CN101001871A - 可溶性ZcytoR14、抗ZcytoR14抗体和结合伴侣以及在炎症中的使用方法 - Google Patents

可溶性ZcytoR14、抗ZcytoR14抗体和结合伴侣以及在炎症中的使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL－17F、IL－17A或IL－17A和IL－17F多肽分子的活性。IL－17A和IL－17F是参与炎症过程和人疾病的细胞因子。ZcytoR14是IL－17A和IL－17F的共同受体。本发明包括可溶性ZcytoR14、抗ZcytoR14抗体和结合伴侣，以及使用这些可溶性受体、抗体和结合伴侣拮抗IL－17F、IL－17A或IL－17A和IL－17F的方法。

Description

可溶性ZcytoR14、抗ZcytoR14抗体和结合伴侣以及在炎症中的使用方法
参考相关的发明
本申请要求2004年6月10日提交的美国临时申请系列号60/578,805的利益，该临时申请在此引用作为参考。
发明背景
细胞因子是介导各种生物学效应的可溶性小蛋白，所述效应包括生长的调节和许多细胞类型的分化(参见，例如，Arai等人，Annu.Rev.Biochem.59：783(1990)；Mosmann，Curr.Opin.Immunol.3：311(1991)；Paul和Seder，Cell76：241(1994))。构成细胞因子群体的蛋白包括白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子和其他调节分子。例如，人白细胞介素-17是刺激白细胞介素-6、细胞内粘着分子1、白细胞介素-8、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和前列腺素E2表达的细胞因子，并且在CD34+造血前体优先地成熟为嗜中性粒细胞中起着重要作用(Yao等人，J.Immunol.155：5483(1995)；Fossiez等人，J.Exp.Med.183：2593(1996))。
结合细胞因子的受本一般由这样的一种或多种整联膜蛋白构成，所述膜蛋白高度亲和性地结合细胞因子并将该结合事件通过某些受体亚基的细胞质部分传导给细胞。基于细胞因子受体的细胞外配体结合结构域的相似性已将其分成几类。
经证明的细胞因子和其受体的体内活性说明其他细胞因子、细胞因子受体、细胞因子激动剂和细胞因子拮抗剂的临床潜能和对其的需要。例如，已证明的促炎细胞因子家族的体内活性说明促炎分子的拮抗剂的巨大临床潜能和对其的需要。
发明详述
本发明通过提供促炎细胞因子IL-17A和IL-17F的拮抗剂来解决这些需要。明确地，促炎细胞因子IL-17A和IL-17F具有高度的序列相似性，共有许多生物学特性，其都由激活的T细胞产生。其已被当作为促进各种自身免疫和炎性疾病(包括类风湿性关节炎和哮喘)的进展的因子。事实上，抵消IL-17A功能的试剂在人疾病的几种小鼠模型中显著地改善发病率和严重度。IL-17A通过和其关联受体IL-17受体(IL-17R)相互作用来介导其作用，但IL-17F的受体仍未得到鉴定。现在我们报导我们已鉴定了IL-17R关联分子ZcytoR14作为IL-17F的受体。然而，我们也已指出，该受体结合IL-17A和IL-17F，对两者具有相似的高亲和力。另一方面，IL-17R高度亲和地结合IL-17A，但结合IL-17F的亲和力非常低。与之一致的是，我们已显示IL-17R的可溶性形式在表达两种受体中任一受体的细胞中阻断IL-17A的结合和信号传导，但不干扰IL-17F和ZcytoR14的结合或IL-17F对ZcytoR14的作用。相反地，ZcytoR14的可溶性形式在表达两种受体中任一受体的细胞中拮抗单独的IL-17A和IL-17F或同时拮抗两者。因为IL-17A干涉已被认为是几种自身免疫疾病的有效疗法，因此使用本发明的可阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17A、IL-17F或IL-17A和IL-17F两者一起的活性的拮抗剂(包括可溶性ZcytoR14受体和中和性抗ZcytoR14抗体)将具有优于只靶向这两种细胞因子中的一种的治疗法的有利方面。因此本发明还提供了其在炎性疾病中的用途以及相关的组合物和方法。
A) 综述
免疫相关疾病和炎性疾病是非常复杂的、通常为多条相互关联的生物学途径的表现或结果，所述途径在正常生理学中对于对创伤或损伤的反应、启动对创伤或损伤的修复以及启动组织对抗外来生物的先天性或获得性防御是至关重要的。当这些正常的生理学途径直接由于反应强烈的原因、作为不正常的调控或过度刺激、作为对自身反应或作为这些因素的组合的结果而造成另外的创伤或损伤时，疾病和病状就发生了。
尽管这些疾病的发生通常包括多步骤途径和通常多个不同的生物学系统/途径，但在这些途径的一个或多个途径的关键点上进行干涉通常具有改善或治疗效果。可通过有害过程/途径的拮抗作用或有益过程/途径的刺激作用来进行治疗性干涉。
许多免疫相关病症是已知的并且已被详尽地研究。这些疾病包括免疫介导的炎性疾病(例如类风湿性关节炎、免疫介导的肾病、肝胆管病(hepatobiliary diseases)、炎性肠病(IBD)、牛皮癣和哮喘)、非免疫介导的炎性疾病、传染病、免疫缺陷病、瘤形成等。
T淋巴细胞(T细胞)是哺乳动物免疫反应的重要组成部分。T细胞识别这样的抗原，该抗原和主要组织相容性复合物(MHC)内的基因编码的自体分子关联。也可将所述抗原和MHC分子一起在抗原呈递细胞、病毒感染的细胞、癌细胞、移植物等的表面上展示。T细胞系统消除这些改变的对宿主哺乳动物施以健康威胁的细胞。T细胞包括辅助T细胞和细胞毒性T细胞。辅助T细胞在识别抗原呈递细胞上的抗原-MHC复合物后大量增殖。辅助T细胞也分沁各种细胞因子，即，在B细胞、细胞毒性T细胞和参与免疫应答的各种其他细胞的活化中发挥中心作用的淋巴因子。
体液和细胞介导的免疫反应中的中心事件是辅助T细胞的激活和克隆扩增。通过T细胞受体(TCR)--CD3复合物和抗原呈递细胞的表面上的抗原-MHC的相互作用来启动辅助T细胞的激活。该相互作用介导这样的生物化学事件的级联反应，即其诱导静息辅助T细胞进入细胞周期(G0至G1的转换)和导致IL-2和有时IL-4的高亲和力受体的表达。激活的T细胞继续通过细胞周期进行增殖并分化成记忆细胞或效应细胞。
除了通过TCR介导的信号以外，T细胞的激活还包括通过抗原呈递细胞释放的细胞因子诱导的或通过抗原呈递细胞和T细胞上的膜结合分子之间的相互作用诱导的另外的共刺激作用。已显示细胞因子IL-1和IL-6提供共刺激信号。在抗原呈递细胞的表面表达的B7分子和在T细胞表面表达的CD28和CTLA-4分子之间的相互作用影响T细胞的激活。激活的T细胞表达增加数目的细胞粘附分子例如ICAM-1、整联蛋白integrins、VLA-4、LFA-1、CD56等。
混合淋巴细胞培养物或混合淋巴反应物(MLR)中的T细胞增殖是化合物刺激免疫系统的能力的已建立的指征。在许多免疫反应中，炎症细胞浸润损伤或感染的位置。迁移细胞可以是嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞或淋巴细胞，这可通过受影响的组织的组织学检查确定。Current Protocols in Immunology，ed.John E.Coligan，1994，John Wiley & Sons，Inc.
可通过抑制免疫反应来治疗免疫相关疾病。使用可溶性受体和/或中和抗体在治疗免疫介导的疾病和炎性疾病上是有益的，所述受体和/或抗体抑制具有免疫刺激活性的分子。可使用(直接地使用蛋白或通过使用抗体激动剂)抑制免疫应答的分子抑制免疫应答，从而改善免疫相关疾病。
已鉴定白细胞介素-17(IL-17A)为嗜T淋巴松鼠猴疱疹病毒T(lymphotropic Herpes virus Saimiri)(HSV)编码的蛋白的细胞直向同源物(ortholog)[参见，Rouvier等人，J.Immunol.，150(12)：5445-5456(19993)；Yao等人，J.Immunol.，122(12)：5483-5486(1995)和Yao等人，Immunity，3(6)：811-821(1995)]。随后的表征已显示该蛋白是在广泛的外周组织中诱导促炎症反应的有效的细胞因子。IL-17A是大约32kDa的二硫键连接的同型二聚体细胞因子，其只由CD4+激活的记忆T细胞合成和分泌(参阅Fossiez等人，Int.Rev.Immunol.，16：541-551[1998])。确切地，IL-17以具有19-23个残基的N末端信号序列的155个氨基酸的前体多肽形式表达和以二硫键连接的同型二聚糖蛋白形式分泌。I1-17A公开于WO9518826(1995)、WO9715320(1997)和WO9704097(1997)以及美国专利号6,063,372。
尽管其组织分布受到限制，但IL-17A在各种类型的细胞上展示多效性的生物学活性。已发现IL-17A刺激许多细胞因子的产生。其诱导IL-6、IL-8、IL-12、白血病抑制因子(LIF)、前列腺素E2、MCP-1和由粘着细胞如成纤维细胞、角质形成细胞、上皮和内皮细胞产生的G-CSF的分泌。IL-17A也具有诱导ICAM-1表面表达、T细胞增殖、CD34.sup.+人祖细胞生长和分化成嗜中性粒细胞。IL-17A也参与骨代谢，已表明其在特征为存在激活的T细胞和TNFα产物的病理学状况例如类风湿性关节炎和骨植入体的松化上发挥重要的作用(VanBezooijen等人，J.Bone Miner.Res.14：1513-1521[1999])。发现来源于类风湿性关节炎患者的滑液组织的激活的T细胞分泌高于来源于正常个体或骨关节炎患者的IL-17A的量的IL-17A(Chabaud等人，Arthritis Rheum.42：963-970[1999])。这暗示该促炎细胞因子活跃地促进类风湿性关节炎中的滑液炎症。除了其促炎反应作用外，IL-17A似乎还通过另一种机制促成类风湿性关节炎病状。例如，已显示IL-17A在成骨细胞中诱导破骨细胞分化因子(ODF)mRNA的表达(Kotake等人，J.Clin.Invest.，103：1345-1352[1999])。ODF刺激祖细胞分化成破骨细胞，该细胞参与骨再吸收作用。
因为IL-17A的水平在类风湿性关节炎患者的滑液中显著增加，因此IL-17A诱导的破骨细胞的形成似乎在类风湿性关节炎中的骨再吸收中起着至关重要的作用。据认为IL-17A也在某些其他的自身免疫病症例如多发性硬化症中起着关键作用(Matusevicius等人，Mult.Scler.，5：101-104[1999])。还显示IL-17A，通过细胞内信号转导，在人巨噬细胞中刺激Ca.sup.2+流入和[cAMP]的减少(Jovanovic等人，J.Immunol.，160：3513[1998])。用IL-17A处理的成纤维细胞诱导NF-.κB的激活，[Yao等人，Immunity，3：811(1995)，Jovanovic等人，同上]，而用其处理的巨噬细胞激活NF-κB和促分裂原活化蛋白激酶(Shalom-Barek等人，J.Biol.Chem.，273：27467[1998])。
此外，IL-17A也和参与骨和软骨生长的哺乳动物细胞因子样因子7具有序列相似性。和IL-17A多肽具有序列相似性的其他蛋白是人胚胎来源白细胞介素关联因子(human embryo-derivedinterleukin-related factor)(EDIRF)和白细胞介素-20。
和IL-17A的广泛效应一致的是，已发现IL-17A的细胞表面受体广泛地在许多组织和细胞类型中表达(Yao等人，Cytokine，9：794[1997])。尽管人IL-17A受体(IL-17R)(866个氨基酸)的氨基酸序列预测了具有单一跨膜结构域和长的、525个氨基酸的细胞内结构域，但该受体序列是独特的，其不和来自细胞因子/生长因子受体家族的任一受体的序列相似。结合IL-17A自身和其他已知蛋白缺乏相似性的事实，这表明IL-17A和其受体可能是信号转导蛋白和受体的新家族的部分。已证明IL-17A通过和其独特的细胞表面受体结合来介导其活性，其中前面的研究已表明，将T细胞和IL-17A受体多肽的可溶性形式接触可抑制T细胞增殖和由PHA、伴刀豆球蛋白A和抗TCR单克隆抗体诱导的IL-2的产生(Yao等人，J.Immunol.，155：5483-5486[1995])。这样，在鉴定和表征和已知的细胞因子受体特别是IL-17A受体具有同源性的新的多肽上存在极大兴趣。
IL-17F的表达模型似乎和IL-17A的相似，这样，其只包括激活的CD4+T细胞和单核细胞(Starnes等人J.Immunol.167：4137-4140[2001])。已证明IL-17F在成纤维细胞中诱导G-CSF、IL-6和IL-8(Hymowitz等人，EMBO J.20：5322-5341[2001])和在内皮细胞中诱导TGF-b(Starnes等人J.Immunol.167：4137-4140[2001])。最近报导，IL-23(由树突状细胞产生的细胞因子)可介导IL-17A和IL-17F(主要在记忆T细胞中)的产生(Aggarwal等人J.Biol.Chem.278：1910-1914[2003])。
此外，已显示IL-17A和IL-17F在患关节炎和哮喘个体中过量表达或上调(参阅Moseley等人cytokineGrowth Factor Rev14：155-174[2003])。对于关节炎，这些细胞因子以这样的方式作用，该方式对于和类风湿性和骨性关节炎关联的软骨和关节破坏是特异的。例如，已证明IL-17A和IL-17F在关节软骨外植体中通过释放软骨蛋白聚糖糖胺聚糖和胶原片段，同时抑制新的蛋白聚糖和胶原的合成来提高基质的降解(Cai等人Cytokine16：10-21[2001]；Attur等人Arthritis Rheum44：2078-2083[2001])。
和IL-17A相似，也已证明小鼠中IL-17F的过量表达增加肺嗜中性粒细胞的募集和导致肺中Th1关联性细胞因子(包括IL-6、IFN-γ、IP-10和MIG)的增加的表达(Starnes等人J.Immunol.167：4137-4140[2001])。IL-17F也在来自变应原激发(allergen-challenged)的哮喘的T细胞中上调(Kawaguchi等人J.Immunol167：4430-4435[2001])，并且发现其在NHBE中诱导IL-6和IL-8的产生。和IL-17A相反，IL-17F似乎在体外抑制血管生成(Starnes等人J.Immunol.167：4137-4140[2001])。
通过各种人组织中的Northern印迹法没有检测到IL-17F mRNA，但在CD4+T细胞和单核细胞被激活后其被显著地诱导。在小鼠中，发现Th2细胞和肥大细胞在被激活后表达IL-17F。参见，Dumont，ExpertOpin.Ther.Patents13(3)(2003)。和IL-17A一样，也发现IL-17F的表达在小鼠中通过IL-23上调。
I1-17细胞因子/受体家族似乎在细胞因子网络中代表独特的信号转导系统，其为控制免疫和炎症应答提供了创新的方法。因此，本发明基于新的IL-17家族受体ZcytoR14和其结合IL-17A和IL-17F的能力的发现。
这样，IL-17F和IL-17A活性的拮抗剂例如ZcytoR14可溶性受体和针对其的抗体(包括本发明的抗人ZcytoR14单克隆和中和抗体)在炎性疾病的治疗上是有用的，特别是在牛皮癣的治疗中用作单独的IL-17F和IL-17A或两者一起的拮抗剂。此外，IL-17F活性的拮抗剂，例如ZcytoR14可溶性受体和针对其的抗体(包括本发明的抗人ZcytoR14单克隆和中和抗体)用于其他炎性疾病的治疗，例如在这样的疾病的治疗中结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17F和IL-17A(单独地或一起地)，所述疾病是特应性和接触性皮炎、IBD、结肠炎、内毒素血症、关节炎、类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、成人呼吸系统疾病(adult respiratory disease)(ARD)、脓毒性休克、多器官衰竭、炎性肺损伤例如哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、气道高反应性(airway hyper-respons iveness)、慢性支气管炎、过敏性哮喘、细菌性肺炎、牛皮癣、湿疹和炎性肠病例如溃疡性结肠炎和克罗恩病、幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori)感染、由于腹膜炎症(即由于感染、损伤等造成的)造成的腹内粘连(intraabdominal adhesions)和/或脓肿、全身性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症、全身性硬化症、肾病综合征、器官同种异体移植排斥、移植物抗宿主疾病(GVHD)、肾、肺、心脏等移植排斥、链球菌细胞壁(SCW)诱导的关节炎、骨关节炎、牙龈炎/牙周炎、疱疹间质角膜炎(herpetic stromal keratitis)、癌症包括前列腺癌、肾癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、白血病、血管生成、再狭窄和川畸病。
细胞因子受体亚基的特征在于包含配体结合结构域和一般参与信号转导的效应结构域的多结构域结构。多聚体细胞因子受体包括单体、同型二聚体(例如，PDGF受体αα和ββ同种型、促红细胞生成素受体、MPL[血小板生成素受体]和G-CSF受体)、其亚基分别具有配体结合和效应结构域的异二聚体(例如，PDGF受体αβ同种型)和具有功能不同的组成亚基的多聚体(例如，IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7和GM-CSF受体)。一些受体亚基对于许多受体是共同的。例如，AIC2B亚基，其不能独自地结合配体但包含细胞内信号转导结构域，其是IL-3和GM-CSF受体的组分。基于其结构和功能，许多细胞因子可被分至4个相关家族中的一个家族。例如，I类造血受体的特征在于存在包含保守的半胱氨酸残基和WSXWS基元(SEQ ID NO：10)的结构域。特征在于二硫键形成的环的其他结构域，包括蛋白激酶结构域、III型纤连蛋白结构域和免疫球蛋白结构域，存在于某些造血受体中。urdal， Ann.Reports Med.Chem.  26：221-228，1991和Cosman， Cytokine  5：95-106，1993已综述了细胞因子受体的结构。一般认为在使生物获得新的生物学功能的选择压力下，新的受体家族成员从已存在的受体基因的重复产生，从而导致多基因家族的存在。因此家族成员包含祖先基因的残迹，可在分离和鉴定其他家族成员中利用这些特征性质。
本发明提供了可溶性受体(称为“ZcytoR14”或“可溶性ZcytoR14”或“sZcytoR14”，其所有名称在此可互换使用)或/和ZcytoR14细胞因子受体的中和抗体的新的用途。本发明也提供了用于人炎性和自身免疫疾病的可溶性ZcytoR14多肽片段和融合蛋白。可使用本发明的抗ZcytoR14抗体和可溶性ZcytoR14受体(包括中和性抗ZcytoR14抗体)在治疗炎症和炎性疾病中阻断、抑制、降低、拮抗或中和IL-17F或IL-17A、或IL-17A和IL-17F一起的活性，所述病症是例如牛皮癣、牛皮癣性关节炎、类风湿性关节炎、内毒素血症、炎性肠病(IBD)、结肠炎、哮喘、同种异体移植排斥、免疫介导的肾病、肝胆管病、多发性硬化症、动脉粥样硬化、肿瘤生长的促进或退行性关节病和此处公开的其他炎性病症。
SEQ ID NO：1提供了编码人ZcytoR14的说明性核苷酸序列；被编码的多肽显示于SEQ ID NO：2。ZcytoR14用作IL-17A(SEQ ID NOS：13 &14)和IL-17F(SEQ ID NOS：15 & 16)的受体。ZcytoR14可用作单体、同型二聚体或异二聚体。优选地，ZcytoR14充当IL-17A和/或IL-17F的同型二聚体受体。ZcytoR14也可充当IL-17相关细胞因子的异二聚体受体的亚基。ZcytoR14公开于共同拥有的美国专利申请号10/458,647和共同拥有的WIPO公开号WO 01/04304，二者以其全文在此引用作为参考。编码ZcytoR14(SEQ ID NO：1)的人cDNA克隆的分析显示这样的编码692个氨基酸(SEQ ID NO：2)的开放阅读框架，即其包含大约20个氨基酸残基(SEQ ID NO：2的氨基酸残基1至20)的假定的信号序列、大约431个氨基酸残基(SEQ ID NO：2的氨基酸残基21至452；SEQ ID NO：3)的细胞外配体结合结构域、大约20个氨基酸残基(SEQ ID NO：2的氨基酸残基453至473)的跨膜结构域和大约203个氨基酸残基(SEQ ID NO：2的氨基酸残基474至677)的细胞内结构域。此外，由SEQ ID NO：22表示配体结合结构域。
由SEQ ID NO：4提供编码变体人ZcytoR14(称为“ZcytoR14-1”)的另一个说明性核苷酸序列，被编码的多肽示于SEQ ID NO：5。ZcytoR14-1公开于共同拥有的美国专利申请号10/458,647和共同拥有的WIPO公开号WO 01/04304，两者在此以其全文引用作为参考。序列分析显示Zcytor14-1是受体多肽的截短形式。即，Zcytor14-1缺少SEQ IDNO：2的氨基酸残基1至113。SEQ ID NO：10表示包含Zcytor14的N末端部分的Zcytor14-1多肽的氨基酸序列。
Zcytor14和Zcytor14-1的氨基酸序列的比较也表明两种多肽代表可变剪接变体。Zcytor14的氨基酸序列包含Zcytor14-1所缺乏的17个氨基酸的片段(SEQ ID NO：2的氨基酸残基339至355)，而Zcytor14在氨基酸479之后缺少在Zcytor14-1中发现的13个氨基酸的片段(SEQ IDNO：5的氨基酸残基350至362)。SEQ ID NO：11提供了包含这两个氨基酸片段的多肽，而SEQ ID NO：12提供了缺少13和17个氨基酸的片段的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：23提供了编码变体人ZcytoR14(称为“ZcytoR14-6”)的另一个说明性核苷酸序列，被编码的多肽示于SEQ ID NO：24。当和SEQ ID NO：2所示的ZcytoR14相比，ZcytoR14-6具有25个氨基酸的残基缺失。确切地，ZcytoR14-6不包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基94至氨基酸残基118。编码ZcytoR14-6(SEQ ID NO：23)的人cDNA克隆的分析显示大约427个氨基酸的细胞外配体结合结构域(SEQ ID NO：24的氨基酸残基1至427)、大约20个氨基酸残基的跨膜结构域(SEQ ID NO：24的氨基酸残基428至448)和大约218个氨基酸残基的细胞内结构域(SEQID NO：24的氨基酸残基449至667)。
SEQ ID NO：25提供了编码变体鼠类ZcytoR14的说明性核苷酸序列，被编码的多肽显示于SEQ ID NO：26。鼠类ZcytoR14充当鼠类IL-17A(SEQ ID NOS：17和18)和鼠类IL-17F(SEQ ID NOS：19和20)的受体。编码ZcytoR14(SEQ ID NO：1)的鼠类cDNA克隆的分析显示大约449个氨基酸残基的细胞外配体结合结构域(SEQ ID NO：27)。此外，由SEQ IDNO：28表示配体结合结构域。
SEQ ID NO：29提供了编码变体鼠类ZcytoR14的另一个说明性核苷酸序列；被编码的多肽示于SEQ ID NO：30。
Zcytor14基因位于染色体3p25-3p24上。如下所述，该区域和各种病症和疾病关联。
Northern分析表明，Zcytor14基因在甲状腺、肾上腺、前列腺、和肝脏组织中强烈表达，而在心脏、小肠、胃和气管组织中较少表达。相反地，在大脑、胎盘、肺、骨骼肌、肾、胰腺、脾、胸腺、睾丸、卵巢、结肠、外周血白细胞、脊髓、淋巴结和骨髓中极少表达或不表达。这些观察资料显示可在不同的组织之间差异地使用Zcytor14序列。
如下所述，本发明提供了包含这样的氨基酸序列的分离的多肽，该序列和参照氨基酸序列SEQ ID NO：2的21-692具有至少70％、至少80％或至少90％、或超过95％例如96％、97％、98％或大于99％或更大的同一性，其中所述分离的多肽特异性地结合这样的抗体，该抗体特异性地结合包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽。本发明也提供了包含这样的氨基酸序列的分离的多肽，该氨基酸序列和下面的参照氨基酸序列具有至少70％、至少80％或至少90％的同一性，所述参照氨基酸序列选自(a)SEQ ID NO：2的氨基酸残基21至452、(b)SEQ ID NO：10的氨基酸残基21至435、(c)SEQ ID NO：2的氨基酸残基21至677和(d)SEQ ID NO：2的氨基酸残基1至692，其中所述分离的多肽特异性地结合这样的抗体，该抗体特异性地结合由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或SEQ ID NO：10的氨基酸序列构成的多肽。说明性多肽包括包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸序列的多肽。
本发明也提供了包含细胞外结构域的分离的多肽，其中细胞外结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的氨基酸残基21至452或氨基酸序列SEQ ID NO：10的氨基酸残基21至435。这些多肽也可包含相对于细胞外结构域位于羧基端的跨膜结构域，其中跨膜结构域包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基453至473。这些多肽也可包含相对于跨膜结构域位于羧基端部分的细胞内结构域，其中细胞内结构域包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基474至677，或SEQ ID NO：10的氨基酸残基457至673，和任选地，相对于细胞外结构域位于氨基端位置的信号分泌序列，其中信号分泌序列包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的氨基酸残基1至20。
本发明也包括变体Zcytor14多肽，其中变体多肽的氨基酸序列和SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少70％的同一性、至少80％的同一性、至少90％的同一性、至少95％的同一性或大于95％的同一性，其中变体多肽的氨基酸序列和SEQ ID NO：2的氨基酸序列之间的任何差异是由于一个或多个保守性氨基酸替代造成的。
此外，本发明也提供了上面公开的结合IL-17F(例如SEQ ID NO：16所示的人IL-17F多肽序列)的分离的多肽。人IL-17F多核苷酸序列示于SEQ ID NO：15。小鼠IL-17F多核苷酸序列示于SEQ ID NO：19，对应的多肽示于SEQ ID NO：20。本发明也提供了上面公开的结合IL-17A(例如SEQ ID NO：14所示的人IL-17A多肽序列)的分离的多肽。人IL-17A多核苷酸序列示于SEQ ID NO：13。小鼠IL-17A多核苷酸序列示于SEQ IDNO：17，对应的多肽示于SEQ ID NO：18。
本发明也提供了包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或3的至少15个连续氨基酸残基的分离的多肽和表位。说明性多肽包括包含或由SEQ IDNO：2或3、其抗原表位或其功能性IL-17A或IL-17F结合片段构成的多肽。此外，本发明也提供了上面公开的结合、阻断、抑制、降低、拮抗或中和IL-17F或IL-17A的活性的分离的多肽。
本发明也包括变体ZcytoR14多肽，其中变体多肽的氨基酸序列和SEQ ID NO：2的氨基酸残基具有至少70％的同一性、至少80％的同一性、至少90％的同一性、至少95％的同一性或超过95％的同一性，例如96％、97％、98％、或超过99％或更大的同一性，其中变体多肽的氨基酸序列和对应的SEQ ID NO：2的氨基酸序列之间的任何差异都是由一个或多个保守性氨基酸替代造成的。此处描述了这些保守性氨基酸替代。此外，本发明也提供了上面公开的结合、阻断、抑制、降低、拮抗或中和IL-17F或IL-17A的活性的分离的多肽。
本发明还提供了特异性结合这些多肽的抗体和抗体片段。示例性抗体包括中和抗体、多克隆抗体、鼠类单克隆抗体、衍生自鼠类单克隆抗体的人源化抗体和人单克隆抗体。说明性的抗体片段包括F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、scFv和最小识别单位。中和抗体优先结合ZcytoR14，这样就阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17A和IL-17F与ZcytoR14的相互作用；本发明也可包含阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17A或IL-17F与ZcytoR14的结合的抗ZcytoR14中和抗体。即，本发明的抗ZcytoR14中和抗体可单独地结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和各IL-17A或IL-17F，或同时结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17A和IL-17F。本发明还包括包含此处描述的载体和肽、多肽或抗体的组合物。
此外，本发明提供了这样的药物组合物，其包含药物可接受载体和这样的表达载体中的或包含这些表达载体的重组病毒中的至少一种。本发明还包括包含此处描述的药物可接受的载体和多肽或抗体的药物组合物。
本发明也涉及这样的抗独特型抗体、或抗独特型抗体片段，所述抗体或抗体片段与特异性结合包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽或其片段的抗体或抗体片段特异性结合。示例性抗独特型抗体与特异性结合由SEQ ID NO：2构成的多肽的抗体特异性结合。
本发明也提供了包含ZcytoR14多肽和免疫球蛋白部分的融合蛋白。在这些融合蛋白中，免疫球蛋白部分可以是免疫球蛋白重链恒定区，例如人Fc片段。本发明也包括分离的编码这些融合蛋白的核酸分子。
本发明也提供了结合这样的多肽的多克隆和单克隆抗体，所述多肽包含ZcytoR14细胞外结构域，例如单体、同型二聚体、异二聚体和多聚体受体，包括可溶性受体。此外，可使用这些抗体拮抗ZcytoR14配体(IL-17F(SEQ ID NO：16)和IL-17A(SEQ ID NO：14))单独地或一起地和ZcytoR14受体的结合。
通过参考下面的详细描述，本发明的这些方面和其他方面将变得明了。此外，下面给出了各种参考资料并以其全文在此引用作为参考。
B) 定义
在下面的描述中，广泛地使用了许多术语。提供下列定义以帮助理解本发明。
如此处所用，“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、由聚合酶链式反应(PCR)产生的片段以及通过连接作用、剪断作用(scission)、内切核酸酶作用和外切核酸酶作用中的任一种产生的片段。核酸分子可由天然发生的核苷酸的单体构成(例如DNA和RNA)、或天然发生的核苷酸的类似物(例如，天然发生的核苷酸的α-对映体形式)的单体构成、或这两种单体的组合构成。修饰的核苷酸可在糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱基部分具有变化。糖修饰作用包括，例如，用卤素、烷基、胺基和叠氮基替换一个或多个羟基，或可将糖官能化为醚或酯类的形式。此外，可用立体化学和电子相似的结构例如氮杂-糖和碳环糖类似物替代整个糖部分。碱基部分中修饰的示例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶、或其他熟知的杂环取代。可通过磷酸二酯键或这些键的类似键连接核酸单体。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、phosphoranilidate、氨基磷酸(phosphoramidate)等。术语“核酸分子”也包括所谓的“肽核酸”，其包含附着至聚酰胺主链的天然发生的或修饰的核酸碱基。核酸可以是单链的或双链的。
术语“核酸分子的互补链”是指和参照核苷酸序列相比，具有互补的核苷酸序列和相反的方向的核酸分子。例如，序列5′ATGCACGGG3′和5′CCCGTGCAT3′互补。
术语“简并核苷酸序列”是指和编码多肽的参照核酸分子相比，包含一个或多个简并密码子的核苷酸序列。简并密码子包含不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(即，GAU和GAC三联体各自编码Asp)。
术语“结构基因”是指转录成信使RNA(mRNA)的核酸分子，然后该RNA被翻译成特定多肽特有的氨基酸序列。
“分离的核酸分子”是未整合入生物体的基因组DNA中的核酸分子。例如，已从细胞的基因组中分离的编码生长因子的DNA分子是分离的DNA分子。分离的核酸分子的另一个示例是未整合入生物的基因组中的化学合成的核酸分子。已从特定的物种分离的核酸分子比来自该物种的染色体的完全DNA分子小。
“核酸分子构建体”是这样的单链或双链的核酸分子，即其通过人工干预被修饰，从而包含以自然界中不存在的排列方式组合和并列的核酸的片段。
“线性DNA”是指具有游离5′和3′末端的非环形DNA分子。可通过酶促降解或物理破坏从封闭的环形DNA分子例如质粒制备线性DNA。
“互补DNA(cDNA)”是通过逆转录酶从mRNA模板形成的单链DNA分子。一般地，使用和mRNA的部分互补的引物起始反转录。本领域技术人员也使用术语“cDNA”表示由这样的单链DNA分子和其互补DNA链构成的双链DNA分子。术语“cDNA”也指从RNA模板合成的cDNA分子的克隆。
“启动子”是指导结构基因转录的核苷酸序列。一般地，启动子位于基因的5′非编码区，邻近结构基因的转录起始位点。在转录的起始中发挥作用的启动子内的序列元件的特征通常在于一致核苷酸序列。这些启动子元件包括RNA聚合酶结合位点、TATA序列、CAAT序列、分化特异性元件(differentiation-specific elements)(DSEs；McGehee等人，Mol.Endocrinol.7：551(1993))、环AMP效应元件(CREs)、血清效应元件(serum response elements)(SREs；Treisman，Seminars in Cancer Biol.1：47(1990))、糖皮质类固醇应答元件(GREs)和其他转录因子例如CRE/ATF(O′Reilly等人，J.Biol.Chem.267：19938(1992))、AP2(Ye等人，J.Biol.Chem.269：25728(1994))、SP1、cAMP效应元件结合蛋白(CREB；Loeken，Gene Expr.3：253(1993))和八聚体因子(octamer factors)(参见，一般，Watson等人，eds.，Molecular Biology of the Gene，第4版.(TheBenjamin/Cummings Publishing Company，Inc.1987)，和Lemaigre和Rousseau，Biochem.J.303：1(1994))的结合位点。如果启动子是可诱导的启动子，那么转录速率响应诱导剂而增加。相反地，如果启动子是组成型启动子，则不能通过诱导剂调控转录速率。阻抑型启动子也是已知的。
“核心启动子”包含启动子发挥作用所必需的核苷酸序列，包括TATA盒和转录起始位点。根据该定义，核心启动子在可增强活性或提供组织特异性活性的特异性序列不存在的情况可以具有或可以不具有可检测的活性。
“调控元件”是调节核心启动子的活性的核苷酸序列。例如，调控元件可包含这样的核苷酸序列，该序列结合使转录专门地或优先地在特定的细胞、组织或器官中进行的细胞因子。这些类型的调控元件一般和以“细胞特异性”、“组织特异性”或“器官特异性”的方式表达的基因关联。
“增强子”是这样的类型的调控元件，无论增强子相对于转录起始位点的距离或排列方向如何，其都可增加转录的功效。
“异源DNA”是指在给定的宿主细胞内非天然存在的DNA分子或DNA分子的群体。相对于特定的宿主细胞异源的DNA分子可包含来源于宿主细胞物种的DNA(即，内源DNA)，只要将该宿主DNA和非宿主DNA(即，外源DNA)组合。例如，包含这样的编码多肽的非宿主DNA片段的DNA分子被认为是异源DNA分子，所述非宿主DNA片段有效地连接至包含转录启动子的宿主DNA片段。相反地，异源DNA分子可包含有效地和外源启动子连接的内源基因。作为另一个说明性示例，如果包含来源于野生型细胞的基因的DNA分子被导入缺少该野生型基因的突变细胞，则该DNA分子被认为是异源DNA。
“多肽”是无论天然产生的或通过合成产生的、通过肽键连接的氨基酸残基的多聚体。少于大约10个氨基酸残基的多肽通常称为“肽”。
“蛋白”是包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白也可包含非肽组分，例如糖类。可通过这样的细胞给蛋白加上糖和其他非肽取代基，在所述细胞中，产生该蛋白，所述糖和其他非肽取代基随细胞类型的变化而变化。此处以其氨基酸主链的结构定义蛋白；取代基例如糖基一般不指明，虽然如此，但其仍可以存在。？
由非宿主DNA分子编码的肽或多肽是“异源”肽或多肽。
“克隆载体”是能够在宿主细胞中自主复制的核酸分子例如质粒、粘粒或噬菌体。克隆载体一般包含一个或少数限制性内切核酸酶识别位点和编码这样的标记基因的核苷酸序列，所述识别位点允许以可确定的方式插入核酸分子而不丢失载体的基本生物学功能，所述标记基因适合用于鉴定和选择用该克隆载体转化的细胞。标记基因一般包括提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。
“表达载体”是编码在宿主细胞中表达的基因的核酸分子。一般地，表达载体包含转录启动子、基因和转录终止子。基因表达一般置于启动子的控制之下，这样的基因被认为“有效地连接至”启动子。类似地，如果调控元件调控核心启动子的活性，那么该调控元件和核心启动子是有效地连接的。
“重组宿主”是包含异源核酸分子例如克隆载体或表达载体的细胞。在本说明书中，重组宿主的示例是从表达载体产生ZcytoR14的细胞。相反地，可通过是ZcytoR14的“天然来源”或缺少表达载体的细胞产生ZcytoR14。
“整合转化子”是这样的重组宿主细胞，在该重组细胞中，异源DNA已被整合入该细胞的基因组。
“融合蛋白”是通过包含至少2个基因的核苷酸序列的核酸分子表达的杂合蛋白。例如，融合蛋白可包含和结合亲和基质的多肽融合的ZcytoR14多肽的至少部分。这样的融合蛋白提供了使用亲和层析法分离大量ZcytoR14的手段。
术语“受体”是指结合称为“配体”的生物活性分子的细胞关联性蛋白。该相互作用介导配体对细胞的效应。受体可以是膜结合受体、细胞溶胶或细胞核中的受体；单体(例如，促甲状腺激素受体、β-肾上腺素能受体)或多聚体(例如，PDGF受体、生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、促红细胞生成素受体和IL-6受体)。膜结合受体的特征在于包含细胞外配体结合结构域和细胞内效应结构域(通常参与信号转导)的多结构域结构。在某些膜结合受体中，细胞外配体结合结构域和细胞内效应结构域位于分开的、包含完整功能性受体的多肽中。
一般地，配体和受体的结合导致受体的构象变化，这使效应结构域和细胞内其他分子之间产生相互作用，该相互作用依次导致细胞的代谢作用上的改变。通常和受体-配体相互作用关联的代谢事件包括基因转录、磷酸化作用、去磷酸化作用、环AMP产物的增加、细胞钙的动员、膜脂质的动员、细胞粘着、肌醇脂质的水解和磷脂的水解。
“可溶性受体”是不和细胞膜结合的受体多肽。可溶性受体是最普遍的缺少跨膜和细胞质结构域、以及和细胞膜的其他连接例如通过糖基磷酸肌醇(gpi)的连接的配体结合性受体。可溶性受体可包含额外的氨基酸残基，例如提供多肽的纯化或提供多肽至基质的附着位点的亲和标签、或免疫球蛋白恒定区序列。许多细胞表面受体具有天然发生的、可溶性对应物(counterpart)，该对应物通过蛋白水解作用产生或通过可变剪接的mRNA翻译产生。可溶性受体可以是单体、同二聚体、异二聚体或多聚体，多聚体受体一般包含不超过9个亚基，优选地不超过6个亚基和最优选地不超过3个亚基。当受体多肽缺乏充分的跨膜和细胞内多肽片段以至不能分别提供膜锚定或信号转导时，认为其基本上不含有这些片段。细胞因子受体的可溶性受体一般包含无跨膜结构域和细胞内结构域的细胞外细胞因子结合结构域。例如，代表性可溶性受体包括如SEQ ID NO：21中所示的IL-17R的可溶性受体。描述已知的细胞因子受体序列的包含无跨膜结构域和细胞内结构域的细胞外细胞因子结合结构域的序列完全在本领域技术人员的水平之内。此外，本领域技术人员可使用遗传密码子容易地确定编码这些可溶性受体多肽的多核苷酸。
术语“分泌信号序列”是指编码这样的肽(“分泌肽”)的DNA序列，该肽，作为更大的多肽的组成部分，指导该更大的多肽通过合成其的细胞的分泌途径。在通过分泌途径的运输过程中，一般切断更大的肽以除去分泌肽。
“分离的多肽”是这样的多肽，即其基本上不含在天然状态下和该多肽结合的污染性细胞组分例如糖、脂质或其他蛋白性质的杂质。一般地，分离的多肽的制剂包含以高度纯化的形式即至少大约80％的纯度、至少大约90％的纯度、至少大约95％的纯度、高于95％的纯度例如96％、97％或98％或更高的纯度或高于99％的纯度的该多肽。显示特定蛋白制剂包含分离的多肽的一个方法是通过蛋白制剂的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶的考马斯亮蓝染色后，显现出单一的条带来进行显示。然而，术语“分离的”不排除相同的多肽以可选择的物理形式例如二聚体或可选择地糖基化或衍生形式存在。
此处使用术语“氨基端”和“羧基端”表示多肽中的位置。在上下文允许的情况下，使用这些关于多肽的特定序列或部分的术语表示临近或相对的位置。例如，多肽内的某些位于参照序列的羧基端的序列位于临近参照序列的羧基末端，但不必在全长多肽的羧基末端。
术语“表达”是指基因产物的生物合成。例如，在结构基因的情况下，表达包括将结构基因转录成mRNA和将mRNA翻译成一种或多种多肽。
此处使用术语“剪接变体”表示从基因转录的RNA的可变形式。剪接变异通过使用转录的RNA分子内的可变剪接位点天然地产生，或其较不普遍地产生于分开转录的RNA分子之间，其可产生转录自相同基因的几种mRNA。剪接变体可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。此处也使用术语剪接变体表示由转录自基因的mRNA的剪接变体编码的多肽。
如此处所用的，术语“免疫调节剂”包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、共刺激分子、造血因子等、和这些分子的合成的类似物。
术语“互补/反互补对(complement/anti-complement pair)”是指在合适的条件下形成非共价结合的稳定配对的不相同的部分。例如，生物素和抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)是互补/反互补对的原型成员。其他互补/反互补对包括受体/配体对、抗体/抗原(或半抗原或表位)对、有义/反义多核苷酸对等。在想要随后分离互补/反互补对的情况下，互补/反互补对优选地具有低于109M-1的结合亲和力。
“抗独特型抗体”是和免疫球蛋白的可变区结构域结合的抗体。在本说明书中，抗独特型抗体和抗ZcytoR14抗体的可变区结合，从而，抗独特型抗体模拟了ZcytoR14的表位。
“抗体片段”是抗体的部分例如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab等。无论怎样的结构，抗体片段和被该完整的抗体识别的相同抗原结合。例如，抗ZcytoR14单克隆抗体片段结合ZcytoR14的表位。
术语“抗体片段”也包括结合特定抗原的合成的或经基因工程改造的多肽，例如由轻链可变区构成的多肽、由重链和轻链可变区构成的“Fv”片段、其中轻链和重链可变区通过肽连接体连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)和由模拟高变区的氨基酸残基构成的最小识别单位。
“嵌合抗体”是这样的重组蛋白，该重组蛋白包含来自啮齿类抗体的可变结构域和互补决定区，同时抗体的剩余部分来源于人抗体。
“人源化抗体”是这样的重组蛋白，在该重组蛋白中，单克隆抗体的鼠类互补决定区已从鼠类免疫球蛋白的重链和轻链可变区转移入人可变结构域。这样的人源化抗体的构建在本领域技术人员的技术范围之内，所述人源化抗体是衍生自鼠类抗体、在人中用于治疗用途的抗体，例如结合或中和人蛋白的抗体。
如此处所用的，“治疗剂”是被缀合至抗体部分以产生用于治疗的缀合物的分子或原子。治疗剂的示例包括药物、毒素、免疫调节剂、螯合剂、硼化合物、光活化剂或染料以及放射性同位素。
“可检测的标记物”是可被缀合至抗体部分以产生用于诊断的分子的分子或原子。可检测的标记物的示例包括螯合剂、光活化剂、放射性同位素、荧光剂、顺磁性离子或其他标志物部分。
术语“亲和标签”此处用于表示可附着至第二多肽以提供第二多肽的纯化或检测或提供第二多肽附着至基质的位点的多肽片段。原则上，可将可获得其抗体或其他特异性结合剂的任何多肽或蛋白用作亲和标签。亲和标签包括多组氨酸片段、A蛋白(Nilsson等人，EMBO J.4：1075(1985)；Nilsson等人，Methods Enzymol.198：3(1991))、谷胱苷肽S转移酶(Smith和Johnson，Gene67：31(1988))、Glu-Glu亲和标签(Grus senmeyer等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA82：7952(1985))、P物质、FLAG肽(Hopp等人，Biotechnology6：1204(1988))、链霉抗生物素结合肽或其他抗原表位或结合结构域。一般参见，Ford等人，Protein Expression and Purification 2：95(1991)。可从提供商(例如，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)商购获得编码亲和标签的DNA分子。
“裸露抗体”是完整的抗体，和抗体片段相反，其不与治疗剂缀合。裸露抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体，以及某些重组抗体例如嵌合抗体和人源化抗体。
如此处所用的，术语“抗体组分”包括完整的抗体和抗体片段。
“免疫缀合物”是抗体组分和治疗剂或可检测标记物的缀合物。
如此处所用的，术语“抗体融合蛋白”是指包含抗体组分和ZcytoR14多肽组分的重组分子。抗体融合蛋白的示例包括包含ZcytoR14细胞外结构域和Fc结构域或抗原结合区的蛋白。
“靶多肽”或“靶肽”是这样的氨基酸序列，该氨基酸序列包含至少一个表位并在靶细胞例如肿瘤细胞或携带感染剂抗原的细胞上表达。T细胞识别由主要组织相容性复合物分子呈递的靶多肽或靶肽的肽表位和一般裂解靶细胞或将其他免疫细胞招募至靶细胞的位置，从而杀死靶细胞。
“抗原表位”是这样的肽，该肽结合主要组织相容性复合物分子以形成被T细胞识别的MHC-肽复合物，从而在呈递至T细胞后诱导细胞毒性淋巴细胞应答。因此，抗原肽能够结合合适的主要组织相容性复合物分子和诱导细胞毒性T细胞应答，例如细胞裂解或抗靶细胞(其结合或表达该抗原)的特异性细胞因子释放。可将抗原肽结合在抗原呈递细胞或靶细胞上的I类或II类主要组织相容性复合物分子。
在真核生物中，RNA聚合酶II催化结构基因的转录，产生mRNA。可设计核酸分子使之包含这样的RNA聚合酶II的模板，在该模板中RNA转录物具有和特定的mRNA的序列互补的序列。所述RNA转录本被称为“反义RNA”，编码反义RNA的核酸分子被称为“反义基因”。反义RNA分子能够结合mRNA分子，导致mRNA翻译的抑制。
“对于ZcytoR14是特异性的反义寡核苷酸”或“ZcytoR14反义寡核苷酸”是这样的寡核苷酸，该寡核苷酸具有(a)能够和ZcytoR14基因的部分形成稳定的三链体的序列，或(b)能够和ZcytoR14基因的mRNA转录物的部分形成稳定的双链体的序列。
“核酶”是包含催化中心的核酸分子。该术语包括RNA酶、自我拼接RNAs、自我切割RNA和进行这些催化功能的核酸分子。编码核酶的核酸分子被称为“核酶基因”。
“外在引导序列(external guide sequence)”是这样的核酸分子，该分子指导内源核酶，RNA酶P至特定种类的细胞内mRNA，导致通过RNA酶P产生的mRNA的断裂。编码外在引导序列的核酸分子被称为“外在引导序列基因”。
术语“变体ZcytoR14基因”是指编码具有这样的氨基酸序列的多肽的核酸分子，该序列是SEQ ID NO：2的变体。这些变体包括天然发生的ZcytoR14基因的多态性，和包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的保守性氨基酸替代的合成的基因。ZcytoR14基因的其他变体形式是包含此处描述的核苷酸序列的插入或缺失的核酸分子。变体ZcytoR14基因可通过例如在严紧条件下，确定该基因是否和具有SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：4、或其互补序列杂交来进行鉴定。
可选择地，可通过序列比较来鉴定变体ZcytoR14基因。当就最大对应性进行比对时，如果两个氨基酸序列的氨基酸残基相同，那么这两个氨基酸序列具有“100％氨基酸序列同一性”。类似地，当就最大对应性进行比对时，如果两个核苷酸序列的核苷酸残基相同，那么这两个核苷酸序列具有“100％的核苷酸序列同一性”。可使用标准软件程序，例如由DNASTAR(Madison，Wisconsin)生产的LASERGENE生物信息学计算套件中包含的程序，进行序列比较。用于通过确定最优比对来比较两个核苷酸或氨基酸序列的其他方法对于本领域技术人员来说是熟悉的(参见，例如，Peruski和Peruski，The Internet and theNew Biology：Tools for Genomic and Molecular Research(ASMPress，Inc.1997)，Wu等人(eds.)，“Information Supernighwayand Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins，”inMethods in Gene Biotechnology，pages123-151(CRC Press，Inc.1997)，和Bishop(ed.)，Guide to Human Genome Computing，第2版(Academic Press，Inc.1998))。下面描述用于确定序列同一性的特定方法。
不管用于鉴定变体ZcytoR14基因或变体ZcytoR14多肽的特定方法如何，可功能性地表征变体基因或由变体基因编码的多肽特异性结合抗ZcytoR14抗体的能力。也可通过使用此处描述的生物学或生物化学测定法功能性地表征变体ZcytoR14基因或变体ZcytoR14多肽结合其配体例如IL-17A和/或IL-17F的能力。
此处所用的术语“等位变体”是指占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种可选择形式的任一形式。等位变异天然地通过突变产生，其可导致群体内的表型多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽上无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。此处也使用术语等位变体表示由基因的等位变体编码的蛋白。
术语“直向同源物”是指从一个物种获得的这样的多肽或蛋白，所述多肽或蛋白是来自不同物种的多肽或蛋白的功能性对应物。直向同源物中的序列差异是物种形成的结果。
“平行进化同源物(Paralogs)”是由生物产生的不同的但结构相关的蛋白。据认为平行进化同源物通过基因重复产生。例如，α-球蛋白、β-球蛋白和肌红蛋白是相互的平行进化同源物。
本发明包括ZcytoR14基因的功能性片段。在本发明的说明书中，ZcytoR14基因的“功能性片段”是指编码ZcytoR14多肽的部分的核酸分子，该多肽的部分是此处描述的结构域或至少特异性地结合抗ZcytoR14抗体。
由于标准分析方法的不精确性的原因，聚合物的分子量和长度理解为近似值。当该值表达为“大约”X或“近似”X时，所述的X的值理解为精确值±10％。
C)ZcytoR14多核苷酸或基因的产生
可通过使用基于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4的多核苷酸探针筛选人cDNA或基因组文库来获得编码人ZcytoR14基因的核酸分子。这些技术是标准的和已建立好的，可使用购自商业提供者的克隆试剂盒进行这些技术。参见，例如，Ausubel等人(eds.)，Short Protocols inMolecular Biology，第3版，John Wiley和Sons1995；Wu等人，Methods in Gene Biotechnology，CRC Press，Inc.1997；Aviv和Leder，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 69：1408(1972)；Huynh等人，“Constructing and Screening cDNA Libraries in λgt10 andλgt11，”in DNA Cloning：A Practical Approach Vol.I，Glover(ed.)，page49(IRL Press，1985)；Wu(1997)at pages47-52.
