KR20010099695A - Ｍｐ１ 수용체에 결합하며 혈소판신생 활성을 갖는트롬보포이에틴 펩티드의 이량체형 유사체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈소판신생 활성을 갖는 화합물의 범위, 특히 펩티드 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 포유동물내에서 혈소판 또는 혈소판 전구체(예를 들어, 거핵구)를 증가시키는데 사용될 것이다.

Description

ＭＰ１ 수용체에 결합하며 혈소판신생 활성을 갖는 트롬보포이에틴 펩티드의 이량체형 유사체 {DIMERIC THROMBOPOIETIN PEPTIDE MIMETICS BINDING TO MP1 RECEPTOR AND HAVING THROMBOPOIETIC ACTIVITY}

본 출원은 1998년 10월 23일에 제출한 미국 가출원 일련 번호 제 60/105,348 호를 우선권으로 주장하고 있다.

본 발명은 시험관내 및 생체내에서 혈소판 및 거핵구와 같은 그의 전구체 세포의 생산을 자극시키는 능력을 갖는 화합물, 특히 펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 화합물의 특징을 설명하기 전에, 혈소판신생 활성을 갖는 두 가지 단백질에 관한 배경을 하기에 제시하였다 : 트롬보포이에틴(TPO) 및 거핵구 성장 및 발달 인자(MGDF).

내인성 트롬보포이에틴(TPO)의 클로닝[Lok 등의, Nature 369 : 568 - 571 (1994) ; Bartley 등의, Cell 77 : 1117 - 1124 (1994) ; Kuter 등의, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 11104 - 11108 (1994) ; de Sauvage 등의, Nature 369 : 533 - 538 (1994) ; Kato 등의, Journal of Biochemistry 119 : 229 - 236 (1995) ; Chang 등의, Journal of Biological Chemistry 270 : 511 - 514 (1995)]은 거핵구형성(거핵구 생산) 및 혈소판신생(혈소판 생산)에 관한 관심을 급속히 증가시키고 있다.

간 및 신장에서 1 차적으로 생산되는 60 - 70 kDa 의 글리코실화된 단백질인 내인성 인체 TPO 는 332 개의 아미노산으로 이루어져 있다[Bartley 등의, Cell 77 : 1117 - 1124 (1994) ; Chang 등의, Journal of Biological Chemistry 270 : 511 - 514 (1995)]. 그 단백질은 서로 다른 종들 사이에서 고도로 보존되어 있으며, 아미노 말단(아미노산 1 - 172)[Bartley 등의, Cell 77 : 1117 - 1124 (1994)]에서 인체 에리트로포이에틴과 23 % 의 상동성을 가지고 있다[Gurney 등의, Blood 85 : 981 - 988 (1995)]. 내인성 TPO 가 혈소판신생의 생물학적 조절자로서의 단서에 대한 모든 특징을 소유하고 있음이 밝혀졌다. 시험관내 활동에는마우스의 정제된 조혈 간세포[Zeigler 등의, Blood 84 : 4045 - 4052 (1994)]와 인체 CD34⁺세포[Lok 등의, Nature 369 : 568 - 571 (1994) ; Rasko 등의, Stem Cells 15 : 33 - 42 (1997)]로 부터 거핵구 콜로니의 특이적 유발, 배수성이 증가된 거핵구의 생산[Broudy 등의, Blood 85 : 402 - 413 (1995)]과 말단의 거핵구 성숙 및 혈소판 생산의 유발[Zeigler 등의, Blood 84 : 4045 - 4052 (1994) ; Choi 등의, Blood 85 : 402 - 413 (1995)]이 포함된다. 역으로, TPO 수용체(c-Mp1)에 대한 합성 안티센스 올리고데옥시누클레오티드는 거핵구 선조의 콜로니 - 형성 능력을 현저하게 억제하였다[Methia 등의, Blood 82 : 1395 - 1401 (1993)]. 더욱이, c-Mp1 를 넉-아웃시킨 마우스는 심하게 혈소판이 감소되며 거핵구도 결핍되어 있었다[Alexander 등의, Blood 87 : 2162 - 2170 (1996)].

재조합 인체 MGDF(rHuMGDF, 캘리포니아 사우젼드 오크스에 소재하는 암젠 인코포레이티드에서 입수하였음)는 TPO 와 관련된 또 다른 혈소판신생의 폴리펩티드이다. 인체 TPO의 아미노-말단 수용체-결합 도메인을 함유한 절단된 단백질을 코드하는 cDNA 를 함유한 플라스미드로 형질전환시켜 사용한 E. coli 가 소개되었다[Ulich 등의, Blood 86 : 971 - 976 (1995)]. 그 폴리펩티드를 추출, 되접힘, 정제하고 폴리[에틸렌 글리콜](PEG) 성분은 아미노 말단에 공유결합하였다. 결과적으로 생성된 분자를 본원에서는 PEG-rHuMGDF 또는 간략히 MGDF 라 언급한다.

동물 모델을 이용한 다양한 연구[Ulich, T.R. 등의, Blood 86 : 971 - 976 (1995) ; Hokom, M.M. 등의, Blood 86 : 4486 - 4492 (1995)]에는 골수 이식 및 화학요법 또는 방사선요법에 의해 종종 일어나는 증상인 혈소판 감소증에 있어 TPO 와 MGDF 의 치료학적 유용성을 상세히 기술하고 있다. 인체에서의 예비 데이터는 다양한 세팅에서 혈소판 수를 증가시킨 MGDF 의 유용성을 입증하였다[Basser 등의, Lancet 348 : 1279 - 81 (1996) ; Kato 등의, Journal of Biochemistry 119 : 229 - 236 (1995) ; Ulich 등의, Blood 86 : 971 - 976 (1995)]. MGDF 투여로 인해 건강한 혈소판 기증자 본래 수치의 약 3 배가 되도록 순환 혈소판 수가 증가되기 때문에 혈소판 기증 과정을 강화시키는데 MGDF 가 사용될 수 있다.

TPO 및 MGDF 는 거핵구, 혈소판, CD34⁺세포 및 원시 선조세포와 같은 특정 혈소판신생의 세포 표면에 1 차적으로 발현되는 c-Mpl 수용체에 결합함으로써 그들의 작용을 나타낸다[Debili, N. 등의, Blood 85 : 391 - 401 (1995) ; de Sauvage, F.J. 등의, Nature 369 : 533 - 538 (1994) ; Bartley T.D. 등의, Cell 77 : 1117 - 1124 (1994) ; Lok, S. 등의, Nature 369 : 565 - 8 (1994)]. 인터루킨과 단백질 호르몬에 대한 대부분의 수용체와 같이 c-Mpl 은 클래스 I 시토킨 수용체 상과에 속한다[Vigon, I 등의, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 5640 - 5644 (1992)]. 이러한 수용체 부류의 활성에는 일련의 신호전달 반응을 개시시키는 수용체 동종이합체화 반응을 유도하는 리간드 - 결합이 포함된다.

일반적으로, 그 수용체와 단백질 리간드 사이의 상호작용은 상대적으로 넓은 접촉면에서 종종 발생한다. 그러나, 그것의 수용체에 결합하는 인체 성장 호르몬의 경우에 서술한 것 같이, 접촉면에서 극소수의 핵심 잔기만이 실질적으로 결합 에너지의 대부분에 기여한다[Clackson, T. 등의, Science 267 : 383 - 386 (1995)]. 남아있는 단백질 리간드의 대부분이 정상 형태에서 결합하는 에피토프를 나타내는 역할만 한다는 사실은 훨씬 작은 크기의 활성 리간드 발견을 가능하게 하였다.

전술한 성과로 인해, 시스템을 나타내는 파지 펩티드 라이브러리는 다량의 단백질 리간드 중 소형의 펩티드 유사체를 입증하는데 있어 유력한 기술로서 제시되었다[Scott, J.K. 등의, Science 249 : 386 (1990) ; Devlin, J.J. 등의, Science 249 : 404 (1990) 참조]. 이러한 기술을 이용하여, c-Mpl 수용체의 작용물질로서 작용하는 소형 펩티드 분자를 발견하였다[Cwirla, S.E. 등의, Science 276 : 1696 - 1699 (1997) 참조].

상기 연구에서, 필라멘트상의 파지의 피막 단백질에 대한 융합형태로 나타나는 무작위 소형 펩티드 서열을 c-Mpl 의 항체 - 고정 세포외 도메인에 대하여 친화 - 용리 시켰으며 나머지 파지는 친화성 정제의 두 번째 과정동안 풍부해졌다. 단단한 결합제의 풀을 풍부하게 얻기 위하여 본 결합 선별과 재신장 과정을 여러 번 반복하였다. 결과적으로, 그들의 서열에서 서로 관련이 없는 c-Mpl-결합 펩티드의 두가지 부류를 처음으로 입증하였다. 그리고 돌연변이를 유발시킨 라이브러리를 좀 더 최상의 결합제로 활용하도록 만들었으며, 이것은 결국 IC₅₀= 2 nM 과 EC₅₀= 400 nM 을 갖는 매우 활성적인 펩티드를 분리할 수 있게 되었다[Cwirla, S.E. 등의, Science 276 : 1696 - 1699 (1997)]. TMP (TPO 유사체 펩티드)로 지정된 14 - 잔기 펩티드는 TPO 또는 MGDF의 서열과는 상동성이 나타나지 않았다. 본 발명의 TMP 구조는 다음과 같다 :

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala SEQ ID NO : 1

또는

단일 문자를 이용하여 아미노산을 약자로 표기하면 IEGPTLRQWLAARA 이다.

이전의 EPO 유사 펩티드에 관한 유사한 연구에서, EPO 유사 펩티드(EMP)를 동일한 기술[Wrighton, N.C. 등의, Science 273 : 458 - 463(1996) 참조]을 이용하여 발견하였으며, EPO 수용체(EPOR)에 결합하는데 있어 이량체로서 작용함을 발견하였다. 이렇게해서 형성된 (리간드)₂/(수용체)₂복합체는 X-선 결정학 데이터에 의한 C2 거울상을 가진다[Livnah, O. 등의, Science 273 : 464 - 471 (1996)]. 이러한 구조적 데이터에 입각하여, 공유결합한 EMP 이량체는 두 EMP 단위체의 C-말단에서 탄성의 스페이서와 교차 결합하도록 되어있으며 시험관내/생체내 생활성도에서도 결합을 매우 증가시키는 것으로 밝혀졌다[Wrighton, N.C., 등의, Nature Biotechnology 15 : 1261 - 1265 (1997)].

유사한 C-말단 이량체화 방법을 TPO 유사 펩티드(TMP)에 적용하였다[Cwirla, S.E. 등의, Science 276 : 1696 - 1699 (1997). TMP 의 C-말단에 연결된 이량체(C-C 연결)는 결합 친화도를 0.5 nM 로 증진시켰으며 세포 증식 검정에 있어서 시험관내 활성도(EC₅₀= 0.1 nM)도 현저하게 증가시켰다[Cwirla, S.E. 등의, Science 276 : 1696 - 1699 (1997)]. 본 TMP C-C 이량체 구조는 다음과 같다 :

본 발명의 다른 양상에 있어서, 직렬의 이량체는 일반적으로 면역글로불린의 Fc 영역으로 불리는 면역글로불린 단백질로 부터 유도된 하나 또는 그 이상의 성분에 더 결합할 수 있게 되었다. 결과적으로 생성된 화합물은 TMP 직렬 이량체의 Fc 융합체 형태에 속한다.

하기는 본 발명의 화합물의 일부와 관련하여 유용한, 항체의 Fc 영역에 관한 간략한 배경 부분이다.

항체는 기능적으로 분리된 두 부분, 항원과 결합하며 "Fab" 로 알려진 가변 도메인과 보체 고정 또는 식작용과 같은 효과기 기능에 대한 연관성을 제공하는 "Fc" 로 알려진 불변 도메인을 포함한다. 면역글로불린 중 Fc 영역은 긴 플라즈마 반감기를 가지고 있으며, 반면에 Fab 부분은 짧은 반감기를 가지고 있다[Capon, 등의, Nature 337 : 525 - 531 (1989)].

반감기를 연장하거나 면역글로불린의 Fc 영역에 모두 존재하는 Fc 수용체 결합, 단백질 A 결합, 보체 고정 및 태반의 이동과 같은 기능을 삽입하기 위해 Fc 도메인을 이용하여 치료학적 단백질 산물을 제조하였다[Capon, 등의, Nature 337 : 525 - 531 (1989)]. 예를 들어, IgGl 항체의 Fc 영역은 CD30-L 에 융합되고, 이 CD30-L 은 호지킨 질환성 종양세포, 퇴행성 림프종세포, T 세포성 백혈병세포 및 그 밖의 악성 종양세포 타입에서 발현되는 CD30 수용체에 결합한다. 미국 특허 번호 제 5,480,981 호를 참조하라. 항염증성 및 항주사제인 IL-10 은 시토킨의 짧은 순환성 반감기를 증가시키기 위해 마우스의 Fcγ2a 에 융합되었다[Zheng, X. 등의, The Journal of Immunology, 154 : 5590 - 5600 (1995)]. 연구는 또한 패혈성 쇽에 걸린 환자를 치료하기 위해 인체 IgGl 의 Fc 단백질과 연결된 종양 괴사 인자 수용체의 사용을 증가시켰다[Fisher, C. 등의, N. Engl. J. Med., 334 : 1697 - 1702 (1996) ; Van Zee, K. 등의, The Journal of Immunology, 156 : 2221 - 2230 (1996)]. Fc 는 또한 AIDS 를 치료하기 위한 치료학적 단백질을 생산하기위해 CD4 수용체와 융합되었다. Capon 등의, Nature, 337 : 525 - 531 (1989)를 참조하라. 더욱이, 인터루킨 2 는 인터루킨 2 의 짧은 반감기와 그것의 전신성 독성을 극복하기 위해 IgG1 또는 IgG3 의 Fc 부분에 융합된다. Harvill 등의, Immunotechnology, 1 : 95 - 105 (1995)를 참조하라.

TPO 및 MGDF 의 이용가능성에도 불구하고, 거기에는 여전히 혈소판 및/또는 혈소판 전구체 세포, 특히 거핵구(거핵구형성 활성)의 생산을 자극시키는 생물학적 활성도(혈소판신생 활성)를 가지는 또 다른 화합물을 제공해야 되는 필요성이 남아있다. 본 발명은 상기 언급한 활성 및 그와 관련된 양상을 함유한 신규한 화합물을 제공한다.

발명의 요약

본 발명은 c-Mpl 수용체에 결합하여 c-Mpl 수용체를 활성화시킴으로써 막횡단 신호를 유발시킬 수 있는 화합물군을 제공하며, 상기 수용체는 내인성 트롬보포이에틴(TPO)의 활성도를 조절한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 혈소판신생 활성, 즉 생체내 및 시험관내에서 혈소판 및/또는 거핵구형성의 활성을 자극시키는 능력, 또는 생체내 및 시험관내에서 혈소판 전구체 생산을 자극시키는 능력을 갖는다.

첫번째 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 화합물 및 생리학적으로 용인가능한 그의 염은 다음의 일반적 구조를 포함한다 :

TMP₁-(L₁)_n-TMP₂

여기에서 TMP₁및 TMP₂는 중심 구조를 포함한 화합물의 군에서 각각 독립적으로 선택한것이고 :

X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀,

여기에서,

X₂는 Glu, Asp, Lys 및 Val 중에서 선택한 것이고 ;

X₃은 Gly 와 Ala 중에서 선택한 것이고 ;

X₄는 Pro 이며 ;

X₅는 Thr 와 Ser 중에서 선택한 것이고 ;

X₆은 Leu, Ile, Val, Ala 및 Phe 중에서 선택한 것이고 ;

X₇은 Arg 와 Lys 중에서 선택한 것이고 ;

X₈은 Gln, Asn 및 Glu 중에서 선택한 것이고 ;

X₉는 Trp, Tyr 및 Phe 중에서 선택한 것이고 ;

X₁₀은 Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met 및 Lys 중에서 선택한 것이고 ;

본원에서 서술한 바와 같이 L₁은 링커이며 ;

n 은 0 또는 1 이다.

첫 번째 실시형태에 있어, L₁은 (Gly)_n을 포함하며, 여기에서 n 은 1 내지 20 이고, n 이 1 보다 클 경우에는 최대한 Gly 잔기의 반이 나머지 19 개의 천연 아미노산 또는 그것의 입체이성질체 중에서 선택한 다른 아미노산에 의해 치환될 것이다.

TMP₁및 TMP₂에 대해 상기에서 설명한 중심 구조 X₂-X₁₀이외에, 그밖의 다른 관련 구조는 또한 하기에서 나열한것 중 하나 또는 그 이상이 TMP₁및/또는 TMP₂중심 구조에 첨가되면 가능해진다 : X₁은 N-말단에 첨가되고/되거나 X₁₁, X₁₂, X₁₃및/또는 X₁₄는 C-말단에 첨가되며, 여기에서 X₁, X₁₂, X₁₃및 X₁₄는 다음과 같다 :

X₁은 Ile, Ala, Val, Leu, Ser 및 Arg 중에서 선택한 것이고 ;

X₁₁은 Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His 및 Glu 중에서 선택한 것이고 ;

X₁₂는 Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Gly, Ser 및 Gln 중에서 선택한 것이고 ;

X₁₃은 Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gln 및 Gly 중에서 선택한 것이며 ; 및

X₁₄는 Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu 및 Gly 중에서 선택한 것이다.

두 번째의 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물 및 생리학적으로 용인가능한 그의 염은 다음과 같은 일반식을 갖는다 :

(Fc)_m-(L₂)_q-TMP₁-(L₁)_n-TMP₂-(L₃)_r-(Fc)_p

여기에서, TMP₁, TMP₂및 n 은 각각 상기에서 언급한 것이고 ; L₁, L₂및 L₃은 본원에서 언급한 링커군에서 각각 독립적으로 선택한 링커군이며 ; Fc 는 면역글로불린의 Fc 영역이고 ; m, p, g 및 r 은 0 과 1 중에서 각각 독립적으로 선택한 것이며, 여기서 m 또는 p 중 적어도 하나는 1 이며, 또한 m 이 0 이면 g 가 0 이고, p 가 0 이면 r 이 0 인 경우를 더 포함한다. 첫 번째 실시형태에서, L₁은 (Gly)_n을 포함하며, 여기에서 n 은 1 내지 20 이고, n 이 1 보다 클 경우에는, 최대한 Gly 잔기의 반이 나머지 19 개의 천연 아미노산 또는 그것의 입체이성질체 중에서 선택한 다른 아미노산에 의해 치환될 것이다.

상기 화합물의 유도체(하기에 서술하였음) 또한 본 발명에 포함된다.

