ES2240981T3 - Citocina denominada lerk-7. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION ESTA DIRIGIDA A UNA PROTEINA DENOMINADA LERK - 7, A UN ADN QUE CODIFICA LA LERK - 7, Y A CELULAS HUESPED TRANSFORMADAS CON EL ADN DE LERK - 7. TAMBIEN SE DESCRIBEN ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA LA LERK - 7. LA PROTEINA LERK - 7 SE UNE A LOS RECEPTORES DE LA SUPERFICIE CELULAR CONOCIDOS COMO ELK Y HEK.

Description

Citocina denominada Lerk-7.

Antecedentes de la invención

Las proteínas conocidas como las tirosinas quinasas receptores tienen una actividad quinasa intrínseca que se activa tras la unión a ligando. Esta clase de proteínas se caracteriza por motivos estructurales conservados dentro de los dominios catalíticos (Hanks y col., Science, 242: 42, 1988) y se puede subdividir en familias basándose en las características estructurales de las regiones N-terminales del dominio catalítico.

La familia de receptores eph, nombradas después del primer miembro aislado (Hirai y col., Science, 238: 1717, 1987) es la mayor subfamilia de tirosina quinasas receptoras. Entre losa miembros de esta familia están cek4 (Sajjadi y col., New Biol. 3: 769, 1991) y cek5 (Pasquale, E. B., Cell Regulation 2: 523, 1991) de pollo; mek (Sajjadi y col., anterior), bsk (Zhou y col., J. Neurosci. Res., 37: 129, 1994), nuk (Henkemeyer y col., Oncogene 9: 1001, 1994), y sek (Gilardi -Hebenstreit y col., Oncogene 7: 2499, 1992) de murino; elk (Letwin y col., Oncogene 3: 621, 1988; Lhotak y col., Mol. Cell. Biol. 11: 2496, 1991), eek (Chan y col., Oncogene 6: 1057, 1991) ehk-1 y ehk-2 (Maisonpierre y col., Oncogene 8: 3277, 1993) de rata; y hek (Boyd y col., J. Biol. Chem., 267: 3262, 1992; Wicks y col., PNAS USA, 89: 1611, 1992), hek2 (Bohme y col., Oncogene 8: 2857, 1993), eck (Lindberg y col., Mol. Cell. Biol. 10: 6316. 1990), y erk (Chan y col., anterior) de seres humanos.

Las proteínas de esta subfamilia están relacionadas no solamente en sus dominios citoplásmicos, sino también en sus dominios extracelulares, que son 41 a 68% idénticas. De manera interesante, las distribuciones en tejido de estos diversos receptores son variadas. Por ejemplo, la expresión de ARNm de elk se ha reseñado que está limitada a testículos y cerebro (Lhotak y col, anterior), mientras eck no solamente se encuentra en estos dos mismos tejidos sino en pulmón, intestino, riñón, bazo, ovario, y piel también. Debido a que la mayoría de las tirosina quinasas receptores relacionadas con eph se expresan principalmente en el cerebro, se ha postulado que estos receptores y sus ligandos pueden estar implicados en el crecimiento, diferenciación, y supervivencia de neuronas.

La glicoiproteína de superficie celular denominada (quinasa de tipo eph/elk humana) se purificó mediante Boyd y col., (J. Biol. Chem., 267: 3262, 1992). Un anticuerpo monoclonal inmunorreactivo con hek se usó para estudiar la expresión de hek en un número tipos de células humanas (Boyd y col., anterior). El antígeno hek se detectó en la línea celular LK63 de leucemia de células pre-B humanas (la línea celular empleada como inmunógeno contra la que se indujo el anticuerpo) y la línea celular JM de leucemia de células T humana. La línea celular de linfoma Raji B mostró una débil expresión de antígeno hek, y las líneas celulares restantes ensayadas (tanto líneas celulares normales como tumorales, entre las que estaban líneas celulares hematopoyéticas que incluían líneas de células T y pre-B) eran consistentemente negativas. De las muestras de biopsia de tejido normal y tumoral que se ensayaban también para evaluar la expresión de antígeno hek, ninguno de los tejidos normales esta positivo y solamente una proporción muy baja de tumores hamatopoyéticos era positiva.

La expresión de las transcripciones de hek en las líneas celulares LK63 y JM descritas anteriormente, así como la línea celular HSB-2 de leucemia de células T humana, se ha demostrado mediante análisis de transferencia de Northern (Wicks y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1611, 1992). Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos para un clon de ADNc de hek aislado también se presentan en Wicks y col., anteriormente.

Un clon parcial de la proteína superficial celular denominada elk se descubrió primero en una genoteca de expresión de ADNc de cerebro de rata que se rastreó para proteínas que expresan actividad de tirosina quinasa (Letwin y col., Oncogene, 3: 621, 1988). Más tarde, una secuencia compuesta que se extiende sobre la región codificadora de elk entera se derivó de clones parciales aislados de una genoteca de ADNc de cerebro de rata y una genoteca de cerebro cerebelar usando el clon parcial como una sonda (Lhotak y col., Mol. Cell. Biol. 11: 2496, 1991).

Los ligandos que se han identificado para las tirosina quinasas receptoras son un grupo diverso de proteínas que afectan el crecimiento, diferenciación, y supervivencia de células que expresan los receptores. Debido a la homología de los receptores en la familia de eph, un ligando dado para un receptor específico también se puede unir a otros receptores. Se han aislado los ligandos para hek y elk, como se describe en más detalle más adelante.

La identificación de ligandos adicionales para hek y elk que pueden existir probarían utilidad en la investigación de la naturaleza de procesos celulares regulados por la señalización a través de estos receptores. Si se desea la potenciación o inhibición de una señal biológica particular mediada a través de estos receptores, es ventajoso identificar cada una de las proteínas que puede jugar un papel en la transducción de tales señales. Además, se sabe que ciertas proteínas se pueden unir a receptores sin iniciar la señal de transducción, incluyendo la proteína antagonista del receptor de interleucina-1 (Eisenberg y col., Nature, 343: 341, 1990; Hannun y col., Nature, 343: 336, 1990; y Carter y col., Nature 344: 633, 1990). La identificación de proteínas adicionales que se unen a hek o elk es también deseable con el fin de determinar si tales proteínas funcionan como antagonistas.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a una citocina novedosa denominada Lerk-7. Se proporcionan en esta memorias descriptiva proteínas de Lerk-7 purificadas, junto con ADN aislados que codifican Lerk-7, vectores de expresión que comprenden el ADN de Lerk-7, y células hospedadoras transformadas con los vectores de expresión. Los procedimientos para producir Lerk-7 incluyen cultivo de tales células hospedadoras transformadas en condiciones que promueven la expresión de Lerk-7.

Los polipéptidos Lerk-7 se unen a los receptores de la superficie celular conocidos como hek, elk, y eck, que se han descrito anteriormente. La invención también abarca anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos lerk-7.

Descripción detallada de la invención

Una citocina novedosa denominada Lerk-7 se proporciona en esta memoria descriptiva. Esta citocina se une a las tirosina quinasas receptoras conocidas como elk, hek, y eck.

La presente invención abarca ADN que codifica Lerk-7, vectores de expresión que comprenden el ADN de Lerk-7, y células hospedadoras transformadas con los vectores de expresión. Un procedimiento para producir polipéptidos Lerk-7 comprende el cultivo de células hospedadoras transformadas en condiciones que conducen a la expresión de Lerk-7, y recuperación de Lerk-7 expresada. Se describen los polipéptidos Lerk-7 purificados tanto en forma soluble como unidos a membrana.

Los polipéptidos de Lerk-7 o fragmentos inmunogénicos de los mismos se pueden emplear como inmunógenos para generar anticuerpos que son inmunorreactivos con ellos. En una realización de la invención, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales.

Un ADNc que codifica Lerk-7 se ha aislado a partir de una genoteca de ADNc de cerebro fetal humano, como se describe en el ejemplo 1. La secuencia de nucleótidos de la región codificadora de este ADNc de Lerk-7 se presenta en la SEC ID Nº: 4, y la secuencia de aminoácidos codificada por ella se presenta en la SEC ID Nº: 5. Esta proteína Lerk-7 comprende un péptido señal N-terminal (aminoácidos -20 a -1 de la SEC ID Nº: 5), un dominio de unión a receptores extracelulares (aminoácidos 1 a 133), una región espaciadora (aminoácidos 134 a 183), y un alargamiento C-terminal de residuos hidrófobos (aminoácidos 194 a 208).

Lerk-7 se predice que está anclada a la superficie celular mediante enlace glicosilfosfatidilinositol (GPI). Los anclajes a la membrana de GPI, incluyen la estructura química y procesamiento de los mismos, se describen en Ferguson, M. y A. Williams, Ann. Rev. Biochem., 57: 285, 1988. Cuando se expresa inicialmente, ciertas proteínas comprenden un dominio hidrófobo C-terminal que contiene señales para anclar GPI. Un sitio de escisión se localiza cadena arriba, a menudo aproximadamente 10-12 aminoácidos cadena arriba del extremo N del dominio hidrófobo. El procedimiento post-traduccional incluye escisión de la proteína en este sitio de escisión. Un anclaje GPI se une al aminoácido C-terminal recientemente expuestote la proteína madura, procesada. De este modo, cuando las proteínas Lerk-7 se expresan en células que reconocen señales de anclaje GPI, la secuencia de aminoácidos de longitud completa de SEC ID Nº: 5 representa una forma precursora de la proteína.

El sitio de unión GPI predicho en al proteína Lerk-7 es el resto asparagina en al posición 183. Después de la escisión de al proteína (durante el procesamiento post traduccional), este resto asparagina se realiza en el extremo C de la proteína procesada. Un resto GPI se une a este resto asparagina. Esta predicción del sitio de escisión probable se basa en secuencias de consenso encontradas en otras proteínas ancladas por GPI. Es posible que la escisión se produzca en cualquier lugar cadena arriba de la región hidrófoba.

La presente invención proporciona tanto las formas unidas a membrana celular como solubles (secretadas) de Lerk-7. Los polipéptidos de Lerk-7 solubles incluyen el dominio de unión a receptores de una Lerk-7 nativos, pero carece de la señal GPI que produciría retención del polipéptido en una membrana celular. Los polipéptidos Lerk-7 solubles abarcados por la invención retienen la capacidad de unirse al receptor de hek o elk. La Lerk-7 soluble también puede incluir la región espaciadora o parte del dominio hidrófobo, con tal que se pueda secretar la proteína Lerk-7
soluble.

La Lerk-7 soluble se puede identificar (y distinguida de sus homólogos unido a membrana no soluble) separando células intactas que expresan un polipéptido Lerk-7 a partir del medio de cultivo, por ejemplo, mediante centrifugación, y ensayando el medio (sobrenadante) para la presencia de la proteína deseada. La presencia de Lerk-7 en el medio indica que la proteína se secretó a partir de las células y de este modo es una forma soluble de la proteína deseada.

Las formas solubles de Lerk-7 poseen ciertas ventajas sobre la forma unida a membrana de la proteína. Se facilita la purificación de la proteína a partir de las células hospedadoras recombinantes, ya que las proteínas solubles se secretan a partir de las células. Además, las proteínas soluble son generalmente más adecuadas para ciertas aplicaciones, por ejemplo, para administración intravenosa.

Las proteínas Lerk-7 solubles están truncadas en el extremo C. La supresión del dominio hidrófobo se cree que es suficiente para prevenir el anclaje de GPI de la proteína a la membrana celular, aunque la proteína se puede truncar adicionalmente para suprimir el aminoácido que constituye el sitio de unión a GPI. Los ejemplos de polipéptidos Lerk-7 humanos solubles incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos truncados en el extremo C de manera que el aminoácido C terminal sea cualquiera de aquellos entre o incluyendo los restos en las posiciones 133 y 193 de la SEC ID Nº: 5.

En realizaciones particulares, los polipéptidos Lerk-7 solubles incluyen los que comprenden los aminoácidos 1 - 133, 1 - 182, 1 - 185, ó 1 - 193 de la SEC ID Nº: 5. Para ilustrar una realización, se preparó un vector de expresión que codifica una proteína de fusión recombinante que comprende los aminoácidos -20 a 185 de la SEC ID Nº: 5, seguido de un péptido codificado por una secuencia del sitio de clonación múltiple del vector, seguido de un polipéptido de la región Fc (derivado de un anticuerpo). Esta proteína de fusión se secretó a partir de las células hospedadoras en las que se expresó, y mostró actividad biológica, como se evidenció mediante unión a eck. En otra alternativa, el polipéptido soluble es un fragmento del dominio de unión al receptor de Lerk-7 que retiene la capacidad de unirse a elk o hek.

