-
GEBIET DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Identifikation
und Isolation von DNA, den therapeutischen Einsatz und die rekombinante
Produktion von neuen Polypeptiden, die eine Sequenzidentität mit dem
Cytokin IL-17 und dem zytotoxischen T-Lymphozyten-assoziierten Antigen
8 (CTLA-8) aufweisen, die hierin als PRO1122-Polypeptid bezeichnet werden.
-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
Es
wurde berichtet, dass das Cytokin Interleukin 17 (IL-17) Epithel-,
Endothel- und Fibroblastenzellen stimuliert, Cytokine, wie z.B.
IL-6, IL-8, und Granulozytenkoloniestimulierenden Faktor sowie Prostaglandin
E2 zu sekretieren. Während
die Expression von IL-17 auf aktivierte T-Zellen beschränkt ist,
wird der IL-17-Rezeptor in großem
Maß exprimiert – eine Eigenschaft,
die mit den pleiotropen Aktivitäten
von IL-17 übereinstimmt. Weiters
wurde gezeigt, dass Fibroblasten, wenn sie in Gegenwart von IL-17
kultiviert wurden, die Proliferation der bevorzugten Reifung von
CD34+ zu Neutrophilen unterstützen
konnte. In der Folge könnte
IL-17 ein früher Verstärker oder
sogar ein Erhalter der T-Zellen-abhängigen Entzündungsreaktion und/oder ein
Element des Cytokin-Netzwerks sein, das das Immunsystem mit der
Blutbildung verbindet. Siehe Yao et al., J. Immunol. 155 (12), 5483-5486
(1995); Fossiez et al., J. Exp. Med. 183 (6), 2593-2603 (1996);
Kennedy et al., J. Interferon Cytokine Res. 16 (8), 611-617 (1996).
-
Im
Allgemeinen sind neue Proteine von Interesse. Extrazelluläre Proteine
spielen eine wichtige Rolle in der Bildung, Differenzierung und
Erhaltung von multizellulären
Organismen. Die Bestimmung vieler individueller Zellen, z.B. Proliferation,
Migration, Differenzierung oder die Wechselwirkung mit anderen Zellen,
wird typischerweise durch die von anderen Zellen und/oder der unmittelbaren
Umgebung erhaltene Information bestimmt. Diese Information wird
oft durch sekretierte Polypeptide (z.B. mitogene Faktoren, Überlebensfaktoren, zytotoxische
Faktoren, Differenzierungsfaktoren, Neuropeptide und Hormone) übertragen,
die wiederum von verschiedenen Zell rezeptoren oder membrangebundenen
Proteinen aufgenommen und interpretiert werden. Diese sekretierten
Polypeptide oder Signalmoleküle
passieren gewöhnlicherweise
den zellulären
Sekretionsweg, um ihre Wirkstelle im extrazellulären Umfeld zu erreichen.
-
Sekretierte
Proteine haben verschiedene gewerbliche Anwendungen, wie z.B. in
pharmazeutischen Produkten, Diagnosemitteln, Biosensoren und Bioreaktoren.
Die meisten derzeit verfügbaren
Proteinarzneimittel, wie z.B. thrombolytische Mittel, Interferone,
Interleukine, Erythropoietine, Kolonie-stimulierende Faktoren und
verschiedene weitere Cytokine, sind sekretorische Proteine. Deren
Rezeptoren, die Membranproteine sind, weisen ebenfalls ein Potential
als therapeutische oder diagnostische Wirkstoffe auf.
-
Es
werden seitens der Industrie sowie im akademischen Bereich Bemühungen unternommen,
neue native sekretierte Proteine zu identifizieren. Viele Bemühungen konzentrieren
sich auf das Screenen von rekombinanten Säugetier-DNA-Bibliotheken zur Identifizierung der
Sequenzen, die für
neue sekretierte Proteine kodieren. Beispiele für Screening-Verfahren und -Techniken
sind in der Literatur beschrieben [siehe beispielsweise Klein et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7108-7113 (1996);
US-Patent Nr. 5.536.637 ]. Die Ergebnisse
dieser Bemühungen
werden hierin vorgestellt.
-
Interleukin-17
ist ein kürzlich
beschriebenes Cytokin, das von T-Zellen abstammt, wobei man erst
beginnt, dessen biologische Funktionen zu verstehen. Spriggs et
al., J. Clin. Immunol. 17, 366 (1997); H.E. Broxmeyer, J. Exp. Med.
183, 2411 (1996). Als IL-17 anfangs als c-DNA-Klon eines Nagetier-T-Zellen-Lymphoms identifiziert
wurde, wurde erkannt, dass es eine ähnliche Sequenz wie ein offener
Leseraster eines Primaten-Herpesvirus, Herpesvirus saimiri, aufwies – Rouvier
et al., J. Immunol. 150, 5445 (1993); Yao et al., Immunity 3, 811
(1995) [Yao-1], Fossiez et al., J. Exp. Med. 183, 2593 (1996). In
der Folge wurde bestätigt,
dass dieses virale Protein zahlreiche, wenn nicht alle, immunstimulierenden
Aktivitäten
für den
Wirt IL-17 aufweist. Fleckenstein und Desrosiers, "Herpesvirus saimiri
and herpesvirus ateles",
in: The Her pesviruses, 82, I.B. Roizman (Hrsg.), Plenum Publishing
Press, New York (1982); B.I. Biesinger et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89, 3116 (1992).
-
Menschliches
IL-17 ist ein 20-30 kDa großes,
homodimeres Protein mit Disulfid-Bindungen
und variabler Glykosylierung. Yao-1, s.o. Fossier et al., s.o. Ein
offener Leserater mit 155 Aminosäuren,
der eine N-terminale Sekretionssignalsequenz mit 19-23 Aminosäuren umfasst,
kodiert dafür.
Die Aminosäuresequenz
von IL-17 ist nur dem oben beschriebenen Herpesvirus-Protein ähnlich und
weist keine signifikante Identität
mit den Sequenzen anderer Cytokine oder anderer bekannter Proteine
auf. Zusätzlich
dazu wurde die für
IL-17 kodierende mRNA nur in aktivierten CD4+-Gedächtnis-T-Zellen
und PMA/Ionomycin-stimulierten PBMC-Zellen nachgewiesen.
-
Trotz
der eingeschränkten
Gewebeverteilung weist IL-17 pleiotropische biologische Aktivitäten in Bezug
auf verschiedene Zelltypen, wie z.B. Fibroblasten, Endothelzellen
und Epithelzellen, auf. M.K. Spriggs, s.o.; H.E. Broxmeyer, s.o.
Es wurde festgestellt, dass IL-17 die Produktion vieler Cytokine
stimuliert: TNF-α und
IL-1β bei
Makrophagen [Jovanovic et al., J. Immunol. 160, 3513 (1998)]; IL-6,
IL-8 und das intrazelluläre Adhäsionsmolekül (ICAM-1)
bei menschlichen Fibroblasten. Fossiez et al., s.o., Yao et al.,
J. Immunol. 155, 5483 (1995) [Yao-2]; Granulozytenkoloniestimulierenden
Faktor (G-CSM) und Prostaglandin (PGE-2) bei Synoviozyten, Fossiez
et al., s.o. Durch das Einführen
einiger Cytokine kann IL-17 eine große Bandbreite an, hauptsächlich proinflammatorischen
und hämatopoetischen,
Reaktionen vermitteln. Dies führte
zu der Vermutung, dass IL-17 eine wesentliche Rolle bei der Initiierung
oder dem Aufrechterhalten einer Entzündungsantwort spielen kann.
Jovanovic et al., s.o.
-
In Übereinstimmung
mit der großen
Bandbreite der Wirkung von IL-17 wurde festgestellt, dass der Zelloberflächenrezeptor
für IL-17
in zahlreichen Geweben und Zelltypen verbreitet exprimiert wird – Yao et
al., Cytokine 9, 794 (1997) [Yao-3]. Während die Aminosäuresequenz
des hIL-17-Rezeptors (866 Aminosäuren)
ein Protein mit einer einzigen Transmembrandomäne und einer langen intrazellulären Domäne mit 525
Aminosäuren
vorhersagt, ist die Rezeptorsequenz einzigartig und keinem ande ren
Rezeptor aus der Cytokin/Wachstumsfaktor-Rezeptor-Familie ähnlich.
In Verbindung mit der mangelnden Ähnlichkeit von IL-17 selbst
mit anderen bekannten Proteinen deutet das darauf hin, dass IL-17
und sein Rezeptor Teil einer neuen Familie von Signalproteinen und
Rezeptoren sein könnte.
-
Es
wurde durch intrazelluläre
Signalübertragung
weiters gezeigt, dass IL-17 ein vorübergehendes Ca2 +-Einströmen
und eine Reduktion von [cAMP]i bei menschlichen
Makrophagen stimuliert. Jovanovic et al., s.o. Mit IL-17 behandelte
Fibroblasten und Makrophagen induzieren die Aktivierung von NF-κB – Yao-1,
s.o.; Jovanovic et al., s.o. – während damit
behandelte Makrophagen NF-κB
und Mitogen-aktivierte Proteinkinasen aktivieren. Shalom-Barek et
al., J. Biol. Chem. 273, 27467 (1998).
-
Die
vorliegende Offenbarung beschreibt das Klonieren und die Charakterisierung
von zwei neuen Proteinen, die als PRO1031 (IL-17B) und PRO1122 (IL-17C)
bezeichnet werden, sowie aktive Varianten davon, die IL-17 in Bezug
auf ihre Aminosäuresequenz ähnlich sind.
Die Erfindung betrifft Letzteres, PRO1122 (IL-17C).
-
WO99/61617 , die ausschließlich für die Bewertung
der Neuheit relevant ist, betrifft ebenfalls dasselbe Protein, wobei
es darin als IL-21 bezeichnet wird.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Die
Anmelder haben einen cDNA-Klon identifiziert, der für ein neues
Polypeptid kodiert, das eine Sequenzidentität mit IL-17 aufweist, wobei
das Polypeptid in der vorliegenden Anmeldung als "PRO1122" bezeichnet wird.
-
Ein
Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft, wie in den Ansprüchen definiert,
die Verwendung eines isolierten PRO1122-Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz
umfasst, die zumindest etwa 80 % Sequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa
81 % Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest 82 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest
83 % Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest 84 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest
85 % Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest 86 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest
87 % Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest 88 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest
89 % Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest 90 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest
91 % Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest 92 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest
93 % Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest 94 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest
95 % Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest 96 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest
97 % Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest 98 % Sequenzidentität und noch bevorzugter zumindest
99 % Sequenzidentität
mit der Sequenz der Aminosäurereste
etwa 1 oder etwa 19 bis etwa 197 inklusive aus 3 (Seq.-ID
Nr. 3) aufweist. In einem bevorzugten Aspekt umfasst das Polypeptid
die Aminosäurereste
etwa 1 oder etwa 19 bis etwa 197 inklusive aus 3 (Seq.-ID
Nr. 3).
-
In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert,
die Verwendung eines isolierten PRO1122-Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz
umfasst, die zumindest etwa 80 % Sequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa
81 % Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest 82 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest
83 % Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest 84 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest
85 % Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest 86 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest
87 % Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest 88 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest
89 % Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest 90 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest
91 % Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest 92 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest
93 % Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest 94 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest
95 % Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest 96 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest
97 % Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest 98 % Sequenzidentität und noch bevorzugter zumindest
99 % Sequenzidentität
mit der Aminosäure
aufweist, für
die menschliche Protein-cDNA kodiert, die am 22. Dezember 1998 unter
der Zugriffsnummer 203552 bei der ATCC hinterlegt wurde.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird das PRO1122-Polypeptid durch Expression des Polypeptids, für das das
cDNA-Insert des Vektors kodiert, der am 22. Dezember 1998 unter
der Zugriffsnummer 203552 bei der ATCC hinterlegt wurde, erhalten
oder kann dadurch erhalten werden.
-
In
einem spezifischen Aspekt verwendet die Erfindung ein isoliertes
PRO1122-Polypeptid
ohne die N-terminale Signalsequenz und/oder das initiierende Methionin.
Verfahren zur Herstellung derselben werden auch hierin beschrieben,
wobei diese Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle, die einen
Vektor umfasst, der das geeignete kodierende Nucleinsäuremolekül umfasst,
unter für
die Expression von PRO1122-Polypeptid geeigneten Bedingungen und
die Gewinnung des PRO1122-Polypeptids
aus der Zellkultur umfassen.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, Antagonisten eines
nativen PRO1122-Polypeptids. In einem bestimmten Aspekt handelt
es sich bei dem Antagonisten um einen Anti-PRO1122-Antikörper.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, eine Zusammensetzung,
die einen wie obenstehend definierten PRO1122-Polypeptid-Antagonisten in Kombination
mit einem Träger
umfasst. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Träger um einen pharmazeutisch
annehmbaren Träger.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, die Verwendung
eines PRO1122-Polypeptids oder eines wie obenstehend beschriebenen
Antagonisten davon (bei dem es sich um einen Anti-PRO1122-Antikörper handeln
kann) zur Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung einer
Erkrankung eingesetzt werden kann, die auf das PRO1122-Polypeptid
oder einen Agonisten oder Antagonisten davon (z.B. Anti-PRO1122)
reagiert. In einem speziellen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung
eines PRO1122-Polypeptids oder eines Antagonisten davon in einem
Behandlungsverfahren zur Behandlung einer degenerativen Knorpelerkrankung.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, PRO1122-Antagonisten-Moleküle.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, eine therapeutische
Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge an PRO1122-Antagonist
in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
-
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
-
1 zeigt
die von den Nucleotiden 42-581 aus Seq.-ID Nr. 2 abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID
Nr. 1). In 1 wird auch das Signalpeptid,
eine N-Glykosylierungsstelle,
eine Region, die mit IL-17 Sequenzidentität aufweist, Molekulargewicht
und der ungefähre
pl angeführt.
-
2 zeigt
eine Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 2), die die Nucleotidsequenz
einer Nativsequenz-PRO1031-cDNA umfasst (Nucleotide 42-581 von Seq.-ID
Nr. 2), wobei die Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 2) ein Klon ist,
der hierin als "UNQ516" und/oder "DNA59294-1381" bezeichnet wird.
-
3 zeigt
die von den Nucleotiden 50-640 aus Seq.-ID Nr. 4 abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID
Nr. 3). Es werden auch die ungefähren
Stellen des Signalpeptids, eine Leucin-Zipper-Struktur in einer Region,
die Sequenzidentität
mit IL-17 aufweist, angeführt.
Das ungefähre
Gewicht in Dalton und der ungefähre
pl werden auch angeführt.
-
4 zeigt
eine Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 4), die eine Nucleotidsequenz
einer Nativsequenz-PRO1122-cDNA (Nucleotide 50-640 von Seq.-ID Nr.
1) enthält,
wobei die Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 4) ein Klon ist, der hierin
als "UNQ561" und/oder "DNA62377-1381-1" bezeichnet wird.
Die Komplementärsequenz
und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen
werden auch angeführt.
-
5 zeigt
DNA47332 (Seq.-ID Nr. 5), ein virtuelles DNA-Fragment, das zur Isolierung
von DNA59294 (Seq.-ID Nr. 2) verwendet wird.
-
6 zeigt
DNA49665 (Incyte EST 1347523) (Seq.-ID Nr. 7), ein virtuelles Fragment,
das zur Isolierung von DNA62377 (Seq.-ID Nr. 4) verwendet wird.
-
7 zeigt den Abgleich der durch DNA59624
(IL17-B) (Seq.-ID Nr. 6), DNA62377 (IL17-C) (Seq.-ID Nr. 3) und
IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) kodierten Proteinsequenzen. Die vermutlichen
Signalsequenzen sind unterstrichen, potentielle N-verbundene Glykosylierungsstellen
sind doppelt unterstrichen, und die konservierten Tryptophan- und
Cystein-Reste sind mit Sternen gekennzeichnet. IL-17, IL-17B und
IL-17C weisen eine Aminosäureidentität von 26-28
% miteinander auf. 7B zeigt nur den Abgleich der
durch DNA59624 (Seq.-ID Nr. 1) und DNA62377 (Seq.-ID Nr. 3) kodierten
Proteine.
-
8 ist
eine RNA-Blot-Analyse von IL-17B (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1). Der Northern-Blot zeigt mRNA von
menschlichen Geweben (Clontech), die an eine menschliche IL-17B-spezifische,
radioaktiv markierte Sonde wie in Beispiel 8 beschrieben hybridisiert
ist. RNA-Größenmarker
sind links angeführt.
Eine Rehybridisierung desselben Blots mit einer menschlichen β-Actin-cDNA-Sonde
ist unten angeführt.
-
9A-9B zeigen Balkendiagramme,
die die biologische Aktivität
von IL-17 (Seq.-ID Nr. 11), IL-17B (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) und
IL-17C (UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3) veranschaulichen. 9A zeigt menschliche Vorhaut-Fibroblasten- (HFF-)
Zellen, die mit Kontroll-Fc-Fusionsprotein, IL-17, IL17-B.Fc (Seq.-ID
Nr. 12) oder IL-17C.Fc (Seq.-ID Nr. 13) in einer Menge von 100 ng/ml
18 h lang kultiviert werden, wobei die konditionierten Medien in
Bezug auf IL-6 (Seq.-ID Nr. 14) wie in Beispiel 10 beschrieben getestet
wurden. 9B zeigt die menschliche leukämische Zelllinie
THP1, die mit denselben Cytokinen (100 ng/ml) wie oben unter denselben
Bedingungen behandelt wurde, wobei die Überstände in Bezug auf das Mail der TNF-α- Freisetzung getestet
wurden. Die Ergebnisse werden als Mittelwert +/- SF von dreifachen
Bestimmungen eines repräsentativen
Experiments ausgedrückt.
-
10 ist eine Zeitkurve, die die Abhängigkeit
von durch IL-17B und IL-17C aktivierter TNF-α-Freisetzung von THP1-Zellen
zeigt. In 10A wurden THP1-Zellen mit
100 ng/ml (2,2 nM) IL-17B.Fc (Seq.-ID Nr. 12) oder IL-17C.Fc 8 (Seq.-ID
Nr. 13) 0,5 bis 32 h lang inkubiert, die konditionierten Medien
wurden geerntet, und die TNF-α-Konzentration wurde
wie in Beispiel 10 beschrieben mengenmäßig bestimmt. In 10B wurden THP1-Zellen mit IL-17B.Fc und IL-17C.Fc
in einem Konzentrationsbereich von 0 bis 120 nM 18 h lang behandelt,
und die TNF-α-Freisetzung
wurde bestimmt.
-
11 ist eine Immunfällung von IL-17R-ECD (Seq.-ID
Nr. 15) mit IL-17 (Seq.-ID Nr. 11), IL-17B (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C
(Seq.-ID Nr. 3). His-markierte IL-17-Rezeptor-ECD wurde in 293-Zellen exprimiert und
metabolisch mit 35S markiert, wie in Beispiel
11 beschrieben. Der Überstand
wurde gesammelt, und Ni-NTA-Perlen wurden zur Affinitätsfällung der
His-markierten IL-17R-ECD (Seq.-ID Nr. 15) in dem Überstand eingesetzt
(Spur 1). In 11A wurden IL-17 (Seq.-ID Nr.
11), IL-17B.Fc (Seq.-ID Nr. 12) und IL-17C.Fc (Seq.-ID Nr. 13) oder
Kontroll-Fc-Fusionsproteine mit dem Überstand inkubiert, und Protein-A-Agarose-Perlen wurden
zur Ausfällung
der Fc-Fusionsproteine
zugesetzt. Zur IL-17-Immunfällungsreaktion
wurden Anti-IL-17-Antikörper zugeführt. 11B zeigt die Ergebnisse eines kompetitiven Bindungsexperiments,
wobei die Immunfällung
von IL-17R-ECD (Seq.-ID Nr. 22) durch IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) in
Gegenwart eines fünffachen Überschusses
an IL-17B.his (Seq.-ID Nr. 23) und His-markierter Kontrollproteine
erfolgte. Die Fällungsprodukte
in 11A und 11B wurden
mittels Elektrophorese auf NuPAGE-(4-12 % Bis-Tris) Gelen analysiert. Molekulargewichtmarker
werden bei jeder Tafel links angezeigt.
-
12 zeigt die FACS-Analyse der Bindung
von IL-17B.Fc (Seq.-ID Nr. 12) und IL-17C.Fc (Seq.-ID Nr. 13) an THP1-Zellen.
THP1-Zellen wurden mit IL-17B.Fc (A) oder IL-17C.Fc (B) oder Kontroll-Fc-Fusionsproteinen
in PBS (5 % Pferdeserum) inkubiert, wonach FITC-konjugierte sekundäre Anti-Fc-Antikörper zugesetzt
wurden.
-
13 zeigt die Wirkung von IL-17 (Seq.-ID Nr. 11)
auf artikuläre
Knorpel. Knorpelexplantate wurden in der angegebenen Konzentration
von IL-17 allein (durchgehende Linie) oder in Gegenwart von IL-1α in der angegebenen
Konzentration (schraffiert) (Seq.-ID Nr. 25) oder IL1ra (IL-1-Rezeptorantagonist,
R&D Systems, 1 μg/ml) (Seq.-ID
Nr. 26) 72 h lang kultiviert. Die Freisetzung von Proteoglykan (PG)
in die Medien (obere Tafel) deutet auf einen Abbau der Matrix hin.
Die Matrixsynthese wurde durch die Inkorporation von 35S-Sulfat
in das Gewebe bestimmt (untere Tafel).
-
14 zeigt die Wirkung von IL-17 (Seq.-ID Nr. 11)
auf die Freisetzung von Stickoxid. Explantate wurden mit IL-17 (10
ng/ml) allein (linke Balken) oder in Gegenwart von IL-1α (10 ng/ml)
(Seq.-ID Nr. 25) (rechte Balken) behandelt. Nach 48 h wurden die
Medien in Bezug auf Nitritkonzentration getestet.
-
15 zeigt die Wirkung von NO auf durch
IL-17 induzierte Veränderungen
im Matrixstoffwechsel. Explantate wurden mit IL-17 (5 ng/ml) (Seq.-ID
Nr. 11) allein (+) oder mit einem irreversiblen Hemmer von Stickoxidsynthase,
NOS (L-NIO, Caymen Chemical, 0,5 mM), behandelt. Nach 72-ständiger Behandlung
wurden die Medien in Bezug auf (A) Nitrit und (B) Proteoglykane
(PG) getestet. (C) Die Proteoglykan-Synthese wurde durch das Inkorporieren
von 35S-Sulfat in das Gewebe bestimmt.
-
16 zeigt die Wirkung der NO-Hemmung auf durch
IL-1a induzierte Veränderungen
im Proteoglykan-(PG-) Stoffwechsel. Artikuläre Knorpelexplantate wurden
mit IL-1α (5
ng/ml) (Seq.-ID Nr. 25) allein (+) oder mit NOS-Hemmern (L-NIO oder
L-NIL) (L-NIL: reversibler NOS-Hemmer, Caymen Chemical) oder IL-1ra
(IL-1 Rezeptoranatagonist, R&D
Systems, 1 μg/ml)
(Seq.-ID Nr. 26) behandelt. Nach 72-ständiger Behandlung wurden die
Medien in Bezug auf (A) Nitritkonzentration und (B) Proteoglykan-Menge
getestet. (C) Die Matrixsynthese wurde durch das Inkorporieren von 35S-Sulfat
in das Gewebe bestimmt.
-
17 zeigt die Wirkung von UNQ516 (Seq.-ID Nr. 1)
auf artikuläre
Knorpel. Explantate wurden mit UNQ561 in einer Konzentration von
1 % oder 0,1 % ohne (erste 3 Balken von links) oder in Gegenwart
(erste 3 Balken von rechts) von IL-1α (Seq.-ID Nr. 25) in einer Menge
von 10 ng/ml behandelt, und die Proteoglykan- (PG-) Synthese und
die Nitritproduktion wurden wie in Beispiel 16 beschrieben bestimmt.
-
18 zeigt die Wirkung von UNQ561 (Seq.-ID Nr. 3)
auf artikuläre
Knorpel. Explantate wurden mit UNQ561 in einer Konzentration von
1 % oder 0,1 % ohne (erste 3 Balken von links) oder in Gegenwart
(erste 3 Balken von rechts) von IL-1α(+) (10 ng/ml) (Seq.-ID Nr.
25) behandelt, und die Proteoglykan- (PG-) Freisetzung und -Synthese
werden als Menge über
der Kontrollmenge angegeben.
-
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
-
AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
I. Definitionen
-
Die
Bezeichnungen "PRO1122-Polypeptid" und "PRO1122" umfassen, wie hierin
verwendet, Nativsequenz-PRO1122 und Polypeptidvarianten davon (die
hierin genauer definiert sind). Das PRO1122-Polypeptid kann aus
einer Reihe von Quellen isoliert werden, wie z.B. aus menschlichen
Gewebearten oder aus einer anderen Quelle, oder durch Rekombinations-
oder synthetische Verfahren hergestellt werden.
-
Ein "Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid" umfasst ein Polypeptid,
das dieselbe Aminosäuresequenz wie
ein natürliches
PRO1122-Polypeptid aufweist. Ein solches Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid
kann aus der Natur isoliert werden oder durch Rekombinations- oder
synthetische Verfahren hergestellt werden. Die Bezeichnung "Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid" umfasst spezifisch
natürlich
vorkommende trunkierte oder sekretierte Formen eines PRO1122-Polypeptids
(z.B. lösliche
Formen, die beispielsweise eine extrazelluläre Domänensequenz enthalten), natürlich vorkommende
Varianten (z.B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich vorkommende
Allele von PRO1122-Polypeptid.
-
In
einer Ausführungsform
der Erfindung handelt es sich bei dem verwendeten Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid
um ein Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid voller Länge oder ein reifes Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid,
das die Aminosäuren
1 oder 19 bis 197 aus 3 (Seq.-ID Nr. 3) umfasst.
Obgleich gezeigt wird, dass das in 3 offenbarte
PRO1122-Polypeptid (d.h. UNQ 561) mit einem Methionin-Rest beginnt,
der als Aminosäureposition
1 bezeichnet wird, ist es auch vorstellbar und möglich, dass ein anderer Methionin-Rest,
der sich entweder stromauf oder stromab von Aminosäureposition
1 in 3 befindet, als Ausgangsaminosäurerest verwendet werden kann.
-
Die
Bezeichnung "UNQ561" bezieht sich auf
das spezifische Nativsequenz-PRO1122-Protein,
die in 3 dargestellt ist. Fakultativ
wird das PRO1122-Polypeptid
durch das Exprimieren des durch das cDNA-Insert von dem unter der
ATCC-Zugriffsnummer 203522 hinterlegten Vektor DNA62377-1381-1 kodierten
Polypeptids erhalten oder kann auf diese Weise erhalten werden.
-
"PRO1122-Variante" bezeichnet ein "aktives" PRO1122-Polypeptid
wie untenstehend definiert, das zumindest etwa 80 % Aminosäuresequenzidentität mit dem
PRO1122-Polypeptid
aufweist, das die abgeleitete Aminosäuresequenz aus den Resten 1
oder etwa 19 bis 197, wie in 3 (Seq.-ID
Nr. 3) dargestellt, für
ein Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid
voller Länge
oder ein reifes Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid aufweist. Solche PRO1122-Polypeptid-Varianten
umfassen beispielsweise PRO1122-Polypeptide, in denen ein oder mehrere
Aminosäurereste
am N- oder C-Terminus oder innerhalb der in 3 dargestellten
Sequenz (Seq.-ID Nr. 3) hinzugefügt,
substituiert oder deletiert wurden. Gewöhnlicherweise weist eine PRO1122-Polypeptidvariante
zumindest etwa 80 % Aminosäuresequenzidentität, vorzugsweise
zumindest etwa etwa 81 % Aminosäuresequenzidentität, noch
bevorzugter zumindest etwa 82 % Aminosäuresequenzidentität, noch
bevorzugter zumindest etwa 83 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest
etwa 84 % Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest etwa 85 % Sequenzidentität, noch
bevorzugter zumindest etwa 86 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest
etwa 87 % Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest etwa 88 % Sequenzidentität, noch
bevorzugter zumindest etwa 89 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest
etwa 90 % Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest etwa 91 % Sequenzidentität, noch
bevorzugter zumindest etwa 92 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest
etwa 96 % Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest etwa 97 % Sequenzidentität, noch
bevorzugter zumindest etwa 98 % Sequenzidentität und noch bevorzugter zumindest
etwa 99 % Aminosöuresequenzidentität mit der
Aminosäuresequenz
aus 3 (Seq.-ID Nr. 3) auf, mit oder ohne Signalpeptid
(z.B. mit Signalpeptidaminosäureresten
1 bis 197 der Seq.-ID Nr. 3, ohne Signalpeptid etwa 19 bis 197 von
Seq.-ID Nr. 3). Die hierin bereitgestellten Varianten schließen die
Nativsequenz-PRO1122-Sequenzen
sowie die hierin beschriebenen Polypeptide und Nucleinsäuren aus,
mit denen die PRO1122-Polypeptide 100 % Identität aufweisen und/oder die bereits
auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.
-
"Prozentsatz (%) der
Aminosäuresequenzidentität" ist in Bezug auf
die hierin identifizierten PRO1122-Aminosäuresequenzen als Prozentsatz
der Aminosäurereste
in einer möglichen
Sequenz definiert, die mit den Aminosäureresten in einer PRO1122-Polypeptidsequenz
ident sind, nachdem die Sequenzen abgeglichen wurden und, bei Bedarf,
Lücken
eingeführt
wurden, um den maximalen Prozentsatz in Bezug auf die Sequenzidentität zu erzielen,
wobei konservative Substitutionen nicht als Teil der Sequenzidentität erachtet werden.
Der Abgleich zum Zweck der Bestimmung des Prozentsatzes der Aminosäuresequenzidentität kann auf
verschiedenen Wegen erfolgen, die Fachleuten auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt sind, beispielsweise unter Einsatz einer allgemein
verfügbaren
Computersoftware, wie z.B. ALIGN-, ALIGN-2-, Megalign-(DNASTAR)
oder BLAST- (z.B. Blast-, Blast-2-, WU-Blast-2-) Software. Fachleute
auf dem Gebiet der Erfindung können
geeignete Parameter zur Messung des Abgleichs bestimmen, wie z.B.
Algorithmen, die erforderlich sind, um einen maximalen Abgleich über die
volle Länge
der zu vergleichenden Sequenzen zu erzielen. Die hierin verwendeten
%-Identitätswerte
wurden beispielsweise unter Einsatz von WU-BLAST-2 (Altschul et al.,
Methods in Enzymology 266, 260-280 (1996)) erhalten. Die meisten
WU-BLAST-2-Suchparameter sind auf die Standardwerte eingestellt.
Jene, die nicht auf die Standardwerte eingestellt sind, d.h. die
einstellbaren Parameter, werden mit folgenden Werten festgelegt:
overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, Word threshold (T) =
11 und scoring matrix = BLOSUM 62. Für die Zwecke hierin wird ein
Aminosäuresequenzidentitäts-%-Wert
durch das Dividieren (a) der Anzahl der übereinstimmenden identen Aminosäurereste
der Aminosäuresequenz
des PRO1122-Polypeptids von Interesse und der Vergleichsaminosäuresequenz
von Interesse (d.h. der Sequenz, mit der das PRO1122-Polypeptid
von Interesse verglichen wird), wie durch WU-BLAST-2 bestimmt, durch
(b) die Gesamtanzahl der Aminosäurereste
des PRO1122-Polypeptids von Interesse.
-
"Isoliert" bezeichnet, wenn
es zur Beschreibung der verschiedenen hierin offenbarten Polypeptide
herangezogen wird, ein Polypeptid, das identifiziert und von einer
Komponente seiner natürlichen
Umgebung getrennt und/oder aus dieser gewonnen wurde. Vorzugsweise
weist das isolierte Polypeptid keine Assoziation mit Komponenten
auf, mit denen es natürlicherweise
assoziiert ist. Verunreinigende Komponenten aus seiner natürlichen
Umgebung sind Materialien, die typischerweise die diagnostischen
oder therapeutischen Verwendungen des Polypeptids beeinträchtigen
würden,
und können
Enzyme, Hormone und andere proteinhaltige oder nicht-proteinhaltige
gelöste
Stoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Polypeptid
(1) unter Einsatz eines Zentrifugenröhrchensequenzierers bis zu
einem Grad gereinigt, der ausreicht, um zumindest 15 Reste einer
N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz zu erhalten, oder
(2) mittels SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden oder reduzierenden
Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise
Silberfarbstoff bis zur Homogenität gereinigt. isoliertes Polypeptid
umfasst Polypeptid in situ in rekombinanten Zellen, da zumindest
eine Komponente des natürlichen
Umfelds von PRO1122-Polypeptid nicht vorhanden ist. Gewöhnlicherweise
wird isoliertes Polypeptid jedoch durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
-
Die
Bezeichnung "Kontrollsequenzen" bezieht sich auf
DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel verbundenen kodierenden
Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die
für Prokaryoten
geeigneten Kontrollsequen zen umfassen beispielsweise einen Promotor,
gegebenenfalls eine Operatorsequenz, und eine Ribosom-Bindungsstelle.
Es ist bekannt, dass eukaryotische Zellen Promotoren, Polyadenylierungssignale
und Enhancer nutzen.
-
Eine
Nucleinsäure
ist "operabel verbunden", wenn sie sich in
funktioneller Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz
befindet. Die DNA für
eine Präsequenz
oder einen Sekretionsleader ist beispielsweise operabel mit der
DNA für
ein Polypeptid verbunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das
an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder
Enhancer ist operabel mit einer kodierenden Sequenz verbunden, wenn
er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosom-Bindungsstelle
ist operabel mit einer kodierenden Sequenz verbunden, wenn sie zur
Erleichterung der Translation angeordnet ist. Im Allgemeinen bedeutet "operabel verbunden", dass die verbundenen
DNA-Sequenzen zusammenhängend
sind und, im Fall eines Sekretionsleaders, zusammenhängend und
in der Lesephase sind. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein.
Die Verbindung erfolgt über
eine Ligation an angemessenen Restriktionsstellen. Wenn solche Stellen
nicht vorhanden sind, werden die synthetischen Oligonucleotidadapter
oder -linker gemäß der herkömmlichen
Praxis eingesetzt.
