odstranění vazebného místa pro komplement (Cíq); a/nebo pro (3) odstranění místa pro buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátkách (ADCC), Taková místa jsou známá v oboru a jakékoliv substituce známé v oboru je možno použít pro Fc v předkládaném vynálezu. Viz, například, Molecular Immunology, svazek 29, č. 5, 633-639 (1992), s ohledem na ADCC místa v IgG l.

- 16CZ 302155 B6

Podobně může být jeden nebo více tyrosinových zbytků nahrazen feny lalan i novým zbytkem. Do rozsahu předkládaného vynálezu také spadají další aminokyselinové inserce, delece (například v rozsahu 1-25 aminokyselin) a/nebo substituce. Obecně jsou výhodnější konzervativní aminokyselinové substituce. Dále, alterace mohou být ve formě alterovaných aminokyselin, jako jsou peptidomimetika nebo D-aminokyseliny.

Fc sekvence TMP sloučenin mohou být také der i váti zo vány, tj. mohou obsahovat modifikace jiné než inserce, delece nebo substituce aminokyselinových zbytků. Výhodně jsou modifikace kovalentního charakteru a zahrnují například chemické navázání polymerů, lipidů a jiných organicio kých a anorganických skupin. Deriváty podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny za účelem prodloužení cirkulujícího poločasu, nebo mohou být navrženy pro zlepšení specificity polypeptidů pro cílové buňky, tkáně nebo orgány.

Je také možno použít vazebnou doménu pro receptor intaktní Fc molekuly jako Fc část sloučenin is podle předkládaného vynálezu, jak je popsáno ve WO 96/32478, nazvané „Altered Polypeptides with Increased Half-Life“. Dalšími členy třídy molekul označované jako Fc jsou ty, které jsou popsány ve WO 97/34631, nazvané „Immunoglobulin-Like Domains with Increased HalfLives“. Obě publikované PCT přihlášky citované v tomto odstavci jsou zde uvedeny jako odkazy.

Fúze s Fc může být provedena na N nebo na C konci TMP_t nebo TMP₂ nebo na obou koncích TMP. Překvapivě bylo zjištěno, že peptidy, ve kterých je Fc skupina ligována na N-konec TMP skupiny, jsou biologicky aktivnější než ostatní, takže jsou přednostně tvořeny fúze obsahující Fc doménu na N-konci TMPi (tj. r a p jsou v obecném vzorci oba 0 a m a q jsou oba 1). Když je Fc řetězec fúzován na N-konec TMP nebo spojovací skupiny, tak jsou takové fúze obvykle provedeny na C-konci Fc řetězce a naopak.

Výhodné jsou také sloučeniny, které jsou dimery (například tandemové a netandemové) sloučenin podle obecného vzorce uvedeného výše. V takových případech je každý Fc řetězec navázán na tandemový dimer TMP peptidu. Schematický příklad takových sloučenin je uveden na obr. 6C. Výhodný příklad takových sloučenin je uveden na obr. 6C, kde Fc je dimer sloučeniny SEQ ID NO: 5, každý L₂ je (Gly)₅, TMPi a TMP₂ jsou každý sloučenina SEQ ID NO: 1 a každý L| je (Gly)₈. Tato sloučenina je zde také označována jako „Fc_TMP_t-L-TMP₂“. Je také reprezentována jako dimer (prostřednictvím Fc Části) SEQ ID NO: 34, Analogická sloučenina, ve které je Fc skupina navázána prostřednictvím spojovací skupiny na C-konec TMP₂ skupin na obr. 6C je také možná a je zde označována jako TMP|-L-TMP₂—Fc.

Některé konkrétní příklady sloučenin ze druhé skupiny jsou uvedeny dále:

- 17CZ 302155 B6

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 22)

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA-Fc (SEQ ID NO: 23) ffiGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA-Fc (SEQ ID NO: 24)

Fc-GG-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-rEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 25)

Fc-EEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 26)

Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (cyclic) |_| (SEQ ID NO:27)

Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (linear) (SEQ ID NO:28)

Fc-IEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA (SEQ ID NO. 29)

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 30)

Fc-TEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 31) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 32)

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA

I

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 33)

Fc-GGGGG-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 34)

V každé sloučenině uvedené výše se také předpokládá N-koncový Met (nebo M5 v jednopísmenném kódu). Met zbytek může být navázán na N-konec Fc skupiny v těch případech, kdy je Fc skupina navázaná na N-konec TMP. V těch případech, kdy je Fc skupina navázaná na C-konec TMP, může být Met zbytek navázán na N konec TMP skupiny.

V každém z výše uvedených případů je Fc výhodně Fc region těžkého řetězce lidského imunolo globulinu IgGl nebo jeho biologicky aktivní fragment, derivát nebo dimer, viz Ellison, J. W. et al., Nucleic Acids Res. 10: 4071^4079 (1982). Fc sekvence uvedená v SEQ ID NO: 5 je nejvýhodnější Fc pro sloučeniny uvedené výše. Také výhodné jsou výše uvedené sloučeniny, ve kterých je Fc dímerní formou sekvence SEQ ID NO: 5 a Fc řetězec je navázán na TMP tandemový dimer.

Dále, ačkoliv mnoho výhodných sloučenin druhého provedení obsahuje jeden nebo více tandemových dimeru v tom smyslu, že obsahují dvě navázané TMP skupiny, obsahují jiné sloučeniny podle předkládaného vynálezu tandemové multimery TMP, tj. jedná se o sloučeniny následujících příkladných vzorců:

- 18CZ 302155 B6

FC-TMP1-L-TMP2-L-TMP3;

FC-TMP1-L--TMP2-L-TMP3-L-TMP4 ;

FC-TMF1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-L-TMP5;

TMP1-L-TMP2-L-TMP3-FC;

TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-FC;

TMPi-L-TMP₂-L-TMP3-L-TMP4-L“TMP₅-Fc;

kde TMP], TMP₂, TMP₃, TMP₄ a TMP₅ mají stejné nebo různé struktury a kde Fc a každý TMP a L jsou stejné, jak jsou definovány výše a spojovací skupiny jsou volitelné. V každém případě uvedeném výše může být Fc skupina monomerní nebo dimemí a v případech, kdy je Fc skupina dimemí, může být na každý Fc řetězec navázán jeden nebo více TMP multimerů. Také jsou možné jiné příklady, ve kterých jsou TMP dimery nebo multimery navázány na N i C konec jednoho nebo obou Fc řetězců, včetně případů, kdy jsou TMP dimery a multimery navázány na všechny čtyři konce dvou Fc řetězců.

Výhodně mají sloučeniny tohoto druhého provedení vynálezu celkovou délku přibližně 200 až 400 aminokyselin (tj. jedná se o polypeptidy).

Způsoby přípravy

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny různými způsoby. Protože mnoho těchto sloučenin jsou peptidy, nebo obsahují peptidy, jsou zejména relevantní způsoby peptidové syntézy. Například mohou být použity techniky syntézy na pevné fázi. Vhodné techniky jsou dobře známé v oboru a zahrnují ty, které jsou popsány v Merrifield, v Chem. Poly20 peptides, str. 335-61 (Katspyannis and Panayotis, vyd., 1973); Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85: 2149 (1963); Davis et al., Biochem Intl. 10: 394—414 (1985); Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis (1969); US patent 3941763; Finn et al,, The Proteins, 3. vydání, svazek 2, str. 105-253 (1976); a Erickson et al., the Proteins, 3. vydání, svazek 2, str. 257-527 (1976). Syntéza na pevné fázi je výhodnou technikou pro přípravu jednotlivých peptidů, protože je nejlevnější technikou pro přípravu malých peptidů.

Peptidy mohou být také vyráběny transformovanými hostitelskými buňkami za použití rekombinantních DNA technik. Pri takové výrobě se připraví rekombinantní molekula DNA kódující peptid. Způsoby pro přípravu takových molekul DNA a/nebo RNA jsou dobře známé v oboru.

Například, sekvence kódující peptid může být excidována z DNA za použití vhodných restrikčních enzymů. Relevantní sekvence může být připravena polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) s použitím vhodných restrikčních míst pro následné klonování. Alternativně může být molekula DNA/RNA syntetizována za použití technik chemické syntézy, jako je fosforoamiditová technika. Také může být použito kombinace těchto technik.

Vynález také zahrnuje vektor kódující peptidy ve vhodném hostiteli. Vektor obsahuje molekulu DNA, která kóduje peptidy, operativně navázanou na kontrolní sekvence pro expresi. Způsoby pro provedení této operativní vazby, buď po nebo před insercí molekuly DNA kódující peptid do vektoru, jsou dobře známé. Mezi kontrolní sekvence pro expresi patří promotory, aktivátory, zesilovače, operátory, vazebná místa pro ribosomy, startovací signály, stop signály, signály pro navázání koncovky, polyadenylaění signály ajiné signály účastnící se kontroly transkripce nebo translace.

Výsledný vektor obsahující molekulu DNA kódující peptid je použit pro transformaci vhodného hostitele. Tato transformace může být provedena za použití metod dobře známých v oboru.

- 19CZ 302155 B6

Jakákoliv z mnoha dostupných a dobře známých hostitelských buněk může být použita při provádění předkládaného vynálezu. Výběr určitého hostitele je závislý na mnoha faktorech známých v oboru. Mezi tyto faktory patří, například, kompatibilita s vybraných expresním vektorem, toxicita peptidů kódovaných molekulou DNA pro hostitele, rychlost transformace, možnost snadného získání peptidů, charakteristiky exprese, biologická bezpečnost a náklady. Mezi těmito faktory musí být rovnováha aje třeba si uvědomit, že ne všichni hostitelé jsou stejně účinní při expresi určité DNA sekvence.

Při dodržení těchto obecných pravidel patří mezi použitelné mikrobiální hostitele bakterie (jako je E. coli), kvasinky (jakoje Saccharomyces spp. a Pichia pastoris) a jiné houby, hmyzí, rostlinné, savčí (včetně lidských) buňky v kultuře a jiní hostitelé známí v oboru.

Potom se transformovaný hostitel kultivuje za běžných fermentačních podmínek tak, aby byly exprimovány požadované peptidy. Takové fermentační podmínky jsou dobře známé v oboru.

Nakonec se peptidy přečistí z fermentační kultury nebo z hostitelských buněk, které je exprimují. Tyto metody pro přečištění jsou dobře známé v oboru.

Sloučeniny, které obsahují derivatizované peptidy, nebo které obsahují nepeptidové skupiny, mohou být syntetizovány technikami dobře známými v organické chemii.

Použití sloučenin

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mají schopnost vázat se na a aktivovat c-Mpl receptor, a/nebo mají schopnost stimulovat produkci (in vitro a in vivo) trombocytů (mají „trombopoetickou aktivitu) a prekurzorů trombocytů (mají „megakaryocyto poetickou aktivitu). Pro měření aktivity těchto sloučenin je možno použít standardních testů, jako jsou testy popsané ve WO 95/26746 nazvané „Compositions and Methods for Stimulating Megakaryocyte Growth and Differentiation“ Testy in vivo jsou dále popsány v části „Příklady provedení vynálezu.

Stavy, které mohou být léčeny způsoby a prostředky podle předkládaného vynálezu, jsou obecně ty stavy, při kterých existuje deficit megakaryocytů/trombocytů, nebo stavy, u kterých se předpokládá deficit megakaryocytů/trombocytů v budoucnu (například pro plánovaný chirurgický výkon nebo při dárcovství trombocytů). Takové stavy mohou být důsledkem deficitu (dočasného nebo trvalého) aktivního Mpl ligandu in vivo. Generický termín pro deficit trombocytů je trombocytopenie a tak jsou způsoby a prostředky podle předkládaného vynálezu obecně vhodné pro profylaktickou nebo terapeutickou léčbu trombocytopenie u pacientů.

Světová Zdravotnická Organizace klasifikuje stupeň trombocytopenie podle počtu cirkulujících trombocytů u jedince (Miller et al., Cancer 47: 210-211 (1981)). Například, jedinec nevykazující žádné známky trombocytopenie (stupeň 0) bude mít alespoň 100 000 trombocytů/mm³. Mírná trombocytopenie (stupeň 1) označuje počet cirkulujících trombocytů mezi 79 000 a 99 000/mm³. Středně těžká trombocytopenie (stupeň 2) označuje počet cirkulujících trombocytů mezi 50 000 a 74 000/mm³ a těžká trombocytopenie označuje počet cirkulujících trombocytů mezi 25 000 a 49 000/mm³. Život ohrožující trombocytopenie je charakterizována počtem cirkulujících trombocytů menším než 25 000/mm³.

Trombocytopenie (deficit trombocytů) může být přítomna z různých důvodů, včetně chemoterapie a jiné terapie různými léky, aktinoterapie, chirurgického výkonu, ztrátě krve při poranění a specifických onemocnění. Příklady specifických onemocnění, která mohou zahrnovat trombocytopenii a která mohou být léčena způsobem podle předkládaného vynálezu, jsou: aplastická anemie; idiopatická nebo autoimunnní trombocytopenie (ITP), včetně idiopatické trombocytopenické purpury asociované s karcinomem prsu; ITP asociovaná s HIV a trombotická trombocytopenická purpura spojená s HIV; metastatické nádory způsobující trombocytopenii; systémový lupus erythematodes, včetně neonatálního lupusového syndromu spojeného se spleno-20CZ 302155 B6 megalií; Fanconiho syndrom; deficit vitamínu B12; deficit kyseliny listové; May-Hegglinova anomálie; Wiskott-Aldrichův syndrom; chronická jatemí onemocnění; myelodysplastický syndrom spojený s trombocytopenii; paroxysmální noční hemoglobinurie; akutní významná trombocytopenie po terapii C7E3 Fab (Abciximab); alloimunni trombocytopenie, včetně matemální alloimunni trombocytopenie; trombocytopenie asociovaná s antifosfolipidovými protilátkami a trombózou; autoimunní trombocytopenie; trombocytopenie indukovaná léky, včetně trombocytopenie indukované karboplatinou, trombocytopenie indukované heparinem; fetální trombocytopenie; gestační trombocytopenie; Hughesův syndrom; lupoidní trombocytopenie; ztráta krve při masivním krvácení a/nebo krvácení pri nehodě; myeloproliferativní onemocnění; tromboi« cytopenie u pacientů s malignitami; trombotická trombocytopenická purpura, včetně trombotické mikroangiopatie manifestující se jako trombotická trombocytopenická purpura/hemolytico-uremický syndrom u pacientů s nádorovými onemocněními; autoimunní hemolytická anemie; okultní perforace divertikulu v jejunu; Čistá aplasie červené řady; autoimunní trombocytopenie; nefropathia epidemica; akutní renální selhání spojené s rifampicinem; Paris-Trousseauova trom15 bocytopenie; neonatální alloimunni trombocytopenie; paroxysmální noční hemoglobinurie; hematologické změny spojené s karcinomem žaludku; hemolyticko uremické syndromy v dětství; hematologické projevy související s virovými infekcemi jako je trombocytopenie spojená s infekcí virem hepatitidy A a CMV. Také některé léčby AIDS vedou k trombocytopenii (například AZT). Některé procesy hojení ran mohou být také zlepšeny v důsledku vyššího počtu trombo20 cytů.

