KR20010089764A - 인터류킨-17과 관련된 포유류의 사이토카인, 이를코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이의 용도 - Google Patents

인터류킨-17과 관련된 포유류의 사이토카인, 이를코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이의 용도 Download PDF

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둘락 노먼 씨.
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Abstract

본 발명에서는, 포유류 유래의 CTLA-8과 관련된 항원, 이러한 항원을 코딩하는 핵산, 특이적인 항체 및 정제된 단백질을 포함한 이와 관련된 시약을 제공한다. 또한, 본 발명에서는, 상기 시약을 이용하는 방법 및 진단 킷트를 제공한다.

Description

인터류킨-17과 관련된 포유류의 사이토카인, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이의 용도 {INTERLEUKIN-17 RELATED MAMMALIAN CYTOKINES. POLYNUCLEOTIDES ENCODING THEM. USES}
척추 동물의 면역 시스템은 다수의 장기 및 여러 상이한 유형의 세포로 이루어져 있다. 주요 2가지 유형의 세포로는, 골수성계 (myeloid lineage) 및 림프구계 (lymphoid lineage) 세포가 포함된다. 림프구계 세포에는, 태아의 간 또는 성인의 골수에서 분화되는 것을 특징으로 하는 것으로 처음에 알려졌던 B 세포, 및 흉선에서 분화되는 것을 특징으로 하는 것으로 처음에 알려졌던 T 세포가 포함된다 {예를 들면, 참조: Paul (ed. 1998)Fundamental Immunology(4th ed.) Ravan Press, New York}.
면역 반응 또는 세포 분화의 여러 가지 발생 측면에 있어서, 사이토카인으로알려져 있는 가용성 단백질이 세포간 상호 작용에 핵심 역할을 수행한다. 특히, 이러한 사이토카인은 여러 가지의 방법으로 세포 활성을 매개한다. 여러 경우를 보면, 이러한 사이토카인은 조혈성 간세포(hematopoietic stem cell)가 면역 반응에 관여하는 상기한 세포계를 포함하는 엄청난 수의 전구 세포 (progenitor)로 증식, 성장 및 분화하는 것을 조절하는 것으로 관찰되었다.
하지만, 상기한 성숙 경로에 있어서 다양한 발생 단계에 있는 세포에 의해 발현되는 세포 분자들이 완전하게 확인되어 있지 못한 실정이다. 게다가, 이러한 세포들의 다양한 생리 상태, 발생 상태 또는 증식 상태를 유도, 유지 또는 조정하는 신호 분자들의 활동 역할 및 메카니즘에 대해서도 알려진 바가 많지 않다. 분명한 점은, 상기한 면역 시스템 및 다양한 종류의 스트레스에 대한 이들의 반응이 의학 (예를 들면, 감염성 질환, 암-관련 반응 및 치료, 알레르기성 반응 및 이식 거부 반응)과 관련성이 있다는 것이다 {참조: 예를 들면, Thorn 등,Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw/Hill, New York}.
의료 과학은 환경적인 요소들에 대한 불충분한 또는 부적당한 생리학적 반응에 대한 치료를 수행함에 있어서 적절한 면역 시스템의 동원 또는 억제에 크게 의존한다. 그러나, 면역 시스템이 어떻게 조절 또는 분화되는 지에 대한 이해가 부족하여, 생물학적 공격 (biological challenge)에 대해 반응하는 정상적인 방어 메카니즘을 유리하게 조정할 수 없는 실정이다. 따라서, 관련된 세포의 발생 또는 생리의 비정상적인 또는 비적절한 조절이 특징인 의학적인 상태는 여전히 치유하기 힘든 실정이다. 특정 사이토카인을 발견하여 특성을 규명하게 되면, 면역 시스템, 조혈성 세포 및 기타 유형의 세포에 영향을 미치는 광범위한 퇴행성 또는 기타의 질환 상태에 대한 치료법을 개발할 수 있을 것이다. 본 발명은 이러한 여러 가지 문제에 대한 해결책을 제공한다.
