DE69534593T2

DE69534593T2 - Onkostatin- m rezeptor

Info

Publication number: DE69534593T2
Application number: DE69534593T
Authority: DE
Inventors: Bruce Mosley; J. David COSMAN
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1994-05-26
Filing date: 1995-05-22
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2015-05-23
Also published as: US6010886A; JP4392058B2; EP0760857B1; CA2190371C; AU694232B2; WO1995033059A3; WO1995033059A2; US5925740A; DK0760857T5; DE69534593D1; US5891997A; EP0760857A1; US20030109003A1; CA2190371A1; US6524817B1; US5783672A; AU2601695A; DK0760857T3; JPH10501131A; ATE309375T1

Description

Hintergrund der Erfindung
Onkostatin-M ist ein sezerniertes einkettiges Polypeptidcytokin, welches das Wachstum bestimmter aus Tumoren abgeleiteten und normaler Zelllinien reguliert. Es wurden eine Reihe Zellarten gefunden, die das Onkostatin-M-Protein binden. Siehe dazu z.B. Linsley et al., J. Biol. Chem., 264: 4282 (1989). Es wurde gezeigt, dass Onkostatin-M die Proliferation eine Anzahl von Tumorzelltypen hemmt (Linsley et al. s. o.). Im Gegensatz dazu wird jedoch dem Protein zugeschrieben, dass es die Vermehrung von Kaposi-Sarkomzellen stimuliert (Nair et al., Science 255: 1430, 1992; Miles et al., Science 255: 1432, 1992; und Cai et al., Am. J Pathol. 145: 74, 1994).
Die Identifizierung und Isolierung von Onkostatin-M bindenden Proteinen, wie beispielsweise Zelloberflächen Onkostatin-M Rezeptoren, ist wünschenswert, da sie es beispielsweise ermöglichen, das biologische Signal, das über den Rezeptor übertragen wird, zu untersuchen. Solche Rezeptoren in löslicher Form könnten ebenso dazu verwendet werden, um eine biologische Aktivität von Onkostatin-M in verschiedenen In-vitro-Untersuchungen oder In-vivo-Verfahren kompetitiv zu hemmen. Eine lösliche Form des Rezeptors könnte verabreicht werden, um Onkostatin-M in vivo zu binden und damit zum Beispiel zu verhindern, dass sich Onkostatin-M an endogene Zelloberflächen-Rezeptoren bindet.
Bei einem als gp130 bekannten Protein wurde festgestellt, dass es Onkostatin-M bindet, jedoch mit einer relativ niedrigen Affinität (Gearing et al., Science 255: 1434, 1992). Liu et al., Cytokine 6(3): 272 (1994) fand heraus, dass die Bindung zwischen Onkostatin-M und gp130 allein nicht ausreichte, um die zelluläre Proliferation von BAFOnkostatin-M130-Zellen, die mit Onkostatin-M behandelt wurden, auszulösen und schloss daraus ist, dass ein weiterer unbekannter Faktor oder Faktoren notwendig ist bzw. sind, um einen funktionellen Onkostatin-M-Rezeptor zu bilden. Heterodimere Rezeptoren, die einen Leukämiehemmungsfaktor (LIF)-Rezeptor und gp130 aufweisen, binden Onkostatin-M mit höherer Affinität als gp130 allein, sie binden jedoch auch LIF mit höherer Affinität (Gearing et al., s. o.). Für bestimmte Anwendungen wäre ein Rezeptor vorteilhaft, der Onkostatin-M mit hoher Affinität bindet, jedoch nicht als LIF-Rezeptor mit hoher Affinität wirkt. Vor der vorliegenden Erfindung wurde noch kein solcher Rezeptor identifiziert oder isoliert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Polypeptid bereit, das hierin als Onkostatin-M-Rezeptor-β-Untereinheit (OSM-Rβ) bezeichnet wird. Außerdem wird ein Rezeptor bereitgestellt, der OSM-Rβ, welcher mit einem als gp130 bekanntes, Onkostatin-M bindendes Protein (vorzugsweise kovalent) verbunden ist, aufweist. Das gp130 Polypeptid kann kovalent mit dem OSM-Rβ-Polypeptid durch jedes geeignete Mittel zum Beispiel über ein Vernetzungsreagens oder einen Polypeptidlinker verbunden werden. In einer Ausführungsform der Erfindung ist der Rezeptor ein durch DNA-Rekombinationstechnologie hergestelltes Fusionsprotein. Dieser OSM-Rβ und gp130 aufweisende Rezeptor bindet Onkostatin-M in höherem Grad als gp130 allein. Durch Onkostatin-M vermittelte Störungen können durch die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge dieses erfundenen Rezeptors an einen Patienten mit einer solchen Störung behandelt werden.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine Scatchard-Analyse, die durch eine Untersuchung der Bindung von radiojodiertem Onkostatin-M durch Zellen, die rekombinantes gp130 exprimieren, erzeugt wurden. Die Überprüfung ist in Beispiel 2 beschrieben.
2 zeigt eine Scatchard-Analyse der Ergebnisse einer Untersuchung der Bindung von radiojodiertem Onkostatin-M durch Zellen, die sowohl rekombinantes gp130 als auch rekombinantes OSM-Rβ exprimieren. Wie in Beispiel 2 beschrieben ist, zeigen die Daten in 2 eine höhere Bindungsaffinität von Onkostatin-M im Vergleich zur Onkostatin-M- Bindung durch gp130 allein, wie in 1 dargestellt ist.
3 ist ein Balkendiagramm, das die Bindung des Leukämiehemmungsfaktors (LIF) und Onkostatin-M an verschiedene Rezeptorproteine, wie in Beispiel 5 beschrieben ist, darstellt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung schafft ein neues, Onkostatin-M-Rezeptor-β-Untereinheit (OSM-Rβ) genanntes Polypeptid. OSM-Rβ kodierende isolierte DNA, OSM-Rβ-DNA enthaltende Expressionsvektoren und mit solchen Expressionsvektoren transformierte Wirtszellen werden offenbart. Verfahren zur Produktion von rekombinanten OSM-Rβ Polypeptiden, einschließlich lösli chen Formen des Proteins, werden ebenfalls offenbart. Antikörper, die mit dem neuen Polypeptid immunreaktiv sind, werden hierin ebenso bereitgestellt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist auf einen Rezeptor gerichtet, der in der Lage ist, Onkostatin-M zu binden, wobei dieser Rezeptor OSM-Rβ und gp130 aufweist. Der Rezeptor findet in verschiedenen In-vitro- und In-vivo-Verfahren Anwendung, einschließlich bei der Behandlung von Störungen, die durch Onkostatin-M vermittelt werden.
In Beispiel 1 isolierte DNA und kodierte AmiNrsäuresequenzen der OSM-Rβ-cDNA werden in SEQ ID Nr.: 5 und SEQ ID Nr.: 6 gezeigt. Das kodierte Protein weist (vom N- zum C-Terminus) ein Signalpeptid (Aminosäuren –27 bis –1 der SEQ ID Nr.: 6), gefolgt von einer extrazellulären Domäne (Aminosäuren 1 bis 714), einer transmembranen Region (Aminosäuren 715 bis 734) und einer zytoplasmatischen Domäne (Aminosäuren 735 bis 952) auf. E.-coli-Zellen, die mit einem rekombinanten Vektor welcher OSM-Rβ-cDNA im Klonierungsvektor pBluescript^® SK-aufweist transformiert wurden, wurden am 16. August 1994 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA, hinterlegt, wo ihnen die Zugangsnummer ATCC 69675 zugeteilt wurde.
Die in Beispiel 2 beschriebene Bindungsuntersuchung verglich die Bindung von Onkostatin-M durch Zellen, die entweder gp130 allein oder sowohl gp130 als auch OSM-Rβ exprimieren. Die Zellen, die sowohl gp130 als auch OSM-Rβ exprimierten, zeigten eine höhere Onkostatin-M-Bindungsaffinität als Zellen, die gp130 allein exprimierten. Die in Beispiel 5 beschriebene Untersuchung demonstriert, dass OSM-Rβ allein Onkostatin-M nicht auf nachweisbarem Niveau binden kann. Proteine, die durch Zellen exprimiert wurden, die sowohl mit einem löslichen OSM-Rβ/Fc-Fusionsprotein kodierenden Vektor als auch mit einem löslichen gp130/Fc-Fusionsproteinkodierenden Vektor cotransfiziert wurden, banden Onkostatin-M in höherem Grade als Proteine, die durch Zellen exprimiert wurden, die nur mit einem löslichen gp130/Fc-Fusionsprotein kodierenden Vektor transfiziert wurden.
In einer Ausführungsform weist ein Rezeptor der vorliegenden Erfindung gp130, welches durch jedes geeignete Mittel jedes kovalent mit OSM-Rβ verbunden ist auf zum Beispiel über ein Vernetzungsreagens oder einen Polypeptidlinker. Die Proteine gp130 und OSM-Rβ sind auf eine Weise kovalent verbunden, die nicht die resultierende Fähigkeit des Rezeptors, Onkostatin-M zu binden, beeinträchtigt. In einer Ausführungsform ist der Rezeptor ein Fusionsprotein, das durch DNA-Rekombinationstechnologie hergestellt wurde.
Alternativ kann der Rezeptor gp130, das nicht kovalent mit OSM-Rβ komplexiert ist, aufweisen. Nichtkovalente Verbindung von gp130 an OSM-Rβ kann auf jegliche Weise erreicht werden, die nicht die Fähigkeit des Rezeptors, Onkostatin-M zu binden, beeinträchtigt. Bei einem Ansatz wird eine erste Verbindung an OSM-Rβ und eine zweite Verbindung, die sich nichtkovalent mit erster Verbindung verbindet, an gp130 angehängt. Beispiele für solche Verbindungen sind Biotin und Avidin. Der Rezeptor wird somit durch die nichtkovalenten Interaktionen von Biotin mit Avidin gebildet. In einer Ausführungsform der Erfindung sind OSM-Rβ und gp130 rekombinante Polypeptide, wobei beide aus rekombinanten Zellen gereinigt und dann nichtkovalent miteinander verbunden wurden, um den Rezeptor zu bilden. Eine Wirtszelle kann mit zwei verschiedenen Expressionsvektoren transformiert werden, so dass sowohl OSM-Rβ als auch gp130 von der rekombinanten Wirtszelle produziert werden. OSM-Rβ und gp130, die von solchen rekombinanten Wirtszellen produziert werden, können sich durch nichtkovalente Interaktionen verbinden, um einen Komplex zu bilden. Wenn solche transformierte Zellen die membrangebundenen Formen der Proteine exprimieren, so sind diese Zellen für verschiedene Untersuchungen einschließlich Konkurrenzuntersuchungen nützlich.
Das hier gp130 genannte Protein wurde aus zellulären Quellen einschließlich Plazentagewebe und einer Myelomzelllinie U266 gereinigt. Es wurden eine Reihe weiterer Zelltypen gefunden, die gp130 mRNA exprimieren, wie bei Hibi et al., in Cell 63: 1149 (1990) beschrieben. Es wurde berichtet, dass gp130 bei der Bildung von Interleukin-6-Bindungsstellen hoher Affinität und in der IL-6-Signalübertragung beteiligt ist (Hibi et al., s. o.). gp130 dient auch als Affinitätswandler für den LIF-Rezeptor (Gearing et al., Science 255: 1434, 1992).
Die Klonierung und Expression von cDNA, welche das gp130 Protein in voller Länge kodiert, wurde von Hibi et al., s. o. beschrieben.
Die hierin verwendeten Bezeichnungen OSM-Rβ und gp130 schließen Varianten und gekürzte Formen der nativen Proteine, welche die gewünschte biologische Aktivität besitzen, ein. Varianten, die durch das Hinzufügen, Substituieren oder Deletieren von Aminosäure(n) in der ursprünglichen Sequenz hergestellt wurden, werden nachstehend detaillierter behandelt.
Ein Beispiel für ein OSM-Rβ-Polypeptid ist jenes, das durch den cDNA-Klon, der in Beispiel 1 beschrieben ist, kodiert wird (d.h. kodiert durch das OSM-Rβ-cDNA-Insert des rekombinanten Vektors im hinterlegten Stamm ATCC 69675). Weitere OSM-Rβ-Polypeptide schließen solche ein, denen die transmembrane Region vollständig oder teilweise oder die zytoplasmatische Domäne des Proteins fehlen. Zusätzlich gekürzte OSM-Rβ-Polypeptide können in Bezug auf die Sequenzen, die in der Erythropoetin-Rezeptorenfamilie konserviert sind, ausgewählt werden. Die Wünschbarkeit der Einbeziehung der Signalsequenz hängt von solchen Faktoren, wie der Position des OSM-Rβ in einem Fusionsprotein und den beabsichtigten Wirtszellen ab, wenn der Rezeptor über rekombinante DNA Technologie hergestellt werden soll.
Ein Beispiel für ein geeignetes gp130-Polypeptid ist jenes, welches die in SEQ ID Nr.: 2 dargestellte Aminosäurensequenz aufweist. DH5a-Zellen des E.-coli-Stamms, die mit einem gp130-kodierenden rekombinanten Vektor genannt B10G/pDC303 transformiert wurden, wurden am 14. Nrvember 1991 bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland hinterlegt und erhielten die Zugangsnummer 68827. Der Säugetier-Expressionsvektor pDC303 (in den die gp130-cDNA eingesetzt wurde, um B10G/pDC303 zu bilden) ist auch als SF CAV bekannt und wurde in der PCT-Anmeldung WO 93/19777 beschrieben. Die Nucleotidsequenz der gp130-cDNA, die ein Plasmid B10G/pDC303 enthalten ist, und die dadurch kodierte Aminosäuresequenz, werden in SEQ ID Nr.: 1 und SEQ ID Nr.: 2 dargestellt. Das Protein weist (in der Reihenfolge von N-Terminus zu C-Terminus) eine 22-Aminosäuresignalsequenz, die komplette extrazelluläre Domäne (Aminosäuren 1–597), eine transmembrane Region (die mit AmiNrsäure 598 beginnt) und einen Teil einer zytoplasmatische Domäne (Aminosäuren 621–686) auf.
Alternativ kann auch das von Hibi et al. s. o. beschriebene gp130-Protein verwendet werden. Die achte Aminosäure des Signalpeptids in der von Hibi et al. beschriebenen Sequenz ist Valin, in der SEQ ID Nr.: 2 jedoch Leucin (an Position –15). Dieser Unterschied in der Aminosäuresequenz kann einem genetischen Polymorphismus zugeschrieben werden (Allelenvariation bei den Personen, die dieses Protein bilden). Des Weiteren ist das gp130-Protein der SEQ ID Nr.: 2 in der zytoplasmatischen Domäne verkürzt und endet mit dem Leucin-Rest, der in der von Hibi et al. s. o. dargestellten Sequenz an Position 708 gefundenen wurde. Obwohl es verkürzt ist, besitzt das gp130-Protein der SEQ ID Nr.: 2 die extrazelluläre Domäne, die für die Bindung von Onkostatin-M verantwortlich ist, und ist somit zur Verwendung als ein Bestandteil der Rezeptoren der vorliegenden Erfindung geeignet.
Regionen des gp130-Proteins, entsprechen Domänen, die in bestimmten anderen Rezeptoren konserviert sind, werden bei Hibi et al. s. o. auf Seite 1150, Spalte 2, und auf Seite 1151, Spalte 1 beschrieben. Es können auch andere gekürzte gp130-Polypeptide verwendet werden, die ausgewählt wurden, um diese konservierten Regionen aufzuweisen.
Lösliche OSM-Rβ- und gp130-Polypeptide werden für bestimmte Anwendungen bevorzugt. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist der Rezeptor lösliches, kovalent an lösliches gp130 angehängtes OSM-Rβ auf. „Lösliches OSM-Rβ", wie im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf Polypeptide, die in ihrer AmiNrsäuresequenz im Wesentlichen der extrazellulären Region des natürlichen OSM-Rβ gänzlich oder teilweise ähnlich sind und die aufgrund des Fehlens einer transmembranen Region, die zu einer Retention des Polypeptids an der Zellmembran führen würde, bei der Expression sezerniert werden. Geeignete lösliche OSM-Rβ-Polypeptide behalten die erwünschte biologische Aktivität. Lösliches OSM-Rβ kann auch einen Teil der transmembranen Region oder einen Teil der zytoplasmatischen Domäne oder andere Sequenzen einschließen, vorausgesetzt, dass das lösliche OSM-Rβ-Protein sezerniert werden kann.
