ES2252732T3 - Nueva citoquina que une cd30. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTA UN POLIPEPTIDO (CD30-L) Y SECUENCIAS DE DNA, VECTORES Y CELULAS HUESPEDES TRANSFORMADAS PARA PROPORCIONAR POLIPEPTIDOS CD30-L. EL POLIPEPTIDO CD30-L SE UNE AL RECEPTOR CONOCIDO COMO CD30, QUE SE ENCUENTRA EN CELULAS DE TUMOR DE ENFERMEDADES DE HODGDIN.

Description

Nueva citoquina que une CD30.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Hodgkin es un linfoma humano cuya etiología no se conoce todavía bien. Las células neoplásicas de la enfermedad de Hodgkin se conocen como células de Hodgkin y Reed-Sternberg (H-RS). CD30 es un antígeno de superficie de 120 kd ampliamente usado como marcador clínico para el linfoma de Hodgkin y manifestaciones hematológicas malignas relacionadas (Froese y otros, J. Immunol. 139:2081 (1987); Pfreundschuh y otros, Onkologie 12:30 (1989); Carde y otros, Eur. J. Cancer 26:474 (1990)). Identificado originalmente por el anticuerpo monoclonal Ki-1, que es reactivo con células H-RS (Schwab y otros, Nature (London) 299:65 (1982)), posteriormente se encontró que el CD30 se expresa en una subserie de linfomas no de Hodgkin (NHL), incluido el linfoma de Burkitt, así como varias líneas humanas viralmente transformadas (células T humanas linfotrópicas transformadas con virus I o II y células B transformadas con virus de Epstein-Barr (Stein y otros, Blood 66:848 (1985); Andreeson y otros, Blood 63:1299 (1984)). De hecho, globalmente, el 50% de los linfomas de Hodgkin son EBV^{+} (Klein, Blood 80:299 (1992)). Que el CD30 juega un papel en las interacciones linfoides normales lo sugieren su detección histológica en una población pequeña de células linfoides en nodos reactivos de linfa y la expresión inducida en células T y B purificadas después de activación de lectina (Stein y otros, Int. J. Cancer 30:445 (1982) y Stein y otros, 1985, referencia citada antes).

Se ha dado cuenta de la clonación y expresión de un gen que codifica CD30 y el CD30 se ha caracterizado como una proteína de transmembrana que posee una homología sustancial con la superfamilia del receptor del factor de crecimiento de nervios (Durkop y otros, Cell 68:421, 1992). Durkop y otros sugieren que el CD30 es el receptor de uno o más factores de crecimiento aún no identificados y reconocen la importancia de investigar la existencia y naturaleza de tales factores de crecimiento con el fin de conocer la etiología de la enfermedad de
Hodgkin.

Antes de la presente invención, sin embargo, no se conocían tales factores de crecimiento u otras moléculas que se unen al receptor CD30. Había así necesidad de identificar y caracterizar un ligando para CD30.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una nueva citoquina designada CD30-L, así como DNA aislado que codifica la proteína de CD30-L, vectores de expresión que comprenden el DNA aislado y un procedimiento para producir CD30-L por cultivo de células huésped que contienen los vectores de expresión en condiciones apropiadas para expresión de la proteína de CD30-L. CD30-L es un ligando que se une al antígeno CD30 asociado a la enfermedad de Hodgkin (un receptor de superficie). También se proporcionan anticuerpos dirigidos contra la proteína de CD30-L o un fragmento inmunogénico de ella.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1a y 1b presentan un cDNA y una secuencia codificada de aminoácidos para el receptor conocido como CD30. Esta secuencia la han dado a conocer Durkop y otros (Cell 68:421, 1992). El péptido señal está subrayado y la región de transmembrana se señala con una línea doble.

La Figura 2 presenta cDNA y secuencias de aminoácidos codificada para un fragmento Fc de IgGI humano. El fragmento Fc se usó para preparar una proteína de fusión CD30/Fc usada en los procedimientos de exploración para aislar cDNA de CD30-L.

La Figura 3 presenta una secuencia de DNA y la secuencia de aminoácidos codificada así, para la región de codificación de un clon de cDNA de CD30-L, según se describe en el Ejemplo 4. La región de transmembrana está subrayada. Los nucleótidos están numerados en el margen izquierdo; los aminoácidos en el margen derecho.

La Figura 4 presenta una secuencia parcial de aminoácidos para un clon de cDNA de CD30-L humano según se describe en el Ejemplo 6. La secuencia humana (h) está alineada con una porción N-terminal de la secuencia de murino (m) (aminoácidos 1-130). La región de transmembrana está subrayada para la secuencia de murino y marcada con una línea por encima para la secuencia humana.

La Figura 5 presenta una secuencia de DNA y la secuencia de aminoácidos codificada por él, para la región de codificación del clon de cDNa de CD30-L humano, como se describe en el Ejemplo 6. La región de transmembrana está subrayada. Los nucleótidos están numerados en el margen izquierdo; los aminoácidos en el margen derecho.

La Figura 6 presenta una secuencia de DNA, y la secuencia de aminoácidos codificada por él, para la región de codificación de un clon de cDNA de CD30-L de murino, como se describe en el Ejemplo 7. La región de transmembrana está subrayada. La proteína codificada comprende 19 aminoácidos adicionales como terminal N cuando se compara con la secuencia de la Figura 3.

La Figura 7 presenta una secuencia de DNA, y la secuencia de aminoácidos codificada por él, para la región de codificación de un clon de cDNA de CD30-L humano, como se describe en el Ejemplo 7. La región de transmembrana está subrayada. La proteína codificada comprende 19 aminoácidos adicionales en el terminal N cuando se compara con la secuencia de la Figura 5.

Descripción detallada de la invención

Se ha aislado de acuerdo con la presente invención cDNA que codifica un nuevo polipéptido que puede actuar como ligando para el receptor CD30 asociado a la enfermedad de Hodgkin. También se proporcionan vectores de expresión que comprenden el cDNA del ligando de CD30 (CD30-L) y procedimientos para producir polipéptidos de CD30-L recombinantes por cultivo de células huésped que contienen los vectores de expresión en condiciones apropiadas para expresión de CD30-L y recuperación del CD30-L expresado. La invención también abarca la proteína de CD30-L purificada.

La presente invención proporciona también CD30-L o fragmentos antigénicos de él que pueden actuar como inmunógenos para generar anticuerpos específicos para los inmunógenos de CD30-L. Así, se pueden preparar anticuerpos específicos para CD30-L o sus fragmentos antigénicos.

La nueva citoquina descrita aquí es un ligando para CD30, un receptor que es miembro de la superfamilia de receptores TNF/NGF. Por tanto, probablemente, CD30-L es responsable para la transducción de una señal biológica por vía del CD30, que se conoce que se expresa en la superficie de células tumorales de la enfermedad de Hodgkin.

Un uso del ligando de CD30 de la presente invención es el de herramienta de investigación para estudiar la patogénesis de la enfermedad de Hodgkin. Como se describe en el Ejemplo 8, el CD30-L intensifica la proliferación de la linea HDLM-2 de células de linfoma CD30^{+} derivadas de la enfermedad de Hodgkin. Fenotípicamente, las células de HDLM-2 son células de tipo T. CD30-L no produjo efecto detectable sobre la proliferación o viabilidad de células CD30^{+} de las líneas KM-H2 y L-428 de células de linfoma derivadas de la enfermedad de Hodgkin. El CD30-L de la presente invención proporciona un medio para investigar los papeles que pueden desempeñar el CD30-L y el receptor cognado en la etiología de la enfermedad de Hodgkin.

El CD30-L presentaba un efecto citotóxico sobre la línea Karpas 299 de células CD30^{+} de linfoma no de Hodgkin (véase Ejemplo 8). Así CD30-L tiene uso potencial como agente terapéutico.

El ligando de CD30 induce también la proliferación de células T en presencia de un coestímulo anti CD3. El CD30-L de la presente invención es así útil también como herramienta de investigación para elucidar los papeles que pueden desempeñar CD30 y CD30-L en el sistema inmune. La expresión de CD30-L que se puede inducir sobre células T normales y macrófagos y la presencia de su receptor en células B y T activadas son consistentes con efectos autocrinos y paracrinos.

La regulación por hiperproducción de CD30 que acompaña la transformación de EBV, HTLVI y HTLVII también justifica una investigación, y el CD30-L aquí proporcionado es útil en tales estudios. HTLVI es una causa próxima de leucemia/linfoma de células T adultas. EBV se ha asociado desde hace mucho tiempo con el linfoma de Burkitt y el carcinoma nasofaríngeo y, globalmente, el 50% de los linfomas son EBV^{+} (revisión por Klein, 1992, cita anterior).

Los polipétidos de CD30-L de la presente invención también se pueden emplear en ensayos in vitro para la detección de CD30 o CD30-L o sus interacciones. Por ejemplo, se pueden identificar tipos de células adicionales que expresan CD30.

El término "CD30-L", tal como se usa aquí, se refiere a un género de polipéptidos que son capaces de unir el CD30. El CD30-L humano está dentro del ámbito de la presente invención, como lo están las proteínas de CD30-L derivadas de otras especies mamíferas. Tal como se usa aquí, el término "CD30-L" incluye proteínas unidas a membrana (que comprenden un dominio citoplásmico, una región de transmembrana y un dominio extracelular) así como proteínas truncadas que retienen la propiedad de unir el CD30. Entre tales proteínas truncadas están incluidas, por ejemplo, CD30-L soluble que comprende sólo el dominio extracelular (unión del receptor).

El aislamiento de un cDNA que codifica CD30-L de murino se describe en los posteriores ejemplos 1-4. Se preparó como se describe en el Ejemplo 1, una proteína de fusión CD30-Fc para uso en la exploración de clones en un procedimiento de clonación de expresión directa para identificar los que expresaban una proteína que uniera el CD30.

En resumen, se aisló RNA total de una línea de células T humanas designada HUT-102, que ha sido descrita por Durkop y otros, cita anterior, y Poiesz y otros (PNAS USA 77:7415-19, 1980). Se preparó cDNA de primera cadena usando como molde el RNA total. Se amplificó por reacción en cadena de polimerasa (PCR) DNA que codifica el dominio extracelular de CD30 humano usando cebadores basados en la secuencia de CD30 humano publicada por Durkop y otros, cita anterior, y se aisló el fragmento de DNA amplificado. Se construyó y transfectó en células de mamífero un vector de expresión que comprendía el DNA del dominio extracelular de CD30 fusionado en el marco al terminal N de una secuencia de DNA humano de la región Fc de IgG1. La proteína expresada se purificó por un procedimiento que implicaba el uso de una columna de proteína G (a la que se une la porción Fc de la proteína de fusión).

Se exploraron tres líneas de células T cooperadoras de murino activadas, y se encontró que las tres se unían a un derivado fluorescente de la proteína CD30-Fc. Se preparó una biblioteca de cDNA de una de las células T cooperadoras de murino. Se transfectó en células COS-7 (de mamífero) cDNA de esta biblioteca (en un vector de expresión de mamífero que también replica en E. coli) para aislar clones que expresan una proteína que se une a CD30 usando una técnica de expresión directa de clones. Los clones se exploraron en cuanto a su actividad para unir ^{125}I-CD30/Fc y se aisló un clon positivo. El vector recombinante aislado del clon positivo (cDNA de CD30-L de murino en el plásmido pDC202) se transformó en células de E. coli, se depositó en la American Type Culture Collection el 28 de mayo de 1992 y se le asignó el número de acceso ATCC 69004. El depósito se hizo en términos del Tratado de Budapest.

El cDNA de CD30-L de murino se radiomarcó y se usó como sonda para aislar cDNA de CD30-L humano por hibridación de especies cruzadas. En resumen, una biblioteca de cDNA preparada a partir de linfocitos de sangre periférica humana se exploró con cDNA de murino marcado con ^{32}P y se aisló un clon positivo como se describe en el Ejemplo 6. DNA de CD30-L humano aislado del clon positivo se insertó en el plásmido pGEMBL y luego se transformó en células de E. coli como se describe en el Ejemplo 6. Se depositaron en la American Type Culture Collection el 24 de junio de 1992 muestras de células de E. coli transformadas con el vector recombinante; el número de acceso asignado fue ATCC 69020. El depósito se hizo en términos del Tratado de Budapest.

Se aislaron como se describe en el Ejemplo 7 secuencias adicionales de DNA de CD30-L humano y de murino. Las proteínas codificadas por los clones del Ejemplo 7 comprenden aminoácidos adicionales en el terminal N, en comparación con los clones aislados en los Ejemplo 4 y 6.

Las proteínas de CD30-L de la invención incluyen, por tanto, aunque no únicamente, las proteínas de CD30-L humano caracterizadas por la secuencia de aminoácidos N-terminal Met-Gln-Val-Gln-Pro-Gly-Ser-Val-Ala-Ser-Pro-Trp (Figura 3) o Met-Glu-Pro-Gly-Leu-Gln-Gln-Ala-Gly-Ser-Cys-Gly (Figura 6). También se dan las proteínas de CD30-L humano caracterizadas por la secuencia de aminoácidos N terminal Met-His-Val-Pro-Ala-Gly-Ser-Val-Ala-Sert-His-Leu (Figura 5) o Met-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gln-Ala-Leu-Asn-Gly-Met (Figura 7).

Si bien en el procedimiento de exploración que se describe más adelante en el Ejemplo 4 se empleó una proteína de fusión CD30/Fc, se podría usar CD30 marcado para explorar clones en líneas de células candidato para expresión de proteínas de CD30-L. La proteína de fusión CD30/Fc tiene la ventaja de purificarse con facilidad. Además, los enlaces disulfuro se forman entre las regiones Fc de dos cadenas separadas de la proteína de fusión, creando dímeros. Se escogió el receptor dímero de CD30/Fc por la ventaja potencial de una mayor afinidad de unión del ligando de CD30 a la vista de la posibilidad de que el ligando que se estaba buscando fuera multímero.