-
Die "Stringenz" der Hybridisierungsreaktionen
kann durch Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung leicht bestimmt
werden und ist im Allgemeinen eine empirische Berechnung, die von
der Sondenlänge,
der Waschtemperatur und der Salzkonzentration abhängt. Im
Allgemeinen erfordern längere
Sonden höhere
Temperaturen für
angemessenes Annealing, während
kürzere
Sonden niedrigere Temperaturen erfordern. Die Hybridisierung hängt im Allgemeinen
von der Fähigkeit
der denaturierten DNA ab, erneut einen Doppelstrang zu bilden, wenn
komplementäre
Stränge
in einer Umgebung unterhalb der Schmelztemperatur vorhanden sind. Je
höher das
Maß der
erwünschten
Homologie zwischen der Sonde und der hybridisierbaren Sequenz ist,
desto höher
die relative Temperatur, die eingesetzt werden kann. In der Folge
kann daraus geschlossen werden, dass höhere relative Temperaturen
dazu neigen, die Reaktionen stringenter zu machen, während niedrigere Temperaturen
sie weniger stringent machen. Für
zusätzliche
Details und Erklärungen
in Bezug auf die Strin genz von Hybridisierungsreaktionen siehe Ausubel
et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience
Publishers (1995).
-
"Stringente Bedingungen" oder "hochstringente Bedingungen" können, wie
hierin definiert, als jene identifiziert werden, bei denen (1) eine
geringe Ionenstärke
und hohe Temperaturen zum Waschen eingesetzt werden, wie z.B. 0,015
M Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1 % Natriumdodecylsulfat
bei 50 °C;
(2) während
der Hybridisierung ein Denaturierungsmittel, wie z.B. Formamid,
eingesetzt wird, wie z.B. 50 Vol.-% Formamid mit 0,1 % Rinderserumalbumin/0,1
% Ficoll/0,1 % Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer mit
pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42 °C; oder (3)
50 % Formamid, 5 × SSC (0,75
M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8),
0,1 % Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardtsche
Lösung,
beschallte Lachssperma-DNA (50 μg/ml),
0,1 % SDS und 10 % Dextransulfat bei 42 °C mit Wäschen bei 42 °C in 0,2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat)
und 50 % Formamid bei 55 °C
gefolgt von einer hochstringenten Wäsche aus 0,1 × SSC, das
EDTA enthält,
bei 55 °C
verwendet wird.
-
"Moderat stringente
Bedingungen" können als
jene identifiziert werden, die von Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1989),
beschrieben werden, und umfassen die Verwendung von Waschlösungen und
Hybridisierungsbedingungen (z.B. Temperatur, Ionenstärke und
% SDS), die weniger stringent sind als die oben beschriebenen. Ein
Beispiel für
moderat stringente Bedingungen ist die Inkubation über Nacht
bei 37 °C
in einer Lösung,
die Folgendes umfasst: 20 % Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat),
50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardtsche Lösung, 10
% Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte gescherte Lachssperma-DNA,
gefolgt vom Waschen der Filter in 1 × SSC bei etwa 37-50 °C. Fachleute
auf dem Gebiet der Erfindung wissen, wie sie die Temperatur, die Ionenstärke etc.
nach Bedarf anpassen müssen,
um Faktoren, wie z.B. der Sondenlänge und dergleichen, gerecht
zu werden.
-
Die
Bezeichnung "Epitop-markiert" bezieht sich, wie
hierin verwendet, auf ein chimäres
Polypeptid, das PRO1122-Polypeptid oder eine Domänensequenz davon an ein "Markierungspolypeptid" fusioniert umfasst.
Das Markierungspolypeptid weist ausreichend Reste auf, um ein Epitop
bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann
oder das durch einen anderen Wirkstoff identifiziert werden kann
und doch kurz genug ist, dass es die Aktivität des PRO1122-Polypeptids nicht
beeinträchtigt.
Das Markierungspolypeptid ist vorzugsweise auch relativ einzigartig,
so dass der Antikörper
im Wesentlichen nicht mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete
Markierungspolypeptide weisen im Allgemeinen zumindest 6 Aminosäurereste
und gewöhnlicherweise
zwischen etwa 8 bis etwa 50 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen
etwa 10 bis etwa 20 Reste) auf.
-
Wie
hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung "Immunadhäsin" auf Antikörperähnliche Moleküle, die
die Bindungsspezifität
eines heterologen Proteins (eine "Adhäsion") mit den Effektorfunktionen
konstanter Immunglobulindomänen
kombinieren. Strukturell umfassen die Immunadhäsine eine Fusion einer Aminosäuresequenz
mit der erwünschten
Bindungsspezifität,
die sich von der Antigenerkennungs- und -bindungsstelle eines Antikörpers unterscheidet
(d.h. "heterolog" ist), und einer
konstanten Immunglobulindomänensequenz. Der
Adhäsin-Teil
eines Immunadhäsinmoleküls ist typischerweise
eine zusammenhängende
Aminosäuresequenz,
die zumindest die Bindungsstelle eines Rezeptors oder eines Liganden
umfasst. Die konstante Immunglobulindomänensequenz in dem Immunadhäsin kann
aus einem beliebigen Immunglobulin, wie z.B. IgG-1-, IgG-2-, IgG-3-
oder IgG-4-Subtypen, IgA (umfassend IgA-1 und IgA-2), IgE, IgD oder
IgM, erhalten werden.
-
Die
Bezeichnung "Antikörper" wird im weitesten
Sinn verwendet und umfasst spezifisch einzelne monoklonale Anti-PRO1122-Polypeptid-Antikörper (umfassend
Agonist-, Antagonist- und neutralisierende Antikörper), Anti-PRO1122-Antikörper-Zusammensetzungen
mit polyeptioper Spezifität,
einkettige Anti-PRO1122-Antikörper und
Fragmente von Anti-PRO1122-Antikörpern.
Die Bezeichnung "monoklonaler
Antikörper" bezieht sich, wie
hierin verwendet, auf einen Antikörper, der aus einer Population
von im Wesentlichen homogenen Antikörper erhalten wird, d.h. die
einzelnen Antikörper,
die die Population bilden, sind bis auf mögliche natürlich vorkommende Mutationen,
die in geringen Mengen vorhanden sein können, ident.
-
"Aktiv" oder "Aktivität" bezieht sich für die Zwecke
hierin auf eine Form/Formen von PRO1122, die weiterhin die biologischen
und/oder immunologischen Aktivitäten
von nativen oder natürlich
vorkommenden Polypeptiden aufweisen. Weiters bezieht sich "biologische" Aktivität auf eine
biologische Funktion (entweder hemmend oder stimulierend), die durch
ein natives oder natürlich
vorkommendes PRO1122 hervorgerufen wird, abgesehen von der Fähigkeit,
die Produktion eines Antikörpers
gegen ein antigenes Epitop zu induzieren, die von einem nativen
oder natürlich
vorkommenden PRO1122 aufgewiesen wird; und eine "immunologische Aktivität" bezieht sich nur
auf die Fähigkeit,
die Produktion eines Antikörpers
gegen ein antigenes Epitop zu induzieren, die von einem nativen
oder natürlich
vorkommenden PRO1122 aufgewiesen wird. Eine bevorzugte biologische
Aktivität
umfasst beispielsweise das Freisetzen von TNF-α aus THP1-Zellen.
-
"Degenerative Knorpelerkrankung" beschreibt eine
Reihe von Störungen,
die im Wesentlichen dadurch gekennzeichnet sind, dass die Knorpelmatrix
zerstört
wird. Zusätzliche
Pathologien umfassen Stickoxidproduktion und erhöhten Proteoglykan-Abbau. Beispielhafte
Störungen,
die diese Definition umfasst, umfassen beispielsweise Arthritis
(z.B. Osteoarthritis, rheumatische Arthritis, Arthritis psoriatica),
Sepsis, Colitis ulcerosa, Psoriasis, Multiple Sklerose, Typ-I-Diabetes,
Riesenzellarteriitis, systemischen Lupus erythematodes und Sjörgen-Syndrom.
-
Die
Bezeichnung "Antagonist" wird im weitesten
Sinn verwendet und umfasst alle Moleküle, die die biologische Aktivität eines
hierin offenbarten nativen PRO1122-Polypeptids teilweise oder vollständig blockieren,
hemmen oder neutralisieren. Auf ähnliche
Weise wird die Bezeichnung "Agonist" hierin im weitesten
Sinn verwendet und umfasst alle Moleküle, die eine biologische Aktivität eines
hierin offenbarten nativen PRO1122-Polypeptids nachahmen. Geeignete
Agonisten- oder Antagonistenmoleküle umfassen spezifisch Agonisten-
oder Antagonisten-Antikörper
oder -Antikörperfragmente,
Fragmente oder Aminosäuresequenzvarianten
von nativen PRO1122-Polypeptiden, Peptide, kleine organische Moleküle etc.
Ein Verfahren zur Identifizierung der Agonisten oder Antagonisten
eines PRO1122-Polypeptids können
das Kontaktieren eines PRO1122-Polypeptids mit einem möglichen
Agonisten- oder Antagonistenmolekül und das Messen der nachweisbaren
Veränderung
in Bezug auf eine oder mehrere biologische Aktivitäten, die
gewöhnlicherweise
mit dem PRO1122-Polypeptid assoziiert werden, umfassen.
-
"Antikörper" (Abs) und "Immunglobuline" (Igs) sind Glykoproteine
mit denselben strukturellen Eigenschaften. Während Antikörper eine Bindungsspezifität für ein spezifisches
Antigen aufweisen, umfassen Immunglobuline Antikörper und Antikörperähnliche
Moleküle,
die keine Antigen-Spezifität
aufweisen. Polypeptide der letzteren Art werden beispielsweise in
geringem Maß vom
Lymphsystem und in höherem
Maß von
Myelomen produziert. Die Bezeichnung "Antikörper" wird im weitesten Sinn verwendet und
umfasst spezifisch, ohne Einschränkung,
intakte monoklonale Antikörper,
polyklonale Antikörper,
multispezifische Antikörper
(z.B. bispezifische Antikörper),
die aus zumindest zwei intakten Antikörpern gebildet werden, und
Antikörperfragmente, solange
diese die erwünschte
biologische Aktivität
aufweisen.
-
Die
Bezeichnungen "behandeln", "Behandlung" und "Therapie" beziehen sich, wie
hierin verwendet, auf kurative, prophylaktische und präventive
Therapie. Ein Beispiel einer "präventiven
Therapie" ist die
Prävention
oder die Minderung einer pathologischen Erkrankung oder Störung. Jene,
die einer Behandlung bedürfen,
umfassen die, die bereits an der Störung leiden, sowie die, die
zur Entwicklung der Störung
neigen, oder die, bei denen das Auftreten der Störung verhindert werden soll.
-
"Chronische" Verabreichung bezieht
sich auf die kontinuierliche Verabreichung eines Wirkstoffs/von Wirkstoffen
im Gegensatz zu einer akuten Verabreichung, um die anfängliche
therapeutische Wirkung (Aktivität) über einen
längeren
Zeitraum hinweg aufrechtzuerhalten. Eine "intermittierende" Verabreichung bezeichnet eine Behandlung,
die nicht fortlaufend ohne Unterbrechung erfolgt, sonder eher zyklischer
Natur ist.
-
Die
Bezeichnung "Säugetier" bezieht sich, wie
hierin verwendet, auf ein als Säugetier
klassifiziertes Tier, umfassend Menschen, Haus- und Nutztiere, sowie
Zoo-, Sportlind Stubentiere, wie z.B. Rinder (z.B. Kühe), Pferde,
Hunde, Schafe, Schweine, Kaninchen, Ziegen, Katzen etc. In einer
bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung handelt es sich bei dem Säugetier um einen Menschen.
-
Die
Verabreichung "in
Kombination mit" einem
oder mehreren weiteren therapeutischen Wirkstoffen umfasst die gleichzeitige
und die aufeinander folgende Verabreichung in beliebiger Reihenfolge.
-
Eine "therapeutisch wirksame
Menge" ist die Mindestmenge
eines Wirkstoffs (z.B. PRO1122, eines Antagonisten oder Agonisten
davon), die erforderlich ist, damit das Säugetier therapeutischen Nutzen
aus der Behandlung ziehen kann. Eine "therapeutisch wirksame Menge" für ein Säugetier,
das an einer degenerativen Knorpelstörung leidet, dazu neigt, diese
zu entwickeln, oder dessen Erkrankung daran verhindert werden soll, entspricht
einer solchen Menge, die eine Verbesserung der pathologischen Symptome,
des Fortschreitens der Erkrankung, des physiologischen Zustands
in Zusammenhang mit Resistenz gegen eine oder Entwicklung einer
Erkrankung, die im Wesentlichen durch die Zerstörung der Knorpelmatrix gekennzeichnet
ist, induziert, steigert oder auf andere Weise hervorruft.
-
"Träger" umfassen, wie hierin
verwendet, pharmazeutisch annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren,
die in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch
für die
Zelle oder das Säugetier
sind, das diesen ausgesetzt wird. Oft handelt es sich bei dem physiologisch
annehmbaren Träger
um eine wässrige
pH-gepufferte Lösung.
Beispiele für
physiologisch annehmbare Träger
umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische
Säuren;
Antioxidationsmittel, wie z.B. Ascorbinsäure; niedermolekulare Polypeptide
(weniger als etwa 10 Reste); Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine
oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon;
Aminosäuren,
wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide,
Disaccharide und andere Kohlenwasserstoffe, umfassend Glucose, Mannose oder
Dextrine; Chelatbildner, wie z.B. EDTA; Zucker alkohole, wie z.B.
Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z.B. Natrium; und/oder
nichtionische Tenside, wie z.B. TWEEN®, Polyethylenglykol
(PEG) und PLURONICSTM.
-
Die
Bezeichnung "Antikörperfragmente" umfasst einen Teil
eines intakten Antikörpers,
vorzugsweise die Antigen-Bindungsregion oder die variable Region
eines intakten Antikörpers.
Beispiele für
Antikörperfragmente
umfassen Fab-, Fab'-,
F(ab')2-
und Fv-Fragmente; Diakörper;
lineare Antikörper
(Zapata et al., Protein Engin. 8 (10), 1057-1062 (1995)); einkettige
Antikörpermoleküle und multispezifische
Antikörper
aus Antikörperfragmenten.
-
Durch
den Papainverdau von Antikörpern
entstehend zwei idente Antigen-Bindungsfragmente,
die als "Fab"-Fragmente bezeichnet
werden, wobei jedes eine einzige Antigen-Bindungsstelle aufweist,
und ein Rest-"Fc"-Fragment, wobei
dessen Bezeichnung dessen Fähigkeit
widerspiegelt, leicht zu kristallisieren. Eine Pepsinbehandlung
liefert ein F(ab')2-Fragment, das zwei Antigenkombinationsstellen
aufweist und weiterhin ein Antigen vernetzen kann.
-
"Fv" ist das kleinste
Antikörperfragment,
das eine vollständige
Antigenerkennungs- und
-bindungsstelle enthält.
Diese Region besteht aus einem Dimer aus einer variablen Schwer-
und Leichtkettendomäne
in enger, nicht-kovalenter Bindung. In dieser Anordnung treten die
drei CDR jeder variablen Domäne
in Wechselwirkung, um eine Antigen-Bindungsstelle auf der Oberfläche des
VH-VL-Dimers zu definieren. Kollektiv verleihen die 6 CDR dem Antikörper eine
Antigen-Bindungsspezifität.
Auch eine einzige variable Domäne
(oder die Hälfte
einer Fv, die nur drei für
ein Antigen spezifische CDR umfasst) weist jedoch die Fähigkeit
auf, ein Antigen zu erkennen und zu binden, wenngleich mit einer
geringeren Affinität
als die gesamte Bindungsstelle.
-
Das
Fab-Fragment enthält
auch eine konstante Leichtketten-Domäne und die erste konstante
Domäne
(CH1) der Schwerkette. Fab-Fragmente unterscheiden sich von Fv-Fragmenten
durch die Hinzufügung
von wenigen Resten am Carboxy-Ende der Schwerketten-CH1-Domäne, umfassend
ein oder mehrere Cysteine aus der Antikör per-Gelenksregion. Fab'-SH bezeichnet hierin
Fab', worin der
Cystein-Rest/die Cystein-Reste der konstanten Domänen eine
freie Thiol-Gruppe aufweisen. F(ab1)2-Antikörperfragmente
wurden ursprünglich als
Fab'-Fragmentpaare
hergestellt, die Gelenks-Cysteine zwischen ihnen aufweisen. Andere
chemische Verbindungen von Antikörperfragmenten
sind ebenfalls bekannt.
-
Die "Leichtketten" von Antikörpern (Immunglobulinen)
einer beliebigen Wirbeltierspezies können baierend auf den Aminosäuresequenzen
ihrer konstanten Domänen
einem von zwei verschiedenen Typen, κ und λ, zugeordnet werden.
-
In
Abhängigkeit
von der Aminosäuresequenz
der konstanten Domäne
ihrer Schwerketten können
Immunglobuline verschiedenen Klassen zugeordnet werden. Es gibt
fünf Hauptklassen
von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, wobei einige von
diesen weiter in Unterklassen (Isotypen) unterteilt werden können, z.B.
IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA und IgA2.
-
"Einkettige Fv-" oder "sFv"-Antikörperfragmente
umfassen die VH- und die VL-Domänen des
Antikörpers,
wobei diese Domänen
in einer einzigen Polypeptidkette vorhanden sind. Vorzugsweise umfasst
das Fv-Polypeptid weiters einen Polypeptidlinker zwischen der VH-
und der VL-Domäne,
der es ermöglicht,
dass sFv die erwünschte
Struktur zur Antigenbindung bildet. Für einen Überblick über Fv siehe Pluckthun, in:
The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Band 113, 269-315, Rosenburg
und Moore (Hrsg.), Springer-Verlag, New York (1994).
-
Die
Bezeichnung "Diakörper" bezieht sich auf
kleine Antikörperfragmente
mit zwei Antigen-Bindungsstellen, wobei die Fragmente eine variable
Schwerketten-Domäne
(VH) umfassen, die in derselben Polypeptidkette mit einer variablen
Leichtketten-Domäne (VL)
verbunden ist (VH-VL). Unter Einsatz eines Linkers, der zu kurz
ist, um eine Paarbildung der beiden Domänen an derselben Kette zu ermöglichen,
sind die Domänen gezwungen,
mit den komplementären
Domänen
einer anderen Kette Paare zu bilden und zwei Antigen-Bindungsstellen
zu schaffen. Diakörper
werden um fassender beispielsweise in
EP
404.097 ,
WO 93/11161 und Hollinger
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993), beschrieben.
-
Ein "isolierter" Antikörper ist
ein Antikörper,
der identifiziert und getrennt und/oder aus einer Komponente seines
natürlichen
Umfelds gewonnen wurde. Verunreinigende Komponenten seines natürlichen
Umfelds sind Materialien, die die diagnostischen und therapeutischen
Verwendungen des Antikörpers
beeinträchtigen
würden,
und können
Enzyme, Hormone und andere proteinhaltige oder nicht-proteinhaltige
gelöste
Stoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper (1)
auf mehr als 95 Gew.-% Antikörper gereinigt,
wie durch das Lowry-Verfahren bestimmt, und besonders bevorzugt
auf mehr als 99 Gew.-%, (2) unter Einsatz eines Zentrifugenröhrchensequenzierers
bis zu einem Maß gereinigt,
das ausreicht, um zumindest 15 Reste der N-terminalen oder internen
Aminosäuresequenz
zu erhalten, oder (3) mittels SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden
oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau
oder vorzugsweise Silberfarbstoff bis zur Homogenität gereinigt.
Ein isolierter Antikörper
umfasst den Antikörper
in situ in rekombinanten Zellen, da zumindest eine Komponente des
natürlichen
Umfelds des Antikörpers
nicht vorhanden ist. Gewöhnlicherweise
wird der isolierte Antikörper
jedoch zumindest durch einen Reinigungsschritt hergestellt.
-
Das
Wort "Markierung" bezieht sich, wie
hierin verwendet, auf eine nachweisbare Verbindung oder Zusammensetzung,
die direkt oder indirekt an den Antikörper konjugiert ist, um einen "markierten" Antikörper zu erzeugen.
Die Markierung kann selbst nachweisbar sein (z.B. Radioisotopmarkierungen
oder Fluoreszenzmarkierungen) oder, im Fall einer Enzymmarkierung,
eine chemische Veränderung
einer Substratverbindung oder -zusammensetzung katalysieren, die
nachweisbar ist.
-
"Festphase" ist die Bezeichnung
für eine
nicht-wässrige
Matrix, an der der Antikörper
der vorliegenden Erfindung haften kann. Beispiele für Festphasen
hierin umfassen jene, die teilweise oder vollständig aus Glas bestehen (z.B.
Glas mit gesteuerter Porengröße), Polysaccharide
(z.B. Agarose), Polyacrylamide, Polystyrol, Polyvinylalkohol und
Silicone. In bestimmten Ausführungsformen
kann die Festphase in Abhän gigkeit
vom Zusammenhang den Well einer Testplatte umfassen; in anderen
handelt es sich um eine Reinigungssäule (z.B. eine Affinitätschromatographiesäule). Diese
Bezeichnung umfasst auch eine diskontinuierliche Festphase getrennter
Teilchen, wie z.B. die in
US-Patent
Nr. 4.275.149 beschriebene.
-
Ein "Liposom" ist ein kleines
Bläschen,
das aus verschiedenen Arten von Lipiden, Phospholipiden und/oder
Tensiden besteht, was für
die Zufuhr eines Arzneimittels (wie z.B. PRO1122-Polypeptid oder
des Antikörpers
dazu) an ein Säugetier
nützlich
ist. Die Komponenten des Liposoms sind gewöhnlicherweise in einer Doppelschichtanordnung
angeordnet, ähnlich
wie die Lipid-Anordnung in biologischen Membranen.
-
Ein "kleines Molekül" ist hierin als Molekül mit einem
Molekulargewicht von weniger als etwa 500 Dalton definiert.
-
"Modulieren" bezeichnet die Beeinflussung
(z.B. Up-, Down-Regulation oder Steuerung in einer anderen Form)
der Ebene des Signalwegs. Durch Signaltransduktion gesteuerte zelluläre Prozesse
umfassen die Transkription von bestimmten Genen, normale Zellfunktionen,
wie z.B. Stoffwechsel, Wachstum, Differenzierung, Adhäsion, Apoptose
und Überleben,
sowie abnormale Prozesse, wie z.B. Transformation, Blockieren von Differenzierung
und Metastasenbildung, sind aber nicht auf diese beschränkt.
-
II. Erfindungsgemäße Zusammensetzungen und Verfahren
-
A. PRO1122-Polypeptid voller Länge
-
Die
vorliegende Erfindung identifiziert und isoliert Nucleotidsequenzen,
die für
Polypeptide kodieren, die in der vorliegenden Anmeldung als PRO1122
bezeichnet werden. Insbesondere haben die Anmelder cDNA identifiziert
und isoliert, die für
ein PRO1031- (z.B. UNQ516, IL-17B, Seq.-ID Nr. 1) und ein PRO1122-
(z.B. UNQ561, IL-17C, Seq.-ID Nr. 3) Polypeptid kodiert, wie in
den untenstehenden Beispielen detaillierter offenbart wird. Unter
Einsatz der Computerprogramme BLAST und FastA zum Sequenzabgleich
haben die Anmelder festgestellt, dass verschiedene Abschnitte des
PRO1031- und des PRO1122-Polypeptids Sequenzidentität mit IL-17
aufweisen. Dementsprechend wird gegenwärtig angenommen, dass das in
der vorliegenden Anmeldung offenbarte PRO1031- und das PRO1122-Polypeptid
neu identifizierte Mitglieder der Cytokin-Familie sind und somit
an Entzündungen
und/oder der Immunsystemfunktion beteiligt sein könnten. Mit
Letzterem beschäftigt sich
die vorliegende Erfindung.
-
Wie
bereits erläutert
bezieht sich die Bezeichnung "PRO1122" auf die native Sequenz
und Varianten, während
sich die Bezeichnung "UNQ561" auf die spezifische
Aminosäuresequenz
in 3 (Seq.-ID Nr. 3) und/oder die durch die unter
der Zugriffsnummer 203552 bei der American Type Culture Collection
hinterlegte cDNA kodierten Proteine bezieht.
-
Wie
in den untenstehenden Beispielen offenbart, wurde der hierin als
DNA62377-1381-1
bezeichnete cDNA-Klon bei der ATCC hinterlegt. Die tatsächliche
Nucleotidsequenz des Klons kann durch Fachleute auf dem Gebiet der
Erfindung leicht durch das Sequenzieren des hinterlegten Klons unter
Einsatz von Routineverfahren auf dem Gebiet der Erfindung bestimmt
werden. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz
kann unter Einsatz von Routineverfahren ausgehend von der Nucleotidsequenz
bestimmt werden. Für
das hierin beschriebene PRO1122-Polypeptid und die kodierende Nucleinsäure haben
die Anmelder den Leseraster identifiziert, von dem angenommen wird,
dass es sich um den mit der gegenwärtig verfügbaren Sequenzinformation am
besten identifizierbaren Leseraster handelt.
-
B. PRO1122-Varianten
-
Zusätzlich zum
hierin beschriebenen Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid voller Länge wird
in Betracht gezogen, dass PRO1122-Varianten hergestellt werden können. PRO1122-Varianten
können
durch das Vornehmen geeigneter Nucleotidveränderungen in der DNA, die für PRO1122
kodiert, oder durch die Synthese des gewünschten PRO1122-Polypeptids
erzeugt werden. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ist klar, dass
Veränderungen
der Aminosäuren
die posttranslationalen Prozesse des Polypeptids verändern können, wie
z.B. die Veränderung
der Anzahl oder der Position von Glykosylierungsstellen oder die
Veränderung
der Membranverankerungseigenschaften.
-
Variationen
des Nativsequenz-PRO1122 voller Länge oder in verschiedenen Domänen des
hierin beschriebenen PRO1122-Polypeptids können beispielsweise unter Einsatz
eines beliebigen Verfahrens und unter Anwendung der Richtlinien
für konservative
und nicht-konservative Mutationen erfolgen, die beispielsweise in
US-Patent Nr. 5.364.934 erläutert werden.
Bei den Variationen kann es sich um Substitution, Deletion oder Insertion
eines oder mehrerer Codons handeln, die für das PRO1122-Polypeptid kodieren,
was im Vergleich mit der nativen Sequenz von PRO1122 zu einer Veränderung
der Aminosäuresequenz
des PRO1122-Polypeptids führt.
Fakultativ erfolgt die Variation durch die Substitution zumindest
einer Aminosäure
durch eine beliebige andere Aminosäure in einer oder mehreren
Domänen
des PRO1122-Polypeptids. Eine Anleitung zur Bestimmung, welcher
Aminosäurerest
insertiert, substituiert oder deletiert werden kann, ohne die gewünschte Aktivität zu beeinträchtigen,
kann ermittelt werden, indem die Sequenz des PRO1122-Polypeptids
mit der eines homologen bekannten Proteinmoleküls verglichen wird und die
Anzahl der Aminosäuresequenzveränderungen
in Regionen mit hoher Homologie minimiert wird. Aminosäuresubstitutionen
können
das Ergebnis des Ersetzens einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen
strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften sein, wie z.B. das
Ersetzen eines Leucins durch ein Serin, d.h. das Ergebnis von konservativen Aminosäureersetzungen.
Insertionen oder Deletionen können
fakultativ im Bereich von 1 bis 5 Aminosäuren erfolgen. Die mögliche Variation
kann durch das systematische Vornehmen von Insertionen, Deletionen
oder Substitutionen von Aminosäuren
in der Sequenz und das Testen der resultierenden Varianten in Bezug
auf die Aktivität
der nativen Sequenz voller Länge
oder der reifen nativen Sequenz (z.B. durch einen der in den untenstehenden
Beispielen beschriebenen In-vitro-Tests) bestimmt werden.
-
PRO1122-Polypeptidfragmente
werden hierin bereitgestellt. Solche Fragmente können am N- oder C-Terminus
trunkiert sein, oder ihnen können
beispielsweise im Vergleich mit einem Protein voller Länge oder einem
nativen Protein im Inneren Reste fehlen. Bestimmten Resten fehlen
Aminosäurereste,
die für
eine gewünschte
biologische Aktivität
des PRO1122-Polypeptids nicht wesentlich sind.
-
PRO1122-Fragmente
können
durch ein beliebiges einer Reihe von herkömmlichen Verfahren hergestellt
werden. Gewünschte
Peptidfragmente können
chemisch synthetisiert werden. Ein alternativer Ansatz umfasst das
Erzeugen von PRO1122-Fragmenten
mittels Enzymverdau, z.B. durch die Behandlung des Proteins mit
einem Enzym, von dem bekannt ist, dass es Proteine an durch bestimmte
Aminosäurereste
definierten Stellen spaltet, oder durch den Verdau der DNA mit geeigneten
Restriktionsenzymen und die Isolation des gewünschten Fragments. Ein weiteres
geeignetes Verfahren umfasst das Isolieren und Amplifizieren eines DNA-Fragments,
das für
ein gewünschtes
Polypeptidfragment kodiert, mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Oligonucleotide, die die gewünschten
Termini des DNA-Fragments definieren, werden an den 5'- und 3'-Primern in der PCR
eingesetzt. Vorzugsweise teilen die PRO1122-Polypeptidfragmente
zumindest eine biologische und/oder immunologische Aktivität mit dem
in 3 dargestellten nativen PRO1122-Polypeptid (Seq.-ID
Nr. 3).
-
In
bestimmten Ausführungsformen
werden konservative Substitutionen von Interesse in Tabelle 1 in der
Spalte "Bevorzugte
Substitutionen" angeführt. Wenn
solche Substitutionen zu einer Veränderung der biologischen Aktivität führen, werden
umfassendere Veränderungen,
die in Tabelle 1 als Beispielsubstitutionen bezeichnet werden, wie
weiter unten in Bezug auf die Aminosäureklassen beschrieben, durchgeführt, und
die Produkte werden gescreent. Tabelle 1 Konservative Substitutionen
Ursprünglicher
Rest | Beispielsubstitutionen | Bevorzugte
Substitutionen |
Ala
(A) | val,
leu, ile | val |
Arg
(R) | lys,
gln, asn | lys |
Asn
(N) | gln,
his, lys, arg | gln |
Asp
(D) | glu | glu |
Cys
(C) | ser | ser |
Gln
(Q) | asn | asn |
Glu
(E) | asp | asp |
Gly
(G) | pro,
ala | ala |
His
(H) | asn,
gln, lys, arg | arg |
Ile
(I) | leu,
val, met, ala, phe, Norleucin | leu |
Leu
(L) | Norleucin,
ile, val, met, ala, phe | ile |
Lys
(K) | arg,
gln, asn | arg |
Met
(M) | leu,
phe, ile | leu |
Phe
(F) | leu,
val, ile, ala, tyr | leu |
Pro
(P) | ala | ala |
Ser
(S) | thr | thr |
Thr
(T) | ser | ser |
Trp
(W) | tyr,
phe | tyr |
Tyr
(Y) | trp,
phe, thr, ser | phe |
Val
(V) | ile,
leu, met, phe, ala, Norleucin | leu |
-
Wesentliche
Modifikationen der Funktion oder immunologischen Identität von PRO1122-Polypeptid werden
erzielt, indem Substitutionen ausgewählt werden, die sich in ihrer
Wirkung auf das Beibehalten (a) der Struktur des Polypeptidgerüsts im Bereich
der Substitution, beispielsweise als Faltblatt- oder Helixkonformation,
(b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c)
der Sperrigkeit der Seitenkette stark unterscheiden. Natürlich vorkommende
Reste werden bezogen auf ihre gemeinsamen Seitenketteneigenschaften
in Gruppen unterteilt:
- (1) Hydrophob: sys,
ser, thr;
- (2) Neutral hydrophil: cys, ser, thr;
- (3) Sauer: asp, glu;
- (4) Basisch: asn, gln, his, lys, arg;
- (5) Reste, die die Kettenorientierung beeinflussen: gly, pro;
und
- (6) Aromatisch: trp, tyr, phe.
-
Nicht-konservative
Substitutionen umfassen den Austausch eines Mitglieds einer dieser
Klassen durch das Mitglied einer anderen Klasse. Auf diese Weise
substituierte Reste können
an den konservativen Substitutionsstellen eingeführt werden oder noch bevorzugter
an den verbleibenden (nicht-konservativen) Stellen.
-
Die
Variationen können
unter Einsatz von Verfahren durchgeführt werden, die auf dem Gebiet
der Erfindung bekannt sind, wie z.B. Olignucleotid-vermittelte (ortsgerichtete)
Mutagenese, Alanin-Scanning und PCR-Mutagenese. Ortsgerichtete Mutagenese
[Carter et al., Nucl. Acids. Res. 13, 4331 (1986); Zoller et al., Nucl.
Acids Res. 10, 6487 (1987)], Kassettenmutagenese [Wells et al.,
Gene 34, 315 (1985)], Restriktionsselektionsmutagenese [Wells et
al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317, 415 (1986)] oder andere
bekannte Verfahren können
auf die klonierte DNA zur Herstellung der für PRO1031 kodierenden DNA-Variante
angewandt werden.
-
Scanning-Aminosäureanalyse
kann auch eingesetzt werden, um eine oder mehrere Aminosäuren in einer
zusammenhängenden
Sequenz zu identifizieren. Zu den bevorzugten Scanning-Aminosäuren gehören relativ
kleine, neutrale Aminosäuren.
Solche Aminosäuren
umfassen Alanin, Glycin, Serin und Cystein. Alanin ist typischerweise
eine bevorzugte Scanning-Aminosäure
von dieser Gruppe, da es die Seitenkette über das β-Kohlenstoffatom hinausgehend
eliminiert und die Wahrscheinlichkeit geringer ist, dass es die
Hauptkettenkonformation der Variante verändert. Alanin ist auch deshalb
typischerweise zu bevorzugen, da es die häufigste Aminosäure ist.
-
Weiters
kommt es häufig
in bedeckten und freiliegenden Positionen vor [Creighton, The Proteins,
W.H. Freeman & Co.,
New York; Chothia, J. Mol. Biol. 150, 1 (1976)]. Wenn Alaninsubstitution
nicht ausreichende Mengen einer Variante liefert, kann eine isoterische
Aminosäure
eingesetzt werden.
