JP6730705B2 - 哺乳動物細胞に対する外来遺伝子の導入効率の向上剤 - Google Patents
哺乳動物細胞に対する外来遺伝子の導入効率の向上剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6730705B2 JP6730705B2 JP2016574847A JP2016574847A JP6730705B2 JP 6730705 B2 JP6730705 B2 JP 6730705B2 JP 2016574847 A JP2016574847 A JP 2016574847A JP 2016574847 A JP2016574847 A JP 2016574847A JP 6730705 B2 JP6730705 B2 JP 6730705B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- foreign gene
- introducing
- efficiency
- improving
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 60
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 title claims description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 77
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 36
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 claims description 26
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 claims description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 22
- 230000035699 permeability Effects 0.000 claims description 22
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 13
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 10
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 9
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 7
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 5
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 claims 4
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 claims 4
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 24
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 24
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 20
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 4
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 3
- VSNHCAURESNICA-UHFFFAOYSA-N Hydroxyurea Chemical compound NC(=O)NO VSNHCAURESNICA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 229960001330 hydroxycarbamide Drugs 0.000 description 3
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 230000004382 visual function Effects 0.000 description 3
- RAVVEEJGALCVIN-AGVBWZICSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-5-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]acetyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]hexanoyl]amino]hexanoyl]amino]-5-(diamino Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 RAVVEEJGALCVIN-AGVBWZICSA-N 0.000 description 2
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 108010035848 Channelrhodopsins Proteins 0.000 description 2
- 108700000788 Human immunodeficiency virus 1 tat peptide (47-57) Proteins 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 210000000857 visual cortex Anatomy 0.000 description 2
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 2
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 11-cis-retinal Chemical compound O=C/C=C(\C)/C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 0.000 description 1
- ZESRJSPZRDMNHY-YFWFAHHUSA-N 11-deoxycorticosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 ZESRJSPZRDMNHY-YFWFAHHUSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000195628 Chlorophyta Species 0.000 description 1
- 241000725101 Clea Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108700020121 Human Immunodeficiency Virus-1 rev Proteins 0.000 description 1