바람직하게 본 발명의 화합물은 펩티드이며, 그들은 조제한 펩티드의 표준 합성 방법 또는 그 밖의 다른 방법에 의해 제조될 수 있다. 비-펩티드 부분을 포함하는 본 발명의 화합물은 응용 가능한 경우, 표준 유기 화학 반응 또는 표준 펩티드 화학반응에 의해 합성될 수 있다.

본 발명의 화합물은 적절한 제약학적 담체 물질과 함께 삽입하고 인체(또는 그 밖의 다른 포유동물)와 같은 피실험자에게 유효량을 투여함으로써 치료학적 또는 예방학적 목적으로 사용된다. 그 밖의 다른 양상 또한 본 발명에 포함된다.

본 발명은 일반적으로 혈소판신생 활성을 갖는 화합물의 범위, 특히 펩티드 및 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 포유동물내에서 혈소판 또는 혈소판 전구체(예를 들어, 거핵구) 생산을 증가시키는데 사용될 것이다.

본 발명의 여러가지 다른 양상 및 이점들은 하기의 상세한 설명, 도면의 설명에 기재된 참고문헌에 뚜렷이 나타날 것이다 :

도 1 은 본 발명의 Fc 융합 화합물에서 사용되는 인체 IgG1 중 전형적인 Fc 폴리누클레오티드 및 단백질 서열(SEQ ID NO : 3 은 5' → 3' 을 리딩하는 코딩 가닥이고, SEQ ID NO : 4 는 3' → 5' 을 리딩하는 상보적 가닥이며 ; SEQ ID NO : 5 는 코드화한 아미노산 서열이다)을 나타낸 것이다.

도 2 는 폴리에틸렌글리콜화된 펩티드 19 의 제조를 위한 합성 도식을 나타낸 것이다(SEQ ID NO : 17).

도 3 은 폴리에틸렌글리콜화된 펩티드 20 의 제조를 위한 합성 도식을 나타낸 것이다(SEQ ID NO : 17).

도 4 는 다양한 화합물을 한 번에 100 ㎍/㎏ 농축괴 주사로 정상적인 암컷의 BDF₁마우스를 치료하여 생체내에서 생성된 혈소판 수를 나타낸것이며, 다음과 같다 : PEG-MGDF 는 천연 인체 TPO 중 1 - 163 아미노산의 환원성 아미노화에 의해 N-말단 아미노기에 부착된 평균 분자량이 20 kD 인 PEG 이며, 상기 천연 인체 TPO 는 E. coli 에서 발현되며(글리코실화되지 않음)(발명의 명칭이 "거핵구 성장 및 분화를 자극하기 위한 조성물 및 방법" 인 제 WO 95/26746 호를 참조하라) ; TMP 는 SEQ ID NO : 1 인 화합물을 의미하며 ; TMP-TMP 는 SEQ ID NO : 21 인 화합물을 의미하고 ; PEG-TMP-TMP 는 SEQ ID NO : 18 인 화합물을 의미하며, 여기서 PEG 군은 도 3 에 나타난 바와 같이 평균 분자량이 5 kD 인 PEG 이며 ; 하기에 언급한 TMP-TMP-Fc 와 Fc-TMP-TMP 는, Fc 군이 TMP-TMP 펩티드 C-말단 보다는 오히려 N-말단에 부착되는 것을 제외하고는 TMP-TMP-Fc 와 동일한 것이다.

도 5 는 7 일 동안에 걸쳐 이식한 삼투성 펌프를 통해 전달된 다양한 화합물로 정상적인 BDF1 마우스를 치료하여 생체내에서 생성된 혈소판 수를 나타낸 것이다. 동일한 방법에서 언급한 화합물은 상기 도 4 에 설명되어 있다.

도 6A, 6B 및 6C 는 본 발명의 바람직한 화합물의 간략한 도표를 나타낸 것이다. 도 6A 는 Fc 융합 화합물을 나타낸 것이며 여기에서 Fc 성분은 TMP 이량체의 N-말단에서 융합되며, 여기에서 Fc 부분은 단량체(단일 사슬)형태이다. 도 6B 는 Fc 영역이 TMP 이량체의 N-말단에 융합된 Fc 융합 화합물을 나타낸 것이며, 여기에서 Fc 부분은 이량체 및 하나의 Fc 단량체가 TMP 이량체에 부착된 것이다. 도 6C 는 Fc 성분이 TMP 이량체의 N-말단에 융합된 Fc 융합 화합물을 나타낸 것이고, 여기에서 Fc 부분은 이량체이며 각각의 Fc 단량체는 TMP 이량체에 부착된 것이다.

좀 더 바람직한 특성을 갖는 치료제의 발달에 있어 대표가 되는 화합물로서 소형의 구조를 찾고자 하는 노력에 있어서, TMP 이량체의 다양한 유형과 관련 구조는 하나의 TMP 펩티드의 C-말단이 두 번째 TMP펩티드 N-말단에 직접적으로 또는 링커를 통해 결합하도록 되어있으며 결과적으로 생성된 이량체 분자의 생활성도에 대한 이량체화 방법의 효과가 조사되었다. 몇몇 경우에 있어, 소위 직렬 이량체(C-N 링커)라고 하는 것들은 두 개의 단량체 사이에 링커를 가지도록 되어있고, 이 링커는 바람직하게 천연 아미노산으로 구성되어 있으므로 그들의 합성은 재조합 기술로 쉽게 이용가능하다.

본 발명은 혈소판신생 활성을 갖는 화합물군의 발견에 기초를 둔 것이며 내인성의 TPO 수용체인 c-Mpl 에 결합함으로써 그들의 활성을 나타내는 것으로 여겨진다.

화합물 및 유도체

첫 번째 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물 및 생리학적으로 용인가능한 그의 염은 다음과 같은 일반구조를 포함하고 :

TMP₁-(L₁)_n-TMP₂

여기에서 TMP₁및 TMP₂는 다음과 같은 중심 구조를 포함하는 화합물의 군에서 각각 독립적으로 선택한 것이고 :

X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀

여기에서,

X₂는 Glu, Asp, Lys 및 Val 중에서 선택한 것이고 ;

X₃은 Gly 및 Ala 중에서 선택한 것이고 ;

X₄는 Pro 이며 ;

X₅는 Thr 및 Ser 중에서 선택한 것이고 ;

X₆은 Leu, Ile, Val, Ala 및 Phe 중에서 선택한 것이고 ;

X₇은 Arg 및 Lys 중에서 선택한 것이고 ;

X₈은 Gln, Asn 및 Glu 중에서 선택한 것이며 ;

X₉는 Trp, Tyr 및 Phe 중에서 선택한 것이고 ;

X₁₀은 Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met 및 Lys 중에서 선택한 것이며 ;

L₁은 본원에서 언급한 바와 같이 링커이며 ;

n 은 0 또는 1 이다.

첫 번째 실시형태에 있어, L₁은 (Gly)_n을 포함하며, 여기에서 n 은 1 내지 20 이고, n 이 1 보다 클 경우에는 Gly 잔기의 반이 나머지 19 개의 천연 아미노산 또는 그것의 입체이성질체 중에서 선택한 다른 아미노산으로 치환될 것이다.

TMP₁및 TMP₂에 대해 상기에서 설명한 중심 구조 X₂-X₁₀이외에, 그 밖의 다른 관련 구조는 또한 하기에서 나열한 것 중 하나 또는 그 이상이 TMP₁및/또는 TMP₂중심 구조에 첨가되면 가능해진다 : X₁은 N-말단에 첨가되고/되거나 X₁₁, X₁₂, X₁₃및/또는 X₁₄는 C-말단에 첨가되며, 여기에서 X₁, X₁₁, X₁₂, X₁₃및 X₁₄는 다음과 같다 :

X₁은 Ile, Ala, Val, Leu, Ser 및 Arg 중에서 선택한 것이고 ;

X₁₁은 Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His 및 Glu 중에서 선택한 것이고 ;

X₁₂는 Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Gly, Ser 및 Gln 중에서 선택한 것이고 ;

X₁₃은 Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gln 및 Gly 중에서 선택한 것이며 ;

X₁₄는 Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu 및 Gly 중에서 선택한 것이다.

"TMP" 란 용어는 적어도 9 개의 소단위(X₂-X₁₀)로 이루어진(즉, 포함하는) 성분을 의미하도록 사용되었으며, 여기에서 X₂-X₁₀은 중심 구조를 포함한다. X₂-X₁₄소단위는 바람직하게 20 개의 천연 아미노산 중에서 독립적으로 선택한 것이나, 본 발명에는 X₂-X₁₄가 본 분야에서 잘 알려진 인공 아미노산 중에서 독립적으로 선택한 화합물도 포함된다. 특정한 바람직한 아미노산은 각각의 위치에서 확인되었다. 예를 들어, X₂는 Glu, Asp, Lys 또는 Val 일것이다. 아미노산에 대한 3 문자와 1 문자의 축약형을 본원에서 사용하였으며 ; 각각의 경우에 그 축약형은 20 개의 천연 아미노산 또는 공지된 그것의 변이체를 대신하여 사용된 표준 축약형이다. 이러한 아미노산은 L 또는 D 입체화학(L 형도 D 형도 아닌 Gly 을 제외하고는)이며, TMP 는 입체화학의 조합을 포함한다. 그러나, L 입체화학은 TMP 사슬에 존재하는 모든 아미노산에 적합하며 바람직한 형태이다. 본 발명은 또한 아미노산의 카르복시 말단 서열에 아미노 말단이 역전된 곳에서 역 TMP 분자를 제공한다. 예를 들어, 일반적인 서열 X₁-X₂-X₃을 갖는 분자의 역전은 X₃-X₂-X₁이다. 본 발명은 또한 역 TMP와 같이, 아미노산의 카르복시 말단 서열에 아미노 말단이 역전된 곳에서 역-역 TMP 분자를 제공하며, 일반적으로 TMP 의 "L" 거울상이성질체인 잔기는 "D" 형 입체이성질체로 변경된다.

TMP 의 생리학적으로 용인가능한 염 또한 포함된다. "생리학적으로 용인가능한 염" 이란 공지된 것이거나 후에 제약학적으로 용인가능한 것으로 발견된 모든 염을 의미한다. 특정한 바람직한 예로는 다음과 같다 : 아세트산염, 트리플루오로아세트산염, 염산염, 취화수소산염, 황산염, 시트르산염, 타르타르산염, 글리콜산염, 옥살산염.

TMP 의 "유도체" 는 상기에서 언급한 TMP 로 치환될 수 있음을 생각할 수 있다. 상기 유도체 TMP 는 하기에서 설명된 하나 또는 그 이상의 변경이 일어난 성분을 포함한다 :

펩티드[-C(O)NR-] 결합 중 하나 또는 그 이상은 -CH₂-카르밤산염 결합[-CH₂-OC(O)NR-] 과 같은 비-펩티드 결합 ; 인산염 결합 ; -CH₂-술폰아미드[-CH₂-S(O)₂NR-] 결합 ; 요소[-NHC(O)NH-] 결합 ; -CH₂-2 차 아민 결합 ; 또는 알킬화된 펩티드 결합[-C(O)NR⁶- 여기에서 R⁶은 저급 알킬임]으로 치환되며 ;

R 및 R¹이 모두 수소가 아니라는 가정하에, N-말단이 -NRR' 기 ; -NRC(O)R 기 ; -NRC(O)OR 기 ; -NRS(O)₂R 기 ; -NHC(O)NHR 기, 여기서 R 및 R¹은 수소 또는 저급 알킬이며, 숙신이미드 기 ; 벤질옥시카르보닐-NH-(CBZ-NH-) 기 ; 또는 저급 알킬, 저급 알콕시, 클로로 및 브롬 중에서 선택한 페닐 고리에 1 내지 3 개의 치환기를 갖는 벤질옥시카르보닐-NH-기로 유도된 펩티드 ; 및

유리 C 말단이 -C(O)R²(여기에서 R²는 저급 알킬 및 -NR³R⁴로 구성된 기에서 선택하였으며, R³및 R⁴는 수소 및 저급 알킬 중에서 독립적으로 선택하였음)로 유도된 펩티드. "저급" 이란 1 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 기를 의미한다.

부가적으로, 펩티드의 표적 아미노산 잔기를 선택한 곁사슬 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도제(organic derivatizing agent)와 반응시킴으로써 TMP 분자내로 각각의 아미노산의 변경이 도입될 것이다. 전형적인 예를 하기한다.

리신 및 아미노 말단 잔기는 숙신산 또는 그 밖의 다른 카르복실산 무수물과 반응할 수 있다. 이러한 인자로 인한 유도 반응은 리신 잔기의 전하를 역전시키는 효과를 갖는다. 알파-아미노-함유 잔기를 유도하는 그 밖의 다른 적절한 시약에는 메틸 피콜린이미데이트 ; 피리독살 포스페이트 ; 피리독살 ; 클로로보로하이드라이드 ; 트리니트로벤젠술폰산 ; 0-메틸이소우레아 ; 2,4 펜탄디온과 같은 이미도에스테르 ; 및 글라이옥실에이트로 촉매 반응시킨 아미노기 전달 효소가 포함된다.

아르기닌 잔기는 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-시클로헥산디온 및 닌히드린 중에서 하나 또는 몇몇의 통상적으로 이용가능한 시약과 반응함으로써 변형가능하다. 아르기닌 잔기의 유도 반응은 구아니딘 작용기의 pka 가 높기 때문에 알칼린 조건에서 수행하였다. 더욱이, 이러한 시약은 아르기닌 구아니디노 기 뿐만 아니라 리신기와 반응할 수 있다.

본질적으로 티로실 잔기의 특정 변이는 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과의 화학 반응에 의해 스펙트럼 라벨을 티로신 잔기내로 도입하는데 각별한 관심을 갖고 광범위하게 연구되어 왔다. 가장 일반적으로, N-아세틸이미다졸 및 테트라니트로메탄은 각각 0-아세틸 티로신류 및 3-니트로 유도체를 형성하는데 사용될 것이다.

카르복시 곁기(아스파르틸 또는 글루타밀)는 1-시클로헥실-3-(2-모르폴린일-(4-에틸)카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸페닐)카르보디이미드와 같은 카르보디이미드류(R'-N=C=N-R')와의 반응에 의해 선택적으로 변형될 수 있다.

더욱이, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응에 의해 아스파라지닐 및 글루타미닐 잔기로 전환될 것이다.

글루타미닐 및 아스파라지닐 잔기는 유사한 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 종종 아마이드 분해될 것이다. 선택적으로, 이러한 잔기는 약산성 조건하에서 아마이드 분해될 것이다. 이러한 잔기의 각각의 형태는 본 발명의 범주내에 포함된다.

이기작용성 제제에 의한 유도 반응은 불용성의 지지체 매트릭스 또는 그 밖의 다른 거대분자의 담체에 펩티드 또는 그것의 작용성 유도체를 교차 결합시키는데 유용하다. 통상적으로 사용되는 교차 결합 제제는 예를 들어, 다음을 포함한다 : 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르(예를 들어 4-아지도살리실산으로 된 에스테르), 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피온산염)과 같은 디숙신이미딜 에스테르를 함유한 동종이기작용성의 이미도에스테르 및 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이기작용성의 말레이미드. 메틸-3-[(P-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 유도제로 빛의 존재하에서 교차결합할 수 있는 광활성의 중간체를 수득하였다. 택일적으로, 미국 특허 번호 제 3,969,287 호 ; 3,691,016 호 ; 4,195,128 호 ; 4,247,642 호 ; 4,229,537 호 ; 및 4,330,440 호에 기술된 취화사이안-활성 탄수화물 및 반응 기질과 같은 활성 불용성 매트릭스는 단백질 고정에 사용될 것이다.

그 밖의 가능한 변형은 다음과 같다 : 프롤린 및 리신의 히드록시화 반응, 세릴 또는 트레오닌 잔기 중 히드록시기의 인산화반응, Cys 에서 황 원자의 산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 곁사슬 중 알파-아미노 기의 메틸화[Creighton, T.E., proteins : Structure and Molecule properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, PP. 79 - 86 (1983)], N-말단 아민의 아세틸화 반응 및 일부 경우에 있어, C-말단 카르복시기의 아미드 생성 반응.

상기 유도된 성분은 본 발명의 화합물의 혈소판신생 활성, 용해도, 흡수, 생물학적 반감기 등을 포함하는 하나 또는 그 이상의 특성을 바람직하게 향상시킨다. 택일적으로, 유도된 성분으로 된 화합물은 유도되지 않은 화합물의 특징 및/또는 성질과 동일하거나 근본적으로 동일하다. 그 성분은 선택적으로 화합물의 바람직하지 않은 부작용등을 제거하거나 약화시킬 것이다.

상기에서 설명한 중심구조 X₂-X₁₀이외에, 특별하게 생각할 수 있는 그 밖의 다른 구조는 중심구조에 결합된 하나 또는 그 이상의 부가적인 X 군이 존재하는 구조이다. 따라서 X₁및/또는 X₁₁, X₁₂, X₁₃및 X₁₄는 중심 구조에 결합될 것이다. 전형적인 몇몇 추가 구조는 다음과 같다 :

X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁;

X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂;

X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃;

X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄;

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀;

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁;

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂;

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃;

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄;

여기에서 X₁내지 X₁₄는 상기에서 설명한 바와 같다. TMP₁및 TMP₂각각은 서열 및/또는 길이에서 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, TMP₁및 TMP₂는 동일하다.

특별하게 바람직한 TMP 는 다음과 같다 :

Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala(SEQ ID NO : 1).

본원에서 사용한 "포함하는" 의 의미는 무엇 보다도, 정해진 서열 각각의 말단이나 C-말단 또는 둘 다에 또다른 아미노산을 포함하는 화합물을 의미한다. 그러나, X₂내지 X₁₀, X₁내지 X₁₄와 같은 구조 또는 그 밖의 다른 전형적 구조 중 하나가 존재하는 한, 나머지 화학 구조는 상대적으로 덜 중요하다. 물론, X₂내지 X₁₀또는 X₁내지 X₁₄중심 구조의 모든 외각 구조는 본 발명의 화합물의 혈소판신생 활성을 중재하는데 중요하지 않다. 예를 들어, N-말단의 Met 잔기는 본 발명의 범주내에 포함된다. 더욱이, 본 발명의 바람직한 화합물의 대부분이 2 개의 TMP 성분을 갖는다는 점에서 직렬의 이량체이지만, 본 발명의 나머지 화합물은 다음과 같은 전형적 구조의 화합물인 TMP 직렬의 중합체이다 :

TMP₁-L-TMP₂-L-TMP₃;

TMP₁-L-TMP₂-L-TMP₃-L-TMP₄;

TMP₁-L-TMP₂-L-TMP₃-L-TMP₄-L-TMP₅;

여기에서, TMP₁, TMP₂, TMP₃, TMP₄및 TMP₅는 동일하거나 상이한 구조를 가질 수 있으며, 각각의 TMP 및 L 은 본원에서 설명한 바와 같고, 링커는 각각 선택가능하다. 바람직하게, 본 발명의 화합물은 2 - 5 개, 특히 바람직하게 2 - 3 개 및 가장 바람직하게 2 개의 TMP 성분으로이루어져 있다. 본 발명의 첫 번째 실시형태의 화합물은 전체 아미노산의 바람직하게는 약 60 보다 적게 더 바람직하게는 약 40 보다 적은 아미노산을 갖는다(그들은 펩티드일 것이다).

상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 첫 번째 실시형태의 화합물은 직접 결합되었거나 링커군에 의해 연결된 바람직한 TMP 이량체이다. 단위체성 TMP 성분은 왼쪽에서 부터 오른쪽으로 리딩되는 N 말단에서 C 말단으로의 통상적으로 이용가능한 방향을 나타낸다. TMP₁의 C 말단이 직접 또는 링커를 통해 TMP₂의 N-말단에 결합되므로 본 발명의 화합물은 모든 방향이 가능하다. 이 방향은 직렬 방향이며, 본 발명의 화합물은 일반적으로 "직렬의 이량체" 일 것이다. TMP₁및 TMP₂가 구조적으로 상이할지라도 본 화합물은 이량체 형태로 간주된다.

"링커" 군("L₁")은 선택가능하다. 링커가 존재할때, 링커는 본질적으로 스페이서 역할을 하므로 화학 구조에 있어서는 중요하지 않다. 링커는 최종 화합물의 생물학적 활성도를 방해하지 않으며 또한 최종 화합물의 면역원성을 현저하게 증가시키지 않는것을 선택해야 한다. 링커는 바람직하게 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산으로 이루어져 있다. 따라서, 바람직한 실시 형태에 있어서, 링커는 Y_n을 포함하며, 여기에서 Y 는 천연 아미노산 또는 그것의 입체이성질체이며 n 은 1 내지 20 중 하나이다. 그러므로, 링커는 펩티드 결합에 의해 연결된 1 내지 20 개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 여기에서 아미노산은 20 개의 천연 아미노산에서 선택한 것이다. 더 바람직한 실시형태에 있어, 1 내지 20 개의 아미노산은 Gly, Ala, Pro, Asn, Gln, Cys, Lys 중에서 선택한 것이다. 좀 더 바람직하게, 링커는 Gly, Gly-Gly [(Gly)₂], Gly-Gly-Gly [(Gly)₃]... (Gly)₂₀, Ala, Gly-Ala, Ala-Gly, Ala-Ala 등과 같이 입체구조적으로 방해하지 않는 아미노산 대다수로 구성되어 있다. 그 밖의 다른 링커의 예는 다음과 같다 :

(Gly)₃Lys(Gly)₄(SEQ ID NO : 6) ;

(Gly)₃AsnGlySer(Gly)₂(SEQ ID NO : 7)

(본 구조는 글리코실화되는 부위를 제공하며, 그것이 포유동물 세포계로 재결합적으로 도입될때 상기 부위의 글리코실화가 가능해진다) ;

(Gly)₃Cys(Gly)₄(SEQ ID NO : 8) ; 및

GlyProAsnGly (SEQ ID NO : 9).

상기 명명법을 설명하기 위한 예를 들면, (Gly)₃Lys(Gly)₄는 Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly 을 의미하는 것이다. 또한 Gly 와 Ala의 조합이 바람직하다.

또한 비-펩티드 링커도 가능하다. 예를 들어, s = 2 - 20 인, -HN-(CH₂)s-CO- 와 같은 알킬 링커가 사용될 수 있다. 이러한 알킬 링커는 저급 알킬(예, C₁-C₆), 저급 아실, 할로겐(예, Cl, Br), CN, NH₂, 페닐 등과 같은 비-입체적으로 부자유한 군에 의해 더 치환될 수 있다.

비-펩티드 링커의 또다른 형태는 다음과 같은 폴리에틸렌 글리콜 군이다 :

-HN-CH₂-CH₂-(O-CH₂-CH₂)_n-O-CH₂-CO-

여기에서, n 은 링커의 전체 분자량이 약 101 - 5000, 바람직하게 101 - 500 의 범위가 되도록 한다.

일반적으로, 약 0 - 14 소단위체(예, 아미노산)의 링커가 본 발명의 첫번째 실시형태의 혈소판신생 화합물이라는 것이 밝혀졌다.

펩티드 링커는 TMP 에 대해 상기 기술된 것과 동일한 방법으로 유도체를 형성하기 위해 변형될 수 있다.

이러한 첫번째 군의 화합물은 선형 또는 고리형이 될 수 있다. "고리형" 은 최소한 두 개의, 즉 인접하지 않은 분자의 부분들이 서로 연결된 것을 의미하는 것이다. 예를 들어, 분자의 아미노 말단과 카르복시 말단이 고리형 분자를 형성하기 위해 공유결합될 수 있다. 대안적으로, 분자는 둘 또는 그 이상의 Cys 잔기를 포함할 수 있는데(예, 링커내에), 이 Cys 잔기는 이황화물 결합을 형성함으로써 고리화될 수 있다. 하나 이상의 직렬 펩티드 이량체는 이량체의 이량체를 형성하기 위해 연결될 수 있다. 그러므로, 예를 들어 Cys 잔기를 함유하는 직렬 이량체는 또다른 이량체의 Cys 와 분자내 이황화물 결합을 형성할 수 있다. 예를 들어, 하기 SEQ ID NO : 20 의 화합물을 참고하라.

또한 본 발명의 화합물은 다음과 같은 담체 분자와 공유 또는 비공유 결합될 수 있다 : 선형 중합체(예, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리리신, 덱스트란 등), 가지난-사슬 중합체(예를 들어, 1981년 9월 15일자 Denkenwalter 등의 미국 특허 제 4,289,872 호 ; 1993년 7월 20일자 Tam 등의 미국 특허 제 5,229,490 호 ; 1993년 10월 28일자 Frechet 등의 제 WO 93/21259 호를 참고하라) ; 지질 ; 콜레스테롤군(예, 스테로이드) ; 또는 탄수화물이나 올리고당. 사용가능한 다른 담체로는 하나 또는 그 이상의 다음과 같은 수용성 중합체 부착물을 포함한다 : 미국 특허번호 제 4,640,835 호, 제 4,496,689 호, 제 4,301,144 호, 제 4,670,417 호, 제 4,791,192 호 및 제 4,179,337 호에 기술되어 있는 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시에틸렌 글리콜. 본 분야에 공지된 또다른 유용한 중합체로는 다음을 포함한다 : 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로스, 또는 중합체를 기초로하는 다른 탄수화물, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)-폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 동종중합체, 산화 폴리프로필렌/산화 에틸렌 공-중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예, 글리세롤) 및 폴리비닐 알콜, 및 이러한 중합체들의 혼합물.

그러한 담체로는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 바람직하다. PEG 군은 알맞은 분자량이며 곧은 사슬이나 가지난 사슬일 수 있다. PEG 의 평균 분자량은 바람직하게 약 2 kDa - 약 100 kDa 범위이며, 더 바람직하게는 약 5 kDa - 약 50 kDa 이며, 가장 바람직하게는 약 5 kDa - 약 10 kDa 이다.

PEG 성분상의 반응기(예, 알데히드, 아미노, 에스테르, 티올, α-할로아세틸, 말레이미도 또는 히드라지노기)를 표적 화합물상의 반응기(예, 알데히드, 아미노, 에스테르, 티올, α-할로아세틸, 말레이미도 또는 히드라지노기)로 옮기는 아실화, 환원성 알킬화, 미카엘 첨가반응, 티올 알킬화 또는 다른 화학선택적 접합/결합 방법을 통하여 일반적으로 PEG 기가본 발명의 화합물에 부착될 것이다.

탄수화물(올리고당) 군은 단백질에서 글리코실화 부위로 알려진 부위에 쉽게 부착될 수 있다. 올리고당류가 Asn-X-Ser/Thr 서열(여기에서, X 는 프롤린을 제외한 다른 어떤 아미노산일 수 있다)의 일부라 할 때, 일반적으로 O-결합된 올리고당류는 세린(Ser)이나 트레오닌(Thr) 잔기에 부착되는 반면, N-결합된 올리고당류는 아스파라긴(Asn) 잔기에 부착된다. 바람직하게, X 는 프롤린을 제외한 19 개의 천연 아미노산 중 하나이다. N-결합된 올리고당류와 O-결합된 올리고당류 및 각각의 형태에서 형성된 당 잔기의 구조들은 상이하다. 둘 다에서 공통적으로 관찰되는 당의 한 가지 형태는 N-아세틸뉴라민산(시알산으로도 명명함)이다. 시알산은 대개 N-결합된 올리고당류와 O-결합된 올리고당류의 말단 잔기이며, 시알산의 음전하로 인하여 글리코실화된 화합물에 산성을 부여할 수 있다. 그러한 부위(들)는 본 발명의 화합물의 링커에 연결될 수 있으며, 바람직하게는 폴리펩티드 화합물을 재조합 생산하는 동안 세포에 의해 글리코실화된다(예를 들어, CHO, BHK, COS 와 같은 포유동물 세포내에서). 그러나, 그러한 부위들은 본 분야에 공지된 합성 또는 반-합성 과정에 의해 더욱 글리코실화될 수 있다.

본 발명의 예시적인 펩티드 몇 가지를 하기에 나타내었다. 한 문자로된 아미노산 약어를 사용하였고, 링커를 명확하게 표시하기위해 대시(dash)로 따로 표시하였다. 그밖의 약어 BrAc 는 브로모아세틸 [BrCH₂C(O)]을, PEG 는 폴리에틸렌 글리콜을 의미한다.

상기 화합물들 각각에 있어서, N-말단 Met(또는 M 잔기, 한 문자 코드 사용시) 도 예상할 수 있다. 또한 상기 화합물들의다중합체(예를 들어, 직렬 및 비-직렬, 공유결합 및 비-공유결합된)도 예상된다.

본 발명의 두번째 실시형태에 있어서, 상기 기술된 화합물들을 직접 또는 링커 군을 통해 하나 또는 그 이상의 Fc 군에 융합시킬 수도 있다. 이러한 두번째 군의 화합물 및 생리학적으로 용인가능한 그의 염의 화학식은 일반적으로 다음과 같다 :

(Fc)_m-(L₂)_q-TMP₁-(L₁)_n-TMP₂-(L₃)_r-(Fc)_p

여기에서, TMP₁, TMP₂및 n 은 각각 상기에 기술되어 있고 ; L₁, L₂및 L₃는 상기 기술된 링커 군에서 각각 독립적으로 선택된 링커 군이며 ; Fc 는 면역글로불린의 Fc 부위이고 ; m, p, q 및 r 은 0 과 1 중에서 각각 독립적으로 선택되며, 여기에서 적어도 하나의 m 또는 p 는 1 이고, 또한 여기에서 m 이 0 이면 q 는 0 이고, p 가 0 이면 r 이 0 이다.

따라서, 이러한 두번째 군의 화합물들은 상기 기술된 화합물의 첫번째 군에 대해 정의된 바와 같은 구조를 지니지만, 이 화합물들은 직접 또는 하나 또는 그 이상의 링커 군을 통해 적어도 하나의 Fc 군에 더 융합된다.

상기 화합물들의 Fc 서열은 인체 면역글로불린 IgG-1 중쇄[Ellison, J.W. 등의, Nucleic Acids Res. 10 : 4071 - 4079 (1982) 참조], 또는 본 분야에 공지된 다른 Fc 서열(예를 들어, IgG-2, IgG-3 및 IgG-4, 또는 그 외의 면역글로불린들을 포함하지만 그것들로 제한되지는 않는 다른 IgG 류) 중에서 선택될 수 있다.

항체의 Fc 부위가 이황화물 결합이나 비-공유 결합에 의해 이량체 또는 다중합체로 결합되는 단량체 폴리펩티드 단편으로 이루어진다는 것은 잘 알려져있다. 천연 Fc 분자의 단량체 소단위체 사이의 분자간 이황화물 결합의 수는 관련된 항체의 종류(예, IgG, IgA, IgE) 또는 하위종류(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2)에 따라 1 - 4 개 범위이다. 본원에서 사용된 용어 "Fc" 는 Fc 분자의 단량체, 이량체 및 다중합체 형태를 총칭한다. 이량체 형성을 방해하는 특정한 조건이 없다면, 적절한 Cys 잔기가 존재할 때 이황화물 결합을 형성함으로써 Fc 단량체는 자발적으로 이량체화될 것임을 주지하여야 한다. Fc 이량체내에서 정상적으로 이황화물 결합을 형성하는 Cys 잔기가 제거되거나 다른 잔기로 치환된다 하더라도, 단량체 사슬은 일반적으로 비-공유 상호작용을 통해 이량체화될 것이다. 본원에서 사용된 용어 "Fc" 는 다음과 같은 형태를 의미한다 : 천연 단량체, 천연 이량체(이황화물 결합으로 연결됨), 변이된 이량체(이황화물 결합 및/또는 비-공유 연결됨), 및 변이된단량체(즉, 유도체).

Fc 부분의 변이체, 유사체 또는 유도체는 잔기 또는 서열의 다양한 치환에 의해 형성될 수 있다.

변이체(또는 유사체) 폴리펩티드는 삽입 변이체를 포함하는데, 여기에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기는 Fc 아미노산 서열을 추가한다. 삽입은 단백질의 한쪽 말단이나 양쪽 말단에서 일어날 수 있거나, Fc 아미노산 서열의 내부 부위내에 위치할 수 있다. 한쪽 말단이나 양쪽 말단에 부가 잔기를 갖는 삽입 변이체는 예를 들어, 아미노산 표식이나 표지를 포함하는 단백질 및 융합 단백질을 포함한다. 예를 들어, 특히 분자를 E. coli 와 같은 박테리아 세포에서 재조합적으로 발현시킬때, Fc 분자는 N-말단 Met 을 선택적으로 포함할 수 있다.

Fc 결실 변이체에 있어서, Fc 폴리펩티드내 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 제거된다. 결실은 Fc 폴리펩티드의 한쪽 말단이나 양쪽 말단에 있을 수 있거나, Fc 아미노산 서열내 하나 또는 그 이상의 잔기를 제거할 수도 있다. 따라서, 결실 변이체는 Fc 폴리펩티드 서열의 모든 단편을 포함한다.

Fc 치환 변이체에 있어서, Fc 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상의 잔기가 제거되고 대체 잔기로 치환된다. 본 발명의 한 양상에 있어서, 치환은 사실상 보존적이지만, 비-보존적 치환도 포함한다.

예를 들어, Fc 서열의 이황화물 교차결합 형성을 일부 또는 전부 방해하기 위하여 시스테인 잔기를 삭제하거나 다른 아미노산으로 치환할 수 있다. 특히, SEQ ID NO : 5 의 위치 7 및 10 의 아미노산은 시스테인 잔기이다. 이러한 시스테인 잔기를 각각 제거하거나, 하나 또는 그 이상의 이러한 시스테인 잔기를 Ala 또는 Ser 과 같은 다른 아미노산으로 치환할 수 있다. 또다른 실시예와 같이, 변이는 (1) Fc 수용체 결합 부위의 제거 ; (2) 보체(Clq) 결합 부위의 제거 및/또는 ; (3) 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 부위의 제거를 위해 아미노산 치환이 도입될 수도 있다. 그러한 부위는 본 분야에 공지되어 있고, 공지된 치환은 본원에서 사용된 Fc 범위 이내이다. 예를 들어, IgG1 내 ADCC 부위에 관하여 기록된Molecular Immunology,Vol. 29, No. 5, 633 - 639 (1992) 를 참조하라.

또한, 하나 또는 그 이상의 티로신 잔기도 페닐알라닌 잔기로 치환될 수 있다. 그 외의 변이체 아미노산 삽입, 결실(예를 들어, 1 - 25 아미노산) 및/또는 치환도 예상할 수 있고, 이들은 본 발명의 범위이내이다. 보존적 아미노산 치환이 일반적으로 바람직할 것이다. 게다가, 펩티드유사체 또는 D-아미노산과 같은 변형된 아미노산 형태로 변형될 수 있다.

TMP 화합물의 Fc 서열도 또한 유도될 수 있는데, 즉, 아미노산 잔기의 삽입, 결실이나 치환 이외의 변이이다. 이러한 변이는 사실상 공유결합이 바람직하며, 예를 들어, 중합체, 지질, 그 외의 유기 및 무기 성분과의 화학적 결합을 포함한다. 본 발명의 유도체는 순환 반감기를 증가시키도록 제조될 수 있으며, 폴리펩티드가 표적 세포, 조직 또는 기관에 정확히 표적화하는 능력이 개선되도록 고안될 수 있다.

또한, "증가된 반감기를 갖는 변형된 폴리펩티드" 라는 제목의 제 WO 96/32478 호에 기술된 것처럼, 본래의 Fc 분자의 재이용 수용체 결합 도메인을 발명 화합물의 Fc 부분으로 사용하는 것도 가능하다. 본원에서 Fc 로 명명된 분자 종류의 다른 멤버들은, "증가된 반감기를 갖는 면역글로불린-유사 도메인" 이라는 제목의 제 WO 97/34631 호에 기술되어 있다. 본 단락에 기재되어 있는 공개된 PCT 출원 둘 다는 본원에 참고문헌으로 인용되었다.

Fc 융합은 TMP₁또는 TMP₂의 N 이나 C 말단에서, 또는 TMP 들의 N 과 C 말단 둘 다에서 이루어질 수 있다. 놀랍게도, TMP 군의 N 말단에 결합된 Fc 부분내의 펩티드는 가능한 다른 것들보다 생물학적으로 더 활성이므로, TMP₁(즉, 일반적인 화학식에서 r 과 p 가 둘 다 0 이고, m 과 q 가 둘 다 1 임) 의 N 말단에 Fc 도메인을 갖는 융합이 바람직하다는 것으로 밝혀졌다. Fc 사슬이 TMP 또는 링커의 N-말단에 융합될때, 이러한 융합은 일반적으로 Fc 사슬의 C-말단에서 일어날 것이며, 그 역도 마찬가지다.

상기 일반 화학식에서 기술한 화합물의 이량체(예를 들어, 직렬 및 비-직렬의)인 화합물도 또한 바람직하다. 이런 경우에 있어서, 각각의 Fc 사슬은 TMP 펩티드의 직렬 이량체에 결합될 것이다. 그러한 화합물의 예시 도해를 도 6C 에 나타내었다. 이러한 형태의 화합물의 바람직한 예는 도 6C 를 기초로 하는데, 여기에서 Fc 는 SEQ ID NO : 5 의 화합물의 이량체이고, 각각의 L₂는 (Gly)₅이고, TMP₁과 TMP₂는 각각 SEQ ID NO : 1 의 화합물이고, 각각의 L₁은 (Gly)₈이다. 또한 이 화합물은 본원에서 "Fc-TMP₁-L-TMP₂" 로도 명명된다. 또한 SEQ ID NO : 34 의 이량체(Fc 부분 전체)로도 표현된다. Fc 군이도 6C 의 TMP₂군의 C-말단에 링커를 통해 부착된 유사체 화합물도 예상할 수 있으며, 이는 본원에서 "TMP₁-L-TMP₂-Fc" 로 명명된다.

두번째 군의 화합물의 몇몇 구체적인 예를 하기에 제시하였다 :

상기 화합물들 각각에 있어서, 부가적인 N-말단 Met(또는 M 잔기, 한 문자 코드 사용시) 도 예상할 수 있다. Fc 군이 TMP 의 N-말단에 부착되는 경우에, Met 잔기는 Fc 군의 N-말단에 부착될 것이다. Fc 군이 TMP 의 C-말단에 부착되는 경우에, Met 잔기는 TMP 군의 N-말단에 부착될 것이다.

상기 각각의 경우에서, Fc 는 바람직하게 인체 면역글로불린 IgG1 중쇄 또는 생물학적으로 활성인 단편, 유도체 또는 그것의 이량체의 Fc 부분이다[Ellison, J.W. 등의, Nucleic Acids Res. 10 : 4071 - 4079 (1982) 참조]. SEQ ID NO : 5 에 나타난 Fc 서열이 상기 화합물들의 Fc 로 가장 바람직하다. 또한 SEQ ID NO : 5 의 서열의 이량체 형태인 Fc, 및 TMP 직렬 이량체에 부착된 각각의 Fc 사슬내의 상기 화합물들도 바람직하다.

부가적으로, 두번째 실시형태의 여러가지 바람직한 화합물들이 2 개의 결합된 TMP 부분을 포함하는 하나 또는 그 이상의 직렬 이량체를 포함한다 하더라도, 본 발명의 또다른 화합물들은 TMP 들의 직렬 다중합체, 즉 하기의 예시적인 구조의 화합물들을 포함한다 :

Fc-TMP₁-L-TMP₂-L-TMP₃;

Fc-TMP₁-L-TMP₂-L-TMP₃-L-TMP₄;

Fc-TMP₁-L-TMP₂-L-TMP₃-L-TMP₄-L-TMP₅;

TMP₁-L-TMP₂-L-TMP₃-L-Fc;

TMP₁-L-TMP₂-L-TMP₃-L-TMP₄-L-Fc;

TMP₁-L-TMP₂-L-TMP₃-L-TMP₄-L-TMP_-5-L-Fc;

여기에서, TMP₁, TMP₂, TMP₃, TMP₄및 TMP₅는 동일한 구조 또는 상이한 구조를 가질 수 있고, Fc 와 각각의 TMP 및 L 은 상기 기술된 것과 같이 정의되며, 링커는 각각 선택적이다. 상기 각각의 경우에 있어서, Fc 군은 단량체 또는 이량체일 수 있고, Fc 가 이량체인 경우에는 하나 또는 그 이상의 TMP 다중합체가 각각의 Fc 사슬에 부착될 수 있다. 또한 TMP 이량체나 다중합체가 Fc 사슬 한쪽 또는 양쪽의 N-말단과 C-말단 둘 다에 부착되는(TMP 이량체나 다중합체가 2 개의 Fc 사슬의 4 개의 모든 말단에 부착되는 경우를 포함함) 다른 실시예들도 예상할 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 두번째 실시형태의 화합물은 총 약 200 - 400 개의 아미노산을 가질 것이다(즉, 폴리펩티드).

제조 방법

본 발명의 화합물은 다양한 방법으로 만들 수 있다. 대부분의 화합물들이 펩티드이거나 펩티드를 포함하므로, 본원에서는 펩티드를 합성하는 방법이 특히 적절하다. 예를 들어, 고체상 합성 기술이 사용될 수 있다. 적절한 기술은 본 분야에 공지되어 있고, 다음에 기재된 것들을 포함한다 : Merrifield, Chem. Polypeptides, pp. 335 - 61(Katsoyannis 및 Panayotis eds. 1973) ; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 : 2149 (1963) ; Davis 등의, Biochem. Intl. 10 : 394 - 414 (1985) ; Stewart 및 Young, Solid Phase Peptide Synthesis (1969) ; 미국 특허 번호 제 3,941,763 호 ; Finn 등의, The Proteins, 3rd ed., vol. 2, pp. 105 - 253 (1976) ; 및 Erickson 등의, The Proteins, 3rd ed., vol. 2, pp. 257 - 527 (1976). 고체상 합성은 소형 펩티드를 만드는 비용 효율이 가장 높은 방법이므로 각각의 펩티드를 만드는 기술로 바람직하다.

또한 펩티드는 재조합 DNA 기술을 이용하여 형질전환된 숙주 세포내에서 만들 수도 있다. 그렇게하여 펩티드를 코드하는 재조합 DNA 분자는 제조된다. 그러한 DNA 분자 및/또는 RNA 분자를 제조하는 방법은 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 펩티드를 코드하는 서열은 적절한 제한 효소를 사용하여 DNA 로부터 잘라낼 수 있다. 차후의 클로닝을 위해 유용한 제한 부위의 함유물과 함께 PCR 을 이용하여 적절한 서열을 만들어낼 수 있다. 대안적으로, DNA/RNA 분자는 포스포라미디트 방법과 같은 화학적 합성 기술을 이용하여 합성할 수 있다. 또한 이러한 기술을 연합하여 사용할 수도 있다.

본 발명은 또한 적절한 숙주내 펩티드를 코드하는 벡터를 포함한다. 벡터는 적절한 발현 조절 서열에 작동적으로 결합된 펩티드를 코드하는 DNA 분자를 포함한다. 이러한 작동적 결합을 실행하는 방법(펩티드를 코드하는 DNA 분자를 벡터내로 삽입시키기 전이나 후에)은 공지되어 있다. 발현 조절 서열은 다음을 포함한다 : 프로모터, 활성인자(activator), 증강인자(enhancer), 작동인자(operator), 리보솜 결합 부위, 개시 신호, 정지 신호, 캡 신호(cap signal), 폴리아데닐화 신호, 및 전사나 번역을 조절하는 것과 관련된 그 외의 신호.

펩티드를 코드하는 DNA 분자를 함유하는 결과적인 벡터는 적절한 숙주를 형질전환시키는데 사용된다. 이러한 형질전환은 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.

사용가능하고 공지된 대부분의 숙주 세포는 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다. 본 분야에서 인지되는 많은 인자들에 따라 특정 숙주가 선택된다. 이러한 인자는 예를 들어 다음을 포함한다 : 선택된 발현 벡터와의 적합성, DNA 분자에 의해 코드되는 펩티드의 숙주 세포에 대한 독성, 형질전환 속도, 펩티드의 회수 용이성, 발현 특성, 생물학적 안정성 및 비용. 모든 숙주가 특정 DNA 서열을 발현하는데 동등하게 효과적이지는 않기 때문에 이러한 인자들의 균형이 맞춰져야 한다.

이러한 일반적인 지침내에서, 유용한 미생물 숙주는 박테리아(E. coli 와 같은), 효모[사카로미세스 에스피(Saccharomyces sp.) 및 피히아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은] 및 그 외의 진균, 곤충, 식물, 배양액내 포유동물(인체를 포함함) 세포, 또는 본 분야에 공지된 그 외의 숙주를 포함한다.

그런 다음, 원하는 펩티드를 발현시키기 위해 형질전환된 숙주를 통상적인 발효 조건하에서 배양한다. 그러한 발효 조건은 본 분야에 공지되어 있다.

마지막으로, 발현된 펩티드를 발효 배양액 또는 숙주 세포로부터 정제한다. 이러한 정제 방법 또한 본 분야에 공지되어 있다.

유도된 펩티드 또는 비-펩티드 군을 포함하는 화합물은 공지된 유기 화학 기술에 의해 합성될 수 있다.

화합물의 용도

본 발명의 화합물은 c-Mpl 수용체에 결합하는 능력 및 c-Mpl 수용체를 활성화하는 능력을 가지며 및/또는 혈소판("혈소판신생 활성") 및 혈소판 전구체("골수거핵구형성 활성")의 생산(생체내 및 시험관내 시험 둘 다에서)을 자극하는 능력을 갖는다. 이러한 화합물들의 활성을 측정하기 위하여, "거핵구 성장 및 분화를 자극하는 조성물 및 방법" 이라는 제목의 제 WO 95/26746 호에 기술되어 있는 것과 같은 표준 검정을 사용할 수 있다. 생체내 검정은 본원의 실시예 부분에 더 자세히 기술되어 있다.

본 발명의 방법 및 조성물로 치료되는 증상은 일반적으로 다음과 같다 : 거핵구/혈소판 결핍증 또는 장래에 거핵구/혈소판 결핍증이 예상되는(예를 들어, 계획된 외과수술이나 혈소판 기증 때문에) 증상. 그러한 증상은 생체내 활성 Mpl 리간드 결핍증(일시적으로 또는 영구적으로)의 결과일 것이다. 혈소판 결핍증을 지칭하는 일반적인 용어는 혈소판감소증으로서, 본 발명의 방법 및 조성물은 그것을 필요로하는 환자의 혈소판감소증을 예방 또는 치료하는데 일반적으로 유용하다.

세계 보건 기구에서는 개체내 순환 혈소판의 수를 기준으로 혈소판감소증의 정도를 분류하였다[Miller, 등의, Cancer 47 : 210 - 211 (1981)]. 예를 들어, 혈소판감소증 증상을 나타내지 않는(등급 0) 개체는 일반적으로 적어도 100,000 혈소판/㎣ 을 가질 것이다. 경증의(mild) 혈소판감소증은(등급 1) 79,000 - 99,000/㎣ 사이의 순환 혈소판 수준을 나타낸다. 온화한 정도의(moderate) 혈소판감소증은(등급 2) 50,000 - 74,000 혈소판/㎣ 사이를 나타내고 위중한 정도의 혈소판감소증은 25,000 - 49,000 혈소판/㎣ 사이로 특정된다. 생명을 위협하거나 쇠약하게하는 정도의 혈소판감소증은 25,000/㎣ 보다 적은 수의 혈소판 순환 농도로 특정된다.

혈소판감소증(혈소판 결핍증)은 화학요법과 여러가지 약물로 치료하는 그 외의 치료법, 방사선 치료, 외과수술, 우발적 실혈 및 그 외의 특정 질병 증상을 포함하는 다양한 이유로 나타날 수 있다. 혈소판감소증과 관련되고 본 발명에 따라 치료될 수 있는 특정 질병 증상의 예는 다음과 같다 : 재생불량성빈혈 ; 유방암과 연관된 특발성 혈소판감소성자반병을 포함하는 특발성 또는 면역성 혈소판감소증(ITP) ; HIV 관련 ITP 및 HIV 관련 혈전성 혈소판감소성자반병 ; 혈소판감소증을 일으키는 전이성 종양 ; 신생아루푸스증후군비종을 포함하는 전신성 홍반성루푸스 ; 판코니증후군 ; 비타민 B12 결핍증 ; 엽산 결핍증 ; 메이-헤글린이상 ; 비스코트-올드리치증후군 ; 만성 간 질환 ; 혈소판감소증과 연관된 골수형성이상증후군 ; 발작성야간혈색소뇨증 ; 급성 심재성 혈소판감소증에 이은 C7E3 Fab (Abciximab) 요법 ; 모계 동종면역 혈소판감소증을 포함하는 동종면역 혈소판감소증 ; 항인지질 항체 및 혈전증과 연관된 혈소판감소증 ;자가면역 혈소판감소증 ; 카르보플라틴-유도성 혈소판감소증, 헤파린-유도성 혈소판감소증을 포함하는 약물-유도성 면역 혈소판감소증 ; 태아 혈소판감소증 ; 임신 혈소판감소증 ; 휴즈증후군 ; 루포이드 혈소판감소증 ; 우발적 실혈 및/또는 대량 실혈 ; 골수증식 장애 ; 악성종양 환자의 혈소판감소증 ; 암환자의 혈전성 혈소판감소성자반병/용혈성 요독증후군과 같은 혈전성 미소혈관증상을 포함하는 혈전성 혈소판감소성자반병 ; 자가면역성 용혈성빈혈 ; 잠재성 공장게실천공 ; 순수적혈구형성부전증 ; 자가면역 혈소판감소증 ; 유행성신장병 ; 리팜피신과 연관된 급성 신부전 ; 파리-트루소 혈소판감소증 ; 신생아동종면역 혈소판감소증 ; 위암의 혈액학적 변화 ; 소아기 용혈성 요독증후군 ; A 형 간염 바이러스 및 CMV 와 연관된 혈소판감소증을 포함하는 바이러스 감염과 관련된 혈액학적 증상 ; 몇몇 AIDS 치료로 인한 혈소판감소증(예, AZT). 일부 창상치료장애도 혈소판 수의 증가로 이득을 볼 수 있다.

장래에 있을 외과수술때문에 혈소판 결핍증이 예상되는 경우에는, 혈소판을 필요로하는 몇 일 전 내지 몇 시간 전에 본 발명의 화합물을 투여할 수 있다. 우발적 실혈 및 대량 실혈과 같은 급성 상황일 경우에는, 혈액이나 정화된 혈소판과 함께 본 발명의 화합물을 투여할 수 있다.

몇몇 세포가 Mpl 수용체를 발현하기 위해 발견된다면 본 발명의 화합물은 거핵구이외의 몇몇 세포 형태를 자극하는데도 유용할 것이다. Mpl 리간드에 의한 자극에 반응하는 Mpl 수용체를 발현하는 세포와 연관된 증상도 본 발명의 범위 이내이다.

본 발명의 화합물은 혈소판이나 혈소판 전구체 세포의 생산이 요구되는, 또는 c-Mpl 수용체의 자극이 요구되는 상태에 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 본 발명의 화합물은 혈소판, 거핵구 등을 필요로하는 포유동물의 어떠한 증상이라도 치료하는데 사용될 수 있다. 그러한 증상은 본원에서 참고문헌으로 인용한 다음의 예시적인 자료에 상세히 기술되어 있다 : 제 WO 95/26746 호 ; 제 WO 95/21919 호 ; 제 WO 95/18858 호 ; 제 WO 95/21920 호.

본 발명의 화합물은 또한 혈소판 및/또는 거핵구 및 관련 세포의 저장 기간 또는 생존 능력을 유지시키는데 사용될 수도 있다. 따라서, 그런 세포를 포함하는 조성물내의 하나 또는 그 이상의 화합물의 유효량을 포함하는데 유용할 수 있다.

"포유동물" 이란 인체를 포함하고, 개와 고양이를 포함하는 애완동물 ; 원숭이를 포함하는 외래 및/또는 동물원 동물 ; 마우스, 랫 및 기니피그를 포함하는 실험실 동물 ; 말, 소, 양, 염소 및 돼지를 포함하는 농장 동물 등을 포함하는 모든 포유동물을 의미한다. 바람직한 포유동물은 사람이다.

제약학적 조성물

본 발명은 또한 발명 화합물의 제약학적 조성물을 사용하는 방법도 제공한다. 그러한 제약학적 조성물은 주사로 투여되거나, 또는 경구, 코, 경피 또는 다른 투여 형태로 투여될 수 있는데, 주사는 예를 들어, 정맥내, 피내, 근육내, 유방내, 복강내, 초내, 안내, 안구후, 폐내(예, 분무질화된 약물) 또는 피하 주사(장기간 방출을 위한 저류물 투여를 포함함)를 포함하고 ; 그 외의 다른 투여 형태는 설하, 항문, 질내, 또는 비(脾)성 캡슐과 뇌 아래나 각막내에 끼워넣는 외과적 이식에 의한 투여를 포함한다. 치료는 단일 투여 또는 치료 기간에 걸쳐 여러번 투여하여 이루어진다. 일반적으로, 제약학적 조성물은 본 발명의 화합물의 유효량과 함께 제약학적으로 용인가능한 희석제, 방부제, 용해제, 유화제, 보조제 및/또는 담체를 포함하는 것으로 이해된다. 그러한 조성물은 다음을 포함한다 : 다양한 완충제 성분(예, 트리스-HCl, 아세트산염, 인산염), pH 및 이온 강도의 희석제 ; 계면활성제와 용해제(예, 트윈 80, 폴리소르베이트 80), 항-산화제(예, 아스코르브산, 메타중아황산 나트륨), 방부제(예, 티메르졸, 벤질알콜) 및 증량 물질(예, 락토스,만니톨)과 같은 첨가제 ; 폴리락트산, 폴리글리콜산 등과 같은 중합체성 화합물의 미립자화된 제제내로 또는 리포솜내로의 물질 혼합. 히알루론산도 사용될 수 있고, 히알루론산은 혈행내에서의 시간 지연을 조절하는 효과를 지닌다. 제약학적 조성물은 또한 제약학적 담체, 부형제 또는 매개체로 사용되는 다른 제약학적으로 용인가능한 액체, 반고체 또는 고체 희석제를 포함할 수 있는데, 다음을 포함하지만 그것으로 제한되지는 않는다 : 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우르산염, 스테아르산 마스네슘, 메틸- 및 프로필히드록시벤조산염, 전분, 수크로스, 덱스트로스, 아카시아 고무, 인산칼슘, 미네랄 오일, 코코아기름 및 테오브로마 오일. 그러한 조성물은 생체내 방출 속도, 안정성, 물리적 상태, 및 본 발명의 단백질 및 유도체의 생체내 청소율에 영향을 미친다. 예를 들어, 본원에서 참고문헌으로 인용한 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) 페이지 1435 - 1712 를 참고하라. 조성물은 액체 형태로 제조되거나, 냉동건조된 형태와 같은 건조 분말 형태로 제조될 수 있다. 경피 제제형과 같은, 주입가능한 서방성 제제형으로도 제조될 수 있다.

경구 고체 투여 형태도 본원에서의 용도로 예상되는데, 이는 본원에서 참고문헌으로 인용한 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton PA 18042)의 제 89 장에 일반적으로 기술되어 있다. 고체 투여 형태는 정제, 캡슐, 환제, 트로키제나 함당정제, 교갑 또는 펠릿을 포함한다. 리포솜 캡슐화 또는 프로테이노이드 캡슐화도 본 발명의 조성물을 제형화 하는데 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 제 4,925,673 호에 기재된 프로테이노이드 중심체와 같음). 리포솜 캡슐화가 사용될 수 있고, 리포솜은 다양한 중합체로 유도될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 제 5,013,556 호). 치료용으로 가능한 고체 투여 형태는 본원에서 참고문헌으로 인용한 Marshall, K., Modern Pharmaceutics, Edited by G. S. Banker 및 C. T. Rhodes 제 10 장, 1979 에 기술되어 있다. 제제형은 일반적으로 발명의 화합물, 및 생물학적 활성 물질을 위장 환경으로부터는 보호하고 장에서는 방출하게 하는 비활성 성분들을 포함할 것이다.

상기 발명 화합물의 경구 투여 형태도 특히 예상된다. 필요하다면 경구 투여가 유효하도록 화합물을 화학적으로 변형시킬 수 있다. 일반적으로 예상되는 화학적 변형은 적어도 하나의 성분(moiety)이 화합물 분자에 결합하는 것인데, 그러한 성분은 (a) 단백질가수분해의 저해 ; 및 (b) 위나 장으로부터 혈류로의 흡수를 가능하게 한다. 또한 화합물의 전반적인 안정성을 증가시키고, 체내 순환시간을 증가시키는 것이 바람직하다. 그러한 성분의 예로는 다음을 포함한다 : 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸 셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈 및 폴리프롤린 [Abuchowski 및 Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs, Hocenberg 및 Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, (1981), pp 367 - 383 ; Newmark, 등의, J. Appl. Biochem. 4 : 185 - 189 (1982)를 참조하라]. 사용가능한 다른 중합체로는 폴리-1,3-디옥솔란 및 폴리-1,3,6-티옥소칸이 있다. 상기 기술된 것들 중 제약학적으로 사용하기에 바람직한 것은 폴리에틸렌 글리콜 성분이다.

경구 투여 형태에 있어서, 본 발명의 치료학적 화합물의 흡수를 증강시키기 위한 담체로서 N-(8-[2-히드록시벤조일]아미노)카프릴산 나트륨 (SNAC)과 같은 변이된 지방족 아미노산의 염을 사용하는 것도 가능하다. SNAC 를 사용하는 헤파린 제제형의 임상적 효과는 에미스피어 테크놀로지스(Emisphere Technologies)에 의해 실시된 단계 Ⅱ 시험에서 증명되었다. 미국 특허 번호 제 5,792,451 호, "경구 약물 방출 조성물 및 방법" 을 참고하라.

치료제는 약 1 ㎜ 입자 크기의 과립이나 펠릿 형태의 미세한 다미립자로 제제형내에 포함될 수 있다. 캡슐 투여용 물질의 제제형은 분말, 가볍게 압축된 충전물 또는 정제일 수도 있다. 치료제는 압축하여 제조될 수 있다.

착색제 및 향미제도 모두 포함될 것이다. 예를 들어, 단백질(또는 유도체)이 제형화(리포솜 캡슐화 또는 중십체 캡슐화에 의함)된 다음, 착색제와 향미제를 포함하는 냉장된 음료와 같은 식용 산물내로 더 포함될 수 있다.

비활성 물질로 치료제를 희석하거나 부피를 증가시킬 수 있다. 이러한 희석제는 탄수화물, 특히 만니톨, α-락토스, 무수 락토스, 셀룰로스, 수크로스, 변형된 덱스트란 및 전분을 포함한다. 특정 무기염도 충전제로 사용할 수 있는데, 삼인산칼슘, 탄산마그네슘 및 염화나트륨을 포함한다. 상업적으로 사용가능한 몇몇 희석제로는 Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress 및 Avicell 이 있다.

붕괴제는 고체 투여 형태 치료제의 제제형내에 포함될 수 있다. 붕괴제로 사용되는 물질은 전분, Explotab 를 기초로하는 상업용 붕괴제를 포함하는 전분을 포함하지만 그것으로 한정되지는 않는다. 전분 글리콜산 나트륨, 앰버라이트, 카르복시메틸셀룰로스나트륨, 울트라아밀로펙틴, 알진산 나트륨, 젤라틴, 오렌지껍질, 카르복시메틸셀룰로스산, 천연 스폰지 및 벤토나이트 모두 사용될 수 있다. 붕괴제의 또다른 형태는 불용성의 양이온성 교환 수지이다. 분말화된 고무도 붕괴제 및 결합제로서 사용될 수 있는데, 이들은 아가, 카라야 및 트라가칸트와 같이분말화된 고무를 포함할 수 있다. 알진산 및 그의 염도 또한 붕괴제로서 유용하다.

결합제는 치료제와 함께 딱딱한 정제를 형성하기 위해 사용되며, 아카시아, 트라가칸트, 전분 및 젤라틴과 같은 천연 산물로부터 얻은 물질을 포함한다. 그 외의 것으로는 메틸셀룰로스(MC), 에틸셀룰로스(EC) 및 카르복시메틸셀룰로스(CMC)를 포함한다. 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 히드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC)는 둘 다 치료제를 과립화 하는 알콜성 용액에 사용될 수 있다.

윤활제는 제형화 과정 중에 들러붙지 않게 하기 위하여 치료제의 제제형내에 포함될 수 있다. 윤활제는 치료제와 다이 벽(die wall) 사이의 층으로 사용되며, 이들은 다음을 포함하는 스테아르산을 포함하지만 그것으로 한정되지는 않는다 : 마그네슘염 및 칼슘염, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 액체 파라핀, 식물유 및 왁스. 또한 가용성 윤활제로는 라우릴 황산나트륨, 라우릴 황산마그네슘, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, 카르보왁스 4000 및 6000.

제형화하는 동안 약물의 유동성을 개선하고 가압하는 동안 재배열을 촉진하는 활택제를 첨가할 수도 있다. 활택제는 전분, 활석, 발열실리카 및 수화한 실리코알루미늄산염을 포함한다.

치료제가 수성 환경에서 용해되도록 하기 위하여, 습윤제로서 계면활성제를 첨가할 수 있다. 계면활성제는 라우릴 황산나트륨, 술포숙신산 디옥틸 나트륨 및 술폰산 디옥틸 나트륨과 같은 음이온성 세정제를 포함한다. 양이온성 세정제도 사용될 수 있으며, 이는 염화 벤조알코늄 또는 염화 벤조에토늄을 포함할 수 있다. 계면활성제로 제제형내 포함될 수 있는 잠재적인 비이온성 세정제로는 라우로마크로골 400, 스테아르산 폴리옥실 40, 폴리옥시에틸렌 수소첨가된 피마자유 10, 50 및 60, 모노스테아르산 글리세롤, 폴리소르베이트 40, 60, 65 및 80, 수크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스가 있다. 이러한 계면활성제는 단백질 또는 유도체의 제제형내에 단독으로 또는 다른 비율의 혼합물로서 존재할 수 있다.

화합물의 흡수를 강력하게 향상시키는 첨가제로는 예를 들어 지방산, 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산이 있다.

방출이 조절되는 제제형도 바람직할 것이다. 약물은 확산이나 침출 장치에 의해 방출을 허용하는 비활성 매트릭스내로 혼합될 수 있다(예, 검). 서서히 변성되는 매트릭스도 제제형내로 혼합될 수있다(예, 알진산염, 다당류). 방출이 조절되는 치료제의 또 다른 형태는 오로스 쎄라퓨틱 시스템(알자 코포레이션 : Alza Corp.)에 기초한 방법에 의한 것으로서, 즉, 삼투압 효과로 인한 단일 소통로를 통하여 물을 들여보내고 약물을 밀어내는 반투과성 막으로 약물을 넣는다. 몇몇 장용 피복물도 서방성 효과를 갖는다.

다른 피복물도 제제형에 사용할 수 있다. 피복 팬(coating pan)에 사용할 수 있는 다양한 당류가 포함된다. 치료제는 필름 피복된 정제내에도 사용할 수 있고, 이 경우에 사용되는 물질은 2 개 군으로 나누어진다. 첫번째는 비-장용 물질로서, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 메틸히드록시-에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필-메틸 셀룰로스, 소듐 카르복시-메틸 셀룰로스, 프로비돈 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 두번째 군은 일반적으로 프탈산의 에스테르인 장용 물질로 이루어진다.

물질을 혼합하여 최적의 필름 피복물을 제공하는데 사용할 수 있다. 필름 피복은 제피기 또는 유동층에서 실시할 수 있고 또는 압축 피복하여 실시할 수도 있다.

또한 본 발명의 단백질(또는 그것의 유도체)의 폐 수송도 예상할 수 있다. 단백질(또는 유도체)은 폐 상피 내층에서 혈류로 통과하고 흡입하는 동안 포유동물의 폐로 수송된다. 이것에 관한 다른 보고는 다음을 포함한다 : Adjei 등의, Pharmaceutical Research 7 : 565 - 569 (1990) ; Adjei 등의, International Journal of Pharmaceutics 63 : 135 - 144 (1990)(아세트산 류프롤리드) ; Braquet 등의, Journal of Cardiovascular Pharmacology 13 (suppl.5) : s. 143 - 146 (1989)(엔도테린-1) ; Hubbard 등의, Annals of Internal Medicine 3 : 206 - 212 (1989)(α1-안티트립신) ; Smith 등의, J. Clin. Invest. 84 : 1145 - 1146 (1989)(α1-프로테아제) ; Oswein 등의, "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery Ⅱ, Keystone, Colorado, March, 1990 (재조합 인체 성장 호르몬) ; Debs 등의, The Journal of Immunology 140 : 3482 - 3488 (1988)(인터페론-γ 및 종양괴사인자-α) 및 Platz 등의, 미국 특허 번호 제 5,284,656 호(과립구 군체자극인자).

치료 산물의 폐 수송을 위해 고안된 폭넓은 범위의 기계적 장치도 본 발명의 실시에 사용됨을 예상할 수 있고, 분무기, 정량 흡입기 및 분말 흡입기를 포함하지만 그것으로 제한되지는 않으며, 그것들 모두는 본 분야의 숙련자들에게 잘 알려져있다.

본 발명의 실시에 적합한, 상업적으로 이용가능한 장치의 몇몇 특정한 예로는 다음의 것들이 있다 : 미국 미주리 세인트 루이스 소재의 말린크로트 인코포레이티드(Mallinckrodt, Inc.)에서 제조된 울트라벤트 분무기 ; 미국 콜로라도 앵글우스 소재의 마퀘스트 메디컬 프로덕츠(Marquest Medical Products)에서 제조된 에이컨 Ⅱ 분무기 ; 미국 노스캐롤라이나 리서치 트라이앵글 파크 소재의 그락소 인코포레이티드(Glaxo Inc.)에서 제조된 벤톨린 정량 흡입기 ; 및 미국 메사츄세츠 베드포드 소재의 피존즈 코포레이션(Fisons Corp.)에서 제조된 스핀헬러 분말 흡입기.

제제형의 사용시 요구되는 그러한 모든 기구들은 본 발명의 화합물을 투약하는데 적합하다. 일반적으로, 각각의 제제형은 사용하는 도구의 형태에 특이적이며, 치료에 유용한 희석제, 보조제 및/또는 담체 이외의 적절한 추진 물질을 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물은 원위의 폐에 가장 효과적으로 수송될 수 있도록 하기 위하여 10 ㎛ (또는 미크론) 이하의 평균 입자 크기, 가장 바람직하게는 0.5 - 5 ㎛ 의 입자 크기를 갖는 입자 형태로 제조되어야만 가장 유리하다.

담체는 트레할로스, 만니톨, 자일리톨, 수크로스, 락토스 및 소르비톨과 같은 탄수화물을 포함한다. 제제형에 사용되는 다른 성분으로 DPPC, DOPE, DSPC 및 DOPC 를 포함할 수 있다. 천연 계면활성제 또는 합성 계면활성제를 사용할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜을 사용할 수 있다(단백질이나 유사체를 유도하는 그것의 용도와는 별도로). 사이클로덱스트란과 같은 덱스트란을 사용할 수 있다. 담즙산염 및 다른 관련 증강인자를 사용할 수 있다. 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체를 사용할 수 있다. 아미노산을 완충 제제형에서 사용하는 것과 동일하게 사용할 수 있다.

또한 리포솜, 미소캡슐이나 중심체, 봉입체 복합체, 또는 다른 형태의 담체도 사용할 수 있다.

분사 또는 초음파 분무기에 사용하기에 적절한 제제형은 일반적으로 용액 ㎖ 당 약 0.1 - 25 ㎎ 의 생물학적 활성 단백질의 농도로 물에 용해된 발명의 화합물을 포함할 것이다. 또한 제제형은 완충액 및 단당을 포함할 수 있다(예를 들어, 단백질 안정화 및 삼투압의 조절용).

정량 흡입기구에 사용하는 제제형은 계면활성제를 첨가한 추진제에 현탁시킨 발명의 화합물을 함유하는, 미세하게 분쇄된 분말을 일반적으로포함할 것이다. 추진제는 이러한 목적에 사용되는, 다음과 같은 통상적인 물질일 수 있다 : 클로로플루오로카본, 히드로클로로플루오로카본, 히드로플루오로카본, 또는 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄을 포함하는 히드로카본, 또는 그것의 조합물. 적절한 계면활성제는 트리올레산 소르비탄 및 콩 레시틴을 포함한다. 올레산도 계면활성제로서 유용할 수 있다.

분말 흡입기구로 투약되는 제제형은 발명의 화합물을 함유하는 미세하게 분쇄된 건조 분말을 포함할 것이며, 다음과 같은 증량제도 포함할 수 있다 : 기구로부터 분말을 손쉽게 분산시키는 양(예, 제제형 중량의 50 - 90 %)의 락토스, 소르비톨, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 자일리톨.

발명의 화합물의 비(nasal) 수송도 예상된다. 비수송은 치료 산물을 코에 투여한 후, 폐내에 산물의 축적없이, 직접적으로 단백질을 혈류로 통과하게 한다. 비수송 제제형은 덱스트란 또는 사이클로덱스트란과 함께 포함된다. 그 외의 점막을 통과하는 수송도 예상된다.

투여량

상기 기술된 증상을 치료하는 방법에 관련된 투여량 처방계획은 약물의 작용을 변화시키는 다양한 인자, 예를들어, 환자의 나이, 증상, 체중, 성별 및 식이, 감염의 위중성, 투여 시간 및 다른 임상적 인자들을 고려하여 주치의에 의해 결정될 것이다. 일반적으로, 투여는 하루에 체중 ㎏ 당 발명 화합물 0.1 ㎍ - 100 ㎎ 의 범위내이고, 바람직하게는 0.1 - 1000 ㎍/㎏ ; 하루 투여량 또는 긴 시간 간격이나 짧은 시간 간격(예를 들어, 격일로, 1 주에 2 번, 1 주 마다, 또는 하루에 2 번이나 3 번)에 동등한 투여량으로 투여되는 0.1 - 150 ㎍/㎏ 이 더욱 바람직하다.

본 발명의 화합물은 초기 대형환제로 투여된 다음, 약물 산물의 치료적 혈행 수준을 유지하기 위해 계속적인 주입을 실시할 수 있다. 다른 예로는, 본 발명의 화합물을 1 회 투여할 수 있다. 본 분야의 숙련자들은 유효 투여량과 투여 처방계획을 의학적 경험과 환자 개개인의 임상적 증상에 의해 손쉽게 결정할 것이다. 투여 빈도는 제제의 약물동력학적 요인과 투여 경로에 따라 결정될 것이다. 최적의 제약학적 제제형은 투여 경로와 원하는 투여량에 따라 본 분야의 숙련자에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 본원에서 참고문헌으로 인용한 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) 페이지 1435 - 1712 를 참고하라. 그러한 제제형은 투여된 제제의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출율, 생체내 청소율에 영향을 미칠 것이다. 투여 경로에 따라서, 적절한 투여량은 체중, 체표면적 또는 기관의 크기를 기준으로 계산될 것이다. 상기 언급된 제제형 각각을 포함하는 치료용의 적절한 투여량을 결정하는데 필요한 더 정밀한 계산은, 상기 기술된 인체 임상 시험에서 관찰된 약물동력학 데이터 뿐만 아니라 과도한 실험(특히 투여량 정보에 관한)과 본원에서 기술한 분석 없이 본 분야의 숙련자에 의해 일상적으로 이루어질 수 있다. 적절한 투여량은 적절한 투여-반응 데이터와 관련하여 투여량의 혈액 수준을 결정하는 기존의 분석을 사용하여 확인할 수 있다. 최종 투여량 처방계획은 약물의 작용을 변화시키는 다양한 인자, 예를 들어, 약물의 특이 활성, 손상의 정도와 환자의 반응, 환자의 나이, 증상, 체중, 성별 및 식이, 감염의 위중성, 투여 시간 및 다른 임상적 인자들을 고려하여 주치의에 의해 결정될 것이다. 실시된 연구와 같이, 적절한 투여량 수준 및 다양한 질병과 증상에 대한 치료 기간에 관하여 더 자세한 정보가 알려질 것이다.

또한 본 발명의 치료방법, 조성물 및 화합물은 혈소판 결핍증 및 그외의 증상을 보이는 질병 치료시 시토킨류, 가용성 Mp1 수용체, 조혈 인자, 인터루킨, 성장 인자 또는 항체와 함께 또는 단독으로 사용할 수 있다. 본 발명의 화합물은 IL-3 또는 GM-CSF 와 같은 일반적인조혈 자극물질과 배합시켜 일부 형태의 혈소판감소증 치료에 유용할 것으로 기대된다. meg-CSF, 간세포 인자(SCF), 백혈병 저해 인자(LIF), 온코스타틴 M(OSM) 등의 다른 거핵구 자극 인자 또는 거핵구 자극 활성을 갖는 다른 분자 또한 Mp1 리간드와 함께 사용할 수 있다. 이러한 공동-투여에 적합한 또다른 시토킨류 또는 조혈 인자는 다음을 포함한다 : IL-1 알파, IL-1 베타, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, 군체 자극 인자-1(CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, 과립구 군체 자극 인자(G-CSF), EPO, 인터페론-알파(IFN-알파), 칸센서스 인터페론, IFN-베타, IFN-감마, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, 트롬보포이에틴(TPO), 안지오포이에틴(예, Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y), 인체 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드, 맥관 내피 성장 인자(VEGF), 안지오제닌, 골 형태원 단백질-1, 골-형태원 단백질-2, 골-형태원 단백질-3, 골 형태원 단백질-4, 골-형태원 단백질-5, 골-형태원 단백질-6, 골 형태원 단백질-7, 골-형태원 단백질-8, 골-형태원 단백질-9, 골 형태원 단백질-10, 골-형태원 단백질-11, 골-형태원 단백질-12, 골 형태원 단백질-13, 골-형태원 단백질-14, 골-형태원 단백질-15, 골 형태원 단백질 수용체 IA, 골 형태원 단백질 수용체 IB, 뇌 유래 신경영양성 인자, 모양체 호중구성 인자, 모양체 호중구성 인자 수용체 α, 시토킨-유도 호중구 화학주성 인자 1, 시토킨-유도 호중구 화학주성 인자 2α, 시토킨-유도 호중구 화학주성 인자 2β, β 내피 세포 성장 인자, 엔도텔린 1, 표피성장 인자, 상피-유도 호중구 유인제, 섬유아세포 성장 인자 4, 섬유아세포 성장 인자 5, 섬유아세포 성장 인자 6, 섬유아세포 성장 인자 7, 섬유아세포 성장 인자 8, 섬유아세포 성장 인자 8b, 섬유아세포 성장 인자 8c, 섬유아세포 성장 인자 9, 섬유아세포 성장 인자 10, 산성 섬유아세포 성장 인자, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 신경교 세포주-유래 신경영양성 인자 수용체 α1, 신경교 세포주-유래 신경영양성 인자 수용체 α2, 성장 관련 단백질, 성장 관련 단백질 α, 성장 관련 단백질 β, 성장 관련 단백질 γ, 헤파린 결합 표피 성장 인자, 간세포 성장 인자 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 I, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 Ⅱ. 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, 케라티노사이트 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 백혈병 억제 인자 수용체 α, 신경 성장 인자, 신경 성장 인자 수용체, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 태반 성장 인자, 태반 성장 인자 2, 혈소판-유도 내피 세포 성장 인자, 혈소판 유도 성장 인자, 혈소판 유도 성장 인자 A 사슬, 혈소판 유도 성장 인자 AA, 혈소판 유도 성장 인자 AB, 혈소판 유도 성장 인자 B 사슬, 혈소판 유도 성장 인자 BB, 혈소판 유도 성장 인자 수용체 α, 혈소판 유도 성장 인자 β, 프리 -B 세포 성장 촉진 인자, 간세포 인자 수용체, TNF(TNFO, TNF1, TNF2 포함), 형질전환 성장 인자 α, 형질전환 성장 인자 β, 형질전환 성장 인자 β1, 형질전환 성장 인자 β1.2, 형질전환 성장 인자 β2, 형질전환 성장 인자 β3, 형질전환 성장 인자β5, 잠재적 형질전환 성장 인자 β1, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 I, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 Ⅱ, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 Ⅲ, 종양 괴사 인자 수용체 I 형, 종양 괴사 인자 수용체 Ⅱ 형, 우로키나제-형 플라스미노겐 활성화인자 수용체, 맥관 내피 성장 인자 및 키메라 단백질과 그것의 생물학적으로 활성인 단편 또는 면역학적으로 활성인 단편. 유효량의 가용성 포유동물 Mp1 수용체를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것도 유용할 것이며, 거핵구가 일단 성숙형이 되면 이 거핵구가 혈소판이 되는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 화합물을 투여(성숙한 거핵구의 수를 증가시키기 위하여)한 후에 가용성 Mp1 수용체를 투여(리간드를 불활성화시키고 혈소판을 생산하는 거핵구를 성숙시키기 위하여)하면 혈소판 생성을 자극하는 데 특히 효과적인 방법이 될 것으로 기대된다. 상기 언급된 투여량은 치료학적 조성물내에 다른 부가 성분을 보충함으로써 조절할 수 있다. 치료 환자의 경과는 통상적인 방법에 의해 모니터할 수 있다.

본 발명의 화합물이 혈소판 및/또는 거핵구와 그 관련 세포 조성물내로 부가될 경우에 그 양은 일반적으로 본 분야에 공지된 기술이나 분석에 의해 실험적으로 결정될 것이다. 보통은 10⁶세포 당 0.1 ㎍-1 ㎎ 의 본 화합물 범위이다.

특정 사항에 대한 본 발명의 지침을 기술하고 있는 본 출원은 본원에 기술되어 있는 내용을 바탕으로 본 분야의 숙련자들에게 인지될 것으로 여겨진다. 본 발명의 산물에 대한 예 및 그것의 대표적인 분리 방법, 이용 방법, 제조 방법은 하기하였다.

Ⅰ. 다음은 본원에 기술된 제 1 군의 화합물의 일부를 제조하는 방법을 예로 기술한 것이다.

Ａ. 물질 및 방법

펩티드 합성에 사용한 모든 아미노산 유도체(모든 L-구조) 및 수지는 노바바이오켐(Novabiochem)에서 구입하였다. 펩티드 합성 시약(DCC, HOBt 등)은 어플라이드 바이오시스템즈, 인코포레이티드(Applied Biosystems, Inc.)에서 용액 형태로 구입하였다. 두 PEG 유도체는 셰어워터 폴리머즈, 인코포레이티드(Shearwater Polymers, Inc.)에서 입수하였다. 모든 용매(디클로로메탄, N-메틸피롤리돈, 메탄올, 아세토니트릴)는 EM 사이언시즈에서 구입하였다. HPLC 분석은 바이닥 컬럼(Vydac column ; 0.46 cm × 25 cm, C18 역상, 5 mm)을 구비한 벡맨 시스템(Beckmen system)에 1 ㎖/분의 유속과 220 및 280 nm 에서의 UV 이중 검출로 실시하였다. 두 개의 이동상을 갖는 모든 HPLC 작동에는 선형 기울기를 사용하였다 : 완충액 A-H₂O(0.1 % TFA) 및 완충액 B-아세토니트릴(0.1 % TFA). 17b, 18, 19 및 20 과 같이 본원에 언급한 번호 매긴 펩티드는 표 1 과 관련하여 숫자화한 것이며, 이들 중 일부는 도 2 및 3 에 더 상세히 기술되어 있다.

펩티드 합성. 모든 펩티드는 널리 알려진 단계적 고체상 합성 방법으로 제조하였다. Fmoc 화학을 이용한 고체상 합성은 ABI 펩티드 합성기를 이용하여 실시하였다. 일반적으로, 펩티드 합성은 0.1 mmol 크기의 미리 적하된 왕 수지(Wang resin)로 시작한다. Fmoc 탈보호는 표준적인 피페리딘 프로토콜로 실시하였다. 결합은 DCC/HOBt를 이용하였다. 곁사슬 보호기는 다음과 같다 : Glu(O-t-Bu), Thr(t-Bu), Ang(Pbf), Gln(Trt), Trp(t-Boc) 및 Cys(Trt). 폴리에틸렌 글리콜화를 위한 제 1 펩티드 전구체의 경우, 링커상의 lys의 곁사슬 보호를 위해 Dde 를 사용하였고 최종적인 결합을 위해 Boc-Ile-OH를 사용하였다. 무수 히드라진(NMP 내 2 %, 3 × 2 분)을 이용하여 Dde 를 제거한 후 DCC 의 작용으로 미리 제조된 무수브롬아세트산과 결합시켰다. 펩티드 18 의 경우, 링커내 시스테인 곁사슬은 트리틸기에 의해 보호된다. 모든 펩티드-수지의 최종 탈보호 및 절단은 2.5 %H₂O, 0.5 % 페놀, 2.5 % 트리이소프로필실란 및 2.5 % 티오아니졸을 함유하는 트리플루오로아세트산(TFA)을 이용하여 실온에서 4 시간동안 이루어졌다. TFA 를 제거한 후, 절단된 펩티드를 차가운 무수에테르로 침전시켰다. 고리 펩티드의 이황화물 형성은H₂0 내 15 % DMSO(pH 7.5)를 이용하여 조물질(crude material) 상에서 직접 이루어졌다. 모든 비정제 펩티드는 조제적 역상 HPLC 에 의해 정제되었으며 구조는 ESI-MS 및 아미노산 분석에 의해 확인하였다.

택일적으로, 상기한 모든 펩티드는 t-Boc 화학에 의해서도 제조할 수 있다. 이 경우, 출발 수지는 전형적인 메리필드 수지 또는 팜 수지를 사용할 것이며 곁사슬 보호기는 다음과 같다 : Glu(OBzl), Thr(Bzl), Arg(Tos), Trp(CHO), Cys(p-MeBzl). 불화수소(HF)가 펩티드 수지의 최종 절단에 사용될 것이다.

천연 아미노산으로 구성된 링커를 갖는 본 연구의 모든 직렬 이량체 펩티드 또한 DNA 재조합 방법에 의해 제조할 수 있다.

폴리에틸렌 글리콜화. 신규하고 다양한 합성 펩티드의 폴리에틸렌 글리콜화 방법은 용액내에서 접합 결합을 형성함으로써 펩티드 및PEG 부분을 결합시키는 것으로, 이들 각각은 서로 상대방에 대하여 반응하는 특정 기능을 갖는다. 전구체 펩티드는 상기한 바와 같은 종래의 고체상 합성으로 용이하게 제조할 수 있다. 하기한 바와 같이, 이들 펩티드는 특정 부위에서 적당한 작용기로 "미리 활성화" 한다. 전구체를 PEG 부분과 반응시키기 전에 충분히 특정화한다. PEG 와 펩티드의 결합은 보통 수성상에서 일어나며 역상 HPLC 분석에 의해 용이하게 분석할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜화된 펩티드는 조제적 HPLC 분석에 의해 용이하게 분석할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜화된 펩티드는 조제적 HPLC 분석, 아미노산 분석 및 레이저 탈착 질량 분광광도측정법에 의해 특정화할 수 있다.

펩티드 19 의 제조. 펩티드 17b(12 ㎎) 및 MeO-PEG-SH5000(30 ㎎, 2 당량)을 1 ㎖의 수성 완충액(pH 8)에 녹였다. 혼합물을 실온에서 30 분간 항온하였고, 반응의 > 80 % 가 진행되었음을 HPLC 분석으로 확인하였다. 폴리에틸렌 글리콜화물은 조제적 HPLC 로 분리하였다.

펩티드 20 의 제조. 펩티드 18(14 mg) 및 MeO-PEG-말레이미드 (25 ㎎)을 약 1.5 ㎖ 의 수성 완충액(pH 8)에 용해시켰다. 혼합물은 실온에서 약 30 분간 항온하였고 이 때에 ~ 70 % 의 형질전환이 이루어졌는데, 이것은 HPLC 컬럼에 시료의 분취량을 가함으로써 HPLC 분석으로 확인하였다. 폴리에틸렌 글리콜화물은 조제적 HPLC 로 정제하였다.

생활성도 검정. 시험관내 TPO 생검정은 인체 mpl 수용체로 형질감염시킨 마우스 32D 세포의 IL-3 의존성 클론을 이용한 유사분열촉진 검정이다. 이 검정은 WO 95/26746 에 보다 상세히 기술되어 있다. 세포는 10 % 태아 클론 Ⅱ 및 1 ng/㎖ 의 mIL-3 을 함유하는 MEM 배지에 보관한다. 시료를 부가하기 전에, mIL-3 가 결핍된 성장 배지로 2 회 세척하여 세포를 준비한다. 넓은 12 지점의 TPO 표준 곡선을 33 내지 39 pg/ml 에 걸쳐 나타내었다. 표준 곡선의 선형부에 속하는 것으로 추정되는 네 희석물(100 내지 125 pg/ml)을 각 시료에 대하여 제조하고 삼중으로 런닝시킨다. 부피 100㎕ 씩의 각 시료 희석물 또는 대조를 10,000 세포/웰을 함유하는 96 웰 미량역가 평판 중 적당한 웰에 가한다. 37。C 및 10 % CO₂에서 44 시간 경과 후에, MTS (세포에 의해 포르마잔으로 생환원되는 테트라졸륨 화합물)를 각 웰에 가한다. 대략 6 시간 후에, 490 nm 에서 평판 해독기로 흡광도를 측정한다. 투여량 반응 곡선(로그 TPO 농도 대 O.D. - 백 그라운드)을 만들고 표준 곡선의 선형부에 속하는 지점의 선형 회귀 분석을 실시하였다. 미지의 실험 시료 농도는 결과적인 선형 방정식 및 희석 인자의 보정을 이용하여 결정한다.

약어. HPLC : 고성능 액체 크로마토그래피 ; ESI-MS : 전자 스프레이 이온화 질량 분광광도측정법 ; MALDI-MS : 기질-관련 레이저 탈착 이온화 질량 분광광도측정법 ; PEG : 폴리 (에틸렌 글리콜). 모든 아미노산은 표준 세문자 코드 또는 한 문자 코드로 표시한다. t-Boc : 3 차 부톡시카르보닐 ; tBu : 3 차 부틸 ; Bzl : 벤질 ; DCC : 디시클로헥실카르보디이미드 ; HOBt : 1-히드록시벤조트리아졸 ; NMP : N-메틸-2-피롤리딘온 ; Pbf : 2,2,4,6,7-펜다메틸디히드로-벤조푸란-5-술포닐 ; Trt : 트리틸 ; Dde : 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소-시클로헥실리덴) 에틸.

Ｂ. 결 과

폴리글리신 링커를 이용하여 제조한 TMP 직렬 이량체. 순차적으로 결합된 TMP 이량체는 TMP 이량체 형태가 c-Mp1 (TPO 수용체)와의 효과적인 상호작용에 필수적이며 수용체 항목에 있는 수용체들이 서로 어떻게 꼬이느냐에 따라 두 TMP 분자가 구형의 이량체 입체형태를 변화시키지 않는 방법으로 C- 내지 N-말단 입체형태에서 서로 결합한다는 가정을 근거로 제조하였다. 직렬로 결합된 이량체의 활성도는 순서대로 정렬된 두 TMP 단량체의 C-말단 및 N-말단을 연결하는 링커 조성물 및 길이를 알맞게 선택해야 한다. c-Mp1 에 결합하는 TMP 의 구조에 관한 정보가 없기 때문에, 0 내지 10 으로 구성된 링커와 일련의 이량체펩티드 및 14 개의 글리신 잔기(표 1)를 합성하였다. 글리신은 그것의 간단성과 가요성 때문에 선택하였다. 가요성 폴리글리신 펩티드 사슬로 인해 필요한 입체형태에서 두 개의 결합된 TMP 반복체가 자유자재로 접힐 수 있는 반면, 입체적으로 보다 장애가 있는 아미노산 서열은 강성이 높아 수용체내 이량형 펩티드의 올바른 팩킹을 방해하는 바람직하지 못한 이차 구조를 가질 것이다.

결과적인 펩티드는 Fmoc 또는 t-Boc 화학 중 하나를 이용하여 통상적인 고체상 펩티드 합성 방법 [Merrifield, R.B., Journal of the American Chemical Society 85 : 2149 (1963) 참조] 에 의해 용이하게 입수할 수 있다. 위대칭 방식으로 두 개의 펩티드 사슬을 제작하기 위해 직각으로 보호되는 리신 잔기를 개시 가지점으로 이용하는 C-말단 결합 평행 이량체 (SEQ ID NO : 2) 를 합성하는 것과는 달리 [Cwirla, S. E. 등의 Science 276 : 1696 - 1699 (1997) 참조], 본 발명의 직렬 이량체는 간단하게 합성될 뿐 아니라 C-말단에서 N-말단으로의 연속적인 펩티드 사슬의 조립으로 단계적으로 합성된다. TMP 의 이량체화는 C-말단 이량체에서 보여지는 바와 같이 결합 친화성 보다 증식 활성에 있어서 극적인 효과를 갖기 때문에 [Cwirla, S. E. 등의, Science 276 : 1696 - 1699 (1997) 참조], 전체 길이의 c-Mp1 으로 형질감염시킨 마우스 32D 세포의 IL-3 의존성 클론을 이용한 TPO-의존 세포-증식 검정으로 합성 펩티드의 생물학적활성도를 직접 실험하였다 [Palacios, R. 등의 Cell 41 : 727 (1985) 참조]. 실험 결과(하기 표 1 참조)에 나타나 있는 바와 같이, 폴리글리신 결합 직렬 이량체 모두는 단량체에 비해 ＞1000 배의 효능 증가를 보였고, 이러한 세포 증식 검정에서 C-말단 이량체보다도 더 효능이 뛰어났다. 본 검정의 C-말단 이량체의 절대 활성도는 천연 TPO 단백질의 활성도보다 낮았으며, 이는 C-말단 이량체가 천연 리간드만큼 활성적인 것으로 앞서 보고된 것과는 차이가 있다 [Cwirla, S. E. 등의 Science 276 : 1696 - 1699 (1997) 참조]. 이것은 두 검정에 사용된 조건의 차이에서 기인한 것일 수 있다. 그러나, 동일한 검정에서 두 번째 단량체의 N-말단이 첫 번째 단량체의 C-말단과 결합하는 직렬 이량체 및 두 번째 단량체의 C-말단이 첫 번째 단량체의 C-말단과 결합하는 평행 이량체 간의 활성도 차이는 평행 이량체 산물에 비해 직렬 이량체 산물이 월등하다는 사실이 분명히 입증되었다. 광범위한 길이가 링커에 허용된다는 점 또한 흥미롭다. 선택된 TMP 단량체 (SEQ ID NO : 1)에 적합한 링커는 분명 8 개의 글리신으로 이루어져 있다.

그외의 직렬 이량체. 상기 TMP 직렬 이량체에 이어, 단량체 자체 내에 변이를 포함하거나 다른 링커를 갖는 수 개의 다른 분자들을 제조하였다. 이들 분자 중 첫 번째인 펩티드 13 은 B-턴 형태의 2 차 구조를 이루는 성향이 높은 것으로 알려진 서열인 GPNG 로 구성된링커를 갖는다. 단량체보다 효능이 약 100-배 높기는 하나, 이 펩티드는 GGGG-결합 유사체보다 ＞10-배 낮은 것으로 나타났다. 따라서, 링커 부위에 상대적으로 견고한 B-턴을 도입하면 이러한 짧은 링커 형태에 최적의 작동물질 입체형태의 약간의 뒤틀림이 유발된다.

TMP 서열내 Trp9 는 무작위 펩티드 라이브러리로부터 분리한 활성 펩티드에서 매우 보존된 잔기이다. EPO 유사 펩티드의 컨센서스 서열에도 Trp 가 잘 보존되어 있으며, 이 Trp 잔기는 두 EPO 유사 펩티드 (EMP) 간의 소수성 코어 형성에 관계하며 EPO 수용체와의 소수성 상호작용에 기여하는 것으로 나타났다[Livnah, O. 등의 Science 273 : 464 - 471 (1996) 참조]. 유사성에 의해, TMP 내 Trp9 잔기는 펩티드 리간드의 이량체화에서의 역할과 유사한 역할을 할 것이며, 두 개의 인돌 고리에 의해 발휘되는 비공유적 소수성 힘의 효과를 조절하고 측정하기 위해, Trp 위치를 돌연변이시킨 수 개의 유사체를 제조하였다. 따라서, 펩티드 14 의 경우에 두 TMP 단량체 각각의 Trp 잔기를 Cys 로 치환하고 산화에 의해 두 시스테인 간에 분자내 이황화물 결합이 형성되며, 분자내 이황화물 결합이 펩티드 이량체화시 두 Trp 잔기 간의 소수성 상호작용과 유사할 것으로 여겨진다. 펩티드 15 는 펩티드 14 로부터 환원된다. 펩티드 16 의 경우, 두 Trp 잔기는 Ala 에 의해 치환되었다. 분석 데이터에 나타나 있는 바와 같이, 세 유사체 모두 불활성이었다.이들 데이터는 또한 Trp 가 이량체 형성에 대해서가 아니라 TPO 유사 펩티드 활성에 중요함을 입증하였다.

다음의 두 펩티드(펩티드 17a 및 18) 각각은 8-아미노산 링커, Lys 또는 Cys 잔기를 내포한다. 이들 두 화합물은 폴리에틸렌 글리콜화된 두 펩티드(펩티드 19 및 20)의 전구체로서, Lys 또는 Cys 의 곁사슬은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 부분에 의해 변이된다. 거대 PEG 성분(5 kDa)이 펩티드 분자내 중요 결합 부위에서 충분히 떨어져 위치하도록 하기 위해, 상대적으로 긴 링커 중앙에 PEG 부분을 도입하기로 하였다. PEG 는 펩티드 및 단백질-기제 치료제의 약물동력학적 프로필을 향상시키기 위해 공유결합 변성제로 널리 이용되는 공지된 생적합성 중합체이다.

모듈한 용액 기제 방법은 합성 펩티드나 제조합 펩티드를 폴리에틸렌 글리콜화하기에 용이하도록 고안하였다. 이 방법은 한 쌍의 상호 반응성인 작용기 간의 특정 반응을 이용하는, 현재 잘 알려진 화학선택적 결합 방법에 기초한 것이다. 따라서, 폴리에틸렌 글리콜화된 19 의 경우에는 리신 곁사슬을 브로모아세틸기로 미리 활성화하여 티올-이량체화된 PEG 와의 반응을 일으키는 펩티드 17b 를 생성한다. 리신 ε-아민 보호를 위해 직교 보호기인 Dde 를 사용하였다. 일단 모든 펩티드 사슬이 조립되면, N-말단 아민은 t-Boc 로 재보호되었다. 그런 다음 브로모아세틸화를 위해 Dde 를 제거하였다. 이 방법으로 종래의 역상 HPLC 를 사용하여 용이하게 정제한 양질의 비정제 펩티드를 수득하였다. 티올-변이 PEG 와 펩티드의 결합은 pH 8 의 수성 완충액에서 일어났으며, 반응은 30 분 이내에 완결되었다. 폴리에틸렌 글리콜화된 정제 물질의 MALDI-MS 분석으로 인접한 피크 간에 44 Da 의 증가를 보이는 특징적인 벨 모양의 스펙트럼을 밝혀내었다. PEG-펩티드 20 의 경우, 시스테인 잔기를 링커 부위에 두고 그것의 곁사슬 티올기를 말레이미드-함유 PEG 에 대한 부착 부위로 사용하였다. 이 펩티드의 폴리에틸렌 글리콜화에 유사한 조건을 사용하였다. 분석 데이터에서 밝혀진 바와 같이, 이들 폴리에틸렌 글리콜화된 두 펩티드는 폴리에틸렌 글리콜화되지 않은 펩티드에 비해 상당히 높은 시험관내 활성도를 보였다.

펩티드 21 은 그것의 8-아미노산 링커내에 잠재적인 글리코실화 모티프, NGS 를 갖는다. 전형적인 직렬 이량체가 펩티드 결합에 의해 결합된 천연 아미노산으로 구성되므로, 적당한 진핵 세포계에서 이러한 분자가 발현하여 Asn 의 곁사슬 카르복시아미드에 부가되는 탄수화물 부분과 글리코펩티드를 생산할 것이다. 글리코실화는 단백질의 수성 안정성 및 생체내 안정성을 향상시킴으로써 주어진 단백질의 생물학적 활성도에대해 다수의 양성 영향을 미칠 수 있는 일반적인 번역후 변형이다. 분석 데이터에서 알 수 있는 바와 같이, 링커 내로 삽입되는 글리코실화 모티프는 높은 생물학적 활성도를 유지하였다. 잠재적 글리코펩티드의 합성 전구체는 -(Gly)₈- 결합 유사체의 활성도에 필적하는 활성도를 나타냈다. 일단 글리코실화되면, PEG 와 탄수화물 부분이 나타내는 유사한 물리화학적 성질로 인해 이 펩티드는 폴리에틸렌 글리콜화된 펩티드와 동일한 정도의 활성도를 가질 것으로 기대된다.

최종 펩티드는 이량체의 이량체이다. 이것은 산화된 펩티드 18 에 의해 제조되며, 링커에 위치한 두 시스테인 잔기 사이에 분자간 이황화물 결합을 형성하였다. 이 펩티드는 TMP 가 사량체로서 활성일 가능성을 갖도록 제조하였다. 이 펩티드가 조절된 몰 기저에 대하여 평균 직렬 이량체보다 활성적이지 않은 것으로 데이터에 나타났으며, 이는 TMP 의 활성형이 실제로 이량체라는 생각을 간접적으로 뒷받침하는 것으로, 만약 그렇지 않다면, 직렬 이량체의 이량체화가 생물학적 활성도에 다른 영향을 미칠 것이다.

하기 표 I 은 하기 시험관내 분석을 근거로 한 EC₅₀과 관련하여 하기 화합물의 상대적 활성도를 요약한 것이다.

주의 : 표 1 의 숫자는 약 1 로그의 활성도를 나타내므로, "1" 과 "4" 의 활성도 차이는 약 1000-배이다. 0.5 의 증가는 중간점이므로, "1" 과 "3.5" 의 활성도 차이는 약 500-배이다. "ND" 는 측정되지 않았음을 의미한다.

Ⅱ. 본원에 기술한 제 2 군의 화합물을 제조하는 방법의 예를 하기하였다.

Ａ. 도 6C 에 나타나 있는 Fc 융합 화합물의 제조.

TPO-유사 펩티드 (SEQ ID NO : 34)의 이량체의 프레임 내에 융합시킨 인체 IgG1 의 Fc 부위를 코드하는 DNA 서열을, 1uxPR 프로모터의 조절하에 하기 플라스미드 발현 벡터 pAMG21 에 삽입하였다.

표준적인 PCR 기술을 이용하여 융합 유전자를 구성하였다. PCR 반응의 주형으로는 SEQ ID NO : 34 의 화합물의 잔여물을 코드하는 합성 유전자 및 Fc 서열을 함유하는 융합 벡터이다. 하기한 4 중복 올리고누클레오티드로부터 합성 유전자를 구성하였다 :

하기와 같은 이중쇄를 형성하기 위하여 4 올리고누클레오티드를 어닐링하였다.

이 이중쇄는 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머로서 1830 - 52 및 1830 - 55 를 이용한 PCR 반응으로 증폭하였다.

분자의 Fc 부분은 하기 프라이머와 Fc DNA 를 이용한 PCR 반응으로 제조하였다 :

올리고누클레오티드 1830 - 51 및 1830 - 52 는 24 누클레오티드 중복을 포함하며, 이것으로 인해 외부 프라이머 1216 - 52 및 1830 - 55 를 이용한 세 번째 반응에서 상기 PCR 산물을 결합시킴으로써 리딩 프레임내로 두 유전자가 정확하게 융합된다.

최종적인 PCR 유전자 산물(전체 길이의 융합 유전자)을 제한 엔도누클레아제 XbaI 및 BamHI 으로 절단한 다음, 역시 XbaI 및 BamHI 으로 절단한 벡터 pAMG21(하기 참조) 내로 결합시켰다. 결합된 DNA 를 E.coli 균주 2596(GM221, 하기 참조) 숙주 세포 내로 형질전환시켰다. 재조합 단백질 산물을 생산하는 능력 및 올바른 누클레오티드 서열을 갖는 유전자 융합체를 갖는 지에 대해 클론을 스크리닝하였다. 단백질 발현량은 50 ㎖ 의 진탕기 플라스크 실험으로 측정하였다. 쿠마지에 염색 PAGE 겔을 통해 전세포 용해물의 융합체 발현을 분석하였다.

융합 단백질의 아미노산 서열은 하기 상응 누클레오티드 서열에 나타나 있다 :

pAMG21

발현 플라스미드 pAMG21 은 1996년 7월 24일자, 수탁 번호 제 98113 호로 ATCC 에 기탁되었다.

GM221(암젠 숙주 균주 #2596)

암젠 숙주 균주 #2596 은 초기ebg부위내 온도 민감성 람다 리프레서 cI857s7 및 후기ebg부위(68 분) 내 lacI^Q리프레서 둘다를 함유하도록 변이시킨 E.coli K-12 균주이다. 이들 두 리프레서 유전자가 존재함으로써 이 숙주를 다양한 발현계로 이용할 수 있으나, 이들 리프레서 모두 luxP_R의 발현에는 부적절하다. 형질전환되지 않은 숙주는 항생제에 대한 내성을 갖지 않는다.

cI857s7 유전자의 리보솜 결합 부위는 증진된 RBS 를 포함하도록 변형시켰다. 이 결합 부위는 진뱅크 수탁 번호 M64441 Gb_-Ba 에서 번호매긴 바에 따라ebg개재 서열을 결실시킨 채로 누클레오티드 위치 1170 및 1411 사이의ebg오페론 내로 삽입하였다.

구성물은 MMebg-cI857s7 증진 RBS #4 로 명명된 재조합 파아지를 이용하여 F'tet/393 내 염색체로 운반되었다. 재조합 및 분해 후에,하기 염색체 삽입물만이 세포에 남게 하였다. 이것을 다시 F'tet/GM101 이라 명명하였다.

진뱅크 수탁 번호 M64441Gb_-Ba 에서 번호매긴 바에 따라ebg개재 서열을 결실시킨 채로 누클레오티드 위치 2493 및 2937 사이의ebg오페론 내로 lacI^Q구성물을 운반함으로써 F'tet/GM101 을 변이시켰다.

구성물은 AGebg-LacIQ#5 로 명명된 재조합 파아지를 이용하여 F'tet/GM101 내 염색체로 운반되었다. 재조합 및 분해 후에, 하기 염색체 삽입물만을 세포에 남겨 두었다. 이것을 다시 F'tet/GM221 이라 명명하였다. 25 ㎍/ml 농도의 LB 에서 아크리딘 오렌지를 이용하여 균주로부터 F'tet 에피좀을 처리하였다. 처리된 균주의 테트라사이클린 민감성을 확인한 다음 GM221 로 보관하였다.

숙주 균주 GM221 내에 순서대로 내포되어 있는, 플라스미드 pAMG21 내 Fc 융합 구성물(본원에서는 pAMG21-Fc-TMP-TMP 로 언급함) 은 1998년 10월 22일자, 기탁 번호 제 98957 호로 ATCC 에 기탁되었다.

발현. 유도 전, 50 ㎍/㎖ 의 카나마이신을 함유하는 루리아 육즙 배지에서 E.coli GM221 내 pAMG21-Fc-TMP-TMP 를 37。C 에서 배양하였다. 배양 배지에 최종 농도가 20 ng/㎖ 가 되도록 합성 자가유도제로 N-(3-옥소헥사노일)-DL-호모세린 락톤을 가한 후 luxPR 프로모터에 의해 발현되는 Fc-TMP-TMP 유전자 산물을 유도한 다음, 이 배양액을 37。C 에서 3 시간 더 배양하였다. 3 시간 후, 현미경으로 박테리아 배양액 내에 봉입체가 존재하는 지를 검사한 다음 원심분리를 통해 수확하였다. 유도 배양액에서 광굴절 봉입체가 관찰되었으며, 이것은 Fc-TMP-TMP 가 E. coli 의 불용성 분획에서 생산되는 것이 가장 적당함을 나타내는 것이다. 10 % β-머캅토 에탄올을 함유하는 라엠리 시료 완충액에 재현탁시킴으로써 세포 펠렛을 직접 용균시키고 SDS-PAGE 에 의해 분석하였다. 대략 30 kDa 의 강한 쿠마지에 염색 밴드가 SDS-PAGE 겔에서 관찰되었다. 추정되는 유전자 산물의 길이는 269 아미노산일 것이며, 분자량은 약 29.5 kDa 일 것이다. 발효는 10 L 규모의 표준적인 회분 배양 조건하에서 실시하였으며, 벤치 규모에서 수득되는 발현량과 유사한 양의 Fc-TMP-TMP 가 발현되었다.

Fc-TMP-TMP 의 정제

고압 균질화(14,000 PSI 로 2 회)로 물(1/10)에서 세포를 파쇄한 후 원심분리(J-6B 에서 1 시간 동안 4200 RPM)에 의해 봉입체를 수확하였다.6 M 구아니딘, 50 mM 트리스, 8 mM DTT, pH 8.7 에서 1 시간 동안 1/10 비율로 봉입체를 용해하였다. 용해된 혼합물을 2 M 요소, 50 mM 트리스, 160 mM 아르기닌, 3 mM 시스테인, pH 8.5 에 20 배 희석하였다. 혼합물을 차게 하여 밤새 교반하였다. 이 시점에서 Fc-TMP-TMP 단량체 소단위체를 이량체화하여 도 6C 의 구조를 갖는 이황화물-결합 화합물을 형성하였고, 한외거르기에 의해 약 10 배 농축하였다. 그런 다음 10 mM 트리스, 1.5 M 요소, pH 9 로 3 배 희석하였다. 이 혼합물의 pH 는 아세트산으로 pH 5 로 맞추었다. 원심분리에 의해 침전물을 제거한 후, 20 mM NaAc, 100 mM NaCl, pH 5 로 평형화한 SP-세파로스 패스트 플로우 컬럼에 상청액을 적하하였다(실온에서 10 ㎎/㎖ 씩 단백질 적하). 100 mM NaCl 내지 500 mM NaCl 범위의 기울기로 20 컬럼 부피의 동일 완충액을 이용하여 단백질을 용리하였다. 컬럼에서 수득한 풀을 3 배 희석하고, 20 mM NaAc, 150 mM NaCl, pH 5 로 평형화한 SP-세파로스 HP 컬럼에 적하하였다(실온에서 10 ㎎/㎖ 씩 단백질 적하). 150 mM NaCl 내지 400 mM NaCl 범위의 기울기로 20 컬럼 부피의 동일 완충액을 이용하여 단백질을 용리하였다. 피크를 풀링하고 여과하였다.

Ⅲ. 본 발명의 다양한 화합물을 이용한 마우스의 생체내 데이터를 하기에 요약하였다.

마우스. 생후 대략 10 - 12 주된 정상적인 암컷 BDF1.

채혈 계획. 군 당 10 마리씩의 치료 0 일째에, 군 당 총 20 마리의 마우스에 해당하는 두 군은 4 일 차이를 두고 시작하였다. 각 시점에서 다섯 마리의 마우스를 출혈시키고, 1 주에 최소한 3 회씩 출혈시켰다. 이소플루란으로 마우스를 마취하고 총 140 - 160 ㎕ 부피의 혈액을 안와동 천자로 수득하였다. 혈액은 마우스 혈액용 소프트웨어를 가동시켜 테크니콘 HIE 혈액 분석기로 계수하였다. 측정된 파라미터는 백혈구 세포, 적혈구 세포, 헤마토크리트, 헤모글로빈, 혈소판, 호중구였다.

치료. 농축괴 치료를 위해 마우스에게 피하 투여하거나 지속적인 수송을 위해 마이크로-삼투 펌프를 7 일간 꽂아 두었다. 0.2 ㎖ 의 부피로 피하 투여하였다. 마취한 마우스의 견갑골 사이에 피하 절개된 피부에 삼투 펌프를 삽입하였다. 0.1 % BSA 를 함유하는 PBS 에 화합물을 희석하였다. 모든 실험은 이 희석물만으로 처리한 대조군을 포함하며, "담체" 로 표시하였다. 펌프의 유속을 나타내는 눈금을 그래프에 나타나 있는 치료량으로 표시하였고 펌프내 실험 항목들의 농도를 맞추었다.

화합물. 화합물의 적정 투여량은 7 일간의 마이크로-삼투 펌프로 마우스에게 수송되었다. 7 일 삼투 펌프에 의해 100 ㎍/㎏ 씩의 여러 화합물로 마우스를 처리하였다. 동일한 화합물 중 일부를 단일 농축괴 주입으로 마우스에게 투여하였다.

활성도 실험 결과. 활성도 실험 결과는 도 4 및 도 5 에 나타나 있다. 7-일 마이크로 삼투 펌프를 이용한 투여량 반응 검정에 있어서(데이터는 나타나 있지 않음), SEQ ID NO : 18 의 화합물이 나타내는 최대 효과는 100 ㎍/㎏/일에서였으며 ; 10 ㎍/㎏/일의 투여량은 최대 활성도의 약 50 % 를 나타냈고 ; 1 ㎍/㎏/일의 투여량은 이 검정계가 나타내는 활성도 중 가장 낮은 활성도를 보였다. 10 ㎍/㎏/일 투여량의 화합물은 본 실험에서 100 ㎍/㎏/일의 폴리에틸렌 글리콜화되지 않은 rHu-MGDF 와 거의 동일한 활성도를 보였다.

Ⅳ.토론

MGDF 는 인체 성장 호르몬(hGH)과 유사한 방식으로 작용하는 것으로 널리 알려져 있다. 즉, 단백질 리간드의 한 분자는 활성화를 위해 수용체의 두 분자와 결합한다[Wells, J.A. 등의 Ann. Rev. Biochem. 65 : 609 - 634 (1996) 참조]. 이러한 상호작용은 보다 작은 TMP 펩티드의작용과 유사한 것이다. 그러나 본 연구는, C-C 평행 방식 또는 C-N 순차 방식 중 하나로 TMP 를 공유 이량체화함으로써 10³이상의 인자에 의해 원래의 단량체의 시험관내 생물학적 효능이 증가되므로, 이러한 모방에는 두 TMP 분자의 협동 작용이 필요함을 시사하고 있다. 상대적으로 낮은 단량체의 생물학적 효능은 비공유 이량체의 비효율적인 형성에서 기인하는 것일 것이다. 제조된 공유 이량체는 작은 14-잔기 펩티드 두 분자 간의 약하고 비공유적인 상호작용에 의해 독점적으로 조절되는 비공유 이량체 형성에 대한 엔트로피 장벽을 제거하는 능력을 갖는다.

직렬 이량체의 대부분이 C-말단 평행 이량체보다 더 효능이 있음을 주목해야 한다. 직렬 이량체화는 C-C 평행 이량체화보다 더 알맞은 입체형태를 갖는 분자를 제공할 것이다. 직렬 이량체의 표면적인 비대칭적 특징은 비대칭 분자로서 두 개의 동일한 수용체 분자를 결합시키기 위해 상이한 두 부위를 사용하는 천연 리간드와 보다 더 가깝게 할 것이다.

PEG 부분을 도입하면 단백질 가수분해되는 것을 막고 신장 여과를 통한 청소율을 감소시킴으로써 변이 펩티드의 생체내 활성도를 증진시킬것으로 여겨졌다. 세포-기저 증식 검정에서 폴리에틸렌 글리콜화가 직렬 이량체화된 TMP 펩티드의 시험관내 생물학적 활성도를 더 증가시킬 것으로는 기대하지 않았다.

Ⅴ. 본 발명의 여러 화합물을 원숭이에게 이용하여 수득한 생체내 데이터를 하기에 요약하였다.

피하 투여를 통한 AMP2 투여와 관련하여 암컷의 Rh 원숭이에 대한 조직학적 파라미터를 측정하기 위해, 다음 프로토콜을 계획하여 실시하였다. 세 마리씩 다섯 군으로 나누었다. 제 1 군은 대조로서 AMP2 및 폴리에틸렌 글리콜화된 재조합 인체 MGDF(PEG-rHuMGDF) 둘다 함유하지 않는 아세트산 완충액(20 mM 아세트산나트륨, 0.25 M 염화나트륨, pH 5)을 투여하였다. 제 2 군은 하기에 나타낸 간격을 두고 1 또는 그 이상 AMP2 를 투여하였다 ; 제 3 군은 하기에 나타낸 간격을 두고 1000 ㎍/㎏ 의 AMP2 를 투여하였다 ; 제 4 군은 하기에 나타낸 간격을 두고 5000 ㎍/㎏ 의 AMP2 를 투여하였다 ; 제 5 군은 하기에 나타낸 간격을 두고 100 ㎍/㎏ 의 PEG-rHuMGDF 를 투여하였다.

1 회 투여량을 처음으로 투여한 날을 1 주기의 0 일로 정하였다. 2 주기의 투여는 21, 23, 25, 28, 30, 32 일에 이루어졌다. 3 주기 중에 1 회 투여는 84 일에 이루어졌고, 4 주기에는 123 일에 투여되었다. 동물은 새로운 환경 적응기에는 1 일 1 회, 투여일에는 1 일 3 회(투여 전, 투여 직후 30 분, 투여 후 2 내지 3 시간), 비투여일에는 1 일 1 회씩 임상 징후를 보였다. 음식물 소비량은 투여 시작 7 일전부터 회복기 말까지 각 동물에게 제공된 음식물의 양과 남겨진 양을 근거로 매일 측정하였다. 각 동물의 체중은 투여 섭생 전 2 회, 투여중 2 회 및 회복기에 측정하였다. 조직으로부터의 채혈은 투여 시작 전에 1 회, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 20, 22, 24, 26, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 55, 62, 69, 76, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 111, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 150 일에 1 회 이루어졌다. 약물동력학적 분석을 위해 투여전 1 회 및 투여후 1, 4, 24 시간째에 1 회씩 0.5 ㎖ 의 혈청 시료를 취하였다. 시료는 0, 21, 32, 84, 123 일째에 취하여 분석에 이용할 때까지 약 ­70。C 에 저장하였다. 항체 분석을 위하여, 1 회 투여 1 주전 및 0 일(투여전), 6, 13, 20, 27, 34, 41, 48, 55, 62, 69, 76, 83, 90, 97, 104, 111, 118, 129, 136, 143 및 150 일에 1 회씩 2 ㎖ 의 혈액 시료를 모았다. 시료는 분석에 사용할 때까지 ­70。C 에 보관하였다.

혈소판 수준은 PEG-rHuMGDF 에서 가장 큰 폭의 증가를 나타낸 모든 치료군 및 고투여량의 AMP2 군에서 증가한 것으로 나타났다. 1 주기에서 혈소판 피크 수준은 PEG-rHuMGDF 군(9 일) 및 5000 ㎍/㎏ 의 AMP2 군(9 일)에서 대조군의 평균 혈소판 수에 비해 각각 약 3.3 배 및 3.1 배씩 증가하였다. 저투여량의 AMP2 혈소판 수준은 동일한 특정일에 대조보다 약 1.5 배 증가하였다.

그러나, 4 주기에서 PEG-rHuMGDF 군은 전 주기에서 만큼의 혈소판 수 증가를 나타내지 못했다. PEG-rHuMGDF 군은 본 주기의 투여 후 9일에 대조군보다 약 2 배의 혈소판 수 증가를 보였다. 4 주기 중 최고 투여량의 AMP2 군의 평균 혈소판 수는 대조군보다 3.3 배 높았다. 또한 PEG-rHuMGDF 투여 동물은 4 주기 시작 지점(투여량 당)에서 대조군의 평균 혈소판 수보다 53 % 낮은 평균 혈소판 수를 보였으며, 4 주기의 말기(투여 후 27 일)에 각 군의 평균 혈소판 수는 대조군보다 79 % 낮았다. 모든 AMP2 동물의 경우, 4 주기의 초기 및 말기에 평균 혈소판 수가 대조군의 혈소판 수의 ±15 % 였다.

1 주기 및 2 주기에, 적혈구 세포(RBC) 수가 모든 치료군에서 대조에 비해 감소하는 추세로 나타났다. 감소 추세는 41 일 내지 43 일에 가장 명백히 나타났다. 적혈구 수는 47 일에 빠른 속도로 정상 수준으로 회복되기 시작했다(대조와 비교하여). 1 주기 및 2 주기 중에, 백혈구 세포(WBC)의 양은 35 일의 대조에 비해 상당히 증가하였다(2.6 배). 33 일에 5000 ㎍/㎏ 의 APM2 군에서는 근소한 증가를 보였다. 37 일에는 정상(대조) 수준으로 회복되기 시작하였다. 모든 치료군의 4 주기에서 명백한 WBC 변화를 보이지 않는 것과 유사한 반응이 3 주기에서 나타났다.

3 주기 중에, 13 일까지는(3 주기 단일 투여 후) 500 ㎍/㎏ 의 AMP2 군 을 제외한 모든 치료군에서 RBC 수가 약간씩 감소하였다. RBC 값은 17 일째에 대조에 비해 정상 수준을 회복하기 시작했다.

4 주기에, 모든 치료군의 RBC 수는 500 ㎍/㎏ 의 AMP2 군을 제외하고는 대조에 비해 감소하였다. 다른 주기와는 달리, 본 주기에는 하나 이상의 최저점이 존재하였다. 이러한 감소는 투여후 1 - 9 일부터 확실히 나타났으며, 11 일에 빠른 속도로 회복되기 시작하였다.

실험 결과, 실험한 모든 주기에서 모든 치료 동물에 대하여 투여후 7 일 내지 9 일에 대조 동물의 혈소판 수 증가 이상의 증가가 검출되었다. 반복적인 투여로 1 회 투여에 비해 보다 높은 혈소판 생산 반응이 유도된 것으로 나타났다. 4 주기에는, PEG-rHuMGDF 군에 의해 유도되는 혈소판 반응이 이전 주기 및 고투여량의 AMP2 반응에 비해 낮았다. RBC 수의 감소는 각 실험 주기 중의 일부 지점에서 대부분의 치료군에 대한 1, 2, 3, 4 주기에서 나타났으나, 모든 혈액학적 파라미터는 투여 중지 후 정상 수준(대조에 비해)으로 회복되었다.

이러한 결과는 전반적으로 AMP2 치료가 Rh 원숭이에 대해 매우 내성이며, AMP2 가 여러 치료 주기 후에 혈소판 수를 증가시켰음을 나타냈다. 혈소판 수를 근거로, AMP2 에 대한 생물학적으로 중요한 면역-매개 반응이 존재하는 지는 분명하지 않았다. 반대로, PEG-rHuMGDF 를 이용한 여러 주기의 치료에서 4 주기까지는 혈소판 반응 저해를 보이지 않았는데, 이것은 PEG-rHuMGDF 에 대한 항체가 생성되었으며 이들 항-MGDF 항체는 내생 Rh TPO 와 교차반응함을 시사하는 것이다.

본 발명을 상세히 기술하였으나, 본원에 기술된 발명의 범주 및 양상에서 벗어남이 없는 범위 내에서 다수의 변형이나 변이가 이루어질 수 있음은 본 분야의 숙련자들에게 자명할 것이다.

본 발명에서 보호받고자 하는 독점성 또는 권리를 하기 하였다.

Claims (34)

1. 다음과 같은 구조를 포함하며 mp1 수용체에 결합하는 화합물 및 생리학적으로 용인가능한 그의 염 :

   TMP₁-(L₁)_n-TMP₂

   여기에서 TMP₁및 TMP₂는

   X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀

   를 포함하는 코어 화합물의 군에서 각각 독립적으로 선택한 것이며:

   여기에서,

   X₂는 Glu, Asp, Lys 및 Val 중에서 선택한 것이고 ;

   X₃은 Gly 및 Ala 중에서 선택한 것이고 ;

   X₄는 Pro 이며 ;

   X₅는 Thr 및 Ser 중에서 선택한 것이고 ;

   X₆은 Leu, Ile, Val, Ala 및 Phe 중에서 선택한 것이고 ;

   X₇은 Arg 및 Lys 중에서 선택한 것이고 ;

   X₈은 Gln, Asn 및 Glu 중에서 선택한 것이며 ;

   X₉는 Trp, Tyr 및 Phe 중에서 선택한 것이고 ;

   X₁₀은 Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met 및 Lys 중에서 선택한 것이며 ;

   L₁은 링커이며 ;

   n 은 0 또는 1 이다.
2. 제 1 항에 있어서, TMP₁및 TMP₂는 다음 중에서 독립적으로 선택한 것임을 특징으로 하는 화합물 :

   X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁;

   X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂;

   X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃;

   X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄;

   X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀;

   X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁;

   X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂;

   X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃; 및

   X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_{14 ,}

   여기에서, X₂-X₁₀은 다음과 같다 ;

   X₁은 Ile, Ala, Val, Leu, Ser 및 Arg 중에서 선택한 것이고 ;

   X₁₁은 Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His 및 Glu 중에서 선택한 것이고 ;

   X₁₂는 Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Gly, Ser 및 Gln 중에서 선택한 것이며 ;

   X₁₃은 Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gln 및 Gly 중에서 선택한 것이며 ;

   X₁₄는 Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu 및 Gly 중에서 선택한 것이다.
3. 제 1 항에 있어서, TMP₁및/또는 TMP₂는 다음 중 하나 또는 그 이상에서 설명한 바와 같이 유도됨을 특징으로 하는 화합물 :

   펩티드[-C(0)NR-]결합 중 하나 또는 그 이상이 -CH₂-카르밤산염 결합[-CH₂-OC(0)NR-]과 같은 비-펩티드 결합 ; 인산염 결합 ; -CH₂-술폰아미드[-CH₂-S(0)₂NR-] 결합 ; 요소[-NHC(0)NH-] 결합 ; -CH₂- 2차 아민 결합 ; 또는 알킬화된 펩티드 결합[-C(0)NR⁶- 여기에서 R⁶은 저급 알킬임]으로치환됨 ;

   R 및 R¹이 모두 수소가 아니라는 가정하에, N-말단이 -NRR'기 ; NRC(0)R기 ; -NRC(0)OR기 ; -NRS(0)₂R기 ; -NHC(0)NHR기, 여기에서 R 및 R¹은 수소 또는 저급 알킬이며 ; 숙신이미드기 ; 벤질옥시카르보닐-NH-(CBZ-NH-)기 ; 또는 저급 알킬, 저급 알콕시, 클로로 및 브롬 중에서 선택한 페닐 고리에 1 내지 3 개의 치환기를 갖는 벤질옥시카르보닐-NH-기로 유도됨 ;

   C 말단은 -C(0)R²이며 여기에서 R²는 저급 알콕시 및 -NR³R⁴중에서 선택한 것이며 R³및 R⁴는 수소 및 저급 알킬 중에서 독립적으로 선택한 것이다.
4. 제 1 항에 있어서, 모든 아미노산이 D 형 구조를 가짐을 특징으로 하는 화합물.
5. 제 1 항에 있어서, 아미노산 중 적어도 하나가 D 형 구조를 가짐을 특징으로 하는 화합물.
6. 제 1 항에 있어서, 화합물이 고리형임을 특징으로 하는 화합물.
7. 제 1 항에 있어서, TMP₁및 TMP₂가 각각 Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala(SEQ ID NO : 1) 임을 특징으로 하는 화합물.
8. 제 1 항에 있어서, L₁이 펩티드를 포함함을 특징으로 하는 화합물.
9. 제 8 항에 있어서, L₁은 Y_n을 포함하며, 여기에서 Y 는 천연 아미노산 또는 그것의 입체이성질체이고 n 은 1 내지 20 임을 특징으로 하는 화합물.
10. 제 8 항에 있어서, L₁은 (Gly)_n을 포함하며, 여기에서 n 은 1 내지 20 이고, n 이 1 보다 클 경우에는 Gly 잔기의 반이 나머지 19 개의 천연 아미노산 또는 그것의 입체이성질체 중에서 선택한 다른 아미노산으로 치환됨을 특징으로 하는 화합물.
11. 제 8 항에 있어서, L₁은 다음 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 화합물 :

    (Gly)₃Lys(Gly)₄(SEQ ID NO : 6);

    (Gly)₃AsnGlySer(Gly)₂(SEQ ID NO : 7);

    (Gly)₃Cys(Gly)₄(SEQ ID NO : 8) ; 및

    GlyProAsnGly(SEQ ID NO : 9).
12. 제 8 항에 있어서, L₁은 Cys 잔기를 포함함을 특징으로 하는 화합물.
13. 제 12 항의 화합물의 이량체.
14. 제 13 항에 있어서 이량체가

    임을 특징으로 하는 이량체.
15. 제 1 항에 있어서, L₁이 (CH₂)_n을 포함하며, 여기에서 n 이 1 내지 20 임을 특징으로 하는 화합물.
16. 제 1 항에 있어서, 다음 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 화합물 :
17. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 다음의 구조식을 가짐을 특징으로 하는 화합물 및 생리학적으로 용인가능한 그의 염 :

    (Fc)_m-(L₂)_q-TMP₁-(L₁)_n-TMP₂-(L₃)_r-(Fc)_p

    여기에서 L₁, L₂및 L₃은 다음으로 이루어진 링커군에서 각각 독립적으로 선택한 링커군이며 ;

    Y_n, 여기에서 Y 는 천연 아미노산 또는 그것의 입체이성질체이고 n 은 1 내지 20 이며 ;

    (Gly)_n, 여기에서 n 은 1 내지 20 이고, n 이 1 보다 클 경우에는 Gly 잔기의 반이 나머지 19 개의 천연 아미노산 또는 그것의 입체이성질체 중에서 선택한 다른 아미노산으로 치환되며 ;

    (Gly)₃Lys(Gly)₄(SEQ ID NO : 6) ;

    (Gly)₃AsnGlySer(Gly)₂(SEQ ID NO : 7) ;

    (Gly)₃Cys(Gly)₄(SEQ ID NO : 8) ;

    GlyProAsnGly(SEQ ID NO : 9) ;

    Cys 잔기 ; 및

    (CH₂)_n, 여기에서 n 은 1 내지 20 이며 ;

    Fc는 면역글로불린의 Fc 영역이고 ; m, p, g 및 r 은 0 과 1 중에서 각각 독립적으로 선택한 것이며, 여기에서 m 또는 p 중 적어도 하나는 1 이고 만약 m 이 0 이면 q 는 0 이고, p 가 0 이면 r 은 0 이다.
18. 제 17 항에 있어서, L₁, L₂및 L₃은 Y_n중에서 각각 독립적으로 선택한 것이고, 여기에서 Y 는 천연 아미노산 또는 그것의 입체이성질체를 선택한 것이며 n 은 1 내지 20 임을 특징으로 하는 화합물.
19. 제 18 항에 있어서, L₁은 (Gly)_n을 포함하며, 여기에서 n 은 1 내지 20 이고 n 이 1 보다 클 경우에는, Gly 잔기의 반이 나머지 19 개의 천연 아미노산 또는 그것의 입체이성질체 중에서 선택한 다른 아미노산으로 치환됨을 특징으로 하는 화합물.
20. 제 18 항에 있어서, L₁, L₂및 L₃은 다음 중에서 독립적으로 선택한 것임을 특징으로 하는 화합물 :

    (Gly)₃Lys(Gly)₄(SEQ ID NO : 6);

    (Gly)₃AsnGlySer(Gly)₂(SEQ ID NO : 7);

    (Gly)₃Cys(Gly)₄(SEQ ID NO : 8) ; 및

    GlyProAsnGly(SEQ ID NO : 9).
21. 제 18 항에 있어서, L₁, L₂또는 L₃이 Cys 잔기를 포함함을 특징으로 하는 화합물.
22. 제 21 항의 화합물의 이량체.
23. 제 17 항에 있어서, L₁, L₂또는 L₃은 (CH₂)_n을 포함하며 여기에서 n 은 1 내지 20 임을 특징으로 하는 화합물.
24. 제 1 항에 있어서, 다음 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 화합물 :
25. 제 1 항의 화합물의 유효량을 환자에게 투여하여 그것을 필요로하는 환자내에서 거핵구 또는 혈소판을 증가시키는 방법.
26. 제 25 항에 있어서, 상기 유효량이 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 임을 특징으로 하는 방법.
27. 제약학적으로 용인가능한 그의 담체와 혼합하여 제 1 항의 화합물을 포함하는 제약학적 조성물.
28. 제 8 항의 화합물을 코드하는 폴리누클레오티드.
29. 제 13 항의 화합물을 코드하는 폴리누클레오티드.
30. 제 18 항의 화합물을 코드하는 폴리누클레오티드.
31. 제 22 항의 화합물을 코드하는 폴리누클레오티드.
32. 제 28 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항의 폴리누클레오티드를 포함하는 벡터.
33. 제 32 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
34. 적당한 영양 배지에서 제 33 항의 숙주 세포를 성장시키는 단계와 상기 세포 또는 영양배지로부터 화합물을 분리시키는 단계를 포함하는, 제 8 항, 제 13 항, 제 18 항 또는 제 22 항의 화합물을 제조하는 방법.