-
C. Modifikationen von PRO1122
-
Kovalente
Modifikationen von PRO1122-Polypeptiden sind Teil des Umfangs der
vorliegenden Erfindung wie in den Ansprüchen definiert. Eine Art einer
kovalenten Modifikation umfasst die Umsetzung der Ziel-Aminosäurereste
des PRO1122-Polypeptids mit einem organischen Derivatisierungsmittel,
das in der Lage ist, mit ausgewählten
Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten eines PRO1122-Polypeptids zu
reagieren. Die Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist nützlich,
um beispielsweise PRO1122 mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder -oberfläche zur
Verwendung in dem Verfahren zur Reinigung von Anti-PRO1122-Antikörpern zu
vernetzen und umgekehrt. Herkömmlicherweise
eingesetzte Vernetzungsmittel umfassen z.B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan,
Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit
4-Azidosalicylsäure,
homobifunktionelle Imidoester, umfassend Disuccinimidylester, wie
z.B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylproprionat),
bifunktionelle Maleinimide, wie z.B. Bis-N-maleinimido-1,8-octan,
und Mittel, wie z.B. Methyl-3-[(pazidophenyl)dithio]proprioimidat.
-
Weitere
Modifikationen umfassen das Desamidieren von Glutaminyl- und Asparaginylresten
zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten, das Hydroxylieren
von Prolin und Lysin, das Phosphorylieren der Hydroxylgruppen von
Seryl- und Threonylresten, das Methylieren der a-Aminogruppen von
Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten [T.E. Creighton, Proteins:
Structure and Molecular Properties, 79-86, W.H. Freeman & Co., San Francisco (1983)], das
Acetylieren von N-terminalem Amin und das Amidieren von C-terminalen Carboxylgruppen.
-
Eine
weitere Art der kovalenten Modifikation des PRO1122-Polypeptids,
die Teil des Umfangs der vorliegenden Erfindung wie in den Ansprüchen definiert
ist, umfasst das Verändern
des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. "Veränderung
des nativen Glykosylierungsmusters" bezieht sich für die Zwecke hierin auf die
Deletion einer oder mehrerer Kohlenwasserstoffgruppierungen im Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid und/oder
die Hinzufügung
einer oder mehrere Glykosylierungsstellen, die im Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid
nicht vorhanden sind. Zusätzlich
dazu umfasst die Phrase qualitative Veränderungen in Bezug auf die Glykosylierung
der nativen Proteine, umfassend eine Veränderung in Bezug auf die Natur
und die Proportionen der verschiedenen vorhandenen Kohlenwasserstoffgruppierungen.
-
Die
Hinzufügung
von Glykosylierungsstellen zu PRO1122-Polypeptiden kann durch die
Veränderung der
Aminosäuresequenz
erzielt werden. Die Veränderung
kann beispielsweise durch die Hinzufügung oder Substitution eines
oder mehrerer Serin- oder Threonin-Reste im Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid
erfolgen (für
-gebundene Glykosylierungsstellen). Die PRO1122-Aminosäuresequenz
kann gegebenenfalls durch Veränderungen
auf DNA-Ebene verändert
werden, insbesondere durch die Mutation der DNA, die für das PRO1122-Polypeptid
kodiert, an vorbestimmten Basen, so dass die erzeugten Codons in
die gewünschten Aminosäuren translatieren.
-
Ein
weiteres Mittel zur Steigerung der Anzahl von Kohlenwasserstoffgruppierungen
an dem PRO1122-Polypeptid besteht in der chemischen oder enzymatischen
Bindung von Glycosiden an das Polypeptid. Solche Verfahren sind
auf dem Gebiet der Erfindung beispielsweise in
WO 87/05330 , veröffentlicht am 11. September
1987, und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306
(1981), beschrieben.
-
Die
Entfernung der an dem PRO1122-Polypeptid vorhandenen Kohlenwasserstoffgruppierungen
kann chemisch oder enzymatisch oder mittels Mutationssubstitution
von Codons erfolgen, die für
Aminosäurereste kodieren,
die als Glykosylierungsziele dienen. Chemische Deglykosylierungsverfahren
sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und beispielsweise in
Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 258, 52 (1987), und Edge
et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Die enzymatische
Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen an Polypeptiden kann unter
Einsatz verschiedener Endo- und Exo-Glykosidasen wie von Thotakura et
al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben erfolgen.
-
-
PRO1122-Polypeptide
können
auch so modifiziert werden, dass sie chimäre Moleküle bilden, die ein PRO1122-Polypeptid
umfassen, das an ein anderes heterologes Polypeptid oder eine andere
heterologe Aminosäuresequenz
fusioniert ist. In einer Ausführungsform
umfasst ein solches chimäres
Molekül
eine Fusion eines PRO1122-Polypeptids mit einem markierten Polypeptid,
das ein Epitop bereitstellt, an das ein Anti-Markierungs-Antikörper selektiv
binden kann. Die Epitop-Markierung wird im Allgemeinen am Amino-
oder Carboxy-Terminus des PRO1122-Polypeptids angeordnet. Die Gegenwart
solcher Epitop-markierter Formen eines PRO1122-Polypeptids kann unter Einsatz eines
Antikörpers
gegen das Markierungspolypeptid nachgewiesen werden. Das Bereitstellen
einer Epitop-Markierung ermöglicht
auch, dass das PRO1122-Polypeptid rasch mittels Affinitätsreinigung
unter Einsatz eines Anti-Markierungs-Antikörpers oder eines anderen Affinitätsmatrix-Typs,
der an die Epitop-Markierung bindet, gereinigt wird.
-
Verschiedene
Markierungspolypeptide und die entsprechenden Antikörper sind
auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispiele umfassen Polyhistidin-
(poly-his-) oder Polyhistidinglycin-(poly-his-gly-) Markierungen;
das flu-HA-Markierungspolypeptid und seinen Antikörper 12CA5
[Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159-2165 (1988)]; die c-myc-Markierung
und die 8F9-, 3C7-, 6E10-, G4-, B7- und 9E10-Antikörper dazu
[E-van et al., Molecular
and Cellular Biology 5, 3610-3616 (1985)] sowie die Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein-D-
(gD-) Markierung und seinen Antikörper [Paborsky et al., Protein
Engineering 3 (6), 547-553 (1990)]. Weitere Markierungspolypeptide
umfassen Flag-Peptide [Hopp et al., BioTechnology 6, 1204-1210 (1988)];
das KT3- Epitop-Peptid
[Martin et al., Science 255, 192-194 (1992)]; ein α-Tubulin-Epitop-Peptid [Skinner et
al., J. Biol. Chem. 266, 15163-15166 (1991)] und die T7-Gen-10-Protein-Peptidmarkierung
[Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393-6397
(1990)].
-
In
einer alternativen Ausführungsform
kann das chimäre
Molekül
eine Fusion eines PRO1122-Polypeptids mit einem Immunglobulin oder
einer bestimmten Region eines Immunglobulins umfassen. Für eine bivalente
Form des chimären
Moleküls
könnte
eine solche Fusion an die Fc-Region eines IgG-Moleküls erfolgen. Die
Ig-Fusionen umfassen vorzugsweise die Substitution einer löslichen
Transmembrandomäne
(deletierte oder inaktivierte Form) eines PRO1122-Polypeptids anstelle
zumindest einer variablen Region in einem Ig-Molekül. In einer
besonders bevorzugten Ausführungsform
umfasst die Immunglobulinfusion die Gelenks-, CH2- und CH3-, oder
die Gelenks-, CH1-, CH2- und CH3-, Regionen eines IgG1-Moleküls. Zur
Herstellung von Immunglobulinfusionen siehe auch
US-Patent Nr. 5.428.130 , ausgegeben
am 27. Juni 1995.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
können
die PRO1122-Polypeptide auch zur Bildung eines chimären Moleküls modifiziert
werden, das ein an einen Leucin-Zipper fusioniertes PRO1122-Polypeptid
umfasst. Verschiedene Leucin-Zipper-Polypeptide wurden bereits auf
dem Gebiet der Erfindung beschrieben. Siehe z.B. Landschulz et al.,
Science 240, 1759 (1988);
WO
94/10308 ; Hoppe et al., FEBS Letters 344, 1991 (1994); Maniatis
et al., Nature 341, 24 (1989). Es wird angenommen, dass der Einsatz
eines an ein PRO1122-Polypeptid fusionierten Leucin-Zippers erwünscht sein
könnte,
um das Dimerisieren oder Trimerisieren eines löslichen PRO1122-Polypeptids in Lösung zu
unterstützen.
Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ist klar, dass der Leucin-Zipper
an den N- oder C-Terminus des PRO1122-Moleküls fusioniert werden kann.
-
D. Herstellung von PRO1122
-
Die
untenstehende Beschreibung betrifft hauptsächlich die Herstellung von
PRO1122 durch das Kultivieren von Zellen, die mit einem Vektor,
der für
PRO1122-Polypeptid kodierende Nucleinsäure enthält, transformiert oder transfiziert
wurden. Selbstverständlich
wird in Betracht gezogen, dass alternative Verfahren, die auf dem
Gebiet der Erfindung bekannt sind, zur Herstellung von PRO1122-Polypeptiden
eingesetzt werden können.
Beispielsweise kann die PRO1122-Sequenz oder Teile davon mittels
direkter Peptidsynthese unter Einsatz von Festphasenverfahren hergestellt
werden [siehe z.B. Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H.
Freeman & Co.,
San Francisco, Calif. (1969); J. Merrifield, Am. Chem. Soc. 85,
2149-2154 (1963)]. In-vitro-Proteinsynthese kann unter Einsatz von
manuellen Verfahren oder automatisch erfolgen. Die automatische Synthese
kann beispielsweise unter Einsatz eines Peptidsynthesegeräts von Applied
Biosystems (Foster City, Calif.) gemäß den Angaben des Herstellers
erfolgen. Verschiedene Teile von PRO1122-Polypeptiden können getrennt
voneinander chemisch synthetisiert werden und unter Einsatz von
chemischen oder enzymatischen Verfahren kombiniert werden, um ein
PRO1122-Polypeptid
voller Länge
herzustellen.
-
1. Isolation von für PRO1122 kodierender DNA
-
DNA,
die für
ein PRO1122-Polypeptid kodiert, kann aus einer cDNA-Bibliothek erhalten
werden, die aus Gewebe hergestellt wird, von dem man annimmt, dass
es die PRO1122-mRNA aufweist und diese in nachweisbarem Maß exprimiert.
Dementsprechend kann DNA, die für
menschliches PRO1122 kodiert, einfach, wie in den Beispielen beschrieben,
aus einer cDNA-Bibliothek aus menschlichem Gewebe erhalten werden.
Das für
PRO1122 kodierende Gen kann auch aus einer Genom-Bibliothek oder durch bekannte synthetische
Verfahren (z.B. automatische Syntheseverfahren, Oligonucleotidsynthese)
erhalten werden.
-
Bibliotheken
können
mit Sonden (wie z.B. Antikörpern
gegen ein PRO1122-Polypeptid
oder Oligonucleotiden mit zumindest etwa 20-80 Basen) gescreent
wer den, die so gestaltet sind, dass sie das Gen von Interesse oder
das durch dieses kodierte Protein identifizieren. Das Screenen der
cDNA- oder Genom-Bibliothek mit der gewählten Sonde kann unter Einsatz
von Standardverfahren erfolgen, wie z.B. in Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press,
New York (1989), beschrieben. Ein alternatives Mittel zur Isolation
der Gene ist der Einsatz des PCR-Verfahrens [Sambrook et al., s.o.;
Dieffenbach et al., PCR-Primer: A Laborstory Manual, Cold Spring
Harbor Laborstory Press (1995)].
-
Die
untenstehenden Beispiele beschreiben Verfahren zum Screenen einer
cDNA-Bibliothek.
Die als Sonden ausgewählten
Oligonucleotidsequenzen sollten ausreichend lang und ausreichend
eindeutig sein, um falsche positive Ergebnisse zu minimieren. Das
Oligonucleotid ist vorzugsweise so markiert, dass es bei der Hybridisierung
an DNA in der gescreenten Bibliothek nachgewiesen werden kann. Verfahren
zur Markierung sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen
den Einsatz von radioaktiven Markierungen, wie z.B. 32P-markiertem
ATP, Biotinylieren und Enzymmarkierung. Die Hybridisierungsbedingungen,
umfassend gemäßigt- und
hochstringente Bedingungen, werden in Sambrook et al., s.o., bereitgestellt.
-
Die
durch solche Bibliothek-Screeningverfahren identifizierten Sequenzen
können
verglichen und mit anderen bekannten Sequenzen abgeglichen werden,
die in öffentlichen
Datenbanken, wie z.B. GenBank, oder anderen privaten Sequenzdatenbanken
hinterlegt und verfügbar
sind. Sequenzidentität
(auf Aminosäure-
oder Nucleotidebene) in definierten Regionen des Moleküls oder über die
volle Länge
der Sequenz kann unter Einsatz von Verfahren, die auf dem Gebiet
der Erfindung bekannt sind, und wie hierin beschrieben (z.B. durch Sequenzabgleich
unter Einsatz von Computersoftwareprogrammen, wie z.B. ALIGN, DNAstar,
BLAST, BLAST-2, INHERIT und ALIGN-2, die verschiedene Algorithmen
zur Messung der Homologie einsetzen) bestimmt werden.
-
Eine
Nucleinsäure
mit einer Sequenz, die für
Proteine kodiert, kann durch das Screenen ausgewählter cDNA- oder Genom-Bibliotheken
unter Einsatz der hierin erstmals offenbarten abgeleiteten Aminosäuresequenz
und, bei Bedarf, unter Einsatz herkömmlicher Primer-Extensionsverfahren,
wie in Sambrook et al., s.o., beschrieben, zur Detektion der Vorläufer und
Verarbeitung von mRNA-Zwischenprodukten, die möglicherweise nicht in cDNA
umkehrtranskribiert wurden, erhalten werden.
-
2. Auswahl und Transformation
von Wirtszellen
-
Wirtszellen
werden mit hierin beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren
zur Herstellung von PRO1122-Polypeptid transfiziert oder transformiert
und in herkömmlichen
Nährmedien
kultiviert, die nach Bedarf zum Induzieren von Promotoren, zur Auswahl
von Transformanten oder zum Amplifizieren von Genen, die für die gewünschten
Sequenzen kodieren, modifiziert sind. Die Kulturbedingungen, wie
z.B. Medium, Temperatur, pH und dergleichen, können durch Fachleute auf dem
Gebiet der Erfindung ohne übermäßiges Experimentieren
bestimmt werden. Im Allgemeinen sind Grundlagen, Protokolle und
praktische Verfahren zum Maximieren der Produktivität von Zellkulturen
in Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler (Hrsg.),
IRL Press (1991), und Sambrook et al., s.o., zu finden.
-
Transfektionsverfahren,
wie z.B. CaPO
4 und Elektroporation, sind
Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. In Abhängigkeit
von der verwendeten Wirtszelle erfolgt die Transformation unter
Einsatz eines Standardverfahrens, das für die entsprechenden Zellen
geeignet ist. Die Calciumbehandlung unter Einsatz von Calciumchlorid,
wie in Sambrook et al., s.o., beschrieben, oder Elektroporation
wird im Allgemeinen für Prokaryoten
oder andere Zellen eingesetzt, die deutliche Zellwandbarrieren aufweisen.
Die Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation
von bestimmten Pflanzenzellen eingesetzt, wie von Shaw et al., Gene
23, 315 (1983), und in
WO 89/05859 ,
veröffentlicht
am 29. Juni 1989, beschrieben. Für
Säugetierzellen
ohne solche Zellwände
kann das Calciumphosphatausfällungsverfahren
von Graham und van der Eb, Virology 52, 456-457 (1978), eingesetzt
werden. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellenwirtsystemtransformationen
wurden in
US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben.
Transformationen in Hefe erfolgen typischerweise gemäß dem Verfahren
von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et
al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 76, 3829 (1979). Andere Verfahren
zum Einführen
von DNA in Zellen, wie z.B. durch Kernmikroinjektion, Elektroporation,
bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen oder Polykationen,
z.B. Polybren, Polyornithin, können
jedoch auch eingesetzt werden. In Bezug auf verschiedene Verfahren
zur Transformation von Säugetierzellen
siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527-537 (1990), und
Mansour et al., Nature 336, 348-352 (1988).
-
Geeignete
Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der Nucleinsäure (z.B.
DNA) in dem Vektor umfassen hierin prokaryotische Zellen, Hefezellen
oder höhere
eukaryotische Zellen. Geeignete Prokaryoten umfassen Eubakterien,
wie z.B. Gramnegative oder Gram-positive Organismen, wie z.B. Enterobacteriaceae, wie
z.B. E. coli, sind aber nicht auf diese beschränkt. Verschiedene E.-coli-Stämme sind
allgemein verfügbar, wie
z.B. der E.-coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC
31.537); E.-coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325) und K5 772 (ATCC 53.635).
Andere geeignete prokaryotische Wirtszellen umfassen Enterobacteriacea,
wie z.B. Escherichia, z.B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella,
Proteus, Salmonella, z.B. Salmonella typhimurium, Serratia, z.B.
Serratia marcescans, und Shigella sowie Bacilli, wie z.B. B. subtilis
und B. licheniformis (z.B. B. licheniformis 41P, offenbart in DD
266.710, veröffentlicht
am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z.B. P. aeruginosa, und Streptomyces.
Diese Beispiele dienen der Veranschaulichung und sind nicht einschränkend. Stamm
W3110 ist ein besonders bevorzugter Wirt oder Elternwirt, da er
ein verbreiteter Wirtsstamm für
die Fermentation von rekombinanten DNA-Produkten ist. Vorzugsweise
sekretiert die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen Enzymen.
Stamm W3110 kann beispielsweise modifiziert werden, um eine genetische
Mutation in den Genen zu bewirken, die für in Bezug auf den Wirt endogene
Proteine kodieren, wobei Beispiele für solche Wirte den E.-coli-W3110-Stamm 1A2, der den
vollständigen
Genotyp tonA aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 9E4, der den vollständigen Genotyp
tonA ptr3 aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 27C7 (ATCC 55.244), der
den vollsgtändigen
Genotyp tonA, ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan
r aufweist; E.-coli-W3110-Stamm
4084, der Stamm 37D6 mit einer nicht-Kanamycin-resistenten degP-Deletionsmutation ist,
und einen E.-coli-Stamm umfassen, der mutierte periplasmatische
Protease aufweist, wie in
US-Patent Nr.4.946.783 ,
ausgegeben am 7. August 1990, offenbart. Alternativ dazu sind In-vivo-Klonierungsverfahren, wie
z.B. PCR oder andere Nucleinsäure-Polymerase-Reaktionen, geeignet.
-
Zusätzlich zu
Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben, wie z.B. fädige Pilze
oder Hefe, als Klonierungs- oder Expressionswirte für PRO1122-kodierende
Vektoren geeignet. Saccharomyces cerevisiae ist ein herkömmlicherweise
eingesetzter niederer eukaryotischer Wirtsorganismus. Weitere umfassen
Schizosaccharomyces pombe (Beach und Nature, Nature 290, 140 (1981);
EP 139.383 , veröffentlicht
am 2. Mai 1995); Kluyveromyces-Wirte (
US-Patent
Nr. 4.943.529 ; Fleer et al., Bio/Technology 9, 968-975
(1991)), wie z.B. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt
et al., J. Bacteriol. 737 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K.
bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii
(ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), Van den Berg et al.,
Bio/Technology 8, 135 (1990); K. thermotolerans und K. marxianus;
Yarrowia (
EP 402.226 );
Pichia pastoris (
EP 183.070 );
Sreekishna et al., J. basic Microbiol. 28, 265-278 (1988); Candid;
Trichoderma reesia (
EP 244.234 );
Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5359-5263 (1979));
Schwanniomyces, wie z.B. Schwanniomyces occidentalis (
EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990);
und fädige
Pilze wie z.B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (
WO 91/00357 , veröffentlicht am 10. Jänner 1991)
und Aspergillus-Wirte, wie z.B. A. nidulans (Balance et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 112, 284-289 (1983); Tilburn et al., Gene
26, 205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 4170-1474
(1984)) und A. niger (Kelly und Hynes, EMBO J. 4, 475-479 (1985)).
Methylotrope Hefen werden aus den Gattungen Hansenula, Candida,
Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis und Rhodotorula ausgewählt. Eine
Liste spezifischer Spezies, die Beispiele dieser Hefeklasse sind,
sind in C. Antony, The Biochemistry of Methylotrophs 269 (1982),
zu finden.
-
Geeignete
Wirtszellen zur Expression von glykosyliertem PRO1122 stammen von
multizellulären
Organismen. Beispiele für
Wirbellosenzellen umfassen Insektenzellen, wie z.B. Drosohpila S2
und Spodoptera Sf9, Spodoptera high5, sowie Pflanzenzellen. Beispiele
für nützliche
Säugetierwirtszelllinien
umfassen Chinahamster- Eierstockzellen
(CHO-Zellen) und COS-Zellen. Spezifischere Beispiele umfassen die
durch SV40 transformierte Affennieren-CV1-Zelllinie (COS-7, ATCC
CRL 1651); die menschliche Embryonierenzelllinie (293- oder 293-Zellen,
die zum Wachstum in Suspensionskultur subkloniert wurden, Graham
et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR
(CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980));
Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243-251 (1980)); menschliche
Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2,
HB 8065) und Mammatumorzellen der Maus (MMT 060562, ATCC CCL51).
Die Auswahl von geeigneten Wirtszellen wird als auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt erachtet.
-
3. Auswahl und Verwendung
eines replizierbaren Vektors
-
Die
Nucleinsäure
(z.B. cDNA oder genomische DNA), die für das gewünschte PRO1122-Polypeptid kodiert,
kann zum Klonieren (Amplifizieren der DNA) oder zur Expression in
einen replizierbaren Vektor insertiert werden. Verschiedene Vektoren
sind allgemein verfügbar.
Der Vektor kann beispielsweise in Form eines Plasmids, Cosmids,
Viruspartikels oder Phagen vorliegen. Die geeignete Nucleinsäuresequenz
kann durch verschiedene Verfahren in den Vektor insertiert werden.
Im Allgemeinen wird DNA an (einer) geeigneten Restriktionsendonuclease-Stelle(n)
unter Einsatz von Verfahren insertiert, die auf dem Gebiet der Erfindung
bekannt sind. Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen eine oder
mehrere Signalsequenzen, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere
Markergene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz,
sind aber nicht auf diese beschränkt.
Die Konstruktion von geeigneten Vektoren, die eine oder mehrere
dieser Komponenten enthalten, erfolgt unter Einsatz von Standard-Ligationsverfahren,
die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.
-
Das
PRO1122-Polypeptid kann nicht nur direkt rekombinant produziert
werden, sondern auch als Fusionspolypeptid mit einem heterologen
Polypeptid, das eine Signalsequenz sein kann, oder einem anderen
Polypeptid mit einer spezifischen Spaltungsstelle am N-Terminus
des reifen Proteins oder Polypeptids. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz
eine Komponente des Vektors sein oder ein Teil der PRO1122-kodierenden DNA,
die in den Vektor insertiert wird. Die Signalsequenz kann eine prokaryotische
Signalsequenz sein, die beispielsweise aus der aus alkalischen Phosphatase-,
Penicillinase-, Ipp- oder hitzestabilen Enterotoxin-II-Leadern bestehenden
Gruppe ausgewählt
ist. Zur Hefe-Sekretion kann es sich bei der Signalsequenz z.B.
um Hefe-Invertase-Leader, α-Faktor-Leader
(umfassend Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktor-Leader, wobei Letztere
in
US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben
werden) oder saure-Phosphatase-Leader, den C.-albicans-Glucoamylase-Leader
(
EP 362.179 , veröffentlicht
am 4. April 1990) oder das in
WO
90/13646 , veröffentlicht
am 15. November 1990, beschriebene Signal handeln. Bei der Säugetierzellexpression
können die
Säugetiersignalssequenzen
zur direkten Sekretion des Proteins, wie z.B. Signalsequenzen von
sekretierten Polypeptiden derselben oder einer verwandten Spezies,
sowie virale Sekretionsleader eingesetzt werden.
-
Expressions-
und Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor
ermöglicht,
sich in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren.
Solche Sequenzen sind für zahlreiche
Bakterien, Hefe und Viren bekannt. Der Ursprung der Replikation
des Plasmids pBR322 ist für
die meisten Gramnegativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmidursprung
ist für
Hefe geeignet, und verschiedene Virusursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus,
VSV oder BPV) sind für
Klonierungsvektoren in Säugetierzellen geeignet.
-
Expressions-
und Klonierungsvektoren umfassen typischerweise ein Selektionsgen,
das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Typische Selektionsgene
kodieren für
Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen
Toxinen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin,
verleihen, (b) auxotrophe Mängel
ergänzen
oder (c) wesentliche Nährstoffe
liefern, die aus komplexen Medien nicht verfügbar sind, z.B. das Gen, das
für D-Alanin-Racemase
für Bacilli
kodiert.
-
Beispiele
für geeignete
selektierbare Marker für
Säugetierzellen
sind jene, die die Identifikation von Zellen ermöglichen, die in der Lage sind,
die PRO1122-kodierende Nucleinsäure
aufzunehmen, wie z.B. DHFR oder Thymidinkinase. Eine geeignete Wirtszelle
bei Verwendung von Wildtyp-DHFR ist die CHO-Zelllinie, die mangelhafte
DHFR-Aktivität
aufweist und wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77,
4216 (1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wird. Ein geeignetes
Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trpl-Gen, das in dem
Hefeplasmid Yrp7 vorhanden ist [Stinchcomb et al., Nature 282, 39
(1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene
10, 157 (1980)]. Das trpl-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen
mutierten Hefestamm bereit, der nicht in der Lage ist, in Tryptophan
zu wachsen, wie z.B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 [Jones, Genetics
85, 12 (1977)].
-
Expressions-
und Klonierungsvektoren enthalten gewöhnlicherweise einen Promotor,
der operabel mit der PRO1122-kodierenden Nucleinsäuresequenz
verbunden ist, um die mRNA-Synthese zu steuern. Promotoren, die
von einer Reihe von potenziellen Wirtszellen erkannt werden, sind
bekannt. Promotoren, die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten
geeignet sind, umfassen die β-Lactamase-
und Lactose-Promotor-Systeme
[Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281,
544 (1979)], alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp-) Promotorsystem
[Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980);
EP 36.776 ] und Hybridpromotoren, wie
z.B. der tac-Promotor [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
80, 21-25 (1983)]. Promotoren zur Verwendung in Bakteriensystemen
enthalten auch eine Shine-Dalgarno(S.D.-) Sequenz, die operabel
mit der DNA verbunden ist, die für
das PRO1122-Polypeptid
kodiert.
-
Beispiele
für geeignete
Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren
für 3-Phosphoglyceratkinase
[Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)] oder andere glykolytische Enzyme
[Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry
17, 4900 (1978)], wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase,
Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase,
3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase,
Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
-
Weitere
Hefe-Promotoren, bei denen es sich um induzierbare Promotoren handelt,
die den zusätzlichen
Vorteil haben, dass die Transkription durch die Wachstumsbedingungen
gesteuert wird, sind die Promotor-Regionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom
C, Saure Phosphatase, Abbauenzyme in Zusammenhang mit dem Stickstoffstoffwechsel,
Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme,
die für
die Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete
Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefe-Expression sind
weiters in
EP 73.657 beschrieben.
-
PRO1122-Transkription
aus Vektoren in Säugetierwirtszellen
wird beispielsweise von Promotoren gesteuert, die aus den Genomen
von Viren, wie z.B. Polyoma-Virus, Geflügelpockenvirus (
UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989),
Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), Rinderpapillomavirus, Vogelsarkomvirus,
Cytomegalievirus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und Simian-Virus-40
(SV40), aus heterologen Säugetierpromotoren,
z.B. dem Actin-Promotor oder einem Immunglobulin-Promotor, und aus
Hitzeschock-Promotoren erhalten, vorausgesetzt, dass diese Promotoren
mit dem Wirtszellensystem verträglich
sind.
-
Die
Transkription von DNA, die für
PRO1122-Polypeptid kodiert, durch höhere Eukaryoten kann durch das
Insertieren einer Enhancer-Sequenz in den Vektor gesteigert werden.
Enhancer sind cis-wirkende DNA-Elemente, gewöhnlicherweise in einer Größe von etwa
10 bis 300 bp, die auf einen Promotor wirken, um dessen Transkription
zu steigern. Viele Enhancer-Sequenzen sind aus Säugetiergenen bekannt (Globin,
Elastase, Albumin, α-Fetoprotein
und Insulin). Typischerweise wird jedoch ein Enhancer von einem
eukaryotischen Virus eingesetzt. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer
auf der späten
Seite des Replikationsursprungs (bp 100-270), den frühen Cytomegalievirus-Promotor-Enhancer,
den Polyoma-Enhancer auf der späten
Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer. Die Enhancer
können
in den Vektor an Position 5' oder
3' der PRO1122-Kodierungssequenz
gespleißt
werden, befinden sich aber vorzugsweise an der 5'-Stelle vom Promotor.
-
Die
in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-,
Tier-, menschlichen oder kernhaltigen Zellen anderer multizellulärer Organismen)
verwendeten Vektoren enthalten auch Sequenzen, die für die Beendigung
der Transkription und die Stabilisierung der mRNA erforderlich sind.
Solche Sequenzen sind allgemein aus den nicht translatierten 5'-, und gelegentlich
3'-, Regionen von
eukaryotischer oder viraler DNA oder cDNA erhältlich. Diese Regionen enthalten
Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im nicht translatierten
Teil der mRNA, die für
PRO1122 kodiert, transkribiert werden.
-
Weitere
Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die für die Anpassung an die Synthese
von PRO1122-Polypeptiden in rekombinanten Wirbeltierzellkulturen
geeignet sind, werden in Gething et al., Nature 293, 620-625 (1981);
Mantei et al., Nature 281, 40-46(1979);
EP 117.060 und
EP 117.058 beschrieben.
-
4. Nachweis von Genamplifikation/-expression
-
Genamplifikation
und/oder -expression können
direkt in einer Probe gemessen werden, beispielsweise durch herkömmliches
Southern-Blotting, Northern-Blotting, um die Transkription von mRNA
mengenmäßig zu bestimmen
(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205 (1980)), Dot-Blotting
(DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisieren
unter Einsatz einer angemessen markierten Sonde basierend auf den
hierin bereitgestellten Sequenzen. Alternativ dazu können Antikörper eingesetzt
werden, die spezifische Duplexe erkennen können, wie z.B. DNA-Duplexe,
RNA-Duplexe und
DNA-RNA-Hybridduplexe oder DNA-Protein-Duplexe. Die Antikörper können wiederum
markiert sein, und der Test kann erfolgen, wenn der Duplex an eine
Oberfläche
gebunden ist, so dass bei Bildung des Duplexes an der Oberfläche die
Gegenwart des an den Duplex gebundenen Antikörpers nachgewiesen werden kann.
-
Genexpression
kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren, wie z.B. immunohistochemisches
Färben
von Zellen oder Gewebeteilen und Testen von Zellkulturen oder Körperflüssigkeiten,
erfolgen, um die Expression des Genprodukts direkt mengenmäßig zu bestimmen.
Antikörper,
die für
immunohistochemisches Färben
und/oder das Testen von Probeflüssigkeiten
nützlich
sind, können
monoklonal oder polyklonal sein und in einem Säugetier hergestellt werden.
Die Antikörper
können
auf geeignete Weise gegen ein Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid oder
ein synthetisches Peptid basierend auf den hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen
oder gegen eine exogene Sequenz, die an PRO1122-kodierende DNA fusioniert
ist und für ein
spezifisches Antikörper-Epitop
kodiert, hergestellt werden.
-
5. Reinigung des Polypeptids
-
Formen
von PRO1122 können
aus dem Kulturmedium oder aus Wirtszelllysaten gewonnen werden. Wenn
sie Membran-gebunden sind, können
sie unter Einsatz einer geeigneten Detergenslösung (z.B. Triton-X 100) oder
durch enzymatische Spaltung von der Membran freigesetzt werden.
Zellen, die zur Expression von PRO1122-Polypeptiden eingesetzt werden, können durch
verschiedene physikalische oder chemische Mittel, wie z.B. Gefrier-Auftau-Zyklen,
Beschallung, mechanischen Aufschluss oder Zelllysiermittel, aufgeschlossen werden.
-
Es
kann wünschenswert
sein, PRO1122 aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden
zu reinigen. Die folgenden Verfahren sind Beispiele für geeignete
Reinigungsverfahren: durch Fraktionieren auf einer Ionenaustausch-Säule; Ethanolausfällen; Umkehrphasen-HPLC;
Chromatographie auf Siliciumdioxid oder auf einem Kationenaustauschharz,
wie z.B. DEAE; Chromatofokussieren; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatausfällen; Gelfiltration
unter Einsatz von z.B. Sephadex G-75; Protein-A-Sepharose-Säulen zur Entfernung von Verunreinigungen,
wie z.B. IgG; und Metallchelatorsäulen zur Bindung von Epitop-markierten
Formen von PRO1122-Polypeptid. Verschiedene Verfahren zur Proteinreinigung
können
eingesetzt werden, und solche Verfahren sind auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt und beispielsweise in Deutscher, Methods in Enzymology
182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice,
Springer Verlag, New York (1982), beschrieben. Der gewählte Reinigungsschritt/die
gewählten
Reinigungsschritte hängen
beispielsweise von der Natur des eingesetzten Herstellungsverfahrens
und dem speziellen PRO1122-Polypeptid, das hergestellt wird, ab.
-
E. Verwendungen für PRO1122
-
Nucleotidsequenzen
(oder deren Komplement), die für
PRO1122-Polypeptide kodieren, können
auf dem Gebiet der Molekularbiologie vielfältig angewandt werden, wie
z.B. als Hybridisierungssonden, bei der Kartierung von Chromosomen
und Genen und zur Herstellung von Antisense-RNA oder -DNA. PRO1122-kodierende
Nucleinsäure
ist auch zur Herstellung von PRO1122-Polypeptiden durch die hierin
beschriebenen Rekombinationsverfahren nützlich.