Gleichermaßen bezieht sich der hierin benutzte Begriff "lösliches gp130" auf Proteine, die in ihrer Aminosäuresequenz im Wesentlichen der extrazellulären Region des natürlichen gp130 insgesamt oder teilweise ähnlich sind und die bei der Expression sezerniert werden, aber die erwünschte biologische Aktivität behalten. Lösliches gp130 kann einen Teil der transmembranen Region, zytoplasmatischen Domäne oder anderen Sequenzen einschließen, vorausgesetzt, dass das Polypeptid sezerniert wird.
In einer Ausführungsform weisen die löslichen OSM-Rβ- und gp130-Polypeptide die gesamte extrazelluläre Domäne auf. Um die Sekretion hervorzurufen, weisen die löslichen Polypeptide das natürliche Signalpeptid oder ein heterologes Signalpeptid auf. Somit schließen Beispiele für lösliche OSM-Rβ-Polypeptide die Aminosäuren –27 bis 714 oder 1 bis 714 des SEQ ID Nr.: 6. ein. Beispiele für lösliche gp130-Polypeptide weisen die Aminosäuren –22 bis 597 oder 1 bis 597 der SEQ ID Nr.: 2 auf.
Zusätzliche Beispiele für lösliche gp130-Polypeptide sind solche, denen eine bis alle drei Fibronektindomänen, die innerhalb der extrazellulären Domäne zu finden sind, fehlen, wie in Beispiel 4 unten beschrieben ist. Diese löslichen gp130-Polypeptide schließen solche ein, die die Aminosäuren –22 bis y oder 1 bis y der SEQ ID NR: 2 aufweisen, wobei y eine ganze Zahl zwischen 308 und einschließlich 597 ist.
Ein lösliches Fusionsprotein, das die Aminosäuren –27 bis 432 des OSM-Rβ der SEQ ID Nr.: 6, fusioniert mit einem Antikörper-Fc-Region-Polypeptid, aufweist, wird in Beispiel 5 beschrieben. Der OSM-Rβ-Rest des Fusionsproteins, welches ein Fragment der extrazellulären Domäne des OSM-Rβ ist, behielt die gewünschte biologische Aktivität. Somit weisen Beispiele für lösliche OSM-Rβ-Polypeptide die Aminosäuren –27 bis x oder 1 bis x der SEQ ID Nr.: 6 auf wobei x eine ganze Zahl zwischen 432 und einschließlich 714 ist.
Lösliches OSM-Rβ und lösliches gp130 können identifiziert (und von ihren unlöslichen membrangebundenen Pendants unterschieden) werden, indem intakte Zellen, die das gewünschte Protein exprimieren, vom Kulturmedium z.B. durch Zentrifugation abgetrennt werden und das Me dium (Überstand) auf die Anwesenheit des gewünschten Proteins untersucht wird. Das Kulturmedium kann mit Verfahren, die denen in den unten beschriebenen Beispielen ähnlich oder mit jenen identisch sind, untersucht werden. Die Anwesenheit von OSM-Rβ oder gp130 im Medium zeigt, dass das Protein von den Zellen sekretiert wurde und somit eine lösliche Form des gewünschten Proteins ist. Lösliches OSM-Rβ und lösliches gp130 können natürlich auftretende Formen dieser Proteine sein. Alternativ können lösliche Fragmente der OSM-Rβ- und gp130-Proteine durch rekombinante DNA Technologie hergestellt oder anderweitig isoliert werden, wie unten beschrieben ist.
Die Verwendung löslicher Formen von OSM-Rβ und gp130 ist für bestimmte Anwendungen vorteilhaft. Die Reinigung der Proteine von rekombinanten Wirtszellen wird erleichtert, da die löslichen Proteine von den Zellen sekretiert werden. Des Weiteren ist ein Rezeptor gemäß der vorliegenden Erfindung, der lösliche OSM-Rβ- und gp130-Proteine beinhaltet, im Allgemeinen für die intravenöse Verabreichung geeigneter.
In Bezug auf die vorangehende Erörterung des Signalpeptids und die verschiedenen Domänen der gp130- und OSM-Rβ-Proteine erkennt der Fachmann, dass die oben beschriebenen Grenzen solcher Regionen der Proteine nur annähernd sind. Zum Beispiel kann sich, obwohl es Computerprogramme gibt, die die Abspaltungsstelle eines Signalpeptids vorhersagen, die Abspaltung an anderen Stellen als den vorhergesagten auftreten. Des Weiteren ist anerkannt, dass eine Proteinzubereitung eine Mischung aus Proteinmolekülen aufweisen kann, die aufgrund der Abspaltung des Signalpeptids an mehr als einer Stelle verschiedene N-terminale-Aminosäuren haben. Außerdem wurde die transmembrane OSM-Rβ-Region durch Voraussage des Computerprogramms, verbunden mit der von Gearing et al. (EMBO J., 10: 2839, 1991) beschriebenen Homologie zur transmembranen Region des LIF-Rezeptorproteins, identifiziert. Somit schließen lösliche OSM-Rβ-Polypeptide, die die extrazelluläre Domäne aufweisen, auch solche, ein die eine C-terminale Aminosäure haben, die von der oben als C-Terminus der extrazellulären Domäne identifizierten variieren kann. Des Weiteren kann die posttranslatorische Verarbeitung, die aufgrund des jeweils verwendeten Expressionssystems variieren kann, Proteine mit verschiedenen N-Termini ergeben. Derartige Varianten, die die gewünschten biologischen Aktivitäten behalten, sind in den hierin verwendeten Begriffen „OSM-Rβ-Polypeptide" und „gp130- Polypeptide" mit eingeschlossen.
Verkürztes OSM-Rβ und gp130, einschließlich löslicher Polypeptide, können mit einer Anzahl von konventionellen Verfahren hergestellt werden. Bei rekombinanten Proteinen kann ein DNA-Fragment, das ein gewünschtes Fragment kodiert, in einen Expressionsvektor subkloniert werden. Alternativ kann eine gewünschte DNA-Sequenz mit bekannten Verfahren chemisch synthetisiert werden. DNA-Fragmente können auch durch eine Restriktionsendonukleasen-Verdauung von geklonten DNA-Sequenzen in voller Länge hergestellt und durch Agarose-Gelelektrophorese isoliert werden. Linker, die Restriktionsendonucleasen-Spaltungsstelle(n) beinhalten, können zur Insertion des gewünschten DNA-Fragments in einen Expressionsvektor verwendet werden, oder das Fragment kann an natürlich darin vorkommenden Spaltungsstellen verdaut werden. Oligonukleotide, die den N- oder C-Terminus eines DNA-Fragments zu einem gewünschten Punkt rekonstruieren, können synthetisiert werden. Das Oligonucleotid kann eine Restriktionsendonukleasen-Spaltungsstelle stromaufwärts der gewünschten codierenden Sequenz enthalten und ein Initiationscodon (ATG) am N-Terminus der codierenden Sequenz positionieren.
Auch das gut bekannte Polymerase-Ketten-Reaktion Verfahren kann verwendet werden, um eine DNA-Sequenz, die ein gewünschtes Proteinfragment kodiert, zu isolieren. Oligonucleotidprimer, die die gewünschten Termini des Fragments aufweisen, werden in einer solchen Polymerase-Ketten-Reaktion verwendet. Es kann jedes geeignete PCR-Verfahren verwendet werden. Ein solches Verfahren ist bei Saiki et al., Science 239: 487 (1988), beschrieben. Ein weiteres ist in Recombinant DNA Methodology, Wu et al., Hrsg., Academic Press Inc., San Diego (1989), SS. 189–196 beschrieben. Im Allgemeinen werden bei PCR-Reaktionen die 5'- und 3'-Oligonucleotidprimer mit der DNA-Matrize (in diesem Fall OSM-Rβ- oder gp130-DNA) und jedem der vier Desoxynukleosidtriphosphate in einer dafür geeigneten Pufferlösung kombiniert. Die Lösung wird erhitzt (z.B. von 95° bis 100°C), um die doppelsträngige DNA-Matrize zu denaturieren, und wird dann vor Zugabe eines DNA-Polymerase-Enzyms abgekühlt. Mehrere Zyklen der Reaktionen werden ausgeführt, um das gewünschte DNA-Fragment zu amplifizieren.
Das gp130-Polypeptid wird durch kovalente oder nicht-kovalente Bindung an das OSM-Rβ-Polypeptid angehängt. Die kovalente Anfügung wird für bestimmte Anwendungen bevorzugt. z.B. für In-vivo-Anwendung, da kovalente Bindungen im Gegensatz zu nicht-kovaltenten im Allgemeinen eine verbesserte Stabilität verleihen. Für die Konstruktion des Rezeptors gemäß der vorliegenden Erfindung kann die kovalente Bindung durch Vernetzungsreagenzien, Peptidlinker oder jede andere geeignete Technik erreicht werden.
Es sind mehrere für die Vernetzung eines Proteinmoleküls mit einem anderen geeignete Reagenzien bekannt. Zum Beispiel sind für diesen Zweck heterobifunktionale und homobifunktionale Linker von Pierce Chemical Company, Rockford, IIliNris, erhältlich. Solche Linker enthalten zwei funktionelle Gruppen (z.B. Ester und/oder Maleimide), die mit bestimmten funktionellen Gruppen an Aminosäureseitenkette reagieren und somit ein Polypeptid mit einem anderen verbinden.
Eine Art von Peptidlinker, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden kann, schafft zwischen den gp130- und OSM-Rβ-Domänen einen Abstand, der groß genug ist um das ordnungsgemäße Falten jeder Domäne in die für die gewünschte biologische Aktivität notwendige Sekundär- oder Tertiärstruktur sicher zu stellen. Außerdem sollte der Linker zu lassen, dass die extrazellulären Domänen von pg130 und OSM-Rβ die räumliche Orientierung annehmen, um die Onkostatin-M-Bindungsstelle zu bilden.
Geeignete Peptidlinker sind in Fachkreisen bekannt und können entsprechend den konventionellen Verfahren verwendet werden. Zu den geeigneten Peptidlinkern gehören die in US-Patent 4,751,180 und 4,935,233 beschriebenen. Ein Peptidlinker kann an gp130 und OSM-Rβ durch jedes der konventionellen Verfahren zur Anheftung eines Polypeptids an ein anderes angeheftet werden. Die, wie oben beschrieben, von der Pierce Chemical Company erhältlichen Vernetzungsreagenzien gehören ebenfalls zu solchen Reagenzien, die verwendet werden können. Aminosäuren, die mit solchen Reagenzien reagierende Seitenketten haben, können in den Peptidlinkern, z.B. an deren Termini, enthalten sein. Vorzugsweise wird ein Fusionsprotein, das ein über einen Peptidlinker mit OSM-Rβ verbundenes gp130 aufweist, durch rekombinierte DNA-Technologie hergestellt. In einer Ausführungsform der Erfindung, sind OSM-Rβ und gp130 durch Polypeptide die von Immunglobulin abgeleitet sind miteinander verbunden. Die Herstellung von Fusionsproteinen, die heterologe Polypeptide aufweisen, welche an verschiedene Abschnitte von Antikörper-abgeleiteten Polypeptiden (einschließlich der Fc-Domäne) fusioniert sind, wurde z.B. von Ashkenazi et al. (PNAS USA 88: 10535, 1991) und Byrn et al. (Nature 344: 677, 1990) beschrieben. So kann, zum Beispiel, ein aus der Fc-Region eines Antikörpers abgeleitetes Polypeptid an den C-Terminus von OSM-Rβ angehängt werden. Ein anderes Fc-Polypeptid wird an den C-Terminus von gp130 angehängt. Zwischen den beiden Fc-Polypeptiden entstehen Disulfid-Bindungen (z.B. in der so genannten Hingeregion, in der zwischenkettige Disulfid-Bindungen normalerweise in Antikörpermolekülen vorhanden sind), wodurch ein Heterodimer entsteht, welches das mit dem gp130/Fc-Fusionsprotein verbundene OSM-Rβ/Fc-Fusionsprotein enthält. Vorteilhafterweise werden die Wirtszellen mit zwei verschiedenen Expressionsvektoren cotransfiziert, von denen einer lösliches OSM-Rβ/Fc und der andere lösliches gp130/Fc kodiert. Es wird angeNrmmen, dass das Heterodimer sich interzellulär oder während der Sekretion bildet.
Der hierin gebrauchte Begriff „Fc-Polypeptid" schließt native und Mutein-Formen sowie verkürzte Fc-Polypeptide, welche die Dimerisation fördernde Hingeregion aufweist, ein. cDNA, die ein einkettiges, aus der Fc-Region eines menschlichen IgG1-Antikörpers abgeleitetes Polypeptid kodiert, wurde in den pBluescript-SK^®-Klonierungsvektor (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) geklont, um einen hIgG1Fc genannten rekombinanten Vektor zu produzieren. Eine einzigartige BglII-Stelle befindet sich nahe dem 5'-Ende der eingefügten Fc-Kodierungssequenz. Eine SpeI-Stelle liegt unmittelbar stromabwärts des Stoppcodons. Die DNA und kodierte Aminosäuresequenzen der geklonten Fc-cDNA sind in SEQ ID Nr: 3 und SEQ ID Nr: 4 dargestellt. Das durch die cDNA kodierte Fc-Polypeptid erstreckt sich von der N-terminalen-Hingeregion zum natürlichen C-Terminus, d.h., es ist im Wesentlichen eine Antikörper-Fc-Region von voller Länge. Ein geeignetes Mutein dieses Fc-Polypeptids wird in der US-Patentanmeldung der Seriennummer 08/097,827 beschrieben. Das Mutein zeigt eine geringere Affinität zu Fc-Rezeptoren.
Homodimere, die zwei durch Disulfid-Bindung verbundene OSM-Rβ/Fc-Polypeptide oder gp130/Fc-Polypeptide aufweisen, können ebenfalls durch bestimmte der hierin beschriebenen transfizierten Wirtszellen produziert werden. Die Homodimere können voneinander und von dem Heterodimer aufgrund ihrer unterschiedlichen Größe (z.B. durch Gelelektrophorese) getrennt werden. Das Heterodimer kann auch (wie nachstehend beschrieben) durch sequentielle Immunoraffinitätschromatographie gereinigt werden.
In einer alternativen Ausführungsform wird ein erstes Fusionspolypeptid, das gp130 (oder ein Fragment davon) oberhalb der konstanten Region einer leichten Kette eines Antikörpers (oder eines Fragments davon) enthält, hergestellt. Ein zweites Fusionspolypeptid weist OSM-Rβ oberhalb der konstanten Region einer schweren Kette eines Antikörpers (oder eines Fragments einer schweren Kette, deren N-Terminus sich wenigstens durch die C_H1-Region erstreckt) auf. Disulfid-Bindung(en) entstehen zwischen der leichten Kette des gp130-Fusionspolypeptids und der schweren Kette des OSM-Rβ-Fusionspolypeptids, wodurch ein Rezeptor der vorliegenden Erfindung entsteht. Als weitere Alternative wird ein OSM-Rβ-Antikörper-leichte Kette-Fusionspolypeptid hergestellt und mit (Disulfid gebunden) an einem Fusionspolypeptid, das mit einer schweren Kette eines Antikörper fusioniertes gp130 enthält, kombiniert. Wenn zwei der vorgenannten, durch Disulfid-Bindung verbundene Moleküle kombiniert werden, entstehen zwischen den beiden Fc-Regionen weitere Disulfid-Bindungen. Der resultierende Rezeptor der vorliegenden Erfindung, der vier Fusionspolypeptide aufweist, ähnelt in der Struktur einem Antikörper und zeigt bivalent die Onkostatin-M-Bindungsstelle.
Die gp130- und OSM-Rβ-Polypeptide können separat aus zellulären Quellen gereinigt und dann miteinander verbunden werden. Alternativ kann der Rezeptor der vorliegenden Erfindung mittels rekombinierter DNA-Technologie produziert werden. Die gp130- und OSM-Rβ-Polypeptide können von transformierten Wirtszellen für die anschließende kovalente Bindung separat produziert und gereinigt werden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle mit fremder DNA, die gp130 und OSM-Rβ als separate Polypeptide kodiert, transformiert/transfiziert. Die beiden Polypeptide können von demselben Expressionsvektor mit Start- und Stoppcodons für jedes der beiden Gene kodiert werden, oder die rekombinanten Zellen können mit zwei separaten Expressionsvektoren cotransfiziert werden. In einer weiteren Ausführungsform wird der Rezeptor als Fusionsprotein in rekombinanten Zellen produziert.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Rezeptorprotein ein rekombinantes Fusionsprotein mit der Formel: R_I-L-R₂ oder R₂-L-R₁ wobei R₁ gp130 oder ein gp130-Fragment darstellt; R₂ stellt OSM-Rβ oder ein OSM-Rβ- Fragment dar, und L stellt einen Peptidlinker dar.