Además, en los procedimientos de exploración se puede sustituir la proteína CD30/Fc con otras proteínas de fusión adecuadas que comprenden CD30. Se pueden formar otras proteínas de fusión fusionando una secuencia de DNA del dominio de unión del ligando de CD30 a una secuencia de DNA que codifica otro polipéptido que es capaz de purificación por afinidad, por ejemplo, avidina o estreptavidina. La construcción de gen resultante se puede introducir en células mamíferas para expresar una proteína de fusión. Las proteínas de fusión de receptor/avidina se pueden purificar por cromatografía de afinidad con biotina. La proteína de fusión se puede recuperar luego de la columna eluyendo con una solución altamente salina u otro tampón apropiado. Otras regiones Fc del anticuerpo pueden sustituir la región Fc de IgG1 humano descrita en el Ejemplo 1. Otra región de Fc adecuada se define como cualquier región que pueda unirse con una afinidad alta a proteína A o proteína G y entre tales regiones está incluida la región Fc de IgG1 de murino o fragmentos de la región Rc de IgG1 humano, por ejemplo, fragmentos que comprenden al menos la región de articulación de manera que se formarán enlaces disulfuro entre cadenas.

Se puede aislar de otras especies mamíferas cDNA que codifica polipéptido de CD30-L por procedimientos análogos a los empleados en el aislamiento de clon de CD30-L. Por ejemplo, una biblioteca de cDNA derivada de una especie mamífera diferente puede sustituir la biblioteca de cDNA de murino que se exploró para unir la proteína de fusión CD30/Fc humana radioyodada en el procedimiento de clonación de expresión directa descrito en el Ejemplo 4. Los tipos de células de las que se pueden preparar las bibliotecas de cDNA se pueden seleccionar por el procedimiento de selección de FACS descrito en el Ejemplo 2 o cualquier otra técnica adecuada. Como alternativa, se puede explorar por hibridación Northern mRNA aislado de varias líneas de células para determinar una fuente adecuada de mRNA de CD30-L mamífero para uso en la clonación de un gen de CD30-L.

Alternativamente, se pueden utilizar los cDNAs de CD30-L humano o de murino descritos aquí para explorar cDNA derivado de otras fuentes mamíferas para cDNA de CD30-L usando técnicas de hibridación de especies por cruce. Resumidamente, se prepara por técnicas estándar para uso como sonda un oligonucleótido basado en la secuencia de nucleótidos de la región de codificación (preferiblemente la región extracelular) del clon de murino o humano o, preferiblemente, el cDNA de CD30-L de longitud completa. La sonda de murino o humana se usa para explorar una biblioteca de cDNA de mamífero o una biblioteca genómica, generalmente en condiciones moderadamente severas.

Las proteínas de CD30-L de la presente invención incluyen, aunque no limitativamente, CD30-L de murino que comprende los aminoácidos 1-220 de la Figura 3 o 1-239 de la Figura 6; CD30-L humano que comprende los aminoácidos 1-215 de la Figura 5 o 1-234 de la Figura 7; y proteínas que comprenden truncamientos N terminales, C terminales o internos de las secuencias anteriores pero que retienen la actividad biológica deseada. Los ejemplos incluyen proteínas de CD30-L de murino que comprenden los aminoácidos x a 239 de la Figura 6, siendo x 1-19 (esto es, el aminoácido N terminal se selecciona entre los aminoácidos 1-19 de la Figura 6, y el aminoácido C terminal es el aminoácido 239 de la Figura 6). Como se describe en el Ejemplo 7, los aminoácidos 1-19 de la secuencia de la Figura 6 no son esenciales para unir CD30-L de murino al receptor CD30. También proporciona la presente invención proteínas de CD30-L humano que comprenden los aminoácidos y a 234 de la Figura 7, siendo y 1-19 (esto es, el aminoácido N terminal es cualquiera de los aminoácidos 1-19 de la Figura 7 y el aminoácido 234 es el aminoácido C terminal). Tales proteínas, truncadas en el terminal N, son capaces de fijar CD30, como se discute en el Ejemplo 7.

Una realización de la presente invención proporciona polipéptidos de CD30-L soluble. Los polipéptidos de CD30-L soluble comprenden la totalidad o parte del dominio extracelular de un CD30-L nativo pero carecen de la región de transmembrana que causaría la retención del polipéptido sobre una membrana celular. Puesto que la proteína de CD30-L carece de un péptido señal, se fusiona un péptido señal heterólogo al terminal N de una proteína CD30-L soluble para promover su secreción, como se describe detalladamente más adelante. El péptido señal se escinde de la proteína de CD30-L después de la secreción desde la célula huésped. Los polipéptidos de CD30-L soluble que se pueden emplear retienen la capacidad para unir el receptor CD30. El CD30-L soluble puede incluir también parte de la región de transmembrana o parte del dominio citoplasmático u otras secuencias con tal de que la proteína de CD30-L soluble sea capaz de ser secretada.

El CD30-L soluble se puede identificar (y distinguir de sus conjugados unidos a membrada no solubles) separando células intactas que expresan la proteína deseada del medio de cultivo, por ejemplo, por centrifugación, y ensayando el medio (material sobrenadante) en cuanto a la presencia de la proteína deseada. El medio de cultivo se puede ensayar usando procedimientos que son similares o idénticos a los que se describen en los ejemplos posteriores. La presencia de CD30-L en el medio indica que la proteína se secretó de las células y, por tanto, es una forma soluble de la proteína deseada.

El uso de formas solubles de CD30-L es ventajoso para ciertas aplicaciones. Se facilita la purificación de las proteínas de células huésped recombinantes, puesto que las proteínas solubles se secretan de las células.

Los ejemplos de polipéptidos de CD30-L solubles incluyen los que comprenden el dominio extracelular entero de una proteína de CD30-L nativo. Uno de tales CD30-L solubles comprende los aminoácidos 49 (Gln) a 220 (Asp) de la secuencia de CD30-L de murino de la Figura 3. Otros polipéptidos de CD30-L solubles comprenden los aminoácidos z a 215 (Asp) de la secuencia de CD30-L humano de la Figura 5, siendo z 44, 45, 46 o 47. En otras palabras, el aminoácido N terminal de CD30-L humano soluble se selecciona entre los aminoácidos de las posiciones 44-47 de la Figura 5.

Se puede preparar CD30-L truncado, incluidos polipéptidos solubles, por cualquiera de varias técnicas convencionales. En el caso de proteínas recombinantes, se puede subclonar en un vector de expresión un fragmento de DNA que codifica el fragmento deseado. Alternativamente, se puede sintetizar químicamente una secuencia de DNA deseada usando técnicas conocidas. También se pueden producir fragmentos de DNA por digestión con endonucleasa de restricción de una secuencia de DNA de longitud completa clonada y aislamiento por electroforesis sobre geles de agarosa. Se pueden emplear conectores que contienen sitio(s) de escisión de endonucleasa de restricción para insertar el fragmento de DNA deseado en un vector de expresión, o el fragmento se puede digerir en los sitios de escisión naturalmente presentes en él. También se puede emplear el procedimiento bien conocido de reacción en cadena de polimerasa para aislar una secuencia de DNA que codifica un fragmento de proteína deseado.

En otra metodología, se puede emplear un tratamiento enzimático (por ejemplo, usando Bal 31 exonucleasa) para suprimir nucleótidos terminales del fragmento de DNA con el fin de obtener un fragmento que tiene un terminal particular deseado. Entre los conectores disponibles comercialmente están los que se pueden ligar a extremos embotados producidos por digestión de Bal 31 y que contienen sitio(s) de escisión de endonucleasa de restricción. Alternativamente, se pueden sintetizar oligonucleótidos que reconstruyen el terminal N o el C de un fragmento de DNA a un punto que se desee. El oligonucleótido puede contener un sitio de escisión de endonucleasa de restricción corriente arriba de la secuencia de codificación deseada y situar un codón de iniciación (ATG) en el terminal N de la secuencia de codificación.

La presente invención proporciona polipéptidos de CD30-L purificados, tanto recombinantes como no recombinantes. También están dentro del ámbito de la presente invención las variantes y derivados de proteínas de CD30-L nativo que retienen la deseada actividad biológica. Las variantes de CD30-L se pueden obtener por mutaciones de secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos de CD30-L nativos. Una variante de CD30-L, según se considera aquí, es un polipéptido sustancialmente homólogo a un CD30-L nativo, pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente al de CD30-L nativo (humano, de murino o de otra especie mamífera) a causa de una o varias supresiones, inserciones o sustituciones.

Preferiblemente, la secuencia de la variante de aminoácidos es como mínimo idéntica en un 80% a la secuencia de aminoácidos de CD30-L nativo, muy preferiblemente idéntica en un 90% como mínimo. El grado de homología (identidad porcentual) se puede determinar, por ejemplo, comparando información de secuencias usando el programa GAP de ordenador, versión 6.0, descrito por Devereux y otros (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984), asequible del Genetics Computer Group de la Universidad de Wisconsin (UWGCG). El programa GAP utiliza el método de alineamiento de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), según la revisión de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math 2:482, 1981). Los parámetros por defecto preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz unaria de comparación (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids. Res. 14:6745, 1986, según es descrita por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358, 1979; (2) una penalización de 3,0 para cada brecha y una penalización adicional de 0,10 para cada símbolo de cada brecha, y (3) ninguna penalización para brechas terminales.

Las alteraciones de la secuencia de aminoácidos nativa se puede realizar por cualquiera de varias técnicas conocidas. Las mutaciones se pueden introducir en puntos particulares sintetizando nucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permiten la ligación a fragmentos de la secuencia nativa. Después de la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o supresión de aminoácidos deseada.

Alternativamente, se pueden emplear procedimientos de mutagénesis específicos al sitio, dirigidos a oligonucleótidos, para obtener un gen alterado que tiene codones particulares alterados de acuerdo con la sustitución, supresión o inserción requerida. Describen ejemplos de métodos para hacer tales alteraciones, Walder y otros (Gene 42:133, 1986); Bauer y otros (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, enero de 1985, 12:19); Smith y otros, (Genetic Engineering: Priciples and Methods, Plenum Press, 1981), y patentes U.S. nº. 4.518.584 y nº. 4.737.462, que se incorporan aquí por referencia.

Las variantes pueden comprender secuencias sustituidas conservadoramente, lo que significa que un resto de amioácido dado es reemplazado por un resto que tiene unas características fisicoquímicas similares. Entre los ejemplos de sustituciones conservadoras están la sustitución de un resto alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu o Ala por otro, o sustituciones de un resto polar por otro, como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Glu y Asn. Son bien conocidas otras sustituciones conservadoras, por ejemplo, sustituciones de regiones enteras que tienen similares características de hidrofobia.

El CD30-L se puede modificar también para crear derivados de CD30-L formando conjugados covalentes o agregativos con otros restos químicos, tales como grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo, etc. Los derivados covalentes de CD30-L se pueden preparar uniendo los restos químicos a grupos funcionales en cadenas laterales de aminoácidos de CD30-L o en el terminal N o el terminal C de un polipéptido de CD30-L o su dominio extracelular. Entre otros derivados de CD30-L dentro del ámbito de la presente invención están incluidos conjugados covalentes o agregativos de CD30-L o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, como puede ser por síntesis en cultivo recombinante como fusiones N o C terminales. Por ejemplo, el conjugado puede comprender una secuencia señal o líder de polipétido (por ejemplo, el líder del factor \alpha de Saccharomyces) en el terminal N de un polipéptido de CD30-L soluble. El péptido líder o señal dirige cotranslacionalmente o postranslacionalmente la transferencia del conjugado desde su sitio de síntesis al sitio dentro o fuera de la membrana celular o la pared celular.

Las fusiones de polipéptidos de CD30-L pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación e identificación de CD30-L. Tales péptidos incluyen, por ejemplo, los poli-His o los péptidos antigénicos de identificación descritos en la patente U.S. nº. 5.011.912 y por Hopp y otros en Bio/Technology 6:1204, 1988. Uno de tales péptidos es el péptido FLAG®, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDK), que es altamente antigénico y proporciona un epitopo unido reversiblemente por un anticuerpo monoclonal específico que permite un ensayo rápido y una purificación fácil de la proteína recombinante expresada. Esta secuencia también se escinde específicamente por enteroquinasa mucosa de bovino en el resto que sigue inmediatamente al par Asp-Lys. Las proteínas de fusión rematadas con este péptido pueden ser también resistentes a la degradación celular en E. coli. Un hibridoma de murino designado 4E11 produce un anticuerpo monoclonal que se une al péptido DYKDDDDK en presencia de ciertos cationes metálicos divalentes (como se describe en la patente U.S. nº. 5.011.912), que se ha depositado en la American Type Culture Collection con el número de acceso HB 9259.

La presente invención incluye además polipéptidos de CD30-L con o sin glicosilación asociada de configuración nativa. El CD30-L expresado en sistemas de expresión de levaduras o mamíferos (por ejemplo, células COS-7) puede ser similar o significativamente diferente a un polipéptido de CD30-L en cuanto al peso molecular y la configuración de glicosilación dependiendo de la elección del sistema de expresión. La expresión de polipéptidos de CD30-L en sistemas de expresión bacterianos, tales como E. coli, proporciona moléculas no glicosiladas.

Se pueden preparar construcciones de DNA que codifican varias adiciones o sustituciones de restos o secuencias de aminoácidos, o supresiones de restos terminales o internos o secuencias no necesarias para la actividad o unión biológica. Por ejemplo, se pueden modificar sitios de N glicosilación en el dominio extracelular de CD30-L para imposibilitar la glicosilación, mientras que se puede realizar la expresión de un análogo de carbohidrato homogéneo, reducido, usando sistemas de expresión de levaduras o mamíferos. Los sitios de N-glicosilación en polipéptidos eucarióticos se caracterizan por un triplete de aminoácidos Asn-X-Y, en el que X es cualquier aminoácido excepto Pro, e Y es Ser o Thr. Las modificaciones apropiadas de la secuencia de nucleótidos que codifica este triplete dará por resultado sustituciones, adiciones o supresiones que impiden la unión de restos de carbohidrato en la cadena lateral de Asn. La alteración de un nucleótido individual, escogido de manera que Asn es reemplazado por un aminoácido diferente, por ejemplo, es suficiente para inactivar un sitio de N-glicosilación. Entre los procedimientos conocidos para desactivar los sitios de N-glicosilación en proteínas están los descritos en las patentes U.S. nº. 5.071.972 y EP 276.846.

