ES2249770T3 - Receptor de oncostatina m. - Google Patents

Abstract

UN NUEVO POLIPEPTIDO QUE FUNCIONA COMO LA CADENA BE DEL RECEPTOR M DE ONCOSTATINA, Y SE DENOMINA POR TANTO OSM-R{BE}. LAS PROTEINAS RECEPTORAS HETERODIMERICAS QUE COMPRENDEN OSM-R{BE} Y GP130, SE UNEN A ONCOSTATINA M, Y SE UTILIZAN PARA INHIBIR LAS ACTIVIDADES BIOLOGICAS MEDIADAS POR ONCOSTATINA M.

Description

Receptor de oncostatina M.

Antecedentes de la invención

La oncostatina M es una citocina polipéptida de cadena sencilla secretada que regula el desarrollo de ciertas líneas de células normales y derivadas de tumores. Se ha encontrado que un cierto número de tipos de células se unen a la proteína oncostatina M. Véase, por ejemplo, Linsey y otros, J. Biol. Chem., vol. 264, pág. 4282, (1989). Se ha mostrado que la oncostanina M inhibe la proliferación de un cierto número de tipos de células de tumores (Linsey y otros, véase cita anterior). Sin embargo, por el contrario, esta proteína ha sido implicada en la estimulación de la proliferación de las células del sarcoma de Kaposi (Nair y otros, Science, vol. 255, pág. 1430, (1992); Miles y otros, Science, vol. 255, pág. 1432, (1992); y Cai y otros, Am. J. Pathol., vol. 145, pág. 74, (1994)).

La identificación y aislamiento de proteínas de unión a la oncostatina M, tales como los receptores de oncostatina M de superficie de células, es deseable por razones tales como posibilitar el estudio de la señal biológica transducida a través del receptor. Dichos receptores en forma soluble podrían usarse igualmente para inhibir de manera competitiva una actividad biológica de la oncostatina M en diversos ensayos in vitro o procedimientos in vivo. Una forma soluble del receptor podría administrarse para unir la oncostatina M in vivo, inhibiéndose, de esta forma, la unión, por ejemplo, de la oncostatina M a receptores de superficie de células endógenas.

Se ha encontrado que una proteína conocida como gp130 se une a la oncostatina M, pero con relativamente baja afinidad (Gearing y otros, Science, vol. 255, pág. 1434, (1992). Liu y otros, Cytokine, vol. 6, (no. 3), pág. 272, (1994), ha encontrado que la unión entre oncostatina M y gp130 sola, fue insuficiente para provocar la proliferación celular de células BAF-M130 tratadas con oncostatina M, lo que sugiere que se requiere un factor o factores desconocidos adicionales para formar un receptor de oncostatina M funcional. Los receptores heterodímeros que comprenden un receptor del factor inhibidor de la leucemia (LIF) y gp130 unen la oncostanina M con mayor afinidad de lo que lo hace la gp130 sola, pero igualmente une al LIF con alta afinidad (Gearing y otros, véase cita anterior). Para ciertas aplicaciones, un receptor que une la oncostatina M con alta afinidad, pero que no funcione como un receptor de LIF de alta afinidad, sería ventajoso. Antes de la presente invención, no se había identificado o aislado un receptor de este tipo.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un nuevo polipéptido al cual se le ha designado aquí como la subunidad \beta del receptor de oncostatina M (OSM-R\beta). Igualmente, se proporciona un receptor que comprende OSM-R\beta ligado (preferiblemente covalentemente) a una proteína de unión a la oncostatina M conocida como gp130. El polipéptido gp130 puede estar covalentemente ligado al polipéptido OSM-R\beta por cualquier medio adecuado, tal como a través de un reactivo reticulante o un ligador polipéptido. En una realización de la invención, el receptor es una proteína de fusión producida mediante tecnología de DNA recombinante. Este receptor comprende OSM-R\beta y gp130 que se une a oncostatina M a niveles superiores a los que lo hace la gp 130 sola. Los trastornos mediados por la oncostatina M pueden ser tratados mediante la administración de una cantidad eficaz terapéuticamente de este receptor de la invención a un paciente afligido por un trastorno de este tipo.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 presenta un análisis Scatchard generado a partir de un ensayo para la unión de oncostatina M radioyodada por células que expresan gp130 recombinante. El ensayo se describe en el Ejemplo 2.

La Figura 2 presenta un análisis Scatchard de los resultados de un ensayo para la unión de oncostatina M radioyodada por células que expresan tanto gp130 recombinante como OSM-R\beta recombinante. Tal como se describe en el Ejemplo 2, los datos de la Figura 2 demuestran una mayor afinidad de unión de la oncostatina M comparada con la unión de la oncostatina M por gp130 sola representada en la Figura 1.

La Figura 3 es un gráfico de barras que representa la unión del factor inhibidor de la leucemia (LIF) y la oncostatina M a diversas proteínas receptoras, tal como se describe en el Ejemplo 5.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un nuevo polipéptido designado como la subunidad \beta del receptor de oncostatina M (OSM-R\beta). Se describe el DNA aislado que contiene la codificación de OSM-R\beta, los vectores de expresión que contienen el DNA de OSM-R\beta, y las células huéspedes transformadas con dichos vectores de expresión. Igualmente, se describen procedimientos para la producción de polipéptidos OSM-R\beta recombinantes, incluyendo formas solubles de la proteína. Así mismo, se proporcionan aquí anticuerpos inmunoreactivos con el nuevo polipéptido.

Otra realización de la invención está dirigida a un receptor capaz de unión a la oncostatina M, en el que el receptor comprende OSM-R\beta y gp130. El receptor es de utilidad en diversos procedimientos in vitro e in vivo, incluyendo el tratamiento de trastornos mediados por la oncostatina M.

El DNA y las secuencias de aminoácidos codificados del cDNA de OSM-R\beta aisladas en el Ejemplo 1, se presentan en la SEC ID NO:5 y SEC ID NO:6. La proteína codificada comprende (a partir del N-terminal al C-terminal) un péptido señal (aminoácidos -27 a -1 de la SEC ID NO:6) seguido de un dominio extracelular (aminoácidos 1 a 714), una región transmembrana (aminoácidos 715 a 734) y un dominio citoplásmico (aminoácidos 735 a 952). Las células de E. coli transformadas con un vector recombinante que comprende el cDNA de OSM-R\beta en el vector de clonación pBluescript^{R} SK^{-} se depositaron en el American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA, el 16 de Agosto de 1994, asignándose el número de registro ATCC 69675.

El ensayo de unión descrito en el Ejemplo 2 compara la unión de la oncostatina M por células que expresan o bien gp130 sola o bien ambas gp130 y OSM-R\beta. Las células que expresan ambas gp130 y OSM-R\beta mostraron una mayor afinidad de unión de oncostatina M de lo que lo hicieron las células que expresan gp130 sola. El ensayo descrito en el Ejemplo 5 demuestra que la OSM-R\beta sola no se une a la oncostatina M a un nivel detectable. Sin embargo, las proteínas expresadas por células co-transfectadas tanto con un vector que contiene la codificación de una proteína de fusión OSM-R\beta/Fc soluble como con un vector que contiene la codificación de una proteína de fusión gp130/Fc soluble, se unen a la oncostatina M a niveles más altos de lo que lo hicieron las proteínas expresadas por células transfectadas con un vector que contiene la codificación de gp130/Fc soluble sola.

En una realización, el receptor de la presente invención comprende gp130 covalentemente ligada a OSM-R\beta por cualquier medio adecuado, tal como a través de un reactivo reticulante o un ligador polipéptido. Las proteínas gp130 y OSM-R\beta están covalentemente ligadas de una manera tal que no interfieren con la capacidad del receptor resultante para unirse con la oncostatina M. En una realización, el receptor es una proteína de fusión producida mediante tecnología de DNA recombinante.

Como alternativa, el receptor puede comprender gp130 acomplejada no covalentemente con OSM-R\beta. La unión no covalente de gp130 a OSM-R\beta puede lograrse por cualquier medio adecuado que no interfiera con la capacidad del receptor para unirse con la oncostatina M. En una vía de realización, se unió un primer compuesto a OSM-R\beta y un segundo compuesto, que no estaba covalentemente unido al primer compuesto, se unió a gp130. Ejemplos de dichos compuestos son la biotina y avidina. El receptor se forma, de esta manera, a través de las interacciones no covalentes de biotina con avidina. En una realización de la invención, OSM-R\beta y gp130 son polipéptidos recombinantes, cada uno de ellos purificado a partir de células recombinantes y, a continuación, unidos no covalentemente uno con otro para formar el receptor. Una célula huésped puede transformarse con dos vectores de expresión diferentes de manera tal que ambos OSM-R\beta y gp130 estén producidos por la célula huésped recombinante. El OSM-R\beta y gp130 producidos mediante dichas células huéspedes transformadas, pueden asociarse para formar un complejo a través de interacciones no covalentes. Cuando dichas células transformadas expresan las formas unidas a la membrana de las proteínas, dichas células son útiles en diversos ensayos, incluyendo ensayos de competencia.

La proteína designada aquí como gp130, ha sido purificada a partir de fuentes celulares que incluyen tejido placentario y una línea de células de mieloma U236. Se han encontrado un cierto número de tipos de células adicionales para expresar mRNA de gp130, tal como ha sido informado por Hibi y otros, en Cell, vol. 63, pág. 1149, (1990). Se ha informado que la gp130 está implicada en la formación de sitios de unión de interleuquina-6 de alta afinidad y en la transducción de la señal IL-6 (Hibi y otros, véase cita anterior). Igualmente, la gp130 sirve como un convertidor de afinidad para el receptor de LIF (Gearing y otros, Science, vol. 255, pág. 1434, (1992)). La clonación y expresión del cDNA que contiene la codificación de una longitud completa de la proteína gp130 ha sido informada por Hibi y otros, véase cita anterior.

Tal como aquí se usan, los términos OSM-R\beta y gp130 incluyen variantes y formas truncadas de las proteínas naturales que poseen la actividad biológica deseada. La variantes producidas mediante la adición, substitución o deleción de aminoácidos en la secuencia nativa, se exponen con mayor detalle más adelante.

Un ejemplo de un polipéptido OSM-R\beta es el codificado por el clon de cDNA descrito en el Ejemplo 1 (es decir, codificado por el inserto de cDNA de OSM-R\beta del vector recombinante en la cepa depositada ATCC 69675). Otros polipéptidos OSM-R\beta incluyen los que carecen de toda o parte de la región transmembrana o del dominio citoplásmico de la proteína. Pueden elegirse polipéptidos OSM-R\beta truncados adicionales con respecto a secuencias que están conservadas en la familia del receptor hematopoyetina. El que sea deseable la inclusión de la secuencia señal depende de factores tales como la posición de la OSM-R\beta en una proteína de fusión y las células huéspedes a que se destinan cuando el receptor ha de producirse mediante tecnología de DNA recombinante.

Un ejemplo de un polipéptido gp130 adecuado es el que comprende la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID NO:2. Las células de la cepa DH5\alpha de E. coli transformadas con un vector recombinante que contiene la codificación de gp130, designado como B10G/pDC303, se depositaron en el American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA, el 14 de Noviembre de 1991, asignándose el número de registro ATCC 68827. El vector de expresión mamífero pDC303 (dentro del cual se había insertado el cDNA de gp130 para formar el B10G/pDC303) se conoce igualmente como SF CAV y ha sido descrito en la Solicitud PCT WO 93/19777. La secuencia de nucleótido del cDNA de gp130 contenida en el plásmido B10G/pDC303 y la secuencia de aminoácidos codificada de este modo, se presentan en la SEC ID NO:1 y SEC ID NO:2. La proteína comprende (en el orden a partir de la N-terminal al C-terminal) una secuencia señal de 22 aminoácidos, un dominio extracelular completo (aminoácidos 1-597), una región transmembrana (empezando con el aminoácido 598) y un dominio citoplásmico parcial (aminoácidos 621-686).

Como alternativa, puede usarse la proteína gp130 descrita por Hibi y otros (véase cita anterior). El octavo aminoácido del péptido señal es valina en la secuencia informada por Hibi y otros, pero es leucina en la SEC ID NO:2 (en la posición -15). Esta diferencia en la secuencia de aminoácidos puede ser atribuible a polimorfismo genético (variación alélica entre individuos que producen la proteína). Además, la proteína gp130 de la SEC ID NO:2 está truncada dentro del dominio citoplásmico, terminando con el resto leucina situado en la posición 708 en la secuencia presentada en Hibi y otros, véase cita anterior. Aunque truncada, la proteína gp130 de la SEC ID NO:2 comprende el dominio extracelular responsable de la unión con la oncostatina M y, por ello, es adecuada para uso como un componente de los receptores de la presente invención.

Las regiones de la proteína gp130 que corresponden a los dominios que se encuentran conservados entre ciertos receptores están expuestas por Hibi y otros, véase cita anterior, en la página 1150, columna 2, y en la página 1151, columna 1. Pueden usarse otros polipéptidos gp130 truncados elegidos para incluir estas regiones conservadas.

Los polipéptidos OSM-R\beta y gp130 solubles son preferidos para ciertas aplicaciones. En una realización de la presente invención, el receptor comprende OSM-R\beta soluble unido covalentemente a gp130 soluble. Por "OSM-R\beta soluble" tal como se usa en el contexto de la presente invención, se hace referencia a polipéptidos que son substancialmente similares en la secuencia de aminoácidos a toda o parte de la región extracelular de una OSM-R\beta nativa y que, debido a la carencia de una región transmembrana que ocasionaría la retención del polipéptido sobre una membrana de la célula, son secretados mediante la expresión. Los polipéptidos OSM-R\beta solubles adecuados retienen la actividad biológica deseada. Igualmente, el OSM-R\beta soluble puede incluir parte de la región transmembrana o parte del dominio citoplásmico u otras secuencias, siempre y cuando que la proteína OSM-R\beta soluble sea capaz de ser secretada.

De igual forma, el término "gp130 soluble" tal como se usa aquí, se refiere a proteínas que son substancialmente similares en la secuencia de aminoácidos a toda o parte de la región extracelular de una gp130 nativa y que son secretados mediante la expresión, pero que retienen la actividad biológica deseada. Igualmente, la gp130 soluble puede incluir parte de la región transmembrana, el dominio citoplásmico, u otras secuencias, con la condición de que el polipéptido sea secretado.