Cuando inicialmente se expresaba en una célula hospedadora, los polipéptidos Lerk-7 solubles ventajosamente comprenden el péptido señal nativo o uno de los péptidos señal heterólogos descritos más adelante que es funcional dentro de las células hospedadoras empleadas. Las secuencias de ADN aisladas que codifican proteínas Lerk-7 solubles están abarcadas por la presente invención.

Los fragmentos de Lerk-7, que incluyen polipéptidos solubles, se pueden preparar mediante cualquiera de las numerosas técnicas convencionales. Una secuencia de ADN que codifica una Lerk-7 truncada se puede sintetizar químicamente usando técnicas conocidas. Los fragmentos de ADN se pueden producir mediante endonucleas de restricción de una secuencia de ADN clonada de longitud completa, y aislarse mediante electroforesis sobre geles de agarosa. Se pueden utilizar los oligonucleótidos que reconstruyen el extremo 5' ó 3' de un fragmento de ADN en un punto deseado. Los engarces que contienen sitio(s) de escisión de endonbucleasa de restricción se puede(n) emplear para insertar el fragmento de ADN deseado en un vector de expresión. El procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocido también se pueden emplear para amplificar un fragmento de ADN que codifica un fragmento de proteína particular. En la PCR se emplean cebadores que definen los extremos deseados del fragmento de ADN. Como una alternativa adicional, se pueden emplear técnicas de mutagénesis conocidas para insertar un codón de parada en un punto deseado, por ejemplo, inmediatamente cadena abajo del codón para el último aminoácido del dominio de unión a receptor.

Se han descubierto otras proteínas que se unen a tanto hek como elk, y se denominan Lara-1 a Lerk-6 (ligandos de las quinasas relacionadas con eoh). Las Lerk 2 y 5 son proteínas transmembrana de tipo 1, mientras que las Lerks 1, 3, 4, y 6 están ancladas a la membrana celular mediante enlace GPI. El porcentaje de identidad de las secuencias de aminoácidos de estas proteínas varía entre 30 y 59%, y cada proteína tiene cuatro restos cisteína conservados.

Holzman y col., (Mol. Cell. Biol. 10: 5830, 1990) reseñaron la clonación de ADnc para una proteína llamada B61. La capacidad de B61 de unirse a elk y a hek se descubrió posteriormente, y la proteína B61 proporcionó la denominación alternativa Lerk-1 (Beckmann y col., EMBO J. 13: 3757, 1994). B61 también se ha reseñado que es un ligando para la tirosina quinasa receptora descrita anteriormente conocida como eck (Bartley y col., Nature 368: 558, 1994).

Lerk-2, también conocida como ligando elk, se describe en la solicitud PCT WO 94/11384. Tanto Lerk-1 como Lerk-4 se describen en la patente de Estados Unidos Nº 5.516.658. Lerk-5 se describe en la patente de Estados Unidos Nº 6.303.769.

El ADN de Lerk-6 y proteínas de describen en la patente de Estados Unidos Nº 5.919.905. Un clon de ADNc de Lerk-6 murino denominado \lambda13 se aisló a partir de una genoteca de ADNc embrionaria murina de 11,5 días. Una secuencia de ADN sustancialmente completa de la región codificadora del ADNc del clon \lambda13, y la secuencia de aminoácidos codificada por ella, se presentan en esta memoria descriptiva en la SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 2, respectivamente. La fase abierta de lectura dentro de esta secuencia codifica una proteína de 184 aminoácidos. El primer aminoácido de la SEC ID Nº: 2 (Ala) se cree que se localiza en o muy cerca del extremo N nativo. Un lisado celular que contiene el ADNc del clon \lambda13 (ADN del Lerk-6 en \lambdagt10) se depositó con la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, MD, Estados Unidos el 15 de julio de 1994, y número de acceso de cesión común con la presente ATCC 75829.

El ADNc de Lerk-7 de la presente invención se descubrió durante un intento de aislar ADNc que codifica el homólogo humano de Lerk-6 humanos. Un fragmento de ADN de Lerk-6 de ratón se usó como una sonda para seleccionar una genoteca de ADNc humana en un intento por clonar la Lerk-6 humana. Sorprendentemente, un clon de ADNc aislado codificaba una proteína novedosa, la Lerk-7 de la presente invención.

El porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos de la Lerk-7 humana de la SEC ID Nº: 5 con la secuencia de aminoácidos de otras diversas proteínas es como sigue, en el que "h" representa ser humano, "m" representa ratón, y "r" representa rata:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 h Lerk-1 \+  \hskip2cm  \+ 45.771\cr  h
Lerk  -  2 \+ \+ 27.602\cr  r Lerk  -  2 \+
\+ 25.676\cr  m Lerk  -  2 \+ \+ 26.126\cr  h
Lerk  -  3 \+ \+ 42.342\cr  h Lerk  -  4 \+
\+ 42.000\cr  h Lerk  -  5 \+ \+ 25.792\cr  m
Lerk  -  5 \+ \+ 25.114\cr  m Lerk  -  6 \+
\+
55.330\cr}

Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "Lerk-7" se refiere a un género de polipéptidos que son sustancialmente homólogos con la proteína Lerk-7 humana descrita en el ejemplo 1. Los polipéptidos preferiblemente comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica, y más preferiblemente al menos 90% idéntica, a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 5, como se describe adicionalmente más adelante. Los polipéptidos Lerk-7 son capaces de unirse a los receptores descritos anteriormente denominados hek y elk. Ciertos usos de Lerk-7 fluyen de su capacidad de unirse a elk o hek, como se describe en más detalle más adelante.

Lerk-7 también se une al receptor denominado eck (por la quinasa de células epiteliales), que se describe en Lindberg y Hunter (Mol. Cel. Biol. 10: 6316, 1990). Eck se expresa predominantemente en líneas celulares de origen epitelial y en tejidos que contienen una proporción significativa de células epiteliales (Lindnerg y Hunter, anteriormente). Las células que expresan eck incluyen tipos de células tanto normales como cancerosas (Lindberg y Hunter, anteriormente). Los usos adicionales de Lerk-7 fluyen de su capacidad de unirse a eck, como se describe más adelante.

Los ácidos nucleicos y proteínas de Lerk-7 se proporcionan en esta memoria descriptiva. También dentro del alcance de al presente invención son ácidos nucleicos y proteínas de Lerk-7 derivados de otras especies de mamíferos que incluyen pero no se limitan a murino, bovino, porcino, equino, o diversas especies de primates.

Los polipéptidos de Lerk-7 proporcionados en esta memoria descriptiva incluyen variantes de polipéptidos Lerk-7 nativos que conservan actividad una actividad biológica de una v nativa. El término "variantes de Lerk-7" como se usan en esta memoria descriptiva se refiere a polipéptidos que son sustancialmente homólogos a Lerk-7 nativa, pero que tienen una secuencia de aminoácidos diferente de la de una Lerk-7 nativa debido a que una o más supresiones, inserciones o sustituciones. Del mismo modo, los ADNc que codifican Lerk-7 de la presente invención incluyen variantes que difieren de una secuencia de ADN de Lerk-7 nativa de una o más supresiones, inserciones o sustituciones, pero que codifican un polipéptido de Lerk-7 biológicamente activo. El término "biológicamente activo" como se refiere a Lerk-7, indica que la Lerk-7 es capaz de unirse a hek o a elk.

Las secuencias de ADN o aminoácidos variantes preferiblemente son al menos 80% idénticas a una secuencia de Lerk-7 nativa, más preferiblemente al menos 90% idénticas. El porcentaje de identidad se puede determinar, por ejemplo, comparando la información de secuencias usando el programa de ordenador GAP, versión 6.0 descrito por Devereux y col (Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984) y disponible de la Universidad de Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Los parámetros por defecto preferidos para el programa GAP incluyen: (19 una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación de peso de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986, como describen Schwartz y Dayhoff, eds, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353 - 358, 1979; (2) una penalización de 3,0 para cada hueco y una penalización de 0,10 adicional para cada símbolo en cada hueco; y (3) ninguna penalización para huecos finales.

Los polipéptidos de Lerk-7 variantes incluyen de este modo fragmentos de Lerk-7 que conservan la capacidad de unirse a hek o elk. Los ejemplos de polipéptidos de Lerk-7 truncados dentro del alcance de la presente invención son polipéptidos solubles (secretados).

Las realizaciones adicionales de secuencias de aminoácidos variantes son las que comprenden sustituciones conservadoras significando que un resto de aminoácido dado se reemplaza con un resto que tiene características fisicoquímicas similares. Los ejemplos de sustituciones conservadoras de un resto alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu, o Ala por otro, o sustituciones de un resto polar por otro, tal como entre Lys y Arg, Glu y Asp; o Gln y Asn. Otras de tales sustituciones conservadoras, por ejemplo, sustituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobicidad similares, se conocen también. Una(s) sustitución(es) de aminoácidos que contienen Lerk-7 se considera(n) en esta memoria descriptiva que están sustituidas de manera conservadora cuando el polipéptido no nativo resultante conserva una actividad biológica deseada de Lerk-7 nativa.

La invención además incluye polipéptidos Lerk-7 con o sin glicosilación de patrón nativo asociado. Lerk-7 expresada en sistemas de expresión de mamíferos o de levaduras (por ejemplo, células COS-7) puede ser similar a o significativamente diferente de un polipéptido de Lerk-7 nativo en patrón de peso molecular y de glicosilación., dependiendo de la elección del sistema de expresión. La expresión de polipéptidos de Lerk-7 en sistemas de expresión bacterianos, tales como E. coli, proporciona moléculas no glicosiladas.

Los sitios de N-glicosilación en el dominio extracelular de Lerk-7 se pueden modificar para que eviten la glicosilación, permitiendo la expresión análoga de carbohidrato más homogéneo, reducido en sistemas de expresión de mamíferos y de levaduras. Los sitios de N-glicosilación en polipéptidos eucarióticos se caracterizan por un triplete de aminoácidos Asn-X-Y, en el que X es cualquier aminoácido excepto Pro e Y es Ser p Thr. la proteína Lerk-7 humana de la SEC ID Nº: 5 comprende uno o de tales tripletes, en los aminoácidos 17 - 19 de la SEC ID Nº: 5. Las sustituciones, adiciones o supresiones apropiadas a la secuencia de nucleótidos que codifica estos tripletes darán como resultado la prevención de unión de restos de carbohidratos a la cadena lateral Asn. La alteración de un solo nucleótido, elegido de manera que Asn se reemplace por un diferente aminoácido, por ejemplo, es suficiente para inactivar un sitio de N-glicosilación. Los procedimientos conocidos para inactivar los sitios de N-glicosilación en proteínas incluyen las descritas en la patente de Estados Unidos Nº 5.071.972 y el documento EP 276.846.

En otro ejemplo de secuencias variantes que codifican restos Cys que no son esenciales para actividad biológica se pueden alterar de manera que produzcan los restos Cys a suprimir o reemplazar con otros aminoácidos, evitando la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos tras la renaturalización. Los restos cisteína que corresponden a los cuatro cisteínas que se conservan entre las proteínas Lerk se encuentran en las posiciones 42, 70, 82, y 131 de la SEC ID Nº: 5. Para mantener la actividad biológica de la proteína nativa, estas cuatro cisteínas permanecen deseablemente inalteradas.

Otras variantes se preparan mediante modificación de restos de aminoácidos dibásicos adyacentes que potencian la expresión en sistemas de levaduras en los que está presente la actividad de la proteasa KEX2. El documento EP 212.914 describe el uso de una mutágenesis dirigida al sitio para inactivar los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 se inactivan suprimiendo, añadiendo o sustituyendo restos que alteran los pares Arg-Arg, Arg-Lys, y Lys-Arg para eliminar la ocurrencia de estos restos básicos adyacentes. Los emparejamientos Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles a la escisión por KEX2, y la conversión fr Arg-Lys o Lys-Arg a Lys-Lys representa un planteamiento conservador y preferido para inactivar los sitios de KEX2. La Lerk-7 humana contiene dos sitios de procesamiento de la proteasa KEX2, en los aminoácidos 78 - 79 y 128 - 129 de la SEC ID Nº: 5.

Las variantes o alelos de Lerk-7 de origen natural también están abarcados por la invención. Los ejemplos de tales variantes son proteínas que se producen a partir de casos de ayuste de ARNm alternativos o a partir de la escisión proteolítica de la proteína Lerk-7, en la que se conserva la propiedad de unión a elk o hek. El ayuste alternativo de ARNm puede producir una proteína Lerk-7 truncada pero biológicamente activa, por ejemplo, tal como una forma soluble de origen natural de la proteína. Las variaciones atribuibles a proteolisis incluyen, por ejemplo, diferencias en los extremos N o C tras la expresión en diferentes tipos de células hospedadoras, debido a la eliminación proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de la proteína Lerk-7 (generalmente entre los aminoácidos terminales 1 - 5).