-
Die
DNA62377-1381-1-Nucleotidsequenz voller Länge (Seq.-ID Nr. 4) oder die
native PRO1122-Nucleotid-kodierende Sequenz voller Länge oder
Teile davon können
als Hybridisierungssonden für
eine cDNA-Bibliothek eingesetzt werden, um PRO1122-Gen oder andere Gene
zu isolieren (z.B. die, die für
natürlich
vorkommende Varianten von PRO1122 oder Entsprechungen von anderen
Spezies kodieren), die eine gewünschte
Sequenzidentität
mit der in 4 offenbarten PRO1122-Nucleotidsequenz
(Seq.-ID Nr. 4) aufweisen. Fakultativ beträgt die Länge der Sonden etwa 20 bis
50 Basen. Die Hybridisierungssonden können von der DNA62377-1381-1-Nucleotidsequenz
aus Seq.-ID Nr. 4, wie in 4 dargestellt,
oder von Genomsequenzen, wie z.B. Promotoren, Enhancer-Elementen
und Introns, der für
Nativsequenz-PRO1122 kodierenden DNA stammen. Ein Screening-Verfahren
umfasst beispielsweise das Isolieren der kodierenden Region des PRO1122-Gens
unter Einsatz der bekannten DNA-Sequenz zum Synthetisieren einer
ausgewählten
Sonde mit etwa 40 Basen. Hybridisierungssonden können durch verschiedene Markierungen
markiert werden, wie z.B. durch Radionucleotide, wie z.B. 32P oder 35S, oder
Enzymmarkierungen, wie z.B. alkalische Phosphatase, die mittels
Avidin/Biotin-Verbindungssystemen
an die Sonde gebunden ist. Markierte Sonden, die eine zu der des
PRO1122-Gens der vorliegenden Erfindung komplementäre Sequenz
aufweisen, können
zum Screenen von Bibliotheken von menschlicher cDNA, genomischer
DNA oder mRNA eingesetzt werden, um zu bestimmen, an welche Elemente
dieser Bibliotheken die Sonde hybridisiert. Hybridisierungsverfahren
werden in den untenstehenden Beispielen detaillierter beschrieben.
-
Eine
beliebige EST-Sequenz (oder ein Fragment davon), die in der vorliegenden
Anmeldung offenbart wird, kann auf ähnliche Weise unter Verwendung
der hierin offenbarten Verfahren als Sonde eingesetzt werden.
-
Weitere
nützliche
Fragmente von PRO1122-Nucleinsäuren
umfassen Antisense- oder Sense-Oligonucleotide, die eine einsträngige Nucleinsäuresequenz
(RNA oder DNA) umfassen, die in der Lage ist, an die Ziel-PRO1122-mRNA
(Sense) der PRO1122-DNA-(Antisense) Sequenzen zu binden. Antisense-
oder Sense-Oligonucleotide
umfassen gemäß der vorliegenden
Erfindung ein Fragment der kodierenden Region von PRO1122-DNA. Ein
solches Fragment umfasst im Allgemeinen etwa 14 Nucleotide, vorzugsweise
etwa 14 bis 30 Nucleotide. Die Fähigkeit,
ein Antisense- oder Sense-Nucleotid basierend auf einer cDNA-Sequenz,
die für ein
bestimmtes Protein kodiert, abzuleiten, wird beispielsweise in Stein
und Cohen, Cancer Res. 48, 2659 (1988), und van der Krol et al.,
BioTechniques 6, 958 (1988), beschrieben.
-
Die
Bindung von Antisense- oder Sense-Oligonucleotiden an Zielnucleinsäuresequenzen
führt zur
Bildung von Duplexen, die die Transkription oder Translation der
Zielsequenz durch ein oder mehrere Mittel blockieren, wie z.B. durch
verstärkten
Abbau der Duplexe, verfrühte
Beendigung von Transkription oder Translation oder durch andere
Mittel. Die Antisense-Oligonucleotide können demnach eingesetzt werden,
um die Expression von PRO11122-Proteinen zu blockieren. Antisense-
oder Sense-Oligonucleotide umfassen weiters Oligonucleotide mit
modifizierten Zucker-Phosphodiester-Gerüsten (oder
anderen Zuckerbindungen, wie z.B. die in
WO 91/06629 beschriebenen), in denen
solche Zuckerbindungen endogenen Nucleasen gegenüber resistent sind. Solche
Oligonucleotide mit resistenten Zuckerbindungen sind in vivo stabil
(d.h. in der Lage, gegenüber
enzymatischem Abbau zu bestehen), weisen aber weiterhin Sequenzspezifität auf, um
in der Lage zu sein, an die Zielnucleotidsequenzen zu binden.
-
Weitere
Beispiele für
Sense- oder Antisense-Oligonucleotide umfassen jene Oligonucleotide,
die kovalent an organische Gruppierungen gebunden sind, wie z.B.
die in
WO 90/10048 beschriebenen,
sowie an andere Gruppierungen, die die Affinität des Oligonucleotids in Bezug
auf eine Zielnucleinsäuresequenz
steigern, wie z.B. Poly-L-Lysin.
Weiters können
interkalierende Mittel, wie z.B. Ellipticin, und Alkylierungsmittel oder
Metallkomplexe an die Sense- oder Antisense-Oligonucleotide gebunden
sein, um die Bindungsspezifitäten
dieser Antisense- oder Sense-Oligonucleotide in Bezug auf die Zielnucleotidsequenz
zu modifizieren.
-
Antisense-
oder Sense-Oligonucleotide können
durch ein beliebiges Gen-Übertragungsverfahren,
wie z.B. CaPO
4-vermittelte DNA-Transfektion,
Elektroporation oder unter Einsatz von Gen-Transfervektoren, wie z.B.
des Epstein-Barr-Virus, in eine Zelle eingeführt werden, die die Zielnucleinsäuresequenz
enthält.
Bei einem bevorzugten Verfahren wird ein Antisense- oder Sense-Oligonucleotid
in einen geeigneten retroviralen Vektor insertiert. Eine Zelle,
die die Zielnucleinsäuresequenz
enthält,
wird mit dem rekombinanten retroviralen Vektor, in vivo oder ex
vivo, kontaktiert. Geeignete retrovirale Vektoren umfassen die von
den Maus-Retroviren M-MuLV, N2 (ein von M-MuLV abgeleitetes Retrovirus)
abgeleiteten Vektoren oder die als CDT5A, DCT5B und DCT5C bezeichneten
Doppelkopievektoren (siehe
WO
90/13641 ), sind jedoch nicht darauf beschränkt.
-
Sense-
oder Antisense-Oligonucleotide können
auch durch Bildung eines Konjugats mit einem Liganden-Bindungsmolekül, wie in
WO 91/04753 beschrieben,
in eine Zelle eingeführt
werden, die die Zielnucleotidsequenz enthält. Geeignete Liganden-Bindungsmoleküle umfassen
Zelloberflächenrezeptoren,
Wachstumsfaktoren, andere Cytokine oder andere Liganden, die an
Zelloberflächenrezeptoren
binden, sind aber nicht auf diese beschränkt. Vorzugsweise beeinträchtigt die
Konjugation mit dem Ligand-Bindungsmolekül die Fähigkeit des Liganden-Bindungsmoleküls, an das
entsprechende Molekül
oder den entsprechenden Rezeptor zu binden oder das Eindrin gen des
Sense- oder Antisense-Oligonucleotids oder dessen konjugierter Version
in die Zelle zu blockieren, nicht wesentlich.
-
Alternativ
dazu kann ein Sense- oder Antisense-Oligonucleotid durch Bildung
eines Oligonucleotid-Lipid-Komplexes in eine Zelle, die die Zielnucleinsäuresequenz
enthält,
eingeführt
werden, wie in
WO 90/10448 beschrieben.
Der Sense- oder Antisense-Olignucleotid-Lipid-Komplex wird in der
Zelle vorzugsweise durch eine endogene Lipase dissoziiert.
-
Die
Sonden können
auch in PCR-Verfahren zur Erzeugung eines Sequenz-Pools zur Identifikation
von nahe verwandten PRO1122-Sequenzen eingesetzt werden.
-
Nucleotidsequenzen,
die für
ein PRO1122-Polypeptid kodieren, können auch zur Konstruktion
von Hybridisierungssonden zum Kartieren des Gens, das für das PRO1122-Polypeptid
kodiert, sowie für
die genetische Analyse von Individuen mit genetischen Störungen eingesetzt
werden. Die hierin bereitgestellte Nucleotidsequenz kann unter Einsatz
von bekannten Verfahren, wie z.B. In-situ-Hybridisieren, Bindungsanalyse
in Bezug auf bekannte chromosomale Marker und Hybridisierungsscreening
mit Bibliotheken, in Bezug auf Chromosome und spezifische Regionen
eines Chromosoms kartiert werden.
-
Wenn
die Kodiersequenzen für
PRO1122 für
ein Protein kodieren, das an ein anderes Protein bindet (beispielsweise
wenn PRO1122-Polypeptid als Rezeptor dient), kann das PRO1122-Polypeptid
in Tests zur Identifikation der anderen Proteine oder Moleküle, die
an der Bindungswechselwirkung beteiligt sind, eingesetzt werden.
Durch solche Verfahren können
Hemmer der Rezeptor/Liganden-Bindungswechselwirkung identifiziert
werden. Proteine, die an solchen Bindungswechselwirkungen beteiligt
sind, können
auch zum Screenen auf Peptide oder kleinmolekulare Hemmer oder Agonisten
der Bindungswechselwirkung eingesetzt werden. Das PRO1122-Rezeptor-Polypeptid
kann auch zur Isolierung von (einem) korrelativen Liganden eingesetzt
werden. Screening-Tests können
so gestaltet werden, dass sie die Leitstruktur-Verbindungen finden, die
die biologische Aktivität
von nativem PRO1122 oder einem PRO1122-Rezeptor nachahmen. Solche
Screening-Tests
umfassen auch Tests, die für
Hochdurchsatzscreening von chemischen Bibliotheken angewandt werden
können,
wodurch sie besonders zur Identifikation von kleinmolekularen potentiellen
Arzneimitteln geeignet sind. Kleine Moleküle, die in Betracht gezogen
werden, umfassen synthetische organische oder anorganische Verbindungen.
Die Tests können
in verschiedenen Formaten durchgeführt werden, z.B. als Protein-Protein-Bindungstests,
biochemische Screening-Tests, Immuntests und zellbasierte Tests,
die auf dem Gebiet der Erfindung alle hinreichend charakterisiert
sind.
-
Nucleinsäuren, die
für PRO1122-Polypeptid
kodieren, oder eine seiner modifizierten Formen können auch
eingesetzt werden, um nicht-menschliche transgene Tiere oder nicht-menschliche "Knockout"-Tiere zu erzeugen,
die wiederum für
die Entwicklung und das Screening von therapeutisch wirksamen Reagenzien nützlich sind.
Ein nicht-menschliches
transgenes Tier (z.B. eine Maus oder Ratte) ist ein Tier, das Zellen
aufweist, die ein Transgen enthalten, wobei das Transgen in das
Tier oder einen Vorfahren des Tiers in einer pränatalen, z.B. einer embryonischen,
Phase eingeführt
wurde. Ein Transgen ist eine DNA, die in das Genom einer Zelle integriert
ist, aus der sich ein transgenes Tier entwickelt. In einer Ausführungsform
kann cDNA, die für
PRO1122-Polypeptid kodiert, eingesetzt werden, um genomische DNA,
die für
PRO1122 kodiert, gemäß den etablierten
Verfahren zu klonieren, und die genomischen Sequenzen können eingesetzt
werden, um transgene Tiere zu erzeugen, die Zellen enthalten, die
DNA exprimieren, die für
PRO1122 kodiert. Verfahren zur Erzeugung transgener Tiere, insbesondere
von Tieren wie Mäusen
oder Ratten, sind auf dem Gebiet der Erfindung verbreitet und beispielsweise
in den
US-Patenten Nr. 4.736.866 und
4.870.009 beschrieben. Typischerweise
wären bestimmte
Zellen das Ziel für
die PRO1122-Transgen-Inkorporation mit Gewebe-spezifischen Enhancern.
Transgene Tiere, die eine Kopie eines Transgens umfassen, das für PRO1122
kodiert und in einer embryonalen Phase in die Keimbahn des Tiers
eingeführt
wurde, können
eingesetzt werden, um die Wirkung der gesteigerten Expression von
PRO1122-kodierender DNA zu untersuchen. Solche Tiere können als
Testtiere für
Reagenzien eingesetzt werden, von denen angenommen wird, dass sie
beispiels weise Schutz in Bezug auf pathologische Zustände in Zusammenhang
mit dessen Überexpression
verleihen. Gemäß dieser Facette
der Erfindung wird ein Tier mit dem Reagenz behandelt, und ein Auftreten
des pathologischen Zustands in geringerem Maße im Vergleich mit Tieren,
die das Transgen aufweisen, aber nicht behandelt wurden, würde auf
eine potentielle therapeutische Intervention in Bezug auf den pathologischen
Zustand hindeuten.
-
Alternativ
dazu können
nicht-menschliche Homologe von PRO1122 eingesetzt werden, um ein PRO1122"Knockout"-Tier zu erzeugen,
das aufgrund der homologen Rekombination zwischen dem PRO1122-kodierenden
endogenen Gen und der PRO1122-kodierenden veränderten genomischen DNA, die in
eine Embryozelle des Tiers eingeführt wurden, ein defektes oder
verändertes
Gen aufweist, das für PRO1122
kodiert. Beispielsweise kann PRO1122-kodierende cDNA eingesetzt
werden, um genomische DNA, die für
PRO1122 kodiert, gemäß etablierten
Verfahren zu klonieren. Ein Teil der genomischen DNA, die für PRO1122
kodiert, kann deletiert oder durch ein anderes Gen ersetzt werden,
wie z.B. durch ein Gen, das für einen
selektierbaren Marker kodiert, der eingesetzt werden kann, um die
Integration zu überwachen.
Typischerweise sind mehrere Kilobasenpaare unveränderter flankierender DNA (an
den 5'- und den
3'-Enden) Teil des
Vektors (siehe z.B. Thomas und Capecchi, Cell 51, 503 (1987), für eine Beschreibung
von homologen Rekombinationsvektoren). Der Vektor wird in eine embryonale
Stammzelllinie eingeführt
(z.B. mittels Elektroporation), und Zellen, in denen die eingeführte DNA
homolog mit der endogenen DNA rekombiniert wurde, werden ausgewählt (siehe
z.B. Li et al., Cell 69, 915 (1992)). Die ausgewählten Zellen werden dann in
eine Blastozyste eines Tiers injiziert (z.B. eine Maus oder Ratte),
um Aggregationschimären
zu bilden (siehe z.B. Bradley, in: Teratocarcinomas und Embryonic
Stem Cells: A Practical Approach, 113-152, E.J. Robertson (Hrsg.), Oxford,
Irland (1987)). Ein chimärer
Embryo kann dann in ein geeignetes pseudoträchtiges weibliches Pflegetier
implantiert werden, und der Embryo kann ausgetragen werden, um dann
ein "Knockout"-Tier zu sein. Nachkommen,
die die homogen rekombinierte DNA in ihrer Keimlinie aufweisen,
können
unter Einsatz von Standarderfahren identifiziert werden und zur
Zucht von Tieren eingesetzt werden, in denen alle Zellen die homolog rekombinierte
DNA enthalten. Knock out-Tiere können
beispielsweise in Bezug auf ihre Fähigkeit, bestimmte pathologische
Zustände
abzuwehren, und die Entwicklung pathologischer Zustände aufgrund
des Fehlens des PRO1122-Polypeptids charakterisiert werden.
-
Nucleinsäure, die
für PRO1122-Polypeptide
kodiert, kann auch in der Gentherapie eingesetzt werden. Bei Gentherapie-Anwendungen
werden Gene in Zellen eingeführt,
um eine In-vivo-Synthese des therapeutisch wirksamen Genprodukts
zu erzielen, beispielsweise um ein defektes Gen zu ersetzen. "Gentherapie" umfasst herkömmliche
Gentherapie, bei der eine andauernde Wirkung mit einer einzigen
Behandlung erzielt wird, sowie die Verabreichung von gentherapeutischen
Wirkstoffen, was die einmalige oder wiederholte Verabreichung einer
therapeutisch wirksamen DNA oder mRNA umfasst. Antisense-RNA und
-DNA können
als therapeutische Wirkstoffe zum Blockieren der Expression bestimmter
Gene in vivo eingesetzt werden. Es wurde bereits gezeigt, dass kurze
Antisense-Oligonucleotide in Zellen importiert werden können, wo
sie trotz ihrer geringen intrazellulären Konzentrationen aufgrund
ihrer beschränkten
Aufnahme durch die Zellmembran als Hemmer wirken. Zamecnik et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4143-4146 (1986). Die Oligonucleotide
können
modifiziert werden, um deren Aufnahme zu steigern, z.B. durch das
Substituieren ihrer negativ geladenen Phosphodiestergruppen durch
ungeladene Gruppen.
-
Es
stehen verschiedene Verfahren zum Einführen von Nucleinsäuren in
lebensfähige
Zellen zur Verfügung.
Die Verfahren variieren in Abhängigkeit
davon, ob die Nucleinsäure
in vitro in eine kultivierte Zelle oder in vivo in die Zellen des
gewünschten
Wirts eingeführt
werden. Verfahren, die für
den Transfer von Nucleinsäure
in Säugetierzellen
in vitro geeignet sind, umfassen den Einsatz von Liposomen, Elektroporation,
Mikroinjektion, Zellfusion, DEAE-Dextran, das Calciumphosphat-Ausfällungsverfahren
etc. Die derzeit bevorzugten Verfahren für In-vivo-Gentransfer umfassen
die Transfektion mit viralen (typischerweise retroviralen) Vektoren
und Virushüllprotein-Liposom-vermittelte
Transfektion (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11,205-210(1993)).
In manchen Situationen ist es wünschenswert,
eine Nucleinsäurequelle
mit einem Wirkstoff bereitzustellen, der auf die Zielzellen abzielt,
wie z.B. ein Antikörper,
der für
ein Zelloberflächenmembranprotein
oder die Zielzelle spezifisch ist, ein Ligand für einen Rezeptor an den Zielzellen
etc. Wenn Liposomen eingesetzt werden, können Proteine, die an ein Zelloberflächenmembranportein,
das mit Endocytose assoziiert ist, binden, zum Targeting und/oder
zur Erleichterung der Aufnahme eingesetzt werden, z.B. Kapsidproteine
oder Fragmente davon, die für
einen speziellen Zelltyp tropisch sind, Antikörper für Proteine, die beim Zyklieren
internalisiert werden, Proteine, die auf die intrazelluläre Lokalisierung
abzielen und die intrazelluläre
Halbwertszeit steigern. Das Verfahren zur Rezeptor-vermittelten
Endocytose wird beispielsweise in Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432
(1987), und Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414
(1990), beschrieben. Für
eine Übersicht über Gen-Markierung
und Gen-Therapieprotokolle siehe Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992).
-
Die
hierin beschriebenen PRO1122-Polypeptide können auch als Molekulargewicht-Marker zu Zwecken
der Proteinelektrophorese eingesetzt werden.
-
Das
Nucleinsäuremolekül, das für die PRO1122-Polypeptide
kodiert, oder hierin beschriebene Fragmente davon sind für die Chromosomenidentifikation
nützlich.
In dieser Hinsicht besteht ein dauerhafter Bedarf, neue Chromosomen-Marker
zu identifizieren, da derzeit relativ wenige Chromosom-Markierungsreagenzien
bezogen auf tatsächlichen
Sequenzdaten verfügbar
sind. Jedes PRO1122-Nucleinsäuremolekül der vorliegenden
Erfindung kann als Chromosomen-Marker eingesetzt werden.
-
Die
PRO1122-Polypeptide und Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden
Erfindung können
auch für Gewebetypisierung
eingesetzt werden, wobei die PRO1122-Polypeptide der vorliegenden Erfindung
in einem Gewebe im Vergleich mit einem anderen anders exprimiert
werden können.
PRO1122-Nucleinsäuremoleküle können auch
zur Erzeugung von Sonden für
PCR, Northern-Analyse, Southern-Analyse und Western-Analyse Anwendung
finden.
-
PRO1122-Polypeptide
der vorliegenden Erfindung, die biologische Aktivität aufweisen,
die mit der von IL-17 verwandt ist, können sowohl in vivo zu therapeutischen Zwecken
als auch in vitro eingesetzt werden. Fachleute auf dem Gebiet der
Erfindung wissen, wie die PRO1122-Polypeptide der vorliegenden Erfindung
für solche
Zwecke einzusetzen sind.
-
PRO1122
kann in Tests mit Polypeptiden, mit denen es Identität aufweist,
eingesetzt werden, um die relativen Aktivitäten zu bestimmen. Die Ergebnisse
können
dementsprechend verwendet werden.
-
Ein
Abgleich der vorhergesagten Aminosäuresequenz von IL-17B (z.B.
UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C (UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3) mit
der bekannten Sequenz von IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) zeigt, dass es
sich um eine Familie verwandter Sequenzen mit 26-28 % Aminosäureidentität zwischen
den drei Elementen handelt (7). Alle
drei Polypeptide enthalten eine hydrophobe Sequenz am N-Terminus,
von der man annimmt, dass sie als Sekretionssignalsequenz von 18-20
Aminosäuren
funktioniert, wodurch man einen vorhergesagten Größenbereich
für die
Elemente dieser Familie erhält,
der 155 bis 197 Aminosäuren
beträgt
(reifes Molekulargewicht: 17 bis 20 kDa). Der Abgleich in 7 zeigt verschiedene konservierte Aminosäuren, umfassend einen
Tryptophan-Rest und 5 Cysteine in der C-terminalen Hälfte der
Proteine.
-
Die
PRO1122-kodierende Nucleinsäure
oder Fragmente davon können
auch zur Chromosomen-Lokalisation eingesetzt werden. Die Chromosomenlokalisierung
von IL-17B (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C (UNQ561) (Seq.-ID
Nr. 3) wurde unter Einsatz von Taqman-Primern und Sonden ermittelt,
die in den nicht-translatierten 3'-Regionen
von IL-17B und IL-17C gestaltet wurden, erfolgte mittels PCR mit
einem Stanford-Radiation-Hybrid-Panel-G3-Panel. IL-17B (UNQ516)
(Seq.-ID Nr. 1) wurde in Bezug auf das menschliche Chromosom 5q32-34
kartiert, während
IL-17C (UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3) in Bezug auf Chromosom 16q24 lokalisiert
wurde. Menschliches IL-17 selbst ist auf Chromosom 2q31 zu finden.
Rouvier et al., M. Immunol. 150, 5445 (1993).
-
Durch
die Isolation und Charakterisierung der beiden neuen Verwandten
von IL-17 haben die Anmelder die potentielle Rolle dieser Familie
von Cytokinen in Bezug auf proinflammatorische Immunantworten und andere
Reaktionen festgestellt und erweitert. Die drei Elemente der Familie,
IL-17 (Seq.-ID Nr. 11), IL-17B (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C (Seq.-ID
Nr. 3), sind in Bezug auf die Primärstruktur mit insgesamt etwa
27 % Aminosäureidentität, umfassend
5 konservierte Cystein-Reste (7),
mäßig eng
verwandt. Die drei Elemente der Familie weisen alle eine Reihe von
Merkmalen auf – sie
sind alle 150-200 Aminosäurereste
lang, sie werden von Zellen über
eine hydrophobe Sekretionssignalsequenz sekretiert, und sie werden
als Homodimere mit Disulfid-Bindungen exprimiert, wobei diese in
manchen Fällen
glykosyliert scheinen.
-
Wenngleich
sie basierend auf Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit
Elemente derselben Genfamilie sind, werden die drei Proteine in
verschiedenen Geweben exprimiert und im Genom dispergiert. Es wurde
berichtet, dass die Expression von IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) nur in
aktivierten T-Zellen erfolgt – Fossiez
et al., J. Exp. Med. 183, 2593 (1996); Yao et al., J. Immunol. 155,
5483 (1995) [Yao-3], während
hierin gezeigt wird, dass IL-17B (DNA59294) (Seq.-ID Nr. 2) in normaler
menschlicher adulter Bauchspeicheldrüse, Dünndarm und Magen exprimiert
wird (8). Die Expressionsstruktur
von IL-17C (DNA62377) (Seq.-ID Nr. 4) ist jedoch viel eingeschränkter, da
bisher noch keine bestätigte
Expression in anderen Geweben entdeckt wurde.
-
Die
hierin beschriebenen Charakterisierungen zeigen, dass die biologische
Aktivität
von IL-17B (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C (UNQ561) (Seq.-ID
Nr. 3) sich deutlich von den bestätigten Aktivitäten von
IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) unterscheiden. IL-17B (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C
(UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3) rufen beide keine Induktion der IL-6-Produktion
in menschlichen Vorhaut-Fibroblasten hervor (Beispiel 10) (9A). Das steht im Gegensatz zu der für IL-17
(Seq.-ID Nr. 11) bekannten deutlichen Induktion. Yao et al., Immunity
3, 811 (1995) [Yao-1], Yao et al., J. Immunol. 155, 5483 (1995)
[Yao-3]. Umgekehrt induzieren IL-17B (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C
(Seq.-ID Nr. 3) beide die Freisetzung von TNF-α aus der monozytären Zelllinie, THP1,
während
IL-17 nur eine geringe Wirkung hat (9B).
Die stimulierte Freisetzung von TNF-α in THP1-Zellen durch IL-17B
(Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C (Seq.-ID Nr. 3) ist zeit- und konzentrationsabhängig (Beispiel
10) (10), wobei IL- 17B (Seq.-ID Nr. 1) etwa 10-mal potenter
ist als IL-17C (Seq.-ID Nr. 3) [EC50=2,4 nM
für IL-17B
vs. 25 nM für
IL-17C].
-
Die
verschiedenen biologischen Wirkungen von IL-17 (Seq.-ID Nr. 11)
im Vergleich mit IL-17B oder C (Seq.-ID Nr. 1 und 3) deuten darauf
hin, dass sie über
verschiedene Zelloberflächenrezeptoren
(oder unterschiedliche Rezeptorkomponenten) funktionieren könnten als
der bekannte IL-17-Rezeptor. Yao et al., Cytokine 9, 794 (1997)
[Yao-3]. In einer Bemühung,
die Frage der Rezeptor-Spezifität
direkt zu untersuchen, haben die Anmelder gezeigt, dass sowohl IL-17B
(Seq.-ID Nr. 1) als auch IL-17C (Seq.-ID Nr. 3) nicht in der Lage sind,
an die IL-17-Rezeptor-ECD (Seq.-ID Nr. 16) (11A)
zu binden sowie mit IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) um die Bindung an seine
Rezeptor-ECD (Seq.-ID Nr. 16) (11B)
zu konkurrieren. IL-17B (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C (Seq.-ID Nr.
3) binden an die Oberfläche
von THP1-Zellen, wo sie Aktivität
aufweisen (12). Die Wechselwirkung
ist zumindest in dem Maß spezifisch,
dass ein Kontroll-Fc-Fusionsprotein nicht in der Lage ist, an diese
Zellen zu binden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass es eine
Reihe von Rezeptoren geben könnte,
die das Signal von der Familie von IL-17-Cytokinen binden und transduzieren – ein Rezeptor/Liganden-Modell, das
für viele
Cytokin- und Wachstumsfaktor-Familien gefunden wurde.
-
Die
hierin offenbarten neuen Cytokine, PRO1031 (z.B. 516) und PRO1122
(z.B. UNQ561), unterscheiden sich in Bezug auf ihre Expressionsstruktur
und ihre biologischen Aktivitäten
von IL-17 (Seq.-ID Nr. 11). Die unterschiedliche Expression in Verbindung
mit der mangelnden Wechselwirkung mit dem bekannten IL-17-Rezeptor
deutet auf eine erweiterte Rolle der IL-17-Familie in pro-entzündlichen
Immunreaktionen hin.
-
F. Anti-PRO1122-Antikörper
-
Die
vorliegende Erfindung nutzt weiters Anti-PRO1122-Polypeptid-Antikörper. Beispielhafte
Antikörper umfassen
polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische und heterokonjugierte
Antikörper.
-
1. Polyklonale Antikörper
-
Die
Anti-PRO1122-Antikörper,
die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, können polyklonale
Antikörper
umfassen. Verfahren zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern sind
Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Polyklonale Antikörper können in
einem Säugetier,
beispielsweise durch eine oder mehrere Injektionen eines immunisierenden
Wirkstoffs und, nach Wunsch, eines Adjuvans, gezüchtet werden. Typischerweise
werden der immunisierende Wirkstoff und/oder das Adjuvans durch
mehrere subkutane oder intraperitoneale Injektionen in das Säugetier
injiziert. Der immunisierende Wirkstoff kann PRO1122-Polypeptid
oder ein Fusionsprotein davon umfassen. Es kann auch nützlich sein,
den immunisierenden Wirkstoff an ein Protein zu binden, von dem
bekannt ist, dass es in dem zu immunisierenden Säugetier immunogen ist. Beispiele
für solche
immunogene Proteine umfassen Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin,
Serumalbumin, Rinder-Thyreoglobulin und Sojabohnen-Trypsin-Hemmer,
sind aber nicht auf diese beschränkt.
Beispiele für
das Adjuvans, das eingesetzt werden kann, umfassen komplettes Freundsches
Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl Lipid A, synthetisches
Trehalose-Dicorynomycolat).
Das Immunisierungsprotokoll kann von Fachleuten auf dem Gebiet der
Erfindung ohne übermäßiges Experimentieren ausgewählt werden.
-
2. Monoklonale Antikörper
-
Die
Anti-PRO1122-Antikörper
können
alternativ dazu monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können unter
Einsatz von Hybridom-Verfahren hergestellt werden, wie z.B. durch
die von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschriebenen.
Bei einem Hybridom-Verfahren wird typischerweise eine Maus, ein
Hamster oder ein anderes geeignetes Wirtstier mit einem immunisierenden
Wirkstoff immunisiert, um Lymphozyten zu produzieren, die Antikörper, die
spezifisch an den immunisierenden Wirkstoff binden, erzeugen oder
in der Lage sind, diese zu erzeugen. Alternativ dazu können die
Lymphozyten in vitro immunisiert werden.
-
Der
immunisierende Wirkstoff umfasst typischerweise PRO1122-Polypeptid
oder ein Fusionsprotein davon. Im Allgemeinen werden periphere Blutlymphozyten
("PBL") eingesetzt, wenn
Zellen mit menschlichem Ursprung gewünscht werden, oder Milz-oder Lymphknotenzellen,
wenn nicht-menschliche Säugetierquellen gewünscht sind.
Die Lymphozyten werden dann mit einer sich unbegrenzt vermehrenden
Zelllinie unter Einsatz eines geeigneten Fusionsmittels, wie z.B.
Polyethylenglykol, zur Bildung einer Hybridomzelle fusioniert (Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103, Academic
Press (1986)). Sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind gewöhnlicherweise
transformierte Säugetierzellen,
insbesondere Myelomzellen von Nagetieren, Rindern oder menschlichen
Ursprungs. Gewöhnlicherweise
werden Ratten- oder Maus-Myelomzelllinien eingesetzt. Die Hybridomzellen
können
in einem geeigneten Nährmedium
kultiviert werden, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen
enthält,
die das Wachstum und das Überleben
der nicht fusionierten, sich unbegrenzt vermehrenden Zellen hemmen.
Wenn den Elternzellen beispielsweise das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase
(HGPRT oder HPRT) fehlt, umfasst das Nährmedium für die Hybridomen typischerweise
Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin ("HAT-Medium"), wobei diese Substanzen das Wachstum
von Zellen mit HGPRT-Mangel verhindern.
-
Bevorzugte,
sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind jene, die wirksam fusionieren,
eine stabile Expression von Antikörpern durch die ausgewählten Antikörperproduzierenden
Zellen in hohem Maß unterstützen und
in Bezug auf ein Medium, wie z.B. HAT-Medium, empfindlich sind.
Noch bevorzugtere, sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind Maus-Myelomlinien,
die beispielsweise von dem Salk Institute Cell Distribution Center,
San Diego, Kalifornien, und der American Type Culture Collection,
Rockville, Maryland, bezogen werden können. Menschliche Myelom- und
Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien wurden auch in Bezug auf die
Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern beschrieben (Kozbor,
J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody
Production Techniques and Applications, 51-63, Marcel Dekker Inc.,
New York (1987)).
-
Das
Nährmedium,
in dem die Hybridomzellen kultiviert werden, kann in Bezug auf das
Vorhandensein von gegen PRO1122-Polypeptid gerichteten monoklonalen
Antikörpern
getestet werden. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität von durch
die Hybridomzellen produzierten Antikörpern durch Immunfällung oder
durch einen Invitro-Bindungstest bestimmt, wie z.B. einen Radioimmuntest
(RIA) oder eine enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA).
Solche Verfahren und Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die
Bindungsaffinität
des monoklonalen Antikörpers
kann beispielsweise durch die Scatchard-Analyse von Munson und Pollard,
Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
-
Nach
der Identifikation der gewünschten
Hybridomzellen können
die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren
subkloniert und durch herkömmliche
Verfahren [Goding, s.o.] gezüchtet
werden. Geeignete Nährmedien
für diesen
Zweck umfassen beispielsweise Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium
und RPMI-1640-Medium. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in
vivo als Aszites in einem Säugetier
gezüchtet werden.
-
Die
durch die Subklone sekretierten monoklonalen Antikörper können isoliert
oder aus dem Nährmedium
oder der Aszitesflüssigkeit
durch herkömmliche
Immunglobulin-Reinigungsverfahren, wie z.B. Protein-A-Sepharose,
Hydroxylapatit-Chromatographie,
Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, gereinigt
werden.
-
Die
monoklonalen Antikörper
können
auch durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden, wie z.B.
durch die in US-Patent Nr. 4.816.567 beschriebenen. DNA, die für die monoklonalen
Antikörper
der vorliegenden Erfindung kodiert, kann unter Einsatz von herkömmlichen
Verfahren (z.B. unter Einsatz von Oligonucleotid-Sonden, die in der Lage sind, spezifisch
an Gene zu binden, die für
die Schwer- und Leichtketten von Maus-Antikörpern kodieren) leicht isoliert
und sequenziert werden. Die erfindungsgemäßen Hybridomzellen dienen als
bevorzugte Quelle für
diese DNA. Wenn die DNA isoliert wurde, kann sie in Expressionsvektoren platziert
werden, die dann in Wirtszellen, wie z.B. Affen-COS-Zellen, Chinahamster- Eierstockzellen
(CHO) oder Myelomzellen, die sonst kein Immunglobulinprotein produzieren,
transfiziert werden, um die Synthese von monoklonalen Antikörpern in
den rekombinanten Wirtszellen zu bewirken. Die DNA kann auch modifiziert werden,
beispielsweise durch das Substituieren der Sequenz, die für menschliche
konstante Schwer- und Leichtketten-Domänen kodiert, anstelle der homologen
Maus-Sequenzen (
US-Patent Nr. 4.816.567 ;
Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855 (1984))
oder durch die kovalente Bindung der gesamten, für ein Nicht-Immunglobulin-Peptid kodierenden Sequenz
oder eines Teils davon an die Immunglobulin-kodierende Sequenz.