본 발명은, 포유동물 세포 (예를 들면, 포유동물의 면역 시스템에 속하는 세포)의 생리, 발생 및 분화를 조절하는 기능을 발휘하는 단백질과 관련한 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명에서는, 조혈성 세포를 포함한 다양한 유형의 세포에 있어서의 세포 생리, 발생, 분화 또는 기능을 조절하는 핵산, 단백질, 항체 및 유사체 (mimetics)를 제공한다.
발명의 요약
본 발명은, CTLA-8으로 지칭되는 사이토카인과 서열 유사성이 매우 큰 다양한 사이토카인-유사 단백질을 코딩하는 cDNA 클론의 발견에 부분적으로 기초한 것이다.
본 발명에서는, 본 발명의 단백질을 코딩하는 분리된 유전자, 이 유전자로 코딩된 단백질의 변이체 (예를 들면, 천연 상태의 서열, 생물종 및 대립형질 변이체에 돌연변이가 발생한 돌연변이체인 뮤테인, 융합 단백질, 화학적 유사체, 항체 및 기타의 구조상 또는 기능상 유사체)를 포함한다. 또한, 본 발명에서는, 이러한 상이한 핵산 또는 단백질 조성물의 다양한 용도를 포함한다.
본 발명의 핵산에 관한 소정의 양태에서는, 하기 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 포함하는 분리된 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다:
(a) 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 적어도 8개의 연속적인 (contiguous) 아미노산을 코딩하거나,
서열번호 6, 8, 10 또는 12의 적어도 5개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절 (distinct segment)을 코딩하거나,
서열번호 5, 7, 9 또는 11의 적어도 21개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어진 하나 이상의 분절을 포함하는, 포유 동물의 IL-173의 서열;
(b) 서열번호 14, 16 또는 18의 적어도 8개의 연속적인 아미노산을 코딩하거나,
서열번호 14, 16 또는 18의 적어도 5개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절을 코딩하거나,
서열번호 14, 16 또는 18의 적어도 21개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어진 하나 이상의 분절을 포함하는, 포유 동물의 IL-174의 서열;
(c) 서열번호 28의 적어도 8개의 연속적인 아미노산을 코딩하거나,
서열번호 28의 적어도 5개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절을 코딩하거나,
서열번호 27의 적어도 21개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어진 하나 이상의 분절을 포함하는, 포유 동물의 IL-176의 서열; 및
(d) 서열번호 30의 적어도 8개의 연속적인 아미노산을 코딩하거나,
서열번호 30의 적어도 5개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절을 코딩하거나,
서열번호 29의 적어도 21개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어진 하나 이상의 분절을 포함하는, 포유 동물의 IL-177의 서열.
본 발명의 다른 양태에서는, 하기 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 포함하는, 소정의 발현벡터 중의 폴리뉴클레오티드를 포함한다:
(a) 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 적어도 12개의 연속적인 (contiguous) 아미노산을 코딩하거나,
서열번호 6, 8, 10 또는 12의 적어도 7개 및 10개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절 (distinct segment)을 코딩하거나,
서열번호 5, 7, 9 또는 11의 적어도 27개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는, IL-173의 서열;
(b) 서열번호 14, 16 또는 18의 적어도 12개의 연속적인 아미노산을 코딩하거나,
서열번호 14, 16 또는 18의 적어도 7개 및 10개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절을 코딩하거나,
서열번호 13, 15 또는 17의 적어도 27개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는, IL-174의 서열;
(c) 서열번호 28의 적어도 12개의 연속적인 아미노산을 코딩하거나,
서열번호 28의 적어도 7개 및 10개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절을 코딩하거나,
서열번호 27의 적어도 27개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는, IL-176의 서열; 및
(d) 서열번호 30의 적어도 12개의 연속적인 아미노산을 코딩하거나,
서열번호 30의 적어도 7개 및 10개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절을 코딩하거나,
서열번호 29의 적어도 27개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는, IL-177의서열.