Con relación a la descripción anterior del péptido señal y diversos dominios de la proteína Lerk-7, los expertos en la técnica reconocerán que las demarcaciones anteriormente descritas de tales regiones de la proteína están aproximadas. Por ejemplo, aunque los programas de ordenador que predicen el sitio de escisión de un péptido señal están disponibles, se produce escisión en los sitios distintos de los predichos. Además, se reconoce que una preparación de proteína puede comprender una mezcla de moléculas de proteínas que tienen diferentes aminoácidos N-terminal, debido a la escisión del péptido señal en uno o más sitios. Además, el procesamiento post-traduccional puede variar según el sistema de expresión particular empleado. De este modo, por ejemplo, el aminoácido N- o C-terminal de una proteína recombinante puede variar según el tipo de células hospedadoras en las que se expresa la proteína.

Las variantes y derivados de proteínas Lerk-7 nativas se pueden preparar mediante mutación de secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos de Lerk-7 nativos. Las mutaciones se pueden introducir en loci particulares sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permiten la ligación a fragmentos de la secuencia nativa. Después de la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución, o supresión de aminoácidos deseada. Como alternativa, los procedimientos de mutagénesis específica del sitio dirigida a nucleótidos se pueden emplear par introducir una mutación deseada. Los procedimientos para realizar tales alteraciones incluyen las descritas por Walder y col. (Gene 42; 133, 1986); Bauer y col. (Gene 37: 73, 1985); Craik (BioTechniques, enero de 1985, 12 - 19); Smith y col. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel) Proc. Natl Acad. Sci. USA 82: 488, 1985); Kunkel y col. (Methods in Enzymol. 154: 367, 1987); y las patentes de Estadios Unidos Números 4.518.584 y 4.737.462.

La Lerk-7 se puede modificar para crear derivados de Lerk-7 mediante la formación de conjugados covalentes o acumulativos con otros restos químicos, tales como grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Los derivados covalentes de Lerk-7 se pueden preparar mediante la unión de restos químicos a grupos funcionales sobre cadenas laterales de aminoácidos de Lerk-7 o en el extremo N o el extremo C de un polipéptido de Lerk-7 o el dominio extracelular de los mismos. Otros derivados de Lerk-7 dentro del alcance de esta invención incluyen conjugados acumulativos o covalentes de polipéptidos de Lerk-7 con otras proteínas o polipéptidos, tales como mediante al síntesis en cultivos recombinantes como fusiones N-terminal o C-terminal.

Las fusiones de polipéptidos de Lerk-7 pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación e identificación de Lerk-7. Tales péptidos incluye, por ejemplo, poli-His o los péptidos de identificación antigénicos descritos en la patente de Estados Unidos Nº 5.011.912 y en Hopp y col., BioTechnology 6: 1204, 1988. Uno de tales péptidos es el péptido Flag®, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, que es altamente antigénico y proporciona un epítope unido reversiblemente mediante un anticuerpo monoclonal específico, que permite un ensayo rápido y fácil purificación de la proteína recombinante expresada. Un hibridoma murino denominado 4E11 produce un anticuerpo monoclonal que se une al péptido Flag® en presencia de ciertos cationes metálicos divalentes, como se describe en la Patente de Estados unidos 5.011.912. La línea celular de hibridoma 4E11 se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo bajo el número de acceso HB 9259. Los anticuerpos monoclonales que se unen al péptido Flag® están disponibles de Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, Connecticut.

Debido a la degeneración conocida del código genético, en el que más de un codón puede codificar el mismo aminoácido, una secuencia de ADN puede variar entre la mostrada en la SEC ID Nº: 4 y todavía codifica una proteína Lerk-7 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 5. Tales secuencias de ADN variantes se pueden producir a partir de mutaciones silenciosas (por ejemplo, las que se producen durante la amplificación por PCR), o pueden ser el producto de mutagénesis deliberada de una secuencia nativa. De este modo, la presente invención proporciona secuencias de ADN aisladas seleccionadas entre secuencias de ADN de Lerk-7 nativas (por ejemplo, ADNc que comprende la secuencia de nucleótidos presentada en al SEC ID Nº: 4) y el ADN que se degenera como resultado del código genético a una secuencia de ADN de Lerk-7 nativa.

Las variantes de Lerk-7 que poseen la capacidad de unirse a hek o elk se pueden identificar mediante cualquier ensayo adecuado. La actividad biológica de una variante de Lerk-7 se puede determinar, por ejemplo, ensayando para la capacidad de variante de competir con una Lerk-7 nativa para unirse a hek o elk (es decir, ensayos de unión competitiva).

Los ensayos de unión competitiva se pueden realizar siguiendo la metodología convencional. Los reactivos que se pueden emplear en ensayos de unión competitiva incluyen células que expresan hek/elk intactas y Lerk-7 solubles, marcadas radiactivamente. Por ejemplo, Lerk-7 nativa marcada radiactivamente se pueden usar para competir con una variante de Lerk-7 para unirse a hek o elk unida a la superficie celular. En lugar de células intactas, se podría sustituir una proteína de fusión soluble hek/Fc o elk/Fc unida a una fase sólida a través de la interacción de la proteína A o proteína G con el resto Fc. Las columnas de cromatografía que contienen proteína A y Proteína G incluyen las disponibles de Pharmacia Biotech, Inc., Pisacataway, NJ. Otro tipo de ensayo de unión competitiva utiliza hek o elk soluble marcado radiactivamente, tales como proteína de fusión hek/Fc o elk/Fc, y células intactas que expresan Lerk-7. Los resultados cualitativos se pueden obtener mediante ensayos de unión en placa autorradiográficos competitivos, o los estudios Scatchard se pueden utilizar para generar resultados cuantitativos.

La actividad biológica de una proteína de Lerk-7 nativa o fragmento de la misma expresados en un sistema de expresión particular se puede confirmar usando ensayos de unión competitiva. Por ejemplo, la Lerk-7 se puede ensayar para evaluar la capacidad de competir con una de las otras proteínas de Lerk-7 (por ejemplo Lerk-6) para unirse a elk o hek.

Lerk-7 también se une al receptor conocido como eck (Lindberg y Hunter, Mol. Cell. Biol. 10: 6316, 1990). Es posible que la Lerk-7 de la presente invención se unirá a otros receptores de la familia eph (véase al sección de antecedentes). Tal unión se puede analizar usando un ensayo adecuado análogo a los descritos anteriores y en los ejemplos 4 y 7.

Los usos de Lerk-7 que fluyen de la capacidad de unirse a elk, hek, y eck incluyen, pero no se limitan a, los siguiente. Lerk-7 encuentra uso como un reactivo de purificación de proteínas. Los polipéptidos Lerk-7 se pueden unir a un material de soporte sólido y usarse para purificar proteínas hek, elk, o eck mediante cromatografía de afinidad. En ciertas realizaciones, los fragmentos Lerk-7 o proteínas de fusión (por ejemplo, fusiones Lerk-7/Fc) que contienen el dominio de unión al receptor de Lerk-7 se unen al soporte sólido. Los polipéptidos se pueden unir a un material de soporte sólido mediante procedimientos convencionales. Como ejemplo, están disponibles las columnas de cromatografía que contienen grupos funcionales que reaccionarán con grupos funcionales sobre cadenas laterales de aminoácidos de proteínas (Pharmacia Biotech, Inc., Pisacataway, NJ). Las proteínas de fusión Lerk-7/Fc se pueden unir a columnas de cromatografía que contienen proteína A o Proteína G mediante interacción con el resto Fc.

Las proteínas Lerk-7 también encuentran uso en células purificadoras que expresan hek, elk, o eck sobre la superficie celular. La Lerk-7 (o fragmentos de fusión de la misma) se une a una fase sólida tal como una matriz de cromatografía en columna o un sustrato adecuado similar. Por ejemplo, se pueden revestir microesferas magnéticas con y mantenerse en un recipiente de de incubación mediante un campo magnético. Las suspensiones de mezclas celulares que contienen células que expresan hek/elk/ack se ponen en contacto con la fase sólida que tiene Lerk-7 en ellas. Las células que expresan hek o elk o eck sobre la superficie celular se unen a la Lerk-7 fijada, y las células no unidas que se retiran por lavado. Este procedimiento de unión de afinidad es útil para purificar o identificar tales células que expresan hek/elk/eck.

Los procedimientos de liberación de células seleccionadas positivamente de la fase sólida se conocen en la técnica y abarcan, por ejemplo, el uso de enzimas. Las enzimas adecuadas son no tóxicas y no nocivas a las cálulas y se dirigen preferiblemente a escisión se las proteínas hek o elk o eck, por lo tanto liberando la suspensión de células resultante del material de Lerk-7 "extraño".

La población de células purificadas, especialmente si se obtienen se tejido fetal, después de pueden usar para repoblar tejidos maduros (adultos). Por ejemplo, células neurales que expresan elk se pueden aislar mediante el procedimiento anterior, después de administran a un mamífero aquejado de un trastorno neurodegenerativo.

Como alternativa, se pueden incubar primero mezclas de células sospechosas de contener células hek/elk^{+} con Lerk-7 biotinilada. Los períodos de incubación están típicamente al menos una hora de duración para asegurar unión suficiente a hek/elk. Después la mezcla resultante se pasa a través de una columna compactada con perlas recubiertas con avidina, mediante la cual la alta afinidad de biotina para avidina proporciona la unión de la célula a las perlas. El uso de perlas recubiertas de avidina se conoce en la técnica. Véase Berenson, y col., J. Cell. Biochem., 10D: 239 (1986). El lavado de material no unido y la liberación de las células unidas y la liberación de las células unidas se realiza usando procedimientos convencionales.

De este modo Lerk-7 se puede emplear en al separación o purificación de los tipos de células descritos anteriormente que expresan hek o elk. Lerk-7 también encuentra uso en al identificación de tipos adicionales de células que expresan hek o elk sobre la superficie celular. Lerk-7 se puede conjugar a un resto detectable tal como un radionúclido para detectar células que expresan hek/elk. Como ejemplo, el marcado radiactivo con ^{125}I se puede realizar mediante cualquiera de varias metodologías convencionales que producen una molécula de 1 Lerk-7 marcada con ^{125}I para con alta actividad específica. Otro resto detectable tal como una enzima que puede catalizar una reacción colorimétrica o fluorométrica, se puede usar biotina o avidina. Las células a ensayar para evaluar la expresión de hek/elk se pueden poner en contacto con Lerk-7 marcadas. Después de incubación, la Lerk-7 marcada no unida se retira y se determina la presencia o ausencia del resto detectable sobre las células.

Las proteínas Lerk-7 también se pueden emplear para medir la actividad biológica de proteínas elk o hek en términos de su afinidad de unión para Lerk-7. Las proteínas Lerk-7 así encuentran uso como reactivos que se pueden emplear llevando a cabo estudios de "control de calidad", por ejemplo, para controlar la semivida y estabilidad de proteína elk o hek en diferentes condiciones. Como ejemplos adicionales, v se usa en al determinación de si se mantiene la actividad biológica después de la modificación o una proteína elk o hek (por ejemplo, modificación, truncamiento, mutación química, etc.). De este modo la actividad biológica de una proteína elk o hek se puede determinar antes de que se use en un estudio de investigación, o por ejemplo, posiblemente en la clínica.

Como ilustración, Lerk-7 se emplea en un estudio de afinidad de unión para medir la actividad biológica de una proteína elk que se ha almacenado a diferentes temperaturas, o producirse en tipos de células diferentes. La afinidad de unión de la proteína elk modificada para Lerk-7 se compara con la de una proteína elk no modificada para detectar cualquier impacto adverso de las modificaciones sobre la actividad biológica de elk. De manera similar, la actividad biológica de una proteína hek se puede determinar usando Lerk-7.

Los polipéptidos de Lerk-7 también encuentran uso como vehículos para distribuir agentes unidos a los mismos a células que llevan el receptor de la superficie celular elk o hek. La expresión de antígeno hek se ha reseñado para ciertas líneas celulares leucémicas, incluyendo la línea celular de leucemia de células T humana denominada JM y la línea celular de leucemia de células pre-B humana denominada LK63 (Boyd y col., J. Biol. Chem. 267: 3262, 1992, y Wicks y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 1611, 1992). De este modo las proteínas Lerk-7 se pueden usar para distribuir agentes de diagnóstico o terapéuticos a estas células (o a otros tipos de células encontrados que expresan hek o elk sobre la superficie celular) en procedimientos in vitro o in vivo.