也可使用聚合酶链式反应(PCR)和这样的寡核苷酸引物获得编码人ZcytoR14基因的核酸分子，所述寡核苷酸引物具有基于ZcytoR14基因或cDNA的核苷酸序列的核苷酸序列。由例如，Yu等人，“Use of thePolymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries，”inMethods in Molecular Biology，第15卷：PCR Protocols：CurrentMethods and Applications，White(ed.)，Humana Press，Inc.，1993提供用于使用PCR筛选文库的一般方法。此外，由例如，Preston，“Useof Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase ChainReaction to Clone Gene Family Member s，”in Methods in MolecularBiology，第15卷：PCR Protocols：Current Methods andApplications，White(ed.)，Humana Press，Inc.1993描述了使用PCR分离相关基因的技术。作为另一选择，可通过使用此处描述的(参见，例如Ausubel(1995))相互启动(mutually priming)的长寡核苷酸和核苷酸序列合成核酸分子来获得ZcytoR14基因。使用聚合酶链式反应的已建立的技术提供了合成长度至少为2千碱基的DNA分子的能力(Adang等人，Plant Molec.Biol.21：1131(1993)，Bambot等人，PCRMethods and Applications 2：266(1993)，Dillon等人，“Use of thePolymerase Chain Reaction for the Rapid Construction ofSynthetic Genes，”in Methods in Molecular Biology，第15卷：PCR Protocols：Current Methods and Applications，White(ed.)，pages263-268，(Humana Press，Inc.1993)，和Holowachuk等人，PCRMethods Appl.4：299(1995))。关于多核苷酸合成的综述，参见，例如，Glick和Pasternak，Molecular Biotechnology，Principles andApplications of Recombinant DNA(ASM Press1994)，Itakura等人，Annu.Rev.Biochem.53：323(1984)，和Climie等人，Proc.Nat’l Acad Sci.USA87：633(1990)。
D)ZcytoR14基因变体的产生
本发明提供了编码此处公开的ZcytoR14多肽的多种核酸分子，包括DNA和RNA分子。本领域技术人员容易地认识到，考虑到遗传密码的简并性，在这些多核苷酸分子中可能存在相当多的序列变化。此外，本发明也提供了分离的可溶性单体、同型二聚体、异二聚体和多聚体受体多肽，所述受体多肽包含至少一个和SEQ ID NO：2的受体多肽基本上同源的ZcytoR14受体亚基。因此，本发明涉及包含SEQ ID NO：1或SEQID NO：4的简并核苷酸的ZcytoR14多肽编码性核酸分子和其RNA等同物。
本领域技术人员可容易地认识到，考虑到遗传密码的简并性，在这些多核苷酸分子中可能存在相当多的序列变化。SEQ ID NO：7是包含所有编码SEQ ID NO：2的Zcytor14多肽的核酸分子的简并核苷酸序列。本领域技术人员认识到，通过用U替换T，SEQ ID NO：7的简并序列也提供了编码SEQ ID NO：2的所有RNA序列。因此，本发明涉及这样的编码Zcytor14多肽的核酸分子，该分子包含SEQ ID NO：1的核苷酸154至核苷酸2229，和其RNA等同物。类似地，通过用U替代T，SEQ ID NO：6的Zcytor14-1简并序列也提供了编码SEQ ID NO：5的所有RNA序列。
表1列出了单字母密码以表示简并核苷酸的位置。“方案”是由密码字母表示的核苷酸。“互补物”表示互补核苷酸的密码。例如，密码Y表示C或T，其互补物R表示A或G，A对于T是互补的，G对于C是互补的。
表1
核苷酸     方案     互补物     方案
A     A     T     T
C     C     G     G
G     G     C     C
T     T     A     A
R     A|G     Y     C|T
Y     C|T     R     A|G
M     A|C     K     G|T
K     G|T     M     A|C
S     C|G     S     C|G
W     A|T     W     A|T
H     A|C|T     D     A|G|T
B     C|G|T     V     A|C|G
V     A|C|G     B     C|G|T
D     A|G|T     H     A|C|T
N     A|C|G|T     N     A|C| G|T
简并密码子，包括给定的氨基酸的所有可能的密码子，列于表2。
表2
氨基酸 单字母代码 密码子     简并密码子
    Cys C     TGC TGT     TGY
    Ser S     AGC AGT TCA TCC TCG TCT     WSN
    Thr T     ACA ACC ACG ACT     ACN
    Pro P     CCA CCC CCG CCT     CCN
    Ala A     GCA GCC GCG GCT     GCN
    Gly G     GGA GGC GGG GGT     GGN
    Asn N     AAC AAT     AAY
    Asp D     GAC GAT     GAY
    Glu E     GAA GAG     GAR
    Gln Q     CAA CAG     CAR
    His H     CAC CAT     CAY
    Arg R     AGA AGG CGA CGC CGG CGT     MGN
    Lys K     AAA AAG     AAR
    Met M     ATG     ATG
    Ile I     ATA ATC ATT     ATH
    Leu L     CTA CTC CTG CTT TTA TTG     YTN
    Val V     GTA GTC GTG GTT     GTN
    Phe F     TTC TTT     TTY
    Tyr Y     TAC TAT     TAY
    Trp W     TGG     TGG
    Ter     TAA TAG TGA     TRR
    Asn|Asp B     RAY
    Glu|Gln Z     SAR
    Any X     NNN
本领域技术人员将认识到，在确定简并密码子(其代表了编码氨基酸的所有可能的密码子)中引入了不确定性。例如，丝氨酸的简并密码子(WSN)，在一些情况下，可编码精氨酸(AGR)，精氨酸的简并密码子(MGN)，在一些情况下，可编码丝氨酸(AGY)。类似的关系存在于编码苯丙氨酸和亮氨酸的密码子之间。因此，由简并序列包含的一些多核苷酸可编码变体氨基酸序列，但本领域技术人员通过参考SEQID NO：3的氨基酸序列可容易地鉴定这些变体序列。可就此处描述的功能性容易地对变体序列进行检测。
不同的物种可展示“偏爱密码子作用(preferential codonusage)”。一般参见，Grantham等人，Nucl.Acids Res.8：1893(1980)，Haas等人Curr.Biol.6：315(1996)，Wain-Hobson等人，Gene13：355(1981)，Grosjean和Fiers，Gene 18：199(1982)，Holm，Nuc.Acids Res.14：3075(1986)，Ikemura，J.Mol.Biol.158：573(1982)，Sharp和Matassi，Curr.Opin.Genet.Dev.4：851(1994)，Kane，Curr.Opin.Biotechnol.6：494(1995)，和Makrides，Microbiol.Rev.60：512(1996)。如此处所用的，术语“偏爱密码子利用”或“偏爱密码子”是本领域的术语，其是指在某些物种的细胞中最频繁使用的蛋白翻译密码子，从而偏向使用编码各氨基酸的可能的密码子(参见表2)中的一个或少数几个代表。例如，氨基酸苏氨酸(Thr)可由ACA、ACC、ACG或ACT编码，但在哺乳动物细胞中ACC是最常使用的密码子；在其他物种中，例如，昆虫细胞、酵母、病毒或细菌中，不同的Thr密码子是优选的。可通过本领域中已知的各种方法将特定物种的偏爱密码子导入本发明的多核苷酸中。将偏爱密码子序列导入重组DNA可以，例如，通过使蛋白在特定的细胞类型或物种中更有效地翻译来增加蛋白的生产。因此，此处公开的简并密码子序列用作这样的模板，该模板用于在本领域内普遍使用的和此处公开的各种细胞类型和物种中多核苷酸的最优化表达。就各种物种中的表达检验和最优化包含偏爱密码子的序列，并就此处公开的功能性检验其。
可通过各种方法，例如通过使用完整的或部分的人cDNA或用基于公开的序列的一组或多组简并探针进行探测来分离编码ZcytoR14的cDNA。也可使用聚合酶链式反应和根据此处公开的代表性人ZcytoR14序列设计的引物来克隆cDNA。此外，可使用cDNA文库转化或转染宿主细胞，可用抗ZcytoR14多肽的抗体检测目的cDNA的表达。
本领域技术人员认识到，SEQ ID NO：1中公开的序列代表人ZcytoR14的单个等位基因，认识到预期发生其等位变异和可变剪接。可按照标准的方法通过探测来自不同的个体的cDNA或基因组文库来克隆该序列的等位基因变体。此处公开的核苷酸序列的等位变体，包括包含沉默突变的变体和其中突变导致氨基酸序列改变的变体，在本发明的范围之内，作为此处公开的氨基酸序列的等位变体的蛋白也在本发明的范围之内。从可变剪接的mRNA产生的、保持ZcytoR14多肽的性质的cDNA分子包含在本发明的范围之内，由该cDNA和mRNA编码的多肽也在本发明的范围之内。可按照本领域已知的标准方法，通过探测来自不同个体或组织的cDNA或基因组文库来克隆这些序列的等位变体和剪接变体。
通过使用上述方法，本领域技术人员可制备各种包含可溶性ZcytoR14受体亚基的多肽，所述多肽和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4的氨基酸基本上同源，或编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5的氨基酸或其等位变体并保持野生型ZcytoR14受体的配体结合特性。这些多肽也可以包括此处一般公开的其他的多肽区段。
在本发明的某些实施方案中，在严紧条件下，分离的核酸分子可和包含此处公开的核酸序列互补。例如，这些核酸分子可在严紧条件下和包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4的核苷酸序列的核酸分子或和包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4互补的核苷酸序列的核酸分子或其片段杂交。
一般地，选择严紧条件，使其在确定的离子强度和pH下比特定序列的热解链点(thermal melting point)(Tm)低大约5℃。Tm是这样的温度，在该温度下，(在确定的离子强度和pH下)50％的靶序列和完全匹配的探针杂交。杂交后，可在严紧条件下或在高度严紧条件下洗涤核酸分子以除去非杂交核酸分子。参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(Cold SpringHarbor Press 1989)；Ausubel等人，(eds.)，Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley and Sons，Inc.1987)；Berger和Kimmel(eds.)，Guide to Molecular Cloning Techniques，(Academic Press，Inc.1987)；和Wetmur，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.26：227(1990))。序列分析软件例如OLIGO6.0(LSR；LongLake，MN)和Primer Premier 4.0(Premier Biosoft International；Palo Alto，CA)，以及存在于因特网上的软件，都是可获得的用于基于用户定义的标准分析给定的序列和计算Tm的工具。改变杂交和洗涤条件以使之适合用于特定多核苷酸的杂交在本领域技术人员的能力范围之内。
本发明也提供了这样的分离的ZcytoR14多肽，该肽和SEQ ID NO：2的多肽或其直向同源物具有基本上相似的序列同一性。此处使用的术语“基本上相似的序列同一性”是指多肽和SEQ ID NO：2显示的序列或其直向同源物具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％例如96％、97％、98％或高于95％的序列同一性。例如，可使用变体和直向同源ZcytoR14受体产生针对人ZcytoR14的免疫应答和产生针对人ZcytoR14的交叉反应性抗体。可如此处所描述的人源化和修饰这些抗体，将其治疗性地用于治疗牛皮癣、牛皮癣性关节炎、IBD、结肠炎、内毒素血症以及用于此处描述的其他治疗性应用。
本发明也涉及这样的ZcytoR14变体核酸分子，可使用2个标准来鉴定该ZcytoR14变体核酸分子：编码的多肽和SEQ ID NO：2的氨基酸序列之间的相似性的确定，和杂交测定法。这些ZcytoR14变体包括这样的核酸分子，即(1)在这样的严紧洗涤条件下保持和具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4的核苷酸序列(或其互补链)的核酸分子杂交的核酸分子，在所述严紧洗涤条件下，洗涤严紧度为55-65℃下的含0.1％SDS的0.5x-2x SSC，和(2)编码和SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或高于95％例如96％、97％、98％或99％的序列同一性的核酸分子。可选择地，可将ZcytoR14变体表征为这样的核酸，即(1)在这样的高度严紧洗涤条件下保持和具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4的核苷酸序列(或其互补链)的核酸分子杂交的核酸分子，在所述高度严紧洗涤条件中，洗涤严紧度为50-65℃下的含0.1％SDS的0.1x-0.2x SSC，和(2)编码和SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或高于95％例如96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的多肽。
通过常规方法确定百分比序列同一性。参见，例如，Altschul等人，Bull.Math Bio.48：603(1986)，和Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad：Sci.USA89：10915(1992)。简而言之，通过使用值为10的缺口开放罚分、值为1的缺口延伸罚分和表3(氨基酸以标准的单字母代码标示)中所示的Henikoff和Henikoff(同上)“BLOSUM62”评分矩阵，排列2个氨基酸序列以最优化比对评分。然后将百分比同一性计算为：([相同匹配的总数]/[较长序列的长度加上引入至较长序列以比对2个序列的缺口的数目])(100)。
表3
    A  R  N  D  C  Q  E  G  H  I  L  K  M  F  P  S  T  W  Y  V
A   4
R  -1  5
N  -2  0  6
D  -2 -2  1  6
C   0 -3 -3 -3  9
Q  -1  1  0  0 -3  5
E  -1  0  0  2 -4  2  5
G   0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6
H  -2  0  1 -1 -3  0  0 -2  8
I  -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3  4
L  -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  2  4
K  -1  2  0 -1 -3  1  1 -2 -1 -3 -2  5
M  -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  1  2 -1  5
F  -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1  0  0 -3  0  6
P  -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7
S   1 -1  1  0 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4
T   0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  1  5
W  -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  1 -4 -3 -2  11
Y  -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3  2 -1 -1 -2 -1  3 -3 -2 -2  2  7
V   0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  1 -2  1 -1 -2 -2  0 -3 -1  4
本领域技术人员知道存在许多可获得的用于比对两个氨基酸序列的已建立的算法。Pearson和Lipman的“FASTA”相似性搜索算法是用于检查此处公开的氨基酸序列和假定的ZcytoR14变体的氨基酸序列所共有的相似性水平的合适的蛋白质比对方法。FASTA算法由Pearson和Lipman，Proc.Nat’l Acad Sci.USA 85：2444(1988)，和Pearson，Meth.Enzymol.183：63(1990)进行描述。简而言之，FASTA首先在不考虑保守性氨基酸替代、插入或缺失的情况下，通过鉴定查询序列(例如，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3)和测试序列共有的具有最高一致性密度(如果ktup变量＝1)或成对一致性(如果ktup＝2)的区域来表征序列相似性。然后通过使用氨基酸替代矩阵比较所有成对氨基酸的相似性来给具有最高密度的一致性的10个区域重新打分，“修剪”所述区域的末端使之只包含对最高分值有贡献的残基。如果存在几个具有高于“截止”值的评分(基于序列长度和ktup值通过预设的公式计算的)的区域，那么检查经修剪的起始区域以确定是否可连接该区域以形成具有缺口的近似比对。最后，使用考虑氨基酸插入和缺失的Needleman-Wunsch-Sellers算法的修改方案(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：444(1970)；Sellers，SIAM J.Appl.Math.26：787(1974))对两个氨基酸序列的最高评分区域进行比对。FASTA分析的说明性参数是：ktup＝1、缺口开放罚分＝10、缺口延伸罚分＝1、取代矩阵＝BLOSUM62。可通过修改评分矩阵文件(“SMATRIX”)来将这些参数引入FASTA程序中，如在Pearson，Meth.Enzymol.183：63(1990)的附录2中所解释的。
也可利用上面公开的比率，使用FASTA确定核酸分子的序列同一性。对于核苷酸序列的比较，ktup值可在1至6之间，优选地从3至6的范围内变化，最优选地是3，如上所述设置其他参数。
本发明包括编码这样的多肽的核酸分子，该多肽和此处公开的氨基酸序列相比具有保守性氨基酸改变。例如，可获得包含SEQ ID NO：2的一个或多个氨基酸替代的变体，在该变体中，烷基氨基酸在ZcytoR14氨基酸序列中替代烷基氨基酸，芳香族氨基酸在ZcytoR14氨基酸序列中替代芳香族氨基酸，含硫氨基酸在ZcytoR14氨基酸序列中替代含硫氨基酸，包含羟基的氨基酸在ZcytoR14氨基酸序列中替代包含羟基的氨基酸，酸性氨基酸在ZcytoR14氨基酸序列中替代酸性氨基酸，碱性氨基酸在ZcytoR14氨基酸序列中替代碱性氨基酸，二碱式一羧基氨基酸(dibasic monocarboxylic amino acid)在ZcytoR14氨基酸序列中替代二碱式一羧基氨基酸氨基酸。在普通氨基酸中，例如，通过下列组中的各组内的氨基酸之间的替代来举例说明“保守性氨基酸替代”：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，(3)丝氨酸和苏氨酸，(4)天冬氨酸和谷氨酸，(5)谷氨酰胺和天冬酰胺，和(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。BLOSUM62表是氨基酸取代矩阵，其产生自代表超过500组关联蛋白的高度保守区域的蛋白序列区段的大约2,000个局部多重比对(Henikoff和Henikoff，Proc.Nat’l Acad Sci.USA 89：10915(1992))。因此，可使用BLOSUM62取代频率定义可被引入本发明的氨基酸序列的保守性氨基酸替代。尽管可能只基于化学性质(如上所述的性质)设计氨基酸替代，但术语“保守性氨基酸替代”优选地是指由大于-1的BLOSUM62值代表的替代。例如，如果替代的特征在于为0、1、2或3的BLOSUM62值，那么该氨基酸替代是保守的。根据该系统，优选的保守性氨基酸替代的特征在于至少为1(例如，1、2或3)的BLOSUM62值，更优选的保守性氨基酸替代的特征在于至少为2(例如2或3)的BLOSUM62值。ZcytoR14的特定的变体的特征在于其和对应的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：2)具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或高于95％例如96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性，其中氨基酸序列上的变异是由于一个或多个保守性氨基酸替代造成的。
可通过例如用核苷酸替代SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4中列举的核苷酸来在ZcytoR14基因中引入保守性氨基酸变换。可通过寡核苷酸指导的诱变、接头分区诱变、使用聚合酶链式反应的诱变等(参见Ausubel(1995)；和McPherson(ed.)，Directed Mutagenesis：A PracticalApproach(IRL Press1991))来获得这些“保守性氨基酸”变体。可就特异性地结合抗ZcytoR14抗体的能力鉴定变体ZcytoR14多肽。
本发明的蛋白也可包含非天然发生的氨基酸残基。非天然发生的氨基酸残基包括，但不限于，反式-3-甲基脯氨酸、2，4-甲醇基脯氨酸、顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺(homoglutamine)、哌可酸、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、3，3-二甲脯氨酸、叔-亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。用于将非天然发生的氨基酸残基整合入蛋白的几种方法在本领域是已知的。例如，可使用其中使用经化学方法氨基酰化的抑制型tRNA抑制无义突变的体外系统。用于合成氨基酸和氨基酰化的tRNA的方法在本领域是已知的。一般在包含大肠杆菌(E.coli)S30提取物和可商购获得的酶和其他试剂的无细胞系统中转录和翻译包含无义突变的质粒。通过层析纯化蛋白。参见，例如Robertson等人，J.Am.Chem.Soc.113：2722(1991)，Ellman等人，Methods Enzymol.202：301(1991)，Chung等人，Science 259：806(1993)，和Chung等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 90：10145(1993)。
在第二种方法中，通过显微注射突变的mRNA和化学氨基酰化的抑制型tRNA来在爪蟾卵中进行翻译(Turcatti等人，J.Biol.Chem.271：19991(1996))。在第三种方法中，在要被替代的天然氨基酸(例如，苯丙氨酸)不存在的情况下和在想要的非天然发生的氨基酸(例如，2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)存在的情况下培养大肠杆菌细胞。将非天然发生的氨基酸整合入蛋白以替代其天然的对应物。参见，Koide等人，Biochem.33：7470(1994)。通过体外化学修饰可将天然发生的氨基酸残基转化成非天然发生的种类。可将化学修饰和定点诱变结合以进一步扩展替代的范围(Wynn和Richards，Protein Sci.2：395(1993))。
可使用有限数目的非保守性氨基酸、非遗传密码子编码的氨基酸、非天然发生的氨基酸和非天然氨基酸替代ZcytoR14的氨基酸残基。
可根据本领域已知的方法，例如定点诱变或丙氨酸扫描述诱变(Cunningham和Wells，Scidnce 244：1081(1989)，Bass等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 88：4498(1991)，Coombs和Corey，“Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering，”inProteins：Analysis and Design，Angeletti(ed.)，pages259-311(Academic Press，Inc.1998))鉴定本发明的多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中，在分子中的每一个残基上引入单个丙氨酸突变，就生物学活性检测所得的突变分子以鉴定对于该分子的活性是至关重要的氨基酸残基。也参见，Hilton等人，J.Biol.Chem.271：4699(1996)。
尽管可使用序列分析进一步确定ZcytoR14的配体结合区域，但也可通过结构(例如通过这些技术如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，结合假定的接触位点氨基酸的突变确定的结构)的物理分析确定在ZcytoR14的结合活性(例如ZcytoR14和I1-17A或IL-17F的结合，或和抗ZcytoR14抗体的结合)中起作用的氨基酸。参见，例如，de Vos等人，Science 255：306(1992)，Smith等人，J.Mol.Biol.224：899(1992)，和Wlodaver等人，FEBS Lett.3099：59(1992)。
可使用已知的诱变和筛选的方法，例如由Reidhaar-Olson和Sauer(Science 241：53(1988))或Bowie和Sauer(Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 86：2152(1989))公开的方法产生和检测多个氨基酸替代。简而言之，这些发明者公开了这样的方法，该方法用于同时随机化多肽中的两个或更多个位点，选择功能性多肽，然后测定诱变处理的多肽的序列以确定各位点上的可允许的替代的谱。可使用的其他方法包括噬菌体展示法(例如，Lowman等人，Biochem.30：10832(1991)，Ladner等人，美国专利号5,223,409，Huse，国际公开号WO 92/06204，和局部定点诱变(Derbyshire等人，Gene 46：145(1986)，和Ner等人，DNA7：127，(1988))。此外，可将生物素或FITC标记的ZcytoR14用于ZcytoR14配体的表达克隆。
也可由Stemmer，Nature 370：389(1994)，Stemmer，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 91：10747(1994)，和国际公开号WO 97/20078公开的DNA改组产生公开的ZcytoR14核苷酸和多肽序列的变体。简而言之，通过亲本DNA的随机片段的体外同源重组，然后使用导致随机引入的点突变的PCR进行重新装配来产生变体DNA分子。可使用亲本DNA分子的家族例如来自不同物种的等位变体或DNA分子来修饰该技术，从而将其他的可变性引入该方法。通过选择想要的突变同时进行抗有害变化的选择来就想要的活性进行选择或筛选，然后再进行另外的重复诱变和检测提供了序列的快速“进化”。
可将此处公开的诱变方法和高通量、自动化的筛选方法结合，以在宿主细胞中检测克隆的、诱变处理的多肽的活性。可使用现代化设备从宿主细胞回收编码生物学活性多肽或结合抗ZcytoR14抗体的多肽的诱变处理的DNA分子并对其进行快速测序。这些方法使得能够快速确定目的多肽中的单个氨基酸的重要性，并可用于未知结构的多肽。
本发明也包括ZcytoR14多肽的“功能性片段”和编码这些功能性片段的核酸分子。可进行核酸分子的常规删除分析以获得编码ZcytoR14多肽的核酸分子的功能性片段。作为说明，可用BAl31核酸酶降解具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4的核苷酸序列的DNA分子以获得系列嵌套缺失片段。然后将所述片段以符合正确的读框方式插入表达载体，就结合抗ZcytoR14抗体的活性分离和检测表达的多肽。外切核酸酶降解的一个替代方案是使用寡核苷酸定位诱变以引入缺失或终止密码子，从而确定想要的片段的产生。可选择地，可使用聚合酶链式反应合成ZcytoR14基因的特定片段。
通过已由Horisberger和Di Marco，Pharmac.Ther.66：507(1995)概述的关于在干扰素的任一末端或两个末端截断的研究来举例说明该一般方法。此外，由例如Treuter等人，Molec.Gen.Genet.240：113(1993)，Content等人，“Expression and preliminarydeletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by humaninterferon，”in Biological Interferon Systems，Proceedings ofISIR-TNO Meeting on Interferon Systems，Cantell(ed.)，pages65-72(Nijhoff1987)，Herschman，“The EGF Receptor，”inControl of Animal Cell Proliferation，第1卷，Boynton等人，(eds.)pages169-199(Academic Press1985)，Coumailleau等人，J.Biol.Chem.270：29270(1995)；Fukunaga等人，J.Biol.Chem.270：25291(1995)；Yamaguchi等人，Biochem.Pharmacol.50：1295(1995)，和Meisel等人，Plant Molec.Biol.30：1(1996)描述用于蛋白的功能性分析的标准技术。
本发明也涉及和此处公开的氨基酸序列相比具有氨基酸改变的ZcytoR14基因的功能性片段。如上所述，可通过确定和公开的核苷酸和氨基酸序列的同一性的水平，基于结构来鉴定变体ZcytoR14基因。基于结构鉴定变体基因的可选择的方法是确定编码潜在的变体ZcytoR14基因的核酸分子是否可与包含核苷酸序列例如SRQ ID NO：1或SEQ ID NO：4的核酸分子杂交。
本发明也包括使用ZcytoR14多肽的功能性片段、抗原表位、ZcytoR14多肽的具有表位的部分、和编码这些功能性片段、抗原表位、ZcytoR14多肽的具有表位的部分的核酸分子。使用这些片段产生用于产生这样的抗体和结合伴侣的多肽，所述抗体和结合伴侣结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17A或IL-17F或IL-17A和IL-17F一起的活性。此处定义的“功能性”ZcytoR14多肽或其片段的特征在于其阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17A或IL-17F的炎症性、增殖性或分化性活性的能力，在于其诱导或抑制特化的细胞功能的能力，或在于其特异性结合抗ZcytoR14抗体、细胞、IL-17A或IL-17F的能力。如此处前面所描述的，ZcytoR14的特征在于此处所描述的独特的细胞因子受体结构和结构域。因此，本发明还涉及使用这样的融合蛋白，该融合蛋白包含：(a)包含上述的结构域中的一个或多个结构域的多肽分子；和(b)包含这些结构域中的一个或多个结构域的功能性片段。融合蛋白的其他多肽部分可由另一种细胞因子受体例如IL-10R、IL-13R、IL-17R、IL-10RB(CRF2-4)提供，或由有助于融合蛋白分泌的非天然的和/或非关联的分泌信号肽提供。
本发明也提供包含此处描述的ZcytoR14多肽的具有表位的部分的多肽片段或肽。这些片段或肽可包含“免疫原表位”，该表位是当将整个蛋白用于免疫时引起抗体反应的蛋白的部分。可使用标准的方法鉴定具有免疫原表位的肽(参见，例如Geysen等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 81：3998(1983))。
相反地，多肽片段或肽可包含“抗原表位”，该表位是抗体可特异性结合的蛋白分子的区域。某些表位由氨基酸的线性或连续片段构成，这样的表位的抗原性不会被变性剂破坏。在本领域已知，可使用能模拟蛋白的表位的相对短的合成肽刺激抗该蛋白的抗体的产生(参见，例如，Sutcliffe等人，Science 219：660(1983))。因此，本发明的具有抗原表位的肽、抗原性肽、表位和多肽用于产生和此处描述的多肽结合的抗体以及鉴定和筛选这样的抗ZcytoR14单克隆抗体，该单克隆抗体是中和性的，其可结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17F和IL-17A(单独地或一起地)的活性。本发明的这些中和单克隆抗体可结合ZcytoR14抗原表位。可使用Hopp/Woods亲水性分布图确定SEQ ID NO：2或4内的最具抗原性潜能的区域(Hopp等人， Proc. Natl.Acad.Sci.78：3824-3828，1981；Hopp， J.Immun.Meth. 88：1-18，1986和Triquier等人， Protein Engineering  11：153-169，1998)。该图基于滑动六残基窗口(sliding six-residue window)。忽略埋藏的G、S和T残基以及暴露的H、Y和W残基。在ZcytoR14中，可通过本领域技术人员确定这些区域。此外，SEQ ID NO：2或4中的ZcytoR14抗原表位，如使用例如DNASTAR Protean程序(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)进行Jameson-Wolf作图预测的表位，用作优选的抗原表位，其可通过本领域技术人员进行确定。该分析的结果表明SEQID NO：2的下列氨基酸序列可提供合适的抗原肽：氨基酸26至23(“抗原性肽1”)、氨基酸41至46(“抗原性肽2”)、74至81(“抗原性肽3”)、氨基酸95至105(“抗原性肽4”)、氨基酸109至119(“抗原性肽5”)、氨基酸95至119(“抗原性肽6”)、氨基酸178至185(“抗原性肽7”)、氨基酸200至206(“抗原性肽8”)、氨基酸231至238(“抗原性肽9”)、氨基酸231至241(“抗原性肽10”)、氨基酸264至270(“抗原性肽11”)、氨基酸274至281(“抗原性肽12”)、氨基酸317至324(“抗原性肽13”)、氨基酸357至363(“抗原性肽14”)、氨基酸384至392(“抗原性肽15”)、氨基酸398至411(“抗原性肽16”)、氨基酸405至411(“抗原性肽17”)、氨基酸423至429(“抗原性肽18”)、氨基酸434至439(“抗原性肽19”)。本发明涉及使用抗原性肽1至19中的任一种肽产生抗Zcytor14的抗体。本发明也涉及包含抗原性肽1至19中的至少一种肽的多肽。
在优选的实施方案中，本发明的中和抗体结合的抗原表位可包含SEQ ID NO：2(和SEQ ID NO：3的对应的残基)或SEQ ID NO：5的残基，所述残基对于配体-受体结合，例如和ZcytoR14与IL-17A或IL-17F(单独地或一起地)的结合非常重要。
具有抗原表位的肽和多肽可包含此处公开的氨基酸序列的至少4至10个氨基酸、至少10至15个氨基酸或大约15至大约30个氨基酸。如此处所描述的，可通过使ZcytoR14片段化或通过化学肽合成产生这些具有表位的肽和多肽。此外，可通过随机肽文库的噬菌体展示选择表位(参见，例如，Lane和Stephen，Curr.Opin.Immunol.5：268(1993)，和Cortese等人，Curr.Opin.Biotechnol.7：616(1996))。由例如，Mole，“Epitope Mapping，”in Methods in MolecularBiology，第10卷，Manson(ed.)，pages105-116(The Humana Press，Inc.1992)，Price，“Production and Characterization ofSynthetic Peptide-Derived Antibodies，”in MonoclonelAntibodies：Production，Engineering，and Clinieal Application，Ritter和Ladyman(eds.)，pages60-84(Cambridge UniversityPress1995)，和Coligan等人(eds.)，Current Protocols inImmunology，pages9.3.1-9.3.5和pages 9.4.1-9.4.11(JohnWiley & Sons1997)描述用于鉴定表位和从包含表位的小肽产生抗体的标准方法。
对于任何ZcytoR14多肽，包括变体和融合蛋白，通过使用上面的表1和表2中所示的信息，本领域技术人员可容易地产生编码该变体的完全简并多核苷酸序列。此外，本领域技术人员可使用标准软件，基于此处描述的核苷酸和氨基酸序列设计ZcytoR14变体。
E)ZcytoR14多肽的产生
可在进行常规的技术之后，在重组宿主细胞中产生本发明的多肽，包括全长多肽、可溶性单体、同型二聚体、异二聚体和多聚体受体；全长受体；受体片段(例如，配体结合片段和抗原表位)、功能性片段和融合蛋白。为表达ZcytoR14基因，必须将编码多肽的核酸分子有效地连接至在表达载体中控制转录表达的调控序列，然后将其导入宿主细胞。除了转录调控序列例如启动子和增强子外，表达载体可包含翻译调控序列和适合用于筛选具有表达载体的细胞的标记基因。
适合用于在真核细胞中生产外源蛋白的表达载体一般包含(1)原核DNA元件，所述元件编码细菌复制起点和抗生素抗性标记物，从而提供生长和在细菌宿主中选择表达载体；(2)控制转录起始的真核DNA元件，例如启动子，和(3)控制转录本的加工的DNA元件，例如转录终止/聚腺苷酰化序列。如上所述，表达载体也可包括编码指导异源多肽进入宿主细胞的分泌途径的分泌序列。例如，ZcytoR14表达载体可包含ZcytoR14基因和来源于任何分泌基因的分泌序列。
本发明的ZcytoR14蛋白可在哺乳动物细胞中表达。合适的哺乳动物宿主细胞的示例包括非洲绿猴肾细胞(Vero；ATCC CRL1587)、人胚胎肾细胞(293-HEK；ATCC CRL1573)、幼仓鼠肾细胞(BHK-21、BHK-570；ATCC CRL8544、ATCC CRL10314)、犬肾细胞(MDCK、ATCCCCL34)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1、ATCC CCL61、CHO DG44(Chasin等人，Som.Cell.Molec.Genet.12：555，1986))、大鼠垂体细胞(GH1；ATCC CCL82)、HeLa S3细胞(ATCC CCL2.2)、大鼠肝细胞瘤细胞(H-4-II-E；ATCC CRL1548)、SV40转化的猴肾细胞(COS-1；ATCC CRL1650)和鼠类胚胎细胞(NIH-3T3；ATCC CRL1658)。
对于哺乳动物宿主，转录和翻译调控信号可来自哺乳动物病毒，例如，腺病毒、牛乳头状瘤病毒、猿猴病毒等，其中调控信号和具有高水平的表达的特定基因关联。也可从哺乳动物基因例如肌动蛋白、胶原蛋白、肌球蛋白和金属硫蛋白的基因获得合适的转录和翻译调控序列。
转录调控序列包括足以指导RNA合成起始的启动子区域。合适的真核启动子包括小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer等人，J.Molec.Appl.Genet.1：273(1982))、疱疹病毒的TK启动子(McKnight，Cell31：355(1982))、SV40早期启动子(Benoist等人，Nature 290：304(1981))、劳斯肉瘤病毒启动子(Gorman等人，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 79：6777(1982))、细胞巨化病毒启动子(Foecking等人，Gene45：101(1980))和小鼠乳腺瘤病毒启动子(一般参见，Etcheverry，“Expression of Engineered Proteins in Mammalian CellCulture，”in Protein Engineering：Principles and Practice，Cleland等人(eds.)，pages163-181(John Wiley & Sons，Inc.1996))。
可选择地，如果原核启动子受真核启动子的调控，那么该原核启动子，例如噬菌体T3 RNA聚合酶启动子，可用于在哺乳动物细胞中控制ZcytoR14基因的表达(Zhou等人，Mol.Call.Biol.10：4529(1990)，和Kaufman等人，Nucl.Acids Res.19：4485(1991))。
在某些实施方案中，将编码ZcytoR14可溶性受体多肽、或ZcytoR14多肽的片段的DNA序列有效地连接至其表达所必需的表达载体内的其他基因元件，通常包括转录启动子和终止子。所述载体一般也包含一种或多种选择标记物和一个或多个复制起始位点，尽管本领域技术人员认识到，在某些系统内，可在分开的载体上提供选择标志物，和通过将外源DNA整合入宿主细胞基因组中来提供其的复制。启动子、终止子、选择标志物、载体和其他元件的选择在本领域技术人员的水平之内的常规设计范围之内。在文献中描述了许多这些元件，并且其也可从提供商商购获得。可将可溶性受体复合物的多个组分以分开的表达载体的形式共转染，或可将所述多个组分包含在单个表达载体内。表达蛋白复合物的多个组分的这些技术在本领域是熟知的。
可使用各种标准方法(包括磷酸钙转染法、脂质体介导的转染、显微注射介导的递送、电穿孔等)将表达载体导入宿主细胞。可选择和繁殖转染细胞以提供包含稳定地整合入宿主细胞基因组的表达载体的重组宿主细胞。由例如，Ausubel(1995)和Murray(ed.)，GeneTransfer and Expression Protocols(Humana Press1991)描述用于将载体导入真核细胞的技术和使用显性选择标记物选择这些稳定的转化子的技术。
例如，一种合适的选择性标记物是提供对抗生素新霉素的抗性的基因。在该情况下，在新霉素类型药物例如G-418等存在的情况下进行选择。也可使用选择系统增加目的基因的表达水平，即称为“扩增”的方法。通过在低水平选择剂存在的情况下培养转染子，然后增加选择剂的量以筛选产生高水平的被导入基因的产物的细胞来进行扩增。合适的可扩增的选择标记物是二氢叶酸还原酶(DHFR)，其可提供对氨甲蝶呤的抗性。也可使用其他抗性基因(例如，潮霉素抗性基因、广谱抗药基因、嘌呤霉素乙酰转移酶基因)。可选择地，可通过这些方法例如FACS分选法或磁珠分离技术，使用引入改变的表型的标记物，例如绿色荧光蛋白或细胞表面蛋白例如CD4、CD8、I类MHC、胎盘碱性磷酸酶，从未转染的细胞中将转染的细胞分选出来。
也可通过使用病毒递送系统培养哺乳动物细胞来生产ZcytoR14多肽。用于此目的的示例性病毒包括腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、痘苗病毒和腺伴随病毒(AAV)。腺病毒，是双链DNA病毒，是目前研究最透彻的用于递送异源核酸的基因转移载体(关于综述，参见Becker等人，Meth.Cell Biol. 43：161(1994)，和Douglas和Curiel，Science & Medicine4：44(1997))。腺病毒系统的有利方面包括容纳相对大的DNA插入物、培养至高滴度的能力、感染广泛的哺乳动物细胞类型的能力和允许和大量可获得的包含不同启动子的载体一起使用的适应性。
通过删除腺病毒基因组的部分，可容纳更大的异源DNA的插入物(高达7kb)。可通过直接连接或通过和共转染的质粒的同源重组将这些插入物整合入病毒DNA。将必需的E1基因从病毒载体中删除是个选择，这导致不能复制，除非由宿主细胞提供E1基因才能进行复制。腺病毒转染的人293细胞(ATCC号CRL-1573、45504、45505)，可以例如贴壁细胞方式或以相对高的细胞密度的悬浮培养方式进行培养以产生大量的蛋白(参见，Garnier等人，Cytotechnol.15：145(1994))。
ZcytoR14也可在其他高等真核细胞例如鸟类、真菌、昆虫、酵母或植物细胞中表达。杆状病毒系统提供了将克隆的ZcytoR14基因导入昆虫细胞的有效方法。合适的表达载体基于苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)多核型多角体病毒(AcMNPV)，其包括熟知的启动子例如果蝇热激蛋白(hsp)70启动子、苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒立刻早期基因启动子(ie-1)和晚早期39K启动子、杆状病毒p10启动子和果蝇金属硫蛋白启动子。制备重组杆状病毒的第二种方法使用由Luckow(Luckow，等人，J.Virol.67：4566(1993))描述的基于转座子的系统。使用转移载体的该系统以BAC-to-BAC试剂盒(Life Technologies，Rockville，MD)的形式出售。该系统使用转移载体，即包含Tn7转座子的PFASTBAC(Life Technologies)，将编码ZcytoR14多肽的DNA转入杆状病毒基因组，该病毒基因组以称为“杆粒”的大质粒形式保持在大肠杆菌中。参见，Hill-Perkins和Possee，J.Gen.Virol.71：971(1990)，Bonning，等人，J.Gen.Virol.75：1551(1994)，和Chazenbalk，和Rapoport，J.Biol.Chem.270：1543(1995)。此外，转移载体可包含在表达的ZcytoR14多肽的C或N末端和编码表位标签的例如Glu-Glu表位标签(Grussenmeyer等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.82：7952(1985))的DNA按读码框融合的融合物。通过使用本领域已知的技术，将包含ZcytoR14基因的转移载体转化入大肠杆菌，筛选包含指示重组杆状病毒的间断1acZ基因的杆粒。然后使用常用技术分离包含重组杆状病毒基因组的杆粒DNA。
可将说明性PFASTBAC改造至变化相当大的程度。例如，可除去多角体蛋白启动子并用杆状病毒碱性蛋白启动子(也称作Pcor、p6.9或MP启动子)替代，该碱性蛋白启动子在杆状病毒感染早期表达，并且已显示有利于表达分泌蛋白(参见，例如，Hill-Perkins和Possee，J.Gen.Virol.71：971(1990)，Bonning，等人，J.Gen.Virol.75：1551(1994)，和Chazenbalk和Rapoport，J.Biol.Chem.270：1543(1995)。在这些转移载体构建体中，可使用碱性蛋白启动子的短的或长的形式。此外，可构建用来源于昆虫蛋白的分泌信号序列取代天然的ZcytoR14分泌信号序列的转移载体。例如，可在构建体中使用来自蜕皮甾类葡糖基转移酶(EGT)，蜜蜂的蜂毒素Melittin(InvitrogenCorporation；Carlsbad，CA)或杆状病毒gp67(PharMingen：SanDiego，CA)的分泌信号序列替代天然的ZcytoR14分泌信号序列。
使用重组病毒或杆粒转染宿主细胞。合适的昆虫宿主细胞包括来源于IPLB-Sf-21(草地夜蛾蛹卵巢细胞系)的细胞系，例如Sf9(ATCCCRL1711)、Sf21AE和Sf21(Invitrogen Corporation；San Diego，CA)、和果蝇Schneider-2细胞以及来源于粉纹夜蛾(Trichoplusiani)(美国专利号，5,300,435)的HIGH FIVEO细胞系(Invitrogen)。可使用可商购获得的无血清培养基培养和维持细胞。对于Sf9细胞合适的培养基是Sf900IITM(Life Technologies)或ESF921TM(ExpressionSystems)；和对于粉纹夜蛾细胞使用的培养基是Ex-cell0405TM(JRHBiosciences，Lenexa，KS)或Express FiveOTM(Life Technologies)。当使用重组病毒时，一般将细胞从大约2-5×105个细胞的接种密度培养至1-2×106个细胞的密度，此时以0.1至10、更一般地接近3的感染复数(MOI)加入重组病毒贮存物。
由Bailey等人，“Manipulation of Baculovirus Vectors，”inMethods in Molecular Biology，第7卷：Gene Transfer andExpression Protocols，Murray(ed.)，pages 147-168(The HumanaPress，Inc.1991)，Patel等人，“The baculovirus expressionsystem，”in DNA Cloning 2：Expression Systems，第2版，Glover等人(eds.)，pages205-244(Oxford University Press1995)，Ausubel(1995)at pages16-37至16-57，Richardson(ed.)，Baculovirus Expression Protocols(The Humana Press，Inc.1995)，和Lucknow，“Insect Cell Expression Technology，”in ProteinEngineering：Principles and Practice，Cleland等人(eds.)，pages183-218(John Wiley & Sons，Inc.1996)提供用于在杆状病毒系统中生产重组蛋白的已建立的技术。
也可使用真菌细胞，包括酵母细胞，表达此处描述的基因。在该方面特别有益的酵母种类包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)和甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)。用于在酵母中表达的合适的启动子包括来自GAL1(半乳糖)、PGK(磷酸甘油激酶)、ADH(醇脱氢酶)、AOX1(醇氧化酶)、HIS4(组氨醇脱氢酶)等的启动子。已设计了许多醇母克隆载体并且可容易地获得其。这些载体包括基于YIp的载体，例如YIp5，YRp载体，例如YRp17，YEp载体例如YEp13和YCp载体，例如YCp19。由例如，Kawasaki，美国专利号4,599,311，Kawasaki等人，美国专利号4,931,373，Brake，美国专利号4,870,008，Welch等人，美国专利号5,037,743，和Murray等人，美国专利号.4,845,075公开了用外源DNA转化酿酒酵母细胞和从其生产重组多肽的方法。通过由选择标记物确定的表型，通常为抗药性或在特定营养物(例如，亮氨酸)不存在的情况下的生长能力，选择转化的细胞。用于酿酒酵母的合适的载体系统是由Kawasaki等人(美国专利号4,931,373)公开的POT1载体系统，该系统使得能够通过将细胞培养在含有葡萄糖的培养基上来选择转化的细胞。用于醇母的其他合适的启动子和终止子包括来自糖酵解酶基因(参见，例如，Kawasaki，美国专利号4,599,311，Kingsman等人，美国专利号4,615,974，和Bitter，美国专利号4,977,092)和醇脱氢酶基因的启动子和终止子。也参见美国专利号4,990,446、5,063,154、5,139,936和4,661,454。
用于其他酵母，包括多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromycesfragilis)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)、巴斯德毕赤氏酵母、甲醇毕赤酵母、季也蒙氏毕赤氏酵母(Pichia guillermondii)和麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)的转化系统在本领域是已知的。参见，例如，Gleeson等人，J.Gen.Microbiol.132：3459(1986)，和Cregg，美国专利号4,882,279。根据McKnight等人，美国专利号4,935,349的方法可使用曲霉(Aspergillus)细胞。Sumino等人，美国专利号5,162,228公开了转化产黄顶头孢霉菌(Acremoniumchrysogenum)的方法。Lambowitz，美国专利号4,486,533公开了转化脉孢菌(Neurospora)的方法。.
由Raymond，美国专利号5,716,808，Raymond，美国专利号5,736,383，Raymond等人，Yeast 14：11-23(1998)，和国际公开号WO 97/17450、WO 97/17451、WO 98/02536和WO 98/02565中公开了使用甲醇毕赤酵母作为宿主生产重组蛋白的用途。通常以双链、环形质粒的方式制备用于转化甲醇毕赤酵母的DNA分子，在转化前，优选地将该质粒线性化。为了在甲醇毕赤酵母中生产多肽，质粒中的启动子和终止子可以是甲醇毕赤酵母基因例如甲醇毕赤酵母醇利用基因(AUG1或AUG2)的启动子和终止子。其他有用的启动子包括二羟基丙酮合酶(DHAS)、甲酸脱氢酶(FMD)和过氧化氢酶(CAT)基因的启动子。为了帮助将DNA整合入宿主染色体，优选地使质粒的整个表达片段在两个侧翼连接宿主的DNA序列。用于甲醇毕赤酵母的合适的选择标记物是甲醇毕赤酵母ADE2基因，该基因编码磷酸核糖5-氨基咪唑羧化酶(AIRC；EC4.1.1.21)，其允许ade2宿主细胞在缺少腺嘌呤的情况下生长。为了进行其中想要最少量地使用甲醇的大规模的、工业化的生产方法，可使用其中删除了甲醇利用基因(AUG1和AUG2)的宿主细胞。为了生产分泌蛋白，宿主细胞可以在液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)上具有缺陷。使用电穿孔帮助将包含编码目的多肽的DNA的质粒导入甲醇毕赤酵母细胞。可使用呈指数式衰减、具有从2.5至4.5kV/cm(优选地大约3.75kV/cm)的场强的脉冲电场和从1至40毫秒(最优选地大约20毫秒)的时间常数(t)进行电穿孔来转化甲醇毕赤酵母细胞。
也可将表达载体导入植物原生质体、完整的植物组织或分离的植物细胞。用于将表达载体导入植物组织的方法包括用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)直接感染或共培养植物组织、显微注射介导的递送、DNA注射、电穿孔等。参见，例如，Horsch等人，Science227：1229(1985)，Klein等人，Biotechnology 10：268(1992)，和Miki等人，“Procedures for Introducing Foreign DNA intoPlants，”in Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology，Glick等人(eds.)，pages67-88(CRC Press，1993)。
可选择地，可在原核宿主细胞中表达ZcytoR14基因。可用于在原核宿主中表达ZcytoR14多肽的合适的启动子对于本领域技术人员来说是熟知的，其包括能够识别T4、T3、Sp6和T7聚合酶的启动子、λ噬菌体的PR和PL启动子、大肠杆菌的trp、recA、热激、lacUV5、tac、lpp-lacSpr、phoA和lacZ启动子、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的启动子、芽孢杆菌(Bacillus)的噬菌体的启动子、链霉菌(Streptomyces)的启动子、λ噬菌体的int启动子、pBR322的bla启动子和氯霉素乙酰转移酶基因的CAT启动子。已由Glick，J.Ind.Microbiol.1：277(1987)，Watson等人，Molecular Biology of theGene，4th Ed.(Benjamin Cummins1987)，和Ausubel等人(1995)对原核启动子进行了综述。
合适的原核宿主包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。大肠杆菌的合适的株系包括BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、DH1、DH4I、DH5、DH5I、DH5IF′、DH5IMCR、DH10B、DH10B/p3、DH11S、C600、HB101、JM101、JM105、JM109、JM110、K38、RR1、Y1088、Y1089、CSH18、ER1451和ER1647(参见，例如，Brown(ed.)，Molecular BiologyLabfax(Academic Press1991))。枯草芽孢杆菌的合适的株系包括BR151、YB886、MI119、MI120和B170(参见，例如，Hardy，“BacillusCloning Methods，”in DNA Cloning：APractical Approach，Glover(ed.)(IRL Press1985))。
当在细菌例如大肠杆菌中表达ZcytoR14多肽时，可将多肽保留在细胞质中，通常以不溶性颗粒的形式保留，或可通过细菌分泌序列直接将多肽分泌至周质间隙。在前一种情况下，裂解细胞，回收所述颗粒并使用例如异硫氰酸胍或尿素使之变性。然后通过稀释变性剂(例如通过对尿素溶液和还原和氧化谷胱甘肽的组合透析来进行稀释)，之后对缓冲盐溶液进行透析来重折叠和二聚化变性的多肽。在后一种情况下，可从周质间隙以可溶性和功能性的形式回收多肽，通过破裂细胞(通过，例如，超声处理或渗透休克)以释放周质间隙的内容物和回收蛋白进行回收，从而避免了对变性和重折叠的需要。
用于在原核宿主中表达蛋白的方法对于本领域技术人员来说是熟知的(参见，例如，Williams等人，“Expression of foreignproteins in E.coliusing plasmid vectors and purification ofspecific polyclonal antibodies，”in DNA Cloning2：ExpressionSystems，第2版，Glover等人(eds.)，page15(Oxford UniversityPress1995)，Ward等人，“Genetic Manipulation and Expressionof Antibodies，”in Monoclonal Antibodies：Principles andApplicationns，page137(Wiley-Liss，Inc.1995)，和Georgiou，“Expression of Proteins in Bacteria，”in ProteinEngineering：Principles and Ptactice，Cleland等人(eds.)，page101(John Wiley & Sons，Inc.1996))。
用于将表达载体导入细菌、酵母、昆虫和植物细胞的标准方法由例如Ausubel(1995)提供。
用于表达和回收由哺乳动物细胞系统产生的外源蛋白的一般方法由例如Etcheverry，“Expression of Engineered Proteins inMammalian Cell Culture，”in Protein Engineering：Principlesand Practice，Cleland等人(eds.)，pages163(Wiley-Liss，Inc.1996)提供。用于回收由细菌系统产生的蛋白的标准技术由例如Grisshammer等人，“Purification of over-produced proteinsfromE.coli cells，”in DNA Cloning2：Expression Systems，第2版，Glover等人(eds.)，pages59-92(Oxford University Press1995)提供。由Richardson(ed.)，Bacuulovirus Expression Protocols(TheHumana Press，Inc.1995)描述了用于从杆状病毒系统分离重组蛋白的已建立的方法。
作为选择，可通过完全的固相合成、部分固相方法、片段缩合或经典的溶液合成来合成本发明的多肽。这些合成方法对于本领域技术人员来说是熟知的(参见，例如，Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149(1963)，Stewart等人，“Solid Phase Peptide Synthesis”(第2版)，(Pierce Chemical Co.1984)，Bayer和Rapp，Chem.Pept.Prot.3：3(1986)，Atherton等人，Solid Phase Peptide Synthesis：APractical Approach(IRL Press1989)，Fields和Colowick，“Solid-Phase Peptide Synthesis，”Methods in EnzymologyVolume289(Academic Press1997)，和Lloyd-Williams等人，Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins(CRC Press，Inc.1997))。总的化学合成策略上的变化，例如“天然的化学连接”和“表达的蛋白的连接”也是标准的(参见，例如，Dawson等人，Science266：776(1994)，Hackeng等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA94：7845(1997)，Dawson，Methods Enzymol.287：34(1997)，Muir等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 95：6705(1998)，和Severinov和Muir，J.Biol.Chem.273：16205(1998)).
本发明的肽和多肽包含SEQ ID NO：2或5的至少6个、至少9个或至少15个连续氨基酸残基。作为说明示例，多肽可包含SEQ ID NO：2或5的至少6个、至少9个或至少15个连续氨基酸残基。在本发明的某些实施方案中，多肽包含这些氨基酸序列的20、30、40、50、100或更多个连续残基。编码这些肽和多肽的核酸分子可用作聚合酶链式反应的引物和探针。
此外，ZcytoR14多肽和其片段在高等真核细胞中可表达为单体、同型二聚体、异二聚体或多聚体。可使用这些细胞产生包含至少一个ZcytoR14多肽(“包含ZcytoR14的受体”或“包含ZytoR14的受体多肽”)的ZcytoR14单体、同型二聚体、异二聚体和多聚体受体多肽，或可在筛选系统中将这些细胞用作测定细胞。在本发明的一个方面中，通过培养的细胞产生包含ZcytoR14细胞外结构域的本发明的多肽，使用该细胞筛选受体的配体，包括天然配体，IL-17F和IL-17A，或甚至天然配体的激动剂和拮抗剂。该方法概述如下，将编码受体的cDNA或基因和其表达所必需的其他基因元件(例如，转录启动子)组合在一起，将所得的表达载体插入宿主细胞。在各种筛选系统中选择和使用表达DNA和产生功能性受体的细胞。可在相同细胞中表达单体、同型二聚体、异二聚体和多聚体受体复合物的各组分。此外，也可将单体、同型二聚体、异二聚体和多聚体受体复合物的组分融合至跨膜结构域或其他膜融合部分以使能够装配复合物和筛选上述的转染子。
为了测定本发明的IL-17A和IL-17F的拮抗剂多肽和抗体，适合用于表达包含ZcytoR14的受体或已知结合IL-17A或IL-17F以及转导受体介导的信号的其他受体(例如，表达IL-17R的细胞)的哺乳动物细胞包括表达可与ZcytoR14一起形成功能性复合物的其他受体亚基的细胞。使用和要表达的受体一样来自相同的物种的细胞也是优选。在优选的实施方案中，所述细胞依赖于外源提供的用于其扩增的造血生长因子。该类型的优选细胞系是人TF-1细胞系(ATCC编号CRL-2003)和AML-193细胞系(ATCC编号CRL-9589)，所述细胞系是GM-CSF依赖性人白血病细胞系和BaF3(Palacios和Steinmetz，Cell41：727-734，(1985))，所述BaF3是IL-3依赖性鼠类pre-B细胞系。其他细胞系包括BHK、COS-1和CHO细胞。可将适合的宿主细胞进行改造以产生必需的受体亚基或进行想要的细胞应答所需的其他细胞组分。该方法是有利的，因为可将细胞系进行改造以表达来自任何物种的受体亚基，从而克服由于物种特异性产生的潜在限制。可在来自相同的物种的细胞系中克隆和使用人受体cDNA的物种直向同源物，例如BaF3细胞系中的小鼠cDNA。因此可将依赖于一种造血生长因子例如GM-CSF或IL-3的细胞系进行改造，使之成为依赖于通过ZcytoR14受体起作用的另一种细胞因子，例如IL-17F或IL-17A。
在筛选测定法中使用表达功能性受体的细胞。各种合适的测定法在本领域中是已知的。这些测定法基于靶细胞中的生物学反应的检测。一个这样的测定法是细胞增殖测定法。在受试化合物存在或不存在的情况下培养细胞，通过例如测量氚标记的胸苷的整合或通过基于3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑_(MTT)(Mosman，J.Immunol.Meth.65：55-63，(1983))的代谢分解的比色测定法来检测细胞的增殖。可选择的测定形式使用经进一步改造从而表达报告基因的细胞。将报告基因连接至对受体关联途径作出反应的启动子元件，该测定法检测报告基因的转录的激活。该方面中的优选的启动子元件是血清响应元件，或SRE。参见，例如，Shaw等人，Cell56：563-572，(1989)。优选的这样的报告基因是萤光素酶基因(de Wet等人，Mol.Cell.Biol.7：725，(1987))。通过使用本领域已知的方法(例如，Baumgartner等人，J.Biol.Chem.269：.29094-29101，(1994)；Schenborn和Goiffin，Promega_Notes41：11，1993)检测发光来检测萤光素酶基因的表达。萤光素酶活性测定试剂盒可从例如PromegaCorp.，Madison，WI商购获得。可使用该类型的靶细胞系筛选化学试剂文库、细胞条件化的培养基、真菌液体培养基、土壤样品、水样品等。例如，可对靶细胞测定细胞条件化的培养基样品的文库以鉴定产生配体的细胞。然后使用阳性细胞在哺乳动物表达载体中产生cDNA文库，将该文库分为亚文库、转染入宿主细胞并进行表达。然后测定来自转染的细胞的培养基样品，随后对亚文库再细分，再转染、传代培养，和再次测定阳性细胞以分离编码配体的克隆的cDNA。
由本发明提供的其他筛选方法包括杂合受体多肽的使用。这些杂合多肽大体分为2类。在第1类中，ZcytoR14的细胞内结构域连接至第二受体的配体结合结构域。第2类杂合受体多肽包含ZcytoR14(SEQ IDNO：3)的细胞外(配体结合)结构域和第二受体(优选地造血细胞因子受体)的细胞内结构域和跨膜结构域。本发明的该第2类受体的杂合ZcytoR14单体、同型二聚体、异二聚体和多聚体在已知能够对第二受体转导的信号作出应答的细胞中表达。这两类杂合受体一起使得能够鉴定用于发展检测IL-17F或IL-17A的测定法的反应性细胞类型。此外，可在IL-17F或IL-17A存在的情况下使用这些细胞，以在竞争型测定法中检测本发明的可溶性受体拮抗剂。在该测定法中，在本发明的可溶性受体存在的情况下，增殖或IL-17F或IL-17A的信号转导活性上的降低证明了拮抗活性。此外，也可使用ZcytoR14可溶性受体结合测定法(基于细胞的测定法)，确定可溶性受体是否结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17F或IL-17A的活性。
F)ZcytoR14融合蛋白和缀合物的产生
ZcytoR14类似物的一个大类是具有这样的氨基酸序列的变体，该序列是此处公开的氨基酸序列的突变。如下面所描述的，由抗独特型抗体和其片段提供另一大类ZcytoR14类似物。此外，可将包含抗独特型可变结构域的重组抗体用作类似物(参见，例如，Monfardini等人，Proc.Assoc.Am.Physicians 108：420(1996))。因为抗独特型ZcytoR14抗体的可变结构域模拟ZcytoR14，因此这些结构域可提供ZcytoR14结合活性。产生抗独特型催化抗体的方法对于本领域技术人员来说是已知的(参见，例如，Joron等人，Ann.N Y Acad.Sci.672：216(1992)，Friboulet等人，Appl.Biochem.Biotechnol.47：229(1994)，和Avalle等人，Ann.N Y Acad.Sci.864：118(1998))。
通过使用组合文库提供鉴定ZcytoR14类似物的另一种方法。由例如Kay等人，Phage Display of Peptides and Proteins(AcademicPress1996)，Verdine，美国专利号5,783,384，Kay，等人，美国专利号5,747,334，和Kauffman等人，美国专利号5,723,323提供用于构建和筛选噬菌体展示和其他组合文库的方法。
ZcytoR14多肽具有体内和体外用途。作为说明示例，可向细胞培养基中加入ZcytoR14的可溶性形式以抑制由培养细胞产生的ZcytoR14配体(即IL-17F、IL-17A或两者)的作用。
可使用ZcytoR14的融合蛋白在重组宿主中表达ZcytoR14，和分离产生的ZcytoR14。如下所述，特定的ZcytoR14融合蛋白也在诊断和治疗上具有用途。一类融合蛋白包含引导来自重组宿主细胞的ZcytoR14多肽的肽。为指导ZcytoR14多肽进入真核宿主细胞的分泌途径，在ZcytoR14表达载体中提供分泌信号序列(也称为信号肽，前导序列，前原(prepro)序列或前序列(pre sequence))。尽管分泌信号序列可来源于ZcytoR14，但合适的信号序列也可以来自另一种分泌蛋白或从头合成。以这样的方式将分泌信号序列有效地连接至编码ZcytoR14的序列，即，使得两个序列以正确的符合读框的方式连接和定位，从而指导新合成的多肽进入宿主细胞的分泌途径。分泌信号通常位于编码目的多肽的核苷酸序列的5’，尽管某些分泌信号序列可位于目的核苷酸序列的其他位置(参见，例如，Welch等人，美国专利号5,037,743；Holland等人，美国专利号5,143,830)。
尽管可将哺乳动物细胞产生的ZcytoR14或另一种蛋白的分泌信号序列(例如，组织型纤溶酶原激活物信号序列，如在例如美国专利号5,641,655中所描述的)用于在重组哺乳动物宿主表达ZcytoR14，但在酵母细胞中表达时优选地使用酵母的信号序列。合适的酵母信号序列的示例是来源于酵母接合信息素α因子(由MFα1基因编码)、转化酶(由SUC2基因编码)、或酸性磷酸酶(由PHO5基因编码)的信号序列。参见，例如，Romanos等人，“Expression of Cloned Genes in Yeast，”inDNA Cloning2：APractical Approach，第2版，Glover and Hames(eds.)，pages123-167(Oxford University Press1995)。
可通过表达编码细胞外结构域，例如包含SEQ ID NO：3的多肽或非人受体的对应区域的截断的DNA来制备ZcytoR14可溶性受体多肽。优选地可以基本上不含跨膜和细胞内多肽片段的形式制备细胞外结构域多肽。为指导受体结构域通过宿主细胞外运，将受体DNA连接至编码分泌肽例如t-PA分泌肽的第二个DNA片段。为帮助分泌受体结构域的纯化，可将这样的C末端延伸物融合至受体多肽，所述C末端延伸物是例如多组氨酸标签、P物质、FlagTM肽(Hopp等人，Biotechnology6：1204-1210，(1988)；可从Eastman Kodak Co.，New Haven，CT获得)或可获得其抗体或其他特异性结合剂的另外的多肽或蛋白。此外，也如上所述制备来自细胞外细胞因子结合结构域的ZcytoR14抗原表位。
在可选择的方法中，可以和免疫球蛋白重链恒定区(通常为Fc片段)的融合物的方式表达ZcytoR14的受体细胞外结构域或其他细胞因子受体组分，所述恒定区包含2个恒定区结构域和铰链区，但缺少可变区(参见，Sledziewski，AZ等人，美国专利号6,018,026和5,750,375)。本发明的可溶性ZcytoR14多肽包括这些融合物。一种这样的融合物示于SEQ ID NO：64。这些融合物一般以多聚体分子的形式分泌，其中Fc部分相互之间通过二硫键连接，两个受体多肽相互之间非常紧密地靠近排列。该类型的融合物可用于从溶液中亲和纯化关联配体，作为体外测定工具，用于通过特异性地滴定完配体来阻断、抑制或减少体外信号，以及作为体内拮抗剂，通过肠胃外途径施用其以结合循环配体或从循环中将其清除。为纯化配体，在有助于受体-配体结合的条件(通常接近生理学温度、pH和离子强度)下，向包含配体的样品(例如，细胞条件化的培养基或组织提取物)加入ZcytoR14-Ig嵌合体。然后通过使用固定在固体支持物(例如不溶性树脂小珠)的A蛋白进行混合来分离嵌合体-配体复合物。然后使用常规化学技术例如使用盐或pH梯度洗脱配体。在可选择的方法中，可将嵌合体自身结合至固体支持物，如上进行结合和洗脱。可在体内使用嵌合体以调节炎症反应，包括急性期反应例如血清淀粉样蛋白A(SAA)、C-反应性蛋白(CRP)等。可经肠胃外途径(例如，通过肌内、皮下或静脉内注射)施用具有高结合亲和力的嵌合体。循环分子结合配体并通过正常的生理学过程从循环中将其清除。为了用于测定法，通过Fc区域将嵌合体结合至支持物并用于ELISA形式。
为帮助分离本发明的抗ZcytoR14和结合伴侣，可有利地使用这样的测定系统，该测定系统使用配体结合受体(或抗体，互补/反互补对的一个成员)或其结合片段以及商购可获得的生物传感装置(BIAcore，Pharmacia Biosensor，Piscataway，NJ)。将这些受体、抗体、互补/反互补对的成员或片段固定在受体芯片的表面。由Karlsson， J.Immunol.Methods  145：229-40，1991和Cunningham和Wells， J.Mol.Biol.  234：554-63，1993公开了该仪器的用途。使用胺或巯基化学试剂将受体、抗体、成员或片段共价地附着至葡聚糖纤维(其附着至流体小室内的金膜)。将受试样品通过所述小室。如果配体、表位或互补/反互补对的相对成员存在于样品中，其将分别和固定的受体、抗体或成员结合，从而导致介质的折射率发生变化，将该变化通过金膜的表面等离子体共振的变化来进行检测。该系统允许确定这样的结合和解离率，根据所述结合和解离率可计算结合亲和力和确定结合的化学计量学。可选择地，可使用SELDI(TM)技术(Ciphergen，Inc.，Palo Alto，CA)分析配体/受体结合。此外，上述BIACORE技术通常可用于竞争性实验以确定不同的单克隆抗体是否结合ZcytoR14多肽上的相同或不同的表位，这样，其可用于帮助本发明的中和抗体的表位作图，所述中和抗体结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17F或IL-17A和IL-17F两者。
也可在本领域已知的其他测定系统中使用配体结合性受体多肽。这些系统包括用于确定结合亲和力的Scatchard分析法(参见Scatchard， Ann.NY Acad.Sci.  51：660-72，1949)和量热测定法calorimetric assays(Cunningham等人， Science  253：545-48，1991；Cunningham等人， Science  245：821-25，1991)。
本发明还提供了各种其他多肽融合物和包含一个或多个多肽融合物的关联多聚体蛋白。例如，可以融合物的形式制备可溶性ZcytoR14受体，形成美国专利号5,155,027和5,567,584中公开的二聚化蛋白。该方面中的优选的二聚化蛋白包括免疫球蛋白恒定区结构域，例如，IgGγ1，和人κ轻链。免疫球蛋白-可溶性ZcytoR14融合物可在经改造的细胞中表达，从而产生各种多聚体ZcytoR14受体类似物。可将辅助结构域融合至可溶性ZcytoR14受体，从而将其靶向特定细胞、组织或大分子(例如，胶原、或表达ZcytoR14配体IL-17F或IL-17A的细胞)。可将ZeytoR14多肽融合至2个或多个部分，例如用于纯化的亲和标签和靶向性结构域。多肽融合物也可包含1个或多个切割位点，特别是在结构域之间。参见，Tuan等人， Connective Tissue Research  34：1-9，1996。
在细菌细胞中，通常想要以融合蛋白的形式表达异源蛋白以减少所表达的蛋白的毒性、增加其稳定性和提高其回收。例如，可以包含谷胱甘肽S-转移酶多肽的融合蛋白的形式表达ZcytoR14。谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白通常是可溶性的，并且可容易地在固定的谷光甘肽柱子上从大肠杆菌裂解物中纯化其。在相似的方法中，可用直链淀粉树脂柱分离包含结合麦芽糖的蛋白多肽的ZcytoR14融合蛋白，也可使用IgG-Sepharose纯化包含截断的A蛋白基因的C末端的融合蛋白。由例如Williams等人，“Expression of Foreign Proteins in E.coli UsingPlasmid Vectors and Purification of Specific PolyclonalAntibodies，”in DNA Cloning 2：APractical Approach，第2版，Glover and Hames(Eds.)，pages15-58(Oxford University Press1995)描述了用于在细菌细胞中以融合蛋白的形式表达异源多肽的已建立的技术。此外，可商购获得表达系统。例如，PINPOINT Xa蛋白纯化系统(Promega Corporation；Madison，WI)提供了使用包含抗生物素蛋白的树脂分离这样的融合蛋白的方法，该融合蛋白包含在表达期间被生物素化的多肽。
用于分离由原核或真核细胞表达的异源多肽的肽标签包括多组氨酸标签(其具有对镍螯合型树脂的亲和力)、c-myc标签、钙调蛋白结合蛋白  (用钙调蛋白亲和层析分离的)、P物质、RYIRS标签(其结合抗RYIRS抗体)、Glu-Glu标签和FLAG标签(其结合抗FLAG抗体)。参见，例如，Luo等人，Arch.Biochem.Biophys.329：215(1996)，Morganti等人，Biotechnol.Appl.Biochem.23：67(1996)，和Zheng等人，Gene186：55(1997)。可从例如Sigma-Aldrich Corporation(St.Louis，MO)商购获得编码这些肽标签的核酸分子。
融合蛋白的另一种形式包含ZcytoR14多肽和免疫球蛋白重链恒定区(通常是Fc片段)，所述恒定区包含2个或3个恒定区结构域和铰链区但缺少可变区。作为说明示例，Chang等人，美国专利号5,723,125，描述了包含人干扰素和人免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白。通过肽连接体部分将干扰素的C端连接至Fc片段的N端。肽连接体的示例是主要包含T细胞惰性序列(其是免疫学惰性的)的肽。示例性肽连接体具有氨基酸序列：GGSGG SGGGG SGGGG S(SEQ ID NO：9)。在该融合蛋白中，示例性Fc部分是在溶液中稳定的，具有极少或没有补体激活活性的人γ4链。因此，本发明涉及包含ZcytoR14部分和人Fc片段的ZcytoR14融合蛋白，其中ZcytoR14部分的C端通过肽连接体附着至Fc片段的N端，例如包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5的氨基酸序列的肽。ZcytoR14部分可以是ZcytoR14分子或其片段。例如，融合蛋白可包含SEQ ID NO：3的氨基酸和Fc片段(例如，人Fc片段)(SEQ ID NO：64)。
在另一个变化中，ZcytoR14融合蛋白包含IgG序列、共价连接至IgG序列的氨基末端的ZcytoR14部分和共价地连接至ZcytoR14部分的氨基末端的信号肽，其中所述IgG序列以下列顺序由下列元件构成：铰链区、CH2结构域和CH3结构域。因此，IgG序列缺少CH1结构域。ZcytoR14部分显示此处描述的ZcytoR14活性，例如和ZcytoR14的配体结合的能力。已由LaRochelle等人，EP 742830(WO 95/21258)描述了产生包含抗体和非抗体部分的融合蛋白的该一般方法。
可将包含ZcytoR14部分和Fc部分的融合蛋白用作，例如，体外测定工具。例如，可使用ZcytoR14-免疫球蛋白融合蛋白检测ZcytoR14配体在生物学样品中的存在，其中ZcytoR14部分用于结合配体，和大分子例如A蛋白或抗Fc抗体，用于将融合蛋白结合至固体支持物。可使用这些系统鉴定干扰ZcytoR14配体，例如，IL-17F或IL-17A和IL-17F两者与其受体的结合的激动剂和拮抗剂。
抗体融合蛋白的其他示例包括包含抗原结合结构域的多肽和包含ZcytoR14细胞外结构域的ZcytoR14片段。可使用这些分子靶向特定的组织以使之获得ZcytoR14结合活性的益处。
本发明还提供了各种其他的多肽融合物。例如，可在本发明的ZcytoR14和来自细胞因子受体家族的另一个成员的功能性等同结构域之间交换提供生物学活性的结构域的部分或全部。可在重组宿主细胞中表达多肽融合物以产生各种ZcytoR14融合类似物。可将ZcytoR14多肽融合至2个或多个部分或结构域，例如用于纯化的亲和标签和靶向性结构域。多肽融合物也可包含一个或多个切割位点，特别是在结构域之间。参见，例如，Tuan等人，Connective Tissue Research 34：1(1996)。
可通过本领域技术人员已知的方法，通过制备融合蛋白的各组分并通过化学方法将其缀合来制备融合蛋白。可选择地，可使用已知的技术产生按正确读框的方式编码融合蛋白的两种成分的多核苷酸，并通过此处描述的方法表达其。由例如Ausubel(1995)at pages16-19至16-25描述用于酶促和化学切割融合蛋白的一般方法。
可通过由这些技术(如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记)确定的结构的物理分析结合ZcytoR14配体激动剂的假定的接触位点氨基酸的突变进一步表征ZcytoR14结合结构域。参见，例如，de Vos等人，Science255：306(1992)，Smith等人，J.Mol.Biol.224：899(1992)，和Wlodaver等人，FEBS Lett.309：59(1992).