Die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung beinhalten Konstrukte, bei denen der C-terminale-Abschnitt des gp130 an den Linker fusioniert ist, der an den N-terminalen-Abschnitt des OSM-Rβ fusioniert ist, sowie Konstrukte, bei denen der C-terminale-Abschnitt des OSM-Rβ an den Linker fusioniert ist, der an den N-terminalen-Abschnitt des gp130 fusioniert ist. gp130 ist in einer solchen Art kovalent an OSM-Rβ gebunden, dass ein einziges Protein erzeugt wird, welches die gewünschten biologischen Aktivitäten von gp130 und OSM-Rβ behält. Die Komponenten des Fusionsproteins sind in der Reihenfolge ihres Auftretens aufgelistet (d.h., das N-terminale-Polypeptid ist zuerst aufgeführt, gefolgt von dem Linker und dann von dem C-terminalen-Polypeptid).
Eine DNA-Sequenz, die ein Fusionsprotein kodiert, wird mit Hilfe der rekombinaten DNA-Technologie konstruiert, um separate DNA-Fragmente, die gp130 und OSM-Rβ kodieren, in einen geeigneten Expressionsvektor zu inserieren. Das 3'-Ende eines gp130 kodierenden DNA-Fragments wird (über den Linker) an das 5'-Ende des OSM-Rβ kodierenden DNA-Fragments mit den Leserastern der Sequenzen in Phase ligiert,, damit die mRNA in ein einziges biologisch aktives Fusionsprotein translatiert werden kann. Alternativ kann das 3'-Ende eines OSM-Rβ kodierenden DNA-Fragments (über den Linker) an das 5'-Ende des gp130 kodierenden DNA-Fragments ligiert werden, mit den Leserastern der Sequenzen in Phase, damit die mRNA in ein einziges biologisch aktives Fusionsprotein translatiert werden kann. Eine DNA-Sequenz, die eine N-terminale- Signalsequenz kodiert, kann auf der DNA-Sequenz, die das N-terminale-Polypeptid kodiert, zurückbehalten werden, während Stoppcodons, die das Durchlesen zur zweiten (C-terminalen-)DNA-Sequenz verhindern würden, eliminiert werden. Umgekehrt wird ein Stoppcodon, das für die Beendigung der Translation notwendig ist, auf der zweiten DNA-Sequenz zurückbehalten. DNA, die eine Signalsequenz kodiert, wird vorzugsweise von der DNA- Sequenz, die das C-Terminal-Polypeptid kodiert, entfernt.
Eine DNA-Sequenz, die einen erwünschten Polypeptidlinker kodiert, kann mit Hilfe jedes geeigneten konventionellen Verfahrens zwischen und im selben Leseraster wie die gp130 und OSM-Rβ kodierende DNA eingefügt werden. Zum Beispiel kann ein chemisch synthetisiertes Oligonucleotid, das den Linker kodiert und die geeigneten Restriktionsendonukleasen-Spaltungsstellen enthält, zwischen die gp130 und OSM-Rβ kodierenden Sequenzen ligiert werden.
Alternativ kann eine chemisch synthetisierte DNA-Sequenz eine zum 3'-Terminus (ohne das Stoppcodon) komplementäre Sequenz von entweder gp130 oder OSM-Rβ gefolgt von einer den Linker kodierenden Sequenz enthalten, der eine Sequenz folgt, die zu dem 5'-Terminus der anderen von gp130 oder OSM-Rβ komplementär ist. Danach wird eine Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese angewandt, um die den Linker kodierende Sequenz in einen Vektor, der eine direkte Fusion von gp130 und OSM-Rβ enthält, einzufügen.
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte DNA-Sequenzen bereit, welche die oben beschriebenen Fusionsproteine kodieren, welche gp130, OSM-Rβ und einen Peptidlinker aufweisen. DNA, welche die neuartigen, hierin offenbarten OSM-Rβ-Polypeptide kodiert, ist ebenso bereitgestellt, wie DNA, welche die OSM-Rβ-Polypeptide, die an Immunglobin abgeleitete Polypeptide fusioniert sind, kodiert. In die vorliegende Erfindung einbegriffene DNA, die OSM-Rβ kodiert, beinhaltet zum Beispiel cDNA, chemisch synthetisierte DNA, durch PCR isolierte DNA, genomische DNA und Kombinationen davon. Genomische OSM-Rβ-DNA kann unter Verwendung der in Beispiel 1 isolierten cDNA, oder Fragmenten davon als Sonde mittels Standardverfahren isoliert werden.
Es werden hierin auch rekombinante, Expressionsvektoren, welche die isolierten DNA-Sequenzen enthalten, bereitgestellt. „Expressionsvektor" bezieht sich auf ein replizierbares DNA-Konstrukt, das dazu verwendet wird, um DNA zu exprimieren, die das gewünschte Protein kodiert und die eine Transkriptionseinheit einschließt, die eine Gruppe, bestehend aus (1) genetischem Element oder genetischen Elementen mit einer regulierenden Rolle bei der Genexpression, zum Beispiel Promoter, Operatoren oder Enhancer, funktionsfähig verbunden mit (2) einer DNA-Sequenz, die ein gewünschtes Protein kodiert, das in mRNA transkribiert und in Protein translatiert wird, und (3) geeignete Initiierungs- und Terminationssequenzen für die Transkription und Translation, aufweist. Die Auswahl der Promoter und anderer regulierender Elemente variiert im Allgemeinen entsprechend der vorgesehenen Wirtszelle.
Bei den Expressionsvektoren werden regulierende Elemente, die die Transkription oder Translation kontrollieren, im Allgemeinen von Säugetier-, mikrobiellen-, viralen oder Insektengenen abgeleitet. Die Fähigkeit zur Replikation in einem Wirt, wird normalerweise durch einen Replikationsursprung verliehen, und ein Selektionsgen zum erleichterten Erkennen von Transformanten kann zusätzlich eingebaut werden. Es können auch von Retroviren abgeleitete Vektoren eingesetzt werden.
DNA-Regionen sind funktionsfähig verbunden, wenn zwischen ihnen funktionelle Beziehungen bestehen. Zum Beispiel wird eine DNA, die ein Signalpeptid kodiert (sekretorische Leitsequenz), funktionsfähig mit einer DNA für ein Polypeptid verbunden, wenn das Polypeptid als ein Präkursor exprimiert wird, der durch die Membran der Wirtszelle abgesondert wird; ein Promotor wird funktionsfähig mit einer kodierenden Sequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz kontrolliert, und eine Ribosomenbindungsstelle wird funktionsfähig mit einer kodierenden Sequenz verbunden, wenn sie so positioniert wird, dass sie die Translation gestattet. Im Allgemeinen bedeutet „funktionsfähig verbunden" aneinander angrenzend und im Fall der sekretorischen Leitsequenz, aneinander angrenzend und im Leseraster.
Transformierte Wirtszellen sind Zellen, die unter Verwendung von rekombinnater DNA-Technologie mit fremder DNA transformiert oder transfiziert worden sind. Im Kontext der vorliegenden Erfindung schließt die Fremd-DNA eine Sequenz, die die Proteine gemäß dieser Erfindung kodiert ein. Wirtszellen können zum Zweck des Klonens oder der Amplifizierung der Fremd-DNA oder mit einem Expressionsvektor für Produktion des Proteines transformiert werden. Geeignete Wirtszellen schließen Zellen von Prokaryoten, Hefen oder höheren Eukaryoten ein. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit Bakterien-, Pilz-, Hefe- oder Säugetierwirtszellen werden von Pouwels et al. beschrieben (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985).
Prokaryoten schließen Gram-negative und Gram-positive Organismen, zum Beispiel E. coli oder Bazillen ein. Prokaryotische Expressionsvektoren besitzen im Allgemeinen einen oder mehrere phänotypische selektierbare Marker, zum Beispiel ein Gen, welches ein Protein kodiert, das Antibiotikaresistenz verleiht oder ein autotrophes Bedürfnis bereitstellt, und einen vom Wirt erkann ten Replikationsursprung, um die Amplifikation innerhalb des Wirtes zu gewährleisten. Beispiele für prokaryotische Wirte, die zur Transformation geeignet sind, umfassen E. coli, Bazillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschieden Art innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus, obwohl wahlweise auch andere verwendet werden können.,
Nützliche Expressionsvektoren für bakterielle Verwendung können einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Replikationsursprung enthalten, der von kommerziell erhältlichen Plasmiden abgeleitet ist, welche die genetischen Elemente des wohlbekannten Klonierungsvekors pBR322 (ATCC 37017) aufweisen. Zu solchen kommerziellen Vektoren gehören zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Diese pBR322-„Rückgrat"-Abschnitte werden mit einem geeigneten Promotor und der zu exprimierenden strukturellen Sequenz kombiniert. Bei der Transformation von E. coli werden normalerweise Derivate von pBR233, einem von einer E.-coli-Art abgeleiteten Plasmid, verwendet (Bolivar et al., Gene 2: 95, 1977). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz, was eine einfache Möglichkeit zur Identifizierung transformierter Zellen bietet.
Zu Promotoren, die im Allgemeinen in rekombinanten mikrobischen Expressionsvektoren verwendet werden, gehören das β-Lactamase-(Penicillinase) und Lactose-Promotor-System (Chang et al., Nature 275: 615, 1978; und Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979), das Tryptophan-(trp)-Promotor-System (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980; und EPA 36,776) und Tac-Promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 412, 1982). Ein besonders nützliches bakterielles Expressionssystem verwendet den Phagen-λ-PL-Promotor und den cI857ts thermoinduzierbaren Repressor. Zu den Plasmidvektoren, die von der American Type Culture Collection erhältlich sind, und in denen Derivate des λ-PL-Promotors enthalten sind, gehören das Plasmid pHUB2, welches im E.-coli-Stamm JMB9 (ATCC 37092) resident ist und pPLc28 welches in E.coli RR1 (ATCC 53082) resisdent ist. Das rekombinante Rezeptorprotein kann auch in Hefewirten vorzugsweise aus Saccharomyces-Arten, wie S. cerevisiae exprimiert werden. Hefe von anderen Gattungen, wie Pichia oder Kluyveromyces, können ebenfalls verwendet werden. Hefevektoren enthalten im Allgemeinen einen Replikationsursprung vom 2 μm-Hefeplasmid oder einer autonom replizierenden Sequenz (ARS), einen Promotor, Rezeptorfusionsprotein kodierende DNA, Sequenzen für Polyadenylierung und Transkriptionstermination und ein Selektionsgen. Vorzugsweise enthalten Hefevektoren einen Replikationsursprung und Selektionsmarker, die die Transformation sowohl von Hefe als auch von E. coli erlauben, z.B. das Ampicillin-Resistenzgen von E. coli und das S.-cerevisiae-trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen mu tierten Hefestamm liefert, dem die Fähigkeit, in Tryptophan zu wachsen, fehlt, und einen von einem hoch exprimierten Hefegen exprimierten Promotor, um die Transkription einer Strukturssequenz stromabwärts zu induzieren. Die Gegenwart der trp1-Lesion im Genom der Hefewirtszelle bietet dann aufgrund von Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan eine geeignete Umgebung zum Nachweis der Transformation.
Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren schließen die Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; und Holland et al., Biochem. 17: 4900, 1978), wie Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-PhosphoglyceratOnkostatin-Mutase, Pyruvatkinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase ein. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression sind bei R. Hitzeman et al., EPA 73, 657 näher beschrieben.
Bevorzugte Hefevektoren können unter Verwendung von DNA-Sequenzen von pBR322 für die Selektion und Replikation in E. coli (Amp^r-Gen und Replikationsursprung) und Hefe-DNA-Sequenzen, einschließlich eines Glucose-repressiblen ADH2-Promotors und eines α-Faktor-Sekretionsleitsequenz zusammengebaut werden. Der ADH2-Promotor wurde von Russell et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) und Beer et al., (Nature 300: 724, 1982) beschrieben. Die α-Faktor-Leitsequenz der Hefe, die die Sekretion von heterologen Proteinen lenkt, kann zwischen dem Promotor und dem strukturellen Gen, das exprimiert werden soll, eingefügt werden. Siehe z.B. Kurjan et al., Cell 30: 922, 1982; und Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984. Die Leitsequenz kann so modifiziert werden, dass sie in der Nähe ihres 3'-Endes eine oder mehrere nützliche Restriktionsstellen enthält, die die Fusion der Leitsequenz mit den Fremdgenen erleichtern.
Geeignete Protokolle zur Hefetransformation sind dem Fachmann bekannt. Ein beispielhaftes Verfahren wird von Hinnen et al. beschrieben, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, (1978), wobei auf Trp⁺ Transformanten in einem Selektivmedium, bestehend aus 0,67% Hefe-Stickstoffbase, 0,5% Caseinhydrolysat, 2% Glucose, 10 μg/ml Adenin and 20 μg/ml Uracil, selektiert wurde.
Wirtsstämme, die mit Vektoren transformiert wurden, welche den ADH2-Promotor aufweisen, können für die Expression in einem reichen Medium bestehend aus 1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 1% Glucose, ergänzt mit 80 μg/ml Adenin und 80 μg/ml Uracil, gezüchtet werden. Nach Verbrauch der Glucose im Medium kommt es zur Derepression des ADH2-Promotors. Rohhe fe-Überstände werden durch Filtration geerntet und vor der weiteren Reinigung bei 4°C gehalten. Verschieden Säugetier- oder Insekten-Zellkultursysteme können zur Exprimierung eines rekombinanten Proteins verwendet werden. Baculovirus-Systeme zur Produktion von heterologen Proteinen in Insektenzellen werden von Luckow und Summers, Bio/TechNrlogy 6: 47 (1988) rezensiert. Beispiele für geeignete Säugetier-Wirtszelllinien schließen L-Zellen, C127, 3T3, Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO), HeLa- und BHK-Zell-Linien ein. Weitere geeignete Säugetier-Wirtszellen schließen CV-1-Zellen (ATCC CCL70) und COS-7-Zellen (ATCC CRL 1651; beschrieben von Gluzman, Cell 23: 175, 1981), wobei beide aus Affennieren abgeleitet sind, ein. Eine weitere Affennieren-Zelllinie, CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478), wurde durch Transfektion von der CV-1-Zelllinie mit einem Gen, das das Epstein-Barr-Virus-Kernantigen-1 (EBNA-1) kodiert, und mit einem Vektor, der CMV-Regulationssequenzen enthält (McMahan et al., EMBO J. 10: 2821, 1991), gewonnen. Das EBNA-1-Gen gestattet die episomale Replikation der Expressionsvektoren, wie HAV-EO oder pDC406, die den EBV-Replikationsursprung enthalten.
Säugetier-Expressionsvektoren können nicht-transkribierte Elemente aufweisen, wie zum Beispiel einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und mit dem zu exprimierende Gen verbundene Enhancer und andere flankierende nichttranskribierte Sequenzen am 5'- oder 3'-Ende und nichttranslatierte Sequenzen am 5'- oder 3'-Ende, wie zum Beispiel Notwendige Ribosomen-Bindungsstellen, eine Poly-Adenylierungsstelle, Donator- und Akzeptor-Spleißstellen und Transkriptionsterminations-Sequenzen. Die Transkriptions- und Translations-Kontrollsequenzen in den für die Transformation von Vertebraten-Zellen verwendeten Expressionsvektoren können von viralen Quellen geliefert werden. Zum Beispiel werden im Allgemeinen verwendete Promotoren und Enhancer aus Polyoma, Adenovirus 2, Simian-Virus 40 (SV40) und humanen Zytomegalievirus gewonnen. Aus dem SV40-Virusgenom gewonnene DNA-Sequenzen, wie zum Beispiel SV40-Ursprung-, frühe und späte Promotor, Enhancer, Spleiß- und Polyadenylierungsstellen können dazu verwendet werden, um die anderen für die Expression einer heterologen DNA-Sequenz benötigten genetischen Elemente zu liefern. Die frühen und späten Promotoren sind besonders nützlich, weil beide leicht vom Virus als Fragment gewonnen werden, das auch den Replikationsursprung des SV40-Virus enthält (Fiers et al., Nature 273: 113, 1978). Kleinere oder größere SV40-Fragmente können ebenfalls verwendet werden, sofern die 250 bp Sequenz, die sich von der Hind-III-Stelle bis zur BglI-Stelle im Replikationsursprung des Virus erstreckt, enthalten ist.