En una realización, los polipéptidos OSM-R\beta y gp130 solubles pueden incluir el dominio extracelular entero. Para efectuar la secreción, los polipéptidos solubles comprenden el péptido señal nativo o un péptido señal heterólogo. De acuerdo con ello, los ejemplos de polipéptidos OSM-R\beta solubles comprenden los aminoácidos -27 a 714 ó 1 a 714 de la SEC ID NO:6. Los ejemplos de polipéptidos gp130 solubles comprenden los aminoácidos -22 a 597 ó 1 a 597 de la SEC ID NO:2.

Los ejemplos adicionales de polipéptidos gp130 solubles son aquellos que carecen desde uno hasta los tres dominios de fibronectina encontrados dentro del dominio extracelular, tal como se describe en el Ejemplo 4 más adelante. Estos polipéptidos gp130 solubles incluyen los que comprenden los aminoácidos -22 a y ó 1 a y de la SEC ID NO:2, en donde y es un número entero entre 308 y 597, inclusives.

En el Ejemplo 5, se describe una proteína de fusión soluble que comprende los aminoácidos -27 al 432 del OSM-R\beta de la SEC ID NO:6 fusionado a un polipéptido de una región Fc de un anticuerpo. La parte OSM-R\beta de la proteína de fusión, la cual es un fragmento del dominio extracelular de OSM-R\beta, retuvo la actividad biológica deseada. De acuerdo con ello, los ejemplos de polipéptidos OSM-R\beta solubles comprenden los aminoácidos -27 a x, ó 1 a x de la SEC ID NO:6, en donde x es un número entero entre 432 y 714, inclusive.

El OSM-R\beta soluble y el gp130 soluble pueden identificarse (y distinguirse de sus contrapartes unidas a la membrana no solubles) separando las células intactas que expresan la proteína deseada a partir del medio de cultivo, p. ej., mediante centrifugación, y ensayando el medio (sobrenadante) para determinar la presencia de la proteína deseada. El medio de cultivo puede ensayarse usando procedimientos que son similares o idénticos a los descritos en los ejemplos que figuran más adelante. La presencia de OSM-R\beta o de gp130 en el medio indica que la proteína ha sido secretada a partir de las células y, por ello, es una forma soluble de la proteína deseada. El OSM-R\beta soluble y el gp130 soluble pueden ser formas que se producen de manera natural de estas proteínas. Como alternativa pueden producirse fragmentos de proteínas OSM-R\beta y gp130 mediante tecnología de DNA recombinante o aislarse de cualquier otra forma, tal como se describe más adelante.

El uso de formas solubles de OSM-R\beta y gp130 es ventajoso para ciertas aplicaciones. La purificación de las proteínas procedentes de células huéspedes recombinantes se facilita por el hecho de que las proteínas solubles se secretan a partir de las células. Además, un receptor de la presente invención que comprende proteínas OSM-R\beta y gp130 solubles de la presente invención, es, generalmente, más adecuado para administración intravenosa.

Con respecto a la exposición anterior de péptidos señal y los diversos dominios de las proteínas gp130 y OSM-R\beta, el técnico experto reconocerá que los límites anteriormente descritos de dichas regiones de las proteínas son aproximados. Por ejemplo, aunque se encuentran disponibles programas de ordenador que predicen el sitio de escisión de un péptido señal, la escisión puede ocurrir en sitios distintos de los predecidos. Además, está reconocido el hecho de que una preparación de proteína puede comprender una mezcla de moléculas de proteína que tienen diferentes aminoácidos N-terminales, debido a la escisión del péptido señal en más de un sitio. Así mismo, la región transmembrana de OSM-R\beta se identificó mediante predición con un programa de ordenador en combinación con homología a la región transmembrana de la proteína receptora de LIF descrita por Gearing y otros (EMBO J., vol. 10, pág. 2038, (1991)). De acuerdo con ello, los polipéptidos OSM-R\beta solubles que comprenden el dominio extracelular incluyen aquellos que tienen un aminoácido C-terminal, el cual puede variar del identificado anteriormente como el C-terminal del dominio extracelular. Además, la transformación post-tradución, que puede variar de acuerdo con el sistema de expresión particular usado, puede proporcionar proteínas que tienen N-terminaciones diferentes. Dichas variantes, las cuales retienen las actividades biológicas deseadas, están abarcadas por los términos "polipéptidos OSM-R\beta" y "polipéptidos gp130" tal como se usan aquí.

Los OSM-R\beta y gp130 truncados, que incluyen polipéptidos solubles, pueden prepararse por cualquiera de entre un cierto número de técnicas convencionales. En el caso de proteínas recombinantes, un fragmento de DNA que contiene la codificación de un fragmento deseado, puede subclonarse dentro de un vector de expresión. Como alternativa, una secuencia de DNA deseada puede sintetizarse químicamente usando técnicas conocidas. Igualmente, pueden producirse fragmentos de DNA mediante digestión endonucleasa de restricción de una secuencia de DNA clonada de longitud completa, y aislada mediante electroforésis sobre geles de agarosa. Pueden usarse ligadores que contengan el sitio(s) de escisión endonucleasa de restricción para insertar el fragmento de DNA deseado dentro de un vector de expresión, o bien el fragmento puede digerirse en los sitios de escisión presentes de manera natural en él. Pueden sintetizarse oligonucleótidos que reconstruyan las N- o C-terminaciones de un fragmento de DNA en un punto deseado. El oligonucleótido puede contener un sitio de escisión endonucleasa de restricción más arriba de la secuencia de codificación deseada y la posición de un codón de iniciación (ATG) en la N-terminación de la secuencia de codificación.

Igualmente, puede usarse el bien conocido procedimiento de reacción de cadena de polimerasa (PCR) para aislar una secuencia de DNA que contenga la codificación de un fragmento de proteína deseado. Los cebadores oligonucleótidos que comprenden las terminaciones deseadas del fragmento se usan en una reacción de cadena de polimerasa de este tipo. Puede usarse cualquier procedimiento PCR adecuado. Un procedimiento de este tipo es el descrito por Saiki y otros, Science, vol. 239, pág. 487, (1988). Otro, es el descrito en Recombinant DNA Methodology, Wu y otros, eds., Academic Press Inc., San Diego, (1989), págs. 189-196. En general, las reacciones PCR implican la combinación de cebadores oligonucleótidos 5' y 3' con DNA molde (en este caso, DNA de OSM-R\beta o gp130) y cada uno de los cuatro desoxinucleósido trifosfatos, en una solución adecuadamente tamponada. La solución se calienta (p. ej., desde 95ºC a 100ºC) para desnaturalizar el DNA molde de doble hebra y, a continuación, se enfría antes de la adición de una enzima DNA polimerasa. Con el fin de amplificar el fragmento de DNA deseado se realizan múltiples ciclos de las reacciones.

El polipéptido gp130 está unido al polipéptido OSM-R\beta a través de un enlace covalente o no covalente. Para ciertas aplicaciones, se prefiere la unión covalente, p. ej., para uso in vivo, en vista de la estabilidad generalmente potenciada conferida por las uniones covalentes, en oposición a las no covalentes. En la construcción del receptor de la presente invención, el enlace covalente puede llevarse a cabo a través de reactivos de reticulación, ligadores péptidos, o cualquier otra técnica adecuada.

Se conocen numerosos reactivos útiles para la reticulación de una molécula de proteína con otra. Los ligadores heterobifuncionales y homobifuncionales se encuentran disponibles para este fin, por ejemplo, de Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois. Dichos ligadores contienen dos grupos funcionales (p. ej., ésteres y/o maleimidas), los cuales reaccionan con ciertos grupos funcionales situados sobre las cadenas laterales de aminoácidos, ligando, de esta forma, una con otra.

Un tipo de ligador péptido que puede usarse en la presente invención, separa los dominios de gp130 y OSM-R\beta a una distancia suficiente como para asegurar que cada dominio se pliega adecuadamente dentro de las estructuras secundarias y terciarias necesarias para la actividad biológica deseada. Igualmente, el ligador suele permitir que los dominios extracelulares de gp130 y OSM-R\beta asuman la orientación espacial adecuada como para formar el sitio de unión para la oncostatina M.

Los ligadores péptidos adecuados son conocidos en la técnica, y pueden usarse de acuerdo con técnicas convencionales. Entre los ligadores péptidos adecuados se encuentran los descritos en las Patentes de EE.UU. 4.751.180 y 4.935.233. Un ligador péptido puede unirse a gp130 y OSM-R\beta mediante cualquiera de los procedimientos convencionales usados para unir un polímero con otro. Los reactivos de reticulación disponibles de Pierce Chemical Company tal como se ha descrito anteriormente, se encuentran entre los que pueden usarse. Los aminoácidos que tienen cadenas laterales reactivas con dichos reactivos pueden incluirse en el ligador péptido, p. ej., en la terminación del mismo. Preferiblemente, una proteína de fusión que comprende gp130 unido a OSM-R\beta a través de un ligador péptido, se prepara mediante tecnología de DNA recombinante.

En una realización de la invención, OSM-R\beta y gp130 están ligados mediante polipéptidos derivados a partir de inmunoglobulinas. La preparación de proteínas de fusión que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados a diversas porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (incluyendo el dominio Fc), ha sido descrita, p. ej., por Ashkenazi y otros (PNAS USA, vol. 88, pág. 10533, (1991)) y Byrn y otros (Nature, vol. 344, pág. 677, (1990)). A modo de ejemplo, un polipéptido derivado a partir de la región Fc de un anticuerpo, puede unirse al C-terminal de OSM-R\beta. Un polipéptido Fc separado se une al C-terminal de gp130. Entre los dos polipéptidos Fc se forman enlaces disulfuro (p. ej., en la región denominada bisagra, en donde la intercadena de enlaces disulfuro se encuentra normalmente presente en moléculas anticuerpo), lo que produce un heterodímero que comprende la proteína de fusión OSM-R\beta/Fc ligada a la proteína de fusión gp130/Fc. De manera ventajosa, las células huéspedes son co-transfectadas con dos vectores de expresión diferentes, uno que contiene la codificación de OSM-R\beta/Fc soluble y el otro que contiene la codificación de gp130/Fc soluble. Se cree que el heterodímero se forma intracelularmente o durante la secreción.

El término "polipéptido Fc" tal como aquí se usa, incluye formas nativas y muteínas, así como polipéptidos Fc truncados que contienen la región bisagra que promueve la dimerización. El cDNA que contiene la codificación de un polipéptido de cadena sencilla derivado a partir de la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano, ha sido clonado dentro del vector de clonación pBluescript^{R} (Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA) para producir un vector recombinante designado como hIgG1Fc. Un sitio BglII único está posicionado cerca del extremo 5' de la secuencia que contiene la codificación del Fc insertado. Inmediatamente más abajo del codón de parada existe un sitio SpeI. El DNA y las secuencias de aminoácidos codificados del cDNA del Fc clonado se presentan en la SEC ID NO:3 y la SEC ID NO:4. El polipéptido Fc codificado por el cDNA se extiende a partir de la región bisagra N-terminal hasta el C-terminal nativo, es decir, es una región Fc de anticuerpo de longitud completa esencialmente. Una muteína adecuada de este polipéptido Fc se encuentra descrita en la Patente de EE.UU. No. de Serie 08/097.827. La muteína muestra afinidad reducida por los receptores Fc.

Los Homodímeros que comprenden dos polipéptidos OSM-R\beta/Fc y dos polipéptidos gp130/Fc ligados a través de enlaces disulfuro, son igualmente producidos mediante determinadas células huéspedes transfectadas aquí descritas. Los homodímeros pueden separarse uno del otro y del heterodímero en virtud de las diferencias de tamaño (p. ej., mediante electroforésis de gel). Igualmente, el heterodímero puede purificarse mediante cromatografía de inmunoafinidad secuencial (descrita más adelante).

En una realización alternativa, se preparó un primer polipéptido de fusión que comprende gp130 (o un fragmento del mismo) más arriba de la región constante de una cadena ligera de anticuerpo (o un fragmento del mismo). Un segundo polipéptido de fusión comprende OSM-R\beta más arriba de la región constante de una cadena pesada de anticuerpo (o un fragmento de cadena pesada del mismo, cuyo N-terminal se extiende al menos a través de la región C_{H}l. El enlace(s) disulfuro formado entre el polipéptido de fusión de cadena ligera de gp130 y el polipéptido de fusión de cadena pesada de OSM-R\beta, produce, de esta manera, un receptor de la presente invención. Como una alternativa adicional, se preparó un polipéptido de fusión de cadena ligera de anticuerpo y se combinó con (mediante enlaces disulfuro) un polipéptido de fusión que comprende gp130 fusionado a una cadena pesada de anticuerpo. Cuando dos de las moléculas unidas mediante disulfuro anteriores se combinaron, se formaron enlaces disulfuro adicionales entre las dos regiones Fc. El receptor resultante de la presente invención que comprende cuatro polipéptidos de fusión se asemeja a un anticuerpo en cuanto a la estructura y muestra el sitio de unión de oncostatina M bivalentemente.

Los polipéptidos gp130 y OSM-R\beta pueden purificarse por separado a partir de fuentes celulares y, a continuación, ligarse conjuntamente. Como alternativa, el receptor de la presente invención puede producirse usando tecnología de DNA recombinante. Los polipéptidos gp130 y OSM-R\beta pueden producirse por separado y purificarse a partir de las células huéspedes transformadas para posterior ligamiento covalente. En una realización de la presente invención, una célula huésped se transforma/transfecta con DNA extraño que contiene el código de gp130 y OSM-R\beta como polipéptidos separados. Los dos polipéptidos pueden estar codificados por el mismo vector de expresión con codones de iniciación y parada para cada uno de los dos genes, o las células recombinantes pueden ser co-transfectadas con dos vectores de expresión separados. En otra realización, el receptor se produce como una proteína de fusión en células recombinantes.

En una realización de la presente invención, la proteína receptor es una proteína de fusión recombinante de la fórmula:

R_{1}-L-R_{2}

\hskip1cm

ó

\hskip1cm

R_{2}-L-R_{1}

en donde R_{1} representa gp130 o un fragmento de gp130; R_{2} representa OSM-R\beta o un fragmento de OSM-R\beta; y L representa un ligador péptido.