本发明也涉及经化学修饰的ZcytoR14化合物，其中将ZcytoR14多肽和聚合物连接。说明性ZcytoR14多肽是缺少功能性跨膜结构域的可溶性多肽，例如由氨基酸残基SEQ ID NO：3构成的多肽。一般地，聚合物是水溶性的，这样ZcytoR14缀合物不会在水环境例如生理学环境中沉淀。合适的聚合物的示例是已被修饰从而具有单一反应性基团的聚合物，例如用于酰化作用的活性酯或用于烷基化的醛。通过该方法，可控制聚合的程度。反应性醛的示例是聚乙二醇丙醛、单-(C1-C10)烷氧基、或其芳氧基衍生物(参见，例如，Harris，等人，美国专利号5,252,714)。聚合物可以是分枝的或不分枝的。此外，可使用聚合物的混合物产生ZcytoR14缀合物。
用于治疗的ZcytoR14缀合物可包含药物可接受的水溶性聚合物部分。适合的水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、单甲氧基-PEG、单-(C1-C10)烷氧基-PEG、芳氧基-PEG、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)PEG、2，2，2-三氟乙磺酰基单甲氧基PEG、PEG丙醛、二-琥珀酰亚胺碳酸酯PEG、丙二醇同聚物、共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇、葡聚糖、纤维素或其他基于糖类的聚合物。合适的PEG可具有从大约600至大约60,000，包括，例如5,000、12,000、20,000和25,000的分子量。ZcytoR14缀合物也可包含这些水溶性聚合物的混合物。
ZcytoR14缀合物的一个示例包含ZcytoR14部分和附着至ZcytoR14部分的N端的聚烷基氧化物部分。PEG是合适的聚烷基氧化物。作为说明性示例，可用PEG修饰ZcytoR14，该方法称为“PEG化”。可通过本领域已知的PEG化反应的任一种进行ZcytoR14的PEG化(参见，例如，EP 0 154 316，Delgado等人，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems9：249(1992)，Duncan和Spreafico，Clin.Pharmacokinet.27：290(1994)，和Francis等人，Int J Hematol68：1(1998))。例如，可通过和反应性聚乙二醇分子的酰化反应或烷基化反应进行PEG化。在可选择的方法中，通过缩合活化的PEG形成ZcytoR14缀合物，其中PEG的末端羟基或氨基已被活化的连接体取代(参见，例如，Karasiewicz等人，美国专利号5,382,657)。
通过酰化作用进行的PEG化一般需要使活化的PEG的酯衍生物和ZcytoR14多肽反应。活化的PEG的酯的示例是被酯化至N-羟基琥珀酰亚胺的PEG。如此处所用的，术语“酰化作用”包括下列类型的ZcytoR14和水溶性聚合物之间的连接：酰胺、氨基甲酸、尿烷等连接。用于通过酰化作用制备PEG化的ZcytoR14的方法一般包括步骤：(a)在使一个或多个PEG基团附着至ZcytoR14的条件下，使ZcytoR14多肽和PEG(例如PEG的醛衍生物的反应性酯)反应，和(b)获得反应产物。一般地，基于已知的参数和想要的结果确定酰化作用的最佳反应条件。例如，PEG：ZcytoR14的比率越大，多PEG化的ZcytoR14产物的百分比越高。
通过酰化作用获得的PEG化的产物一般是多PEG化ZcytoR14产物，其中通过酰基连接性基团PEG化赖氨酸ε-氨基。连接键的示例是酰胺。一般地，所得的ZcytoR14被至少95％单、二或三PEG化，尽管依赖于反应条件，可形成一些具有更高程度的PEG化的种类。可使用标准的纯化方法例如透析、超滤、离子交换层析、亲和层析等将PEG化种类和未缀合的ZcytoR14多肽分离。
通过烷化作用进行的PEG化一般包括在还原剂存在的情况下使PEG的末端醛衍生物和ZcytoR14反应。通过-CH2-NH基团可将PEG基附着至多肽。
此外，可使用本领域已知的和此处描述的方法PEG化本发明的抗ZcytoR14抗体或抗体片段。
通过还原性烷化作用产生单PEG化的产物的衍生作用利用不同类型的可获得的伯氨基的不同反应性进行衍生作用。一般地，在允许利用赖氨酸残基的ε-氨基和蛋白的N端残基的α-氨基之间的pKa差异的pH下进行反应。通过这样的选择性衍生作用，控制包含反应性基团例如醛的水溶性聚合物的附着。和聚合物的缀和反应主要在蛋白的N端上发生，而无其他反应性基团例如赖氨酸侧链氨基的显著修饰。本发明提供了基本上均一的ZcytoR14单聚合物缀合物制剂。
产生单聚合物ZcytoR14缀合分子的基本上均一的群体的还原性烷化作用可包括步骤：(a)在还原性烷化作用的条件下，在适合于允许ZcytoR14的氨基端上的α氨基进行选择性修饰的pH下，使ZcytoR14多肽和反应性PEG反应，和(b)获得反应产物。用于还原性烷化作用的还原剂在水溶液中应当是稳定的并且只能够还原在还原性烷化作用的最初过程中形成的希夫碱。说明性还原剂包括硼氢化钠、氰基硼氢化钠、二甲胺硼烷(dimethylamine borane)、三甲胺硼烷和吡啶硼烷(pyridine borane)。
对于基本上均一的单聚合物ZcytoR14缀合物的群体，还原性烷化反应条件是允许水溶性聚合物部分选择性地附着至ZcytoR14的N端的条件。这些反应条件一般提供了赖氨酸氨基和N末端α氨基之间的pKa的差异。pH也影响所用的聚合物对蛋白的比例。一般地，如果pH更低，聚合物对蛋白的更大的过量是想要的，因为N端α基的反应性越小，就需要更多聚合物来达到最佳条件。如果pH更高，聚合物：ZcytoR14不必更大，因为可获得更多的反应性基团。一般地，pH在3至9、或3至6的范围之内。可使用该方法制备包含ZcytoR14的同型二聚体、异二聚体或多聚体可溶性受体缀合物。
另一个要考虑的因素是水溶性聚合物的分子量。一般地，聚合物的分子量越高，可附着至蛋白的聚合物分子的数目越少。对于PEG化反应，典型的分子量是大约2kDa至大约100kDa、大约5kDa至大约50kDa、或大约12kDa至大约25kDa。水溶性聚合物对ZcytoR14的摩尔比一般地在1∶1至100∶1的范围之内。一般地，对于多PEG化，水溶性聚合物对ZcytoR14的摩尔比是1∶1至20∶1，对于单PEG化是1∶1至5∶1。
用于产生包含多肽和水溶性聚合物部分的缀合物的一般方法在本领域是已知的。参见，例如，Karasiewicz等人，美国专利号5,382,657，Greenwald等人，美国专利号5,738,846，Nieforth等人，Clin.Pharmacol.Ther.59：636(1996)，Monkarsh等人，Anal.Biochem.247：434(1997))。可使用该方法制备包含ZcytoR14的同型二聚体、异二聚体或多聚体可溶性受体缀合物。
本发明涉及包含肽或多肽例如此处描述的可溶性受体或抗体的组合物。此等组合物可进一步包含载体。载体可以是常规的有机或无机载体。载体的示例包括水、缓冲液、醇、丙二醇、聚乙二醇、麻油、玉米油等。
G)ZcytoR14多肽的分离
可将本发明的多肽纯化至，相对于污染性大分了(特别是其他蛋白和核酸)，至少大约80％的纯度、至少大约90％的纯度、至少大约95％的纯度、或大于95％的纯度例如96％、97％、98％或大于99％的纯度，并且不含感染性因子和致热性因子。也可将本发明的多肽纯化至药物纯状态，该纯度超过99.9％的纯度。在某些制剂中，纯化的多肽基本上不含其他多肽，特别是动物来源的其他多肽。
可使用分级分离和/或常规的纯化方法获得从天然来源(例如，人组织来源)纯化的ZcytoR14、合成的ZcytoR14多肽和从重组宿主细胞纯化的重组ZcytoR14多肽和融合ZcytoR14多肽的制剂。一般地，可使用硫酸铵沉淀法或酸或离液剂提取法进行样品的分级分离。示例性纯化步骤可包括羟基磷灰石、大小排阻、FPLC和反相高效液相层析。合适的层析介质包括衍生化的葡聚糖、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、特种硅土(specialty silicas)等。PEI、DEAE、QAE和Q衍生物是合适的。示例性层析介质包括用苯基、丁基或辛基衍生的介质，例如苯基-Sepharose FF(Pharmacia)、Toyopearl butyl650(TosoHaas，Montgomeryville，PA)、辛基-Sepharose(Pharmacia)等；或聚丙烯酸树脂，例如Amberchrom CG71(Toso Haas)等。合适的固体支持物包括玻璃小珠、基于二氧化硅的树脂、纤维素树脂、琼脂糖小珠、交联的琼脂糖小珠、聚苯乙烯小珠、交联的聚丙烯酰胺树脂等，所述支持物在其被使用的条件下是不溶性的。可用可使蛋白通过氨基、羧基、巯基、羟基和/或糖部分附着的反应性基团修饰这些支持物。
偶联化学试剂的示例包括溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧化物活化、巯基活化、酰肼活化和用于碳二亚胺偶联化学试剂的羧基和氨基衍生物。这些试剂和其他固体基质是本领域内熟知的和广泛使用的，并且可从提供商商购获得。用于多肽分离和纯化的特定方法的选择在常规技术范围之内并且可部分地通过选择的支持物的特性进行确定。参见，例如，Affinity Chromatography：Principles&Methods(Pharmacia LKB Biotechnology1988)，和Doonan，ProteinPurification Protocols(The Humana Press1996)。
本领域技术人员可设计ZcytoR14分离和纯化上的另外的变化。例如，可使用如下所述获得的抗ZcytoR14抗体通过免疫亲和纯化分离大量的蛋白。
也可通过利用特定性质分离本发明的多肽。例如，可使用固定化的金属离子吸附(IMAC)层析纯化富含组氨酸的蛋白，包括包含多组氨酸标签的蛋白。简而言之，首先用二价金属离子加载凝胶以形成螯合物(Sulkowski，Trends in Biochem.3：1(1985))。依赖于所用的金属离子，可将富含组氨酸的蛋白以不同的亲和力吸附至该基质，通过竞争性洗脱、降低pH、或使用强螯合剂洗脱所述蛋白。纯化的其他方法包括通过凝集素亲和层析和离子交换层析纯化糖基化蛋白(M.Deutscher，(ed.)，Meth.Enzymol.182：529(1990))。在本发明的其他实施方案中，可构建目的多肽和亲和标签(例如，麦芽糖-结合蛋白质，免疫球蛋白的结构域)的融合物以帮助纯化。此外，可使用ZcytoR14细胞外结构域的配体-结合特性，通过例如使用亲和层析纯化例如包含ZcytoR14的可溶性受体，在所述亲和层析中，将IL-17F配体结合至柱子，使用标准层析方法结合和随后洗脱包含ZcytoR14的受体。
也可通过上述的化学合成制备ZcytoR14多肽或其片段。ZcytoR14多肽可以是单体或多聚体、糖基化或非糖基化的、PEG化或非PEG化的、和可以包含或可以不包含起始甲硫氨酸残基。
H)针对ZcytoR14蛋白的抗体的产生
可通过例如使用ZcytoR14表达载体的产物或从天然来源分离的ZcytoR14作为抗原来获得针对ZcytoR14的抗体。特别有用的抗ZcytoR14抗体“特异性地结合”ZcytoR14。如果抗体表现下列两种特性中的至少一种则该抗体被认为是特异性结合的：(1)抗体以阈值水平的结合活性结合ZcytoR14，和(2)抗体和与ZcytoR14关联的多肽不发生显著的交叉反应。
关于第1特性，如果抗体以106M-1或更大的、优选地107M-1或更大的、更优选地108M-1或更大的、最优选地109M-1或更大的结合亲和力(Ka)结合ZcytoR14多肽、肽或表位则其是特异性地结合。本领域技术人员通过例如Scatchard分析法(Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51：660(1949))可容易地确定抗体的结合亲和力。关于第2特征，例如，如果通过使用标准的Western印迹分析法，抗体检测ZcytoR14，但不检测目前已知的多肽，那么抗体不和关联多肽发生显著的交叉反应。已知的关联多肽的示例包括已知的细胞因子受体。
可使用具有抗原性ZcytoR14表位的肽和多肽产生抗ZcytoR14抗体。本发明的具有抗原性ZcytoR14表位的肽和多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或此处公开的另一种氨基酸序列中的至少9个、或15至大约30个氨基酸的序列。然而，包含本发明的氨基酸序列的更大部分的肽或多肽，包含30至50个氨基酸或任何长度(包括长达和包含本发明的多肽的整个氨基酸序列的长度)，也用于诱导结合ZcytoR14的抗体产生。选择在水溶剂中提供充分溶解性的具有表位的肽的氨基酸序列(即，所述序列包含相对亲水的残基，同时一般避免疏水性残基)是想要的。此外，对于抗体生产，包含脯氨酸残基的氨基酸序列也是想要的。
作为说明示例，使用通过LASERGENE(DNASTAR；Madison，WI)的PROTEAN程序(版本3.14)进行的Jameson-Wolf方法，Jameson和Wolf，CABIOS4：181，(1988)鉴定了ZcytoR14中的潜在的抗原性位点。在该分析中使用缺省参数。
Jameson-Wolf法通过组合用于蛋白结构预测的6个主要子程序来预测潜在的抗原决定簇。简而言之，首先使用Hopp-Woods方法，Hopp等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 78：3824(1981)，鉴定代表最大局部亲水性区域的氨基酸序列(参数：平均7个残基)。在第2步骤中，使用Emini法，Emini等人，J.Virology55：836(1985)计算表面或然率(surface probabilities)(参数：表面决定阈值(0.6)＝1)。第三，使用Karplus-Schultz法，Karplus和Schultz，Naturwissenschaften72：212(1985)预测主链柔度(backbone chainflexibility)(参数：柔度阈值(0.2)＝1)。在分析的笫4和第5步骤中，使用Chou-Fasman，Chou，“Prediction of Protein StructuralClasses from Amino Acid Composition，”in Prediction of ProteinStructure and the Principles of Protein Conformation，Fasman(ed.)，pages549-586(Plenum Press1990)，和Garnier-Robson，Garnier等人，J.Mol.Biol.120：97(1978)的方法对数据进行二级结构预测(Chou-Fasman参数：构象表＝64个蛋白；α区域阈值＝103；β区域阈值＝105；Garnier-Robson参数：α和β决定常数＝0)。在第6子程序中，使用柔度参数和亲水性/溶剂可接触性因子一起确定称为“抗原性指数”的表面等值(surface contour value)。最后，将峰加宽函数用于抗原性指数，该函数通过加上峰值的20、40、60或80％来加宽主要表面峰以补偿从表面区域相对于内部区域的移动所产生的额外的自由能。然而，不将该计算用于存在于螺旋区域的任何主峰，因为螺旋区域倾向于较低的柔性。可使用Hopp/Woods亲水性分布图确定在SEQ ID NO：3内最具抗原性潜力的区域(Hopp等人， Proc.Natl.Acad. Sci.78：3824-3828，1981；Hopp， J.Immun.Meth.  88：1-18，1986和Triquier等人， Protein Engineering  11：153-169，1998)。所述分布图基于滑动6残基窗口。忽略埋藏的G、S和T残基和暴露的H、Y和W残基。此外，将例如使用DNASTAR Protean程序(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)通过Jameson-Wolf作图预测的SEQ ID NO：3中的ZcytoR14抗原表位用作优选的抗原表位，其可通过本领域技术人员来确定。这些抗原表位包括(1)SEQ ID NO：3的氨基酸残基73至氨基酸残基82；(2)SEQ ID NO：3的氨基酸残基95至氨基酸残基104；(3)SEQ IDNO：3的氨基酸残基111至氨基酸残基119；(4)SEQ ID NO：3的氨基酸残基179至氨基酸残基186；(5)SEQ ID NO：3的氨基酸残基200至氨基酸残基205；(6)SEQ ID NO：3的氨基酸残基229至氨基酸残基236；(7)SEQ ID NO：3的氨基酸残基264至氨基酸残基268；和(8)SEQ ID NO：3的氨基酸残基275至氨基酸残基281。本发明也涉及使用抗原表位X至Y中的任一表位产生抗ZcytoR14抗体或将其用作筛选或鉴定本发明的中和单克隆抗体的工具。本发明也涉及包含抗原肽X至Y中至少一个的多肽。本发明使用此处描述的任何抗原肽或表位产生抗ZcytoR14抗体以及鉴定和筛选这样的抗ZcytoR14单克隆抗体，所述单克隆抗体是中和抗体，其可结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17F和IL-17A(单独地或一起地)的活性。
此外，合适的抗原也包括这样的ZcytoR14多肽，例如可形成可溶性ZcytoR14异二聚体或多聚体多肽等的多肽，该多肽包含和另一种细胞因子细胞外结构域(例如I或II类细胞因子受体结构域)一起的上面公开的ZcytoR14细胞因子结合结构域、或细胞外结构域。
可使用本领域技术人员熟知的方法制备抗重组ZcytoR14蛋白或抗从天然来源分离的ZcytoR14的多克隆抗体。参见，例如，Green等人，“Production of Polyclonal Antisera，”in ImmunochemicalProtocols(Manson，ed.)，pages1-5(Humana Press1992)，和Williams等人，“Expression of foreign proteins in E.coliusingplasmid vectors and purification of specific polyclonalantibodies，”in DNA Cloning2：Expression Systems，第2版，Glover等人(eds.)，page15(Oxford University Press1995)。通过使用佐剂例如明矾(氢氧化铝)或弗氏完全或不完全佐剂可增加ZcytoR14多肽的免疫原性。用于免疫的多肽也包括融合多肽，例如ZcytoR14或其部分和免疫球蛋白多肽或麦芽糖结合蛋白的融合物。多肽免疫原可以是全长分子或其部分。如果多肽部分是“半抗原样的”，可将该部分有利地结合至或连接至用于免疫的大分子载体(例如钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素)。
尽管一般在动物例如马、牛、狗、鸡、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、山羊或绵羊中生产多克隆抗体，但也可从类人灵长类动物的抗体衍生本发明的抗ZcytoR14抗体。可在例如Goldenberg等人，国际专利公开号WO 91/11465，和Losman等人，Int.J.Cancer46：310(1990)中查找到用于在狒狒中产生诊断和治疗用途的抗体的一般技术。
可选择地，可产生单克隆抗ZcytoR14抗体。可通过本领域技术人员已知的方法(参见，例如，Kohler等人，Nature256：495(1975)，Coligan等人(eds.)，Current Protocols in Immunology，第1卷，pages2.5.1-2.6.7(John Wiley&Sons1991)[“Coligan”]，Picksley等人，“Production of monoclonal antibodies againstproteins expressed in E.coli，”in DNA Cloning2：ExpressionSystems，第2版，Glover等人(eds.)，page93(Oxford UniversityPress1995))获得抗特定抗原的啮齿动物单克隆抗体。
简而言之，可这样获得单克隆抗体，用包含ZcytoR14基因产物的组合物注射小鼠，通过取出血清样品以验证抗体产物的存在，取出脾脏以获得B淋巴细胞，将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆杂交瘤，选择产生抗所述抗原的抗体的阳性克隆，培养产生抗所述抗原的抗体的克隆，从杂交瘤培养物中分离抗体。
此外，可从人单克隆抗体产生本发明的抗ZcytoR14抗体。从已通过基因工程改造，产生对抗原攻击起反应的特异性人抗体的转基因小鼠获得人单克隆抗体。在该技术中，将人重链和轻链基因座的元件导入来源于胚胎干细胞系的小鼠品系，所述小鼠品系包含内源重链和轻链基因座的靶向断裂。转基因小鼠可合成对于人抗原是特异性的人抗体，可使用所述小鼠产生分泌人抗体的杂交瘤。由例如，Green等人，Nature Genet.7：13(1994)，Lonberg等人，Nature368：856(1994)，和Taylor等人，Int.Immun.6：579(1994)描述用于从转基因小鼠获得人抗体的方法。
可通过各种已良好建立的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化单克隆抗体。这些分离技术包括使用A蛋白Sepharose的亲和层析、大小排阻层析和离子交换层析(参见，例如，Coligan at pages2.7.1-2.7.12和pages2.9.1-2.9.3；Baines等人，″Purification ofImmunoglobulin G(IgG)，″in Methods in Molecular Biology，第10卷，pages79-104(The Humana Press，Inc.1992))。
对于特定的用途，制备抗ZcytoR14抗体的片段是想要的。可通过抗体的蛋白水解作用获得这些抗体片段。可通过常规的方法，用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶降解完整的抗体来获得抗体片段。作为说明性示例，可通过使用胃蛋白酶酶促断裂抗体以提供称为F(ab′)2的5S片段来产生抗体片段。可用巯基还原剂进一步断裂该片段，从而产生3.5S Fab′单价片段。任选地，可使用二硫链断裂产生的巯基的封闭基团进行该断裂反应。作为另一种选择，使用胃蛋白酶的酶促断裂直接产生2个单价Fab片段和Fc片段。由例如，Goldenberg，美国专利号4,331,647，Nisonoff等人，Arch Biochem.Biophys.89：230(1960)，Porter，Biochem.J.73：119(1959)，Edelman等人，in Methods inEnzymology第1卷，page422(Academic Press1967)，和Coliganat pages2.8.1-2.8.10和2.10.-2.10.4描述这些方法。
也可使用断裂抗体的其他方法，例如形成单价轻-重链片段的重链的分离、片段的进一步断裂，或其他酶促、化学或遗传技术，只要所述片段结合由该完全抗体识别的抗原。
例如，Fv片段包含结合的VH和VL链。该结合可以是非共价的，如由Inbar等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 69：2659(1972)所描述的。可选择地，可通过分子间二硫键连接或通过化学试剂例如戊二醛(参见，例如，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437(1992))交联可变链。
Fv片段可包含通过肽连接体连接的VH和VL链。通过构建包含编码VH和VL结构域的结构基因(所述VH和VL结构域通过寡核苷酸连接)制备这些单链抗原结合蛋白(scFv)。将结构基因插入随后被导入宿主细胞例如大肠杆菌的表达载体。重组宿主细胞合成具有跨接2个V结构域的连接体肽的单个多肽链。由Whitlow等人，Methods：A Companion toMethods in Enzymology2：97(1991)(也参见，Bird等人，Science242：423(1988)，Ladner等人，美国专利号4,946,778，Pack等人，Bio/Technology11：1271(1993)，和Sandhu，同上)描述用于产生scFvs的方法。
作为说明性示例，可这样获得scFV，在体外将淋巴细胞暴露于ZcytoR14多肽，选择噬菌体或相似的载体中的抗体展示文库(例如，通过使用固定的或标记的ZcytoR14蛋白或肽)来获得scFV。可通过在噬菌体(噬菌体展示)或在细菌例如大肠杆菌上展示的随机肽文库来获得编码具有潜在的ZcytoR14多肽结合结构域的多肽的基因。可通过许多方法例如通过随机诱变和随机多核苷酸合成来获得编码所述多肽的核苷酸序列。可使用这些随机肽展示文库选择和这样的已知的靶相互作用的肽，该靶可以是蛋白或多肽，例如配体或受体、生物大分子或合成的大分子、或有机或无机物。用于产生和筛选这些随机肽展示文库的技术在本领域是已知的(Ladner等人，美国专利号5,223,409，Ladner等人，美国专利号4,946,778，Ladner等人，美国专利号5,403,484，Ladner等人，美国专利号5,571,698，和Kay等人，PhageDisplay of Peptides and Proteins(Academic Press，Inc.1996))，可从例如CLONTECH Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)、InvitrogenInc.(San Diego，CA)、New Engl and Biolabs，Inc.(Beverly，MA)和Pharmacia LKB Biotechnology Inc.(Piscataway，NJ)商购获得用于筛选这些文库的随机肽展示文库和试剂盒。可使用此处公开的ZcytoR14序列筛选随机肽展示文库以鉴定结合ZcytoR14的蛋白。
抗体片段的另一种形式是编码单个互补决定区(CDR)的肽。可通过构建编码目的抗体的CDR的基因来获得CDR肽(“最小识别单位”)。通过例如使用聚合酶链式反应合成来自产生抗体的细胞的RNA的可变区来制备这些基因(参见，例如，Larrick等人，Methods：A Companionto Methods in Enzymology 2：106(1991)，Courtenay-Luck，“Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies，”inMonoclonal Antibodies：Production，Engineering and ClinicalApplication，Ritter等人(eds.)，page166(Cambridge UniversityPress1995)，和Ward等人，“Genetic Manipulation and Expressionof Antibodies，”in Monoclonal Antibodies： Principles andApplications，Birch等人，(eds.)，page137(Wiley-Liss，Inc.1995))。
可选择地，可从“人源化的”单克隆抗体产生抗ZcytoR14抗体。通过将来自小鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变区的小鼠互补决定区转移至人可变结构域来产生人源化的单克隆抗体。然后在鼠类对应物的构架区内用人抗体的特有的残基进行取代。使用来自人源化单克隆抗体的抗体组分避免了和鼠类恒定区的免疫原性关联的潜在问题。用于克隆鼠类免疫球蛋白可变结构域的一般方法描述于例如Orlandi等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 86：3833(1989)。由例如Jones等人，Nature321：522(1986)，Carter等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA89：4285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437(1992)，Singer等人，J.Immun.150：2844(1993)，Sudhir(ed.)，AntibodyEngineering Protocols(Humana Press，Inc.1995)，Kelley，“Engineering Therapeutic Antibodies，”in ProteinEngineering：Principles and Pracrice，Cleland等人(eds.)，pages399-434(John Wiley&Sons，Inc.1996)，和Queen等人，美国专利号5,693,762(1997)描述用于产生人源化单克隆抗体的技术。
此外，可使用本领域内和此处描述的方法PEG化本发明的抗ZcytoR14抗体或抗体片段。
使用标准技术，用抗ZcytoR14抗体或抗体片段免疫动物来制备多克隆抗独特型抗体。参见，例如，Green等人，“Production ofPolyclonal Antisera，”in Methods In Molecular Biology：Immunochemical Protocols，Manson(ed.)，pages1-12(HumanaPress1992)。也参见，Coligan at pages2.4.1-2.4.7。可选择地，使用上述技术，用抗ZcytoR14抗体或抗体片段作为免疫原来制备单克隆抗独特型抗体。作为另一种选择，可使用上述技术制备人源化抗独特型抗体或类人灵长类动物抗独特型抗体。由例如Irie，美国专利号5,208,146，Greene，等人，美国专利号5,637,677，和Varthakavi和Minocha，J.Gen.Virol.77：1875(1996)描述用于产生抗独特型抗体的方法。
可用可检测的标记物缀合抗ZcytoR14抗体以形成抗ZcytoR14免疫缀合物。合适的可检测的标记物包括，例如，放射性同位素、荧光标记物、化学发光标记物、酶标记物、生物发光标记物或胶体金。制备和检测这些可检测标记的免疫缀合物的方法对于本领域技术人员来说是熟知的，并在下面进行更详细的描述。
可检测的标记物可以是通过放射自显影法检测的放射性同位素。对于本发明的目的特别有用的同位素是3H、125I、131I、35S和14C。
也可用荧光化合物标记抗ZcytoR14免疫缀合物。通过将免疫缀合物暴露于合适波长的光并检测所得的荧光来确定荧光标记的抗体的存在。荧光标记化合物包括异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。
可选择地，可通过将抗体组分偶联至化学发光化合物来可检测地标记抗ZcytoR14免疫缀合物。通过检测化学反应过程产生的发光的存在来确定化学发光标记的免疫缀合物的存在。化学发光标记化合物的示例包括鲁米诺、4-氨基邻苯二甲酰肼、芳香族吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
类似地，可使用生物发光化合物标记本发明的抗ZcytoR14免疫缀合物。生物发光是在这样的生物系统中发现的化学发光类型，在所述生物系统中，催化蛋白增加了化学发光反应的效率。通过检测发光的存在来确定生物发光蛋白的存在。用于标记的生物发光化合物包括荧光素、萤光素酶和水母发光蛋白。
可选择地，可通过将抗ZcytoR14抗体组分连接至酶来可检测地标记抗ZcytoR14免疫缀合物。当在合适的底物存在的情况下温育抗ZcytoR14抗体-酶缀合物时，酶部分和底物反应，产生可通过例如分光光度计、荧光计或可视方法检测的化学部分。可用于可检测地标记多特异性的免疫缀合物的酶的示例包括β-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、过氧化物酶和碱性磷酸酶。
本领域技术人员知道可根据本发明使用的其他合适的标记物。可使用本领域已知的标准技术来使标记物部分和抗ZcytoR14抗体结合。由Kennedy等人，Clin.Chim.Acta70：1(1976)，Schurs等人，Clin.Chim.Acta81：1(1977)，Shih等人，Int′l J.Cancer46：1101(1990)，Stein等人，Cancer Res.50：1330(1990)，和Coligan，同上描述该方面的典型方法。
此外，可使用已和抗生物素蛋白、链霉抗生物素和生物素缀合的抗ZcytoR14抗体增加免疫化学检测的方便性和通用性(参见，例如，Wilchek等人(eds.)，“Avidin-Biotin Technology，”Methods InEnzymology，第184卷.(Academic Press1990)，和Bayer等人，“Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology，”in Methods In Molecular Biology，第1卷，Manson(ed.)，pages149-162(The Humana Press，Inc.1992)。
用于进行免疫测定法的方法是良好建立的方法。参见，例如，Cook和Self，“Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays，”in Monoclonal Antibodies：Production，Engineering，andClinical Application，Ritter and Ladyman(eds.)，pages180-208，(Cambridge University Press，1995)，Perry，“The Role ofMonoclonal Antibodies in the Advancement of ImmunoassayTechnology，”in Monoclonal Antibodies：Principles andApplications，Birch和Lennox(eds.)，pages107-120(Wiley-Liss，Inc.1995)，和Diamandis，Immunoassay(Academic Press，Inc.1996)。
本发明也涉及用于进行用于测定ZcytoR14基因表达的免疫学诊断测定法的试剂盒。这些试剂盒包含至少一个装有抗ZcytoR14抗体或抗体片段的容器。试剂盒也可包含装有一种或多种能够指示ZcytoR14抗体或抗体片段存在的试剂的第二容器。这些指示剂的示例包括可检测的标记物例如放射性标记物、荧光标记物、化学发光标记物、酶标记物、生物发光标记物、胶体金等。试剂盒也可以包含递送给用户的使用ZcytoR14抗体或抗体片段检测ZcytoR14蛋白的手段。例如，书面说明书可声明，可使用包装的抗体或抗体片段检测ZcytoR14。可将书面材料直接用于容器，或可以包装书明书的形式提供书面材料。
I)抗ZcytoR14抗体拮抗ZcytoR14结合IL-17F或IL-17A和IL-17F两者的用途
用于产生或选择此处有用的抗体的可选择的技术包括在体外将淋巴细胞暴露于可溶性ZcytoR14受体多肽或其片段(例如抗原表位)，并选择噬菌体或相似的载体中的抗体展示文库(例如，通过使用固定的或标记的可溶性ZcytoR14受体多肽或其片段例如抗原表位进行筛选)。可通过筛选在噬菌体中展示(噬菌体展示)的或在细菌例如大肠杆菌中展示的随机肽文库来获得编码具有潜在的结合结构域的多肽的基因，所述多肽是例如可溶性ZcytoR14受体多肽或其片段例如抗原表位。可通过许多方法例如通过随机诱变和随机多核苷酸合成法获得编码所述多肽的核苷酸序列。这些随机肽展示文库可用于筛选和已知的靶相互作用的肽，所述靶可以是蛋白或多肽，例如配体或受体、生物大分子或合成的大分子、或有机物或无机物。用于建立和筛选这些随机肽展示文库的技术在本领域是已知的(Ladner等人，美国专利号5,223,409；Ladner等人，美国专利号4,946,778；Ladner等人，美国专利号5,403,484和Ladner等人，美国专利号5,571,698)，可从例如Clontech(Palo Alto，CA)、Invitrogen Inc.(San Diego，CA)、New England Biolabs、Inc.(Beverly，MA)和Pharmacia LKBBiotechnology Inc.(Piscataway，NJ)商购获得用于筛选这些文库的随机肽展示文库和试剂盒。可使用可溶性ZcytoR14受体多肽或其片段(例如此处公开的抗原表位多肽)筛选随机肽展示文库来鉴定结合包含ZcytoR14的受体多肽的蛋白。和包含可溶性ZcytoR14的受体多肽相互作用的这些“结合多肽”可用于标记细胞；用于通过亲和纯化分离同源多肽；可将其直接或间接地缀合至药物、毒素、放射性核素等。也可将这些结合多肽用于这样的分析方法，所述方法用于例如筛选表达文库和中和活性，例如用于结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17A和IL-17F(单独地或一起地)与ZcytoR14之间的相互作用或病毒对受体的结合。也可将结合多肽用于这样的诊断测定法，该诊断测定法用于确定可溶性包含ZcytoR14的受体多肽的循环水平；用于检测或定量作为潜在的病状或疾病的标志物的可溶性或非可溶性包含ZcytoR14的受体。这些结合多肽也可用作在体外和体内阻断或抑制可溶性或膜结合的ZcytoR14单体受体或ZcytoR14同型二聚体、异二聚体或多聚体多肽结合(例如对配体的结合)和信号转导的“拮抗剂”。此外，这些结合多肽用作抗ZcytoR14单体受体或抗ZcytoR14同型二聚体、异二聚体或多聚体多肽和用于抑制IL-17F或IL-17A和IL-17F两者一起的活性以及受体活性或蛋白结合。针对本发明的天然受体复合物产生的抗体和ZcytoR14-表位-结合抗体、和抗ZcytoR14中和性单克隆抗体可以是优选的实施方案，因为其可更特异性地抗ZcytoR14和可抑制IL-17F或同时抑制IL-17A和IL-17F。此外，可分别在IL-17A或IL-17F和包含ZcytoR14的可溶性受体存在的情况下，在IL-17A或IL-17F扩增、信号捕获、萤光素酶或结合测定法中以及在此处描述的其他生物学或生物化学测定法中检测本发明的抗体的拮抗和结合活性。
抗可溶性ZcytoR14受体多肽的抗体(例如针对SEQ ID NO：3的抗体)或其片段例如抗原表位可用于在体内抑制IL-17A、IL-17F、或IL-17A和IL-17F两者一起的炎症效应，用于抵抗炎症和炎性疾病例如牛皮癣、牛皮癣性关节炎、类风湿性关节炎、内毒素血症、炎性肠病(IBD)、结肠炎、哮喘、同种异体移植排斥、免疫介导的肾病、肝胆管病、多发性硬化症、动脉粥样硬化、肿瘤生长的促进或退行性关节病和此处公开的其他炎性病症的治疗用途；用于标记表达ZcytoR14受体的细胞；用于通过亲和层析分离可溶性包含ZcytoR14的受体多肽；用于确定可溶性包含ZcytoR14的受体多肽的循环水平的诊断测定法；用于检测或定量作为潜在的病状或疾病的标志物的可溶性的包含ZcytoR14的受体；用于使用FACS的分析方法；用于筛选表达文库；用于产生可用作IL-17F或IL-17A激动剂的抗独特型抗体；和用作在体外和体内结合、阻断、抑制、减少或拮抗ZcytoR14受体功能或结合、阻断、抑制、减少或拮抗或中和IL-17F和/或IL-17A活性(单独地或一起地)的中和抗体或拮抗剂。合适的直接标签或标记物包括放射性核素、酶、底物、辅助因子、生物素、抑制剂、荧光标记物、化学发光标记物、磁颗粒等；间接标签或标记物可表征作为中间物的生物素-抗生物素蛋白或其他互补/反互补对的用途。此处的抗体也可直接或间接地缀合至药物、毒素、放射性核素等，这些缀合物用于体内诊断或治疗用途。此外，可在体外使用抗可溶性的包含ZcytoR14的受体多肽或其片段的抗体，以在测定法例如Western印迹法或本领域已知的其他测定法中检测变性的或非变性的包含ZcytoR14的受体多肽或其片段。
抗可溶性ZcytoR14受体或可溶性ZcytoR14同型二聚体、异二聚体或多聚体受体多肽的抗体用于标记表达对应的受体的细胞并测定其表达水平，用于亲和纯化，在诊断测定法中用于确定受体多肽的循环水平，用于使用荧光激活的细胞分选的分析方法。此外，二价抗体和抗同种型抗体可用作模拟ZcytoR14配体，IL-17F或IL-17A的效应的激动剂。
也可将此处的抗体直接或间接地缀合至药物、毒素、放射性核素等，这些缀合物用于体内诊断或治疗用途。例如，可使用识别可溶性ZcytoR14受体或可溶性ZcytoR14同型二聚体、异二聚体或多聚体受体多肽的抗体或结合多肽鉴定或处理这样的组织或器官，所述组织或器官表达对应的反互补分子(即，包含ZcytoR14的可溶性或膜结合受体)。更明确地，可将针对可溶性的包含ZcytoR14的受体多肽的抗体或其生物活性片段或部分偶联至可检测的或细胞毒性分子和将其递送至具有表达包含ZcytoR14的受体的组织或器官的哺乳动物，例如表达ZcytoR14的癌。
合适的可检测的分子可直接或间接地附着至结合包含ZcytoR14的受体多肽的多肽例如“结合多肽”(包括上述的结合肽)、抗体或其生物活性片段或部分。合适的可检测的分子包括放射性核素、酶、底物、辅助因子、抑制剂、荧光标记物、化学发光标记物、磁性颗粒等。合适的细胞毒性分子可直接或间接地附着至所述多肽或抗体，其包括细菌或植物毒素(例如，白喉毒素、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素、篦麻蛋白、相思豆毒蛋白等)，以及治疗性放射性核素，例如碘-131、铼-188或钇-90(直接地附着至多肽或抗体，或通过例如螯合部分间接地附着)。也可将结合性多肽或抗体缀合至细胞毒性药物，例如阿霉素。为了间接附着可检测的或细胞毒性分子，可将可检测的或细胞毒性分子和互补/反互补对的成员缀合，而将另一个成员结合至结合多肽或抗体部分。对于这些目的，生物素/链霉抗生物素是示例性互补/反互补对。
在另一个实施方案中，可将结合性多肽-毒素融合蛋白或抗体-毒素融合蛋白用于被靶向的细胞或组织的抑制或切除(例如，治疗癌细胞或组织)。可选择地，如果结合性多肽具有多个功能结构域(即，激活结构域或配体结合结构域和靶向性结构域)，只包含靶向性结构域的融合蛋白可适合用于指导可检测的分子、细胞毒性分子或互补分子朝向目的细胞或组织类型。在当只包含单个结构域的融合蛋白包含互补分子的情况下，可将反互补分子缀合至可检测的或细胞毒性分子。因此这些结构域-互补分子融合蛋白代表了用于一般反互补-可检测的/细胞毒性分子缀合物的细胞/组织特异性递送的一般靶向性载体。
在另一个实施方案中，ZcytoR14结合性多肽-细胞因子或抗体-细胞因子融合蛋白可用于在体内增强杀伤靶组织(例如，脾、胰、血液、淋巴、结肠和骨髓癌)，如果结合性多肽-细胞因子或抗ZcytoR14受体抗体靶向过度增殖的细胞(一般参见，Hornick等人，Blood89：4437-47，1997)。所述融合蛋白可使细胞因子靶向想要的作用位点，从而提供了提高的细胞因子的局部浓度。合适的抗ZcytoR14单体、同型二聚体、异二聚体或多聚体抗体靶向不想要的细胞或组织(即，肿瘤或白血病)，融合的细胞因子通过效应细胞介导提高的靶细胞裂解。例如，用于该目的合适的细胞因子包括白细胞介素2和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
可选择地，此处描述的结合ZytoR14受体的多肽或抗体融合蛋白可用于在体内通过直接刺激ZcytoR14受体调控的细胞凋亡途径来增强杀伤靶组织，导致表达包含ZcytoR14的受体的过度增殖的细胞的细胞死亡。
J) 具有ZcytoR14活性的多肽或针对ZcytoR14的抗体的治疗性 用途
可使用具有可溶性ZcytoR14活性的氨基酸序列，通过结合ZcytoR14配体IL-17A和IL-17F(单独地或一起地)，从而，阻断ZcytoR14配体和内源ZcytoR14受体的结合来调节免疫系统。也可使用ZcytoR14拮抗剂，例如可溶性ZcytoR14或抗ZcytoR14抗体，通过抑制ZcytoR14配体和内源ZcytoR14受体的结合来调节免疫系统。因此，本发明包括对这样的受治疗者使用具有ZcytoR14活性的蛋白、多肽和肽(例如可溶性ZcytoR14多肽、ZcytoR14多肽片段、ZcytoR14类似物(例如，抗ZcytoR14抗同种型抗体)、和ZcytoR14融合蛋白)，所述受治疗者缺乏足够量的该多肽，或产生过量的ZcytoR14配体。也可使用ZcytoR14拮抗剂(例如，抗ZcytoR14抗体)治疗产生过量ZcytoR14配体或ZcytoR14的受治疗者。合适的受治疗者包括哺乳动物，例如人。例如，这些ZcytoR14多肽和抗ZcytoR14抗体用于结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17A和IL-17F(单独地或一起地)，用于治疗炎症和炎性疾病，所述病症是例如牛皮癣、牛皮癣性关节炎、类风湿性关节炎、内毒素血症、炎性肠病(IBD)、结肠炎、哮喘、同种异体移植排斥、免疫介导的肾病、肝胆管病、多发性硬化症、动脉粥样硬化、肿瘤生长的促进或退行性关节病和此处公开的其他炎性病症。
在优选的实施方案中，ZcytoR14，SEQ ID NO：3)的可溶性受体形式是在体内结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17A和IL-17F(单独地或一起地)的单体、同型二聚体、异二聚体或多聚体。针对这些ZcytoR14单体、同型二聚体、异二聚体或多聚体的抗体和结合性多肽也用作ZcytoR14活性的拮抗剂，和用作IL-17A和IL-17F的拮抗剂(单独地或一起地)，如此处所描述的。
此外，我们在此已描述了在基于细胞的中和测定法中多克隆和单克隆中和抗IL-17F抗体结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17F和IL-17A的活性。对应于ZcytoR14 cDNA的mRNA的组织分布的分析显示ZcytoR14基因的mRNA在甲状腺、肾上腺、前列腺和肝组织中强烈表达，在心脏、小肠、胃和气管组织中以较低程度表达。特别地，ZcytoR14在非T细胞外周血细胞系(包括单核细胞、B细胞和骨髓谱系的细胞)中持续表达。此外，ZcytoR14mRNA在来源于皮肤的细胞系中可靠地表达。表达ZcytoR14的其他细胞系是出现在阵列上的所有5个大肠细胞系。相反地，在大脑、胎盘、肺、骨骼肌、肾、胰腺、脾、胸腺、睾丸、卵巢、结肠、外周血白细胞、脊髓、淋巴结和骨髓中极少表达或不表达。ZcytoR14结合的配体(IL-17F和/或IL-17A)参与诱导炎症反应和促进炎性疾病，主要通过其增加炎症介质的产量的能力来诱导，所述炎症介质包括IL-1b、IL-6和TNF-a以及参与嗜中性粒细胞的增殖、成熟和趋化性的介质(综述参见Witowski等人Cell.Mol.Life Sci.61：567-579[2004])。
因此，本发明的特定实施方案涉及在炎症和免疫疾病或病症中作为拮抗剂的可溶性ZcytoR14和抗ZcytoR14抗体的用途，所述病症或病症是例如牛皮癣、牛皮癣性关节炎、特应性皮炎、炎性皮肤病症、类风湿性关节炎、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、憩室病、哮喘、胰腺炎、I型糖尿病(IDDM)、胰腺癌、胰腺炎、格雷夫斯病、结肠癌和肠癌、自身免疫疾病、脓毒症、器官和骨髓移植；由于内毒素血症、创伤、手术或感染引起的炎症；淀粉样变性病；脾大；移植物抗宿主病；其中炎症的抑制、免疫抑制、造血性细胞、免疫细胞、炎症细胞或淋巴细胞、巨噬细胞、T细胞(包括Th1和Th2细胞)的增殖的减少、对病原体或抗原的免疫应答的抑制、或其中IL-17F或IL-17A细胞因子受到抑制的其他状况是想要的。
此外，结合此处描述的ZcytoR14多肽的抗体或结合性多肽和ZcytoR14多肽自身可用于：
1)在由这样的疾病造成的急性炎症、炎症的治疗中以及淀粉样变性病、和动脉粥样硬化、卡斯尔曼病、哮喘和其他和急性期反应的诱导关联的疾病的治疗中通过IL-17A或IL-17F的受体阻断、抑制、减少、拮抗或中和信号转导，所述疾病是创伤、组织损伤、手术、脓毒症或感染以及慢性炎性疾病例如哮喘、炎性肠病(IBD)、慢性结肠炎、脾大、类风湿性关节炎、复发性急性炎症发作(recurrent acuteinflammatory episodes)(例如，结核病)。
2)在自身免疫疾病的治疗中阻断、抑制、减少、拮抗或中和通过IL-17A或IL-17F的受体进行的信号转导以在免疫细胞(例如淋巴细胞、单核细胞、粒细胞)中阻止或抑制通过ZcytoR14进行的信号转导，所述自身免疫疾病是例如IDDM、多发性硬化症(MS)、全身性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、类风湿性关节炎和IBD。可选择地，抗体，例如针对包含ZcytoR14的受体的单克隆抗体，也可用作拮抗剂以清除不想要的免疫细胞，从而治疗自身免疫疾病。可用抗例如可溶性ZcytoR14可溶性受体的MAb抑制免疫应答或清除侵入细胞来治疗哮喘、过敏症和其他特应性疾病。使用本发明的多肽和抗体，阻断、抑制、减少或拮抗通过ZcytoR14进行的信号转导也可有益于胰腺、肾、垂体和神经元细胞的疾病。可有益于IDDM、NIDDM、胰腺炎和胰腺癌。ZcytoR14可用作癌症的MAb治疗法的靶，其中拮抗性MAb可抑制癌症生长并靶向免疫介导的杀伤。(Holliger P，和Hoogenboom，H： Nature Biotech.  16：1015-1016，1998)。抗可溶性ZcytoR14的Mab也可用于治疗肾病例如肾小球肾炎(glomerulosclerosis)、膜神经病(membranous neuropathy)、淀粉样变性病(其也影响肾脏和其他组织)、肾动脉硬化症、各种来源的肾小球肾炎、肾的纤维化增殖(fibroproliferative)疾病以及和SLE、IDDM、II型糖尿病(NIDDM)关联的肾功能障碍、肾肿瘤和其他疾病。
3)在自身免疫疾病例如IDDM、MS、SLE、重症肌无力、类风湿性关节炎和IBD的治疗中促进、增强、增加或启动通过IL-17A或IL-17F受体进行的信号转导。抗ZcytoR14中和抗体和单克隆抗体可为淋巴细胞或其他免疫细胞提供信号以进行分化、改变增殖或改变改善自身免疫性的细胞因子或细胞表面蛋白的产量。明确地，对细胞因子分泌的其它模式作出反应的T辅助细胞应答的调控可脱离自身免疫应答从而改善疾病(Smith JA等人， J.Immunol.  160：4841-4849，1998)。类似地，可使用激动性的抗可溶性ZcytoR14单体、同型二聚体、异二聚体和多聚体的单克隆抗体进行信号转导、消除和脱离参与哮喘、过敏和特应性疾病的免疫细胞。通过ZcytoR14的信号转导也可有利于胰腺、肾脏、垂体和神经元细胞的疾病。可有益于IDDM、NIDDM、胰腺炎和胰腺癌。ZcytoR14可作为胰腺癌的MAb治疗的靶，其中发信号的MAb抑制癌的生长和靶向免疫介导的杀伤(Tutt，AL等人， J Immunol.161：3175-3185，1998)。类似地可用抗本发明的包含ZcytoR14的可溶性受体的单克隆抗体治疗肾细胞癌。
可使用此处描述的可溶性ZcytoR14多肽在上述的自身免疫疾病，特应性疾病、NIDDM、胰腺炎和肾功能障碍的治疗中结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17F或IL-17A的活性(单独地或一起地)。可使用ZcytoR14的可溶性形式提高由Th细胞介导的抗体反应和/或提高淋巴细胞或其他免疫细胞的IL-4或其他细胞因子的产量。
本发明的可溶性的包含ZcytoR14的受体用作IL-17A或IL-17F细胞因子的拮抗剂。可通过IL-17A或IL-17F的直接中和或结合获得该拮抗性效果。除了拮抗性用途外，本发明的可溶性受体可结合IL-17F并用作IL-17A或IL-17F细胞因子的载体蛋白以将所述配体转运至身体内的不同组织、器官和细胞。这样，可将本发明的可溶性受体融合或偶联至这样的分子、多肽或化学部分，所述分子、多肽或化学部分指导可溶性受体-配体复合物至特定的位置，例如组织、特定的免疫细胞或肿瘤。例如，在急性感染或一些癌症中，有利方面可产生自通过IL-17F的作用诱导的炎症和局部急性期反应蛋白。因此，本发明的可溶性受体可用于特异性地指导IL-17A或IL-17F的作用。参见，Cosman，D. Cytokine  5：95-106，1993；和Fernandez-Botran，R.Exp.Opin.Invest.Drugs  9：497-513，2000。