Un ejemplo de tal uso es exponer una línea celular leucémica hek^{+} a un conjugado agente terapéutico/ Lerk-7 para determinar si el agente muestra citotoxicidad hacia las células leucémicas. Un número de diferentes agentes terapéuticos unidos a Lerk-7 se pueden incluir en un ensayo para detectar y comparar el efecto citotóxico de los agentes sobre las células leucémicas. Los conjugados Lerk-7/agente de diagnóstico se puede emplear para detectar la presencia de células hek^{+} in vitro o in vivo.

Los agentes de diagnóstico o terapéuticos que se pueden unir a un polipéptido de Lerk-7 incluyen, pero no se limitan a, fármacos, toxinas, radionúclidos, cromóforos, enzimas que catalizan una reacción colorimétrica o fluorométrica, y similares, con el agente particular que se elige según la aplicación propuesta. Los ejemplos de fármacos incluyen los usados en el tratamiento de diversas formas de cáncer, por ejemplo, mostazas de nitrógeno tal como una mostaza de nitrógeno de L-fenilalanina o ciclofosfamida, intercalando agentes tales como cis-diaminodicloroplatino, antimetabolitos tales como 5-fluorouracilo, alcaloides vinca tales como vincristina, y antibióticos tales como bleomicina, doxorubicina, daunorubicina, y los derivados de los mismos. Entre las toxinas están ricina, abrina, toxina de difteria, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, proteínas inactivadotas de ribosoma, micotoxinas tales como tricotecenas, y derivados y fragmentos (por ejemplo, cadenas individuales) de los mismos. Los radionúclidos adecuados para uso diagnóstico incluyen, pero no se limitan a, ^{123}I, ^{131}I, ^{99m}Tc, ^{111}In, y ^{76}Br. Los radionúclidos adecuados para uso terapéutico incluyen, pero no se limitan a, ^{131}I, ^{211}At, ^{77}Br, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{212}Pb, ^{212}Bi, ^{109}Pg, ^{64}Cu, y ^{67}Cu.

Tales agentes se pueden unir a la Lerk-7 mediante cualquier procedimiento convencional adecuado. Lerk-7, que es una proteína, comprende grupos funcionales sobre cadenas laterales de aminoácidos que se pueden hacer reaccionar con grupos funcionales sobre un agente deseado para formar enlaces covalentes, por ejemplo. Como alternativa, la proteína o agente se puede derivatizar para generar o unirse a un grupo funcional reactivo deseado. La derivatización puede incluir la unión de uno de los reactivos de acoplamiento bifuncionales disponibles para unir diversas moléculas a proteínas (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Se conocen numerosas técnicas para marcar radiactivamente proteínas. Los metales radionúclidos se pueden unir a Lerk-7 usando por ejemplo, un agente quelante bifuncional adecuado.

De este modo se preparan los conjugados que comprenden Lerk-7 y un agente de diagnóstico o terapéutico (preferiblemente unido covalentemente). Los conjugados se administran o de otra manera se emplean en una cantidad apropiada para la aplicación particular.

Otro uso de la Lerk-7 de la presente invención es una herramienta de trabajo para estudiar el papel que Lerk-7, en unión con elk o hek, puede jugar en el crecimiento o diferenciación de células que llevan el receptor de elk o hek. Los polipéptidos de Lerk-7 de la presente invención también se pueden emplear en ensayos in vitro para la detección de elk o Lerk-7 o las interacciones de los mismos. De manera similar, Lerk-7 encuentra uso en ensayos para evaluar la interacción de Lerk-7 con hek. Se ha sugerido la posibilidad de que hek juegue un papel en la génesis de tumores (Boyd y col., anteriormente). La proteína Lerk-7 es útil para investigar qué efecto de unión de Lerk-7 a hek puede tener sobre la generación de tumores.

Aunque ciertos uso de Lerk-7 se ilustran en esta memoria descriptiva con relación a las propiedades de unión a elk o a la unión a hek, se entiende que usos análogos que surgen de la capacidad de Lerk-7 de unirse a eck. Los ejemplos de tipos de células cancerosas que expresan eck son la línea HeLa de células epiteliales humana, una línea de células de carcinoma epidérmico humana denominada A431 (Lindberg y Hunter, anteriormente), líneas celulares de melanoma (Easty y col., Cancer Research, 55: 2528, 1995) y la línea HT29 de células de carcinoma adeno de colon humana. Lerk-7 se puede usar para distribuir agentes terapéuticos o de diagnóstico a tales células, como se ha descrito anteriormente con respecto a las células que llevan hek.

Los ácido nucleicos de Lerk-7 se pueden emplear en la detección de defectos del gen de Lerk-7, por ejemplo, en un ensayo in vitro llevado a cabo sobre muestras de ADN derivadas de un individuo a ensayarse para evaluar tal defecto. El ADN de la presente invención se puede emplear en el reemplazo de genes de Lerk-7 defectuosos, por ejemplo, en procedimientos de terapias génicas.

Como se ha descrito anteriormente, cuando se analizaron diversos tejidos de rata para evaluar ARNm de elk, se detectaron solamente en cerebro y testículos (Lhotak y col., anteriormente) La unión de Lerk-7 a elk sobre tejido neural puede ejercer un efecto neuroprotector o neurotrófico.

Lerk-7 encuentra uso como reactivo de cultivo de tejidos. Una proteína Lerk-7 se puede añadir a neuronas cultivadas in vitro para potenciar la viabilidad o prolongar la durabilidad de las neuronas cultivadas, facilitando de este modo estudios de investigación, y posible tratamiento clónico de tejido neural.

La proteína Lerk-7 descrita anteriormente se ha encontrado que ejerce un efecto neurotrófico o neuronal del hipocampo, y proteger las neuronas contra la excitotoxicidad mediada por glutamato. Del mismo modo la Lerk-7 puede mostrar propiedades neuroprotectoras o neurotróficas. De este modo Lerk-7 puede encontrar uso en un procedimiento para tratar trastornos de tejido neural, que implica poner en contacto el tejido neural con Lerk-7. Tales trastornos incluyen lesión o enfermedades neurológicas, o bien crónicas o agudas. El uso de Lerk-7 en la preparación de un medicamento para tratar enfermedad o lesión de tejido neural se contempla en esta memoria descriptiva.

Las composiciones que comprenden una cantidad eficaz de un polipéptido de Lerk-7 de la presente invención, en combinación con otros componentes tales como un diluyente, vehículo o excipiente adecuado, se proporcionan es esta memoria descriptiva. La Lerk-7 se puede formular según procedimientos conocidos usados para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. La Lerk-7 se puede combinar en mezcla, o bien como el material activo solo o con otros materiales activos conocidos, con diluyentes farmacéuticamente adecuados (por ejemplo, solución salina, Tris-HCl, acetato, y soluciones tamponadas con fosfato), conservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenos), emulsionantes, solubilizantes, adyuvantes y/o vehículos. Los vehículos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, edición 16ª de 1980, Mack Publishing Company.

Además, tales composiciones pueden contener Lerk-7 complejada con polietilenglicol (PEG), iones metálicos, o incorporados en compuestos poliméricos tales como ácido poliacético, ácido poliglicólico, hidrogeles, dextrano, etc., o incorporados en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares fantasmas de eritrocitos o esferoblastos. Tales composiciones influenciarán el estado físico, solubilidad, estabilidad velocidad de liberación in vivo, y velocidad de eliminación in vivo de v, y de este modo se eligen según la aplicación propuesta. Como alternativa, Lerk-7 es une por GPI a un sustrato, en el que el sustrato está compuesto de material fisiológicamente aceptable que tiene una composición adecuada para unión de Lerk-7 mediante enlaces GPI. El sustrato que lleva Lerk-7 se puede implantar quirúrgicamente. Lerk-7 también se puede conjugar a anticuerpos contra receptores, ligandos o antígenos, específicos de tejidos, o acoplados a receptores específicos de tejidos.

Tales composiciones pueden contener un polipéptido de ligandos o antígenos, en cualquier forma descrita en esta memoria descriptiva, tales como proteínas nativas, variantes, derivados, fragmentos biológicamente activos u oligómeros. En una realización, la composición comprende un polipéptido de ligandos o antígenos, soluble.

La Lerk-7 se puede administrar en cualquier manera adecuada, por ejemplo, por vía tópica, parenteral, o mediante inhalación. El término "parenteral" incluye inyección, por ejemplo, mediante vías subcutánea, intravenosa, o intramuscular, también incluyendo inyección localizada, por ejemplo, en un sitio de enfermedad o lesión. La liberación sostenida a partir de implantes también está contemplada. Las dosificaciones adecuadas y concentraciones de fármaco adecuadas contenidas en las composiciones pueden variar dependiendo de muchos factores, incluyendo el uso propuesto, peso corporal y edad del paciente, y vía de administración. Preliminarmente las dosis de pueden determinar según ensayos en animales, y la escala de dosificaciones para administración humana se puede realizar según las prácticas aceptadas en la técnica.

Formas oligoméricas de Lerk-7

Los polipéptidos de Lerk-7 están abarcados por la presente invención en la forma de oligómeros, tales como dímeros, trímeros, u oligómeros más altos unidos covalentemente o no unidos covalentemente. Tales oligómeros pueden ser de origen natural o producidos mediante tecnología de ADN recombinante. Los oligómeros se pueden unir mediante enlaces disulfuros formados entre restos cisteína sobre polipéptidos de Lerk-7 diferentes.

Los oligómeros de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, oligómeros que comprenden dos a cuatro polipéptidos de Lerk-7. En una realización, los polipéptidos de Lerk-7 son solubles.

Como alternativa, se prepara un oligómero de Lerk-7 usando polipéptidos derivados de inmunoglobulinas. Se ha descrito la preparación de proteínas de fusión que comprenden ciertos polipéptidos heterólogos condensados a diversas porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (incluyendo el dominio Fc), por ejemplo, mediante Ashkenazi y col., (PNAS USA 88: 10535, 1991), Byrn y col., (Nature 344; 677, 1990), y Hollenbaugh y col., (Current Protocols in Immunology, Supl. 4, 1992, pp. 10.19.1 - 10.19.11), incorporada en esta memoria descriptiva por referencia. Una realización de la presente invención se refiere a un dímero de Lerk-7 creado mediante la fusión de Lerk-7 a la región Fc de un anticuerpo (por ejemplo, IgG1) de una manera que no interfiere con la unión de Lerk-7 al dominio de unión de ligando de hek o elk. El polipéptido Fc preferiblemente se condensa al extremo C de una Lerk-7 soluble que comprende solamente el dominio extracelular.

Una fusión génica que codifica la proteína de fusión Lerk-7/Fc se inserta en un vector de expresión apropiado. Las proteínas de fusión Lerk-7/Fc se expresan en células hospedadoras transformadas con el vector de expresión recombinante, y se dejan ensamblar a muchas moléculas de tipo anticuerpo, después de lo cual se forman enlaces diulfuro intercadena entre polipéptidos de Fc, produciendo Lerk-7 divalente. Si las proteínas de fusión se realizan con tanto cadenas pesadas como ligeras de un anticuerpo, es posible formar un oligómero de Lerk-7 con tantas como cuatro regiones extracelulares de Lerk-7.

En esta memoria descriptiva se proporcionan proteínas de fusión que comprendan un polipéptido de Lerk-7 condensado a un polipéptido de Fc derivado de un anticuerpo. También se proporcionan ADN que codifica tales proteínas de fusión, así como dímeros que contienen dos proteínas de fusión unidas mediante enlaces disulfuro entre restos Fc de los mismos. El término "polipéptido de Fc" como se usa en esta memoria descriptiva incluye formas nativas y de muteína de polipéptidos derivados de la región de Fc de un anticuerpo. También se incluyen formas truncadas de tales polipéptidos que contienen la región bisagra que promueve la dimerización. Un polipéptido de Fc adecuado, descrito en la solicitud PCT WO 93/10151, es un polipéptido de cadena individual que se extiende desde la región bisagra N terminal al extremo C nativo. Una muteína de este polipéptido de Fc se describe en el ejemplo tres más adelante. La muteína muestra afinidad reducida por los receptores de Fc.

Un procedimiento para preparar Lerk-7 oligomérica implica el uso de una cremallera de leucina. Los dominios de cremallera de leucina son péptidos que promueven oligomerización de las proteínas en los que se encuentran. Las cremalleras de leucina se identificaron originalmente en varias proteínas de unión a ADN (Landschulz y col., Science, 240: 1759, 1988), y después se ha encontrado en una diversidad de proteínas diferentes. Entre las cremalleras de leucina conocidas son péptidos de origen natural y derivados de los mismos que se dimerizan o trimerizan. Los ejemplos de dominios de cremallera de leucina útiles para producir proteínas oligoméricas solubles se describen en la solicitud PCT WO 94/10308. En una realización, las proteínas recombinantes que comprenden un polipéptido de Lerk-7 soluble condensado a un péptido que se dimeriza o trimeriza en solución se expresan en células hospedadoras adecuadas. Los oligómeros de Lerk-7 se recuperan del medio de cultivo.