- 101000756400 Human T-cell leukemia virus 2 Protein Rex Proteins 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000004330 Rhodopsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000820 Rhodopsin Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 1
- 206010047571 Visual impairment Diseases 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 229960003654 desoxycortone Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000017532 inherited retinal dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000002735 iris pigment epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000029257 vision disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000004552 water soluble powder Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
Description
本発明は、哺乳動物細胞に対する外来遺伝子の導入効率の向上剤に関する。
哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する方法には様々な方法が存在するが、その一つとしてウイルスベクターを利用する方法が知られている。この方法は、ゲノムに目的遺伝子を組み込んだウイルスを標的細胞に感染させることによって、目的遺伝子を標的細胞に送り込むものであり、ウイルスベクターのなかでもアデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：以下「ＡＡＶ」と略称する）ベクターは、ヒトに対する安全性が高いウイルスベクターとして、すでに遺伝子治療において実用化されている。しかしながら、ＡＡＶの哺乳動物細胞への感染効率は、細胞の種類や由来によって様々であることから、感染効率が低い細胞が標的細胞である場合、標的細胞に対する目的遺伝子の導入効率が劣ることで、充分な遺伝子治療の効果が発揮されない。
本発明者らは、これまで視覚障害に対する治療方法についての研究を精力的に行ってきており、その成果として、ＡＡＶベクターを用いた遺伝子治療において、標的細胞である虹彩色素上皮細胞に発現する上皮成長因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：以下「ＥＧＦＲ」と略称する）のチロシンキナーゼ活性を阻害することで、目的遺伝子である脳由来神経栄養因子遺伝子の導入効率が向上することを、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害する低分子有機化合物であるチルホスチン（ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ）を用いて確認している（非特許文献１）。しかしながら、チルホスチンは、低濃度（例えばインビトロの実験において１０μＭ）で細胞毒性を示すことが知られている。また、抗がん剤として用いられるヒドロキシ尿素も、ＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際に外来遺伝子の導入効率を向上させる作用を有することが知られているが、その作用は極めて弱い。
Ｅｒｉｋｏ Ｓｕｇａｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５；４６：３３４１−３３４８
そこで本発明は、ＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際に用いる、外来遺伝子の導入効率の新規な向上剤を提供することを目的とする。
本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意検討を行った結果、膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドが、ＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際、外来遺伝子の導入効率の向上剤の有効成分として有用であることを見出した。
上記の点に鑑みてなされた本発明のＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際に用いる、外来遺伝子の導入効率の向上剤は、請求項１記載の通り、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドのＣ末端に膜透過性を有するペプチドを結合させた結合ペプチドを有効成分とする。
また、請求項２記載の外来遺伝子の導入効率の向上剤は、請求項１記載の外来遺伝子の導入効率の向上剤において、哺乳動物細胞が網膜細胞である。
また、請求項３記載の外来遺伝子の導入効率の向上剤は、請求項１記載の外来遺伝子の導入効率の向上剤において、外来遺伝子が光感受性陽イオン選択的チャネル遺伝子である。
また、本発明の哺乳動物細胞に対する外来遺伝子の導入効率を向上させる方法は、請求項４記載の通り、インビトロにおいてＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドのＣ末端に膜透過性を有するペプチドを結合させた結合ペプチドを存在させることによる。
また、本発明は、請求項５記載の通り、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドのＣ末端に膜透過性を有するペプチドを結合させた結合ペプチドに関する。
また、本発明のインビトロにおいてＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する方法は、請求項６記載の通り、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドのＣ末端に膜透過性を有するペプチドを結合させた結合ペプチドの存在下で行うものである。
また、請求項２記載の外来遺伝子の導入効率の向上剤は、請求項１記載の外来遺伝子の導入効率の向上剤において、哺乳動物細胞が網膜細胞である。
また、請求項３記載の外来遺伝子の導入効率の向上剤は、請求項１記載の外来遺伝子の導入効率の向上剤において、外来遺伝子が光感受性陽イオン選択的チャネル遺伝子である。
また、本発明の哺乳動物細胞に対する外来遺伝子の導入効率を向上させる方法は、請求項４記載の通り、インビトロにおいてＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドのＣ末端に膜透過性を有するペプチドを結合させた結合ペプチドを存在させることによる。