Las proteínas de fusión de la presente invención incluyen constructos en los cuales la porción C-terminal de gp130 está fusionada al ligador que está fusionado a la porción N-terminal de OSM-R\beta, e igualmente constructos en los cuales la porción C-terminal de OSM-R\beta está fusionada al ligador que está fusionado a la porción N-terminal de gp130. El gp130 está covalentemente ligado a OSM-R\beta de manera tal que se produzca una proteína única que retiene las actividades biológicas deseadas de gp130 y OSM-R\beta. Los componentes de la proteína de fusión están listados en su orden de aparición (es decir, el polipéptido N-terminal está listado en primer lugar, seguido por el ligador y, a continuación, el polipéptido C-terminal).

Se construyó una secuencia de DNA que contenía el código de una proteína de fusión usando técnicas de DNA recombinantes, para insertar fragmentos de DNA separados conteniendo la codificación de gp130 y OSM-R\beta dentro de un vector de expresión apropiado. El extremo 3' de un fragmento de DNA que contenía la codificación de gp130 se ligó (a través del ligador) al extremo 5' de un fragmento de DNA que contenía la codificación de OSM-R\beta con los marcos de lectura de las secuencias en fase, para permitir la traducción del mRNA dentro de una única proteína de fusión biológicamente activa. Como alternativa, el extremo 3' de un fragmento de DNA que contiene la codificación de OSM-R\beta puede ligarse (a través del ligador) al extremo 5' de un fragmento de DNA que contiene la codificación de gp130 con los marcos de lectura de las secuencias en fase, para permitir la traducción del mRNA dentro de una única proteína de fusión biológicamente activa. Una secuencia de DNA que contiene la codificación de una secuencia señal N-terminal puede ser retenida sobre la secuencia de DNA que contiene la codificación del polipéptido N-terminal, en tanto que los codones de parada, los cuales impedirían la lectura a lo largo de la segunda secuencia de DNA (C- terminal), son eliminados. Inversamente, un codón de parada requerido para terminar la traducción, se retiene sobre la segunda secuencia de DNA. Preferiblemente, el DNA que contiene la codificación de una secuencia señal se separa de la secuencia de DNA que contiene la codificación del polipéptido C-terminal. Una secuencia de DNA que contiene la codificación de un ligador polipéptido deseado puede insertarse entre, y dentro del mismo marco de lectura, las secuencias de DNA que contienen la codificación de gp130 y OSM-R\beta usando cualquier técnica convencional adecuada. Por ejemplo, entre las secuencias que contienen la codificación de gp130 y OSM-R\beta puede ligarse un oligonucleótido químicamente sintetizado que contenga la codificación del ligador y que contenga los sitios de escisión endonucleasa de restricción apropiados.

Como alternativa, una secuencia de DNA químicamente sintetizada puede contener una secuencia complementaria a la terminación 3' (sin el codón de parada) tanto de gp130 como de OSM-R\beta, seguido de una secuencia que contenga la codificación del ligador, seguido a su vez de una secuencia complementaria a la terminación 5' del otro de gp130 y OSM-R\beta. A continuación, puede usarse la mutagénesis dirigida al oligonucleótido para insertar la secuencia que contenga la codificación del ligador dentro de un vector que contenga una fusión directa de gp130 y OSM-R\beta.

La presente invención proporciona secuencias de DNA aisladas que contienen la codificación de las proteínas de fusión anteriormente descritas, las cuales comprenden gp130, OSM-R\beta, y un ligador péptido. Igualmente, se proporciona el DNA que contiene la codificación de los nuevos polipéptidos OSM-R\beta aquí descritos, al igual que el DNA que contiene la codificación de polipéptidos OSM-R\beta fusionados a polipéptidos derivados de inmunoglobulina. El DNA que contiene la codificación de OSM-R\beta abarcado por la presente invención, incluye, por ejemplo, cDNA, DNA químicamente sintetizado, DNA aislado mediante PCR, DNA genómico, y combinaciones de los mismos. El DNA de OSM-R\beta genómico puede aislarse usando el cDNA aislado en el Ejemplo 1, o fragmentos del mismo, como una sonda usando técnicas estándar.

Igualmente, se proporcionan aquí vectores de expresión recombinantes que contienen las secuencias de DNA aisladas. Por "vector de expresión" se hace referencia a un constructo de DNA replicable usado para expresar DNA que contiene el código de la proteína deseada y el cual incluye una unidad de transcripción que comprende el ensamblado de (1) elemento(s) genético que tiene un papel regulador en la expresión del gen, por ejemplo, promotores, operadores, o potenciadores, operativamente ligados a (2) una secuencia de DNA que contiene la codificación de una proteína deseada que está transcrita dentro del mRNA y traducida dentro de la proteína, y (3) las secuencias de iniciación y terminación de transcripción y traducción apropiadas. La selección del promotor y de otros elementos reguladores varía, generalmente, de acuerdo con la célula huésped deseada.

En los vectores de expresión, los elementos reguladores que controlan la transcripción o traducción derivan generalmente de genes mamíferos, microbianos, víricos o de insectos. Adicionalmente, puede incorporarse la capacidad para replicarse en un huésped, usualmente conferida mediante un origen de replicación, y un gen de selección con el fin de facilitar el reconocimiento de los transformantes. Igualmente, pueden usarse vectores derivados a partir de retrovirus.

Las regiones de DNA están operativamente ligadas cuando están funcionalmente relacionadas unas con otras. Por ejemplo, el DNA que contiene la codificación de un péptido señal (conductor secretor) está operativamente ligado al DNA para un polipéptido si el polipéptido está expresado como un precursor que está secretado a través de la membrana de la célula huésped; un promotor está operativamente ligado a una secuencia de codificación si controla la transcripción de la secuencia; y un sitio de unión ribosoma está operativamente ligado a una secuencia de codificación si está posicionado de manera que permita la traducción. Generalmente, "operativamente ligado" significa contiguo y, en el caso de conductores secretores, contiguos y en el marco de lectura.

Las células huéspedes transformadas son células que han sido transformadas o transfectadas con DNA extraño usando técnicas de DNA recombinante. En el contexto de la presente invención, el DNA extraño incluye una secuencia que contiene la codificación de las proteínas de la invención. Las células huéspedes pueden ser transformadas para fines de clonación o de amplificación del DNA extraño, o pueden ser transformadas con un vector de expresión para la producción de proteína. Las células huéspedes adecuadas incluyen procariotes, levaduras o células eucarióticas superiores. Los vectores de clonación y expresión apropiados para uso con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y mamíferos, se encuentran descritos por Pouwels y otros (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elseviers, New York, 1985).

Los procariotes incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo E. coli o Bacillus. Generalmente, los vectores de expresión procarióticos comprenden uno o más marcadores seleccionables fenotípicos, por ejemplo un gen que contiene la codificación de proteínas que confiere resistencia a antibióticos o que suministra una necesidad autotrófica, y un origen de replicación reconocido por el huésped con el fin de asegurar la amplificación dentro del huésped. Los ejemplos de huéspedes procarióticos adecuados para transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y varias especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque igualmente pueden usarse otros como una materia a elegir.

Los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y origen bacteriano de replicación derivado a partir de plásmidos comercialmente disponibles, que comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017). Dichos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, el pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y el pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Estas secciones de la "cadena principal" del pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural a expresar. Típicamente, la E. coli se transforma usando derivados del pBR322, un plásmido derivado a partir de una especie E. coli (Bolivar y otros, Gene, vol. 2, pág. 95, (1977)). El pBR322 contiene genes para resistencia a la ampicilina y tetraciclina y esto proporciona un medio sencillo para la identificación de células transformadas.

Los promotores comúnmente usados en vectores de expresión microbiana recombinante incluyen el sistema promotor \beta-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (Chang y otros, Nature, vol. 275, pág. 615, (1978); y Goeddel y otros, Nature, vol. 281, pág. 544, (1979)), el sistema promotor triptófano (trp) (Goeddel y otros, Nucl Acids Res., vol. 8, pág. 4057, (1980); y la EPA 36.776) y el promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pág. 412, (1982)). Un sistema de expresión bacteriano especialmente útil usa el fago promotor \lambda P_{L} y el represor termoinducible cI857ts. Los vectores plásmidos disponibles a partir del American Type Culture Collection que incorporan derivados del promotor \lambda P_{L} incluyen el plásmido pHUB2, residente en la cepa de E. coli JMB9 (ATCC 37092) y el pPLc28, residente en E. coli RR1 (ATCC 53082).

La proteína receptor recombinante puede igualmente expresarse en huéspedes de levaduras, preferiblemente a partir de especies Saccharomyces, tal como S. cerevisiae. Igualmente, pueden usarse levaduras de otros géneros tal como Pichia o Kluyveromyces. Generalmente, los vectores de levadura contienen un origen de replicación a partir del plásmido de levadura de 2 \mum o una secuencia autónomamente replicativa (ARS), un promotor, el DNA que contiene la codificación de la proteína de fusión receptora, secuencias para la poliadenilación y terminación de transcripción y un gen de selección. Preferiblemente, los vectores de levadura incluyen un origen de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación tanto de levadura como de E. coli, p. ej., gen de resistencia a la ampicilina de E. coli y el gen trp1 de S. cerevisiae, lo que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para desarrollarse en triptófano, y un promotor derivado a partir de un gen de levadura expresado para inducir la transcripción de una secuencia estructural más abajo. La presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona, de esta forma, un entorno eficaz para la detección de la transformación mediante desarrollo en ausencia de triptófano.

Las secuencias promotoras adecuadas en vectores de levadura incluyen los promotores para metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y otros, J. Biol. Chem., vol. 255, pág. 2073, (1980)) u otras enzimas glucolíticas (Hess y otros, J. Adv. Enzyme Reg., vol. 7, pág. 149, (1968); y Holland y otros, Biochem., vol. 17, pág. 4900, (1978)), tal como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. Los vectores y promotores adecuados para uso en la expresión en levadura han sido descritos además por R. Hitzeman y otros, en EPA 73.657.

Los vectores de levadura preferidos pueden ensamblarse usando secuencias de DNA procedentes de pBR322 para selección y replicación en E. coli (gen Amp^{r} y origen de replicación) y secuencias de DNA de levadura que incluyen un promotor ADH2 represor de la glucosa y un conductor de secreción del factor \alpha. El promotor ADH2 ha sido descrito por Russell y otros (J. Biol. Chem., vol. 258, pág. 2674, (1982)) y Beier y otros, (Nature, vol. 300, pág. 724, (1982)). El conductor del factor \alpha de levadura, el cual dirige la secreción de proteínas heterólogas, puede insertarse entre el promotor y el gen estructural a expresar. Véanse, p. ej., Kurjan y otros, Cell, vol. 30, pág. 922, (1982); y Bitter y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, pág. 5330, (1984). La secuencia conductora puede modificarse para que contenga, cerca de su extremo 3', uno o más sitios de restricción útiles para facilitar la fusión de la secuencia conductora a genes extraños.

Los protocolos de transformación de levadura adecuados son conocidos por los expertos en la técnica. Un ejemplo de técnica es la descrita por Hinnen y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 75, pág. 1929, (1978), que selecciona los transformantes Trp^{+} en un medio selectivo que consiste en base nitrógeno de levadura al 0,67%, ácidos casamino al 0,5%, glucosa al 2%, 10 \mug/ml de adenina y 20 \mug/ml de uracilo.

Las cepas huéspedes transformadas por vectores que comprenden el promotor ADH2 pueden desarrollarse para su expresión en un medio rico que consiste en extracto de levadura al 1%, peptona al 2%, y glucosa al 1% suplementada con 80 \mug/ml de adenina y 80 \mug/ml de uracilo. La desrepresión del promotor ADH2 se produce debido al agotamiento del medio de glucosa. Los sobrenadantes de levadura bruta se recolectan mediante filtración y mantienen a 4ºC antes de su purificación posterior.

Para expresar proteína recombinante pueden usarse varios sistemas de cultivo de células de mamífero o insecto. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos han sido revisados por Luckow y Summers en Bio/Tecnology, vol. 6, pág. 47, (1988). Los ejemplos de líneas de células huéspedes de mamífero adecuadas incluyen células L, C127, 3T3, ovario de hámster chino (CHO), HeLa, y líneas de células BHK. Las líneas de células huéspedes de mamífero adecuadas adicionales incluyen células CV-1 (ATCC CCL70) y células COS-7 (ATCC CRL 1651; descritas por Gluzman, Cell, vol. 23, pág. 175, (1981)), ambas derivadas a partir de riñón de mono. Otra línea de células de riñón de mono, la CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478), se derivó mediante transfección de la línea de células CV-1 con un gen que contiene la codificación del antígeno-1 nuclear del virus de Epstein-Barr (EBNA-1) y con un vector que contiene secuencias reguladoras de CMV (McMahan y otros, EMBO J., vol. 10, pág. 2821, (1991)). El gen EBNA-1 permite la replicación episómica de vectores de expresión, tales como HAV-EO o pDC406, que contienen el origen de replicación de EBV.

Los vectores de expresión de mamífero pueden comprender elementos no transcritos tal como un origen de replicación, un promotor y potenciador adecuado ligado al gen a expresar, y otras secuencias no transcritas flanqueantes 5' ó 3', y secuencias no traducidas 5' ó 3', tal como sitios de unión de ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de corte y empalme, y secuencias de terminación de transcripción. Las secuencias de control de transcripción y traducción en los vectores de expresión a usar en la transformación de las células de vertebrados pueden suministrarse como fuentes víricas. Por ejemplo, los promotores y potenciadores comúnmente usados son los derivados de Polioma, Adenovirus 2, Virus de simio 40 (SV40), y citomegalovirus humano. Las secuencias de DNA derivadas a partir del genoma vírico SV40, por ejemplo, origen SV40, promotor temprano y tardío, potenciador, corte y empalme, y sitios de poliadenilación, pueden usarse para proporcionar otros elementos genéticos requeridos para la expresión de una secuencia de DNA heterólogo. Los promotores temprano y tardío son particularmente útiles debido a que ambos se obtienen fácilmente a partir del virus en forma de un fragmento, el cual contiene, igualmente, el origen de replicación vírico SV40 (Fiers y otros, Nature, vol. 273, pág. 113, (1978)). Igualmente, pueden usarse fragmentos de SV40 más pequeños o mayores, siempre y cuando se incluya la secuencia de aproximadamente 250 bp que se extiende desde el sitio HindIII hacia el sitio BglI localizada en el origen de replicación vírico.