En otro ejemplo, se pueden alterar las secuencias que codifican restos Cys que no son esenciales para la actividad biológica con el fin de causar que se supriman los restos Cys o se reemplacen con otros aminoácidos, impidiendo la formación, después de renaturalización, de puentes intramoleculares disulfuro incorrectos. Se preparan otras variantes por modificación de restos dibásicos de aminoácidos adyacentes para intensificar la expresión en sistemas de levaduras en los que está presente la actividad de KEX2 proteasa. La patente EP 212.914 describe el uso de mutagénesis específica al sitio para inactivar los sitios que procesa la KEX2 proteasa en una proteína. Los sitios de procesado de la KEX2 proteasa se inactivan suprimiendo, añadiendo o sustituyendo para alterar los pares Arg-Arg, Arg-Lys y Lys-Arg para eliminar la presencia de estos restos básicos adyacentes. Los emparejamientos Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles a la escisión por KEX2, y la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg en Lys-Lys representa un enfoque conservador y preferido para inactivar sitios de KEX2. Las muteínas resultantes son menos susceptibles a la escisión por la KEX2 proteasa en puntos que no son la secuencia líder del factor \alpha de levadura, donde se pretende la secreción después de escisión.

La presente invención abarca también las variantes naturales de CD30-L. Los ejemplos de tales variantes son proteínas que resultan de eventos alternativos de reparación de mRNA (puesto que, presumiblemente, CD30-L está codificado por un gen multiexon) o de la escisión proteolítica de la proteína de CD30-L, en las que se retiene la propiedad de unir el CD30. La reparación alternativa de mRNA puede dar una proteína de CD30-L truncada pero biológicamente activa, tal como una forma soluble natural de la proteína, por ejemplo. Entre las variaciones atribuibles a proteolisis están incluidas, por ejemplo, diferencias en los terminales N o C después de expresión en diferentes tipos de células huésped debidas a la eliminación proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de la proteína de CD30-L (generalmente, de 1-5 aminoácidos).

Las secuencias de ácidos nucleicos dentro del ámbito de la presente invención incluyen las secuencias aisladas de DNA y RNA que hibridizan con las secuencias de nucleótidos de CD30-L descritas aquí en condiciones de severidad moderada o fuerte y que codifican CD30-L biológicamente activo. Las condiciones de severidad moderada se refieren a las condiciones descritas en, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, por Sambrook y otros, 2ª ed., vol. 1, págs. 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989). Las condiciones de severidad moderada, según han definido Sambrook y otros, incluyen el uso de una solución de prelavado de 5 X SSC, 0,5% de SDS, EDTA
1 mM (pH 8,0) y condiciones de hibridación de aprox. 55ºC, 5 X SSC, durante la noche. Las condiciones de fuerte severidad incluyen temperaturas más altas de hibridación y lavado. El operario experto sabe que la temperatura y la concentración salina de la solución de lavado se pueden ajustar según sea necesario de acuerdo con factores tales como la longitud de la sonda.

La presente invención proporciona así secuencias aisladas de DNA que codifican CD30-L biológicamente activo, seleccionadas entre: (a) DNA derivado de la región de codificación de un gen de CD30-L mamífero (por ejemplo, DNA que comprende la secuencia de nucleótidos presentada en las Figuras 3, 5, 6 o 7); (b) DNA capaz de hibridación con un DNA de (a) en condiciones moderadamente severas y que codifica CD30-L biológicamente activo, y (c) DNA que está degenerado como resultado del código genético a un DNA definido en (a) o (b) y que codifica CD30-L biológicamente activo. La presente invención abarca las proteínas de CD30-L codificadas por las secuencias de DNA de (a), (b) y (c).

Entre los ejemplos de proteínas de CD30-L codificadas por DNA que difieren de las secuencias de DNA activo de las Figuras 3, 5, 6 y 7, en las que el DNA variante hibridará con una secuencia de DNA nativo en condiciones moderadamente severas, están incluidos, aunque no limitativamente, fragmentos de CD30-L (soluble o unido a membrana) y proteínas CD30-L que comprenden sitio(s) inactivados de glicosilación, sitio(s) inactivados de procesado por KEX2 proteasa, o sustitución(es) conservadora(s) de aminoácidos, según se ha descrito antes. La presente invención abarca también las proteínas de CD30-L codificadas por DNA derivado de otra especie mamífera, en las que el DNA se hibridará con el DNA humano o de murino de las Figuras 3, 5, 6 o 7.

Las variantes que poseen la capacidad requerida de unir el CD30 se pueden identificar por un ensayo adecuado. Por ejemplo, la actividad biológica del CD30-L se puede determinar por competición para unirse al dominio de unión del ligando de CD30 (esto es, ensayos competitivos de unión).

Un tipo de ensayo competitivo de unión para los polipéptidos de CD30-L usa un CD30-L soluble humano o de murino radiomarcado y células intactas que expresan CD30 de superficie celular (por ejemplo, líneas de células tales como HUT102, descrita por Durkop y otros, cita anterior). En vez de células intactas, se podría usar CD30 soluble unido a una fase sólida (tal como una proteína de fusión CD30/Fc unida a una columna de proteína A o proteína G por interacción con la región Fc de la proteína de fusión). Otro tipo de ensayo de unión competitivo utiliza CD30 radiomarcado soluble, tal como una proteína de fusión CD30/Fc, y células intactas que expresan CD30-L. Alternativamente, se podría usar CD30-L soluble unido a una fase sólida.

Los ensayos competitivos de unión se pueden realizar usando metodología estándar. Por ejemplo, se puede usar CD30-L radiomarcado de murino para competir con un homólogo de CD30-L putativo para conocer la actividad de unión frente a CD30 unido en superficie. Se pueden obtener resultados cualitativos por ensayos competitivos de unión de placas autorradiográficas, o se pueden utilizar gráficos de Scatchard para obtener resultados cuantitativos.

Los ensayos competitivos de unión con células intactas que expresan CD30 se pueden realizar por dos métodos. En un primer método, se hacen crecer células que expresan CD30 de células de superficie en suspensión o por adherencia a placas de cultivo de tejidos. Las células de superficie se pueden eliminar por tratamiento con EDTA 5 mM durante 10 min a 37ºC. En un segundo método, se pueden usar células COS transfectadas que expresan CD30 unido a membrana. Las células COS u otras células de mamífero se pueden transfectar con cDNA de CD30 humano en un vector apropiado para expresar CD30 de longitud completa con una región extracelular.

Alternativamente, se puede unir CD30 soluble a una fase sólida tal como una matriz de cromatografía en columna o un sustrato similar adecuado para análisis de la presencia de un resto detectable tal como ^{125}I. La unión a una fase sólida se puede realizar, por ejemplo, obteniendo una proteína de fusión CD30/Fc y uniéndola a una matriz que contiene proteína A o proteína G.

Otro medio para medir la actividad biológica de CD30-L (incluidas las variantes) es utilizar CD30 conjugado soluble (por ejemplo, ^{125}I-CD30/Fc) en ensayos de competición similares a los descritos antes. En este caso, empero, se usan células intactas que expresan CD30-L, o CD30-L soluble unido a un sustrato sólido, para medir la competición para unir CD30 soluble marcado a CD30-L por una muestra que contiene una variante putativa de CD30-L.

El CD30-L de la presente invención puede usarse también en un ensayo de unión para detectar células que expresan CD30. Por ejemplo, se puede conjugar CD30-L o un dominio extracelular o fragmento de él a un resto detectable tal como ^{125}I. El radiomarcado con ^{125}I se puede realizar por cualquiera de varias metodologías estándar que dan una molécula funcional de ^{125}I-CD30-L marcada a una actividad específica alta. Alternativamente, se puede usar otro resto detectable, tal como una enzima que puede catalizar una reacción colorimétrica o fluorométrica, biotina o avidina. Las células a ensayar en cuanto a la expresión de CD30 se pueden poner en contacto con el CD30-L conjugado. Después de la incubación, se elimina el CD30-L conjugado no unido y se mide la unión usando el resto detectable.

Los polipéptidos de CD30-L pueden existir como oligómeros tales como dímeros o trímeros. Los oligómeros se pueden unir por enlaces disulfuro formados entre restos de cisteína en diferentes polipéptidos de CD30-L. En una realización de la invención, se crea un CD30-L dímero fusionando CD30-L a la región Fc de un anticuerpo (IgG1) de manera que no interfiera con la unión de CD30-L al dominio de unión del ligando de CD30. Preferiblemente, el polipéptido de Fc se fusiona al terminal N de un CD30-L soluble (que comprende sólo el dominio extracelular). En el Ejemplo 1 de más adelante, se presenta un procedimiento para aislar DNA que codifica una región Fc de IgG1 para uso en la preparación de proteínas de fusión. Se inserta un gen de fusión que codifica la proteína de fusión de CD30-L/Fc en un vector de expresión apropiado. Se deja que las proteínas de fusión de CD30-L/Fc se reúnan a modo de moléculas de anticuerpo, después de lo cual se forman enlaces disulfuro de cadenas entre polipéptidos de Fc, resultando CD30-L divalente. Si las proteínas de fusión se hacen con cadenas pesadas y cadenas ligeras de un anticuerpo, es posible formar un CD30-L oligómero con hasta 4 regiones extracelulares de CD30.

Alternativamente, se pueden unir múltiples copias de CD30-L mediante conectores peptídicos. Por tecnología de DNA recombinante, se puede producir una proteína de fusión que comprende dos o más copias de CD30-L (preferiblemente polipéptidos de CD30-L solubles), separada por conectores de peptídicos. Entre los conectores peptídicos que se pueden emplear están cadenas de aminoácidos que tienen una longitud de 5 a 100 aminoácidos, que preferiblemente comprenden aminoácidos seleccionados entre el grupo constituido por glicina, asparagina, serina, treonina y alanina. En una realización de la presente invención, una proteína de fusión comprende 2 o 3 polipéptidos de CD30-L solubles unidos a través de un conector de péptidos seleccionado entre Gly_{4}SerGly_{5}Ser y (Gly_{4}Ser)_{n},
siendo n = 4-12. La producción de proteínas de fusión recombinantes se ilustra en, por ejemplo, la patente U.S. nº. 5.073.627.

La presente invención proporciona oligómeros de dominios extracelulares de CD30-L o fragmentos de ellos, unidos por enlaces disulfuro, o expresados como proteínas de fusión con o sin grupos conectores de aminoácidos. Por ejemplo, se puede unir una molécula de dímero de CD30-L por un grupo conector de la región Fc de IgG1. El análisis de CD30-L recombinante expresado de la presente invención por SDS-PAGE reveló formas monómeras y oligómeras de la proteína. Las proteínas de CD30-L de la presente invención se cree que forman intracelularmente oligómeros (dímeros, trímeros y oligómeros superiores unidos por enlaces disulfuro). Los oligómeros se unen luego a la superficie de la célula por la región de transmembrana de la proteína.

La presente invención proporciona vectores de expresión recombinante para CD30-L y células huésped transformadas con los vectores de expresión. Se puede emplear cualquier sistema de expresión adecuado. Los vectores incluyen una secuencia de DNA de CD30-L (por ejemplo, una secuencia de DNA sintético derivada de cDNA que codifica un polipéptido de CD30-L), unido operativamente a secuencias de nucleótidos reguladoras transcripcional o translacionalmente, tales como las derivadas de genes mamíferos, microbianos, virales o de insectos. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores, operadores o reforzadores transcripcionales, un sitio de unión ribosomal de mRNA y secuencias apropiadas que controlan la iniciación y terminación de la transcripción y traducción. Las secuencias de nucleótidos están unidas operativamente cuando la secuencia reguladora funcionalmente se refiere a la secuencia de DNA de CD30-L. Así, una secuencia de nucleótidos de promotor está unida operativamente a una secuencia de DNA de CD30-L si la secuencia de nucleótidos de promotor controla la transcripción de la secuencia de DNA de CD30-L. La capacidad de replicación en las células huésped deseadas, usualmente conferida por un origen de replicación, y un gen de selección por el que se identifican los transformantes, se pueden incorporar adicionalmente en el vector de expresión.

Además, en los vectores de expresión se pueden incorporar secuencias que codifican péptidos señal apropiados que no son nativos al gen de CD30-L. Por ejemplo, una secuencia de DNA para un péptido señal (líder secretor) se puede fusionar en marco a la secuencia de CD30-L de manera que el CD30-L se traduce primeramente como proteína de fusión que comprende el péptido señal. Un péptido señal fusionado al terminal N de una proteína de CD30-L soluble promueve la secreción extracelular del CD30-L .El péptido señal se escinde del polipéptido de CD30-L después de la secreción de CD30-L de la célula. Los péptidos señal se seleccionan de acuerdo con las células huésped deseadas, y se describen más adelante ejemplos de ellos. Las células huésped adecuadas para expresión de polipéptidos de CD30-L incluyen los procariotes, las células de levadura y las células eucarióticas superiores. Se describen vectores de clonación y expresión adecuados para uso con células huésped de bacterias, hongos, levaduras y mamíferos en, por ejemplo, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, por Pouwels y otros, Elsevier, New York, (1985). Se podrían usar sistemas de traducción exentos de células para producir polipéptidos de CD30-L usando derivados de RNAs de las construcciones de DNA descritas aquí.

Los procariotes incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o Bacilli. Entre las células huésped procarióticas adecuadas para transformación están incluidas, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella ryphimurium y varias otras especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. En una célula huésped eucariótica, tal como E. coli, un polipéptido de CD30-L puede incluir un resto N teminal de metionina para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula huésped procariótica. El Met N-terminal se puede escindir del polipéptido de CD30-L recombinante expresado.

Por lo general, los vectores de expresión para uso en células huésped procarióticas comprenden una o más genes marcadores fenotípicos seleccionables. Un gen marcador fenotípico seleccionable es, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que confiere resistencia antibiótica o que suministra un requerimiento autotrópico. Los ejemplos de vectores de expresión útiles para células huésped procarióticas incluyen los derivados de plásmidos disponibles comercialmente, tales como el vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). El pBR322 contiene genes para resistencia a la ampicilina y la tetraciclina y proporciona así un medio simple para identificar células transformadas. En el vector pBR322 se inserta un promotor apropiado y una secuencia de DNA de CD30-L. Otros vectores disponibles comercialmente son, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec. Madison, WI, USA).

Las secuencias de promotores comúnmente usadas para vectores de expresión de células huésped procarióticas recombinantes incluyen \beta-lactamasa (penicilinasa), sistema promotor de lactosa (Chang y otros, Nature 275:615, 1978; y Goeddel y otros, Nature 281:544, 1979), sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel y otros, Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980, y solicitud EP-A-36776) y el promotor de tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pág.412, 1982). Un sistema de expresión de células huésped procarióticas particularmente útil emplea un promotor \lambdaP_{L} de fago y una secuencia de represor termolábil de c1857ts. Los vectores de plásmidos disponibles de la American Type Culture Collection que incorporan derivados del promotor \lambdaP_{L} incluyen el plásmido pHUB2 (que reside en la cepa JMB9 de E. coli (ATCC 37092)) y pPLc28 (residente en RR1 de E. coli (ATCC 53082)).