此外，本发明的可溶性受体可用于稳定IL-17F或IL-17A，从而通过稳定配体免受降解或清除或通过将配体靶向身体内的作用位点来增加生物利用率、治疗时间和/或配体的功效。例如天然发生的IL-6/可溶性IL-6R复合物稳定IL-6并可通过gp130受体进行信号转导。参见，Cosman，D. 同上，和Fernandez-Botran，R. 同上。此外，可将ZcytoR14和关联配体例如IL-17F一起用于形成配体/可溶性受体复合物。这些复合物可用于刺激来自呈递伴侣受体亚基例如pDIRS1(IL-17ARB)或CRF2-4(IL-10RB)的细胞的应答。ZcytoR14/配体复合物的细胞特异性和看到的针对单独施用的配体的特异性不同。此外，复合物可具有不同的药物代谢动力学特性例如作用半衰期、剂量/反应和器官或组织特异性。因此ZcytoR14/IL-17F或ZcytoR14/IL-17A复合物可具有增强免疫反应或刺激肾小球膜细胞或刺激肝细胞的激动剂活性。可选择地，只有表达和复合物二聚化的参与信号转导的亚基的组织可受到和对IL6/IL6R复合物的应答相似的影响(Hirota H.等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.  92：4862-4866，1995；Hirano，T.inThomason，A.(Ed.)”The Cytokine Handbook”，第3版，p.208-209).IL-12和CNTF的可溶性受体/细胞因子复合物展示了相似的活性。
此外，炎症是生物抵抗侵入物的保护性反应。炎症是涉及许多细胞和体液介质的级联反应事件。在一个方面，炎症反应的抑制可造成宿主免疫受损；然而，如果对其不加抑制，炎症可导致严重的并发症，包括慢性炎性疾病(例如，牛皮癣、关节炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎性肠病等)、脓毒性休克和多器官衰竭。重要的是，这些不同的疾病状态具有共同的炎症介质。特征在于炎症的疾病集合对人发病率和死亡率具有极大的影响。因此很清楚，消炎蛋白，例如ZcytoR14和抗ZcytoR14抗体，对大量的人和动物疾病(从哮喘和过敏至自身免疫性和脓毒性休克)具有至关重要的治疗潜能。
1. 关节炎
关节炎，包括骨关节炎、类风湿性关节炎、损伤引起的关节炎关节等，是可从使用消炎蛋白例如本发明的ZcytoR14多肽的治疗受益的常见炎性病状。例如，类风湿性关节炎(RA)是影响整个身体的全身性疾病，其是最普遍的关节炎形式中的一种。其特征在于关节滑膜的炎症，该炎症导致疼痛、强直、温热、发红和肿胀。炎症细胞释放可降解骨和软骨的酶。作为类风湿性关节炎的结果，发炎的关节衬里(jointlining)，滑膜，可侵入和破坏骨和软骨，导致关节损坏、严重疼痛和其他生理学效应。被影响的关节可丧失其形状和排列，导致疼痛和丧失活动能力。
类风湿性关节炎(RA)是免疫介导的疾病，其特征明确地在于导致重度残疾和增加的死亡率的炎症和随后的组织破坏。各种细胞因子局部地产生于患风湿症的关节。大量研究已证明IL-1和TNF-α，两种原型促炎细胞因子，在参与滑液炎症和渐进性关节损毁的机制中起着重要作用。事实上，在患有RA的患者中施用TNF-α和IL-1抑制剂已导致炎症的临床和生物学体征的显著提高和骨质侵蚀和软骨破坏的放射学体征的降低。然而，尽管存在这些鼓舞人心的结果，显著百分比的患者不对这些试剂起反应，暗示着其他介质也参与关节炎的病理生理学(Gabay， Expert.Opin.Biol.Ther.  2(2)：135-149，2002)。这些介质中的一种可以是IL-17A或IL-17F，这样，结合或抑制IL-17F或IL-17A活性的分子，例如可溶性ZcytoR14、ZcytoR14多肽、或抗ZcytoR14抗体或结合伴侣，可用作在类风湿性关节炎和其他关节炎疾病中减少炎症的有价值的治疗剂。
存在本领域内已知的类风湿关节炎的几种动物模型。例如，在胶原诱导的关节炎(CIA)模型中，小鼠发展和人类类风湿性关节炎非常相似的慢性炎性关节炎。因为CIA和RA共有相似的免疫学和病理学特征，所以这使其成为筛选潜在的人消炎化合物的理想模型。CIA模型在小鼠中是个熟知的模型，其发生依赖于免疫应答和炎症应答。所述免疫应答包括对作为抗原提供的胶原起反应的B细胞和CD4+T细胞之间的相互作用，并导致抗胶原抗体的产生。炎症相是组织对炎症的介质的应答的结果，是这些抗体中的一些抗体和小鼠的天然胶原发生交叉反应并激活补体的级联反应的结果。使用CIA模型的有利方面是发病机理的基本机制是已知的。已鉴定了II型胶原上的相关T细胞和B细胞表位，已确定了和免疫介导的关节炎相关的免疫学参数(例如，延迟型过敏和抗胶原抗体)和炎症参数(例如，细胞因子、趋化因子和降解基质的酶)，因此其可用于在CIA模型中评价受试化合物的功效(Wooley，Curr.Opin.Rheum.3：407-20，1999；Williams等人， Immunol.89：9784-788，1992；Myers等人， Life Sci.  61：1861-78，1997；和Wang等人， Immunol.  92：8955-959，1995)。
一个研究小组已显示，相对于对照小鼠，抗小鼠IL-17抗体减轻小鼠CIA模型中的症状，从而在概念上显示可溶性Zcytor14-Fc在治疗人疾病上是有益的。当预防性地引入关节炎时或在关节炎的症状已存在于模型中后，单独地施用小鼠-IL-17-特异性大鼠抗血清减轻了动物中的关节炎症状(Lubberts等人， Arthritis Rheum.  50：650-9，2004)。因此，可在特定的人疾病例如关节炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、内毒素血症、炎性肠病(IBD)、结肠炎和此处公开的其他炎性病症的治疗中使用Zcytor14-Fc中和IL-17A和/或IL-17F。
给这些CIA模型小鼠施用可溶性的包含ZcytoR14的多肽(ZcytoR14)，例如ZcytoR14-Fc4或其他ZcytoR14可溶性和融合蛋白，被用于评估可溶性ZcytoR14(作为用于减轻症状和改变疾病的病程的IL-17F的拮抗剂)的用途。此外，显示IL-17F被ZcytoR14抑制的结果可提供这样的概念的证据，所述概念是，其他IL-17F拮抗剂，例如可溶性ZcytoR14或针对其的中和抗体，也可用于改善疾病的症状和改变疾病的病程。此外，因为IL-17A和/或IL-17F诱导参与类风湿性关节炎的发病机理和进程的IL-1b和TNF-a的产生，所以可溶性的包含ZcytoR14的多肽，例如ZcytoR14-Fc4或其他IL-17F可溶性受体(例如，ZcytoR14；SEQ ID NO：3)和抗ZcytoR14抗体以及融合蛋白的施用可潜在地抑制RA中的炎症应答。通过示例但非限定性示例说明，每只小鼠10-200ug Zcytor14-Fc的注射(通过皮下、腹膜内、或肌内给药途径每周进行1至7次注射，进行长达4周，但不限于4周)可显著地降低疾病评分(爪评分、发炎率或发病率)。依赖于Zcytor14-Fc施用的启动(例如在胶原免疫之前或之时，或在第二次胶原免疫之后的任何那些时间上，包括疾病已经发展的那些时间点)，Zcytor14在预防类风湿性关节炎和阻断其进展上可以是有效的。其他潜在的治疗剂包括ZcytoR14多肽、抗ZcytoR14抗体或抗IL-17F抗体或结合伴侣等。
2. 内毒素血症
内毒素血症是通常由传染因子例如细菌和其他传染性疾病因子、脓毒症、中毒性休克综合征造成的重症，或是遭受机会感染等的免疫受损患者中的重症。消炎蛋白例如本发明的ZcytoR14多肽和抗体的治疗性用途可有助于预防和治疗人和动物中的内毒素血症。ZcytoR14多肽或抗ZcytoR14抗体或结合伴侣，可用作在内毒素血症中减轻炎症和病理效应的有价值的治疗剂。
脂多糖(LPS)诱导的内毒素血症涉及许多在传染性疾病中产生病理效应的促炎介质的参与，啮齿类动物中的LPS诱导的内毒素血症是被广泛使用和接受的用于研究潜在的促炎因子或免疫调节剂的药理学效应的模型。革兰氏阴性细菌产生的LPS在脓毒性休克的发病机理中是主要的致病因子(Glausner等人， Lancet  338：732，1991)。事实上可通过给动物单次注射LPS实验式地诱导休克样状态。由对LPS起反应的细胞产生的分子可直接或间接地靶向病原体。尽管这些生物学应答保护宿主免受侵入性病原体，但其也可能产生有害方面。因此，作为重度革兰氏阴性细菌感染的结果发生的先天免疫的巨大刺激，导致细胞因子和其他分子的过量产生，导致致命综合症、脓毒性休克的发生，所述疾病的特征在于发烧、低血压、弥散性血管内凝血和多器官衰竭(Dumitru等人 Cell103：1071-1083，2000)。
LPS的这些毒效应主要和导致多炎症介质的释放的巨噬细胞活化相关。在这些介质中，如通过中和抗TNF抗体的施用(Beutler等人，Science 229：869，1985)预防LPS毒性所表明的，TNF似乎起着至关重要的作用。已很好地确定，给C57B1/6小鼠肺部注射入大肠杆菌LPS将在大约注射后2小时导致循环IL-6、TNF-α、IL-1和急性期蛋白(例如，SAA)的显著增加。LPS的毒性似乎由这些细胞因子介导，因为抗这些介质的被动免疫可导致降低的死亡率(Beutler等人， Science 229：869，1985)。用于预防和/或治疗脓毒性休克的有效的免疫干预策略包括抗TNF mAb、IL-1受体拮抗剂、LIF、IL-10和G-CSF。
给这些LPS诱导的模型施用可溶性的包含ZcytoR14的多肽，例如ZcytoR14-Fc4或其他ZcytoR14可溶性或融合蛋白，可用于评价ZcytoR14改善LPS诱导的疾病的症状和改变其病程的用途。此外，显示IL-17F被ZcytoR14抑制的结果可提供这样的概念的证据，所述概念是，其他IL-17F拮抗剂，例如可溶性ZcytoR14或针对其的抗体，也可用于在LPS诱导的模型中改善症状和改变疾病的病程。所述模型将显示通过LPS注射产生的IL-17F的诱导和通过ZcytoR14多肽进行的疾病的有效治疗。因为LPS诱导可能促进内毒素血症的病理学促炎因子的产生，因此可使用拮抗剂ZcytoR14多肽中和IL-17F活性或其他促炎因子来减轻内毒素血症的症状，例如在内毒素性休克中看到的症状。其他潜在的治疗剂包括ZcytoR14多肽、抗ZcytoR14抗体或结合伴侣等。
3. 炎性肠病IBD
在美国大约有500,000人遭受可影响结肠或直肠(溃疡性结肠炎)或两者或小肠和大肠(克罗恩病)的炎性肠病(IBD)。这些疾病的发病机理不清楚，但其涉及受影响的组织的慢性炎症。ZcytoR14多肽、抗ZcytoR14抗体或结合伴侣可用作在IBD和相关疾病中减轻炎症和病理学效应的有价值的治疗剂。
溃疡性结肠炎(UC)是大肠(通常称为结肠)的炎性疾病，其特征在于结肠的粘膜或最内层衬里(innermost lining)的炎症和溃疡。该炎症经常使结肠排空，导致腹泻。症状包括粪便稀松和关联性腹部绞痛、发烧和体重减轻。尽管UC的确切原因不清楚，但最近的研究表明身体的天然防御系统抵御身体中被身体当作外来物的蛋白(“自身免疫反应”)。可能因为其和消化道内的细菌蛋白相似，这些蛋白可激起或刺激开始破坏结肠衬里的过程。当结肠的衬里被破坏时，溃疡形成释放粘液、脓和血液。疾病通常在直肠区域开始，最终可扩展至整个大肠。炎症的重复发作导致肠壁的加厚和具有瘢痕组织的直肠。结肠组织的死亡或脓毒症可伴随严重的疾病发生。溃疡性结肠炎的症状在严重度上不同，其发病可以是渐进的或是突然的。可通过许多因素包括呼吸道感染或应激引起发作。
尽管目前不能获得治愈UC的方法，但治疗集中在抑制结肠衬里中的异常炎症过程。可获得包括皮质类固醇免疫抑制剂(例如，硫唑嘌呤、巯嘌呤和氨甲蝶呤)和氨基水杨酸的治疗法来治疗疾病。然而，长期使用免疫抑制剂例如皮质类固醇和硫唑嘌呤可导致严重的副作用，包括骨萎缩、白内障、感染以及肝脏和骨髓效应。在其中目前的治疗不成功的患者中，手术是种选择。手术包括切除完整的结肠和直肠。
存在可部分模拟慢性溃疡性结肠炎的几种动物模型。最广泛使用的模型是2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇(TNBS)诱导的结肠炎模型，其诱导结肠中的慢性炎症和溃疡。当通过直肠内滴注法将TNBS导入易感小鼠后，其在结肠粘膜中诱导T细胞介导的免疫应答，在该情况下，导致大片的粘膜炎症，其特征在于T细胞和巨噬细胞通过大肠的整个壁的密集渗透。此外，该组织病理学还伴随着渐进体重减轻(消瘦)、血性腹泻、直肠脱垂和大肠壁加厚(Neurath等人  Intern.Rev.Immunol.19：51-62，2000)。
另一种结肠炎模型使用葡聚糖硫酸钠(DSS)，该葡聚糖硫酸钠诱导急性结肠炎，所述急性结肠炎通过血性腹泻、体重减轻、结肠缩短和伴有嗜中性粒细胞渗透的粘膜溃疡来表现。DSS诱导的结肠炎的组织学特征在于炎症细胞渗透入粘膜固有层(lamina propria)，淋巴样增生、灶性隐窝损伤(focal crypt damage)和上皮溃疡形成。据认为这些变化是由于DSS对上皮的毒害作用和粘膜固有层细胞的吞噬作用以及TNF-α和IFN-γ的产生而产生的。尽管其常用，但关于DSS和人疾病的关联性的机制的几个问题仍未解决。DSS被当作不依赖于T细胞的模型，因为在T细胞缺陷型动物例如SCID小鼠中观察到其效应。
给这些TNBS或DSS模型施用可溶性的包含ZcytoR14的多肽，例如ZcytoR14-Fc4或其他ZcytoR14可溶性和融合蛋白，可用于评价可溶性ZcytoR14改善胃肠疾病的症状和改变其病程的用途。此外，显示IL-17F被ZcytoR14抑制的结果提供了这样的概念的证据，所述概念是，其他IL-17F拮抗剂，例如可溶性ZcytoR14或针对其的抗体，也可用于改善结肠炎/IBD模型中的症状和改变疾病的病程。
4. 牛皮癣
牛皮癣是影响超过七百万美国人的慢性皮肤病。当新的皮肤细胞生长异常，导致发炎的、肿胀的和鳞状斑的皮肤(其中老皮肤未足够快地脱落)时，牛皮癣发生。斑块状银屑病(plaque psoriasis)(最普遍的形式)的特征在于上面覆盖银白色鳞屑的皮肤炎症斑(“损伤”)。牛皮癣可限制在少数斑中或影响中等至大面积的皮肤，最普遍地出现在头皮、膝盖、肘和躯干。尽管其是高度可见的，但牛皮癣不是接触性传染病。该病的发病机理涉及受影响的组织的慢性炎症。ZcytoR14多肽、抗ZcytoR14抗体或结合伴侣可用作减轻牛皮癣、其他炎性皮肤病、皮肤和粘膜过敏以及相关疾病中的炎症和病理效应的有价值的治疗剂。
牛皮癣是T细胞介导的皮肤炎性病症，其可产生极大的不适。其是没有治愈方法和影响所有年龄的人的疾病。牛皮癣影响大约百分之二的欧洲和北美人口。尽管具有轻微牛皮癣的个体通常可用局部药剂控制其疾病，但世界范围内超过一百万患者需要紫外或全身性免疫抑制剂治疗。不幸的是，紫外照射的不方便性和危险性以及许多治疗法的毒性限制了其长期使用。此外，患者通常具有牛皮癣的复发，在一些情况下，在停止免疫抑制剂治疗后立刻出现反弹。
也可在检测IL-17F或IL-17A配体的循环水平的诊断系统内和在急性期炎症应答关联性IL-17F的检测中使用ZcytoR14可溶性受体多肽和针对其的抗体。在相关的实施方案中，特异性结合本发明的ZcytoR14可溶性受体的抗体或其他试剂可用于检测循环受体多肽；反过来，ZcytoR14可溶性受体自身可用于检测循环或局部作用的IL-17F或IL-17A多肽。配体或受体多肽的提高的或降低的水平可以指示病理状况，包括炎症或癌症。已知IL-17F诱导相关的急性期炎症应答。此外，急性期蛋白或分子例如IL-17A或IL-17F的检测可在某些病状中指示慢性炎性病状(例如，哮喘、牛皮癣、类风湿性关节炎、结肠炎、IBD)。这些病状的检测用于帮助疾病的诊断和帮助医生选择恰当的疗法。
可溶性ZcytoR14的子宫内(In utero)给药可用于在疾病模型中通过减少或消除和过量表达IL-17F的IL-17F转基因幼畜(pup)或过量表达IL-17A的IL-17A转基因幼畜相关的表型来显示体内功效。在本领域存在使用拮抗剂例如中和单克隆抗体(mAb)进行子宫内治疗的先例。在一种情况下，B细胞的B-1亚型的产生明显地受到用对于B细胞特异性分子CD19是特异性的mAb治疗怀孕的雌性小鼠的影响(例如，Krop I.等人， Eur.J.Immunol.  26(1)：238-42，1996)。Krop等人在怀孕后的第9天开始用500ug PBS中的大鼠抗小鼠CD19mAb(或大鼠同种型匹配的对照Ab)腹膜内定期注射怀孕小鼠，随后隔日注射直至生产。也在10天大小时用500ug这些抗体注射幼畜一次。在另一种情况下，Tanaka等人发现在使用抗IL-2受体β链的单克隆抗体的子宫内治疗中，完全消除了Thy-1+树突样表皮细胞的产生。IL-2受体的两个不同亚基，即α链(IL-2Rα)和β链(IL-2Rβ)，在整个胚胎胸腺个体发生过程中以几乎相互排斥的方式表达。通过施用抗IL-2Rβ的中和mAb阻断IL-2Rβ(IL-2R的信号转导组分)，导致Thy-1+皮肤树突样表皮细胞的完全和选择性消失。任何其他T细胞亚型的发生都不受损害。这表明IL-2在胚胎Vγ5+细胞和其后代的发生中起着至关重要的作用(参见，Tanaka，T.等人， Int Immunol.  4(4)：487-9，1992)。此外，Schattemann GC等人使用子宫内系统显示PDGF-A是正常鼠类心血管发育所必需。几个证据显示血小板衍生的生长因子A链(PDGF-A)是正常胚胎心血管发育所必需的。将抗PDGF-A中和抗体导入小鼠子宫内蜕膜导致体内PDGF-A配体-受体相互作用选择性中断18-24小时，使得能够确定PDGF-A是否是心血管发育所必需的和需要其的时间(参见，Schattemann GC等人， Dev.Biol.  176(1)：133-42，1996)。这些结果，和本领域中描述的其他结果，提供了拮抗剂例如中和mAbs或可溶性受体可在子宫内引起强效应的证据。类似地，可显示这样的数据，该数据显示可溶性受体的功效和/或在动物模型中在体内用单克隆抗体中和IL-17A和IL-17F以减少或消除在分别过量表达IL-17A和IL-17F的转基因幼畜中发现的皮肤表型的功效。
除了此处描述的其他疾病模型以外，可使用重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠模型测量可溶性ZcytoR14和/或抗ZcytoR14抗体对来源于人牛皮癣病灶的炎症组织的活性。已发展了几种小鼠模型，在所述模型中将人细胞移植入免疫缺陷小鼠(统称为异种移植物模型)；参见，例如，Cattan AR，Douglas E， Leuk.Res.  18：513-22，1994和Flavell，DJ， Hematological Oncology  14：67-82，1996。作为牛皮癣的体内异种移植物模型，将人牛皮癣皮肤组织移植入SCID小鼠模型，并用合适的拮抗剂进行激发。此外，可使用本领域内的其他牛皮癣动物模型评价IL-17A和IL-17F拮抗剂，例如将人牛皮癣皮肤移植物移植入AGR129小鼠模型，并用合适的拮抗剂攻击(例如，参见，Boyman，O.等人， J.Exp.Med. Online publication#20031482，2004，此处引用作为参考)。结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17F或IL-17A和IL-17F一起的活性的可溶性ZcytoR14或抗ZcytoR14抗体是优选的拮抗剂，然而，可在该模型中使用抗IL-17A和抗IL-22抗体(单独地或一起地)、可溶性ZcytoR14以及其他IL-17A和IL-17F的拮抗剂。类似地，可在SCID模型中使用来源于人结肠炎、IBD、关节炎、或其他炎性损伤的组织或细胞来确定此处描述的IL-17A和IL-17F的拮抗剂的消炎性质。
可通过对具有人炎症组织(例如，牛皮癣损伤等)的SCID小鼠或此处描述的其他模型施用抗ZcytoR14抗体或可溶性ZcytoR14化合物来检验这样的疗法，该疗法经设计使用可溶性ZcytoR14、抗ZcytoR14抗体或其衍生物、激动剂、缀合物或变体来消除、延迟或减轻炎症。使用本领域熟知的方法，以在一段时间内在受治疗的群体内增加的消炎效果来测量和通过统计学的方法评价治疗的功效。一些示例性方法包括，但不限于在牛皮癣模型中测量例如表皮厚度、上层真皮中的炎症细胞的数目和角化不全的程度。这些方法在本领域是已知的并且在此处得到描述。例如，参见，Zeigler，M.等人 Lab Invest 81：1253，2001；Zollner，T.M.等人 J.Clin.Invest.  109：671，2002；Yamanaka，N.等人 Microbio.lImmunol.  45：507，2001；Raychaudhuri，S.P.等人 Br.J.Dermatol.  144：931，2001；Boehncke，W.H等人Ar ch.Dermatol.Res.  291：104，1999；Boehncke，W.H等人. J.Invest.Dermatol.  116：596，2001；Nickoloff，B.J.等人 Am.J.Pathol.  146：580，1995；Boehncke，W.H等人 J.Cutan. Pathol.  24：1，1997；Sugai，J.，M.等人 J.Dermatol.Sci.  17：85，1998；和Villadsen L.S.等人 J.Clin.Invest.  112：1571，2003。也要使用熟知的方法例如流式细胞仪(或PCR)在一段时间内监控炎症以对存在于样品中的炎症或损伤细胞数目、IBD的评分(体重减轻、腹泻、直肠出血、结肠长度)、CIA RA模型的爪疾病评分和炎症评分进行定量。例如，适合在该模型中检验的治疗策略包括使用可溶性ZcytoR14、抗ZcytoR14抗体、其他IL-17A和IL-17F拮抗剂(单独地或一起地)、或相关缀合物或基于破坏可溶性ZcytoR14和其配体IL-17A和IL-17F的相互作用的拮抗剂的直接治疗，或基于细胞的疗法，其使用可溶性ZcytoR14或抗ZcytoR14抗体或其衍生物、激动剂、缀合物或变体。
此外，牛皮癣是和增生性表皮角质细胞和浸润性单核细胞(包括CD4+记忆T细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)相关的慢性炎性皮肤病(Christophers， Int.Arch.Allergy Immunol.， 110：199，1996)。目前认为，环境抗原在起始和促进该疾病的病理学中起着重要作用。然而，据认为，对自身抗原的耐受性的丧失介导了牛皮癣的病理学。据认为树突细胞和CD4+T细胞在介导导致病理学的免疫应答的抗原呈递和识别中起着重要作用。我们最近已经发展了基于CD4+CD45RB转移模型(Davenport等人， Internat.Immunopharmacol.， 2：653-672)的牛皮癣模型。给小鼠施用本发明的可溶性ZcytoR14或抗ZcytoR14抗体。疾病评分(皮肤损伤、炎症细胞因子)的抑制表明IL-17A和IL-17F的拮抗剂(例如抗ZcytoR14抗体或ZcytoR14可溶性受体)在牛皮癣中的功效。
5. 特应性皮炎
AD是普通的慢性炎性疾病，其特征在于辅助T细胞亚型2(Th2)的过度活化的细胞因子。尽管不知道AD的确切病因，但其已涉及多个因素，包括极度活跃的Th2免疫应答、自身免疫性、感染、变应原和遗传倾向。疾病的关键特性包括干燥病(皮肤的干燥)、瘙痒症(皮肤的瘙痒)、结膜炎、炎性皮肤损伤、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)感染、提高的血液嗜酸性粒细胞增多症、血清IgE和IgG1的提高、和伴随T细胞、肥大细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞浸润的慢性皮炎。已公认金黄色葡萄球菌的建群使AD恶化和使该皮肤病的慢性永生。
通常在患有哮喘和过敏性鼻炎的患者中发现AD，其通常是过敏性疾病的初始表现。西方国家中大约20％的人口遭受这些过敏性疾病，由于未知原因，发展中国的AD发病率正在上升。AD通常始于儿童时期，其通常可从青春期持续至成人期。目前对于AD的治疗包括局部施用皮质类固醇、口服环孢菌素A、非皮质类固醇免疫抑制剂例如他克莫司(以软膏形式存在的FK506)和干扰素-γ。尽管存在各种AD的治疗法，许多患者的症状并未改善，或其对药物治疗具有不利的反应，存在对其他更有效的治疗剂的研究的需要。本发明的可溶性ZcytoR14多肽和抗ZcytoR14抗体，包括本发明的中和抗人ZcytoR14抗本，可用于在特定的人疾病例如特应性皮炎、炎性皮肤病和此处公开的其他炎性病症的治疗中中和IL-17F和IL-17A。
6. 哮喘
IL-17在变应原诱导的T细胞活化和气道中嗜中性粒细胞流入中起着重要作用。IL-17的受体在气道中表达(Yao，等人.Immunity3：811(1995))，过敏哮喘中IL-17介导的嗜中性粒细胞的募集主要由经IL-17刺激的人支气管上皮细胞(HBECs)和人支气管成纤维细胞产生的化学引诱物IL-8、GRO-α和巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)诱导(Yao，等人J Immuol155：5483(1995))；Molet，等人J AllergyClin Immunol108：430(2001))。IL-17也刺激HBEC释放IL-6、嗜中性粒细胞激活因子(Fossiez，等人，J Exp Med 183：2593(1996)，和Linden等人Int Arch Allergy Immunol126：179(2001))并且已显示其和TNF-α一起协同地延长人嗜中性粒细胞在体外的存活时间(Laan，等人Eur Respir J21：387(2003))。此外，IL-17能够通过其这样的能力在哮喘中放大炎症应答，所述能力是增强参与气道重塑的细胞因子例如促纤维(profibrotic)细胞因子、IL-6和IL-11以及炎症介质粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的分泌的能力(Molet，等人.J Allergy Clin Immunol108：430(2001))。
临床证据显示哮喘的急性、重度恶化和气道中嗜中性粒细胞的募集和活化相关，因此IL-17可能在哮喘中起着重要作用。患有轻度哮喘的患者在游离、可溶性IL-17A蛋白的局部浓度上显示可检测的增加(Molet，等人J Allergy Clin Immunol108：430(2001))，而具有诱导的、重度气道炎症(由于暴露于猪圈(swine confinement)导致的)的健康人志愿者在支气管肺泡位置显示显著增加的游离的、可溶性IL-17A蛋白的浓度(Fossiez，等人，J Exp Med183：2593(1996)，和Linden，等人Int Arch Allergy Immunol126：179(2001))。此外，痰中的IL-17水平已和患有增加的气道高反应性的个体关联Barczyk，等人Respir Med97：726(2003)。
在动物的气道高反应性模型中，致敏小鼠对卵清蛋白的长期吸入导致支气管嗜酸性粒细胞炎症和发炎的肺组织中的IL-17mRNA表达的早期诱导以及支气管中性白细胞增多Hellings，等人Am J Respi CellMol Biol28：42(2003)。抗IL-17单克隆抗体强烈地减少支气管嗜中性粒细胞的流入，但显著地增加支气管肺泡灌洗液和血清中的IL-5水平，加重的变应原诱导的支气管嗜酸性粒细胞的流入，暗示着IL-17A可以参与决定抗原刺激后嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞累积之间的平衡。
在IL-17家族成员中，IL-17F和IL-17A关联最紧密。IL-17F介导的生物学活性和IL-17A的相似，其中IL-17F刺激IL-6、IL-8和G-CSF的产生Hurst，等人J Immunol169：443(2002)。IL-17F也在内皮细胞中诱导IL-2、转化生长因子(TGF)-□和单核细胞趋化蛋白(MCP)的产生Starnes，等人J Immunol167：4137(2001)。类似地，变应原攻击可在患有过敏性哮喘的患者中增加局部IL-17F Kawaguchi，等人J Immunol167：4430(2001)。鼠类肺中的IL-17F的基因递送增加了支气管肺泡位置中的嗜中性粒细胞，而IL-17F的粘膜转移提高了银诱导的肺中性白细胞增多症的水平和对乙酰甲胆碱的气道应答性Oda，等人Am J Respir Crit Care Med171：12(2005)。
除了哮喘以外，几种慢性炎性气道疾病的特征在于气道内的嗜中性粒细胞的招募，已报导IL-17在呼吸器官病症例如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、细菌性肺炎和囊性纤维化的发病机理中起着重要作用(Linden，等人Eur Respir J15：973(2000)，Ye，等人Am J RespirCell Mol Biol25：335(2001)，Rahman，等人Clin Immunol115：268(2005))。可证明抗IL-17A和/或抗IL-17F治疗性分子对于炎症的体外模型中的慢性炎性气道疾病是有效的。IL-17F和/或IL-17A活性的拮抗剂例如ZcytoR14可溶性受体和针对其的抗体(包括本发明的抗人ZcytoR14单克隆和中和抗体)的这样的能力可用于测量这些拮抗剂在防止由于IL-17A和/或F刺激的原因直接产生炎症介质的功效，所述能力是抑制IL-17A和/或IL-17F诱导的来自培养的HBEC或支气管成纤维细胞的细胞因子和趋化因子产生的能力。如果加入针对IL-17F和/或IL-17A的活性的拮抗剂例如ZcytoR14可溶性受体和针对其的抗体(包括本发明的抗人ZcytoR14单克隆和中和抗体)显著地减少炎症介质的产生和表达，那么预期其在和慢性气道炎症关联的炎症方面是有效的。
对于药物用途，配制用于根据常规方法肠胃外特别是静脉内或皮下递送的本发明的可溶性ZcytoR14或抗ZcytoR14抗体。通过例如使用微型泵(mini-pumps)或其他合适的技术进行推注、受控释放或通过在通常1至数小时的时间内的输注进行静脉内给药。一般地，药物制剂包含造血蛋白和药物可接受的载体例如盐水、缓冲盐水、5％的葡萄糖水溶液等。制剂还可包含一种或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、白蛋白以防止蛋白在瓶子表面丢失，等等。当使用这样的组合治疗时，可将细胞因子组合在单一制剂中或以分开的制剂施用。配制的方法在本领域是已知的，公开于例如 Remington′s Pharmaceutical Sciences，Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton PA，1990中，其在此引用作为参考。治疗剂量通常为每天0.1至100mg/kg患者体重、优选地每天0.5-20mg/kg的范围内，由临床医生根据已接受的标准，考虑要治疗的病症的性质和严重度、患者体质等确定确切的剂量。剂量的确定在本领域技术人员的水平之内。通常在化学疗法后或骨髓移植后在长达28天的一段时间内施用蛋白或施用至达到＞20,000/mm3、优选地＞50,000/mm3的血小板计数。更一般地，在一周或更短的时间内，通常在1至3天的时间内施用蛋白。一般地，本发明的可溶性ZcytoR14或抗ZcytoR14抗体的治疗有效量是这样的量，该量在淋巴样或骨髓祖细胞的增殖和/或分化上足以产生临床上显著的增加，该增加表现为成熟细胞(例如血小板或嗜中性粒细胞)的循环水平增加。因此持续治疗血小板病症直至达到至少20,000/mm3、优选地50,000/mm3的血小板计数。本发明的可溶性ZcytoR14或抗ZcytoR14抗体也可以和其他细胞因子例如IL-3、-6和-11、干细胞因子、促红细胞生成素、G-CSF和GM-CSF一起施用。在组合治疗的方案中，其他细胞因子的日剂量一般是：EPO，150U/kg；GM-CSF，5-15lg/kg；IL-3，1-5lg/kg；和G-CSF，1-25lg/kg。使用EPO的组合治疗，特别适合例如具有低EPO水平的贫血患者。
一般地，可溶性ZcytoR14(或ZcytoR14类似物或融合蛋白)或抗ZcytoR14抗体的施用剂量视这些因素如患者的年龄、体重、身高、性别、总体医学状况和以前的医疗史的变化而变化。一般地，想要给接受者提供这样的剂量的可溶性ZcytoR14或抗ZcytoR14抗体，该剂量在从大约1pg/kg至10mg/kg(药剂量/患者体重)的范围之内，尽管也可依照情况施用更低或更高的剂量。
可通过局部导管输注或通过直接的损伤区注射经静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、胸膜内、鞘内途径给受试者施用可溶性ZcytoR14或抗ZcytoR14抗体。当通过注射施用治疗性蛋白时，可通过连续输注或通过一次或多次推注进行施用。
给药的其他途径包括经口、经粘膜、经肺和经皮肤施用。经口给药适合聚酯微球体、玉米醇溶蛋白微球体、类蛋白微球体、聚氰基丙烯酸酯微球体和基于脂质的系统(参见，例如，DiBase和Morrel，“Oral Delivery of Microencapsulated Proteins，”in ProteinDelivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(eds.)，pages255-288(Plenum Press1997))。通过这样的胰岛素施用模式(参见，例如，Hinchcliffe和Illum，Adv.Drug Deliv.Rev.35：199(1999))举例说明鼻内给药的可行性。可制备包含可溶性ZcytoR14或抗ZcytoR14抗体的无水或液体颗粒，在干粉分配器、液体气雾发生器或喷雾器的帮助下将其吸入(例如.，Pettit and Gombotz，TIBTECH16：343(1998)；Patton等人，Adv.Drug Deliv.Rev.35：235(1999))。通过AERX糖尿病治疗系统举例说明该方法，该系统是将雾化的胰岛素递送入肺的手工操纵的电子吸入器。研究已显示在低频超声的帮助下已将大如48,000kDa的蛋白以治疗性浓度递送穿过皮肤，这说明了透皮给药的可行性(Mitragotri等人，Science269：850(1995))。使用电穿孔的透皮给药提供了施用具有ZcytoR14结合活性的分子的另一种方法(Potts等人，Pharm.Biotechnol.10：213(1997))。
可根据已知的方法配制包含可溶性ZcytoR14或抗ZcytoR14抗体的药物组合物以制备药物用途的组合物，由此将治疗性蛋白和药物可接受载体混合在一起。如果物质的施用可被接受者患者耐受，则认为其是“药物可接受的载体”。无菌磷酸缓冲盐是药物可接受载体的一个示例。其他合适的载体对于本领域技术人员来说是熟知的。参见，例如，Gennaro(ed.)，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第19版(Mack Publishing Company 1995)。
为达到治疗目的，以治疗有效量给患者施用可溶性ZcytoR14或抗ZcytoR14抗体分子和药物可接受的载体。如果施用量是生理学显著的，那么本发明的治疗分子和药物可接受的载体的组合被认为以“治疗有效量”施用。如果药剂的存在导致接受者患者的生理学上产生可检测的变化则其是生理学上显著的。例如，如果用于治疗炎症的药剂的存在减缓炎症应答那么其是生理学显著的。
可以液体剂型、气溶胶、或固体剂型提供包含可溶性ZcytoR14(或ZcytoR14类似物或融合蛋白)或中和抗ZcytoR14抗体的药物组合物。以可注射的溶液和口服混悬剂来举例说明液体剂型。示例性固体剂型包括胶囊、片剂和控释剂型。后一种剂型通过微型渗透泵(miniosmotic pumps)和植入体举例说明(Bremer等人，Pharm.Biotechnol.10：239(1997)；Ranade，“Implants in DrugDelivery，”in Drug Delivery Systems，Ranade和Hollinger(eds.)，pages95-123(CRC Press1995)；Bremer等人，“Protein Deliverywith Infusion Pumps，”in Protein Delivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(eds.)，pages239-254(Plenum Press1997)；Yewey等人，“Delivery of Proteins from a Controlled ReleaseInjectable Implant，”in Protein Delivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(eds.)，pages93-117(Plenum Press197))。
脂质体提供了将治疗性多肽经静脉内、腹膜内、鞘内、肌内、皮下、或通过口服给药、吸入、或鼻内给药递送至受试者的一种方法。脂质体是由包围水性区室的一层或多层脂双层构成的微小囊泡(一般参见，Bakker-Woudenberg等人，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(Suppl.1)：S61(1993)，Kim，Drugs46：618(1993)，和Ranade，“Site-Specific Drug Delivery Using Lipos omes asCarrirs，”in Drug Delivery Systems，Ranade和Hollinger(eds.)，pages3-24(CRC Press1995))。脂质体在组成上类似于细胞膜，因此，可安全地施用脂质体，其可被生物降解。依赖于制备的方法，脂质体可以是单层或多层的，脂质体可在大小为0.02μm至大于10μm的直径范围内变化。可将各种药剂封装入脂质体中：疏水性试剂被分配入双层而亲水性试剂被分配入内部水空间(参见，例如，Machy等人，Liposomes In Cell Biology And Pharmacology(John Libbey1987)，和Ostro等人，American J.Hosp.Pharm.46：1576(1989))。此外，可能通过改变脂质体大小、双层的数目、脂质组成以及脂质体的电荷和表面特征来控制被封装的药剂的治疗利用度。
脂质体几乎可吸附至任何类型的细胞，然后慢慢地释放被封装的药物。可选择地，被吸收的脂质体可被吞噬细胞内吞。内吞后，脂质体内降解脂质体脂质，释放被封装的药物(Scherphof等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.446：368(1985))。在经静脉内施用后，小质脂体(0.1至1.0μm)通常被主要位于肝脏和脾脏的网状内皮系统的细胞吸收，而大于3.0μm的脂质体则沉积在肺中。通过网状内皮系统的细胞进行的较小脂质体的该优先吸收已用于将化学治疗剂递送至巨噬细胞和递送至肝脏的肿瘤。
可通过几种方法包括使用大剂量的脂质体颗粒饱和或通过药理学方法选择性地使巨噬细胞失活来避开网状内皮系统(Claassen等人，Biochim.Biophys.Acta 802：428(1984))。此外，已显示将糖脂衍生的或聚乙二醇衍生的磷脂整合入脂质体膜导致网状内皮系统的吸收显著减少(Allen等人，Biochim.Biophys.Acta1068：133(1991)；Allen等人，Biochim.Biophys.Acta1150：9(1993))。
也可通过改变磷脂的组成或通过向脂质体中插入受体或配体来制备靶向特定细胞或器官的脂质体。例如，已使用用高含量的非离子表面活性剂制备的脂质体靶向肝脏(Hayakawa等人，Japanese Patent04-244，018；Kato等人，Biol.Pharm.Bull.16：960(1993))。通过在甲醇中混合大豆磷脂酰胆碱、α-生育酚和乙氧基化氢化蓖麻油(HCO-60)，在真空下浓缩该混合物，然后用水重构该混合物来制备这些制剂。也已显示二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和从大豆产生的豆甾醇糖苷(sterylglucoside)混合物(SG)和胆固醇(Ch)的脂质体制剂靶向肝脏(Shimizu等人，Biol.Pharm.Bull.20：881(1997))。
可选择地，可将各种靶向性配体结合在脂质体的表面，所述配体是例如抗体、抗体片段、糖类、维生素和转运蛋白。例如，可用分枝型半乳糖脂质衍生物修饰脂质体以使其靶向无唾液酸糖蛋白(半乳糖)受体，该受体只在肝细胞的表面表达(Kato和Sugiyama，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.14：287(1997)；Murahashi等人，Biol.Pharm.Bull.20：259(1997))。类似地，Wu等人，Hepatology27：772(1998)，已显示用无唾液酸基胎球蛋白标记脂质体导致缩短的血浆半衰期和极大地增加了肝细胞对无唾液酸基胎球蛋白标记的脂质体的吸收。另一方面，预先注射无唾液酸基胎球蛋白可抑制包含分枝型半乳糖脂质衍生物的脂质体在肝中积累(Murahashi等人，Biol.Pharm.Bull.20：259(1997))。多乌头酸化的人血清白蛋白脂质体提供了用于将脂质体靶向肝细胞的另一种方法(Kamps等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 94：11681(1997))。此外，Geho等人美国专利号4,603,044，描述了导向肝细胞的脂质体囊泡递送系统，其具有对于和肝脏的特化的代谢细胞关联的肝胆管受体的特异性。
在组织寻靶的更普通的方法中，用对于靶细胞表达的配体是特异性的生物素化的抗体预标记该靶细胞(Harasym等人，Adv.Drug Deliv.Rev.32：99(1998))。在游离抗体的血浆清除之后，施用链霉抗生物素缀合的脂质体。在另一个方法中，将靶向性抗体直接附着至脂质体(Harasym等人，Adv.Drug Deliv.Rev.32：99(1998))。
可使用蛋白质微胶囊化的标准技术(参见例如，Anderson等人，Infect.Immun.31：1099(1981)，Anderson等人，Cancer Res.50：1853(1990)，和Cohen等人，Biochim.Biophys.Acta1063：95(1991)，Alving等人“Preparation and Use of Liposomes inImmunological Studies，”in Liposome Technology，第2版，第III卷，Gregoriadis(ed.)，page317(CRC Press1993)，Wassef等人，Meth.Enzymol.149：124(1987))将多肽和抗体封装在脂质体中。如上面所指出的，治疗上有用的脂质体可包含各种组分。例如，脂质体可包含聚(乙二醇)的脂质衍生物(Allen等人，Biochim.Biophys.Acta1150：9(1993))。
已设计了可维持治疗性蛋白的高系统水平的可降解的聚合物微球体。用可降解的聚合物例如聚(丙交酯共乙交酯)(PLG)、聚酐、聚(原酸酯)、非生物可降解的乙基乙酸乙烯酯聚合物制备微球体，其中将蛋白捕获入聚合物中(Gombotz和Pettit，Bioconjugate Chem.6：332(1995)；Ranade，“Role of Polymers in Drug Delivery，”in Drug Delivery Systems，Ranade和Hollinger(eds.)，pages51-93(CRC Press1995)；Roskos和Maskiewicz，“DegradableControlled Release Systems Useful for Protein De livery，”inProtein Delivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(eds.)，pages45-92(Plenum Press1997)；Bartus等人，Science281：1161(1998)；Putney和Burke，Nature Biotechnology 16：153(1998)；Putney，Curr.Opin.Chem.Biol.2：548(1998))。聚乙二醇(PEG)包被的纳米球(nanospheres)也可提供用于治疗性蛋白的静脉内施用的载体(参见，例如，Gref等人，Pharm.Biotechnol.10：.167(1997))。
本发明也涉及经化学修饰的具有结合ZcytoR14的活性的多肽，例如ZcytoR14单体、同型二聚体、异二聚体或多聚体可溶性受体、和ZcytoR14拮抗剂，例如抗ZcytoR14抗体或结合多肽、或中和抗ZcytoR14抗体，所述多肽和上述的聚合物连接。
本领域技术人员可设计其他剂型，例如由Ansel和Popovich，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第5版(Lea&Febiger1990)，Gennaro(ed.)，Remington′sPharmaceutical Sciences，第19版(Mack Publishing Company1995)，和Ranade和Hollinger，Drug Delivery Systems(CRC Press1996)所显示的。
作为说明性示例，可以包含这样的容器的试剂盒提供药物组合物，该容器装有具有ZcytoR14的细胞外结构域的多肽，例如ZcytoR14单体、同型二聚体、异二聚体或多聚体可溶性受体、或ZcytoR14的拮抗剂(例如，结合ZcytoR14多肽的抗体或抗体片段，或中和抗ZcytoR14抗体)。可以用于单剂或多剂的可注射溶液的剂型提供治疗性多肽，或以在注射前进行重构的无菌粉末的形式提供。可选择地，这样的试剂盒可包含干粉分配器、液体气雾发生器或用于施用治疗性多肽的喷雾器。这样的试剂盒还可包含关于药物组合物的适应症和应用的书面资料。此外，这些资料可包括这样的声明，即在具有已知的对ZcytoR14有过敏反应的患者中禁用ZcytoR14组合物。
可以液体剂型、气溶胶或固体剂型提供这样的药物组合物，该药物组合物包含抗ZcytoR14抗体或结合伴侣(或抗ZcytoR14抗体片段、抗体融合物、人源化抗体等)、或ZcytoR14可溶性受体。通过可注射的溶液、气溶胶、微滴(droplets)、拓扑(topological)溶液和口服悬混剂举例说明液体剂型。示例性固体剂型包括胶囊、片剂和控释剂型。通过微型渗透泵和植入体(Bremer等人， Pharm.Biotechnol.10：239(1997)；Ranade，“Implants in Drug Delivery”，in Drug DeliverySystems，Ranade和Hollinger(eds.)，pages95-123(CRC Press1995)；Bremer等人，“Protein Delivery with Infusion Pumps，”in Protein Delivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(eds.)，pages239-254(Plenum Pres1997)；Yewey等人，  “Delivery ofProteins from a Controlled Release Injectable Implant，”inProtein Delivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(eds.)，pages93-117(Plenum Press1997))举例说明固体剂型。其他固体剂型包括乳脂、糊剂、其他局部应用的等。
脂质体提供了将治疗性多肽经静脉内、腹膜内、鞘内、肌内、皮下、或通过口服给药、吸入、或鼻内给药递送至受试者的一种方法。脂质体是由包围水性区室的一层或多层脂质双层构成的微小囊泡(一般参见，Bakker-Woudenberg等人，Eur.J Cin.Microbiol.Infect.Dis.129(Suppl.1)：S61(1993)，Kim，Drugs46：618(1993)，和Ranade，“Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes asCarriers，”in Drug Delivery Systems，Ranade和Hollinger(eds.)，pages3-24(CRC Press1995))。脂质体在组成上类似于细胞膜，因此，可安全地施用脂质体，其可被生物降解。依赖于制备的方法，脂质体可以是单层或多层的，脂质体可在大小为0.02μM至大于10μm的直径范围内变化。可将各种药剂封装入脂质体中：疏水性试剂被分配入双层而亲水性试剂分被配入内部水空间(参见，例如，Machy等人，Liposomes In Cell Biology And Pharmacology(John Libbey1987)，和Ostro等人，American J.Hosp.Pharm.46：1576(1989))。此外，可能通过改变脂质体大小、脂双层的数目、脂质组成以及脂质体的电荷和表面特征来控制被封装的药剂的治疗利用度。
脂质体几乎可吸附至任何类型的细胞，然后慢慢地释放被封装的药物。可选择地，被吸收的脂质体可被吞噬细胞内吞。内吞后，脂质体内降解脂质体脂质，释放被封装的药物(Scherphof等人，Ann.N.Y.Acad..Sci.446：368(1985))。在经静脉内给药后，小质脂体(0.1至1.0μm)通常被主要位于肝脏和脾脏的网状内皮系统的细胞吸收，而大于3.0μm的脂质体则沉积在肺中。通过网状内皮系统的细胞进行的较小脂质体的该优先吸收已用于将化学治疗剂递送至巨噬细胞和递送至肝脏的肿瘤。
可通过几种方法包括使用大剂量的脂质体颗粒饱和或通过药理学方法选择性地使巨噬细胞失活来避开网状内皮系统(Claassen等人，Biochim.Biophys.Acta 802：428(1984))。此外，已显示将糖脂衍生的或聚乙二醇衍生的磷脂整合入脂质体膜导致网状内皮系统的吸收显著减少(Allen等人，Biochim.Biophys.Acta1068：133(1991)；Allen等人，Biochim.Biophys.Acta1150：9(1993))。
也可通过改变磷脂的组成或通过向脂质体中插入受体或配体来制备靶向特定细胞或器官的脂质体。例如，已使用用高含量的非离子表面活性剂制备的脂质体靶向肝脏(Hayakawa等人，Japanese Patent04-244，018；Kato等人，Biol.Pham.Bull.16：960(1993))。通过在甲醇中混合大豆磷脂酰胆碱、α-生育酚和乙氧基化氢化蓖麻油(HCO-60)，在真空下浓缩该混合物，然后用水重构该混合物来制备这些制剂。也已显示二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和从大豆产生的豆甾醇糖苷混合物(SG)和胆固醇(Ch)的脂质体将制剂靶向肝脏(Shimizu等人，Biol.Pharm.Bull.20：881(1997))。
可选择地，可将各种靶向性配体结合在脂质体的表面，所述配体是例如抗体、抗体片段、糖类、维生素和转运蛋白。例如，可用分枝型半乳糖脂质衍生物修饰脂质体以使其靶向无唾液酸糖蛋白(半乳糖)受体，该受体只在肝细胞的表面表达(Kato和Sugiyama，Crit.ReivTher.Drug carrier Syst.14：287(1997)；Muraha shi等人，Biol.Pharm.Bull.20：259(1997))。类似地，Wu等人，Hepatology27：772(1998)，已显示用无唾液酸基胎球蛋白标记脂质体导致缩短的血浆半衰期和极大地增加了肝细胞对无唾液酸基胎球蛋白标记的脂质体的吸收。另一方面，预先注射无唾液酸基胎球蛋白可抑制包含分枝型的半乳糖脂质衍生物的脂质体在肝中积累(Murahashi等人，Biol.Pharm.Bull.20：259(1997))。多乌头酸化的人血清白蛋白脂质体提供了用于将脂质体靶向肝细胞的另一种方法(Kamps等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 94：11681(1997))。此外，Geho等人美国专利号4,60304，描述了指向肝细胞的脂质体小囊泡递送系统，其具有对于和特化肝代谢细胞结合的肝胆管受体的特异性。
在组织寻靶的更普通的方法中，用对于由靶细胞表达的配体是特异性的生物素化的抗体预标记该靶细胞(Harasym等人，Adv.DrugDeliv.Rev. 32：99(1998))。在游离抗体的血浆清除之后，施用经链霉抗生物素缀合的脂质体。在另一个方法中，将靶向性抗体直接附着至脂质体(Harasym等人，Adv.Drug Deliv.Rev.32：99(1998))。
可使用蛋白质微胶囊化的标准技术(参见例如，Anderson等人，Infect.Immun.31：1099(1981)，Anderson等人，CancerRes.50：1853(1990)，和Cohen等人，Biochim.Biophys.Acta 1063：95(1991)，Alving等人“Preparation and Use of Liposomes inImmunological Studies，”in Liposome Technology，第2版，第III卷，Gregoriadis(ed.)，page317(CRC Press1993)，Wassef等人，Meth.Enzymol.149：124(1987))将抗ZcytoR14中和抗体和具有IL-17F或IL-17A结合活性的结合伴侣、或ZcytoR14可溶性受体封装在脂质体中。如上面所指出的，治疗上有用的脂质体可包含各种组分。例如，脂质体可包含聚(乙二醇)的脂质衍生物(Allen等人，Biochim.Biophys.Acta1150：9(1993))。