Při předpokládaném deficitu trombocytů, například pri plánovaném chirurgické výkonu, mohou být sloučeniny podle předkládaného vynálezu podány několik dnů až několik hodin před potřebou trombocytů. Pri akutních stavech, jako jsou úrazy a masivní ztráty krve, mohou být sloučeni25 ny podle předkládaného vynálezu podány současně s krví nebo přečištěnými destičkami.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být také užitečné pro stimulaci jiných typů buněk než megakaryocytů, pokud tyto buňky exprimují Mpl receptor. Stavy asociované s takovými buňkami exprimuj ícími Mpl receptor, které reagují na stimulaci Mpl ligandem, spalo dají také do rozsahu předkládaného vynálezu.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být použity v jakékoliv situaci, ve které je žádoucí produkce trombocytů nebo prekurzorových buněk trombocytů, nebo když je žádoucí stimulace c-Mpl receptoru. Tak mohou být sloučeniny podle předkládaného vynálezu použity pro léčbu jakéhokoliv stavu u savce, pri kterém existuje potřeba trombocytů, megakaryocytů a podobně. Takové stavy jsou podrobně popsány například ve WO: 95/26746, WO 95/21919, WO 95/18858, WO 95/21920, které jsou zde uvedeny jako odkazy.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být také použity pro zachování životaschopní nosti nebo při skladování trombocytů a/nebo megakaryocytů a příbuzných buněk. Proto může být vhodné použít účinné množství jedné nebo více sloučenin v prostředcích obsahujících takové buňky.

Termín „savec“ označuje jakéhokoliv savce, včetně člověka, domácích zvířat jako jsou psi a kočky, exotických zvířat, jako jsou opice, laboratorních zvířat, jako jsou myši, krysy a morčata, zemědělských zvířat, jako jsou koně, krávy, ovce, kozy a prasata, a podobně. Výhodným savcem je člověk.

Farmaceutické prostředky

Předkládaný vynález také poskytuje způsoby pro použití farmaceutických prostředků obsahujících sloučeniny podle předkládaného vynálezu. Takové farmaceutické prostředky mohou být určeny pro injekční podání, orální, nasální, transdermální nebo jiné podání, včetně, například, intravenózního, intradermálního, intramuskulámího, intramamárního, intraperitoneálního, íntra55 thekálního, nitroočního, retrobulbámího, intrapulmonálního (například aerosolové prostředky)

-21 CZ 302155 B6 nebo podkožního injekčního podání (včetně depotního podání pro dlouhodobé uvolňování); a dále včetně sublinguálního, análního, vaginálního podání nebo chirurgické implantace, například ve splenické kapsli, do mozku nebo do rohovky. Léčba může spočívat v jedné dávce nebo ve více dávkách za určitou dobu. Obecně, vynález zahrnuje farmaceutické prostředky obsahující účinné množství sloučeniny podle předkládaného vynálezu společně s farmaceuticky přijatelným ředidlem, konzervačními činidly, solubilizačními činidly, emulgačními činidly, pomocnými činidly a/nebo nosiči. Takové prostředky obsahují ředidla s různým obsahem pufru (například Tris-HCl, acetat, fosfát), pH a iontovou silou; přísady jako jsou detergenční činidla a solubilizační činidla (například Tween 80, Polysorbát 80); antioxidační činidla (jako je kyselina askorbová, metalo hydrogensiřičitan sodný); konzervační činidla (například Thimersol, benzy lalkohol); a činidla upravující objem (například laktózu, manitol); tyto materiály se mohou zapracovat do částicových přípravků polymemích sloučenin, jako je kyselina polymléčná, kyselina polyglykolová atd., nebo do liposomů. Může se použít kyselina hyaluronová a ta může prodloužit dobu přítomnosti aktivní složky v cirkulaci. Farmaceutické prostředky mohou volitelně obsahovat ještě další far15 maceuticky přijatelné kapalné, semisolidní nebo solidní ředidlo, které slouží jako farmaceutické veh i kul um, přísada nebo médium, včetně například polyoxyethylensorbitanmonolauratu, stearanu hořečnatého, methyl- a propyIhydroxybenzoatu, škrobů, sacharózy, dextrózy, arabské klovatiny, fosforečnanu vápenatého, minerálního oleje, kakaového másla a kakaový olej. Takové složení může ovlivňovat fyzikální stav, stabilitu, rychlost uvolňování in vivo a rychlost klírens in vivo proteinů a derivátů podle předkládaného vynálezu. Viz například Remingtons Pharmaceutical Sciences, 18. vydání (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA18042), str. 1435-1712, které jsou zde uvedeny jako odkaz. Prostředky mohou být v kapalné formě nebo ve formě sušeného prášku, jako je například lyofilizovaná forma. Vynález zahrnuje také implantovatelné prostředky se zpomaleným uvolňováním, stejně jako transdermální prostředky.

Předpokládá se použití orálních pevných dávkových forem, které jsou obecně popsány v například Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 18. vydání (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) v kapitole 89, kteráje zde uvedena jako odkaz. Mezi pevné dávkové formy patří tablety, kapsle, pilulky, pastilky nebo medicinální oplatky nebo pelety. Pro přípravu prostředků podle předkládaného vynálezu může být také použita liposomální nebo proteinoidní enkapsulace (jak je tomu například u proteinoidních mikrosfér popsaných v US patentu 4925673. Může být použita enkapsulace v liposomech a liposomy mohou být derivatizovány různými polymery (například U.S. patent 5013556). Popis možných dávkových forem pro terapeutika je uveden v Marshall, K., Modem Pharmaceutics, vyd. G. S. Bankéř and C. T. Rhodes, kapitola 10, 1979, která je zde uvedena jako odkaz. Obecně, prostředek bude obsahovat sloučeninu podle předkládaného vynálezu a inertní přísady chránící sloučeninu před žaludečním prostředím a uvolňují biologicky aktivní materiál v tenkém střevu.

Vynález také specificky zahrnuje orální dávkové formy sloučenin podle předkládaného vynálezu.

Pokud je to nutné, mohou být sloučeniny chemicky modifikovány tak, aby bylo podání účinné. Obecně, možnou chemickou modifikací je navázání alespoň jedné skupiny na molekulu sloučeniny samotné, kde uvedená skupina (a) inhibuje proteolýzu; a (b) umožňuje přechod sloučeniny z žaludku nebo střeva do krevního oběhu. Žádoucí je také zvýšení celkové stability sloučeniny a prodloužení doby cirkulace v těle. Příklady takových skupin jsou: polyethylenglykol, kopolymery ethylenglykolu a propylenglykolu, karboxymethylcelulóza, dextran, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon a polyprolin (Abuchowski and Davis; Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, vyd., Wiley-Interscience, New York, NY, (1981), str. 367-383; Newmark et al., J. Appl. Biochem. 4:185-189 (1982)). Dalšími polymery, které mohou být použity, jsou poly-l,3-díoxolan a poly-l,3,6-tixocan. Pro farmaceutické použití uvedené výše jsou výhodné polyethylenglykolové skupiny.

Pro orální dávkové formy je také možno použít soli modifikované alifatické aminokyseliny, jako je N-(8-[2-hydroxybenzoyl]amino)kaprylát sodný (SNAC), jako nosiče pro zlepšení absorpce terapeutických sloučenin podle předkládaného vynálezu. Klinická účinnost heparinového pro-22CZ 302155 B6 středku využívajícího SNAC byla prokázána ve fázi II studie provedené Emispher Technologies.

Viz US Patent 5792451 „Oral drug delivery composition and methods“.

Terapeutikum může být obsaženo v prostředku jako jemné mikročástice ve formě granulí nebo pelet velikosti přibližně 1 mm. Materiál pro přípravu kapslí může být ve formě prášku, mírně lisovaných materiál nebo i tablet. Terapeutikum může být připraveno lisováním.

Mohou být použita barviva a chuťová korigens. Například, protein (nebo derivát) může být připraven (například enkapsulován v liposomech nebo mikrosférách) a potom může být vložen do io potravinářského výrobku, jako jsou chlazené nápoje obsahující barviva a chuťová korigens.

Je možno naředit nebo zvýšit objem terapeutika inertním materiálem. Mezi tyto inertní materiály patří karbohydráty, zejména manitol, α-laktóza, bezvodá laktóza, celulóza, sacharóza, modifikované dextrany a škrob. Některé anorganické soli mohou být také použity jako plniva, včetně fos15 forečnanu vápenatého, uhličitanu hořeČnatého a chloridu sodného. Některými komerčně dostupnými ředidly jsou Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress a Avicell.

V pevné dávkové formě farmaceutického prostředku obsahujícího terapeuticky aktivní činidlo může být obsaženo činidlo podporující rozpadavost. Činidlem podporujícím rozpadavost může být například škrob, včetně komerčně dostupného činidla podporujícího rozpadavost na bázi škrobu, kterým je Explotab. Také může být použit gly ko lat škrob sodný, Amber lite, karboxymethylcelulóza sodná, ultramylopektin, alginát sodný, želatina, pomerančová kůra, kyselá karboxymethylcelulóza, přirozená mořská houba a bentonit. Jinou formou činidel podporujících rozpadavost jsou nerozpustné kationtoměničové pryskyřice. Práškové klovatiny mohou být použity jako činidla podporující rozpadavost a jako pojivá a mezi tyto práškové klovatiny patří agar, Karaya a tragant. Kyselina alginová a její sodná sůl jsou také vhodnými činidly podporujícími rozpadavost.

Pojivá mohou být použita pro soudržnost terapeutického činidla ve formě kapsle a patří mezi ně materiály z přirozených produktů, jako je arabská klovatina, tragant, škrob a želatina. Dalšími pojivý jsou methyleelulóza (MC), ethylcelulóza (EC) a karboxymethylcelulóza (CMC). Polyvinylpyrrolidon (PVP) a hydroxypropy lmethy leelulóza (HPMC) mohou být použity v alkoholových roztocích pro granulování terapeutického činidla.

Protitřecí činidla mohou být použita při přípravě farmaceutických prostředků pro prevenci slepování během přípravy. Kluzná činidla mohou být použita jako vrstva mezi terapeuti kem a stěnou lisovacího nástroje a mezi taková činidla patří například kyselina stearová a její hořečnaté a vápenaté sole, polytetrafluorethylen (PTFE), kapalný parafín, rostlinný olej a vosky. Může být použito rozpustné kluzné činidlo, jako je laurylsíran sodný, laurylsíran hořečnatý, polyethylenglykoly různé molekulové hmotnosti, Carbowax 4000 a Carbowax 6000.

Mazadlo, které může zlepšit tekutost léku během přípravy a které může napomoci uspořádání při lisování, může být také přidáno. Mezi taková činidla patri škrob, talek, vulkanický oxid křemičitý a hydratovaný silikoaluminát.

Pro usnadnění rozpouštění terapeutického činidla ve vodném prostředí může být přidán surfaktant jako smáčí vé činidlo. Mezi surfaktanty patří aniontová detergenční činidla, jako je laurylsíran sodný, dioktylsukcínat sodný a dioktylsulfonat sodný. Mohou být použita také kationtová detergenční činidla a mezi ně patri benzalkoniumchlorid a benzethoniumchlorid. Seznam poten50 ciálních neiontových detergentních činidel, která mohou být použita jako surfaktanty, zahrnuje lauromakrogol 400, polyoxyl 40 stearát, polyoxyethylenový hydrogenovaný ricinový olej 10, 50 a 60 glycerol monostearát, polysorbát 40, 60, 65 a 80, ester sacharózy s mastnými kyselinami, methy leelulóza a karboxymethylcelulóza. Tyto surfaktanty mohou být přítomny v prostředku obsahujícím protein nebo derivát samostatně nebo ve směsi v různých poměrech.

-23 CZ 302155 B6

Aditivy, které zvyšují vychytávání sloučeniny, jsou například mastné kyseliny kyselina olejová, kyselina linoleová a kyselina linolenová.

Mohou být žádoucí prostředky s řízeným uvolňováním. Aktivní složka může být obsažena v inertní matrici, která umožňuje uvolňování buď difusí, nebo odplavováním, jak je tomu například u klovatin. Prostředek může rovněž obsahovat pomalu se rozkládající matrice, jako jsou algináty a polysacharidy. Jiná forma řízeného uvolňování tohoto terapeutika je způsob na bázi Oros terapeutického systému (Alza Corp.), tj., lék je uzavřen v polopropustné membráně, která umožňuje průnik vody a vytlačování léku jedním malým otvorem v důsledku osmotického efektu. Některé enterální potahy také oddalují uvolňování léčiva.

V prostředku mohou být použity také jiné potahy. Mezi tyto potahy patří různé sacharidy, které mohou být naneseny v potahovací pícce. Terapeutické činidlo může být také podáno ve formě tablety potažené filmem a materiály použité v tomto případě se dělí do 2 skupin. První jsou neenterální materiály a patří mezi ně methy [celulóza, ethylcelulóza, hydroxyethylcelulóza, methy Ihydroxy-ethylcelulóza, hydroxypropylcelulóza, hydroxypropyl-methylcelulóza, karboxymethylcelulóza sodná, povidon a polyethylenglykoly. Druhou skupinou jsou enterální materiály a patří sem běžné estery kyseliny ftalové.

Pro dosažení optimálního potahu filmem může být použita směs materiálů. Potažení filmem může být provedeno v pícce nebo ve fluidním loži nebo tlakově.

Také je možno provést plicní podání proteinu (nebo jeho derivátu) podle předkládaného vynálezu. Protein (nebo derivát) je podán do plic inhalačně a přechází pres plicní epitel do krevního řečiště (dále viz Adjei et al., Pharmaceutical Research 7: 565-569 (1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics 63: 135-144 (1990) (leuprolid acetat); Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology 13 (suppl. 5): str. 143-146 (1989) (endotelin-1); Hubbart et al., Annals of Interna! Medicine 3: 206-212 (1989) (αΐ-antitrypsin); Smith et al., J. Clin. Invest. 84:

1145-1146 (1989) (αΐ-proteinasa); Pswein et al. „Aerosolization of Proteins“, Proceedings of Symposium on Respirátory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, 1990 (rekombinantní lidský růstový hormon); Debs et al., the Journal of Immunology 140: 3482-3488 (1988) (interferon-γ a faktor nekrózy nádorů a) a Platz et al., US patent 5284656 (faktor stimulující kolonie granu locytů).