본 발명의 소정의 양태에서는, 하기 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다:
(a) 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 적어도 16개의 연속적인 (contiguous) 아미노산을 코딩하거나,
서열번호 6, 8, 10 또는 12의 적어도 10개 및 13개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절 (distinct segment)을 코딩하거나,
서열번호 5, 7, 9 또는 11의 적어도 33개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하거나,
서열번호 5, 7, 9 또는 11의 전체 성숙 코딩 부위 (entire mature encoding portion)를 포함하는, IL-173의 서열;
(b) 서열번호 14, 16 또는 18의 적어도 16개의 연속적인 아미노산을 코딩하거나,
서열번호 14, 16 또는 18의 적어도 10개 및 13개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절을 코딩하거나,
서열번호 13, 15 또는 17의 적어도 33개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하거나,
서열번호 13, 15 또는 17의 전체 성숙 코딩 부위 (entire mature encoding portion)를 포함하는, IL-174의 서열;
(c) 서열번호 28의 적어도 16개의 연속적인 아미노산을 코딩하거나,
서열번호 28의 적어도 10개 및 14개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절을 코딩하거나,
서열번호 27의 적어도 33개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하거나,
서열번호 27의 전체 성숙 코딩 부위 (entire mature encoding portion)를 포함하는, IL-176의 서열; 및
(d) 서열번호 30의 적어도 16개의 연속적인 아미노산을 코딩하거나,
서열번호 30의 적어도 10개 및 14개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절을 코딩하거나,
서열번호 29의 적어도 33개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하거나,
서열번호 29의 전체 성숙 코딩 부위 (entire mature encoding portion)를 포함하는, IL-177의 서열.
본 발명에서는, 예를 들면, (a) 상기한 발현 벡터를 발현시켜 상기한 폴리펩티드를 생산하는 것을 포함하여, 상기한 폴리펩티드를 제조하는 방법;
(b) 상기한 폴리펩티드를 상보적인 핵산과 접촉시키는 것을 포함하여, 듀플렉스 핵산(duplex nucleic acid)을 제조하는 방법; 또는
(c) PCR 방법으로 증폭시키는 것을 포함하여, 상기한 폴리펩티드를 제조하는 방법 등 다양한 방법을 제공한다.
이와 달리, 본 발명에서는, 적어도 55℃ 및 400mM 미만의 염의 스트린전트 세척 조건(stringent wash condition)하에서, (a) 서열번호 5, 7, 9 또는 11의 코딩 부위로 이루어진 상기한 IL-173의 폴리뉴클레오티드;
(b) 서열번호 13, 15 또는 17의 코딩 부위로 이루어진 상기한 IL-174의 폴리뉴클레오티드;
(c) 서열번호 27의 코딩 부위로 이루어진 상기한 IL-176의 폴리뉴클레오티드 ; 또는
(d) 서열번호 29의 코딩 부위로 이루어진 상기한 IL-177의 폴리뉴클레오티드와 혼성화되는, 분리한 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에서는,
(a) 상기한 세척 조건이 적어도 65℃이고 300mM 미만의 염; 또는
(b) 서열번호 5, 7, 9 또는 11의 코딩 부위 (IL-173), 서열번호 13, 15 또는 17의 코딩 부위 (IL-174), 서열번호 27의 코딩 부위 (IL-176) 또는 서열번호 29의 코딩 부위 (IL-177)의 적어도 50개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명에서는, 예를 들면, 상기한 폴리뉴클레오티드; 및 (a) 검색용으로 상기한 폴리뉴클레오티드를 사용하기 위한 지침 및/또는 (b) 상기한 폴리뉴클레오티드 또는 기타의 킷트 시약(reagent)을 제거하기 위한 지침을 포함하는, 소정의 킷트를 제공한다.