また、本発明は、請求項５記載の通り、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドのＣ末端に膜透過性を有するペプチドを結合させた結合ペプチドに関する。
また、本発明のインビトロにおいてＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する方法は、請求項６記載の通り、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドのＣ末端に膜透過性を有するペプチドを結合させた結合ペプチドの存在下で行うものである。
本発明によれば、ＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際に用いる、外来遺伝子の導入効率の向上剤の有効成分として、膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドを提供することができる。
本発明のＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際に用いる、外来遺伝子の導入効率の向上剤は、膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドを有効成分とする。
本発明における膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドにおいて、膜透過性を有するペプチドは、細胞膜を通過して細胞質内へ移行する作用を持つ自体公知のアミノ酸配列を有するもの（Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ：ＣＰＰ）であってよく、例えば、ＨＩＶ−１ Ｔａｔに由来するＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）、ＦＨＶ ｃｏａｔに由来するＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ（配列番号２）、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖに由来するＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ（配列番号３）、ＢＭＶ Ｇａｇに由来するＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ（配列番号４）、ＨＴＬＶ−ＩＩ Ｒｅｘに由来するＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ（配列番号５）などが挙げられる（必要であれば例えば、二木史朗、蛋白質核酸酵素、Ｖｏｌ．４７ Ｎｏ．１１（２００２）１４１５−１４１９を参照のこと）。これらのアミノ酸配列は、膜透過性を有する限りにおいて１〜５個のアミノ酸が欠失、置換または付加したものであってもよい。
本発明における膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドにおいて、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドは、自体公知のアミノ酸配列を有するものであってよく、例えば、ＥＧＦＲの自己リン酸化部位であるＹ９９２に由来するＤＥＹＬＩ（配列番号６）、Ｙ１０６８に由来するＶＰＥＹＩＮＱ（配列番号７）、Ｙ１１４８に由来するＤＹＱＱＤ（配列番号８）、Ｙ１１７３に由来するＥＮＡＥＹＬＲ（配列番号９）などが挙げられる（必要であれば例えば、Ｍｉｎｅｏ Ａｂｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２００６；１４７：４０２−４１１を参照のこと）。これらのアミノ酸配列は、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害する限りにおいて１〜５個のアミノ酸が欠失、置換または付加したものであってもよい。
本発明における膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドは、膜透過性を有するペプチドのＣ末端にＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドを結合させてもよいし、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドのＣ末端に膜透過性を有するペプチドを結合させてもよい。具体例としては、ＨＩＶ−１ Ｔａｔに由来するＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲのＣ末端にＹ１０６８に由来するＶＰＥＹＩＮＱやＹ１１４８に由来するＤＹＱＱＤを結合させたペプチド、ＦＨＶ ｃｏａｔに由来するＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲのＣ末端にＹ１１７３に由来するＥＮＡＥＹＬＲを結合させたペプチド、Ｙ１０６８に由来するＶＰＥＹＩＮＱのＣ末端にＨＩＶ−１ Ｔａｔに由来するＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを結合させたペプチドなどが挙げられる。
本発明における膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドは、ペプチド合成機を用いて化学合成することができるが、遺伝子工学的手法によって調製してもよい。
なお、本発明における膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドは、ＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際の安定性を保つことなどを目的として、そのＮ末端をアセチル化したりＣ末端をアミド化したりしてもよい。
本発明における膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドは、例えば水溶性の粉末である。従って、インビトロにおいてＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際、細胞の培養液に溶解して例えば１〜２４時間、３７℃でインキュベートした後、ウイルスを細胞に感染させることで、外来遺伝子の導入効率を向上させることができる。また、インビボにおいては、本発明における膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドを、外来遺伝子を組み込んだＡＡＶベクターの溶液に溶解してから、体内に投与してウイルスを細胞に感染させることで、外来遺伝子の導入効率を向上させることができる。本発明における膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドの、細胞の培養液への溶解量や外来遺伝子を組み込んだＡＡＶベクターの溶液への溶解量は、例えば０．１μＭ〜１０Ｍの範囲になるように適宜設定すればよい。なお、本発明において、哺乳動物細胞は、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ 、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌなどの各種の部位の細胞であってよい。