Při provádění předkládaného vynálezu je možno použít různé mechanické prostředky pro plicní podání terapeutik, včetně nebul izátoru, inhalátorů s měřitelnou dávkou a inhalaČních prostředků pro prášky, které jsou všechny dobře známé v oboru.

Některé příklady komerčně dostupných prostředků vhodných pro provedení tohoto vynálezu jsou Ultravent nebulizátor, vyráběný Mallinckrodt, lne., St. Louis, Missouri; Acom II nebulizátor, vyráběný Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; Ventolin inhalátor s odměříte lnou dávkou, vyráběný Glaxo lne., Research Triangle Park, North Carolina; a Spinhaler práškový inhalátor, vyráběný Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Všechny takové prostředky vyžadují použití přípravků vhodných pro podání sloučeniny podle předkládaného vynálezu. Obvykle je každý přípravek specifický pro určitý typ prostředku a může být nutné použití vhodného hnacího plynu, kromě ředidel, adjuvans a/nebo nosičů užitečných v terapii.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu budou nejlépe připraveny ve formě částic s průměrnou velikostí částic menší než 10 pm (nebo mikronů), nejlépe 0,5 až 5 pm, pro umožnění co nej účinnějšího podání do distálních částí plic.

Mezi nosiče patří karbohydráty, jako je trehalóza, mannitol, xylitol, sacharóza, laktóza a sorbitol. Dalšími přísadami jsou DPPC, DOPE, DSPC a DOPC. Mohou být použity přirozené nebo synte-24 CZ 302155 B6 tické surfaktanty. Může být použit polyethylenglykol (kromě jeho použití při derivatizaci proteinu nebo analogu. Může být použit dextran, jako je cyklodextran. Mohou být použity žlučové soli nebo jiné příbuzné zesilovače absorpce. Může být použita celulóza nebo deriváty celulózy. Mohou být použity aminokyseliny, například v pufrovacích prostředcích.

Vynález také zahrnuje použití liposomů, mikrokapslí nebo mikrosfér, inkluzních komplexů nebo jiných typů nosičů.

Prostředky vhodné pro použití v nebulizátoru, ať tryskovém, nebo ultrazvukovém, budou obvykle io obsahovat sloučeninu podle předkládaného vynálezu rozpuštěnou ve vodě v koncentraci od přibližně 0,1 do 25 mg biologicky aktivního proteinu na ml roztoku. Prostředek může také obsahovat pufr a jednoduchý cukr (například pro stabilizaci proteinu a regulaci osmotického tlaku).

Nebulizační prostředek může také obsahovat surfaktant, pro redukci nebo prevenci agregace proteinu indukované povrchově aktivními silami, která je způsobena atomizací roztoku při příi5 pravě aerosolu.

Prostředky pro použití v inhalačním prostředku s odměřitelnou dávkou budou obvykle obsahovat jemně dělený prášek obsahující sloučeninu podle předkládaného vynálezu suspendovanou v hnacím plynu pomocí surfaktantu. Hnacím plynem může být jakýkoliv materiál běžně používaný pro tento účel, jako je chlorfluorkarbon, hydrofluorchlorkarbon, hydrofluorkarbon nebo hydrokarbon, včetně trichlorfluormethanu, dichlordifluormethanu, dichlortetrafluorethanolu a 1,1,1,2-tetrafluorethanu nebo jejich kombinací. Vhodnými surfaktanty jsou sorbitantrioleat a sójový lecitin. Jako surfaktant může být použita také kyselina olejová.

Prostředky pro podání inhalačním prostředkem pro podání prášku budou obsahovat jemně dělený suchý prášek obsahující sloučeninu podle předkládaného vynálezu a mohou také obsahovat činidlo zvyšující objem, jako je laktóza, sorbitol, sacharóza, manitol, trehalóza nebo xylitol, v množství, které usnadňuje podaní prášku z prostředku, kde toto množství je například 50 až 90 % hmotnosti prostředku.

Je možné také nasální podání sloučeniny podle předkládaného vynálezu. Nasální podání umožňuje průnik proteinu do krevního řečiště přímo po podání terapeutického prostředku do nosu, bez potřeby podání prostředku do plic. Prostředky pro nasální podání zahrnují prostředky s dextranem nebo cyklodextranem. Také je možné podání přes jiné sliznice.

Dávkování

Dávkování použité ve způsobu léčby onemocnění uvedených výše bude určeno ošetřujícím lékařem pro zvážení různých faktorů, které modifikují působení léků, jako je věk, zdravotní stav, tělesná hmotnost, pohlaví a dietní zvyklosti pacienta, závažnost jakékoliv infekce, doba podání a jiné klinické faktory. Obecně by dávka měla být v rozsahu 0,1 pg až 100 mg sloučeniny podle předkládaného vynálezu na kg tělesné hmotnosti a den, lépe 0,1 až 1000 pg/kg; a nejlépe 0,1 až 150 pg/kg, v denních dávkách nebo v ekvivalentních v delších nebo kratších intervalech, například každý druhý den, dvakrát týdně, jednou týdně nebo dvakrát nebo třikrát denně.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být podány počáteční bolusovou dávkou a potom kontinuální infusí pro udržování terapeutických koncentrací léku v cirkulaci. Alternativně může být sloučenina podle předkládaného vynálezu podána jako jediná dávka. Odborníci v oboru snadno optimalizují účinné dávky a režimy podání podle standardní lékařské praxe a klinického stavu konkrétního pacienta. Frekvence podávání bude záviset na farmakokinetických parametrech činidel a na způsobu podání. Optimální farmaceutický prostředek bude vybrán odborníkem v oboru podle způsobu podání a požadované dávky. Viz, například, Remíngton's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), str. 1435-1712, kteréjsou zde uvedeny jako odkaz. Takové prostředky mohou ovlivňovat fyzikální stav, stabilitu, rychlost uvolňování in vivo a rychlost klírens in vivo podaného činidla. V závislosti na způsobu podání

-25CZ 302155 B6 může být vhodná dávka vypočtena podle tělesné hmotnosti, tělesného povrchu a velikosti orgánu. Další úpravy výpočtů nutných pro stanovení vhodné dávky pro léčbu každým z prostředků uvedených výše jsou rutinní pro odborníky v oboru bez zbytečného experimentování, zejména ve světle zde popsaných informací o dávkách a testech, stejně jako farmakokineticky dat z klinických studií na lidech popsaných výše. Vhodné dávky mohou být určeny známými testy pro stanovení koncentrací léčiv v krvi, společně s daty dávka-odpověď. Konečný dávkový režim bude určen ošetřujícím lékařem po zvážení různých faktorů, které modifikují působení léků, jako je například specifická aktivita léku, závažnost onemocnění a reaktivita pacienta, věk, zdravotní stav, tělesná hmotnost, pohlaví a dietní zvyklosti pacienta, závažnost jakékoliv infekce, doba podání a jiné klinické faktory. Protože jsou prováděny studie, objeví se další informace týkající se vhodných dávek a trvání léčby pro různá onemocnění a stavy.

Terapeutické způsoby, prostředky a sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být použity, samostatně nebo v kombinaci s jinými cytokiny, solubilním Mpl receptorem, hematopoetickými faktory, interleukiny, růstovými faktory nebo protilátkami, v léčbě onemocnění charakterizovaných jinými příznaky, stejně jako deficitem trombocytů. Předpokládá se, že sloučeniny podle předkládaného vynálezu budou užitečné pro léčbu některých forem trombocytopenie v kombinaci s obecnými stimulátory hematopoesy, jako je 1L—3 nebo GM-CSF. Společně s Mpl ligandem mohou být použity také další faktory stimulující megakaryocyty, jako je například meg-CSF, faktor kmenových buněk /SCF), leukemický inhibiční faktor (L1F), onkostatin M (OSM) nebo jiné molekuly s megakaryocytámí stimulační aktivitou. Mezi další příkladné cytokiny nebo hematopoetické faktory pro takové společné podání patří IL-lct, IL-Ιβ, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, 1L—6, 1L-11, faktor stimulující kolonie 1 (CSF-I), M-CSF, SCF, GM-CSF, faktor stimulující kolonie granulocytů (G-CSF), EPO, interferon a (IFN-α), společný interferon, IFN-β, IFN-γ, IL-7, IL-8, 1L-9, IL-10, 1L-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, trombopoetin (TPO), angiopoetiny, například Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, lidský peptid podobný angiopoetinu, vaskulámí endotelový růstový faktor (VEGF), angiogenin, kostní morfogenní protein-l, kostní morfogenní protein-2, kostní morfogenní protein-3, kostní morfogenní protein-4, kostní morfogenní protein-5, kostní morfogenní protein-6, kostní morfogenní protein-7, kostní morfogenní proteín-8, kostní morfogenní protein-9, kostní morfogenní protein-l0, kostní morfogenní protein-l 1, kostní morfogenní proteín-12, kostní morfogenní protein-l3, kostní morfogenní protein-l4, kostní morfogenní protein-l5, receptor pro kostní morfogenní protein IA, receptor pro kostní morfogenní protein 1B, mozkové neurotrofní faktory, receptor a pro ciliámí neurotrofní faktor, cytokiny indukovaný chemotaktický faktor pro neutrofily 1, cytokiny indukovaný chemotaktický faktor pro neutrofily 2a, cytokiny indukovaný chemotaktický faktor pro neutrofily 2β, růstový faktor β endotelových buněk, endotelin 1, epidermátní růstový faktor, epitelový atraktant pro neutrofily, fibroblastový růstový faktor 4, fibroblastový růstový faktor 5, fibroblastový růstový faktor 6, fibroblastový růstový faktor 7, fibroblastový růstový faktor 8, fibroblastový růstový faktor 8b, fibroblastový růstový faktor 8c, fibroblastový růstový faktor 9, fibroblastový růstový faktor 10, kyselý fibroblastový růstový faktor, alkalický fibroblastový růstový faktor, receptor α 1 pro neurotrofní růstový faktor odvozený od gliální buněčné linie, receptor a2 pro neurotrofní růstový faktor odvozený od gliální buněčné linie, protein související s růstem, protein související s růstem a, protein související s růstem β, protein související s růstem γ, epidermální růstový faktor vážící se na heparin, hepatocytámí růstový faktor, receptor pro hepatocytámí růstový faktor, insulinu podobný růstový faktor 1, receptor pro insulinu podobný růstový faktor I, insulinu podobný růstový faktor II, vazebný protein pro insulinu podobný růstový faktor II, keratinocytámí růstový faktor, leukemický inhibiční faktor, receptor α pro leukemický inhibiční faktor, nervový růstový faktor, receptor pro nervový růstový faktor, neurotrofin 3, neurotrofín 4, placentami růstový faktor, placentami růstový faktor 2, trombocytámí endotelový růstový faktor, trombocytámí růstový faktor, A řetězec trombocytámího růstového faktoru, trombocytámí růstový faktor AA, trombocytámí růstový faktor AB, β řetězec trombocytámího růstového faktoru, trombocytámí růstový faktor BB, receptor α pro trombocytámí růstový faktor, receptor β pro trombocytámí růstový faktor, růstový faktor pro pre-B lymfocyty, receptor pro faktor kmenových buněk, TNF, včetně TNF0, TNF1, TNF2, transformující růstový faktor a, transformující

-26CZ 302155 B6 růstový faktor β, transformující růstový faktor βΐ, transformující růstový faktor βΐ .2, transformující růstový faktor β2, transformující růstový faktor β3, transformující růstový faktor β5, latentní transformující růstový faktor βΐ, vazebný protein I pro transformující růstový faktor β, vazebný protein II pro transformující růstový faktor β, vazebný protein III pro transformující růstový faktor β, receptor typu I pro faktor nekrózy nádorů, receptor typu II pro faktor nekrózy nádorů, receptor pro plasminogenový aktivátor urokinasovébo typu, cévní endotelový růstový faktor, a chimérické proteiny a jejich biologicky nebo imunologicky aktivní fragmenty. Dále může být vhodné podat, simultánně nebo sekvenčně, účinné množství solubilního savčího Mpl receptoru, který, jak se zdá, způsobuje fragmentaci megakryocytů na trombocyty po dozrání megakaryocytů. Tak se předpokládá, že podání sloučeniny podle předkládaného vynálezu (pro zvýšení počtu zralých megakaryocytů) a potom podání solubilního Mpl receptoru (pro inaktivaci ligandů a pro produkci trombocytů ze zralých megakaryocytů) je zejména účinným postupem pro stimulaci produkce trombocytů. Dávky uvedené výše se upravují s ohledem na takové další složky v terapeutických prostředcích. Vývoj stavu u léčeného pacienta může být sledován běžnými způsoby.

V případě, že jsou sloučeniny podle předkládaného vynálezu přidány k trombocytámím a/nebo megakaryocytámím přípravkům nebo přípravkům příbuzných buněk, tak se použité množství určí experimentálně za použití technik a testů známých v oboru. Například je možno použít dávky od 0,1 pg do 1 mg sloučeniny podle předkládaného vynálezu na 10⁶ buněk.

Je třeba si uvědomit, že použití způsobů podle předkládaného vynálezu pro určitý problém nebo situaci, je schopen odborník v oboru provést podle popisu vynálezu. Příklady prostředků podle předkládaného vynálezu a reprezentativních způsobů pro jejich izolaci, použití a výrobu, jsou uvedeny dále.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Tento příklad popisuje způsoby pro přípravu některých sloučenin první skupiny.

A. Materiály a metody

Všechny aminokyselinové deriváty (všechny v L-konfiguraci) a pryskyřice použité při syntéze peptidů byly zakoupeny od Novabiochem. Činidla pro peptidovou syntézu (DCC, HOBt., atd.) byla zakoupena ve formě roztoků od Applied Biosystems, lne. Dva PEG deriváty byly od Shearawter Polymers, Inc. Všechna rozpouštědla (dichlormethan, N-methylpyrrolidon, methanol, acetonitril) byla od EM Sciences. Analytická HPLC byla provedena na Beckman systému s Vydac kolonou (0,46 cm x 25 cm, Cl 8 reversní fáze, 5 mm) při průtoku 1 ml/min a při duální UV detekci při 220 a 280 nm. Pro všechny HPLC kroky byly použity lineární gradienty se dvěma mobilními fázemi: pufr A - H₂O (0,1% TFA) a pufr B - acetonitril (0,1% TFA). Použité číslování peptidů, například 17b, 18, 19 a 20, se vztahuje k tabulce 1 a některé z těchto peptidů jsou dále ilustrovány na obr. 2 a 3.