Ein solches Nicht-Immunglobulin-Polypeptid kann für die konstanten
Domänen
eines Antikörpers der
Erfindung oder für
die variablen Domänen
einer Antigen-Kombinationsstelle eines erfindungsgemäßen Antikörpers substituiert
werden, um einen chimären
zweiwertigen Antikörper
zu erzeugen.
-
Die
Antikörper
können
einwertige Antikörper
sein. Verfahren zur Herstellung von einwertigen Antikörpern sind
auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Ein Verfahren umfasst beispielsweise
die rekombinante Expression von Immunglobulin-Leichtkette und modifizierter
Schwerkette. Die Schwerkette wird im Allgemeinen an einem Punkt
in der Fc-Region trunkiert, um Schwerketten-Vernetzung zu vermeiden.
Alternativ dazu werden die relevanten Cystein-Reste durch andere
Aminosäurereste
substituiert oder deletiert, um eine Vernetzung zu vermeiden.
-
In-vitro-Verfahren
sind auch zur Herstellung von einwertigen Antikörpern geeignet. Der Verdau
von Antikörpern
zur Herstellung von Fragmenten davon, insbesondere von Fab-Fragmenten,
kann unter Einsatz von Routineverfahren erfolgen, die auf dem Gebiet
der Erfindung bekannt sind.
-
3. Humanisierte Antikörper
-
Die
Anti-PRO1122-Antikörper,
die in der Erfindung eingesetzt werden, können weiters humanisierte Antikörper oder
menschliche Antikörper
umfassen. Humanisierte Formen von nicht-menschlichen (z.B. Maus-) Antikörpern sind
chimäre
Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z.B.
Fv, Fab, Fab', F(ab')2 oder andere
Antigen-bindende Subsequenzen von Antikörpern), die eine Mindestsequenz
aufweisen, die von nicht-menschlichem Immunglobulin stammt. Humanisierte
Antikörper
umfassen menschliche Immunglobuline (Empfänger-Antikörper), in denen Reste einer
komplementaritätsbestimmenden
Region (CDR) des Empfängers
durch Reste einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spender-Antikörper), wie
z.B. Maus, Ratte oder Kaninchen, mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt
wurden. In manchen Fällen
werden Fv-Rahmenreste von menschlichem Immunglobulin durch entsprechende
nicht-menschliche Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können auch
Reste umfassen, die weder in dem Empfänger-Antikörper noch in der importierten
CDR oder Rahmensequenz zu finden sind. Im Allgemeinen umfasst der
humanisierte Antikörper
im Wesentlichen die ganze von zumindest einer und typischerweise
zwei variablen Domänen,
in denen alle oder im Wesentlichen alle CDR-Regionen jenen eines
nichtmenschlichen Immunglobulins entsprechen oder alle oder im Wesentlichen
alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Consensussequenz
sind. Der humanisierte Antikörper
umfasst optimalerweise auch zumindest einen Teil einer konstanten Immunglobulin-Region
(Fc), typischerweise die eines menschlichen Immunglobulins (Jones
et al., Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332,
323-329 (1988), und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)).
-
Verfahren
zum Humanisieren von nicht-menschlichen Antikörpern sind auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen
oder mehrere Aminosäurereste
auf, die in diesen aus einer nicht-menschlichen Quelle eingeführt wurden.
Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden
oft als "Import"-Reste bezeichnet,
die typischerweise von einer variablen "Import"-Domäne
stammen. Die Humanisierung kann im Wesentlichen gemäß dem Verfahren
von Winter und seinen Mitarbeitern erfolgen (Jones et al., Nature
321, 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323-327 (1988);
Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)), indem Nagetier-CDR oder
-CDR-Sequenzen für
die entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers substituiert
werden. Dementsprechend handelt es sich bei solchen "humanisierten" Antikörpern um
chimäre
Antikörper
(
US-Patent Nr. 4.816.567 ), worin
im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch
die entsprechende Sequenz einer nicht-menschlichen Spezies substituiert
wurde. In der Praxis handelt es sich bei humanisierten Antikörpern typischerweise
um menschliche Antikörper,
in denen einige CDR-Reste und möglicherweise
einige FR-Reste durch Reste von analogen Stellen in Nagetier-Antikörpern substituiert
sind.
-
Menschliche
Antikörper
können
auch unter Einsatz von verschiedenen Verfahren hergestellt werden, die
auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie z.B. Phagendisplay-Bibliotheken
(Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et
al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)). Die Verfahren von Cole et al.
und Boerner et al. stehen auch zur Herstellung von menschlichen
monoklonalen Antikörpern
zur Verfügung
(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77, Alan
R. Liss (1985), und Boerner et al., J. Immunol. 147 (1), 86-95 (1991)).
Auf ähnliche
Weise können
menschliche Antikörper
durch das Einführen
von menschlichen Immunglobulinloci in transgene Tiere, z.B. Mäuse, hergestellt
werden, in denen die endogenen Immunglobulin-Gene teilweise oder
vollständig
inaktiviert wurden. Bei Provokation ist die Produktion von menschlichen
Antikörpern
zu beobachten, die der Produktion von Antikörpern in Menschen in jeder
Hinsicht, umfassend Gen-Neuordnung, -Anordnung und Antikörper-Repertoire,
sehr ähnlich
ist. Dieser Ansatz wird beispielsweise in den
US-Patenten Nr. 5.545.807 ,
5.545.806 ,
5.569.825 ,
5.625.126 ,
5.633.425 ,
5.661.016 und in den folgenden wissenschaftlichen
Publikationen beschrieben: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783
(1992); Lonberg et al., Nature 368, 856-859 (1994); Morrison, Nature
368, 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996); Neuberger,
Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg und Huszar, intern.
Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995).
-
4. Antikörper-abhängige Enzym-gesteuerte Prodrug-Therapie
(ADEPT)
-
Die
Antikörper
der vorliegenden Offenbarung können
auch in ADEPT eingesetzt werden, indem der Antikörper an ein Prodrug-aktivierendes
Enzym konjugiert wird, das ein Prodrug (z.B. einen Peptidyl-Chemotherapie-Wirkstoff,
siehe
WO 81/01145 ) in
ein aktives Anti-Krebs-Arzneimittel umsetzt. Siehe beispielsweise
WO 88/07378 und
US-Patent Nr. 4.978.278 .
-
Die
Enzym-Komponente des Immunkonjugats, das für ADEPT eingesetzt werden kann,
umfasst ein beliebiges Enzym, das in der Lage ist, so auf ein Prodrug
zu wirken, dass es in seine aktivere, zytotoxische Form umgesetzt
wird.
-
Enzyme,
die in dem Verfahren wirksam sind, umfassen Glycosidase, Glucoseoxidase;
menschliches Lysosym; menschliche Glucuronidase; alkalische Phosphatase,
die zur Umsetzung von Phosphat-hältigen Prodrugs
in freie Arzneimittel wirksam ist; Arylsulfatase, die zur Umsetzung
von Sulfat-hältigen
Prodrugs in freie Arzneimittel wirksam ist; Cytosindeaminase, die
zur Umsetzung von nicht-toxischem 5-Fluorcytosin in das Anti-Krebs-Arzneimittel
5-Fluoruracil wirksam ist; Proteasen, wie z.B. Serratiaprotease;
Thermolysin; Substilisin; Carboxypeptidasen (z.B. Carboxypeptidase
G2 und Carboxypeptidase A) und Cathepsine (wie z.B. Cathepsin B
und L), die zur Umsetzung von Peptid-hältigen Prodrugs in freie Arzneimittel
wirksam sind; D-Alanylcarboxypeptidasen, die zur Umsetzung von Prodrugs,
die D-Aminosäure-Substituenten
umfassen, wirksam sind; Kohlenwasserstoff-spaltende Enzyme, wie
z.B. β-Galactosidase
und Neuraminidase, die zur Umsetzung von glykosylierten Prodrugs
in freie Arzneimittel wirksam sind; β-Lactamase, die zur Umsetzung
von mit β-Lactamen
derivatisierten Prodrugs in freie Arzneimittel wirksam ist; sowie
Penicillin-Amidasen, wie z.B. Penicillin-V-Amidase oder Penicillin-G-Amidase,
die zur Umsetzung von an ihren Aminstickstoffatomen mit Phenoxyacetyl-
bzw. Phenylacetylgruppen derivatisierten Prodrugs in freie Arzneimittel
wirksam sind, sind aber nicht auf diese beschränkt. Alternativ dazu können auch
Antikörper
mit Enzymaktivität,
die auf dem Gebiet der Erfindung auch als "Abzyme" bekannt sind, eingesetzt werden, um
die erfindungsgemäßen Prodrugs
in freie aktive Arzneimittel umzusetzen (siehe z.B. Massey, Nature
328, 457-458 (1987)). Antiköper-Abzym-Konjugate können wie
hierin beschrieben zur Zufuhr des Abzyms zu einer Tumorzellpopulation
hergestellt werden.
-
Die
Enzyme können
mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind,
wie z.B. unter Einsatz der oben angeführten heterobifunktionellen
Vernetzungsmittel, kovalent an die Anti-PRO1122-Antikörper gebunden
werden. Alternativ dazu können
Fusionsproteine, die zumindest die Antigen-Bindungsregion des Antikörpers gebunden
an zumindest einen funktionell aktiven Enyzmabschnitt umfassen,
unter Einsatz von DNA-Rekombinationstechniken, die auf dem Gebiet
der Erfindung bekannt sind, hergestellt werden (siehe z.B. Neuberger
et al., Nature 312, 604-608 (1984)).
-
5. Bispezifische Antikörper
-
Bispezifische
Antikörper
sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die
Bindungsspezifitäten
für zumindest
zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der
Bindungsspezifitäten
ist eine Bindungsspezifität
für ein
PRO1031-Polypeptid und die andere eine Bindungsspezifität für ein anderes
Antigen, vorzugsweise für
ein Zelloberflächen-Protein,
-Rezeptor oder -Rezeptoruntereinheit.
-
Verfahren
zur Herstellung von bispezifischen Antikörpern sind auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt. Herkömmlicherweise
basiert die rekombinante Produktion von bispezifischen Antikörpern auf
der Co-Expression von zwei Immunglobulin-Schwerketten-/Leichtketten-Paaren, wobei
die beiden Schwerketten verschiedene Spezifitäten aufweisen (Milstein und
Cuello, Nature 305, 537-539 (1983)). Aufgrund der zufälligen Anordnung
von Immunglobulin-Schwer- und -Leichtketten produzieren diese Hybridome
(Quadrome) ein potentielles Gemisch aus zehn verschiedenen Antikörpermolekülen, von
denen nur eines die richtige bispezifische Struktur aufweist. Die
Reinigung des richtigen Moleküls
erfolgt gewöhnlicherweise
durch Affinitätschromatographie-Schritte. Ähnliche
Verfahren werden in
WO 93/08829 ,
veröffentlicht
am 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655-3659
(1991), offenbart.
-
Variable
Antikörper-Domänen mit
den gewünschten
Bindungsspezifitäten
(Antikörper-Antigen-Kombinationsstellen)
können
an konstante Immunglobulin-Domänensequenzen
fusioniert werden. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten
Immunglobulin-Schwerketten-Domäne,
die zumindest einen Teil der Gelenks-, CH2- und CH3-Regionen umfasst.
Vorzugsweise umfasst die erste konstante Schwerkettenregion (CH1)
die Stelle, die für
die Bindung von Leichtketten, die zumindest in einer der Fusionen
vorkommen, erforderlich ist. DNA, die für die Immunglobulin-Schwerketten-Fusionen
und, nach Wunsch, die Immunglobulin-Leichtketten kodieren, werden in getrennte
Expressionsvektoren insertiert und in einen geeigneten Wirtsorganismus
co-transfiziert. Für
weitere Details zur Herstellung bispezifischer Antikörper siehe
beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 120 (1986).
-
Gemäß einem
anderen Ansatz, der in
WO 96/27011 beschrieben
wird, kann die Grenzfläche
zwischen einem Paar Antikörpermolekülen so verändert werden,
dass der Prozentsatz an Heterodimeren maximiert wird, die aus der
rekombinanten Zellkultur gewonnen werden. Die bevorzugte Grenzfläche umfasst
zumindest einen Teil der CH3-Region einer konstanten Antikörper-Domäne. In diesem
Verfahren werden eine oder mehrere kleine Aminosäureseitenketten von der Grenzfläche des
ersten Antikörpermoleküls durch
längere
Seitenketten (z.B. Tyrosin oder Tryptophan) ersetzt. Kompensatorische "Hohlräume", die dieselbe oder
eine ähnliche Größe wie die
längere(n)
Seitenkette(n) aufweisen, werden auf der Grenzfläche des zweiten Antikörpermoleküls gebildet,
indem die langen Aminosäureseitenketten
durch kleinere (z.B. Alanin oder Threonin) ersetzt werden. Dadurch
wird ein Mechanismus zur Steigerung der Heterodimer-Ausbeute gegenüber anderen
ungewünschten
Endprodukten, wie z.B. Homodimeren, bereitgestellt.
-
Bispezifische
Antikörper
können
als Antikörper
voller Länge
oder Antikörperfragmente
(z.B. bispezifische F(ab')2-Antikörper)
hergestellt werden. Verfahren zur Erzeugung bispezifischer Antikörper aus
Antikörperfragmenten
sind in der Literatur beschrieben. Bispezifische Antikörper können beispielsweise
unter Einsatz von chemischer Bindung hergestellt werden. Brennan
et al., Science 229, 81 (1985), beschrei ben ein Verfahren, bei dem
intakte Antikörper
proteolytisch zur Erzeugung von F(ab')2-Fragmenten
gespalten werden. Diese Fragmente werden in Gegenwart von Dithiol
komplexierendem Natriumarsenit zur Stabilisierung benachbarter Dithiole
und zur Vermeidung intermolekularer Disulfid-Bildung reduziert.
Die erzeugten Fab'-Fragmente werden
dann in Thionitrobenzoat- (TNB-) Derivate umgesetzt. Eines der Fab'-TNB-Derivate wird
dann mittels Reduktion mit Mercaptoethylamin zu Fab'-Thiol rückumgesetzt
und mit einer äquimolaren
Menge des anderen Fab'-TNB-Derivats
zur Bildung des bispezifischen Antikörpers gemischt. Die hergestellten
bispezifischen Antikörper
können
als Wirkstoffe zur selektiven Immobilisierung von Enzymen eingesetzt
werden.
-
Fab'-Fragmente können direkt
aus E. coli gewonnen und chemisch zur Bildung von bispezifischen
Antikörpern
verbunden werden. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217-225 (1992), beschreiben
die Herstellung eines vollständig
humanisierten bispezifischen F(ab')2-Antikörpermoleküls. Jedes
Fab'-Fragment wurde
getrennt von E. coli sekretiert und in vitro einer gerichteten chemischen
Verbindung zur Bildung des bispezifischen Antikörpers unterzogen. Der so gebildete
bispezifische Antikörper
war in der Lage, an Zellen, die ErbB2-Rezeptor überexprimierten, und normale
menschliche T-Zellen zu binden sowie die lytische Aktivität menschlicher
zytotoxischer Lymphozyten gegen menschliche Brusttumorziele auszulösen.
-
Verschiedene
Verfahren zur Herstellung und Isolierung von bispezifischen Antikörperfragmenten
unmittelbar aus rekombinanter Zellkultur wurden ebenfalls beschrieben.
Bispezifische Antikörper
wurden beispielsweise unter Einsatz von Leucin-Zippern erzeugt, Kostelny et al., J.
Immunol. 148 (5), 1547-1553 (1992), wobei die Leucin-Zipper-Peptide
von Fos- und Jun-Proteinen mittels Genfusion an die Fab'-Abschnitte zwei verschiedener Antikörper gebunden
wurden. Die Antikörper-Homodimere wurden
an der Gelenksregion zur Bildung von Monomeren reduziert und dann
zur Bildung der Antikörper-Heterodimere
erneut oxidiert. Dieses Verfahren kann auch zur Herstellung von
Antikörper-Homodimeren
eingesetzt werden. Das von Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90, 6444-6448 (1993), beschriebene "Diabody"-Verfahren stellt einen alternativen
Mechanismus zur Herstellung von bispezifischen Antikörperfragmenten
bereit. Die Fragmente umfassen eine variable Schwerketten-Domäne (VH), die über
einen Linker mit einer variablen Leichtketten-Domäne
(VL) verbunden ist, wobei der Linker zu
kurz ist, um die Paarbildung zwischen den beiden Domänen an derselben Kette
zu ermöglichen.
Dementsprechend sind die VH- und die VL-Domänen
eines Fragments gezwungen, Paare mit den komplementären VL- und VH-Domänen eines
anderen Fragments zu bilden, wodurch zwei Antigen-Bindungsstellen
entstehen. Eine weitere Strategie zur Herstellung bispezifischer
Antikörperfragmente
unter Einsatz eines einkettigen Fv-(sFv-) Dimers wurde ebenfalls
beschrieben. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994).
-
Antikörper mit
mehr als zwei Wertigkeiten werden ebenfalls in Betracht gezogen.
Beispielsweise können
trispezifische Antikörper
hergestellt werden. Tutt et al., J. Immunol. 147, 60 (1991).
-
Beispielhafte
bispezifische Antikörper
können
an zwei verschiedene Epitope an einem bestimmten "PRO"-Protein hierin binden.
Alternativ dazu kann ein Anti-"PRO"-Proteinarm mit einem Arm kombiniert
werden, der an ein Trigger-Molekül
an einem Leukozyten, wie z.B. einem T-Zell-Rezeptormolekül (z.B.
CD2, CD3, CD28 oder B7) oder Fc-Rezeptoren für IgG (FcγR), wie z.B. RcγRI (CD64),
RcγRII (CD32)
und FcγIII
(CD16), bindet, um die Zellverteidigungsmechanismen auf die Zelle
zu fokussieren, die das spezielle "PRO"-Protein exprimiert.
Diese Antikörper
weisen einen "PRO"-Bindungsarm und einen Arm auf, der einen
zytotoxischen Wirkstoff oder einen Radionuklid-Chelatbildner, wie
z.B. EOTUBE, DPTA, DOTA oder TETA, bindet. Ein weiterer bispezifischer
Antikörper
von Interesse bindet das "PRO"-Polypeptid und bindet
außerdem
Gewebefaktor (TF).
-
6. Heterokonjugierte Antikörper
-
Heterokonjugierte
Antikörper
sind auch Teil des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugierte
Antikörper
bestehen aus zwei kovalent verbundenen Antikörpern. Es wurde beispielsweise
vorgeschlagen, dass solche Antikörper
Immunsystemzellen auf ungewünschte
Zellen richten (
US-Patent Nr.
4.676.980 ) sowie zur Be handlung von HIV-Infektion (
WO 91/00360 ;
WO 92/200373 ;
EP 03089 ). Es wird in Betracht gezogen,
dass die Antikörper
in vitro unter Einsatz von in der synthetischen Proteinchemie bekannten
Verfahren hergestellt werden können,
umfassend Verfahren, bei denen Vernetzungsmittel eingesetzt werden.
Immuntoxine können
beispielsweise unter Einsatz einer Disulfidaustauschreaktion oder
durch Bildung einer Thioetherbindung hergestellt werden. Beispiele
für zu
diesem Zweck geeignete Reagenzien umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat
sowie jene, die beispielsweise in
US-Patent
Nr. 4.676.980 offenbart werden.
-
7. Effektorfunktions-Engineering
-
Es
kann wünschenswert
sein, die in der Erfindung verwendeten Antikörper in Bezug auf die Effektorfunktion
zu modifizieren, um die Wirksamkeit des Antikörpers zu steigern. Beispielsweise
kann ein Cystein-Rest/können
Cystein-Reste in die Fc-Region eingeführt werden, wodurch die Bildung
von Interketten-Disulfid-Bindungen in dieser Region ermöglicht wird.
Die so erzeugten homodimeren Antikörper können eine verbesserte Internalisierungskapazität und/oder
ein gesteigertes Komplementvermitteltes Töten von Zellen und eine gesteigerte
Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC)
aufweisen. Siehe Caron et al., J. Exp. Med. 176, 1191-1195 (1992),
und B. Shopes, J. Immunol. 148, 2918-2922 (1992). Homodimere Antikörper mit gesteigerter
Antitumor-Aktivität
können
auch unter Einsatz von heterobifunktionellen Vernetzungsmitteln,
wie in Wolff et al., Cancer Research 53, 2560-2565 (1993), beschrieben,
hergestellt werden. Alternativ dazu kann ein Antikörper mit
doppelten Fc-Regionen durch genetische Veränderung hergestellt werden,
wodurch er eine gesteigerte Komplement-Lyse und ADCC-Kapazitäten aufweisen
kann. Siehe Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3, 219-230
(1989).
-
8. Immunkonjugate
-
Die
Erfindung betrifft auch Immunkonjugate, die einen Antikörper umfassen,
der an einen zytotoxischen Wirkstoff, wie z.B. einen chemotherapeutischen
Wirkstoff, ein Toxin (z.B. ein enzymatisch aktives Toxin, das von
Bakterien, Pilzen, Pflanzen oder Tieren stammt, oder Fragmente davon
oder ein kleinmoleküliges
Toxin), oder ein radioaktives Isotop konjugiert ist (d.h. ein Radiokonjugat).
-
Chemotherapeutische
Wirkstoffe, die zur Herstellung solcher Immunkonjugate nützlich sind,
wurden bereits obenstehend beschrieben. Enzymatisch aktive Proteintoxine
und Fragmente davon, die eingesetzt werden können, umfassen die Diphtherie-A-Kette, nicht-bindende
aktive Fragmente des Diphtherie-Toxins, Cholera-Toxin, Botulinus-Toxin,
die Exotoxin-A-Kette (von Pseudomonas aeruginosa), die Ricin-A-Kette,
die Abrin-A-Kette, die Modeccin-A-Kette, α-Sarcin, Aleurites-fordii-Proteine,
Dianthin-Proteine,
Phytolaca-americana-Proteine (PAPI, PAPII und PAP-S), Momordica-Charantia-Hemmer,
Curcin, Crotin, Sapaonaria-officinalis-Hemmer, Gelonin, Saporin,
Mitgellin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin und die Tricothecene.
Kleinmolekülige
Toxine umfassen beispielsweise Calicheamicine, Maytansinoide, Palytoxin
und CC1065. Verschiedene Radionuklide stehen zur Herstellung radiokonjugierter
Antikörper
zur Verfügung.
Beispiele umfassen 212Bi, 131I, 131In, 90Y und 186Re.
-
Konjugate
aus dem Antikörper
und dem zytotoxischen Wirkstoff werden unter Einsatz verschiedener bifunktioneller
Protein-Kopplungsmittel hergestellt, wie z.B. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP),
Iminothiolan (IT), bifunktionelle Derivate von Imidoestern (wie
z.B. Dimethyladipimidat HCL), aktive Ester (wie z.B. Disuccinimidylsuberat),
Aldehyde (wie z.B. Glutaraldehyd), Bisazido-Verbindungen (wie z.B. Bis(p-azidobenzoyl)hexandiamin),
Bisdiazonium-Derivate (wie z.B. Bis(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin), Diisocyanate
(wie z.B. Tolyen-2,6-diisocyanat) und Bis-aktive Fluorverbindungen
(wie z.B. 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol). Ein Ricin-Immuntoxin kann beispielsweise
wie in Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987), beschrieben hergestellt
werden. Kohlenstoff-14-markierte 1-Isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylentriaminpentaessigsäure (MX-DTPA)
ist ein beispielhafter Chelatbildner für die Konjugation eines Radionucleotids
an den Antikörper.
Siehe
WO 94/11026 .
-
In
einer anderen Ausführungsform
kann der Antikörper
an einen "Rezeptor" (wie z.B. Streptavidin)
zur Verwendung zum Tumor-Prätargeting
konjugiert werden, wobei das Antikörper-Rezeptor-Konjugat dem
Patienten verabreicht wird, gefolgt von der Entfernung des ungebundenen
Konjugats aus dem Blutkreislauf unter Einsatz eines Klärungsmittels
und der darauf folgenden Verabreichung eines "Liganden" (z.B. Avidin), das an einen zytotoxischen
Wirkstoff (z.B. ein Radionucleotid) konjugiert ist.
-
9. Immunliposomen
-
Die
hierin offenbarten Antikörper
können
auch als Immunliposomen formuliert werden. Liposomen, die den Antikörper enthalten,
werden durch Verfahren hergestellt, die auf dem Gebiet der Erfindung
bekannt sind, wie z.B. die in Epstein et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
77, 4030 (1980), und den
US-Patenten
Nr. 4.485.045 und
4.544.545 beschriebenen
Verfahren. Liposomen mit verbesserter Zirkulationszeit sind in
US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
-
Besonders
nützliche
Liposomen können
durch das Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren
mit einer Lipidzusammensetzung hergestellt werden, die Phosphatidylcholin,
Cholesterin und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE)
enthält.
Liposomen werden durch Filter mit definierter Porengröße extrudiert,
um Liposomen mit dem gewünschten
Durchmesser zu erhalten. Fab'-Fragmente des Antikörpers der
vorliegenden Erfindung können
wie in Martin et al., J. Biol. Chem. 257, 286-288 (1982), beschrieben über eine Disulfid-Austauschreaktion
an die Liposomen konjugiert werden. Ein chemotherapeutischer Wirkstoff
(wie z.B. Doxorubicin) ist gegebenenfalls in dem Liposom enthalten.
Siehe Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19), 1484 (1989).
-
10. Pharmazeutische Antikörper-Zusammensetzungen
-
Antikörper, die
spezifisch an das hierin identifizierte PRO1122-Polypeptid sowie
an andere, mittels der obenstehend offenbarten Screening-Tests identifizierte
Moleküle
binden, können
in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung verschiedener
Störungen
verabreicht werden.
-
Wenn
ein PRO1122-Polypeptid intrazellulär ist und ganze Antikörper als
Hemmer eingesetzt werden, sind internalisierende Antikörper zu
bevorzugen. Es können
jedoch auch Lipofektionen oder Liposomen eingesetzt werden, um den
Antikörper
oder ein Antikörperfragment
in die Zellen einzuführen.
Wenn Antikörperfragmente
eingesetzt werden, ist das kleinste hemmende Fragment, das spezifisch
an die Bindungsdomäne des
Zielproteins bindet, zu bevorzugen. Basierend auf den Sequenzen
der variablen Region eines Antikörpers können beispielsweise
Peptidmoleküle
gestaltet werden, die die Fähigkeit
beibehalten, die Zielproteinsequenz zu binden. Solche Peptide können chemisch
synthetisiert und/oder mittels DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt
werden. Siehe z.B. Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,
7889-7893 (1993).
-
Die
Formulierung hierin kann auch mehr als eine aktive Verbindung aufweisen,
wie es für
die bestimmte, zu behandelnde Erkrankung erforderlich ist, wobei
die aktiven Verbindungen vorzugsweise komplementäre Aktivitäten aufweisen, die einander
nicht beeinträchtigen.
Alternativ oder zusätzlich
dazu kann die Zusammensetzung einen Wirkstoff umfassen, der ihre
Funktion verbessert, wie z.B. einen zytotoxischen Wirkstoff, Cytokine,
einen chemotherapeutischen Wirkstoff oder einen wachstumshemmenden
Wirkstoff. Solche Moleküle sind
geeigneterweise in Kombination in Mengen vorhanden, die für den beabsichtigten
Zweck wirksam sind.
-
Die
Wirkstoffe können
auch eingeschlossen in Mikrokapseln beispielsweise durch Coazervations-Verfahren
oder durch Grenzflächenpolymerisation
hergestellt werden, beispielweise Hydroxymethylcellulose- oder Felatin-Mikrokapseln
bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln, in kolloidalen Arzneimittelzufuhrsystemen
(beispielsweise Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanoteilchen
und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen. Solche Verfahren sind
in Remington's Pharmaceutical
Sciences, s.o., offenbart.
-
Die
Formulierungen, die zur In-vivo-Verabreichung verwendet werden sollen,
müssen
steril sein. Dies kann einfach durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen
sichergestellt werden.
-
Es
können
Retard-Präparate
hergestellt werden. Geeignete Beispiele für Retard-Präparate
umfassen semipermeable Matrizen aus festen hydrophoben Polymeren,
die den Antikörper
enthalten, wobei die Matrizen in Form von Formgegenständen vorliegen,
z.B. in Form von Filmen oder Mikrokapseln. Beispiele für Retard-Matrizen
umfassen Polyester, Hydrogele (z.B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat)
oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (
US-Patent Nr. 3.773.919 ), Copolymere
aus L-Glutaminsäure-γ-ethyl-L-glutamat,
nicht abbaubarem Ethylenvinylacetat, abbaubaren Milchsäure-Glycolsäure-Copolymeren,
wie z.B. LUPRON DEPOT
TM (injizierbare Mikrokügelchen
aus Milchsäure-Glycolsäure-Copolymer
und Leuprolidacetat) und Poly-D-(-)3-hydroxybuttersäure. Während Polymere,
wie z.B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glycolsäure, die Freisetzung der Moleküle im Verlauf
von 100 Tagen ermöglichen,
setzen bestimmte Hydrogele die Proteine in einem kürzeren Zeitraum
frei. Wenn eingekapselte Antikörper
eine lange Zeit über
im Körper
bleiben, können
sie aufgrund dessen, dass sie Feuchtigkeit bei 37 °C ausgesetzt
sind, denaturieren oder Aggregate bilden, wodurch es zu einem Verlust
der biologischen Aktivität
und möglichen
Veränderungen
in Bezug auf die Immunogenität kommt.
Es können
rationale Strategien zur Stabilisierung in Abhängigkeit von den beteiligten
Mechanismen entwickelt werden. Wenn beispielsweise festgestellt
wird, dass es sich bei dem Aggregationsmechanismus um die Bildung
einer intermolekularen S-S-Bindung durch Thiosulfidaustausch handelt,
kann die Stabilisierung durch die Modifikation der Sulfhydryl-Reste,
das Lyophilisieren aus sauren Lösungen,
die Steuerung des Feuchtigkeitsgehalts unter Einsatz von geeigneten
Additiven und die Entwicklung spezifischer Polymermatrixzusammensetzungen
erfolgen.
-
G. Verwendungen für Anti-PRO1122-Antikörper
-
Die
Anti-PRO1122-Antikörper
der vorliegenden Erfindung können
auf verschiedene Weise genutzt werden. Beispielsweise können die
Anti-PRO1122-Antikörper
in Diag nosetests für
PRO1122-Polypeptide eingesetzt werden, z.B. zum Nachweis der Expression
in bestimmten Zellen, Gewebe oder Serum. Verschiedene Diagnosetest-Verfahren, die auf
dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, können eingesetzt werden, wie
z.B. kompetitive Bindungstests, direkte oder indirekte Sandwicht-Tests
und Immunfällungstests,
die in heterogenen oder homogenen Phasen durchgeführt werden
(Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, 147-158, CRC
Press, Inc. (1987)). Die in den Tests eingesetzten Antikörper können mit
einer nachweisbaren Gruppierung markiert werden. Die nachweisbare
Gruppierung sollte in der Lage sein, direkt oder indirekt, ein nachweisbares
Signal zu produzieren. Die nachweisbare Gruppierung kann ein Radioisotop,
wie z.B. 3H, 14C, 32P, 35S oder 125I, eine fluoreszierende oder chemilumineszierende
Verbindung, wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin,
oder ein Enzym, wie z.B. alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder
Meerrettichperoxidase, sein. Ein beliebiges Verfahren, das auf dem
Gebiet der Erfindung bekannt ist, kann zum Konjugieren des Antikörpers an
die nachweisbare Gruppierung eingesetzt werden, umfassend die von
Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry
13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981),
und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982), beschriebenen
Verfahren.
-
Anti-PRO1122-Antikörper sind
auch zur Affinitätsreinigung
von PRO1122-Polypeptiden
aus rekombinanter Zellkultur oder natürlichen Quellen nützlich.
In diesem Verfahren werden die Antikörper gegen ein PRO1122-Polypeptid
auf einem geeigneten Träger,
wie z.B. einem Sephadex-Harz oder Filterpapier, unter Einsatz von
Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, immobilisiert.
Der immobilisierte Antirköper wird
dann mit einer Probe kontaktiert, die das zu reinigende PRO1122-Polypeptid
enthält,
wonach der Träger mit
einem geeigneten Lösungsmittel
gewaschen wird, das im Wesentlichen alle Materialien in der Probe
mit Ausnahme des PRO1122-Polypeptids, das an den immobilisierten
Antikörper
gebunden ist, entfernt. Schließlich
wird der Träger
mit einem anderen geeigneten Lösungsmittel
gewaschen, das das PRO1122-Polypeptid von dem Antikörper löst.
-
H. PRO1122-Antagonisten/Agonisten
-
Diese
Offenbarung umfasst Verfahren zum Screenen von Verbindungen, um
jene zu identifizieren, die das PRO1122-Polypeptid nachahmen (Agonisten)
oder die Wirkung der PRO1122-Polypeptid hemmen (Antagonisten). Screening-Tests
für mögliche Antagonisten-Arzneimittel
sind so gestaltet, dass sie Verbindungen identifizieren, die an
die PRO1122-Polypeptide, für
die die hierin identifizierten Gene kodieren, binden oder Komplexe
mit diesen bilden oder die Wechselwirkung der kodierten Polypeptide
mit anderen zellulären
Proteinen auf andere Weise beeinflussen. Solche Screening-Tests
umfassen Tests, die für
das Hochdurchsatzscreening von chemischen Bibliotheken geeignet
sind, wodurch sie besonders zur Identifizierung der möglichen
kleinmoleküligen
Arzneimittel geeignet sind.