Pueden construirse ejemplos de vectores tal como se describe por Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol., vol. 3, pág. 280, (1983)). Un sistema útil para expresión estable de alto nivel de cDNAs de receptores de mamíferos en células epiteliales mamarias múridas C127, puede construirse substancialmente tal como ha sido descrito por Cosman y otros (Mol. Immunol., vol. 23, pág. 935, (1986)). Igualmente, pueden usarse vectores derivados a partir de retrovirus.

Cuando se desea la secreción de la proteína OSM-R\beta a partir de las células huéspedes, el vector de expresión puede comprender DNA que contiene la codificación de un péptido señal o conductor. En lugar de la secuencia señal nativa, puede agregarse una secuencia señal heteróloga, tal como la secuencia señal para interleuquina-7 (IL-7) descrita en la Patente de EE.UU. 4.965.195; la secuencia señal para el receptor de interlequina-2 descrita por Cosman y otros, Nature, vol. 312, pág. 768, (1984); el péptido señal interleuquina-4 descrito en la EP 367.566; el péptido señal receptor de interleuquina-1 del tipo I descrito en la Patente de EE.UU. 4.968.607; y el péptido señal receptor de interleuquina-1 del tipo II descrito en EP 460.846.

La presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de las proteínas recombinantes de la presente invención, el cual comprende el cultivo de una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de DNA que contiene el código de dicha proteína bajo condiciones que promueven la expresión. A continuación, la proteína deseada puede purificarse a partir del medio de cultivo o de los extractos de células. La proteína deseada puede ser OSM-R\beta o, por ejemplo, el receptor heterodímero. Los sistemas de traducción libres de células podrían igualmente usarse para producir la proteína deseada usando RNA derivado a partir del nuevo DNA de la presente invención.

A modo de ejemplo, los sobrenadantes procedentes de sistemas de expresión que secretan proteína recombinante dentro del medio de cultivo, pueden, en primer lugar, concentrarse usando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación adecuada. Por ejemplo, una matriz de afinidad adecuada puede comprender oncostatina M. Una matriz de afinidad de oncostatina M puede prepararse mediante el acoplamiento de oncostatina M humana recombinante a Hydrazide Affigel (Biorad) o Sepharose (Pharmacia) activada mediante bromuro de cianógeno, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se prefiere la inmunopurificación secuencial usando anticuerpos unidos a un soporte adecuado. Las proteínas de unión a un anticuerpo específico para OSM-R\beta se recuperan y ponen en contacto con anticuerpo específico para gp130 sobre un soporte insoluble. De esta forma, pueden identificarse y aislarse las proteínas inmunoreactivas con ambos anticuerpos.

Como alternativa, puede usarse una resina de intercambio de aniones, por ejemplo, una matriz o substrato que tenga grupos dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente usados en la purificación de proteínas. Como alternativa, puede usarse una etapa de intercambio de cationes. Los intercambiadores de cationes incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Los preferidos son los grupos sulfopropilo. Para purificar adicionalmente una proteína de fusión, puede usarse una o más etapas de cromatografía líquida de alta eficacia de fase inversa (RP-HPLC) que usan medios RP-HPLC hidrófobos, p. ej., gel de sílice con grupos colgantes metilo o alifáticos de otro tipo.

Algunas de las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, pueden usarse para proporcionar una proteína recombinante esencialmente homogénea. El cultivo de células recombinantes permite la producción de la proteína de fusión libre de aquellas proteínas contaminantes que estarían normalmente asociadas con gp130 o OSM-R\beta, ya que ellas se encuentran en la naturaleza en sus especies de origen respectivos, p. ej., sobre la superficies de ciertos tipos de células.

Los procedimientos de purificación anteriores se encuentran entre aquellos que pueden usarse igualmente para purificar receptores no recombinantes de la presente invención. Cuando se usan procedimientos de ligamiento que pueden producir homodímeros (gp130-ligador-gp130 y OSM-R\beta-ligador-OSM-R\beta), pueden usarse procedimientos de purificación que separan el heterodímero de dichos homodímeros. Un ejemplo de un procedimiento de este tipo es la inmunopurificación secuencial tal como se ha expuesto anteriormente. En una realización, la OSM-R\beta (recombinante o no recombinante) se purifica de manera tal que no son detectables por SDS-PAGE bandas correspondientes a otras proteínas (contaminantes).

La proteína recombinante producida en cultivo bacteriano se aísla, normalmente, mediante extracción inicial a partir de gránulos de células, seguido de una o más etapas de concentración, desalinificación, intercambio acuoso de iones o cromatografía de exclusión por tamaños. Finalmente, puede usarse la cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) para las etapas de purificación finales. Las células microbianas usadas en la expresión de proteínas de fusión recombinantes pueden romperse mediante cualquier procedimiento conveniente, incluyendo el ciclo congelación-descongelación, tratamiento por ultrasonidos, rotura mecánica, o el uso de agentes de lisado de células.

La fermentación de levaduras que expresan proteínas de fusión como una proteína secretada simplifica grandemente la purificación. La proteína recombinante secretada resultante de una fermentación a gran escala puede purificarse mediante procedimientos análogos a los descritos por Urdal y otros (J. Chromatog., vol. 296, pág. 171, (1984)), lo cual implica dos etapas de HPLC de fase inversa, secuenciales, para la purificación de una proteína recombinante sobre una columna de HPLC preparativa.

El DNA o las secuencias de aminoácidos de gp130 y OSM-R\beta puede variar de la presentada en la SEC ID NO:1 y SEC ID NO:5, respectivamente. Debido a la conocida degeneración del código genético, puede existir una considerable variación en las secuencias de nucleótidos que contienen la codificación de la misma secuencia de aminoácidos. Además, las secuencias de DNA capaces de hibridación con la secuencia de DNA nativa de la SEC ID NO:1 o la SEC ID NO:5 bajo condiciones moderadamente restrictivas o altamente restrictivas, y las que contiene el código de un polipéptido gp130 o OSM-R\beta biológicamente activo, respectivamente, se consideran igualmente que son secuencias de DNA que contienen la codificación de gp130 o la codificación de OSM-R\beta, dentro del contexto de la presente invención. Dichas secuencias de hibridación incluyen, pero sin limitarse a ellas, secuencias variantes tales como las descritas más adelante, y DNA derivado a partir de otras especies de mamíferos. La OSM-R\beta humana entra dentro del alcance de la presente invención, al igual que lo son las proteínas OSM-R\beta derivadas a partir de otras especies de mamíferos, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, rata, bovino, porcino, o diversos primates no humanos.

Las condiciones moderadamente restrictivas incluyen condiciones descritas, por ejemplo, por Sambrock y otros, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., vol. 1, págs. 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989). Las condiciones moderadamente restrictivas, tal como las define Sambrock y otros, incluyen el uso de una solución de prelavado de 5X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y condiciones de hibridación de aproximadamente 55ºC, 5X SSC, durante una noche. Las condiciones altamente restrictivas incluyen temperaturas más altas de hibridación y de lavado. El experto en la técnica entenderá que la temperatura y la concentración de sal de la solución de lavado puede ajustarse según sea necesario, de acuerdo con factores tales como la longitud de la sonda. Una realización de la invención está dirigida a secuencias de DNA que se hibridan con el DNA de OSM-R\beta de la SEC ID NO:5 bajo condiciones altamente restricitivas, en donde dichas condiciones incluyen la hibridación a 68ºC, seguido de lavado en 0,1X SSC/SDS al 0,1% a 63-68ºC. En otra realización, la presente invención proporciona un receptor heterodímero que comprende OSM-R\beta y gp130, en donde dicho OSM-R\beta y gp130 están codificados por DNA que se hibrida con el DNA de la SEC ID NO:5 o la SEC ID NO:1, respectivamente, bajo condiciones moderadamente o altamente restrictivas.

Además, ciertas mutaciones en una secuencia de nucleótido que contiene el código de OSM-R\beta o gp130 no están expresadas en el producto de proteína final. Por ejemplo, pueden hacerse substituciones de nucleótidos para potenciar la expresión, fundamentalmente con el fin de evitar hélices de estructura secundaria en el mRNA transcrito (véase EP 75.444A). Pueden hacerse otras alteraciones de la secuencia de nucleótidos con el fin de proporcionar codones que sean más o menos fácilmente traducidos por el huésped seleccionado, p. ej., los bien conocidos codones de preferencia de E. coli para la expresión de E. coli.

La secuencia de aminoácidos de gp130 o OSM-R\beta nativos puede variarse mediante substitución, deleción, adición, o inserción de uno o más aminoácidos con el fin de producir una variante de gp130 u OSM-R\beta. Las variantes que poseen la actividad biológica deseada de las proteínas de gp130 y OSM-R\beta nativas pueden usarse en el receptor de la presente invención. Los ensayos mediante los cuales puede analizarse la actividad biológica de las proteínas variantes, se encuentran descritos en los ejemplos que figuran más adelante. Los polipéptidos gp130 biológicamente activos son capaces de unirse a la oncostatina M. La actividad biológica deseada de los polipéptidos OSM-R\beta aquí descritos es la capacidad para potenciar la unión de la oncostatina M cuando el OSM-R\beta está unido a gp130, comparado con el nivel de unión de oncostatina M a gp130 solo.

Las alteraciones de la secuencia de aminoácidos nativos puede llevarse a cabo mediante cualquiera de entre un cierto número de técnicas conocidas. Por ejemplo, pueden introducirse mutaciones en cualquier loci particular mediante la síntesis de oligonucleótidos que contienen un secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que hacen posible el ligamiento a fragmentos de la secuencia nativa. Después del ligamiento, la secuencia reconstruida resultante contiene el código de un análogo que tiene la inserción, substitución, o deleción de aminoácidos deseada.

Como alternativa, pueden usarse procedimientos de mutagénesis específicos del sitio dirigidos a oligonucleótidos, con el fin de proporcionar un gen alterado conteniendo codones particulares alterados de acuerdo con la substitución, deleción, o inserción requerida. Los ejemplos de procedimientos para la realización de las alteraciones anteriormente establecidas están descritos por Walder y otros (Gene, vol. 42, pág. 133, (1986)); Bauer y otros (Gene, vol. 37, pág. 73, (1985)); Craig (BioTechniques, págs. 12-19, Enero 1985); Smith y otros (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, (1981)); Patente de EE.UU. No. 4.518.584, y Patente de EE.UU. No. 4.737.462.

Las variantes bioequivalentes de OSM-R\beta y gp130 pueden construirse, por ejemplo, mediante la realización de varias substituciones de restos de aminoácidos o la deleción de aminoácidos internos o de terminación no necesarios para la actividad biológica. En una realización de la invención, la secuencia de aminoácidos variante es al menos un 80% idéntica, preferiblemente al menos un 90% idéntica, a la secuencia nativa. El por ciento de semejanza puede determinarse, por ejemplo, comparando la información de la secuencia usando un programa de ordenador GAP, versión 6.0, disponible de la University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). El programa GAP usa el procedimiento de alineamiento de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol., vol 48, pág. 443, (1970)), tal como ha sido revisado por Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., vol. 2, pág. 482, (1981)). En resumen, el programa GAP define la semejanza como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) que son semejantes, dividido por el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros de defectos preferidos para el programa GAP incluye: (1) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación pesada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res., vol. 14, pág. 6745, (1986)), tal como ha sido descrita por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358, (1979); (2) una penalización de 3,0 por cada espacio y una penalización adicional de 0,1 por cada símbolo en cada espacio; y (3) ninguna penalización por los espacios de los extremos.

Generalmente, las substituciones suelen hacerse de manera conservadora; es decir, los aminoácidos substitutos los más preferidos son aquellos que tienen características fisicoquímicas que se asemejan a las de los restos substituidos. Los ejemplos de substituciones conservadoras incluyen substituciones de un resto alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu, o Ala por otro, o substituciones de un resto polar por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Otras de dichas substituciones conservadoras, por ejemplo, substituciones de regiones enteras que tienen características hidrófobas similares, son bien conocidas.

Los restos cisteína pueden ser eliminados o reemplazados con otros aminoácidos para prevenir la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos durante la remaduración. Los aminoácidos hidrófilos pueden ser substituidos por aminoácidos hidrófobos en la región transmembrana y/o el dominio intracelular de gp130 y OSM-R\beta para potenciar la solubilidad en agua de las proteínas.

Los restos aminoácidos dibásicos adyacentes pueden ser modificados para potenciar la expresión en sistemas de levaduras en las cuales está presente la actividad KEX2 proteasa. La EP 212.914, describe el uso de mutagénesis especifica del sitio para inactivar sitios de transformación de KEX2 proteasa en una proteína. Los sitios de transformación de KEX2 proteasa se inactivan mediante deleción, adición, o substitución de restos para alterar pares Arg-Arg, Arg-Lys, y Lys-Arg, con el fin de eliminar la incidencia de estos restos básicos adyacentes. Estos pares de aminoácidos, que constituyen los sitios de transformación de KEX2 proteasas, se encuentran en los restos 290-291, 291-292, 580-581, y 797-798 de la proteína OSM-R\beta de la SEC ID NO:6. Estos sitios KEX2 se encuentran en las posiciones 153-154 y 621-622 de la proteína gp130 de la SEC ID NO:2. Los emparejamientos Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles a la escisión por KEX2, y la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg a Lys-Lys representan una vía conservadora y preferida para la inactivación de sitios KEX2.

La presente invención incluye igualmente proteínas con o sin glucosilación de patrones nativos asociados. La expresión de DNAs que contienen la codificación de las proteínas de fusión en bacterias tales como E. coli proporciona moléculas no glucosiladas. Los análogos mutantes funcionales que tienen sitios de N-glucosilación inactivados pueden producirse mediante síntesis y ligamiento de oligonucleótidos o mediante técnicas de mutagénesis dirigida al sitio. Estas proteínas análogas pueden producirse en una forma de carbohidrato reducida, homogénea, con un buen rendimiento, usando sistemas de expresión de levaduras. Los sitios de N-glucosilación en proteínas eucarióticas se caracterizan por la tripleta de aminoácidos Asn-A_{1}-Z, en donde A_{1} es cualquier aminoácido excepto Pro, y Z es Ser o Thr. En esta secuencia, la asparagina proporciona un grupo amino de cadena lateral para la unión covalente del carbohidrato.