外来遺伝子は、標的細胞に対して導入されることで、例えば疾患の治療効果を発揮するものなどであってよい。具体的には、哺乳動物細胞としては、哺乳動物の網膜細胞（網膜を構成する神経細胞やグリア細胞や色素上皮細胞など）が挙げられる。外来遺伝子としては、視覚機能に重要な役割を果たす光受容チャネルロドプシンなどの光感受性陽イオン選択的チャネルの遺伝子が挙げられる。ＡＡＶベクターへの光感受性陽イオン選択的チャネル遺伝子の組み込みや、光感受性陽イオン選択的チャネル遺伝子を組み込んだＡＡＶベクターの網膜細胞への導入は、例えばＴｏｍｉｔａ Ｈｉｒｏｓｈｉ，ｅｔ ｓｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，２０１４；２２（８）：１４３４−１４４０に記載の方法に従って行うことができる。本発明者らは、この文献において、光感受性陽イオン選択的チャネル遺伝子を組み込んだＡＡＶベクターを網膜細胞に導入にすることによって視覚機能が回復することを報告したが、本発明における膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドは、より少量の光感受性陽イオン選択的チャネル遺伝子を組み込んだＡＡＶベクターによる、より効果的な視覚機能の回復に寄与する。
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
実施例１：
カニクイザル由来の繊維芽細胞株であるＣＹＮＯＭ−Ｋ１を９６ウェルプレートにそれぞれ１×１０４個ずつ播種し、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地で、１日、３７℃でインキュベートした。１×ＤＰＢＳで２回ｗａｓｈした後、４０ｍＭのヒドロキシ尿素（ＨＵ）（１ｍＭの酪酸ナトリウムを含む）、１０μＭのチルホスチン（Ｔｙｒ）、被験物質としての各種の濃度のＡｃｅｔｙｌ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＶＰＥＹＩＮＱ−ＣＯＮＨ２（配列番号１０：Ｓｈｉｍａｄｚｕ社のペプチド合成機ＰＳＳＭ−８を用いた化学合成による水溶性の白色粉末）をそれぞれ加え、５時間、３７℃でインキュベートした。インキュベートを終了した後、２％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地で２回ｗａｓｈしてから、市販のＡＡＶとｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｎ１ Ｖｅｃｔｏｒを用いてメーカのマニュアルに従って作製したＡＡＶ−ｐｍＣｈｅｒｒｙ（１×１０１２〜１３ｐａｒｔｉｃｌｅ／ｍＬ）２．５μＬ＋２％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地４７．５μＬをウイルス溶液として加え、２時間、３７℃でインキュベートした後、１８％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地を５０μＬ加えた。１日後に培地交換を行い、さらに３日間培養した。その後、核染色剤であるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２溶液を５μｇ／ｍＬになるように加え、３０分間、室温でインキュベートし、蛍光顕微鏡で細胞の写真を撮影した。撮影した写真から、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現効率を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２によって核が青色に染色された全細胞数に対する、ｍＣｈｅｒｒｙによって核が赤色に染色された細胞数の比率として計算した。結果を図１に示す（無処理群をコントロールとする相対値）。図１から明らかなように、被験物質である膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドは、濃度依存的にｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の導入効率を向上させることで発現効率を向上させ、その作用はチルホスチンに匹敵するものであった。なお、この被験物質は、チルホスチンよりも低毒性であった（例えばインビトロの実験において１ｍＭでも細胞毒性を示さない）。
カニクイザル由来の繊維芽細胞株であるＣＹＮＯＭ−Ｋ１を９６ウェルプレートにそれぞれ１×１０４個ずつ播種し、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地で、１日、３７℃でインキュベートした。１×ＤＰＢＳで２回ｗａｓｈした後、４０ｍＭのヒドロキシ尿素（ＨＵ）（１ｍＭの酪酸ナトリウムを含む）、１０μＭのチルホスチン（Ｔｙｒ）、被験物質としての各種の濃度のＡｃｅｔｙｌ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＶＰＥＹＩＮＱ−ＣＯＮＨ２（配列番号１０：Ｓｈｉｍａｄｚｕ社のペプチド合成機ＰＳＳＭ−８を用いた化学合成による水溶性の白色粉末）をそれぞれ加え、５時間、３７℃でインキュベートした。インキュベートを終了した後、２％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地で２回ｗａｓｈしてから、市販のＡＡＶとｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｎ１ Ｖｅｃｔｏｒを用いてメーカのマニュアルに従って作製したＡＡＶ−ｐｍＣｈｅｒｒｙ（１×１０１２〜１３ｐａｒｔｉｃｌｅ／ｍＬ）２．５μＬ＋２％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地４７．５μＬをウイルス溶液として加え、２時間、３７℃でインキュベートした後、１８％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地を５０μＬ加えた。１日後に培地交換を行い、さらに３日間培養した。その後、核染色剤であるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２溶液を５μｇ／ｍＬになるように加え、３０分間、室温でインキュベートし、蛍光顕微鏡で細胞の写真を撮影した。撮影した写真から、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現効率を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２によって核が青色に染色された全細胞数に対する、ｍＣｈｅｒｒｙによって核が赤色に染色された細胞数の比率として計算した。結果を図１に示す（無処理群をコントロールとする相対値）。図１から明らかなように、被験物質である膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドは、濃度依存的にｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の導入効率を向上させることで発現効率を向上させ、その作用はチルホスチンに匹敵するものであった。なお、この被験物質は、チルホスチンよりも低毒性であった（例えばインビトロの実験において１ｍＭでも細胞毒性を示さない）。