Exemplarische Vektoren können so wie von Okayama und Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983) offenbart wurde konstruiert werden. Ein nützliches System für die stabile, starke Expression der Säugetierrezeptor cDNAs in C 127 murinen Brustepithelzellen kann im Wesentlichen wie von Cosman et al (Mol. ImmuNrl. 23: 935, 1986) beschrieben ist, konstruiert werden. Aus Retroviren abgeleitete Vektoren können ebenfalls verwendet werden.
Wenn die Sekretion des OSM-Rβ-Proteins aus der Wirtszelle erwünscht ist, kann der Expressionsvektor eine DNA enthalten, welche ein Signal- oder Leader-Peptid kodiert. Statt der nativen Signalsequenz kann eine heterologe Signalsequenz hinzugefügt werden, wie zum Beispiel die Signalsequenz für Interleukin-7 (IL-7), beschrieben in US-Patent 4.965.195; die Signalsequenz für den Interleukin-2-Rezeptor, beschrieben bei Cosman et al., Nature 312: 768 (1984); das Interleukin-4-Signalpeptid, beschrieben in EP 367.566 ; das Typ-I-Interleukin-1-Rezeptor-Signalpeptid, beschrieben im US-Patent 4.968.607; und das Typ-II-Interleukin-1-Rezeptor-Signalpeptid, beschrieben in EP 460.846 .
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zum Herstellen von rekombinanten Proteinen der vorliegenden Erfindung und weist die Kultivierung einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, welcher eine DNA-Sequenz aufweist, welche das Protein kodiert unter Bedingungen, die die Expression fördern auf. Das gewünschte Protein wird dann aus dem Kulturmedium oder Zellextrakten gereinigt. Das gewünschte Protein kann zum Beispiel entweder OSM-Rβ oder der heterodimere Rezeptor sein. Es können ebenfalls zellfreie Translationssysteme verwendet werden, um das gewünschte Protein mit Hilfe von RNA, die von der neuartigen DNA der vorliegenden Erfindung abgeleitet wurde, zu produzieren.
Als ein mögliches Beispiel können Überstände von Expressionssystemen, die das rekombinante Protein in das Kulturmedium absondern, zuerst unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Proteinkonzentrationsfiltern, wie zum Beispiel mittels einer Ultrafiltrationseinheit von Amicon oder Millipore Pellicon konzentriert werden Nach dem Konzentrationsschritt kann das Konzentrat auf eine geeignete Reinigungsmatrix aufgetragen werden. Eine geeignete Affinitätsmatrix kann zum Beispiel Onkostatin-M enthalten. Eine Onkostatin-M-Affnitätsmatrix kann durch die Kopplung von rekombinantem Human-Onkostatin-M an Bromcyan-aktivierte Sepharose (Pharmacia) oder an Hydrazid Affigel (Biorad) gemäß den Empfehlungen des Herstellers hergestellt werden. Die sequentielle Immunreinigung unter Verwendung von Antikörpern, die an einen geeigneten Träger gebunden sind, wird bevorzugt. Proteine, die sich an einen OSM-Rβ-spezifischen Antikörper binden, werden gewonnen und mit einem pg130-spezifischen Antikörper auf einem unlöslichen Träger in Kontakt gebracht. Proteine, die mit beiden Antikörpern immunoreaktiv sind, können somit identifiziert und isoliert werden.
Alternativ kann ein Anionenaustauscherharz, beispielsweise eine Matrix oder ein Substrat mit anhängenden Diethylaminoethyl-Gruppen (DEAE), verwendet werden. Als Matrizen können Acrylamid, Agarose, Dextran, Zellulose oder andere häufig in der Proteinreinigung verwendete Typen verwendet werden. Alternativ kann ein Kationenaustauscherschritt verwendet werden. Geeignete Kationenaustauscher schließen verschiedene unlösliche Matrizen ein, die Sulfopropyl- oder Karboxymethyl-Gruppen enthalten. Sulfopropyl-Gruppen werden bevorzugt.
Ein oder mehrere Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Schritte (RP-HPLC), die hydrophobe RP-HPLC-Medien verwenden, z.B. Kieselgel, das anhängende Methyl- oder andere aliphatische Gruppen besitzt, können zur weiteren Reinigung des Fusionsproteines verwendet werden.
Einige oder alle der bisherigen Reinigungsschritte können in verschiedenen Kombinationen verwendet werden, um ein im Wesentlichen homogenes rekombinantes Protein bereitzustellen. Rekombinante Zellkulturen ermöglichen die Produktion eines Fusionsproteins, welches frei von diesen kontaminierenden Proteinen, die normalerweise mit gp130 oder OSM-Rβ assoziiert sind, wie sie in der Natur in ihrer jeweiligen Herkunftsart wie z.B. auf der Oberfläche bestimmter Zelltypen auftreten.
Die vorgenannten Reinigungsverfahren gehören zu jenen, die auch zur Reinigung von nicht rekombinanten Rezeptoren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Wenn Linkingverfahren verwendet werden, die Homodimere (gp130-Linker-gp130 und OSM-Rβ-Linker-OSM-Rβ) produzieren können, werden Reinigungsverfahren, die das Heterodimer von solchen Homodimeren trennen, eingesetzt. Ein Beispiel für ein derartiges Verfahren ist die oben erläuterte Immunreinigung. In einer Ausführungsform, wird OSM-Rβ (rekombinant oder nicht-rekombinant) so gereinigt, dass durch SDS-PAGE keine Banden, die anderen (kontaminierenden) Proteinen entsprechen, festgestellt werden können.
Ein rekombinantes, in einer Bakterienkultur produziertes Protein wird normalerweise durch anfängliche Extraktion aus Zellpellets isoliert, gefolgt von einem oder mehreren Konzentrations-, Aussalzungs-, wässrigen Ionenaustausch- oder Größenausschlusschromatographie-Schritten. Abschließend kann Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) als letzter Reinigungsschritt angewandt werden. Mikrobiobische Zellen, die bei der Expression rekombinanter Fusions proteine verwendet werden, können durch jedes geeignete Verfahren, einschließlich Gefrier/Tau-Zyklen, Sonikation, mechanische Zerstörung oder Verwendung von Zell-Iysierende-Agenzien zerstört werden.
Die Hefefermentation, die Fusionsproteine als sekretiertes Protein exprimiert, vereinfacht die Reinigung stark. Sekretierte rekombinante Proteine, die aus einer im großen Rahmen durchgeführten Fermentation resultieren, können mit Verfahren analog zu denen in Urdal et al. (J. Chromatog. 296: 171, 1984) offenbarten, gereinigt werden, wobei zwei sequentielle Umkehrphasen-HPLC-Schritte zur Reinigung eines rekombinanten Proteins mit einer präparativen HPLC-Säule eingeschlossen sind.
Die DNA- oder Aminosäuresequenzen von gp130 und OSM-Rβ können von den in SEQ ID Nr: 1 und SEQ ID Nr: 5 dargestellten abweichen. Aufgrund der bekannten Degeneration des genetischen Codes können beträchtliche Variationen in den Nukleotidsequenzen, die dieselbe Aminosäuresequenz kodieren, auftreten. Außerdem gelten DNA-Sequenzen, die in der Lage sind, unter mäßig stringenten oder stark stringenten Bedingungen zur nativen DNA-Sequenz der SEQ ID Nr: 1 und SEQ ID Nr: 5 zu hybridisieren und die das biologisch aktive gp130 bzw. OSM-Rβ-Polypeptid kodieren, im Kontext der vorliegenden Erfindung ebenso als gp130- oder OSM-Rβ-kodierende DNA-Sequenzen. Solche hybridisierenden Sequenzen schließen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Variantensequenzen wie die nachstehend beschriebenen und von anderen Säugetierarten abgeleitete DNA ein. Menschliches OSM-Rβ ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ebenso wie OSM-Rβ-Proteine, die von anderen Säugetierarten abgeleitet werden, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Ratten, Rinder, Schweine oder verschiedene nicht-menschliche Primaten.
Mäßig stringente Bedingungen schließen Bedingungen, die beispielsweise bei Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd ed., Vol 1, pp. 1.101–104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, beschrieben wurden, ein. Mäßig stringente Bedingungen, wie in Sambrook et al. Definiert ist, schließen solche einer Vorwaschlösung von 5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH-Wert 8,0) und Hybridisierungsbedingungen von etwa 55°C, 5 × SSC über Nacht ein. Stark stringente Bedingungen schließen höhere Hybridisierungs- und Waschtemperaturen ein. Der Fachmann wird erkennen, dass sich die Temperatur und die Salzkonzentration der Waschlösung nach Erfordernis entsprechend Faktoren wie der Sondenlänge eingestellt werden kann. Eine Ausführungsform der Erfindung ist auf DNA-Sequenzen gerichtet, die mit der OSM-Rβ-DNA der SEQ ID Nr: 5 unter stark stringenten Bedingungen hybridisiert werden, wobei die Bedingungen eine Hybridisierung bei 68°C gefolgt von einer Waschung in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 63–68°C beinhalten. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung, stellt die vorliegende Erfindung einen heterodimeren Rezeptor bereit, in dem OSM-Rβ und gp130 durch eine DNA kodiert sind, die unter mäßig oder stark strigenten Bedingungen zu der DNA der SEQ ID Nr: 5 oder SEQ ID Nr: 1 hybridisiert.
Weiters werden bestimmte Mutationen in einer Nukleotidsequenz, die OSM-Rβ oder gp130 kodiert, nicht in das endgültige Proteinprodukt exprimiert. Zum Beispiel können Nukleotid-Substitutionen vorgenommen werden, um die Expression zu verbessern, hauptsächlich, um sekundäre Strukturschleifen in der transkribierten mRNA zu vermeiden (siehe EP 75,444A ). Andere Änderungen der Nukleotidsequenz können gemacht werden, um Codons zu erhalten, die von dem gewählten Wirt einfacher translatiert werden können, z.B. der bekannte E. coli Vorzugscodon für E. coli-Expression.
Die Aminosäuresequenz von nativem gp130 oder OSM-Rβ kann durch Substituieren, Deletieren, Hinzu- oder Einfügen einer oder mehrerer Aminosäuren variieren, um eine gp130 oder OSM-Rβ-Variante zu erhalten. Varianten, die die gewünschte biologische Aktivität des nativen gp130- und OSM-Rβ-Proteine besitzen, können im Rezeptor der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Untersuchungen, durch welche die biologische Aktivität der Varianten-Proteine analysiert werden kann, werden in den nachstehenden Beispielen beschrieben. Biologisch aktive gp-130-Polypeptide sind in der Lage, Onkostatin-M zu binden. Die hierin offenbarte gewünschte biologische Aktivität von OSM-Rβ-Polypeptiden ist die Fähigkeit, die Bindung von Onkostatin-M zu verbessern, wenn OSM-Rβ mit gp130 verbunden ist, verglichen mit dem Niveau der Onkostatin-M-Bindung an gp130 allein.
Änderungen an der nativen Aminosäuresequenz lassen sich durch ein beliebiges aus einer Reihe bekannter Verfahren realisieren. Zum Beispiel können Mutationen an besonderen Stellen durch Synthetisieren von Oligonukleotiden, die eine Mutantensequenz enthalten, die von Restriktionsstellen flankiert ist, eingeführt werden, die die Ligation von Fragmenten der nativen Sequenz ermöglicht. Im Anschluss an die Ligation kodiert die resultierende rekonstruierte Sequenz ein Analogon, dass die gewünschte Aminosäureeinfügung, -substitution oder -deletion enthält.
Alternativ können Oligonukleotid-gerichtete, ortsspezifische Mutageneseverfahren angewandt werden, um ein verändertes Gen bereitzustellen, das ein besonderes Codon aufweist, welches entsprechend der erforderlichen Substitution, Deletion oder Einfügung verändert wurde. Beispielhafte Verfahren zur Bewirkung der oben dargestellten Veränderungen sind bei Walder et al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene 37: 73, 1985); Craig (BioTechniques, Januar 1985, 12–19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); US-Patent Nr. 4,518,584 und US-Patent Nr. 4,737,462 offenbart.
Bioequivalente Varianten von OSM-Rβ und gp130 können sich zum Beispiel durch verschiedene Substitutionen von Aminosäureresten oder durch Deletion terminaler oder interner Aminosäuren, die für die biologische Aktivität nicht benötigt werden, konstruiert werden. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die variierte Aminosäuresequenz mindestens zu 80%, im Idealfall mindestens zu 90% identisch mit der nativen Sequenz. Die prozentuale Ähnlichkeit kann beispielsweise durch Vergleichen der Sequenzinformation mit Hilfe des GAP-Computer-Programms, Version 6.0, erhältlich von University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) bestimmt werden. Das GAP-Programm verwendet den Needleman-Wunsch Algorithmus (J. Mol. Biol. 48: 443, 1970) in der überarbeiteten Version von Smith und Westerman (Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981). Kurz gesagt definiert das GAP-Programm Ähnlichkeit als Anzahl ausgerichteter Symbole (d.h. Nukleotide oder Aminosäuren), die ähnlich sind, geteilt durch die Gesamtzahl der Symbole in der kürzeren der beiden Sequenzen. Die bevorzugten Standardparameter für das GAP-Programm schließen ein: (1) eine unäre Vergleichsmatrix (enthält einen Wert von 1 für Übereinstimmungen und einen Wert von 0 für Nicht-Übereinstimmungen) für Nukleotide und die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov und Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986, wie beschrieben bei Schwartz und Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequenz and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353–358, 1979; (2) einen Strafpunkt von 3,0 für jede Lücke und einen zusätzlichen Strafpunkt von 0,10 für jedes Symbol in jeder Lücke und (3) keinen Strafpunkt für Endlücken.
Im Allgemeinen sollten Substitutionen konservativ gemacht werden, d.h. die am meisten bevorzugten Aminsäuresubstituenten sind solche, die physiochemische Merkmale haben, die jenen des zu ersetzenden Reste ähneln. Beispiele für konservative Substitutionen schließen die Substitution eines aliphatischen Rests durch einen anderen, wie Ile, Leu oder Ala für einen anderen, oder Substitutionen eines polaren Rests für einen anderen, wie zwischen Lys und Arg, Glu und Asp, oder Gln und Asn ein. Andere solche konservativen Substitutionen, wie zum Beispiel die Substitutionen von ganzen Regionen mit ähnlichen Hhydrophobizitätsmerkmalen, sind gut bekannt.
Cysteinreste können deletiert oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, um die Bildung von unnötigen oder inkorrekten intramolekularen Disulfidbrücken bei der Renaturierung zu verhindern. Aminosäuren können durch hydrophille hydrophobe Aminosäuren im transmembranen Bereich und/oder in der intrazellulären Domäne von gp130 und OSM-Rβ ersetzt werden, um die Wasserlöslichkeit der Proteine zu verbessern.
Benachbarte zweibasische Aminosäurereste können modifiziert werden, um die Expression in Hefesystemen, in denen KEX2-Proteaseaktivität vorkommt, zu verbessern. EP 212,914 offenbart der Verwendung der ortsspezifischer Mutagenese, um die KEX2-Protease verarbeitenden Stellen in einem Protein zu inaktivieren. KEX2-Protease verarbeitende Stellen werden durch Deletion, Addition oder Substitution von Resten inaktiviert, um Arg-Arg, Arg-Lys und Lys-Arg-Paare zu verändern, um das Vorkommen solcher benachbarter basischer Reste zu eliminieren. Diese Aminosäurepaare, die KEX2-Protease verarbeitende Stellen darstellen, finden sich bei den Resten 290–291, 291–292, 580–581 und 797–798 des OSMβ-Proteins der SEQ ID Nr: 6. Diese KEX2-Stellen werden an den Positionen 153–154 und 621–622 des gp130 Proteins der SEQ ID Nr: 2 gefunden. Lys-Lys-Paarungen sind wesentlich weniger anfällig gegenüber einer KEX2-Spaltung, und die Umwandlung von Arg-Lys oder Lys-Arg zu Lys-Lys stellt einen konservativen, bevorzugten Ansatz für die Inaktivierung von KEX2-Stellen dar.