La secuencia de aminoácidos de OSM-R\beta en la SEC ID NO:6 contiene 16 de tales sitios de N-glusolicación, encontrándose todos ellos en el dominio extracelular, en los aminoácidos 15-17, 57-59, 104-106, 136-138, 149-151, 194- 194, 280-282, 299-301, 318-320, 334-336, 353-355, 395-397, 419-421, 464-466, 482-484, y 553-555 de la SEC ID NO:6. El dominio extracelular de gp130 comprende sitios de N-glucosilación en las posiciones 21-23, 61-63, 109-111, 135-137, 205- 207, 224-226, 357-359, 361-363, 368-370, 531-533, y 542-544 de la SEC ID NO:2. Un sitio de este tipo puede eliminarse mediante substitución de otro aminoácido por Asn o por el resto Z, por deleción de Asn o Z, o por inserción de un aminoácido no Z entre A_{1} y Z, o por un aminoácido distinto de Asn entre Asn y A_{1}. Los procedimientos conocidos para la inactivación de sitios de N-glucosilación en proteínas, incluyen los descritos en la Patente de EE.UU. 5.071.972 y EP 276.846.

Las variantes de las proteínas receptores de la presente invención, incluyen, igualmente, varias formas estructurales de la proteína primaria que retiene la actividad biológica. Debido a la presencia de grupos amino y carboxilo ionizables, una proteína receptor puede estar, por ejemplo, en la forma de sales ácidas o básicas, o puede estar en forma neutra. Igualmente, los restos de aminoácidos individuales pueden ser modificados mediante oxidación o reducción.

Igualmente, la estructura de aminoácido primaria puede ser modificada mediante la formación de conjugados covalentes o agregados con otras partes químicas, tales como grupos glucosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Los derivados covalentes se preparan mediante el ligamiento de grupos funcionales particulares a cadenas laterales de aminoácidos o los N- o C-terminales. Otros derivados de la proteína receptor dentro del alcance de esta invención, incluyen conjugados covalentes o agregados de la proteína receptor con otras proteínas o polipéptidos, tal como mediante la síntesis en cultivo recombinante como fusiones N- o C-terminales. Por ejemplo, el polipéptido conjugado puede ser una secuencia de polipéptido señal (o conductor) en la región N-terminal de la proteína que, al mismo tiempo que la traducción o posteriormente a la traducción, dirige la transferencia de la proteína desde su sitio de síntesis hasta su sitio de función dentro o fuera de la membrana o la pared de la célula (p. ej., el conductor factor \alpha de levadura).

Los péptidos pueden fusionarse a la proteína deseada (p. ej., mediante técnicas de DNA recombinante) con el fin de facilitar la purificación o identificación. Los ejemplos incluyen poly-His o el péptido Flag^{R} Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEC ID NO:7) (Hopp y otros, Bio/Technology, vol. 6, pág. 1204, (1988), y Patente de EE.UU. 5.011.912). El péptido Flag^{R} es altamente antigénico y proporciona un epítopo reversiblemente unido mediante un anticuerpo monoclonal específico, lo cual permite un rápido ensayo y fácil purificación de la proteína recombinante expresada. Los sistemas de expresión útiles para la fusión del octapéptido Flag^{R} al N- o C-terminal de una proteína dada se encuentran disponibles de Estaman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, CT, al igual que lo están los anticuerpos monoclonales que se unen al octapéptido.

Abarcados por la presente invención se encuentran los polipéptidos OSM-R\beta en la forma de oligómeros, tales como dímeros o trímeros. Dichos oligómeros pueden presentarse de manera natural o producirse mediante tecnología de DNA recombinante. La presente invención proporciona oligómeros de OSM-R\beta (preferiblemente, el dominio extracelular o un fragmento del mismo), ligados por enlaces disulfuro o expresados como proteínas de fusión con o sin ligadores péptidos. Los oligómeros pueden formarse, por ejemplo, mediante enlaces disulfuro entre restos de cisteína sobre diferentes polipéptidos OSM-R\beta. En otra realización, los oligómeros OSM-R\beta pueden prepararse usando polipéptidos derivados a partir de inmunoglobulinas, tal como se ha descrito anteriormente.

Las variantes de OSM-R\beta que se producen de manera natural se encuentran igualmente abarcadas por la presente invención. Los ejemplos de dichas variantes son proteínas que resultan de episodios de corte y empalme de mRNA alternativos o de la escisión proteolítica de la proteína OSM-R\beta, en la que se ha retenido la actividad biológica deseada. El corte y empalme alternativo de mRNA puede producir una proteína OSM-R\beta truncada pero biológicamente activa, tal como, por ejemplo, una forma soluble producida de manera natural de la proteína. Las variaciones atribuibles a la proteolísis incluyen, por ejemplo, diferencias en el N- o C-terminal durante la expresión en diferentes tipos de células huéspedes, debido a la separación proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de la proteína OSM-R\beta (generalmente a partir de 1-5 aminoácios terminales). Las variantes de gp130 que se producen de manera natural pueden usarse en los receptores de la invención.

La presente invención proporciona igualmente una composición farmacéutica que comprende una proteína receptor de la presente invención con un vehículo o diluyente aceptable fisiológicamente. Dichos vehículos y diluyentes serán no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones usadas. Dichas composiciones pueden comprender, por ejemplo, una proteína receptor en una solución tamponada, a la cual puede agregarse antioxidantes tal como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente diez restos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos incluyendo sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tal como EDTA, glutationa y otros estabilizadores y excipientes. El receptor de la presente invención puede administrarse mediante cualquier procedimiento adecuado de una manera apropiada a la indicación, tal como inyección intravenosa, administración local, infusión continua, liberación sostenida a partir de implantes, etc.

El receptor heterodímero de la presente invención (que comprende gp130 y OSM-R\beta) es útil como un reactivo de unión a oncostatina M. Este receptor, el cual preferiblemente comprende gp130 soluble y OSM-R\beta soluble, tiene aplicaciones tanto in vitro como in vivo. Los receptores pueden usarse en ensayos in vitro, p. ej., en estudios del mecanismo de la transducción de la señal biológica que se inicia mediante la unión de oncostatina M a este receptor sobre una célula. Dichos receptores podrían igualmente usarse para inhibir una actividad biológica de oncostatina M en varios ensayos in vivo o en procedimientos in vitro. En una realización de la invención, el receptor de la invención se administra para unirse a oncostatina M, inhibiéndose, de esta forma, la unión de la oncostatina M a receptores de superficie de célula endógenos. Igualmente, se inhibe de esta forma la actividad biológica mediada por dicha unión de oncostatina M a las células.

La gp130 sola se une a oncostatina M, pero con relativamente baja actividad (Gearin y otros, Science, vol. 255, pág. 1434, (1992)). Los receptores heterodímeros que comprenden un receptor del factor inhibidor de la leucemia (LIF) y gp130 se unen a oncostatina M con mayor afinidad de lo que lo hace la gp130 sola, pero igualmente une el LIF con alta afinidad (Gearin y otros, véase cita anterior). Los receptores de la presente invención, producidos mediante células co-transfectadas, por ejemplo, con DNA que contiene la codificación de OSM-R\beta y gp130, se unen a oncostatina M con alta afinidad pero no funcionan como unos receptores de LIF de alta afinidad. Dichos receptores de la presente invención pueden usarse cuando, por ejemplo, se desea la inhibición de una actividad mediada por oncostatina M, pero no una actividad mediada por LIF. La oncostatina M comparte ciertas propiedades con el LIF, pero muestra otras actividades que no son mostradas por el LIF. Además, el uso de receptores de la invención en ensayos in vitro ofrece la ventaja de permitir determinar que los resultados del ensayo son atribuibles a la unión de la oncostatina M, pero no al LIF, por el receptor.

En una realización de la invención, se administra in vivo un receptor heterodímero que comprende OSM-R\beta y gp130, para inhibir un actividad biológica de oncostatina M. La oncostatina M ha mostrado desarrollo de actividad modulante sobre una diversidad de tipos de células diferentes, y se ha informado que estimula la hematopoyesis, estimula la proliferación de células epiteliales, incrementa la actividad plasmina (induciendo, con ello, la fibrinolísis), inhibe la angiogénesis y suprime la expresión de antígenos complejos de histocompatibilidad principal sobre células endoteliales. Véanse, la Solicitud PCT WO 9109057 y la Solicitud de Patente Europea No. 422.186. Cuando no son deseables estos u otros efectos biológicos de la oncostatina M, puede administrarse un receptor de la presente invención para unirse a la oncostatina M.

El receptor de la invención puede administrarse a un paciente en una cantidad eficaz terapéuticamente con el fin de tratar un trastorno mediado por la oncostatina M. Se dice que un trastorno está mediado por la oncostatina M cuando la oncostatina M causa (directamente o indirectamente) o exacerba el transtorno. Pueden usarse proteínas receptores solubles para unirse de manera competitiva a la oncostatina M, inhibiéndose, de esta forma, la unión de la oncostatina M a receptores de superficie de célula endógenos. Se estima que la oncostatina M estimula la producción de la interleuquina-6 (IL-6), tal como ha sido informado por Brown y otros en J. Immunol., vol. 147, pág. 2175, (1991). De acuerdo con ello, la oncostatina M puede mediar indirectamente en trastornos asociados con la presencia de IL-6. Se ha informado que la IL-6 está implicada en la patogénesis del sarcoma de Kaposi asociado al SIDA (deWit y otros, J. Intern. Med. [England]., vol. 229, pág. 1432, (1991)). Se ha informado que la oncostatina M juega un papel en la estimulación de la proliferación de las células del sarcoma de Kaposi (Nair y otros, Science, vol. 255, pág. 1430, (1992) y Miles y otros, Science, vol. 255, 1432, (1992)). La unión de la oncostatina M por un receptor de la presente invención (preferiblemente una forma soluble del mismo), puede, de acuerdo con ello, ser útil en el tratamiento del sarcoma de Kaposi.

Los receptores heterodímeros que comprenden OSM-R\beta ligado a gp130 encuentran igualmente uso en ensayos para determinar la actividad biológica de proteínas de oncostatina M, cuya actividad biológica se mide en términos de afinidad de unión por el receptor. Con fines ilustrativos, el receptor puede usarse en un ensayo de unión con el fin de medir la actividad biológica de un fragmento, variante, o muteína de oncostatina M. El receptor es útil para la determinación de en qué casos se retiene la actividad biológica de la oncostatina M después de la modificación de una proteína de oncostatina M (p. ej., modificación química, mutación, etc.). La afinidad de unión de la proteína de oncostatina M modificada por el receptor se compara con la de una proteína de oncostanina M no modificada con el fin de detectar cualquier impacto adverso de la modificación sobre la actividad biológica. De esta forma, puede confirmarse la actividad biológica antes de usar la proteína modificada, por ejemplo, en un estudio o ensayo de investigación.

Los receptores heterodímeros encuentran uso igualmente como reactivos que pueden usarse por aquellos que llevan a cabo estudios de "seguridad de la calidad", p. ej., para monitorizar la vida media y la estabilidad de proteínas de oncostatina M bajo diferentes condiciones. Los receptores pueden usarse para confirmar la actividad biológica (en términos de afinidad de unión por el receptor) en proteínas de oncostatina M que han sido almacenadas a diferentes temperaturas, durante diferentes períodos de tiempo, o que, por ejemplo, han sido producidas en diferentes tipos de sistemas de expresión recombinantes.

La presente invención proporciona además fragmentos de las secuencias de nucleótidos de OSM-R\beta aquí presentados. Dichos fragmentos comprenden, de manera deseable, al menos aproximadamente 14 nucleótidos de la secuencia presentada en la SEC ID NO:5. Los complementos de DNA y RNA de dichos fragmentos se proporcionan aquí, conjuntamente tanto con las formas de hebra sencilla como de hebra doble del DNA de OSM-R\beta.

Entre los usos de dichos fragmentos de ácido nucléico, se encuentra el uso como una sonda. Dichas sondas pueden usarse en procedimientos de hibridación en especies cruzadas para aislar DNA de OSM-R\beta a partir de especies de mamíferos adicionales. A modo de ejemplo, puede usarse una sonda correspondiente al dominio extracelular de OSM-R\beta. Las sondas encuentran igualmente uso en la detección de la presencia de ácidos nucléicos de OSM-R\beta en ensayos in vitro y en procedimientos tales como transferencias Northern y Southern. Pueden identificarse tipos de células que expresan OSM-R\beta. Dichos procedimientos son bien conocidos, y un técnico experto puede elegir una sonda de una longitud adecuada, dependiendo de la aplicación particular a que se destine. Las sondas pueden marcarse (p. ej., con ^{32}P) mediante técnicas convencionales.

Otros fragmentos útiles de los ácidos nucléicos de OSM-R\beta son oligonucleótidos de sentido o antisentido que comprenden una secuencia de ácido nucléico de hebra sencilla (tanto RNA como DNA), capaz de unirse a secuencias diana de mRNA de OSM-R\beta (sentido) o de DNA de OSM-R\beta (antisentido). Los oligonucleótidos de sentido o antisentido, de acuerdo con la presente invención, pueden comprender un fragmento de la región de codificación de cdNA de OSM-R\beta. Generalmente, un fragmento de este tipo comprende al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente desde aproximadamente 14 hasta aproximadamente 30 nucleótidos. La capacidad para crear un oligonucleótido de sentido o antisentido basado en una secuencia de cDNA para una proteína dada, se describe, por ejemplo, por Stein y Cohen en Cancer Res., vol. 48, pág. 2659, (1988) y por van der Krol y otros, en BioTechniques, vol. 6, pág. 958, (1988).

La unión de oligonucleótidos de sentido o antisentido a secuencias de ácido nucléico diana, da como resultado la formación de dúplex que bloquean la traducción (RNA) o la transcripción (DNA) por uno de entre varios medios, incluyendo la degradación potenciada de los dúplex, la terminación prematura de la transcripción o traducción, o por otros medios. De acuerdo con ello, los oligonucleótidos antisentido pueden usarse para bloquear la expresión de proteínas de OSM-R\beta.

Los oligonucleótidos de sentido o antisentido comprenden, además, oligonucleótidos que tienen estructuras principales fosfodiéster-azúcar modificadas (u otros enlaces azúcar, tales como los descritos en WO 91/06629) y en donde dichos enlaces azúcar son resistentes a nucleasas endógenas. Dichos oligonucleótidos con enlaces azúcar resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resistir la degradación enzimática), pero retienen la especificidad de la secuencia para ser capaz de unirse a secuencias de nucleótidos diana. Otros ejemplos de oligonucleótidos de sentido o antisentido incluyen aquellos oligonucleótidos que están covalentemente unidos a partes orgánicas, tales como los descritos en la WO 90/10448, y otras partes que incrementan la afinidad del oligonucleótido por una secuencia de ácido nucléico diana, tal como poly-(L-lisina). Además aún, pueden unirse agentes de intercalamiento, tal como elipticina, y agentes de alquilación o complejos de metales, a oligonucleótidos antisentido para modificar las especificidades de unión del oligonucleótido de sentido o antisentido por la secuencia de nucleótido diana.