-
Die
Tests können
in verschiedenen Formaten durchgeführt werden, wie z.B. Protein-Protein-Bindungstests,
biochemische Screening-Tests, Immuntests und zellbasierende Tests,
deren Merkmale auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Um für Antagonisten
und/oder Agonisten der PRO1122-Signalübertragung zu screenen, wird
das Testgemisch unter Bedingungen inkubiert, unter denen PRO1122,
außer
bei Gegenwart des möglichen
pharmakologischen Wirkstoffs, die TNF-α-Freisetzung aus THP-1-Zellen
mit einer Bezugsaktivität
hervorruft. Alternativ dazu kann es sich bei der getesteten Aktivität um das
Freisetzen von Stickstoffoxid (NO) und Proteoglykanen aus mit IL-17
und/oder IL-1α behandelten
artikulären
Knorpeln handeln.
-
In
Bindungstests besteht die Wechselwirkung in der Bindung, und der
gebildete Komplex kann isoliert oder im Reaktionsgemisch nachgewiesen
werden. In einer speziellen Ausführungsform
wird das PRO1122-Polypeptid, für
das das hierin identifizierte Gen kodiert, oder das mögliche Arzneimittel
auf einer Festphase, z.B. einer Mikrotiterplatte, mittels kovalenter
oder nicht kovalenter Bindungen immobilisiert. Eine nicht kovalente
Bindung wird im Allgemeinen dadurch hergestellt, dass die feste
Oberfläche
mit einer Lösung aus
PRO1122-Polypeptid beschichtet und getrocknet wird. Alternativ dazu
kann ein immobilisierter Antikörper, z.B.
ein monoklonaler Anti körper,
der für
das zu immobilisierende PRO1122-Polypeptid spezifisch ist, eingesetzt
werden, um es an der festen Oberfläche zu verankern. Der Test
erfolgt durch die Zugabe der nicht immobilisierten Komponente, die
durch eine nachweisbare Markierung markiert sein kann, zu der immobilisierten Komponente,
die mit einer nachweisbaren Markierung markiert sein kann. Wenn
die Reaktion abgeschlossen ist, werden die nicht umgesetzten Komponenten,
z.B. durch Waschen, entfernt, und die an der festen Oberfläche verankerten
Komplexe werden nachgewiesen. Wenn die ursprünglich nicht immobilisierte
Komponente eine nachweisbare Markierung aufweist, deutet der Nachweis
der auf der Oberfläche
immobilisierten Markierung darauf hin, dass es zu einer Komplexbildung
gekommen ist. Wenn die ursprünglich
nicht immobilisierte Komponente keine Markierung aufweist, kann
die Komplexbildung beispielsweise unter Einsatz eines markierten
Antikörpers
erfolgen, der spezifisch an den immobilisierten Komplex bindet.
-
Wenn
die mögliche
Verbindung mit einem bestimmten PRO1122-Polypeptid, für das ein
hierin identifiziertes Gen kodiert, in Wechselwirkung tritt, aber
nicht an dieses bindet, kann die Wechselwirkung mit diesem Polypeptid
durch Verfahren getestet werden, die für den Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen
bekannt sind. Solche Tests umfassen herkömmliche Ansätze, wie z.B. Vernetzen, Co-Immunfällung und
Co-Reinigung unter Einsatz von Gradienten oder Chromatographiesäulen. Zusätzlich dazu
können
Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Einsatz eines Gensystems
auf Hefe-Basis, wie von Fields und Mitarbeitern beschrieben, überwacht
werden (Fields und Song, Nature 240, 245-246 (1989); Chien et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991), wie von Chevray
und Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5791 (1991), offenbart).
Viele Transkriptionsaktivatoren, wie z.B. Hefe-GAL4, bestehen aus
zwei physikalisch getrennten modularen Domänen, wobei eine als DNA-Bindungsdomäne dient,
während
die andere als Transkriptionsaktivierungsdomäne funktioniert. Das in den
zuvor genannten Publikationen beschriebene Hefe-Expressionssystem
(im Allgemeinen als "Zwei-Hybrid-System" bezeichnet) nutzt
diese Eigenschaft und setzt zwei Hybridproteine ein, eines, in dem
das Zielprotein an die DNA-Bindungsdomäne von GAL4 fusioniert ist,
und ein anderes, in dem die möglichen
aktivierenden Proteine an die Aktivierungs domäne fusioniert sind. Die Expression
des GAL1-lacZ-Reportergens gesteuert durch einen GAL4-aktivierten
Promotor hängt
von der Wiederherstellung von GAL4-Aktivität über Protein-Protein-Wechselwirkung
ab. Kolonien, die das wechselwirkende Polypeptid enthalten, werden
mit dem chromogenen Substrat für β-Galactosidase
nachgewiesen. Ein vollständiges
Set (MATCHMAKERTM) zur Identifizierung von
Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei spezifischen Proteinen
unter Einsatz des Zwei-Hybrid-Verfahrens ist im Handel von Clontech
erhältlich.
Dieses System kann auch erweitert werden, um die Proteindomänen zu kartieren,
die an spezifischen Protein-Wechselwirkungen beteiligt sind, und
Aminosäurereste,
die für
diese Wechselwirkungen wesentlich sind, zu lokalisieren.
-
Verbindungen,
die die Wechselwirkung eines Gens, das für ein hierin identifiziertes
PRO1122-Polypeptid kodiert, und weiteren intra- oder extrazellulären Komponenten
stört,
können
wie folgt getestet werden: Gewöhnlicherweise
wird ein Reaktionsgemisch hergestellt, das das Genprodukt und die
intra- oder extrazelluläre
Komponente unter Bedingungen und über einen Zeitraum hinweg enthält, die
die Wechselwirkung und die Bindung der beiden Produkte ermöglichen.
Um die Fähigkeit
einer vermutlichen Verbindung in Bezug auf die Bindungshemmung zu
testen, erfolgt die Reaktion ohne die und in Gegenwart der Testverbindung.
Zusätzlich dazu
kann zu einem dritten Reaktionsgemisch ein Placebo zugesetzt werden,
das als positive Kontrolle dient. Die Bindung (Komplexbildung) zwischen
der Testverbindung und der in dem Gemisch vorhandenen intra- oder extrazellulären Komponente
wird wie oben beschrieben überwacht.
Die Bildung eines Komplexes in der Kontrollreaktion/den Kontrollreaktionen,
aber nicht in dem Reaktionsgemisch, das die Testverbindung enthält, deutet
darauf hin, dass die Testverbindung die Wechselwirkung zwischen
der Testverbindung und ihrem Reaktionspartner beeinflusst.
-
Antagonisten
können
durch Kombination des PRO1122-Polypeptids und eines potentiellen
Antagonisten mit membrangebundenen PRO1122-Polypeptid-Rezeptoren
oder rekombinanten Rezeptoren unter für einen kompetitiven Inhibitionstest
geeigneten Bedingungen nachgewiesen werden. Das PRO1122-Polypeptid kann,
z.B. durch Radioaktivität,
markiert sein, so dass die Anzahl der PRO1122-Polypeptid-Moleküle, die
an den Rezeptor gebunden sind, eingesetzt werden kann, um die Wirksamkeit
des potentiellen Antagonisten zu bestimmen. Das Gen, das für den Rezeptor
kodiert, kann durch verschiedene Verfahren, die Fachleuten auf dem
Gebiet der Erfindung bekannt sind, beispielsweise mittels Liganden-Panning
und FACS-Sortierung, identifiziert werden. Coligan et al., Current
Protocols in Immun. 1 (2), Kapitel 5 (1991). Vorzugsweise wird Expressionsklonieren
eingesetzt, wobei polyadenylierte RNA aus einer Zelle hergestellt
wird, die auf das PRO1122-Polypeptid reagiert, und eine aus dieser
RNA hergestellte cDNA-Bibliothek wird in Pools aufgeteilt und eingesetzt,
um COS-Zellen oder andere Zellen, die nicht auf PRO1122-Polypeptid
reagieren, zu transfizieren. Die transfizierten Zellen, die auf
den Glasträgern
gezüchtet
werden, werden markiertem PRO1122-Polypeptid ausgesetzt. Das PRO1122-Polypeptid
kann durch verschiedene Mittel markiert sein, wie z.B. lodierung
oder Einschluss einer Erkennungsstelle für eine ortsspezifische Proteinkinase.
Nach Fixierung und Inkubation werden die Träger einer autoradiographischen
Analyse unterzogen. Positive Pools werden identifiziert, und Sub-Pools
werden hergestellt und erneut unter Einsatz eines interaktiven Sub-Pooling-
und Screening-Verfahrens transfiziert, wodurch man schlussendlich
einen einzigen Klon erhält,
der für
den vermutlichen Rezeptor kodiert.
-
Als
alternativen Ansatz zur Rezeptor-Identifikation kann markiertes
PRO1122-Polypeptid
mit Zellmembranen oder Extraktpräparaten,
die das Rezeptormolekül
exprimieren, Photoaffinitäts-verbunden
werden. Vernetztes Material wird mittels PAGE aufgelöst und einem
Röntgenfilm
ausgesetzt. Der markierte Komplex, der den Rezeptor enthält, kann
abgetrennt werden, in Peptidfragmente aufgelöst und Protein-Mikrosequenzierung unterzogen
werden. Die Aminosäuresequenz,
die durch das Mikrosequenzieren erhalten wird, würde eingesetzt werden, um einen
Satz degenerierter Oligonucleotid-Sonden für das Screenen einer cDNA-Bibliothek
zur Identifizierung des Gens herzustellen, das für den vermutlichen Rezeptor
kodiert.
-
In
einem anderen Test für
Antagonisten werden Säugetierzellen
oder ein Membranpräparat,
die den Rezeptor exprimieren, mit markiertem PRO1122-Polypeptid
in Ge genwart der vermutlichen Verbindung inkubiert. Die Fähigkeit
der Verbindung, diese Wechselwirkung zu fördern oder zu blockieren, könnte dann
entfernt werden.
-
Spezifischere
Beispiele potentieller Antagonisten umfassen ein Oligonucleotid,
das an die Fusionen von Immunglobulinen mit PRO1122-Polypeptid bindet,
und insbesondere Antikörper,
die ohne Einschränkung poly-
und monoklonale Antikörper,
Antikörperfragmente,
einkettige Antikörper,
anti-idiotypische Antikörper
und chimäre
oder humanisierte Formen solcher Antikörper oder Fragmente sowie menschliche
Antikörper
und Antikörperfragmente
umfassen. Alternativ dazu kann es sich bei einem potentiellen Antagonisten
um ein nahe verwandtes Protein handeln, beispielsweise um eine mutierte
Form von PRO1122-Polypeptid, die den Rezeptor erkennt, aber keine
Wirkung hat, wodurch die Wirkung von PRO1122-Polypeptid kompetitiv
gehemmt wird.
-
Eine
weiterer potentieller PRO1122-Polypeptid-Antagonist ist ein Antisense-RNA- oder -DNA-Kosntrukt,
das unter Einsatz eines Antisense-Verfahrens hergestellt wird, wobei
z.B. ein Antisense-RNA- oder -DNA-Molekül so wirkt, dass es die Translation
von mRNA durch das Hybridisieren an Ziel-mRNA direkt blockiert und
die Translation in Protein verhindert. Antisense-Verfahren können eingesetzt
werden, um die Genexpression durch Tripelhelixbildung oder Antisense-DNA
oder -RNA zu steuern, wobei beide Verfahren auf der Bindung eines
Polynucleotids an DNA oder RNA basieren. Der kodierende 5'-Abschnitt der Polynucleotidsequenz,
die für
reife PRO1122-Polypeptide hierin kodiert, wird beispielsweise eingesetzt,
um eine Antisense-RNA-Oligonucleotidsequenz zu gestalten, die für die reifen
PRO1122-Polypeptide
hierin kodiert, und wiederum eingesetzt, um Antisense-RNA-Oligonucleotide mit
einer Länge
von 10 bis 40 Basenpaaren zu gestalten. Ein DNA-Oligonucleotid wird gestaltet, um in
Bezug auf eine Region des an der Transkription beteiligten Gens
komplementär
zu sein (Tripelhelix – siehe
Lee et al., Nucl. Acids Res. 6, 3073 (1979); Cooney et al., Science
241, 456 (1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991)), wodurch
die Transkription und die Produktion von PRO1122-Polypeptid verhindert wird. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid
hybridisiert in vivo an die mRNA und blockiert die Translation des
mRNA-Moleküls
zu PRO1122-Polypeptid (Antisense – Okano, Neurochem. 546, 560
(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression,
CRC Press, Boca Raton, Florida (1988)). Die oben beschriebenen Oligonucleotide
können
auch Zellen zugeführt
werden, so dass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden
kann, um die Produktion von PRO1122-Polypeptid zu hemmen. Wenn Antisense-DNA
eingesetzt wird, sind Oligodesoxyribonucleotide, die von der Translationsinitiationsstelle
stammen, z.B. etwa zwischen den Positionen -10 und +10 der Zielgennucleotidsequenz,
zu bevorzugen.
-
Potentielle
Antagonisten umfassen kleine Moleküle, die an die aktive Stelle,
die Rezeptorbindungsstelle, die Wachstumsfaktorbindungsstelle oder
andere bedeutende Bindungsstellen des PRO1122-Polypeptids binden,
wodurch sie die normale biologische Aktivität von PRO1122-Polypeptid blockieren.
Beispiele für
kleine Moleküle
umfassen kleine Peptide oder Peptid-ähnliche Moleküle, vorzugsweise
lösliche
Peptide, und synthetische organische oder anorganische Nicht-Peptidyl-Verbindungen,
sind aber nicht auf diese beschränkt.
-
Ribozyme
sind enzymatische RNA-Moleküle,
die in der Lage sind, die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren.
Ribozyme wirken durch Sequenz-spezifische Hybridisierung an komplementäre Ziel-RNA,
gefolgt von endonucleolytischer Spaltung. Spezifische Ribozym-Spaltungsstellen
in einer potentiellen Ziel-RNA können
durch bekannte Verfahren identifiziert werden. Für weitere Details siehe z.B.
Rossi, Current Biology 4, 469-471 (1994), und PCT-Veröffentlichung
Nr.
WO 97/33551 (veröffentlicht
am 18. September 1997).
-
Nucleinsäuremoleküle in Tripelhelixanordnung,
die zur Transkriptionshemmung eingesetzt werden, sollten einsträngig sein
und aus Desoxynucleotiden bestehen. Die Grundzusammensetzung dieser
Oligonucleotide ist so gestaltet, dass sie die Tripelhelix-Bildung über Hoogsteen-Basenpaarungsregeln
fördern,
die im Allgemeinen große
Abschnitte Purine und Pyrimidine auf einem Duplexstrang erfordern.
Für weitere
Details siehe PCR-Veröffentlichung
Nr.
WO 97/33551 , s.o.
-
I. Diagnostische Verwendungen
-
Eine
weitere Verwendung der hierin offenbarten Verbindungen (z.B. PRO1122-Varianten und Anti-PRO1122-Antikörper), hierin
beschrieben, besteht darin, dabei zu helfen, zu diagnostizieren,
ob eine Störung,
bis zu einem gewissen Maß,
durch durch PRO1122 modulierte Signalübertragung hervorgerufen wird.
-
Ein
Diagnosetest zur Bestimmung, ob eine bestimmte Störung (z.B.
eine degenerative Knorpelstörung)
durch PRO1122-Signalübertragung
hervorgerufen wird, kann unter Einsatz der folgenden Schritte durchgeführt werden:
(1) Kultivieren von Testzellen oder -geweben, die PRO1122 exprimieren;
(2) Verabreichen einer Verbindung, die die durch PRO1122 modulierte
Signalübertragung
hemmen kann, und (3) Messen der durch PRO1122 vermittelten phänotypischen
Wirkung in den Testzellen. Die Schritte können unter Einsatz von Standardverfahren
im Licht der vorliegenden Offenbarung durchgeführt werden. Standardverfahren
können beispielsweise
eingesetzt werden, um Zellen oder Gewebe zu isolieren und in vivo
zu kultivieren.
-
Verbindungen
mit einem verschiedenen Ausmaß an
Selektivität
sind für
die Diagnose der Rolle von PRO1122 nützlich. Verbindungen, die PRO1122
zusätzlich
zu einer anderen Form eines Adaptormoleküls aufweisen, können beispielsweise
als anfängliche
Testverbindungen eingesetzt werden, wenn eines oder mehrere Adaptormoleküle die Störung hervorrufen.
Die selektiven Verbindungen können
dann eingesetzt werden, um die mögliche
Rolle anderer Adaptorproteine beim Auslösen der Störung weiter auszuschließen.
-
Testverbindungen
sollten bei der Hemmung intrazellulärer Signalaktivität potenter
sein als beim Ausüben
einer zytotoxischen Wirkung (z.B. ein IC
50/LD
50 von mehr als 1). Der IC
50 und
LD
50 können
auch durch Standardverfahren gemessen werden, wie z.B. durch einen
MTT-Test oder durch die Messung der Menge an freigesetzter LDH.
Das Maß an
IC
50/LD
50 einer
Verbindung sollte bei der Bewertung des Diagnosetests berücksichtigt
werden. Im Allgemeinen ist die Information umso relativer, je größer das
Verhältnis
ist. Geeignete Kontrollen berücksichtigen
die mögliche
zytotoxische Wirkung einer Verbindung, wie z.B. die Behandlung von
Zellen, die nicht mit einer Zellproliferationsstörung in Zusammenhang stehen
(z.B. Kontrollzellen), mit einer Testverbindung, wobei diese auch
Teil eines Diagnosetests sein können.
Die Diagnoseverfahren der vorliegenden Erfindung umfassen das Screening
in Bezug auf Wirkstoffe, die die Wirkung von PRO1122 auf degenerative Knorpelstörungen modulieren.
Beispielhafte Nachweisverfahren umfassen radioaktive Markierung
und Immunfällung
(
US-Patent Nr. 5.385.915 ).
-
Antikörper, umfassend
Antikörperfragmente,
können
beispielsweise eingesetzt werden, um die Expression von Proteinen,
für die
die Gene kodieren, die mit der Erkrankung in Zusammenhang stehen,
qualitativ und quantitativ nachzuweisen ("Marker-Gen-Produkte"). Der Antikörper ist vorzugsweise mit einer
nachweisbaren, z.B. einer fluoreszierenden, Markierung versehen,
und die Bindung kann durch Lichtmikroskopie, Durchflusszytometrie,
Fluorimetrie oder andere auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren überwacht werden.
-
Der
In-situ-Nachweis der Bindung von Antikörpern an die Marker-Gen-Produkte
kann beispielsweise mittels Immunfluoreszenz- oder Immunelektronenmikroskopie
erfolgen. Zu diesem Zweck wird eine histologische Probe aus dem
Patienten entfernt, ein markierter Antikörper wird auf diese angewandt,
vorzugsweise indem der Antikörper
auf einer biologischen Probe überschichtet
wird. Dieses Verfahren ermöglicht
auch die Bestimmung der Verteilung des Marker-Gen-Produkts in dem
untersuchten Gewebe. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ist
klar, dass eine Vielzahl an histologischen Verfahren für den In-situ-Nachweis
zur Verfügung steht.
-
J. Pharmazeutische Zusammensetzungen
-
PRO1122
oder Antagonisten davon (z.B. Antikörper) sowie andere durch die
zuvor hierin offenbarten Screening-Tests identifizierte Moleküle können als
therapeutische Wirkstoffe eingesetzt werden. Solche therapeutischen
Wirkstoffe werden gemäß bekannten
Verfahren zur Herstellung pharmazeutisch wirksamer Zusammensetzungen formuliert,
wobei PRO1122, der Antagonist oder Agonist davon in Beimischung
mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger kombiniert wird.
-
Wenn
das Protein, für
das das amplifizierte Gen kodiert, intrazellulär ist und ganze Antikörper als
Hemmer eingesetzt werden, sind im Fall von PRO1122-Antagonisten-Antikörpern internalisierende
Antikörper
zu bevorzugen. Lipofektionen oder Liposomen können jedoch auch zur Zufuhr
des Antikörpers
oder eines Antikörperfragments
in Zellen eingesetzt werden. Wenn Antikörperfragmente eingesetzt werden,
ist das kleinste hemmende Element, das spezifisch an die Bindungsdomäne des Zielproteins
bindet, zu bevorzugen. Basierend auf den Sequenzen der variablen
Region eines Antikörpers
können
beispielsweise Peptidmoleküle
gestaltet werden, die die Fähigkeit
beibehalten, die Zielproteinsequenz zu binden. Solche Peptide können chemisch
synthetisiert werden und/oder mittels DNA-Rekombinationsverfahren
hergestellt werden (siehe z.B. Marasco et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)).
-
Therapeutische
Formulierungen werden zur Lagerung hergestellt, indem der Wirkstoff,
der einen gewünschten
Reinheitsgrad aufweist, mit optionalen pharmazeutisch annehmbaren
Trägern,
Exzipienten oder Stabilisatoren in Form von lyophilisierten Formulierungen
oder wässrigen
Lösungen
gemischt wird (Remington's
Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., A. Osol (Hrsg.) (1980)). Annehmbare
Träger,
Exzipienten oder Stabilisatoren sind in den verwendeten Dosierungen
und Konzentrationen für
den Rezipienten nicht toxisch und umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat,
Citrat und andere organische Säuren;
Antioxidationsmittel, wie z.B. Ascorbinsäure und Methionin; Konservierungsmittel
(wie z.B. Octadecyldimethylbenzylammoniumchlorid; Hexamethoniumchlorid;
Benzalkoniumchlorid; Benzethoniumchlorid; Phenol, Butyl- oder Benzylalkohol;
Alkylparabene, wie z.B. Methyl- oder Propylparaben; Catechin; Resorcin;
Cyclohexanol; 3-Pentanol und m-Cresol); niedermolekulare Polypeptide
(mit weniger als 10 Resten); Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine
oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon;
Aminosäuren,
wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Histidin, Arginin oder Lysin;
Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, wie z.B.
Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie z.B. EDTA; Zucker,
wie z.B. Saccharose, Mannit, Trehalose oder Sorbit; salzbildende Gegenionen,
wie z.B. Natrium; Metallkomplexe (z.B. Zn-Protein-Komplexe); und/oder
nicht-ionische Tenside, wie z.B. TWEENTM,
PLURONICSTM oder Polyethylenglykol (PEG).
-
Die
Formulierung hierin kann auch mehr als eine aktive Verbindung enthalten,
wie für
die spezielle Erkrankung, die behandelt werden soll, erforderlich
ist, wobei die aktiven Verbindungen vorzugsweise komplementäre Aktivitäten aufweisen,
die einander nicht negativ beeinflussen. Alternativ oder zusätzlich dazu
kann die Zusammensetzung einen zytotoxischen Wirkstoff, ein Cytokin
oder einen wachstumshemmenden Wirkstoff umfassen. Solche Moleküle sind
auf geeignete Weise in Kombination in Mengen vorhanden, die für den gewünschten
Zweck wirksam sind.
-
Die
Wirkstoffe können
auch in Mikrokapseln eingeschlossen sein, die beispielsweise durch
Koazervationsverfahren oder durch Grenzflächenpolymerisierung hergestellt
werden, wie z.B. Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln
bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln, in kolloidalen Arzneimittelzufuhrsystemen
(z.B. Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen,
Mikroemulsionen, Nanoteilchen und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen.
Solche Verfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl.,
A. Osol (Hrsg.) (1980), offenbart.
-
Die
Formulierungen, die zur In-vivo-Verabreichung eingesetzt werden
sollen, müssen
steril sein. Das kann leicht durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen
erzielt werden.
-
Therapeutische
Zusammensetzungen hierin werden im Allgemeinen in einem Behälter mit
einer sterilen Zugangsöffnung
platziert, beispielsweise einem Beutel mit einer intravenösen Lösung oder
einer Phiole mit einem Verschluss, der mit einer hypodermalen Injektionsnadel
durchstochen werden kann.
-
Es
können
Retard-Präparate
hergestellt werden. Geeignete Beispiele für Retard-Präparate
umfassen semipermeable Matrizen aus festen hydrophoben Polymeren,
die den Antikörper
enthalten, wobei die Matrizen in Form von Formgegenständen vorliegen,
z.B. in Form von Filmen oder Mikrokapseln. Beispiele für Retard-Matrizen
umfassen Polyester, Hydrogele (z.B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat)
oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (
US-Patent Nr. 3.773.919 ), Copolymere
aus L-Glutaminsäure- und γ-Ethyl-L-glutamat,
nicht abbaubarem Ethylenvinylacetat, abbaubaren Milchsäure-Glycolsäure-Copolymeren,
wie z.B. LUPRON DEPOT
TM (injizierbare Mikrokügelchen
aus Milchsäure-Glycolsäure-Copolymer
und Leuprolidacetat) und Poly-D-(-)3-hydroxybuttersäure. Die
Mikroverkapselung von rekombinanten Proteinen für kontrollierte Freisetzung
wurde erfolgreich mit menschlichem Wachstumshormon (rhGH), Interferon-(rhIFN-),
Interleukin-2 und MN rpg 120 durchgeführt. Johnson et al., Nat. Med.
2, 795-799 (1996); Yasuda et al., Biomed. Ther. 27, 1221-1223 (1993); Hora
et al., Bio/Technology 8, 755-758 (1990); Cleland, "Design and Production
fo Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide
Microsphere Systems",
in: Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, 439-462,
Powell und Newman (Hrsg.), Penum Press, New York (1995);
WO 97/03692 ;
WO 96/40072 ;
WO 96/07399 und
US-Patent Nr. 5.654.010 .
-
Die
Retard-Formulierungen dieser Proteine können unter Einsatz von Polymilch-Coglykolsäure-(PLGA-)
Polymer aufgrund dessen Bioverträglichkeit
und weitreichender bioabbaubarer Eigenschaften hergestellt werden.
Die Abbauprodukte von PLGA, Milch- und Glykolsäure können im menschlichen Körper schnell
gereinigt werden. Außerdem
kann die Abbaubarkeit dieses Polymers im Bereich von Monaten bis
Jahren in Abhängigkeit
von seinem Molekulargewicht und seiner Zusammensetzung angepasst
werden. Lewis, "Controlled
release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", in: Biodegradable
Polymers as Drug Delivery Systems, 1-41, M. Chasin und R. Langer
(Hrsg.), Marcel Dekker, New York (1990).
-
Während Polymere,
wie z.B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure, die Freisetzung von Molekülen über einen
Zeitraum von 100 Tagen hinweg ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele
Proteine innerhalb eines kürzeren
Zeitraums frei. Wenn die verkapselten Antikörper über lange Zeit hinweg im Körper bleiben,
kann es aufgrund dessen, dass sie Feuchtigkeit bei 37 °C ausgesetzt
sind, dazu kommen, dass sie denaturieren oder aggregieren, wodurch
es zu einem Verlust der biologischen Aktivität und möglichen Veränderungen in Bezug auf die
Immunogenität
kommt. Es können
in Abhängigkeit
von dem beteiligten Mechanismus rationale Strategien zur Stabilisierung
entwickelt werden. Wenn beispielsweise festgestellt wird, dass es
sich bei dem Aggregationsmechanismus um die Bildung einer intermolekularen
S-S-Bindung durch
Thiosulfidaustausch handelt, kann die Stabilisierung durch die Modifikation
der Sulfhydryl-Reste, das Lyophilisieren aus sauren Lösungen,
die Steuerung des Feuchtigkeitsgehalts unter Einsatz von geeigneten
Additiven und die Entwicklung spezifischer Polymermatrixzusammensetzungen
erfolgen.
-
K. Behandlungsverfahren
-
Es
wird in Betracht gezogen, dass die Verbindungen der vorliegenden
Erfindung zur Behandlung verschiedener Erkrankungen eingesetzt werden
können,
wie z.B. für
die Erkrankungen, die durch eine Überexpression und/oder Aktivierung
der hierin identifizierten, mit einer Erkrankung assoziierten Gene
gekennzeichnet sind. Die Erfindung stellt ähnliche Verwendungen für PRO1122-Polypeptide
und -Antagonisten sowie Antagonisten zur Verwendung in solchen Verfahren,
wie in den Ansprüchen
beschrieben, bereit. Beispielhafte Erkrankungen oder Störungen,
die mit solchen Antikörpern
oder anderen Verbindungen, wie z.B., aber nicht ausschließlich, Antisense-Molekülen etc.,
behandelt werden sollen, umfassen Entzündungs- und Immunerkrankungen,
insbesondere jene, die durch den Abbau der Knorpelmatrix gekennzeichnet
sind, wie z.B. Arthritis (z.B. Osteoarthritis, Arthritis psoriatica,
rheumatische Arthritis), oder andere degenerative Entzündungserkrankungen.
-
Die
Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung, z.B. Antikörper, werden
einem Säugetier,
vorzugsweise einem Menschen, gemäß den bekannten
Verfahren verabreicht, wie z.B. mittels intravenöser Verabreichung als Bolus
oder kontinuierlicher Infusion über
einen bestimmten Zeitraum hinweg, intramuskulär, intraperitoneal, intracerebral,
intracerobrospinal, subkutan, intraartikulär, intrasynovial, intrathekal,
intraokkular, intraläsional, oral,
topisch, mittels Inhalation oder durch kontrollierte Freisetzung.
-
Weitere
Therapieschemata können
mit der Verabreichung von PRO1122 oder einem Antagonisten davon,
z.B. Antikörpern,
der vorliegenden Erfindung kombiniert werden.
-
Zur
Prävention
oder Behandlung von Erkrankungen hängt die geeignete Dosierung
eines Wirkstoffs (z.B. eines Antikörpers) von der Art der zu behandelnden
Erkrankung, wie oben definiert, der Schwere und dem Verlauf der
Erkrankung, vorhergehenden Therapien, der Krankengeschichte des
Patienten und dessen Reaktion auf den Wirkstoff sowie davon ab,
ob der Wirkstoff zu präventiven
oder therapeutischen Zwecken verabreicht wird, und liegt im Ermessen
des behandelnden Arztes. Der Wirkstoff wird dem Patienten auf geeignete Weise
ein Mal oder in einer Reihe von Behandlungen verabreicht.
-
Die
Dosierung und die gewünschte
Arzneimittelkonzentration der pharmazeutischen Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung kann in Abhängigkeit von der speziellen
angedachten Verwendung variieren. Die Bestimmung der geeigneten
Dosierung oder des Verabreichungswegs gehört zu den Fähigkeiten von Fachleuten auf
dem Gebiet. Tierversuche stellen eine verlässliche Orientierung zur Bestimmung
der wirksamen Dosierung für
die Therapie bei Menschen bereit. Die Interspezies-Skalierung wirksamer
Dosierungen kann gemäß den durch
J. Mordenti und W. Chappell, "The
Use of Interspecies Scaling in Toxiokinetics", in: Toxiokinetics and New Drug Development,
42-46, Yacobi et al. (Hrsg.), Pergamon Press, New York (1989), dargelegten
Grundsätzen
erfolgen.
-
Wenn
In-vivo-Verabreichung eines PRO1122-Polypeptids oder Agonisten oder
Antagonisten davon eingesetzt wird, können normale Dosierungsmengen
im Bereich von etwa 10 ng/kg bis zu 100 mg/kg Säugetierkörpergewicht oder mehr pro Tag
liegen, vorzugsweise etwa 1 μg/kg/Tag
bis zu 100 mg/kg Säugetierkörpergewicht
oder mehr pro Tag, abhängig
vom Verabreichungsweg. Orientierung in Bezug auf die speziellen Dosierungen
und Zufuhrverfahren wird in der Literatur bereitgestellt; siehe
z.B.
US-Patente Nr. 4.567.760 ,
5.206.344 oder
5.255.212 . Es ist Teil des Umfangs
der vorliegenden Erfindung, dass verschiedene Formulierungen für verschiedene
Behand lungsverbindungen und verschiedene Störungen wirksam sind, so dass
die Verabreichung, die auf ein Organ oder Gewebe abzielt, beispielsweise
die Zufuhr auf einem anderen Weg erfordern kann als die Zufuhr zu
einem anderen Organ oder Gewebe. Außerdem können die Dosierungen durch eine
oder mehrere getrennte Verabreichungen oder durch kontinuierliche
Infusion verabreicht werden. Bei wiederholter Verabreichung über mehrere
Tage hinweg oder länger,
abhängig
von der Erkrankung, wird die Behandlung fortgesetzt, bis die gewünschte Unterdrückung der
Erkrankungssymptome eintritt. Es können jedoch auch andere Dosierungschemata
wirksam sein. Der Fortschritt dieser Therapie kann leicht durch
herkömmliche
Verfahren und Tests überwacht
werden.
-
L. Fabrikate
-
Es
kann ein Fabrikat bereitgestellt werden, das Materialien enthält, die
für die
Diagnose und Behandlung der oben beschriebenen Störungen wirksam
sind. Das Fabrikat umfasst einen Behälter und eine Markierung. Geeignete
Behälter
umfassen beispielsweise Flaschen, Phiolen, Spritzen und Teströhrchen.
Die Behälter
können
aus verschiedenen Materialien, wie z.B. Glas oder Kunststoff, bestehen.
Der Behälter
enthält
eine Zusammensetzung, die zur Diagnose oder Beahndlung der Erkrankung
wirksam ist, und kann eine sterile Zugangsöffnung aufweisen (beispielsweise
kann der Behälter
ein Beutel mit einer intravenösen
Lösung
oder eine Phiole mit einem Verschluss sein, der mit einer Nadel
zur subkutanen Injektion durchstochen werden kann). Der Wirkstoff
in der Zusammensetzung ist typischerweise ein PRO1122-Polypeptid, ein Antagonist
oder ein Agonist davon. Die Markierung auf oder in Verbindung mit
dem Behälter
weist darauf hin, dass die Zusammensetzung zur Diagnose oder Behandlung
der jeweiligen Erkrankung eingesetzt wird. Das Fabrikat kann weiters einen
zweiten Behälter
umfassen, der einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer, wie z.B.
Phosphat-gepufferte Salzlösung,
Ringersche Lösung
und Dextroselösung,
umfasst. Er kann weiters andere Materialien umfassen, die aus kommerzieller
Hinsicht oder aus Sicht des Anwenders wünschenswert sind, wie z.B.
weitere Puffer, Verdünnungsmittel,
Filter, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Anwendungshinweisen.
-
Die
folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und sollen
den Umfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einschränken.
-
BEISPIELE
-
Im
Handel erhältliche
Reagenzien, auf die in den Beispielen verwiesen wird, wurden, wenn
nicht anders angegeben, gemäß den Herstellerhinweisen
eingesetzt. Die American Type Culture Collection, Rockville, Maryland,
ist die Quelle der in den folgenden Beispielen und in der gesamten
Beschreibung identifizierten, mit ATCC-Zugriffsnummern bezeichneten Zellen.