已设计了可维持治疗性蛋白的高系统水平的可降解的聚合物微球体。用可降解的聚合物例如聚(丙交酯共乙交酯)(PLG)、聚酐、聚(原酸酯)、非生物可降解的乙基乙酸乙烯酯聚合物制备微球体，其中蛋白被捕获入聚合物中(Gombotz和Pettit，Bioconjugate Chem.6：332(1995)；Ranade，“Role of Polymers in Drug Delivery，”in Drug Delivery Systems，Ranade和Hollinger(eds.)，pages51-93(CRC Press1995)；Roskos和Maskiewicz，“DegradableControlled Release Systems Useful for Prote in Delivery，”inProtein Delivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(eds.)，pages45-92(Plenum Press1997)；Bartus等人，Science281：1161(1998)；Putney和Burke，Nature Biotechnology 16：153(1998)；Putney，Curr.Opin.Chem.Biol.2：548(1998))。聚乙二醇(PEG)包被的纳米球也可提供用于治疗性蛋白的静脉内给药的载体(参见，例如，Gref等人，Pharm.Biotechnol.10：167(1997))。
本发明也涉及经化学修饰的和上述聚合物连接的抗ZcytoR14抗体或结合伴侣，例如抗ZcytoR14抗体或ZcytoR14可溶性受体。
本领域技术人员可设计其他剂型，例如由Ansel和Popovich，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第5版(Lea&Febiger1990)，Gennaro(ed.)，Remington′sPharmaceutical Sciences，第19版(Mack Publishing Company1995)，和Ranade和Hollinger，Drug Delivery Systems(CRC Press1996)所显示的。
本发明也涉及抗IL-17F抗体的组合物，以及使用和包含此处描述的抗体、肽或多肽的方法和治疗剂。这些组合物还可包含载体。所述载体可以是常规的有机或无机载体。载体的示例包括水、缓冲液、醇、丙二醇、聚乙二醇、麻油、玉米油等。
K)转基因小鼠的产生
可将转基因小鼠经基因工程改造以在所有组织中或在组织特异性或组织优先的调控元件的控制下过量表达IL-17F、IL-17A或Zcytor14基因。可使用这些过剩生产者表征由过量表达产生的表型，所述转基因动物可用作由过量IL-17F、IL-17A或Zcytor14导致的人疾病的模型。过量表达这些基因中的任一基因的转基因小鼠也提供了在更大的动物的牛奶或血液中生产Zcytor14例如可溶性Zcytor14的模型生物反应器。用于产生转基因小鼠的方法对于本领域技术人员来说是熟知的(参见，例如，Jacob，“Expression and Knockout ofInterferons in Transgenic Mice，”in Overexpression andKnockout of Cytokines in Transgenic Mice，Jacob(ed.)，pages111-124(Academic Press，Ltd.1994)，Monastersky和Robl(eds.)，Strategies in Transgenic Animal Science(ASM Press1995)，和Abbud和Nilson，“Recombinant Protein Expression in TransgenicMice，”in Gene Expression Systems：Using Nature for the Artof Expression，Fernandez and Hoeffler(eds.)，pages367-397(Academic Press，Inc.1999))。
例如，用于产生表达Zcytor14基因的转基因小鼠的方法可始于成年的、可育的雄性(studs)(B6C3f1，2-8个月大小(Taconic Farms，Germantown，NY))、切除输精管的雄性(duds)(B6D2f1，2-8个月，(Taconic Farms))、青春期前的可育雌性(供体)(B6C3f1，4-5周，(Taconic Farms))和成年可育雌性(接受者)(B6D2f1，2-4个月，(Taconic Farms))。使供体适应一周，然后用大约8IU/小鼠的孕马血清促性腺激素(Pregnant Mare’s Serum gonadotrophin)(SigmaChemical Company；St.Louis，MO)经腹膜内注射供体，46-47小时后，经腹膜内途径注射8IU/小鼠的人体绒毛膜促性腺激素(hCG(Sigma))以诱导超数排卵。在注射激素后将供体与studs交配。通常在hCG注射后13小时内发生排卵。交配后的上午通过阴道塞的存在确认交配。
在手术镜下收集受精卵。收集输卵管，将卵释放入载有透明质酸酶(Sigma)的尿分析法载片中。在透明质酸酶中洗涤卵一次，在已和5％CO2、5％O2和90％N2一起在37℃下温育的Whitten’s W640介质中洗涤二次(由例如Menino和O’Claray，Biol.Reprod.77：159(1986)，和Dienhary和Downs，Zygote4：129(1996)所描述的)。然后将卵贮存在37℃/5％CO2下的温箱中直至显微注射。
将10至20微克的包含编码Zcytor14的序列的质粒DNA线性化、凝胶纯化并以每微升5-10纳克的终浓度悬浮于10mM Tris-HCl(pH7.4)、0.25mM EDTA(pH8.0)中以用于显微注射。例如，编码Zcytor14的序列可编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基21至452的多肽。
将质粒DNA显微注射入存在于由温暖的、CO2平衡的石蜡油覆盖的W640介质的液滴中的收获的卵中。将DNA吸入注射器针头(通过0.75mmID、1mmOD硼硅玻璃毛细管抽吸)，注射入单个卵中。用注射针头穿透各卵，注入一种或两种单倍体前核。
将皮升(picoliter)的DNA注射入前核，抽出注射针头而不接触核仁。重复该方法直至所有卵被注射。将成功地显微注射的卵转移至具有预放气的W640介质的器官组织培养皿中以在37℃/5％CO2的温箱中贮存过夜。
第2天，将2细胞胚胎转移至假孕接受者。在和切除输精管的dud交配后，通过交配塞的存在鉴定所述接受者。麻醉接受者，并对背部左侧进行修剃，然后转移至手术解剖用显微镜。在这样的皮肤上产生小切口并穿透整个肌壁，所述皮肤和肌壁位于由肋架、马鞍和后腿、膝和脾之间的中间位置勾勒的腹部区域的中间位置。将生殖器官由腹中取出并置于小手术单上。将脂肪垫伸展在手术单上，将婴儿小弹簧镊(Roboz，Rockville，MD)系在脂肪垫上并悬挂在小鼠的背部，防止器官滑回体内。
使用装有石蜡油之后是交替的W640和气泡的精细移液管，将来自前一天注射的12-17个健康的2细胞胚胎转移入接受者。隆起的壶腹ampulla位于和占据壶腹和粘液囊(bursa)之间的输卵管，用28g针在输卵管中靠近粘液囊处产生切口，确保不撕裂壶腹或粘液囊。
将移液管移入输卵管中的切口，将胚胎吹入其中，使笫1个气泡脱离移液管。轻轻地将脂肪垫推入腹膜，让生殖器官滑入。用一缝线缝合腹膜壁，用缝合夹闭合皮肤。将小鼠在37℃载物片加温器上恢复最少4小时。
将受者成对地送回笼中，进行19-21天的怀孕。生产后，允许在产后19-21天断奶。区分刚断奶的动物的性别并将其按性别分开放入笼中，用干净的剪刀从尾部剪下0.5cm的活组织检查样品(用于基因分型)。
使用，例如，QIAGEN DNEASY试剂盒按照厂商说明书从尾部剪出物中制备基因组DNA。使用设计用来扩增Zcytor14基因或被导入相同质粒的选择标记基因的引物通过PCR分析基因组DNA。在确定动物是转基因动物后，通过将转基因雌性和野生型雄性、或转基因雄性和一只或两只野生型雌性放在一起使其回交产生近交系。在幼崽出生和断奶后，分离性别，将其少许剪下的尾巴用于基因分型。
为检测转基因在活动物中的表达，进行部分肝切除。手术制备物(surgical prep)由正好在剑突下面的上腹部组成。使用无菌技术，在胸骨下方产生小的1.5-2cm的切口，将肝脏的左侧叶从腹部取出。使用4-0丝线，围绕下叶打结以确保其在体腔外面。使用无创伤夹夹住结，同时将可吸收的Dexon(American Cyanamid；Wayne，N.J.)的第2个环置于靠近第1个结。在Dexon结的远端进行切割，将大约100mg切割的肝组织放入无菌培养皿中。将切下的肝切片转移至14ml聚丙烯圆底管中，在液氮中快速冷冻，然后在干冰中保存。用缝合线和缝合夹将手术位置封闭，手术后将动物的笼子在37℃的加热垫上放置24小时。手术后每天检查动物，在术后7至10天取下缝合夹。使用RNA溶液杂交测定法或聚合酶链式反应检查各转基因小鼠的Zcytor14mRNA的表达水平。
除了产生过量表达IL-17F、IL-17A或Zcytor14的转基因小鼠外，通过基因工程改造产生异常低地表达的或不表达这些基因中的任一基因的转基因小鼠是有用的。这些转基因小鼠提供了和缺乏IL-17F、IL-17A或Zcytor14关联的疾病的有用模型。如上所述，可使用反义基因、核酶基因或外在引导序列基因抑制Zcytor14基因表达。为产生Zcytor14基因表达不足的转基因小鼠，将这些抑制序列靶向Zcytor14mRNA。用于产生具有异常低的特定基因的表达的转基因小鼠的方法对本领域技术人员来说是已知的(参见，例如，Wu等人，“GeneUnderexpression in Cultured Cells and Animals by Antisense DNAand RNA Strategies，”in Methods in Gene Biotechnology，pages205-224(CRC Press1997))。
产生具有极低或无Zcytor14基因表达的转基因小鼠的另一方法是产生这样的小鼠，该小鼠中至少一个正常的Zcytor14等位基因被无功能的Zcytor14基因取代。设计无功能Zcytor14基因的一个方法是在编码Zcytor14的核酸分子中插入另一个基因，例如选择标记基因。用于产生这些所谓的“基因敲除小鼠”的标准方法对于本领域技术人员来说是已知的(参见，例如，Jacob，“Expression and Knockout ofInterferons in Transgenic Mice，”in Overexpression andKnockout of Cytokines in Transgenic Mice，Jacob(ed.)，pages111-124(Academic Press，Ltd.1994)，和Wu等人，“New Strategiesfor Gene Knockout，”in Methods in Gene Biotechnology，pages339-365(CRC Press1997))。
通过下面的非限定性实施例进一步说明本发明。
实施例
实施例1
ZcytoR14基因的表达
使用Human Multiple Tissue Blots(CLONTECH Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)进行Northern分析。从通过凝胶纯化的PCR产物中产生2种探针。使用ZC21798(5′CGG CGT GGT GGT CTT GCT CTT3′；SEQ ID NO：8)和ZC21808(5′TCC CGT CCC CCG CCC CAG GTC 3′；SEQ ID NO：31)作为引物制备第一探针。使用购自Amersham(Arlington Heights，IL)的Multiprime标记试剂盒，按照厂商实验方案放射性标记探针。使用NUCTRAP push柱子(STRATAGENE，LaJolla，CA)纯化探针。将EXPRESSHYB(CLONTECH)溶液用作northern印迹法的预杂交和杂交溶液。在65℃进行杂交过夜。杂交后，如下在含有0.1％SDS和SSC的溶液中洗涤印迹，每次30分钟：在室温下在2xSSC中洗涤2次，在50℃下在0.1x SSC中洗涤3次，在55℃下在0.1x SSC中洗涤1次，和在65℃下在0.1x SSC中洗涤1次。结果证明ZcytoR14基因在甲状腺、肾上腺、前列腺和肝组织中强烈表达，在心脏、小肠、胃和气管组织中以较低程度表达。相反地，在脑、胎盘、肺、骨骼肌、肾、胰腺、脾、胸腺、睾丸、卵巢、结肠、外周血白细胞、脊髓、淋巴结和骨髓中表达极低或不表达。
实施例2
使用PCR确定细胞系组中mRNA的分布
从室内培养的静息和经刺激的细胞系纯化总RNA，使用Qiagen(Valencia，CA)RNeasy试剂盒，按照厂商说明书进行纯化，或使用酸-酚纯化方案(Chomczynski和Sacchi，Analytical Biochemistry，162：156-9，1987)进行纯化。通过将RNA的等分在AgilentBioanalyzer上进行分析来确定RNA的质量。如果RNA显著降解，不将其用于随后的第一链cDNA的生成。通过使用zc41011(5’CTCTCCATCCTTATCTTTCATCAAC 3’；SEQ ID NO：32)和zc410 2(5’CTCTCTGCTGGCTAAACAAAACAC 3’；SEQ ID NO：33)，即扩增基因间基因组DNA的单位点引物，对RNA的等分进行PCR分析来确定污染性基因组DNA的存在。用于污染性基因组DNA测定的PCR条件如下：2.5μl10X缓冲液和0.5μl Advantage2cDNA聚合酶混合物(BDBiosciences Clontech，Palo Alto，CA)、2ul 2.5mM dNTP混合物(Applied Biosystems，Foster City，CA)、2.5μl10X Rediload(Invitrogen，Carlsbad，CA)和0.5μl20uM zc41011和zc41012，于25ul终体积中。循环参数是94℃20”、40个94℃20”60℃1’20”的循环和一个72℃7’的循环。将10ul各反应物接受琼脂糖凝胶电脉，就来自污染性基因组DNA的PCR产物的存在检查凝胶。如果观察到污染性基因组DNA，使用不含DNA的试剂(Ambion，Inc，Austin，TX)按照厂商说明书对总RNA进行DNA酶解，然后如上所述重新检测。只有表现不含污染性基因组DNA的RNA才可用于随后的第一链cDNA的生成。
将来自82个人细胞系的20μg总RNA各自和水生成98μl的体积，然后各分成2个49ul的等分(各包含10μg总RNA)，将其置于2块96孔PCR板中。向各等分加入用于第一链cDNA合成的试剂(Invitrogen First Strand cDNA Synthesis System，Carlsbad，CA)：20μl25mM MgCl2、10ul10X RT缓冲液、10ul0.1M DTT、2μl寡dT、2ul RNAseOut。然后，向来自各细胞系的一个等分加入2μlSuperscript II逆转录酶，向对应的细胞系等分加入2μl H2O使之作为缺少逆转录酶的负对照。如下温育所有样品：25℃10’、42℃50’、70℃15’。将样品分配在深孔板中并用水稀释至1.7ml。使用Multipette(Saigan)设备多次以16.5μl为等分加入96孔PCR板的各孔中，产生大量细胞系统的一次性使用的PCR panel，然后将所述panel密封并在-20℃下贮藏。这些panel中的各孔代表来自在大约100ng总RNA的第一链cDNA。将82个细胞系涂布在2块板上，阵列#118A和#118B。通过使用针对两个广泛表达但只有中等丰度的基因CLTC(网格蛋白)和TFRC(转铁蛋白受体C)的引物对一组panel进行多重PCR测定来确定panel中的第一链cDNA的质量。将0.5ul各网格蛋白引物zc42901(5’CTCATATTGCTCAACTGTGTGAAAAG 3’；SEQ ID NO：34)，zc42902(5’TAGAAGCCACCTGAACACAAATCTG3’；SEQ ID NO：35)，和TFRC引物zc42599(5’ATCTTGCGTTGTATGTTGAAAATCAATT3’；SEQ ID NO：36)，zc42600(5’TTCTCCACCAGGTAAACAAGTCTAC3’；SEQ ID NO：37)与2.5μl10X缓冲液和0.5μl Advantage2cDNA聚合酶混合物(BD BiosciencesClontech，Palo Alto，CA)、2μl2.5mM dNTP混合物(AppliedBiosystems，，Foster City，CA)、2.5μl 10X Rediload(Invitrogen，Carlsbad，CA)混合，并将其加入至阵列#118A和阵列#118B的各小孔。循环参数如下：94℃20”、35个94℃20”、67℃80”的循环和1个72℃7’的循环。将10μl各反应物接受琼脂糖凝胶电泳，就这样的PCR产物的存在对凝胶评分，所述PCR产物是对于各细胞系的+RT小孔是特异性的各基因的PCR产物。
通过在这些针对每个样品的PCR条件下使用有义寡核苷酸ZC42756(5’ctctccaggcccaagtcgtgctct3’；SEQ ID NO：38)和反义寡核苷酸ZC42757(5’ttgtcctgggggcctcgtgtctcc3’；SEQ ID NO：39)进行PCR来测定人第一链cDNA panel中的ZcytoR14的mRNA的表达，所述PCR条件是：2.5μl10X缓冲液和0.5μl advantage2cDNA聚合酶混合物(BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA)、2μl2.5mMdNTP混合物(Applied Biosystems，)、2.5ul10X Rediload(Invitrogen，Carlsbad，CA)和0.5μl20uM各有义和反义引物。循环条件是94℃2’、35个94℃1’、66℃30”、72℃1.5’的循环和1个72℃7’的循环。将10μl各反应物接受琼脂糖凝胶电泳，就ZcytoR14的阳性或阴性表达对凝胶评分。
ZcytoR14mRNA在代表广泛的组织和细胞类型的许多细胞系中广泛地表达。特别地，ZcytoR14在非T细胞外周血细胞系，包括单核细胞、B细胞和骨髓谱系细胞的细胞中持续地表达。此外，ZcytoR14mRNA在来源于皮肤的细胞系中可靠地表达。表达ZcytoR14的其他细胞系是出现在阵列上的所有5个大肠细胞系。
实施例3
使用RT PCR确定小鼠细胞系组中mRNA的分布
从室内培养的60个静息和受刺激的细胞系纯化总RNA，使用Qiagen(Valencia，CA)RNeasy试剂盒，按照厂商说明书进行纯化，或使用酸-酚纯化方案(Chomczynski和Sacchi，AnalyticalBiochemistry，162：156-9，1987)或Trizol reagent方案(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行纯化。
将来自各细胞系的5μg总RNA分配在深孔96孔板中，向各小孔中加125μl3M NaOAc和100μl Pellet Paint(Novagen，Madison，WI))，然后用H2O将终体积调整至1.25ml。使用Multipette(Saigan)设备多次以25μl为等分将RNA混合物分配入96孔PCR板的各孔，然后向各孔加入75ul EtOH，产生大量细胞系的一次性RT PCR panels，然后密封该RT PCR panels并于-20℃下贮藏。通过在6000RPM下在Qiagen(Valencia，CA)96-孔离心机中第一次离心一个panel10’来进行RTPCR筛选。通过将板倒置在吸水纸上除去上清液。用100μl70％EtOH洗涤RNA沉淀物，然后在6000RPM下离心5分钟。再除去上清液，使板风干直至剩余的EtOH蒸发。将RNA沉淀物重悬浮于15μlH2O。
在这些针对每个样品的条件下通过使用zc38910(5’acgaagcccaggtaccagaaagag3’；SEQ ID NO：40)和zc38679(5’aaaagcgccgcagccaagagtagg3’；SEQ ID NO：41)的RT PCR检测小鼠细胞系RNA组中的ZcytoR14mRNA的表达，所述条件是：SuperScriptOne-Step PCR with Platinum Taq试剂盒，Invitrogen，Carlsbad，CA。循环条件是：1个循环：48℃下进行30分钟，94℃下进行2分钟，接着进行35个循环：94℃进行15秒，55℃进行30秒，72℃进行1.5分钟，然后进行1个循环：72℃进行7分钟。将10μl各反应物接受琼脂糖凝胶电泳，就ZcytoR14的阳性或阴性表达对凝胶进行评分。
鼠类ZcytoR14mRNA在几种小鼠细胞系中表达，特别是来源于骨髓的细胞系，包括成骨细胞、脂肪细胞和前脂肪细胞系。此外，小鼠ZcytoR14mRNA存在于几种这样的样品中，所述样品来自内分泌系统例如胰腺间质细胞系、胰岛细胞系和下丘脑、唾液腺和睾丸细胞系。
实施例4
大肠杆菌中产生的IL-17F的重折叠和纯化
A)包函体的分离和pIL-17F的提取
在批量发酵或摇瓶培养中诱导蛋白表达后，在Sorvall浮桶式转头中，在1升的瓶中和3000RPM下离心大肠杆菌液体培养基。使用50mM含有200mM NaCl和5mM EDTA的Tris pH8.0洗涤细胞粘团直至上清液清澈来除去任何培养基污染物。
然后将细胞沉淀物悬浮于冰冷的裂解缓冲液(50mM Tris pH8.0、5mM EDTA、200mM NaCl，10％蔗糖(w/v)、5mM DTT、5mM Benzamidine；)直至在600nm处达到10-20个光密度单位。然后将浆液在冷的APV2000Lab Homogenizer中在8500-9000psi下通过3次，从而产生破裂的细胞裂解物。通过在20,000X G、4℃下离心细胞裂解物1小时回收不溶性级分(包函体)。
将产生自20,000X G离心的包函体沉淀物称重，然后以每克包函体10ml清洗缓冲液将其重悬浮于清洗缓冲液(50mM Tris pH8，包含200mM NaCl、5mM EDTA、5mM DTT、5mM Benzamidine)中。通过用OMNIinternational rotor stator generator匀浆实现完全分散。在4℃、20,000X G下对该悬浮物离心30分钟。重复3-5次清洗循环直至上清液变清。
将最终清洗好的沉淀物溶解在7M的盐酸胍Tris缓冲液(pH8、40mM)和0.1M亚硫酸钠和0.02M连四硫酸钠中。在4℃下通过轻轻地搅拌过夜进行提取和亚硫酸分解反应。在35,000X g、4℃下离心所得的粉红色溶液1小时，将包含可溶性pIL-17F的澄清上清液进行0.45um过滤。
B)pIL-17F重折叠方法
通过滴加稀释入冰冷的重折叠缓冲液(含有55mM MES、10.56mMNaCl、0.44mM KCl、0.055％PEG(3400K)、1.1mm EDTA、20％甘油、0.5M盐酸胍、0.75M 1∶1比例((1mM GSH∶1mM GSSG)的精氨酸和谷胱甘肽氧化还原对)重折叠溶解的、亚硫酸分解的pIL-17F。用HCl将重折叠缓冲液的pH调整至6.5，以100ug/ml的终浓度加入pIL-17F。稀释后，在冷室中慢慢搅拌混合物72小时。
C)产物回收和纯化
在实验室级别的TFF系统中将重折叠的pIL-17F用10kDa截断值的膜浓缩10倍。然后使用0.45微米的膜对其进行过滤，加入醋酸将pH调节至5.1。在用50mM醋酸缓冲液，pH5.1平衡的Pharmacia SPFast Flow柱子上通过阳离子交换层析捕获经pH调节的物质。以1∶5的与平衡缓冲液的线内比例(inline proportioning)以190cm/小时的流速装载pIL-17F。该稀释降低了离子强度，使靶可以有效地结合基质。完成上样后，用平衡缓冲液将柱子洗涤至基线吸光率。在pH5.1下用0.4M的50mM醋酸盐缓冲液中的NaCl洗涤柱子，然后在pH5.1下，用5CV0.4M至1.5M的50mM醋酸盐缓冲液中的NaCl梯度洗脱结合的蛋白。所述蛋白在大约1M NaCl处洗脱，通过洗脱级分的SDSPAGE分析，大约85％为二聚体。混合和浓缩包含pIL-17F的级分以通过大小排阻层析进行最终的纯化和更换缓冲液，所述浓缩使用Amicon搅拌室和10kDa截断值的膜进行。
D)大小排阻缓冲液交换和配制
将浓缩的阳离子混合物(以3-4％的CV体积)以30cm/小时的流速注入在50mM磷酸钠缓冲液和109mM NaCl、pH7.2中平衡的PharmaciaSuperdex75大小排阻柱。将包含产物的对称的洗脱峰在50mM磷酸钠缓冲液和109mM NaCl、pH7.2中稀释至1mg/ml的浓度。将最终的pIL-17F进行0.2微米的无菌过滤、等分并在-80℃下贮藏。最终产率为20％。
实施例5
哺乳动物可溶性ZcytoR14表达构建体的构建
使用编码ZcytoR14多肽(SEQ ID NO：43)的DNA片段(SEQ IDNO：42)、编码mFc1的DNA片段(SEQ ID NO：44)和表达载体pZMP20，通过重叠延伸PCR和同源重组构建包含人ZcytoR14[L21-K451]-mFc1(小鼠BALB/cμ2a Fc)的表达构建体。通过PCR扩增产生所述片段。
编码ZcytoR14[L21-K451]的PCR片段在最优化的组织型纤溶原酶激活物前原分泌前导序列编码区中包含和pZMP20载体序列的5’重叠区、编码[L21-K451]的ZcytoR14细胞外结构域和与mFc1编码区的3’重叠区。PCR扩增反应使用5’寡核苷酸[GTTTCGCTCAGCCAGGAAATCCATGCCGAGTTGAGACGCTTCCGTAGACTGGAGAGGCTTGTGGGGCCT；SEQ ID NO：46]、3’寡核苷酸[TGTGGGCCCTCTGGGCTCCTTGTGGATGTATTTGTC；SEQ ID NO：47]和作为模板的前面产生的ZcytoR14的DNA克隆。
编码mFc1的PCR片段包含和zcytoR14序列重叠的5’、mFc1编码区和在脊髓灰质炎病毒内核糖体进入位点中与pZMP20载体重叠的3’。PCR扩增反应使用5寡核苷酸[GACAAATACATCCACAAGGAGCCCAGAGGGCCCACA；SEQ ID NO：48]、3’寡核苷酸[CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGTCCGGGA；SEQ ID NO：49]和作为模板的前面产生的mFc1的DNA克隆。
PCR扩增反应条件如下：1个循环：94℃，5分钟；35个循环：94℃进行1分钟，然后在55℃下，进行2分钟，然后在72℃进行3分钟；1个循环：72℃，10分钟。将PCR反应混合物在1％的琼脂糖凝胶上进行跑胶，使用QIAquickTMGel Extraction试剂盒(Qiagen，Cat.No.28704)提取对应于预期大小的DNA片段。
通过重叠延伸PCR连接2个PCR片段。在使用5’寡核苷酸[GTTTCGCTCAGCCAGGAAATCCATGCCGAGTTGAGACGCTTCCGTAGACTGGAGAGGCTTGTGGGGCCT；SEQ ID NO：46]和3’寡核苷酸[CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGTCCGGGA；SEQ ID NO：49]的PCR扩增反应中将大约1μl的两种凝胶提取片段中的各片段混合。使用的PCR条件如下：1个循环：94℃，进行5分钟；35个循环：94℃，进行1分钟，然后55℃，进行2分钟，之后72℃，进行3分钟；1个循环：72℃，进行10分钟。将PCR反应混合物在1％的琼脂糖凝胶上跑胶，使用QIAquickTMGel Extraction试剂盒(Qiagen，Cat.No.28704)从凝胶中提取对应于插入物大小的DNA片段。
质粒pZMP20是包含这样的表达盒、大肠杆菌的复制起始位点、哺乳动物选择标记物表达单位和在酿酒酵母(S.cerevisiae.)中进行选择和复制所需的URA3和CEN-ARS序列的哺乳动物表达载体，所述表达盒具有MPSV启动子、用于在酵母重组之前线性化的BglII位点、otPA信号肽序列、来自脊髓灰质炎病毒的内核糖体进入元件、在跨膜结构域的C末端截短的CD8的细胞外结构域，哺乳动物选择标记物表达单位包含SV40启动子、增强子和复制起始位点、DHFR基因以及SV40终止子。
在酵母中和凝胶提取的ZcytoR14[L21-K451]-mFc1 PCR片段重组之前用BglII降解质粒pZMP20，将100μl感受态酵母(酿酒酵母)细胞和10μl ZcytoR14[L21-K451]-mFc1插入物DNA以及100ng BglII降解的pZMP20载体混合，将混合物转移至0.2cm电穿孔小杯中。使用设置为0.75kV(5kV/cm)、∞欧姆和25μF的电源(BioRadLaboratories，Hercules，CA)对酵母/DNA混合物进行电脉冲。向小杯中加入600μl的1.2M的山梨醇，以100μl和300μl的等分将酵母涂板在2个URA-D板上并在30℃下温育。大约72小时后，将来自单块板的Ura+酵母转化子重悬浮在1ml H2O中，短暂离心以沉淀酵母细胞。将细胞沉淀重悬浮于0.5ml裂解缓冲液(2％Triton X-100、1％SDS、100mM NaCl、10mM Tris、pH8.0、1mM EDTA)。将500μl裂解混合物加入至装有250μl用酸洗涤的玻璃珠和300μl酚氯仿的Eppendorf管中，涡旋振荡3分钟，以最大速度在Eppendorf离心机中离心5分钟。将300μl的水相转移至新管，使用600μl乙醇，然后以最大速度离心30分钟来沉淀DNA。将管中溶液轻轻倒出，用1mL70％的乙醇洗涤沉淀。将管中溶液轻轻倒出，将DNA沉淀重悬浮于30μl10mM Tris，pH8.0，1mM EDTA。
使用5μl酵母DNA制剂和50μl大肠杆菌细胞进行电穿孔感受态大肠杆菌细胞(DH12S)的转化。在2.0kV、25μF和400欧姆下对细胞进行电脉冲。电穿孔后，加入1ml SOC(2％BactoTMTryptone(Difco，Detroit，MI)、0.5％酵母提取物(Difco)、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM葡萄糖)，然后以50μl和200μl等分将细胞涂板在2块LB AMP板(LB broth(Lennox)，1.8％BactoTMAgar(Difco)，100mg/L氨苄青霉素)上。
将用于构建体的3个DNA克隆的插入物接受序列分析，选择包含正确序列的一个克隆。按照厂商说明书，使用可商购获得的试剂盒(QIAGEN Plasmid Mega Kit，Qiagen，Valencia，CA)分离大规模的质粒DNA。
实施例6
表达ZcytoR14-CEE、ZcytoR14-CHIS和ZcytoR14-CFLAG的哺乳动物可溶性ZcytoR14表达构建体的构建
使用编码ZcytoR14[L21-K451](SEQ ID NO：42)的DNA片段和表达载体pZMP20，通过PCR和同源重组构建包含人ZcytoR14[L21-K451](其具有C末端标签，Glu-Glu(CEE)、六组氨酸(CHIS)或FLAG(CFLAG))的表达构建体。
编码zcytoR14CEE的PCR片段在最优化的组织型纤溶酶原激活物前原分泌前导序列编码区包含和pZMP20载体序列重叠的5’、编码[L21-K451]的ZcytoR14细胞外结构域、Glu-Glu标签(Glu Glu Tyr MetPro Met Glu；SEQ ID NO：53)的序列、和在脊髓灰质炎病毒内核糖体进入位点区域中与pZMP20载体重叠的3’。PCR扩增反应使用5’寡核苷酸[GTTTCGCTCAGCCAGGAAATCCATGCCGAGTTGAGACGCTTCCGTAGACTGGAGAGGCTTGTGGGGCCT；SEQ ID NO：46]、3’寡核苷酸[CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTATTCCATGGGCATGTATTCTTCCTTGTGGATGTATTTGTC；SEQ ID NO：50]和作为模板的前面产生的ZcytoR14的DNA克隆。
所述PCR扩增反应条件如下：1个循环：94℃，进行5分钟；35个循环：94℃，进行1分钟，然后55℃，进行2分钟，之后72℃，进行3分钟；1个循环：72℃，进行10分钟。将PCR反应混合物在1％的琼脂糖凝胶上跑胶，使用QIAquickTMGel Extraction试剂盒(Qiagen，Cat.No.28704)从凝胶上提取对应于预期大小的DNA片段。
在酵母中和凝胶提取的ZcytoR14CEE PCR片段重组之前用BglII降解质粒pZMP20，将100μl感受态酵母(酿酒酵母)细胞和10μlZcytoR14CEE插入物DNA以及100ngBglII降解的pZMP20载体混合，将混合物转移至0.2cm电穿孔小杯中。使用设置为0.75kV(5kV/cm)、∞欧姆和25μF的电源(BioRad Laboratories，Hercules，CA)对酵母/DNA混合物进行电脉冲。向小杯中加入600μl的1.2M的山梨醇，以100μl和300μl的等分将酵母涂板在2块URA-D板上并在30℃下温育。大约72小时后，将来自单块板的Ura+酵母转化子重悬浮于1mlH2O中，短暂离心以沉淀酵母细胞。将细胞沉淀重悬浮于0.5ml裂解缓冲液(2％Triton X-100、1％SDS、100mM NaCl、10mM Tris、pH8.0、1mM EDTA)。将500μl裂解混合物加入至装有250μl用酸洗涤的玻璃珠和300μl酚氯仿的Eppendorf管中，涡旋振荡3分钟，以最大速度在Eppendorf离心机中离心5分钟。将300μl的水相转移至新管，使用600μl乙醇，然后以最大速度离心30分钟来沉淀DNA。将管中溶液轻轻倒出，用1mL70％的乙醇洗涤沉淀。将管中溶液轻轻倒出，将DNA沉淀重悬浮于30μl10mM Tris，pH8.0，1mM EDTA。
使用5μl酵母DNA制剂和50μl大肠杆菌细胞进行电穿孔感受态大肠杆菌细胞(DH12S)的转化。在2.0kV、25μF和400欧姆下对细胞进行电脉冲。电穿孔后，加入1ml SOC(2％BactoTM Tryptone(Difco，Detroit，MI)、0.5％酵母提取物(Difco)、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM葡萄糖)，然后以50μl和200μl的等分将细胞涂板在2块LB AMP板(LB broth(Lennox)，1.8％BactoTMAgar(Difco)，100mg/L氨苄青霉素)上。
将构建体的3个DNA克隆的插入物接受序列分析，选择包含正确序列的一个克隆。按照厂商说明书，使用可商购获得的试剂盒(QI AGENPlasmid Mega Kit，Qiagen，Valencia，CA)分离大规模的质粒DNA。
使用相同的方法制备具有C末端组氨酸标签(其由Gly Ser GlyGly His His His His His His(ZcytoR14CHIS；SEQ ID NO：51)组成)、C末端FLAG标签(其由Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys(ZcytoR14CFLAG；SEQ ID NO：52)组成)的ZcytoR14。为制备这些构建体，使用3’寡核苷酸[CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGATGTCCACCAGATCCCTTGTGGATGTATTTGTC；SEQ ID NO：54 ]而不是SEQ ID NO：50的3’寡核苷酸产生ZcytoR14CHIS，或使用3’寡核苷酸[CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTACTTATCATCATCATCCTTATAATCGGATCCCTTGTGGATGTATTTGTC；SEQ ID NO：55]产生ZcytoR14CFLAG.。
实施例7
表达ZcytoR14-mFc1融合蛋白、和ZcytoR14-CEE、ZcytoR14-CHIS和ZcytoR14-CFLAG C-末端标记的蛋白的可溶性zcytoR14受体表达构建体的转染和表达
在37℃下用200个单位的PvuI分别降解3组200μg的各可溶性zcytoR14融合蛋白或经标记的表达构建体3个小时，用异丙醇沉淀，在1.5mL微量离心管中离心。将上清液轻轻倒离沉淀物，用1mL70％的乙醇洗涤沉淀物，将其在室温下温育5分钟。在14,000RPM下在微量离心机中离心小管10分钟，将上清液轻轻倒离沉淀物。然后在无菌环境中将沉淀物重悬浮于750μl CHO细胞组织培养基，将其在60℃下温育30分钟，并让其冷却至室温。大约5×106个CHO细胞沉淀在三只管中的每一只管中，使用DNA介质溶液重悬浮所述细胞。将DNA/细胞混合物置于0.4cm小杯中，使用下列参数(950μF、高电容、300V)进行电穿孔。然后取出小杯中的内容物，混合，并用CHO细胞组织培养基稀释至25mL，放入125mL摇瓶中。将摇瓶在37℃、6％CO2下置于振荡器上的培养箱中，在120RPM下进行振荡。
将CHO细胞接受营养选择，然后转入200nM氨甲蝶呤(MTX)进行扩增，之后转入1μM MTX进行扩增。通过Western印迹法确认融合蛋白或被标记的蛋白的表达，扩大CHO细胞的生产以收获细胞进行蛋白的纯化。
实施例8
可溶性zcytoR14的表达
使用ZcytoR14_Tbx的DNA片段和表达载体pZMP40通过同源重组构建包含zcytoR14-Tbx-C(Fc9)(SEQ ID NO：64)的表达质粒。使用引物zc44531和zc44545通过PCR扩增产生所述片段。
PCR片段zcytoR14_Tbx包含部分zcytoR14细胞外结构域编码区，使用前面产生的ZcytoR14的克隆作为模板产生该PCR片段。所述片段包括在otPA编码区中和pZMP40载体序列重叠的5’、ZcytoR14片段(SEQ ID NO：2的氨基酸残基21至451)、连接体序列、凝血酶切割位点和在Fc9编码区中与pZMP40载体重叠的3’。所用的PCR条件如下：1个循环，94℃，进行5分钟；35个循环，94℃，进行1分钟，然后55℃，进行2分钟，之后72℃，进行3分钟；1个循环：72℃，进行10分钟。
将PCR反应混合物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，使用QIAquickTMGel Extraction试剂盒(Qiagen，Cat.No.28704)从凝胶提取对应于插入物大小的条带。
质粒pZMP40是这样的哺乳动物表达载体，其包含这样的表达盒、来自脊髓灰质炎病毒的内核糖体进入位点(IRES)元件和在跨膜结构域的C末端截断的CD8的细胞外结构域、大肠杆菌复制起始位点、这样的哺乳动物选择标记表达单位和在酿酒酵母中进行选择和复制所必需的URA3和CEN-ARS序列，所述表达盒具有MPSV启动子、用于插入编码序列的多个限制位点、otPA信号肽序列和Fc9的序列，所述哺乳动物选择标记表达单位包含SV40启动子、增强子和复制起始位点、DHFR基因以及SV40终止子。其构建自pZMP21(美国专利公开号No.US2003/0232414 A1；保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC#PTA-5266)。
在酵母中和PCR片段重组之前用BglII切开质粒pZMP40。将100μl感受态酵母(酿酒酵母)细胞和10μl插入物DNA(SEQ ID NO：66)以及100ng切开的pZMP40载体独立地混合，将混合物转移至0.2cm电穿孔小杯中。使用设置为0.75kV(5kV/cm)、∞欧姆和25μF的电源(BioRad Laboratories，Hercules，CA)对酵母/DNA混合物进行电脉冲。向小杯中加入600μl的1.2M的山梨醇，以100μl和300μl的等分将酵母涂板在2块URA-D板上并在30℃下温育。大约72小时后，将来自单块板的ura+酵母转化子重悬浮于1ml H2O中，短暂离心以沉淀酵母细胞。将细胞沉淀重悬浮于0.5ml裂解缓冲液(2％Triton X-100、1％SDS、100mM NaCl、10mM Tris、pH8.0、1mM EDTA)。将500μl裂解混合物加入至装有250μl用酸洗涤的玻璃珠和300μl酚-氯仿的Eppendorf管中，涡旋3分钟，以最大速度在Eppendorf离心机中离心5分钟。将300μl的水相转移至新管，使用600μl乙醇(EtOH)沉淀DNA，然后以最大速度离心30分钟。将管中溶液轻轻倒出，用1mL70％的乙醇洗涤沉淀。将管中溶液轻轻倒出，将DNA沉淀重悬浮于30μl TE中。
使用5μl酵母DNA制剂和50μl细胞进行电穿孔感受态大肠杆菌细胞(DH12S)的转化。在2.0kV、25μF和400欧姆下对细胞进行电脉冲。电穿孔后，加入1ml SOC(2％BactoTM Tryptone(Difco，Detroit，MI)、0.5％酵母提取物(Difco)、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM葡萄糖)，然后以50μl和200μl的等分将细胞涂板在2块LB AMP板(LB broth(Lennox)，1.8％BactoTM Agar(Difco)，100mg/L氨苄青霉素)上。
将构建体的3个克隆的插入物接受序列分析，对于每种构建体，选择包含正确序列的一个克隆。按照厂商说明书，使用可商购获得的试剂盒(QIAGEN Plasmid Mega Kit，Qiagen，Valencia，CA)分离大规模的质粒DNA。
在37℃下用200个单位的PvuI分别降解3组200μg的ZcytoR14[L21-K451]_Tbx_C(Fc9)构建体3小时，然后用IPA沉淀，在1.5mL微量离心管中离心。将上清液轻轻倒离沉淀物，用1mL70％的乙醇洗涤沉淀物，将其在室温下温育5分钟。在14,000RPM下在微量离心机中离心小管10分钟，将上清液轻轻倒离沉淀物。然后在无菌环境中将沉淀物重悬浮于750μl的PF-CHO细胞组织培养基，使之在60℃下温育30分钟，并让其冷却至室温。在三只管中的每一只管中，大约5E6个APFDXB11细胞被离心沉淀，使用DNA介质溶液重悬浮所述细胞。将DNA/细胞混合物置于0.4cm小杯中，使用下列参数(950μF、高电容、和300V)进行电穿孔。然后取出小杯中的内容物，混合，并用PF-CHO培养基稀释至25mL，放入125mL摇瓶中。将瓶子在37℃、6％CO2下置于振荡器上的培养箱中，在120RPM下进行振荡。
将细胞系接受营养物选择，然后转入200nM氨甲蝶呤(MTX)中进行扩增，之后转入1μM MTX中进行扩增。通过Western印迹法确认表达，扩大细胞系的生产，然后纯化蛋白。
实施例9
来自CHO细胞的可溶性ZcytoR14的纯化
使用Pellicon-II切向流系统将来自表达ZcytoR14-TbX-Fc9(SEQ ID NO：64)的CHO细胞的条件化培养基对两个Biomax0.1m230kD分子量截止膜盒(Millipore，Bedford，MA)浓缩大约10倍。用冰醋酸将浓缩的培养基的pH调整至5.5，通过0.2μm的膜进行无菌过滤，然后将其装载至Protein Gsepharose fast flow树脂(Pharmacia，Piscataway，NJ)，在4℃下进行批处理层析过夜。在装载经pH调节的条件化培养基之前，用5倍柱体积(大约150ml)的25mM醋酸钠、150mM NaCl，pH5.5预平衡G蛋白树脂。经过滤的、经pH调节的条件化培养基对树脂的比例是33∶1(v/v)。
在环境温度(大约21℃)下进行批处理层析法。将经批处理的、经pH调节的、0.22μm过滤的、条件化的培养基倒入空的5.5x20.5cm玻璃柱子(BioRad，Hercules，CA)，通过重力填允柱子。使用10倍柱体积(大约300ml)的25mM醋酸钠、150mM NaCl，pH5.5洗涤柱子。然后用100mM甘氨酸，pH2.7对结合的蛋白进行pH洗脱。收集9.0ml的级分，立即用1.0ml2.0M Tris，pH8.0中和。通过SDS-PAGE考马斯染色分析收集的级分。将收集的含zcytoR14-Tbx-Fc9的级分混合，按照厂商说明书，使用5kD分子量截断值的Biomax膜旋转浓缩器(Millipore，Bedford，MA)将其浓缩大约6倍。
然后在4℃下，使用7kD分子量截断值的膜Slide-A-Lyzer(Pierce，Rockford，IL)将混合的、浓缩的级分充分地对1X磷酸缓冲盐溶液，pH7.3(Sigma，St.Louis，MO)进行透析。在等分和在-80℃下贮存前，将1x磷酸缓冲盐溶液pH7.3中配制的ZcytoR14-TbX-Fc9进行0.22μm无菌过滤。
实施例10
IL-17A和IL-17F对人ZcytoR14的结合
A)生物素化的细胞因子对转染的细胞的结合
就其结合生物素化的人IL-17A和IL-17F的能力评估已用编码人IL-17受体(SEQ ID NO：21)、人ZcytoR14(SEQ ID NO：2)或同时编码这两种受体的表达载体转化的幼仓鼠肾(BHK)细胞。用乙二胺四乙酸收获细胞，对细胞计数并将其在染色介质(SM)中稀释至每ml107个细胞，所述染色介质是HBSS和1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)、10mM Hepes和0.1％叠氮化钠(w/v)。将生物素化的人IL-17A(SEQ ID NO：14)和人IL-17F(SEQ ID NO：16)以各种浓度和细胞在冰上温育30分钟。30分钟后，用SM洗去过量的细胞因子，将所述细胞和1∶100稀释的缀合至藻红蛋白的链霉抗生物素(SA-PE)在冰上温育30分钟。洗去过量的SA-PE，通过流式细胞仪分析细胞。根据细胞因子染色的平均荧光强度对细胞因子结合的量进行定量。根据该分析，我们发现人IL-17A以相似的程度结合IL-17R和ZcytoR14。此外，人IL-17F以相似的水平结合ZcytoR14，但以比在IL-17A情况下看到的低得多的水平可检测地结合IL-17R。
B)生物素化的细胞因子对人外周血单核细胞的结合
通过菲柯尔密度梯度离心从全血制备人外周血单核细胞(PBMC)。将每ml107个细胞的PBMC同时和1μg/ml的生物素化的IL-17A或IL-17F以及抗特定细胞表面蛋白的缀合有荧光染料的抗体一起温育，所述抗体经设计用于区分各种白细胞谱系。这些标志物包括CD4、CD8、CD19、CD11b、CD56和CD16。洗去过量的抗体和细胞因子，通过和上述的SA-PE一起温育来检测特定细胞因子的结合。通过流式细胞仪分析样品，通过该分析，我们发现人IL-17A结合几乎所有被检查的PBMC群体，但人IL-17F不能可检测地结合任一群体。
C)生物素化的人IL-17A和IL-17F和未标记的细胞因子的特异性给合的抑制
如上所述进行结合研究，但在结合反应中加入过量的未标记的人IL-17A和IL-17F。在使用BHK细胞的研究中，未标记的细胞因子的量在一定浓度范围内进行变化，我们发现未标记的IL-17A的加入竞争IL-17A和I L-17F与ZcytoR14和IL-17R的结合。然而，未标记的IL-17F竞争IL-17A和IL-17F与ZcytoR14的结合，但不能有效地竞争对IL-17R的结合。这表明IL-17A和IL-17F特异性地结合ZcytoR14，表明其结合相同的或明显重叠的位点，因为其对结合产生交叉竞争。此外，IL-17A竞争IL-17F对IL-17R的相对弱的结合，表明这两种细胞因子也结合IL-17R中的相似区域，但IL-17F结合IL-17R的亲和力相对于ZcytoR14的亲和力要低许多。
D)生物素化的人IL-17A和IL-17F与可溶性zcytoR14和IL-17R的特异性结合的抑制
如上所述进行结合研究，除了在结合反应中加入ZcytoR14或IL-17R的可溶性形式。这些可溶性受体是通过各受体的的细胞外结构域融合至人IgG1恒定(Fc)区产生的融合蛋白。我们发现可溶性ZcytoR14抑制人IL-17A和IL-17F与IL-17R和ZcytoR14转染的BHK细胞的结合。然而，可溶性IL-17R抑制IL-17A与任一受体的结合，但不能有效地阻止IL-17F和ZcytoR14的结合，这和IL-17F对IL-17R的较弱的结合一致。
实施例11
IL-17A和IL-17F结合ZcytoR14
A)使用冷配体(Cold Ligand)的结合抑制
在进行测定前两天，以40,000个细胞/小孔将用hZcytoR14(SEQID NO：2)和IL-17R(SEQ ID NO：21)转染的BHK细胞涂布在24孔板(Costar3527)上。以三份重复独立地向小孔中加入总共250ul/孔的10ng/ml结合缓冲液(RPMI1640培养基(JRH51502-500M)和10mg/ml牛血清白蛋白(Gibco15260-037))中的IL-17A(SEQ ID NO：14)和IL-17F(SEQ ID NO：16)(其已通过碘珠(iodobead)法被放射性标记)。以100倍的摩尔过量加入冷竞争剂。被检验的竞争剂包括IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F和IL-21。在冰上温育小孔1小时，然后用PBS(Invitrogen20012-027)洗涤2次，用高盐溶液(1.5M NaCL、50mM HEPES pH7.4)洗涤1次。在室温下用500ul0.8M NaOH提取小孔30分钟，在γ计数器(Packard Cobra II A5005)中测量每分钟的计数。
该结果显示100x摩尔的冷IL-17A和IL-17F能够减少125I IL-17A对BHK hZcytoR14的结合大约7倍，而IL-17B、C、D、E和IL-21对结合无作用。100x摩尔的冷IL-17A减少125I IL-17A对BHK IL-17R的结合大约4倍，而IL-17B、C、D、E和IL-21对结合无作用。100x摩尔的冷IL-17A和IL-17F减少125I IL-17F对BHK hZcytoR14的结合分别为大约4倍和5倍，而IL-17B、C、D、E和IL-21对结合无作用。
B)使用可溶性受体的结合抑制作用：
如上面第一部分中所述进行hzytor14(SEQ ID NO：2)和IL-17R(SEQ ID NO：21)转染的BHK细胞的结合，但在竞争中用100倍摩尔过量的可溶性hZcytoR14x1/Fc9(实施例8)和可溶性IL-17R/Fc(购自R&D；Ref.177-IR)替代冷配体。如第一部分所述对细胞进行洗涤、提取和计数。
可溶性hZcytoR14/Fc抑制125IL-17F对BHK hZcytoR14的结合，IC50为10X摩尔过量，其获自3个实验的平均值。可溶性hzcytoR14/Fc对相同细胞系中的125I IL-17A的抑制提供了20X摩尔过量的平均IC50，可溶性IL-17R/Fc对125I IL-17A的抑制产生了20X摩尔过量的平均IC50。
C)结合饱和作用
如第一部分所述，将转染的BHK细胞涂布入24孔皿。从4nM的浓度开始，以8个1∶3的稀释度(直至1.83pM)，加入总共250μl/孔的结合缓冲液中的经放射性标记的IL-17A和IL-17F，重复三份。分别地，在各稀释点上加入100倍摩尔过量的冷配体。如第一部分所述对细胞进行洗涤、提取和计数。通过从各稀释点上的无竞争的计数减去100倍过量的计数来将每分钟特异性的计数对加入的放射性标记的配体的浓度作图。将这些规范化的数据作图以产生放射性标记的配体和转染的BHK细胞的各组合的饱和结合曲线。图4显示根据所有三个实验计算的亲和力值。
表4
 125I IL-17A+BHK hZcytoR141.180pM2.200pM3.370pM125I IL-17F+BHK hZcytoR141.50pM2.60pM3.80pM     125I IL-17A+BHK IL-17R1.2.5+/-0.2nM2.4.5+/-0.3nM3.5.9+/-0.1nM125I IL-17F+BHK IL-17R1.非常低的亲和力2.非常低的亲和力3.非常低的亲和力
单位点结合曲线最紧密地符合IL-17A和IL-17F对IL-17R的结合。两位点结合曲线最紧密地符合IL-17A和IL-17F对hZcytoR14的结合。高亲和力结合位点是上面显示的值。低亲和力结合位点具有非常低的亲和力并且在三个实验之间变化很大。
实施例12
鼠类Nih3t3细胞对人IL-17A和IL-17F的应答
A)细胞涂板和kz142腺病毒报告基因的感染.