Syntéza peptidů: Všechny peptidy byly připraveny dobře známou metodou syntézy na pevné fázi. Syntéza na pevné fázi s Fmoc činidly byla provedena za použití ABI Peptide Synthetiser. Obvykle začala syntéza peptidu s předem naplněnou Wangovou pryskyřicí v 0,1 mmol měřítku. Fmoc odstranění chránících skupin bylo provedeno podle standardního piperidinového protokolu. Kopulace byla provedena za použití DCC/HOBt. Chránící skupiny pro vedlejší řetězce byly: Glu (O-t-Bu), Thr (t-Bu), Arg (PBF), Gin (Trt), Trp (t-Boc) a Cys (Trt). Pro první peptidový prekurzor pro pegylaci byl pro chránění vedlejšího řetězce Lys na spojovací skupině použit Dde a

-27CZ 302155 B6

Boc-Ile-OH byl použit pro poslední kopulaci. Dde byl odstraněn za použití bezvodého hydrazínu (2% vNMP, 3x2 minuty) a potom se provedla kopulace s anhydridem kyseliny bromoctové působením DCC. Pro peptid 18 byl vedlejší řetězec cysteinu ve spojovací skupině chráněné tritylovou skupinou. Konečné odstranění chránících skupin a štěpení všech peptidylových pryskyřic bylo provedeno při teplotě okolí po dobu 4 hodin za použití kyseliny trifluoroctové (TFA) obsahující 2,5% H₂O, 5% fenol, 2,5% triisopropylsilan a 2,5% thioanisol. Po odstranění TFA se odštěpený peptid vysrážel chladným bezvodým etherem. Tvorba disulfídových vazeb v cyklickém peptidu byla provedena přímo na surovém materiálu za použití 15% DMSO v H₂O (pH 7,5). Všechny surové peptidy byly přečištěny preparativní HPLC s reverzní fází ajejich struktury byly io potvrzeny ESI-MS a aminokyselinovou analýzou.

Alternativně mohou být peptidy popsané výše připraveny za použití t-Boc postupu. V tomto případě je výchozí pryskyřicí klasická Merrifieldova nebo Pam pryskyřice a chránícími skupinami pro vedlejší řetězce jsou: Glu (Obzl), Thr(Bzl), Arg(Tos), Trp (CHO), Cys(p-MeBzl). Fluoro15 vodík (HF) může být použit pro konečné štěpení peptidylových pryskyřic.

Všechny tandemové d i měrní peptidy popsané v tomto příkladu, které obsahují spojovací skupiny složené z přirozených aminokyselin, mohou být také připraveny rekombinantní DNA technikou.

ao PEGylace. Byla vyvinuta nová, konvergentní strategie pro pegylaci syntetických peptidů, která zahrnuje kombinování - prostřednictvím vytvoření konjugační vazby v roztoku - peptidu a PEG skupiny, které obsahují každá speciální funkci, která je reaktivní s funkcí druhé skupiny. Prekurzorové peptidy mohou být snadno připraveny technikou syntézy na pevné fázi, jak byla popsána výše. Jak bylo popsáno výše, tyto peptidy jsou „preaktivovány“ vhodnou funkční skupinou na specifickém místě. Prekurzory mohou být přečištěny a plně charakterizovány před reakcí s PEG skupinou. Ligace peptidu s PEG obvykle probíhá ve vodné fázi a může být snadno sledována analytickou HPLC s reverzní fází. Pegylované peptidy mohou být snadno přečištěny preparativní HPLC a charakterizovány analytickou HPLC, aminokyselinou analýzou a hmotnostní spektrometrií s desorpcí laserem.

V)

Příprava peptidu 19. Peptid 17b (12 mg) a Me0-PEG-SH5000 (30 mg, 2 ekv.) se rozpustí v 1 ml vodného pufru (pH 8). Směs se inkubuje při teplotě okolí po dobu přibližně 30 minut a reakce se sleduje analytickou HPLC, která ukáže více než 80% dokončení reakce. Pegylovaný materiál se izoluje preparativní HPLC.

Příprava peptidu 20. Peptid 18(14 mg) a MeO-PEG-maleimid (25 mg) se rozpustí v 1,5 ml vodného pufru (pH 8). Směs se inkubuje při teplotě okolí po dobu přibližně 30 minut, kdy je 70 % transformace dokončeno, jak je sledováno analytickou HPLC pomocí aplikace podílu vzorku do HPLC kolony. Pegylovaný materiál se izoluje preparativní HPLC.

Test biologické aktivity

TPO in vitro biotest je mitogenní test využívající klonu myších 32D buněk závislých na IL-3, které byly transfektovány lidským Mpl receptorem. Tento test je podrobně popsán ve

WO 95/26746. Buňky se kultivují v MEM médiu obsahujícím 10% Fetal Cloně II a 1 ng/ml mIL-3. Před přidáním vzorku se buňky připraví dvojím proplachem kultivačním médiem bez IL3. Určí se prodloužená dvanáctibodová TPO standardní křivka v rozsahu od 3333 do 39 pg/ml. Pro každý vzorek se připraví čtyři ředění spadající do lineární části standardní křivky (1000 až 125 pg/ml) a tyto se zpracují třikrát. 100 μΐ každého ředění vzorku nebo standardu se přidá do vhodných jamek 96jamkové mikrotitrační plotny obsahující 10 000 buněk/jamku. Po 44 hodinách při 37 °C a 10% CO₂ se do každé jamky přidá MTS (tetrazoliová sloučenina, která je biologicky redukována buňkami na formazan). Přibližně o 6 hodin později se odečte optická densita na čtečce ploten při 490 nm. vytvoří se křivka dávka-odpověď (log koncentrace TPO vs. O.D, pozadí) a provede se lineární regresní analýza bodů, které spadají do lineární části standardní

-28CZ 302155 B6 křivky. Koncentrace neznámých testovaných vzorků se určí za použití získané lineární rovnice a za použití korekce pro naredění.

Zkratky: HPLC: vysoceúčinná kapalinová chromatografie; ESI-MS: hmotnostní spektrometrie s ionizací postřikem elektrony; MALDI-MS: hmotnostní spektrometrie s ionizací desorpcí laserem na matrici; PEG: polyethylenglykol. Všechny aminokyseliny jsou uvedeny ve standardním trojpísmenném nebo jednopísmenném kódu. t-Boc: terc-butoxykarbonyl; tBu: terc-butyl; Bzl: benzyl; DCC:dícyklohexylkarbodiimid; HOBt: 1-hydroxybenztriazol; NMP: N-methyl-2pyrrolidon; Pbf: 2,2,4,7-pentamethyldihydrobenzfuran-5-sulfonyl; Trt: trityl; Dde: 1-(4,4dimethyl-2,6-dioxo-cyklohexyliden)ethyl.

B. Výsledky

TMP tandemové dimery s polyglycinovými spojovacími skupinami. Vývoj sekvenčně vázaných TMP dimerů byl založen na předpokladu, že dimemí formy TMP jsou nutné pro účinnou interakci s c-Mpl (TPO receptor) a na tom, že podle toho, jak jsou navzájem uspořádány vzhledem k receptoru, mohou být dvě MTP molekuly navzájem vázány na C- nebo N-konci tak, že není narušena celková dimemí konformace. Je jasné, že aktivita tandemově vázaných dimerů závisí také na správném výběru délky a složení spojovací skupiny spojující C- a -konce dvou sekvenčně uspořádaných TMP monomerů. Protože není dostupná žádná informace o struktuře TMP navázaného na c-Mpl, byla syntetizována série dimemích peptidů se spojovacími skupinami složenými z 0 až 10 a 14 glycinových zbytků (Tabulka 1). Glycin byl vybrán pro svou jednoduchost a flexibilitu. Předpokládalo se, že flexibilní polyglycinový peptidový řetězec umožní volné skládání dvou spojených TMP jednotek do požadované konformace. Zatímco více stericky omezené aminokyselinové sekvence mohou mít nežádoucí sekundární struktury, jejichž rigidita by mohla narušit správné skládání dimemího peptidu ve vztahu k receptoru.

Výsledné peptidy je možno připravit běžnými technikami peptidové syntézy na pevné fázi (Merrifield, R. B., Journal ofthe American Chemical Society 85: 2149 (1963)), za použití Fmoc nebo t-Boc techniky. Oproti syntéze C-koncově vázaných paralelních dimerů (SEQ ID NO: 2), která vyžaduje použití ortogonálně chráněného lysinového zbytku jako počátečního místa větvení pro přípravu dvou peptidových řetězců pseudosymetrickým způsobem (Cwirla, S. E. et at, Science 276: 1696-1699 (1997)), je syntéza našich tandemových dimerů přímé, postupné sestavování kontinuálního peptidového řetězce od C- do N-konce. Protože má dimerizace TMP dramatičtější vliv na proliferační aktivitu než na vazebnou afinitu, jak je prokázáno pro C-koncový dimer (Cwirla, S. E. et at, Science 276: 1696-1699 (1997)), byly syntetické peptidy testovány přímo na biologickou aktivitu v testu proliferace TPO dependentních buněk za použití IL—3 dependentního klonu myších 32 D buněk transfektovaných kompletním c-Mpl (Palacios, R. et at, Cell 41: 727 (1985)). Jak ukazují výsledky testu (viz tabulka 1, dále), vykazovaly všechny polyglycinem spojené tandemové dimery > lOOOnásobné zvýšení účinnosti ve srovnání s monomerem a byly v tomto proliferačním testu účinnější než C-koncový dimer. Absolutní aktivita Ckoncového dimerů v našem testu byla nižší než aktivita přirozeného TPO proteinu, což je odlišné dřívějších zjištění, ve kterých byl C-koncový dimer stejně aktivní jako přirozený ligand (Cwirla, S. E. et al., Science 276: 1696-1699 (1997)). Toto může být způsobeno odlišnými podmínkami použitými v obou testech. Nicméně, rozdíl v aktivitě mezi tandemovými dimery (C-konec prvního monomeru je navázán na N-konec druhého monomeru) a paralelními dimery (C-konec prvního monomeru je navázán na C-konec druhého monomeru) ve stejném testu jasně dokazují lepší vlastnosti tandemově dimerízované sloučeniny ve srovnání s paralelně dimenzovanou sloučeninou. Je zajímavé, že jsou možné různé délky spojovací skupiny. Optimální spojovací skupina použitá s vybranými TMP monomery (SEQ ID NO: 1) je složen z 8 glycinů.

Jiné tandemové dimery. Po této první sérii TMP tandemových dimerů bylo navrženo několik dalších molekul, buď s jinými spojovacími skupinami, nebo s modifikacemi monomeru. První z těchto molekul, peptid 13, má spojovací skupinu složenou zGPNG, což je sekvence, o kteréje známo, že snadno vytváří sekundární strukturu typu (3-šroubovice. Ačkoliv je ještě stále asi

-29CZ 302155 B6 lOOkrát účinnější než monomer, je tento peptid 1 Okřát méně aktivní než GGGG-vázaný analog. Proto se zdá, že použití relativně rigidní β-šroubovice jako spojovací skupiny způsobuje mírné narušení optimální agonistické konformace v této formě s krátkou spojovací skupinou.

Trp 9 v TMP sekvenci je vysoce konzervovaný zbytek v aktivních peptidech izolovaných z knihoven náhodných peptidů. Existuje také vysoce konzervovaný Trp v konvenčních sekvencích EPO mimetíckých peptidů a bylo zjištěno, že tento Trp zbytek se účastní tvorby hydrofobního jádra mezi dvěma EPO mimetickými peptidy (EMP) a přispívá k hydrofobním interakcím s EPO receptorem (Livnah, O. et al., Science 273: 464—471 (1996)). Analogicky se předpokládá, že Trp9 zbytek v TMP může mít podobnou funkci v dimerizaci peptidového ligandů a v pokusu o modulování a hodnocení vlivů nekovalentních hydrofobních sil ve dvou indolových kruzích se konstruovalo několik analogů vzniklých mutací Trp. V peptidu 14 byl Trp zbytek v každém ze dvou TMP monomerů nahrazen Cys a oxidací byla vytvořena intramolekulová dísulfídová vazba mezi dvěma cysteiny, která měla napodobovat hydrofobní interakce mezi dvěma Trp zbytky v dimerizaci peptidu. Peptid 15 je redukovanou formou peptidu 14. V peptidu 16 byly dva Trp zbytky nahrazeny Ala. Jak ukazují výsledky testů, byly všechny tři analogy inaktivní. Tato data dále ukazují, že Trp je významný pro aktivitu TPO mimetického peptidu a ne pouze pro tvorbu dimeru.

Další dva peptidy (peptid 17 a 18) obsahovaly oba ve své 8-aminokyselinové spojovací skupině Lys nebo Cys zbytek. Tyto dvě sloučeniny jsou prekurzory dvou pegylovaných peptidů (peptidu 19 a 20), ve kterých je vedlejší řetězec Lys nebo Cys modifikován polyethylenglykolovou (PEG) skupinou. PEG skupina byla vložena do středu relativně dlouhé spojovací skupiny, takže byla velká PEG složka (5 kDa) dostatečně daleko od významných vazebných míst v molekule peptidu, PEG je známý biokompatibilní polymer, který se stále častěji používá pro kovalentní modifikaci za účelem zlepšení farmakokinetických profilů peptidových a proteinových terapeutických činidel.

Pro běžnou pegylaci syntetických nebo rekombinantních peptidů byla použita modulární metoda v roztoku. Tento způsob je založen na dobře známé chemoselektivní Iigační strategii, která využívá specifické reakce mezi párem navzájem reaktivních skupin. Tak byl pro pegylovaný peptid 199 vedlejší řetězec lysinu preaktivován bromacety lovou skupinou za vzniku peptidu 17b, který byl připravený pro reakci s PEG derivatizovaným thiolem. Pro chránění ε-aminu lyseinu byla použita ortogonální chránící skupina, Dde. Po sestavení celého peptidového řetězce byl N-koncový amin znovu chráněn T-Boc. Dde skupina byla potom odstraněna, aby byla umožněna bromacety láce. Tato strategie vede k zisku surového peptidu vysoké kvality, který může být snadno přečištěn za použití běžné HPLC s reverzní fází. Ligace peptidu s PEG modifikovaným thiolem probíhá ve vodném pufru při pH 8 a reakce je dokončena během 30 minut. MALDI-MS analýza přečištěného, pegylovaného materiálu ukázala charakteristické, zvonovité spektrum s kroky 44 Da mezi sousedními píky. Pro PEGpeptid 20 byl cysteinový zbytek umístěn do spojovacího regionu a jeho thiolová skupina vedlejšího řetězce mohla sloužit jako místo navázání pro PEG obsahující maleimid. Podobné podmínky byly použity pro pegylaci tohoto peptidu. Jak ukázaly výsledky testu, mají tyto dva pegylované peptidy ještě větší biologickou aktivitu in vitro než jejich nepegylované protějšky.