또한, 본 발명에서는, 예를 들면, 상기한 발현 벡터를 함유하는 다양한 세포, 즉 원핵생물 세포, 진핵생물 세포, 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 포유류 세포, 마우스 세포, 영장류 세포 또는 인간 세포를 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드와 관련된 양태에서는,
(a) 적어도, i) 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 8개의 일치하는 연속적인 아미노산으로 이루어진 하나의 분절(segment), 또는 ii) 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 적어도 5개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 2개의 상이한 분절을 포함하는, IL-173의 분리된 또는 재조합 항원성 폴리펩티드;
(b) 적어도, i) 서열번호 14, 16 또는 18의 8개의 일치하는 연속적인 아미노산으로 이루어진 하나의 분절, 또는 ii) 서열번호 14, 16 또는 18의 적어도 5개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 2개의 상이한 분절을 포함하는, IL-174의 분리된 또는 재조합 항원성 폴리펩티드;
(c) 적어도, i) 서열번호 28의 8개의 일치하는 연속적인 아미노산으로 이루어진 하나의 분절, 또는 ii) 서열번호 28의 적어도 5개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 2개의 상이한 분절을 포함하는, IL-176의 분리된 또는 재조합 항원성 폴리펩티드; 또는
(d) 적어도, i) 서열번호 30의 8개의 일치하는 연속적인 아미노산으로 이루어진 하나의 분절, 또는 ii) 서열번호 30의 적어도 5개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 2개의 상이한 분절을 포함하는, IL-177의 분리된 또는 재조합 항원성 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드와 관련된 다른 양태에서는, 상기한 폴리펩티드에서,
(a) 상기한 8개의 일치하는 연속적인 아미노산으로 이루어진 분절이, 적어도 14개의 연속적인 아미노산이거나;
(b) 상기한 적어도 5개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 분절 중 하나의분절이, 적어도 7개의 연속적인 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드와 관련된 또 다른 양태에서는, 상기한 폴리펩티드에 있어서,
(A) a) 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 성숙한 서열 (mature sequence)을 포함하거나, b) 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 성숙한 서열을 면역원 (immunogen)으로 하여 생성된 폴리클로날 항체에 대해 민감하게 결합하거나, c) 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 10개의 연속적인 아미노산 서열로 이루어진 다수의 상이한 폴리펩티드 분절을 포함하거나, d) 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 천연 대립형질 변이체 (natural allelic variant)이거나, e) 적어도 30개의 아미노산을 가지거나, f) 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 성숙한 서열에 대해 선택적인 적어도 2개의 비-중첩성 에피토프(non-overlapping epitope)를 가지는, IL-173의 폴리펩티드;
(B) a) 서열번호 14, 16 또는 18의 성숙한 서열을 포함하거나, b) 서열번호 14, 16 또는 18의 성숙한 서열을 면역원으로 하여 생성된 폴리클로날 항체에 대해 민감하게 결합하거나, c) 서열번호 14, 16 또는 18의 10개의 연속적인 아미노산 서열로 이루어진 다수의 상이한 폴리펩티드 분절을 포함하거나, d) 적어도 30개의 아미노산을 가지거나, e) 서열번호 14, 16 또는 18의 성숙한 서열에 대해 선택적인 적어도 2개의 비-중첩성 에피토프를 가지는, IL-174의 폴리펩티드;
(C) a) 서열번호 28의 서열을 포함하거나, b) 서열번호 28의 서열을 면역원으로 하여 생성된 폴리클로날 항체에 대해 민감하게 결합하거나, c) 서열번호 28의10개의 연속적인 아미노산 서열로 이루어진 다수의 상이한 폴리펩티드 분절을 포함하거나, d) 적어도 30개의 아미노산을 가지거나, e) 서열번호 28의 영장류 단백질에 대해 선택적인 적어도 2개의 비-중첩성 에피토프를 가지는, IL-176의 폴리펩티드; 또는