Los oligonucleótidos de sentido o antisentido pueden introducirse dentro de una célula que contenga la secuencia de ácido nucléico diana mediante cualquier procedimiento de transferencia de genes, incluyendo, por ejemplo, la transfección de DNA mediada por CaPO_{4}, la electroporación, o mediante el uso de vectores de transferencia de genes tal como el virus Epstein-Barr. Preferiblemente, los oligonucleótidos de sentido o antisentido se introducen dentro de una célula que contiene la secuencia de ácido nucléico diana mediante inserción del oligonucleótido de sentido o antisentido dentro de un vector retrovírico adecuado y, a continuación, poniendo en contacto la célula con el vector retrovírico que contiene la secuencia insertada, tanto in vivo como ex vivo. Los vectores retrovíricos adecuadas incluyen, pero sin limitarse a ellos, los derivados a partir del retrovirus múrido M-MuLV, del N2 (un retrovirus derivado a partir de M-MuLV), o de los vectores de doble copia designados como DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase, Solicitud PCT US 90/02656).

Los oligonucleótidos de sentido o antisentido pueden igualmente introducirse dentro de una célula que contenga la secuencia de ácido nucléico diana, mediante la formación de un complejo oligonucleótido-lípido, tal como se describe en WO 90/10448. Preferiblemente, el complejo oligonucleótido-lípido de sentido o antisentido se disocia dentro de la célula mediante una lipasa endógena.

Los ejemplos siguientes se proporcionan con el fin de ilustrar ciertas realizaciones de la invención, pero no deben de considerarse como limitativos del alcance de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento de DNA que contienen la codificación de OSM-R\beta

El DNA que contiene la codificación de la subunidad \beta del receptor de oncostatina M se aisló tal como sigue a continuación. El procedimiento comenzó con la preparación de oligonucleótidos que degeneran a secuencias de aminoácidos que están conservadas entre proteínas de la familia receptor de hematopoyetina.

La alineación de las secuencias de aminoácidos de tres proteínas en la familia receptor de hematopoyetina (gp130, receptor LIF, y receptor G-CSF) revela varias regiones altamente conservadas. Dichas regiones conservadas han sido identificadas y expuestas por Gearing y otros, en Polyfuncional Cytokines: IL-6 and LIF, Bock y otros, Eds., John Wiley & Sons, Chichester, UK, pág. 245, (1992). Después de la inclusión de secuencias homólogas procedentes igualmente de la cadena \gamma del receptor IL-2 (Takeshita y otros, Science, vol. 257, pág. 379, (1992)), se prepararon mediante técnicas convencionales los oligonucleótidos que degeneran hasta algunas de las regiones conservadas (es decir, conjuntos de oligonucleótidos que incluyen todas las secuencias de DNA posibles que pueden contener el código de las secuencias de aminoácidos en las regiones conservadas).

Se usaron dos conjuntos de oligonucleótidos degenerados como cebadores en una reacción de cadena de polimerasa (PCR). Los cebadores 5' se degeneraron a la secuencia de aminoácidos PheArgXArgCys (SEC ID NO:9), la cual se encuentra en las posiciones 275-279 de la secuencia de gp130 de la SEC ID NO:2, en donde X representa Ile (encontrada en dicha posición en gp130 y LIF-R) o Val (para IL-2R\gamma). Igualmente, se usaron los cebadores 5' adicionales para degenerar a la secuencia LeuGlnIleArgCys (SEC ID NO:10), la cual se encuentra en la posición correspondiente en G-CSF-R. Los cebadores 3' se degeneraron a la secuencia de aminoácidos TrpSerXTrpSer (SEC ID NO:11), la cual se encuentra en las posiciones 288-292 de la secuencia de gp130 de la SEC ID NO:2, en donde X representa Asp (encontrada en dicha posición en gp130 y FG-CSF-R), Lys (para LIF-R), o Glu (para IL-2R\gamma).

Con el fin de comprobar la viabilidad de esta vía, la PCR se llevó a cabo usando los cebadores anteriormente descritos con DNA de LIF-R, gp130, G-CSF-R, o IL-2R\gamma, como molde. Las reacciones se llevaron a cabo mediante técnicas convencionales, y los productos de reacción se analizaron mediante electroforésis sobre gel. Para cada reacción, se observó sobre el gel una banda de aproximadamente un tamaño de 50 pares de bases, lo que indica una amplificación satisfactoria de un fragmento de DNA del tamaño esperado.

A continuación, se llevó a cabo la PCR usando DNA humano genómico como molde. Los productos de reacción se analizaron mediante electroforésis sobre gel, y se visualizó una banda de 50 pb. Esta banda se escindió a partir del gel, y de ella se eluyó el DNA. El DNA se subclonó dentro del vector de clonación pBLUESCRIPT^{R} SK, el cual se encuentra disponible de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, California. Las células de E. coli se transformaron con los vectores recombinantes resultantes, y las colonias individuales de los transformantes se cultivaron en placas de 96 cavidades.

Se eligieron aleatoriamente doce colonias y, de ellas, se aislaron los vectores recombinantes. Se determinaron las secuencias de nucleótidos de los insertos de DNA de los vectores. Siete de estos insertos se identificaron por su secuencia como DNA de gp130, dos fueron LIF-R, una contenía un codón de parada y no pareció ser de interés, y dos contenían una nueva secuencia (la misma secuencia, en ambas orientaciones). Mediante técnicas estándar, se preparó y marcó con ^{32}P una sonda de oligonucleótidos que contenía esta nueva secuencia (la porción del inserto que está entre las dos secuencias cebadoras).

La sonda marcada con ^{32}P se usó para rastrear dos bibliotecas de cDNA diferentes, una derivada a partir de placenta humana y la otra a partir de una línea de células designada como IMTLH-1. La biblioteca placentaria se eligió debido a que la placenta es una fuente rica de factores de desarrollo y de diferenciación. Las células IMTLH, obtenidas mediante transformación de células estromáticas de médula ósea humana con pSV-neo, se eligieron debido a que se encontró que se unían a la oncostatina M pero no al LIF (Thoma y otros, J. Biol. Chem., vol. 269, pág. 6215, (1994)). Además, se detectó una banda de RNA de aproximadamente 5,5-6,0 kb sobre transferencia Northern de RNA derivado a partir de células IMTLH-1 y placenta, sondada con la sonda marcada con ^{32}P identificada anteriormente.

A partir de las bibliotecas, se aislaron clones positivos y se determinaron mediante secuenciación de DNA, con el fin de contener varias porciones del nuevo DNA de interés. Aunque se identificó un codón iniciador (que indica el extremo 5' de una región de codificación), ninguno de los clones pareció contener el codón de parada que representaría el extremo 3' de la región de codificación.

Mediante técnicas estándar, se sintetizó y marcó con ^{32}P una sonda de oligonucleótido que correspondía a la secuencia encontrada cerca del extremo 3' de varios de los clones. La sonda se usó para rastrear una biblioteca de cdNA derivada a partir de la línea de células de fibroblasto de pulmón humano transformada con SV40, la WI-26 VA4. Esta biblioteca se construyó tal como se describe en el Ejemplo 2 de la Patente de EE.UU. 5.264.416. Se aislaron los clones que comprendían la secuencia de codificación adicional en el extremo 3' (comparada con los anteriores clones identificados previamente).

Se construyó un vector de expresión, que contenía un fragmento de DNA que comprende este extremo 3' de la nueva secuencia ligada a fragmentos de DNA procedentes de los clones anteriormente descritos que contienen el extremo 5' de la nueva secuencia. La secuencia de nucleótido del DNA de OSM-R\beta humano en el vector recombinante resultante, se presenta en la SEC ID NO:5. La proteína codificada por el DNA aislado se presenta en la SEC ID NO:6.

El vector era un vector de expresión de mamífero designado como pDC409. Este vector es similar al pDC406, descrito por McMahan y otros (EMBO J., vol. 10, pág. 2821, (1991)). Un sitio BglII fuera del sitio de clonación múltiple (mcs) en pDC406 ha sido borrado, de forma tal que el sitio BgIII en el mcs de pDC409 es único. El sitio de clonación múltiple (mcs) de pDC409 difiere del de pDC406 en que contiene sitios de restricción adicionales y tres codones de parada (uno en cada marco de lectura). Un promotor T7 polimerasa más abajo de los mcs, facilita la secuenciación de DNA insertado dentro de los mcs.

El inserto de cDNA de OSM-R\beta se escindió a partir de un vector de expresión usando enzimas de restricción que escinden dentro de las regiones de no codificación de 5' y 3' del cDNA. El cDNA escindido se ligó dentro del sitio EcoRV del vector de clonación pBluescript^{R} SK (Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA). El sitio EcoRV, encontrado en el sitio de clonación múltiple del vector, se destruyó mediante la inserción del cDNA. Células de E. coli transformadas con el vector recombinante resultante se depositaron en el American Culture Type Collection, Rockville, MD, USA, el 16 de Agosto de 1994, asignándose el número de registro ATCC 69675. El depósito se efectuó bajo los términos del Tratado de Budapest.

La secuencia de aminoácidos OSM-R\beta que contiene el código presentado en la SEC ID NO:6, comprende un péptido de señal N-terminal (aminoácidos -27 a -1) seguido de un dominio extracelular (aminoácidos 1 a 74), una región transmembrana (aminoácidos 715 a 734) y un dominio citoplásmico (aminoácidos 735 a 952). La secuencia de aminoácidos de OSM-R\beta es aproximadamente un 30% idéntica a la de la proteína receptor del LIF descrita por Gearing y otros (EMBO J., vol. 10, pág. 2839, (1991) y en la Patente de EE.UU. 5.284.755, lo cual se incorpora aquí como referencia. La secuencia de DNA de la región de codificación de OSM-R\beta es aproximadamente un 48% idéntica a la porción de DNA del LIF-R que se alinea con la región de codificación de OSM-R\beta cuando se usa el programa de ordenador GAP anteriormente descrito.

Ejemplo 2 Ensayo para detectar la unión a oncostatina M

Tal como se indica a continuación, se llevó a cabo un ensayo para determinar la unión de oncostatina M por células que expresan tanto gp130 recombinante como OSM-R\beta recombinante. Igualmente, se llevó a cabo un ensayo para determinar la unión de oncostatina M por células que expresan gp130 sola, con fines comparativos.

La oncostatina M puede purificarse a partir de células en las cuales la proteína se encuentra de manera natural, o a partir de células transformadas con un vector de expresión que contiene la codificación de oncostatina M. Una fuente de oncostatina M es las células U937 tratadas con éster de forbol, tal como ha sido descrito por Zarling y otros, en PNAS U.S.A., vol. 83, pág. 9739, (1986). La purificación de la oncostatina M recombinante ha sido descrita por Linsley y otros (J. Biol. Chem., vol. 264, pág. 4282-4289, (1989)) y por Gearing y otros EMBO J., vol. 10, pág. 2839, (1991)).

La oncostatina M (OSM) puede radiomarcarse usando cualquier procedimiento convencional adecuado. La radioyodación de la oncostatina M ha sido descrita, por ejemplo, por Linsley y otros (véase cita anterior). En un procedimiento adecuado, la OSM se radiomarca usando un reactivo de radioyodación en forma de enzimo-esférulas comercialmente disponibles (BioRad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La ^{125}I-OSM se diluye con una solución madre de trabajo en medio de unión, el cual es medio RPMI 1640 que contiene albúmina de suero bovino (BSA) al 2,5% (p/v), azida sódica al 0,2% (p/v), y Hepes 20 mM, pH 7,4.

Las células CV1-EBNA-1 en discos de 150 mm (3,6x10^{6} células/disco) se transfectaron con un vector de expresión contiene la codificación de gp130, o se co-transfectaron con el vector que contiene la codificación de gp130 y un vector que contiene la codificación de OSM-R\beta. Todas las células se co-transfectaron adicionalmente con un vector de expresión de mamífero designado como pDC419, descrito más adelante.

El vector que contiene la codificación de OSM-R\beta fue el vector recombinante descrito en el Ejemplo 1, el cual comprende la longitud total del DNA de OSM-R\beta en el vector de expresión de mamífero pDC409. El vector que contiene la codificación de gp130 comprende la secuencia de DNA de gp130 humano de la SEC ID NO:1 en un vector de expresión de mamífero designado como pDC304. Un vector recombinante similar, que comprende el mismo DNA que contiene la codificación de gp130 en el vector de expresión de mamífero pDC303, se depositó en células huéspedes de la cepa DH5\alpha de E. coli en el American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Estas células transformadas se depositaron bajo el nombre B10G/pDC303 (DH5\alpha) el 14 de Noviembre de 1991, asignándose el No. de Registro de ATCC 68827. El depósito se efectuó bajo los términos del Tratado de Budapest.

El pDC304 comprende un sitio NotI en su sitio de clonación múltiple, pero es, por otra parte, idéntico al pDC303. Igualmente, el pDC304 es idéntico al pCAV/NOT, descrito en la Solicitud PCT WO 90/05183, excepto que ha sido eliminado un segmento del conductor tripartito del adenovirus-2 (TPL) que contiene un promotor funcional críptico en bacterias. La expresión de proteína a partir del promotor críptico es potencialmente perjudicial para la preparación y aislamiento de un plásmido recombinante deseado en células bacterianas.

El vector pDC410 es idéntico al vector pDC409 descrito en el Ejemplo 1, excepto que el origen de replicación del pDC409 está reemplazado por DNA que contiene la codificación del antígeno T grande de SV40 impulsado a partir del promotor SV40 en pDC410. La co-transfección de estas células con este vector proporciona el antígeno T de SV40, el cual impulsa la replicación de alto nivel de DNA de los otros vectores plásmidos, que contienen el origen de replicación de SV40. De acuerdo con ello, el pDC410 es importante para la replicación episómica de los vectores co-transfectados en células CV1-EBNA-1.

Las células transfectadas se cultivaron durante 24 horas, se tripsinizaron y volvieron a sembrar en placas y, a continuación, se cultivaron durante otras 24 horas para permitir la expresión de las proteínas codificadas, las cuales se retuvieron sobre la membrana de la célula. Las células adherentes se desprendieron usando EDTA 5 mM en pBS y, a continuación, se lavaron dos veces con medio de unión (medio RPMI 1640 conteniendo 25 mg/ml de albúmina de suero bovino, 2 mg/ml de azida sódica, y HEPES 20 mM, pH 7,2).