Die vorliegende Erfindung schließt auch Proteine mit oder ohne assoziierte Glykosilierung nach nativem Muster ein. Die Expression von DNAs, die die Fusionsproteine in Bakterien, wie E. coli kodieren, liefert nicht-glykosilierte Moleküle. Funktionale mutante Analoga mit inaktivierten N-glykosilierten Stellen lassen sich durch Oligonukleotidsynthese und Ligation oder durch ortsspezifische Mutageneseverfahren herstellen. Diese analogen Proteine lassen sich in einer homogenen, kohlenhydrat-reduzierten Form mit einer guten Ausbeute unter Verwendung von Hefeexpressionssystemen herstellen. N-Glykosilierungsstellen in eukaryotischen Proteinen sind durch das Aminosäuretriplet Asn-A1-Z gekennzeichnet, wobei A1 jede Aminosäure außer Pro und Z Ser oder Thr ist. In dieser Sequenz stellt Asparagin eine Seitenketten-Aminogruppe für die kovalente Anheftung von Kohlenhydrat, bereit.
Die OSM-Rβ Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr: 6 enthält 16 solcher N-Glycosilierungsstellen, die alle in der extrazellulären Domäne, bei den Aminosäuren 15–17, 57–59, 104–106, 136–138, 149–151, 194–196, 280–282, 299–301, 318–320, 334–336, 353–355, 395–397, 419–421, 464–466, 482–484 und 553–555 der SEQ ID-Nr: 6 gefunden werden. Die extrazelluläre Domäne von gp130 weist N-Glycosilierungsstellen an den Positionen 21–23. 61–63, 109–111, 135–137, 205–207, 224–226, 357–359, 361–363, 368–370, 531–533 und 542–544 der SEQ ID Nr: 2 auf. Eine solche Stelle kann durch Substitution einer anderen Aminosäure für Asn oder für Rest-Z, durch Deletion von Asn oder Z oder durch Einfügung einer Nicht-Z Aminosäure zwischen A1 und Z oder einer Aminosäure außer Asn zwischen Asn und A1 eliminiert werden. Bekannte Verfahren für das Inaktivieren von N-Glycosilierungsstellen in Proteinen schließen die im US-Patent 5,071,972 und EP 276,846 beschriebenen ein.
Varianten der Rezeptorproteine der vorliegenden Erfindung schließen auch verschiedene Strukturformen des Primärproteins ein, die biologische Aktivität bewahren. Aufgrund der Gegenwart ionisierbarer Amino- und Carboxylgruppen, zum Beispiel, kann ein Rezeptorprotein die Form eines sauren oder basischen Salzes haben oder in neutraler Form auftreten. Einzelne Aminosäurereste können auch durch Oxidation oder Reduktion modifiziert werden.
Die primäre Aminosäurestruktur kann auch durch Bildung kovalenter oder aggregativer Konjugate mit anderen chemischen Resten, wie Glycosylgruppen, Lipiden, Phosphat, Acetylgruppen und dergleichen modifiziert werden. Kovalente Derivate werden durch Bindung bestimmter funktioneller Gruppen an Aminosäureseitenketten oder an die N- oder C-Termini hergestellt. Andere Derivate des Rezeptorproteins im Rahmen der vorliegenden Erfindung schließen kovalente oder aggregative Konjugate des Rezeptorproteins mit anderen Proteinen oder Polypeptiden, wie durch Synthese in rekombinanter Kultur als N- oder C-terminale Fusionen, ein.
Beispielsweise kann das konjugierte Polypeptid eine Signal-(oder Leit-)-Polypeptidsequenz an der N-terminalen Region des Proteins sein, welche cotranslatorisch oder posttranslatorisch den Transfer des Proteins von seinem Syntheseort zu seinem Funktionsort innerhalb oder außerhalb der Zellmembran oder -wand lenkt (z.B. der Hefe-α-Faktor-Leiter).
Peptide können mit dem gewünschten Protein (z.B. über rekombinante DNA-Techniken) fusioniert werden, um die Reinigung oder Identifikation zu erleichtern. Beispiele schließen poly-His oder das Flag^®-Peptid, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID Nr: 7) ein (Hopp et al., Bio Technology 6: 1204, 1988 und US-Patent 5,011,912). Das Flage^®-Peptid ist hoch antigen und stellt ein Epitop bereit, das reversibel durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper gebunden ist, was eine rasche Untersuchung und leichte Reinigung von exprimiertem rekombinanten Protein ermöglicht. Expressionssysteme, die für die Fusionierung des Flag^®-Octapeptids an den N- oder C-Terminus eines gegebenen Proteins nützlich sind, sind von Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, CT, erhältlich, ebenso wie monoklonale Antikörper, die das Octapeptid binden.
Eingeschlossen in der vorliegenden Erfindung sind OSM-Rβ-Polypeptide in der Form von Oligomeren, wie Dimeren oder Trimeren. Solche Oligomere können natürlich auftreten oder durch rekombinante DNA-Technologie erzeugt werden. Die vorliegende Erfindung stellt Oligomere von OSM-Rβ (vorzugsweise die extrazelluläre Domäne oder ein Fragment davon) bereit, die durch Disulfidbindungen verbunden sind oder als Fusionsproteine mit oder ohne Peptidlinker exprimiert werden. Oligomere können z.B. durch Disulfidbereichen zwischen Cystenresten in verschiedenen OSM-Rβ-Polypeptiden gebildet werden.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können OSM-Rβ-Oligomere mit Hilfe von Polypeptiden hergestellt werden, die, wie oben beschrieben, von Immunglobulinen abgeleitet sind.
Natürlich auftretende OSM-Rβ Varianten werden auch von der vorliegenden Erfindung umfasst. Beispiele für solche Varianten sind Proteine, die aus alternativen mRNA-Spleißereignissen oder durch die proteolytische Spaltung des OSM-Rβ-Proteins entstehen, wobei die gewünschte.
Biologische Aktivität erhalten bleibt. Alternatives Spleißen von mRNA kann ein gekürztes, aber biologisch aktives OSM-Rβ-Protein ergeben, wie zum Beispiel eine natürlich vorkommende lösliche Form des Proteins. Variationen, die der Proteolyse zuschreibbar sind, schließen zum Beispiel Unterschiede in den N- oder C-Termini bei der Expression in verschiedenen Arten von Wirtszellen ein, die durch proteolytische Entfernung einer oder mehreren terminaler Aminosäuren vom OSM-Rβ-Protein verursacht sind (im Allgemeinen von 1–5 terminalen Aminosäuren). Natürlich vorkommende gp130-Varianten lassen sich in den erfinderischen Rezeptoren verwenden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein Rezeptorprotein der vorliegenden Erfindung mit einem physiologisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel aufweist.
Solche Träger und Verdünnungsmittel werden bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen für die Rezipienten nicht toxisch sein. Solche Zusammensetzungen können zum Beispiel das Rezeptorprotein in einer gepufferten Lösung aufweisen, zu dem Antioxidationen, wie z.B. Ascorbinsäure, niedermolekular Polypeptide (weniger als etwa zehn Reste), Proteine, Aminosäure, Kohlehydrate einschließlich Glucose, Saccharose oder Dextrine, Chelatbildner wie EDTA, Glutathion und andere Stabilisatoren und Exzipienten hinzugefügt sein kann. Der Rezeptor der vorliegenden Erfindung kann durch jedes geeignete Verfahren auf eine für die Indikation geeignete Weise verabreicht werden, wie intravenöse Injektion, lokale Verabreichung, kontinuierliche Infusion, nachhaltige Abgabe aus Implantaten usw..
Der heterodimere Rezeptor der vorliegenden Erfindung (weist gp130 und OSM-Rβ auf) ist als ein Onkostatin M bindender Wirkstoff nützlich. Dieser Rezeptor, der vorzugsweise lösliches gp130 und lösliches OSM-Rβ aufweist, hat sowohl in vitro als auch in vivo Anwendungen, wie z.B. in Untersuchungen des Mechanismus der Transduktion des biologischen Signals, das durch Bindung von Onkostatin M an diesen Rezeptor an einer Zelle initiiert wird. Solche Rezeptoren können auch dazu verwendet werden, um eine biologische Aktivität von Onkostatin M in verschiedenen In-vitro Untersuchungen oder In-vivo Verfahren zu hemmen. In einer Ausführungsform der Erfindung, wird der erfinderische Rezeptor verabreicht, um Onkostatin M zu binden und auf diese Weise die Bindung des Onkostatin M an endogene Zelloberflächenrezeptoren zu hemmen. Eine biologische Aktivität, die durch eine solche Bindung von Onkostatin M an die Zellen vermittelte wird ist auf diese Weise auch gehemmt.
gp130 allein bindet Onkostatin M, aber mit relativ niedriger Affinität (Gearing et al., Science 255: 1434,1992). Heterodimere Rezeptoren, die einen Leukämie hemmenden Faktor (LIF) Rezeptor und gp130 aufweisen, binden Onkostatin M mit einer höheren Affinität als gp130 allein, sie binden aber auch LIF mit einer hohen Affinität (Gearing et al., s. o.). Rezeptoren der vorliegenden Erfindung, die durch Zellen produziert werden, die beispielsweise mit OSM-Rβ- und gp130-kodierender DNA cotransfiziert werden, binden Onkostatin M mit einer hohen Affinität, wirken jedoch nicht als LIF-Rezeptoren mit hoher Affinität. Solche Rezeptoren der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, wenn beispielsweise eine Hemmung einer Onkostatin M vermittelten Aktivität, nicht aber einer LIF vermittelten Aktivität gewünscht ist. Onkostatin M teilt bestimmte Eigenschaften mit LIF, weist aber auch andere Aktivitäten auf die LIF nicht aufweist. Außerdem bietet die Verwendung der Rezeptoren der vorliegenden Erfindung in In-vitro Untersuchungen den Vorteil, dass man bestimmen kann, dass die Untersuchungs-Ergebnisse der Bindung von Onkostain M, jedoch nicht von LIF durch den Rezeptor zuzuschreiben sind.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein heterodimerer Rezeptor, der OSM-Rβ und gp130 aufweist, in vivo verabreicht, um eine biologische Aktivität von Onkostatin M zu hemmen.
Onkostatin M hat an einer Vielfalt verschiedener Zellarten wachstumsmodulierende Aktivität gezeigt. Berichten zufolge stimuliert Onkostatin M die Hematopoiesis, die epitheliale Zellproliferation, steigert die Plasminaktivität (und bewirkt dabei Fibrinolyse), hemmt die Angiogenese und unterdrückt die Exprimierung von Antigenen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (Major histocompatibility complex) an Endothelzellen. Siehe PCT-Anmeldung WO 9109057 und europäisch Patentanmeldung Nr. 422,186. Wenn diese oder andere biologische Wirkungen von Onkostatin M unerwünscht sind, kann ein Rezeptor der vorliegenden Erfindung verabreicht werden, um Onkostatin M zu binden.
Der erfinderische Rezeptor kann einem Patienten in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht werden, um eine durch Onkostatin M vermittelte Störung zu behandeln. Eine Störung gilt als durch Onkostatin M vermittelt, wenn Onkostatin M die Störung (direkt oder indirekt) verursacht oder diese verschlimmert. Lösliche Rezeptorproteine können verwendet werden, um sich in Konkurrenz an Onkostatin M zu binden und dadurch die Bindung von Onkostatin M an endogene Zelloberflächenrezeptoren zu hemmen. Es wird angenommen, dass Onkostatin M die Produktion des Cytokins-Interleukin-6 (IL-6) stimuliert, wie von Braun et al., J. Immunol. 147: 2175 (1991) berichtet wird. Onkostatin M könnte deshalb indirekt Störungen, die mit der Anwesenheit von IL-6 assoziiert sind, vermitteln. Berichten zufolge ist IL-6 in die Pathogenese des Kaposi-Sarkoms, das mit AIDS in Zusammenhang steht, involviert (de Wit et al., J. Intern. Med. (England) 229: 539, 1991). Berichten zufolge spielt Onkostatin M eine Rolle bei der Stimulierung der Proliferation von Kaposi-Sarkomzellen (Nair et al., Science 255: 1430, 1992, und Miles et al., Science 255: 1432, 1992). Die Bindung von Onkostatin M durch einem Rezeptor der vorliegenden Erfindung (vorzugsweise eine lösliche Form davon) kann somit nützlich in der Behandlung des Kaposi-Sarkoms sein.
Heterodimere Rezeptoren, die mit gp130 verbundenes OSM-Rβ aufweisen, finden auch in Untersuchungen zur biologischen Aktivität von Onkostatin M-Proteinen Verwendung, wobei diese biologische Aktivität in Bezug auf die Bindungsaffinität zum Rezeptor gemessen wird. Zur Erläuterung kann der Rezeptor in einer Bindungsuntersuchung verwendet werden, um die biologische Aktivität eines Onkostatin M-Fragments, einer -Variante, oder eines Onkostatin-Muteins zu messen. Der Rezeptor ist nützlich um zu bestimmen, ob die biologische Aktivität von Onkostatin M nach der Modifizierung eines Onkostatin M-Proteins (z.B. chemische Modifizierung, Mutation usw.) erhalten bleibt. Die Bindungsaffinität des modifizierten Onkostatin M-Proteins zum Rezeptor wird mit der eines unveränderten Onkostatin M-Proteins verglichen, um etwaige nachteilige Wirkung der Modifikation auf die biologische Aktivität zu erfassen. Die biologische Aktivität kann auf diese Art beurteilt werden, bevor das modifizierte Protein beispielsweise in einer Forschungsstudie oder einer Untersuchung verwendet wird.
Die heterodimeren Rezeptoren finden auch als Reagenzien Verwendung, die von jenen eingesetzt werden können die "Qualitätssicherungs"-Studien durchführen, beispielsweise, um die Lagerfähigkeit und Stabilität von Onkostatin M-Proteinen unter verschiedenen Bedingungen zu überwachen. Die Rezeptoren können verwendet werden, um die biologische Aktivität (bezüglich der Bindungsaffinität zum Rezeptor) von Onkostatin M-Proteinen zu bestätigen, die zum Beispiel bei verschiedenen Temperaturen und über verschiedene Zeiträume gelagert worden sind oder die in verschiedenen Arten von rekombinanten Expressionssystemen hergestellt worden sind.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Fragmente der hierin dargestellten OSM-Rβ-Nukleotidsequenzen bereit. Gewünscht ist, dass solche Fragmente zumindest etwa 14 Nukleotide der in SEQ ID Nr: 5 dargestellten Sequenz aufweisen. DNA- und RNA-Komplemente der Fragmente sind hierin, zusammen sowohl mit Einzelstrang- als auch Doppelstrangformen der OSM-Rβ-DNA bereitgestellt.
Zu den Verwendungen derartiger Nukleinsäurefragmente gehört die Verwendung als Sonde. Derartige Sonden lassen sich in artenübergreifenden Hybridisierungsverfahren verwenden, um OSM-Rβ-DNA von zusätzlichen Säugetierarten zu isolieren. Als ein Beispiel kann eine dem extrazellulären Bereich von OSM-Rβ entsprechende Sonde verwendet werden. Die Sonden finden auch bei der Erfassung der Anwesenheit von OSM-Rβ-Nukleinsäuren in In-vitro-Untersuchungen und in solchen Verfahren wie Northern- und Southern-Blot Verwendung. Zellarten, die OSM-Rβ exprimieren, lassen sich identifizieren. Solche Verfahren sind gut bekannt, und der Fachmann kann, abhängig von der speziell beabsichtigten Anwendung, eine Sonde geeigneter Länge wählen. Die Sonden lassen sich durch konventionelle Verfahren markieren (z.B. mit ³²P).
Andere nützliche Fragmente der OSM-Rβ-Nukleinsäuren sind Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide welche eine einsträngige Nukleinsäuresequenz (entweder RNA oder DNA) aufweisen, die zur Bindung an OSM-Rβ-MRNA (Sinn) oder an OSM-Rβ-DNA (Gegensinn) Zielsequenzen imstande ist. Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung können ein Fragment der Kodierregion von OSM-Rβ-cDNA aufweisen. Ein derartiges Fragment weist im Allgemeinen zumindest etwa 14 Nukleotide, vorzugsweise von etwa 14 bis etwa 30 Nukleotide auf.
Die Fähigkeit, ein Gegensinn- oder ein Sinn-Oligonukleotid basierend auf einer cDNA-Sequenz für ein gegebenes Protein zu erzeugen, ist zum Beispiel bei Stein und Cohen, Cancer Res. 48: 2659, 1988 und van der Krol et al., BioTechniques 6: 958, 1988, beschrieben.