(D) a) 서열번호 30의 서열을 포함하거나, b) 서열번호 30의 서열을 면역원으로 하여 생성된 폴리클로날 항체에 대해 민감하게 결합하거나, c) 서열번호 30의 10개의 연속적인 아미노산 서열로 이루어진 다수의 상이한 폴리펩티드 분절을 포함하거나, d) 적어도 30개의 아미노산을 가지거나, e) 서열번호 30의 영장류 단백질에 대해 선택적인 적어도 2개의 비-중첩성 에피토프를 가지는, IL-177의 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 상기한 폴리펩티드에 있어서,
a) 멸균성 조성물 중에 포함되거나;
b) 글리코실화 (glycosylation)가 되어 있지 않거나;
c) 변성(denaturation)되어 있거나;
d) 합성 폴리펩티드이거나;
e) 고형 기질에 부착되어 있거나;
f) 검출용 또는 정제용 태그 (tag)를 갖는 융합 단백질이거나;
g) 천연 서열로부터 5-폴드 (fold) 이하로 치환된 변이체이거나;
h) 천연 서열로부터 결손 또는 삽입된 변이체인, 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명에서는, 예를 들면, 상기한 폴리펩티드를 하기의 용도로 사용하는 방법을 제공한다:
a) 상기 폴리펩티드를 방사성 표지로 표지시키는 것을 포함하여, 상기 폴리펩티드를 표지시키는 방법;
b) 상기한 폴리펩티드와 다른 폴리펩티드의 혼합물을 크로마토그래피 매트릭스 상에서 러닝(running)시켜 상기한 폴리펩티드를 분리하는 것을 포함하여, 상기한 폴리펩티드와 다른 폴리펩티드의 혼합물 중에서 상기한 폴리펩티드를 분리시키는 방법;
c) 상기한 폴리펩티드와의 결합을 유도하는 적합한 조건하에서 상기한 폴리펩티드와 함께 인큐베이션시키는 것을 포함하여, 상기한 폴리펩티드에 민감하게 결합하는 화합물을 동정하는 방법; 또는
d) 상기한 폴리펩티드를 반응성 시약으로 유도화시키고, 상기한 폴리펩티드를 매트릭스에 컨쥬게이션시키는 것을 포함하여, 상기한 폴리펩티드를 매트릭스에 컨쥬게이션시키는 방법.
또한, 본 발명에서는, 하기 폴리펩티드에 민감하게 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 결합 화합물(binding compound)을 갖는 항체를 제공한다:
a) 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 성숙한 폴리펩티드를 포함하는 IL-173의 폴리펩티드;
b) 서열번호 14, 16 또는 18의 서열을 포함하는 IL-174의 폴리펩티드;
c) 서열번호 28의 서열을 포함하는 IL-176의 폴리펩티드; 또는
d) 서열번호 30의 서열을 포함하는 IL-177의 폴리펩티드.
본 발명의 한 양태에서는, 상기한 항체가 하기 폴리펩티드에 대해 유도된 폴리클로날 항체인 것을 특징으로 하는, 결합-화합물을 포함한다:
a) 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 IL-173의 폴리펩티드;
b) 서열번호 14, 16 또는 18의 IL-174의 폴리펩티드;
c) 서열번호 28의 IL-176의 폴리펩티드; 또는
d) 서열번호 30의 IL-177의 폴리펩티드.
본 발명의 다른 양태에서는,
a) 상기한 항체가, i) 면역 선택된 것이거나, ii) 소정의 변성된 단백질에 결합한 것이거나, iii) 상기한 폴리펩티드에 대한 Kd가 적어도 30mM이거나;
b) 상기한 결합-화합물이, i) 비드 또는 플라스틱 멤브레인을 포함한 고형 기질에 부착된 것이거나, ii) 멸균 조성물 중에 포함된 것이거나, iii) 방사성 표지 또는 형광 표지를 포함하여 검출가능하게 표지된 것을 특징으로 하는, 결합-화합물을 포함한다.
본 발명에서는, 예를 들면, 항원-항체 복합체가 형성될 수 있는 조건하에서, 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 28 또는 30의 서열을 포함하는 폴리펩티드와 상기한 결합-화합물을 접촉시키는 것을 포함하여, 항원-항체 복합체를 제조하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기한 결합-화합물이 항체이고, 상기한 폴리펩티드는 생물학적 샘플 중에 있다.
본 발명에서는, 예를 들면, 상기한 결합-화합물; 및 a) 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 28 또는 30의 폴리펩티드, b) 검출용으로 상기한 결합-화합물을사용하기 위한 지침, 또는 c) 상기한 결합-화합물 또는 기타의 시약을 제거하기 위한 지침을 포함하는, 킷트를 제공한다.