使用包含谷氨酰胺和补充以丙酮酸盐的DMEM/10％FBS将来源于小鼠成纤维细胞(描述于ATCC)Nih3t3的Nih3t3细胞以5000个细胞/孔涂布在白色固体细胞培养基包被的96孔板(Cat.#3917.Costar)中，并在37℃和5％CO2下培养过夜。第二天，除去涂布培养基，在包含谷氨酰胺和补充以丙酮酸盐的DMEM/1％FBS中制备5000个颗粒/细胞感染复数的Kz142腺病毒颗粒，并在37℃和5％CO2下培养过夜。B)测量kz142腺病毒报告基因感染的nih3t3细胞的IL-17A和F的活化作用的萤光素酶测定法
在用腺病毒颗粒报告基因温育过夜后，在补充28％BSA的无血清培养基中制备人IL-17A和IL-17F配体处理物。除去腺病毒颗粒和培养基，提供合适的配体剂量，重复三份。继续在37℃和5％CO2下温育4小时，之后除去培养基，裂解细胞15分钟，使用萤光素酶测定系统和试剂(Cat.#e1531Promega.Madison，WI.)和微板发光测量计测量平均荧光强度(MFI)。在从.1至1000ng/ml人IL-17A和IL-17F的范围的浓度上检测活性，对于两个配体产生大约50ng/ml的EC50值。这些数据暗示nih3t3细胞具有针对这些配体的受体，和暗示着IL-17A和IL-17F激活NfKb/Ap-1转录因子。
实施例13
鼠类Nih3t3细胞表达IL-17受体和ZcytoR14受体
nih3t3 RNA的RTPCR分析证明，这些细胞对于IL-17受体和ZcytoR14受体是阳性的，这和其对通过这些受体中的一种或两种受体介导的人IL-17A和IL-17F介导作用的nfkb/ap1应答是一致的。
RTPCR详述：
A) 小鼠cytor14 PCR
使用标准的方法从分离自nih3t3细胞的总RNA制备cDNA的第一链。使用热启动聚合酶和按照厂商推荐(Qiagen，Valencia，CA)，使用有义引物，zc38910，5’ACGAAGCCCAGGTACCAGAAAGAG3’(SEQ IDNO：56)和反义引物，zc38679，5’AAAAGCGCCGCAGCCAAGAGTAGG3’(SEQ ID NO：57)以及35个扩增循环进行PCR。琼脂糖电泳显示预期850bp大小的单一的、明显的扩增子。
B) 小鼠IL-17R PCR
使用标准的方法从分离自nih3t3细胞的总RNA制备cDNA的第一链。使用热启动聚合酶和按照厂商推荐(Qiagen，Valencia，CA)，使用有义引物，zc38520，5’CGTAAGCGGTGGCGGTTTTC3’(SEQ ID NO：58)和反义引物，zc38521，5’TGGGCAGGGCACAGTCACAG3’(SEQ ID NO：59)以及35个扩增循环进行PCR。琼脂糖电泳显示预期498bp大小的单一的、明显的扩增子。
实施例14
表达ap1/nfkb转录因子的稳定的Nih3t3测定克隆的建立
用包含新霉素选择标记的kz142ap1/nfkb报告基因构建体稳定地转染上述鼠类nih3t3细胞。将新霉素抗性转染库以克隆密度涂板。使用克隆环分离克隆，使用人IL-17A配体作为诱导物，通过萤光素酶测定法筛选所述克隆。选择具有最高平均荧光强度(MFI)(通过ap1/NfkB萤光素酶)和最低背景的克隆。选择稳定的转染细胞系并命名为nih3t3/kz142.8。
实施例15
使用可溶性ZcytoR14和IL-17受体/FC嵌合物对鼠类Nih3t3细胞中的由人IL-17A和IL-17F产生的活化作用的抑制
在萤光素酶测定法中，使用ZcytoR14或IL-17R的可溶性形式作为apl/nfkb元件的人IL-17A和IL-17F激活作用的拮抗剂。这些可溶性受体是从融合至人IgG1恒定(Fc)区的各受体的细胞外结构域产生的融合蛋白。购买可溶性人IL-17R FC融合蛋白。(重组人IL-17R/FC嵌合体，目录号177-IR-100，R&D Systems，Inc.，Minneapolis，Mn.)。如上所述构建可溶性人ZcytoR14 FC嵌合体(ZcytoR14sR/FC9)。我们发现过量的ZcytoR14sR/FC9和人IL17RsR/FC嵌合体抑制鼠类3t3/kz142.8测定细胞系的ap1/nfkb活化的人IL-17A和IL-17F介导作用的EC50水平。
ZcytoR14sR/FC9蛋白在拮抗IL-17F的激活作用上显示了最大的效力，IL17RsR/FC嵌合体在拮抗IL-17A的激活作用上显示了最大的效力。
实施例16
IL-17F mRNA在哮喘的鼠类模型中被上调
在小鼠的致敏和气道刺激模型中测量IL-17F mRNA的水平。通过在第0和第7天腹膜内注射10ug50％Imject Alum(Pierce)中的重组屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)变应原1(DerP1)(Indoor biotechnologies，Cardiff，UK)来使成组的8至10周大小的小鼠致敏。7天后，在连续的3天(第14、15和16天)中用50ul PBS中的20ug DerP1攻击小鼠。该组有4只小鼠。负对照包括经磷酸缓冲盐溶液(PBS)致敏，然后经PBS攻击的5只小鼠。此外用DerP1致敏3只小鼠，然后用PBS攻击小鼠。在施用变应原或对照攻击后48小时，收获整个肺组织并分离总RNA。
使用相同量的来自各受试者的总RNA制备第一链cDNA。使用Qiagen hotstar聚合酶(Qiagen，Valencia，CA)和根据厂商的推荐进行IL-17F PCR。IL-17F PCR使用35个扩增循环，使用有义引物zc46098，5’ACTTGCCATTCTGAGGGAGGTAGC3’(SEQ ID NO：60)和反义引物46099，5’CACAGGTGCAGCCAACTTTTAGGA3’(SEQ ID NO：61)。为了确定在所有受试者中模板质量是均一的，对相同量的用于IL-17F扩增的各模板使用β肌动蛋白PCR。β肌动蛋白PCR包括25个循环的PCR，使用有义引物zc44779，5’GTGGGCCGCTCTAGGCACCA3’(SEQ IDNO：62)和反义引物zcc44776，5’CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGGG3’(SEQ ID NO：63)。
来自DerP1致敏的、DerP1攻击的处理组(哮喘刺激)的所有4只小鼠显示明显的IL-17F扩增。相反地，从负对照观察到弱的IL-17F扩增，所述负对照包括代表DerP1致敏的/PBS攻击的处理组的3个受试者和来自PBS致敏的/PBS攻击的处理组的5个受试者。负对照的β肌动蛋白扩增至少和哮喘刺激的受试者的一样显著，表明弱的负对照IL-17F的扩增不是由于模板问题造成的。
实施例17
COS细胞转染和分泌物捕获
A) Cos细胞转染和分泌物捕获测定法显示ZcytoR14sR/Fc9和IL-17F 是受体/配体对
使用分泌物捕获测定法将人ZcytoR14(SEQ ID NO：2)和人IL-17F(SEQ ID NO：16)配对。在分泌测定法中，将可溶性ZcytoR14sR/Fc9融合蛋白(实施例8)用作结合剂。将包含人IL-17B、C、D、E和F的cDNA的包含SV40复制起始区的表达载体瞬时转染入COS细胞。使用下面描述的分泌物捕获测定法进行ZcytoR14sR/Fc9对转染的COS细胞的结合。只看到ZcytoR14sR/Fc9对人IL-17F的阳性结合。这些结果证明人ZcytoR14和IL-17F是受体/配体对的新发现。
B) COS细胞转染
如下进行COS细胞转染：将3ul汇集的DNA和5ul LipofectamineTM混合于92ul无血清DMEM培养基(500ml DMEM中的55mg丙酮酸钠、146mg L-谷氨酰胺、5mg转铁蛋白、2.5mg胰岛素、1μg硒和5mg胎球蛋白)，在室温下温育30分钟，然后加入400ul无血清DMEM培养基。将该500ul混合物加入至涂布在12孔组织培养板中的1.5×105COS细胞/孔中并在37℃下温育5小时。加入500ul20％FBS DMEM培养基(100ml FBS、500ml DMEM中的55mg丙酮酸钠和146mg L-谷氨酰胺)并温育过夜。
C) 分泌物捕获测定法
如下进行分泌物捕获：用PBS漂洗细胞以除去培养基，然后用1.8％PBS中的甲醛固定15分钟。然后用TNT(0.1M Tris-HCL、0.15M NaCl和0.05％Tween-20水溶液)洗涤细胞，用0.1％PBS中的Triton-X渗透细胞15分钟，然后再用TNT洗涤细胞。用TNB(0.1M Tris-HCL、0.15M NaCl和0.5％封闭试剂(NEN Renaissance TSA-Direct试剂盒)水溶液)封闭细胞1小时，再用TNT进行洗涤。用1μg/ml人ZcytoR14x1sR/FC9可溶性受体融合蛋白温育细胞1小时。然后用TNT洗涤细胞。用1∶200稀释的山羊抗人Ig-HRP(Fc特异性的)再温育细胞1小时。用TNT再次洗涤细胞。
用在稀释缓冲液(NEN试剂盒)中以1∶50稀释的荧光素酪胺(fluorescein tyramide)试剂检测阳性结合并温育4-6分钟，用TNT洗涤细胞。用在TNT中以1∶5稀释的Vectashield Mounting Media(Vector Labs Burlingame，CA)保存细胞。在荧光显微镜上使用FITC滤镜观察细胞。
实施例18
鼠类抗人ZcytoR14单克隆抗体的产生
A. 用于产生抗ZcytoR14抗体的免疫接种
1. 可溶性ZcytoR14-muFc
按照双周的给药日程，通过腹膜内注射25-50ug可溶性人ZcytoR14-muFc蛋白(实施例23)(该蛋白以1∶1(v∶v)和Ribi佐剂(Sigma)混合)来免疫6至12周大小的未处理的或敲除了ZcytoR14的小鼠。第3次免疫后7至10天，通过眶后放血(retroorbital bleed)采集血液样品，收获血清并就其在中和测定法(例如，此处描述的)中抑制IL-17或IL-17F对ZcytoR14的结合的能力，以及在FACS染色测定法中相对于未转染的293细胞对转染了ZcytoR14的细胞的染色的能力对其进行评价。继续免疫小鼠和采集血样并如上所述进行评价直至中和滴度达到平台。此时，用25-50ug PBS中的可溶性ZcytoR14-Fc蛋白血管内注射具有最高中和滴度的小鼠。3天后，收获来自这些小鼠的脾和淋巴结，将其用于杂交瘤的产生，例如通过使用本领域技术人员已知的标准技术(例如，参见，Kearney，J.F.等人，J Immunol.123：1548-50，1979；和Lane，R.D.J Immunol Methods81：223-8，1985)用小鼠骨髓瘤(P3-X63-Ag8.653.3.12.11)细胞或本领域中其他合适的细胞来产生杂交瘤。
2. 可溶性ZcytoR14、ZcytoR14-CEE、ZcytoR14-CHIS、 ZcytoR14-CFLAG
按照双周的给药日程通过腹膜内注射25-50ug以1∶1(v∶v)和Ribi佐剂(Sigma)混合的可溶性人ZcytoR14-CEE、ZcytoR14-CHIS或ZcytoR14-CFLAG来免疫6至12周大小的未处理的或敲除了ZcytoR14的小鼠。第3次免疫后7至10天，通过眶后放血采集血液样品，收获血清并就其在中和测定法(例如，此处描述的)中抑制IL-17或IL-17F对ZcytoR14的结合的能力，以及在FACS染色测定法中相对于未转染的293细胞对转染了ZcytoR14的细胞的染色的能力对其进行评价。继续免疫小鼠和采集血样并如上所述进行评价直至中和滴度达到平台。此时，用25-50ug PBS中的可溶性ZcytoR14、ZcytoR14-CEE、zcytor-CHIS或ZcytoR14-CFLAG抗原蛋白经血管内途径注射具有最高中和滴度的小鼠。3天后，收获来自这些小鼠的脾和淋巴结，将其用于杂交瘤的产生，例如通过使用本领域技术人员已知的标准技术(例如，参见，Kearney，J.F.等人，J Immunol.123：1548-50，1979；和Lane，R.D.J Immunol Methods 81：223-8，1985)用小鼠骨髓瘤(P3-X63-Ag8.653.3.12.11)细胞或本领域中其他合适的细胞来产生杂交瘤。
3. 表达ZcytoR14的P815转染子
通过腹膜内注射1×105活的、转染的P815细胞，例如P815/ZcytoR14细胞(例如，0.5ml2×105细胞/ml的细胞密度的细胞)免疫6至10周大小的雌性DBA/2小鼠。在注射之前，使细胞保持在指数生长期。为进行注射，收获细胞，用PBS洗涤3次，然后重悬浮于PBS中使密度达到2×105细胞/ml。在该模型中，如果未产生对转染的靶抗原的免疫应答，那么小鼠在2-3周内发生腹水肿瘤并在4-6周进展至死亡。以2-3周的间隔如上所述对在第3周未表现腹部水肿(腹水的标志)的小鼠进行再免疫。第2次免疫后7至10天，通过眶后放血采集血液样品，收获血清并就其在中和测定法(例如，此处描述的)中抑制IL-17或IL-17F对IL-17或ZcytoR14的结合的能力，以及在FACS染色测定法中相对于未转染的293细胞对转染了ZcytoR14的细胞的染色的能力对其进行评价。继续免疫小鼠和采集血样并如上所述进行评价直至中和滴度达到平台。此时，用1×105活的、经转染的P815细胞经腹膜内途径注射具有最高中和滴度的小鼠。4天后，收获来自这些小鼠的脾和淋巴结，将其用于杂交瘤的产生，例如通过使用本领域技术人员已知的标准技术(例如，参见，Kearney，J.F.等人，同上，和Lane，R.D.同上)用小鼠骨髓瘤(P3-X63-Ag8.653.3.12.11)细胞或本领域中其他合适的细胞系来产生杂交瘤。
上面使用活的、经转染的P815细胞的免疫方案的替代方案包括每2-3周腹膜内注射1-5×106经照射的、转染的细胞。在该方法中，没有动物产生腹水和死于腹水。相反地，就中和针对其血清中的ZcytoR14的免疫应答监控动物，所述血清是如上所述始于第2次免疫后的放血产生的血清。在中和滴度已达到最高水平后，给具有最高滴度的小鼠提供5×106经照射的细胞的融合前腹膜内注射，在4天后，收获来自这些小鼠的脾和淋巴结并将其用于杂交瘤的产生，例如通过使用本领域技术人员已知的标准技术(例如，参见，Kearney，J.F.等人，同上，和Lane，R.D.同上)用小鼠骨髓瘤(P3-X63-Ag8.653.3.12.11)细胞或本领域中其他合适的细胞系来产生杂交瘤。
B. 就结合ZcytoR14和抑制IL-17或IL-17F对ZcytoR14的结合的抗 体筛选杂交瘤融合细胞
在融合后8-10天在杂交瘤上清液中进行3个不同的初步筛选。对于第一测定，使用缀合HRP的山羊抗小鼠κ链和抗λ轻链第二步骤试剂进行ELISA，就上清液中的抗体结合板结合的可溶性人ZcytoR14、ZcytoR14-muFc、ZcytoR14-CEE、ZcytoR14-CHIS或ZcytoR14-CFLAG蛋白的能力对所述抗体进行检测，以鉴定结合的小鼠抗体。为证明对ZcytoR14融合蛋白的ZcytoR14部分的特异性，针对融合至相同鼠类的Fc区域(mG2a)、EE序列、HIS序列、或FLAG序列的无关蛋白评价最初的测定法中的阳性上清液。这些上清液中结合ZcytoR14融合蛋白但不结合包含无关的muFc或其他蛋白的融合蛋白序列的抗体被认为对于ZcytoR14是特异的。关于第2测定法，通过ELISA，就其抑制生物素化的IL-17或生物素化的人IL-17F对板结合的ZcytoR14-muFc或ZcytoR14-融合蛋白的结合的能力评价所有杂交瘤上清液中的抗体。
随后就其抑制IL-17或IL-17F对经ZcytoR14转染的Baf3或BHK细胞或正常人支气管上皮细胞的结合的能力对包含特异性结合ZcytoR14的抗体的所有上清液进行检测，无论其在ELISA测定法中抑制IL-17或IL-17F对ZcytoR14的结合与否。随后就其在FACS分析中相对于未转染的Baf3或BHK细胞对经ZcytoR14转染的细胞的染色的能力对所有这样的上清液进行评价，所述上清液在IL-17或IL-17F的抑制测定法中或IL-17和IL-17F一起的抑制测定法中呈中和作用阳性。设计该分析法以确定IL-17或IL-17F对ZcytoR14的结合的抑制确实是由于特异性结合ZcytoR14受体的抗体造成的。此外，因为使用抗IgG第二步骤试剂进行FACS分析，因此特异性的FACS阳性结果表明中和抗体可能属于IgG种类。通过这些方法，分别鉴定了在板结合性ELISA中结合ZcytoR14的master小孔，在基于ELISA的抑制测定法中抑制IL-17或IL-17F对ZcytoR14的结合的master小孔，阻断IL-17和IL-17F与经ZcytoR14转染的Baf3或BHK细胞相互作用的master小孔，所述master小孔对使用抗小鼠IgG第二步骤试剂进行的经ZcytoR14转染的Baf3或BHK细胞的染色呈现明显的阳性。
第3测定法由表达ZcytoR14和可响应IL-17F处理而被诱导分泌IL-8或IL-6的原代人支气管上皮细胞组成。通过其抑制这些细胞在IL-17或IL-17F刺激下产生IL-8或IL-6的能力测定特异性单克隆抗体。测定对此处描述的IL-17或IL-17F起反应的IL-8和IL-6的产生。
可选择地，可将单克隆抗体抗ZcytoR14(其在NIH3T3A或其他包含ZcytoR14的细胞中介导IL-17或IL-17F诱导的萤光素酶的产生的抑制)和上面提到的生物活性中和测定法中的一种一起使用或取代其。此处描述NIH3T3细胞中的NFkB介导的萤光素酶测定法。
C) 克隆产生抗ZcytoR14特异性抗体的杂交瘤
通过标准的低密度稀释(少于每孔1个细胞)法克隆产生这样的特异性抗ZcytoR14mAb的杂交瘤细胞系，所述抗体交叉中和IL-17和IL-17F对适当地转染的BaF3或BHK细胞的结合。在涂板后大约5-7天，通过对例如板结合的人ZcytoR14-muFc进行ELISA，然后通过对上述的包含无关muFc的融合蛋白进行ELISA以对阳性小孔进行重新检测来筛选所述克隆。通过重复中和测定法和FACS分析就特异性抗体活性进一步确定选择的克隆，该克隆的上清液结合ZcytoR14-muFc而不结合包含无关muFc的融合蛋白。克隆所有选择的ZcytoR14抗体阳性克隆最少两次以帮助确保克隆性和确定抗体生产的稳定性。如所描述的进行其他轮的克隆和筛选直至，优选地，至少95％的所得克隆对于中和抗ZcytoR14抗体的产生呈阳性。
D) 由抗ZcytoR14mAbs识别的分子的生物化学特性
通过标准的免疫沉淀法，然后通过SDS-PAGE分析或western印迹法(两者都使用来自经ZcytoR14转染的和未转染的Baf3或BHK细胞的可溶性膜制剂)进行这样的生物化学确认，即被假定的抗ZcytoR14mAb识别的靶分子ZcytoR14确实是ZcytoR14。此外，使用表达ZcytoR14的非转染细胞系的可溶性膜制剂显示：所述mAb识别天然受体链和转染的受体链。可选择地，就其特异性免疫沉淀或western印迹杂交可溶性ZcytoR14-muFc蛋白的能力检测mAb。
实施例19
通过来自用经人ZcytoR14转染的P815细胞注射的小鼠的血清进行的人ZcytoR14的中和
使用基于细胞的中和测定法，以1％、0.5％、0.25％、0.13％、0.06％、0.03％、0.02％和0％的系列稀释度加入来自用活的经人ZcytoR14转染的P815细胞(实施例17)注射的小鼠的血清。在37℃、5％CO2下温育测定板4天，在第4天以20μl/孔的量加入Alamar Blue(Accumed，Chicago，IL)。再将板在37℃、5％CO2下温育16小时。结果显示来自4只动物的血清可中和通过人ZcytoR14进行的huIL-17和huIL-17F的信号转导。
结果例如这些结果提供了其他证据，所述证据证明，通过例如针对本发明的ZcytoR14的中和单克隆抗体结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17或IL-17F的活性(单独地或一起地)有效地阻断了ZcytoR14，可在体内有利地减少IL-17或IL-17F(单独地或一起地)的效应，并且可减少IL-17和/或IL-17F-诱导的炎症，例如在牛皮癣、IBD、结肠炎、慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化中看到的炎症，或由IL-17和/或IL-17F诱导的其他炎性疾病，包括IBD、关节炎、哮喘、牛皮癣性关节炎、结肠炎、炎性皮肤病症和特应性皮炎。
实施例20
抗人ZcytoR14单克隆抗体的药物动力学
以例如3x3mL的等分、大约1mg/mL(在280nM下通过UV吸光率确定的)的浓度提供受试单克隆抗体抗人ZcytoR14mAb，并在-80℃下贮存直至使用。载体是1X PBS(50mM NaPO4、109mM NaCl)，pH7.3。使用前，在室温下解冻mAb，提供等分1和等分2分别作为100μg IV和SC剂量组。将等分3的一半在1X PBS中以1∶2稀释用于50μg SC剂量组，而将等分3的第二半部分在1X PBS中以1∶10稀释用于10μgSC剂量组。雌性SCID小鼠(n＝96)获自Charles River Lab。在到达后检查动物的健康状况并进行群养(每笼3只动物)。研究开始时，小鼠为12周大小，平均体重大约为22g。
A) 剂量给药方案
随机地将雌性SCID小鼠(n＝24/剂量组)置于4个剂量给药组(表5)。通过在尾部静脉中经静脉内注射大约93μL来给第1组施用抗人ZcytoR14mAb，通过在脖子的颈部经皮下注射大约93μL来给第2、3和4组施用所述mAb。
B) 样品采集
在进行血液采集前，用氟烷或异氟烷完全麻醉小鼠。通过心脏条(cardiacstick)在所有时间点上采集，除了第168小时时间点(通过眼放血采集，并在第504小时的时间点上通过心脏条再对相同的动物放血)血液样品。将血液收集入血清分离器的管中并让其凝结15分钟。随后在14,000rpm下离心样品3分钟。离心后，将125-150uL的等分分配入经标记的eppendorf管并立即在-80℃下贮存直至用于分析。
表5
  组号   剂量(ROA)   动物   PK时间点
  1   100μg(IV)   3只小鼠/时间点*   0.25，1，4，8，24，72，168，336和504小时
  2   100μg(SC)   3只小鼠/时间点*   0.25，1，4，8，24，72，168，336和504小时
  3   50μg(SC)   3只小鼠/时间点*   0.25，1，4，8，24，72，168，336和504小时
  4   10μg(SC)   3只小鼠/时间点*   0.25，1，4，8，24，72，168，336和504小时
*将相同的动物用于第168和504小时的时间点。
C)通过ELISA进行的血清抗人ZcytoR14mAb浓度的定量
发展酶联免疫吸附测定法(ELISA)并使其符合在药物动力学研究中分析来自用抗ZcytoR14mAb剂量给药的动物的小鼠血清样品的要求。该测定法经设计用于使用可商购获得的二抗和使用TMB的比色检测法。修饰用于标准曲线的稀释度以提高标准曲线的线性部分的准确度。使用2倍稀释度的100ng/mL至0.231ng/mL的范围内的标准曲线使得能够对小鼠血清样品进行定量。将QC样品在10％SCID小鼠血清中稀释至1∶100、1∶1000和1∶10000并根据标准曲线回推所述样品的量。
D)药物动力学分析
将血清浓度对时间数据下载至用于药物动力学分析的WinNonlinProfessional4.0软件(Pharsight，Inc.；Cary，NC)。使用非区室分析法(Noncompartmental analysis)确定基于各时间点的平均数据的药物动力学参数。
实施例21
通过抗人ZcytoR14单克隆抗体产生的对IL-17和IL-17F的活性的中
和
使用基于细胞的中和测定法，以系列稀释度例如以10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、625ng/ml、313ng/ml、156ng/ml和78ng/ml加入纯化的小鼠抗人ZcytoR14单克隆抗体。在37℃、5％CO 2下温育测定板4天，在第4天，以20μl/孔加入Alamar Blue(Accumed，Chicago，IL)。再将板在37℃、5％CO2下温育16小时。该测定法能够证明，纯化的抗人ZcytoR14单克隆抗体能够中和huIL-17和huIL-17F通过ZcytoR14进行的信号转导。对于高度有效的抗体，当以大约10μg/ml的浓度使用时，所述抗体完全中和由huIL-17或huIL-17F诱导的增殖，在更低的浓度上增殖的抑制以剂量依赖性的方式降低。同种型匹配的负对照小鼠mAb，当以上述浓度进行检测时，没有提供两种细胞因子中的任一种的增殖作用的抑制作用。这些结果能够进一步证明针对ZcytoR14的单克隆抗体确实能够在低浓度上拮抗促炎配体IL-17和IL-17F的活性。
实施例22
IL-17A在人外周血单核细胞中诱导提高的IFN-γ和TNF-α的水平
通过菲柯尔密度梯度离心纯化人外周血单核细胞(PBMC)，然后在37℃下，在单独的培养基、50ng/ml抗人CD3抗体或50ng/ml抗人CD3抗体和1□g/ml抗人CD28抗体中温育过夜。建立这些条件中的各条件的复制式培养，不提供细胞因子、提供25ng/ml人IL-17A或25ng/ml人IL-17F。在24小时的温育后，收获来自各培养物的上清液，使用B-D Bioscience’s human Th1/Th2 Cytometric Bead Array(CBA)就细胞因子的含量测定所述上清液。我们发现，已用抗CD3或抗CD3和抗CD28刺激的并已用IL-17A补充的培养物，相对于未加入细胞因子的培养物或接受IL-17F的培养物，包含显著提高的IFN-γ和TNF-α的水平(各提高3-5倍)。其中无抗CD3刺激物的培养物在细胞因子水平上未显示显著的变化。此外，IL-17A的加入在和CBA一起被测定的其他细胞因子(包括IL-2、IL-4、IL-5和IL-10)中没有诱导显著的改变。这些数据表明IL-17A但非IL-17F可在用抗CD3或抗CD3和抗CD28刺激的PBMC培养物中提高IFN-γ和TNF-α的产量。
实施例23
ZcytoR14-Fc在小鼠胶原诱导的关节炎(CIA)模型中减少发病率和病症进程
A) 小鼠胶原诱导的关节炎(CIA)模型
将10周大小的雄性DBA/1J小鼠(Jackson Labs)分成3组，每组13只小鼠。在第21天，经皮下尾部注射给动物施用在完全弗氏佐剂(由Chondrex，Redmond，WA配制的)中配制的50-100μl1mg/ml鸡II型胶原，3周后，在第0天给其提供相同的注射，但是胶原配制于不完全弗氏佐剂中。以腹膜内注射的方式在从第0天至大部分小鼠展示疾病的中度症状的日期范围内的不同时间点上施用ZcytoR14-Fc，每周3次，进行4周。实验组接受10或100μg ZcytoR14-Fc/动物/剂量，对照组接受载体对照、PBS(Life Technologies，Rockville，MD)。在第2次胶原免疫后，动物开始显示关节炎的症状，大多数动物在1.5-3周内发生炎症。通过使用卡尺测量爪的厚度和通过给各爪赋予临床评分((0-3)：如下所述，0＝正常，0.5＝脚趾发炎，1＝轻微爪炎症，2＝中度爪炎症和3＝重度爪炎症)来评价疾病的程度。
B) 监控疾病
在第2次胶原注射后，动物很快可开始显示爪炎症的症状，一些动物甚至可以在第2次胶原注射之前开始具有脚趾炎症的症状。大多数动物在增强注射的1.5-3周内发生关节炎，但一些可能需要更长的时间。该模型中疾病的发生率一般为95-100％，在使用40只动物的研究中一般看到0-2个非应答者(在观察6周后确定的)。注意，当炎症开始时，通常可短暂同时发生可变的低级爪或脚趾炎症。因为该原因，直到明显的、持续的爪肿胀已发生时才认为动物具有已确立的疾病。
每天观察所有动物以确定其爪的病理状态，这可通过将定性临床评分赋予各爪来进行确定。每天，根据临床疾病的状态给各动物的4只爪评分。为确定临床评分，可认为爪具有3个区域：脚趾、爪自身(手或脚)和腕或踝关节。记录关于这些区域的炎症的程度和严重度，包括：各脚趾肿胀的观察、撕裂状的指甲或脚趾的发红、爪中任何一爪的浮肿或发红的任何证据的记录、腱或骨的细微解剖学界限的任何丧失的记录、就任何浮肿或发红对腕或踝的评价以及炎症是否延伸至接近腿。1、2或3的爪的评分首先基于严重度的总的印象，其次基于涉及的区域的数量。下面显示用于临床评分的标准。
C) 临床评分
0＝正常
0.5＝涉及一个或多个脚趾，但只有脚趾发炎
1＝轻微炎症，包括爪(1个区域)，和可以包括脚趾
2＝爪的中度炎症，可包括一些爪和/或腕/踝(2个区域)
3＝爪、腕/踝和一些或所有脚趾(3个区域)的严重炎症
已确立的疾病定义为持续连续2天的评定级别为2或更高的爪炎症的定性评分。当已确立的疾病出现时，记录日期并将其称为动物患上“已确立的疾病”的第1天。
在整个实验中采集血液以监控抗胶原抗体的血清水平以及血清免疫球蛋白和细胞因子的水平。血清抗胶原抗体和疾病的严重度高度相关。在第21天对动物实施无痛致死术，采集血液用于制备血清和CBC。从各动物收集一个受影响的爪置于10％NBF中用于组织学检查，将一个爪在液氮中冷冻并在-80℃下贮存以用于mRNA分析。此外，将1/2个脾、1/2胸腺、1/2肠系膜淋巴节、1个肝叶和左肾收集于RNAlater中以用于RNA分析，将1/2个脾、1/2胸腺、1/2肠系膜淋巴节、剩下的肝和右肾收集于10％NBF中以进行组织学检查。收集血清并在-80℃下冷冻以进行免疫球蛋白和细胞因子分析。
在所有时间点接受ZcytoR14-Fc的小鼠组的特征在于爪炎症的发病和/或进程上的延迟。这些结果表明ZcytoR14可减少与这些模型相关的炎症以及发病率和进程。这些结果可由这样的观察资料进一步支持，即ZcytoR14-Fc导致减少血清TNFa、IL-1b和抗胶原抗体的水平。
实施例24
表达apl/nfkb转录因子的鼠类测定细胞系Nih3t3/kz142.8中ZcytoR14的稳定的过量表达
用具有氨甲蝶呤抗性基因(二氢叶酸还原酶，DHFR)的表达载体中的人zcytor14x1(SEQ ID NO：2)转染鼠类nih3t3/kz142.8测定细胞系。使用可商购获得的试剂盒和按照厂商建议进行该转染。(Mirus，Madison，WI.Cat.#MIR218)将细胞置于补充了1μM mtx的生长培养基中以选择包含人zcytor14X1转基因的表达载体。选择后，产生人zcytor14x1转染库，将其称为nih3t3/kz142.8/hcytor14x1。
A) 使用nih3t3/kz142.8测定细胞系的萤光素酶测定法
因为nih3t3/kz142.8具有稳定的kz142报告基因，因此对于腺病毒感染不需要加入该报告基因。因此萤光素酶测定方案被简化并按下列方法进行：
1. 细胞涂板
使用包含谷氨酰胺和补充以丙酮酸盐的DMEM/10％FBS，以5000个细胞/孔将nih3t3/kz142.8细胞涂板在白色固体细胞培养物包被的96孔板中，(Cat.#3917.Costar)，并在37℃和50％CO2将其培养过夜。在第2天，除去涂板培养基，更换为包含谷氨酰胺和补充以丙酮酸盐的DMEM/1％FBS，并在37℃和50％CO2下培养过夜。
2. 测量稳定的kz142报告基因的IL-17A和F激活的萤光素酶 测定法
在1％fbs，DMEM培养基中温育过夜后，在补充BSA至.28％水平的无血清培养基中制备IL-17A和IL-17F配体稀释物。在加入配体稀释物后，在37℃和50％CO2下温育细胞4小时，除去培养基后，裂解细胞15分钟，使用萤光素酶测定系统和试剂(Cat.#e1531Promega.Madison，WI.)以及微量培养板发光测量计测量平均荧光强度(MFI)。检测在.1至1000ng/ml范围内变动的浓度上的两个配体的活性。nih3t3/kz142.8/hcytor14x1转染库显示和亲本细胞系对于鼠类IL-17A配体的活性相似的鼠类IL-17A配体的活性。(实施例14)。然而，cytor14x1转染子库显示提高的对人IL-17A和F处理物的应答，即使这些配体浓度低达20毫微微克的情况下亦如此。mIL-17A信号转导和亲本细胞系(实施例14)中相当的事实暗示对于表达人ZcytoR14的细胞不存在一般的、非特异性的问题，暗示着鼠类IL-17A可能通过内源鼠类nih3t3细胞IL-17R或ZcytoR14受体进行信号转导。因此，人IL-17A和IL-17F在这样低的配体浓度上提高MFI的事实可表明细胞对这些配体的特异性高应答性，该应答通过过量表达的人ZcytoR14受体介导。
该结果具有重大的临床和生物学后果和用途。例如，生理状况可导致ZcytoR14受体的局部上调，然后这可使这些区域对IL-17A和IL-17F产生高度敏感，导致在比经显示无ZcytoR14过量表达的浓度低许多的配体浓度上产生生物学活化作用。因此，比前面认为的或由本领域技术人员承认的浓度低得多的可溶性受体水平可足以拮抗更低的这些假设的配体浓度。
实施例25
IL-17F和IL-17A活性的拮抗剂在炎性肠病(IBD)模型中减少发病率和进程
设计该模型以显示和来自健康对照的组织相比，培养的来自IBD患者的肠组织产生更高水平的炎症介质。增加的炎症介质(包括但不限于IL-1b、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17A和F、IL-18、IL-23、TNF-a、IFN-g、MIP家族成员、MCP-1、G-和GM-CSF等)的产量通过其对激活炎症途径和下游效应细胞的效应促成了所述病症和IBD关联性症状如克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。然后这些途径和组分导致体内观察到的组织和细胞损伤/破坏。因此，该模型可模拟IBD的该增强的炎症介质方面。此外，当在这些炎症组分存在的情况下培养来自健康对照的肠组织或人肠上皮细胞(IEC)系时，可观察到炎症途径信号转导和组织和细胞损伤的证据。
在体内人IBD中有效的治疗剂可通过抑制和/或中和炎症介质的产生和/或存在而离体起作用或在IEC模型中起作用。
在该模型中，从患有IBD的患者或从进行肠活组织检查、切除的健康对照或从死后组织标本采集人肠组织，并使用Alexakis等人(Gut53：85-90；2004)的修改方案进行处理。在无菌条件下，用大量PBS轻轻地洗净样品，然后在完全组织培养基(加入抗生素以预防细菌过度生长)中培养组织的切片。用下列物质中的一种处理来自相同组织糜库的样品：载体(PBS)、重组人(rh)IL-17A、rhIL-17F或rhIL-17A+rhIL-17F。此外，用或不用IL-17A或IL-17F(单独的或一起的)(例如可溶性ZcytoR14)的拮抗剂处理这些样品。按照人IEC系的研究进行该实验方案，除了细胞是从已存在的贮存细胞传代的细胞外。在不同的培养时间(从1小时至数天)后，收集上清液并就炎症介质(包括上面列出的介质)进行分析。在来自患有IBD的患者的样品或用rhIL-17A和/或F处理的样品中，和未处理的健康对照组织样品相比，炎症细胞因子和趋化因子的水平获得提高。针对IL-17F和/或IL-17A的活性的拮抗剂例如ZytoR14可溶性受体或针对其的抗体(包括本发明的抗人-ZcytoR14单克隆抗体和中和抗体)的加入显著地减少了炎症介质的产生，从而可预期对人IBD是有效的。
实施例26
针对IL-17F和IL-17A的活性的拮抗剂在多发性硬化(MS)模型中减少发病率和进程
多发性硬化症(MS)是被认为由许多因素，包括淋巴细胞和单核细胞炎性浸润和通过CNS的脱髓鞘作用的存在介导的复杂疾病。小胶质细胞是聚居于中枢神经系统(CNS)并在损伤或感染后开始被激活的巨噬细胞样细胞。已认为小胶质细胞在各种CNS疾病包括MS中起着至关重要的作用，其可用于研究所述疾病的发生、进程和治疗的机制(Nagai等人Neurobiol Dis8：1057-1068；2001；Olson等人J NeurosciMethods128：33-43；2003)。因此可将永生化的人小胶质细胞系和/或已建立的人星形神经胶质细胞系用于研究炎症因子对这些细胞类型的一些效应和其中和潜能。炎症因子(包括但不限于IL-1b、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17A和F、IL-18、IL-23、TNF-a、IFN-g、MIP家族成员、RANTES、IP-10、MCP-1、G-和GM-CSF等)可通过其对激活炎症途径和下游效应细胞的效应促成和MS相关的症状和病理状态。
为了评价IL-17A和IL-17F的促炎作用、和针对IL-17F和/或IL-17A活性的拮抗剂例如ZcytoR14可溶性受体和针对其的抗体(包括本发明抗人ZcytoR14单克隆抗体和中和抗体)中和或减少这些作用的能力，用下列物质中的一种处理培养的神经胶质细胞：载体、rhIL-17A、rhIL-17F、rhIL-17A+IL-17F。此外，用或不用IL-17A或IL-17F(单独的或一起的)(例如可溶性ZcytoR14)的拮抗剂处理这些样品。在不同的培养时间(从1小时至数天)后，收集上清液并就炎症因子(包括上面列出的因子)的水平和/或表达对其进行分析。和只用载体处理的培养物相比，在rhIL-17A和/或IL-17F存在下，炎症因子和趋化因子的水平获得提高。针对IL-17F和/或IL-17A的活性的拮抗剂例如ZytoR14可溶性受体和针对其的抗体(包括本发明的抗人-ZcytoR14单克隆抗体和中和抗体)的加入显著地减少了炎症介质的产生和表达，从而可预期其在和人MS关联的炎症方面是有效的。
实施例27
针对IL-17F和IL-17A的活性的拮抗剂在类风湿性关节炎(RA)和骨关节炎(OA)模型中减少发病率和进程
设计该模型以显示，来自患有RA和OA的患者的人滑液培养物(包括滑液巨噬细胞、滑液成纤维细胞和关节软骨细胞)和外植体，和来自健康对照的培养物/外植体相比，产生更高水平的炎症介质。炎症介质(包括但不限于制瘤素M、IL-1b、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17A和F、IL-18、IL-23、TNF-a、IFN-g、IP-10、RANTES、RANKL、MIP家族成员、MCP-1、G-和GM-CSF、一氧化氮等)的该增强的产量通过其对炎症途径和下游效应细胞的激活作用促成和RA和OA关联的症状和病理状态。然后这些途径和组分导致炎性浸润、软骨和基质丢失/破坏、骨丢失以及前列腺素和环氧合酶的上调。因此，该模型可模拟体内和离体实验中RA和OA的破坏性炎症方面。此外，当在这些炎症组分中的几种(例如制瘤素M、TNF-a、IL-1b、IL-6、IL-17A和F、IL-15等)存在的情况下培养来自健康对照的外植体和滑液培养物时，可观察到炎症途径信号转导。在体内在人RA中有效的治疗剂可在上面的体外和离体模型中通过抑制和/或中和炎症介质的产生和/或存在来起作用。
在该模型中，从患有RA、OA的患者、或从进行关节置换术的健康对照或从死后组织样品中收集人滑液外植体，并使用Wooley和Tetlow(Arthritis Res2：65-70；2000)和van‘t Hof等人(Rheumatology39：1004-1008；2000)的修改方案对其进行处理。也研究滑液成纤维细胞、滑液巨噬细胞和关节软骨细胞的培养。用下列物质中的一种处理重复的双份样品：载体(PBS)、重组人(rh)IL-17A、rhIL-17F、或rhIL-17A+rhIL-17F，一些样品包含制瘤素M、TNF-a、IL-1b、IL-6、IL-17A、IL-17F和IL-15的各种组合。此外，用或不用IL-17A或IL-17F的拮抗剂例如ZcytoR14可溶性受体和针对其的抗体(包括本发明的抗人ZcytoR14单克隆抗体和中和抗体)处理这些样品。在不同的培养时间(从1小时至数天)后，收集上清液并就炎症介质包括上面列出的介质的水平对其进行分析。在来自患有RA或OA的患者的样品、或用rhIL-17A和/或F(单独地或和其他炎症因子一起地)处理的样品中，炎症细胞因子和趋化因子，和未处理的健康对照外植体或未处理的细胞培养物中的相比，获得了提高。针对IL-17F和/或IL-17A的活性的拮抗剂例如ZytoR14可溶性受体和针对其的抗体(包括本发明的抗人-ZcytoR14单克隆抗体和中和抗体)的加入显著地减少了炎症介质的产量，从而可预期其在人RA和OA中是有效的。
实施例28
IL-17A和IL-17F功能性应答
用人zcytoR14x1(SEQ ID NO：1)和小鼠zcytoR14x1(SEQ ID NO：25)稳定地转染NIH-3T3/KZ142细胞。如上所述，用剂量响应的IL-17A、IL-17F、鼠类IL-17F和合适的对照处理各系7和15分钟。当转染ZcytoR14x1(SEQ ID NO：1)时，IL-17A和IL-17F对磷酸化的IκB-α和p38MAPK转录因子产生剂量依赖性应答，比来自健康系的固有的信号转导高大约30％。当转染鼠类ZcytoR14x1(SHQ ID NO：25)时，IL-17A和IL-17F不增加信号转导。鼠类IL-17F不增加人或鼠类ZcytoR14x1的信号转导。
实施例29
鼠类疾病模型中IL-17A、IL-17F、IL-17R和ZcytoR14的表达
使用已知的技术就IL-17A、IL-17F、IL-17R和ZcytoR14的表达分析4个鼠类的疾病模型(哮喘、DSS结肠炎、特应性皮炎和实验性变应性脑脊髓炎)。
在哮喘模型中，IL-17A和IL-17F在患病的和未患病的小鼠的肺、脾、肺引流淋巴结和肺浸润细胞中以极低至不可检测的水平表达。与脾和淋巴结相比，发现Zcytor14的信息在肺中以更高的水平表达，但不受疾病调控。和肺相比，IL-17R在脾和肺引流淋巴结中以更高的水平表达，但也不受疾病调控。
和哮喘模型相反，IL-17A和IL-17F在DSS结肠炎模型中，在患病而不是正常的小鼠中在近侧结肠和末端结肠中都被高度上调。两种细胞因子在肠系膜淋巴结中都未显著上调。此外，发现两种细胞因子在急性DSS诱导的结肠炎中但非慢性DSS诱导的结肠炎的背景中都得到上调。发现，和近侧结肠和末端结肠相比，IL-17R主要在肠系淋巴结中表达，但不受疾病调控。相反地，和肠系淋巴结相比，ZcytoR14在近末端结肠组织中以更高的水平表达。ZcytoR14的表达不受疾病调控。
在特应性皮炎中，未检测到IL-17A mRNA。发现IL-17F在皮肤和皮肤引流淋巴结中表达但未表现出明显地受疾病调控。和皮肤相比，IL-17R mRNA以更高的水平在皮肤引流淋巴节中表达，但不受疾病控制。和皮肤引流淋巴结相比，Zcytor14以更高的水平在皮肤中表达，但也不受疾病调控。
在实验性变应性脑脊髓炎中，IL-17A和IL-17F在患病的但非健康的小鼠的脊髓中都表现上调。和脊髓相比，IL-17F已在淋巴节中以更高的水平表达，但淋巴节中的表达不受疾病调控。然而，这些组织中的总的表达水平相当低。和脑和脊髓相比，IL-17R以更高的水平在淋巴结组织中表达。未检测Zcytor14。
简而言之，IL-17A和IL-17F的表达在DSS诱导的结肠炎和实验性变应性脑脊髓炎模型的背景中似乎受疾病的调控，但明显地在哮喘或特应性皮炎中不受疾病的调控。IL-17R和zcytor14的表达似乎不受疾病的调控，但IL-17R的表达似乎集中在淋巴样组织中而zcytor14的表达似乎集中在非淋巴样组织中。
实施例30
ZcytoR14是IL-17A和IL-17F的活化作用的介质
用具有氨甲蝶呤抗性基因(二氢叶酸还原酶，DHFR)的表达载体中的人ZcytoR14X1(SEQ ID NO：2)转染鼠类nih3t3/kz142.8测定细胞系。类似地将人IL-17RA(SEQ ID NO：21)转染入该细胞系。使用可商购获得的试剂盒和按照厂商建议(Mirus，Madison，WI.Cat.#MIR218)进行转染。将细胞置于补充有1μM mtx的生长培养基中以选择包含所述表达构建体的表达载体。选择后，产生转染库，称为nih3t3/kz142.8/hcytor14X1和nih3t3/kz142.8/IL-17R。
A) 使用基于nih3t3/kz142.8的细胞系的萤光素酶测定法
因为基于nih3t3/kz142.8的细胞系具有稳定的ap1/nfkb报告基因(kz142)，因此对于腺病毒转染无需加入该报告基因。从而简化了萤光素酶测定方案，按下列方法进行该方案：
1. 细胞涂板
使用包含谷氨酰胺和补充以丙酮酸盐的DMEM/10％FBS，以5000个细胞/孔将细胞涂板在白色固体细胞培养物包被的96孔板中，(Cat.#3917.Costar)，并在37℃和5％CO2下培养过夜。在第2天，除去涂板培养基，更换为包含谷氨酰胺和补充以丙酮酸盐的DMEM/1％FBS，并在37℃和5％CO2培养过夜。
2. 测量稳定的kz142报告基因的IL-17A和F的激活作用的萤光 素酶测定法
在1％fbs，DMEM培养基中温育过夜后，在补充BSA至.28％水平的无血清培养基中制备人IL-17A和IL-17F配体稀释物。在加入配体稀释物后，在37℃和5％CO2下温育细胞4小时，在除去培养基后，裂解细胞15分钟，使用萤光素酶测定系统和试剂(Cat.#e1531Promega.Madison，WI.)以及微量培养板发光测量计测量平均荧光强度(MFI)。检测在从.1至100ng/ml范围内变动的浓度上的两个配体的活性。
下面描述的EC50是至少4个实验的平均值。nih3t3/kz142.8/hcytor14x1转染库显示和亲本细胞系对于鼠类IL-17A配体的活性相似的鼠类IL-17A配体的活性，具有大约4ng/ml的EC50。(实施例14)。hcytor14x1重组系中的mIL-17A信号转导和亲本细胞系(实施例14)中的相当的事实暗示着鼠类IL-17A可能通过内源性鼠类nih3t3细胞IL-17R或ZcytoR14受体进行信号转导而不通过hcytor14X1激活细胞。然而，zcytor14X1转染子库显示提高的针对人IL-17A处理的应答性，重组系中的.41ng/ml EC50(4个实验的平均值)对亲本系中的2.8ng/ml的EC50(重组系中具有强度高出6.8倍的EC50)。此外，hIL-17RCX1重组系具有增强的对hIL-17F的应答性，重组系中.61ng/ml的EC50对亲本系中的10ng/ml的EC50(重组系中具有强度高出17倍的EC50)。hIL-17RCX1系中的增加hIL-17A和F的效力和作为人IL-17A和IL-17F的高亲和力受体的人zcytor14X1一致。相反地，hIL-17RA重组系只对hIL-17A具有增强的灵敏度，.6ng/ml的EC50对亲本系中的2.8ng/ml的EC50。在hIL-17RA重组系中不存在hIL-17F EC50的增加，12.4ng/ml的IL-14F EC50对亲本系中的8.9ng/ml的EC50。
该结果具有重大意义，因为其明确地暗示着hzcytor14X1为hIL-17A和hIL-17F的活化作用的介质，并暗示着hIL-17RA只介导针对hIL-17A的激活作用而非hIL-17F的激活作用的信号转导。
实施例31
IL-17A和IL-17F的静脉内给药
确定鼠类或人IL-17A或IL-17F的静脉内给药在不同时间点上对BALB/c小鼠中的全血计数(CBC)和血清细胞因子/趋化因子的影响。
1ug mIL-17A的静脉内给药在给药后1-2小时导致循环嗜中性粒细胞增加大约2倍(通过CBC)和导致血清KC和MCP-1增加大约10倍(通过Luminex)；使用5ug hIL-17A在这些趋化因子中观察到相似的结果。在2小时的时间点上，在用1ug mIL-17A(显示最大的增加)、5ug hIL-17A或5ug hIL-17F处理的小鼠中，血液单核细胞水平也获得显著地提高。在1和2小时的时间点上，m和hIL-17F的静脉内给药导致血清IL-15的显著增加(通过Luminex)，和在相同的时间点上导致血清KC和MCP-1少量增加。
实施例32
静脉内给药的IL-17A和IL-17F的中和
通过腹膜内注射可溶性受体(针对鼠类配体的mIL-17RA：Fc、针对人配体的可溶性人ZcytoR14)中和静脉内注射的IL-17A和IL-17F介导的细胞因子和趋化因子的增加。在接受静脉内尾部注射：PBS、2ugmIL-17A、mIL-17F或2ug mIL-17A和F(对于接受mIL-17RA：Fc的小鼠)；或2ug hIL-17A、hIL-17F、或2ug hIL-17A和F(对于接受可溶性人ZcytoR14的小鼠)之前3小时，通过腹膜内注射给雌性BALB/c小鼠施用PBS、100ug mIL-17RA：Fc或100ug可溶性人ZcytoR14。在配体施用1小时后采集血清并就少数血清细胞因子和趋化因子对其进行分析。
和PBS+IL-17A治疗的小鼠相比，用通过腹膜内注射可溶性受体预治疗的小鼠显著地降低IL-17A介导的IL-17A和KC的血清浓度的增加。
根据上述内容，要认识到，尽管此处已描述了用于说明目的的本发明的特定实施方案，但其可产生各种变化而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明除了受所附的权利要求限定外不受其他限定。
                                    序列表
<110>Presnell，Scott R.
     Burkhead，Steven K.
     Levin，Steven D.
     Kuestner，Rolf E.
     Gao，Zeren
     Jaspers，Stephen R.