Die Bindung von Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotiden an Zielnukleinsäuresequenzen hat die Bildung von Duplexen zum Ergebnis, die die Translation (RNA) oder Transkription (DNA) durch eines von mehreren Mitteln, einschließlich verstärktem Abbau der Duplexe, vorzeitiger Beendigung der Transkription oder Translation oder anderer Mittel blockieren. Das Gegensinn- Oligonukleotid kann auf diese Art verwendet werden, um die Expression von OSM-Rβ-Proteinen zu blockieren.
Gegensinn oder Sinn-Oligonukleotide weisen weiters Oligonukleotide mit modifizierten Zucker-Phosphodiester-Rückgraten (oder anderen Zuckerbindungen wie jene, die in WO91/06629 beschrieben sind) auf wobei solche Zuckerbindungen gegen endogene Nukleasen resistent sind. Solche Oligonukleotide mit resistenten Zuckerbindungen sind in vivo stabil (d.h., imstande, enzymatischem Abbau zu widerstehen), bewahren jedoch Sequenzspezifität, um in der Lage zu sein, Ziel-Nukleotidsequenzen zu binden. Andere Beispiele für Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotide schließen solche Oligonukleotide ein, welche kovalent mit organischen Resten wie den in WO 90/10448 beschriebenen, und anderen Resten, die die Affinität des Oligonukleotids zu einer Zielnukleinsäuresequenz, wie Poly-(L-Lysin) erhöhen, verbunden sind. Weiters können Interkalanzien, wie Ellipticin und Alkylanzien oder Metallkomplexe an die Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotide angeheftet werden, um die Bindungsspezifitäten des Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotids für die Zielnukleotidsequenz zu modifizieren.
Gegensinn oder Sinn-Oligonukleotide können mittels jeglichem Gentransferverfahren, einschließlich beispielsweise CaPO₄ vermittelter DNA-Transfektion, Elektroporation, oder durch Nutzung von Gentransfervektoren, wie Epstein-Barr-Virus, in eine die Zielnukleinsäuresequenz enthaltende Zelle eingebracht werden. Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide werden vorzugsweise in eine die Zielnukleinsäuresequenz enthaltende Zelle eingefügt durch Insertion des Gegensinns- oder Sinn-Oligonukleotids in einen geeigneten retroviralen Vektor; und dann wird die Zelle mit dem die eingeführte Sequenz enthaltenden retroviralen Vektor entweder in vivo oder ex vivo in Kontakt gebracht. Zu geeigneten retroviralen Vektoren gehören, ohne auf diese beschränkt zu sein, solche, die vom murinen Retrovirus M-MuLV, N2 (einem von M-MuLV abgeleiteten Retrovirus) abgeleitet sind, oder die als DCT5A, DCT5B und DCT5C (siehe Anmeldung US 90/02656) bezeichneten, Doppel-Kopie-Vektoren.
Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotide können auch in eine die Zielnukleotidsequenz enthaltende Zelle durch Bildung eines Konjugats mit einem Ligand-bindenden Molekül einfügen, wie in WO 91/04753 beschrieben ist. Zu geeigneten Ligand bindenden Molekülen gehören, ohne auf diese beschränkt zu sein, Zelloberflächenrezeptoren, Wachstumsfaktoren, andere Cytokine oder andere Liganden, die Zelloberflächenrezeptoren binden.
Alternativ kann ein Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotid in eine die Zielnukleinsäuresequenz enthaltende Zelle durch Bildung eines Oligonukleotid-Lipidkomplexes eingefügt werden, wie in WO 90/10448 beschrieben ist. Der Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotid-Lipidkomplex wird vorzugsweise innerhalb der Zelle durch eine endogene Lipase dissoziiert.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um bestimmte Ausführungsformen der Erfindung zu erläutern; sie sind nicht als den Umfang der Erfindung einschränkend auszulegen.
Beispiele
Beispiel 1
Isolierung von OSM-Rβ-kodierender DNA
Die DNA, die die Onkostatin-M-Rezeptor-β-Untereinheit kodiert, wurde folgendermaßen isoliert. Das Verfahren begann mit der Herstellung, von Oligonukleotid-Degeneraten aus Aminosäuresequenzen, welche unter Proteinen der Hematopoietin-Rezeptorfamilie konserviert sind.
Die Ausrichtung der Aminosäuresequenzen von drei Proteinen in der Hematopoietin-Rezeptorfamilie (gp130, LIF-Rezeptor und G-CSF-Rezeptor) zeigt einige hoch konservierte Regionen. Derartig konservierte Regionen werden von Gearing et al. in Polyfunctional Cytokines: IL-6 und LIF, Bock et al. (Hrsg.), John Wiley & Sons, Chichester, UK, 1992, Seite 245, identifiziert und diskutiert. Auch Einbeziehung von homologen Sequenzen der γ-Kette des IL-2 Rezeptors (Takeshita et. al. Science 257: 379, 1992), wurden Oglionukleotid-Degenerate aus bestimmten konservierten Regionen (d.h. Paare von Oglionukleotiden, die alle möglichen DNA-Sequenzen beinhalten, die die Aminosäuresequenzen in den konservierten Regionen kodieren können), durch konventionelle Verfahren hergestellt.
Zwei Sätze an Degenerat-Oligonukleotide wurden als Primer in einer Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) verwendet. 5' Primer wurden zur Aminosäuresequenz PheArgXArgCys (SEQ ID Nr: 9) degeneriert, die sich an den Positionen 275–279 der gp130-Sequenz der SEQ ID Nr: 2 befindet, wobei X Ile (gefunden an dieser Position in gp130 und LIF-R) oder Val (für IL-2Rγ) darstellt. Zusätzliche 5'-Primer degenerieren zur Sequenz LeuGlnIleArgCys (SEQ ID Nr: 10), die an der entsprechenden Position inG-CSF-R gefunden wurde, wo sie auch verwendet wird. Die 3'-Primer sind Degenerate der Aminosäuresequenz TrpSerXTrpSer (SEQ ID Nr: 11), die sich an den Positionen 288–292 der gp130-Sequenz der SEQ ID Nr: 2 findet, wobei X Asp (gefunden an dieser Position in gp130 und G-CSF-R), Lys (für LIF-R) oder Glu (für IL-2Rγ) darstellt.
Um die Realisierbarkeit dieser Herangehensweise zu testen, wurde unter Verwendung der oben beschriebenen Primer eine Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) mit LIF-R, gp130, G-CSF- R oder IL-2Rγ-DNA als Matrizen durchgeführt. Die Reaktionen wurden mit konventionellem Verfahren durchgeführt, und die Reaktionsprodukte wurden mittels Gelelektrophorese analysiert. Für jede Reaktion wurde eine Bande in der Größe von etwa 50 Basenpaaren auf dem Gel gesehen, was auf eine erfolgreiche Amplifikation des DNA-Fragments der erwarteten Größe hindeutete.
Die PCR wurde dann unter Verwendung genomischer humaner-DNA als Matrize durchgeführt. Die Reaktionsprodukte wurden durch Gelelektrophorese analysiert und ein 50 pb-Bande wurde visualisiert. Diese Bande wurde aus dem Gel herausgeschnitten und die DNA wurde daraus eluiert. Die DNA wurde in den Klonierungsvektor pBLUESCRIPT^® SK subkloniert, der von Stratagene Cloning System (La Jolla, Kalifornien) erhältlich ist. E. coli-Zellen wurden mit den resultierenden rekombinanten Vektoren transformiert und individuelle Kolonien die Transformanten wurden in Platten mit 96 Kammern kultiviert.
Zwölf Kolonien wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt, und die rekombinaten Vektoren wurden daraus isoliert. Es wurden die Nukleotidsequenzen der DNA-Inserts der Vektoren bestimmt. Sieben dieser Inserts wurden durch ihre Sequenz als gp130-DNA identifiziert, zwei waren LIF-R, eines beinhaltete ein Stopp-Codon und erschien nicht interessant, und zwei enthielten eine neuartige Sequenz (dieselbe Sequenz, in beiden Orientierungen). Eine Oligonukleotidsonde, die diese neuartige Sequenz beinhaltete (der Abschnitt des Inserts, der sich zwischen den beiden Primersequenzen befindet) wurde mittels Standartverfahren hergestellt und mit ³²P markiert.
Die mit ³²P markierte Sonde wurde verwendet, um zwei verschiedene cDNA-Bibliotheken zu durchsuchen, wobei eine von der menschlichen Plazenta und die andere von einer mit IMTLH-1 bezeichneten Zelllinie abgeleitet wurde. Die plazentale Bibliothek wurde ausgewählt, weil Plazenta eine reichhaltige Quelle für Wachstums- und Differenzierungsfaktoren ist. Die IMTLH-Zellen, die durch Transformation von menschlichen Knochenmarkstromazellen mit pSV-neo gewonnen werden, wurden ausgewählt, weil herausgefunden wurde, dass sie Onkostatin M, nicht jedoch LIF binden (Thoma et al. J. Biol. Chem. 269: 6215, 1994). Darüber hinaus wurde ein RNA-Bande von etwa 5,5–6,0 kb in den Northern Blots von RNA, die von IMTLH-1-Zellen und der Plazenta abgeleitet ist, sondiert mit der oben identifizierten, ³²P markierten Sonde entdeckt.
Von beiden Bibliotheken wurden positive Klone isoliert, und durch DNA-Sequenzierung wurde festgestellt, dass sie verschiedene Abschnitte der neuartigen DNA von Interesse beinhalten. Obwohl ein Initiatorcodon (der das 5'-Ende der Kodierungsregion kennzeichnet) identifiziert wurde, enthielt offenbar keiner der Klone das Stopp-Codon, das das 3'-Ende der Kodierungsregion darstellen würde.
Eine der Sequenz, die in der Nähe des 3'-Endes in verschiedenen Klonen festgestellt wurde, entsprechende Oligonukleotid-Sonde wurde nach Standardverfahren synthetisiert und mit ³²P markiert. Die Sonde wurde verwendet, um die cDNA-Bibliothek, die aus der SV40-transformierten menschlichen Lungen-Fibroblast Zellinie WI-26 VA4 abgeleitet wurde, zu durchsuchen. Diese Bibliothek wurde zusammengestellt, wie in Beispiel 2 des US-Patents 5,264,416 beschrieben ist. Klone, die zusätzliche Kodierungssequenzen am 3'-Ende aufweisen (im Vergleich zu den oben identifizierten Klonen) wurden isoliert.
Ein Expressionsvektor wurde konstruiert, der ein DNA-Fragment enthält, welches dieses 3'-Ende der neuartigen Sequenz aufweist, die an die DNA-Fragmente der oben beschriebenen Klone ligiert ist, die das 5'-Ende der neuartigen Sequenz enthalten. Die Nukleotidsequenz der menschlichen OSM-Rβ-DNA im resultierenden rekombinanten Vektor ist in SEQ ID Nr: 5 dargestellt. Das Protein, das durch die isolierte DNA kodiert ist, ist in SEQ ID Nr: 6 dargestellt.
Der Vektor war ein als pDC409 bezeichneter Säugetier-Expressionsvektor. Dieser Vektor ist dem pDC406 ähnlich wie in McMahan et al., (EMBO J. 10: 2821, 1991) beschrieben ist. Eine BglII-Stelle außerhalb der multiplen Klonierungsstelle (MCS) im pDC406 wurde so deletiert, dass die BglII-Stelle in der MCS von pDC406 einzigartig ist. Die pDC409 multiple Klonierungsstelle (MCS) unterscheidet sich von der pDC406 dadurch, dass sie zusätzliche Restriktionsstellen und drei Stopp-Codons beinhaltet (eine in jedem Leserahmen). Ein T7-Polymerase-Promoter stromabwärts der MCS erleichtert die Sequenzierung der in die MCS eingefügten DNA.
Das OSM-Rβ cDNA-Insert wurde aus dem Expressionsvektor unter Verwendung von Restriktionsenzymen herausgeschnitten, die innerhalb der 5' und 3' nicht-kodierenden Regionen der cDNA spalten. Die herausgeschnittene cDNA wurde in die EcoRV-Stelle des Klonierungsvektors pBluescript^® SK (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Kalifornien) ligiert. Die Eco RV-Stelle, die in der multiplen Klonierungsstelle des Vektors gefunden wurde, wurde durch die Insertion der cDNA zerstört. E. coli-Zellen, die mit dem resultierenden rekombinanten Vektor transformiert wurden, wurden am 16. August 1994 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD (LTSA) hinterlegt und mit der Zugriffsnummer ATCC 69675 versehen. Die Hinterlegung erfolgte im Sinne des Budapester Abkommens.
Die in SEQ ID Nr: 6 dargestellte kodierte OSM-Rβ-Aminosäuresequenz beinhaltet ein N-terminales Signalpeptid (Aminosäure –27 bis –1), gefolgt von einer extrazellulären Domäne (Aminosäure 1 bis 714), einer transmembranen Region (Aminosäure 715 bis 734) und einer zytoplasmatischen Domäne (Aminosäure 735 bis 952). Die OSM-Rβ-Aminosäuresequenz ist zu ungefähr 30% identisch mit der des LIF-Rezeptor-Proteins, das in Gearing et al. (EMBO J. 10: 2839, 1991) und im US-Patent 5,284,755 beschrieben ist; welche hiermit als Referenz aufgenommen werden. Die DNA-Sequenz der kodierenden Region von OSM-Rβ ist zu ungefähr 48% identisch mit dem Abschnitt der LIF-R-DNA, die mit der kodierenden Region von OSM-Rβ ausgerichtet ist, wenn das oben beschriebene Computerprogramm eingesetzt wird.
Beispiel 2
Untersuchung zur Ermittlung der Bindung von M
Eine Untersuchung zur Bindung von Onkostatin M durch Zellen, die sowohl rekombinantes gp130 als auch rekombinantes OSM-Rβ exprimieren wurde folgendermaßen durchgeführt. Eine Untersuchung der Bindung von Onkostatin M durch Zellen, die ausschließlich gp 130 exprimieren, wurde ferner zu Vergleichszwecken durchgeführt.
Onkostatin M kann aus Zellen, in denen das Protein natürlicherweise gefunden wird, oder aus Zellen, die mit einem Onkostatin M kodierenden Expressionsvektor transformiert sind, gereinigt werden. Eine Quelle von Onkostatin M sind Phorbolester behandelte U937-Zellen, wie von Linsley et al. (J. Biol. Chem. 264: 4282–4289, 1989) und Gearing et al. (EMBO J. 10: 2839, 1991) beschrieben wird.
Onkostatin M (OSM) kann unter Nutzung jedes geeigneten konventionellen Verfahrens radioaktiv markiert werden. Radiojodierung von Onkostatin M wurde beispielsweise von Linsley et al. (siehe oben), beschrieben. In einem geeigneten Verfahren, wird OSM radioaktiv markiert, indem ein kommerziell erhältliches Enzymobead-Radiojodierungsreagens (BioRad) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. Das resultierende ¹²⁵I-OSM wird zu einer Arbeitsstammlösung in bindendem Medium verdünnt, das ein RPMI-1640-Medium ist, welches 2,5% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA), 0,2% (w/v) Natriumazid und 20 mM Hepes pH-Wert 7,4 enthält.
CVI-EBNA-1-Zellen wurden in 150 mm-Schalen (3,6 × 10⁶ Zellen/Schale) mit einem gp130-kodierenden Expressionsvektor transfiziert oder mit dem gp130 kodierenden Vektor und einem OSM-Rβ kodierenden Vektor cotransfiziert. Alle Zellen wurden zusätzlich mit einem Säugetier-Expressionsvektor transfiziert, der pDC410 genannt und nachstehend beschrieben wird.