Alternativamente, el CD30-L se puede expresar en células huésped de levaduras, preferiblemente del género Sacccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae). También pueden emplearse otros géneros de levaduras, tales como Pichia o Kluyveromyces. Frecuentemente, los vectores de levaduras contendrán un origen de secuencia de replicación de un plásmido de levadura de 2\mu, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias para poliadenilación, secuencias para terminación de transcripción y genes de marcador seleccionables. Las secuencias de promotores adecuadas para vectores de levaduras incluyen, entre otras, promotores para metalotioneína, 3-fosfogliceratoquinasa, (Hitzeman y otros, J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess y otros, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; y Holland y otros, Biochem. 17:4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato de carboxilasa, fosofofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvatoquinasa, triosefosfatoisomerasa, fosfoglucosaisomerasa y glucoquinasa. Describe otros vectores y promotores adecuados para uso en expresión de levaduras Hitzman, solicitud EP-A-75.657. Otra alternativa es el promotor ADH2 represible de glucosa descrito por Russel y otros, (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) y Beier y otros (Nature, 300:724, 1982). Los vectores lanzadera replicables en levaduras y E. coli se pueden construir insertando secuencias de DNA de pBR322 para selección y replicación en E. coli (gen Amp^{r} y origen de replicación) en los vectores de lavaduras descritos antes.

La secuencia líder del factor \alpha de levaduras se puede emplear para dirigir la secreción del polipéptido de CD30-L. Frecuentemente, la secuencia del factor \alpha se inserta entre la secuencia de promotor y la secuencia del gen estructural. Véase, por ejemplo, Kurjan y otros, Cell 30:933, 1982; Bitter y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984; patentes U.S. nº. 4.546.082 y EP 324.274. Los expertos en la técnica conocen otras secuencias líder adecuadas para facilitar la secreción de polipéptidos recombinantes de huéspedes de levaduras. Una secuencia líder se puede modificar cerca de su extremo 3' para contener uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia líder al gen estructural.

Los expertos en la técnica conocen protocolos de transformación de levaduras. Uno de tales protocolos es el descrito por Hinnen y otros, Proc. Natl. Acad. Sci USA 75:1929, 1978. El protocolo de Hinnen y otros selecciona los transformantes Trp^{+} en un medio selectivo, medio selectivo constituido por 0,67% de base nitrogenada de levadura, 0,25% de casaminoácidos, 2% de glucosa, 10 \mug/ml de adenina y 20 \mug/ml de uracilo.

Las células huésped de levadura transformadas por vectores que contienen la secuencia de promotor de ADH2 se pueden hacer crecer para inducir expresión en un medio "rico". Un ejemplo de un medio rico es un medio que consta de 1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 1% de glucosa suplementado con 80 \mug/ml de adenina y 80 \mug/ml de uracilo. La redepresión del promotor de ADH2 se produce cuando se agota la glucosa del medio.

También podrían emplearse sistemas de cultivos de células huésped de mamíferos o insectos para expresar polipéptidos recombinantes de CD30-L. Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988) han hecho una revisión de sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos. También se pueden emplear líneas establecidas de células de origen mamífero. Los ejemplos de líneas adecuadas de células huésped de mamíferos incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman y otros, Cell 23:175, 1981), líneas de células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163) células de ovario de hamster chino (CHO), células HeLa y células BHK (ATCC CRL 10), y la línea de células CV1/EBNA derivada de la línea CV1 de células de riñón de mono verde africano (ATCC CCL 70), descrita por MacMahan y otros (EMBO j. 10:2821, 1991).

Las secuencias de control transcripcional y translacional para vectores de expresión de células huésped de mamíferos se pueden extraer de genomas virales. Las secuencias de promotor y las secuencias de intensificación comúnmente usadas derivan de virus polyoma, adenovirus 2, virus 40 de simio (SV40) y citomegalovirus humano. Se pueden usar secuencias de DNA derivadas del genoma viral de SV40, por ejemplo, origen de SV40, promotor temprano y tardío, de intensificación, sitios de reparación y poliadenilación, para obtener otros elementos genéticos para expresión de una secuencia estructural de genes en una célula huésped de mamífero. Son particularmente útiles promotores virales tempranos y tardíos porque ambos se obtienen fácilmente a partir de un genoma viral como un fragmento que también puede contener un origen viral de replicación (Fiers y otros, Nature, 273:113, 1978). También se pueden usar fragmentos de SV40 menores o mayores, con tal de que esté incluida la secuencia de aproximadamente 250 bp que se extiende desde el sitio Hind III hacia el sitio Bgl 1 localizado en el origen viral de SV40 del sitio de replicación.

Se pueden construir como discuten Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983) vectores de expresión ejemplares para uso en células huésped de mamíferos. Un sistema útil para expresión estable a alto nivel de cDNAs de mamífero en células epiteliales mamarias de murino C127 se puede construir sustancialmente como describen Cosman y otros (Mol. Immunol. 23:935, 1986). Se ha depositado como ATCC 39890 un vector útil de alta expresión, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman y otros, Nature 312:768, 1984. Se describen otros vectores de expresión mamíferos en la solicitud de patente EP-A-0367556 y en la solicitud de patente U.S. nº. serial 07/701.415, presentada el 16 de mayo de 1991, que se incorporan aquí por referencia. Los vectores se pueden derivar de retrovirus. Para conseguir secreción de CD30 (una proteína de tipo II que carece de una secuencia señal nativa) se puede añadir una secuencia señal heteróloga. Son ejemplos de péptidos señal en sistemas de expresión de mamíferos la secuencia señal para interleuquina-7 (IL-7) descrita en la patente U.S. nº. 4.965.195; la secuencia señal para el receptor de interleuquina-2 descrita por Cosman y otros, Nature 312:768 (1984); el péptido señal de interleuquina-4 descrito en la patente EP 367.566; el péptido señal del receptor de interleuquina-1 de tipo I descrito en la patente U.S. nº. 4.968.607, y el péptido señal del receptor de interleuquina-1 de tipo II descrito en la patente EP 460.846. Cada una de estas referencias que describen péptidos señal se incorpora aquí por referencia.

La presente invención proporciona proteína de CD30-L sustancialmente homogénea que se puede producir por sistemas de expresión recombinantes como se ha descrito antes o purificar a partir de células naturales. El CD30-L se purifica a homogeneidad sustancial, indicada por una banda de proteína individual en el análisis por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE).

En una realización de la presente invención, se purifica CD30-L de fuente celular usando una técnica adecuada de purificación de proteínas. Por ejemplo, las células pueden ser linfocitos T activados de una especie mamífera de interés, tal como la línea de células de murino TB9, descrita en los Ejemplos 2 y 3, o células T de sangre humana periférica inducidas.

Un procedimiento alternativo para producir la proteína de CD30-L comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de DNA que codifica CD30-L en condiciones tales que se expresa CD30-L. La proteína de CD30-L se recupera luego del medio de cultivo de extractos de células dependiendo del sistema de expresión empleado. Como sabrá el técnico experto, los procedimientos para purificar el CD30-L recombinante variarán de acuerdo con factores tales como el tipo de células huésped empleadas y de si se excreta o no CD30-L en el medio de cultivo.

Por ejemplo, cuando se emplean sistemas de expresión que secretan la proteína recombinante, se puede concentrar primeramente el medio de cultivo usando un filtro para concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amico o Millipore Pellicon. Seguidamente a la etapa de concentración, se puede aplicar el concentrado a una matriz de purificación tal como un medio de filtración de gel. Alternativamente, se puede emplear una resina de intercambio aniónica, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos pendientes dietilaminoetilo (DEAE). Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos utilizados corrientemente para la purificación de proteínas. Alternativamente, se puede emplear una etapa de intercambio catiónico. Entre las resinas de intercambio catiónico adecuadas están incluidas varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo. Finalmente, para purificar más el CD30-L, se pueden emplear una o más etapas de cromatografía de líquidos de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) empleando medios hidrófobos de RP-HPLC (por ejemplo, sílice que tiene grupos pendientes metilo u otros alifáticos). Se pueden emplear algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en varias combinaciones, para obtener una proteína recombinante sustancialmente homogénea.

También es posible utilizar una columna de afinidad que comprende el dominio de unión del ligando de CD30 para purificar por afinidad polipéptidos de CD30-L expresados. Se pueden eliminar los polipéptidos de CD30-L de la columna de afinidad en un tampón de elución altamente salino y luego dializar para el uso en un tampón bajo en sales. Alternativamente, la columna de afinidad puede comprender un anticuerpo que fija el CD30-L. El Ejemplo 5 describe un procedimiento para emplear la proteína de CD30-L de la presente invención para generar anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD30-L.

Usualmente, la proteína recombinante producida en un cultivo bacteriano se aisla por rotura inicial de las células huésped, centrifugación, extracción de los pélets de células si se trata de un polipéptido insoluble, o de un fluido sobrenadante si se trata de un polipéptido soluble, a lo que sigue una o más etapas de concentración, desalación, intercambio iónico, purificación por afinidad o cromatografía de exclusión de tamaños. Finalmente, se puede emplear RP-HPLC para las etapas de purificación final. Las células microbianas se pueden desintegrar por cualquier método conveniente, como mediante ciclos de congelación-descongelación, sonicación, desintegración mecánica o usando agentes de lisado de células.

Para expresar CD30-L como polipéptido secretado, preferiblemente se emplean células huésped de levadura transformadas. Esto simplifica la purificación. El polipéptido recombinante secretado de la fermentación de células huésped de levadura se puede purificar por métodos análogos a los descritos por Urdal y otros (J. Chromatog. 296:171, 1984). Urdal y otros describen dos etapas secuenciales de HPLC en fase inversa para la purificación de IL-2 humano recombinante en una columna preparativa de HPLC.

La presente invención proporciona además oligonucleótidos antisentido o de sentido que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos de cadena simple (RNA o DNA) capaz de unirse a las secuencias de mRNA de CD30-L (sentido) o DNA de CD30-L (antisentido). Los nucleótidos antisentido o sentido de acuerdo con la presente invención comprenden un fragmento de la región de codificación de cDNA de CD30-L. Un fragmento así comprende, por lo general, al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos. Se describe la capacidad para crear un oligonucleótido antiosentido o de sentido, basado en una secuencia de cDNA para una proteína dada, en, por ejemplo, Cancer Res. 48:2659, 1988, por Stein y Cohen, y en BioTechniques 6:958, 1988, por Krol y otros.

La fijación de oligonucleótidos antisentido o de sentido a secuencias de aminoácidos da por resultado la formación de dúplex que bloquean la traducción (RNA) o la transcripción (DNA) por uno o varios medios, incluida la degradación intensificada de los dúplex, la terminación prematura de la transcripción o traducción, o por otros medios. Los oligonucleótidos antisentido se pueden usar así para bloquear la expresión de proteínas de CD30-L.

Los oligonucleótidos antisentido o de sentido comprenden además oligonucleótidos que tienen espinazos de azúcar-fosfodiéster (u otras uniones de azúcares tales como las descritas en el documento WO 91/06629) y en los que tales uniones de azúcares son resistentes a las nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con uniones resistentes de azúcares son estables in vivo (esto es, capaces de resistir la degradación enzimática) pero retienen la especifidad de secuencia para ser capaces de unirse a las secuencias diana de nucleótidos. Entre otros ejemplos de oligonucleótidos de sentido o antisentido están incluidos los nucleótidos que están unidos por covalencia a restos orgánicos, como los descritos en el documento WO 90/10448, y otros restos que aumentan la afinidad del oligonucleótido para una secuencia de ácido nucleico diana, tal como poli-(L-lisina). Además, a los oligonucleótidos de sentido o antisentido se pueden añadir agentes de intercalación tales como elipticina, y agentes de alquilación o complejos metálicos para modificar las especifidades de unión del oligonucleótido antisentido o de sentido para la secuencia de nucleótido diana. Los oligonucleótidos antisentido o de sentido se pueden introducir en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico diana por cualquier método de transferencia de genes, incluidas, por ejemplo, transfección de DNA mediada por CaPO_{4}, transfección, electroporación u otros vectores de transferencia de genes tales como virus de Epstein-Barr. Preferiblemente, los oligonucleótidos antisentido o de sentido se introducen en una célula que contiene la secuencia diana de nucleótido por inserción del nucleótido antisentido o de sentido en un vector retroviral adecuado, poniendo luego en contacto la células con el vector de retrovirus que contiene la secuencia insertada, in vivo o ex vivo. Entre los vectores retrovirales adecuados están incluidos, aunque no únicamente, los derivados del retrovirus de murino M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV) o los vectores de copia doble designados DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase solicitud de PCT US 90/02656).

Los oligonucleótidos de sentido o antisentido se pueden introducir también en una célula que contiene la secuencia de nucleótido diana por formación de un conjugado con una molécula ligando de unión, como se describe en el documento WO 91/04753. Entre las moléculas ligando de unión adecuadas están incluidos, aunque no únicamente, receptores de superficie de células, factores de crecimiento, otras citoquinas u otros ligandos que se unen a receptores de superficie de células. Preferiblemente, la conjugación de la molécula ligando de unión no interfiere sustancialmente con la capacidad de la molécula de unión de ligando para unirse a su correspondiente molécula o receptor, o para bloquear la entrada a la célula del oligonucleótido de sentido o antisentido o su versión conjugada.

Alternativamente, se puede introducir un oligonuceótido de sentido o antisentido en una célula que contiene la secuencia de nucleótido diana por formación de un complejo de oligonucleótido-lípido según se describe en el documento WO 90/10448. Preferiblemente, el complejo de oligonucleótido de sentido o antisentido-lípido se disocia dentro de la célula por una lipasa endógena.

Los ejemplos siguientes se presentan para ilustrar realizaciones particulares y no para limitar el ámbito de la invención.

Ejemplo 1 Preparación de una proteína de fusión soluble de CD30/Fc

Este ejemplo describe la construcción de un vector que codifica CD30/Fc para expresar una proteína de fusión CD30/Fc soluble para uso en la detección de clones de cDNA que codifican un ligando de CD30. Se obtuvo un fragmento de cDNA que codifica la región extracelular (dominio de unión de ligando) de un receptor CD30 humano usando técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR) y que está basado en la secuencia publicada por Durkop y otros (Cell 68:421, 1992), que se presenta en la Figura 1.