     Bilsborough，Janine
<120>可溶性ZcytoR14、抗ZcytoR14抗体和结合伴侣以及在炎症中的使用方法
<130>04-06P1
<160>66
<170>FastSEQ for Windows Version4.0
<210>1
<211>2255
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(154)...(2229)
<400>1
aactacccag cacagccccc tccgccccct ctggaggctg aagagggatt ccagcccctg   60
ccacccacag acacgggctg actggggtgt ctgcccccct tggggggggg cagcacaggg  120
cctcaggcct gggtgccacc tggcacctag aag atg cct gtg ccc tgg ttc ttg   174
Met Pro Val Pro Trp Phe Leu
 1               5
ctg tcc ttg gca ctg ggc cga agc cca gtg gtc ctt tct ctg gag agg    222
Leu Ser Leu Ala Leu Gly Arg Ser Pro Val Val Leu Ser Leu Glu Arg
         10                  15                  20
ctt gtg ggg cct cag gac gct acc cac tgc tct ccg ggc ctc tcc tgc    270
Leu Val Gly Pro Gln Asp Ala Thr His Cys Ser Pro Gly Leu Ser Cys
     25                  30                  35
cgc ctc tgg gac agt gac ata ctc tgc ctg cct ggg gac atc gtg cct    318
Arg Leu Trp Asp Ser Asp Ile Leu Cys Leu Pro Gly Asp Ile Val Pro
 40                  45                  50                  55
gct ccg ggc ccc gtg ctg gcg cct acg cac ctg cag aca gag ctg gtg    366
Ala Pro Gly Pro Val Leu Ala Pro Thr His Leu Gln Thr Glu Leu Val
                  60                 65                  70
ctg agg tgc cag aag gag acc gac tgt gac ctc tgt ctg cgt gtg gct    414
Leu Arg Cys Gln Lys Glu Thr Asp Cys Asp Leu Cys Leu Arg Val Ala
             75                  80                  85
gtc cac ttg gcc gtg cat ggg cac tgg gaa gag cct gaa gat gag gaa    462
Val His Leu Ala Val His Gly His Trp Glu Glu Pro Glu Asp Glu Glu
         90                  95                 100
aag ttt gga gga gca gct gac tca ggg gtg gag gag cct agg aat gcc    510
Lys Phe Gly Gly Ala Ala Asp Ser Gly Val Glu Glu Pro Arg Asn Ala
    105                 110                 115
tct ctc cag gcc caa gtc gtg ctc tcc ttc cag gcc tac cct act gcc    558
Ser Leu Gln Ala Gln Val Val Leu Ser Phe Gln Ala Tyr Pro Thr Ala
120                 125                 130                 135
cgc tgc gtc ctg ctg gag gtg caa gtg cct gct gcc ctt gtg cag ttt    606
Arg Cys Val Leu Leu Glu Val Gln Val Pro Ala Ala Leu Val Gln Phe
                140                 145                 150
ggt cag tct gtg ggc tct gtg gta tat gac tgc ttc gag gct gcc cta    654
Gly Gln Ser Val Gly Ser Val Val Tyr Asp Cys Phe Glu Ala Ala Leu
            155                 160                 165
ggg agt gag gta cga atc tgg tcc tat act cag ccc agg tac gag aag    702
Gly Ser Glu Val Arg Ile Trp Ser Tyr Thr Gln Pro Arg Tyr Glu Lys
        170                 175                 180
gaa ctc aac cac aca cag cag ctg cct gcc ctg ccc tgg ctc aac gtg    750
Glu Leu Asn His Thr Gln Gln Leu Pro Ala Leu Pro Trp Leu Asn Val
    185                 190                 195
tca gca gat ggt gac aac gtg cat ctg gtt ctg aat gtc tct gag gag    798
Ser Ala Asp Gly Asp Asn Val His Leu Val Leu Asn Val Ser Glu Glu
200                 205                 210                 215
cag cac ttc ggc ctc tcc ctg tac tgg aat cag gtc cag ggc ccc cca    846
Gln His Phe Gly Leu Ser Leu Tyr Trp Asn Gln Val Gln Gly Pro Pro
                220                 225                 230
aaa ccc cgg tgg cac aaa aac ctg act gga ccg cag atc att acc ttg    894
Lys Pro Arg Trp His Lys Asn Leu Thr Gly Pro Gln Ile Ile Thr Leu
            235                 240                 245
aac cac aca gac ctg gtt ccc tgc ctc tgt att cag gtg tgg cct ctg    942
Asn His Thr Asp Leu Val Pro Cys Leu Cys Ile Gln Val Trp Pro Leu
        250                 255                 260
gaa cct gac tcc gtt agg acg aac atc tgc ccc ttc agg gag gac ccc    990
Glu Pro Asp Ser Val Arg Thr Asn Ile Cys Pro Phe Arg Glu Asp Pro
    265                 270                 275
cgc gca cac cag aac ctc tgg caa gcc gcc cga ctg cga ctg ctg acc   1038
Arg Ala His Gln Asn Leu Trp Gln Ala Ala Arg Leu Arg Leu Leu Thr
280                 285                 290                 295
ctg cag agc tgg ctg ctg gac gca ccg tgc tcg ctg ccc gca gaa gcg   1086
Leu Gln Ser Trp Leu Leu Asp Ala Pro Cys Ser Leu Pro Ala Glu Ala
                300                 305                 310
gca ctg tgc tgg cgg gct ccg ggt ggg gac ccc tgc cag cca ctg gtc   1134
Ala Leu Cys Trp Arg Ala Pro Gly Gly Asp Pro Cys Gln Pro Leu Val
            315                 320                 325
cca ccg ctt tcc tgg gag aac gtc act gtg gac aag gtt ctc gag ttc   1182
Pro Pro Leu Ser Trp Glu Asn Val Thr Val Asp Lys Val Leu Glu Phe
        330                 335                 340
cca ttg ctg aaa ggc cac cct aac ctc tgt gtt cag gtg aac agc tcg   1230
Pro Leu Leu Lys Gly His Pro Asn Leu Cys Val Gln Val Asn Ser Ser
    345                 350                 355
gag aag ctg cag ctg cag gag tgc ttg tgg gct gac tcc ctg ggg cct   1278
Glu Lys Leu Gln Leu Gln Glu Cys Leu Trp Ala Asp Ser Leu Gly Pro
360                 365                 370                 375
ctc aaa gac gat gtg cta ctg ttg gag aca cga ggc ccc cag gac aac   1326
Leu Lys Asp Asp Val Leu Leu Leu Glu Thr Arg Gly Pro Gln Asp Asn
                 380                385                 390
aga tcc ctc tgt gcc ttg gaa ccc agt ggc tgt act tca cta ccc agc   1374
Arg Ser Leu Cys Ala Leu Glu Pro Ser Gly Cys Thr Ser Leu Pro Ser
            395                 400                 405
aaa gcc tcc acg agg gca gct cgc ctt gga gag tac tta cta caa gac   1422
Lys Ala Ser Thr Arg Ala Ala Arg Leu Gly Glu Tyr Leu Leu Gln Asp
        410                 415                 420
ctg cag tca ggc cag tgt ctg cag cta tgg gac gat gac ttg gga gcg   1470
Leu Gln Ser Gly Gln Cys Leu Gln Leu Trp Asp Asp Asp Leu Gly Ala
    425                 430                 435
cta tgg gcc tgc ccc atg gac aaa tac atc cac aag cgc tgg gcc ctc   1518
Leu Trp Ala Cys Pro Met Asp Lys Tyr Ile His Lys Arg Trp Ala Leu
440                 445                 450                 455
gtg tgg ctg gcc tgc cta ctc ttt gcc gct gcg ctt tcc ctc atc ctc   1566
Val Trp Leu Ala Cys Leu Leu Phe Ala Ala Ala Leu Ser Leu Ile Leu
                460                 465                 470
ctt ctc aaa aag gat cac gcg aaa gcg gcc gcc agg ggc cgc gcg gct   1614
Leu Leu Lys Lys Asp His Ala Lys Ala Ala Ala Arg Gly Arg Ala Ala
            475                 480                 485
ctg ctc ctc tac tca gcc gat gac tcg ggt ttc gag cgc ctg gtg ggc   1662
Leu Leu Leu Tyr Ser Ala Asp Asp Ser Gly Phe Glu Arg Leu Val Gly
        490                 495                 500
gcc ctg gcg tcg gcc ctg tgc cag ctg ccg ctg cgc gtg gcc gta gac   1710
Ala Leu Ala Ser Ala Leu Cys Gln Leu Pro Leu Arg Val Ala Val Asp
    505                 510                 515
ctg tgg agc cgt cgt gaa ctg agc gcg cag ggg ccc gtg gct tgg ttt   1758
Leu Trp Ser Arg Arg Glu Leu Ser Ala Gln Gly Pro Val Ala Trp Phe
520                 525                 530                 535
cac gcg cag cgg cgc cag acc ctg cag gag ggc ggc gtg gtg gtc ttg   1806
His Ala Gln Arg Arg Gln Thr Leu Gln Glu Gly Gly Val Val Val Leu
                540                 545                 550
ctc ttc tct ccc ggt gcg gtg gcg ctg tgc agc gag tgg cta cag gat   1854
Leu Phe Ser Pro Gly Ala Val Ala Leu Cys Ser Glu Trp Leu Gln Asp
            555                 560                 565
ggg gtg tcc ggg ccc ggg gcg cac ggc ccg cac gac gcc ttc cgc gcc   1902
Gly Val Ser Gly Pro Gly Ala His Gly Pro His Asp Ala Phe Arg Ala
        570                 575                 580
tcg ctc agc tgc gtg ctg ccc gac ttc ttg cag ggc cgg gcg ccc ggc   1950
Ser Leu Ser Cys Val Leu Pro Asp Phe Leu Gln Gly Arg Ala Pro Gly
    585                 590                 595
agc tac gtg ggg gcc tgc ttc gac agg ctg ctc cac ccg gac gcc gta   1998
Ser Tyr Val Gly Ala Cys Phe Asp Arg Leu Leu His Pro Asp Ala Val
600                 605                 610                 615
ccc gcc ctt ttc cgc acc gtg ccc gtc ttc aca ctg ccc tcc caa ctg   2046
Pro Ala Leu Phe Arg Thr Val Pro Val Phe Thr Leu Pro Ser Gln Leu
                620                 625                 630
cca gac ttc ctg ggg gcc ctg cag cag cct cgc gcc ccg cgt tcc ggg   2094
Pro Asp Phe Leu Gly Ala Leu Gln Gln Pro Arg Ala Pro Arg Ser Gly
            635                 640                 645
cgg ctc caa gag aga gcg gag caa gtg tcc cgg gcc ctt cag cca gcc   2142
Arg Leu Gln Glu Arg Ala Glu Gln Val Ser Arg Ala Leu Gln Pro Ala
        650                 655                 660
ctg gat agc tac ttc cat ccc ccg ggg act ccc gcg ccg gga cgc ggg   2190
Leu Asp Ser Tyr Phe His Pro Pro Gly Thr Pro Ala Pro Gly Arg Gly
    665                 670                 675
gtg gga cca ggg gcg gga cct ggg gcg ggg gac ggg act taaataaagg    2239
Val Gly Pro Gly Ala Gly Pro Gly Ala Gly Asp Gly Thr
680                 685                 690
cagacgctgt ttttct                                                 2255
<210>2
<211>692
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Met Pro Val Pro Trp Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly Arg Ser Pro
 1               5                  10                  15
Val Val Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Gly Pro Gln Asp Ala Thr His
            20                  25                  30
Cys Ser Pro Gly Leu Ser Cys Arg Leu Trp Asp Ser Asp Ile Leu Cys
        35                  40                  45
Leu Pro Gly Asp Ile Val Pro Ala Pro Gly Pro Val Leu Ala Pro Thr
    50                  55                  60
His Leu Gln Thr Glu Leu Val Leu Arg Cys Gln Lys Glu Thr Asp Cys
65                  70                  75                  80
Asp Leu Cys Leu Arg Val Ala Val His Leu Ala Val His Gly His Trp
                85                  90                  95
Glu Glu Pro Glu Asp Glu Glu Lys Phe Gly Gly Ala Ala Asp Ser Gly
            100                 105                 110
Val Glu Glu Pro Arg Asn Ala Ser Leu Gln Ala Gln Val Val Leu Ser
        115                 120                 125
Phe Gln Ala Tyr Pro Thr Ala Arg Cys Val Leu Leu Glu Val Gln Val
    130                 135                 140
Pro Ala Ala Leu Val Gln Phe Gly Gln Ser Val Gly Ser Val Val Tyr
145                 150                 155                 160
Asp Cys Phe Glu Ala Ala Leu Gly Ser Glu Val Arg Ile Trp Ser Tyr
                165                 170                 175
Thr Gln Pro Arg Tyr Glu Lys Glu Leu Asn His Thr Gln Gln Leu Pro
            180                 185                 190
Ala Leu Pro Trp Leu Asn Val Ser Ala Asp Gly Asp Asn Val His Leu
        195                 200                 205
Val Leu Asn Val Ser Glu Glu Gln His Phe Gly Leu Ser Leu Tyr Trp
    210                 215                 220
Asn Gln Val Gln Gly Pro Pro Lys Pro Arg Trp His Lys Asn Leu Thr
225                 230                 235                 240
Gly Pro Gln Ile Ile Thr Leu Asn His Thr Asp Leu Val Pro Cys Leu
                245                 250                 255
Cys Ile Gln Val Trp Pro Leu Glu Pro Asp Ser Val Arg Thr Asn Ile
            260                 265                 270
Cys Pro Phe Arg Glu Asp Pro Arg Ala His Gln Asn Leu Trp Gln Ala
        275                 280                 285
Ala Arg Leu Arg Leu Leu Thr Leu Gln Ser Trp Leu Leu Asp Ala Pro
   290                  295                 300
Cys Ser Leu Pro Ala Glu Ala Ala Leu Cys Trp Arg Ala Pro Gly Gly
305                 310                 315                 320
Asp Pro Cys Gln Pro Leu Val Pro Pro Leu Ser Trp Glu Asn Val Thr
                325                 330                 335
Val Asp Lys Val Leu Glu Phe Pro Leu Leu Lys Gly His Pro Asn Leu
            340                 345                 350
Cys Val Gln Val Asn Ser Ser Glu Lys Leu Gln Leu Gln Glu Cys Leu
        355                 360                 365
Trp Ala Asp Ser Leu Gly Pro Leu Lys Asp Asp Val Leu Leu Leu Glu
    370                 375                 380
Thr Arg Gly Pro Gln Asp Asn Arg Ser Leu Cys Ala Leu Glu Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gly Cys Thr Ser Leu Pro Ser Lys Ala Ser Thr Arg Ala Ala Arg Leu
                405                 410                 415
Gly Glu Tyr Leu Leu Gln Asp Leu Gln Ser Gly Gln Cys Leu Gln Leu
            420                 425                 430
Trp Asp Asp Asp Leu Gly Ala Leu Trp Ala Cys Pro Met Asp Lys Tyr
        435                 440                 445
Ile His Lys Arg Trp Ala Leu Val Trp Leu Ala Cys Leu Leu Phe Ala
    450                 455                 460
Ala Ala Leu Ser Leu Ile Leu Leu Leu Lys Lys Asp His Ala Lys Ala
465                 470                 475                 480
Ala Ala Arg Gly Arg Ala Ala Leu Leu Leu Tyr Ser Ala Asp Asp Ser
                485                 490                 495
Gly Phe Glu Arg Leu Val Gly Ala Leu Ala Ser Ala Leu Cys Gln Leu
            500                 505                 510
Pro Leu Arg Val Ala Val Asp Leu Trp Ser Arg Arg Glu Leu Ser Ala
        515                 520                 525
Gln Gly Pro Val Ala Trp Phe His Ala Gln Arg Arg Gln Thr Leu Gln
    530                 535                 540
Glu Gly Gly Val Val Val Leu Leu Phe Ser Pro Gly Ala Val Ala Leu
545                 550                 555                 560
Cys Ser Glu Trp Leu Gln Asp Gly Val Ser Gly Pro Gly Ala His Gly
                565                 570                 575
Pro His Asp Ala Phe Arg Ala Ser Leu Ser Cys Val Leu Pro Asp Phe
            580                 585                 590
Leu Gln Gly Arg Ala Pro Gly Ser Tyr Val Gly Ala Cys Phe Asp Arg
        595                 600                 605
Leu Leu His Pro Asp Ala Val Pro Ala Leu Phe Arg Thr Val Pro Val
    610                 615                 620
Phe Thr Leu Pro Ser Gln Leu Pro Asp Phe Leu Gly Ala Leu Gln Gln
625                 630                 635                 640
Pro Arg Ala Pro Arg Ser Gly Arg Leu Gln Glu Arg Ala Glu Gln Val
                645                 650                 655
Ser Arg Ala Leu Gln Pro Ala Leu Asp Ser Tyr Phe His Pro Pro Gly
            660                 665                 670
Thr Pro Ala Pro Gly Arg Gly Val Gly Pro Gly Ala Gly Pro Gly Ala
        675                 680                 685
Gly Asp Gly Thr
    690
<210>3
<211>432
<212>PRT
<213>智人
<400>3
Leu Glu Arg Leu Val Gly Pro Gln Asp Ala Thr His Cys Ser Pro Gly
 1               5                  10                  15
Leu Ser Cys Arg Leu Trp Asp Ser Asp Ile Leu Cys Leu Pro Gly Asp
            20                  25                  30
Ile Val Pro Ala Pro Gly Pro Val Leu Ala Pro Thr His Leu Gln Thr
        35                  40                  45
Glu Leu Val Leu Arg Cys Gln Lys Glu Thr Asp Cys Asp Leu Cys Leu
    50                  55                  60
Arg Val Ala Val His Leu Ala Val His Gly His Trp Glu Glu Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Glu Lys Phe Gly Gly Ala Ala Asp Ser Gly Val Glu Glu Pro
                85                  90                  95
Arg Asn Ala Ser Leu Gln Ala Gln Val Val Leu Ser Phe Gln Ala Tyr
            100                 105                 110
Pro Thr Ala Arg Cys Val Leu Leu Glu Val Gln Val Pro Ala Ala Leu
        115                 120                 125
Val Gln Phe Gly Gln Ser Val Gly Ser Val Val Tyr Asp Cys Phe Glu
    130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Ser Glu Val Arg Ile Trp Ser Tyr Thr Gln Pro Arg
145                 150                 155                 160
Tyr Glu Lys Glu Leu Asn His Thr Gln Gln Leu Pro Ala Leu Pro Trp
                165                 170                 175
Leu Asn Val Ser Ala Asp Gly Asp Asn Val His Leu Val Leu Asn Val
            180                 185                 190
Ser Glu Glu Gln His Phe Gly Leu Ser Leu Tyr Trp Asn Gln Val Gln
        195                 200                 205
Gly Pro Pro Lys Pro Arg Trp His Lys Asn Leu Thr Gly Pro Gln Ile
    210                 215                 220
Ile Thr Leu Asn His Thr Asp Leu Val Pro Cys Leu Cys Ile Gln Val
225                 230                 235                 240
Trp Pro Leu Glu Pro Asp Ser Val Arg Thr Asn Ile Cys Pro Phe Arg
                245                 250                 255
Glu Asp Pro Arg Ala His Gln Asn Leu Trp Gln Ala Ala Arg Leu Arg
            260                 265                 270
Leu Leu Thr Leu Gln Ser Trp Leu Leu Asp Ala Pro Cys Ser Leu Pro
        275                 280                 285
Ala Glu Ala Ala Leu Cys Trp Arg Ala Pro Gly Gly Asp Pro Cys Gln
    290                 295                 300
Pro Leu Val Pro Pro Leu Ser Trp Glu Asn Val Thr Val Asp Lys Val
305                 310                 315                 320
Leu Glu Phe Pro Leu Leu Lys Gly His Pro Asn Leu Cys Val Gln Val
                325                 330                 335
Asn Ser Ser Glu Lys Leu Gln Leu Gln Glu Cys Leu Trp Ala Asp Ser
            340                 345                 350
Leu Gly Pro Leu Lys Asp Asp Val Leu Leu Leu Glu Thr Arg Gly Pro
        355                 360                 365
Gln Asp Asn Arg Ser Leu Cys Ala Leu Glu Pro Ser Gly Cys Thr Ser
    370                 375                 380
Leu Pro Ser Lys Ala Ser Thr Arg Ala Ala Arg Leu Gly Glu Tyr Leu
385                 390                 395                 400
Leu Gln Asp Leu Gln Ser Gly Gln Cys Leu Gln Leu Trp Asp Asp Asp
                405                 410                 415
Leu Gly Ala Leu Trp Ala Cys Pro Met Asp Lys Tyr Ile His Lys Arg
            420                 425                 430
<210>4
<211>1753
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(2)...(1726)
<400>4
g gag gag cct agg aat gcc tct ctc cag gcc caa gtc gtg ctc tcc ttc   49
Glu Glu Pro Arg Asn Ala Ser Leu Gln Ala Gln Val Val Leu Ser Phe
 1               5                   10                  15
cag gcc tac cct act gcc cgc tgc gtc ctg ctg gag gtg caa gtg cct     97
Gln Ala Tyr Pro Thr Ala Arg Cys Val Leu Leu Glu Val Gln Val Pro
             20                  25                  30
gct gcc ctt gtg cag ttt ggt cag tct gtg ggc tct gtg gta tat gac    145
Ala Ala Leu Val Gln Phe Gly Gln Ser Val Gly Ser Val Val Tyr Asp
        35                  40                  45
tgc ttc gag gct gcc cta ggg agt gag gta cga atc tgg tcc tat act    193
Cys Phe Glu Ala Ala Leu Gly Ser Glu Val Arg Ile Trp Ser Tyr Thr
     50                  55                  60
cag ccc agg tac gag aag gaa ctc aac cac aca cag cag ctg cct gcc    241
Gln Pro Arg Tyr Glu Lys Glu Leu Asn His Thr Gln Gln Leu Pro Ala
65                   70                  75                  80
ctg ccc tgg ctc aac gtg tca gca gat ggt gac aac gtg cat ctg gtt    289
Leu Pro Trp Leu Asn Val Ser Ala Asp Gly Asp Asn Val His Leu Val
                85                  90                  95
ctg aat gtc tct gag gag cag cac ttc ggc ctc tcc ctg tac tgg aat    337
Leu Asn Val Ser Glu Glu Gln His Phe Gly Leu Ser Leu Tyr Trp Asn
            100                 105                 110
cag gtc cag ggc ccc cca aaa ccc cgg tgg cac aaa aac ctg act gga    385
Gln Val Gln Gly Pro Pro Lys Pro Arg Trp His Lys Asn Leu Thr Gly
        115                 120                 125
ccg cag atc att acc ttg aac cac aca gac ctg gtt ccc tgc ctc tgt    433
Pro Gln Ile Ile Thr Leu Asn His Thr Asp Leu Val Pro Cys Leu Cys
    130                 135                 140
att cag gtg tgg cct ctg gaa cct gac tcc gtt agg acg aac atc tgc    481
Ile Gln Val Trp Pro Leu Glu Pro Asp Ser Val Arg Thr Asn Ile Cys
145                 150                 155                 160
ccc ttc agg gag gac ccc cgc gca cac cag aac ctc tgg caa gcc gcc    529
Pro Phe Arg Glu Asp Pro Arg Ala His Gln Asn Leu Trp Gln Ala Ala
                165                 170                 175
cga ctg cga ctg ctg acc ctg cag agc tgg ctg ctg gac gca ccg tgc    577
Arg Leu Arg Leu Leu Thr Leu Gln Ser Trp Leu Leu Asp Ala Pro Cys
            180                 185                 190
tcg ctg ccc gca gaa gcg gca ctg tgc tgg cgg gct ccg ggt ggg gac    625
Ser Leu Pro Ala Glu Ala Ala Leu Cys Trp Arg Ala Pro Gly Gly Asp
        195                 200                 205
ccc tgc cag cca ctg gtc cca ccg ctt tcc tgg gag aac gte act gtg    673
Pro Cys Gln Pro Leu Val Pro Pro Leu Ser Trp Glu Asn Val Thr Val
    210                 215                 220
gac gtg aac agc tcg gag aag ctg cag ctg cag gag tgc ttg tgg gct    721
Asp Val Asn Ser Ser Glu Lys Leu Gln Leu Gln Glu Cys Leu Trp Ala
225                 230                 235                 240
gac tcc ctg ggg cct ctc aaa gac gat gtg cta ctg ttg gag aca cga    769
Asp Ser Leu Gly Pro Leu Lys Asp Asp Val Leu Leu Leu Glu Thr Arg
                245                 250                 255
ggc ccc cag gac aac aga tcc ctc tgt gcc ttg gaa ccc agt ggc tgt    817
Gly Pro Gln Asp Asa Arg Ser Leu Cys Ala Leu Glu Pro Ser Gly Cys
            260                 265                 270
act tca cta ccc agc aaa gcc tcc acg agg gca gct cgc ctt gga gag    865
Thr Ser Leu Pro Ser Lys Ala Ser Thr Arg Ala Ala Arg Leu Gly Glu
        275                 280                 285
tac tta cta caa gac ctg cag tca ggc cag tgt ctg cag cta tgg gac    913
Tyr Leu Leu Gln Asp Leu Gln Ser Gly Gln Cys Leu Gln Leu Trp Asp
    290                 295                 300
gat gac ttg gga gcg cta tgg gcc tgc ccc atg gac aaa tac atc cac    961
Asp Asp Leu Gly Ala Leu Trp Ala Cys Pro Met Asp Lys Tyr Ile His
305                 310                 315                 320
aag cgc tgg gcc ctc gtg tgg ctg gcc tgc cta ctc ttt gcc gct gcg   1009
Lys Arg Trp Ala Leu Val Trp Leu Ala Cys Leu Leu Phe Ala Ala Ala
                325                 330                 335
ctt tcc ctc atc ctc ctt ctc aaa aag gat cac gcg aaa ggg tgg ctg   1057
Leu Ser Leu Ile Leu Leu Leu Lys Lys Asp His Ala Lys Gly Trp Leu
            340                 345                 350
agg ctc ttg aaa cag gac gtc cgc tcg ggg gcg gcc gcc agg ggc cgc   1105
Arg Leu Leu Lys Gln Asp Val Arg Ser Gly Ala Ala Ala Arg Gly Arg
        355                 360                 365
gcg gct ctg ctc ctc tac tca gcc gat gac tcg ggt ttc gag cgc ctg   1153
Ala Ala Leu Leu Leu Tyr Ser Ala Asp Asp Ser Gly Phe Glu Arg Leu
    370                 375                 380
gtg ggc gcc ctg gcg tcg gcc ctg tgc cag ctg ccg ctg cgc gtg gcc   1201
Val Gly Ala Leu Ala Ser Ala Leu Cys Gln Leu Pro Leu Arg Val Ala
385                 390                 395                 400
gta gac ctg tgg agc cgt cgt gaa ctg agc gcg cag ggg ccc gtg gct   1249
Val Asp Leu Trp Ser Arg Arg Glu Leu Ser Ala Gln Gly Pro Val Ala
                405                 410                 415
tgg ttt cac gcg cag cgg cgc cag acc ctg cag gag ggc ggc gtg gtg   1297
Trp Phe His Ala Gln Arg Arg Gln Thr Leu Gln Glu Gly Gly Val Val
            420                 425                 430
gtc ttg ctc ttc tct ccc ggt gcg gtg gcg ctg tgc agc gag tgg cta   1345
Val Leu Leu Phe Ser Pro Gly Ala Val Ala Leu Cys Ser Glu Trp Leu
        435                 440                 445
cag gat ggg gtg tcc ggg ccc ggg gcg cac ggc ccg cac gac gcc ttc   1393
Gln Asp Gly Val Ser Gly Pro Gly Ala His Gly Pro His Asp Ala Phe
    450                 455                 460
cgc gcc tcg ctc agc tgc gtg ctg ccc gac ttc ttg cag ggc cgg gcg   1441
Arg Ala Ser Leu Ser Cys Val Leu Pro Asp Phe Leu Gln Gly Arg Ala
465                 470                 475                 480
ccc ggc agc tac gtg ggg gcc tgc ttc gac agg ctg ctc cac ccg gac   1489
Pro Gly Ser Tyr Val Gly Ala Cys Phe Asp Arg Leu Leu His Pro Asp
                 485                490                 495
gcc gta ccc gcc ctt ttc cgc acc gtg ccc gtc ttc aca ctg ccc tcc   1537
Ala Val Pro Ala Leu Phe Arg Thr Val Pro Val Phe Thr Leu Pro Ser
            500                 505                 510
caa ctg cca gac ttc ctg ggg gcc ctg cag cag cct cgc gcc ccg cgt   1585
Gln Leu Pro Asp Phe Leu Gly Ala Leu Gln Gln Pro Arg Ala Pro Arg
        515                 520                 525
tcc ggg cgg ctc caa gag aga gcg gag caa gtg tcc cgg gcc ctt cag   1633
Ser Gly Arg Leu Gln Glu Arg Ala Glu Gln Val Ser Arg Ala Leu Gln
    530                 535                 540
cca gcc ctg gat agc tac ttc cat ccc ccg ggg act ccc gcg ccg gga   1681
Pro Ala Leu Asp Ser Tyr Phe His Pro Pro Gly Thr Pro Ala Pro Gly
545                 550                 555                 560
cgc ggg gtg gga cca ggg gcg gga cct ggg gcg ggg gac ggg act       1726
Arg Gly Val Gly Pro Gly Ala Gly Pro Gly Ala Gly Asp Gly Thr
                565                 570                 575
taaataaagg cagacgctgt ttttcta                                     1753
<210>5
<211>575
<212>PRT
<213>智人
<400>5
Glu Glu Pro Arg Asn Ala Ser Leu Gln Ala Gln ValVal Leu Ser Phe
 1               5                  10                 15
Gln Ala Tyr Pro Thr Ala Arg Cys Val Leu Leu Glu Val Gln Val Pro
            20                  25                  30
Ala Ala Leu Val Gln Phe Gly Gln Ser Val Gly Ser Val ValTyr Asp
        35                  40                  45
Cys Phe Glu Ala Ala Leu Gly Ser Glu Val Arg Ile Trp Ser Tyr Thr
    50                  55                  60
Gln Pro Arg Tyr Glu Lys Glu Leu Asn His Thr Gln Gln Leu Pro Ala
65                  70                  75                  80
Leu Pro Trp Leu Asn Val Ser Ala Asp GIy Asp Asn Val His Leu Val
                85                  90                  95
Leu Asn Val Ser Glu Glu Gln His Phe Gly Leu Ser Leu Tyr Trp Asn
            100                 105                 110
Gln Val Gln Gly Pro Pro Lys Pro Arg Trp His Lys Asn Leu Thr Gly
        115                 120                 125
Pro Gln Ile Ile Thr Leu Asn His Thr Asp Leu Val Pro Cys Leu Cys
    130                 135                 140
Ile Gln Val Trp Pro Leu Glu Pro Asp Ser Val Arg Thr Asn Ile Cys
145                 150                 155                 160
Pro Phe Arg Glu Asp Pro Arg Ala His Gln Asn Leu Trp Gln Ala Ala
                165                 170                 175
Arg Leu Arg Leu Leu Thr Leu Gln Ser Trp Leu Leu Asp Ala Pro Cys
            180                 185                 190
Ser Leu Pro Ala Glu Ala Ala Leu Cys Trp Arg Ala Pro Gly Gly Asp
        195                 200                 205
Pro Cys Gln Pro Leu Val Pro Pro Leu Ser Trp Glu Asn Val Thr Val
    210                 215                 220
Asp Val Asn Ser Ser Glu Lys Leu Gln Leu Gln Glu Cys Leu Trp Ala
225                 230                 235                 240
Asp Ser Leu Gly Pro Leu Lys Asp Asp Val Leu Leu Leu Glu Thr Arg
                245                 250                 255
Gly Pro Gln Asp Asn Arg Ser Leu Cys Ala Leu Glu Pro Ser Gly Cys
            260                 265                 270
Thr Ser Leu Pro Ser Lys Ala Ser Thr Arg Ala Ala Arg Leu Gly Glu
        275                 280                 285
Tyr Leu Leu Gln Asp Leu Gln Ser Gly Gln Cys Leu Gln Leu Trp Asp
    290                 295                 300
Asp Asp Leu Gly Ala Leu Trp Ala Cys Pro Met Asp Lys Tyr Ile His
305                 310                 315                 320
Lys Arg Trp Ala Leu ValTrp Leu Ala Cys Leu Leu Phe Ala Ala Ala
                325                330                 335
Leu Ser Leu Ile Leu Leu Leu Lys Lys Asp His Ala Lys Gly Trp Leu
            340                 345                 350
Arg Leu Leu Lys Gln Asp Val Arg Ser Gly Ala Ala Ala Arg Gly Arg
        355                 360                 365
Ala Ala Leu Leu Leu Tyr Ser Ala Asp Asp Ser Gly Phe Glu Arg Leu
    370                 375                 380
Val Gly Ala Leu Ala Ser Ala Leu Cys Gln Leu Pro Leu Arg Val Ala
385                 390                 395                 400
Val Asp Leu Trp Ser Arg Arg Glu Leu Ser Ala Gln Gly Pro Val Ala
                405                 410                 415
Trp Phe His Ala Gln Arg Arg Gln Thr Leu Gln Glu Gly Gly Val Val
            420                 425                 430
Val Leu Leu Phe Ser Pro Gly Ala Val Ala Leu Cys Ser Glu Trp Leu
        435                 440                 445
Gln Asp Gly Val Ser Gly Pro Gly Ala His Gly Pro His Asp Ala Phe
    450                 455                 460
Arg Ala Ser Leu Ser Cys Val Leu Pro Asp Phe Leu Gln Gly Arg Ala
465                 470                 475                 480
Pro Gly Ser Tyr Val Gly Ala Cys Phe Asp Arg Leu Leu His Pro Asp
                 485                490                 495
Ala Val Pro Ala Leu Phe Arg Thr Val Pro Val Phe Thr Leu Pro Ser
            500                 505                 510
Gln Leu Pro Asp Phe Leu Gly Ala Leu Gln Gln Pro Arg Ala Pro Arg
        515                 520                 525
Ser Gly Arg Leu Gln Glu Arg Ala Glu Gln Val Ser Arg Ala Leu Gln
    530                 535                 540
Pro Ala Leu Asp Ser Tyr Phe His Pro Pro Gly Thr Pro Ala Pro Gly
545                 550                 555                 560
Arg Gly Val Gly Pro Gly Ala Gly Pro Gly Ala Gly Asp Gly Thr
                565                 570                 575
<210>6
<211>1725
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>简并序列
<221>misc_feature
<222>(1)...(1725)
<223>n＝A，T，C或G
<400>6
gargarccnm gnaaygcnws nytncargcn cargtngtny tnwsnttyca rgcntayccn   60
acngcnmgnt gygtnytnyt ngargtncar gtnccngcng cnytngtnca rttyggncar  120
wsngtnggnw sngtngtnta ygaytgytty gargcngcny tnggnwsnga rgtnmgnath  180
tggwsntaya cncarccnmg ntaygaraar garytnaayc ayacncarca rytnccngcn  240
ytnccntggy tnaaygtnws ngcngayggn gayaaygtnc ayytngtnyt naaygtnwsn  300
gargarcarc ayttyggnyt nwsnytntay tggaaycarg tncarggncc nccnaarccn  360
mgntggcaya araayytnac nggnccncar athathacny tnaaycayac ngayytngtn  420
ccntgyytnt gyathcargt ntggccnytn garccngayw sngtnmgnac naayathtgy  480
ccnttymgng argayccnmg ngcncaycar aayytntggc argcngcnmg nytnmgnytn  540
ytnacnytnc arwsntggyt nytngaygcn ccntgywsny tnccngcnga rgcngcnytn  600
tgytggmgng cnccnggngg ngayccntgy carccnytng tnccnccnyt nwsntgggar  660
aaygtnacng tngaygtnaa ywsnwsngar aarytncary tncargartg yytntgggcn  720
gaywsnytng gnccnytnaa rgaygaygtn ytnytnytng aracnmgngg nccncargay  780
aaymgnwsny tntgygcnyt ngarccnwsn ggntgyacnw snytnccnws naargcnwsn  840
acnmgngcng cnmgnytngg ngartayytn ytncargayy tncarwsngg ncartgyytn  900
carytntggg aygaygayyt nggngcnytn tgggcntgyc cnatggayaa rtayathcay  960
aarmgntggg cnytngtntg gytngcntgy ytnytnttyg cngcngcnyt nwsnytnath 1020
ytnytnytna araargayca ygcnaarggn tggytnmgny tnytnaarca rgaygtnmgn 1080
wsnggngcng cngcnmgngg nmgngcngcn ytnytnytnt aywsngcnga ygaywsnggn 1140
ttygarmgny tngtnggngc nytngcnwsn gcnytntgyc arytnccnyt nmgngtngcn 1200
gtngayytnt ggwsnmgnmg ngarytnwsn gcncarggnc cngtngcntg gttycaygcn 1260
carmgnmgnc aracnytnca rgarggnggn gtngtngtny tnytnttyws nccnggngcn 1320
gtngcnytnt gywsngartg gytncargay ggngtnwsng gnccnggngc ncayggnccn 1380
caygaygcnt tymgngcnws nytnwsntgy gtnytnccng ayttyytnca rggnmgngcn 1440
ccnggnwsnt aygtnggngc ntgyttygay mgnytnytnc ayccngaygc ngtnccngcn 1500
ytnttymgna cngtnccngt nttyacnytn ccnwsncary tnccngaytt yytnggngcn 1560
ytncarcarc cnmgngcncc nmgnwsnggn mgnytncarg armgngcnga rcargtnwsn 1620
mgngcnytnc arccngcnyt ngaywsntay ttycayccnc cnggnacncc ngcnccnggn 1680
mgnggngtng gnccnggngc nggnccnggn gcnggngayg gnacn                 1725
<210>7
<211>2076
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>简并序列
<221>misc_feature
<222>(1)...(2076)
<223>n＝A，T，C或G
<400>7
atgccngtnc cntggttyyt nytnwsnytn gcnytnggnm gnwsnccngt ngtnytnwsn   60
ytngarmgny tngtnggncc ncargaygcn acncaytgyw snccnggnyt nwsntgymgn  120
ytntgggayw sngayathyt ntgyytnccn ggngayathg tnccngcncc nggnccngtn  180
ytngcnccna cncayytnca racngarytn gtnytnmgnt gycaraarga racngaytgy  240
gayytntgyy tnmgngtngc ngtncayytn gcngtncayg gncaytggga rgarccngar  300
gaygargara arttyggngg ngcngcngay wsnggngtng argarccnmg naaygcnwsn  360
ytncargcnc argtngtnyt nwsnttycar gcntayccna cngcnmgntg ygtnytnytn  420
gargtncarg tnccngcngc nytngtncar ttyggncarw sngtnggnws ngtngtntay  480
gaytgyttyg argcngcnyt nggnwsngar gtnmgnatht ggwsntayac ncarccnmgn  540
taygaraarg arytnaayca yacncarcar ytnccngcny tnccntggyt naaygtnwsn  600
gcngayggng ayaaygtnca yytngtnytn aaygtnwsng argarcarca yttyggnytn  660
wsnytntayt ggaaycargt ncarggnccn ccnaarccnm gntggcayaa raayytnacn  720
ggnccncara thathacnyt naaycayacn gayytngtnc cntgyytntg yathcargtn  780
tggccnytng arccngayws ngtnmgnacn aayathtgyc cnttymgnga rgayccnmgn  840
gcncaycara ayytntggca rgcngcnmgn ytnmgnytny tnacnytnca rwsntggytn  900
ytngaygcnc cntgywsnyt nccngcngar gcngcnytnt gytggmgngc nccnggnggn  960
gayccntgyc arccnytngt nccnccnytn wsntgggara aygtnacngt ngayaargtn 1020
ytngarttyc cnytnytnaa rggncayccn aayytntgyg tncargtnaa ywsnwsngar 1080
aarytncary tncargartg yytntgggcn gaywsnytng gnccnytnaa rgaygaygtn 1140
ytnytnytng aracnmgngg nccncargay aaymgnwsny tntgygcnyt ngarccnwsn 1200
ggntgyacnw snytnccnws naargcnwsn acnmgngcng cnmgnytngg ngartayytn 1260
ytncargayy tncarwsngg ncartgyytn carytntggg aygaygayyt nggngcnytn 1320
tgggcntgyc cnatggayaa rtayathcay aarmgntggg cnytngtntg gytngcntgy 1380
ytnytnttyg cngcngcnyt nwsnytnath ytnytnytna araargayca ygcnaargcn 1440
gcngcnmgng gnmgngcngc nytnytnytn taywsngcng aygaywsngg nttygarmgn 1500
ytngtnggng cnytngcnws ngcnytntgy carytnccny tnmgngtngc ngtngayytn 1560
tggwsnmgnm gngarytnws ngcncarggn ccngtngcnt ggttycaygc ncarmgnmgn 1620
caracnytnc argarggngg ngtngtngtn ytnytnttyw snccnggngc ngtngcnytn 1680
tgywsngart ggytncarga yggngtnwsn ggnccnggng cncayggncc ncaygaygcn 1740
ttymgngcnw snytnwsntg ygtnytnccn gayttyytnc arggnmgngc nccnggnwsn 1800
taygtnggng cntgyttyga ymgnytnytn cayccngayg cngtnccngc nytnttymgn 1860
acngtnccng tnttyacnyt nccnwsncar ytnccngayt tyytnggngc nytncarcar 1920
ccnmgngcnc cnmgnwsngg nmgnytncar garmgngcng arcargtnws nmgngcnytn 1980
carccngcny tngaywsnta yttycayccn ccnggnacnc cngcnccngg nmgnggngtn 2040
ggnccnggng cnggnccngg ngcnggngay ggnacn                           2076
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>8
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<210>9
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽连接体
<400>9
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
 1               5                  10                  15
<210>10
<211>688
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合Zcytor14蛋白
<400>10
Met Pro Val Pro Trp Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly Arg Ser Pro
 1               5                   10                 15
Val Val Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Gly Pro Gln Asp Ala Thr His
            20                  25                  30
Cys Ser Pro Gly Leu Ser Cys Arg Leu Trp Asp Ser Asp Ile Leu Cys
        35                  40                  45
Leu Pro Gly Asp Ile Val Pro Ala Pro Gly Pro Val Leu Ala Pro Thr
    50                  55                  60
His Leu Gln Thr Glu Leu Val Leu Arg Cys Gln Lys Glu Thr Asp Cys
65                  70                  75                  80
Asp Leu Cys Leu Arg Val Ala Val His Leu Ala Val His Gly His Trp
                85                  90                  95
Glu Glu Pro Glu Asp Glu Glu Lys Phe Gly Gly Ala Ala Asp Ser Gly
            100                 105                 110
Val Glu Glu Pro Arg Asn Ala Ser Leu Gln Ala Gln Val Val Leu Ser
        115                 120                 125
Phe Gln Ala Tyr Pro Thr Ala Arg Cys Val Leu Leu Glu Val Gln Val
    130                 135                 140
Pro Ala Ala Leu Val Gln Phe Gly Gln Ser Val Gly Ser Val Val Tyr
145                 150                 155                 160
Asp Cys Phe Glu Ala Ala Leu Gly Ser Glu Val Arg Ile Trp Ser Tyr
                165                 170                 175
Thr Gln Pro Arg Tyr Glu Lys Glu Leu Asn His Thr Gln Gln Leu Pro
            180                 185                 190
Ala Leu Pro Trp Leu Asn Val Ser Ala Asp Gly Asp Asn Val His Leu
        195                 200                 205
Val Leu Asn Val Ser Glu Glu Gln His Phe Gly Leu Ser Leu Tyr Trp
    210                 215                 220
Asn Gln Val Gln Gly Pro Pro Lys Pro Arg Trp His Lys Asn Leu Thr
225                 230                 235                 240
Gly Pro Gln Ile Ile Thr Leu Asn His Thr Asp Leu Val Pro Cys Leu
                245                 250                 255
Cys Ile Gln Val Trp Pro Leu Glu Pro Asp Ser Val Arg Thr Asn Ile
            260                 265                 270
Cys Pro Phe Arg Glu Asp Pro Arg Ala His Gln Asn Leu Trp Gln Ala
        275                 280                 285
Ala Arg Leu Arg Leu Leu Thr Leu Gln Ser Trp Leu Leu Asp Ala Pro
    290                 295                 300
Cys Ser Leu Pro Ala Glu Ala Ala Leu Cys Trp Arg Ala Pro Gly Gly
305                 310                 315                 320
Asp Pro Cys Gln Pro Leu Val Pro Pro Leu Ser Trp Glu Asn Val Thr
                325                 330                 335
Val Asp Val Asn Ser Ser Glu Lys Leu Gln Leu Gln Glu Cys Leu Trp
            340                 345                 350
Ala Asp Ser Leu Gly Pro Leu Lys Asp Asp Val Leu Leu Leu Glu Thr
        355                 360                 365
Arg Gly Pro Gln Asp Ash Arg Ser Leu Cys Ala Leu Glu Pro Ser Gly
    370                 375                 380
Cys Thr Ser Leu Pro Ser Lys Ala Ser Thr Arg Ala Ala Arg Leu Gly
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Glu Tyr Leu Leu Gln Asp Leu Gln Ser Gly Gln Cys Leu Gln Leu Trp
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Asp Asp Asp Leu Gly Ala Leu Trp Ala Cys Pro Met Asp Lys Tyr Ile
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His Lys Arg Trp Ala Leu Val Trp Leu Ala Cys Leu Leu Phe Ala Ala
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Ala Leu Ser Leu Ile Leu Leu Leu Lys Lys Asp His Ala Lys Gly Trp
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Leu Arg Leu Leu Lys Gln Asp Val Arg Ser Gly Ala Ala Ala Arg Gly
465                 470                 475                 480
Arg Ala Ala Leu Leu Leu Tyr Ser Ala Asp Asp Ser Gly Phe Glu Arg
                485                 490                 495
Leu Val Gly Ala Leu Ala Ser Ala Leu Cys Gln Leu Pro Leu Arg Val
            500                 505                 510
Ala Val Asp Leu Trp Ser Arg Arg Glu Leu Ser Ala Gln Gly Pro Val
        515                 520                 525
Ala Trp Phe His Ala Gln Arg Arg Gln Thr Leu Gln Glu Gly Gly Val
    530                 535                 540
Val Val Leu Leu Phe Ser Pro Gly Ala Val Ala Leu Cys Ser Glu Trp
545                 550                 555                 560
Leu Gln Asp Gly Val Ser Gly Pro Gly Ala His Gly Pro His Asp Ala
                565                 570                 575
Phe Arg Ala Ser Leu Ser Cys Val Leu Pro Asp Phe Leu Gln Gly Arg
            580                 585                 590
Ala Pro Gly Ser Tyr Val Gly Ala Cys Phe Asp Arg Leu Leu His Pro
        595                 600                 605
Asp Ala Val Pro Ala Leu Phe Arg Thr Val Pro Val Phe Thr Leu Pro
    610                 615                 620
Ser Gln Leu Pro Asp Phe Leu Gly Ala Leu Gln Gln Pro Arg Ala Pro
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Arg Ser Gly Arg Leu Gln Glu Arg Ala Glu Gln Val Ser Arg Ala Leu
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Gly Arg Gly Val Gly Pro Gly Ala Gly Pro Gly Ala Gly Asp Gly Thr
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合Zcytor14蛋白
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Val Val Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Gly Pro Gln Asp Ala Thr His
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Cys Ser Pro Gly Leu Ser Cys Arg Leu Trp Asp Ser Asp Ile Leu Cys
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Leu Pro Gly Asp Ile Val Pro Ala Pro Gly Pro Val Leu Ala Pro Thr
    50                  55                  60
His Leu Gln Thr Glu Leu Val Leu Arg Cys Gln Lys Glu Thr Asp Cys
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Phe Gln Ala Tyr Pro Thr Ala Arg Cys Val Leu Leu Glu Val Gln Val
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Ala Leu Pro Trp Leu Asn Val Ser Ala Asp Gly Asp Asn Val His Leu
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Cys Pro Phe Arg Glu Asp Pro Arg Ala His Gln Asn Leu Trp Gln Ala
        275                 280                 285
Ala Arg Leu Arg Leu Leu Thr Leu Gln Ser Trp Leu Leu Asp Ala Pro
    290                 295                 300
Cys Ser Leu Pro Ala Glu Ala Ala Leu Cys Trp Arg Ala Pro Gly Gly
305                 310                 315                 320
Asp Pro Cys Gln Pro Leu Val Pro Pro Leu Ser Trp Glu Asn Val Thr
                325                 330                 335
Val Asp Lys Val Leu Glu Phe Pro Leu Leu Lys Gly His Pro Asn Leu
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Cys Val Gln Val Asn Ser Ser Glu Lys Leu Gln Leu Gln Glu Cys Leu
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Trp Ala Asp Ser Leu Gly Pro Leu Lys Asp Asp Val Leu Leu Leu Glu
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Gly Cys Thr Ser Leu Pro Ser Lys Ala Ser Thr Arg Ala Ala Arg Leu
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Gly Glu Tyr Leu Leu Gln Asp Leu Gln Ser Gly Gln Cys Leu Gln Leu
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Ala Ala Leu Ser Leu Ile Leu Leu Leu Lys Lys Asp His Ala Lys Gly
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Trp Leu Arg Leu Leu Lys Gln Asp Val Arg Ser Gly Ala Ala Ala Arg
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Val Ala Val Asp Leu Trp Ser Arg Arg Glu Leu Ser Ala Gln Gly Pro
    530                 535                 540
Val Ala Trp Phe His Ala Gln Arg Arg Gln Thr Leu Gln Glu Gly Gly
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Val Val Val Leu Leu Phe Ser Pro Gly Ala Val Ala Leu Cys Ser Glu
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Trp Leu Gln Asp Gly Val Ser Gly Pro Gly Ala His Gly Pro His Asp
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Pro Asp Ala Val Pro Ala Leu Phe Arg Thr Val Pro Val Phe Thr Leu
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Pro Ser Gln Leu Pro Asp Phe Leu Gly Ala Leu Gln Gln Pro Arg Ala
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Pro Arg Ser Gly Arg Leu Gln Glu Arg Ala Glu Gln Val Ser Arg Ala
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Leu Gln Pro Ala Leu Asp Ser Tyr Phe His Pro Pro Gly Thr Pro Ala
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Pro Gly Arg Gly Val Gly Pro Gly Ala Gly Pro Gly Ala Gly Asp Gly
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Thr
705
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<213>人工序列
<220>
<223>嵌合Zcytor14蛋白
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Leu Pro Gly Asp Ile Val Pro Ala Pro Gly Pro Val Leu Ala Pro Thr
    50                  55                  60
His Leu Gln Thr Glu Leu Val Leu Arg Cys Gln Lys Glu Thr Asp Cys
65                  70                  75                  80
Asp Leu Cys Leu Arg Val Ala Val His Leu Ala Val His Gly His Trp
                85                  90                  95
Glu Glu Pro Glu Asp Glu Glu Lys Phe Gly Gly Ala Ala Asp Ser Gly
            100                 105                 110
Val Glu Glu Pro Arg Asn Ala Ser Leu Gln Ala Gln Val Val Leu Ser
        115                 120                 125
Phe Gln Ala Tyr Pro Thr Ala Arg Cys Val Leu Leu Glu Val Gln Val
    130                 135                 140
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                165                 170                 175
Thr Gln Pro Arg Tyr Glu Lys Glu Leu Asn His Thr Gln Gln Leu Pro
            180                 185                 190
Ala Leu Pro Trp Leu Asn Val Ser Ala Asp Gly Asp Asn Val His Leu
        195                 200                 205
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    210                 215                 220
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        275                 280                 285
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<212>DNA
<213>智人
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cctcagatta ctacaaccga tccacctcac cttggaatct ccaccgcaat gaggaccctg  300
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catactatta gccaatgctg tagacagaag cattttgata ggaatagagc aaataagata 1500
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tctcttcctc aagcaacact cctagggcct ggcttctgtc tgatcaaggc accacacaac 1740
ccagaaagga gctgatgggg cagaatgaac tttaagtatg agaaaagttc agcccaagta 1800
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ttcgcccgga attc                                                   1874
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<213>智人
<400>14
Met Thr Pro Gly Lys Thr Ser Leu Val Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ser
 1               5                   10                 15
Leu Glu Ala Ile Val Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly
            20                  25                  30
Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn
        35                  40                  45
Leu Asn Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser
    50                  55                  60
Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu
65                  70                  75                  80
Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His
                85                  90                  95
Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser
            100                 105                 110
Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His
        115                 120                 125
Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys
    130                 135                 140
Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala
145                 150                 155
<210>15
<211>923
<212>DNA
<213>智人
<400>15
ggcttcagtt actagctagg ctactgagtt tagttctcag tttggcacct tgataccttt   60
aggtgtgagt gttcccattt ccaggtgagg aactgaggtg caaagagaag ccctgatccc  120
ataaaaggac aggaatgctg agttccgcca gaccatgcat ctcttgctag taggtgaggc  180
gagtctctaa ctgattgcag cgtcttctat tttccaggtc aagtacttgc tgctgtcgat  240
attggggctt gcctttctga gtgaggcggc agctcggaaa atccccaaag taggacatac  300
ttttttccaa aagcctgaga gttgcccgcc tgtgccagga ggtagtatga agcttgacat  360
tggcatcatc aatgaaaacc agcgcgtttc catgtcacgt aacatcgaga gccgctccac  420
ctccccctgg aattacactg tcacttggga ccccaaccgg tacccctcgg aagttgtaca  480
ggcccagtgt aggaacttgg gctgcatcaa tgctcaagga aaggaagaca tctccatgaa  540
ttccgttccc atccagcaag agaccctggt cgtccggagg aagcaccaag gctgctctgt  600
ttctttccag ttggagaagg tgctggtgac tgttggctgc acctgcgtca cccctgtcat  660
ccaccatgtg cagtaagagg tgcatatcca ctcagctgaa gaagctgtag aaatgccact  720
ccttacccag tgctctgcaa caagtcctgt ctgaccccca attccctcca cttcacagga  780
ctcttaataa gacctgcacg gatggaaaca taaaatattc acaatgtatg tgtgtatgta  840
ctacacttta tatttgatat ctaaaatgtt aggagaaaaa ttaatatatt cagtgctaat  900
ataataaagt attaataatg tta                                          923
<210>16
<211>153
<212>PRT
<213>智人
<400>16
Met Val Lys Tyr Leu Leu Leu Ser Ile Leu Gly Leu Ala Phe Leu Ser
 1               5                  10                   15
Glu Ala Ala Ala Arg Lys Ile Pro Lys Val Gly His Thr Phe Phe Gln
            20                  25                  30
Lys Pro Glu Ser Cys Pro Pro Val Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Asp
        35                  40                  45
Ile Gly Ile Ile Asn Glu Asn Gln Arg Val Ser Met Ser Arg Asn Ile
    50                  55                  60
Glu Ser Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Tyr Thr Val Thr Trp Asp Pro
65                  70                  75                  80
Asn Arg Tyr Pro Ser Glu Val Val Gln Ala Gln Cys Arg Asn Leu Gly
                85                  90                  95
Cys Ile Asn Ala Gln Gly Lys Glu Asp Ile Ser Met Asn Ser Val Pro
            100                 105                 110
Ile Gln Gln Glu Thr Leu Val Val Arg Arg Lys His Gln Gly Cys Ser
        115                 120                 125
Val Ser Phe Gln Leu Glu Lys Val Leu Val Thr Val Gly Cys Thr Cys
    130                 135                 140
Val Thr Pro Val Ile His His Val Gln
145                150
<210>17
<211>1172
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>17
gatccacctc acacgaggca caagtgcacc cagcaccagc tgatcaggac gcgcaaacat   60
gagtccaggg agagcttcat ctgtgtctct gatgctgttg ctgctgctga gcctggcggc  120
tacagtgaag gcagcagcga tcatccctca aagctcagcg tgtccaaaca ctgaggccaa  180
ggacttcctc cagaatgtga aggtcaacct caaagtcttt aactcccttg gcgcaaaagt  240
gagctccaga aggccctcag actacctcaa ccgttccacg tcaccctgga ctctccaccg  300
caatgaagac cctgatagat atccctctgt gatctgggaa gctcagtgcc gccaccagcg  360
ctgtgtcaat gcggagggaa agctggacca ccacatgaat tctgttctca tccagcaaga  420
gatcctggtc ctgaagaggg agcctgagag ctgccccttc actttcaggg tcgagaagat  480
gctggtgggt gtgggctgca cctgcgtggc ctcgattgtc cgccaggcag cctaaacaga  540
gacccgcggc tgacccctaa gaaaccccca cgtttctcag caaacttact tgcattttta  600
aaacagttcg tgctattgat tttcagcaag gaatgtggat tcagaggcag attcagaatt  660
gtctgccctc cacaatgaaa agaaggtgta aaggggtccc aaactgcttc gtgtttgttt  720
ttctgtggac tttaaattat ttgtgtattt acaatatccc aagatagctt tgaagcgtaa  780
cttattttaa tgaagtatct acattattat tatgtttctt tctgaagaag acaaaattca  840
agactcagaa attttattat ttaaaaggta aagcctatat ttatatgagc tatttatgaa  900
tctatttatt tttcttcagt atttgaagta ttaagaacat gattttcaga tctacctagg  960
gaagtcctaa gtaagattaa atattaatgg aaatttcagc tttactattt gtttatttaa 1020
ggttctctcc tctgaatggg gtgaaaacca aacttagttt tatgtttaat aactttttaa 1080
attattgaag attcaaaaaa ttggataatt tagctcccta ctctgtttta aaaaaaaatt 1140
gtaacaatat cactgtaata ataaagtttt gg                               1172
<210>18
<211>158
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>18
Met Ser Pro Gly Arg Ala Ser Ser Val Ser Leu Met Leu Leu Leu Leu
 1               5                  10                  15
Leu Ser Leu Ala Ala Thr Val Lys Ala Ala Ala Ile Ile Pro Gln Ser
            20                  25                  30
Ser Ala Cys Pro Asn Thr Glu Ala Lys Asp Phe Leu Gln Asn Val Lys
        35                  40                  45
Val Asn Leu Lys Val Phe Asn Ser Leu Gly Ala Lys Val Ser Ser Arg，
    50                  55                  60
Arg Pro Ser Asp Tyr Leu Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Thr Leu His
65                  70                  75                  80
Arg Asn Glu Asp Pro Asp Arg Tyr Pro Set Val Ile Trp Glu Ala Gln
                85                  90                  95
Cys Arg His Gln Arg Cys Val Asn Ala Glu Gly Lys Leu Asp His His
            100                 105                 110
Met Asn Set Val Leu Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Lys Arg Glu
        115                 120                 125
Pro Glu Set Cys Pro Phe Thr Phe Arg Val Glu Lys Met Leu Val Gly
    130                 135                 140
Val Gly Cys Thr Cys Val Ala Set Ile Val Arg Gln Ala Ala
145                 150                 155
<210>19
<211>462
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>19
atggtcaagt ctttgctact gttgatgttg ggacttgcca ttctgaggga ggtagcagct   60
cggaagaacc ccaaagcagg ggttcctgcc ttgcagaagg ctgggaactg tcctcccctg  120
gaggataaca ctgtgagagt tgacattcga atcttcaacc aaaaccaggg catttctgtc  180
ccacgtgaat tccagaaccg ctccagttcc ccatgggatt acaacatcac tcgagacccc  240
caccggttcc cctcagagat cgctgaggcc cagtgcagac actcaggctg catcaatgcc  300
cagggtcagg aagacagcac catgaactcc gtcgccattc agcaagaaat cctggtcctt  360
cggagggagc cccagggctg ttctaattcc ttcaggttgg agaagatgct cctaaaagtt  420
ggctgcacct gtgtcaagcc cattgtccac caagcggcct ga                     462
<210>20
<211>153
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>20
Met Val Lys Ser Leu Leu Leu Leu Met Leu Gly Leu Ala Ile Leu Arg
 1               5                  10                  15
Glu Val Ala Ala Arg Lys Asn Pro Lys Ala Gly Val Pro Ala Leu Gln
            20                  25                  30
Lys Ala Gly Asn Cys Pro Pro Leu Glu Asp Asn Thr Val Arg Val Asp
        35                  40                  45
Ile Arg Ile Phe Asn Gln Asn Gln Gly Ile Ser Val Pro Arg Glu Phe
    50                  55                  60
Gln Asn Arg Ser Ser Ser Pro Trp Asp Tyr Asn Ile Thr Arg Asp Pro
65                  70                  75                  80
His Arg Phe Pro Ser Glu Ile Ala Glu Ala Gln Cys Arg His Ser Gly
                85                  90                  95
Cys Ile Asn Ala Gln Gly Gln Glu Asp Ser Thr Met Asn Ser Val Ala
            100                 105                 110
Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Gln Gly Cys Ser
        115                 120                 125
Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Met Leu Leu Lys Val Gly Cys Thr Cys
    130                 135                 140
Val Lys Pro Ile Val His Gln Ala Ala
145                 150
<210>21
<211>320
<212>PRT
<213>智人
<400>21
Met Gly Ala Ala Arg Ser Pro Pro Ser Ala Val Pro Gly Pro Leu Leu
 1               5                  10                  15
Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ala Pro Gly Gly Ala Ser
            20                  25                  30
Leu Arg Leu Leu Asp His Arg Ala Leu Val Cys Ser Gln Pro Gly Leu
        35                  40                  45
Asn Cys Thr Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp Ser Trp Ile His
    50                  55                  60
Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp Leu Gln Ile Gln Leu
65                  70                  75                  80
His Phe Ala His Thr Gln Gln Gly Asp Leu Phe Pro Val Ala His Ile
                85                  90                  95
Glu Trp Thr Leu Gln Thr Asp Ala Ser Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala
            100                 105                 110
Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg Leu Cys Val Arg
        115                 120                 125
Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu Arg His His His Arg Arg Trp Arg Phe
    130                 135                 140
Thr Phe Ser His Phe Val Val Asp Pro Asp Gln Glu Tyr Glu Val Thr
145                 150                 155                 160
Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gln
                165                 170                 175
Ser Lys Asn Phe Leu Val Pro Asp Cys Glu His Ala Arg Met Lys Val
            180                 185                 190
Thr Thr Pro Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr
        195                 200                 205
Val Glu Thr Leu Glu Ala His Gln Leu Arg Val Ser Phe Thr Leu Trp
    210                 215                 220
Asn Glu Ser Thr His Tyr Gln Ile Leu Leu Thr Ser Phe Pro His Met
225                 230                 235                 240
Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His Ile Pro Ala Pro Arg
                245                 250                 255
Pro Glu Glu Phe His Gln Arg Ser Asn Val Thr Leu Thr Leu Arg Asn
            260                 265                 270
Leu Lys Gly Cys Cys Arg His Gln Val Gln Ile Gln Pro Phe Phe Ser
        275                 280                 285
Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Ala Thr Val Ser Cys Pro
    290                 295                 300
Glu Met Pro Asp Thr Pro Glu Pro Ile Pro Asp Tyr Met Pro Leu Trp
305                 310                 315                 320
<210>22
<211>221
<212>PRT
<213>智人
<400>22
Lys Pro Arg Trp His Lys Asn Leu Thr Gly Pro Gln Ile Ile Thr Leu
 1               5                  10                  15
Asn His Thr Asp Leu Val Pro Cys Leu Cys Ile Gln Val Trp Pro Leu
            20                  25                  30
Glu Pro Asp Ser Val Arg Thr Asn Ile Cys Pro Phe Arg Glu Asp Pro
        35                  40                  45
Arg Ala His Gln Asn Leu Trp Gln Ala Ala Arg Leu Arg Leu Leu Thr
    50                  55                  60
Leu Gln Ser Trp Leu Leu Asp Ala Pro Cys Ser Leu Pro Ala Glu Ala
65                  70                  75                  80
Ala Leu Cys Trp Arg Ala Pro Gly Gly Asp Pro Cys Gln Pro Leu Val
                85                  90                  95
Pro Pro Leu Ser Trp Glu Asn Val Thr Val Asp Lys Val Leu Glu Phe
            100                 105                 110
Pro Leu Leu Lys Gly His Pro Asn Leu Cys Val Gln Val Asn Ser Ser
        115                 120                 125
Glu Lys Leu Gln Leu Gln Glu Cys Leu Trp Ala Asp Ser Leu Gly Pro
    130                 135                 140
Leu Lys Asp Asp Val Leu Leu Leu Glu Thr Arg Gly Pro Gln Asp Asn
145                 150                 155                 160
Arg Ser Leu Cys Ala Leu Glu Pro Ser Gly Cys Thr Ser Leu Pro Ser
                165                 170                 175
Lys Ala Ser Thr Arg Ala Ala Arg Leu Gly Glu Tyr Leu Leu Gln Asp
            180                 185                 190
Leu Gln Ser Gly Gln Cys Leu Gln Leu Trp Asp Asp Asp Leu Gly Ala
        195                 200                 205
Leu Trp Ala Cys Pro Met Asp Lys Tyr Ile His Lys Arg
    210                215                  220
<210>23
<211>2180
<212>DNA
<213>智人
<400>23
aactacccag cacagccccc tccgccccct ctggaggctg aagagggatt ccagcccctg   60
ccacccacag acacgggctg actggggtgt ctgcccccct tggggggggg cagcacaggg  120
cctcaggcct gggtgccacc tggcacctag aagatgcctg tgccctggtt cttgctgtcc  180
ttggcactgg gccgaagccc agtggtcctt tctctggaga ggcttgtggg gcctcaggac  240
gctacccact gctctccggg cctctcctgc cgcctctggg acagtgacat actctgcctg  300
cctggggaca tcgtgcctgc tccgggcccc gtgctggcgc ctacgcacct gcagacagag  360
ctggtgctga ggtgccagaa ggagaccgac tgtgacctct gtctgcgtgt ggctgtccac  420
ttggccgtgc atgcctctct ccaggcccaa gtcgtgctct ccttccaggc ctaccctact  480
gcccgctgcg tcctgctgga ggtgcaagtg cctgctgccc ttgtgcagtt tggtcagtct  540
gtgggctctg tggtatatga ctgcttcgag gctgccctag ggagtgaggt acgaatctgg  600
tcctatactc agcccaggta cgagaaggaa ctcaaccaca cacagcagct gcctgccctg  660
ccctggctca acgtgtcagc agatggtgac aacgtgcatc tggttctgaa tgtctctgag  720
gagcagcact tcggcctctc cctgtactgg aatcaggtcc agggcccccc aaaaccccgg  780
tggcacaaaa acctgactgg accgcagatc attaccttga accacacaga cctggttccc  840
tgcctctgta ttcaggtgtg gcctctggaa cctgactccg ttaggacgaa catctgcccc  900
ttcagggagg acccccgcgc acaccagaac ctctggcaag ccgcccgact gcgactgctg  960
accctgcaga gctggctgct ggacgcaccg tgctcgctgc ccgcagaagc ggcactgtgc 1020
tggcgggctc cgggtgggga cccctgccag ccactggtcc caccgctttc ctgggagaac 1080
gtcactgtgg acaaggttct cgagttccca ttgctgaaag gccaccctaa cctctgtgtt 1140
caggtgaaca gctcggagaa gctgcagctg caggagtgct tgtgggctga ctccctgggg 1200
cctctcaaag acgatgtgct actgttggag acacgaggcc cccaggacaa cagatccctc 1260
tgtgccttgg aacccagtgg ctgtacttca ctacccagca aagcctccac gagggcagct 1320
cgccttggag agtacttact acaagacctg cagtcaggcc agtgtctgca gctatgggac 1380
gatgacttgg gagcgctatg ggcctgcccc atggacaaat acatccacaa gcgctgggcc 1440
ctcgtgtggc tggcctgcct actctttgcc gctgcgcttt ccctcatcct ccttctcaaa 1500
aaggatcacg cgaaagcggc cgccaggggc cgcgcggctc tgctcctcta ctcagccgat 1560
gactcgggtt tcgagcgcct ggtgggcgcc ctggcgtcgg ccctgtgcca gctgccgctg 1620
cgcgtggccg tagacctgtg gagccgtcgt gaactgagcg cgcaggggcc cgtggcttgg 1680
tttcacgcgc agcggcgcca gaccctgcag gagggcggcg tggtggtctt gctcttctct 1740
cccggtgcgg tggcgctgtg cagcgagtgg ctacaggatg gggtgtccgg gcccggggcg 1800
cacggcccgc acgacgcctt ccgcgcctcg ctcagctgcg tgctgcccga cttcttgcag 1860
ggccgggcgc ccggcagcta cgtgggggcc tgcttcgaca ggctgctcca cccggacgcc 1920
gtacccgccc ttttccgcac cgtgcccgtc ttcacactgc cctcccaact gccagacttc 1980
ctgggggccc tgcagcagcc tcgcgccccg cgttccgggc ggctccaaga gagagcggag 2040
caagtgtccc gggcccttca gccagccctg gatagctact tccatccccc ggggactccc 2100
gcgccgggac gcggggtggg accaggggcg ggacctgggg cgggggacgg gacttaaata 2160
aaggcagacg ctgtttttct                                             2180
<210>24
<211>667
<212>PRT
<213>智人
<400>24
Met Pro Val Pro Trp Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly Arg Ser Pro
 1               5                  10                  15
Val Val Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Gly Pro Gln Asp Ala Thr His
            20                  25                  30
Cys Ser Pro Gly Leu Ser Cys Arg Leu Trp Asp Ser Asp Ile Leu Cys
        35                  40                  45
Leu Pro Gly Asp Ile Val Pro Ala Pro Gly Pro Val Leu Ala Pro Thr
    50                  55                  60
His Leu Gln Thr Glu Leu Val Leu Arg Cys Gln Lys Glu Thr Asp Cys
65                  70                  75                  80
Asp Leu Cys Leu Arg Val Ala Val His Leu Ala Val His Ala Ser Leu
                85                  90                  95
Gln Ala Gln Val Val Leu Ser Phe Gln Ala Tyr Pro Thr Ala Arg Cys
            100                 105                 110
Val Leu Leu Glu Val Gln Val Pro Ala Ala Leu Val Gln Phe Gly Gln
        115                 120                 125
Ser Val Gly Ser Val Val Tyr Asp Cys Phe Glu Ala Ala Leu Gly Ser
    130                 135                 140
Glu Val Arg Ile Trp Ser Tyr Thr Gln Pro Arg Tyr Glu Lys Glu Leu
145                 150                 155                 160
Asn His Thr Gln Gln Leu Pro Ala Leu Pro Trp Leu Asn Val Ser Ala
                165                 170                 175
Asp Gly Asp Asn Val His Leu Val Leu Asn Val Ser Glu Glu Gln His
            180                 185                 190
Phe Gly Leu Ser Leu Tyr Trp Asn Gln Val Gln Gly Pro Pro Lys Pro
        195                 200                 205
Arg Trp His Lys Asn Leu Thr Gly Pro Gln Ile Ile Thr Leu Asn His
    210                 215                 220
Thr Asp Leu Val Pro Cys Leu Cys Ile Gln Val Trp Pro Leu Glu Pro
225                 230                 235                 240
Asp Ser Val Arg Thr Asn Ile Cys Pro Phe Arg Glu Asp Pro Arg Ala
                245                 250                 255
His Gln Asn Leu Trp Gln Ala Ala Arg Leu Arg Leu Leu Thr Leu Gln
            260                 265                 270
Ser Trp Leu Leu Asp Ala Pro Cys Ser Leu Pro Ala Glu Ala Ala Leu
        275                 280                 285
Cys Trp Arg Ala Pro Gly Gly Asp Pro Cys Gln Pro Leu Val Pro Pro
    290                 295                 300
Leu Ser Trp Glu Asn Val Thr Val Asp Lys Val Leu Glu Phe Pro Leu
305                 310                 315                 320
Leu Lys Gly His Pro Asn Leu Cys Val Gln Val Asn Ser Ser Glu Lys
                325                 330                 335
Leu Gln Leu Gln Glu Cys Leu Trp Ala Asp Ser Leu Gly Pro Leu Lys
            340                 345                 350
Asp Asp Val Leu Leu Leu Glu Thr Arg Gly Pro Gln Asp Asn Arg Ser
        355                 360                 365
Leu Cys Ala Leu Glu Pro Ser Gly Cys Thr Ser Leu Pro Ser Lys Ala
    370                 375                 380
Ser Thr Arg Ala Ala Arg Leu Gly Glu Tyr Leu Leu Gln Asp Leu Gln
385                 390                 395                 400
Ser Gly Gln Cys Leu Gln Leu Trp Asp Asp Asp Leu Gly Ala Leu Trp
                405                 410                 415
Ala Cys Pro Met Asp Lys Tyr Ile His Lys Arg Trp Ala Leu Val Trp
            420                 425                 430
Leu Ala Cys Leu Leu Phe Ala Ala Ala Leu Ser Leu Ile Leu Leu Leu
        435                 440                 445
Lys Lys Asp His Ala Lys Ala Ala Ala Arg Gly Arg Ala Ala Leu Leu
    450                 455                 460
Leu Tyr Ser Ala Asp Asp Ser Gly Phe Glu Arg Leu Val Gly Ala Leu
465                 470                 475                 480
Ala Ser Ala Leu Cys Gln Leu Pro Leu Arg Val Ala Val Asp Leu Trp
                485                 490                 495
Ser Arg Arg Glu Leu Ser Ala Gln Gly Pro Val Ala Trp Phe His Ala
            500                 505                 510
Gln Arg Arg Gln Thr Leu Gln Glu Gly Gly Val Val Val Leu Leu Phe
        515                 520                 525
Ser Pro Gly Ala Val Ala Leu Cys Ser Glu Trp Leu Gln Asp Gly Val
    530                 535                 540
Ser Gly Pro Gly Ala His Gly Pro His Asp Ala Phe Arg Ala Ser Leu
545                 550                 555                 560
Ser Cys Val Leu Pro Asp Phe Leu Gln Gly Arg Ala Pro Gly Ser Tyr
                565                 570                 575
Val Gly Ala Cys Phe Asp Arg Leu Leu His Pro Asp Ala Val Pro Ala
            580                 585                 590
Leu Phe Arg Thr Val Pro Val Phe Thr Leu Pro Ser Gln Leu Pro Asp
        595                 600                 605
Phe Leu Gly Ala Leu Gln Gln Pro Arg Ala Pro Arg Ser Gly Arg Leu
   610                  615                 620
Gln Glu Arg Ala Glu Gln Val Ser Arg Ala Leu Gln Pro Ala Leu Asp
625                 630                 635                 640
Ser Tyr Phe His Pro Pro Gly Thr Pro Ala Pro Gly Arg Gly Val Gly
                645                 650                 655
Pro Gly Ala Gly Pro Gly Ala Gly Asp Gly Thr
            660                665
<210>25
<211>2269
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>25
aaatcgaaag cactccagct gaaactgggc ctggagtcca ggctcactgg agtggggaag   60
catggctgga gaggaattct agcccttgct ctctcccagg gacacggggc tgattgtcag  120
caggggcgag gggtctgccc ccccttgggg gggcaggacg gggcctcagg cctgggtgct  180
gtccggcacc tggaagatgc ctgtgtcctg gttcctgctg tccttggcac tgggccgaaa  240
ccctgtggtc gtctctctgg agagactgat ggagcctcag gacactgcac gctgctctct  300
aggcctctcc tgccacctct gggatggtga cgtgctctgc ctgcctggaa gcctccagtc  360
tgccccaggc cctgtgctag tgcctacccg cctgcagacg gagctggtgc tgaggtgtcc  420
acagaagaca gattgcgccc tctgtgtccg tgtggtggtc cacttggccg tgcatgggca  480
ctgggcagag cctgaagaag ctggaaagtc tgattcagaa ctccaggagt ctaggaacgc  540
ctctctccag gcccaggtgg tgctctcctt ccaggcctac cccatcgccc gctgtgccct  600
gctggaggtc caggtgcccg ctgacctggt gcagcctggt cagtccgtgg gttctgcggt  660
atttgactgt ttcgaggcta gtcttggggc tgaggtacag atctggtcct acacgaagcc  720
caggtaccag aaagagctca acctcacaca gcagctgcct gtcctgccct ggctcaatgt  780
gtctacagat ggtgacaatg tccttctgac actggatgtc tctgaggagc aggactttag  840
cttcttactg tacctgcgtc cagtcccgga tgctctcaaa tccttgtggt acaaaaacct  900
gactggacct cagaacatta ctttaaacca cacagacctg gttccctgcc tctgcattca  960
ggtgtggtcg ctagagccag actctgagag ggtcgaattc tgccccttcc gggaagatcc 1020
cggtgcacac aggaacctct ggcacatagc caggctgcgg gtactgtccc caggggtatg 1080
gcagctagat gcgccttgct gtctgccggg caaggtaaca ctgtgctggc aggcaccaga 1140
ccagagtccc tgccagccac ttgtgccacc agtgccccag aagaacgcca ctgtgaatga 1200
gccacaagat ttccagttgg tggcaggcca ccccaacctc tgtgtccagg tgagcacctg 1260
ggagaaggtt cagctgcaag cgtgcttgtg ggctgactcc ttggggccct tcaaggatga 1320
tatgctgtta gtggagatga aaaccggcct caacaacaca tcagtctgtg ccttggaacc 1380
cagtggctgt acaccactgc ccagcatggc ctccacgaga gctgctcgcc tgggagagga 1440
gttgctgcaa gacttccgat cacaccagtg tatgcagctg tggaacgatg acaacatggg 1500
atcgctatgg gcctgcccca tggacaagta catccacagg cgctgggtcc tagtatggct 1560
ggcctgccta ctcttggctg cggcgctttt cttcttcctc cttctaaaaa aggaccgcag 1620
gaaagcggcc cgtggctccc gcacggcctt gctcctccac tccgccgacg gagcgggcta 1680
cgagcgtctg gtgggagcac tggcgtccgc gttgagccag atgccactgc gcgtggccgt 1740
ggacctgtgg agccgccgcg agctgagcgc gcacggagcc ctagcctggt tccaccacca 1800
gcgacgccgt atcctgcagg agggtggcgt ggtaatcctt ctcttctcgc ccgcggccgt 1860
ggcgcagtgt cagcagtggc tgcagctcca gacagtggag cccgggccgc atgacgccct 1920
cgccgcctgg ctcagctgcg tgctacccga tttcctgcaa ggccgggcga ccggccgcta 1980
cgtcggggtc tacttcgacg ggctgctgca cccagactct gtgccctccc cgttccgcgt 2040
cgccccgctc ttctccctgc cctcgcagct gccggctttc ctggatgcac tgcagggagg 2100
ctgctccact tccgcggggc gacccgcgga ccgggtggaa cgagtgaccc aggcgctgcg 2160
gtccgccctg gacagctgta cttctagctc ggaagcccca ggctgctgcg aggaatggga 2220
cctgggaccc tgcactacac tagaataaaa gccgatacag tattcctaa             2269
<210>26
<211>683
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>26
Met Pro Val Ser Trp Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly Arg Asn Pro
 1               5                  10                  15
Val Val Val Ser Leu Glu Arg Leu Met Glu Pro Gln Asp Thr Ala Arg
            20                  25                  30
Cys Ser Leu Gly Leu Ser Cys His Leu Trp Asp Gly Asp Val Leu Cys
        35                  40                  45
Leu Pro Gly Ser Leu Gln Ser Ala Pro Gly Pro Val Leu Val Pro Thr
    50                  55                  60
Arg Leu Gln Thr Glu Leu Val Leu Arg Cys Pro Gln Lys Thr Asp Cys
65                  70                  75                  80
Ala Leu Cys Val Arg Val Val Val His Leu Ala Val His Gly His Trp
                85                  90                  95
Ala Glu Pro Glu Glu Ala Gly Lys Ser Asp Ser Glu Leu Gln Glu Ser
            100                 105                 110
Arg Asn Ala Ser Leu Gln Ala Gln Val Val Leu Ser Phe Gln Ala Tyr
        115                 120                 125
Pro Ile Ala Arg Cys Ala Leu Leu Glu Val Gln Val Pro Ala Asp Leu
    130                 135                 140
Val Gln Pro Gly Gln Ser Val Gly Ser Ala Val Phe Asp Cys Phe Glu
145                 150                 155                 160
Ala Ser Leu Gly Ala Glu Val Gln Ile Trp Ser Tyr Thr Lys Pro Arg
                165                 170                 175
Tyr Gln Lys Glu Leu Asn Leu Thr Gln Gln Leu Pro Val Leu Pro Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Val Ser Thr Asp Gly Asp Asn Val Leu Leu Thr Leu Asp Val
        195                 200                 205
Ser Glu Glu Gln Asp Phe Ser Phe Leu Leu Tyr Leu Arg Pro Val Pro
    210                 215                 220
Asp Ala Leu Lys Ser Leu Trp Tyr Lys Asn Leu Thr Gly Pro Gln Asn
225                 230                 235                 240
Ile Thr Leu Asn His Thr Asp Leu Val Pro Cys Leu Cys Ile Gln Val
                245                 250                 255
Trp Ser Leu Glu Pro Asp Ser Glu Arg Val Glu Phe Cys Pro Phe Arg
            260                 265                 270
Glu Asp Pro Gly Ala His Arg Asn Leu Trp His Ile Ala Arg Leu Arg
        275                 280                 285
Val Leu Ser Pro Gly Val Trp Gln Leu Asp Ala Pro Cys Cys Leu Pro
    290                 295                 300
Gly Lys Val Thr Leu Cys Trp Gln Ala Pro Asp Gln Ser Pro Cys Gln
305                 310                 315                 320
Pro Leu Val Pro Pro Val Pro Gln Lys Asn Ala Thr Val Asn Glu Pro
                325                 330                 335
Gln Asp Phe Gln Leu Val Ala Gly His Pro Asn Leu Cys Val Gln Val
            340                 345                 350
Ser Thr Trp Glu Lys Val Gln Leu Gln Ala Cys Leu Trp Ala Asp Ser
        355                 360                 365
Leu Gly Pro Phe Lys Asp Asp Mer Leu Leu Val Glu Mer Lys Thr Gly
    370                 375                 380
Leu Asn Asn Thr Ser Val Cys Ala Leu Glu Pro Ser Gly Cys Thr Pro
385                 390                 395                 400
Leu Pro Ser Met Ala Ser Thr Arg Ala Ala Arg Leu Gly Glu Glu Leu
                405                 410                 415
Leu Gln Asp Phe Arg Ser His Gln Cys Met Gln Leu Trp Asn Asp Asp
            420                 425                 430
Asn Met Gly Ser Leu Trp Ala Cys Pro Met Asp Lys Tyr Ile His Arg
        435                 440                 445
Arg Trp Val Leu Val Trp Leu Ala Cys Leu Leu Leu Ala Ala Ala Leu
    450                 455                 460
Phe Phe Phe Leu Leu Leu Lys Lys Asp Arg Arg Lys Ala Ala Arg Gly
465                 470                 475                 480
Ser Arg Thr Ala Leu Leu Leu His Ser Ala Asp Gly Ala Gly Tyr Glu
                485                 490                 495
Arg Leu Val Gly Ala Leu Ala Ser Ala Leu Ser Gln Met Pro Leu Arg
            500                 505                 510
Val Ala Val Asp Leu Trp Ser Arg Arg Glu Leu Ser Ala His Gly Ala
        515                 520                 525
Leu Ala Trp Phe His His Gln Arg Arg Arg Ile Leu Gln Glu Gly Gly
   530                  535                 540
Val Val Ile Leu Leu Phe Ser Pro Ala Ala Val Ala Gln Cys Gln Gln
545                 550                 555                 560
Trp Leu Gln Leu Gln Thr Val Glu Pro Gly Pro His Asp Ala Leu Ala
                565                 570                 575
Ala Trp Leu Ser Cys Val Leu Pro Asp Phe Leu Gln Gly Arg Ala Thr
            580                 585                 590
Gly Arg Tyr Val Gly Val Tyr Phe Asp Gly Leu Leu His Pro Asp Ser
        595                 600                 605
Val Pro Ser Pro Phe Arg Val Ala Pro Leu Phe Ser Leu Pro Ser Gln
    610                 615                 620
Leu Pro Ala Phe Leu Asp Ala Leu Gln Gly Gly Cys Ser Thr Ser Ala
625                 630                 635                 640
Gly Arg Pro Ala Asp Arg Val Glu Arg Val Thr Gln Ala Leu Arg Ser
                645                 650                 655
Ala Leu Asp Ser Cys Thr Ser Ser Ser Glu Ala Pro Gly Cys Cys Glu
            660                 665                 670
Glu Trp Asp Leu Gly Pro Cys Thr Thr Leu Glu
        675                 680
<210>27
<211>449
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>27
Met Pro Val Ser Trp Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly Arg Asn Pro
 1               5                  10                  15
Val Val Val Ser Leu Glu Arg Leu Met Glu Pro Gln Asp Thr Ala Arg
            20                  25                  30
Cys Ser Leu Gly Leu Ser Cys His Leu Trp Asp Gly Asp Val Leu Cys
        35                  40                  45
Leu Pro Gly Ser Leu Gln Ser Ala Pro Gly Pro Val Leu Val Pro Thr
    50                  55                  60
Arg Leu Gln Thr Glu Leu Val Leu Arg Cys Pro Gln Lys Thr Asp Cys
65                  70                  75                  80
Ala Leu Cys Val Arg Val Val Val His Leu Ala Val His Gly His Trp
                85                  90                  95
Ala Glu Pro Glu Glu Ala Gly Lys Ser Asp Ser Glu Leu Gln Glu Ser
            100                 105                 110
Arg Asn Ala Ser Leu Gln Ala Gln Val Val Leu Ser Phe Gln Ala Tyr
        115                 120                 125
Pro Ile Ala Arg Cys Ala Leu Leu Glu Val Gln Val Pro Ala Asp Leu
    130                 135                 140
Val Gln Pro Gly Gln Ser Val Gly Ser Ala Val Phe Asp Cys Phe Glu
145                 150                 155                 160
Ala Ser Leu Gly Ala Glu Val Gln Ile Trp Ser Tyr Thr Lys Pro Arg
                165                 170                 175
Tyr Gln Lys Glu Leu Asn Leu Thr Gln Gln Leu Pro Val Leu Pro Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Val Ser Thr Asp Gly Asp Asn Val Leu Leu Thr Leu Asp Val
        195                 200                 205
Ser Glu Glu Gln Asp Phe Ser Phe Leu Leu Tyr Leu Arg Pro Val Pro
    210                 215                 220
Asp Ala Leu Lys Ser Leu Trp Tyr Lys Asn Leu Thr Gly Pro Gln Asn
225                 230                 235                 240
Ile Thr Leu Asn His Thr Asp Leu Val Pro Cys Leu Cys Ile Gln Val
                245                 250                 255
Trp Ser Leu Glu Pro Asp Ser Glu Arg Val Glu Phe Cys Pro Phe Arg
            260                 265                 270
Glu Asp Pro Gly Ala His Arg Asn Leu Trp His Ile Ala Arg Leu Arg
        275                 280                 285
Val Leu Ser Pro Gly Val Trp Gln Leu Asp Ala Pro Cys Cys Leu Pro
    290                 295                 300
Gly Lys Val Thr Leu Cys Trp Gln Ala Pro Asp Gln Ser Pro Cys Gln
305                 310                 315                 320
Pro Leu Val Pro Pro Val Pro Gln Lys Asn Ala Thr Val Asn Glu Pro
                325                 330                 335
Gln Asp Phe Gln Leu Val Ala Gly His Pro Asn Leu Cys Val Gln Val
            340                 345                 350
Ser Thr Trp Glu Lys Val Gln Leu Gln Ala Cys Leu Trp Ala Asp Ser
        355                 360                 365
Leu Gly Pro Phe Lys Asp Asp Met Leu Leu Val Glu Met Lys Thr Gly
    370                 375                 380
Leu Asn Asn Thr Ser Val Cys Ala Leu Glu Pro Ser Gly Cys Thr Pro
385                 390                 395                 400
Leu Pro Ser Met Ala Ser Thr Arg Ala Ala Arg Leu Gly Glu Glu Leu
                405                 410                 415
Leu Gln Asp Phe Arg Ser His Gln Cys Met Gln Leu Trp Asn Asp Asp
            420                 425                 430
Asn Met Gly Ser Leu Trp Ala Cys Pro Met Asp Lys Tyr Ile His Arg
        435                 440                 445
Arg
<210>28
<211>222
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>28
Lys Ser Leu Trp Tyr Lys Asn Leu Thr Gly Pro Gln Asn Ile Thr Leu
 1               5                  10                  15
Asn His Thr Asp Leu Val Pro Cys Leu Cys Ile Gln Val Trp Ser Leu
            20                  25                  30
Glu Pro Asp Ser Glu Arg Val Glu Phe Cys Pro Phe Arg Glu Asp Pro
        35                  40                  45
Gly Ala His Arg Asn Leu Trp His Ile Ala Arg Leu Arg Val Leu Ser
    50                  55                  60
Pro Gly Val Trp Gln Leu Asp Ala Pro Cys Cys Leu Pro Gly Lys Val
65                  70                  75                  80
Thr Leu Cys Trp Gln Ala Pro Asp Gln Ser Pro Cys Gln Pro Leu Val
                85                  90                  95
Pro Pro Val Pro Gln Lys Asn Ala Thr Val Asn Glu Pro Gln Asp Phe
            100                 105                 110
Gln Leu Val Ala Gly His Pro Asn Leu Cys Val Gln Val Ser Thr Trp
        115                 120                 125
Glu Lys Val Gln Leu Gln Ala Cys Leu Trp Ala Asp Ser Leu Gly Pro
    130                 135                 140
Phe Lys Asp Asp Met Leu Leu Val Glu Met Lys Thr Gly Leu Asn Asn
145                 150                 155                 160
Thr Ser Val Cys Ala Leu Glu Pro Ser Gly Cys Thr Pro Leu Pro Ser
                165                 170                 175
Met Ala Ser Thr Arg Ala Ala Arg Leu Gly Glu Glu Leu Leu Gln Asp
            180                 185                 190
Phe Arg Ser His Gln Cys Met Gln Leu Trp Asn Asp Asp Asn Met Gly
        195                 200                 205
Ser Leu Trp Ala Cys Pro Met Asp Lys Tyr Ile His Arg Arg
    210                 215                 220
<210>29
<211>2287
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>29
aaatcgaaag cactccagct gaaactgggc ctggagtcca ggctcactgg agtggggaag   60
catggctgga gaggaattct agcccttgct ctctcccagg gacacggggc tgattgtcag  120
caggggcgag gggtctgccc ccccttgggg gggcaggacg gggcctcagg cctgggtgct  180
gtccggcacc tggaagatgc ctgtgtcctg gttcctgctg tccttggcac tgggccgaaa  240
ccctgtggtc gtctctctgg agagactgat ggagcctcag gacactgcac gctgctctct  300
aggcctctcc tgccacctct gggatggtga cgtgctctgc ctgcctggaa gcctccagtc  360
tgccccaggc cctgtgctag tgcctacccg cctgcagacg gagctggtgc tgaggtgtcc  420
acagaagaca gattgcgccc tctgtgtccg tgtggtggtc cacttggccg tgcatgggca  480
ctgggcagag cctgaagaag ctggaaagtc tgattcagaa ctccaggagt ctaggaacgc  540
ctctctccag gcccaggtgg tgctctcctt ccaggcctac cccatcgccc gctgtgccct  600
gctggaggtc caggtgcccg ctgacctggt gcagcctggt cagtccgtgg gttctgcggt  660
atttgactgt ttcgaggcta gtcttggggc tgaggtacag atctggtcct acacgaagcc  720
caggtaccag aaagagctca acctcacaca gcagctgcct gactgcaggg gtcttgaagt  780
ccgggacagc atccagagct gctgggatgg tgacaatgtc cttctgacac tggatgtctc  840
tgaggagcag gactttagct tcttactgta cctgcgtcca gtcccggatg ctctcaaatc  900
cttgtggtac aaaaacctga ctggacctca gaacattact ttaaaccaca cagacctggt  960
tccctgcctc tgcattcagg tgtggtcgct agagccagac tctgagaggg tcgaattctg 1020
ccccttccgg gaagatcccg gtgcacacag gaacctctgg cacatagcca ggctgcgggt 1080
actgtcccca ggggtatggc agctagatgc gccttgctgt ctgccgggca aggtaacact 1140
gtgctggcag gcaccagacc agagtccctg ccagccactt gtgccaccag tgccccagaa 1200
gaacgccact gtgaatgagc cacaagattt ccagttggtg gcaggccacc ccaacctctg 1260
tgtccaggtg agcacctggg agaaggttca gctgcaagcg tgcttgtggg ctgactcctt 1320
ggggcccttc aaggatgata tgctgttagt ggagatgaaa accggcctca acaacacatc 1380
agtctgtgcc ttggaaccca gtggctgtac accactgccc agcatggcct ccacgagagc 1440
tgctcgcctg ggagaggagt tgctgcaaga cttccgatca caccagtgta tgcagctgtg 1500
gaacgatgac aacatgggat cgctatgggc ctgccccatg gacaagtaca tccacaggcg 1560
ctgggtccta gtatggctgg cctgcctact cttggctgcg gcgcttttct tcttcctcct 1620
tctaaaaaag gaccgcagga aagcggcccg tggctcccgc acggccttgc tcctccactc 1680
cgccgacgga gcgggctacg agcgtctggt gggagcactg gcgtccgcgt tgagccagat 1740
gccactgcgc gtggccgtgg acctgtggag ccgccgcgag ctgagcgcgc acggagccct 1800
agcctggttc caccaccagc gacgccgtat cctgcaggag ggtggcgtgg taatccttct 1860
cttctcgccc gcggccgtgg cgcagtgtca gcagtggctg cagctccaga cagtggagcc 1920
cgggccgcat gacgccctcg ccgcctggct cagctgcgtg ctacccgatt tcctgcaagg 1980
ccgggcgacc ggccgctacg tcggggtcta cttcgacggg ctgctgcacc cagactctgt 2040
gccctccccg ttccgcgtcg ccccgctctt ctccctgccc tcgcagctgc cggctttcct 2100
ggatgcactg cagggaggct gctccacttc cgcggggcga cccgcggacc gggtggaacg 2160
agtgacccag gcgctgcggt ccgccctgga cagctgtact tctagctcgg aagccccagg 2220
ctgctgcgag gaatgggacc tgggaccctg cactacacta gaataaaagc cgatacagta 2280
ttcctaa                                                           2287
<210>30
<211>689
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>30
Met Pro Val Ser Trp Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly Arg Asn Pro
 1               5                  10                  15
Val Val Val Ser Leu Glu Arg Leu Met Glu Pro Gln Asp Thr Ala Arg
            20                  25                  30
Cys Ser Leu Gly Leu Ser Cys His Leu Trp Asp Gly Asp Val Leu Cys
        35                  40                  45
Leu Pro Gly Ser Leu Gln Ser Ala Pro Gly Pro Val Leu Val Pro Thr
    50                  55                  60
Arg Leu Gln Thr Glu Leu Val Leu Arg Cys Pro Gln Lys Thr Asp Cys
65                  70                  75                  80
Ala Leu Cys Val Arg Val Val Val His Leu Ala Val His Gly His Trp
                85                  90                  95
Ala Glu Pro Glu Glu Ala Gly Lys Ser Asp Ser Glu Leu Gln Glu Ser
            100                 105                 110
Arg Asn Ala Ser Leu Gln Ala Gln Val Val Leu Ser Phe Gln Ala Tyr
        115                 120                 125
Pro Ile Ala Arg Cys Ala Leu Leu Glu Val Gln Val Pro Ala Asp Leu
    130                 135                 140
Val Gln Pro Gly Gln Ser Val Gly Ser Ala Val Phe Asp Cys Phe Glu
145                 150                 155                 160
Ala Ser Leu Gly Ala Glu Val Gln Ile Trp Ser Tyr Thr Lys Pro Arg
                165                 170                 175
Tyr Gln Lys Glu Leu Asn Leu Thr Gln Gln Leu Pro Asp Cys Arg Gly
            180                 185                 190
Leu Glu Val Arg Asp Ser Ile Gln Ser Cys Trp Asp Gly Asp Asn Val
        195                 200                 205
Leu Leu Thr Leu Asp Val Ser Glu Glu Gln Asp Phe Ser Phe Leu Leu
    210                 215                 220
Tyr Leu Arg Pro Val Pro Asp Ala Leu Lys Ser Leu Trp Tyr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Leu Thr Gly Pro Gln Asn Ile Thr Leu Asn His Thr Asp Leu Val Pro
                245                 250                 255
Cys Leu Cys Ile Gln Val Trp Ser Leu Glu Pro Asp Ser Glu Arg Val
            260                 265                 270
Glu Phe Cys Pro Phe Arg Glu Asp Pro Gly Ala His Arg Asn Leu Trp
        275                 280                 285
His Ile Ala Arg Leu Arg Val Leu Ser Pro Gly Val Trp Gln Leu Asp
    290                 295                 300
Ala Pro Cys Cys Leu Pro Gly Lys Val Thr Leu Cys Trp Gln Ala Pro
305                 310                 315                 320
Asp Gln Ser Pro Cys Gln Pro Leu Val Pro Pro Val Pro Gln Lys Asn
                325                 330                 335
Ala Thr Val Asn Glu Pro Gln Asp Phe Gln Leu Val Ala Gly His Pro
            340                 345                 350
Asn Leu Cys Val Gln Val Ser Thr Trp Glu Lys Val Gln Leu Gln Ala
        355                 360                 365
Cys Leu Trp Ala Asp Ser Leu Gly Pro Phe Lys Asp Asp Met Leu Leu
    370                 375                 380
Val Glu Met Lys Thr Gly Leu Asn Asn Thr Ser Val Cys Ala Leu Glu
385                 390                 395                 400
Pro Ser Gly Cys Thr Pro Leu Pro Ser Met Ala Ser Thr Arg Ala Ala
                405                 410                 415
Arg Leu Gly Glu Glu Leu Leu Gln Asp Phe Arg Ser His Gln Cys Met
            420                 425                 430
Gln Leu Trp Asn Asp Asp Asn Met Gly Ser Leu Trp Ala Cys Pro Met
        435                 440                 445
Asp Lys Tyr Ile His Arg Arg Trp Val Leu Val Trp Leu Ala Cys Leu
    450                 455                 460
Leu Leu Ala Ala Ala Leu Phe Phe Phe Leu Leu Leu Lys Lys Asp Arg
465                 470                 475                 480
Arg Lys Ala Ala Arg Gly Ser Arg Thr Ala Leu Leu Leu His Ser Ala
                485                 490                 495
Asp Gly Ala Gly Tyr Glu Arg Leu Val Gly Ala Leu Ala Ser Ala Leu
            500                 505                 510
Ser Gln Met Pro Leu Arg Val Ala Val Asp Leu Trp Ser Arg Arg Glu
        515                 520                 525
Leu Ser Ala His Gly Ala Leu Ala Trp Phe His His Gln Arg Arg Arg
    530                 535                 540
Ile Leu Gln Glu Gly Gly Val Val Ile Leu Leu Phe Ser Pro Ala Ala
545                 550                 555                 560
Val Ala Gln Cys Gln Gln Trp Leu Gln Leu Gln Thr Val Glu Pro Gly
                565                 570                 575
Pro His Asp Ala Leu Ala Ala Trp Leu Ser Cys Val Leu Pro Asp Phe
            580                 585                 590
Leu Gln Gly Arg Ala Thr Gly Arg Tyr Val Gly Val Tyr Phe Asp Gly
        595                 600                 605
Leu Leu His Pro Asp Ser Val Pro Ser Pro Phe Arg Val Ala Pro Leu
    610                 615                 620
Phe Ser Leu Pro Ser Gln Leu Pro Ala Phe Leu Asp Ala Leu Gln Gly
625                 630                 635                 640
Gly Cys Ser Thr Ser Ala Gly Arg Pro Ala Asp Arg Val Glu Arg Val
                645                 650                 655
Thr Gln Ala Leu Arg Ser Ala Leu Asp Ser Cys Thr Ser Ser Ser Glu
            660                 665                 670
Ala Pro Gly Cys Cys Glu Glu Trp Asp Leu Gly Pro Cys Thr Thr Leu
        675                 680                 685
Glu
<210>31
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>31
tcccgtcccc cgccccaggt c                                             21
<210>32
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>32
ctctccatcc ttatctttca tcaac                                         25
<210>33
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>33
ctctctgctg gctaaacaaa acac                                          24
<210>34
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>34
ctcatattgc tcaactgtgt gaaaag                                        26
<210>35
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>35
tagaagccac ctgaacacaa atctg                                         25
<210>36
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>36
atcttgcgtt gtatgttgaa aatcaatt                                       28
<210>37
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>37
ttctccacca ggtaaacaag tctac                                         25
<210>38
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>38
ctctccaggc ccaagtcgtg ctct                                          24
<210>39
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>39
ttgtcctggg ggcctcgtgt ctcc                                          24
<210>40
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>40
acgaagccca ggtaccagaa agag                                          24
<210>41
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>41
aaaagcgccg cagccaagag tagg                                          24
<210>42
<211>1293
<212>DNA
<213>智人
<400>42
ctggagaggc ttgtggggcc tcaggacgct acccactgct ctccgggcct ctcctgccgc   60
ctctgggaca gtgacatact ctgcctgcct ggggacatcg tgcctgctcc gggccccgtg  120
ctggcgccta cgcacctgca gacagagctg gtgctgaggt gccagaagga gaccgactgt  180
gacctctgtc tgcgtgtggc tgtccacttg gccgtgcatg ggcactggga agagcctgaa  240
gatgaggaaa agtttggagg agcagctgac tcaggggtgg aggagcctag gaatgcctct  300
ctccaggccc aagtcgtgct ctccttccag gcctacccta ctgcccgctg cgtcctgctg  360
gaggtgcaag tgcctgctgc ccttgtgcag tttggtcagt ctgtgggctc tgtggtatat  420
gactgcttcg aggctgccct agggagtgag gtacgaatct ggtcctatac tcagcccagg  480
tacgagaagg aactcaacca cacacagcag ctgcctgccc tgccctggct caacgtgtca  540
gcagatggtg acaacgtgca tctggttctg aatgtctctg aggagcagca cttcggcctc  600
tccctgtact ggaatcaggt ccagggcccc ccaaaacccc ggtggcacaa aaacctgact  660
ggaccgcaga tcattacctt gaaccacaca gacctggttc cctgcctctg tattcaggtg  720
tggcctctgg aacctgactc cgttaggacg aacatctgcc ccttcaggga ggacccccgc  780
gcacaccaga acctctggca agccgcccga ctgcgactgc tgaccctgca gagctggctg  840
ctggacgcac cgtgctcgct gcccgcagaa gcggcactgt gctggcgggc tccgggtggg  900
gacccctgcc agccactggt cccaccgctt tcctgggaga acgtcactgt ggacaaggtt  960
ctcgagttcc cattgctgaa aggccaccct aacctctgtg ttcaggtgaa cagctcggag 1020
aagctgcagc tgcaggagtg cttgtgggct gactccctgg ggcctctcaa agacgatgtg 1080
ctactgttgg agacacgagg cccccaggac aacagatccc tctgtgcctt ggaacccagt 1140
ggctgtactt cactacccag caaagcctcc acgagggcag ctcgccttgg agagtactta 1200
ctacaagacc tgcagtcagg ccagtgtctg cagctatggg acgatgactt gggagcgcta 1260
tgggcctgcc ccatggacaa atacatccac aag                              1293
<210>43
<211>431
<212>PRT
<213>智人
<400>43
Leu Glu Arg Leu Val Gly Pro Gln Asp Ala Thr His Cys Ser Pro Gly
 1               5                  10                  15
Leu Ser Cys Arg Leu Trp Asp Ser Asp Ile Leu Cys Leu Pro Gly Asp
            20                  25                  30
Ile Val Pro Ala Pro Gly Pro Val Leu Ala Pro Thr His Leu Gln Thr
        35                  40                  45
Glu Leu Val Leu Arg Cys Gln Lys Glu Thr Asp Cys Asp Leu Cys Leu
    50                  55                  60
Arg Val Ala Val His Leu Ala Val His Gly His Trp Glu Glu Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Glu Lys Phe Gly Gly Ala Ala Asp Ser Gly Val Glu Glu Pro
                85                  90                   95
Arg Asn Ala Ser Leu Gln Ala Gln Val Val Leu Ser Phe Gln Ala Tyr
            100                 105                 110
Pro Thr Ala Arg Cys Val Leu Leu Glu Val Gln Val Pro Ala Ala Leu
        115                 120                 125
Val Gln Phe Gly Gln Ser Val Gly Ser Val Val Tyr Asp Cys Phe Glu
    130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Ser Glu Val Arg Ile Trp Ser Tyr Thr Gln Pro Arg
145                 150                 155                 160
Tyr Glu Lys Glu Leu Asn His Thr Gln Gln Leu Pro Ala Leu Pro Trp
                165                 170                 175
Leu Asn Val Ser Ala Asp Gly Asp Asn Val His Leu Val Leu Asn Val
            180                 185                 190
Ser Glu Glu Gln His Phe Gly Leu Ser Leu Tyr Trp Asn Gln Val Gln
        195                 200                 205
Gly Pro Pro Lys Pro Arg Trp His Lys Asn Leu Thr Gly Pro Gln Ile
    210                 215                 220
Ile Thr Leu Asn His Thr Asp Leu Val Pro Cys Leu Cys Ile Gln Val
225                 230                 235                 240
Trp Pro Leu Glu Pro Asp Ser Val Arg Thr Asn Ile Cys Pro Phe Arg
                245                 250                 255
Glu Asp Pro Arg Ala His Gln Asn Leu Trp Gln Ala Ala Arg Leu Arg
            260                 265                 270
Leu Leu Thr Leu Gln Ser Trp Leu Leu Asp Ala Pro Cys Ser Leu Pro
        275                 280                 285
Ala Glu Ala Ala Leu Cys Trp Arg Ala Pro Gly Gly Asp Pro Cys Gln
    290                 295                 300
Pro Leu Val Pro Pro Leu Ser Trp Glu Asn Val Thr Val Asp Lys Val
305                 310                 315                 320
Leu Glu Phe Pro Leu Leu Lys Gly His Pro Asn Leu Cys Val Gln Val
                325                 330                 335
Asn Ser Ser Glu Lys Leu Gln Leu Gln Glu Cys Leu Trp Ala Asp Ser
            340                 345                 350
Leu Gly Pro Leu Lys Asp Asp Val Leu Leu Leu Glu Thr Arg Gly Pro
        355                 360                 365
Gln Asp Asn Arg Ser Leu Cys Ala Leu Glu Pro Ser Gly Cys Thr Ser
    370                 375                 380
Leu Pro Ser Lys Ala Ser Thr Arg Ala Ala Arg Leu Gly Glu Tyr Leu
385                 390                 395                 400
Leu Gln Asp Leu Gln Ser Gly Gln Cys Leu Gln Leu Trp Asp Asp Asp
                405                 410                 415
Leu Gly Ala Leu Trp Ala Cys Pro Met Asp Lys Tyr Ile His Lys
            420                 425                 430
<210>44
<211>699
<212>DNA
<213>智人
<400>44
gagcccagag ggcccacaat caagccctgt cctccatgca aatgcccagc acctaacctc   60
ttgggtggac catccgtctt catcttccct ccaaagatca aggatgtact catgatctcc  120
ctgagcccca tagtcacatg tgtggtggtg gatgtgagcg aggatgaccc agatgtccag  180
atcagctggt ttgtgaacaa cgtggaagta cacacagctc agacacaaac ccatagagag  240
gattacaaca gtactctccg ggtggtcagt gccctcccca tccagcacca ggactggatg  300
agtggcaagg agttcaaatg caaggtcaac aacaaagacc tcccagcgcc catcgagaga  360
accatctcaa aacccaaagg gtcagtaaga gctccacagg tatatgtctt gcctccacca  420
gaagaagaga tgactaagaa acaggtcact ctgacctgca tggtcacaga cttcatgcct  480
gaagacattt acgtggagtg gaccaacaac gggaaaacag agctaaacta caagaacact  540
gaaccagtcc tggactctga tggttcttac ttcatgtaca gcaagctgag agtggaaaag  600
aagaactggg tggaaagaaa tagctactcc tgttcagtgg tccacgaggg tctgcacaat  660
caccacacga ctaagagctt ctcccggact ccgggtaaa                         699
<210>45
<211>233
<212>PRT
<213>智人
<400>45
Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro
 1               5                  10                  15
Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
            20                  25                  30
Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val
        35                  40                  45
Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe
    50                  55                  60
Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Ara Glu
65                  70                  75                  80
Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His
                85                  90                  95
Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys
            100                 105                 110
Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser
        115                 120                 125
Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met
    130                 135                 140
Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro
145                 150                 155                 160
Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn
                165                 170                 175
Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met
            180                 185                 190
Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser
        195                 200                 205
Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr
    210                 215                 220
Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
225                 230
<210>46
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>46
gtttcgctca gccaggaaat ccatgccgag ttgagacgct tccgtagact ggagaggctt   60
gtggggcct                                                           69
<210>47
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>47
tgtgggccct ctgggctcct tgtggatgta tttgtc                             36
<210>48
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>48
gacaaataca tccacaagga gcccagaggg cccaca                             36
<210>49
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>49
caaccccaga gctgttttaa ggcgcgcctc tagattattt acccggagtc cggga        55
<210>50
<211>76
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>50
caaccccaga gctgtt ttaa ggcgcgcctc tagattattc catgggcatg tattcttcct  60
tgtggatgta tttgtc                                                   76
<210>51
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C-末端his标签
<400>51
Gly Ser Gly Gly His His His His His His
 1               5                  10
<210>52
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C-末端FLAG标签
<400>52
Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
 1               5                  10
<210>53
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Glu-Glu标签
<400>53
Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu
 1               5
<210>54
<211>85
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>54
caaccccaga gctgttttaa ggcgcgcctc tagattagtg atggtgatgg tgatgtccac   60
cagatccctt gtggatgtat ttgtc                                         85
<210>55
<211>85
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>55
caaccccaga gctgttttaa ggcgcgcctc tagattactt atcatcatca tccttataat   60
cggatccctt gtggatgtat ttgtc                                         85
<210>56
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>56
acgaagccca ggtaccagaa agag                                          24
<210>57
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>57
aaaagcgccg cagccaagag tagg                                          24
<210>58
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>58
cgtaagcggt ggcggttttc                                               20
<210>59
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>59
tgggcagggc acagtcacag                                               20
<210>60
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>60
acttgccatt ctgagggagg tagc                                          24
<210>61
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>61
cacaggtgca gccaactttt agga                                          24
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>62
gtgggccgct ctaggcacca                                               20
<210>63
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>63
cggttggcct tagggttcag ggggg                                         25
<210>64
<211>2127
<212>DNA
<213>智人
<400>64
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggcgc cgtcttcgtt   60
tcgctcagcc aggaaatcca tgccgagttg agacgcttcc gtagactgga gaggcttgtg  120
gggcctcagg acgctaccca ctgctctccg ggcctctcct gccgcctctg ggacagtgac  180
atactctgcc tgcctgggga catcgtgcct gctccgggcc ccgtgctggc gcctacgcac  240
ctgcagacag agctggtgct gaggtgccag aaggagaccg actgtgacct ctgtctgcgt  300
gtggctgtcc acttggccgt gcatgggcac tgggaagagc ctgaagatga ggaaaagttt  360
ggaggagcag ctgactcagg ggtggaggag cctaggaatg cctctctcca ggcccaagtc  420
gtgctctcct tccaggccta ccctactgcc cgctgcgtcc tgctggaggt gcaagtgcct  480
gctgcccttg tgcagtttgg tcagtctgtg ggctctgtgg tatatgactg cttcgaggct  540
gccctaggga gtgaggtacg aatctggtcc tatactcagc ccaggtacga gaaggaactc  600
aaccacacac agcagctgcc tgccctgccc tggctcaacg tgtcagcaga tggtgacaac  660
gtgcatctgg ttctgaatgt ctctgaggag cagcacttcg gcctctccct gtactggaat  720
caggtccagg gccccccaaa accccggtgg cacaaaaacc tgactggacc gcagatcatt  780
accttgaacc acacagacct ggttccctgc ctctgtattc aggtgtggcc tctggaacct  840
gactccgtta ggacgaacat ctgccccttc agggaggacc cccgcgcaca ccagaacctc  900
tggcaagccg cccgactgcg actgctgacc ctgcagagct ggctgctgga cgcaccgtgc  960
tcgctgcccg cagaagcggc actgtgctgg cgggctccgg gtggggaccc ctgccagcca 1020
ctggtcccac cgctttcctg ggagaacgtc actgtggaca aggttctcga gttcccattg 1080
ctgaaaggcc accctaacct ctgtgttcag gtgaacagct cggagaagct gcagctgcag 1140
gagtgcttgt gggctgactc cctggggcct ctcaaagacg atgtgctact gttggagaca 1200
cgaggccccc aggacaacag atccctctgt gccttggaac ccagtggctg tacttcacta 1260
cccagcaaag cctccacgag ggcagctcgc cttggagagt acttactaca agacctgcag 1320
tcaggccagt gtctgcagct atgggacgat gacttgggag cgctatgggc ctgccccatg 1380
gacaaataca tccacaaggg aggaagtggc ggaggaacag gaagtttggt ccctcgtgga 1440
agcgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 1500
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 1560
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 1620
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 1680
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1740
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1800
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1860
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1920
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1980
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 2040
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 2100
agcctctccc tgtctccggg taaataa                                     2127
<210>65
<211>708
<212>PRT
<213>智人
<400>65
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
 1               5                   10                 15
Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg
            20                  25                  30
Phe Arg Arg Leu Glu Arg Leu Val Gly Pro Gln Asp Ala Thr His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro Gly Leu Ser Cys Arg Leu Trp Asp Ser Asp Ile Leu Cys Leu
    50                  55                  60
Pro Gly Asp Ile Val Pro Ala Pro Gly Pro Val Leu Ala Pro Thr His
65                  70                  75                  80
Leu Gln Thr Glu Leu Val Leu Arg Cys Gln Lys Glu Thr Asp Cys Asp
                85                  90                  95
Leu Cys Leu Arg Val Ala Val His Leu Ala Val His Gly His Trp Glu
            100                 105                 110
Glu Pro Glu Asp Glu Glu Lys Phe GlyGly Ala Ala Asp Ser Gly Val
        115                 120                125
Glu Glu Pro Arg Asn Ala Ser Leu Gln Ala Gln Val Val Leu Ser Phe
    130                 135                 140
Gln Ala Tyr Pro Thr Ala Arg Cys Val Leu Leu Glu Val Gln Val Pro
145                 150                 155                 160
Ala Ala Leu Val Gln Phe Gly Gln Ser Val Gly Ser Val Val Tyr Asp
                165                 170                 175
Cys Phe Glu Ala Ala Leu Gly Ser Glu Val Arg Ile Trp Ser Tyr Thr
            180                 185                 190
Gln Pro Arg Tyr Glu Lys Glu Leu Asn His Thr Gln Gln Leu Pro Ala
        195                 200                 205
Leu Pro Trp Leu Asn Val Ser Ala Asp Gly Asp Asn Val His Leu Val
    210                 215                 220
Leu Asn Val Ser Glu Glu Gln His Phe Gly Leu Ser Leu Tyr Trp Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Gln Gly Pro Pro Lys Pro Arg Trp His Lys Asn Leu Thr Gly
                245                 250                 255
Pro Gln Ile Ile Thr Leu Asn His Thr Asp Leu Val Pro Cys Leu Cys
            260                 265                 270
Ile Gln Val Trp Pro Leu Glu Pro Asp Ser Val Arg Thr Asn Ile Cys
        275                 280                 285
Pro Phe Arg Glu Asp Pro Arg Ala His Gln Asn Leu Trp Gln Ala Ala
    290                 295                 300
Arg Leu Arg Leu Leu Thr Leu Gln Ser Trp Leu Leu Asp Ala Pro Cys
305                 310                 315                 320
Ser Leu Pro Ala Glu Ala Ala Leu Cys Trp Arg Ala Pro Gly Gly Asp
                325                 330                 335
Pro Cys Gln Pro Leu Val Pro Pro Leu Ser Trp Glu Asn Val Thr Val
            340                 345                 350
Asp Lys Val Leu Glu Phe Pro Leu Leu Lys Gly His Pro Asn Leu Cys
        355                 360                 365
Val Gln Val Asn Ser Ser Glu Lys Leu Gln Leu Gln Glu Cys Leu Trp
    370                 375                 380
Ala Asp Ser Leu Gly Pro Leu Lys Asp Asp Val Leu Leu Leu Glu Thr
385                 390                 395                 400
Arg Gly Pro Gln Asp Asn Arg Ser Leu Cys Ala Leu Glu Pro Ser Gly
                405                 410                 415
Cys Thr Ser Leu Pro Ser Lys Ala Ser Thr Arg Ala Ala Arg Leu Gly
            420                 425                 430
Glu Tyr Leu Leu Gln Asp Leu Gln Ser Gly Gln Cys Leu Gln Leu Trp
        435                 440                 445
Asp Asp Asp Leu Gly Ala Leu Trp Ala Cys Pro Met Asp Lys Tyr Ile
    450                 455                 460
His Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly
465                 470                 475                 480
Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                485                 490                 495
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
            500                 505                 510
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
        515                 520                 525
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
    530                 535                 540
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
545                 550                 555                 560
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
                565                 570                 575
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
            580                 585                 590
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
        595                 600                 605
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
    610                 615                 620
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
625                 630                 635                 640
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
                645                 650                 655
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
            660                 665                 670
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
        675                 680                 685
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
    690                 695                 700
Ser Pro Gly Lys
705
<210>66
<211>1416
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的插入物
<400>66
agccaggaaa tccatgccga gttgagacgc ttccgtagac tggagaggct tgtggggcct   60
caggacgcta cccactgctc tccgggcctc tcctgccgcc tctgggacag tgacatactc  120
tgcctgcctg gggacatcgt gcctgctccg ggccccgtgc tggcgcctac gcacctgcag  180
acagagctgg tgctgaggtg ccagaaggag accgactgtg acctctgtct gcgtgtggct  240
gtccacttgg ccgtgcatgg gcactgggaa gagcctgaag atgaggaaaa gtttggagga  300
gcagctgact caggggtgga ggagcctagg aatgcctctc tccaggccca agtcgtgctc  360
tccttccagg cctaccctac tgcccgctgc gtcctgctgg aggtgcaagt gcctgctgcc  420
cttgtgcagt ttggtcagtc tgtgggctct gtggtatatg actgcttcga ggctgcccta  480
gggagtgagg tacgaatctg gtcctatact cagcccaggt acgagaagga actcaaccac  540
acacagcagc tgcctgccct gccctggctc aacgtgtcag cagatggtga caacgtgcat  600
ctggttctga atgtctctga ggagcagcac ttcggcctct ccctgtactg gaatcaggtc  660
cagggccccc caaaaccccg gtggcacaaa aacctgactg gaccgcagat cattaccttg  720
aaccacacag acctggttcc ctgcctctgt attcaggtgt ggcctctgga acctgactcc  780
gttaggacga acatctgccc cttcagggag gacccccgcg cacaccagaa cctctggcaa  840
gccgcccgac tgcgactgct gaccctgcag agctggctgc tggacgcacc gtgctcgctg  900
cccgcagaag cggcactgtg ctggcgggct ccgggtgggg acccctgcca gccactggtc  960
ccaccgcttt cctgggagaa cgtcactgtg gacaaggttc tcgagttccc attgctgaaa 1020
ggccacccta acctctgtgt tcaggtgaac agctcggaga agctgcagct gcaggagtgc 1080
ttgtgggctg actccctggg gcctctcaaa gacgatgtgc tactgttgga gacacgaggc 1140
ccccaggaca acagatccct ctgtgccttg gaacccagtg gctgtacttc actacccagc 1200
aaagcctcca cgagggcagc tcgccttgga gagtacttac tacaagacct gcagtcaggc 1260
cagtgtctgc agctatggga cgatgacttg ggagcgctat gggcctgccc catggacaaa 1320
tacatccaca agggaggaag tggcggagga acaggaagtt tggtccctcg tggaagcgac 1380
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaa                           1416

Claims (44)

1.包含至少一个ZcytoR14亚基的分离的可溶性受体，其中所述ZcytoR14亚基包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽。
2.包含至少一个ZcytoR14亚基的分离的可溶性受体，其中所述ZcytoR14亚基包含SEQ ID NO：24的氨基酸残基1至氨基酸残基427。
3.权利要求1或权利要求2的可溶性受体，其中所述可溶性受体包含2个ZcytoR14亚基，其中所述亚基通过多肽连接体连接在一起。
4.权利要求3的可溶性受体，其中所述多肽连接体具有大约100至240个氨基酸残基。
5.包含ZcytoR14的分离的可溶性受体，其中ZcytoR14包含具有SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列的多肽；其中所述可溶性受体减少IL-17A(SEQ ID NO：14)或IL-17F(SEQ ID NO：16)的促炎活性。
6.权利要求5的可溶性受体，其中所述可溶性受体减少IL-17A(SEQ ID NO：14)或IL-17F(SEQ ID NO：16)两者的促炎活性。
7.结合多肽的抗体或抗体片段，所述多肽包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，其中所述抗体或抗体片段减少IL-17A(SEQ IDNO：14)或IL-17F(SEQ ID NO：16)的促炎活性。
8.权利要求7的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段减少IL-17A(SEQ ID NO：14)和IL-17F(SEQ ID NO：16)的促炎活性。
9.权利要求8的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是：(a)多克隆抗体，(b)鼠类单克隆抗体，(c)来源于(b)的人源化抗体，(d)抗体片段或(e)人单克隆抗体。
10.权利要求8的抗体或抗体片段，其中所述抗体还包含放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记物、化学发光标记物、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。
11.权利要求9的抗体，其中所述抗体还被PEG化。
12.权利要求8的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是：(a)多克隆抗体，(b)鼠类单克隆抗体，(c)来源于(b)的人源化抗体，(d)抗体片段或(e)人单克隆抗体。
13.权利要求8的抗体或抗体片段，其中所述抗体还包含放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记物、化学发光标记物、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。
14.权利要求12的抗体，其中所述抗体还被PEG化。
15.减少IL-17A诱导的或IL-17F诱导的炎症的方法，其包括给患有炎症的哺乳动物施用足以减轻炎症的量的权利要求7的抗体的组合物。
16.减少IL-17A诱导的或IL-17F诱导的炎症的方法，其包括给患有炎症的哺乳动物施用足以减轻炎症的量的权利要求1的ZcytoR14可溶性受体的组合物。
17.治疗遭受IL-17A或IL-17F在其中起作用的炎性疾病的哺乳动物的方法，其包括：
给哺乳动物施用IL-17A或IL-17F的拮抗剂以减轻炎症，其中所述拮抗剂包含(i)特异性结合ZcytoR14(SEQ ID NO：2)的多肽或多肽片段的抗体、抗体片段或结合多肽，或(ii)ZcytoR14(SEQ ID NO：3)的多肽或多肽片段；和
其中减少IL-17A(SEQ ID NO：14)或IL-17F(SEQ ID NO：16)的炎症活性。
18.权利要求17方法，其中所述疾病是哮喘。
19.权利要求17的方法，其中所述疾病是慢性炎性疾病。
20.权利要求19的方法，其中所述疾病是慢性炎性疾病，包括炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、关节炎、特应性皮炎或牛皮癣。
21.权利要求17的方法，其中所述疾病是急性炎性疾病。
22.权利要求21的方法，其中所述疾病是急性炎性疾病，其包括内毒素血症、败血症、中毒性休克综合征或传染性疾病。
23.利要17的方法，其中所述抗体、抗体片段或结合多肽还包含放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记物、化学发光标记物、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。
24.治疗遭受IL-17A或IL-17F在其中起作用的炎性疾病的哺乳动物的方法，其包括：
给哺乳动物施用IL-17A和IL-17F两者的拮抗剂以减轻炎症，其中所述拮抗剂包含(i)特异性结合ZcytoR14(SEQ ID NO：2)的多肽或多肽片段的抗体、抗体片段或结合多肽，或(ii)ZcytoR14(SEQ ID NO：3)的多肽或多肽片段；和
其中减少IL-17A(SEQ ID NO：14)和IL-17F(SEQ ID NO：16)两者的炎症活性。
25.权利要求24的方法，其中所述疾病是哮喘。
26.权利要求24的方法，其中所述疾病是慢性炎性疾病。
27.权利要求26的方法，其中所述疾病是慢性炎性疾病，包括炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、关节炎、特应性皮炎或牛皮癣。
28.权利要求24的方法，其中所述疾病是急性炎性疾病。
29.权利要求28的方法，其中所述疾病是急性炎性疾病，其包括内毒素血症、败血病、中毒性休克综合征或传染性疾病。
30.权利要求24的方法，其中所述抗体、抗体片段或结合多肽还包含放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记物、化学发光标记物、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。
31.在受试者中治疗和ZcytoR14活性关联的病理状态的方法，其包括施用有效量的权利要求1的可溶性受体，从而治疗所述病理状态。
32.权利要求31的方法，其中所述病理状态是哮喘。
33.权利要求31的方法，其中所述病理状态是慢性炎性疾病。
34.权利要求33的方法，其中所述慢性炎性疾病包括炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、关节炎、特应性皮炎或牛皮癣。
35.权利要求31的方法，其中所述病理状态是急性炎性疾病。
36.权利要求35的方法，其中所述急性炎性疾病包括内毒素血症、败血病、中毒性休克综合征或传染性疾病。
37.治疗遭受ZcytoR14在其中起作用的炎性疾病的哺乳动物的方法，其包括：
给哺乳动物施用ZcytoR14的拮抗剂以减轻炎症，其中所述拮抗剂包含特异性结合ZcytoR14(SEQ ID NO：2)的多肽或多肽片段的抗体、抗体片段、ZcytoR14可溶性受体或结合多肽，和
其中减少炎症活性。
38.权利要求37的方法，其中所述疾病是哮喘。
39.权利要求37的方法，其中所述疾病是慢性炎性疾病。
40.权利要求39的方法，其中所述疾病是慢性炎性疾病，包括炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、关节炎、特应性皮炎或牛皮癣。
41.权利要求37的方法，其中所述疾病是急性炎性疾病。
42.权利要求41的方法，其中所述疾病是急性炎性病症，包括内毒素血症、败血病、中毒性休克综合征或传染性疾病。
43.权利要求37的方法，其中所述抗体、抗体片段或结合多肽还包含放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记物、化学发光标记物、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。
44.权利要求37的方法，其中所述抗体、抗体片段或结合多肽还被PEG化。
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