-
Beispiel 1 nach dem Stand der Technik:
Isolation von cDNA-Klonen, die für
menschliches PRO1031 kodieren
-
Die
extrazellulären
Domänen-(ECD-)
Sequenzen (umfassend das Sekretionssignal, falls vorhanden) von
etwa 950 bekannten sekretierten Proteinen von der öffentlichen
Swiss-Prot-Proteindatenbank wurden eingesetzt, um exprimierte Sequenzmarkierungs-(EST-)
Datenbanken zu durchsuchen. Die EST-Datenbanken umfassten öffentliche
EST-Datenbanken (GenBank, Merck/Wash U.) und eine private EST-DNA-Datenbank (LIFESEQ®,
Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, Kalifornien). Die Suche erfolgte
unter Einsatz des Computerprogramms BLAST oder BLAST2 (Altshul et
al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996)) in Form eines Vergleichs
der ECD-Proteinsequenzen
mit einer 6-Raster-Translation der EST-Sequenz. Diese Vergleiche,
die ein BLAST-Ergebnis von 70 (oder in manchen Fällen 90) oder mehr erbrachten
und nicht für
bekannte Proteine kodierten, wurden mit dem Programm "phrap" (Phil Green, University
of Washington, Seattle, Washington) in Consensus-DNA-Sequenzen geclustert
und angeordnet.
-
Ein
anfängliches
virtuelles Sequenzfragment (Consensus-Anordnung) wurde unter Verwendung
von phrap relativ zu anderen EST-Sequenzen assembliert. Die anfängliche
Consensus-DNA-Sequenz wurde unter Einsatz wiederholter BLAST- und phrap-Zyklen
verlängert,
um die Consensus-Sequenz so weit wie möglich unter Einsatz der oben
genannten EST-Sequenzquellen zu verlängern. Das Ergebnis dieser
Anordnung wird in 5 (Seq.-ID Nr. 5) dargestellt
und wird auch als DNA47332 bezeichnet.
-
Eine
Sequenz, die die Consensus-Anordnung umfasst, W74558 (Klon 344649)
(Seq.-ID Nr. 6), wurde weiterführend
untersucht. Die Sequenz wurde vom IMAGE-Konsortium erhalten und analysiert.
Lennon et al., Genomics 33, 151 (1996). DNA-Sequenzieren ergab die DNA-Sequenz voller
Länge von
PRO1031 (hierin als DNA59294-1381 bezeichnet) (Seq.-ID Nr. 2) und
die abgeleitete PRO1031-Proteinsequenz
(UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1).
-
Die
vollständige
Nucleotidsequenz von DNA59294-1381 ist in 2 dargestellt
(Seq.-ID Nr. 2). Klon DNA59294-1381 enthält einen einzigen offenen Leserater
mit einer offensichtlichen Translationinitiationsstelle an den Nucleotidpositionen
42-44 und endet am Stopp-Codon an den Nucleotidpositionen 582-584
(2) (Seq.-ID Nr. 2). Der vorhergesagte Polypeptid-Vorläufer ist
180 Aminosäuren
lang (1) (Seq.-ID Nr. 1). Das PRO1031-(UNQ516-) Protein
voller Länge,
das in 2 (Seq.-ID Nr. 2) dargestellt
ist, weist ein geschätztes Molekulargewicht
von etwa 20437 und einen pl von etwa 9,58 auf. Klon DNA59294-1381
(Seq.-ID Nr. 2) wurde bei der ATCC hinterlegt und hat die Zugriffsnummer
209866 zugeordnet bekommen. Wenn Sequenzierunregelmäßigkeiten
oder Fehler in den hierin bereitgestellten Sequenzen auftreten,
ist klar, dass der hinterlegte Klon die korrekte Sequenz für DNA59624
(Seq.-ID Nr. 2) enthält.
Außerdem
sind die hierin bereitgestellten Sequenzen das Ergebnis bekannter
Sequenzierungsverfahren.
-
Die
Analyse der Aminosäuresequenz
des PRO1031-Polypeptids voller Länge
(UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) deutet darauf hin, dass es sich um ein
neues Cytokin handelt.
-
Eine
weitere Analyse der Aminosäuresequenz
aus Seq.-ID Nr. 2 zeigt, dass sich das vermutliche Signalpeptid
etwa bei den Aminosäuren
1-20 von Seq.-ID Nr. 2 befindet.
-
Eine
N-Glykosylierungsstelle befindet sich etwa bei den Aminosäuren 75-78
von Seq.-ID Nr. 2. Eine Region, die Sequenzidentität mit IL-17
aufweist, befindet sich etwa bei den Aminosäuren 96-180. Die entsprechenden
Nucleotide können
anhand der hierin bereitgestellten Sequenzen routinemäßig bestimmt
werden.
-
BEISPIEL 1: Isolation von cDNA-Klonen,
die für
menschliches PRO1122 kodieren.
-
Eine
exprimierte Sequenzmarkierungs-(EST-) DNA-Datenbank (LIFESEQ®,
Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, Kalifornien) wurde durchsucht,
und eine EST wurde identifiziert. Dabei handelte es sich um Incyte 1347523
(Seq.-ID Nr. 7), die auch als DNA49665 bezeichnet wird. Basierend
auf DNA49665 (Seq.-ID Nr. 7) wurden Oligonucleotide synthetisiert:
1) zur Identifikation einer cDNA-Bibliothek, die die Sequenz von
Interesse enthielt, mittels PCR und 2) zur Verwendung als Sonden
zur Isolation eines Klons der für
PRO1122-kodierenden Sequenz voller Länge (z.B. Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory
Press, New York (1989); Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laborstory
Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press (1995)).
-
Vorwärts- und
Rückwärts-PCR-Primer
umfassen im Allgemeinen 20 bis 30 Nucleotide und sind oft so gestaltet,
dass sie ein PCR-Produkt mit einer Länge von etwa 100-1000 bp liefern.
Die Sondensequenzen sind typischerweise 40-55 bp lang. In manchen
Fällen
werden zusätzliche
Oligonucleotide synthetisiert, wenn die Consensus-Sequenz mehr als
1-1,5 kpb aufweist. Um verschiedene Bibliotheken in Bezug auf einen
Klon voller Länge
zu screenen, wurde die DNA von den Bibliotheken mittels PCR-Amplifikation,
nach Ausuble et al., Current Protocols in Molecular Biology, mit
dem PCR-Primerpaar gescreent. Eine positive Bibliothek wurde dann
verwendet, um unter Einsatz des Sondenoligonucleotids und eines
der Primerpaare Klone zu isolieren, die für das Gen von Interesse kodieren.
-
PCR-Primer
(Vorwärts-,
Rückwärts- und
Hybridisierungs-) wurden synthetisiert:
Vorwärts-PCR-Primer:
5'-ATCCACAGAAGCTGGCCTTCGCCG-3' (Seq.-ID Nr. 8)
Rückwärts-PCR-Primen:
5'-GGGACGTGGATGAACTCGGTGTGG-3' (Seq.-ID Nr. 9)
Hybridisierungssonde:
5'-TATCCACAGAAGCTGGCCTTCGCCGAGTGCCTGTGCAGAG-3' (Seq.-ID Nr. 10).
-
Um
verschiedene Bibliotheken in Bezug auf eine Quelle eines Klons voller
Länge zu
screenen, wurde DNA von den Bibliotheken mittels PCR-Amplifikation
mit dem oben identifizierten PCR-Primerpaar gescreent. Dann wurde
eine positive Bibliothek verwendet, um unter Einsatz der Oligonucleotidsonde
und einem der PCR-Primer Klone zu isolieren, die für das PRO1122-Gen
kodieren.
-
RNA
zur Herstellung der cDNA-Bibliotheken wurde aus menschlichem fötalem Nierengewebe
isoliert. Die cDNA-Bibliotheken, die zur Isolation der cDNA-Klone
eingesetzt wurden, wurden unter Einsatz von Standardverfahren und
im Handel erhältlichen
Reagenzien, wie z.B. jenen von Invitrogen, San Diego, Kalifornien, erstellt.
Die cDNA wurde mit Oligo-dT, das eine Notl-Stelle enthielt, geprimt,
mit dem Blunt-Ende an Sall-hemikinasierte Adaptoren gebunden, mit
Notl gespalten, durch Gelelektrophorese angemessen klassiert und
in einer definierten Orientierung in einen geeigneten Klonierungsvektor
(wie z.B. pRKB oder pRKD; pRK5B ist ein Vorläufer von pRK5D, der die Sfil-Stelle
nicht enthält;
siehe Holmes et al., Science 235, 1278-1280 (1991)) an den einzigen Xhol- und
Notl-Stellen kloniert.
-
DNA-Sequenzieren
der wie oben beschrieben isolierten Klone ergab eine DNA-Sequenz voller Länge für PRO1122
(hierin als DNA62377-1381-1 bezeichnet) (Seq.-ID Nr. 4) und die abgeleitete Protein-PRO1122-Sequenz
(UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3).
-
Die
vollständige
Nucleotid-Sequenz von DNA62377-1381-1 (Seq.-ID Nr. 4) ist in 4A-4B (Seq.-ID Nr.
4) dargestellt. Klon DNA62377-1381-1 (Seq.-ID Nr. 4) enthält einen
einzigen offenen Leseraster mit einer offensichtlichen Translationsinitiationsstelle
an den Nucleotidpositionen 50-52 und einem Ende am Stopp-Codon an
den Nucleotidpositionen 641-643 von Seq.-ID Nr. 4 (4A-4B). Der vorhergesagte Polypeptidvorläufer ist
197 Aminosäuren
lang (3) (Seq.-ID Nr. 3). Das PRO1122-Protein voller
Länge in 3 (UNQ561) (Seq.-ID
Nr. 3) weist schätzungsweise
ein Molekulargewicht von etwa 21765 Dalton und einen pl von etwa
8,53 auf. Klon DNA62377-1381-1
wurde am 22. Dezemter 1998 bei der ATCC hinterlegt und hat die Zugriffsnummer 203552
zugeordnet bekommen. Es ist klar, dass im Falle einer Sequenzirregularität oder eines
Fehlers in den hierin bereitgestellten Sequenzen die hinterlegte
Sequenz die korrekte Sequenz ist. Außerdem sind alle hierin bereitgestellten
Sequenzen das Ergebnis bekannter Sequenzierungsverfahren.
-
Die
Analyse der Aminosäuresequenz
von isoliertem PRO1122 (UNQ561) voller Länge deutet darauf hin, dass
dieses Ähnlichkeit
mit IL-17 aufweist, was darauf hinweist, dass PRO1122 (UNQ561) ein
neues Cytokin sein kann. 3 (Seq.-ID
Nr. 3) zeigt auch die ungefähren
Stellen, an denen sich die Signalpeptide, die Leucin-Zipper-Struktur und eine
Region mit Sequenzidentität
mit IL-17 befinden. Die entsprechenden Nucleotide können routinemäßig z.B.
unter Bezugnahme auf 4A-4B bestimmt werden.
-
BEISPIEL 2: Verwendung von für PRO1122
kodierender DNA als Hybridisierungssonde
-
Das
folgende Verfahren beschreibt die Verwendung einer Nucleotidsequenz,
die für
PRO1122 kodiert, als Hybridisierungssonde.
-
DNA,
die die Kodiersequenz für
PRO1122 voller Länge
(wie in 4 dargestellt, Seq.-ID Nr.
4) oder ein Fragment davon umfasst, wird als Sonde für das Screenen
in Bezug auf homologe DNA (wie z.B. die, die für natürlich vorkommende Varianten
von PRO1122 in menschlichen Gewebe-cDNA-Bibiotheken oder menschlichen
Gewebe-Genombibliotheken
kodieren) eingesetzt.
-
Das
Hybridisierung und Waschen von Filtern, die DNA aus einer der Bibliotheken
enthalten, erfolgt unter folgenden hochstringenten Bedingungen.
Hybridisierung von radioaktiv markierten, von PRO1122-Polypeptid
abgeleiteten Sonden an die Filter erfolgt 20 h lang in einer Lösung aus
50 % Formamid, 5 × SSC,
0,1 % SDS, 0,1 % Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumphosphat, pH
6,8, 2 × Denhardtscher
Lösung
und 10 % Dextransulfat bei 42 °C.
Das Waschen der Filter erfolgt in einer wässrigen Lösung aus 0,1 × SSC und
0,1 % SDS bei 42 °C.
-
DNA
mit der erwünschten
Sequenzidentität
mit der DNA, die für
das Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid
voller Länge
kodiert, kann dann unter Einsatz von Standardverfahren, die auf
dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, identifiziert werden.
-
BEISPIEL 3: Expression von PRO1122-Polypeptiden
in E. coli
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung von unglykosylierten Formen
von PRO1122-Polypeptiden durch rekombinante Expression in E. coli.
-
Die
DNA-Sequenz, die für
PRO1122 voller Länge
oder ein Fragment oder eine Variante davon kodiert, wird zunächst unter
Einsatz von ausgewählten
PCR-Primern amplifiziert. Die Primer sollten Restriktionsenzymstellen
enthalten, die den Restriktionsenzymstellen an dem ausgewählten Expressionsvektor
entsprechen. Verschiedene Expressionsvektoren können eingesetzt werden. Ein
Beispiel für
einen geeigneten Vektor ist pBR322 (abgeleitet von E. coli; siehe
Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)), der Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz
enthält.
Der Vektor wird mit dem Restriktionsenzym verdaut und dephosphoryliert.
Die mit PCR amplifizierten Sequenzen werden dann in den Vektor ligiert.
Der Vektor umfasst vorzugsweise Sequenzen, die für ein Antibiotika-Resistenz-Gen
kodieren, einen trp-Promotor, einen Polt'-His-Leader (umfassend die ersten 6
STII-Codons, eine Polt'-His-Sequenz
und eine Enterokinasespaltungsstelle), die für PRO1122 kodierende Region, λ-Transkriptionsterminator
und ein argU-Gen.
-
Das
Ligationsgemisch wird dann eingesetzt, um einen ausgewählten E.-coli-Stamm
unter Einsatz der in Sambrook et al., s.o., beschriebenen Verfahren
zu transformieren. Transformanten werden durch ihre Fähigkeit
identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen, wonach Antibiotika-Resistenz-Kolonien
ausgewählt
werden. Plasmid-DNA kann isoliert und mittels Restriktionsanalyse
und DNA-Sequenzieren bestätigt
werden.
-
Ausgewählte Klone
können über Nacht
in einem flüssigen
Nährmedium,
wie z.B. mit Antibiotika ergänzter
LB-Kulturlösung,
gezüchtet
werden. Die Über-Nacht-Kultur
kann in der Folge eingesetzt werden um eine Kultur größeren Maßstabs zu
inokulieren. Die Zellen werden dann zu einer gewünschten optischen Dichte gezüchtet, wobei
währenddessen
der Expressionspromotor angeschaltet ist.
-
Nach
dem Kultivieren der Zellen für
mehrere weitere Stunden können
die Zellen durch Zentrifugieren geerntet werden. Das durch Zentrifugieren
erhaltene Zellpellet kann unter Einsatz verschiedener Mittel, die
auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, solubilisiert werden,
und das solubilisierte PRO1122-Polypeptid kann dann unter Einsatz
einer Metallchelatsäule
unter Bedingungen gereinigt werden, die eine enge Bindung des Polypeptids
ermöglichen.
-
BEISPIEL 4: Expression von PRO1122-Polypeptiden
in Säugetierzellen
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung von glykosylierten Formen
von PRO1122-Polypeptiden durch rekombinante Expression in Säugetierzellen.
-
Der
Vektor pRK5 (siehe
EP 307.247 ,
veröffentlicht
am 15. März
1989) wird als Expressionsvektor eingesetzt. Faktultativ wird die
für PRO1122
kodierende DNA unter Einsatz von Ligationsverfahren, wie den in Sambrook
et al., s.o., beschriebenen, mit ausgewählten Restriktionsenzymen in
pRK5 ligiert, um die Insertion von für PRO1122 kodierender DNA zu
ermöglichen.
Der resultierende Vektor wird als pRK5-PRO1122 bezeichnet.
-
In
einer Ausführungsform
kann es sich bei den ausgewählten
Wirtszellen um 293-Zellen
handeln. Menschliche 293-Zellen (ATCC CCL 1573) werden in Gewebekulturplatten
in einem Medium, wie z.B. mit fötalem
Kälberserum
und gegebenenfalls Nährstoffkomponenten
und/oder Antibiotika ergänztem
DMEM, zu Konfluenz gezüch tet.
Etwa 10 μg
pRK5-PRO1122-DNA wird mit etwa 1 μg
DNA, die für
das VA-RNA-Gen (Thimmappaya
et al., Cell 31, 543 (1982)) kodiert, gemischt und in 500 μl 1 mM Tris-HCl,
0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl2 gelöst. Zu diesem
Gemisch werden 500 μl
50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO4 zugetropft,
und die Bildung von Niederschlag wird 10 min lang bei 25 °C ermöglicht.
Der Niederschlag wird dann suspendiert und zu den 293-Zellen zugesetzt
und kann sich dann etwa 4 h lang bei 37 °C absetzen. Das Nährmedium
wird abgesaugt, und 2 ml 20%iges Glycerin in PBS wird 30 s lang
zugesetzt. Die 293-Zellen werden dann mit serumfreiem Medium gewaschen,
frisches Medium wird zugesetzt, und die Zellen werden etwa 5 Tage
lang inkubiert.
-
Etwa
24 h nach den Transfektionen wird das Nährmedium entfernt und durch
Nährmedium
(allein) oder Nährmedium,
das 200 μCi/ml 35S-Cystein und 200 μCi/ml 35S-Methionin enthält, ersetzt.
Nach einer 12-ständigen
Inkubation wird das konditionierte Medium gesammelt, auf einem Rotationsfilter
konzentriert und auf ein 15%iges SDS-Gel geladen. Das verarbeitete Gel kann
getrocknet werden und für
eine bestimmte Dauer einem Film ausgesetzt werden, um das Vorhandensein
von PRO1122-Polypeptid
zu zeigen. Die Kulturen, die transfizierte Zellen enthalten, können weiter
inkubiert werden (in serumfreiem Medium), und das Medium wird in
ausgewählten
Biotests getestet.
-
Bei
einem alternativen Verfahren kann für PRO1122 kodierende DNA vorübergehend
in 293-Zellen eingeführt
werden, indem das von Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
12, 7575 (1981), beschriebene Dextransulfat-Verfahren eingesetzt
wird. 293-Zellen
werden in einer Spinnerflasche zu maximaler Dichte gezüchtet, und
700 μg pRK5-PRO1122-DNA
werden zugesetzt. Die Zellen werden zunächst aus der Spinnerflasche
mittels Zentrifugieren konzentriert und mit PBS gewaschen. Der DNA-Dextran-Niederschlag
wird auf dem Zellpellet 4 h lang inkubiert. Die Zellen werden mit
20 % Glycerin 90 s lang behandelt, mit Gewebekulturmedium gewaschen
und wieder in die Spinnerflasche gefüllt, die Gewebekulturmedium,
5 μg/ml
Rinderinsulin und 0,1 μg/ml
Rindertransferrin enthält.
Nach etwa 4 Tagen wird das konditionierte Medium zentrifugiert und
zur Entfernung von Zellen und Zellbruchstücken filtriert. Die Probe,
die exprimiertes PRO1122-Polypeptid enthält, kann dann durch ein beliebig
ausgewähltes
Verfahren, wie z.B. Dialyse und/oder Säulenchromatographie, konzentriert
und gereinigt werden.
-
In
einer anderen Ausführungsform
kann das PRO1122-Polypeptid in CHO-Zellen exprimiert werden. Der
pRK5-PRO1122-Vektor kann in CHO-Zellen unter Einsatz von bekannten
Reagenzien, wie z.B. CaPO4 oder DEAE-Dextran,
transfiziert werden. Wie oben beschrieben können die Zellkulturen inkubiert
werden und das Medium durch Nährmedium
(allein) oder ein Medium ersetzt werden, das radioaktive Markierungen,
wie z.B. 35S-Methionin, enthält. Nach
Bestimmung des Vorhandenseins von PRO1122-Polypeptid kann das Kulturmedium
durch serumfreies Medium ersetzt werden. Vorzugsweise werden die
Kulturen etwa 6 Tage lang inkubiert, wonach das konditionierte Medium
geerntet wird. Das Medium, das exprimiertes PRO1122-Polypeptid enthält, kann
dann durch ein beliebig ausgewähltes
Verfahren konzentriert und gereinigt werden.
-
Epitop-markiertes
PRO1122-Polypeptid kann auch in CHO-Wirtszellen exprimiert werden.
Die für PRO1122
kodierende DNA kann aus dem pRK5-Vektor subkloniert werden. Das
Subklon-Insert kann PCR unterzogen werden, um im Raster mit einer
ausgewählten
Epitop-Markierung, wie z.B. einer Poly-His-Markierung, in einen
Baculovirus-Expressionsvektor zu fusionieren. Das Poly-His-markierte,
für PRO1122
kodierende DNA-Insert kann dann in einen SV40-gesteuerten Vektor,
der einen Selektionsmarker, wie z.B. DHFR, zur Auswahl von stabilen
Klonen enthält,
subkloniert werden. Schließlich
können
die CHO-Zellen mit dem SV40-gesteuerten Vektor (wie oben beschrieben)
transfiziert werden. Es kann eine Markierung durchgeführt werden, wie
oben beschrieben, um die Expression zu verifizieren. Das Kulturmedium,
das das exprimierte Poly-His-markierte PRO1122-Polypeptid enthält, kann
dann durch ein beliebig ausgewähltes
Verfahren, wie z.B. Ni2 +-Chelat-Affinitätschromatographie,
konzentriert und gereinigt werden.
-
BEISPIEL 5: Expression eines PRO1122-Polypeptids
in Hefe
-
Das
folgende Verfahren beschreibt die rekombinante Expression von PRO1122-Polypeptiden in Hefe.
-
Zunächst werden
Hefe-Expressionsvektoren zur intrazellulären Produktion oder Sekretion
von PRO1122-Polypeptid aus dem ADH2/GAPDH-Promotor hergestellt.
DNA, die für
das PRO1122-Polypeptid von Interesse, ein ausgewähltes Signalpeptid und den
Promotor kodiert, wird in geeignete Restriktionsenzymstellen in
dem ausgewählten
Plasmid zur Steuerung der intrazellulären Expression des PRO1122-Polypeptids insertiert.
Zur Sekretion kann die DNA, die für das PRO1122-Polypeptid kodiert,
in das ausgewählte
Plasmid, gemeinsam mit der für
den ADH2/GAPDH-Promotor kodierenden DNA, der Hefe-α-Faktor-Sektetionssignal-/Leader-Sequenz
und (bei Bedarf) Linker-Sequenzen, zur Expression des PRO1122-Polypeptids
kloniert werden.
-
Hefezellen,
wie z.B. Hefestamm AB110, können
durch das oben beschriebene Expressionsplasmid transformiert und
in ausgewählten
Fermentationsmedien kultiviert werden. Die transformierten Hefeüberstände können durch
Ausfällung
mit 10 % Trichloressigsäure
und Trennung mittels SDS-PAGE gefolgt von Färben der Gele mit Coomassie-Blau-Farbstoff
analysiert werden.
-
Rekombinantes
PRO1122-Polypeptid kann in der Folge isoliert werden und durch Entfernen
der Hefezellen aus dem Fermentationsmedium mittels Zentrifugieren
und anschließendes
Konzentrieren des Mediums unter Einsatz von ausgewählten Patronenfiltern
gereinigt werden. Das Konzentrat, das das PRO1122-Polypeptid enthält, kann
unter Einsatz ausgewählter
Säulenchromatographie-Harze
weiter gereinigt werden.
-
BEISPIEL 6: Expression von PRO 1122-Polypeptiden
in mit Baculovirus infizierten Insektenzellen
-
Das
folgende Verfahren beschreibt die rekombinante Expression von PRO1122-Polypeptiden in mit Baculovirus
infizierten Insektenzellen.
-
Die
für PRO1122
kodierende DNA wird stromauf einer Epitop-Markierung fusioniert,
die Teil eines Baculovirus-Expressionsvektors ist. Solche Epitop-Markierungen
umfassen Poly-His-Markierungen und Immunglobulin-Markierungen (wie
z.B. Fc-Regionen
von IgG). Verschiedene Plasmide können eingesetzt werden, wie
z.B. Plasmide, die von im Handel erhältlichen Plasmiden, wie z.B.
pVL1393 (Novagen), stammen. Kurz gesagt wird die für PRO1122
kodierende DNA oder der gewünschte
Teil der für
PRO1122 kodierenden DNA (wie z.B. die Sequenz, die für die extrazelluläre Domäne eines
Transmembranproteins kodiert) mittels PCR mit Primern amplifiziert,
die in Bezug auf die 5'-
und 3'-Regionen
komplementär
sind. Der 5'-Primer
kann (ausgewählte)
flankierende Restriktionsenzymstellen aufweisen. Das Produkt wird
dann mit den ausgewählten
Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert.
-
Rekombinantes
Baculovirus wird durch das Co-Transfizieren des oben genannten Plasmids
und BaculoGoldTM-Virus-DNA (Pharmingen)
in Spodoptera-frugiperda("Sf9"-) Zellen (ATCC CRL
1711) unter Einsatz von Lipofectin (im Handel von GIBCO-BRL erhältlich)
erzeugt. Nach 4- bis 5-tägiger
Inkubation bei 28 °C
wurden die freigesetzten Viren geerntet und für weitere Amplifikationen eingesetzt.
Virusinfektion und Proteinexpression erfolgen wie von O'Reilley et al., Baculovirus
Expression vectors: A Laborstory Manual, Oxford University Press,
Oxford (1994), beschrieben.
-
Exprimiertes
Poly-His-markiertes PRO1122-Polypeptid kann dann beispielsweise
durch Ni2+-Chelataffinitätschromatographie wie folgt
gereinigt werden. Extrakte werden aus rekombinanten Virus-infizierten Sf9-Zellen
wie von Rupert et al., Nature 362, 175-179 (1993), beschrieben hergestellt.
Kurz gesagt werden Sf9-Zellen gewaschen, erneut in Beschallungspuffer
(25 ml Hepes, pH 7,9; 12,5 mM MgCl2; 0,1
mM EDTA; 10 % Glycerin; 0,1 % NP-40; 0,4 M KCl) suspendiert und
zwei Mal 20 s lang auf Eis beschallt. Die beschallten Präparate werden
durch Zentrifugieren gereinigt, und der Überstand wird 50fach in Ladepuffer
(50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10 % Glycerin, pH 7,8) verdünnt und
durch einen 0,45-μm-Filter
filtriert. Eine Ni2+-NTA-Agarose-Säule (im Handel von Qiagen erhältlich)
wird mit einem Bettvolumen von 5 ml hergestellt, mit 25 ml Wasser
gewaschen und mit 25 ml Ladepuffer äquilibriert. Das filtrierte
Zellextrakt wird mit 0,5 ml pro Minute auf die Säule geladen. Die Säule wird
mit Ladepuffer auf A280-Basisline gewaschen,
wobei an diesem Punkt das Sammeln der Fraktionen beginnt. Dann wird
die Säule
mit einem zweiten Waschpuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10 %
Glycerin, pH 6,0) gewaschen, der nicht-spezifisch gebundenes Protein
eluiert. Nach erneutem Erreichen der A280-Basisline
wird die Säule
mit einem Imidazol-Gradienten von 0 bis 500 mM in dem zweiten Waschpuffer
entwickelt. 1-ml-Fraktionen werden gesammelt und mittels SDS-PAGE
und Silberfärben
oder Western-Blotting mit an alkalische Phosphatase konjugiertem
Ni2+-NTA (Qiagen) analysiert. Fraktionen,
die das eluierte His10-markierte PRO1122-Polypeptid
enthalten, werden gepoolt und gegen Ladepuffer dialysiert.
-
Alternativ
dazu kann die Reinigung des IgG-markierten (oder Fc-markierten)
PRO1122-Polypeptids unter Einsatz bekannter Chromatographieverfahren,
wie z.B. Protein-A- oder Protein-G-Säulenchromatographie, erfolgen.
-
BEISPIEL 7: Herstellung von Antikörpern, die
PRO1122-Polypeptide binden
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die
spezifisch an PRO1122-Polypeptide binden können.
-
Verfahren
zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern sind auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt und werden beispielsweise in Goding, s.o., beschrieben.
Immunogene, die eingesetzt werden können, umfassen gereinigtes
PRO1122-Polypeptid, Fusionsproteine, die ein PRO1122-Polypeptid
enthalten, und Zellen, die rekombinan tes PRO1122-Polypeptid auf
der Zelloberfläche
exprimieren. Die Auswahl des Immunogens kann durch Fachleute auf
dem Gebiet der Erfindung ohne übermäßiges Experimentieren
erfolgen.
-
Mäuse, wie
z.B. Balb/c, werden mit dem in komplettem Freundschem Adjuvans emulgierten PRO1122-Immunogen,
das subkutan oder intraperitoneal in einer Menge von 1-100 μg injiziert
wird, immunisiert. Alternativ dazu wird das Immunogen in MPL-TDM-Adjuvans (Ribi
Immunochemical Research, Hamilton, MT) emulgiert und in die Hinterpfotenballen
der Tiere injiziert. Die immunisierten Mäuse werden dann 10 bis 12 Tage
später
mit zusätzlichem,
in dem ausgewählten
Adjuvans emulgiertem Immunogen geboostet. Danach können die
Mäuse mehrere
Wochen lang mit zusätzlichen
Immunisierungsinjektionen geboostet werden. Serumproben der Mäuse können regelmäßig durch
retro-orbitale Blutabnahmen für
ELISA-Tests zum Nachweis von Anti-PRO1122-Polypeptid-Antikörpern erhalten
werden.
-
Nach
Nachweis eines geeigneten Antikörper-Titers
kann den in Bezug auf Antikörper "positiven" Tieren eine letzte
intravenöse
Injektion des PRO1122-Polypeptids injiziert werden. 3 bis 4 Tage
später
werden die Mäuse
getötet,
und die Milzzellen werden geerntet. Die Milzzellen werden dann (unter
Einsatz von 35 % Polyethylenglykol) an eine ausgewählte Mausmyelomzelllinie,
wie z.B. P3X63AgU.1, erhältlich
von ATCC, Nr. CRL 1597, fusioniert. Die Fusionen erzeugen Hybridomzellen,
die dann in 96-Well-Gewebekulturplatten,
die HAT- (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) Medium enthalten,
zur Hemmung der Proliferation von nicht-fusionierten Zellen, Myelomhybriden
und Milzzellenhybriden ausplattiert.
-
Die
Hybridomzellen werden in einem ELISA-Test in Bezug auf Reaktivität gegenüber PRO1122-Polypeptid
gescreent. Die Bestimmung "positiver" Hybridomzellen,
die die gewünschten
monoklonalen Antikörper gegen
ein PRO1122-Polypeptid sekretieren, ist auf dem Gebiet der Erfindung
bekannt.
-
Die
positiven Hybridomzellen können
intraperitoneal in syngene Balb/c-Mäuse zur Herstellung von monoklonale
Anti-PRO1122-Polypeptid-Antikörper
aufweisendem Aszites injiziert werden. Alterantiv dazu können die
Hybridomzellen in Gewebekulturflaschen oder Rollerflaschen kultiviert
werden. Die Reinigung der in dem Aszites produzierten monoklonalen
Antikörper
können
unter Einsatz von Ammoniumsulfat-Ausfällung gefolgt
von Gelausschlusschromatographie erfolgen. Alternativ dazu kann
eine Affinitätschromatographie
basierend auf der Bindung des Antikörpers an Protein A oder Protein
G eingesetzt werden.
-
BEISPIEL 8: RNA-Expression
-
Mehrfach-Gewebe-Blots,
die Poly-A+-RNA (2 μg pro Spur) aus verschiedenen
menschlichen Geweben enthielten, wurden von Clontech (Palo Alto,
Kalifornien) bezogen. Die vollständigen
CKdierregionen von menschlichem IL-17B (UNQ516) (700 bp) (Seq.-ID
Nr. 1) und IL-17C (UNQ561) (1,1 kbp) (Seq.-ID Nr. 18) wurden als
Hybridisierungssonden eingesetzt. DNA-Sonden wurden mit [α-32P]-dCTP durch zufälliges Primen von DNA-Markierungsperlen
(Pharmacia Biotech) markiert. Die Hybridisierung erfolgte unter
Einsatz von Expresshyb (Clontech), das die radioaktiv markierten
Sonden enthielt, 1 h lang bei 68 °C.
Die Blots wurden dann mit 2 × SSC/0,05
% SDS-Lösung
bei Raumtemperatur 40 min lang gewaschen, gefolgt von Waschen in
0,1 × SSC/0,05
% SDS-Lösung
40 min lang bei 55 °C
mit einem Austausch durch frische Lösung. Die Blots wurden in einem
Phosphor-Bildgeber entwickelt, und das resultierende Bild wurde
dann als 8 hierin aufgenommen.
-
Für IL-17B
(Seq.-ID Nr. 1) wurde ein 800-bp-mRNA-Transkript in Bauchspeicheldrüse, Dünndarm und Magen
von adultem menschlichem Gewebe gefunden; eine schwächere Bande
wurde in den Hoden nachgewiesen (8). IL-17C-
(Seq.-ID Nr. 2) Expression wurde in denselben adulten menschlichen
Geweben untersucht, wobei jedoch keine nachweisbaren Signale beobachtet
wurden.
-
Beispiel 9: Erzeugung von Fc/His-Fusionsproteinen
-
Die
Kodiersequenzen von IL-17B (Seq.-ID Nr. 17) und IL-17C (Seq.-ID
Nr. 18) wurden mittels PCR amplifiziert und in die EcoRI- und Smal-Stellen
von pBPH.His.c zur Erzeugung einer C-terminalen GHHHHHHHH-Markierung
(Seq.-ID Nr. 19) oder die EcoRI- und Stu-Stellen von pBPH.IgG zur
Erzeugung einer C-terminalen Fusion mit der Fc-Region von menschlichem
IgG1 subkloniert. Die Vektoren pBPH.His.c und pBPH.IgG sind Derivate
des Baculovirus-Expressionsvektors pVL1393 (Pharmingen). Ein Fc-
oder His-markiertes Kontrollprotein wurde auf ähnliche Weise durch die C-terminale
Verbindung von Pancreatitis-assoziiertem Protein (175 Aminosäuren) an
den Fc-Anteil von menschlichem IgG1 oder eine His8-Markierung hergestellt.