Como alternativa, el oligómero es una proteína es una proteína de fusión que comprende polipéptidos de Lerk-7 múltiples, con o sin péptidos espaciadores entre los restos de Lerk-7. Tales proteínas de fusión se producen mediante tecnología de ADN recombinante. En una realización, una proteína de fusión comprende dos o más polipéptidos de Lerk-7 solubles, separados por engarces peptídicos.

Los oligómeros tiene la propiedad de sitios de unión bivalente, trivalente, etc. para elk o hek. Además, las proteínas de fusión descritas anteriormente que comprenden restos Fc (y oligómeros formados a partir de los mismos) ofrecen la ventaja de fácil purificación mediante cromatografía de afinidad sobre columnas de proteína a o proteína
G.

Sistemas de expresión

Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de polipéptidos Lerk-7 incluyen células de procariotas, de levaduras o de eucariotas superiores. Los vectores de clonación y expresión adecuados para uso con huéspedes bacterianos, fúngicos, de levaduras, y de mamíferos se describen, por ejemplo, en Pouwels y col. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, (1985). Los sistemas de traducción libres de células también de podrían emplear para producir polipéptidos de Lerk-7 usando ARN derivados de construcciones descritas en esta memoria descriptiva.

El vector de expresión puede incluir ADN que codifica un péptido señal o guía condensado al extremo N o un polipéptido de v. El péptido señal o guía dirige co-traduccionalmente o post-traduccionalmente la transferencia de la Lerk-7 desde su sitio de síntesis a un sitio en el interior o exterior de la membrana celular o pared celular. El péptido señal o guía se escinde del polipéptido de v maduro. La elección del péptido señal o guía depende del tipo de célula hospedadora que se emplea.

Las células hospedadoras procarióticas adecuadas para transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y otras diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus. En una célula hospedadora procariótica, tal como E. coli, un polipéptido de Lerk-7 puede incluir un restos metionina N-terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula hospedadora procariótica. La Met N-terminal se puede escindir del polipéptido de Lerk-7 recombinante expresado.

Los polipéptidos de Lerk-7 se pueden expresar en células hospedadoras de levaduras, preferiblemente del género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae). También se puede emplear otros géneros de levaduras, tales como Pichia, K. lactis o Kluyveromyces. Los vectores de levaduras pueden contener un origen de secuencia de replicación de un plásmido de levadura de 2 \mu, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias para poliadenilación, secuencias para terminación de transcripción, y un gen marcador seleccionable.

Las secuencias promotoras adecuadas para vectores de levaduras incluyen, entre otras, promotores para metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg. 7; 149, 1968; y Holland y col., Biochem. 17: 4900, 1978), tal como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinsa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa. Otra alternativa es el promotor ADH2 que se puede reprimir por glucosa descrito por Russell y col. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) y Beier y col. (Nature 300: 724, 1982). Otros vectores adecuados y promotores para uso en expresión de levaduras se describen adicionalmente en el documento de Hitzeman, EPA-73.657 o en Fleer y col., Gene, 107: 285-195 (1991); y van den Berg y col., Bio/Technology, 8: 135-139 (1990). Los vectores de transferencia replicables tanto en levaduras como en E. coli se pueden construir insertando secuencias de ADN de pBR322 para selección y replicación en E. coli (den Amp^{r} y origen de replicación) en los vectores de levaduras descritos anteriormente.

Una secuencia guía adecuada (por ejemplo, la guía del factor \alpha de Saccharomyces) se puede emplear para dirigir la secreción del polipéptido de Lerk-7 de las células de levaduras. La secuencia guía del factor \alpha generalmente se inserta entre la secuencia promotora y la secuencia génica estructural. Véase, por ejemplo, Kurjan y col., Cell, 30: 933, 1982; Bitter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 5330, 1984; Patente de Estados Unidos 4.546.082; y documento EP 324.274. Los expertos en la técnica conocen otras secuencias guías adecuadas para facilitar la secreción de polipéptidos recombinantes de huéspedes de levaduras. Una secuencia guía se puede modificar cerca de su extremo 3' para que contenga uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia guía al gen estructural.

Los protocolos de transformación de levaduras los conocen los expertos en la técnica. Uno de tales protocolos lo describe Hinnen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978. El protocolo de Hinnen y col., selecciona transformantes de Trp^{+} en un medio selectivo, en el que el medio selectivo consta de base de nitrógeno de levadura al 0,67%, casa aminoácidos al 0,5%, glucosa al 2%, 10 \mug/ml de adenina y 20 \mug/ml de uracilo.

Las células hospedadoras de levaduras transformadas por vectores que contienen la secuencia promotora de ADH2 se pueden cultivar para inducir la expresión en un medio "rico". Un ejemplo de un medio rico es uno constituido por extracto de levadura al 1%, peptona al 2%, y glucosa suplementada con 80 \mug/ml de adenina y 80 \mug/ml de uracilo. La depresión del promotor ADH2 se produce cuando la glucosa se acaba en el medio.

Los sistemas de cultivo de células hospedadoras de mamíferos o insectos también se pueden emplear para expresar polipéptidos de Lerk-7 recombinantes. Los sistemas de baculovirus para producción de proteínas heterólogas en células de insectos están revisadas por Luckow y Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988). También se pueden emplear líneas celulares establecidas de origen mamífero. Los ejemplos de líneas celulares de huéspedes de mamíferos adecuados incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651; Gluzman y col., Cell 23: 175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, la línea celular BHK (ATCC CRL 10) y la línea celular CV-1/EBNA derivada de la línea celular de riñón de mono verde africano CV1 (ATCC CCL 70) como describen McMahan y col (EMBO J. 10: 2821, 1991).

Las secuencias de control transcripcional y traduccional para vectores de expresión de células hospedadoras de mamíferos se pueden escindir de genomas virales. Las secuencias promotoras usadas comúnmente y secuencias potenciadotas se derivan de virus polioma, Adenovirus 2, virus 40 de simio (SV40), y citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral de SV40, por ejemplo, origen SV40, promotor temprano y tardío, potenciador, ayuste, y sitios de poliadenilación se pueden usar para proporcionar otros elementos genéticos para expresión de una secuencia génica estructural en una célula hospedadora de mamífero. Promotores tempranos y tardíos virales son particularmente útiles debido a que ambos se pueden obtener fácilmente de un genoma viral como un fragmento que también puede contener un origen viral de replicación (Fiers y col., Nature 273: 113, 1978). También se pueden usar fragmentos menores o mayores de SV40, con tal que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pares de bases que se extienda desde el sitio Hind III hacia el sitio Bgl I localizado en el origen de replicación viral de SV40.

Los ejemplos de vectores de expresión para uso en células hospedadoras de mamíferos se pueden construir como describen Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983). Un sistema útil para la expresión de alto nivel estable de ADNc de mamífero en células epiteliales de mamífero murino C127 se pueden construir sustancialmente como describen Cosman y col (Mol. Immunol 23: 935, 1986). Un vector útil de alta expresión, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman y col., Nature 312: 768, 1984 se ha depositado como ATCC 39890. Los vectores de expresión de mamífero útiles adicionales se describen en el documento EP-A-0367566, y en el documento WO 91/18982. Los vectores se pueden derivar de retrovirus. En lugar de la secuencia señal nativa, se puede añadirla secuencia señal heteróloga, tal como la secuencia señal para la IL-2 descrita en la patente de Estados Unidos 4.965.195; la secuencia señal para la IL-2 descrita en Cosman y col., Nature 312: 768 (1984); el péptido señal de IL-4 descrito en el documento EP 367.566; el péptido señal receptor de IL-1 de tipo I descrito en la patente de Estados Unidos 4.968.607; y el péptido señal receptor de IL-1 de tipo II descrito en el documento EP 460.846.

Proteína de Lerk-7

Los polipéptidos de Lerk-7 de la presente invención se pueden producir mediante sistemas de expresión recombinante como se ha descrito anteriormente, o purificarse a partir de células de origen natural. Un procedimiento para producir Lerk-7 comprende el cultivo de una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica Lerk-7 en condiciones suficientes para promover la expresión de Lerk-7. La v se recupera después del medio de cultivo o extractos celulares, dependiendo del sistema de expresión empleado. En una realización, una proteína Lerk-7 humana comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína que se expresa mediante células hospedadoras transformadas con un vector de expresión que contiene el ADNc de Lerk-7 encontrado en la cepa ATCC 75959.

Como conocen los expertos en la técnica, los procedimientos para purificar una proteína recombinante variará según factores tales como el tipo de células hospedadoras empleadas y si la proteína recombinante está secretada o no en el medio de cultivo. Otras consideraciones incluyen los tipos de contaminantes que se tienen que retirar, los cuales se pueden variar según las células hospedadoras particulares empleadas para expresar la proteína deseada.

Por ejemplo, cuando se emplean sistemas de expresión que secretan la proteína recombinante el medio de cultivo primero se puede concentrar usando un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Pellicon de Amicon O Millipore. Después de la etapa de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación tal como una matriz de filtración de gel. Como alternativa, se puede emplear una resina de intercambio aniónica, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos de dietilaminoetilo (DEAE) pendientes. Las matrices pueden ser archilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros materiales de soporte empleados comúnmente en al purificación de proteínas. Como alternativa, se puede emplear una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren grupos sulfopropilos. Además, se puede emplear una o más etapas de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) que emplean medio de RP-HPLC hidrófobo (por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos metilo u otros alifáticos pendientes). Alguna o todas las etapas anteriores, en diversas combinaciones, se pueden emplear para proporcionar una proteína de Lerk-7 purificada.

Una alternativa adicional es cromatografía de afinidad, que emplea una matriz de cromatografía que contiene hek, elk, o un anticuerpo reactivo con Lerk-7. Los polipéptidos de Lerk-7 se pueden recuperar de una columna de afinidad usando técnicas convencionales, (por ejemplo, elución en un tampón con alta concentración de sal), después de dializa en un tampón de baja concentración de sal para uso.

La proteína recombinante producida en cultivo bacteriano se puede aislar mediante fragmentación inicial de las células hospedadoras, centrifugación, extracción de los sedimentos celulares si un polipéptido insoluble, o a partir del fluido sobrenadante si un polipéptido soluble, seguido de una o más etapas de cromatografía de concentración, precipitación por sales, intercambio iónico, purificación por afinidad o exclusión de tamaño. Finalmente, se puede emplear RP-HPLC para etapas de purificación final. Las células microbianas se pueden fragmentar mediante cualquier procedimiento conveniente, incluyendo ciclo congelación-descongelación, sonicación, fragmentación mecánica, o uso de agentes de lisado celular.

La Lerk-7 se expresa preferiblemente como un polipéptido secretado en células hospedadoras de levaduras, con el fin de simplificar la purificación. El polipéptido recombinante secretado de una fermentación de células hospedadoras de levaduras se puede purificar mediante procedimientos análogos a los descritos por Urdal y col. (J. Chromatog. 296: 171, 1984). Urdal y col., describen dos etapas de HPLC de fase inversa secuenciales para la purificación de IL-2 humana recombinante sobre una columna de HPLC recombinante.

El grado deseado de pureza depende del uso propuesto de la proteína. Por ejemplo se desea un grado relativamente alto de pureza cuando la proteína se va a administrar in vivo. De manera ventajosa, los polipéptidos de Lerk-7 se purifican de manera que ninguna banda de proteína correspondiente a otras proteínas sean detectables tras análisis mediante electroforesis en gel SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Los expertos en la técnica reconocerán múltiples bandas correspondientes a la proteína de Lerk-7 se puede visualizar mediante SDS-PAGE, debido a la glicosilación diferencial, procesamiento diferencial post-traduccional, y similares, como se ha descrito anteriormente. Una preparación de proteína de Lerk-7 se considera que se ha de purificar mientras no se visualice ninguna banda correspondiente a proteínas diferentes (no Lerk-7). Lo más preferiblemente Lerk-7 se purifica hasta homogeneidad sustancial, como se indica mediante una única banda de proteína tras análisis por SDS-PAGE.

Ácidos nucleicos

La presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados de Lerk-7. Tales ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, el ADN de Lerk-7 humano de la SEC ID Nº 4, tanto en forma de cadena sencilla como de cadena doble, así como el ARN complemento del mismo. El ADN de la Lerk-7 de la presente invención incluye, por ejemplo, ADNc, ADN genómico, ADN sintetizado químicamente, ADN amplificado mediante PCR, y las combinaciones de los mismos. Se puede aislar ADN genómico mediante técnicas convencionales usando el ADNc aislado en el ejemplo 1, o un fragmento Adecuado del mismo, como sonda.