Der OSM-Rβ-kodierende Vektor war der in Beispiel 1 beschriebene rekombinante Vektor, der die OSM-Rβ-DNA mit voller Länge im Säugetier-Expressionsvektor pDC409 aufweist. Der gp130-kodierende Vektor weist die humane gp130-DNA-Sequenz der SEQ ID Nr: 1 in einem pDC304 genannten Säugetier-Expressionsvektor auf. Ein ähnlicher rekombinanter Vektor, der die gleiche gp130-kodierende DNA im Säugetier-Expressionsvektor pDC303 aufweist, wurde in E. coli-Stamm-DH5a-Wirtszellen bei der American Type Culture Collection, Rockville, Kalifornien, hinterlegt. Diese transformierten Zellen wurden unter dem Namen B10G/pDC303 (DH5a) am 14. November 1991 hinterlegt und mit der ATCC-Zugriffs-Nr. 68827 versehen. Die Hinterlegung erfolgte im Sinne des Budapester Abkommens.
pDC304 weist eine NotI-Stelle in seiner multiplen Klonierungsstelle auf ist ansonsten jedoch mit pDC303 identisch. pDC303 ist im Wesentlichen identisch mit pCAV/NOT, wie in der PCT-Anmeldung WO 90/05183 beschrieben ist, außer, dass ein Segment der Adenovirus-2-Tripartite-Leitsequenz (TPL), welche einen in Bakterien funktionalen kryptischen Promoter beinhaltet, deletiert wurde. Proteinexpression von dem kryptischen Promoter ist potentiell von Nachteil für die Herstellung und Isolieren eines gewünschten rekombinanten Plasmids in Bakterienzellen.
Der pDC410-Vektor ist mit dem in Beispiel 1 beschriebenen pDC409-Vektor identisch, außer, dass der EBV-Replikationsursprung von pDC409 durch die DNA ersetzt wird, die das SV40-Große-T-Antigen, angetrieben durch den SV40-Promoter in pDC410 kodiert. Die Cotransfektion der Zellen mit diesem Vektor stellt das SV40 T-Antigen bereit, das die DNA-Replikation der anderen Plasmidvektoren, welche den SV40-Replikationsurprung enthaltend auf hohem Niveau antreibt. pDC410 ist somit für die episomale Replikation des cotransfizierten Vektors in CV1-EBNA-1-Zellen wichtig.
Die transfizierten Zellen werden für 24 Stunden kultiviert, trypsinisiert und neuerlich ausplattiert, dann für weitere 24 Stunden kultiviert, um die Expression der kodierten Proteine, die in der Zellmembran zurückbehalten wurden, zu ermöglichen. Die adhärenten Zellen wurden mittels 5 mM EDTA in PBS ausgetrieben und dann zweimal mit Bindungsmedium gewaschen (RPMI 1640 Onkostatin-Medium, welches 2,5 mg/ml Rinderserumalbumin, 2 mg/ml Natriumazid und 20 mM HEPES, pH-Wert 7,2 enthält). Die Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen an ¹²⁵I-markiertem Onkostatin M in Bindungsmedium für eine Stunde bei 37°C unter vorsichtigem Rühren inkubiert.
Freies und zellgebundenes ¹²⁵I-Onkostatin M wurde unter Verwendung des Phtphalat-Öltrennungsverfahrens von Dower et al. (J ImmuNrl. 132: 751, 1984) getrennt, wie im Wesentlichen von Park et al. (J. Biol. Chem. 261: 4177, 1986, und Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5267, 1987) beschrieben wurde. Das freie und zellgebundene ¹²⁵I- Onkostatin M wurden mit einem Packard Autogamma Counter quantifiziert. Affinitätsberechnungen (Scatchard, Ann N.Y. Acad. Sci. 51: 660, 1949) wurden mit RS/1 (BBN Software, Boston, MA) auf einem Microvax-Computer durchgeführt.
Die Resultate sind in 1 und 2 in Form von Scatchard-Analysen dargestellt. 1 stellt die Resultate für Zellen dar, die nur gp130 exprimieren. Diese transfizierten Zellen zeigten eine einzige Affinitätsbindungsklasse mit ungefähr 29.310 Rezeptorstellen pro Zelle und einer Affinitätskonstante von (Ka) 2,64 × 10⁸. 2 zeigt die Resultate für Zellen, die gp130 und OSM-Rβ exprimieren. Es ist ein biphasisches Muster zu sehen, das zwei Bindungskomponenten anzeigt. Die erste Komponente (ungefähr 2196 Rezeptorenzellen pro Zelle) weist eine Affinitätskonstante von 7,18 × 10⁹ auf. Die zweite Komponente (ungefähr 36.471 Rezeptorenzellen pro Zelle) weist eine Affinitätskonstante von 2,34 × 10⁸ auf. Somit zeigt sich eine relativ hohe Affinitätsbindungskomponente in den Zellen, die sowohl gp130 als auch OSM-Rβ exprimieren. Diese hohen Affinitätsbindungsstellen waren in Zellen, die ausschließlich gp130 exprimieren, nicht vorhanden.
Die Zellen, die sowohl mit OSM-Rβ- als auch mit gp130-kodierenden Expressionsvektoren contransfiziert waren, exprimierten ein Rezeptorprotein der vorliegenden Erfindung. Der Rezeptor bindet Onkostatin M mit höherer Affinität als das gp130-Protein, die nur auf Zellen, die mit dem gp130-kodierenden Vektor transfiziert sind exprimiert wird.
Beispiel 3
Herstellung von monoklonalen Andikörpern gegen OSM-Rβ
Gereinigte OSM-Rβ-Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden als Immunogene verwendet, um monoklonale Antikörper die damit immunreaktiv sind herzustellen, unter Nutzung konventioneller Verfahren, wie zum Beispiel jene die im US-Patent 4,411,993 offenbart sind. Geeignete Immunogene sind, ohne auf diese beschränkt zu sein, rekombinantes OSM-Rβ in voller Länge oder Fragmente davon, wie die extrazelluläre Domäne. Zum Immunisieren von Mäusen wird das Immunogen in vollständigem Freund'schen Adjuvans emulgiert und subkutan in Mengen von 10–100 μg in Balb/c Mäuse injiziert. Zehn bis zwölf Tage später wird die Immunisierung der Tiere mit zusätzlichem Immunogen, das in vollständigem Freund'schen Adjuvans emulgiert ist, verstärkt und anschließlich wird periodisch nach einem wöchentlichen bis zweiwöchentlichen Immunisierungsplan verstärkt fortgesetzt. Serumproben werden periodisch durch retroorbitale Blutung oder Schwanzspitzentfernung zum Testen mittels Dot-Blot-Untersuchung entnommen (Antikörper-Sandwich) oder ELISA (enzymgebundene Immunosorbent-Untersuchung). Andere Untersuchungsverfahren sind auch geeignet.
Nach der Feststellung eines entsprechenden Antikörperstiters, wird positiven Tieren eine intravenöse Injektion von Antigen in Salzlösung gegeben. Drei bis vier Tage später werden die Tiere geopfert, Splenozyten geerntet und mit einer murinen Myelomzelllinie, z.B., NS1 oder, vorzugsweise, P3 × 63Ag8.653 (ATCC CRL 1580) fusioniert. Durch dieses Verfahren erzeugte Hybridomzelllinien werden in Mehrfach-Mikrotiterplatten in ein HAT-selektives Medium (Hypoxantin, Aminopterin und Thymidin) ausplattiert, um die Proliferation von nichtfusionierten Zellen, Myelomhybriden und Milzzellhybriden zu hemmen.
Auf diese Art erzeugte Hybridomklone können durch ELISA auf Reaktivität mit dem Rezeptorprotein untersucht werden, zum Beispiel durch Adaptationen der von Engvall et al., Inummochem 8,871 (1971) und im US-Patent 4,704,004 offenbarten Verfahren. Eine bevorzugte Untersuchungstechnik ist die bei Beckmann et al (J. Immunol, 144: 4212, 1990). beschriebene Antikörper-Fangmethode (Antibody-Capture-technique). Positive Klone werden dann in die Peritonealhöhlen von syngenen Balb/c Mäusen injiziert, um Asziten zu erzeugen, die hohe Konzentrationen (größer als 1 mg/ml) des Anti-OSM-Rβ monoklonalen Antikörpers enthalten. Der resultierende monoklonale Antikörper kann mittels Ammoniumsulfatfällung gefolgt von Gelausschlusschromatographie und/oder Affinitätschromatographie, welche auf der Bindung des Antikörpers an Protein A von Staphylococcus aureus basiert, gereinigt werden.
Beispiel 4
Rezeptoren, die gp130 Polypeptide, denen die FNIII-Domänen fehlen, aufweisen
DNA-Sequenzen, die lösliche gp130 Proteine mit fehlenden Fibronektin Typ III (FNIII)-Domänen kodieren, wurden isoliert und mit einer Fc-kodierenden Sequenz fusioniert. Deletion der FNIII-Domänen bietet den Vorteil, die Größe des gp130/Fc-Fusionsproteins zu reduzieren. Gp130 enthält drei FNIII-Domänen, einschließlich Aminosäuren 300 (Tyr) bis 399 (Phe), 400 (Gln) bis 496 (Pro) beziehungsweise 497 (Pro) bis 597 (Glu) der SEQ ID Nr: 2. Eine oder bis zu alle drei FNIII Domänen können aus gp130 entfernt werden, um die Größe des Proteins zu reduzieren.
Die FNIII-Domänen von gp130 wurden durch Verdauen eines rekombinanten gp130s/Fc-kodierenden Expressionsvektors mit BstX1, dann durch Abstumpfen des Überhangs mit Hilfe der T4 DNA-Polymerase nach konventionellen Verfahren entfernt. Die Erkennungsstelle für BstX1 erstreckt sich über die Nukleotide 1231–1242 der SEQ ID NR: 1 (gp130), die sich innerhalb des Codons für Aminosäuren 10–11 der ersten FNIII Domäne von gp130 spaltet. Der gespaltene Vektor wurde dann mit EcoR5 verdaut, welches innerhalb des Polylinkers des Vektors stromaufwärts der Fc-Sequenz spaltet und stumpfe Enden erzeugt. Das (BstX1)/EcoR5-Fragment, das eine das 5' Ende von gp130 kodierende Sequenz (dem die FNIII Domänen fehlen), die Vektorsequenzen, die Fc-Sequenz und ein Teil der Polylinker Sequenz aufweist, wurde ligiert, um den Vektor zu rezirkulieren.
E. coli-Zellen wurden mit der Ligationsmischung transformiert, Plasmide wurden davon isoliert, und das gewünschte rekombinante Plasmid wurde durch Restriktionsanalyse identifiziert. Das durch das Konstrukt kodierte Fusionsprotein weist (vom N- bis C-Terminus) die Aminosäuren –22 bis 308 der SEQ ID Nr: 2 (gp130), ein vier Aminosäure-Spacerpeptid-Asn Arg-Tyr-Val-, kodiert durch das Polylinkersegment und die Aminosäuren 1–232 der SEQ ID Nr: 3 (Fc) auf. Der gp130-Polypeptid-Rest enthält die ersten 9 Aminosäuren der ersten FNIII-Domäne, aber ihr fehlt der Rest der ersten FNIII-Domäne und alles von der zweiten und dritten FNIII Domäne.
Ein heterodimerer Rezeptor der vorliegenden Erfindung kann OSM-Rβ und das vorangehende verkürzte gp130-Polypeptid, dem die FNIII Domänen fehlen, aufweisen. COS-7-Zellen oder andere geeignete Wirtszellen, werden mit OSM-Rβ-kodierenden und verkürztes gp130-kodierende Expressionsvektoren cotransfiziert. Die cotransfizierten Zellen werden kultiviert, um den heterodimeren Rezeptor zu exprimieren.
Beispiel 5
Untersuchung der Bindung von Onkostatin M und LIF durch Rezeptoren
Eine Untersuchung der Bindung von Onkostatin M oder des Leukämie hemmenden Faktors (LIFs) durch verschiedene Rezeptorproteine wurde wie folgt durchgeführt. Die Rezeptorproteine schlossen lösliches OSM-Rβ/Fc, gp130/Fc, LIF-R/Fc und Kombinationen davon ein. Die Ergebnisse der Untersuchungen werden in 3 gezeigt.
Ein Expressionsvektor, der ein lösliches OSM-Rp/Fc-Fusionsprotein kodiert, welches eine verkürzte extrazelluläre Domäne von OSM-Rβ aufweist, die mit dem N-Terminus eines Fc-Region-Polypeptids, welches von einem Antikörper abgeleitet ist, fusioniert ist, wurde wie folgt konstruiert. Der in Beispiel 1 hergestellte rekombinante Expressionsvektor, der die OSM-Rβ-DNA in Vektor pDC409 aufweist, wurde mit dem Restriktionsenzym SphI verdaut, mit T4 DNA-Polymerase behandelt, um die 3'-Überhänge zu beseitigen (erzeugen stumpfer Enden) und dann mit SalI verdaut, das stromaufwärts der OSM-Rβ-Kodierungsregion spaltet. Das gewünschte Fragment, das das 5' Ende der OSM-Rβ-DNA einschließt und bei Nukleotid 1744 der SEQ ID Nr: 5 endet, wurde mittels konventioneller Verfahren isoliert.
Ein als hIgG1Fc bezeichneter rekombinanter Vektor weist die Fc-Polypeptid kodierende cDNA der SEQ ID Nr: 3, wie oben beschrieben ist, auf. Vektor hIgG1Fc wurde mittels der Restritionsenzyme SnaB1 und NotI verdaut, die in der Polylinkerregion des Vektors stromaufwärts beziehungsweise stromabwärts der Fc-Polypeptid kodierenden cDNA spalten.
Das auf diese Art isolierte Fc-Polypeptid kodierende DNA-Fragment und das oben isolierte OSM-Rβ-kodierende DNA-Fragment wurden in einen SalI/NotI-verdauten Expressionsvektor pDC304 legiert, sodass die Fc-Polypeptid-DNA mit dem 3'-Ende der OSM-Rβ-DNA fusioniert. Der Säugetier-Expressionsvektor pDC304 ist in Beispiel 2 beschrieben. Der resultierende Expressionsvektor kodiert ein Fusionsprotein, das die Aminosäuren –27 bis 432 der OSM-Rβ-Sequenz der SEQ ID Nr: 6, gefolgt von einem durch ein Vektorpolylinker-Segment kodierten Valinrest, gefolgt von den Aminosäuren 1 bis 232 der Fc-Polypeptidsequenz der SEQ ID Nr: 4 aufweist.
Ein Expressionsvektor, der ein lösliches menschliches gp130/Fc-Fusionsprotein kodiert, wurde wie folgt konstruiert. Der menschliche gp130-cDNA aufweisende rekombinante Vektor B10G/pDC303 (ATCC 68827) wurde mit EcoR1 verdaut, und der resultierende 5'-Überhang wurde unter Verwendung von T4 DNA-Polymerase stumpf gemacht. Die Erkennungsstelle für EcoR1 weist die Nukleotide 2056–2061 der SEQ ID Nr: 1 auf. Der durch EcoR1 verdaute Vektor wurde dann mittels XhoI gespalten, welches im Vektor stromaufwärts der gp130 cDNA-Einfügung spaltet.
Vektor hIgG1Fc, der Fc-Polypeptid kodierende cDNA aufweist, wie oben beschrieben ist, wurde mittels Stu1 (einem Stumpfschneider) und Not1 verdaut, die stromaufwärts beziehungsweise stromabwärts der eingefügten Fc cDNA spalten. Das oben isolierte XhoI/(EcoR1) gp130 Fragment wurde an das Fc enthaltende Fragment und an den durch XhoI/NotI verdauten Säugetier-Expressionsvektor pDC304 fusioniert.
E. coli Zellen wurden mit der Ligationsmischung transformiert, Plasmide wurden daraus durch konventionelle Verfahren isoliert, und der gewünschte rekombinante Vektor wurde durch Restriktionsanalyse identifiziert. Das vom rekombinanten Vektor kodierte gp130/Fc-Fusionsprotein weist (vom N- bis zum C-Terminus) die Aminosäuren –22 bis 582 der SEQ ID Nr: 2 (gp130), gefolgt von 7 Aminosäuren, die einen vom Polylinker-Segment des Plasmids hIgG1Fc kodierten Peptidlinker bilden, gefolgt von Aminosäuren 1–232 der SEQ ID Nr: 4 (Fc) auf.
Ein Expressionsvektor, der ein lösliches menschliches LIF-R/Fc-Fusionsprotein kodiert, wurde wie in Beispiel 5 des US-Patents 5,284,755 beschrieben ist, das hiermit als Referenz eingeschlossen ist, konstruiert. Kurz gesagt enthält ein pHLIF-R-65 genannter rekombinanter Vektor menschliche LIF-R-cDNA (ein Teilklon, der ein vollständiges Signalpeptid, extrazelluläre Domäne, transmembrane Region und eine partielle zytoplasmatische domäne kodiert) in Vektor pDC303.