-
Die
Fusionsproteine wurden in H5-Zellen unter Einsatz des durch den
Hersteller empfohlenen Verfahrens (Invitrogen) exprimiert. Kurz
gesagt wurden die DNA-Konstrukte
mit BaculoGold-Baculovirus-DNA (Pharmingen) in einem 7:1-Verhältnis in
adhärente
Sf9-Zellen co-transfiziert. Die Zellen wurden 4 Tage lang bei 28 °C inkubiert,
und der Überstand
wurde geerntet. Der Transfektionsüberstand wurde amplifiziert
und durch Protein-A-Sepharose-Perlen (Pharmacia) für Fc-Fusionsproteine
oder Ni-NTA-Agaroseperlen (QIAGEN) für His-markierte Proteine einer
Affinitätsreinigung
unterzogen.
-
Um
die Proteinexpression zu untersuchen, wurde eine SDS-PAGE-Analyse
der affinitätsgereinigten rekombinanten
Proteine unter nicht-reduzierenden und reduzierenden Bedingungen
gefolgt von Silberfärben durchgeführt.
-
Beispiel 10: Induktion von IL-6- und TNF-α-Freisetzung
-
Unter
Einsatz des in Yao et al., J. Immunol. 155, 5483 (1995) (Yao-2),
für IL-6-
(Seq.-ID Nr. 14)
Freisetzung beschriebenen Verfahrens wurden menschliche Vorhautfibroblastenzellen
(ATCC CRL-2091) in MEM-Medien (10 % FBS) mit dem Testcytokin kultiviert.
Nach 18-ständiger
Inkubation bei 37 °C
und 5 % CO2 wurden die konditionierten Medien
in Bezug auf IL-6 unter Einsatz eines ELISA-Sets (R&D Systems) getestet. Zur
TNF-α-Sekretion
wurden menschliche Leukämie-Monozyten-THP-1-Zellen in RPMI-Medien
(10 % FBS) mit dem Testcytokin kultiviert. Nach 18-stündiger Inkubation
bei 37 °C
und 5 % CO2 wurden die konditionierten Medien
in Bezug auf TNF-α (Seq.-ID
Nr. 20) unter Einsatz eines ELISA-Testsets (R&D Systems) mengenmäßig analysiert.
-
Menschliche
Vorhaut-Fibroblastenzellen (ATCC) wurden getrennt in MEM-Medien
(10 % FBS) in Gegenwart von IL-17B (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) und
IL-17C (UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3) kultiviert. Nach 18-stündiger Inkubation
bei 37 °C
und 5 % CO2 wurden die konditionierten Medien
unter Einsatz eines ELISA-Sets (R&D Systems)
in Bezug auf IL-6 (Seq.-ID Nr. 14) getestet. Im Gegensatz zu dem
durch IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) induzierten hohen IL-6-Spiegel (Seq.-ID
Nr. 14) gelang es weder IL-17B
(Seq.-ID Nr. 1) noch IL-17C (Seq.-ID Nr. 3), die Sekretion von IL-6
(Seq.-ID Nr. 14) in Fibroblastenzellen zu stimulieren (9A).
-
Unter
Einsatz des in Yao et al., Cytokine 9, 194 (1997) (Yao-3), dargelegten
Verfahrens wurde eine menschliche Leukämie-Monozyten-Zelllinie, THP1,
zum Testen der Stimulation der TNF-α- (Seq.-ID Nr. 20) Freisetzung
durch IL-17 (Seq.-ID Nr. 11), UNQ516 (Seq.-ID Nr. 1) und UNQ561
(Seq.-ID Nr. 3) durch Kultivieren in RPMI-Medien (10 % FBS) eingesetzt. Nach 18-stündiger Inkubation
bei 37 °C
und 5 % CO2 wurde TNF-α (Seq.-ID
Nr. 19) in den konditionierten Medien unter Einsatz eines ELISA-Sets
(R&D Systems)
mengenmäßigen bestimmt.
Während
IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) nur einen geringen TNF-α-Spiegel (Seq.-ID Nr. 19) in THP-1-Zellen
induzierte, stimulierten sowohl IL-17B als auch IL-17C (als Fc-Fusionsproteine)
TNF-α-Produktion in THP-1-Zellen
(9B). Ein Kontroll-Fc-Fusionsprotein zeigte keine
Wirkung.
-
Um
die Stimulation von TNF-α-Freisetzung
durch IL-17B und IL-17C weiter zu charakterisieren, wurden Zeitverlauf
und Konzentrationsabhängigkeit
der Reaktion in THP-1-Zellen analysiert. 10 zeigt,
dass IL-17B (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C (UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3) die Freisetzung
von TNF-α (Seq.-ID
Nr. 19) in Abhän gigkeit
von Zeit und Konzentration stimulieren. Der EC50 für die Stimulation
durch IL-17B (UNQ516)
(Seq.-ID Nr. 1) beträgt
2,4 nM, während
jener für
IL-17C (UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3) 25 nM beträgt.
-
Während die
in diesen Experimenten verwendeten IL-17B-(UNQ516) (Seq.-ID Nr.
1) und IL-17C-(UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3) Präparate nicht nachweisbare Mengen
Endotoxin (weniger als 1 EU/ml) enthielten, wurden zusätzliche
Kontrollexperimente durchgeführt,
um zu bestätigen,
dass die TNF-α-(Seq.-ID
Nr. 19) Feisetzung durch THP-1-Zellen real und nicht künstlich
war. Die IL-17B-(UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C-(UNQ561) (Seq.-ID
Nr. 3) Aktivitäten
wurden durch eine Polymyxin-B-Behandlung
nicht beeinträchtigt und
durch Hitzebehandlung aufgehoben, was weiter die Ansicht unterstützt, dass
die Proteine selbst, und nicht das verunreinigende Endotoxin, für die Aktivitäten verantwortlich
waren.
-
Beispiel 11: IL-I 7-Rezeptorbindung
-
Klonieren der ECD eines hIL-17-Rezeptors:
-
Um
die ECD eines menschlichen IL-17-Rezeptors zu klonieren, wurden
zwei Oligonucleotid-Primer an den 5'- und 3'-Enden von IL-17R-ECD (Seq.-ID Nr. 15)
basierend auf der veröffentlichten
Sequenz hergestellt. Yao et al., s.o. (Yao-3). Die beiden Sonden
hatten die folgenden Sequenzen:
Primer 1: 5'-CTG TAC CTC GAG GGT GCA GAG-3' (Seq.-ID Nr. 20)
Primer
2: 5'-CCC AAG CTT
GGG TCA ATG ATG ATG ATG ATG ATG ATG ATG CCA CAG GGG CAT GTA GTC
C-3' (Seq.-ID Nr.
21)
-
Die
oben genannte Primer wurden in PCR-Reaktionen zur Amplifizierung
von cDNA voller Länge
aus einer menschlichen Hoden-cDNA-Bibliothek mit Pfu-Turbo-DNA-Polymerase (Promega)
eingesetzt. Eine C-terminale His-Markierung wurde mittels PCR durch
die Hinzufügung
von Nucleotiden, die für
8 Histidine kodieren, zu dem 3'-Endprimer eingeführt. Das
PCR-Produkt wurde dann in einen Expressionsplasmid vektor pRK5B subkloniert.
Die Sequenzanalyse bestätigte,
dass das Insert ein DNA-Fragment
enthält,
das für
die extrazelluläre
Domäne
(1-320 Aminosäuren)
des veröffentlichten
hIL-17-Rezeptors (Seq.-ID Nr. 15) kodiert.
-
Immunfällung
von IL-17R-ECD:
-
Die
differentielle Aktivität
von IL-17 im Vergleich mit IL-17B (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C (UNQ561)
(Seq.-ID Nr. 3) deutet darauf hin, dass sie verschiedene Zelloberflächenrezeptoren
binden und aktivieren könnten.
Um zu testen, ob IL-17B (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) oder IL-17C (UNQ561)
(Seq.-ID Nr. 3) direkt an den Rezeptor binden, wurde ein Expressionsplasmid,
das IL-17R (C-terminal His-markiert) (Seq.-ID Nr. 22) enthielt,
in 293-Zellen unter Einsatz von SuperFect-Transfektionsreagens (Qiagen) transfiziert.
Die metabolische Markierung von 293-Zellen erfolgte 16 h nach der Transfektion
6 h lang unter Einsatz eines Gemischs aus 50 μCi/ml [35S]-Cys/Met.
Konditioniertes Medium wurde gesammelt und konzentriert (Centricon-10,
Amicon). Um die Expression von IL-17R-ECD (Seq.-ID Nr. 15) zu untersuchen,
wurden Ni-NTA-Perlen (Qiagen) eingesetzt, um die His-markierte IL-17R-ECD (Seq.-ID Nr.
22) aus dem konditionierten Medium affinitätszufällen.
-
Das
konditionierte Medium wurde in RIPA-Puffer (1 % NP40, 0,5 % Natriumdesoxycholat,
0,1 % SDS in PBS) verdünnt
und mit IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) und den Fc-Fusionsproteinen über Nacht bei 4 °C inkubiert. Protein-A-Agaroseperlen
(Pierce) wurden zur Ausfällung
der Fc-Fusionsproteine zugesetzt. Die Niederschläge wurden 3-mal gewaschen,
um die Fc-Fusionsproteine auszufällen.
Die Niederschläge
wurden 3-mal in RIPA-Puffer gewaschen, in SDS-Probepuffer denaturiert
und auf 4-12 % Bis-Tris-NuPAGE-Gelen (Novex) einer Elektrophorese
unterzogen. Für
die Immunfällung
von IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) wurde Anti-IL-17-Antikörper (R&D Systems) zugesetzt.
In einem kompetitiven Bindungsexperiment erfolgt die Immunfällung von
IL-17R-ECD (Seq.-ID Nr. 15) durch IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) in Gegenwart
eines 5fachen molaren Überschusses
an IL-17B.his (Seq.-ID Nr. 23), IL-17C.his-(Seq.-ID Nr. 24) und
His-markiertem Kontrollprotein.
-
Die
IL-17R-ECD (Seq.-ID Nr. 15) migrierte als eine 60-kDa-Bande, wenn
sie über
die Histidin-Markierung gereinigt wurde (11A,
Spur 1). Außerdem
wurde die IL-17R-ECD
(Seq.-ID Nr. 15) auch in Kombination mit IL-17 (Seq.-ID Nr. 11)
(Spur 3) ausgefällt.
Sowohl IL-17B (Seq.-ID Nr. 1) als auch IL-17C (Seq.-ID Nr. 3) gelang
es jedoch nicht, um die Bindung von IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) für die markierte
IL-17-Rezeptor-ECD (Seq.-ID
Nr. 15) zu konkurrieren (11B,
Spur 15 und 16).
-
Beispiel 12: Analyse der Bindung an THP-1-Zellen
mittels fluoreszenzaktiviertem Zellsortierer (FACS)
-
THP-1-Zellen
(5 × 105) wurden in PBS, die 5 % Pferdeserum enthielt,
bei 4 °C
30 min lang vorinkubiert, um nicht-spezifische Bindung zu blockieren.
IL-17 (Seq.-ID Nr. 11), IL-17B.Fc (Seq.-ID Nr. 12), IL-17C.Fc (Seq.-ID
Nr. 13) oder Kontroll-Fc (jeweils 1 μg) wurden zugesetzt und mit
den THP-1-Zellen in einem Volumen von 0,25 ml 1 h lang auf Eis inkubiert.
Für das
IL-17-Bindungsexperiment wurden primäre Anti-hIL-17-Antikörper (1:100
verdünnt)
und an FITC (Jackson Immunology Lab, 1:100 verdünnt) konjugierte sekundäre Ziegen-Anti-Maus-Antikörper aufeinanderfolgend
zugesetzt, mit 30- bis 60-minütiger
Inkubation und umfassendem Waschen vor jeder Zugabe. Für die Fc-Fusionsproteine
wurden die Zellen mit FITC-konjugierten Ziegen-Anti-Mensch-IgG (Fc-spezifisch,
Jackson Immunology Lab, 1:100 verdünnt) gefärbt. Nach sorgfältigem Waschen
wurden mindestens 5.000 Zellen unter Einsatz eines FACS-can (Becton Dickinson)
analysiert.
-
Das
Ergebnis des oben beschriebenen Verfahrens war, dass IL-17B- (Seq.-ID
Nr. 12) und IL-17C-(Seq.-ID Nr. 13) Fc-Fusionsproteine im Vergleich
mit einem Kontroll-Fc-Fusionsprotein
eine Bindung an THP-1-Zellen aufwiesen (13).
-
Beispiel 13: Reiniqunq von PRO1122-Polvpeptiden
unter Einsatz spezifischer Antikörper
-
Native
oder rekombinante PRO1122-Polypeptide können durch verschiedene Standardverfahren
auf dem Gebiet der Proteinreinigung gereinigt werden. Pro-PRO1122-Polypeptid, reifes
PRO1122-Polypeptid oder Prä-PRO1122-Polypeptid
wird beispielsweise mittels Immunaffinitätschromatographie unter Einsatz
von für das
PRO1122-Polypeptid von Interesse spezifischen Antikörpern gereinigt.
Im Allgemeinen wird eine Immunaffinitätssäule durch die kovalente Bindung
des Anti-PRO1122-Antikörpers an
ein aktiviertes Chromatographieharz hergestellt.
-
Polyklonale
Immunglobuline werden aus Immunseren entweder durch Ausfällen mit
Ammoniumsulfat oder durch Reinigung auf immobilisiertem Protein
A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, New Jersey) hergestellt.
Auf ähnliche
Weise werden monoklonale Antikörper
aus Maus-Aszitenflüssigkeit
durch Ammoniumsulfatausfällung
oder Chromatographie auf immobilisiertem Protein A hergestellt.
Teilweise gereinigtes Immunglobulin wird kovalent an ein Chromatographieharz,
wie z.B. CnBraktivierte SEPHAROSE® (Pharmacia LKB
Biotechnology), gebunden. Der Antikörper wird an das Harz gebunden,
das Harz wird blockiert, und das Harzderivat wird gemäß den Herstellerhinweisen
gewaschen.
-
Eine
solche Immunaffinitätssäule wird
zur Reinigung von PRO1122-Polypeptid durch die Herstellung einer
Zellfraktion, die PRO1122-Polypeptid in löslicher Form enthält, eingesetzt.
Dieses Präparat
wird mittels Solubilisierung der gesamten Zelle oder eines subzellulären Anteils
abgeleitet, der durch differentielles Zentrifugieren durch die Zugabe
eines Detergens oder durch andere Verfahren, die auf dem Gebiet
der Erfindung bekannt sind, erhalten wird. Alternativ dazu kann
lösliches
PRO1122-Polypeptid,
das eine Signalsequenz enthält,
in nützlicher
Menge in das Medium sekretiert werden, in dem die Zellen gezüchtet werden.
-
Ein
Präparat,
das ein lösliches
PRO1122-Polypeptid enthält,
wird durch eine Immunaffinitätssäule geleitet,
und die Säule
wird unter Bedingungen gewaschen, die die bevorzugte Absorption
von PRO1122-Polypeptid ermöglichen
(z.B. Puffer mit hoher Ionenstärke
in Gegenwart eines Detergens). Dann wird die Säule unter Bedingungen eluiert,
die die Antikörper-PRO1122-Polypeptid-Bindung
trennen (z.B. ein Puffer mit niedrigem pH, wie z.B. etwa pH 2-3,
oder eine hohe Konzentration eines Chaotrops, wie z.B. Harnstoff
oder Thiocyanat-Ion), und PRO1122-Polypeptid wird gesammelt.
-
Beispiel 14: Arzneimittel-Screening
-
Diese
Erfindung ist insbesondere für
das Screenen von Verbindungen unter Einsatz von PRO1122-Polypeptiden
oder Bindungsfragmenten davon bei verschiedenen Arzneimittel-Screeningverfahren
nützlich.
Das PRO1122-Polypeptid oder Fragment davon, das in einem solchen
Test eingesetzt wird, kann frei in Lösung, an einen festen Träger gebunden,
auf einer Zelloberfläche
getragen oder intrazellulär
lokalisiert sein. Ein Verfahren des Arzneimittel-Screening setzt
eukaryotische und prokaryotische Wirtszellen ein, die stabil mit
rekombinanten Nucleinsäuren
transformiert sind, die das PRO1122-Polypeptid oder ein Fragment
davon exprimieren. Arzneimittel werden gegenüber diesen transformierten
Zellen in kompetitiven Bindungstests gescreent. Solche Zellen können in
lebensfähiger
oder fixierter Form für
Standardbindungstests eingesetzt werden. Beispielsweise kann die
Komplexbildung zwischen PRO1122-Polypeptid oder einem Fragment davon
und dem getesteten Wirkstoff gemessen werden. Alternativ dazu kann
die Verringerung der Komplexbildung zwischen PRO1122-Polypeptid
und dessen Zielzelle oder Zielrezeptoren, die durch den getesteten
Wirkstoff verursacht wird, untersucht werden.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt demnach Screeningverfahren für Arzneimittel
und andere Wirkstoffe bereit, die eine Erkrankung oder Störung in
Zusammenhang mit PRO1122-Polypeptiden beeinflussen können. Diese
Verfahren umfassen das Kontaktieren eines solchen Wirkstoffs mit
einem PRO1122-Polypeptid oder einem Fragment davon und das Testen
(i) des Vorhandenseins eines Komplexes zwischen dem Wirkstoff und dem
PRO1122-Polypeptid oder Fragment davon oder (ii) des Vorhandenseins
eines Komplexes zwischen dem PRO1122-Polypeptid oder Fragment davon
und der Zelle mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt
sind. Bei solchen kompetitiven Bindungstest ist das PRO1122-Polypeptid
oder Fragment davon typischerweise markiert. Nach geeigneter Inkubation
wird freies PRO1122-Polypeptid
oder freie Fragmente davon von dem in gebundener Form vorhandenen getrennt,
und die Menge freier oder nicht komplexierter Markierung dient als
Maß für die Fähigkeit
des jeweiligen Wirkstoffs, an PRO1122 zu binden oder den PRO1122-Polypeptid/Zell-Komplex
zu beeinflussen.
-
Ein
weiteres Verfahren für
das Arzneimittel-Screening stellt ein Hochdurchsatz-Screening für Verbindungen
bereit, die eine geeignete Bindungsaffinität für ein Polypeptid aufweisen,
und wird detailliert in
WO 84/03564 ,
veröffentlicht
am 13. September 1984, beschrieben. Kurz zusammengefasst wird eine
große
Anzahl verschiedener kleiner Peptid-Testverbindungen auf einem festen
Substrat, wie z.B. Kunststoffnadeln oder einer anderen Oberfläche, hergestellt.
Bei Anwendung auf ein PRO1122-Polypeptid werden die Peptid-Testverbindungen
mit PRO1122-Polypeptid umgesetzt und gewaschen. Gebundenes PRO1122
wird durch Verfahren nachgewiesen, die auf dem Gebiet der Erfindung
bekannt sind. Gereinigtes PRO1122-Polypeptid kann auch zur Verwendung
in den zuvor genannten Arzneimittel-Screeningverfahren direkt auf Platten
beschichtet werden. Zusätzlich
dazu können
nicht-neutralisierende Antikörper
eingesetzt werden, um das Peptid einzufangen und auf dem festen
Träger
zu immobilisieren.
-
Diese
Erfindung zieht auch die Verwendung kompetitiver Arzneimittel-Screeningtests
in Betracht, bei denen neutralisierende Antikörper, die in der Lage sind,
PRO1122-Polypeptid
zu binden, spezifisch mit einer Testverbindung in Bezug auf die
Bindung an PRO1122-Polypeptid oder Fragmente davon konkurrieren.
Auf diese Weise können
die Antikörper
eingesetzt werden, um das Vorhandensein eines Peptids nachzuweisen, das
eine oder mehrere Antigen-Determinanten mit PRO1122-Polypeptid teilt.
-
Beispiel 15: Rationale Wirkstoffentwicklung
-
Das
Ziel rationaler Wirkstoffentwicklung besteht in der Produktion struktureller
Analoga biologisch aktiver Polypeptide von Interesse (d.h. eines
PRO1122-Polypeptids) oder kleiner Moleküle, mit denen diese in Wechselwirkung
treten, z.B. Agonisten, Antagonisten oder Hemmer. Jedes dieser Beispiele
kann eingesetzt werden, um Arz neimittel herzustellen, die aktivere
oder stabilere Formen des PRO1122-Polypeptids darstellen oder die
die Funktion des PRO1122-Polypeptids in vivo verbessern oder beeinflussen
(siehe Hodgson, Bio/Technology 9, 19-21 (1991)).
-
Bei
einem Ansatz wird die dreidimensionale Struktur des PRO1122-Polypeptids
oder eines PRO1122-Polypeptid-Hemmer-Komplexes mittels Röntgenkristallographie,
durch Computer-Modellerstellung oder typischerweise insbesondere
durch eine Kombination beider Ansätze bestimmt. Die Form und
Ladungen von PRO1122 müssen
ermittelt werden, um die Struktur und die aktive(n) Stelle(n) des
Moleküls
zu bestimmen. Seltener kann nützliche
Information in Bezug auf die Struktur von PRO1122 durch Modellerstellung
basierend auf der Struktur homologer Proteine erhalten werden. In
beiden Fällen
wird relevante Strukturinformation eingesetzt, um analoge PRO1122-Polypeptid-ähnliche
Moleküle
herzustellen oder wirksame Hemmer zu identifizieren. Wirksame Beispiele
für rationale
Wirkstoffentwicklung kann Moleküle
betreffen, die verbesserte Aktivität oder Stabilität aufweisen,
wie von Braxton und Wells, Biochemistry 31, 7796-7801 (1992), gezeigt, oder
die als Hemmer, Agonisten oder Antagonisten nativer Peptide wirken,
wie von Athauda et al., J. Biochem. 113, 742-746 (1993), gezeigt.
-
Es
ist auch möglich,
einen Ziel-spezifischen Antikörper,
der durch einen funktionellen Test ausgewählt wurde, wie oben beschrieben,
zu isolieren und dann dessen Kristallstruktur zu bestimmen. Dieser
Ansatz liefert im Prinzip ein Pharmacore, das als Basis für die folgende
Arzneimittelentwicklung dienen kann. Es ist möglich, Protein-Kristallographie
gänzlich
zu umgehen, indem Anti-Idiotyp-Antikörper (Anti-Ids) in Bezug auf
einen funktionellen, pharmakologisch aktiven Antikörper hergestellt
werden. Als Spiegelbild eines Spiegelbilds würde die Bindungsstelle der
Anti-Anti-Ids erwartungsgemäß ein Analogon
des ursprünglichen
Rezeptors sein. Der Anti-Id könnte
dann eingesetzt werden, um Peptide aus den Reihen chemisch oder
biologisch hergestellter Peptide zu identifizieren und zu isolieren.
Die isolierten Peptide würden
dann als Pharmacore dienen.
-
Durch
die vorliegende Erfindung können
ausreichende Mengen des PRO1122-Polypeptids
hergestellt werden, um solche analytischen Studien wie Röntgen-Kristallographien
durchzuführen.
Zusätzlich
dazu stellt das hierin bereitgestellte Wissen in Bezug auf die PRO1122-Polypeptid-Aminosäuresequenz
Orientierungshilfen für
jene bereit, die Computermodellerstellungsverfahren anstelle von
oder zusätzlich
zu Röntgenkristallographie
einsetzen.
-
Beispiel 16: Test in Bezug auf artikuläre Knorpelexplantate
-
Einleitung:
-
Wie
zuvor erwähnt
spielt IL-17 wahrscheinlich eine Rolle bei der Auslösung oder
Aufrechterhaltung der proinflammatorischen Reaktion. IL-17 ist ein
Cytokin, das von CD4+-Th-Zellen
exprimiert wird, und induziert die Sekretion von proinflammatorischen
und hämatopoetischen
Cytokinen (z.B. IL-1β,
TNF-α, IL-6,
IL-8, GM-CSF; Aarvak et al., J. Immunol. 162, 1246-1251 (1999);
Fossiez et al., J. Exp. Med. 183, 2593-2603 (1996); Jovanovic et
al., J. Immunol. 160, 3513-3521 (1998)) in einer Reihe von Zelltypen,
umfassend Synoviozyten und Makrophagen. In Gegenwart von IL-17 erhalten
Fibroblasten die Proliferation von hämatopoetischen CD34+-Vorläufern aufrecht
und induzieren ihre bevorzugte Reifung in Neutrophile. In der Folge
kann IL-17 ein früher
Initiator der T-Zell-abhängigen
Entzündungsreaktion
und Teil des Cytokin-Netzwerks sein, das das Immunsystem mit der
Hämatopoese
verbindet.
-
Es
wurde festgestellt, dass die Expression von IL-17 in der Gelenksflüssigkeit
von Patienten mit rheumatischer Arthritis, Arthritis psoriatica
oder Osteoarthritis vorhanden ist, aber nicht in normalen Gelenksgeweben.
IL-17 kann mit den von Monozyten stammenden, proinflammatorischen
Cytokinen IL-1β oder
TNF-α synergieren,
um IL-6 und GM-CSF
zu induzieren. Indem IL-17 direkt auf Synoviozyten wirkt, könnte es
die Sekretion von proinflammatorischen Cytokinen in vivo fördern und
somit die Gelenksentzündung
und -zerstörung verstärken.
-
Um
die mögliche
Rolle von IL-17 besser zu verstehen, haben die Anmelder die Wirkungen
von IL-17 auf den Knorpelmatrix-Metabolismus getestet. Im Lichte
der bekannten katabolischen Wirkungen von Stickstoffoxid (NO) auf
Knorpel und des Vorhandenseins eines hohen NO-Spiegels in arthritischen
Gelenken wurde auch die NO-Produktion gemessen.
-
Verfahren:
-
Artikuläre Knorpelexplantate:
Das metacarpophalangeale Gelenk eines 4-6 Monate alten weiblichen Schweins
wurde aseptisch aufgeschnitten, und artikulärer Knorpel wurde freihändig vorsichtig
herausgeschnitten, um den darunter liegenden Knochen nicht zu beschädigen. Der
Knorpel wurde zerkleinert und unverpackt zumindest 24 h lang in
einer befeuchteten Atmosphäre
mit 95 % Luft, 5 % CO2 in serumfreiem (SF-)
Medium (DME/F12 1:1) mit 0,1 % BSA und Antibiotika kultiviert. Nach
dreimaligem Waschen wurden etwa 80 g artikulärer Knorpel in Micronics-Röhrchen aliquotiert
und zumindest 24 h lang im obigen SF-Medien inkubiert. Testproteine
wurden in einer Konzentration von 1 % entweder alleine oder in Kombination
mit IL-1α (10
ng/ml) (Seq.-ID Nr. 25) zugesetzt. Die Medien wurden geerntet und
zu verschiedenen Zeitpunkten (0, 24, 48, 72 h) getauscht und unter
Einsatz des 1,9-Dimethylmethylen-Blau-(DMB-)
Kolorimetrietests, der in Farndale und Buttle, Biochem. Biophys.
Acta 883, 173-177 (1985), beschrieben wird, in Bezug auf Proteoglykan-Gehalt
getestet. Nach Markierung (über
Nacht) mit 35S-Schwefel wurden die Röhrchen gewogen,
um die Gewebemenge zu bestimmen. Nach Verdau über Nacht wurden die Menge
des in dem Gewebe verbleibenden Proteoglykan sowie die Proteoglykan-Synthese
(35S-Inkorporation)
bestimmt.
-
Messung der NO-Produktion:
-
Der
Test basiert auf dem Prinzip, dass 2,3-Diaminonaphthalin (DAN) mit Nitrit unter
sauren Bedingungen reagiert, um 1-(H)-Naphthotriazol, ein fluoreszierendes
Produkt, zu bilden. Da NO schnell in Nitrit (NO2 -1) und Nitrat (NO3 -1) metabolisiert wird, ist der Nachweis
von Nitrit eine Möglichkeit
zum Nachweis für
das tatsächlich
produzierte NO (wenngleich zu wenig nachgewiesen wird). 10 μl DAN (0,05
mg/ml in 0,62 M HCl) wird zu 100 μl
Probe (Zellkul turüberstand)
zugesetzt, gemischt und bei Raumtemperatur 10-20 min lang inkubiert.
Die Reaktion wird mit 5 ml 2,8 N NaOH beendet. Die Bildung von Diaminonaphthotriazol
wurde unter Einsatz eines Cytoflor-Fluoreszenz-Plattenlesegeräts mit Anregung
bei 360 nm und Ablesen der Emission bei 450 nm gemessen. Für die optimale
Messung von Fluoreszenzintensität
wurden schwarze Platten mit klarem Boden eingesetzt.
-
Ergebnisse und Diskussion:
-
Es
wurde beobachtet, dass IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) die Freisetzung von
Proteoglykanen steigert und deren Synthese reduziert (13). Außerdem
verstärkte
diese Wirkung die bei IL-1α beobachtete
Wirkung (13) (Seq.-ID Nr. 25). Die Wirkungen
von IL-17 werden weder durch die Produktion von Stickstoffoxid gefördert, noch
verstärkt
die Hemmung der Stickstoffoxidfreisetzung den Matrixabbau. UNQ561
(Seq.-ID Nr. 3) verstärkt den
Matrixabbau und hemmt die Matrixsynthese. Somit ist es wahrscheinlich,
dass die Expression von PRO1122 mit degenerativen Knorpelstörungen in
Zusammenhang steht. Andererseits steigert UNQ516 (Seq.-ID Nr. 1)
die Matrixsynthese und hemmt die Freisetzung von Stickstoffoxid
durch artikuläre
Knorpelexplantate.
-
Folglich
trägt IL-17
wahrscheinlich zum Verlust artikulären Knorpels in arthritischen
Gelenken bei, womit die Hemmung der Aktivität von IL-17 Entzündung und
Knorpelzerstörung
einschränken
könnte.
IL-1 und IL-17 weisen aufgrund ihrer Verwendung von verschiedenen
Rezeptoren und überlappenden
Stromab-Signalmechanismen ähnliche,
aber dennoch verschiedene Aktivitäten auf.
-
In
Anbetracht der Erkenntnisse in Bezug auf die potenten katabolischen
Wirkungen von IL-17 auf artikuläre
Knorpelexplantate und der Homologie von UNQ561 und UNQ561 mit IL-17
können
Antagonisten eines oder aller dieser Proteine wirksam zur Behandlung
von Entzündungserkrankungen
und Knorpelschäden,
wie z.B. Arthritis, sein. Die Erkenntnis der Erfinder, dass UNQ516
die NO-Produktion hemmt und die Matrixsynthese fördert, deutet jedoch darauf
hin, dass dieses Protein und Agonisten davon positive Wirkungen
in dem Gelenk haben könnten
und somit an sich wirksam zur Behandlung der zuvor genannten Störungen sein
könnten.
-
Schließlich ist
bekannt, dass Wachstumsfaktoren Zwei-Phasen-Wirkungen haben können und
erkranktes Gewebe anders als normales Gewebe auf einen bestimmten
Faktor in vivo reagieren kann. Aus diesen Gründen können Antagonisten oder Agonisten
(z.B. die Proteine selbst) von UNQ561 zur Behandlung von Entzündungserkrankungen
und Gelenksstörungen,
wie z.B. Arthritis, zweckdienlich sein.
-
Hinterlegung von Material:
-
Die
folgenden Materialien wurden bei der American Type Culture Collection
(ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USA 20110-2209,
hinterlegt:
Material | ATCC-Hinterlegungsnr. | Hinterlegungsdatum |
DNA59294-1381 | 209866 | 14.
Mai 1998 |
DNA62377-1381-1 | 203552 | 22.
Dezember 1998 |
-
Diese
Hinterlegung erfolgte gemäß den Vorschriften
des Budapester Vertrags betreffend die internationale Anerkennung
der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren
und dessen Ausführungsordnung
(Budapester Vertrag).
-
Dadurch
wird sichergestellt, dass 30 Jahre lang beginnend mit dem Hinterlegungsdaum
eine lebensfähige
Kultur erhalten wird. Die Hinterlegung wird durch die ATCC gemäß den Bedingungen
des Budapester Vertrags zur Verfügung
gestellt und unterliegt einem Abkommen zwischen Genentech, Inc.,
und ATCC, das die ständige
und uneingeschränkte
Verfügbarkeit
der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit
bei Ausgabe des relevanten US-Patents oder Offenlegung einer US-
oder einer ausländischen
Patentanmeldung, je nachdem was zuerst eintritt, sicherstellt und
die Verfügbarkeit
der Nachkommenschaft für jemanden,
der durch den Präsidenten
des Patentamts der Vereinigten Staaten bestimmt wurde, gemäß 35 USC §122 und
den entsprechenden Regeln des Präsidenten
(umfassend 37 CFR §1.14
unter besonderem Verweis auf 886 OG 638) darauf Anspruch zu haben,
sicherstellt.
-
Der
Zessionar der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, dass, wenn
eine Kultur des hinterlegten Materials sterben, verloren gehen oder
zerstört
werden sollte, wenn sie unter geeigneten Bedingungen kultiviert
wird, das Material umgehend bei Benachrichtigung durch eine andere
Kultur desselben Materials ersetzt wird. Die Verfügbarkeit
des hinterlegten Materials ist nicht als Ermächtigung dazu auszulegen, die
Erfindung entgegen der durch die Autorität einer Regierung gemäß ihres
Patentrechts gewährten
Rechte umzusetzen.
-
Die
vorhergehende schriftliche Beschreibung wird als ausreichend erachtet,
um es Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung zu ermöglichen,
die Erfindung umzusetzen. Der Umfang der vorliegenden Erfindung soll
nicht durch das hinterlegte Konstrukt eingeschränkt werden, da die hinterlegte
Ausführungsform
nur als eine Veranschaulichung bestimmter Aspekte der Erfindung
dienen soll. Durch die Hinterlegung von Material hierin wird nicht
eingeräumt,
dass die schriftliche Beschreibung, die hierin enthalten ist, unzureichend
ist, um die Umsetzung jedes Aspekts der vorliegenden Erfindung,
umfassend der besten Art der Durchführung, zu ermöglichen,
noch soll sie als Einschränkung
des Umfangs der Ansprüche
auf die spezifischen veranschaulichenden Beispiele, die sie darstellt,
ausgelegt werden. SEQUENZPROTOKOLL
Sequenzprotokoll