La presente invención además proporciona fragmentos de las secuencias de nucleótidos de Lerk-7 presentadas en esta memoria descriptiva. Tales fragmentos deseablemente comprenden al menos aproximadamente 14, preferiblemente al menos 17, nucleótidos consecutivos de la secuencia presentada en la SEC ID Nº: 4. Los complementos de ADN y ARN de dichos fragmentos se proporcionan en esta memoria descriptiva, junto con formas tanto de cadena sencilla como de doble cadena del ADN de Lerk-7.

Entre los uso de tales fragmentos de ácidos nucleicos de Lerk-7 son el uso como una sonda o un cebador. Tales sondas se pueden emplear en procedimientos de hibridación de especies cruzadas para aislar ADN de Lerk-7 de especies de mamíferos adicionales. Como un ejemplo, se puede emplear una sonda correspondiente para el dominio extracelular de una Lerk-7. Las sondas también encuentran uso en al detección de la presencia de ensayos de ácidos nucleicos de Lerk-7 in vivo y en tales procedimientos como transferencias de Northern y Southern. Se pueden identificar los tipos de células que expresan Lerk-7. Tales procedimientos son bien conocidos, y los expertos en la técnica pueden elegir una sonda de longitud adecuada, dependiendo de la aplicación propuesta particular. Las sondas se pueden marcar (por ejemplo, con ^{32}P) mediante técnicas convencionales.

Los oligonucleótidos correspondientes a segmentos de ácidos nucleicos de Lerk-7 encuentran uso como cebadores, en procedimientos tales como reacción en cadena de polimerasa (PCR). Por ejemplo, cebadores 5' y 3' correspondientes a los extremos de una secuencia de Lerk-7 deseada (por ejemplo, un fragmento de Lerk-7) se emplean para aislar y amplificar esa secuencia en un procedimiento convencional de PCR.

Otros fragmentos útiles de los ácido nucleicos de Lerk-7 incluyen oligonucleótidos de polaridad negativa o de polaridad positiva que comprenden una secuencia de una secuencia de ácidos nucleicos de cadena sencilla (bien ARN o ADN) capaces de unirse a secuencias de ARN de Lerk-7 diana (polaridad positiva) o de ADN de v (de polaridad negativa). Los oligonucleótidos de polaridad negativa o polaridad positiva, según la presente invención, comprenden un fragmento de la región codificadora de ADNc de Lerk-7. Tal fragmento generalmente comprende al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos. La capacidad de derivar un oligonucleótido de polaridad negativa o polaridad positiva, basándose en una secuencia de ADNc que codifica una proteína dada se describe, por ejemplo, en Stein y Cohen (Cancer Res, 48: 2659, 1988) y van der Krol y col., (BioTechniques 6: 958, 1988).

La unión de oligonucleótidos de polaridad positiva o polaridad negativa a secuencias de ácidos nucleicos diana da como resultado la formación de dúplex que bloquean la transcripción o traducción de la secuencia diana mediante uno o varios medios, incluyendo degradación potenciada de los dúplex, terminación prematura de la transcripción o traducción, o mediante otros medios. Los oligonucleótidos de polaridad negativa o positiva comprenden además oligonucleótidos que tienen estructuras principales de azúcar fosfodiéster modificadas (u otros enlaces azúcar, tales como las descritas en el documento WO 91/06629) y en los que tales enlaces azúcar son resistentes a nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces azúcar resistentes son estable in vivo (es decir, capaces de resistir degradación enzimática) pero retienen la especificidad de secuencia para ser capaces de unirse a secuencias de nucleótidos
diana.

Otros ejemplos de oligonucleótidos de polaridad positiva o polaridad negativa incluyen los oligonucleótidos que están covalentemente unidos a restos orgánicos, tales como los descritos en el documento WO 90/10448, y otros restos que incrementan la afinidad del oligonucleótido por una secuencia de ácidos nucleicos diana, tal como poli (L-lisina). Todavía adicionalmente, se pueden adjuntar agentes intercalantes, tales como elipticina, y agentes alquilantes o complejos metálicos a oligonucleótidos de polaridad positiva o negativa para modificar las especificidades de unión de los oligonucleótidos de polaridad negativa o polaridad positiva.

Los oligonucleótidos de polaridad negativa o polaridad positiva se pueden introducir en una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleicos diana mediante un procedimiento de transferencia génica, que incluye, por ejemplo, transfección de ADN mediada por CaPO_{4}, electroporación, o mediante el uso de vectores de transferencia génica tales como virus de Epstein-Barr. En un procedimiento preferido, se inserta un oligonucleótido de polaridad negativa o polaridad positiva en un vector retroviral adecuado. Una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleicos diana se pone en contacto con el vector retroviral recombinante, o bien in vivo o ex vivo. Los vectores retrovirales adecuados incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de los retrovirus murinos M-MulV, N2 (un retrovirus derivado de M-MulV), o los vectores de doble copia denominados DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase el documento WO 90/13641).

Los oligonucleótidos de polaridad negativa o polaridad positiva se pueden introducir en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos diana mediante la formación de un conjugado con un a molécula de unión a ligando, como se describe en el documento WO 91/04753. Las moléculas de unión a ligando diana incluyen, pero no se limitan a, receptores de superficie celular, factores de crecimiento, otras citocinas, u otros ligandos que se unen a receptores de superficie celular. Preferiblemente, la conjugación de la molécula de unión a ligando no interfiere sustancialmente con la capacidad de la molécula de unión a ligando de unirse a su molécula o receptor correspondiente, o bloquean la entrada del oligonucleótidos de polaridad positiva o polaridad negativa o su versión conjugada en la célula.

Como alternativa, se puede introducir un oligonucleótido de polaridad positiva o polaridad negativa en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico diana mediante la formación de un complejo oligonucleótido-lípido, como se describe en el documento WO 90/10448. El complejo oligonucleótido de polaridad positiva o polaridad negativa-lípido se disocia preferiblemente dentro de la célula mediante una lipasa endógena.

Anticuerpos

Se proporcionan los anticuerpos que son inmunorreactivos con los polipéptidos de Lerk-7 descritos en esta memoria descriptiva. Tales anticuerpos se unen específicamente a Lerk-7 porque los anticuerpos se unen a Lerk-7 mediante los sitios de unión a antígeno del anticuerpo (como opuestos a unión no específica).

Los anticuerpos policlonales y monoclonales se pueden preparar mediante técnicas convencionales. Véase, por ejemplo, Monoclonal Antibodies. Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet y col., (eds.), Plenum Press, Nueva York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Land (Eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY, (1988). La producción de anticuerpos monocloinales que son inmunorreactivos con Lerk-7 se ilustra adicionalmente en el ejemplo 5 más adelante.

Los fragmentos de unión a antígeno de tales anticuerpos, que se pueden producir mediante técnicas convencionales, están también abarcadas por la presente invención. Los ejemplos de tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, F(ab'), y F(ab')_{2}. También se proporcionan fragmentos de anticuerpos y derivados producidos mediante técnicas de ingeniería genética.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales murinos. Tales anticuerpos humanizados se pueden preparar mediante técnicas conocidas, y ofrecen la ventaja de inmunogenicidad reducida cuando los anticuerpos se administran a seres humanos. En una realización, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende al región variable de un anticuerpo murino (justo el sitio de unión a antígeno del mismo) y una región constante derivada de un anticuerpo humano. Como alternativa, un anticuerpo humanizado puede comprenderle sitio de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal murino y un fragmento de región variable (que carece del sitio de unión a antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales modificados por ingeniería genética adicionales incluyen los descritos en Riechman y col., (Nature, 332: 323, 1988) Liu y col., (PNAS 84: 3439, 1987), Larrick y col (Bio/Technology 7: 934, 1989), y Winter y Harris (TIPS 14, 139, mayo de 1993).

Entre los usos de los anticuerpos están el uso en ensayos para detectar la presencia de polipéptidos Lerk-7, o bien in vitro o in vivo. Los anticuerpos también se pueden emplear en al purificación de proteínas de Lerk-7 mediante cromatografía de inmunoafinidad.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente realizaciones particulares de la invención, y no se interpretan como limitantes del alcance de la presente invención.

Ejemplo 1 Clonación del ADNc de Lerk-7 humano

El ADNc que codifica una Lerk-7 humana de la presente invención se aisló mediante el siguiente procedimiento. En resumen, se identificó ADN de Lerk-7 durante el rastreo de una genoteca de ADNc de cerebro fetal humano con una sonda que se derivó de un ADNc murino denominado Lerk-6.

ADN de Lerk-6 y las proteínas se describen anteriormente y en la patente de Estados Unidos nº 5.919.905. El ADN y secuencias de aminoácidos codificadas para una ADNc de Lerk-6 de tipo murino se presentan en esta memoria descriptiva como SEC ID números 1 y 2.

Una genoteca de ADNc constituida por ADNc de cerebro fetal humano en el vector \lambdagt10 se compró en Clonetech Laboratories, Inc, Palo Alto, California. Se aisló un fragmento ADN de Lerk-6 mediante PCR para uso como sonda. El fragmento de ADN de Lerk-6 contenía los nucleótidos 11 a 443 de la SEC ID Nº: 1. Un cebador empleado en la PCR añadido a un sitio de unión de ARN polimerasa de T3 (CTTTAGTGAGGGTTAATCTATAG) (SEC ID Nº: 3) al extremo 3' del fragmento de ADN de Lerk-6 amplificado.

La sonda se marcó con ^{32}P CTPd usando la técnica de cebado al azar, después se dejó que se hibridizara a conjuntos de ADNc derivados de la genoteca. Después los filtros se lavaron con 0,5X SSC/ SDS al 0,1% a 55ºC durante aproximadamente dos horas. Los conjuntos de hibridación se identificaron, y el rastreo se repitió sobre conjuntos más pequeños sucesivamente, en las mismas condiciones. Un clon de hibridación individual, denominado clon nº 16, se purificó después de la tercera ronda de rastreo.

Se determinó la secuencia de ADN del clon nº 16. Sorprendentemente, el clon codificaba una proteína humana novedosa, denominada Lerk-7 en esta memoria descriptiva, en lugar de codificar el homólogo humano de Lerk-6. La secuencia de nucleótidos de la región codificadora del ADNc de Lerk-7 humano, y la secuencia de aminoácidos codificada de esa manera, se describen en la SEC ID Nº: 4 y SEC ID Nº: 5, respectivamente. La proteína de Lerk-7 de la SEC ID Nº: 5 comprende un péptido señal N-terminal (aminoácidos -20 a -1), un dominio de unión a receptor extracelular (aminoácidos 1 a 133), una región espaciador (aminoácidos 134 a 183), y una región hidrófoba C-terminal (aminoácidos 194 a 208).

Las muestras de un lisado celular que contienen un vector fago recombinante (\lambdagt10 que contiene el ADNc de Lerk-7 humano del clon nº 16 insertado en el sitio de restricción Eco RI del vector) se depositaron en la Colección Americana de Cultivos tipo, Rockville, Maryland. Las muestras se depositaron el 7 de diciembre de 1994, bajo los términos del Tratado de Budapest, y número de acceso de cesión común ATCC 75959.

Ejemplo 2 Preparación de la proteína de fusión elk:Fc soluble

Este ejemplo describe la construcción de un vector de expresión que codifica una proteína de fusión elk:Fc soluble. Esta proteína de fusión se puede emplear en los ensayos de unión descritos en esta memoria descriptiva.

Un ADN y una secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc de elk de rata se presenta en Lhotak y col. (Mol Cell. Biol. 11: 2496, 1991). La proteína elk de rata tiene un dominio extracelular de 538 aminoácidos, un dominio transmembrana de 25 aminoácidos, y un dominio citoplásmático de 419 aminoácidos.

Un fragmento de ADNc de elk de rata se condensó al extremo 5'0 de ADNc que codifica la porción Fc de un anticuerpo IgG1 humano. Un sitio de escisión de endonucleasa de restricción Asp 718 se introdujo cadena arriba de la región codificadora de elk. Se aisló un fragmento Asp 718-BglII de ADNc de elk de rata (que comprende el dominio extracelular entero, la región transmembrana, y una parte pequeña del dominio citoplasmático).

El ADN que codifica una cadena de polipéptido sencilla que comprende la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano se clonó en el sitio SpeI de pBluscript SK®, un vector de clonación que está comercialmente disponible de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, California. Este vector de plásmido es replicable en E. coli y contiene un segmento poliengarce que incluye 21 sitios de restricción únicos. La secuencia de nucleótidos del ADN clonado, junto con la secuencia de aminoácidos del polipéptido Fc codificado por él, se describen en la solicitud PCT WO 93/10151, y se presentan también en la SEC ID Nº: 7 y la SEC ID Nº: 8. Se ha introducido un sitio único BglII, y abarca los codones para los aminoácidos tres y cuatro del polipéptido. El polipéptido de Fc codificado se extiende desde la región bisagra N-terminal al extremo C nativo, es decir, es esencialmente una región de Fc del anticuerpo de longitud completa.