Peptid 21 obsahuje ve své 8-aminokyselinové skupině potenciální glykosylační motiv, NGS. Protože jsou tyto příkladné tandemové dimery tvořeny přirozenými aminokyselinami vázanými peptidovými vazbami, vede exprese takové molekuly ve vhodném eukaryotickém buněčném systému k produkci glykopeptidu s karbohydrátovou skupinou přidanou na karboxamidový vedlejší řetězec Asn. Glykosylace je běžnou posttranslační modifikací, která může mít mnoho příznivých účinků na biologickou aktivitu daného proteinu, protože zvyšuje jeho rozpustnost ve vodě a stabilitu in vivo. Jak ukazují výsledky testů, vedla inkorporace tohoto glykosylačního motivu do spojovací skupiny k zachování vysoké biologické aktivity. Syntetický prekurzor potenciálního glykopeptidu měl aktivitu srovnatelnou s -(Gly)g-vázaným analogem. Po glykosy láci se předpo-30CZ 302155 B6 kláda, že bude tento peptid mít stejnou aktivitu jako pegylované peptidy, z důvodu podobných chemicko-fyzikálních vlastností PEG a karbohydrátové skupiny.

Posledním peptidem je dimer dimerů. Tento peptid byl připraven oxidací peptidu 18, která vedla 5 ke vzniku intermolekulové disulfidové vazby mezi dvěma cysteinovými zbytky v této spojovací skupině. Tento peptid byl navržen proto, aby bylo zjištěno, zdaje TMP aktivní jako tetramer.

Výsledky testu ukázaly, že tento peptid nebyl aktivnější než průměrný tandemový dimer po úpravě na molámí bázi, což nepřímo podporuje myšlenku, že aktivní formou TMP je opravdu dimer, protože jinak by dimerizace tandemového dimeru měla další vliv na biologickou aktivitu.

io

V následující tabulce 1 je souhrnně uvedena relativní aktivita (relativní síla) výše uvedených sloučenin na základě výše popsaných testů in vitro.

Tabulka 1

Relativní

Sloučenina_účinnost

TPO TMP monomer (SEQ ID NO: 1)	4,0 1,0
TMP C-C dimer (SEQ ID NO: 2)	3,5
TMP-(Gly)_n-TMP: 1 n~0	4,5
2	η- 1	4,0
3	n-2	4,0
4	n - 3	4,0
5	n = 4	4,0
6	n = 5	4,0
7	n = 6	4,0
8	n-7	4,0
9	n-8	4,5
10	n-9	4,0
11	n=10	4,0
12	n= 14	4,0
13	TMP-GPNG-TMP (SEQ ID NO. 10)	3,0
14	ffiGPTLRQ£LAARA-GGGGGGGG~IEGPTLRQ£LAARA ! !	0,5
15	(SEQ ID NO. 11) IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCEAARA	0,5
16	(SEQ ID NO. 12) eegptlrqalaara-gggggggg-iegptlrqalaara	0,5
17a	(SEQ ID NO. 13) TMP-GGGKGGGG-TMP (SEQ ID NO. 14)	4,0
17b	TMP-GGGK(BrAc)GGGG-TMP (SEQ ID NO. 15)	ND
18	TMP-GGGCGGGG-TMP (SEQ ID NO. 16)	4,0
19	TMP-GGGK(PEG)GGGG-TMP (SEQ ID NO. 17)	5,0
20	TMP-GGGC(PEG)GGGG-TMP (SEQ ID NO. 18)	5,0
21	TMP-GGGNGSGG-TMP (SEQ ID NO. 19)	4,0
22	TMP-GGGCGGGG-TMP (SEQ ID NO. 20)	4,0

TMP-GGGCGGGG-TMP

-31 CZ 302155 B6

Poznámka: V tabulce 1 označují čísla přibližně I log aktivity, takže rozdíl mezi aktivitou „1“ a „4“ je přibližně 1000 násobný. Zvýšení o 0,5 je zvýšení o střední hodnotu, takže rozdíl mezi aktivitou „1“ a „3,5“je přibližně 500násobný. „ND“ = není stanoveno.

Příklad 2

Následující příklad popisuje způsoby přípravy některých sloučenin druhé skupiny.

io A. Příprava Fc fúzních sloučenin typu uvedeného na obr. 6C.

DNA sekvence kódující Fc region lidského IgGl fúzovaná ve čtecím rámci sdimerem TPO mimetického peptidů (SEQ ID NO: 34) se umístila pod kontrolou luxPR promotoru v plasmidovém vektoru pAMG2l následujícím způsobem.

Fúzní gen byl připraven standardní PCR technikou. Templáty pro PCR reakce byly fúzní vektor obsahující Fc sekvenci a syntetický gen kódující zbytek sloučeniny SEQ ID NO: 34. Syntetický gen byl konstruován ze 4 překrývajících se oligonukleotidů uvedených dále:

1830-52 AAA GGT GGA GGT GGT GGT ATC GAA GGT CCG ACT CTG CGT CAG TGG CTG GCT GCT CGT GCT (SEQ ID NO: 35)

1830-53 ACC TCC ACC ACC AGC ACG AGC AGC CAG CCA CTG ACG CAG AGT CGG ACC (SEQ ID NO: 36)

1830-54 GGT GGT GGA GGT GGC GGC GGA GGT ATT GAG GGC

CCA ACC CTT CGC CAA TGG CTT GCA GCA CGC GCA (SEQ ID NO: 37)

1830-55 AAA AAA AGG ATC CTC GAG ATT ATG CGC GTG CTG

CAA GCC ATT GGC GAA GGG TTG GGC CCT CAA TAC CTC CGC CGC C ,₍₎ (SEQ ID NO: 38) oligonukleotidy byly tepelně zpracovány za vzniku následujícího duplexu:

AAAGGTGGAGGTGGTGGTATCGAAGGTCCGACTCTGCGTCAGTGGCTGGCTGCTCGTGCT 1--------+---------+----------+---------+---------+---------₊ 60

CCAGGCTGAGACGCAGTCACCGACCGACGAGCACGA KGGGGGI EGPTLRQWLAARA

GGTGGTGGAGGTGGCGGCGGAGGTATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAATGGCTTGCAGCA

----------1-----—-----1---------4—---—----μ----------(-----------h 3L2 0

CCACCACCTCCACCGCCGCCTCCATAACTCCCGGGTTGGGAAGCGGTTACCGAACGTCGT

GGGGGGGGX EGPTLRQWLAA

CGCGCA

---------------------------₁₄₈

GCGCGTATTAGAGCTCCTAGGAAAAAAA

R A *

-32 CZ 302155 B6

SEQ ID NO: 39 (ko-lineámí oligonukleotidy 1830—52 a 1830—54)

SEQ ID NO: 40 (ko-lineámí oligonukleotidy 1830-53 a 1830-55) a SEQ ID NO: 41 (kódovaná aminokyselinová sekvence).

Tento duplex byl amplifikován PCR reakcí za použití 1830-52 a 1830-55 jako kódujících a protismyslných příměrů.

Fc část molekuly byla připravena PCR reakcí s Fc DNA za použití primerů:

1216-52 AAC AT A AGT ACC TGT AGG ATC G_ (SEQ Π> NO: 42)

1830-51 TTCGAT ACC ACC ACCTCC ACCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGC (SEQ ID NO; 43)

Oligonukleotidy 1830-51 a 1830-52 obsahující překrývajících se 24 nukleotidů, což umožňuje fúzování těchto dvou genů dohromady ve správném čtecím rámci kombinováním výše uvedených PCR produktů ve třetí reakci za použití vnějších primerů, 1216-52 a 1830-55.

Genový produkt poslední PCR (kompletní fúzní gen) se trávil restrikčními endonukleasami Xbal a BamHI a potom se ligoval do vektoru pAMG21 (viz dále), také tráveném Xbal a BamHI. Ligovaná DNA se transformovala do kompetentních hostitelských buněk E. coli kmene 2596 (GM221, viz dále). Klony se vyšetřovaly na schopnost produkovat rekombinantní protein a na přítomnost genové fúze mající správnou nukleotidovou sekvenci. Úroveň exprese proteinu byla stanovena z hodnocení 50 ml zkumavek. Lyzáty celých buněk byly analyzovány na přítomnost fúzního proteinu na PAGE gelech barvených Coomasie modří.

Aminokyselinová sekvence fúzního proteinu je uvedena pod odpovídající nukleotidovou sekven25 cí.

-33CZ 302155 B6

Xbal f

TCT AGATTTGTTTTAACTAATTAAAGGAGGAATAACATAT GGACAAAAC TCACACATGTC

1---------+---------H----------+-~---------------+ 6q

AGATCTAAACAAAATTGATTAATTTCCTCCTTATTGTATACCTGTTTTGAGTGTGTACAG

MDKTHTCP

CACCTTGTCCAGCTCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAAC ₆₁---------+---------+---------+---------₊---------₊---------_{+ 12}o

GTGGAACAGGTC GAGGCCTTGAGGAC CCCCCTGGC AGTCAGAAGGAGAAGGGGGGTTTTG PCPAPELLGGPSVFLFPPKP

CC AAGGACAC CCTCATGATCT C CCGGACC CCTGAGGT CAC AT GC GTGGT GGTGGACGTGA

121---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180

GGT T CCTGT GGGAGTACTAGAGGGCCTGGGGAC TC CAGTGT AC GCAC CACCACCTGCACT

KDTLMI SRTPEVTCVVVDVS

GC CACGAAGAC CCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGC GTGGAGGTGCATAATG

181---------₊---------+---------+---------₊---------+---------+ 240

CGGTGCTTCTGGGACTCCAGTTCAAGTTGACCATGCACCTGCCGCACCTCCACGTATTAC

HEDPEVKFNWYVDGVEVHNA

CCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACC.GTGTGGTCAGCGTCCTCA 241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------_{+ 300}

GGTTCTGTTTCGGCGCCCTCCTCGTCATGTTGTCGTGCATGGCACACCAGTCGCAGGAGT

KTKPREEQYNSTYRVVSVLT

CCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAG

301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360

GGCAGGACGTGGTCCTGACCGACTTACCGTT CCT CATGTTCAC GTT CCAGAGGTTGTTTC

VLHQDWLNGKEYKC KVSNKA

C C CTC CCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCC GAGAACCAC

361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420

GGGAGGGTCGGGGGTAGCTCTTTTGGTAGAGGTTTCGGTTTCCCGTCGGGGCTCTTGGTG

LPAPIEKTISKAKGQPREPQ

AGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT

421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480

TCCACATGTGGGACGGGGGTAGGGCCCTACTCGACTGGTTCTTGGTCCAGTCGGACTGGA

VYTLPPSRDELTKNQVSLTC gcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagc

481 ----—---540

CGGACCAGTTTCCGAAGATAGGGTCGCTGTAGCGGCACCTCACCCTCTCGTTACCCGTCG

LVKGFYPSDIAVEWESNGQP

C GGAGAACAACTACAAGACCACGCCT CC CGTGCTGGACTCCGACGGCTC CTTCTTCCTCT

541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600

GCCTCTTGTTGATGTTCTGGTGCGGAGGGCACGACCTGAGGCTGCCGAGGAAGAAGGAGA

ENNYKTTPPVLDSDGS FFLY

-34CZ 302155 B6

ACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG

601---------+---------+---------+---------+---------+---------+ €60

TGTCGTTCGAGTGGCACCTGTTCTCGTCCACCGTCGTCCCCTTGCAGAAGAGTACGAGGC

SKLTVDKSRWQQGNVFSCSV

TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA 661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 720

ACTACGTACTCCGAGACGTGTTGGTGATGTGCGTCTTCTCGGAGAGGGACAGAGGCCCAT

MHEALHNHYTQKSLSLSPGK

AAGGTGGAGGTGGTGGTATCGAAGGTCCGACTCTGCGTCAGTGGCTGGCTGCTCGTGCTG 721--------.-+---------+---------+---------+---------+---------+ 780

TTCCACCTCCACCACCATAGCTTCCAGGCTGAGACGCAGTCACCGACCGACGAGCACGAC

GGGGGIEGPTLRQWLAARAG

GTGGTGGAGGTGGCGGCGGAGGTATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAATGGCTTGCAGCKC 7₈₁ ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 840

CACCACCTCCACCGCCGCCTCCATAACTCCCGGGTTGGGAAGCGGTTACCGAACGTCGTG GGGGGGGI EGPTLRQWLAAR

BamHI

GCGCATAATCTCGAGGATCCG 841 ---------+---------+- 861

CGCGTATTAGAGCTCCTAGGC

A

SEQ ID NO: 44 (jeden řetězec čtený 5>3'),

SEQ ID NO: 45 (jeden řetězec čtený 3'->5'), a

SEQ ID NO: 46 (kódovaná aminokyselinová sekvence) pAMG21

Expresní plasmid pAMG21 je dostupný od ATCC pod přírůstkovým číslem 98113 a byl uložen 24. 7. 1996.

io GM221 (Amgen hostitelský kmen č. 2596)

Amgen hostitelský kmen č. 2596 je K-12 kmen E. coli, který byl modifikován tak, aby obsahoval jak lambda represor cI857s7 citlivý na teplotu v časném ebg regionu, tak lacl° represor v pozdním ebg regionu (68 minut). Přítomnost těchto dvou represorových genů umožňuje použití tohoto hostitele s mnoha expresními systémy, nicméně, oba tyto represory jsou irelevantní pro expresi z IucPr. Netransformovaný hostitel nemá resistenci na antibiotika.

Vazebné místo pro ribosomy cI857s7 genu bylo modifikováno tak, aby obsahovalo posílené RBS. Bylo insertováno do ebg operonu mezi nukleotidy 1170 a 1411, podle číslování v GenBank

2(i přírůstkové číslo M64441 GbBa s delecí vmezerené ebg sekvence.

Konstrukt byl přesunut do chromozomu za použití rekombinantního fágu nazvaného MMebgcI857s7 s vloženým RBS č. 4 do F'tet/393. Po rekombinaci a rozdělení zůstávaly v buňkách pouze chromozomální inserty. Tyto byly označeny F'tet/GM101.

F'tet/GM101 byly potom modifikovány vložením lácí⁰ konstruktu do ebg operonu mezi nukleotidy 2493 a 2937, podle číslování v GenBank přírůstkové číslo M6444lGb _Ba s delecí vmezeřené ebg sekvence.

Konstrukt byl přesunut do chromozomu za použití rekombinantního fágu nazvaného AGebgLacIQ Č,5 do F'tet/393. Po rekombinaci a rozdělení zůstávaly v buňkách pouze chromozomální inserty. Tyto byly označeny F'tet/GM22f Ftet episom byl odstraněn z kmene pomocí akridinové oranže v koncentraci 25 pg/ml v LB. Takto zpracovaný kmen byl citlivý na tetracyklin a byl označen GM221.

-35CZ 302155 B6

Fc fúzní konstrukt obsažený v plasmidu pAMG21 (který je zde označen jako pAMH2l-FcTMP-TMP), který byl potom vložen do hostitelského kmene GM221, byl uložen v ATCC pod přírůstkovým číslem 98957, 22. 10. 1998.