実施例２：
被験物質としての各種の濃度のＡｃｅｔｙｌ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＤＹＱＱＤ−ＣＯＮＨ２（配列番号１１：Ｓｈｉｍａｄｚｕ社のペプチド合成機ＰＳＳＭ−８を用いた化学合成による水溶性の白色粉末）を用いること以外は実施例１と同様にしてそのｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現効率に対する作用を評価した。結果を図２に示す。図２から明らかなように、被験物質のｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現効率の向上作用はチルホスチンに匹敵するものであった。なお、この被験物質は、チルホスチンよりも低毒性であった（例えばインビトロの実験において１ｍＭでも細胞毒性を示さない）。
被験物質としての各種の濃度のＡｃｅｔｙｌ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＤＹＱＱＤ−ＣＯＮＨ２（配列番号１１：Ｓｈｉｍａｄｚｕ社のペプチド合成機ＰＳＳＭ−８を用いた化学合成による水溶性の白色粉末）を用いること以外は実施例１と同様にしてそのｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現効率に対する作用を評価した。結果を図２に示す。図２から明らかなように、被験物質のｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現効率の向上作用はチルホスチンに匹敵するものであった。なお、この被験物質は、チルホスチンよりも低毒性であった（例えばインビトロの実験において１ｍＭでも細胞毒性を示さない）。
実施例３：
被験物質としての各種の濃度のＡｃｅｔｙｌ−ＶＰＥＹＩＮＱＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＣＯＮＨ２（配列番号１２：Ｓｈｉｍａｄｚｕ社のペプチド合成機ＰＳＳＭ−８を用いた化学合成による水溶性の白色粉末）を用いること以外は実施例１と同様にしてそのｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現効率に対する作用を評価したところ、チルホスチンに匹敵するｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現効率の向上作用を示した。なお、この被験物質は、チルホスチンよりも低毒性であった（例えばインビトロの実験において１ｍＭでも細胞毒性を示さない）。
被験物質としての各種の濃度のＡｃｅｔｙｌ−ＶＰＥＹＩＮＱＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＣＯＮＨ２（配列番号１２：Ｓｈｉｍａｄｚｕ社のペプチド合成機ＰＳＳＭ−８を用いた化学合成による水溶性の白色粉末）を用いること以外は実施例１と同様にしてそのｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現効率に対する作用を評価したところ、チルホスチンに匹敵するｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現効率の向上作用を示した。なお、この被験物質は、チルホスチンよりも低毒性であった（例えばインビトロの実験において１ｍＭでも細胞毒性を示さない）。
実施例４：
Ｔｏｍｉｔａ Ｈｉｒｏｓｈｉ，ｅｔ ｓｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，２０１４；２２（８）：１４３４−１４４０に記載の方法に従って以下の実験を行った。緑藻類ボルボックス由来のチャネルロドプシン（ＶＣｈＲ１）を基本構造とした改変型チャネルロドプシン（ｍＶＣｈＲ１）の遺伝子をＡＡＶベクターに組み込み、ｍＶＣｈＲ１遺伝子を組み込んだＡＡＶベクターの溶液（２．５×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）５μＬを、３２ゲージハミルトンマイクロシリンジを用いて、失明に至った６ヶ月齢以上の遺伝性網膜変性症（ＲＣＳ，ｒｄｙ／ｒｄｙ）ラット（日本クレア社より購入）の一方の硝子体内に麻酔下で投与した。他方の硝子体内には、ｍＶＣｈＲ１遺伝子を組み込んだＡＡＶベクターと、実施例１に記載の被験物質（Ａｃｅｔｙｌ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＶＰＥＹＩＮＱ−ＣＯＮＨ２：Ｔａｔ−Ｙ１０６８）を含む溶液５μＬを投与した（ｍＶＣｈＲ１遺伝子を組み込んだＡＡＶベクターの最終濃度は対側眼と同じで被験物質の最終濃度は４０μＭ）。投与から２ヶ月後に視覚誘発電位を測定した。具体的には、測定の１週間前に脳視覚野に記録用電極の埋め込み手術を行ったラットの眼前にＬＥＤ光源を配置し、１秒間隔で１０ｍｓの光刺激を２００回行い、光刺激に伴って誘発される視覚野の電位変化を記録した。結果を図３に示す。図３から明らかなように、被験物質である膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドは、網膜細胞へのｍＶＣｈＲ１遺伝子の導入効率を向上させることで発現効率を向上させ、視覚誘発電位の振幅を増大させた（遺伝子導入される主たる細胞は神経節細胞である）。
Ｔｏｍｉｔａ Ｈｉｒｏｓｈｉ，ｅｔ ｓｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，２０１４；２２（８）：１４３４−１４４０に記載の方法に従って以下の実験を行った。緑藻類ボルボックス由来のチャネルロドプシン（ＶＣｈＲ１）を基本構造とした改変型チャネルロドプシン（ｍＶＣｈＲ１）の遺伝子をＡＡＶベクターに組み込み、ｍＶＣｈＲ１遺伝子を組み込んだＡＡＶベクターの溶液（２．５×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）５μＬを、３２ゲージハミルトンマイクロシリンジを用いて、失明に至った６ヶ月齢以上の遺伝性網膜変性症（ＲＣＳ，ｒｄｙ／ｒｄｙ）ラット（日本クレア社より購入）の一方の硝子体内に麻酔下で投与した。他方の硝子体内には、ｍＶＣｈＲ１遺伝子を組み込んだＡＡＶベクターと、実施例１に記載の被験物質（Ａｃｅｔｙｌ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＶＰＥＹＩＮＱ−ＣＯＮＨ２：Ｔａｔ−Ｙ１０６８）を含む溶液５μＬを投与した（ｍＶＣｈＲ１遺伝子を組み込んだＡＡＶベクターの最終濃度は対側眼と同じで被験物質の最終濃度は４０μＭ）。投与から２ヶ月後に視覚誘発電位を測定した。具体的には、測定の１週間前に脳視覚野に記録用電極の埋め込み手術を行ったラットの眼前にＬＥＤ光源を配置し、１秒間隔で１０ｍｓの光刺激を２００回行い、光刺激に伴って誘発される視覚野の電位変化を記録した。結果を図３に示す。図３から明らかなように、被験物質である膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドは、網膜細胞へのｍＶＣｈＲ１遺伝子の導入効率を向上させることで発現効率を向上させ、視覚誘発電位の振幅を増大させた（遺伝子導入される主たる細胞は神経節細胞である）。