El cDNA de CD30 usado como molde en la reacción de PCR se preparó como sigue. Se aisló RNA total de una línea de células T humanas transformada viralmente, designada HUT 102E. Esta línea de células se derivó transformando células T con virus 1 linfotrópico de células T humanas (HTLV-1) como lo describen Poiesz y otros (PNAS USA 77:7415-19, 1980). Primeramente se preparó cDNA de cadena simple usando un kit de síntesis de cDNA SuperScript^{MC} adquirible de GIBCO/BRL (Gaithersburg, Maryland). El cDNA de cadena simple resultante se usó como molde en una reacción de PCR.

El cebador 5' empleado en la reacción PCR era un oligonucleótido de cadena simple (39-mer) de la secuencia

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5'-ATA\underline{GCGGCCGC}CACC\underline{\underbar{ATGCGCGTCCTCCTCGCCGCGCTG}} 3'

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Este cebador comprende un sitio de reconocimiento para la endonucleasa de restricción NotI (subrayado) corriente arriba de una secuencia (subrayado doble) que codifica los ocho primeros aminoácidos (N terminal) de la secuencia de CD30 presentada en la Figura 1, desde metionina (codificada por el codón de iniciación de traducción ATG) a leucina en la posición ocho.

El cebador 3' empleado en la PCR era un oligonucleótido de cadena simple (39 mer) de la secuencia

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3' \underline{\underbar{CAGCGAGAGAGGAGGTGCCCCTTC}}CTCGGG\underline{TCTAGA}ACA 5'

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Este cebador comprende una secuencia (subrayado doble) que es complementaria de la secuencia que codifica los ocho últimos aminoácidos del dominio extracelular deCD30, esto es, los aminoácidos 372 (Val) a 379 (Lys) de la Figura 1. La secuencia CTCGGG que sigue a la secuencia de CD30 es complementaria de los codones para Glu y Pro. Glu y Pro son los dos primeros aminoácidos de un fragmento Fc de anticuerpo que está fusionado al término C del fragmento de CD30 que se describe después. El cebador también sitúa un sitio de reconocimiento para la endonucleasa de restricción Bgl II (subrayada) corriente abajo para uso en la fijación de una secuencia de DNA que codifica el resto del gen que codifica Fc.

La reacción PCR se puede realizar usando cualquier procedimiento adecuado, tal como los descritos por Sarki y otros, Science, 239:487 (1988); por Wu y otros, eds., en Recombinant DNA Methodology, Academic Press Inc., San Diego (1989), págs. 189-196, y por Innis y otros, eds., en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. (1990). Un ejemplo de procedimiento de PCR adecuado es el siguiente: Todas las temperaturas son en grados centígrados. Se añaden los siguientes reactivos a un tubo Eppendorf de 0,5 ml de microcentrifugadora: 10 \mul de tampón 10X de PCR (KCl 500 mM, Tris-HCl 100 mM, pH 8,3 a 25ºC, MgCl_{2} 25 mM y 1 mg/ml de gelatina) (Perkins-Elmer Cetus, Norwalk, CN), 8 \mul de una solución 2,5 mM que contenía dNTP (dATP 2 mM, dCTP 2 mM, dGTP 2 mM y dTTP 2 mM), 2,5 unidades (0,5 \mul de solución estándar de 5000 unidades/ml) de Taq DNA polimerasa (Perkins-Elmer Cetus), 1 ng de DNA molde, 100 picomoles de cada uno de los cebadores de polioligonucleótido, y agua hasta un volumen total de 100 \mul. La mezcla final es recubre luego con 100 \mul de aceite de parafina. La PCR se realiza usando un dispositivo de ciclos térmicos para DNA (Ericomp, San Diego, CA).

En un procedimiento preferente, el molde se desnaturalizó a 94ºC durante 5 min, sometiéndose seguidamente a ciclos de 94ºC durante 1 min (desnaturalización), a 48ºC durante 1 min (anillamiento) y a 72ºC durante 1 min (extensión); a ello siguieron 30 ciclos a 94ºC durante 1 min, 68ºC durante 1 min y 72ºC durante 1 min, efectuándose después del último ciclo una extensión final a 72ºC durante 5 min. Usando las mismas condiciones, una parte alícuota de los productos de esta reacción PCR se reamplificó en una segunda reacción PCR.

El deseado fragmento de DNA amplificado por esta PCR comprendía un sitio NotI corriente arriba de una secuencia que codifica el dominio extracelular entero de CD30, seguido de un sitio Bgl II. Los productos de la reacción PCR se sometieron a digestión cono Not I y Bgl II y el fragmento deseado se purificó por electoforesis en gel.

Se preparó como sigue una secuencia de DNA que codifica un fragmento Fc de anticuerpo a fusionar al fragmento de DNA que codifica CD30. DNA que codifica un polipéptido de cadena simple derivado de la región Fc de un anticuerpo de IgG1 humano se ha clonado en el sitio SpeI del vector pBLUESCRIPT SK®, asequible de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, California. El vector de plásmido es replicable en E. coli y contiene un segmento policonector que incluye 21 sitios de restricción singulares. En la Figura 2 se presentan el DNA y las secuencias de aminoácidos codificadas de la región de codificación de cDNA de Fc clonado. Se ha introducido un sitio BglII singular cerca del extremo 5' de la secuencia que codifica Fc insertada, representada en la Figura 2.

El polipéptido de Fc codificado por DNA se extiende desde la región de articulación N terminal al terminal C nativo, esto es, esencialmente es una región Fc de anticuerpo de longitud total. También se pueden emplear fragmentos de regiones de Fc, por ejemplo, las que están truncadas en el extremo C terminal. Preferiblemente, los fragmentos contienen múltiples restos de cisteína (al menos los restos de cisteína de la reacción de articulación) para permitir que se formen enlaces entre cadenas disulfuro entre las porciones de polipéptido de Fc de dos proteínas de fusión separadas de CD30/Fc, formándose dímeros como se ha discutido antes.

El vector recombinante que contiene la secuencia de Fc se digiere con BglII (que escinde sólo en el sitio representado en la Figura 2) y NotI (que escinde el vector en el sitio de clonación múltiple corriente abajo del inserto de DNA de Fc. El fragmento que codifica Fc (de una longitud de aproximadamente 720 bp) se aisló por procedimientos convencionales usando electroforesis en gel de agarosa LMT.

El fragmento NotI/BglII de DNA que codifica CD30 y el fragmento BglII/NotI de DNA que codifica Fc preparados antes se ligaron en un vector de expresión designado pDC406 como sigue. El plásmido pDC406, que ha sido descrito por McMahan y otros (EMBO J. 10:2821, 1991), es un vector de expresión para uso en células mamíferas, pero también es replicable en células de E. coli.

El pDC406 contiene orígenes de replicación derivados del virus de Epstein-Barr SV40 y pBR322 y es un derivado de HAV-EO descrito por Dower y otros, J. Immunol. 142:4314 (1989). El pCD406 se diferencia de HAV-EO por la supresión del intrón presente en la secuencia líder tripartita de adenovirus en HAV-EO. Se digirió pDC406 con NotI, que escinde el plásmido en un sitio de clonación múltiple justo 3' del sitio SalI, luego se trata con fosfatasa alcalina de intestino bovino (CIAP) para evitar la autoligación.

En condiciones convencionales, se realizó una ligación de tres vías para unir el vector, Fc, y fragmentos de DNA de CD30 y se transformaron con la mezcla de ligación células de E. coli. Se recuperó de las células de E. coli un plásmido del tamaño deseado y se encontró que comprendía el injerto del gen de fusión de CD30/Fc, pero en la orientación incorrecta para expresión. El gen de fusión de CD30/Fc se separó de este plásmido recombinante por digestión con NotI y se ligó a pDC406 digerido con NotI y tratado con CIAP. Se transformaron con la mezcla de ligación células de E. coli. Se aisló un plásmido recombinante que contenía el inserto en la dirección deseada. La secuencia de DC30 se fusionó (en el mismo marco de lectura) a la secuencia de Fc corriente abajo.

Preferiblemente, las moléculas de fusión de CD30/Fc se sintetizan en cultivo de células mamíferas recombinantes porque generalmente son demasiado grandes y complejas para ser sintetizadas por métodos procarióticos de expresión. Entre los ejemplos de células mamíferas adecuadas para expresar una proteína de fusión de receptor/Fc están incluidas células CV-1, (ATCC CCL 70) y células COS-7 (ATCC CRL 1651), ambas derivadas de riñón de mono.

La construcción de DNA pDC406/CD30/Fc se transfectó en la línea de células de riñón de mono CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478). En células huésped de mamíferos, tales como CV1/EBNA, la proteína de fusión de CD30/Fc se expresa fuera del promotor de la región transactivadora de HIV (TAR). La línea de células CV-1/EBNA se derivó por transfección de la línea de células CV-1 (ATCC CCL 70) con un gen que codifica el antígeno-1 nuclear del virus de Epstein-Barr (EBNA-1) que expresa constitutivamente EBNA-1 expulsado del promotor/intensificador intermedio temprano de CMV humano, como lo describen McMahan y otros, cita anterior. El gen de EBNA-1 permite la replicación episomal de vectores de expresión tales como pDC406, que contienen el origen EBV de replicación.

Se cultivaron en botellas rodillo células CVI-EBNA transfectadas con el vector pDC406/CD30/Fc para posibilitar la expresión transitoria de la proteína de fusión que se secreta en el medio mediante el péptido señal de CD30. La proteína de fusión de CD30/Fc se purificó por cromatografía de afinidad. En resumen, un litro del material sobrenadante del cultivo que contenía la proteína de fusión de CD\cdot30/Fc se purificó por filtración del material sobrenadante (por ejemplo, en un filtro de 0,45 \mu) y aplicando el filtrado a una columna de afinidad de proteína G (Schleicher and Schuell, Keene, NH) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La porción Fc de la proteína de fusión se fija sobre la columna por la proteína G. La proteína de fusión fijada se eluye de la columna y se confirma la pureza en un gel de SDS teñido con plata.

Ejemplo 2 Exploración de líneas de células para la unión de CD30

Este ejemplo describe la exploración de ciertas líneas de células en cuanto a su capacidad para unir una proteína de fusión de CD30/Fc. Las líneas de células que se encontró que eran capaces de unir CD30/Fc se consideraron como candidatas para uso como fuentes de ácido nucleico en la tentativa de clonar CD30-L.

Biotinilación de proteínas de fusión de CD30/Fc

La proteína de fusión de CD30/Fc preparada en el Ejemplo 1 se marcó con biotina para usarla en la exploración de líneas de células. La CD30/Fc o IL-4R/Fc humana de control se biotinilaron como sigue: 50 \mug de proteína (200-500 \mug/ml en NaHCO_{3} 0,1M, pH 8,3) se incubaron con 2 \mug (1 mg/ml en DMSO) de biotin-X-N-hidroxisuccinimda (NHS, Calbiochem., La Jolla, CA) durante 30 min a temperatura ambiente. Al finalizar el período de incubación, la mezcla de reacción se microconfinó a través de una columna de desalación Sephadex G-25 de 1 ml (Pharmacia) y el eluído se ajustó a 100 \mug/ml en PBS más 0,02% de NaN_{3}. Las concentraciones de proteína de CD30/Fc y hIL-4R/Fc biotiniladas se determinaron por el ensayo de micro-BCA (Pierce, Rockford, IL) con albúmina ultrapura de suero bovino como patrón.

Tinción de flujo citométrico con proteínas de fusión de Fc biotiniladas

Líneas de células tales como las identificadas antes se exploran en cuanto la fijación de CD30/Fc biotinilada por el procedimiento siguiente. La tinción de 1x10^{6} células se realizó en placas de microtitulación de fondo redondo de 96 pocillos en un volumen de 20 \mul. Las células se preincubaron durante 30 min a 4ºC con 50 \mul de solución de bloqueo constituida por 100 \mug/ml de IgG1 humano + 2% de suero de cabrío en PBS+azida para impedir la unión no específica de proteínas de fusión marcadas a receptores de Fc. Se añadieron luego a los pocillos 150 \mul de PBS+azida y las células se peletizaron por centrifugación durante 4 min a 1200 rpm. Los pélets se pusieron en suspensión en 20 \mul de 5 \mul/ml de CD30/Fc biotinilada o hIL-4R/Fc biotinilada (como control de especifidad) diluida en solución de bloqueo. Después de 30-45 min de incubación a 4ºC, las células se lavaron X2 en PBS+azida y se pusieron en suspensión en 20 \mul de estreptavidin-ficoeritrina (Becton Dickinson) diluída 1:5 en PBS+azida. Después de 30 min más, las células se lavaron X2 y quedan preparadas para análisis. Si es necesario, las células teñidas es pueden fijar en formaldehído al 1%, suero fetal bovino al 1% en PBS+azida y se almacenan a 4ºC en la oscuridad para posterior análisis.

La estreptavidina se une a la molécula de biotina que estaba unida a la proteína de CD30/Fc. La ficoeritrina es una ficobiliproteína fluorescente que actúa como marcador detectable. Para cada tipo de célula se midió luego el nivel de señal fluorescente usando un citómetro de flujo FACScan® (Becton Dickinson).

Líneas de células a explorar en cuanto a la unión de CD30/Fc

Se derivaron líneas de células T cooperadoras específicas para células de hematíes de oveja (SRBC), designadas 7C2(TH1), 7B9(TH0) y SBE11 (TH2), limitando la dilución de cultivos primarios inducidos con antígeno de células C57BL/6 de bazo de murino. Se determinaron los fenotipos TH de estos clones por su capacidad para secretar IL-2 y/o IL-4 en respuesta a la estimulación con el mitógeno concanavalina A (ConA).

Se estimularon células T de sangre humana periférica durante 16 h con 10 \mug/ml de un anticuerpo monoclonal anti CD3 inmovilizado sobre plástico, antes de ensayar la unión de CD30/Fc. El Mab anti CD3 estimula las células T mediante el complejo receptor de células T de CD3 (TCR).