A continuación, las células se incubaron con varias concentraciones de oncostatina M marcada con ^{15}I en medio de unión durante 1 hora a 37ºC con agitación suave.

La ^{125}I-oncostatina M libre y unida con células se separaron usando el procedimiento de separación de aceite de ftalato de Dower y otros (J. Immunol., vol. 132, pág. 751, (1984)), esencialmente tal como ha sido descrito por Park y otros (J. Biol. Chem., vol. 261, pág. 4177, (1986), y Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 84, pág. 5267, (1987)). La ^{125}I-oncostatina M libre y unida con células se cuantificaron sobre un Packard Autogamma Counter. Los cálculos de afinidad (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci., vol. 51, pág. 660, (1949)) se generaron sobre RS/1 (BNN Sofware, Boston, MA), operando sobre un ordenador Microvax.

Los resultados se presentan en las Figuras 1 y 2, en la forma de análisis Scatchard. La Figura 1 presenta los resultados para células que expresan gp130 solo. Estas células transfectadas mostraron una única clase de afinidad de unión, con aproximadamente 29.310 sitios receptores por célula, y una constante de afinidad (Ka) de 2,64x10^{8}. La Figura 2 presenta los resultados para células que expresan gp130 y OSM-R\beta. Puede observarse un patrón bifásico, lo que indica dos componentes de unión. El primer componente (aproximadamente 2196 sitios receptores por célula) mostró una constante de afinidad de 7,18x10^{9}. El segundo componente (aproximadamente 36.471 sitios receptores por célula) mostró una constante de afinidad de 2,38x10^{8}. De acuerdo con ello, se observa un componente de unión de relativamente alta afinidad en las células que expresan tanto gp130 como OSM-R\beta. Estos sitios de alta afinidad estuvieron ausentes en las células que expresan gp130 solo.

Las células co-transfectadas con vectores de expresión que contienen la codificación tanto de OSM-R\beta como de gp130 expresaron una proteína receptor de la presenta invención. El receptor se une a la oncostatina M con mayor afinidad de lo que lo hace la proteína gp130 expresada sobre células transfectadas con el vector que contiene la codificación de gp130 solo.

Ejemplo 3 Preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos contra OSM-R\beta

Los polipéptidos de OSM-R\beta purificados de la presente invención se usaron como inmunógenos para generar anticuerpos monoclonales inmunoreactivos con ellos, usando técnicas convencionales, por ejemplo, las descritas en la Patente de EE.UU. 4.411.993. Los inmunógenos adecuados incluyen, pero sin limitarse a ellos, OSM-R\beta recombinante de longitud total o fragmentos del mismo, tal como el dominio extracelular. Con el fin de inmunizar ratones, el inmunógeno se emulsificó en adyuvante de Freund completo y se inyectó subcutáneamente en cantidades que variaron desde 10-100 \mug en ratones Balb/c. Diez a doce días después, los ratones se reforzaron con inmunógeno adicional emulsificado en adyuvante de Freund incompleto y, después de esto, se reforzaron periódicamente de acuerdo con un calendario de inmunización semanalmente o quincenalmente. Las muestras de suero se extrajeron periódicamente mediante sangrado retro-orbital o mediante corte en la punta de la cola para comprobación mediante el ensayo de mancha de puntos (sándwich de anticuerpo) o mediante ELISA (ensayo inmunoenzimático). Otros procedimientos de ensayo son igualmente adecuados.

Después de la detección de un título de anticuerpo apropiado, a los animales positivos se les administró una inyección intravenosa de antígeno en solución salina. Tres o cuatro días más tarde, los animales se sacrificaron, se recogieron los esplenocitos, y se fusionaron a una línea de células de mieloma múrido, p. ej., NS1 o, preferiblemente, P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las líneas de células de hibridoma generadas mediante este procedimiento se sembraron en placas de microvaloración múltiples en un medio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina, y timidina) para inhibir la proliferación de las células no fusionadas, los híbridos de mieloma, y los híbridos de células de bazo.

Los clones de hibridoma así generados pueden ser rastreados mediante ELISA para determinar su reactividad con la proteína receptor, por ejemplo, mediante adaptaciones de la técnica descrita por Engvall y otros, en Immunochem., vol. 8, pág. 871, (1971)) y en la Patente de EE.UU. 4.704.004. Una técnica de rastreo preferida es la técnica de captura de anticuerpos descrita por Beckmann y otros (J. Immunol., vol. 144, pág. 4212, (1990)). A continuación, los clones positivos se inyectaron dentro de las cavidades peritoneales de ratones Balb/c singénicos para producir ascitis conteniendo altas concentraciones (superiores a 1 mg/ml) de anticuerpo monoclonal anti-OSM-R\beta. El anticuerpo monoclonal resultante puede purificarse mediante precipitación con sulfato amónico, seguido de cromatografía de exclusión de gel, y/o cromatografía de afinidad, en base a la unión del anticuerpo a la Proteína A de Staphylococcus aureus.

Ejemplo 4 Receptores que comprenden polipéptidos gp130 que carecen de dominios FNIII

Las secuencias de DNA conteniendo la codificación de proteínas gp130 solubles que carecen de dominios de fibronectina tipo III (FNIII), se aislaron y fusionaron a una secuencia que contiene la codificación de Fc. La deleción del dominio FNIII proporciona la ventaja de reducir el tamaño de la proteína de fusión gp130/Fc. La gp130 contiene tres dominios FNIII, que comprenden los aminoácidos 300 (Tyr) a 399 (Phe), 400 (Gln) a 496 (Pro), y 497 (Pro) a 597 (Glu), respectivamente, de la SEC ID NO:2. Desde uno hasta los tres dominios FNIII pueden separarse de gp130 para reducir el tamaño de la proteína.

Los dominios FNIII de gp130 se separaron mediante digestión de un vector de expresión que contiene la codificación de gp130/Fc recombinante con BstX1 y, a continuación, terminación con extremos romos del colgante, usando DNA polimerasa T4 de acuerdo con procedimientos convencionales. El sitio de reconocimiento para BstX1 liga los nucleótidos 1231-1242 de la SEC ID NO:1 (gp130), mediante escisión dentro de los codones para los aminoácidos 10-11 del primer dominio FNIII de gp130. A continuación, el vector escindido se digerió con EcoR5, el cual se escinde dentro del poliligador del vector más arriba de la secuencia Fc y genera extremos romos. El fragmento (BstX1)/EcoR5 que comprende una secuencia con la codificación del extremo 5' de gp130 (que carece de los dominios FNIII), las secuencias vector, la secuencia Fc, y una porción del poliligador, se ligó para recircular el vector.

Las células E. coli se transformaron con la mezcla de ligamiento, los plásmidos se aislaron a partir de ellas, y el plásmido recombinante deseado se identificó mediante análisis de restricción. La proteína de fusión codificada por el constructo comprende (desde el N-terminal al C-terminal) los aminoácidos -22 a 308 de la SEC ID NO:2 (gp130), un péptido espaciador de cuatro aminoácidos -Asn-Arg-Tyr-Val- codificado por el segmento poliligador, y los aminoácidos 1-232 de SEC ID NO:3 (Fc). La parte de polipéptido gp130 contiene los primeros 9 aminoácidos del primer dominio FNIII, pero carece del resto del dominio FNIII y de la totalidad del segundo y tercer dominio FNIII.

Un receptor heterodímero de la presente invención puede comprender OSM-R\beta y el polipéptido gp130 truncado anterior que carece de dominios FNIII. Las células COS-7 u otras células huéspedes adecuadas son co-transfectadas con vectores de expresión que contienen la codificación de OSM-R\beta y que contienen la decodificación de gp130 truncado. Las células co-transfectadas se cultivaron con el fin de expresar el receptor heterodímero.

Ejemplo 5 Ensayo para la unión de oncostatina M y de LIF por receptores

Se realizó tal como sigue a continuación un ensayo para la unión de oncostatina M o del factor inhibidor de la leucemia (LIF) por varias proteínas receptores. Las proteínas receptores incluyeron OSM-R\beta/Fc soluble, gp130/Fc, LIF-R/Fc, y combinaciones de las mismas. Los resultados del ensayo se presentan en la Figura 3.

Se construyó un vector de expresión tal como sigue a continuación que contenía la codificación de una proteína de fusión OSM-R\beta/Fc soluble, que comprendía un dominio extracelular truncado de OSM-R\beta fusionado al N- terminal de un polipéptido de región Fc derivado a partir de un anticuerpo. El vector de expresión recombinante preparado en el Ejemplo 1, que comprende el DNA de OSM-R\beta en el vector pDC409, se digerió con la enzima de restricción SphI, se trató con DNA polimerasa T4 para separar los colgantes 3' (que generan extremos romos) y, a continuación, se digerió con SalI, que escinde más arriba de la región de codificación de OSM-R\beta. El fragmento deseado, el cual incluye el extremo 5' del DNA de OSM-R\beta que termina en el nucleótido 1744 de la SEC ID NO:5, se aisló mediante técnicas convencionales.

Un vector recombinante, designado como hIgG1Fc, comprende el cDNA que contiene la codificación del polipéptido Fc de la SEC ID NO:3, tal como se ha descrito anteriormente. El vector hIg1Fc se digerió con las enzimas de restricción SnaB1 y NotL, las cuales escinden en la región poliligadora del vector, más arriba y más abajo, respectivamente, del cDNA que contiene la codificación del polipéptido Fc.

El fragmento de DNA que contiene la codificación del polipéptido Fc así aislado y el fragmento de DNA que contiene la codificación de OSM-R\beta anteriormente aislado, se ligaron dentro de un vector de expresión pDC304 digerido con SalI/NotI de manera tal que el DNA del polipéptido Fc se fusionó al extremo 3' del DNA de OSM-R\beta. El vector de expresión de mamífero pDC304 se encuentra descrito en el Ejemplo 2. El vector de expresión resultante contiene el código de una proteína de fusión que comprende los aminoácidos -27 al 432 de la secuencia OSM-R\beta de la SEC ID NO:6, seguido de un resto valina codificado por un segmento poliligador vector, seguido de los aminoácidos 1 al 232 de la secuencia del polipéptido Fc de la SEC ID NO:4.

Tal como se indica a continuación, se construyó un vector de expresión que contiene la codificación de una proteína de fusión gp130/Fc humana soluble. El vector recombinante B10G/pDC303 (ATCC 68827) que comprende el cDNA de gp130 humano se digerió con EcoR1, y el colgante 5' resultante se transformó en extremo romo usando DNA polimerasa T4. El sitio de reconocimiento para EcoR1 comprende los nucleótidos 2056-2061 de la SEC ID NO:1. A continuación, el vector digerido con EcoR1 se escindió con XhoI, que escinde en el vector más arriba del inserto de cDNA de gp130.

El vector hIgG1Fc, que comprende el cDNA que contiene la codificación del polipéptido Fc tal como se ha descrito anteriormente, se digerió con StuI (un cortador romo) y NotI, que escinde más arriba y más abajo, respectivamente, del cDNA de Fc insertado. El fragmento de gp130 XhoI/(EcoR1) aislado anteriormente se ligó al fragmento que contiene Fc y al vector de expresión mamífero pDC304 digerido con XhoI/NotI.

Las células E. coli se transformaron con la mezcla de ligamiento, los plásmidos se aislaron a partir de ellas mediante procedimientos convencionales, y el vector recombinante deseado se identificó mediante análisis de restricción. La proteína de fusión gp130/Fc codificada por el vector recombinante comprende (desde el N-terminal al C-terminal) los aminoácidos -22 al 582 de la SEC ID NO:2 (gp130), seguido de 7 aminoácidos que constituyen un ligador péptido codificado por el segmento poliligador del plásmido hIgG1Fc, seguido de los aminoácidos 1-232 de la SEC ID NO:4 (Fc).

Se construyó un vector de expresión que contiene la codificación de una proteína de fusión LIF-R/Fc humana soluble, tal como se describe en el Ejemplo 5 de la Patente de EE.UU. 5.284.755, la cual se incorpora aquí como referencia. En resumen, un vector recombinante designado como pHLIF-R-65 contiene el cDNA de LIF-R humano (un clon parcial que contiene la codificación de un péptido señal, dominio extracelular, y región transmembrana completos, y un dominio citoplásmico parcial) en el vector pDC303. El vector de expresión mamífero pDC303 está descrito en la Solicitud PCT WO 93/19777. Las células E. coli transformadas con pHLIF-R-65 se depositaron en el American Type Culture Collection, Rockville, MD, el 11 de Diciembre de 1990, asignándose el número de registro 68491. El DNA que contiene la codificación del péptido señal LIF-R y el dominio extracelular (truncado en el C-terminal) se aisló y fusionó al DNA que contiene la codificación de un anticuerpo del polipéptido de región Fc en pBluescript^{R} SK^{-}. La gen de fusión se escindió del vector de clonación y se insertó dentro del vector de expresión mamífero pDC304 anteriormente descrito. El vector de expresión recombinante resultante contiene el código de una proteína de fusión LIF-R/Fc que comprende los aminoácidos -44 al 702 de la secuencia LIF-R presentada en la Patente de EE.UU. 5.284.755, seguido de un ligador que comprende seis aminoácidos que contienen el código de un segmento poliligador vector, seguido de los aminoácidos 1 al 232 de la secuencia de aminoácidos de Fc de la SEC ID NO:4.

Las células CV-1-EBNA se transfectaron con uno de los tres vectores de expresión recombinantes preparados anteriormente, o se co-transfectaron con dos de los vectores, tal como sigue:

\newpage

	Células transfectadas con vector(s)
Experimento	que contiene la codificación:
A	Vector de expresión vacío (control)
B	gp130/Fc
C	LIF-R/Fc
D	OSM-R\beta
E	OSM-R\beta y LIF-R/Fc
F	OSM-R\beta y gp130/Fc
G	gp130/Fc y LIF-R/Fc

Las células transfectadas se cultivaron para permitir la expresión y secreción de las proteínas de fusión dentro del medio de cultivo. A los sobrenadantes del cultivo se agregaron esférulas reticuladas que portaban Proteína A (Protein A Sepharose CL-4B, Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ), con lo cual las proteínas se unieron a las esférulas mediante la interacción de la parte Fc con la Proteína A. Igualmente, se agregó oncostatina M radioyodada o LIF radioyodado a los sobrenadantes del cultivo. La preparación de ^{125}I-oncostatina M se describe en el Ejemplo 2 anterior. Entre los procedimientos conocidos para la purificación y radioyodación de LIF se encuentran los descritos en el Ejemplo 1 de la Patente de EE.UU. 5.284.755. El ^{125}I-LIF usado en este ensayo fue LIF humano recombinante marcado con ^{125}I usando el reactivo enzimoesférula (BioRad).