Der Säugetier-Expressionsvektor pDC303 ist in der PCT-Anmeldung WO 93/19777 beschrieben. Mit pHLIF-R-65 transformierte E. coli-Zellen wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, am 11. Dezember 1990 deponiert und mit der Zugriffsnummer Nr. 68491 belegt. DNA, die das LIF-R Signalpeptid und die extrazelluläre Domäne (verkürzt am C-Terminus) kodiert, wurde isoliert und zu DNA fusioniert, die ein Antikörper-Fc-Region-Polypeptid in pBluescript^®SK kodiert. Die Genfusion wurde aus dem Klonierungsvektor herausgeschnitten und in den oben beschriebenen Säugetier Expressionsvektor pDC304 eingefügt. Der resultierende rekombinante Expressionsvektor kodiert ein LIF-R/Fc-Fusionsprotein, das die Aminosäuren –44 bis 702 der in US-Patent 5,284,755 dargestellten LIF-R-Sequenz aufweist, gefolgt von einem Linker, der sechs durch ein Vektor-Polylinkersegment kodierte Aminosäuren aufweist, gefolgt von den Aminosäuren 1 bis 232 der Fc-Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr: 4.
CV-1-EBNA-Zellen wurden mit einem der drei oben hergestellten rekombinanten Expressionsvektoren wie folgt transfiziert oder mit zwei der Vektoren cotransfiziert:
Experiment
Zellen, die mit einem Vektor/mit Vektoren transfiziert wurden, der Folgendes kodiert/die Folgendes kodieren:

A leerer Expressionsvektor (Kontrolle)

B gp130/Fc

C LIF-R/Fc

D OSM-Rβ/Fc

E OSM-Rβ/Fc und LIF-R/Fc

F OSM-Rβ/Fc und gp130/Fc

G gp130/Fc und LIF-R/Fc
Die transfizierten Zellen wurden kultiviert, um die Expression und Sekretion des Fusionsproteins zu ermöglichen. Vernetzte Agaroseperlen, die Protein A tragen (Protein A Sepharose CL-4B, Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ), wurden dem Kulturüberstand hinzugefügt, woraufhin das Fusionsprotein an die Perlen, über die Interaktion des Fc-Restes mit dem Protein A gebunden wurden. Radioiodiertes Onkostatin M oder radioiodiertes LIF wurden ebenfalls dem Kulturüberstand hinzugefügt. Die Herstellung von ¹²⁵I- Onkostatin M ist im Beispiel 2 oben beschrieben. Unter den bekannten Verfahren für die Reinigung und für die Radioiodierung von LIF sind jene, die im US-Patent 5.284.755 beschrieben sind. Das in dieser Untersuchung verwendete ¹²⁵I-LIF war rekombinantes menschliches LIF, welches mit ¹²⁵I unter Vewendung des Enzymobead Reagens (BioRad) markiert wurde.
Der Kulturüberstand wurde mit den Protein A-Perlen und ¹²⁵I-LIF oder ¹²⁵I-Onkostatin M für 18 Stunden bei 4°C inkubiert. Freies und zellgebundenes ¹²⁵I-LIF oder ¹²⁵I-Onkostatin M wurden durch Niedriggeschwindigkeitszentrifugation durch einen Einzelschritt-Dichtegradient von 3% Glukose in PBS getrennt. Die perlengebundene radioiodierten Proteine wurden mit einem Packard Autogamma Zähler quantifiziert.
Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Das Säulendiagramm der 3 stellt die Bindung von Onkostatin M oder LIF zu den Proteinen, die von den Zellen exprimiert werden, die wie oben für die Experimente A bis G beschrieben ist, transfiziert sind. Die exprimierten Proteine sind an die Protein A-Perlen gebunden.
Experiment A (Kontrolle) zeigt keine signifikante Bindung von LIF oder Onkostatin M zu den Proteinen, die von den Zellen exprimiert werden, die mit dem leeren Expressionsvektor pDC305 transfiziert sind. Das lösliche gp130/Fc Protein Band Onkostatin M, jedoch konnte keine signifikante Bindung von LIF festgestellt werden (Experiment B). Das lösliche LIF-R/Fc Protein Band LIF, jedoch kein Onkostatin M (Experiment C.) Es konnte keine detektierbare Bindung von LIF oder Onkostatin M durch das lösliches OSM-Rβ/Fc Protein nachgewiesen werden (Experiment D).
Proteine die durch Zellen exprimiert werden, die mit löslichen LIF-R/Fc und OSM-Rβ-kodierenden Vektoren cotransfiziert sind, konnten detektierbare Mengen an Onkostatin M binden, jedoch kein LIF (Experiment E). Proteine die durch Zellen exprimiert werden, die mit löslichem gp130/Fc-kodierenden Vektoren cotransfiziert sind, konnten detektierbare Mengen an Onkostatin M binden, jedoch keine detektierbaren Mengen an LIF (Experiment F).
Die Bindung von Onkostatin M in Experiment F könnte durch Einschließen von unmarkiertem (kaltem) Onkostatin M in die Untersuchung inhibiert werden. Proteine die durch Zellen exprimiert werden, die mit Expressionsvektoren cotransfiziert sind, die lösliches gp130/Fc, und LIF-R/FC kodieren (Experiment G) konnten sowohl Onkostatin M als auch LIF binden. Die LIF Bindung im Experiment G war durch die Zugabe von kaltem LIF zu der Untersuchung inhibiert.
Die Proteine die durch Zellen exprimiert werden, die mit Vektoren cotransfiziert sind, die lösliches OSM-Rβ/Fc und lösliches gp130/Fc kodieren, gemäß der vorliegenden Erfindung, binden auf diese Weise Onkostatin M aber nicht LIF. Dies ist vorteilhaft, wenn die Bindung von Onkostatin M (z.B. um eine biologische Aktivität zu inhibieren oder zu studieren) gewünscht ist, die Bindung von LIF jedoch unerwünscht ist. Die Proteine die durch Zellen exprimiert werden, die mit löslichem gp130/Fc und. löslichem LIF-R/Fc-kodierenden Vektoren cotransfiziert sind, binden sowohl Onkostatin M als auch LIF und bieten dadurch nicht diese vorteilhafte Eigenschaft. Zusätzlich, Zellen die sowohl lösliches OSM-Rβ/Fc als auch lösliches gp130/Fc Banden Onkostatin M mit einem höheren Grad als Zellen, die nur lösliches gp130/Fc exprimieren.
Kurzbeschreibung der Sequenzauflistungen
SEQ ID NR: 1 und SEQ ID NR: 2 zeigen die DNA-Sequenz und die kodierte Aminosäuresequenz für geklonte cDNA, die ein N-terminales Fragment von gp130 kodiert.
SEQ ID NR: 3 und SEQ ID NR: 4 zeigen die DNA-Sequenz und die kodierte Aminosäuresequenz für geklonte cDNA, die ein Polypeptide kodieren, das der Fc-Region eines IgG 1 Antikörpers entspricht.
SEQ ID NR: 5 und SEQ NR: 6 zeigen die DNA und die kodierte Aminosäuresequenz für geklonte cDNA, die die Onkostatin-M-Rezeptor-β-Untereinheit der vorliegenden Erfindung kodiert.
SEQ ID NR: 7 zeigt die Aminosäuresequenz eines Peptids, das zur Erleichterung der Reinigung von daran fusionierten Polypeptiden eingesetzt werden kann.
SEQ ID NR: 8 zeigt ein Spacer-Peptid, das durch einen Polylinker in einem Expressionsvektor kodiert ist, wie in Beispiel 4 beschrieben ist.
SEQ ID NR: 9, 10 und 11 sind Peptide, die den konservierten Sequenzen entsprechen, wie in Beispiel 1 beschrieben ist.
Auflistung der Sequenzen

Claims

Gereinigter Rezeptor mit der Fähigkeit zur Bindung von Onkostatin M, welcher ein gp130-Polypeptid und ein Onkostatin-M-Rezeptor-β-Ketten-(OSM-Rβ-)Polypeptid aufweist, wobei: a) das gp130-Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) dem gp130-Polypeptid der SEQ. ID. NR.: 2; und ii) einem biologisch aktiven gp130-Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, welche zumindest zu 80% mit der Sequenz, die als Aminosäuren 1 bis 686 der SEQ. ID. NR.: 2 wiedergegeben ist, identisch ist; b) das OSM-Rβ-Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: iv) dem OSM-Rβ-Polypeptid der SEQ. ID. NR.: 6; und v) einem biologisch aktiven OSM-Rβ-Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, welche zumindest zu 80% mit der Sequenz, die als Aminosäuren 1 bis 952 der SEQ. ID. NR.: 6 wiedergegeben ist, identisch ist.
Rezeptor nach Anspruch 1, wobei der Rezeptor ein lösliches gp130-Polypeptid aufweist, welches kovalent an ein lösliches OSM-Rβ-Polypeptid gebunden ist.
Rezeptor nach Anspruch 1, wobei der Rezeptor gp130 über einen Peptidlinker kovalent an OSM-Rβ gebunden aufweist.
Rezeptor nach Anspruch 3, wobei der Rezeptor ein rekombinantes Fusionsprotein mit folgender Formel ist: R₁-L-R₂ oder R₂-L-R₁ wobei R₁ ein lösliches gp130 darstellt; R₂ stellt ein lösliches OSM-Rβ dar, und L stellet einen Peptidlinker dar.
Rezeptor nach Anspruch 4, wobei das lösliche gp130 die Aminosäuren 1 bis y der SEQ. ID. NR.: 2 aufweist, wobei y eine ganze Zahl zwischen 308 und 597, jeweils einschließlich, darstellt; und das lösliche OSM-Rβ die Aminosäuren 1 bis x der SEQ. ID. NR.: 6 aufweist, wobei x eine ganze Zahl zwischen 432 und 714, jeweils einschließlich, ist.
Isolierte DNA-Sequenz, welche das Fusionsprotein nach Anspruch 4 oder 5 codiert.
Rekombinanter Expressionsvektor, welcher die DNA-Sequenz nach Anspruch 6 enthält.
Verfahren zur Herstellung eines Rezeptors nach Anspruch 4 oder 5, welches das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor, welcher eine DNA-Sequenz aufweist, transformiert ist, welche das Fusionsprotein unter Bedingungen codiert, welche die Expression des Fusionsproteins unterstützen, sowie das Gewinnen des Fusionsproteins umfasst.
Rezeptor nach Anspruch 2, welcher ein erstes Fusionsprotein aufweist, welches ein Polypeptid der Antikörper-Fc-Region gebunden an den C-Terminus eines löslichen gp130 aufweist, sowie ein zweites Fusionsprotein, welches ein Polypeptid der Antikörper-Fc-Region gebunden an den C-Terminus eines löslichen OSM-Rβ aufweist, wobei das erste Fusionsprotein über Disulfidbindungen zwischen den Polypeptiden der Fc-Region an das zweite Fusionsprotein gebunden ist.
Verfahren zur Herstellung eines Rezeptors nach Anspruch 9, welches das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem ersten Expressionsvektor, welcher das erste Fusionsprotein codiert, sowie mit einem zweiten Expressionsvektor, welcher das zweite Fusionsprotein codiert, co-transfiziert ist, und zwar unter Bedingungen, welche die Expression des ersten und zweiten Fusionsproteins unterstützen, sowie das Gewinnen des Rezeptors umfasst.
Rezeptor nach Anspruch 9, wobei das lösliche gp130 die Aminosäuren 1 bis y der SEQ. ID. NR.: 2 aufweist, wobei y eine ganze Zahl zwischen 308 und 597, jeweils einschließlich, darstellt; und das lösliche OSM-Rβ die Aminosäuren 1 bis x der SEQ. ID. NR.: 6 aufweist, wobei x eine ganze Zahl zwischen 432 und 714, jeweils einschließlich, ist
Rezeptor nach Anspruch 1, wobei: das gp130-Polypeptid ein biologisch aktives gp130-Polypeptid ist, das durch eine DNA codiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) DNA, welche die Codierregion der Nukleotidsequenz dargestellt in SEQ. ID. NR.: 1 aufweist; b) DNA, welche die Fähigkeit besitzt, mit der DNA aus (a) zu hybridisieren, und zwar unter hochstringenten Bedingungen, welche die Hybridisierung bei 68°C gefolgt von Waschung in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 63–68°C einschließen; und c) DNA, welche die Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ. ID. NR.: 2 codiert; wobei das OSM-Rβ-Polypeptid ein biologisch aktives Polypeptid ist, das durch eine DNA codiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a') DNA, welche die Codierregion der Nukleotidsequenz dargestellt in SEQ. ID. NR.: 5 aufweist; b') DNA, welche die Fähigkeit besitzt, mit der DNA aus (a') zu hybridisieren, und zwar unter hochstringenten Bedingungen, welche die Hybridisierung bei 68°C gefolgt von Waschung in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 63–68°C einschließen; und c') DNA, welche die Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ. ID. NR.: 6 codiert;
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche einen Rezeptor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, 9, 11 oder 12, sowie einen physiologisch akzeptables/n Verdünnungsmittel oder Träger aufweist.
Isolierte DNA, welche ein OSM-Rβ-Polypeptid codiert, wobei die DNA ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) DNA, welche ein OSM-Rβ-Polypeptid codiert, welches die Aminosäuren –27 bis 952 der SEQ. ID. NR.: 6 aufweist; b) DNA, welche ein OSM-Rβ-Polypeptid codiert, welches die Aminosäuren 1 bis 952 der SEQ. ID. NR.: 6 aufweist; und c) ein biologisch aktives OSM-Rβ-Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, welche zumindest zu 80% mit der Sequenz dargestellt als die Aminosäuren 1 bis 952 der SEQ. II). NR.: 6 identisch ist.
Isolierte DNA nach Anspruch 14, wobei das OSM-Rβ eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren –27 bis 952 und den Aminosäuren 1 bis 925 der SEQ. ID. NR.: 6 aufweist.
Isolierte DNA nach Anspruch 14, wobei die DNA ein lösliches OSM-Rβ-Polypeptid codiert.
Isolierte DNA nach Anspruch 16, wo das lösliche OSM-Rβ-Polypeptid die Aminosäuren –27 bis x oder 1 bis x der SEQ. ID. NR.: 6 aufweist, wobei x eine ganze Zahl zwischen 432 und 714, jeweils einschließlich, ist.
Expressionsvektor, welcher eine DNA nach einem der Ansprüche 14 bis 17 aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines OSM-Rβ-Polypeptids, welches das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 18 transformiert ist unter Bedingungen, welche die Expression von OSM-Rβ unterstützen, sowie das Gewinnen des OSM-Rβ-Polypeptids aufweist.
OSM-Rβ-Polypeptid, das durch eine DNA nach einem der Ansprüche 14 bis 17 codiert ist.
OSM-Rβ-Polypeptid nach Anspruch 20, wobei das OSM-Rβ ein lösliches OSM-Rβ-Polypeptid ist.
Lösliches OSM-Rβ nach Anspruch 21, welches die Aminosäuren –27 bis x oder 1 bis x der SEQ. ID. NR.: 6 aufweist, wobei x eine ganze Zahl zwischen 432 und 714, jeweils einschließlich, ist.
Gereinigtes OSM-Rβ-Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) dem OSM-Rβ-Polypeptid der SEQ. ID. NR.: 6; und b) einem biologisch aktiven OSM-Rβ-Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, welche zumindest zu 80% mit der Sequenz dargestellt als die Aminosäuren 1 bis 952 der SEQ. ID. NR.: 6 identisch ist.
OSM-Rβ-Polypeptid nach Anspruch 23, wobei das OSM-Rβ durch die OSM-Rβ-c-DNA in dem rekombinanten Vektor codiert ist, der in Stamm ATCC 69675 hinterlegt ist.
OSM-Rβ-Polypeptid nach Anspruch 23, welches die Aminosäuren 1 bis 952 der SEQ. ID. NR.: 6 aufweist.
Fusionsprotein, welches ein lösliches OSM-Rβ-Polypeptid nach Anspruch 21, sowie ein Antikörper-Fc-Polypeptid aufweist.
Antikörper, welcher mit einem OSM-Rβ-Polypeptid nach Anspruch 23 spezifisch immunreaktiv ist.
Antikörper nach Anspruch 27, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist, welcher mit dem OSM-Rβ-Polypeptid der SEQ. ID. NR.: 6 immunreaktiv ist.
Rezeptor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, 9, 11 oder 12 zur Verwendung in der Medizin.
Verwendung eines Rezeptors nach einem der Ansprüche 1 bis 5, 9, 11 oder 12 bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung des Karposi-Sarkoms.