Exprese

Kultury pAMG2l-Fc-TMP-TMP v E. coli GM221 v Luria Broth médiu obsahujícím 50 pg/ml kanamycinu byly inkubovány při 37 °C před indukcí. Indukce exprese Fc-TMP-TMP genu z luxPR promotoru byla provedena přidáním syntetického autoindukčního činidla N-(3-oxoio hexanoyl)-DL-homoserinlaktonu do kultivačního média v konečné koncentraci 20 ng/ml a kultura byla inkubována při 37 °C po dobu 3 hodin. Po třech hodinách se bakteriální kultury znovu vyšetřovaly mikroskopicky na přítomnost inkluzních tělísek a potom se odstředily.

V indukovaných kulturách byla pozorována refraktivní inkluzní tělíska, což naznačuje, že FcTMP-TMP byl nejpravděpodobněji produkován v E. coli v nerozpustné frakci. Buněčné pelety byly lyžovány přímo resuspendováním v Laemmli vzorkovém pufru obsahujícím 10% β-merkaptoethanol a byly analyzovány SDS-PAGE, Na SDS-PAGE gelu byl pozorován 30 kD a proužek intenzivně zbarvený Coomasie barvivém. Předpokládaný genový produkt by měl mít délku 269 aminokyselin a molekulovou hmotnost 29,5 kDa. Také byla provedena fermentace za standardních podmínek v 101, která vedla k podobné expresi Fc-TMP-TMP jako pri produkci v menším množství.

Přečištění Fc-TMP-TMP

Buňky se rozdrtily ve vodě (1/10) homogenizací při vysokém tlaku (2 kola pri 14 000 psi) a inkluzní tělíska se získala odstředěním (4200 rpm v J-6B po dobu 1 hodiny), Inkluzní tělíska se solubilizovala v 6M guanidinu, 50 mM Tris, 8 mM DTT, pH 8,7 po dobu 1 hodiny při poměru 1/10. Solubilizovaná směs se naredila 20násobně v 2 M močovině, 50 mM Tris, 160 mM argininu, 3 mM cysteinu, pH 8,5. Směs se mísila přes noc za chladu. V tuto dobu Fc-TMP-TMP monomery dimetrizují za vzniku disulfidově vázaných sloučenin majících strukturu uvedenou na obr. 6C a potom se zahustí přibližně 1 Okřát ultrafiltrací. Potom se naředí 3krát lOmM Tris, 1,5 M močovinou, pH 9. pH této směsi se potom upraví na pH 5 kyselinou octovou. Sraženina se odstraní odstředěním a supematant se vnese do SP-Sepharose Fast Flow kolony uvedené do rovnováhy v 20 mM NaAc, 100 mM NaCI, pH 5 (10 mg/ml proteinová náplň, teplota okolí). Protein se eluuje za použití 20 objemů kolony gradientem lOOmM NaCI až 500 mM NaCI stejného pufru. Materiál získaný z kolony se naředí 3krát a vnese se do SP-Sepharosové HP kolony ve 20 mM NaAc, 150 mM NaCI, pH 5 (10 mg/ml proteinová náplň, teplota okolí). Protein se eluuje za použití 20 objemů kolony gradientem 150 mM NaCI až 400 mM NaCI stejného pufru. Pík se odebere a přefiltruje se.

Příklad 3

Tento příklad shrnuje výsledky získané u myší in vivo pro různé sloučeniny podle předkládaného vynálezu.

Myši: Normální samice BDF1 stáří přibližně 10 až 12 týdnů.

Odběry krve: Deset myší na skupinu bylo léčeno v den 0, dvě skupiny začaly o 4 dny později (celkem 20 myší). V každou uvedenou dobu byl proveden odběr krve u 5 myší a odběry byly prováděny nejméně třikrát týdně. Myši byly uvedeny do anestezie isofluranem a punkcí orbitálního sinu se získalo celkově 140 až 160 μΐ krve. Krev se hodnotila na Technicon H1E analyzátoru za použití softwaru pro myší krev. Měřenými parametry byly leukocyty, erytrocyty, hematokrit, hemoglobin, trombocyty a neutrofily.

-36CZ 302155 B6

Léčba: Myším byly podávány podkožní bolusové injekce nebo jim byla implantována 7 denní mikroosmotická pumpa pro kontinuální podání. Osmotické pumpy byly vloženy do kožní incise mezi lopatkami anestezovaných myší. Sloučeniny byty nareděny v PBS s 0,1% BSA. Všechny pokusy zahrnovaly jednu kontrolní skupinu, která byla léčena pouze nosičem. Koncentrace testo5 váných sloučenin v pumpách byla upravena tak, aby kalibrovaný tok z pump vedl k dosažení koncentrací uvedených v grafech.

Sloučeniny: Dávka sloučeniny byla podána myším pomocí 7denní mikroosmotické pumpy. Myši byly léčeny různými sloučeninami v jedné dávce 100 pg/kg v 7denní osmotické pumpě. Některé io z těchto sloučenin byly myším podány ve formě jediné bolusové injekce.

Výsledky testu aktivity. Výsledky testů aktivity jsou uvedeny na obr. 4 a 5. V testech dávkaodpověď provedených za použití 7-denních mikroosmotických pump (data nejsou uvedena) byl maximální účinek pozorován pro sloučeninu SEQ ID NO: 18 při 100 pg/kg/den; dávka 10 pg/15 kg/den dosahovala přibližně 50% maximální aktivity a dávka 1 pg/kg/den byla nejnižší dávka, při které mohla být v tomto testovacím systému pozorována aktivita. Dávka 10 pg/kg/den sloučeniny byla stejně aktivní jako dávka 100 pg/kg/den nepegylo váného rHu-MGDF ve stejném pokusu.

Diskuse

Je dobře známo, že MGDF působí podobným způsobem jako lidský růstový hormon (hGH), tj. jedna molekula proteinového ligandu se váže na dvě molekuly receptoru, což způsobí aktivaci receptoru (Wells, J. A: et al., Ann. Rev. Biochem. 65: 609-634 (1996)). Tato interakce je napo25 dobována působením mnohem menšího TMP peptidů. Nicméně, předkládané studie naznačují, že toto napodobení vyžaduje koordinované působení dvou TMP molekul, protože kovalentní dimerizace TMP buď C-C paralelně, nebo C-N sekvenčně, zvyšuje biologickou účinnost původního monomeru in vitro více než lOOOkrát. Relativně nízká biologická účinnost monomeru je pravděpodobně způsobena neúčinnou tvorbou nekovalentního dimeru. Výhodný kovalentní dimer může eliminovat entropickou bariéru pro tvorbu nekovalentního dimeru, který je tvořen výlučně slabými, nekovalentními interakcemi mezi dvěma molekulami malého peptidů tvořeného 14 zbytky.

Je zajímavé, že většina tandemových dimerů je účinnější než C-koncové paralelní dimery. Zdá se, že tandemová dimerizace způsobuje lepší konformaci molekuly než C-C paralelní dimeriza35 ce. Zdánlivě nesymetrický charakter tandemového dimeru může přibližovat tento dimer přirozenému ligandu, který, protože je asymetrickou molekulou, využívá dvě různá místa pro vazbu na dvě identické receptorové molekuly. Vložení PEG molekuly bylo provedeno za účelem zvýšení aktivity modifikovaného peptidů in vivo tím, že bude bránit proteolytické degradaci a zpomalí jeho vylučování renální filtrací. Nepředpokládalo se, že pegylace dále zvýší biologickou aktivitu tandemového dimenzovaného TMP peptidů in vitro v testu buněčné proliferace.

Příklad 5

Následující příklad shrnuje výsledky testů in vivo na opicích pro různé sloučeniny podle předkládaného vynálezu.

Pro hodnocení hematologických parametrů u samic opic makak rhesus po podkožním podání FcTMP-TMP byl navržen a proveden následující protokol. Opice byly rozděleny do pěti skupin po třech. Skupina 1 sloužila jako kontrola a byl jí podán acetatový pufr (20 mM octan sodný, 0,25 M chlorid sodný, pH 5) neobsahující ani Fc-TMP-TMP, ani pegy lovaný, rekombínantní lidský MGDF (PEG-rHuMGDF). Skupině 2 byla podána jedna nebo více dávek Fc-TMP-TMP v uvedených intervalech; skupině 4 bylo podáno 5000 pg/kg Fc-TMP-TMP v uvedených intervalech; a skupině 5 bylo podáno 100 pg/kg PEG-rHuMGDF v uvedených intervalech.

-37CZ 302155 B6

Den, kdy byla podána první dávka, byl označen jako den 0 cyklu 1. V cyklu 2 byly dávky podávány ve dny 21, 23, 25, 28, 30 a 32, Během cyklu 3 byla podána jedna dávka v den 84 a v cyklu 4 byla podána jedna dávka v den 123. U zvířat byly pozorovány klinické příznaky jednou denně s během aklímatizačního období, třikrát denně (před podáním dávky, 30 minut po podání dávky a 2 až 3 hodiny po podání dávky) ve dny aplikace dávek a jednou denně ve dny bez podání dávky.

Příjem potravy byl počítán denně podle počtu podané potravy a ponechané potravy pro každé zvíře 7 dnů před zahájením léčby a na konci sledování. Tělesná hmotnost každého zvířete byla měřena dvakrát před léčbou a dvakrát během léčby a rekonvalescence. Vzorky pro hematologiclo ké vyšetření byly odebrány jednou před léčbou a potom ve dny 1, 3, 5, 7, 9, II, 13, 15, 20, 22,

24, 26, 29, 31,33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47, 49, 55, 62, 69, 76, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99,

101, 103, 105, 111, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 150. Pro analýzu farmakokinetiky byly 0,5 ml vzorky séra odebrány jednou před podáním dávky a 1, 4 a 24 hodin po podání dávky. Vzorky byly odebírány ve dny 0, 21, 32, 84 a 123 a byly uskladněny pri při15 bližně -70 °C do analýzy. Pro analýzu protilátek byly 2 ml vzorky krve odebrány jeden týden před jednou dávkou a ve dny 0 (před podáním dávky), 6, 13, 20, 27, 34, 41, 48, 55, 62, 69, 76, 83, 90, 97, 104, 111, 118, 129, 136, 143 a 150. Vzorky byly uskladněny pri -70 °C do analýzy.

Výsledky ukazují, že hodnoty trombocytů se zvýšily ve všech léčených skupinách s nej vyšším

2o zvýšením ve skupině léčení PEG-rHuMGDF a nej vyšší dávkou Fc-TMP-TMP. V cyklu 1 se píkové hodnoty trombocytů zvýšily přibližně 3,3násobně a 3,1 násobně ve skupině léčené PEGrHuMGDF (den 9) a Fc-TMP-TMP v dávce 5000 pg/kg (den 9), v příslušném pořadí, ve srovnání s průměrným počtem trombocytů v kontrolní skupině. Nejnižší dávka Fc-TMP-TMP zvýšila hodnoty trombocytů přibližně l,05násobně ve srovnání s kontrolou ve stejné dny testu.

Podobné odpovědi nebyly zaznamenány v dalších cyklech.

Nicméně, v cyklu 4 nevykázala skupina léčená PEG-rHuMGDF tak vysoké zvýšení počtu trombocytů jako v předešlých cyklech. Skupina léčená PEG-rHuMGDF vykazovala přibližně 2násobné zvýšení počtu trombocytů ve srovnání s kontrolní skupinou v den 9 tohoto cyklu. Pro srovnání, průměrný počet trombocytů ve skupině léčené nej vyšší dávkou Fc-TMP-TMP v cyklu 4 byl 3,3násobně vyšší než v kontrolní skupině. Dále, zvířata léčená PEG-rHuMGDF měla průměrný počet trombocytů o 53 % nižší než byl průměrný počet trombocytů v kontrolní skupině na počátku 4 cyklu (na dávku) a průměrný počet trombocytů pro tuto skupinu na konci cyklu 4 * (27 dnů po podání dávky) byl o 79 % nižší než v kontrolní skupině. Pro všechna zvířata léčená

MAP2 byl průměrný počet trombocytů na začátku a na konci cyklu 4 ± 15% počtu trombocytů v kontrolní skupině.

V cyklu I a 2 byl zaznamenán trend směrem ke snížení erytrocytů (RBC) ve všech léčených skupinách. Pokles byl nejvýrazněji ve dny 41 až 43 a nejvyšší pokles RBC byl zaznamenán ve sku40 pine léčené PEG-rHuMGDF. Počty se vrátily k normálu (ve srovnání s kontrolou) již v den 47. Počet leukocytů (WBC) během cyklů 1 a 2 byl výrazně zvýšený (2,6-násobně) ve srovnání s kontrolou v den 35. Mírné zvýšení bylo zaznamenáno ve skupině léčené 5000 pg/ml Fc-TMPTMP v den 33. Hodnoty se vrátily k normálním (kontrolním) hodnotám na začátku dne 37. Podobná odpověď byla pozorována v cyklu 3 a žádná změna v leukocytech nebyla pozorována v žádné skupině v cyklu 4.

Během cyklu 3 byl počet erytrocytů mírně snížen v den 13 (po jediné dávce cyklu 3) ve všech léčených skupinách s výjimkou skupiny léčené 500 pg/kg Fc-TMP-TMP. Hodnoty erytrocytů se vrátily k normálním (kontrolním) hodnotám na začátku dne 17.

Během cyklu 4 byl počet erytrocytů snížen ve všech léčených skupinách s výjimkou skupiny léčené 500 pg/kg Fc-TMP-TMP. Oproti jiným cyklům byl v tomto cyklu přítomen více než jeden nadir. Toto snížení se vyskytovalo mezi dny 1 až 9 po podání dávky a upravovalo se ode dne 11.

-38CZ 302155 B6

Výsledky ukazují, že zvýšení počtu trombocytů nad hodnoty u kontrolních zvířat, může být detekováno 7 až 9 dnů po podání dávek u všech léčených zvířat ve všech testovaných cyklech. Zdá se, že opakovaná aplikace vede k vyšší odpovědi v produkci trombocytů ve srovnání s jediným i dávkami. V cyklu 4 byla trombocytární odpověď vyvolaná PEG-rHuMGDF nižší ve srovnání s předešlými cykly a ve srovnání s odpovědí na vysokou dávku Fc-TMP-TMP, Snížení počtu erytrocytů bylo pozorováno v cyklech 1, 2, 3 a 4 ve všech léčených skupinách během každého cyklu studie, ale všechny hematologické parametry se vrátily na normální hodnoty (kontrolní) po ukončení dávkování.

io Dohromady tyto výsledky ukazují, že léčba Fc-TMP-TMP je dobře tolerována u opic makak rhesus a že léčba Fc-TMP-TMP vede ke zvýšení počtu trombocytů po různých cyklech léčby. Nezdá se, že podle výsledných počtů trombocytů, že by existovala významná imunitní odpověď na Fc-TMP-TMP. Naopak, léčba v různých cyklech PEG-rHuMGDF ukázala inhibici trombocytámí odpovědi v cyklu 4, což naznačuje, že byly vytvořeny protilátky k PEG-rHuMGDF a že tyto protilátky mohou být zkříženě reaktivní s endogenním TPO makaka rhesus.