本発明は、ＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際に用いる、外来遺伝子の導入効率の新規な向上剤を提供することができる点において、産業上の利用可能性を有する。
Claims (6)
- 上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドのＣ末端に膜透過性を有するペプチドを結合させた結合ペプチドを有効成分とする、アデノ随伴ウイルスベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際に用いる、外来遺伝子の導入効率の向上剤。
- 哺乳動物細胞が網膜細胞である請求項１記載の外来遺伝子の導入効率の向上剤。
- 外来遺伝子が光感受性陽イオン選択的チャネル遺伝子である請求項１記載の外来遺伝子の導入効率の向上剤。
- インビトロにおいてアデノ随伴ウイルスベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際、上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドのＣ末端に膜透過性を有するペプチドを結合させた結合ペプチドを存在させることによる、哺乳動物細胞に対する外来遺伝子の導入効率を向上させる方法。
- 上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドのＣ末端に膜透過性を有するペプチドを結合させた結合ペプチド。
- インビトロにおいてアデノ随伴ウイルスベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する方法であって、上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドのＣ末端に膜透過性を有するペプチドを結合させた結合ペプチドの存在下で行う方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015024849 | 2015-02-12 | ||
| JP2015024849 | 2015-02-12 | ||
| PCT/JP2016/054042 WO2016129656A1 (ja) | 2015-02-12 | 2016-02-11 | 哺乳動物細胞に対する外来遺伝子の導入効率の向上剤 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020105583A Division JP7142369B2 (ja) | 2015-02-12 | 2020-06-18 | 哺乳動物細胞に対する外来遺伝子の導入効率の向上剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2016129656A1 JPWO2016129656A1 (ja) | 2017-11-24 |
| JP6730705B2 true JP6730705B2 (ja) | 2020-07-29 |
Family
ID=56614823
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2016574847A Active JP6730705B2 (ja) | 2015-02-12 | 2016-02-11 | 哺乳動物細胞に対する外来遺伝子の導入効率の向上剤 |
| JP2020105583A Active JP7142369B2 (ja) | 2015-02-12 | 2020-06-18 | 哺乳動物細胞に対する外来遺伝子の導入効率の向上剤 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020105583A Active JP7142369B2 (ja) | 2015-02-12 | 2020-06-18 | 哺乳動物細胞に対する外来遺伝子の導入効率の向上剤 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JP6730705B2 (ja) |
| WO (1) | WO2016129656A1 (ja) |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7052692B1 (en) * | 1997-09-02 | 2006-05-30 | Advanced Research & Technology Institute | Role of tyrosine phosphorylation of a cellular protein in adeno-associated virus 2-mediated transgene expression |
| ME00238B (me) | 1998-10-23 | 2011-02-10 | Kirin Amgen Inc | Mimičko vezivanje dimernog trombopoitetinskog peptida za mp1 receptor sa trombopoietičkom aktivnošću |
| GB0220805D0 (en) | 2002-09-06 | 2002-10-16 | Univ Sussex | Peptide monomers and protein structures |
| WO2008080112A2 (en) | 2006-12-22 | 2008-07-03 | The Regents Of The University Of California | New fusion molecule based on novel taa variant |
| EP2050759A1 (en) | 2007-10-19 | 2009-04-22 | CONARIS research institute AG | Soluble gp 130 muteins with improved binding activity |
| AU2009326075B2 (en) | 2008-12-08 | 2014-06-05 | Complix Nv | Single-chain antiparallel coiled coil proteins |
| EP2537933A1 (en) | 2011-06-24 | 2012-12-26 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) | An IL-15 and IL-15Ralpha sushi domain based immunocytokines |
| WO2013012924A2 (en) | 2011-07-18 | 2013-01-24 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered microbe-targeting molecules and uses thereof |
| CA2844289C (en) | 2011-08-12 | 2020-01-14 | Omeros Corporation | Anti-fzd10 monoclonal antibodies and methods for their use |