Unión de CD\cdot30/Fc biotinilada

Las líneas de células T de murino 7C2, 7B9 y SBE11 presentaban una unión significativa de CD30/Fc biotinilada sobre la vista con IL-4R/Fc de control después de estimulación durante 18 horas con 3 \mug/ml de Con A. También se ensayaron las células 7C2 después de estimulación durante 6 horas con Con A y se vió una unión específica de cD30/Fc biotinilada. Las células T humanas anti CD3 Mab activadas presentaban una unión significativa de CD30/Fc biotinilada. En ausencia de estimulación, en ninguna de estas líneas de células se vió unión de CD30/Fc biotinilada.

Como fuente de ácido nucleico para aislar una secuencia de DNA que codifica CD30-L se puede usar cualquiera de estas líneas de células que demostraron unión de CD30/Fc. Se puede preparar una biblioteca de cDNA a partir de cualquiera de las tres líneas de células T de murino estimuladas con Con A o las células T de sangre periférica humana y se pueden explorar para identificar cDNA de CD30-L usando la estrategia de clonación de expresión directa que se describe luego, por ejemplo. Se pueden explorar otros tipos de células T activadas en cuanto a la unión de CD30 para identificar fuentes adicionales de ácido nucleico. Las células se pueden derivar de fuentes humanas, de murino u otras fuentes de mamíferos, incluidas, aunque no únicamente, de ratas, de bovino, porcino o células de varios primates. Además, las células T se pueden estimular con mitógenos que no son ConA a activar de otra forma por técnicas convencionales. Ha de tenerse en cuenta que se empleó con éxito CD30/Fc humana para explorar líneas de células humanas y de murino en el ensayo anterior (esto es, CD30/Fc se une a un ligando tanto en las células humanas como las de murino ensayadas).

Ejemplo 3 Preparación de una biblioteca de cDNA a partir de células T cooperadoras de murino activadas

Este ejemplo describe la preparación de una biblioteca de cDNA para clonación de expresión de CD30-L de murino. La biblioteca se preparó a partir de la línea de células T cooperadoras de murino designada 7B9 (descrita antes y por Mosley y otros, Cell 59:335, 1989), que se estimuló durante 6 horas con 3 \mug/ml de Con A. La técnica de construcción de la biblioteca era sustancialmente similar a la descrita por Ausubel y otros, eds., Current Protocols In Molecular Biology, vol. 1, (1987). En resumen, se extrajo RNA total de la línea de células 7B9 y se aisló poli (A)^{+} mRNA por cromatografía con oligo dT celulosa. Se preparó cDNA de doble cadena sustancialmente como lo describen Gubler y otros, Gene 25:263, 1983. Los fragmentos de poli(A)^{+} mRNA se convirtieron en híbridos de RNA-cDNA por transcriptasa inversa usando como cebadores hexanucleótidos al azar. Los híbridos de RNA-cDNA se convirtieron luego en fragmentos de cDNA de doble cadena usando RNAasa H en combinación con DNA polimerasa I. El cDNA de doble cadena resultante se embotó en los extremos con T4 DNA polimerasa.

Adaptadores de BglII desquinasados (esto es, desfosforilados):

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5'- GATCTGGCAACGAAGGTACCATGG –3'

ACCGTTGCTTCCATGGTACC –5'

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se ligaron a los extremos 5' del cDNA de extremos romos resultante usando el método de clonación de adaptador descrito por Haymerle y otros, Nucleic Acids Res. 14:8615, 1986. Sólo el oligonucleótido 24-mer (cadena de arriba) se unirá covalentemente al cDNA durante la reacción de ligación. Los adaptadores no unidos covalentemente (incluido el oligonucleótido de 20 mer anterior) se eliminaron por cromatografía de filtración de gel a 68ºC. Este oligonucleótido 24 no autocomplementario sobresale en el cDNA. El cDNA se insertó en pDC202, un vector de expresión mamífero que también replica en E. coli. PDC202 deriva de pDC201 (Sims y otros, Nature 241:585, 1988). El plásmido pDC201 se construyó a partir de (i) el origen SV40 de replicación, intensificador y promotores temprano y tardío; (ii) el promotor tardío principal de adenovirus 2 y líder tripartito; (iii) las señales de poliadenilación de SV40 y terminación de la transcripción; (iv) genes de RNA asociados a virus 2 de adenovirus (VAI y VAII), y (v) pMSLV (Cosman y otros, Nature 312:768, 1984). El sitio de clonación múltiple contiene sitios de reconocimiento de Kpn I, Sma I y Bgl II. Se separaron de pDC201 ciertas secuencias ajenas de vectores que bordean los genes de VA para crear pD202. Cada uno de los rasgos antes mencionados está presente también en pDC202.

Se digirió pDC202 con Bgl II y se ligaron a él adaptadores Bgl I como se ha descrito para el cDNA anterior, excepto que la cadena de abajo del adaptador (el 20-mer) se une covalentemente al vector y no el 24-mer ligado al cDNA. Se añadió así al vector digerido con Bgl II una extensión de cadena simple complementaria a la añadida al cDNA. Se fosforilaron los extremos 5' del vector adaptado y el cDNA y se ligaron luego las dos especies de DNA en presencia de polinucleótido T4 quinasa. Las mezclas de ligación dializadas se electroporaron en la cepa DH5\alpha de E. coli y los transformantes se seleccionaron sobre placas de ampicilina.

Para crear una biblioteca de clonación por expresión, los vectores recombinantes que contenían cDNA derivado de 7B9 se transfirieron de E. coli a células huésped de mamíferos. Se aisló DNA de plásmido de combinaciones de E. coli transformadas y se transfectaron en una capa subconfluente de células COS-7 usando técnicas estándar. Las células transfectadas se cultivaron durante dos a tres días sobre placas de vidrio con cámara (Lab-Tek) para posibilitar la expresión transitoria de las secuencias de DNA insertadas.

Ejemplo 4 Aislamiento de cDNA de CD30-L de murino

Este ejemplo describe la exploración de la biblioteca de clonación por expresión hecha en el Ejemplo 3 con una proteína de fusión de CD30/Fc marcada. La proteína de fusión de CD30/Fc preparada en el Ejemplo 1 se radioyodó con ^{125}I usando un agente de fase sólida disponible comercialmente (IODO-GEN, Pierce). En este procedimiento, se cultivaron 5 \mug de IODO-GEN en el fondo de un tubo de vidrio de 10 x 75 mm y se incubaron durante 20 min a 4ºC con 75 \mul de fosfato sódico 0,1 M, pH 7,4, y 20 \mul (2mCi) de Na^{125}I. La solución se pasó luego a un segundo tubo de vidrio que contenía 5 \mug de CD30/Fc en 45 \mul de PBS y esta mezcla de reacción se incubó durante 20 min a 4ºC. La mezcla de reacción se fraccionó por filtración en gel sobre un volumen de 2 ml de lecho de Sephadex® G-25 (Sigma) y luego se equilibró en medio RPMI 1640 que contenía 2,5% (v/v) de albúmina de suero bovino (BSA), 0,2% (v/v) de azida sódica y Hepes 20 mM, pH 7,4 como medio de unión. La combinación final de ^{125}I CD30/Fc se diluyó a una solución de acopio de 1x10^{-7} M en medio de unión, que se almacenó durante hasta un mes a 4ºC sin pérdida detectable de la actividad de fijación del receptor.

Se ensayaron monocapas de células COS-7 transfectadas hechas en el Ejemplo 3 por autorradiografía de placas finas en cuanto a la expresión de CD30-L usando la proteína de fusión de CD30/Fc. La técnica autorradiográfica en placa delgada esencialmente fue la descrita por Gearing y otros, EMBO J., 8:3667, 1989. En resumen, células COS-7 transfectadas se lavaron una vez con medio de unión (RPMI 1640 que contenía 25 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA), 2 mg/ml de azida sódica, Hepes 20 mM de pH 7,2 y 50 mg/ml de leche seca no grasa) y se incubaron a 4ºC durante 2 horas en un medio de unión que contenía proteína de fusión CD30/Fc 1x10^{-9} M marcada con ^{135}I. Después de la incubación, las células en placas finas con cámara se lavaron tres veces con tampón de unión y seguidamente dos veces con PBS (pH 3) para eliminar proteína de fusión no unida.

Las células se fijaron por incubación a gluteraldehído al 10% en PBS (30 min a temperatura ambiente), se lavaron dos veces en PBS y se secaron al aire. Las placas finas se sumergieron en emulsión fotográfica GTNB-2 de Kodak (dilución 5x en agua) y se expusieron en la oscuridad durante cuatro días a temperatura ambiente en una caja impermeable a la luz. Las placas finas se revelaron con revelador D19 de Kodak, se enjuagaron en agua y se fijaron con el fijador G433C de Agfa. Las placas finas se examinaron individualmente con un microscopio de 25-40 aumentos. Las placas positivas que presentaban células que expresaban CD30-L se identificaron por la presencia de granos de plata autorradiográficos frente a un fondo de luz.

Se identificaron como positivos para unir la proteína de fusión CD30/Fc ocho combinaciones, de las que cada una contenía aproximadamente 2000 clones individuales. Se titularon las combinaciones y se cultivaron para obtener placas que contenían aproximadamente 200 colonias cada una. Se hizo una réplica de cada combinación de rotura y se rascaron las células para obtener un DNA de plásmido combinado para transfección en células COS-7. Las combinaciones menores se exploraron por autorradiogafía de capa fina como se ha descrito previamente. Varias de las combinaciones de rotura contenían clones que eran positivos para CD30-L como lo indicaba la presencia de un producto de gen expresado capaz de unirse a la proteína de fusión CD30/Fc.

Se tomaron de dos de las combinaciones desintegradas colonias individuales y se inocularon en medio de cultivo en pocillos individuales de placas de 96 pocillos. Se mezclaron cultivos por filas y columnas de combinación y los cultivos mezclados se usaron para preparar DNA para una tanda final de transfección y exploración. Una intersección de una fila positiva y una columna positiva identificaron la colonia positiva. Se aisló, retransfectó y reexploró DNA del clon puro.

Se recuperó el plásmido recombinante que contenía cDNA de CD30-L de murino del clon puro (células huésped COS-7) y se transformó en la cepa DH5\alpha de E. coli. El vector de expresión mamífero pDC202 que contenía cDNA de CD30-L de murino (designado pDC202-mCD30-L) se depositó en las células huésped de la cepa DH5\alpha de E. coli en la American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC) el 28 de mayo de 1992, con el número de acceso ATCC 69004. El depósito se hizo en los términos del Tratado de Budapest.

En la Figura 3 se presenta una secuencia de DNA para la región de codificación del inserto de cDNA del clon pDC202-mCD30-L, junto con la secuencia de aminoácidos no codificada. La proteína comprende un dominio citoploasmático N-terminal (aminoácidos 1-27), una región de transmembrana (aminoácidos 28-48) y un dominio extracelular, esto es, un dominio de unión de receptor (aminoácidos 49-220). Esta proteína carece de un péptido señal.

En los aminoácidos 56-58, 67-69, 95-97, 139-141, 175-177 y 187-189 de la Figura 3 se encuentran seis tripletes de aminoácidos que constituyen sitios de glicosilación unidos con N. La proteína no comprende sitios de tratamiento de KEX2 proteasa.

En esta construcción de vector particular, un codón de ATG situado en los adaptadores Bgl II (véase el Ejemplo 3) está en la misma región de enlace que el inserto de cDNA de CD30-L. Así, un porcentaje de los transcriptos puede comprender la siguiente secuencia de DNA corriente arriba de la secuencia de la Figura 3. También se presentan los aminoácidos codificados, y que serían fusionados al terminal N de la secuencia de la Figura 3, pero no son aminoácidos específicos de CD30-L.

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Ejemplo 5 Anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD30-L

Este Ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales contra CD30-L. Se expresa CD30-L en células huésped mamíferas tales como COS-7 o CV1-EBNA y se purifica usando cromatografía de afinidad de CD320/Fc como se ha descrito aquí. El CD30-L purificado se puede usar para generar anticuerpos monoclonales contra CD30-L usando técnicas convencionales, por ejemplo, las descritas en la patente U.S. nº. 4.411.993. El inmunógeno puede comprender una proteína (o fragmento de ella, tal como un dominio extracelular) fusionada al péptido Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp y otros, BiolTechnology 6:1204, 1988 y patente U.S. nº. 5.011.912) o fusionada a la porción Fc de un anticuerpo, según se ha descrito antes.

Resumidamente: se inmunizan ratones con CD30-L como inmunógeno, emulsionado en coadyuvante de Freund completo, a los que se inyecta subcutánea o intraperitonealmente en cantidades que varían de 10 a 100 \mug. De 10 a 12 días más tarde, los ratones inmunizados reciben una inyección de recuerdo con CD30-L adicional emulsionado en coadyuvante de Freund incompleto. Los ratones reciben periódicamente después una inmunización de recuerdo según un programa de inmunización semanal o bisemanal. Se toman periódicamente muestras de suero por sangrado retroorbital o excisión en la cola para ensayo de transferencia de mancha o ELISA (ensayo inmunosorbente ligado a una enzima) para anticuerpos de CD30-L.

Después de detectar un título de anticuerpos adecuado, a los animales positivos se inyecta una última vez CD30-L en solución salina. Tres o cuatro días después se sacrifican los animales, se cosechan células del bazo y las células de bazo se fusionan a una línea de células de mieloma de murino (por ejemplo, NS1 o Ag 8.653). La última línea de células se puede obtener de la American Type Culture Collection como P3x63Ag.8.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones generan células de hibridoma, que se cultivan en placas de microtitulación múltiples en un medio selectivo de HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células de bazo.

Las células de hibridoma se exploran por ELISA en cuanto a la reactividad frente a CD30-L purificado mediante adaptación de las técnicas descritas por Engvall y otros, en Immunochem 8:871, 1971 y la patente U.S. nº. 4.703.004. Una técnica de exploración preferida es la técnica de captura de anticuerpos descrita por Beckmann y otros (J. Immunol. 144:4212, 1990). Las células de hibridoma positivas se pueden inyectar intraperitonealmente en ratones BALB/c singénicos para producir ascites que contienen concentraciones altas de anticuerpos monoclonales anti CD30-L. Alternativamente, se pueden hacer crecer células de hibridoma in vitro en matraces o botellas rodillo por varias técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en ascites de ratón se pueden purificar por precipitación con sulfato amónico seguida de cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, también se puede usar cromatografía de afinidad basada en la unión de anticuerpo a proteína A o proteína G, como también cromatografía de afinidad basada en la unión a CD30-L.