Je třeba si uvědomit, že existují různé změny a modifikace předkládaného vynálezu, které spadají do rozsahu vynálezu.

Seznam sekvencí <110> Liu, Chuan-Fe Feige, Ulrich Cheetham, JanetC.

25	<120>	Trombopoetické sloučeniny
	<130>	01017/36263
	<140>
30
	<141>
	<150>	60/105348
	<151>	1998-10-23
35
	<160>	46
	<170>	Patentln Ver. 2.0
	<2l0>	1
40	<211>	14
	<212>	PRT
	<213>	Artifíciální sekvence
	<220>
45	<223>	Popis artifíciální sekvence: peptid
	<400>	1
	Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin T
	1	5
50	<210>	2
	<211>	14
	<212>	PRT

-39CZ 302155 B6 <213> Artiťiciální sekvence <220>

<223> Popis artificiální sekvence: peptid <220>

<223> Peptid je podjednotka homodímeru: Podjednotky v homodimeru jsou kovalentně váza né na každém karboxylovém konci peptidovou vazbou s NH₂ CH₂—Clf-Cíh-CTl· CH(CONH₂)-NH-COCH₂CH₃-NH₂ <400> 2

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala 15 10 <210> 3 <211> 684 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Popis artificiální sekvence: oligonukleotid <400> 3 atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgt ccagctccgg aactcctggg gggaccgtca 60 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 120 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 180 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 240 fcaccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 300 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 360 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 420 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 480 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 540 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 660 agcctctccc tgtctccggg taaa 684 <210> 4 <211> 684 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Popis artificiální sekvence: oligonukleotid <400> 4 cacctgtttt gagtgtgtac aggtggaaca ggtcgaggcc ttgaggaccc ccctggcagt 60 cagaaggaga aggggggttt tgggttcctg tgggagtact agagggcctg gggactccag 120 tgtacgcacc accacctgca ctcggtgctt ctgggactcc agttcaagtt gaccatgcac 180 ctgccgcacc tccacgtatt acggttctgt ttcggcgccc tcctcgtcat gttgtcgtgc 240 atggcacacc agtcgcagga gtggcaggac gtggtcctga ccgacttacc gttcctcatg 300 ttcacgttcc agaggttgtt tcgggagggt cgggggtagc tcttttggta gaggtttcgg 360 tttcccgtcg gggctcttgg tgtccacatg tgggacgggg gtagggccct actcgactgg 420 ttcttggtcc agtcggactg gacggaccag tttccgaaga tagggtcgct gtagcggcac 480 ctcaccctct cgttacccgt cggcctcttg ttgatgttct ggtgcggagg gcacgacctg 540 aggctgccga ggaagaagga gatgtcgttc gagtggcacc tgttctcgtc caccgtcgtc 600 cccttgcaga agagtacgag gcactacgta ctccgagacg tgttggtgat gtgcgtcttc 660 tcggagaggg acagaggccc attt 684

-40 CZ 302155 B6 <210> 5 <211> 228 <212> PRT <213> Artifíciální sekvence <220>

<223> Popis artifíciální sekvence: peptid <400> 5

Met Asp Lys Thr His

Thr

Cys

Pro

Pro Cys 10

Pro

Ala

Pro Glu Leu 15

Leu

1

5

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

20

25

30

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

35

40

45

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

50

55

60

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

65

70

75

80

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

85

90

95

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

100

105

110

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

115

120

125

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

145

150

155

160

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

165

170

175

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

180

185

190

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

195

200

205

Met

HiS

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

210

215

220

Ser Pro Gly Lys 225 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artifíciální sekvence

-41 CZ 302155 B6 <220>

<223> Popis artificiální sekvence: peptid

5 <400> 6 Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly
1	5
<210> <211> io <212> <2I3>	7 8 PRT Artificiální sekvence
<220> <223> 15 <400>	Popis artificiální sekvence: peptid
7

Gly Gly Gly Asn Gly Ser Gly Gly

1	5
<210> 20 <21 1 > <212> <2i3>	8 8 PRT Artificiální sekvence
<220> 25 <223>	Popis artificiální sekvence: peptid
<400>	8

Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly 1 5

<210> <211> <212> <213>	9 4 PRT Artificiální sekvence
<220> <223>	Popis artificiální sekvence: peptid
<400> 9 Gly Pro Asn Gly 1
<210> <211> <212> <213>	10 32 PRT Artificiální sekvence
<220> <223>	Popis artificiální sekvence: peptid

-42CZ 302155 B6 <400> 10

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Pro

10 15

Asn Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala 20 25 30

<210>	11
<211>	36
<212>	PRT
<213>	Artificiální sekvence

<220>

<223> Popis artificiální sekvence: peptid <220>

<223> Cyklický peptid: sekundární struktura je udržována disulfidovou vazbou mezi i s intramolekulovými Cys zbytky v pozicích 9 a 31 <400> 11

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Cys Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly

5 10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Cys Leu

25 30

Ala Ala Arg Ala 35

<21O>	12
<211>	36
<212>	PRT
<213>	Artificiální sekvence

<220>

<223> Popis artificiální sekvence: peptid <400> 12

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Cys Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Arg Leu Gin Cys Leu

20	25	30
Ala Ala Arg Ala 35

<210>	13
<211>	36
<212>	PRT
<213>	Artificiální sekvence
<220>
<223>	Popis artificiální sekvence: peptid

-43 CZ 302155 B6 <400> 13

Ile

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin

Ala

Leu

Ala

Arg

Ala

Gly

1

5

10

15

Gly

Ile

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin

Ala

Leu

20

25

30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 14 <211> 36 <212> PRT <213> Artifíciální sekvence <220>

<223> Popis artifíciální sekvence: peptid <400> 14

Ile 1	Glu	Gly	Pro	Thr Leu 5	Arg	Gin
Gly	Lys	Gly	Gly 20	Gly Gly	Ile	Glu
Ala	Ala	Arg 35	Ala

Trp	Leu	Ala	Ala	Arg	Ala	Gly	Gly
	10					15
Gly	Pro	Thr	Leu	Arg	Gin	Trp	Leu
25					30

<210> 15 <211> 36 <212> PRT <213> Artifíciální sekvence <220>

<223> Lys zbytek v pozici 18 je bromacetylován <220>

<223> Popis artifíciální sekvence: derivatizovaný peptid <400> 15

Ile

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin

Trp

Leu

Ala

Arg

Ala

Gly

1

5

10

15

Gly

Lys

Gly

Ile

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin

Trp

Leu

20

25

30

Ala Ala Arg Ala 35

<210	16
<211>	36
<212>	PRT
<2I3>	Artifíciální sekvence
<220>
<223>	Popis artifíciální sekvence: peptid

-44CZ 302155 B6 <400> 16

Ile 1

Glu

Gly

Pro

Thr 5

Leu

Arg

Gin

Trp

Leu 10

Ala

Arg

Ala

Gly Gly 15

Gly

Cys

Gly

Gly 20

Gly

Ile

Glu

Gly 25

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin 30

Trp Leu

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 17 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Lys v pozici 18 je pegylovaný <220>

<223> Popis artificiální sekvence: derivatizovaný peptid <400> 17

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 18 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Cys v pozici 18 je pegylovaný <220>

<223> Popis artificiální sekvence: derivatizovaný peptid <400> 18

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 19 <211> 36

-45C7. 302155 B6 io <212> PRT <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Popis artificiální sekvence: peptid <400> 19

Ile	Glu	Gly	Pro	Thr Leu	Arg	Gin	Trp	Leu	Ala	Ala	rg Ala Gly Gly
1				5				10			15
Gly	Asn	Gly	Ser	Gly Gly	Ile	Glu	Gly	Pro	Thr	Leu	Arg Gin Trp Leu
			20				25				30

Ala Ala Arg Ala 35 <2I0> 20 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Monomemí podjednotka homodímeru; podjednotky v homodimeru jsou vázány disulfi dovou vazbou mezi Cys zbytky v pozici 18 na každé podjednotce <400> 20

Ile 1

Glu

Gly

Pro

Thr Leu 5

Arg

Gin

Trp

Leu 10

Ala

Arg

Ala

Gly Gly 15

Gly

Cys

Gly

Gly 20

Gly Gly

Ile

Glu

Gly 25

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin 30

Trp Leu

Ala

Arg 35

Ala

<210> 21 <21t> 36 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Popis artificiální sekvence: peptid <400> 21

Ile 1

Glu

Gly

Pro

Thr 5

Leu

Arg

Gin

Trp

Leu 10

Ala

Arg

Ala

Gly Gly 15

Gly

Gly 20

Gly

Ile

Glu

Gly 25

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin 30

Trp Leu

Ala

Arg 35

Ala

<210> 22 <211> 32

-46CZ 302155 B6 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Peptid je derivatizován na amino-konci kovalentně navázaným Fc regionem imiinoglobiilinu <220>

<223> Popis artificiální sekvence: peptid <400> 22

Ile 1

Glu

Gly

Pro

Thr 5

Leu Arg

Gin

Trp

Leu 10

Ala

Arg

Ala

Gly 15

Pro

Asn

Gly

Ile

Glu 20

Gly

Pro Thr

Leu

Arg 25

Gin

Trp

Leu

Ala

Ala 30

Arg

Ala

<210> 23 <211> 32 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Peptid je kovalentně navázán na amino a karboxylovém konci na Fc region imuno globulinu <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: peptid <400> 23

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp 1 5

Asn Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg 20 25

Leu Ala Ala Arg Ala Gly Pro 10 15

Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala 30 <210> 24 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Peptid je kovalentně navázán na amino- konci na Fc region imunoglobulinu <220>

<223> Popis arteftciální sekvence: peptid <400> 24

-47CZ 302155 B6

Ile

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin

Trp

Leu

Ala

Arg

Ala

Gly

1

5

10

15

Gly

Ile

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin

Trp

Leu

20

25

30

Ala

Arg

Ala

35

<210> 25 <211> 34 <212> PRT <213> Artifíciální sekvence <220>

<223> Peptid je kovalentně navázán na amino konci na Fc region imunoglobulinů <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: peptid <400> 25

Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala
1	5	10	15
Gly Pro	Asn Gly Ile Glu Gly Pro Thr	Leu Arg Gin	Trp Leu Ala Ala
	20 25		30
Arg Ala

<210> 26 <21 l> 36 <212> PRT <213> Artifíciální sekvence <220>

<223> Popis artefíciální sekvence: peptid <400> 26

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 27 <211> 36 <212> PRT <213> Artifíciální sekvence <220>

<223> Peptid je kovalentně navázán na amino konci na Fc region imunoglobulinů

-48CZ 302155 B6 <220>

<223> Cyklický peptid: sekundární struktura je zachovávána disulfidovou vazbou mezi intramolekulovými Cys zbytky v pozicích 9 a 31 <220>

<223> Popis artificiální sekvence: peptid <400> 27

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Cys Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Cys Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 28 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Peptid je kovalentně navázán na amino konci na Fc region imunoglobulinu <220>

<223> Popis artefíciální sekvence: peptid

<400>

28

Ile 1

Glu

Gly

Pro

Thr Leu Arg 5

Gin

Cys

Leu 10

Ala

Arg

Ala

Gly Gly 15

Gly

Gly 20

Gly Gly Ile

Glu

Gly 25

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin 30

Cys Leu

Ala

Arg 35

Ala

<210> 29 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Popis artefíciální sekvence: peptid <220>

<223> Peptid je kovalentně navázán na amino konci na Fc region imunoglobulinu <400> 29

-49CZ 302155 Β6

lle

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin

Ala

Leu

Ala

Arg

Ala

Gly

1

5

10

15

Gly

lle

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin

Ala

Leu

20

25

30

Ala

Arg

Ala

<210> 30 <211> 36 <212> PRT <213> A rt i fíciál η ί sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: peptid <400> 30

lle 1

Glu

Gly

Pro

Thr 5

Leu Arg

Gin

Trp

Leu 10

Ala

Arg Ala

Gly Gly 15

Gly

Lys

Gly

Gly 20

Gly

Gly lle

Glu

Gly 25

Pro

Thr

Leu

Arg Gin 30

Trp Leu

Ala

Arg 35

Ala

<2ÍO> 31 <211> 36 <212> PRT <213> A rt ific iální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: peptid <400> 31

lle

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin

Trp

Leu

Ala

Arg

Ala

Gly

1

5

10

15

Gly

Cys

Gly

lle

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin

Trp

Leu

20

25

30

Ala

Arg

Ala

35

<2I0> 32 <21I> 36 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: peptid

-50 CZ 302155 B6 <220>

<223> Peptid je kovalentně navázán na amino konci na Fc region imunoglobulinu <400> 32

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly

5 10 15

Glv Asn Gly Ser Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu

25 30

Ala Ala Arg Ala

5	35
<210> <211> <212> io <213>	33 36 PRT Artificiální sekvence
<220 <223>	Popis arteficiální sekvence: peptid
15 <220 <223>	Peptid je podjednotkou homodimeru; podjednotky homodimeru jsou kovalentně vázány disulfidovou vazbou mezi Cys zbytky v pozici 18 podjednotky
<220> io <223>	Peptid je kovalentně navázán na amino konci na Fc region imunoglobulinu
<400	33

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala

	35
25 <210> <211> <212> <213>	34 41 PRT Artificiální sekvence
30 <220> <223>	Popis arteficiální sekvence: peptid
<220> <223> 35 <400	Peptid je kovalentně navázán na amino konci na Fc region imunoglobulinu 34

-51 CZ 302155 B6

Gly

Ile

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin Trp

Leu

Ala

1

5

10

15

Ala

Arg

Ala

Gly

G1 y

Gly

Ile

Glu Gly

Pro

Thr

20

25

30

Leu

Arg

Gin

Trp

Leu

Ala

Arg

Ala

35

40

<210> 35 <211> 60 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: oligonukleotid <400> 35 aaaggtggag gtggtggtat cgaaggtccg actctgcgtc agtggctggc tgctcgtgct 60 <210> 36 <21I> 48 <2I2> DNA <2I3> Artificiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: oligonukleotid <400> 36 acctccacca ccagcacgag cagccagcca ctgacgcaga gtcggacc <210> 37 <211> 66 <212> DNA <213> Artificiální sekvence jo <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: oligonukleotid <400> 37 ggtggtggag gtggcggcgg aggtattgag ggcccaaccc ttcgccaatg gcttgcagca 60 cgcgca 66 <210> 38 <211> 76 <212> DNA <213> Artificiální sekvence 40 <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: oligonukleotid <400> 38 aaaaaaagga tcctcgagat tatgcgcgtg ctgcaagcca ttggcgaagg gttgggccct 60 _4S caatacctcc gccgcc 76