| BR112014031689A2 (pt) | 2012-06-22 | 2017-07-25 | Cytomx Therapeutics Inc | anticorpos reativos cruzados anti-jagged 1/jagged 2, anticorpos anti-jagged ativáveis e métodos de uso deles |
-
2016
- 2016-02-11 WO PCT/JP2016/054042 patent/WO2016129656A1/ja active Application Filing
- 2016-02-11 JP JP2016574847A patent/JP6730705B2/ja active Active
-
2020
- 2020-06-18 JP JP2020105583A patent/JP7142369B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2020191872A (ja) | 2020-12-03 |
| JPWO2016129656A1 (ja) | 2017-11-24 |
| JP7142369B2 (ja) | 2022-09-27 |
| WO2016129656A1 (ja) | 2016-08-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7309827B2 (ja) | 蝸牛および前庭細胞に核酸を送達するための材料および方法 | |
| Makuch et al. | Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA | |
| US11071790B2 (en) | Method for efficient delivery of therapeutic molecules in vitro and in vivo | |
| EP2465931B1 (en) | Light-receiving channel rhodopsin having improved expression efficiency | |
| CN109661471A (zh) | 启动子及其用途 | |
| CN109563153B (zh) | 抗-ryk抗体及使用其的方法 | |
| AU2017378482A1 (en) | Enhanced hAT family transposon-mediated gene transfer and associated compositions, systems, and methods | |
| AU2017256910B2 (en) | Optogenetic visual restoration using Chrimson | |
| CA3052704A1 (en) | Materials and methods for delivering nucleic acids to cochlear and vestibular cells | |
| CN109890404A (zh) | 视觉功能再生剂或视觉功能降低预防剂 | |
| CN107847523A (zh) | 用于诱导有丝分裂后细胞的细胞分裂的方法 | |
| Uezu et al. | Essential role for InSyn1 in dystroglycan complex integrity and cognitive behaviors in mice | |
| DE102007041655A1 (de) | Vermehrung von primären Zellen und deren Verwendung | |
| CN112689675B (zh) | 光响应性蛋白及其应用 | |
| JP7142369B2 (ja) | 哺乳動物細胞に対する外来遺伝子の導入効率の向上剤 | |
| CN111825769B (zh) | 一种泛素化缺失的嵌合抗原受体及其用途 | |
| WO2023143366A1 (zh) | 变异型腺相关病毒及其在疾病治疗中的应用 | |
| US20220226503A1 (en) | Methods for efficient delivery of therapeutic molecules in vitro and in vivo | |
| Pavičić | AAV vector based neonatal desensitization for the assessment of cell-replacement therapy for Parkinson’s disease | |
| Spratt | Sodium Channel Dysfunction in Autism Spectrum Disorder | |
| CN115335525A (zh) | 经修饰的通道视紫红质 | |
| de Lansalut | From gene identification and functional characterization to genome editing approaches for inherited retinal disorders | |
| Orhan Le Gac De Lansalut | From gene identification and functional characterization to genome editing approaches for inherited retinal disorders | |
| Shimizu | The Drosophila Model of Cancer: Characterization of a Conserved Tumour Suppressor and Its Role in the Control of Cell Proliferation and Apoptosis | |
| Oliveira | Molecular Cascades in Midbrain Dopaminenergic Neuron Development: Emphasis on WNTS |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20170710 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190128 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20191126 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200125 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200602 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200618 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6730705 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |