ES2227513T5 - Citoquina novedosa. - Google Patents
Citoquina novedosa. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2227513T5 ES2227513T5 ES92925017T ES92925017T ES2227513T5 ES 2227513 T5 ES2227513 T5 ES 2227513T5 ES 92925017 T ES92925017 T ES 92925017T ES 92925017 T ES92925017 T ES 92925017T ES 2227513 T5 ES2227513 T5 ES 2227513T5
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- cells
- dna
- seq
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
SE DESCRIBE UN POLIPEPTIDO (CD40-L) Y SECUENCIAS DNA, VECTORES Y CELULAS HUESPED TRANSFORMADAS UTILES EN LA PRODUCCION DE CD40-L. CON MAS PARTICULARIDAD, ESTA INVENCION PROPORCIONA POLIPEPTIDOS CD40-L HUMANOS Y MURINE AISLADOS QUE SE UNEN A LA REGION DE UNION EXTRACELULAR DE UN RECEPTOR CD40.
Description
Citoquina novedosa.
La presente invención se refiere a una citoquina
nueva. Más específicamente, la presente invención se refiere a la
clonación de una citoquina murina y humana que se une a un CD40
humano que tiene actividad agonista y antagonista en formas
solubles y unidas a la membrana.
Las citoquinas que tienen una denominación de
"interleuquina" son los factores proteicos que influyen sobre
las células inmunitarias efectoras. Las citoquinas designadas desde
interleuquina-1 a interleuquina-12
se han publicado y denominado interleuquinas. Otras citoquinas
conocidas incluyen el factor de necrosis tumoral (TNF), el factor
estimulador de colonias de macrófagos-granulocitos
(GM-CSF), el factor estimulador de colonias de
granulocitos (G-CSF), el factor de crecimiento de
mastocitos (MGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el
factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), el factor de
crecimiento nervioso (NGF), la eritropoyetina (EPO), el
\gamma-interferón (\gamma-IFN) y
otros.
Se han clonado los ADN de dos receptores de TNF
diferentes (tipo I y tipo II) (Smith y col., Science 248:
1019, 1990; y Schall y col., Cell 61: 361, 1990). Ambas
formas del receptor de TNF están relacionadas entre sí y pertenecen
a una familia de receptores cuyos miembros incluyen el receptor del
factor de crecimiento nervioso (Johnson y col., Cell 47:
545, 1986), el antígeno CD40 de las células B (Stamenkovic y col.,
EMBO J. 8: 1403, 1989), el antígeno de la célula T OX40
(Mallett y col. EMBO J.9:1063, 1990), el antígeno humano Fas
(Itoh y col., Cell 66: 233, 1991) y el receptor
4-IBB murino (Kwon y col., Cell.
Immunol. 121: 414, 1989 [Kwon y col. I] y Kwon y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1963, 1989 [Kwon y col.
II]).
La proteína CD40 humana (CD40) es un péptido de
277 aminoácidos que tiene un peso molecular de 30.600 y un péptido
señal secretor de 19 aminoácidos que comprende, principalmente,
aminoácidos hidrófobos (Stamenkovic y col.). El peso molecular
(exclusivo de glucosilación) de la proteína CD40 humana madura es
28.300. De una genoteca de ADNc preparada para la línea celular de
linfoma de Burkitt, Raji, se aisló un ADNc que codificaba la CD40
humana. La proteína teórica codificada por el ADNc de CD40 contiene
una secuencia líder teórica, un dominio transmembrana y una serie
de otras características comunes a las proteínas receptoras unidas a
la membrana. Se ha descubierto que CD40 se expresa en la superficie
de los linfocitos B, las células epiteliales y algunas líneas de
células de carcinoma.
Se ha mostrado que un anticuerpo monoclonal
(AcMo) dirigido contra CD40 media varios efectos funcionales de las
células B humanas. Entre estos efectos se incluyen: (a) adherencias
homotípicas (Gordon y col., J. Immunol. 140: 1425, 1988
[Gordon y col., 1]; (b) aumento del tamaño celular (Gordon y col. I
y Valle y col., Eur. J. Immunol. 19: 1463, 1989); (c)
proliferación de células B activadas con AcMo
anti-IgM, anti-CD20, ésteres de
forbol solos (Clark y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:
4494, 1986; y Paulie y col., J. Immunol. 142: 590, 1989), o
ésteres de forbol combinados con interleuquina-4
(Gordon y col., Eur. J. Immunol. 17: 1535, 1987 [Gordon y
col. II]; y (d) producción de IgE (Jabara y col., J. Exp.
Med. 172: 1861, 1990; Zhang y col., J. immunol. 146:
1836, 1991) e IgM (Gascan y col., J. Immunol. 147: 8, 1991)
en cultivos con depleción de células T estimulados con
interleuquina-4 (IL-4).
Se descubrió que uno de tales anticuerpos,
denominado AcMo 89 por Banchereau y col., Clin. Immunol.
Spectrum 3: 8, 1991 [Banchereau y col. I], inducía la
proliferación de células B humanas a una concentración del
anticuerpo relativamente baja (30 ng/ml o aproximadamente
10^{-10}M). La proliferación duró de dos a tres semanas y tuvo
como resultado una expansión de diez veces la población de células B
humanas. La estimulación óptima de las células B se produjo cuando
la molécula de superficie CD40 se entrecruzó con la IgM. Los
fragmentos Fab de otro AcMo anti-CD40 indujeron
sólo una débil respuesta proliferativa. Además, Banchereau y col.,
Science 251: 70, 1991 [Banchereau y col. II] comunicaron que
las células B humanas en reposo entraban en un estado de
proliferación mantenida cuando se incubaban tanto con una línea
celular Ltk fibroblástica murina que se había transfectado con el
receptor Fc humano como con un anticuerpo monoclonal específico del
CD40 humano. Banchereau y col. II descubrieron que el
entrecruzamiento con CD40 es necesario para la expansión clonal de
las células B.
El CD23 es un receptor de IgE de baja afinidad
que se ha descubierto que se expresa en la mayoría de las células B
maduras IgM^{-}/IgD^{-}, pero no en las células T. Se ha
secuenciado el CD23 y su secuencia la describieron Kikutani y col.,
Cell 47: 657, 1986. Se descubrió que el CD23 soluble (sCD23)
inducía una reacción pirogénica en conejos, y esta reacción se
anuló con la administración de IgE humana (Ghaderi y col.,
Immunology 73: 510, 1991). Por tanto, el CD23 puede ser un
marcador adecuado de los efectos del CD40 soluble o
CD40-L.
Clark, Tissue Antigens 35:
33-36, 1990, es un artículo de revisión que describe
el CD40 y el hecho de que no se ha identificado el ligando de
CD40.
Yellin y col., Immunol. 147 (10):
3389-3395, 1991 desvelan que un subclon de CD4^{-}
de la línea de células T leucémicas Jurkat, conocido como D1.1,
induce la activación de células B. Esto sugiere que las estructuras
de superficie en D1.1 median este efecto.
La solicitud de patente europea nº 0614374 forma
parte del estado de la técnica según el Artículo 54(3) de
CPE y desvela un anticuerpo que reconoce una molécula de la
superficie de células T en D1.1 conocida como
T-BAM, así como un inmunoprecipitado del anticuerpo
y T-BAM.
Antes de la presente invención no se conocía un
ligando para C40. En consecuencia, en la técnica existe una
necesidad de identificar un ligando de CD40
(CD40-L).
En un primer aspecto, la presente invención
proporciona una secuencia de ADN aislado que codifica un polipéptido
CD40-L que se une a CD40, seleccionado entre: (a)
ADN que comprende los nucleótidos 46 a 828, 196 a 828, 193 a 762 de
la SEQ ID Nº 11 y sus hebras complementarias; (b) ADN que codifica
los aminoácidos 1-261 de la SEQ ID Nº 12; (c) ADN
que codifica los aminoácidos 47-261 de la SEQ ID Nº
12; (d) ADN que codifica los aminoácidos 51-261 de
la SEQ ID Nº 12; (e) ADN que codifica un fragmento de (c) o (d); y
(f) ADN que es complementario al ADN que hibrida con el ADN de (a)
en condiciones moderadamente rigurosas (solución de prelavado de 5 x
SSC, 0,5% SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y condiciones de hibridación de
50ºC, 5 x SSC durante la noche).
En un segundo aspecto, la presente invención
proporciona un ADN aislado que codifica un polipéptido
CD40-L que se une a CD40, seleccionado entre: (a)
ADN que comprende los nucleótidos 1 a 783 de la SEQ ID Nº 1 y su
hebra complementaria; (b) ADN que codifica los aminoácidos 1 a 260
de la SEQ ID Nº 2; (c) ADN que codifica los aminoácidos 47 a 260 de
la SEQ ID Nº 2; (d) ADN que codifica un fragmento de (b) o de (c); y
(e) ADN que es complementario del ADN que hibrida con el ADN de (a)
en condiciones moderadamente rigurosas (solución de prelavado de 5
x SSC, 0,5% de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y condiciones de
hibridación de 50ºC, 5 x SSC durante la noche).
Se ha aislado y se ha caracterizado una nueva
citoquina, en lo sucesivo denominada "CD40-L".
La secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos deducida
del ADNc del CD40-L murino representativo se
describen en la SEQ ID Nº 1 y en la figura 1, y la secuencia de
aminoácidos también se enumera en la SEQ ID Nº 2. La secuencia
nucleotídica y la secuencia de aminoácidos deducida del ADNc de
CD40-L humano representativo se describen en la SEQ
ID Nº 11 y en la figura 2, y la secuencia de aminoácidos se enumera
en la SEQ ID Nº 12. La presente invención además comprende otros
polipéptidos CD40-L codificados por las secuencias
nucleotídicas que hibridan, en condiciones moderada o intensamente
rigurosas, con sondas definidas por la SEQ ID Nº 11 (la región
codificadora del CD40-L humano), fragmentos de la
secuencia que se extienden desde el nucleótido 46 al nucleótido 828
de la SEQ ID Nº 11, o a las secuencias de ADN o de ARN
complementarias a la figura 2 (SEQ ID Nº 11) o fragmentos de los
mismos. La invención además comprende secuencias de ácido nucleico
que, debido a la degeneración del código genético, codifican
polipéptidos sustancialmente idénticos o sustancialmente similares
a los polipéptidos codificados por las secuencias de ácido nucleico
descritas anteriormente y las secuencias complementarias a
ellas.
ellas.
El CD40-L es un polipéptido de
membrana de tipo II que tiene una región extracelular en su extremo
C, una región transmembrana y una región intracelular en su extremo
N. Se ha descubierto una versión soluble del CD40-L
murino en sobrenadantes de células EL-4 y de células
EL-4 clasificadas según una proteína de fusión
CD40/Fc biotinilada descrita en la presente memoria descriptiva. El
CD40-L soluble comprende una región extracelular de
CD40-L o un fragmento del mismo. La secuencia
proteica del CD40-L murino se describe en la figura
1 y la SEQ ID Nº 2, y el CD40-L humano en la figura
2 y la SEQ ID Nº 12. La región extracelular del
CD40-L murino se extiende desde el aminoácido 47 al
aminoácido 260 en la figura 1 y la SEQ ID Nº 2, y la del
CD40-L humano desde el aminoácido 47 al aminoácido
261 en la figura 2 y la SEQ ID Nº 12. La actividad biológica del
CD40-L está mediada por la unión de esta citoquina
al CD40 e incluye la proliferación de células B y la inducción de
la secreción de anticuerpos, incluyendo la secreción de IgE.
Los oligonucleótidos sentido y antisentido
(desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos) que corresponden a una
secuencia de al menos aproximadamente 12 nucleótidos seleccionados
de la secuencia de nucleótidos de CD40-L o de las
secuencias de ADN o de ARN complementarias a la secuencia
nucleotídica del CD40-L como se describen en las
SEQ ID Nº 1 y SEQ ID Nº 11 y en las figuras 1 y 2 impiden la
transcripción o la traducción del ARNm de CD40-L o
de polipéptidos.
Los fragmentos peptídicos de
CD40-L que corresponden a una secuencia proteica de
al menos 10 aminoácidos seleccionados de la secuencia de
aminoácidos codificada por la SEQ ID Nº 1 o la SEQ ID Nº 11, que
pueden actuar como inmunógenos para generar anticuerpos específicos
de inmunógenos CD40-L pueden servir como
determinantes antigénicos que proporcionen anticuerpos monoclonales
específicos del CD40-L.
La invención también proporciona una proteína de
fusión CD40/Fc humana y una proteína CD40 soluble (sCD40) que
comprende la región extracelular del CD40 humano. Ambas proteínas de
fusión, sCD40 y CD40/Fc, pueden inhibir el CD40-L o
la estimulación de células B inducidas por AcMo antiCD40, la
estimulación de IgE inducida por IL-4 y la
inducción de CD23 inducida por IL-4 en células
B.
La figura 1 ilustra las secuencias nucleotídicas
y de aminoácidos correspondientes al CD40-L murino.
Esta proteína es un polipéptido de tipo II que tiene su extremo N
como su dominio intracelular, seguido por una región transmembrana,
y un dominio extracelular en el extremo C del polipéptido. El
dominio extracelular, que es más largo que el dominio intracelular
o que la región transmembrana, contiene un sitio de posible
glucosilación unido a N y dos posibles enlaces disulfuro en vista
de los cuatro residuos de cisteína (Cys).
La figura 2 ilustra las secuencias nucleotídicas
y de aminoácidos correspondientes al CD40-L humano.
Esta proteína es un polipéptido de tipo II que tiene su extremo N
como su dominio intracelular, seguido por una región transmembrana
y un dominio extracelular en el extremo C del polipéptido. El
dominio extracelular, que es más largo que el dominio intracelular
o que la región transmembrana, contiene un sitio de posible
glucosilación unido a N y dos posibles enlaces disulfuro en vista
de los 5 residuos de cisteína (Cys).
La figura 3 ilustra una comparación de las
secuencias proteicas de los CD40-L humano y murino,
que muestra una homología del 77,7% a nivel de aminoácidos.
La figura 4 ilustra la proliferación de células
mononucleares de sangre periférica (PBMC) humana con depleción de
células T causada por la incubación con células CV1 transfectadas
con ADNc del CD40-L murino de longitud completa
(SEQ ID Nº 1) y que expresan la unión CD40-L
(células CD40-L ^{+} CV1) cuando se compararon con
células CV1 transfectadas con un vector vacío (HA VEO) y que no
expresan la unión CD40-L murino. Los resultados de
proliferación al 7º día muestran que las células
CD40-L ^{+}CV1 aumentan de forma significativa la
proliferación de PBMC con depleción de células T en presencia o
ausencia de interleuquina-4
(IL-4).
La figura 5 ilustra una segunda determinación de
la proliferación de PBMC con depleción de células T con la adición
de CD40-L murino unido y 10 ng/ml de
IL-4. Estos datos muestran la ausencia de efectos
comitogénicos de la IL-4 pero el fuerte efecto
mitogénico del CD40-L unido continuó.
La figura 6 ilustra que el
CD40-L unido aumenta la secreción de IgE.
La figura 7 ilustra que el
CD40-L unido a membrana estimula la eliminación de
CD23 en presencia de IL-4.
La figura 8 ilustra la proliferación de células
B esplénicas murinas causada por CD40-L unido murino
o de células 7A1, que es un clon de células T cooperadoras.
La figura 9 ilustra una comparación entre
células EL40.9 murinas, una línea celular seleccionada según la
expresión de CD40-L murino, y células T 7A1 para la
inducción de una respuesta específica de antígeno indicada por
células formadoras de placas (PFC) mediante eritrocitos antioveja
(SCBC).
La figura 10 ilustra una comparación de la
actividad proliferativa de células B de CD40L unido a membrana y
otros tipos de células transfectadas con ADNc diferentes. El
CD40-L unido a membrana mostró una actividad
proliferativa de células B significativamente mayor que un clon de
células colaboradoras u otras células control.
La figura 11 ilustra que las células 7C2 (un
clon de células T colaboradoras) y células CV1 transfectadas con
ADNc de CD40-L murino inducen células formadoras de
placa antiEC.
La figura 12 ilustra una comparación de dos
clones de células T colaboradoras con células que expresan
CD40-L unido a membrana para inducir la
proliferación de células B murinas.
La figura 13 ilustra la inducción de células
formadoras de placa específicas de antígeno por
CD-40-L unido a membrana y un clon
de células T colaboradoras en presencia o ausencia de
interleuquina-2 (IL-2) añadida.
La figura 14 muestra los efectos del
CD40-L unido a la membrana en la estimulación de la
proliferación de células B y la secreción de IgE. Los efectos del
CD40-L unido a la membrana se inhibieron por el
receptor CD40 pero no por el receptor de TNF.
Se han aislado y secuenciado nuevos polipéptidos
que pueden actuar como ligandos del CD40 murino y humano. Más
particularmente, se han clonado y secuenciado los ADNc que codifican
estos ligandos. Además se proporcionan procedimientos para la
expresión de polipéptidos CD40-L recombinantes. Los
polipéptidos CD40-L incluyen otras formas de
CD40-L de mamíferos, tales como derivados o análogos
del CD40-L humano o murino. Los
CD40-L murino y humano comprenden una región
extracelular de, respectivamente, 214 y 215 aminoácidos en el
extremo C del polipéptido unido a la membrana de longitud completa.
La región extracelular contiene el dominio que se une al CD40. Los
CD40-L murino y humano además comprenden una región
transmembrana hidrófoba homóloga de 24 aminoácidos delineada por
aminoácidos cargados en ambos lados y una región intracelular de 22
aminoácidos en su extremo N. La presente invención además comprende
polipéptidos de CD40-L de longitud completa o sus
fragmentos, que comprenden toda o parte de la región extracelular o
derivados de la región extracelular y células de mamífero
transfectadas con un ADNc que codifica el CD40-L
murino o humano y que expresan CD40-L humano o
murino como una proteína unida a la membrana.
La presente invención comprende secuencias de
ADN aisladas que codifican polipéptidos de CD40-L y
secuencias de ADN o de ARN complementarias a tales secuencias de
ADN aisladas. Las secuencias de ADN aisladas y sus complementarias
se seleccionan del grupo formado por (a) los nucleótidos 184 a 828,
los nucleótidos 193 a 828 o los nucleótidos 193 a 762 de la
secuencia de ADN que se expone en la figura 2 (SEQ ID Nº 11) y sus
complementarias, (b) secuencias de ADN que hibridan con las
secuencias de ADN de (a) o sus complementarias en condiciones
moderadamente rigurosas y que codifican un polipéptido de
CD40-L, análogos o derivados del mismo, y (c)
secuencias de ADN que, debido a la degeneración del código
genético, codifican polipéptidos de CD40-L
codificados por cualquiera de las secuencias de ADN anteriores y
sus complementarias. Además, la presente invención incluye vectores
que comprenden secuencias de ADN que codifican polipéptidos de
CD40-L y análogos, células huésped transfectadas con
tales vectores, y un procedimiento para preparar un polipéptido,
que comprende cultivar tal célula huésped en condiciones que
estimulan la expresión del polipéptido. La invención también
proporciona un ADN como se muestra en las SEQ ID Nº 5, 6, 7, 9 ó
10, o su ARN equivalente, o su complementaria.
También se proporciona un polipéptido de
CD40-L purificado que se une al
CD40-L, que proporciona un polipéptido codificado
por el ADN de los aspectos primero y segundo.
La nueva citoquina descrita en la presente
memoria descriptiva es un ligando de CD40, un receptor que es un
miembro de la superfamilia de receptores de TNF. Por tanto, es muy
probable que el CD40-L sea el responsable de la
transducción de la señal a través del CD40, del que se conoce que se
expresa en, por ejemplo, los linfocitos B. El
CD40-L de longitud completa es un polipéptido unido
a la membrana con una región extracelular en su extremo C, una
región transmembrana y una región intracelular en su extremo N. A
partir de la región extracelular o de un fragmento de la misma se
puede preparar una versión soluble del CD40-L y se
ha descubierto un CD40-L soluble en sobrenadantes
de cultivos de células que expresan una versión unida a la membrana
del CD40-L. La secuencia proteica de la región
extracelular del CD40-L murino se extiende desde el
aminoácido 47 al aminoácido 260 de la figura 1 y la SEQ ID Nº2. La
secuencia proteica de la región extracelular del
CD40-L humano se extiende desde el aminoácido 47
hasta el aminoácido 261 en la figura 2 y la SEQ ID Nº 12. La
actividad biológica del CD40-L está mediada por la
unión al CD40 o a su homólogo específico de especie y comprende la
proliferación de células B y la inducción de la secreción de
inmunoglobulinas por parte de las células B activadas. El
CD40-L (incluidas las formas solubles monomérica y
oligomérica, así como las formas unidas a la membrana) pueden
efectuar la proliferación de células B y la secreción de
inmunoglobulinas (a excepción de la secreción de IgE) sin la
presencia de IL-4 añadida, al contrario que los
anticuerpos antiCD40, que requieren IL-4 y
entrecruzamiento para mediar la actividad.
El CD40-L se refiere a un género
de polipéptidos que son capaces de unirse a CD40 o a homólogos en
mamíferos del CD40. Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "CD40-L" incluye polipéptidos de
CD40-L solubles que no tienen regiones
transmembrana ni intracelular, homólogos en mamíferos del
CD40-L humano, análogos del CD40-L
humano o murino o derivados del CD40-L humano o
murino.
El CD40-L también se puede
obtener mediante mutaciones de secuencias nucleotídicas que
codifican un polipéptido de CD40-L. Un análogo de
CD40-L, según se denomina en la presente memoria
descriptiva, es un polipéptido sustancialmente homólogo a una
secuencia de CD40-L humano o murino pero que tiene
una secuencia de aminoácidos diferente a la secuencia nativa del
polipéptido de CD40-L (de las especies humana o
murina) a causa de una o una pluralidad de deleciones, inserciones
o sustituciones. Se pueden sintetizar análogos de
CD40-L a partir de construcciones de ADN preparadas
mediante síntesis y unión de oligonucleótidos o mediante técnicas de
mutagénesis específica de sitio.
La estructura aminoacídica primaria del
CD40-L humano o murino puede modificarse para crear
derivados de CD40-L formando conjugados covalentes
o agregados con otros restos químicos, tales como grupos glucosilo,
lípidos, fosfatos, grupos acetilo y similares, o creando secuencias
aminoacídicas mutantes. Los derivados covalentes del
CD40-L se preparan mediante unión de grupos
funcionales concretos a las cadenas laterales aminoacídicas del
CD40-L o al extremo N o al extremo C de un
polipéptido de CD40-L o del dominio extracelular del
mismo. Otros derivados de CD40-L que entran dentro
del alcance de esta invención incluyen conjugados covalentes o
agregados de CD40-L o sus fragmentos con otras
proteínas o polipéptidos, tales como mediante la síntesis en
cultivo recombinante como fusiones en el extremo N o el extremo C.
Por ejemplo, el conjugado puede comprender una señal o secuencia
polipeptídica líder en la región del extremo N o la región del
extremo C de un polipéptido de CD40-L que, durante
o después de la traducción, dirige la transferencia del conjugado de
su lugar de síntesis a un lugar dentro o fuera de la membrana de la
célula o de la pared celular (por ejemplo, el
\alpha-factor líder de Saccharomyces). Las
fusiones de polipéptidos de CD40-L pueden comprender
polipéptidos añadidos para facilitar la purificación y la
identificación de CD40-L (por ejemplo,
poli-His), o fusiones con otras citoquinas para
proporcionar nuevas entidades polifuncionales. Entre otras
citoquinas se incluyen, por ejemplo, cualquiera de las
interleuquinas 1 a 13, el TNF (factor de necrosis tumoral), el
GM-CSF (factor estimulador de colonias de
granulocitos-macrófagos), G-CSF
(factor estimulador de colonias de granulocitos), MGF (factor de
crecimiento de mastocitos), el factor de crecimiento epidérmico
(EGF), PDGF (factor de crecimiento derivado de las plaquetas), NGF
(factor de crecimiento nervioso), EPO (eritropoyetina),
\gamma-IFN (interferón gamma), el
4-IBB-L (ligando de
4-IBB) y otras citoquinas que afectan al
crecimiento, la diferenciación o la función de las células
inmunitarias.
Las secuencias de ácido nucleico que entran
dentro del alcance de la presente invención incluyen secuencias de
ADN yo de ARN que hibridan con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID
Nº 1 o de la SEQ ID Nº 11 o sus hebras complementarias, en
condiciones moderada o intensamente rigurosas. Condiciones de
hibridación moderadamente rigurosas se refieren a condiciones
descritas en, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning. A
Laboratory Manual, 2ª ed. Vol. 1, pág.
1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1989). Las condiciones moderadamente rigurosas, según han definido
Sambrook y col., incluye el uso de una solución de prelavado de 5 x
SSC, 0,5% de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y condiciones de hibridación
de 50ºC, 5 x SSC, durante la noche. Las condiciones intensamente
rigurosas incluyen temperaturas más elevadas de hibridación y
lavado.
La actividad biológica de CD40-L
puede determinarse, por ejemplo, mediante competición para unirse al
dominio de unión al ligando de CD40 (es decir, ensayos de unión
competitiva). Tanto el CD40-L murino como el
CD40-L humano se unen al CD40 humano. La afinidad
de unión del CD40-L murino (expresado en células
seleccionadas EL-40.9 murinas) para el CD40 humano
fue de aproximadamente 1,74 x 10^{9} M^{-1}. De igual forma, la
afinidad de unión del CD40-L murino (expresado en
células no seleccionadas EL-46-1
murinas) por el CD40 humano fue de aproximadamente 2,3 x 10^{9}
M^{-1}. Las mediciones de la afinidad de unión se encuentran en un
intervalo típico de unión a receptor de citoquina/citoquina.
Una configuración de un ensayo de unión
competitiva para el polipéptido CD40-L usa un
CD40-L murino soluble marcado radioactivamente,
según la figura 1 (SEQ ID Nº 1) o CD40-L humano
según la figura 2 (SEQ ID Nº 11) y células intactas que expresan
CD40 (por ejemplo, células B humanas). En lugar de células intactas,
se podría sustituir el CD40 soluble (tal como una proteína de
fusión CD40/Fc) unido a una fase sólida mediante una interacción de
la Proteína A o la Proteína G con la región Fc de la proteína de
fusión. Una segunda configuración de un ensayo de unión competitiva
usa CD40 soluble marcado radioactivamente tal como una proteína de
fusión CD40/Fc, y células intactas que expresan
CD40-L. Como alternativa, el CD40-L
podría unirse a una fase sólida.
Los ensayos de unión competitiva se pueden
llevar a cabo usando metodología estándar. Por ejemplo, se puede
usar un CD40-L murino marcado radioactivamente para
competir con un homólogo de CD40-L para el estudio
de la actividad de unión frente al CD40 de superficie. Mediante
ensayos de unión competitiva en placas autorradiográficas se pueden
obtener resultados cualitativos o para generar resultados
cuantitativos se pueden usar gráficas de
Scatchard.
Scatchard.
Los ensayos de unión competitiva con células
intactas que expresan CD40 se pueden llevar a cabo mediante dos
procedimientos. En un primer procedimiento, se induce el crecimiento
de las células B en suspensión o mediante adherencia a las placas
de cultivo tisular. Las células adherentes se pueden extraer
mediante tratamiento con EDTA 5 mM durante diez minutos a 37ºC. En
un segundo procedimiento, se pueden usar células COS transfectadas
que expresan CD40 unido a membrana. Las células COS u otras células
de mamíferos se pueden transfectar con ADNc de CD40 humano en un
vector adecuado para que expresen CD40 de longitud completa con una
región extracelular por fuera de la célula.
Como alternativa, el CD40 soluble se puede unir
a una fase sólida tal como una matriz de columna de cromatografía,
o un tubo o sustrato similar para analizar la presencia de un resto
detectable tal como ^{125}I. La unión a una fase sólida se puede
conseguir, por ejemplo, obteniendo una proteína de fusión CD40/Fc y
uniéndola a una proteína A o a una proteína G de superficie.
Otro medio para medir la actividad biológica del
CD40-L y sus homólogos es usar CD40 soluble
conjugado (por ejemplo, ^{125}I-CD40/Fc) en
ensayos de competición similares a los descritos anteriormente. Sin
embargo, en este caso, células intactas que expresan
CD40-L o CD40-L soluble unido a un
sustrato sólido, se usan para medir la competición por la unión de
CD40 soluble, conjugado a CD40-L mediante una
muestra que contiene un homólogo teórico de
CD40.
CD40.
CD40-L también puede estudiarse
midiendo la actividad biológica en un ensayo de proliferación de
células B. Las células B humanas se pueden obtener de amígdalas
humanas mediante purificación por selección negativa y
sedimentación por densidad en Percoll, según se describe en Defrance
y col., J. Immunol. 139: 1135, 1987. Pueden usarse líneas de
células del linfoma de Burkitt para medir la proliferación celular
en respuesta a CD40-L. Ejemplos de líneas de
células de linfoma de Burkitt incluyen, por ejemplo, Raji (ATCC CCL
86), Daudi (ATCC CL 213) y Namalwa (ATCC CRL 1432). El
CD40-L unido a la membrana estimuló la proliferación
de células B. El CD40-L oligomérico,
preferentemente dimérico, puede estimular la proliferación de
células B. El CD40 (receptor) antagoniza la proliferación de
células B estimulada por el CD40-L.
Otro ensayo más para determinar la actividad
biológica de CD40-L es medir la inmunoglobulina
producida por las células B en respuesta a la activación por parte
del CD40-L o un derivado o análogo del mismo. La
secreción de inmunoglobulinas policlonales se puede medir, por
ejemplo, mediante la incubación con 5 x 10^{5} células B/ml en
cultivo durante al menos siete días. La producción de
inmunoglobulinas (Ig) se puede medir mediante un ensayo ELISA tal
como el descrito en Maliszewski y col., J. Immunol. 144:
3028, 1990 [Maliszewski y col. I] o Maliszewski y col., Eur. J.
Immunol. 20: 1735, 1990 [Maliszewski y col. II]. Las células B
murinas se pueden obtener, por ejemplo, de ratones y cultivar según
los procedimientos descritos en Grabstein y col., J. Exp.
Med. 163: 1405, 1986 [Grabstein y col. I], Maliszewski y col. I,
y Maliszewski y col. II.
Se puede usar CD40-L en un
ensayo de unión para detectar las células que expresan CD40. Por
ejemplo, el CD40-L murino según la figura 1 (SEQ ID
Nº 1) o el CD40-L humano según la figura 2 (SEQ ID
Nº 11), o un dominio extracelular o un fragmento del mismo, se
pueden conjugar a un resto detectable tal como ^{125}I. El marcaje
radioactivo con ^{125}I se puede realizar con una cualquiera de
las varias metodologías que proporcionan una molécula
CD40-L-^{125}I
funcional marcada para detectar actividad específica elevada. Como alternativa se puede usar otro resto detectable tal como una enzima que pueda catalizar una reacción colorimétrica o fluorométrica, biotina o avidina. Las células que expresan CD40 se pueden poner en contacto con CD40-L conjugado. Tras la incubación se elimina el CD40-L conjugado que no se ha unido y se mide la unión usando el resto detectable.
funcional marcada para detectar actividad específica elevada. Como alternativa se puede usar otro resto detectable tal como una enzima que pueda catalizar una reacción colorimétrica o fluorométrica, biotina o avidina. Las células que expresan CD40 se pueden poner en contacto con CD40-L conjugado. Tras la incubación se elimina el CD40-L conjugado que no se ha unido y se mide la unión usando el resto detectable.
Los polipéptidos de CD40-L
pueden existir en forma de un monómero soluble o como oligómeros,
como dímeros o trímeros. Los oligómeros pueden estar unidos por
puentes disulfuro formados entre residuos de cisteína de los
diferentes polipéptidos CD40-L. Pueden formarse
usando una cremallera de leucina, tal como la cremallera de leucina
de la SEQ ID Nº 17. Como alternativa, se pueden unir dos dominios de
CD40-L solubles con una secuencia de engarce tal
como una secuencia de engarce Gly_{4}SerGly_{5}Ser, u otras
secuencias de engarce descritas en EE.UU. en la patente 5.073.627,
que se incorpora en la presente memoria descriptiva como referencia.
Los polipéptidos de CD40-L también pueden crearse
mediante fusión del extremo C del CD40-L soluble
(dominio extracelular) con la región Fc de la IgG1 (por ejemplo, la
SEQ ID Nº 3) como se ha descrito para la proteína de fusión CD40/Fc.
Se deja que las proteínas de fusión CD40-L/Fc se
asemejen mucho a las cadenas pesadas de una molécula de anticuerpo
para formar CD40-L divalente. Si las proteínas de
fusión están formadas por cadenas pesadas y ligeras de un
anticuerpo, es posible formar un oligómero CD40-L
con tantas como cuatro regiones extracelulares
CD40-L.
Las proteínas de fusión se pueden preparar
usando técnicas convencionales de corte y empalme enzimático de
fragmentos de las secuencias deseadas. Se pueden usar técnicas de
PCR usando oligonucleótidos sintéticos para preparar y/o amplificar
los fragmentos deseados. También se puede usar la superposición de
oligonucleótidos sintéticos que representen las secuencias deseadas
para preparar construcciones de ADN que codifiquen las proteínas de
fusión. Las proteínas de fusión también pueden comprender
CD40-L y dos o más secuencias adicionales,
incluyendo una secuencia líder (o péptido señal), región Fc, una
secuencia de engarce y secuencias codificadoras de restos altamente
antigénicos que proporcionan un medio para la purificación
superficial o la detección rápida de una proteína de fusión.
Los péptidos señal facilitan la secreción de
proteínas por parte de las células. Un ejemplo de péptido señal es
los 25 aminoácidos del extremo amino de la secuencia líder de la
interleuquina-7 humana (IL-7;
Goodwin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86: 302, 1989;
figura 2B). También se pueden usar otros péptidos señal. Por
ejemplo, se pueden alterar ciertos nucleótidos en la secuencia líder
de la IL-7 sin alterar la secuencia de aminoácidos.
Además, se pueden hacer cambios en los aminoácidos que no afecten a
la capacidad de la secuencia de IL-7 para actuar
como secuencia líder.
El octapéptido Flag®
(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)
no altera la actividad biológica de las proteínas de fusión, es
altamente antigénico y proporciona un epítopo unido de forma
reversible por un anticuerpo monoclonal, lo que permite la
detección rápida y la purificación superficial de la proteína de
fusión expresada. La secuencia Flag® también se escinde
específicamente por la acción de la enteroquinasa mucosa bovina en
el residuo inmediatamente posterior al par Asp-Lys,
las proteínas de fusión protegidas con este péptido también pueden
ser resistentes a la degradación intracelular en E. coli. Se
ha depositado un anticuerpo monoclonal murino que se une a la
secuencia Flag® con el número de registro ATCC HB 9259; en la
patente de EE.UU. 5.011.912, que se incorpora en la presente
memoria descriptiva como referencia, se describen procedimientos
para usar el anticuerpo en la purificación de proteínas de fusión
que comprenden la secuencia Flag®.
Se definen regiones Fc adecuadas como regiones
Fc que se unen a la proteína A o a la proteína G, o como
alternativa, se reconocen por un anticuerpo que se puede usar en la
purificación o la detección de una proteína de fusión que comprende
la región Fc. Entre las regiones Fc preferibles se incluyen la
región Fc de la IgG1 humana o la IgG1 murina. Un ejemplo es la
región Fc de IgG1 que se muestra en la SEQ ID Nº 3; otro ejemplo es
una región Fc codificada por el ADNc obtenido mediante PCR a partir
de cebadores oligonucleotídicos de la SEQ ID N: 9 y la SEQ ID Nº
10, cono ADNc humano como molde. También se pueden usar porciones de
una región FC adecuada, por ejemplo, una región Fc de IgG1 humana
de la que se ha delecionado una secuencia de aminoácidos responsable
de la unión a la proteína A, de forma que la región Fc resultante
se une a la proteína G pero no a la proteína A.
La secuencia repetida
[Gly_{4}Ser]_{3} proporciona una secuencia de engarce que
separa la región extracelular del CD40-L de la
porción Fc de la proteína de fusión por una distancia suficiente
para garantizar que el CD40-L se pliega de forma
adecuada en sus estructuras secundaria y terciaria. Las secuencias
de engarce adecuadas (1) adoptarán una conformación flexible
extendida, (2) no exhibirán propensión a desarrollar una estructura
secundaria ordenada que podría interaccionar con los dominios
funcionales de las proteínas de fusión, y (3) tendrán un mínimo
carácter hidrófobo o cargado que podría interaccionar con los
dominios funcionales de la proteína. Entre los aminoácidos de la
superficie típicos en las regiones proteicas flexibles se incluyen
Gly, Asn y Ser. Virtualmente se esperaría que cualquier permutación
de las secuencias de aminoácidos que contienen Gly, Asn y Ser
cumpliera los criterios anteriores para una secuencia de engarce. En
la secuencia de engarce también se pueden usar otros aminoácidos
casi neutros, tales como Thr y Ala. La longitud de la secuencia de
engarce puede variar sin que afecte de forma significativa a la
actividad biológica de la proteína de fusión. Las secuencias de
engarce son innecesarias cuando las proteínas que se están
condensando tienen regiones aminoacídicas no esenciales en los
extremos N o C, que se pueden usar para separar los dominios
funcionales e impedir la interferencia estérica.
Los polipéptidos de CD40-L
pueden existir como polipéptidos solubles que comprenden el dominio
extracelular de CD40-L como se muestra en la figura
1 (SEQ ID Nº 11) y la figura 2 (SEQ ID Nº 11) o como polipéptidos
unidos a la membrana que comprenden el dominio extracelular, una
región transmembrana y un dominio corto intracelular, como se
muestra en la figura 1 (SEQ ID Nº 1) y la figura 2 (SEQ ID Nº 11)
para las secuencias murina y humana, respectivamente. Además, la
presente invención comprende oligómeros de dominios extracelulares
de CD40-L o fragmentos de los mismos, unidos por
interacciones disulfuro, o expresados como polímeros de fusión con o
sin grupos de enlace de aminoácidos espaciadores. Por ejemplo, una
molécula dimérica de CD40-L puede estar unida por
un grupo de unión a la región Fc de la IgG.
Sin quedar ligado a la teoría, el
CD40-L unido a la membrana y el
CD40-L oligomérico pueden conseguir actividad
estimulando la formación de Ig y la proliferación de células B, que
anteriormente sólo se conseguía mediante anticuerpo antiCD40
reticulado en presencia de IL-4. Además parece muy
probable que el CD40-L monomérico soluble, que
comprende sólo el dominio extracelular de CD40-L y
es capaz de unirse al receptor CD40, sirva para antagonizar la
actividad del CD40-L unido a la membrana y
oligomérico y/o de los anticuerpos antiCD40. Además parece probable
que la interacción del CD40-L unido a la membrana
con CD40 es la principal interacción molecular responsable de la
inducción del crecimiento y diferenciación de las células B hacia la
producción de anticuerpos específicos de antígenos y hacia la
secreción de Ig policlonales dependientes del contacto con células
T. A este respecto, una célula de mamífero transfectada con un ADNc
que codifica CD40-L de longitud completa (es decir,
que está unido a la membrana y tiene un dominio intracelular, una
región transmembrana y un dominio extracelular o un fragmento del
mismo) puede imitar a las células T en cuanto a su capacidad para
inducir el crecimiento de las células B, la diferenciación y la
estimulación de la producción de anticuerpos específicos de
antígeno. Parece que las actividades del CD40-L
oligomérico soluble, preferentemente un dímero de regiones
extracelulares, pueden imitar a las actividades biológicas del
CD40-L unido a la membrana. Es más, el
CD40-L monomérico soluble (que comprende el dominio
extracelular o un fragmento del mismo) se puede unir al receptor de
CD40 para impedir la interacción de las células T con las células B
y, por tanto, tiene una actividad similar al dominio extracelular
de CD40 (receptor), que él mismo puede estar en forma monomérica u
oligomérica. Como alternativa, el CD40-L puede ser
oligomérico (preferentemente un dímero) para actuar como un factor
soluble capaz de inducir el crecimiento de las células B, su
diferenciación y la estimulación de la producción de anticuerpos
específicos de antígeno. En consecuencia, parece que el
CD40-L unido a la membrana y el
CD40-L oligomérico actúan como agonistas del CD40,
mientras que el CD40-L soluble (monomérico) y el
CD40 soluble actúan como antagonistas de CD40 mediante el bloqueo
de los sitios en el receptor CD40 sin transducir la señal de forma
significativa o impidiendo la unión de CD40-L a los
sitios de CD40 en las células B y en otras células diana.
Tanto los agonistas de CD40 como las
antagonistas de CD40 tendrán una actividad terapéutica útil. Por
ejemplo, los agonistas de CD40 (es decir, el CD40L unido a la
membrana y el CD40-L oligomérico) son útiles como
adyuvantes de vacunas y para estimular la producción de AcMo por
parte de las células de hibridoma. Los antagonistas de CD40 (es
decir, el receptor de CD40, CD40/Fc y posiblemente el
CD40-L monomérico, soluble) son útiles para tratar
enfermedades autoinmunitarias que se caracterizan por la presencia
de niveles elevados de complejos
anticuerpo-antígeno, tales como alergia, lupus,
artritis reumatoide, diabetes mellitus insulinodependiente (DMID),
enfermedad injerto contra huésped (GVHD) y otras. Por tanto, en
otros aspectos, la invención proporciona: el uso de un polipéptido
de CD40-L monomérico soluble de la invención en la
preparación de un medicamento para tratar alergias, una reacción
alérgica, lupus, artritis reumatoide o enfermedad injerto contra
huésped; una vacuna que comprende un oligómero del polipéptido de
CD40-L de la invención como adyuvante; una
composición farmacéutica que comprende un polipéptido o un
oligómero de la invención junto con un excipiente farmacéuticamente
aceptable; y un procedimiento para estimular células de hibridoma
para incrementar la secreción de anticuerpos monoclonales, que
comprende administrar a dichas células de hibridoma una cantidad
eficaz de un oligómero del polipéptido de CD40-L de
la invención.
La secreción de IgE por parte de las células B
humanas se puede inducir mediante IL-4 en presencia
de células T (Vercelli y col., J. Exp. Med. 169: 1295,
1989). Además, la producción de IgE se puede inducir a partir de
PBM (células mononucleares de sangre periférica) con depleción de
células T mediante la adición de un AcMo antiCD40 (Jabara y col.,
J. Exp. Med. 172: 1861, 1990 y Zhang y col., J.
Immunol. 146: 1836, 1991). Un procedimiento para inhibir la
producción de IgE por parte de células B activadas, activada por
IL-4 en presencia de células T o por
CD40-L (preferentemente, CD40-L
unido a la membrana), comprende la administración de una cantidad
eficaz de una proteína de fusión CD40/Fc, como se describe en la
presente memoria descriptiva, o un CD40 soluble codificado por la
secuencia de ADNc descrita en la SEQ ID Nº 3. De igual forma, los
receptores de CD40 y posiblemente el CD40-L soluble
(sólo el monómero) también pueden bloquear la secreción de otros
isotipos de anticuerpos.
La presente invención además incluye
polipéptidos de CD40-L con o sin una glucosilación
de patrón nativo asociada. El CD40-L expresado en
sistemas de expresión de levadura o de mamífero (por ejemplo,
células COS-7) puede ser similar a
significativamente diferente de un polipéptido de
CD40-L nativo en cuanto al peso molecular y al
patrón de glucosilación, dependiendo de la elección del sistema de
expresión. La expresión de polipéptidos de CD40-L
en sistemas de expresión bacterianos, tales como E. coli,
proporciona moléculas no glucosiladas.
Se pueden preparar construcciones de ADN que
codifican varias adiciones o sustituciones de residuos o secuencias
de aminoácidos, o deleciones de residuos o secuencias terminales o
internos que no se necesitan para la actividad biológica o para la
unión. Por ejemplo, el sitio de N-glucosilación en
el dominio extracelular de CD40-L se puede
modificar para impedir la glucosilación mientras se permite la
expresión de un análogo hidrato de carbono reducido y homogéneo
usando sistemas de expresión en levaduras. Los sitios de
N-glucosilación en polipéptidos eucarióticos se
caracterizan por un triplete de aminoácidos
Asn-X-Y, en el que X es cualquier
aminoácido excepto Pro, e Y es Ser o Thr. Las modificaciones
adecuadas en la secuencia de nucleótidos que codifica este triplete
darán como resultado sustituciones, adiciones o deleciones que
impidan la unión de residuos de hidratos de carbono en la cadena
lateral de la Asn. En otro ejemplo, se pueden alterar secuencias que
codifican residuos de Cys para provocar que los residuos de Cys se
delecionen o se sustituyan con otros aminoácidos, impidiendo la
formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos tras la
renaturalización. El CD40-L humano comprende cinco
residuos de Cys en su dominio extracelular. Por tanto, al menos uno
de los cinco residuos de Cys se puede sustituir con otro aminoácido
o delecionarse sin que afecte a la estructura terciaria de la
proteína o a la formación de puentes disulfuro.
Otros enfoques de la mutagénesis implican la
modificación de secuencias que codifican residuos de aminoácidos
dibásicos para aumentar la expresión en sistemas en levaduras en los
que está presente actividad de KEX2 proteasa. Pueden construirse
subunidades de un polipéptido de CD40-L mediante la
deleción de secuencias que codifican residuos o secuencias
terminales o internas.
Los polipéptidos CD40-L son
codificados por genes multiexones. La presente invención también
incluye construcciones de ARNm alternativas que se pueden atribuir
a distintos eventos de separación de ARN tras la transcripción y
que comparten regiones de identidad o similitud con los ADNc
descritos en el presente documento.
Los oligonucleótidos antisentido o sentido
comprenden una secuencia de ácido nucleico (ARN o ADN) monocatenario
capaz de unirse a las secuencias de ARNm (sentido) del
CD40-L diana o de ADN (antisentido) del
CD40-L. Los oligonucleótidos antisentido o sentido
pueden comprender un fragmento de la SEQ ID Nº 1 o de la SEQ ID Nº
11 o un ADN o un ARN complementario de la SEQ ID Nº 1 o de la SEQ ID
Nº 11. Tal fragmento comprende al menos aproximadamente 14
nucleótidos. Preferentemente, tal fragmento comprende de
aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos. La capacidad
para crear un oligonucleótido antisentido o sentido, basado en una
secuencia de ADNc para el CD40-L, se describe en,
por ejemplo, Stein y Cohen, Cancer Res. 48: 2659, 1988 y van
der Krol y col., BioTechniques 6: 958, 1988.
La unión de oligonucleótidos antisentido o
sentido a secuencias de ácido nucleico diana tiene como resultado
la formación de dúplex que bloquean la traducción (ARN) o la
transcripción (ADN) a través de uno de varios medios, incluido el
aumento de la degradación de los dúplex, la terminación prematura de
la transcripción o de la traducción, o por otros medios. Entre los
promotores de la polimerasa adecuados se incluyen los promotores
para cualquier ARN polimerasa o promotores para cualquier ADN
polimerasa. Los oligonucleótidos antisentido o sentido además
comprenden oligonucleótidos que tienen estructuras de
fosfodiéster-azúcar modificada (u otros enlaces
entre azúcares, tales como los descritos en el documento WO91/06629)
y en los que tales enlaces entre azúcares son resistentes a las
nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces entre
azúcares resistentes son estables in vivo (es decir, capaces
de resistir la degradación enzimática) pero retienen la
especificidad de la secuencia para poder unirse a las secuencias
nucleotídicas diana. Otros ejemplos de oligonucleótidos sentido o
antisentido incluyen los oligonucleótidos que están unidos
covalentemente a restos orgánicos, tales como los descritos en el
documento WO 90/10448, y otros restos que aumentan la afinidad del
oligonucleótido por una secuencia de ácido nucleico diana, tal como
poli(L-lisina). Todavía más, a los
oligonucleótidos sentido o antisentido pueden unirse agentes
intercalantes, tales como elipticina, y agentes alquilantes o
complejos metálicos, para modificar las especificidades de unión
del oligonucleótido antisentido o sentido por la secuencia
nucleotídica diana. Los oligonucleótidos antisentido o sentido
pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de
ácido nucleico diana mediante cualquier procedimiento de
transferencia génica, incluyendo, por ejemplo, transfección de ADN
mediada por CaPO_{4}, electroporación, u otros vectores de
transferencia génica como el virus de Epstein-Barr.
Los oligonucleótidos antisentido o sentido se introducen
preferentemente en una célula que contiene la secuencia de ácido
nucleico diana mediante inserción del oligonucleótido antisentido o
sentido en un vector retroviral adecuado, después la célula se pone
en contacto con el vector retrovirus que contiene la secuencia
insertada, ya sea in vivo o ex vivo. Los vectores
retrovirales adecuados incluyen, pero no se limitan a, los
retrovirus murinos M-MuLV, N2 (un retrovirus
derivado de M-MuLV), o los vectores de doble copia
designados DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase la solicitud PCT US
90/02656). Como alternativa, se pueden usar otras secuencias
promotoras para expresar el oligonucleótido.
Los oligonucleótidos sentido o antisentido
también pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia
nucleotídica diana mediante la formación de un conjugado con una
molécula de unión al ligando, según se describe en el documento WO
91/04753. Las moléculas de unión al ligando incluyen, pero no se
limitan a, receptores de superficie celular, factores de
crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que se unen a los
receptores de superficie celular. Preferentemente, la conjugación
de la molécula de unión al ligando no interfiere sustancialmente
con la capacidad de la molécula de unión al ligando para unirse a su
correspondiente molécula o receptor o bloquea la entrada de un
oligonucleótido sentido o antisentido o su versión conjugada en la
célula.
Como alternativa, un oligonucleótido sentido o
antisentido puede introducirse en una célula que contiene la
secuencia de ácido nucleico diana mediante la formación de un
complejo oligonucleótido-lípido, según se describe
en el documento WO 90/10448. El complejo oligonucleótido sentido o
antisentido-lípido preferentemente se disocia en el
interior de la células por acción de una lipasa endógena.
La secuencia del ADNc del CD40-L
murino se obtuvo mediante técnicas de expresión directa. La
secuencia del CD40-L humano se obtuvo mediante
técnicas de hibridación de especies cruzadas usando el ADNc del
CD40-L murino como sonda.
Nosotros hemos clonado el CD40-L
murino mediante la obtención en primer lugar de un clon de la región
extracelular del CD40 humano (el receptor) por técnicas de la
reacción en cadena la de polimerasa (PCR) usando cebadores basados
en una secuencia publicada en Stamenkovic y col. (SEQ ID Nº 4). Un
cebador oligonucleotídico anteriormente en la cadena de DNA,
5'-CCGTCGACCACCATGGTTCGTCTGCC-3'
(SEQ ID Nº 5) introduce un sitio Sal I anteriormente en la
cadena de DNA de un iniciador metionina de CD40 y un cebador
oligonucleotídico posteriormente en la cadena de DNA
5'-CCGTCGACGTCTAGAGCCGATCCTGGGG-3'
(SEQ ID Nº 6) inserta un codón de terminación tras el aminoácido
192 de CD40, seguido por sitios Xba 1 y Sal 1. El ADNc amplificado
se digirió con Sal I y se clonó en pDC406 (McMahan y col., EMBO
J. 10: 2821, 1991) para construir pDC406/s CD40.
Un segundo fragmento del receptor CD40 (SEQ ID
Nº 4) se obtuvo mediante técnicas de PCR para la fusión con el
dominio Fc de IgG1 humana (SEQ ID Nº 3). Brevemente, el cebador
oligonucleotídico en 5' (SEQ ID Nº 5) y el molde de fusión (SEQ ID
Nº 4) fueron los mismos que anteriormente. El cebador
oligonucleotídico posteriormente en la cadena de DNA fue
5'-ACAAGATCTGGGCTCTACGTATCTCAGCCGATCCTGGGGAC-3'
(SEQ ID Nº 7) que inserta los aminoácidos Tyr Val Glu Pro Arg (SEQ
ID Nº 8) tras el aminoácido 193 del CD40. Glu y Pro son los primeros
dos aminoácidos de una región bisagra de la IgG1 humana y están
seguidos por un sitio de restricción Bgl II. El sitio de restricción
Bgl II se usó para fusionar el dominio extracelular del CD40 al
resto de la región Fc de la IgG1.
Otras proteínas de fusión que comprenden
dominios de unión al ligando de otros receptores se pueden preparar
mediante la obtención de una secuencia de ADN para el dominio de
unión al ligando de un receptor y fusionar esta secuencia a una
secuencia de ADN que codifica una región Fc de una molécula
anticuerpo que se une a la proteína A o a la proteína G, u otro
polipéptido que es capaz de purificación por afinidad, por ejemplo,
avidina o estreptavidina. La construcción génica resultante se
puede introducir en células de mamífero para expresar
transitoriamente una proteína de fusión. Las proteínas de fusión
receptor/Fc se pueden purificar mediante purificación por afinidad
de la proteína A o la proteína G. Las proteínas de fusión
receptor/avidina se pueden purificar mediante cromatografía de
afinidad por biotina. Después la proteína de fusión puede retirarse
de la columna mediante la elución con una solución rica en sales u
otro tampón adecuado.
Nosotros obtuvimos un ADNc que codificaba la
región Fc de la IgG1 humana mediante amplificación por PCR usando
ADNc de células humanas como molde y un cebador oligonucleotídico
anteriormente en la cadena de DNA
5'-TATTAATCATTCAGAGGGCCCAGATCTTGTGACAAAACTCAC-3'
(SEQ ID Nº 9) y un cebador oligonucleotídico posteriormente en la
cadena de DNA
5'-GCCAGCTTAACTAGTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGA-3''
(SEQ ID Nº 10). El ADNc amplificado por PCR introdujo un sitio
Bgl II cerca del inicio de la región HINGE, que se usó para
ligar el dominio extracelular de CD40 para construir un ADNc de
fusión CD40/Fc, que se ligó en pDC406 para construir
pDC406/CD40/Fc. Otras regiones Fc adecuadas se definen como
cualquier región que se pueda unir con una afinidad elevada a la
proteína A o a la proteína G e incluye la región Fc de la IgG1
humana o la IgG1 murina. Un ejemplo es la región Fc de la IgG1
humana que se muestra en la SEQ ID Nº 3 o el ADNc obtenido mediante
PCR de los cebadores oligonucleotídicos de la SEQ ID Nº 9 y la SEQ
ID Nº 10 con ADNc humano como molde.
Preferentemente, las moléculas de fusión
receptor/Fc se sintetizan en cultivos de células de mamífero
recombinantes porque generalmente son demasiado grandes y complejas
para sintetizarse a través de procedimientos de expresión
procarióticos. Ejemplos de células de mamífero adecuadas para
expresar una proteína de fusión receptor/Fc incluyen células
CV-1 (ATCC CCL 70) y células COS-7
(ATCC CRL 1651), ambas derivadas de riñón de mono.
La construcción de ADN pDC406/CD40/Fc se
transfectó en la línea celular de riñón de mono
CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478). El plásmido pDC406
incluye secuencias reguladoras derivadas de SV40, el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH) y el virus de
Epstein-Barr (EBV). La línea celular
CV-1/EBNA se derivó de la transfección de la línea
células CV-1 con un gen que codifica el antígeno 1
nuclear del virus de Epstein-Barr
(EBNA-1) y que expresa de forma constitutiva
EBNA-1 impulsado por el promotor/intensificador
inmediato-temprano de CMV humano. Un gen
EBNA-1 permite la replicación episomal de los
vectores de expresión tales como pDC406, que contienen el origen de
replicación del EBV.
Los transfectantes que expresan la proteína de
fusión CD40/Fc se identifican, inicialmente, usando transferencia
de puntos o transferencias de tipo Western. Después, los
sobrenadantes se someten a transferencia de puntos o a
electroforesis en gel seguido por transferencia de las proteínas
sometidas a la electroforesis para la unión al AcMo
G-28-5 (un anticuerpo que se une al
receptor de CD40 humano). Las proteínas transferidas se incubaron a
continuación con la proteína A marcada radioactivamente con
^{125}I, se lavaron para eliminar el marcador sin unir y se
analizaron para detectar la expresión de Fc. El anticuerpo
monoclonal G28-5 se produjo según Clark y col.,
supra.
Una vez que se hubieron identificado las células
que expresaban la construcción de fusión, se indujo el crecimiento
a gran escala de cultivos de células que se habían transfectado,
para acumular sobrenadante de las células que expresaban CD40/Fc.
La proteína de fusión CD40/Fc en el líquido sobrenadante se purificó
mediante purificación por afinidad. Brevemente, se purificó un
litro de sobrenadante del cultivo que contenía la proteína de fusión
CD40/Fc mediante filtración de los sobrenadantes de células de
mamífero (por ejemplo, en un filtro de 0,45 \mu) y la aplicación
del filtrado a una columna de afinidad por anticuerpo frente a las
proteínas A/G (Schleicher y Schuell, Keene, NH) a 4ºC a un caudal
de 80 ml/h para una columna de 1,5 cm x 12,0 cm. La columna se lavó
con NaCl 0,5M en PBS hasta que no se pudo detectar proteína libre en
el tampón de lavado. Por último, la columna se lavó con PBS. La
proteína de fusión unida se eluyó de la columna con tampón citrato
25 mM, pH 2,8, y se llevó hasta un pH 7 con tampón Hepes 500
mM,
pH 9,1. Los geles SDS marcados con plata de la proteína de fusión CD40/Fc mostraron que tenía una pureza > 98%.
pH 9,1. Los geles SDS marcados con plata de la proteína de fusión CD40/Fc mostraron que tenía una pureza > 98%.
El CD40 soluble (sCD40) y las proteínas de
fusión CD40/Fc se prepararon como se describe en la presente memoria
descriptiva. Los sobrenadantes se purificaron con una columna de
afinidad por G28-5 (AcMo antiCD40) para purificar
por afinidad el sCD40 expresado por las células transfectadas
CV-1/EBNA. Se agruparon las fracciones que contenían
la proteína y se extrajeron alícuotas para realizar ensayos y
análisis de unión a G28-5 mediante
SDS-PAGE (electroforesis en geles de poliacrilamida
dodecilsulfato sódico) en presencia de ditiotreitol 1 mM como agente
reductor. Se observó una única banda de un peso molecular de 28.100
daltons. En ausencia de agente reductor, el análisis por
SDS-Page del sCD40 reveló dos bandas, una banda
principal de peso molecular 56.000 y una banda menor de peso
molecular 28.000. El patrón de bandas indica que la mayoría del
sCD40 existe en forma de homodímero en solución unido por puentes
disulfuro. La banda de 28.000 es monómero libre.
Las proteínas CD40 se visualizaron mediante
tinción de plata. Las concentraciones de proteína en la muestra se
determinaron usando un ensayo micro-BCA (Pierce) con
seroalbúmina bovina ultrapura como referencia. La pureza del CD40
soluble y la concentración proteica se confirmaron mediante análisis
de aminoácidos. El CD40 soluble purificado se absorbió a papel de
PVDF y el papel se sometió a degradación de Edman automática en un
secuenciador de proteínas modelo 477A de Applied Biosystems
siguiendo las instrucciones del fabricante para secuenciar el
extremo N de la proteína. Este procedimiento comprobó la secuencia
proteica del sCD40.
El CD40 soluble y la proteína de fusión CD40/Fc
pudieron modular las respuestas de las células B humanas en
ausencia de AcMo antiCD40 (G28-5). Las células B
purificadas procedentes de amígdalas se cultivaron con antiIgM e
IL-4 humana y se añadió sCD40 o proteína de fusión
CD40/Fc. Ninguna de las formas de CD40 tuvo un efecto inhibidor
sobre la proliferación de células B (medido mediante la
incorporación de timidina tritiada). Por el contrario, el receptor
de IL-4 inhibió la proliferación de células B
inducida por IL-4 de forma dependiente de
concentración.
El CD40 soluble y la CD40/Fc se probaron para
determinar su capacidad para inhibir la secreción de IgE inducida
por IL-4 en un sistema CML (cultivo de linfocitos
mixto) de 2-donantes. En tres experimentos, el nivel
de producción de IgE se redujo a medida que se aumentó la
concentración de CD40. El CD40 soluble, añadido a una concentración
de 10 \mug/ml, fue capaz de inhibir por completo la secreción de
IgE en este modelo de alergia. Además, la CD40/Fc tuvo efectos
similares que su homónimo soluble. Sin embargo, la adición de una
proteína de fusión receptor de
IL-7-Fc (preparada mediante
procedimientos similares con una secuencia de receptor de
IL-7 publicada) no afectó a la secreción de IgE en
este modelo.
Los niveles de CD23 también se midieron en el
mismo CML en respuesta a sCD40 o a las proteínas de fusión CD40/Fc.
El CD40 soluble produjo una pequeña, pero reproducible disminución
del nivel de sCD23 al sexto día en comparación con los cultivos
estimulados con IL-4 sola, sin embargo, en los
mismos cultivos se produjo un efecto inhibidor más fuerte el día
12. La inducción de CD23 soluble por células E-PBM
(macrófagos de sangre periférica) con depleción de células T
estimuladas por IL-4 se vio afectada de forma
similar por la adición de sCD40, lo que causó una pequeña
disminución de los niveles de sCD23 el sexto día y una inhibición
más pronunciada el día 12. En cada sistema de cultivo, los
resultados con la proteína de fusión CD40/Fc fueron sustancialmente
los mismos que los observados con sCD40.
En un esfuerzo por aislar un ADNc para un
CD40-L, la proteína CD40/Fc purificada se marcó
radiactivamente con ^{125}I usando un agente de fase sólida
comercialmente disponible (IODO-GEN, Pierce). En
este procedimiento, se sembraron 5 \mug de
IODO-GEN en el fondo de un tubo de vidrio de 10 x 75
mm y se incubaron durante veinte minutos a 4ºC con 75 \mul de
fosfato sódico 0,1 M, pH 7,4 y 20 \mul (2 mCi) de Na^{125}I. A
continuación se transfirió la solución a un segundo tubo de vidrio
que contenía 5 \mug de CD40/Fc en 45 \mul de PBS (suero salino
tamponado con fosfato) y esta mezcla de reacción se incubó durante
veinte minutos a 4ºC. La mezcla de reacción se fraccionó mediante
filtración en gel en un volumen de lecho de Sephadex®
G-25 (Sigma) de 2 ml y después se equilibró en
medio RPMI 1640 que contenía 2,5% (v/v) de seroalbúmina bovina
(BSA), 0,2% (v/v) de azida sódica y HEPES 20 mM, medio de unión a
pH 7,4. La acumulación final de CD40^{125}I/Fc se diluyó hasta
obtener una solución SOTCK de trabajo de 1 x 10^{-7}M en medio de
unión y se almacenó durante hasta un mes a 4ºC sin que se observara
ninguna pérdida detectable de la actividad de unión del
receptor.
Se preparó una genoteca de ADNc a partir de la
línea celular EL4 seleccionada mediante FACS (separación de células
activada por fluorescencia) sobre la base de la unión de una
proteína de fusión CD40/Fc biotinilada. Las células se separaron
cinco veces hasta que se produjo un desplazamiento significativo de
la intensidad de la fluorescencia basado en la expresión de un
ligando para CD40 por las células EL-4 seleccionadas
Las células separadas cinco veces se denominaron células
EL-40.5 y estas células se cultivaron con los
propósitos de crear una genoteca de ADNc a partir del ARNm de
EL-40.5 Brevemente, el ADNc se sintetizó, se insertó
en un vector pCD406 vacío y se transformó en E. coli. Los
transformantes se agruparon y el ADN de las acumulaciones se aisló
y se transfectó a células CV1-EBNA para crear una
biblioteca de clonación de expresión. Las células
CV-1-EBNA transfectadas se
cultivaron en plaquillas durante tres días para permitir la
expresión transitoria del CD40-L. Las plaquillas
que contenían las células transfectadas se incubaron a continuación
con CD40/Fc radioyodada, se lavaron para eliminar la CD40/Fc sin
unir, y se fijaron con glutaraldehído. Las plaquillas fijadas se
sumergieron en una emulsión fotográfica líquida y se expusieron en
oscuridad. Después de revelar las plaquillas se analizaron de forma
individual con un microscopio y las células que expresaban
CD40-L se identificaron por la presencia en la
autorradiografía de granos de plata contra un entorno claro.
La biblioteca de clonación de expresión de
células EL-40.5 se sometieron a detección selectiva
y un grupo, que contenía aproximadamente 2000 clones individuales,
se identificó como positivo para la unión de la proteína de fusión
CD40/Fc marcada con ^{125}I. Este grupo de dividió en grupos más
pequeños de aproximadamente 200 colonias. Los grupos más pequeños
se sometieron a detección selectiva como se ha descrito
anteriormente. Uno de los grupos pequeños fue positivo para el
CD40-L.
Un único clon se aisló y se secuenció mediante
técnicas estándar, para proporcionar la secuencia de ADNc y se
dedujo la secuencia de aminoácidos del CD40-L murino
como se muestra en la figura 1 y la SEQ ID Nº 1.
El ADNc del CD40-L homólogo
humano se descubrió mediante técnicas de hibridación con especies
cruzadas. Brevemente, se preparó una genoteca de ADNc de linfocitos
de sangre periférica (PBL) humanos a partir de linfocitos de sangre
periférica tratados con el anticuerpo OKT3 (ATCC, Rockville MD), que
se une al CD3 (10 ng/ml) y a la interleuquina-2
(IL-2, 10 ng/ml), durante seis días. Se lavaron las
células PBL y después se estimularon durante 4 horas con 10 ng/ml
de PMA (acetato de miristato de forbol, Sigma St Louis) y 500 ng/ml
de ionomicina (Calbiochem). El ARN mensajero se aisló a partir de
células PBL, se formó ADNc y el ADNc se ligó en engarces de Eco
R1. El ADNc ligado se insertó en el sitio Eco R1 del
vehículo de clonación fago \lambdagt10 (Gigapak® Stratagen, San
Diego, CA) según las instrucciones del fabricante. El fago se
amplificó, se sembró a densidades de aproximadamente 20.000 fagos
por 15 cm de placa y se realizaron los ensayos del fago, como se
describe en Maniatis y col., Molecular Biology: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982, páginas
316-328. Se construyó una sonda murina
correspondiente a la región codificadora del CD40-L
murino desde el nucleótido 13 al nucleótido 793 de la SEQ ID Nº 1 y
la figura 1. Esta sonda hibridó con los ensayos del fago de la
biblioteca de PBL en condiciones de moderada a intensamente
rigurosas. Brevemente, las condiciones de hibridación fueron 6 x
SSC, 1 x solución de Denhardt, EDTA 2 mM, 0,5% de Np40 (detergente
Nonidet P-40) a 63ºC durante la noche. Este se
siguió de lavado en 3 x SSC, 0,1% de SDS durante tres horas a 55ºC,
seguido por exposición durante la noche a película de rayos X. Las
placas positivas se identificaron con una frecuencia de
aproximadamente 1 por 1000 placas. Las placas positivas se
purificaron dos veces y se preparó ADNc a partir de cultivos
amplificados.
Se pueden usar las secuencias del ADNc del
CD40-L murino o humano descritas en la presente
memoria descriptiva para obtener ADNc que codifican otros homólogos
mamíferos de CD40-L murino o humano mediante
técnicas de hibridación con especies cruzadas. Brevemente, a partir
de la secuencia de nucleótidos de la región extracelular del
CD40-L murino según se describe el la figura 1 (SEQ
ID Nº 1) o del CD40-L humano según se describe en la
figura 2 (SEQ ID Nº 11) se crea una sonda oligonucleotídica. Esta
sonda se puede preparar mediante técnicas estándar, tales como las
descritas en Maniatis y col., supra. La sonda murina o humana
se usa para seleccionar una genoteca de ADNc de mamíferos o una
biblioteca genómica en condiciones de rigurosidad moderada. Entre
los ejemplos de ADNc de mamífero o de bibliotecas genómicas se
incluyen, para ADNc, una biblioteca formada por linfocitos de
sangre periférica de mamífero. Como alternativa, varias genotecas de
ADNc o de ARNm aislados de varias líneas celulares se pueden
seleccionar mediante hibridación Northern para determinar una fuente
adecuada de ADN o ARNm de CD40-L de mamífero.
Los vectores de expresión recombinante para la
expresión de CD40-L mediante técnicas de ADN
recombinante incluyen una secuencia de ADN de
CD40-L que comprende un fragmento de ADN sintético o
derivado de ADNc que codifica un polipéptido de
CD40-L, operablemente unido a una secuencia
nucleotídica adecuada reguladora de la transcripción o de la
traducción, tal como una derivada de un gen de mamífero, de
bacteria, de virus o de insecto. Ejemplos de secuencias reguladoras
incluyen secuencias que tienen un papel regulador en la expresión
génica (por ejemplo, un promotor o un intensificador de la
transcripción), opcionalmente una secuencia operadora para controlar
la transcripción, una secuencia que codifica un sitio de unión al
ARNm ribosómico y secuencias adecuadas que controlan la iniciación
y la terminación de la transcripción y la traducción. Las secuencias
nucleotídicas se unen operablemente cuando la secuencia reguladora
está funcionalmente relacionada con la secuencia de ADN del
CD40-L. Por tanto, una secuencia nucleotídica
promotor se une operablemente a la secuencia de ADN del
CD40-L si la secuencia nucleotídica promotor
controla la transcripción de la secuencia de ADN del
CD40-L. Todavía más, un sitio de unión al ribosoma
puede estar operablemente unido a una secuencia para un polipéptido
de CD40-L si el sitio de unión al ribosoma está
colocado en el interior del vector para estimular la traducción.
Además, las secuencias que codifican los péptidos señal se pueden
incorporar en vectores de expresión. Por ejemplo, una secuencia de
ADN para un péptido señal (líder secretor) puede estar operablemente
unida a una secuencia de ADN del CD40-L. El péptido
señal se expresa como una secuencia de aminoácidos precursora, que
permite mejorar la secreción extracelular del polipéptido de fusión
traducido por una célula huésped de levadura.
Las células huésped adecuadas para la expresión
de polipéptidos de CD40-L incluyen células
procariotas, células de levadura o células eucariotas superiores.
Las procariotas incluyen organismos gram-negativos o
gram-positivos, por ejemplo, E. coli o
Bacilli. Las células huésped procarióticas adecuadas para la
transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus
subtilis, Salmonella typhimurium y varias otras especies
de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y
Staphylococcus. Las células eucarióticas superiores incluyen
líneas celulares establecidas de origen mamífero. También se podrían
usar sistemas de traducción acelulares para producir polipéptidos
de CD40-L usando ARN derivados de construcciones de
ADN descritas en la presente memoria descriptiva. Los vectores de
clonación y expresión adecuados para usar con huéspedes celulares
bacterianos, fúngicos, de levaduras y de mamífero se describen, por
ejemplo, en Pouwels y col. Cloning Vectors: A Laboratory
Manual, Elsevier, Nueva York, (1985).
En una célula huésped procariota, tal como E.
coli, un polipéptido de CD40-L o un análogo
puede incluir un residuo de metionina en el extremo N para
facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula
huésped procariota. La Met del extremo N puede escindirse del
polipéptido de CD40-L recombinante expresado. Las
células huésped procariotas pueden usarse para la expresión de
polipéptidos de CD40-L que no requieren un
procesamiento extenso proteolítico o por disulfuro.
Los vectores de expresión que portan la
secuencia de ADN de CD40-L se transfectan o se
transforman en un cultivo sustancialmente homogéneo de un
microorganismo huésped adecuado o de una línea de células de
mamífero. Las células huésped transformadas son células que se han
transformado o transfectado con secuencias nucleotídicas que
codifican polipéptidos de CD40-L y que expresan
polipéptidos de CD40-L. Los polipéptidos de
CD40-L expresados se localizarán en la célula
huésped y/o se secretarán al fluido sobrenadante del cultivo,
dependiendo de la naturaleza de la célula huésped y de la
construcción génica insertado en la célula huésped.
Los vectores de expresión que se han
transfectado en células huésped procariotas generalmente comprenden
uno o más marcadores fenotípicos seleccionables. Un marcador
fenotípico seleccionable es, por ejemplo, un gen que codifica una
proteína que confiere resistencia a un antibiótico o que suministra
un requerimiento autótrofo, y un origen de replicación reconocido
por el huésped para garantizar la amplificación en el huésped. Otros
vectores de expresión útiles para las células huésped procariotas
incluyen un marcador seleccionable de origen bacteriano derivado de
plásmidos comercialmente disponibles. Este marcador seleccionable
puede comprender elementos genéticos del vector de clonación pBR322
(ATCC 37017). El pBR322 contiene genes de resistencia a ampicilina
y a tetraciclina y, por tanto, proporciona medios simples para
identificar las células transformadas. Las secciones
"estructurales" del pBR322 se combinan con un promotor adecuado
y una secuencia de ADN del CD40-L. Otros vectores
comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3
(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega
Biotec, Madison, WI, EE.UU.).
Las secuencias promotoras se usan habitualmente
para los vectores de expresión recombinante de la célula huésped
procariota. Las secuencias promotoras habituales incluyen la
\beta-lactamasa (penicilinasa), el sistema del
promotor lactosa (Chang y col., Nature 275: 615, 1978; y
Goeddel y col., Nature 281: 544, 1979), el sistema del
promotor triptófano (trp) (Goeddel y col., Nucl. Acids Res.
8: 4057, 19080 y el documento
EP-A-36776) y el sistema del
promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pág. 412, 1982). Un
sistema de expresión de células huésped procariotas particularmente
útil usa un promotor P_{L} del fago \gamma y una secuencia
represora termolábil cI857ts. Entre los vectores plasmídicos
disponibles en la American Type Culture Collection que incorporan
derivados del promotor P_{L} \gamma se incluyen el plásmido
pHUB2 (residente en la cepa de E. coli JMB9 (ATCC 37092) y el
pPLc28 (residente en E. coli RR1 (ATCC 53082)).
El CD40L se puede expresar en las células
huésped de levadura, preferentemente del género Saccharomyces
(por ejemplo, S. cerevisiae). También se pueden usar otros
géneros de levadura, tales como Pichia o
Kluyveromyces. Los vectores de levadura a menudo contendrán
una secuencia de origen de replicación de un plásmido de levadura
de 2 \mu, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región
promotora, secuencias para la poliadenilación, y secuencias para la
terminación del la transcripción. Preferentemente, los vectores de
levadura incluyen una secuencia de origen de replicación y un
marcador seleccionable. Las secuencias promotoras adecuadas para
los vectores de levadura incluyen promotores de metalotioneína, la
3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J.
Biol. Chem. 255: 1073, 1980) u otras enzimas glucolíticas (Hess
y col., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; y Holland y col.,
Biochem. 17: 4900, 1978), tales como enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa.
Otros vectores y promotores adecuados para usar en la expresión en
levaduras se describen en Hitzeman, EPA-73.657.
Se pueden simular vectores de levaduras usando,
por ejemplo secuencias de ADN de pBR322 para su selección y
replicación en E. coli (gen Amp^{r} y origen de
replicación). Otras secuencias de ADN de levadura que se pueden
incluir en una construcción de expresión en levaduras incluyen un
promotor ADH2 reprimible por glucosa y un líder de secreción de
factor \alpha. Russell y col. (J. Biol. Chem. 258: 2674,
1982) y Beier y col. (Nature 300: 724, 1982) han descrito el
promotor ADH2. La secuencia líder del factor \alpha de levadura
dirige la secreción de polipéptidos heterólogos. A menudo, la
secuencia líder del factor \alpha se inserta entre la secuencia
promotora y la secuencia de genes estructurales. Véanse, por
ejemplo, Kurjan y col., Cell 30: 933, 1982 y Bitter y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 81: 5330, 1984. Otras
secuencias líder adecuadas para facilitar la secreción de
polipéptidos recombinantes de huéspedes levadura se conocen por
aquellos expertos en la técnica. Una secuencia líder se puede
modificar cerca de su extremo 3' para que contenga uno o más sitios
de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia líder con
el gen
estructural.
estructural.
Los protocolos de transformación en levaduras se
conocen por los expertos en la técnica. Uno de estos protocolos lo
describen Hinnen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 75:
1929, 1978. El protocolo de Hinnen y col. selecciona transformantes
Trp+ en un medio selectivo, en el que el medio selectivo consiste en
0,67% de base nitrogenada de levadura, 0,5% de ácidos de casamino,
2% de glucosa, 10 \mug/ml de adenina y 20 \mug/ml de adenina y
20 \mug/ml de uracilo.
Se puede estimular el crecimiento de las células
huésped de levadura transformadas con vectores que contienen la
secuencia promotora ADH2 para inducir la expresión en un medio
"rico". Un ejemplo de un medio rico es uno compuesto por un 1%
de extracto de levadura, 2% de peptona y 1% de glucosa complementada
con 80 \mug/ml de adenina y 80 \mug/ml de uracilo. Cuando se
agota la glucosa del medio se produce la depresión del promotor
ADH2.
Los sistemas de cultivo de células huésped de
mamífero o de insecto también podrían usarse para expresar
polipéptidos de CD40-L recombinantes. Los ejemplos
de líneas de células huésped de mamífero adecuadas incluyen la línea
COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651)
(Gluzman y col., Cell 23: 175, 1981), células L, células C127,
células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino
(CHO), células HeLa y líneas celulares BHK (ATCC CRL 10). Entre los
vectores de expresión de mamíferos adecuados se incluyen elementos
no transcritos, tales como un origen de replicación, una secuencia
promotora, un intensificador unido al gen estructural, otras
secuencias no transcritas adyacentes a 5' o a 3', tales como sitios
de unión al ribosoma, un sitio de poliadenilación, sitios
receptores o aceptores de ayustamiento y secuencias de terminación
de la transcripción.
Las secuencias de control de la transcripción y
de la traducción para los vectores de expresión de células huésped
de mamífero se pueden escindir de genomas virales. Por ejemplo, las
secuencias promotoras e intensificadoras de células de mamífero
usadas de forma habitual derivan del virus del polioma, del
adenovirus 2, del virus 40 de simios (SV40) y del citomegalovirus
humano. Se pueden usar secuencias de ADN derivadas del genoma del
virus SV40, por ejemplo, el origen SV40, los promotores temprano y
tardío, los sitios intensificadores, de ayustamiento y de
poliadenilación, para proporcionar los otros elementos genéticos
requeridos para la expresión de una secuencia de genes
estructurales en una célula huésped de mamífero. Los promotores
virales tempranos y tardíos son particularmente útiles porque ambos
se pueden obtener con facilidad de un genoma viral como un
fragmento que también puede contener un origen de replicación viral
(Fiers y col., Nature 273: 113, 1978). También se pueden
usar fragmentos del SV40 más pequeños o más grandes, siempre que
esté incluida la secuencia de aproximadamente 250 pb que se
extiende desde el sitio Hind III hacia el sitio Bgl I
localizada en el origen del virus SV40 del sitio de
replicación.
Los ejemplos de vectores de expresión de
mamíferos se pueden construir como describen Okayama y Berg (Mol.
Cell. Biol. 3: 280, 1983). Un vector de expresión superior
útil, el PMLSV N1/N4, descrito por Cosman y col., Nature
312: 768, 1984, se ha depositado como ATCC 39890. En el documento
EP-A-0367566 y en la solicitud de
patente de EE.UU. con nº de serie 07/701.415 presentada el 16 de
mayo de 1991, incorporada en la presente memoria descriptiva, se
describen vectores de expresión de mamíferos útiles adicionales.
Para la expresión de una región extracelular proteica de tipo II,
tal como CD40-L, debería añadirse una secuencia
señalizadora heteróloga como la secuencia señalizadora para la
interleuquina-7 (IL-7) descrita en
la patente de EE.UU. 4.965.195, o la secuencia señalizadora para el
receptor de la interleuquina-2 descrita en la
solicitud de patente de EE.UU. 06/6262.667 presentada el 2 de julio
de 1984.
El CD40-L humano o murino se
puede preparar en forma unida a la membrana cuando se incluyen las
regiones intracelular y transmembrana o en forma soluble con sólo
el dominio extracelular. Nosotros hemos inducido la expresión del
CD40-L murino de longitud completa en células de
mamífero, para proporcionar células que expresen el
CD40-L murino unido a la membrana. Células CV1 se
transfectaron con el vector HAVEO vacío usando técnicas descritas
en el Ejemplo 6 de la presente memoria descriptiva. Estas células se
usaron como fuente de CD40-L murino unido a la
membrana para la serie de experimentos comunicados en los Ejemplos
10-13 que se comentan más adelante.
Se pueden preparar polipéptidos de
CD40-L mediante el cultivo de células huésped
transformadas en condiciones de cultivo necesarias para expresar
polipéptidos de CD40-L. Los polipéptidos resultantes
expresados pueden, a continuación, purificarse de los medios de
cultivo o de los extractos celulares. Si se desea, se puede
concentrar un polipéptido de CD40-L usando un
filtro de concentración de proteínas disponible en el mercado, por
ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon.
Después de la etapa de concentración, el concentrado se puede
aplicar a una matriz de purificación tal como un medio de filtración
en gel. Como alternativa se puede usar una resina de intercambio
aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato con grupos
dietilaminoetilo (DEAE) pendientes. Las matrices pueden ser
acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos habitualmente
usados en la purificación de proteínas. Entre los intercambiadores
catiónicos adecuados se incluyen varias matrices insolubles que
comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los
grupos sulfopropilo.
Por último, se pueden usar una o más etapas de
cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa
(RP-HPLC) empleando medios RP-HPLC
hidrófobos (por ejemplo, gel de sílice con grupos metilo u otros
alifáticos pendientes), para purificar el CD40-L.
Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en varias
combinaciones, también se pueden usar para proporcionar una
proteína recombinante sustancialmente homogénea.
También es posible usar una columna de afinidad
que comprenda un dominio de unión al ligando de CD40 para purificar
por afinidad los polipéptidos de CD40-L expresados.
Los polipéptidos de CD40-L se pueden extraer de una
columna de afinidad en tampón de elución rico en sal y después se
pueden dializar en un tampón bajo en sal para su uso.
Normalmente, la proteína recombinante producida
en un cultivo bacteriano se aísla mediante la rotura de las células
huésped, centrifugación, extracción de los sedimentos/precipitados
celulares si el polipéptido es insoluble, o del fluido sobrenadante
si el polipéptido es soluble, seguido por más etapas de
concentración, desalación, intercambio iónico, purificación por
afinidad o cromatografía de exclusión por tamaño. Finalmente, se
puede usar una RP-HPLC para las etapas finales de
purificación. Las células microbianas se pueden romper mediante
cualquier procedimiento conveniente, incluidos ciclos de
congelación-descongelación, exposición a
ultrasonidos, rotura mecánica o uso de agentes de lisis celular.
Preferentemente, las células huésped de levadura
transformadas se usan para expresar CD40-L como un
polipéptido secretado. Esto simplifica la purificación. El
polipéptido recombinante secretado procedente de la fermentación de
una célula huésped de levadura se puede purificar mediante
procedimientos análogos a los descritos por Urdal y col. (J.
Chromatog. 296: 171, 1984). Urdal y col. describen dos etapas
secuenciales de RP-HPLC para la purificación de
IL-2 humana recombinante en una columna de HPLC
preparativa.
La presente invención proporciona composiciones
terapéuticas que comprenden una cantidad eficaz de
CD40-L en un vehículo o diluyente adecuado. Para
uso terapéutico, el CD40-L purificado o un análogo
del mismo biológicamente activo se administra a un paciente,
preferentemente un ser humano, para el tratamiento de forma adecuada
para la indicación. Por tanto, por ejemplo, las composiciones
farmacéuticas de CD40-L (por ejemplo, en forma de
un dominio extracelular soluble o de un fragmento del mismo), que se
administran para conseguir un efecto terapéutico deseado, se pueden
administrar mediante inyección en bolo, infusión continua,
liberación mantenida a partir de implantes u otra técnica adecuada.
Típicamente, un agente terapéutico de CD40-L se
administrará en forma de una composición farmacéutica que comprenda
polipéptido de CD40-L purificado junto con
vehículos, excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables.
Tales vehículos serán inocuos para los pacientes a las dosis y
concentraciones usadas. Por lo general, la preparación de tales
composiciones conlleva combinar un polipéptido de
CD40-L con tampones, antioxidantes tales como ácido
ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de
aproximadamente 10 residuos), proteínas, aminoácidos, hidratos de
carbono incluyendo glucosa, sacarosa o dextranos, agentes quelantes
tales como EDTA, glutation y otros estabilizantes y excipientes.
Ejemplos de diluyentes adecuados son suero salino tamponado neutro
o suero salino mezclado con seroalbúmina coespecífica. Los
oligonucleótidos de CD40-L sentido o antisentido
pueden administrase in vivo mediante la administración de
una cantidad eficaz de un vector que contiene una secuencia de ácido
nucleico que codifica un oligonucleótido eficaz antisentido o
sentido. Además, los oligonucleótidos de CD40-L
sentido o antisentido pueden administrarse ex vivo
extrayendo de un individuo las células que contienen ADN o ARNm de
CD40-L, incorporando en las células un
oligonucleótido antisentido o sentido usando técnicas de
transferencia génica y reinfundiendo las células en el
individuo.
Con los siguientes ejemplos se pretende ilustrar
formas de realización particulares y no limitar el alcance de la
invención.
Este ejemplo describe la construcción de una
construcción de ADN de CD40/Fc para expresar una proteína de fusión
CD40 soluble/Fc para usar en la detección de clones de ADNc que
codifican un ligando de CD40. La secuencia de ADNc de la región
extracelular o el dominio de unión al ligando de la secuencia del
receptor humano CD40 completo se obtuvo usando técnicas de reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) y se basa en la secuencia
publicada en Stamenkovic y col., supra. Como molde para la
amplificación por PCR se usó un plásmido de CD40 (CDM8). El CDM8 se
describe en Stamenkovic y col. y se obtuvo de los autores. Se empleó
una técnica de PCR (Sarki y col., Science 239: 487, 1988) usando
cebadores oligonucleotídicos en 5' (anteriormente en la cadena
nucleotídica) y en 3' (posteriormente en la cadena nucleotídica)
para amplificar las secuencias de ADN que codifican el dominio
extracelular de unión al ligando de CD40. El cebador
oligonucleotídico anteriormente en la cadena nucleotídica,
5'-CCGTCGAC
CACCATGGTTCGTCTCGCC-3' (SEQ ID Nº 5) introduce un sitio Sal I en 5' de un iniciador de metionina de CD40 y un cebador oligonucleotídico posteriormente en la cadena nucleotídica, 5'-ACAAGATCTGGGCTCTACGTATCT
CAGCCGATCCTGGGGAC-3' (SEQ ID Nº 7) que inserta aminoácidos Tyr Val Glu Pro Arg (SEQ ID Nº 8) tras el aminoácido 193 de CD40. Glu y Pro son los primeros aminoácidos de una región bisagra de la IgG1 humana y están seguidos por un sitio de restricción Bgl II que se usó para fusionar el dominio extracelular de CD40 al resto de la región Fc de la IgG1 humana.
CACCATGGTTCGTCTCGCC-3' (SEQ ID Nº 5) introduce un sitio Sal I en 5' de un iniciador de metionina de CD40 y un cebador oligonucleotídico posteriormente en la cadena nucleotídica, 5'-ACAAGATCTGGGCTCTACGTATCT
CAGCCGATCCTGGGGAC-3' (SEQ ID Nº 7) que inserta aminoácidos Tyr Val Glu Pro Arg (SEQ ID Nº 8) tras el aminoácido 193 de CD40. Glu y Pro son los primeros aminoácidos de una región bisagra de la IgG1 humana y están seguidos por un sitio de restricción Bgl II que se usó para fusionar el dominio extracelular de CD40 al resto de la región Fc de la IgG1 humana.
La construcción de ADN pDC406/CD40/Fc se
transfectó a la línea celular de riñón de mono
CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478). El plásmido pDC406
incluye secuencias reguladoras derivadas del SV40, del virus de la
inmunodeficiencia humana (HIV) y del virus de
Epstein-Barr (EBV). La línea celular
CV-1/EBNA se derivó mediante transfección de la
línea celular CV-1 con un gen que codifica el
antígeno-1 nuclear del virus de
Epstein-Barr (EBNA-1) que expresa
de forma constitutiva EBNA-1 impulsado por el
promotor/intensificador intermedio-precoz de CMV
humano. El gen EBNA-1 permite la replicación
episomal de los vectores de expresión, tales como pDC406, que
contienen el origen de replicación del EBV.
Una vez que se identificaron las células que
expresaban la construcción de fusión, se indujo el crecimiento en
cultivos a gran escala de células transfectadas para producir la
acumulación de sobrenadantes de las células que expresan CD40/Fc.
La proteína de fusión CD40/Fc en el fluido sobrenadante se purificó
mediante purificación por afinidad. Brevemente, un litro de
sobrenadante del cultivo que contenía la proteína de fusión CD40/Fc
se purificó mediante filtración de los sobrenadantes de las células
de mamífero (por ejemplo, en un filtro de 0,45 \mu) y aplicando
el filtrado a una columna de afinidad por anticuerpo de la proteína
A/G (Schleicher y Schuell, Keene, NH) a 4ºC a un caudal de 80 ml/h
para una columna de 1,5 cm x 12,0 cm. La columna se lavó con NaCl
0,5 M en PBS (suero salino tamponado con fosfato) hasta que no se
pudo detectar proteína en el tampón de lavado. Por último, la
columna se lavó con PBS. La proteína de fusión unida eluyó de la
columna con tampón citrato 25 mM, pH 2,8, y se llevó a un pH 7 con
tampón Hepes 500 mM, pH 9,1. Los geles SDS marcados con plata de la
proteína de fusión CD40/Fc eluida mostraron que era de una pureza
>98%.
La proteína de fusión CD40/Fc purificada se
trató con yodo ^{125}I usando un agente de fase sólida
comercialmente disponible (YODO-GEN, Pierce). En
este procedimiento, se sembraron 5 \mug de
YODO-GEN en el fondo de un tubo de vidrio de 10 x
75 mm y se incubaron durante veinte minutos a 4ºC con 75 \mul de
fosfato sódico 0,1M, pH 7,4 y 20 \mul (2 mCi) de Na^{125}I.
Después, la solución se transfirió a un segundo tubo de vidrio que
contenía 5 \mug de CD40/Fc en 45 \mul de PBS y esta mezcla de
reacción se incubó durante veinte minutos a 4ºC. La mezcla de
reacción se repartió mediante filtración en gel en un lecho de 2 ml
de volumen de Sephadex® G-25 (Sigma) y después se
equilibró en medio RPMI 1640 que contenía 2,5% (v/v) de seroalbúmina
bovina (BSA), 0,2% (v/v) de azida sódica y Hepes 20 mM, medio de
unión a pH 7,4. El grupo final de CD40/Fc ^{125}I se diluyó hasta
obtener una solución madre de trabajo de 1 x 10^{-7}M en medio de
unión y se almacenó durante hasta un mes a 4ºC sin que se produjera
pérdida detectable de la actividad de unión al receptor.
Se observó una incorporación del marcador de
aproximadamente el 50%-60%. El marcaje radioactivo con yodo
proporcionó actividades específicas en el intervalo de 1 x
10^{15} a 5 x 10^{15} cpm/nmol (0,42-2,0 átomos
de yodo radioactivo por molécula de proteína). La electroforesis en
geles de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) reveló un
único polipéptido marcado consistente con los valores esperados. Más
de un 98% de la proteína de fusión marcada era precipitable en
ácido tricloroacético (TCA), lo que indica que el ^{125}I estaba
unido covalentemente a la proteína.
Este ejemplo describe la selección de una línea
celular que expresa de forma teórica CD40-L. Se
seleccionaron varias líneas celulares usando la proteína de fusión
CD40/Fc marcada con yodo radioactivo descrita en el Ejemplo 1.
Brevemente, se llevaron a cabo estudios de unión cuantitativa según
la metodología estándar, y se derivaron gráficos de Scatchard para
las diversas líneas celulares. Se identificó y se seleccionó una
línea celular clonal (EL4, ATCC Catálogo TIP 39), una línea celular
de timoma murino. Antes de la selección, se descubrió que las
células EL-4 expresaban aproximadamente 450
moléculas de CD40-L por célula. Las séptimas células
seleccionadas se denominaron EL-40.7 y se indujo su
crecimiento, y se descubrió que expresaban aproximadamente 10.000
moléculas de CD40-L por célula. Por último, las
novenas células seleccionadas se denominaron EL-40.9
y se indujo su crecimiento, y se descubrió que expresaban
aproximadamente 15.000 moléculas de CD40-L por
célula.
Este ejemplo describe la preparación de una
genoteca de ADNc para la clonación por expresión de
CD40-L murino. La genoteca se preparó a partir de
un quinto clon seleccionado de una línea celular
EL-4 de timoma de ratón (ATCC TIB 39), denominado
EL-40.5. Las células EL-40.5 eran
células EL-4 separadas cinco veces con proteína de
fusión CD40/Fc biotinilada en un FACS (separador de células activado
por fluorescencia). Se preparó una genoteca de ADNc a partir de ARN
obtenido de células EL-40.5, esencialmente como se
describe en la patente de EE.UU. 4,968.607, cuya descripción se
incorpora en la presente memoria descriptiva como referencia.
Brevemente, se construyó una genoteca de ADNc mediante
transcripción inversa de ARNm poli(A)^{+} aislado
del ARN total extraído de la línea celular EL-40.5.
La técnica de construcción de genotecas fue sustancialmente similar
a la descrita por Ausuble y col., eds. Current Protocols in
Molecular Biology, vol. 1 (1987). El ARNm
poli(A)^{+} se aisló mediante cromatografía en
oligodT celulosa y se preparó ADNC bicatenario sustancialmente como
describen Gubler y col. Gene 25: 263, 1983. Los fragmentos de
ARNm poli(A)^{+} se convirtieron en híbridos
ARN-ADNc mediante la transcriptasa inversa usando
hexanucleótidos aleatorios como cebadores. Después, los híbridos
ARN-ADNc se convirtieron en fragmentos de ADNc
bicatenario usando ARNasa H combinada con la ADN polimerasa I. Los
extremos del ADNc bicatenario resultante se convirtieron en romos
con la ADN polimerasa T4.
Los adaptadores Sal I
- \quad
- 5'-TCG ACT GGA ACG AGA CGA CCT GCT-3'
- \quad
- GA CCT TGC TCT GCT GGA CGA- 5'
se ligaron a los extremos 5' del
ADNc con extremos romos resultantes, como se describe en Haymerle y
col., Nucleic Acids Res. 14: 8615, 1986. Los adaptadores no
ligados se eliminaron mediante cromatografía de filtración en gel a
68ºC. Esto dejó prolongaciones no autocomplementarios de 24
nucleótidos en el ADNc. El mismo procedimiento se usó para
convertir los extremos Sal I en 5' del vector de expresión de
mamífero pDC406 en prolongaciones de 24 nucleótidos complementarios
de los añadidos al ADNc. Proporciones óptimas del vector adaptado y
del ADNc se ligaron en presencia de polinucleótido quinasa T4. Las
mezclas de ligamiento dializadas se sometieron a electroforesis en
la cepa DH5\alpha de E. coli y los transformantes se
seleccionaron en placas con
ampicilina.
El ADN plasmídico se aisló de las reservas
formadas por aproximadamente 2.000 clones de E. coli
transformada por reserva. El ADN aislado se transfectó en una capa
subconfluyente de células CV1-EBNA usando
DEAE-dextrano, seguido por tratamiento con
cloroquina sustancialmente según los procedimientos descritos en
Luthman y col., Nucl. Acids. Res. 11: 1295, 1983 y McCutchan
y col., J. Natl. Cancer Inst. 41: 351, 1986.
Las células CV1-EBNA se
mantuvieron en medio completo (medio Eagles modificado con Dulbecco,
que contiene 10% (v/v) de suero bovino fetal, 50 U/ml de
penicilina, 50 U/ml de estreptomicina y L-glutamina
2 mM) y se sembraron en placas hasta una densidad de
aproximadamente 2 x 10^{5} células/pocillo en placas divididas en
cámaras de un único pocillo (Lab-Tek). Las placas se
trataron previamente con 1 ml de fibronectina humana (10 \mug/ml
de PBS) durante 30 minutos, seguido de un único lavado con PBS. Se
eliminaron los medios de las células adherentes en crecimiento en
una capa y se sustituyó con 1,5 ml de medio completo que contenía
sulfato de cloroquina 66,6 \muM. A las células se añadieron
aproximadamente 0,2 ml de una solución de ADN (2 \mug de ADN, 0,5
mg/ml de DEAE-dextrano en medio completo con
cloroquina) y la mezcla se incubó a 37ºC durante aproximadamente
cinco horas. Tras la incubación, se eliminaron los medios y las
células se sometieron a impacto mediante la adición de medio
completo con 10% de DMSO (Dimetilsulfóxido) durante
2,5-20 minutos. La agitación se siguió de la
sustitución de la solución con medio completo fresco. Se indujo el
crecimiento en cultivo de las células durante de dos a tres días
para permitir la expresión transitoria de las secuencias insertadas
de ADN. Estas condiciones condujeron a una frecuencia de
transfección del 30% al 80% en las células CV1-BNA
supervivientes.
Este ejemplo describe la detección selectiva de
la genoteca de clonación de expresión preparada en el Ejemplo 3 con
una proteína de fusión CD40/Fc marcada preparada en el Ejemplo 1.
Después de 48-72 horas, las monocapas transfectadas
de células CV1-EBNA preparadas en el Ejemplo 3 se
analizaron mediante autorradiografía de la placa para la expresión
del CD40-L usando la proteína de fusión CD40/Fc
marcada con yodo radiactivo según se preparó en el Ejemplo 1. Las
células CV1-EBNA transfectadas se lavaron una vez
con medio de unión (RPMI 1640 que contenía 25 mg/ml de seroalbúmina
bovina (BSA), 2 mg/ml de azida sódica, Hepes 20 mM a pH 7,2 y 50
mg/ml de leche seca desgrasada) y se incubaron durante 2 horas a 4ºC
en medio de unión con proteína de fusión CD40/Fc ^{125}I 1 x
10^{-9} M. Después de la incubación, las células en las placas
divididas en cámaras se lavaron tres veces con tampón de unión,
seguido de dos lavados con PBS, (pH 7,3) para eliminar la proteína
de fusión marcada radioactivamente sin
unir.
unir.
Las células se fijaron mediante incubación en
gluteraldehído al 10% en PBS (30 minutos a temperatura ambiente),
se lavaron dos veces en PBS y se secaron al aire. Las placas se
sumergieron en emulsión fotográfica Kodak GTNB-2
(dilución 6 x en agua) y se expusieron en oscuridad durante de dos a
cuatro días a temperatura ambiente en una caja opaca. Las placas se
revelaron en un revelador Kodak D19, se enjuagaron con agua y se
fijaron en fijador Agfa G433C. Las placas se analizaron
individualmente al microscopio con un aumento de
25-40x. Las placas positivas que mostraban las
células que expresan CD40-L se identificaron
mediante la presencia de granos de placa autorradiográficos frente
a un entorno claro.
Se identificó una reserva con aproximadamente
2000 clones individuales como potencialmente positiva para unirse a
la proteína de fusión CD40/Fc. La reserva se valoró y se sembró para
proporcionar placas que contenían, cada una de ellas,
aproximadamente 200 colonias. Cada placa se raspó para proporcionar
ADN plasmídico acumulado para la transfección en células
CV1-EBNA según el mismo procedimiento descrito
anteriormente. La detección selectiva de los grupos más pequeños se
realizó mediante autorradiografía de la placa como se ha descrito
previamente. Uno de los grupos más pequeños contenía clones que eran
positivos para el CD40-L, como indica la presencia
de un producto génico expresado capaz de unirse a la proteína de
fusión CD40/Fc.
El grupo positivo más pequeño se valoró y se
sembró en placas para obtener colonias individuales. Se escogieron
aproximadamente 400 colonias individuales y se inocularon al medio
de cultivo en pocillos individuales de placas de 96 pocillos. Los
cultivos se mezclaron mediante la agrupación de las filas y las
columnas y los cultivos mezclados se usaron para preparar ADN para
un ciclo final de transfección y detección selectiva. Una
intersección de una fila positiva y una columna positiva indicó una
posible colonia positiva. Se identificaron diez posibles colonias
positivas (es decir, los clones candidatos). Se aisló ADN de cada
clon candidato, se volvieron a transfectar y se volvieron a someter
a detección selectiva. Cinco clones candidatos fueron positivos en
unirse a CD40/Fc. Todos los cinco clones candidatos positivos
contenían un inserto de ADNc de 1468 nucleótidos, según se
determina mediante secuenciación de didesoxinucleótidos. La región
codificadora del ADNc del clon de CD40-L
corresponde a la secuencia de la Figura 1 y de la SEQ ID Nº 1.
Un vector de clonación que contenía una
secuencia de CD40-L murino, designado
pDC406-mCD40-L, se depositó en la
American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC) el 6 de
diciembre de 1991 con el número de registro 688872. La secuencia
nucleotídica y la secuencia aminoacídica predicha de este clon se
ilustran en la SEQ ID Nº 1 y la figura 1.
Este ejemplo ilustra una técnica de hibridación
con especies cruzadas que se usó para aislar un homólogo de
CD40-L humano usando una sonda diseñada a partir de
la secuencia del CD40-L murino. Una sonda de
CD40-L murino se produjo mediante la escisión de la
región de codificación del clon de CD40-L murino,
pDC406-CD40-L (nucleótido 13 a 793)
y el marcaje con ^{32}P del fragmento usando cebadores aleatorios
(Boehringer-Mannheim).
En un vector fago \lambda se construyó una
genoteca de ADNc de linfocitos de sangre periférica (PBL) humana
usando ramas \lambdagt10 y se empaquetó in vitro usando un
kit disponible en el mercado (Gigapak® Stratagene, San Diego, CA)
según las instrucciones del fabricante. Las células PBL se
obtuvieron de voluntarios humanos normales y se trataron con 10
ng/ml de OKT3 (un anticuerpo antiCD3) y 10 ng/ml de
Il-2 humana (Immunex, Seattle, WA) durante seis
días. Las células PBL se lavaron y estimularon con 500 ng/ml de
ionomicina (Calbiochem) y 10 ng/ml de PMA (Sigma) durante cuatro
horas. El ARN mensajero y el ADNc se obtuvieron de células PBL
estimuladas y se empaquetaron en vectores fagos \lambdagt10
(Gigapak® Stratagene) según las instrucciones del fabricante.
La sonda murina se hibridó con el ADNc del fago
en 6 x SSC (citrato sódico 15 mM y cloruro sódico 165 mM), 1 X
solución de Denhardt, EDTA 2 mM, 0,5% de Np40 a 63ºC durante la
noche. La hibridación se siguió de lavado extenso en 3 x SSC, 0,1%
de SDS a aproximadamente 55ºC durante tres horas. Las bandas
específicas se visualizaron mediante autorradiografía.
Un vector de clonación que contenía la secuencia
de CD40-L, designado hCD40-L, se
depositó en la American Type Culture Collection, Rockville, MD
(ATCC) el 6 de diciembre de 1991, con el número de registro 68873.
La secuencia nucleotídica y la secuencia aminoacídica predicha de
este clon se ilustran en la SEQ ID Nº 11 y en la
figura 2.
figura 2.
Este ejemplo ilustra la expresión de
CD40-L murino unido a la membrana en células
CV1-EBNA. El ADNc de CD40-L murino
en el vector HAVEO o en el vector HAVEO vacío se transfectó en
células CV1-EBNA usando técnicas estándar, tales
como aquellas descritas por McMahan y col., EMBO J. 10:
28221, 1991 y en el Ejemplo 3 en la presente memoria descriptiva.
Brevemente, las células CV1 EBNA se sembraron en placas a una
densidad de 2 x 10^{6} células por 10 cm de placa en 10 ml de
Medio Esencial Mínimo Dulbecco complementado con suero bovino fetal
al 10% (Medio). Las células se dejaron adherir durante la noche a
37ºC. El Medio se reemplazó con 1,5 ml de Medico que contenía 66,7
\muM de cloroquina y una mezcla de ADN que contenía 5 \mug de
ADNc que codifica mCD40-L. También se añadió a las
células Medio con 175 \mul y 25 \mul de dextrano DEAE (4 mg/ml
en PBS). Las células y el ADNc se incubaron a 37ºC durante 5 horas.
Se extrajo la mezcla de ADNc y las células se sacudieron con 1 ml
de Medio fresco que contenía 10% de DMSO durante 2,5 minutos. El
Medio se reemplazó con Medio fresco y se dejó crecer a las células
durante al menos 3 días.
Este ejemplo ilustra la preparación de
anticuerpos monoclonales frente a CD40-L. Las
preparaciones de CD40-L murino o de
CD40-L humano purificados se preparan mediante
expresión en células COS y purificación por afinidad de CD40/Fc
como se ha descrito en la presente memoria descriptiva. EL
CD40-L purificado puede generar anticuerpos
monoclonales frente a CD40-L usando técnicas
convencionales, por ejemplo, las técnicas descritas en la patente
de EE.UU. 4.411.993. Brevemente, se inmunizan ratones con
CD40-L como un inmunógeno emulsionado en adyuvante
completo de Freund y se inyectan en cantidades que varían de
10-100 \mug por vía subcutánea o intraperitoneal.
De diez a doce días después, los animales inmunizados recibieron un
inóculo de refuerzo con CD40-L adicional
emulsionado en adyuvante de Freund completo. A partir de entonces,
periódicamente, los ratones reciben inóculos de refuerzo según un
programa de inmunización de una o dos veces a la semana.
Periódicamente se extraen muestras de suero mediante extracción de
sangre retroorbitaria o escisión en la punta de la cola para
realizar pruebas mediante ensayo de transferencia de puntos o ELISA
(ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas) para los anticuerpos
frente a
CD40-L.
CD40-L.
Tras la detección de una valoración adecuada de
anticuerpos, se proporciona a los animales con resultados positivos
una última inyección intravenosa de CD40-L en suero
salino. Se sacrifica a los animales de tres a cuatros días después,
se recogen las células del bazo y las células del bazo se fusionan
con una línea celular murina de mieloma (por ejemplo, NS1 o Ag
8.653). Las fusiones generan células de hibridoma, que se siembran
en placa en placas de microvaloración múltiple en un medio HAT
(hipoxantina, aminopterina y timidina) selectivo para inhibir la
proliferación de las células que no se han fusionado, los híbridos
de mieloma y los híbridos de células de bazo.
La detección selectiva de las células de
hibridoma se lleva a cabo mediante ELISA para detectar la
reactividad frente a CD40-L purificado mediante
adaptaciones de las técnicas descritas en Engvall y col.,
Immunochem. 8: 871, 1971 y en la patente de EE.UU. 4.703.004. Las
células de hibridoma positivas se pueden inyectar por vía
intraperitoneal en ratones BALB/c singénicos para producir ascitis
que contienen concentraciones elevadas de anticuerpos monoclonales
antiCD40-L. Como alternativa, las células de
hibridoma se pueden dejar crecer in vitro en matraces o en
frascos rotatorios mediante varias técnicas. Los anticuerpos
monoclonales producidos en las ascitis de ratón se pueden purificar
por precipitación con sulfato amónico seguida por cromatografía por
exclusión en gel. Como alternativa, también se puede usar
cromatografía por afinidad basada en la unión de anticuerpos frente
a la proteína A o la proteína G, como se puede usar cromatografía
por afinidad basada en la unión a CD40-L.
Este ejemplo ilustra los efectos terapéuticos
antialérgicos del sCD40 y de la proteína de fusión CD40/Fc. Se
realizaron pruebas con el CD40 soluble y la CD40/Fc para determinar
su capacidad para inhibir la secreción de IgE inducida por
IL-4 (5 ng/ml) en un sistema CML de dos donantes.
Los datos procedentes de tres experimentos se presentan en la Tabla
I.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los niveles de IgE se midieron 12 días después
en el cultivo mediante un procedimiento de ELISA. Brevemente,
placas de microtitulación de 96 pocillos y fondo plano (Corning) se
revistieron con AcMo de ratón antiIgE humana (Zymed) a una dilución
de 1:500 en PBS (suero salino tamponado con fosfato). Después de
lavar 3 veces, se llevó a cabo una etapa de bloqueo con 5% de leche
seca desgrasada, seguida de la titulación de los estándar de IgE
humana o de los sobrenadantes de prueba. Después de lavar 3 veces se
añadió IgE antihumana de cabra biotinilada (Kirkegard y Perry) a
una dilución de 1:500. Esto se siguió de lavado adicional y después
de la adición de estreptavidina-HRP (Zymed) a una
dilución de 1:500. Después de lavado adicional, se desarrolló la
reacción usando sustrato TMB (Kirkegaard y Perry) y se midió la
absorbancia a 520 nm. Todas las etapas de lavado se llevaron a cabo
en PBS más 0,05% de Tween. Todas las etapas de incubación se
realizaron a volúmenes de 100 \mul/pocillo durante una hora a
temperatura ambiente. La sensibilidad de este ensayo es de 100
pg/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra los efectos del sCD40 y de
la proteína de fusión CD40/Fc para inhibir la liberación de CD23
por parte de las células B estimuladas con IL-4 (5
ng/ml). Se realizaron pruebas con CD40 soluble y CD40/Fc para
determinar su capacidad para inhibir la liberación de sCD23 inducida
por IL-4 en un sistema de CML de dos donantes. Los
datos procedentes de tres experimentos se presentan en la tabla
2.
\vskip1.000000\baselineskip
Los niveles de CD23 se midieron después de 6 y
12 días en cultivo mediante un kit ELISA de detección de sCD23
(Binding Site, San Diego, CA). El límite de sensibilidad fue de 500
pg/ml. Se cultivaron aproximadamente
1 x 10^{5} células por pocillo por triplicado en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo redondo (Intermountain Scientific, Bountiful UT) durante el tiempo indicado en presencia o ausencia de aditivos, como se indica en la tabla 2. Los resultados muestran efectos antialérgicos del sCD40. Se llevaron a cabo estudios similares con CD40/Fc (datos no mostrados) en lugar de sCD40, y se obtuvieron resultados similares. En consecuencia, estos datos del los Ejemplos 8 y 9 ilustran una propiedad antialérgica del CD40.
1 x 10^{5} células por pocillo por triplicado en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo redondo (Intermountain Scientific, Bountiful UT) durante el tiempo indicado en presencia o ausencia de aditivos, como se indica en la tabla 2. Los resultados muestran efectos antialérgicos del sCD40. Se llevaron a cabo estudios similares con CD40/Fc (datos no mostrados) en lugar de sCD40, y se obtuvieron resultados similares. En consecuencia, estos datos del los Ejemplos 8 y 9 ilustran una propiedad antialérgica del CD40.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra la actividad proliferativa
de células B del CD40-L murino unido a la membrana
para células B humana. Se aislaron células mononucleares de sangre
periférica humana (PBMC) de sangre periférica de voluntarios
normales mediante centrifugación por gradiente de densidad con
Histopaque® (Sigma, St. Louis, MO). Las preparaciones con depleción
de células T (E^{-}) se obtuvieron mediante la eliminación de
células T mediante formación de rosetas con EC (eritrocitos de
carnero) tratados con bromuro de
2-aminoetilisotiouranio y centrifugación por
gradiente de densidad adicional sobre Histopaque®. Los ensayos de
proliferación de células B se llevaron a cabo con preparaciones
E^{-} en medio RPMI con 10% de suero bovino fetal (SBF) inactivado
por calor a 37ºC en una atmósfera al 10% de CO_{2}.
Aproximadamente 1 x 10^{5} células E^{-} por pocillo se
cultivaron por triplicado en placas de microtitulación de 96
pocillos de fondo plano (Corning) durante 7 días en presencia de
células CV1 EBNA transfectadas (descritas en el ejemplo 6). Se
transfectaron las células CV1 EBNA con ADNc de
CD40-L murino o con un vector vacío. Las células
recibieron pulsos con 1 \muCi/pocillo de timidina tritiada (25
Ci/nmol, Amersham, Arlingtom Heightd, IL) durante las últimas ocho
horas de cultivo. Las células se recogieron en discos de fibra de
vidrio con un cosechador celular automático y las cpm incorporadas
se midieron mediante espectrometría de centelleo líquido.
La figura 4a muestra una comparación de la
proliferación de células B de células CV1 EBNA transfectadas con
vector vacío (HAVEO) o con ADNc de CD40-L murino en
vector HAVEO. Estos datos muestran que el CD40-L
unido a la membrana estimula la proliferación de células B humanas
en ausencia de un comitógeno. La figura 4b muestra un experimento
similar, a excepción de que se añadieron 10 ng/ml de
IL-4 humana a los cultivos. En este experimento, la
IL-4 intensifica ligeramente la actividad mitogénica
de células B del CD40-L murino unido a la membrana.
La figura 5 es una repetición del experimento que se muestra en la
figura 4b. Sin embargo, cuando se repitió el experimento, no se
observaron signos de actividad comitogénica de la
IL-4. Sí existieron pruebas de la actividad
mitogénica del CD40-L. En consecuencia, el
CD40-L unido a la membrana estimula la proliferación
de células B humanas.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra el efecto del
CD40-L unido a la membrana murino sobre la
estimulación de la producción de IgE y la eliminación de CD23 de
las células E^{-} aisladas en el Ejemplo 10. Aproximadamente 1 x
10^{5} células/pocillo se cultivaron por triplicado en placas de
microtitulación Nunc de 96 pocillos de fondo redondo (Intermountain
Scientific, Bountiful UT) en Medio Dulbecco Modificado de Iscove
(IMDM) más 10% de FCS en atmósfera húmeda de CO_{2} al 10%. El
medio estaba complementado con 50 \mug/ml de transferrina humana
(Sigma), 0,5% de seroalbúmina bovina (Sigma) y 1 \mug/ml de cada
uno de los ácidos oleico, linoleico y palmítico (Sigma). Las
células E^{-} se cultivaron durante 10 días en presencia de 5
ng/ml de IL-4 humana. Se añadió una titulación de
células CV1 EBNA transfectadas con CD40-L murino o
con vector vacío. Después de diez días, se analizaron los
sobrenadantes del cultivo para detectar IgE mediante el
procedimiento de ELISA que se describe en el Ejemplo 8 o para
determinar la eliminación de CD23 mediante el procedimiento descrito
en el Ejemplo 9.
La figura 6 muestra una comparación de la
producción de IgE en los sobrenadantes (en ng/ml) para cultivos de
las células E^{-} y de las células CV1 EBNA transfectadas con
vector vacío (HAVEO) o con CD40-L. No se observaron
diferencias con hasta 3000 células CV1 EBNA, sin embargo la adición
de 10000 ó 30000 de células CV1 EBNA transfectadas con
CD40-L tuvo como resultado una producción de IgE
significativa. Como comparación, cuando las células E^{-} se
incubaron con medio solo, 5 ng/ml de Il-4 o 5 ng/ml
de IL-4 más 500 ng/ml de anticuerpo
G28-5, la producción de IgE fue 4,7, 2,9 y > 600
ng/ml, respectivamente. Cuando se midió la eliminación de CD23 en
la figura 7, las 10000 y 30000 células CV1 EBNA transfectadas con
CD40-L mostraron eliminación de CD23 incrementada
en comparación con las células CV1 EBNA control con vector vacío.
Como comparación, cuando las células E^{-} se incubaron con medio
solo, 5 ng/ml de IL-4 ó 5 ng/ml de
IL-4 más 500 ng/ml de anticuerpo
G28-5, la eliminación de CD23 fue < 0,1, 2,4 y
11,2 ng/ml, respectivamente. Estos datos muestran que la producción
de IgE y la eliminación de CD23 son, ambas, actividades biológicas
asociadas con el CD40-L unido a la membrana.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra la actividad de
proliferación de células B, la producción de inmunoglobulina (Ig)
policlonal, la formación de anticuerpos específicos de antígeno y
varios procedimientos para usar el CD40-L unido a la
membrana y soluble en aplicaciones clínicas. Los inventores
obtuvieron células B de bazo según los procedimientos descritos en
Grabstein y col., I supra, Maliszewski y col., I supra
y Maliszewski y col., II supra. Brevemente, el cultivo mixto
de células se purificó mediante depleción de células T usando
antisuero de células T y complemento, y depleción de células
adherentes mediante paso por columnas de Sephadex® G10 y mediante
selección positiva de células B lavándolas en placas petri
revestidas con IgM de cabra antiratón. Las células B purificadas se
cultivaron en medio RPMI, suero bovino fetal (5% para los ensayos de
proliferación de células B y 20% para los ensayos de células
formadoras de placas o para los ensayos de anticuerpos
policlonales), 2-mercaptoetanol, antibióticos,
aminoácidos y piruvato. La proliferación de células B se midió según
el ensayo descrito en el Ejemplo 10 y en Grabstein y col., I
supra, Maliszewski y col., I supra y Maliszewski y
col., II supra. La formación de anticuerpos específicos de
antígeno se midió mediante el procedimiento descrito en Grabstein y
col., J. Mol. Cell. Immunol. 2: 199, 1986 [Grabstein y col.
II]. Brevemente, para la formación de anticuerpos específicos de
antígeno se usaron eritrocitos de carnero (EC) como antígeno (0,03%
v/v) en cultivos de 2,0 ml de 1 x 10^{6} células B murinas por
cultivo. Los cultivos de células B se incubaron durante 5 días y
las células formadoras de placas se determinaron mediante el ensayo
de la placa hemolítica de Jerne, según se describe en Grabstein y
col. II supra. Las cuentas celulares se determinaron en un
contador coulter. La secreción de Ig policlonales se determinó
mediante ensayos de ELISA específicos de isotipo en cultivos de
siete días de 1 x 10^{6} células B por 2,0 ml de cultivo, según se
describe en Maliszewski y col., I supra y Maliszewski y
col., II supra.
Los resultados de la proliferación de células B
por las células CV1 EBNA transfectadas con CD40-L o
con vector vacío o células 7A1 (un clon de células T colaboradoras)
se muestran en las figuras 8, 10 y 12. Estos datos muestran que el
CD40-L produjo la mayor proliferación de células B.
Las células T colaboradoras 7A1 y 7C2 ejercieron un efecto mínimo
sobre la proliferación de células B.
Los efectos de diversas células en la formación
de anticuerpos específicos de antígeno se muestran en las figuras 9
y 11. La figura 9 muestra una comparación de las células formadoras
de placa que compara el clon de células T colaboradoras 7A1 y las
células El40.9 murinas que secretan un CD40-L
soluble. Las células EL40.9 parecen tener un efecto inhibidor sobre
la formación de anticuerpos específicos de antígeno. La figura 11
muestra PFC (células formadoras de placa) para las células T
colaboradoras 7C2 y las células CV1 EBNA transfectadas bien con
vector vacío o bien con CD40-L. Tanto las células
7C2 como el CD40-L unido a la membrana estimularon
la formación de anticuerpos específicos de antígeno (PFC). La figura
13 compara la formación de anticuerpos específicos de antígeno de
CD40-L y de células 7A1 en presencia o ausencia de
10 ng/ml de interleuquina 2 (IL-2). La
IL-2 aumentó las PFC para las células 7A1 pero no
incrementó las PFC causadas por el CD40-L unido a
la membrana.
La producción de Ig policlonales por parte de
las células B murinas se comparó para la estimulación o la
inhibición con CD40-L unido a la membrana, las
células CV1 EBNA control y las células T colaboradoras 7A1 en
presencia de las citoquinas IL-4 (10 ng/ml) e
IL-5 (dilución 1:40 de sobrenadantes de células COS)
o sin la adición de citoquinas. Las cantidades de IgA, IgG3, IgE,
IgG2b, IgM e IgG1 se muestran en las tablas 3-8,
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos datos indican que la interacción de CD40
con su ligando es la interacción molecular principal responsable de
la inducción del crecimiento de células B y de la diferenciación de
células B tanto hacia la producción de anticuerpos específicos de
antígeno como hacia la secreción de Ig policlonales dependientes del
contacto con células T. Como tales, estos datos sugieren que los
antagonistas de esta interacción, mediante CD40 soluble, la
proteína de fusión CD40/Fc y posiblemente el CD40-L
soluble (monomérico), interferirán de forma significativa con el
desarrollo de las respuestas de anticuerpos. Por tanto, las
situaciones clínicas donde CD40, las proteínas de fusión CD40/Fc y
el CD40-L incluyen alergia, lupus, artritis
reumatoide, diabetes mellitus insulinodependiente y cualesquiera
otras enfermedades donde los anticuerpos autoinmunitarios o los
complejos antígeno/anticuerpo son responsables de la patología
clínica de la enfermedad. Además, el CD40-L unido a
la membrana o el CD40-L soluble oligomérico será
útil para estimular la proliferación de células B y la producción de
anticuerpos. Como tales, estas formas de CD40-L son
más útiles como adyuvantes de vacunas y como agente estimulante para
la secreción de AcMo a partir de las células de
hibridoma.
hibridoma.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra el efecto del
CD40-L unido a la membrana en la proliferación de y
la secreción de IgE por las células mononucleares de sangre
periférica (E^{-}). Las células E^{-} se obtuvieron según el
procedimiento descrito en el Ejemplo 10 y se incubaron durante 7 ó
10 días en presencia de células CV1 EBNA transfectadas con vector
vacío o con ADNc de mCD40-L. Adicionalmente, a
algunas de las preparaciones se añadió proteína de fusión CD40/Fc
(descrita en el Ejemplo 1) o proteína de fusión Receptor de TNF/Fc
(descrita en el documento WO91/03553) como se indica en la figura
14. La secreción de IgE se midió según el procedimiento descrito en
el Ejemplo 8 y la proliferación de células B se midió según el
procedimiento descrito en el Ejemplo 10.
Los resultados en cuanto a la proliferación de
células B y la secreción de IgE se muestran en la figura 14 para
cinco concentraciones diferentes de células CV1 EBNA transfectadas.
Tanto la proliferación de células B como la secreción de IgE se
incrementaron en presencia de CD40-L unido a la
membrana. La adición de proteína de fusión CD40/Fc anuló tanto la
proliferación celular como la secreción de IgE. La proteína de
fusión Receptor de TNF/Fc no ejerció ningún efecto. Como
comparación para la secreción de IgE, la adición de
IL-4 como agente control (sin células CV1 EBNA
transfectadas) no produjo nada de IgE en este ensayo y la adición de
IL-4 más AcMo antiCD40 G28-5 tuvo
como resultado 29,7 ng/ml de IgE en este ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe la construcción de una
construcción de ADN de CD40-L/Fc para expresar una
proteína de fusión CD40 soluble/Fc denominada construcción
CD40-L/FC2. El ADN que codifica
CD40-L/FC2 comprende secuencias que codifican un
péptido líder (o señal), una secuencia hidrófila de ocho aminoácidos
descrita por Hopp y col. (Hopp y col., Biotechnology 6:
1204, 1988; denominada Flag®), una región Fc adecuada de una
inmunoglobulina, una secuencia repetida de
[Gly_{4}Ser]_{3} (descrita en la patente de EE.UU.
5.073.627, que se incorpora la presente memoria descriptiva como
referencia) u otra secuencia de engarce adecuada, y la región
extracelular del CD40-L humano desde el aminoácido
50 al aminoácido 261 (SEQ ID Nº11). Se prepara un vector de
expresión pDC406 que contiene una secuencia líder, Flag®, y la Fc
de la IgG1 humana usando técnicas convencionales de corte y empalme
enzimático de fragmentos que codifican una secuencia líder, Flag®, y
la Fc de IgG1 humana y restricción con Nsi 1 y Not
1.
Se usó una técnica de PCR (Sarki y col., Science
239: 487, 1988) usando cebadores oligonucleotídicos en 5'
(anteriormente en la cadena nucleotídica) y en 3' (posteriormente en
la cadena nucleotídica) para amplificar las secuencias de ADN que
codifican el dominio extracelular de unión al ligando de CD40 de un
vector de clonación que contiene CD40-L humano
(ATCC 68873; SEQ ID Nº 11), para formar un fragmento de PCR. El
cebador oligonucleotídico anteriormente en la cadena nucleotídica
(SEQ ID Nº 13) introdujo anteriormente en la cadena nucleotídica un
sitio Nsi de una secuencia de engarce
([Gly_{4}Ser]_{3}SerSer), que estaba seguida por 21
nucleótidos del dominio extracelular de CD40-L
(desde el aminoácido 51 hasta el 57 de la SEQ ID Nº 11). Un cebador
oligonucleotídico posteriormente en la cadena nucleotídica (SEQ ID
Nº 14) introdujo un sitio Not 1 justo posteriormente en la
cadena nucleotídica del codón de terminación del
CD40-L. EL fragmento de PCR se ligó después en el
vector de expresión pDC406 que contenía una secuencia líder, Flag®,
y la Fc de IgG1. El nucleótido y la secuencia aminoacídica predicha
de CD40-L/FC2 se presentan en la SEQ ID Nº 15 y la
SEQ ID Nº 16. La construcción de ADN resultante
(CD40-L/FC2) se transfectó en la línea de células de
riñón de mono CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478). La
construcción codificaba un CD40-L soluble capaz de
unirse a CD40, como se pone de manifiesto con la unión observada en
los análisis de selección de células activada por fluorescencia
(FACS) usando células que expresan CD40.
Se indujo el crecimiento de cultivos a gran
escala de células 293 de riñón de embrión humano (TACC CDRL 1573)
transfectadas con la construcción que codifica CD40/FC2, para
acumular el sobrenadante que contiene CD40-L/FC2.
La línea celular 293, una línea permanente de riñón embrionario
humano primario transformada con ADN del adenovirus humano 5,
permite la expresión de proteínas recombinantes ligadas en el vector
pCD406. La proteína de fusión CD40-L/FC2 en el
fluido sobrenadante se purificó mediante purificación por afinidad.
Brevemente, el sobrenadante del cultivo que contiene la proteína de
fusión CD40-L/FC2 se purificó filtrando los
sobrenadantes de células de mamífero (por ejemplo, en un filtro de
0,45 \mu) y la aplicando filtrado a una columna de afinidad de
anticuerpos que comprende IgG antihumana de cabra biotinilada
(Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., Westgrove, OA, EE.UU.)
acoplada a agarosa-estreptavidina (Pierce Chemical,
Rockford, IL, EE.UU.) a 4ºC, a un caudal de aproximadamente 60 a 80
ml/h para una columna de 1,5 cm x 12,0 cm. La columna se lavó con
aproximadamente 20 volúmenes de columna de PBS (suero salino
tamponado con fosfato), hasta que no se pudo detectar proteína
libre en el tampón de lavado. La proteína de fusión unida se eluyó
de la columna con tampón citrato 12,5 mM, NaCl 75 mM, pH 2,8, se
llevó hasta un pH 7 con tampón Hepes 500 mM, pH 9,1. El péptido
CD40-L/FC2 oligomérico purificado indujo
proliferación de células B humanas en ausencia de cualquier
coestímulo, y (junto con la citoquina adecuada) tuvo como resultado
la producción de IgG, IgE, IgA e IgM, como se describe en el Ejemplo
12 para el CD40-L unido a la membrana.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe la construcción de una
construcción de ADN de CD40-L para expresar una
proteína de fusión CD40-L soluble denominada
CD40-L trimérico. El CD40-L
trimérico contiene una secuencia líder, una secuencia de 33
aminoácidos referida como una "cremallera de leucina" (SEQ ID
Nº 17), y una secuencia hidrófila de ocho aminoácidos descrita por
Hopp y col. (Hopp y col., BioTechnology 6: 1204, 1988;
denominada Flag®), seguida por la región extracelular del
CD40-L humano desde al aminoácido 50 hasta el
aminoácido 261 (SEQ ID Nº11). La utilidad de las secuencias líder y
Flag® se ha descrito en la sección de la Descripción Detallada. La
secuencia de 33 aminoácidos presentada en la SEQ ID Nº 17 trimeriza
de forma espontánea en solución. Por tanto, se espera que las
proteínas de fusión que comprende esta secuencia de 33 aminoácidos
formen espontáneamente trímeros o multímeros.
La construcción se prepara sintetizando
oligonucleótidos que representan una secuencia líder, la secuencia
de 33 aminoácidos descrita anteriormente y la secuencia Flag®,
después se liga el producto final a un fragmento de ADN que
codifica desde el aminoácido 51 hasta el 261 de la SEQ ID Nº 11,
preparada como se ha descrito en el
Ejemplo 14.
Ejemplo 14.
El producto resultante de la unión en el vector
de expresión pDC406 se transfectó en la línea de células de riñón
de mono CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478). El plásmido
pDC406 incluye secuencias reguladoras derivadas del SV40, del virus
de la inmunodeficiencia humana (VIH) y del virus de
Epstein-Barr (EBV). La línea celular
CV-1/EBNA se derivó mediante transfección de la
línea de células CV-1 con un gen que codifica el
antígeno-1 nuclear del virus de
Epstein-Barr (EBNA-1) que expresa
constitutivamente EBNA-1 dirigido por
promotor/intensificador intermedio-precoz de CMV
humano. El gen EBNA-1 permite la replicación
episomal de los vectores de expresión, tales como pDC406, que
contienen el origen de replicación del EBV.
Una vez que se identifican las células que
expresan la construcción de fusión, se induce el crecimiento de
cultivos a gran escala de células transfectadas para acumular el
sobrenadante de las células que expresan el CD40-L
trimérico. La proteína de fusión trimérica CD40-L en
el fluido sobrenadante se purifica mediante purificación por
afinidad sustancialmente como se describe en la patente de EE.UU.
5.011.912. Para determinar la pureza se pueden preparar geles de
SDS marcados con plata de la proteína de fusión
CD40-L eluida.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: IMMUNEX CORPORATION
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: IMMUNEX CORPORATION
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 51 UNIVERSITY STREET
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: SEATTLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: WASHINGTON
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 98101
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: CITOQUINA NOVEDOSA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 17
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible con PC
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0. Versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US92/08990
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 23 de octubre de 1992
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 783 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: RATÓN
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: CD40-L
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:I..783
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 740 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: SER HUMANO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: Fc IgG1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 519 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: SER HUMANO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: REGIÓN EXTRACELULAR DE CD40
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: CEBADOR DE PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: CEBADOR en 5' DE CD40
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: CEBADOR de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: CEBADOR EN 3' DE CD40
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: CEBADOR DE PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: CEBADOR EN 3' DE CD40
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: PENTAPÉPTIDO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: CEBADOR DE PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: IGG1 HUMANA/FC CEBADOR EN 5'
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO:CEBADOR DE PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: IGG1 HUMANA/FC CEBADOR EN 3'
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 840 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLON: CD40-L
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 46..831
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 11:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 261 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 73 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1425 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: CD40-L humano/FC2-(CD40-L soluble)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LOCALIZACIÓN:4..1422
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:79..1422
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sig_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:4..78
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 473 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LONGITUD: 473 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (16)
1. Una secuencia de ADN aislado que codifica un
polipéptido de CD40-L que se une a CD40,
seleccionado entre:
- (a)
- ADN que comprende los nucleótidos 46 a 828, 196 a 828, 193 a 762 de la SEQ ID Nº 11 y sus hebras complementarias;
- (b)
- ADN que codifica los aminoácidos 1-261 de la SEQ ID Nº 12;
- (c)
- ADN que codifica los aminoácidos 47-261 de la SEQ ID Nº 12;
- (d)
- ADN que codifica los aminoácidos 51-261 de la SEQ ID Nº 12;
- (e)
- ADN que codifica un fragmento de (c) o (d); y
- (f)
- ADN que es complementario del ADN que hibrida con el ADN de (a) en condiciones de rigurosidad moderada (solución de prelavado de 5 x SSC, 0,5% de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y condiciones de hibridación de 50ºC, 5 x SSC durante la noche).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un ADN aislado que codifica un polipéptido de
CD40-L que se une a CD40, seleccionado entre:
- (a)
- ADN que comprende los nucleótidos 1 a 783 de la SEQ ID Nº 1 y su hebra complementaria;
- (b)
- ADN que codifica los aminoácidos 1 a 260 de la SEQ ID Nº 2;
- (c)
- ADN que codifica los aminoácidos 47 a 260 de la SEQ ID Nº 2;
- (d)
- ADN que codifica un fragmento de (b) o (c); y
- (e)
- ADN que es complementario del ADN que hibrida con el ADN de (a) en condiciones de rigurosidad moderada (solución de prelavado de 5 x SSC, 0,5% de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y condiciones de hibridación de 50ºC, 5 x SSC durante la noche).
\vskip1.000000\baselineskip
3. El ADN aislado según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, que comprende adicionalmente un ADN que codifica
una región Fc de inmunoglobulina.
4. Un vector de expresión recombinante que
comprende una secuencia de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3.
5. Una célula huésped transformada o
transfectada con un vector de expresión según la reivindicación
4.
6. Un procedimiento para preparar un
polipéptido, que comprende cultivar una célula huésped según la
reivindicación 5 en condiciones que estimulan la expresión del
polipéptido.
7. Un polipéptido CD40-L
purificado que se une a CD40, que comprende un polipéptido
codificado por el ADN según una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3.
8. Un polipéptido según la reivindicación 7, que
es un monómero soluble.
9. Un oligómero que comprende dos o más
polipéptidos de la reivindicación 7 o la reivindicación 8.
10. El oligómero de la reivindicación 9, que
comprende adicionalmente una región Fc.
11. El oligómero de la reivindicación 9 o de la
reivindicación 10, que comprende adicionalmente una secuencia de
engarce.
12. El uso de un polipéptido monomérico soluble
según la reivindicación 8 en la preparación de un medicamento para
tratar alergias, reacciones alérgicas, lupus, artritis reumatoide o
la enfermedad del injerto contra el huésped.
13. Una composición para vacuna que comprende un
oligómero según cualquiera de las reivindicaciones
9-11, como adyuvante.
14. Una composición farmacéutica que comprende
un polipéptido o un oligómero según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 11 junto con un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
15. Un procedimiento para estimular células de
hibridoma para aumentar la secreción de anticuerpo monoclonal, que
comprende administrar a dichas células de hibridoma una cantidad
eficaz de un oligómero según una cualquiera de las reivindicaciones
9-11.
16. Un ADN como se muestra en la SEQ ID Nº 5, 6,
7, 9 ó 10, o su ARN equivalente, o su complementario.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US78370791A | 1991-10-25 | 1991-10-25 | |
US783707 | 1991-10-25 | ||
US80572391A | 1991-12-05 | 1991-12-05 | |
US805723 | 1991-12-05 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2227513T3 ES2227513T3 (es) | 2005-04-01 |
ES2227513T5 true ES2227513T5 (es) | 2009-04-01 |
Family
ID=27120174
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES92925017T Expired - Lifetime ES2227513T5 (es) | 1991-10-25 | 1992-10-23 | Citoquina novedosa. |
ES98113461T Expired - Lifetime ES2198025T3 (es) | 1991-10-25 | 1992-10-23 | Anticuerpos contra cd40-l. |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES98113461T Expired - Lifetime ES2198025T3 (es) | 1991-10-25 | 1992-10-23 | Anticuerpos contra cd40-l. |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP0897983B1 (es) |
JP (2) | JP3308534B2 (es) |
KR (1) | KR100283541B1 (es) |
AT (2) | ATE274055T1 (es) |
AU (1) | AU661360B2 (es) |
CA (2) | CA2121798C (es) |
DE (2) | DE69233402T3 (es) |
DK (3) | DK0667901T4 (es) |
ES (2) | ES2227513T5 (es) |
FI (2) | FI116850B (es) |
HK (1) | HK1019343A1 (es) |
NO (2) | NO317625B1 (es) |
WO (1) | WO1993008207A1 (es) |
Families Citing this family (75)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5716805A (en) * | 1991-10-25 | 1998-02-10 | Immunex Corporation | Methods of preparing soluble, oligomeric proteins |
US5981724A (en) * | 1991-10-25 | 1999-11-09 | Immunex Corporation | DNA encoding CD40 ligand, a cytokine that binds CD40 |
US7405270B2 (en) | 1991-10-25 | 2008-07-29 | Immunex Corporation | CD40-Ligand lacking native-pattern glycosylation |
US5962406A (en) * | 1991-10-25 | 1999-10-05 | Immunex Corporation | Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same |
US5474771A (en) | 1991-11-15 | 1995-12-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same |
US7070777B1 (en) * | 1991-11-15 | 2006-07-04 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for inhibiting inflammation with an antibody that binds the 5C8 protein |
US6472510B1 (en) | 1992-02-14 | 2002-10-29 | Bristol-Myers Squibb Company | CD40 receptor ligands |
US5397703A (en) | 1992-07-09 | 1995-03-14 | Cetus Oncology Corporation | Method for generation of antibodies to cell surface molecules |
US5874082A (en) * | 1992-07-09 | 1999-02-23 | Chiron Corporation | Humanized anti-CD40 monoclonal antibodies and fragments capable of blocking B cell proliferation |
AU5098493A (en) * | 1992-08-21 | 1994-03-15 | Schering Corporation | Cd40 ligand, anti cd40 antibodies, and soluble cd40 |
US5540926A (en) * | 1992-09-04 | 1996-07-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Soluble and its use in B cell stimulation |
AU676227B2 (en) * | 1993-01-22 | 1997-03-06 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Therapeutic agent for NIDDM |
DE69433399T2 (de) * | 1993-01-22 | 2004-10-14 | Immunex Corp., Seattle | Detektion und behandlung von mutationen in einem gen für einen cd40-liganden |
US5869049A (en) * | 1993-09-02 | 1999-02-09 | Trustees Of Dartmouth College | Methods of inducing T cell unresponsiveness to bone marrow with gp39 antagonists |
JP2991499B2 (ja) * | 1993-09-02 | 1999-12-20 | トラスティーズ・オブ・ダートマス・カレッジ | 抗gp39抗体およびその用途 |
ES2134954T3 (es) * | 1993-09-02 | 1999-10-16 | Dartmouth College | Procedimiento de supresion prolongada de la inmunidad humoral. |
ZA946765B (en) * | 1993-09-02 | 1996-02-15 | Dartmouth College | Methods of prolonged suppression of humoral immunity |
AU1059095A (en) * | 1993-11-24 | 1995-06-13 | Australian National University, The | Treatment of viral disease with cd40l peptide |
US5674492A (en) * | 1993-12-23 | 1997-10-07 | Immunex Corporation | Method of preventing or treating disease characterized by neoplastic cells expressing CD40 |
US5683693A (en) * | 1994-04-25 | 1997-11-04 | Trustees Of Dartmouth College | Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40 |
ES2251719T3 (es) | 1994-04-28 | 2006-05-01 | Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc. | Metodos para la proliferacion y diferenciacion de celulas b y su empleo. |
ATE220331T1 (de) * | 1995-03-01 | 2002-07-15 | Immunex Corp | Cd40 bindendes protein zur stimulierung der immunantwort |
WO1996028568A1 (en) | 1995-03-13 | 1996-09-19 | The Regents Of The University Of Michigan | Cd40 binding compositions and methods of using same |
ATE257858T1 (de) * | 1995-06-07 | 2004-01-15 | Immunex Corp | Cd40l mutein |
DK0833847T3 (da) * | 1995-06-22 | 2003-12-29 | Biogen Inc | Krystaller af fregmenter af CD40-ligand og deres anvendelse |
US6440418B1 (en) | 1995-11-07 | 2002-08-27 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Methods of treating autoimmune diseases with gp39-specific antibodies |
US6001358A (en) | 1995-11-07 | 1999-12-14 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof |
US6340459B1 (en) | 1995-12-01 | 2002-01-22 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Therapeutic applications for the anti-T-BAM (CD40-L) monoclonal antibody 5C8 in the treatment of reperfusion injury in non-transplant recipients |
AU3570797A (en) * | 1996-06-14 | 1998-01-07 | University Of Washington | Absorption-enhanced differential extraction device |
US6017527A (en) * | 1996-07-10 | 2000-01-25 | Immunex Corporation | Activated dendritic cells and methods for their activation |
KR20000022445A (ko) * | 1996-07-10 | 2000-04-25 | 크리스토퍼 엘. 와이트, 스코트 지. 홀퀴스트, 스티븐 엘. 말라스카 | 수상돌기 세포의 활성화 방법 |
US7070771B1 (en) | 1996-12-09 | 2006-07-04 | Regents Of The University Of California | Methods of expressing chimeric mouse and human CD40 ligand in human CD40+ cells |
EP2314695A3 (en) | 1996-12-23 | 2011-12-21 | Immunex Corporation | Ligand for receptor activator of NF-kappa B, ligand is member of TNF superfamily |
US6271349B1 (en) | 1996-12-23 | 2001-08-07 | Immunex Corporation | Receptor activator of NF-κB |
ES2317694T3 (es) | 1998-05-14 | 2009-04-16 | Immunex Corporation | Metodo para inhibir la actividad osteoclastica. |
AU773891C (en) | 1998-10-23 | 2005-02-17 | Kirin-Amgen Inc. | Dimeric thrombopoietin peptide mimetics binding to MP1 receptor and having thrombopoietic activity |
US7300774B1 (en) | 1999-12-09 | 2007-11-27 | The Regents Of The University Of California | Multimeric fusion proteins of the TNF superfamily ligands |
EP1067194A1 (en) * | 1999-04-16 | 2001-01-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Vectors containing a gene coding for CD40 and/or CD40L under the control of a cytokine-inducible promoter which is a human acute phase amyloid A gene promoter. Methods for their production and uses thereof |
CA2369820A1 (en) * | 1999-04-16 | 2000-10-26 | Frank Dicker | Nucleic acids encoding cd40/cd40l chimeric polypeptides, methods for their production and uses thereof |
WO2001016180A2 (en) * | 1999-08-27 | 2001-03-08 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Cd40 agonist compositions and methods of use |
GB9927757D0 (en) * | 1999-11-25 | 2000-01-26 | Kennedy Rheumatology Inst | Treatment of autoimmune diseases |
WO2001079555A2 (en) | 2000-04-14 | 2001-10-25 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Roles of jak/stat family members in tolerance induction |
RU2270691C2 (ru) | 2000-05-12 | 2006-02-27 | Бет Израел Диконесс Медикал Сентер, Инк. | Композиции и способы достижения иммунной супрессии |
PT1326896E (pt) | 2000-10-02 | 2011-03-03 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Anticorpos humanos anti-cd40 |
WO2002036769A2 (en) * | 2000-10-31 | 2002-05-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Nucleic acids encoding cd40/cd40l chimeric polypeptides, methods for their production and uses thereof |
US6586245B2 (en) | 2001-07-18 | 2003-07-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of CD40 ligand expression |
WO2003011324A1 (en) * | 2001-07-31 | 2003-02-13 | Genset S.A. | Agonists and antagonists of moxifin for the treatment of metabolic disorders |
CA2458811C (en) | 2001-09-20 | 2011-05-10 | Immunex Corporation | Selection of cells expressing heteromeric polypeptides |
US7786282B2 (en) | 2001-12-06 | 2010-08-31 | The Regents Of The University Of California | Nucleic acid molecules encoding TNF-α ligand polypeptides having a CD154 domain |
US7495090B2 (en) | 2002-05-23 | 2009-02-24 | The Regents Of The University Of California | Nucleic acids encoding chimeric CD154 polypeptides |
ATE553185T1 (de) | 2003-02-14 | 2012-04-15 | Biogen Idec Inc | Expressionskassette und vektor zur transienten oder stabilen expression exogener moleküle |
AU2005287406B2 (en) | 2004-07-26 | 2011-08-18 | Biogen Ma Inc. | Anti-CD154 antibodies |
CN101080487B (zh) | 2004-10-07 | 2012-11-14 | 阿戈斯治疗公司 | 成熟树突细胞组合物及其培养方法 |
US8513008B2 (en) | 2004-10-07 | 2013-08-20 | Argos Therapeutics, Inc. | Mature dendritic cell compositions and methods for culturing same |
KR101370253B1 (ko) | 2004-10-22 | 2014-03-05 | 암젠 인크 | 재조합 항체의 재접힘 방법 |
EP2500415A1 (en) | 2006-09-13 | 2012-09-19 | Abbott Laboratories | Cell culture improvements |
NZ575328A (en) | 2006-09-13 | 2012-06-29 | Abbott Lab | Cell culture improvements |
EP2066339B1 (en) | 2006-09-18 | 2014-08-13 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Compositions and methods of enhancing immune responses |
WO2009036209A2 (en) | 2007-09-14 | 2009-03-19 | Amgen Inc. | Homogeneous antibody populations |
AU2008318615A1 (en) | 2007-10-30 | 2009-05-07 | Texas A&M University System | Compositions and methods of enhancing immune responses to flagellated bacterium |
PT3097926T (pt) | 2007-11-01 | 2020-01-08 | Univ Guelph | Composições e métodos de potenciação das respostas imunitárias frente a eimeria |
CN101970655B (zh) | 2008-01-15 | 2014-03-05 | Abbvie公司 | 改良哺乳动物表达载体及其用途 |
PL2501822T3 (pl) | 2009-11-17 | 2017-12-29 | E. R. Squibb & Sons, L.L.C. | Sposoby zwiększenia produkcji białek |
WO2011091255A1 (en) | 2010-01-21 | 2011-07-28 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Vaccine vectors and methods of enhancing immune responses |
WO2011156619A2 (en) | 2010-06-09 | 2011-12-15 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Vaccine and methods to reduce campylobacter infection |
CN105142665A (zh) | 2013-02-14 | 2015-12-09 | 阿肯色大学评议会 | 增强对艾美球虫的免疫应答或限制艾美球虫感染的组合物和方法 |
US10023608B1 (en) | 2013-03-13 | 2018-07-17 | Amgen Inc. | Protein purification methods to remove impurities |
US10376571B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-08-13 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Compositions and methods of enhancing immune responses to enteric pathogens |
US10786547B2 (en) | 2015-07-16 | 2020-09-29 | Biokine Therapeutics Ltd. | Compositions, articles of manufacture and methods for treating cancer |
CN107921128B (zh) | 2015-08-05 | 2022-04-26 | 詹森生物科技公司 | 抗cd154抗体及其使用方法 |
WO2017083604A1 (en) | 2015-11-12 | 2017-05-18 | Amgen Inc. | Triazine mediated pharmacokinetic enhancement of therapeutics |
KR20230070521A (ko) | 2016-05-03 | 2023-05-23 | 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 아칸소 | 면역자극 및 항원 폴리펩티드를 포함하는 효모 백신 벡터, 및 그를 이용하는 방법 |
US11384140B2 (en) | 2016-05-11 | 2022-07-12 | Amgen Inc. | Direct selection of cells expressing high levels of heteromeric proteins using glutamine synthetase intragenic complementation vectors |
WO2018157164A1 (en) * | 2017-02-27 | 2018-08-30 | Shattuck Labs, Inc. | Csf1r-based chimeric proteins |
US20190367579A1 (en) | 2017-02-27 | 2019-12-05 | Shattuck Labs, Inc. | Tigit- and light-based chimeric proteins |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2089229C (en) * | 1992-02-14 | 2010-04-13 | Alejandro A. Aruffo | Cd40cr receptor and ligands therefor |
US5540926A (en) * | 1992-09-04 | 1996-07-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Soluble and its use in B cell stimulation |
-
1992
- 1992-10-23 DE DE69233402T patent/DE69233402T3/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-10-23 EP EP98113461A patent/EP0897983B1/en not_active Revoked
- 1992-10-23 DK DK92925017T patent/DK0667901T4/da active
- 1992-10-23 AU AU31226/93A patent/AU661360B2/en not_active Expired
- 1992-10-23 ES ES92925017T patent/ES2227513T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-23 WO PCT/US1992/008990 patent/WO1993008207A1/en active IP Right Grant
- 1992-10-23 ES ES98113461T patent/ES2198025T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-23 CA CA002121798A patent/CA2121798C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-10-23 AT AT92925017T patent/ATE274055T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-10-23 CA CA002312667A patent/CA2312667C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-23 KR KR1019940701285A patent/KR100283541B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-10-23 JP JP50789793A patent/JP3308534B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-10-23 DE DE69233051T patent/DE69233051T2/de not_active Revoked
- 1992-10-23 DK DK97117514T patent/DK0822199T3/da active
- 1992-10-23 AT AT98113461T patent/ATE239790T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-10-23 DK DK98113461T patent/DK0897983T3/da active
- 1992-10-23 EP EP92925017A patent/EP0667901B2/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-04-19 NO NO19941422A patent/NO317625B1/no not_active IP Right Cessation
- 1994-04-20 FI FI941837A patent/FI116850B/fi active IP Right Grant
-
1997
- 1997-11-19 JP JP9318110A patent/JP2877788B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-01-05 NO NO19980030A patent/NO320073B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-08-17 FI FI981765A patent/FI116828B/fi not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-08-24 HK HK99103655A patent/HK1019343A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2227513T5 (es) | Citoquina novedosa. | |
US6410711B1 (en) | DNA encoding CD40 ligand, a cytokine that binds CD40 | |
US7309489B1 (en) | Mouse CD40 ligand-specific antibodies and hybridomas | |
ES2252732T3 (es) | Nueva citoquina que une cd30. | |
ES2229264T3 (es) | Receptor il-17. | |
US6355779B1 (en) | Cytokine designated 4-1BB ligand antibodies and human receptor that binds thereto | |
US6264951B1 (en) | Methods of inhibiting CD40L binding to CD40 with soluble monomeric CD40L | |
ES2236710T3 (es) | Nueva citoquina denominada lerk-5. | |
US5674704A (en) | Cytokine designated 4-IBB ligand | |
US7138500B1 (en) | Antibodies to human 4-1BB | |
ES2216000T3 (es) | Citoquinas que unen el receptor hek de la superficie celular. | |
ES2253753T3 (es) | Citocina que induce apoptosis. | |
ES2315016T3 (es) | Moleculas llamadas b7l-1. | |
ES2353637T3 (es) | Moléculas denominadas ldcam. | |
CA2179909C (en) | Ligand that binds fas antigen | |
US7405270B2 (en) | CD40-Ligand lacking native-pattern glycosylation | |
ES et al. | NEUE CYTOKINE NOUVELLE CYTOKINE |