- 52 CZ 302155 B6 <210> 39 <211> 126 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: oligonukleotid io <400 39 aaaggtggag gtggtggtat cgaaggtccg actctgcgtc agtggctggc tgctcgtgct 60 ggtggtggag gtggcggcgg aggtattgag ggcccaaccc ttcgccaatg gcttgcagca 120 cgcgca 126 <210 40 <211> 124 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: oligonukleotid <400> 40 ccaggctgag acgcagtcac cgaccgacga gcacgaccac cacctccacc gccgcctcca 60 taactcccgg gttgggaagc ggttaccgaa cgtcgtgcgc gtattagagc tcctaggaaa 120 aaaa 124 <210> 41 <211> 42 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <220 <223> Popis arteficiální sekvence: peptid <400> 41

Lys

Gly

ile

Glu

Gly

Pro Thr

Leu

Arg

Gin

Trp Leu

1

5

10

15

Ala

Arg

Ala

Gly

Gly Gly

Gly

Ile

Glu

Gly Pro

20

25

30

Thr

Leu

Arg

Gin

Trp

Leu

Ala

Arg

Ala

35

40

35 <210>	42
<211>	22
<212>	DNA
<213>	Artificiální sekvence
40 <220>
<223>	Popis arteficiální sekvence: oligonukleotid
<400>	42
aacataagta cctgtaggat cg

-53CZ 302155 B6

<210>	43
<211>	52
<212>	DNA
5 <213>	Artificiální sekvence
<220>
<223>	Popis arteficiální sekvence: oligonukleotid
io <400>	43
ttcgatacca ccacctccac ctttacccgg agacagggag
<210>	44
15 <211>	861
<212>	DNA
<213>	Artificiální sekvence
<220>
20 <223>	Popis arteflciální sekvence: oligonukleotid
<400>	44

aggctcttct gc tctagatttg caccttgtcc ccaaggacac gccacgaaga ccaagacaaa ccgtcctgca ccctcccagc aggtgtacac gcctggtcaa cggagaacaa acagcaagct tgatgcatga aaggtggagg gtggtggagg gcgcataatc ttttaactaa agctccggaa cctcatgatc ccctgaggtc gccgcgggag ccaggactgg ccccatcgag cctgccccca aggcttctat ctacaagacc caccgtggac ggctctgcac tggtggtatc tggcggcgga tcgaggatcc ttaaaggagg ctcctggggg tcccggaccc aagttcaact gagcagtaca ctgaatggca aaaaccatct tcccgggatg cccagcgaca acgcctcccg aagagcaggt aaccactaca gaaggtccga ggtattgagg g

aataacatat gaccgtcagt ctgaggtcac ggtacgtgga acagcacgta aggagtacaa ccaaagccaa agctgaccaa tcgccgtgga tgctggactc ggcagcaggg cgcagaagag ctctgcgtca gcccaaccct ggacaaaact cttcctcttc atgcgtggtg cggcgtggag ccgtgtggtc gtgcaaggtc agggcagccc gaaccaggtc gtgggagagc cgacggctcc gaacgtcttc cctctccctg gtggctggct tcgccaatgg cacacatgtc cccccaaaac gtggacgtga gtgcataatg agcgtcctca tccaacaaag cgagaaccac agcctgacct aatgggcagc ttcttcctct tcatgctccg tctccgggta gctcgtgctg cttgcagcac

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

861 <2I0> 45 <211> 861 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Popis arteflciální sekvence: oligonukleotid <400> 45

-54CZ 302155 B6 agatctaaac aaaattgatt aatttcctcc ttattgtata cctgttttga gtgtgtacag 60 gtggaacagg tcgaggcctt gaggaccccc ctggcagtca gaaggagaag gggggttttg 120 ggttcctgtg ggagtactag agggcctggg gactccagtg tacgcaccac cacctgcact 180 cggtgcttct gggactccag ttcaagttga ccatgcacct gccgcacctc cacgtattac 240 ggttctgttt cggcgccctc ctcgtcatgt tgtcgtgcat ggcacaccag tcgcaggagt 300 ggcaggacgt ggtcctgacc gacttaccgt tcctcatgtt cacgttccag aggttgtttc 360 gggagggtcg ggggtagctc ttttggtaga ggtttcggtt tcccgtcggg gctcttggtg 420 tccacatgtg ggacgggggt agggccctac tcgactggtt cttggtccag tcggactgga 480 cggaccagtt tccgaagata gggtcgctgt agcggcacct caccctctcg ttacccgtcg 540 gcctcttgtt gatgttctgg tgcggagggc acgacctgag gctgccgagg aagaaggaga 600 tgtcgttcga gtggcacctg ttctcgtcca ccgtcgtccc cttgcagaag agtacgaggc 660 actacgtact ccgagacgtg ttggtgatgt gcgtcttctc ggagagggac agaggcccat 720 ttccacctcc accaccatag cttccaggct gagacgcagt caccgaccga cgagcacgac 780 caccacctcc accgccgcct ccataactcc cgggttggga agcggttacc gaacgtcgtg 840 cgcgtattag agctcctagg c 861 <210> 46 <211> 269 <212> PRT <213> Artificiáln í sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: peptid <400> 46

Met 1

Asp

Lys

Thr

His 5

Thr Cys

Pro

Cys 10

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu 15

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

20

25

30

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

35

40

45

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

50

55

60

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

65

70

75

80

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

85

90

95

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

100

105

110

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

115

120

125

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

130

135

140

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Sloučenina, která se váže na mpl receptor a obsahuje strukturu (Ec)_ni-(L2)_qTMP_t-(L,)„-TMP₂4L3)_r-(Fc)_p kde TMP] a TMP₂ jsou každý nezávisle vybrány ze skupiny základních sloučenin obsahujících strukturu kde

X₂ je vybrán ze souboru sestávajícího z Glu, Asp, Lys a Val;

Xi je vybrán ze souboru sestávajícího z Gly a Ala;

X₄ je Pro;

X,₅ je vybrán ze souboru sestávajícího z Thr a Ser;

X<, je vybrán ze souboru sestávajícího z Leu, Ile, Val, Ala, a Phe;

X? je vybrán ze souboru sestávajícího z Arg a Lys;

Xs je vybrán ze souboru sestávajícího z Gin, Asn, a Glu;

Xg je vybrán ze souboru sestávajícího z Trp, Tyr, Cys, Ala a Phe;

Xio je vybrán ze souboru sestávajícího z Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met, a Lys;

Lj, L₂ a Li jsou spojovací skupiny nezávisle zvolené ze souboru sestávajícího z Y_n, kde Y je přirozená aminokyselina nebo její stereoizomer a n je 1 až 20;

(Gly)_n, kde n je 1 až 20 a kde je-li n větší než 1, tak může být až polovina Gly zbytků nahrazena zbytky jiné aminokyseliny vybrané ze zbývajících 19 přirozených aminokyselin nebo jejich stereoizomerú;

(Gly)₃Lys(Gly)₄ (Gly)iAsnGlySer(Gly)₂ (Gly)iCys(Gly)₄

GlyProAsnGly (SEQ ID NO: 6); (SEQ ID NO: 7); (SEQ ID NO: 8); (SEQ ID NO: 9);

zbytku Cys a (CH₂)_n, kde n představuje číslo 1 až 20;

Fc je Fc region imunoglobulinu; n je 0 nebo 1;

m, p, q a r jsou každý nezávisle zvolen ze souboru sestávajícího z 0 a 1, přičemž alespoň jeden z m nebo pje 1 a dále když mje 0, potom qje 0, a když pje 0, potom rje 0; a její farmaceuticky přijatelné soli.

- 56CZ 302155 B6
2. Sloučenina podle nároku 1, kde TMP] a TMP₂ jsou nezávisle vybrány ze souboru sestávajícího z

X₂-X₃-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-Xii;

X2“X
3^_X4”X5^-X6^-X7~Xe^-X9^-Xl0^-Xll~Xl2 ' X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xl0-Xll-Xl2-Xl3;

X₂-X3-X4-X5-X6-X7-X₈-X₉-XlO-Xll-Xl2-Xl3-Xl4 ΐ Xi-X₂-X₃-X₄-X5-X6-X7-Xe-X9“Xio;

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11; Χχ-Χ2^_Χ3”Χ4^-Χ5^-Χ6“Χ7~Χ8”Χ9^-Χΐ0“Χΐ1^-Χΐ2 ! XÍ-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X9-X9-X10-XU-X12-X13; 3

XÍ-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14;

kde

X₂ až X₁₀ mají výše uvedený význam;

ιο Xi je vybrán ze souboru sestávajícího z Ile, Ala, Val, Leu, Ser, a Arg;

Xn je vybrán ze souboru sestávajícího z Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His, a Glu;

X12 je vybrán ze souboru sestávajícího z Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Gly, Ser a Gin;

Xi3 je vybrán ze souboru sestávajícího z Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gin, a Gly; a

Xt4 je vybrán ze souboru sestávajícího z Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu a Gly.

20 3. Sloučenina podle nároku 1, kde TMP] a/nebo TMP₂ jsou derivatizovány jedním nebo více z následujících způsobů:

jedna nebo více peptidylových vazeb [-C(O)NR-] je nahrazena nepept idy lovou vazbou zvolenou ze souboru sestávajícího z -CH₂-karbamátové vazby [-CH₂-OC(O)NR-J; fosfonátové vazby;

25 -CHr-sulfonamidové vazby [-CH₂-S(O)₂NR-]; močovinové vazby [-NHC(O)NH-]: -CH₂sekundámí aminové vazby; a alkylované peptidové vazby [-C(O)NR⁶-, kde R⁶ je nižší alkyl];

N-konec je -NRR¹; na -NRC(O)R skupinu; -NRC(O)OR- skupinu; -NRS(O)₂R skupinu; -NHC(O)NHR skupinu, kde R a R¹ jsou vodík nebo nižší alkyl, s podmínkou, že R a R¹ nejsou

30 oba vodík; sukcinimidovou skupinu; benzyloxykarbonyl-NH-(CBZ-NH-) skupinu; nebo benzyloxy karbony 1-NH-skupinu obsahující 1 až 3 substituenty na fenytovém kruhu vybrané ze souboru sestávajícího z nižší alkyl skupiny, nižší alkoxy skupiny, chloru a bromu; a

C-konec je -C(O)R², kde R² je vybrán ze skupiny sestávající z nižší alkoxyskupiny a -NR³R⁴,

35 kde R³ a R⁴jsou nezávisle vybrány ze souboru sestávajícího z vodíku a nižší alkylskuptny.
4. Sloučenina podle nároku 1, která je cyklická.
5. Sloučenina podle nároku 1, kde TMP] a TMP₂ jsou oba

-57CZ 302155 B6

Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala (SEQ ID NO: 1).
6. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 5, kde L_h L₂ a Lije každý nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z Y,„ přičemž Y je vybrán z přirozených aminokyselin nebo jejich stereo5 izomerů a n představuje 1 až 20.
7. Sloučenina podle některého z nároků I až 6, kde L_h L₂ a Li obsahuje (Gly)_n, kde n je 1 až 20 a kde je-li n větší než 1, tak může být až polovina Gly zbytků nahrazena zbytky jiné aminokyseliny vybrané ze zbývajících 19 přirozených aminokyselin nebo jejich stereoizomerů.

io
8. Sloučenina podle některého z nároků I až 7, kde L| je (Gly)₅ a L₂ je (Gly)₈.
9. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 8 zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 46.
10. Sloučenina podle nároku 6, kde Lj, L₂ a Lije každý nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z (Gly)iLys(Gly)₄ (Gly)₃AsnGlySer(Gly)₂ (Gly).iCys(Gly)₄

GlyProAsnGly (SEQ ID NO: 6); (SEQ ID NO: 7); (SEQ ID NO: 8) a (SEQ ID NO: 9).
11. Sloučenina podle nároku 6, kde L₍, L₂ nebo Li obsahuje zbytek Cys.

25
12 Sloučenina podle některého z nároků 1 až 11, kterou je dimer.
13. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 5, kde Li, L₂ nebo L; obsahuje (CH₂)„, kde n představuje l až 20.

30
14. Sloučenina podle nároku 1 zvolená ze souboru sestávajícího z

-58CZ 302155 B6

Ι·ϋ-Π·ΟΡ·ΓΙΤ<ί)λνΐ.ΛΑΚΛ-ΟΡΝΟ-ΙΕΟΡΤΙ.ΗρΑνΕΑΑΙ<Λ (SEQ, ID NO: 22)

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTI^QWLAARA-Fc (SEQ. ID NO: 23)

IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA-Fc (SEQ. ID NO: 24)

Fc-GG-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 25)

Fc-IEGPTERQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 26)

Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG4EGPT1.RQCLAARA (cyklické)

J .............| (SEQ. ID NO: 27)

Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (lineární) (SEQ. ID NO: 28)

Fc-IEGPTERQAEAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA

Fc-IEGFitRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTERQWEAARA (SEQ. ID NO: 29) (SEQ. ID NO: 30) (SEQ. ID NO: 31) (SEQ. ID NO: 32)

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-1EGPTLRQWLAARA *

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPITRQWLAARA (SEQ. ID NO: 33)

Ec-GGGGC4KGPTIJ<QWIAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 34).
15. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14 ve směsi s farmaceuticky přijatelným nosičem.
16. Polynukleotid, který kóduje sloučeninu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14.
17. Vektor, který obsahuje polynukleotid podle nároku 16.

io
18. Hostitelská buňka, která obsahuje vektor podle nároku 17.
19. Způsob výroby sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků lažl4, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 18 ve vhodném živném médiu a izolaci sloučeniny z buňky nebo živného média.

- 59 CZ 302155 B6
20. Sloučenina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14 k použití jako léčivo.
21. Použití sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14 pro výrobu léčiva k použití pro zvyšování megakaryocytů nebo destiček u pacienta.
22. Použití sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14 pro výrobu léčiva k použití pro způsob léčení thrombocytopenie u pacienta, který takové léčení potřebuje, přičemž se takovému pacientovi podává účinné množství sloučeniny.
23. Použití sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14 pro výrobu léčiva pro léčení idiopatické nebo imunitní thrombocytopenie, 1TP, u pacienta, který takové léčení potřebuje, přičemž takovému pacientovi se podává účinné množství sloučeniny.
24. Použití sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14 pro výrobu léčiva pro léčení myelodysplastického syndromu u pacienta, který takové léčení potřebuje, přičemž takovému pacientovi se podává účinné množství sloučeniny.