El fragmento de ADNc de elk Asp 718-BglII descrito anteriormente se clonó en el vector pBluescript SK® que contiene el ADNc de Fc, de manera que el ADNc de elk se posiciona cadena arriba del ADNc de Fc. El ADN de cadena sencilla derivado de la fusión génica resultante se sometió a mutagénesis mediante el procedimiento descrito en Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488, 1985) y Kunkel y col., (Methods in Enzymol. 154: 367, 1987) con el fin de condensar perfectamente al dominio extracelular entero de elk a la secuencia de Fc. El ADN sometido a mutagénesis se secuenció para confirmar que el nucleótido apropiado se ha retirado (es decir, que la región transmembrana y el ADN del dominio citoplasmático parcial se suprimieron) y que las secuencias de elk y Fc estaban en al misma fase de lectura.

La proteína de fusión elk:Fc preferiblemente se sintetiza en células hospedadoras de mamífero, tal como células CV1-EBNA o COS-7. La fusión génica elk: Fc se escindió y se insertó en un vector de expresión de mamífero denominado HAV-EO (Dower y col., J. Immunol. 142: 4314, 1989). Se transfectaron células hospedadoras de mamífero con el vector de expresión recombinante resultante y se cultivaron para permitir la expresión transitoria sw la proteína de fusión, que se secretó en el medio de cultivo mediante el péptido señal de elk. La proteína de fusión elk:Fc se purificó mediante cromatografía de afinidad, usando una columna de sefarosa de proteína A.

Ejemplo 3 Preparación de proteína de fusión hek:Fc soluble

Este ejemplo describe la construcción de un vector de expresión que codifica una proteína de fusión hek:Fc soluble. Esta proteína de fusión se puede emplear en los ensayos de unión descritos en esta memoria descriptiva.

Un ADN y una secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc de hek humano se presenta en Wicks y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1611, 1992) incorporada en esta memoria descriptiva como referencia. Esta proteína hek comprende (desde el extremo N al C) un dominio extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio citoplásmico.

Dos fragmentos de ADN, uno que codifica un fragmento N terminal del dominio extracelular de hek y el otro que codifica un fragmento C terminal del dominio extracelular hek, se aisló mediante reacciones en cadena de polimerasa (PCR) llevadas a cabo en condiciones habituales, usando cebadores de oligonucleótidos basándose en la secuencia de nucleótidos de hek publicada por Wicks y col., anteriormente. El molde para la PCR era ADNc preparado a partir de ARNm aislado de una línea celular de leucemia de células T denominada CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1).

Los productos de PCR que contenían el extremo 5' del ADN de hek se digirieron con SpeI y HindIII para aislar un fragmento de ADN que se extiende desde el extremo 5' de la secuencia de hek humana madura (es decir, ADN defectuoso que codifica la secuencia señal) a un sitio HindIII encontrado e el gen de hek. Los productos de PCR que contienen el extremo 3' del ADN del dominio extracelular de hek se digirieron con HindIII y ClaI para aislar un fragmento que se extiende desde el sitio HindIII interno a un sirio ClaiI justo cadena abajo del extremo 3' de al secuencia que codifica el dominio extracelular hek. El sitio ClaiI es un sitio de clonación múltiple (mcs) introducido justo cadena abajo del dominio extracelular.

Se aisló el ADN que codifica una muteína de la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano. Este ADN de muteína de Fc y el polipéptido codificado por él se describen en la patente de Estados Unidos Nº 5.457.035, titulada "Novel Cytokine Which is a Ligand for OX40". El ADN de muteína se derivó de un ADN que codifica el polipéptido de Fc nativo mediante mutagénesis dirigida al sitio llevada a cabo sustancialmente como describen Deng y Nickoloff, Anal. Biochem. 200: 81 (1992). La secuencia de aminoácidos del polipéptido de muteína de Fc es idéntico al del polipéptido de Fc nativo descrito en la solicitud PCT WO 93/10151, excepto que el aminoácido 19 se ha cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 se ha cambiado de Leu a Glu, y el aminoácido 22 se ha cambiado se Gly a Ala. Este Fc de muteína muestra afinidad reducida por receptores de inmunoglobulina.

Un vector recombinante que contiene el ADN de muteían de Fc se escindió con ClaiI y NotI, que escinde el vector en una región poliengarce inmediatamente cadena arriba y cadena abajo respectivamente, de al inserción de ADN de muteína de Fc. Se aisló el fragmento que codifica la muteína de Fc.

Un vector de expresión de mamífero denominado SMAG4 se escindió con SpeI y NotI. El vector SMAG4 comprende una secuencia que codifica el péptido señal de intecleucina 7 mutino (descrito en la patente de Estados unidos Nº 4.965.195) insertada en el vector de alta expresión de mamíferos pDC201 (descrito en Sims y col., Science 241: 585, 1988, y en la solicitud PCT WO 89/03884), que también es capaz de replicación en E. coli. SpeI escinde el vector inmediatamente cadena debajo de la secuencia que codifica el péptido señal de IL-7. NotI escinde aproximadamente 155 pares de bases cadena abajo del sitio SpeI en un sitio de clonación múltiple del vector. Se aisló el gran fragmento SpeI/NotI que contiene las secuencias de vector y el ADN que codifica el péptido señal de IL-7.

Una ligación de cuatro vías se llevó a cabo para insertar los dos fragmentos de ADN que codifican hek y el fragmento de ADN que codifica muteína de Fc descrito anteriormente en el vector de expresión SMAG4 escindido por SpeI/NotI. Se transfectaron células de E. coli con la mezcla de ligación y el vector recombinante deseado se aisló de las mismas. El vector aislado codifica una proteína de fusión que codifica (entre el extremo N y C) el péptido señal de IL-7 murino, el dominio extracelular de hek, cuatro aminoácidos codificados por mcs introducido y la muteían de Fc.

El vector de expresión se co-transfectó después con pSV3.NEO de plásmido en células CV1/EBNA. La línea celular CV1/EBNA (ATCC CRL 10478) se derivó de una línea celular de riñón de mono como describen McMahan y col., (EMBO J., 10: 2821, 1991). El vector pSV3.NEO expresa el antígeno T de pSV3, que no se produce por las células hospedadoras. El vector pSV3.NEO es similar a pSV3 (Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072, 1981), pero adicionalmente contiene un gen de resistencia a neomicina. Las células transformadas se cultivaron para permitir la expresión transitoria de la proteína de fusión, que se secreta en el medio de cultivo mediante el péptido señal de IL-7 murino.

Ejemplo 4 Estudio de unión

La unión de Lerk-7 a elk o hek se puede determinar usando el siguiente ensayo. Se preparan las células que expresan Lerk-7 sobre al superficie celular. El ADN de v se amplificó mediante PCR. Los cebadores empleados en la PCR se seleccionan para definir los extremos de al región codificadora del ADN de Lerk-7, y también incluyen un sitio de restricción Xho I en el extremo 5' y un sitio Not I en el extremo 3' del ADN amplificado. El cebador en 5' incluye adicionalmente una secuencia de consenso Kozak cadena arriba del codón de iniciación.

Los productos de reacción se digieren con Xho I y Not I se insertan en un vector de expresión pDC410, que se escinde con Sal I (que es compatible con Xho I) y Not I pDC410, un vector de expresión de mamífero que también se replica en E. coli, es similar a pDC406 (McMahan y col, EMBO J. 10: 2821, 1991). El sitio de clonación múltiple (mcs) de pDC410 difiere del de pD406 por que contiene sitios de restricción adicionales y tres codones de parada (uno en cada fase de lectura). Un promotor de polimerasa de T7 cadena abajo del mcs facilita la secuenciación de ADN insertado en el mcs. Además, el origen de replicación de EVB se reemplaza por ADN que codifica el antígeno de T grande SV40 (dirigido de un promotor de SV40) en pDC410.

Células CV1-EBNA-1 en placas de 10 cm^{2} se transfectan con el vector de expresión recombinante que contiene ADN de Lerk-7. La línea celular CV-1/EBNA-1 (ATCC CRL 10478) constitutivamente expresa el antígeno-1 nuclear de EBN dirigido desde el promotor temprano/potenciador inmediato de CMV. CV1-EBNA-1 se deriva de la línea celular CV-1 de riñón de mono verde africano (ATCC CCL 70), como describen McMahan y col. (EMBO J. 10:2821, 1991).

Las células transfectadas se cultivaron durante 24 horas, y las células en cada placa después se dividen en placas de 24 pocillos. Después de cultivar 48 horas adicionales, se lleva a cabo un ensayo de unión mediante el siguiente procedimiento. Las células transfectadas (aproximadamente 4 x 10^{4} células/pocillo) se lavaron con BM-NFDM, que es medio de unión (RPMI 1640 que contiene 25 mg/ml de albúmina sérica bovina, 2 mg/ml de azida sódica, Hepes 20 mM pH 7,2) al que se añadieron 50 mg/ml de lecha seca no grasa. Después las células se incuban durante 1 hora a 37ºC con diversas concentraciones de la proteína de fusión elk:Fc preparada en el ejemplo 2 o la proteína de fusión hek:Fc preparada en el ejemplo 3. Después las células se lavaron y se incubaron con una concentración de saturación constante de ^{125}I -IgG anti-humana de ratón en un medio de unión, con agitación suave durante 1 hora a 37ºC. Después de un lavado extensivo, las células se liberan mediante tripsinización.

La IgG anti-humana de ratón empleada anteriormente se dirige contra la región Fc de IgG humana y se puede obtener de Jackson Immunoresearch Labotarories, Inc., West Grove, PA. El anticuerpo se marca radiactivamente con yodo usando el procedimiento habitual de cloramina-T. El anticuerpo se unirá a la parte Fc de cualquier proteína de fusión elk:Fc o hek:Fc que se ha unido a las células. En todos los ensayos, se ensaya la unión no específica de ^{125}I-anticuerpo en ausencia de elk:Fc (o hek::Fc), así como en presencia de elkFc (o hek:Fc) y un exceso molar de 200 veces de anticuerpo de IgG anti-humano de ratón no marcado.

El anticuerpo-^{125}I unido a células se cuantifica sobre un contador Packard Autogramma. Los cálculos de afinidad (Scatchard, Ann. N. Y. Acad Sci. 51: 660, 1949) se generan sobre RS/1 (software BBN, Boston MA) desarrollado sobre un ordenador Microwax.

Ejemplo 5 Anticuerpos monoclonales que se unen a Lerk-7

Este ejemplo ilustra un procedimiento para preparar anticuerpos monoclonales que se unen a Lerk-7. Los inmunógenos adecuados que se pueden emplear en la generación de tales anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, proteína Lerk-7 purificada o en un fragmento inmunogénico del mismo tal como el dominio extracelular, proteínas de fusión que contienen n Lerk-7 (por ejemplo, una proteína de fusión Lerk-7/Fc soluble), o células que expresan Lerk-7 en la superficie celular.

La Lerk-7 purificada se puede usar para generar anticuerpo monoclonales inmunorreactivos con ellos, usando técnicas convencionales tales como las descritas en la patente de Estados Unidos Nº 4.411.993. En resumen, se inmunizan ratones con inmunógeno de Lerk-7 emulsionado en adyuvante de Freund completo y se inyecta en cantidades que varían entre 10 - 100 \mug por vía subcutánea o intraperitoneal. Después de diez o doce días, los animales inmunizados se estimularon con Lerk-7 adicional emulsionada en adyuvante de Freund incompleto. Los ratones se estimulan periódicamente posteriormente en un programa de inmunización semanalmente o bi-semanalmente. Se toman periódicamente muestras de suero extrayendo sangre retro-orbital o escisión en la punta de la cola para analizar anticuerpos de Lerk-7 mediante ensayo de transferencia de por puntos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) o inhibición de unión a hek o elk.

Después de la detección de un título de anticuerpo apropiado, a los animales positivos se les proporciona una inyección intravenosa de Lerk-7 en solución salina. Tres a cuatro días más tarde, se sacrifican los animales, se recogen las células de bazo y las células de bazo se condensan a una línea celular de mieloma murino, por ejemplo, NS1 o preferiblemente P3 x 63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones generan células de hibridoma, que se siembran en placas de microtitulación múltiple en un medio selectivo de HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no condensadas, híbridos de mieloma, e híbridos de células de bazo.