Ejemplo 6 Aislamiento de cDNA de CD30-L humano

Este ejemplo ilustra una técnica de hibridación por cruzamiento de especies que se usó para aislar un cDNA de CD30-L humano usando una sonda derivada de la secuencia de CD30-L de murino. Se produjo una sonda de CD30-L de murino separando el inserto de DNA entero del clon de murino pDC202-mCD30-L (ATCC 69004, descrito en el Ejemplo 4) por digestión con Bgl II y marcado con ^{32}P del fragmento usando cebadores al azar (Boehrin-
ger-Manheim).

Se construyó una biblioteca de cDNA de linfocitos de sangre periférica humana (PBL) en un vector de fago (\lambdagt 10). Las células PBL se obtuvieron de personas voluntarias normales y se trataron con 10 ng/ml de OKT3 (un anticuerpo anti CD3) y 10 ng/ml de IL-2 humana (Immunex, Seattle, WA) durante 6 días. Las células de PBL se lavaron y se estimularon con 500 ng/ml de ionomicina (Calbiochem) y 10 ng/ml de PMA (Sigma) durante 4 horas. Se aisló RNA de mensajero de las células de PBL estimuladas. El cDNA sintetizado sobre el molde de mRNA se empaquetó en vectores de fago \lambdagt 10 (Gigapak® Stratagene, San Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego se cultivaron los fagos recombinantes en la cepa KW251 de E. coli y se exploraron usando técnicas estándar de hibridación en placa.

La sonda de murino se hibridó con cDNA de fago a 37ºC durante la noche en el tampón de hibridación siguiente:

50% de formamida

Pipes 20 mM (pH 6,4)

NaCl 0,8 M

EDTA 2 mM

0,5% de SDS

0,1 mg/ml de DNA de esperma de salmón

A la hibridación siguió lavado con 2X SSC, 0,1% de SDS a 50ºC. Las placas positivas (que hibridizan) se visualizaron por autorradiografía.

Se purificaron seis de las placas positivas y los insertos se aislaron mediante amplificación por PCR usando oligonucleótidos que flanquean el sitio de clonación. Se derivó una secuencia parcial para CD30-L humano determinando la secuencia de nucleótidos de una porción de uno de estos insertos (clon nº. 9, de aproximadamente una longitud de 2,0 kb). Esta secuencia parcial de aminoácidos se presenta alineada con la correspondiente porción de CD30-L de murino en la Figura 4. La secuencia humana está en las filas de arriba, indicada (h), y la secuencia de murino se indica (m), representándose como X los aminoácidos de identidad dudosa. La región de transmembrana está subrayada para la secuencia de ratón y la secuencia humana está marcada por una línea por encima.

La primera X (en la posición 6) de la secuencia humana muy probablemente es un resto de metionina codificada por un codón de iniciación. Como se puede ver comparando con la secuencia de murino de la Figura 3, un fragmento N terminal (aminoácidos 1-130) de CD30-L de murino está alineado con la secuencia parcial humana de la Fi-
gura 4.

Se determinó la secuencia de DNA de la región de codificación entera del clon de CD30-L humano y se presenta en la Figura 5 junto con la secuencia de aminoácidos. Al dominio cicloplasmático N terminal (aminoácidos 1 a 21) sigue una región de transmembrana (aminoácidos 22 a 43, subrayada en la Figura 5) a la que sigue el dominio extracelular, esto es, de unión del receptor (aminoácidos 44-215). Esta proteína carece de un péptido señal. Cuando el CD30-L humano parcial de la Figura 4 difiere de la secuencia humana de longitud entera presentada en la Figura 5, se considera que la secuencia de la Figura 5 es precisa. La comparación de las secuencias de aminoácidos de CD30-L de murino (Figura 3) y humano (Figura 5) usando el programa GAP de ordenador antes descrito revela una identidad de 73% y una similitud de 83% entre las dos secuencias.

En las posiciones 62-64, 90-92, 134-136, 170-172 y 182-184 se encuentran tripletes de aminoácidos que constituyen sitios de glicosilación unidos con N. En los aminoácidos 72-73 de la Figura 5 se ha encontrado un sitio de procesamiento de KEX2 proteasa. Si se desea, estos sitios de N-glicosilación pueden inactivarse para imposibilitar la glicosilación, como se ha descrito antes. Los sitios de KEX2 se pueden inactivar para reducir la proteolisis cuando se expresa la proteína de CD30-L en células de levaduras, como se ha descrito antes.

Los productos de la reacción PCR descrita antes (por la que se amplificó el inserto de cDNA del clon positivo) se digirieron con EcoRI y se ligaron a un vector digerido con EcoRI designado pGEMBL. El plásmido pGEMBL es un derivado del vector de clonación estándar pBR322 y contiene un policonector que tiene un sitio EcoRI singular junto con otros varios sitios de restricción singulares. El plásmido comprende también un gen de resistencia a la ampicilina. Dente y otros (Nucl. Acids Res. 11:1645, 1983) describen un ejemplo de este tipo de vector.

DH5\alpha de E. coli se transformó con la mezcla de ligación y se identificaron los transformantes que contenían el plásmido recombinante deseado. Muestras del plásmido hCD30-L/pGEMBL que contenía DH5\alpha de E. coli se depositaron en la American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC) el 24 de junio de 1992, con el número de acceso 69020. El depósito se hizo en los términos del Tratado de Budapest. El plásmido recombinante depositado contiene DNA de CD30-L humano que incluye la región codificadora entera representada en la Fi-
gura 5.

Ejemplo 7 Aislamiento de DNA de CD30-L humano y de murino que codifican aminoácidos N terminales adicionales

A causa de que los clones de CD30-L aislados en los Ejemplos 4 y 5 tenían regiones 5' no codificadoras relativamente cortas y carecían de codones de parada corriente arriba del primero codón de iniciación, se intentó el aislamiento de DNA de CD30-L que comprendía secuencias 5' adicionales. Se empleó una técnica anclada de PCR descrita en general por Loh y otros, Science 243:217 (1989) y Carrier y otros, Gene 116:173(1992), cuyos contenidos se incorporan aquí por referencia. Los mismos procedimientos se emplearon para aislar clones de murino y humanos, excepto lo que se hace constar.

Se sintetizó cDNA de primera cadena usando un kit de cDNA Superscript® (GIBCO/BRL, Gaithsburg, MD) en los siguientes modelos de mRNA:

de murino: 5 \mug de total de RNA de la línea de células 7B9 descrita en el Ejemplo 3.

humano: 2 \mug de poliA^{+} RNA de célulasT de sangre humana periférica (los PBLs estimulados descritos en el Ejemplo 6).

Los cebadores empleados en la síntesis de cDNA (denominados cebadores nº. 1 en lo que sigue) eran:

de murino: 5' AGATGCTTTGACACTTG 3'

humano: 5' ATCACCAGATTCCCATC 3'

El cebador nº. 1 de murino es complementario de los nucleótidos 265-281 de la Figura 3. El cebador nº. 1 humano es complementario de los nucleótidos 325-341 de la Figura 5.

La mezcla de reacción se trató con RNAsa H, luego se purificó sobre columna espinal Sephadex G50 (Sigma). Después de secarlo, el cDNA se puso en suspensión en: 10 \mul de H_{2}O, 4 \mul de tampón 5X terminal desoxinucleotidil transferasa (TdT) (según lo especificado por GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD), 4 \mul de dATP 1 mM y 1 \mul de TdT (15 unidades/\mul). Esta mezcla de reacción se incubó a 37ºC durante 10 min para añadir una cola poli-A al extremo 3' del cDNA. La reacción se paró calentando a 68ºC durante 15 min, y la mezcla se aplicó a una columna espinal Sepharex G50. El eluido se diluyó a 250 \mul con Tris 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM. Se preparó una primera mezcla de reacción PCR combinando:

\newpage

10,0 \mul	de cDNA de primera cadena (con colas de adenina)
10,0 \mul	de tampón 10 X
2,0 \mul	de primer cebador de anclaje:
	5' GCATGCGCGCGGCCGCGGAGGT_{17} 3' (100 ng/\lambda)
1,0 \mul	de segundo cebador de anclaje:
	5' GCATGCGCGCGGCCGCGGAGGTT 3' (100 ng/\lambda)
2,0 \mul	de cebador nº. 2 (antisentido)
	de murino: 5' ACAGAAGAGATCCTCTG 3'
	humano 5' CCAACACCATAATAGTG 3'
1,0 \mul	de Taq DNA polimerasa
0,8 \mul	de dNTP 25 mM
73,2 \mul	de H_{2}O des.
\overline{100.0 \ \mu l}	Total

Para esta primera PCR se emplearon las siguientes condiciones de reacción (ciclos de temperatura) y cada una de las PCRs descritas seguidamente:

94ºC	5 min	1X
94ºC	0,5 min	30X
55ºC	1,5 min	30X
72ºC	2,5 min	30X
72ºC	5 min	1X

El primer cebador de anclaje contiene un segmento T que se anillará a la cola poli A añadida al cDNA. El cebador también inserta un sitio de restricción NotI (subrayado) en el DNA amplificado. El segundo cebador de anclaje se anilla (en ciclos posteriores de la reacción) a la secuencia que contiene el sitio NotI insertado en el DNA amplificado mediante el primer cebador de anclaje.

El cebador nº. 2 de murino es complementario de los nucleótidos 206-222 de la Figura 3. El cebador nº. 2 humano es complementario de los nucleótidos 108-124 de la Figura 5.

Se preparó una segunda mezcla de reacción para PCR combinando:

25,0 \mul	de una primera mezcla de reacción de PCR (después de la reacción anterior)
2,0 \mul	del segundo cebador de anclaje
2,0 \mul	de cebador nº. 2
10,0 \mul	de tampón 10X
0,8 \mul	de dNTPs 25 mM
1,0 \mul	de Taq DNA polimerasa
59,2 \mul	de H_{2}O d.
\overline{100.0 \ \mu l}	Total

Se preparó una segunda mezcla de reacción de PCR combinando:

10,0 \mul	de una segunda mezcla de reacción de PCR (después de finalizada la reacción)
10,0 \mul	de tampón 10X
2,0 \mul	de segundo cebador de anclaje
2,0 \mul	de cebador nº. 3
	de murino: 5' GGGTCGACACTTGTGCTTCTCCAGGG 3'
	humano:\mu\mu\mu\mu 5' GGGTCGACCAGGCACAGAGCCA 3'
1,0 \mul	de Taq DNA polimerasa
0,8 \mul	de dNTPs 25 mM
74,2 \mul	de H_{2}O d.
\overline{100.0 \ \mu l}	Total

El cebador nº. 3 de murino contiene un segmento complementario de los nucleótidos 49-66 de la Figura 3. El cebador nº. 3 humano contiene un segmento complementario de los nucleótidos 80-94 de la Figura 5. Cada cebador nº. 3 contiene un segmento que introduce un sitio de reatricción SaII (subrayado) en el DNA amplificado.

Los productos de la reacción PCR (de la reacción PCR nº. 2 para humano y nº. 3 para murino) se separaron por electroforesis sobre gel de agarosa NuSieve al 1% (FMC Bioproducts, Rockland, ME). Se aisló una banda de PCR que comprendía DNA de aproximadamente 300 bp para murino y para humano. El DNA de CD30-L se amplificó más en otra reacción PCR. La mezcla de reacción comprendía:

5 \mul	de banda del gel (fundido a 68ºC)
10 \mul	de tampón 10X
2 \mul	de segundo cebador de anclaje
2 \mul	de cebador nº. 3
1 \mul	de Taq DNA polimerasa
0,8 \mul	de dNTPs 25 mM
79,2 \mul	de H_{2}O d
\overline{100.0 \ \mu l}	Total

Se determinó la secuencia de nucleótidos de los productos de reacción. Los productos de reacción se pueden secuenciar directamente o subclonar por digestión con Not/Sal I antes de secuenciar. La secuenciación reveló DNA adicional en el extremo 5' en comparación con los clones de los Ejemplos 5 y 6, incluido DNA que codifica 19 aminoácidos N terminales adicionales para CD30L-L humano y de murino. El DNA y las secuencias de aminoácidos codificadas para la región de codificación de DNA de CD30-L que comprenden esta secuencia de codificación 5' adicional se representan en las Figuras 6 (de murino) y 7 (humano). Los aminoácidos N terminales adicionales no comprenden sitios de N-glicosilación o de procesamiento de KEX2 proteasa.

Los DNAs de CD30-L humano y de murino aislados en este ejemplo se expresaron en células CV1-EBNA. El peso molecular de la proteína expresada, según análisis SDS-PAGE no reductor, era de aproximadamente 26.519 daltons para CD30-L de murino y de 26.017 daltons para CD30-L humano.

Aunque las proteínas de CD30-L de murino y humano codificadas por los clones de los ejemplos 4 y 6, respectivamente, son truncadas, las proteínas codificadas son biológicamente activas en cuanto a que se unen a CD30. Así, las proteínas de CD30-L que carecen de uno de los 19 primeros aminoácidos, o de todos ellos, presentados en las Figuras 6 o 7, son proteínas de CD30-L biológicamente activas de la presente invención. La supresión de los primeros 19 aminoácidos de las Figuras 6 y 7 da una secuencia de aminoácidos que se idéntica a la presentada en las figuras 3 y 5, respectivamente.

Ejemplo 8 Análisis de las actividades biológicas de CD30-L

Células en las que se había observado previamente expresión de CD30 se exploraron en cuanto a una respuesta al ligando de CD30 recombinante. En los tipos de células humanas exploradas estaban incluidas células T activadas, tres líneas de linfoma de Hodgkin que se parecen a células H-RS con fenotipos primitivos B o del tipo de células T, y una línea de linfoma no de Hodgkin del linfoma anaplásico de célula grande (LCAL).

Se aislaron por centrifugación en Histopaque (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO) células de linfocitos T de sangre periférica y formando rosetas con eritrocitos de ovino tratados con bromuro de 2-aminoetilisotiouronio (AET) como ha sido descrito (Armitage y otros, Int. Immunol. 2:1039 (1990)). El PBT purificado se cultivó luego durante 5 días en presencia de anticuerpo de CD3 inmovilizado y una titulación de células CV1/EBNA fijadas que expresaban ligando de CD30 humano recombinante de longitud completa (unido a membrana). A diferencia con células de control transfectadas sólo con vector, las células que expresaban CD30-L inducían la proliferación de las células T estimuladas de manera dependiente de la dosis, observándose una respuesta máxima con 2,5 x 10^{4} células CC1/EBNA por pocillo. Esta proliferación intensificada (y otras actividades que se describen más adelante) se podían bloquear por inclusión de 10 \mug/ml de CD30/Fc soluble. Se vio una capacidad similar de inducir la proliferación de células T activadas con CD3 en presencia de anticuerpo M44 monoclonal anti CD30 inmovilizado, lo que sugiere la unión cruzada bivalente de receptor inducida por ligando mímico de anticuerpo. El anticuerpo monoclonal M44 es un IgG1 de ratón generado con CD30-Fc purificado como inmunógeno. No se vio respuesta a CD30-L en ausencia de cooestimulación con CD3.