Los sobrenadantes del cultivo se incubaron con las esférulas de Proteína A y ^{125}I-oncostatina M o ^{125}I-LIF libre y unido a células durante 168 horas a 4ºC. La ^{125}I-oncostatina M o ^{125}I-LIF libre y unido a células se separaron mediante centrifugación a baja velocidad a través de un gradiente de densidad de una sola etapa de 3% de glucosa en PBS. Las proteínas radioyododas unidas a esférulas se cuantificaron sobre un contador Packard Autogamma.

Los resultados se presentan en la Figura 3. El gráfico de barras de la Figura 3 representa la unión de oncostatina M o LIF a las proteínas expresadas mediante células transfectadas tal como se ha descrito anteriormente para los experimentos A a G. Las proteínas expresadas están unidas a esférulas de Proteína A.

El experimento A (control) reveló una unión no significativa de LIF u oncostatina M a proteínas expresadas mediante células transfectadas con el vector de expresión vacío pDC304. La proteína gp130/Fc soluble se une a oncostatina M, pero no se demostró una unión significativa de LIF (experimento B). La proteína LIF-R/Fc soluble se une a LIF, pero no la oncostatina M (experimento C). No se demostró una unión detectable de LIF u oncostatina M por la proteína OSM-R\beta/Fc soluble (experimento D).

Las proteínas expresadas mediante células co-transfectadas con vectores que contienen la codificación de OSM-R\beta y LIF/Fc soluble no unen cantidades detectables de oncostatina M, pero unen LIF (experimento E). Las proteínas expresadas mediante células co-transfectadas con vectores que contienen la codificación de OSM-R\beta soluble y gp130 soluble se unen a la oncostatina M, pero no se unen en cantidades detectables a LIF (experimento F). La unión de oncostatina M en el experimento F podría ser inhibida mediante la inclusión de oncostatina M (no marcada (fría) en el ensayo. Las proteínas expresadas mediante células co-transfectadas con vectores de expresión que contienen la codificación de LIF-R/Fc y gp130 soluble (experimento G) se unen tanto con la oncostatina M como con el LIF. La unión de LIF en el experimento G se inhibió mediante la adición de LIF frío al ensayo.

Las proteínas expresadas cuando las células son co-transfectadas con vectores que contiene la codificación de OSM-R\beta/Fc soluble y gp130/Fc soluble, de acuerdo con la presente invención, unen, en este caso, la oncostatina M pero no el LIF. Esto es ventajoso cuando se desea la unión de oncostatina M (p. ej., para inhibir o estudiar una actividad biológica de la misma), pero no se desea la unión del LIF. Las proteínas expresadas mediante células co-transfectadas con vectores que contiene la codificación de gp130/Fc soluble y OSM-R\beta/Fc soluble, se unen tanto con oncostatina M como con LIF, y, de acuerdo con ello, no ofrecen esta propiedad ventajosa. Además las células que expresan tanto OSM-R\beta/Fc soluble como gp130 soluble, se unen a la oncostatina M a un nivel superior a lo que lo hacen las células que expresan gp130/Fc soluble solo.

Breve descripción del listado de secuencias

La SEC ID NO:1 y la SEC ID NO:2 presentan la secuencia de DNA y la secuencia de aminoácidos codificada para cDNA clonado que contiene la codificación de un fragmento N-terminal de gp130.

La SEC ID NO:3 y la SEC ID NO:4 presentan la secuencia de DNA y la secuencia de aminoácidos codificada para cDNA clonado que contiene la codificación de un polipéptido que corresponde a la región Fc de un anticuerpo IgG1.

La SEC ID NO:5 y la SEC ID NO:6 presentan el DNA y la secuencia de aminoácidos codificada para cDNA clonado que contiene la codificación de la subunidad \beta del receptor de oncostatina M de la presente invención.

La SEC ID NO:7 presenta la secuencia de aminoácidos de un péptido que puede usarse para facilitar la purificación de polipéptidos fusionados con él.

La SEC ID NO:8 presenta la secuencia de un péptido espaciador codificado por un poliligador en un vector de expresión, tal como se describe en el Ejemplo 4.

Las SEC ID NOS:9, 10 y 11 son péptidos que corresponden a secuencias conservadas, tal como se describe en el Ejemplo 1.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: Mosley, Bruce

\hskip3.9cm

Cosman, David J.

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(ii)

TITULO DE LA INVENCION: Receptor para oncostatina M

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NUMERO DE SECUENCIAS: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCION DE LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN: Immunex Corporation

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 51 University Street

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Seattle

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: WA

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAIS: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CODIGO: 98101

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFWARE: PatentIn Release #1, Version #1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD PRESENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NUMERO DE SOLICITUD: US 08/308.881

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACION: 9-SEPT-1994

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACION:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NUMERO DE SOLICITUD: US 08/249.553

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACION: 26-MAYO-1994

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACION DEL PROCURADOR/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Anderson, Kathryn A.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NUMERO DE REGISTRO: 32.172

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACION PARA TELECOMUNICACION:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELEFONO: (206) 587-0430

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (206) 233-0644

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TELEX: 756822

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2369 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: cDNA a mRNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

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(iv)

ANTISENTIDO: NO

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(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: placenta humana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: B10G/pDC303

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACION: 244..2369

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACION: 310..2369

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE CLAVE: sig_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACION: 244..309

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 708 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 705 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: cDNA a mRNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: hIgG1Fc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACION: 1..699

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 232 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4171 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: cDNA a mRNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: huOSM-R\beta

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sig_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACION: 368..448

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACION: 368..3307

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACION: 449..3304

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

14

15

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 979 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: péptido FLAG

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: péptido espaciador

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Arg Tyr Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Arg Xaa Arg Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Gln Ile Arg Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Ser Xaa Trp Ser}

Claims (30)

1. Un receptor purificado capaz de unión a la oncostatina M, que comprende un polipéptido gp130 y un polipéptido de la cadena \beta del receptor de oncostatina M (OSM-R\beta), en el que:

a) dicho polipéptido gp130 está seleccionado entre el grupo formado por:

i)

el polipéptido gp130 de la SEC ID NO:2; y

ii)

un polipéptido gp130 biológicamente activo que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica a la secuencia presentada como los aminoácidos 1 a 686 de la SEC ID NO:2;

b) dicho polipéptido OSM-R\beta está seleccionado entre el grupo formado por:

iv)

el polipéptido OSM-R\beta de la SEC ID NO:6; y

v)

un polipéptido OSM-R\beta biológicamente activo que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica a la secuencia presentada como los aminoácidos 1 a 952 de la SEC ID NO:6.

2. Un receptor de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicho receptor comprende un polipéptido gp130 soluble covalentemente ligado a un polipéptido OSM-R\beta soluble.

3. Un receptor de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicho receptor comprende gp130 covalentemente ligado a OSM-R\beta mediante un ligador péptido.

4. Un receptor de acuerdo con la Reivindicación 3, en el que dicho receptor es una proteína de fusión recombinante de la fórmula:

R_{1}-L-R_{2}

\hskip1cm

o

\hskip1cm

R_{2}-L-R_{1}

en donde R_{1} representa un gp130 soluble; R_{2} representa un OSM-R\beta soluble, y L representa un ligador péptido.

5. Un receptor de acuerdo con la Reivindicación 4, en el que dicho gp130 soluble comprende los aminoácidos 1 a y de la SEC ID NO:2, en donde y representa un número entero entre 308 y 597, inclusives; y dicho OSM-R\beta soluble comprende los aminoácidos 1 a x de la SEC ID NO:6, en donde x es un número entero entre 432 y 714, inclusives.

6. Una secuencia de DNA aislado que contiene la codificación de la proteína de fusión de la Reivindicación 4 ó 5.

7. Un vector de expresión recombinante que comprende la secuencia de DNA de la Reivindicación 6.

8. Un procedimiento para la preparación de un receptor de acuerdo con la Reivindicación 4 ó 5, que comprende el cultivo de una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de DNA que contiene la codificación de dicha proteína de fusión bajo condiciones que promueven la expresión de dicha proteína de fusión, y la recuperación de dicha proteína de fusión.

9. Un receptor de acuerdo con la Reivindicación 2, que comprende una primera proteína de fusión que comprende un polipéptido de región Fc anticuerpo unido al C-terminal de un gp130 soluble, y una segunda proteína de fusión que comprende un polipéptido de región Fc anticuerpo unido al C-terminal de un OSM-R\beta soluble, en el que dicha primera proteína de fusión está ligada a dicha segunda proteína de fusión a través de uniones disulfuro entre los polipéptidos de región Fc.

10. Un procedimiento para la preparación de un receptor de acuerdo con la Reivindicación 9, que comprende el cultivo de una célula huésped co-transfectada con un primer vector de expresión que contiene la codificación de dicha primera proteína de fusión y con un segundo vector de expresión que contiene la codificación de dicha segunda proteína de fusión, bajo condiciones que promueven la expresión de dicha primera y segunda proteínas de fusión, y la recuperación de dicho receptor.

11. Un receptor de acuerdo con la Reivindicación 9, en el que dicho gp130 soluble comprende los aminoácidos 1 a y de la SEC ID NO:2, en donde y representa un número entero entre 308 y 597, inclusives; y dicho OSM-R\beta soluble comprende los aminoácidos 1 a x de la SEC ID NO:6, en donde x es un número entero entre 432 y 714, inclusives.

12. Un receptor de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que:

dicho polipéptido gp130 es un polipéptido gp130 biológicamente activo codificado por un DNA seleccionado entre el grupo formado por:

a) DNA que comprende la región de codificación de la secuencia de nucleótido presentada en la SEC ID NO:1;

b) DNA capaz de hibridarse al DNA de (a) bajo condiciones altamente restrictivas que incluyen la hibridación a 68ºC, seguido de lavado en 0,1X SSC/SDS al 0,1% a 63-68ºC; y

c) DNA que contiene la codificación de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID NO:2;

dicho polipéptido OSM-R\beta es un polipéptido biológicamente activo codificado por un DNA seleccionado entre el grupo formado por:

a') DNA que comprende la región de codificación de la secuencia de nucleótido presentada en la SEC ID NO:5;

b') DNA capaz de hibridarse al DNA de (a') bajo condiciones altamente restrictivas que incluyen la hibridación a 68ºC, seguido de lavado en 0,1X SSC/SDS al 0,1% a 63-68ºC; y

c') DNA que contiene la codificación de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID NO:6.

13. Una composición farmacéutica que comprende un receptor de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, 9, 11 ó 12, y un diluyente o vehículo aceptable fisiológicamente.

14. Un DNA aislado que contiene la codificación de un polipéptido OSM-R\beta, en el que dicho DNA está seleccionado entre el grupo formado por:

a) DNA que contiene la codificación de un polipéptido OSM-R\beta que comprende los aminoácidos -27 a 952 de la SEC ID NO:6;

b) DNA que contiene la codificación de un polipéptido OSM-R\beta que comprende los aminoácidos 1 a 952 de la SEC ID NO:6; y

c) un polipéptido OSM-R\beta biológicamente activo que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica a la secuencia presentada como los aminoácidos 1 a 952 de la SEC ID NO:6.

15. Un DNA aislado de acuerdo con la Reivindicación 14, en el que dicho OSM-R\beta comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo formado por los aminoácidos -27 a 952 y los aminoácidos 1 a 952 de la SEC ID NO:6.

16. Un DNA aislado de acuerdo con la Reivindicación 14, en el que dicho DNA contiene el código de un polipéptido OSM-R\beta soluble.

17. Un DNA aislado de acuerdo con la Reivindicación 16, en el que dicho polipéptido OSM-R\beta soluble comprende los aminoácidos -27 a x ó 1 a x de la SEC ID NO:6, en donde x es un número entero entre 432 y 714, inclusives.

18. Un vector de expresión que comprende un DNA de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 14 a 17.

19. Un procedimiento para la preparación de un polipéptido OSM-R\beta, que comprende el cultivo de una célula huésped transformada con un vector de acuerdo con la Reivindicación 18, bajo condiciones que promueven la expresión de OSM-R\beta, y la recuperación del polipéptido OSM-R\beta.

20. Un polipéptido OSM-R\beta codificado por un DNA de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 14 a 17.

21. Un polipéptido OSM-R\beta de acuerdo con la Reivindicación 20, en el que dicho OSM-R\beta es un polipéptido OSM-R\beta soluble.

22. Un OSM-R\beta soluble de acuerdo con la Reivindicación 21, que comprende los aminoácidos -27 a x ó 1 a x de la SEC ID NO:6, en donde x es un número entero entre 432 y 714, inclusives.

23. Un polipéptido OSM-R\beta purificado seleccionado entre el grupo formado por:

a) el polipéptido OSM-R\beta de la SEC ID NO:6; y

b) un polipéptido OSM-R\beta biológicamente activo que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica a la secuencia presentada como los aminoácidos 1 a 952 de la SEC ID NO:6.

24. Un polipéptido OSM-R\beta de acuerdo con la Reivindicación 23, en el que dicho OSM-R\beta está codificado por el cDNA de OSM-R\beta en el vector recombinante depositado en la cepa ATCC 69675.

25. Un polipéptido OSM-R\beta de acuerdo con la Reivindicación 23, que comprende los aminoácidos 1 a 952 de la SEC ID NO:6.

\newpage

26. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido OSM-R\beta soluble de acuerdo con la Reivindicación 21 y un polipéptido Fc anticuerpo.

27. Un anticuerpo que es específicamente inmunoreactivo con un polipéptido OSM-R\beta de acuerdo con la Reivindicación 23.

28. Un anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 27, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que es inmunoreactivo con el polipéptido OSM-R\beta de la SEC ID NO:6.

29. Un receptor de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, 9, 11 ó 12, para uso en medicina.

30. El uso de un receptor de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, 9, 11 ó 12, en la preparación de un medicamento para el tratamiento del sarcoma de Kaposi.