Las células de hibridoma se rastrearon mediante ELISA para evaluar la reactividad contra Lerk-7 purificada mediante adaptaciones de las técnicas descritas en Engvall y col., Inmunochem. 8: 871, 1971 y en la patente de Estados Unidos Nº 4.703.004. Una técnica de rastreo preferida en la técnica de captura de anticuerpo descrita en Beckmann y col., (J. Immunol. 144: 4212, 1990). Las células de hibridoma positivas se pueden inyectar por vía intraperitoneal en ratones BALB/C singénicos produciendo ascites que contenían altas concentraciones de anticuerpos monoclonales anti-Lerk-7. Como alternativa, las células de hibridoma de pueden cultivar in vitro en matraces o botellas cilíndricas mediante diversas técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en ascites de ratón se pueden purificar mediante precipitación con sulfato amónico, seguido de cromatografía de exclusión de gel. Como alternativa, también se puede usar cromatografía de afinidad basándose en al unión de anticuerpo a proteína A o proteína G, como cromatografía de afinidad basándose en la unión a Lerk-7.

Ejemplo 6 Transferencias de Southern

Se realizaron transferencias de Southern genómicas de tipo murino para demostrar que Lerk-7 humana y Lerk-6 murina no son análogas. Sondando el ADN humano con Lerk-7 humana o Lerk-6 murina dio como resultado las siguientes bandas de hibridación (en miles de pares de bases): Lerk-7 [EcoR1 (12,5, 9, 6, 4, 2,5) y BamH1 (13 y 9)]; Lerk-6 [EcoR1 (5) y Bam H1 (5,3)]. Sondando ADN genómico murino da como resultado las siguientes bandas de hibridación: ): Lerk-7 [EcoR1 (12,5, 6) y BamH1 (18,6)]; Lerk-6 [EcoR1 (18) y Bam H1 (2,7, 2,2). Puesto que las bandas de hibridación de Lerk-7 y Lerk-6 no eran idénticas, estos ADNc definen genes únicos.

Ejemplo 7 Estudio de unión

La afinidad de unión de Lerk-7 por elk o por hek se determinó en el siguiente ensayo. . ADNc que codifica el polipéptido de Lerk-7 de longitud completa de la SEC ID Nº: 5 se insertó en SF CAV, un vector de expresión de mamífero que también se replica en E. coli. El vector SF CAV se describe en la solicitud PCT WO 93/19777.

Células CV1-EBNA-1 (descritas en el ejemplo 3) en placas de 10 cm^{2} se transfectaron con el vector de expresión recombinante que contenía ADN de Lerk-7. Las células transfectadas se cultivaron durante 24 horas, y las células en cada placa después de dividieron en placas de 24 pocillos. Después de cultivar 48 horas adicionales, se llevó a cabo un ensayo de unión mediante el siguiente procedimiento. Las células transfectadas (aproximadamente 4 x 10^{4} células/porcillo) se lavaron con BM-NFDM, que es medio de unión (RPMI 1640 que contiene 25 mg/ml de albúmina sérica bovina, 2 mg/ml de azida sódica, Hepes 20 mM pH 7,2) al que se añadieron 50 mg/ml de lecha seca no grasa. Después las células se incubaron durante 1 hora a 37ºC con diversas concentraciones de una proteína de fusión soluble elk:Fc o hek:Fc. La proteína de fusión hek:Fc se preparó como se describe en el ejemplo 3. La proteína de fusión elk:Fc se preparó mediante procedimientos análogos a los descritos en el ejemplo 2, excepto que el polipéptido de Fc de muteína descrito en el ejemplo 3 se sustituyó con el polipéptido de Fc nativo.

Después las células se lavaron y se incubaron con una concentración de saturación constante (20 ng/ml) de una IgG anti-humana de ratón marcada con ^{125}I un medio de unión, con agitación suave durante 1 hora a 37ºC. Después de un lavado extensivo, las células se recogieron mediante tripsinización.

La IgG anti-humana de ratón empleada anteriormente se dirige contra la región de Fcx de IgG humana y está disponible de Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA. El anticuerpo se marca radiactivamente con yodo usando el procedimiento de cloramina-T habitual. El anticuerpo se unirá a la parte Fc de cualquier proteína de fusión elk:Fc o hek:Fc que se ha unido a las células. En todos los ensayos, se ensaya la unión no específica de ^{125}I-anticuerpo en ausencia de elk:Fc (o hek:Fc), así como en presencia de elk:Fc (o hek:Fc) y un exceso molar de 200 veces de anticuerpo de IgG anti-humano de ratón no marcado.

Anticuerpo-^{125}I unido a células se cuantifica sobre un contador Packard Autogramma. Los cálculos de afinidad (Scatchard, Ann. N. Y. Sci. 51: 660, 1949) se generaron sobre RS/1 (software BBN, Boston MA) desarrollado sobre un ordenador Microwax. Los resultados fueron como sigue.

La unión de elk:Fc a las células que expresan Lerk-7 se caracterizó por un patón bifásico, con constates de afinidad (K_{a}) calculada para que fuera K_{a1} = 1,06 x 10^{8} y K_{a2} = 4,95 x 10^{7}. La unión de hek:Fc mostró una clase de afinidad de unión individual (K_{a} = 5,0 x 10^{8}).

Breve descripción del listado de secuencias

SEC ID Nº. 1 y SEC ID Nº: 2 presentan la secuencia de ADN de un ADNc clonado que codifica una proteína denominada Lerk-6, y la secuencia de aminoácidos codificada por ellas, respectivamente. Un fragmento del ADN de la SEC ID Nº: 1 se usó como sonda para aislar el ADN de Lerk-7 de la presente invención, como se describe en el ejemplo 1.

SEC ID Nº: 3 presenta la secuencia de ADN de un sitio de unión a ARN polimerasa de T3, como se describe en el ejemplo 1.

SEC ID Nº: 4 y SEC ID Nº: 5 presentan la secuencia de ADN de una ADNc de Lerk-7 humano clonado, y al secuencia de aminoácidos codificada por ellas, respectivamente. El aislamiento de ADNc se describe en el ejemplo 1.

La SEC ID Nº: 6 presenta la secuencia de aminoácidos del péptido Flag®.

La SEC ID Nº: 7 y la SEC ID Nº: 8 presentan el ADN y secuencias de aminoácidos codificados respectivamente, de un ADN clonado que codifica la región Fc de un anticuerpo de IgG1 humano.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: Immunex Corporation

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(B)

CALLE: 51 University Street

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(C)

CIUDAD Seattle

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(D)

ESTADO: Washington 98101

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): ninguno

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: 2065870430

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

FAX: 2065870606

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

TELEX: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: citocina denominada Lerk-7

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 8

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(iv)

FORMA LEÍBLE DE ORDENADOR

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disco Floppy

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC Compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30 (EPO)

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

DATOS DE SOLICITUD ACTUAL: EP 95944314.4

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 555 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: no

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(iv)

POLARIDAD NEGATIVA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Lerk-6

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 .. 552

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 1:

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 184 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 2:

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

POLARIDAD NEGATIVA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTTAGTGAG GGTTAATCTA TAG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 687 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

POLARIDAD NEGATIVA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORGANISMO: hulerk-7

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sig _ péptido

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(B)

LOCALIZACIÓN: 1 .. 60

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 .. 687

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 61 .. 684

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 4:

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 228 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

POLARIDAD NEGATIVA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CON: péptido FLAG

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 705 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: no

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(iv)

POLARIDAD NEGATIVA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLON: hlgG1Fc

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 .. 699

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 232 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 8:

8

Claims (31)

1. Un ADN aislado que codifica un polipéptido Lerk-7 que se une a hek o elk, en el que dicho polipéptido Lerk-7 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por los restos -20 a 208 de la SEC ID Nº: 5 y los restos 1 a 208 de la SEC ID Nº: 5.

2. Un ADN de la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido Lerk-7 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por los restos -20 a 208 de la SEC ID Nº: 5 y los restos 1 a 208 de la SEC ID Nº: 5.

3. Un ADN de la reivindicación 2, en el que dicho polipéptido Lerk-7 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por los restos -20 a 208 de la SEC ID Nº: 5 y los restos 1 a 208 de la SEC ID Nº: 5.

4. Un ADN de la reivindicación 3, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido por los nucleótidos 1-687 de la SEC ID Nº: 4 y los nucleótidos 61 a 687 de la SEC ID Nº: 4.

5. Un ADN aislado que codifica un polipéptido Lerk-7 soluble que se une a hek o elk, en el que dicho polipéptido Lerk-7 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por los restos -20 a x de la SEC ID Nº: 5 y los restos 1 a x de la SEC ID Nº: 5, en el que x representa un número entero entre 133 y 193, inclusive.

6. Un ADN aislado según la reivindicación 5, en el que dicho polipéptido Lerk-7 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por los restos -20 a x de la SEC ID Nº: 5 y los restos 1 a x de la SEC ID Nº: 5, en el que x representa un número entero entre 133 y 193, inclusive.

7. Un ADN de la reivindicación 6, en el que dicho polipéptido Lerk-7 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por los restos -20 a 113, -20 a 182, -20 a 193, 1 a 133, 1 a 182, y a 193 de la SEC ID Nº: 5.

8. Un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Una célula hospedadora transformada con un vector de expresión de la reivindicación 8.

10. Un procedimiento para producir un polipéptido Lerk-7, que comprende el cultivo de una célula hospedadora de la reivindicación 9 en condiciones que promueven la expresión de dicho polipéptido Lerk-7, y recuperación del polipéptido Lerk-7.

11. Un polipéptido Lerk-7 que codifica un ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

12. Un polipéptido Lerk-7 purificado que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a la secuencia de restos de aminoácidos 1 a 208 de la SEC ID Nº: 5.

13. Un polipéptido Lerk-7 de la reivindicación 12, que comprende la secuencia de aminoácidos 1 a 208 de la SEC ID Nº: 5.

14. Un polipéptido Lerk-7 soluble purificado que se une a hek o elk, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a una secuencia de restos 1 a x de la SEC ID Nº: 5, en el que x representa un número entero entre 133 y 193, inclusive.

15. Un polipéptido Lerk-7 soluble según la reivindicación 14, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 1 a x de la SEC ID Nº: 5, en el que x representa un número entero entre 133 y 193, inclusive.

16. Un polipéptido Lerk-7 soluble según la reivindicación 15, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por los restos 1 a 133, 1 a 182, y 1 a 193 de la SEC ID Nº: 5.

17. Un polipéptido Lerk-7 purificado que es un fragmento de la proteína Lerk-7 de la SEC ID Nº: 5, en el que dicho fragmento se une a hek o elk.

18. Un polipéptido Lerk-7 purificado caracterizado por una secuencia de aminoácidos N-terminal Gln-Asp-Pro-Gly-Ser-Lys-Ala-Val-Ala-Asp-Arg-Tyr-Ala-Val-Tyr.

19. Una proteína purificada Lerk-7 purificada que comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada a partir de la inserción de ADNc de Lerk-7 del vector recombinante en ATCC 75959.

20. Un anticuerpo que específicamente se une a un polipéptido Lerk-7 según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

21. Un anticuerpo según la reivindicación 20, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

22. un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 21, en el que dicho anticuerpo se une específicamente al polipéptido Lerk-7 de la SEC ID Nº: 5.

23. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido Lerk-7 soluble y un polipéptido derivado de un anticuerpo, en el que dicho polipéptido Lerk-7 es un fragmento soluble de la proteína Lerk-7 de la SEC ID Nº: 5, en el que dicho fragmento es capaz de unirse a elk o hek.

24. Una proteína de fusión de la reivindicación 23, en el que dicho polipéptido derivado de anticuerpo es un polipéptido de Fc.

25. Un dímero que comprende dos proteínas de fusión de la reivindicación 24.

26. Un oligómero que comprende entre dos y cuatro polipéptidos Lerk-7 solubles, en el que cada uno de dichos polipéptidos es un fragmento soluble de la proteína Lerk-7 de la SEC ID Nº: 5, en el que dicho fragmento es capaz de unirse a elk o hek.

27. Una composición que comprende un polipéptido Lerk-7 o un oligómero según una cualquiera de las reivindicaciones 11-19, 25 ó 26, y un diluyente, vehículo, o excipiente farmacéuticamente aceptable.

28. Un conjugado que comprende un polipéptido Lerk-7 o un oligómero según una cualquiera de las reivindicaciones 11-19, 25 ó 26, y un agente de diagnóstico o terapéutico.

29. Un polipéptido, oligómero, composición, o conjugado de Lerk-7 según una cualquiera de las reivindicaciones 11-19, 25-28 para uso en medicina humana.

30. El uso de un polipéptido, oligómero, o composición de Lerk-7, según una cualquiera de las reivindicaciones 11-19, o 25-27 en la preparación de un medicamento para tratar un trastorno de tejido neural.

31. El uso de un polipéptido, oligómero, o composición de Lerk-7, según una cualquiera de las reivindicaciones 11-19, o 25-27 para detectar o unirse a un receptor que se une a Lerk-7.