Se investigó la actividad biológica de CD30-L en líneas de células de linfoma humano conocidas para expresar CD30. Las líneas de linfoma humano CD30^{+} ensayadas incluían células HDLM-2, KM-H2, L-428 y Karpas 299. Las condiciones de cultivo para estas cuatro líneas de células han sido publicadas (Drexler y otros, Leuk. Res. 10:487 (1986); Gruss y otros, Cancer Res. 52:3353 (1992)).

La línea de células HDLM-2 derivada de HD se estableció a partir de una efusión pleural maligna de una mujer de 74 años de edad con etapa final de IVB HD (Drexler y otros, 1986, cita anterior; Gruss y otros, 1992, cita anterior). KM-H2 y L-428 son líneas de linfoma derivadas de HD, de células de tipo B. La línea de células humanas Karpas 299 se estableció a partir de células de blastos de sangre periférica de una mujer de 24 años con el diagnóstico de linfoma anaplásico de células grandes (Linfoma humano Ki-1 positivo de alto grado). Las células de blastos periféricos con núcleos pleomórficos eran semejantes a histiocitos primitivos que presentan los marcadores de superficie CD4, CD5, HLA-DR y CD30. La línea de células Karpas 299 posee el mismo perfil citoquímico, inmunológico y cromosómico, con una translocación 2;5, que las células de blastos de la sangre periférica del paciente (Fischer y otros, Blood 72:234 (1988)).

La adición de células CV1/EBNA (10.000 células/pocillo) que expresan CD30-L recombinante humano a la línea de células derivada de HD (50.000 células/pocillo) dió por resultado una proliferación intensificada, mientras que la adición de células CV1/EBNA de control transfectadas con el vector solo tenía un efecto mínimo. La estimulación inducida por CD30-L de la proliferación de células HDLM-2 dependía del tiempo, habiéndose observado un aumento de 3-4 veces a las 72 horas. Se obtuvieron resultados similares usando anticuerpo M44 inmovilizado, y el efecto dependía de la dosis. Células cultivadas con un anticuerpo monoclonal de control con un isotipo emparejado no presentaban respuesta alguna. La máxima intensificación de la proliferación, un aumento de 5 veces respecto a cultivos de control, se detectó después de estimulación con 10 \mug/ml de M44 a las 72 horas. También aquí, el anticuerpo monoclonal de CD30 M44 tiene características agonistas y simula las propiedades del ligando. A diferencia de los resultados anteriores, no se pudieron detectar efectos del CD30-L sobre la proliferación o la viabilidad de las células KM-H2 o L-428, incluso cuando se confirmó por citometría de flujo con M44 que ambas líneas eran de CD30^{+}.

Se vió una respuesta clara y espectacularmente diferente con la línea Karpas 299 del linfoma CD30^{+} no de Hodgkin (LCAL). La adición de células CV1/EBNA que expresan CD30-L o células de anticuerpo de Karpas 299
(5 x 10^{3} células/pocillo) disminuía ocho veces la proliferación. Este efecto se analizó con la medición de la liberación de ^{51}Cr por ensayos citotóxicos. A las 18 horas, la liberación específica en respuesta a CD30-L o M44 era de 29,4% y 30,6%, respectivamente. La adición de células CV1/EBNA transfectadas con el vector solo, o de un anticuerpo de control emparejado con un isotipo, no tenía efecto alguno. Así, a diferencia de la respuesta proliferativa aumentada de HDLM-2 derivado del linfoma de Hodgkin, la respuesta de la línea de linfoma no de Hodgkin Karpas 299 es la muerte de la célula.

Ejemplo 9 Análisis Northern de transcriptos de CD30-L humano y de murino

Se analizaron por transferencia Northern varios tipos de células para detectar transcriptos de CD30-L (mRNAs).

Células humanas

Células PBT humanas, inducidas con un ionóforo de calcio, células T tonsilares no inducidas y monocitos inducidos por LPS expresaban, todas ellas, un transcrito de hibridación individual que migraba entre RNA ribosomal 18 y 28 S. Las células de PBT tratadas con IL-7, células B tonsilares tratadas con PMA, macrófagos THP-1 no inducidos activados con Jurkat o LPS y monocitos tratados con GM-CSF no expresaban CD30-L. IL-1\beta inducía niveles bajos de CD30-L en monocitos. Además, el tejido placental, la línea promielocítica HL60 y dos líneas de células B de linfoma de Burkitt (Daudi y Raji) eran también negativas en cuanto a la expresión de transcriptos de CD30-L. Así, se detectó expresión de CD30-L humano en células T inducidas específicamente y monocitos/macrófagos.

Células de murino

Estos resultados son reflejos especulares de los del sistema de murino. Macrófagos de médula ósea estimulados con LPS, células T 7F9T activadas con Con A (similares a la línea de células T cooperadoras 7B9 de murino descrita en los Ejemplos 2 y 3) y subclones estimulados con LPS del timoma de murino EL4 (ELA 6.1) expresaban un transcripto individual de CD30-L. Las células EL4 6.1 y 7FT no estimuladas, una línea D11 estromal derivada de médula ósea y una línea F4 estromal tímica no expresaban CD30-L.

Ejemplo 10 Caracterización de CD30-L recombinante

Las características bioquímicas de las formas recombinantes de superficie celular de longitud entera de CD30-L de murino y humano se evaluaron por radioyodación de la superficie de células que expresan transitoriamente los ligandos recombinantes, inmunoprecipitando luego los ligandos con CD30/Fc (y proteína G) de lisados de células detergentes solubilizadas. En la mezcla de lisado se incluyeron yodoacetamida (20 mM) y tampones de inmunoprecipitación para inhibir el intercambio potencial de disulfuro. Los precipitados lavados se pusieron luego de manifiesto por SDS-PAGE marcando con fósforo. Las células transfectadas sólo con vector, o las células que expresaban ligando recombinante pero inmunoprecipitadas con un control emparejado con isotipo (hulgG1), no presentaban bandas. En condiciones reductoras, el producto dominante para CD30-L recombinante tanto humano como de murino es una banda difusa de 40 kd. Como el peso molecular de la proteína de CD30-L es 26.000, parece claro el uso de los múltiples sitios de glicosilación unidos con N en los dominios extracelulares. En condiciones no reductoras, aparecen dímeros con uniones disulfuro de CD30-L humano e, incluso se ven oligómeros superiores aparentemente unidos por enlaces disulfuro con el CD30-L de murino. Después de una reducción, la mayoría, no la totalidad, de éstos se convierten en monómeros. El hecho de que no todos los oligómeros se conviertan en monómeros puede reflejar bien una glicosilación diferencial y/o una reducción ineficiente.

Ejemplo 11 Producción de una proteína de fusión de CD30-L humano soluble

Se produjo una proteína de fusión soluble que comprende un polipéptido anticuerpo de la región Fc unido mediante un conector peptídico al término N de un fragmento del dominio extracelular de CD30-L humano cuya actividad biológica se determinó como sigue. Se aisló y se amplificó por PCR DNA que codifica un polipéptido de CD30-L humano que comprende los aminoácidos 47 (Asp) a 215 (Asp) de la Figura 5. La PCR se realizó por procedimientos convencionales usando como cebador 5' un oligonucleótido que comprende los nucleótidos 139-153 de la Figura 5 y una secuencia que contiene un sitio de reconocimiento para BspE1. El cebador 3' abarcaba el codón de terminación de CD30-L y contenía la secuencia de reconocimiento para Not I.

Los productos de la PCR se digirieron con Bsp E1 y Not I y el fragmento deseado se ligó a un vector de expresión designado pDC408, que es un derivado del vector pDC406 descrito antes. El pDC408 había sido modificado para que contuviera (en el orden) 5'-secuencia líder de IL-7 de murino-FLAG®-dominio Fc de IgGI humano-conector peptídico.

La secuencia líder IL-7 de murino se describe en la patente U.S. nº. 4.965.195 y el octapéptido FLAG® se ha descrito antes. El polipéptido de Fc se ha descrito en el Ejemplo 1. Se empleó un conector peptídico de la secuencia Gly_{4}SerGly_{5}Ser y el DNA que codifica CD30-L soluble se insertó inmediatamente corriente abajo del conector peptídico, en el mismo marco de lectura. Se transfectaron células 293 (ATCC CRL 1573; una línea de células humanas primarias embrionarias de riñón, transformadas) con el vector de expresión recombinante y se cultivaron para posibilitar la expresión y secreción de la proteína de fusión. La proteína expresada se purificó en una columna de
proteína A.

La actividad de la proteína expresada se midió usando un ensayo de inhibición en el que se midió la unión de proteína CD30/Fc marcada con ^{125}I a CD30-L expresada sobre la superficie de células CV1/EBNA transformadas. La proteína de fusión que contenía CD30-L soluble reveló ser capaz de inhibir esta unión, lo que indicaba su capacidad para unirse a CD30/Fc. La afinidad medida del ligando soluble para CD30/Fc era aproximadamente equivalente a la de CD30/Fc para el ligando unido a célula.

Claims (24)

1. Un polipéptido ligando de CD30 (CD30-L) purificado capaz de unir una proteína de CD30 que tiene una secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 1, polipéptido de CD30-L que comprende los aminoácidos 1-220 de la Figura 3, los aminoácidos 1-215 de la Figura 5, los aminoácidos 1-239 de la Figura 6 o los aminoácidos 1-234 de la Figura 7.

2. Un polipéptido soluble purificado de CD30-L capaz de unir un polipéptido de CD30 que tiene una secuencia de aminoácidos representada en la Figura 1, polipéptido de CD30-L que comprende los aminoácidos 49-220 de la Figura 3 o los aminoácidos z-215 de la Figura 5, siendo z 44, 45, 46 o 47.

3. Un polipéptido según la reivindicación 1, que tiene una secuencia de aminoácidos que es como mínimo 80% idéntica a la secuencia de polipéptido de la Figura 3, la Figura 5 o la Figura 7.

4. Un derivado de un polipéptido de CD30-L de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polipéptido de CD30-L está unido covalentemente a un grupo glicosilo, un lípido, un fosfato, un grupo acetilo, un polipéptido o un polipéptido señal.

5. Un polipéptido de CD30-L según la reivindicación 3 o 4, polipéptido de CD30-L que es soluble.

6. Un oligómero purificado que comprende dos, tres o más polipéptidos de CD30-L según las reivindicaciones
2 o 5.

7. Un polipéptido de CD30-L según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de amionoácidos x a 239 de la Figura 6, siendo x 1-19, o los aminoácidos y a 234 de la Figura 7, siendo y 1-19.

8. Una secuencia de DNA aislado que codifica un polipéptido de CD30-L capaz de unir una proteína de CD30 que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 1, polipéptido de CD30-L que comprende:

(a)

los aminoácidos 1-220 o los aminoácidos 49-220 de la Figura 3;

(b)

los aminoácidos 1-215 de la Figura 5 o los aminoácidos z-215 de la Figura 5, siendo z 44, 45, 46 o 47:

(c)

los aminoácidos 1-239 de la Figura 6;

(d)

los aminoácidos 1-234 de la Figura 7;

(e)

un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a la secuencia de polipéptido de la Figura 3, la Figura 5 o la Figura 7.

9. Un DNA aislado que codifica un polipéptido de CD30-L soluble de acuerdo con la reivindicación 2 o 5.

10. Una secuencia de DNA aislado de acuerdo con la reivindicación 8 que adicionalmente codifica un polipéptido de Fc derivado de un anticuerpo fusionado, directamente o a través de un conector peptídico, al terminal N del polipéptido de CD30-L.

11. Un DNA aislado, según la reivindicación 10, que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos x a 239 de la Figura 6, siendo x 1 a 19, o la secuencia de aminoácidos y a 234 de la Figura 7, siendo y 1-19.

12. Un vector de expresión que comprende una secuencia de DNA de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.

13. Una célula huésped transformada con un vector de acuerdo con la reivindicación 12.

14. Un procedimiento para la preparación de un polipéptido de CD30-L, procedimiento que comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de acuerdo con la reivindicación 12 en condiciones que promueven la expresión de CD30-L y recuperen el polipéptido de CD30-L.

15. Un procedimiento para la preparación de una proteína de fusión de CD30-L/Fc soluble, procedimiento que comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de comprende un DNA de acuerdo con la reivindicación 10 en condiciones que promueven la expresión de la proteína de fusión de FC30-L/Fc y recuperen la proteína de fusión de CD30-L/Fc.

16. Una proteína de fusión de CD30-L/Fc que comprende un polipéptido de CD30-L soluble de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, y un polipéptido de Fc derivado de un anticuerpo, en la que la mencionada proteína de fusión es capaz de unir una proteína de CD30 que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 1.

17. Una proteína dímera que comprende dos proteínas de fusión de acuerdo con la reivindicación 16 unidas por enlaces disulfuro entre los polipéptidos de Fc.

18. Una secuencia de DNA aislado que codifica una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 16.

19. Un anticuerpo purificado que es inmunorreactivo específicamente con un polipéptido de CD30-L según se ha descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4, 5 o 7.

20. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 19, que es un anticuerpo monoclonal.

21. El uso de un oligonucleótido antisentido o de sentido que comprende una secuencia de al menos 14 nucleótidos que une específicamente una secuencia de DNA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 o su complemento de DNA o RNA en la manufactura de un medicamento para uso en la inhibición de la transcripción o traducción de CD30-L.

22. El uso de un oligonucleótido antisentido o de sentido que comprende una secuencia de al menos 14 nucleótidos que une específicamente una secuencia de DNA según se representa en la Figura 3, 5, 6 o 7 o su complemente de DNA o RNA en la manufactura de un medicamento para inhibir la transcripción o traducción de CD30-L.

23. Una composición de comprende una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 16 o 17.

24. El uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 16 o 17 en un ensayo in vitro para la detección de CD30 o CD30-L o sus interacciones.