또한, 본 발명에서는, 소정의 항체를 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 28 또는 30의 단백질 및 다른 사이토카인에 접촉시키고, 상기 단백질 및 사이토카인과 상기 항체와의 결합을 상호 비교하는 것을 포함하여, 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 28 또는 30의 단백질에 대한 소정의 항체의 결합 선택도를 평가하는 방법을 제공한다.
I. 일반적인 사항
본 발명에서는, 사이토카인 (특히, IL-17으로도 지칭되는 CTLA-8과 관련)의 구조적인 특성을 나타내는 다양한 포유 동물의 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 제공한다. CTLA-8의 랫트, 마우스, 인간형 및 바이러스 상동체 (homolog)는 이미 공지되어 있으며, 이들의 서열은 GenBank에서 입수가능하다 {참조: Rouvier 등, (1993)J.Immunol.150:5445-5456; Yao 등, (1995)Immunity3:811-821; Yao 등, (1995)J.Immunol.155:5483-5486; 및 Kennedy 등, (1996)J.Interferon and Cytokine Res. 16:611-617}. 상기 CTLA-8은, 관절염, 신장 이식 거부 반응, 종양형성, 바이러스-숙주 상호반응 및 선천성 면역에 활성을 가질 수 있을 것으로 보이며, IL-6와 유사한 소정의 조절 기능을 보이는 것 같다 {참조: PubMed (IL-17을 검색); Chabaud 등, (1998)J.Immunol.63:139-148; Amin 등, (1998)Curr.Opin.Rheumatol. 10:263-268; Van Kooten 등, (1998)J.Am.Soc.Nephrol. 9:1526-1543; Fossiez 등, (1998)Int.Rev.Immunol. 16:541-551; Knappe 등, (1998)J.Virol.72:5797-5801; Seow(1998)Vet.Immuno.Immunopathol. 63:139-48; 및 Teunissen 등, (1998)J.Invest.Dermatol. 111:645-649}. NFkB 전사 인자를 통한 신호 전달에 관한 한 보고서에서는, 선천성 면역에 이용되는 신호 경로를 암시해주고 있다 {참조: Shalom-Barak 등, (1998) J.Biol.Chem. 273:27467-27473}.
상기 새로이 공지된 cDNA 서열은, 사이토카인, 성장 인자 및 발암 유전자를 코딩하는 mRNA의 다양한 특성을 나타내고 있다. 상기한 IL-17은 이렇게 새로이 밝혀진 TGF-β와 관련된 사이토카인 군에 속하는 최초 구성원이기 때문에, 본 출원인은 이러한 사이토카인 군 IL-170을 새로운 구성원 IL-172, IL-173, IL-174, IL-176, IL-177; 및 IL-171과 IL-175로 지정하였다. 이러한 군의 폴드(fold)는 사이토카인 TGF-β군에 속하는 것으로 예상된다. 사이토카인 TGF-β군과 IL-170군은, 시스테인 잔기가 소정의 간격을 가지고 나타나는 것을 특징으로 하는 시스틴 낫 모티프 (cystine knot motif)를 공통으로 가지고 있다 {참조: Sun 및 Davies (1995)Ann.Rev.Biophys.Biomolec.Struct.24: 269-291; McDonald 등 (1993)Cell73:421-424; 및 Isaacs (1995)Curr. Op. Struct. Biol.5: 391-395}. 특히, 이러한 구조를 통해, 인간의 IL-172 (서열번호 2)에 있어서, 제101번째, 제103번째, 제143번째, 제156번째 및 제158번째에 위치한 시스테인에 상응하는 다수의 보존된 시스테인 잔기가 있을 것을 암시해 준다. 제1 시스테인은, 인간의 IL-172 (서열번호 2)의 val19의 표 7에서의 위치에 상응한다. 제4 시스테인은, 마우스의 IL-172 (서열번호 4)의 cys141의 위치에 상응하고, 인간의 IL-173 (서열번호 6)의 cys119의 위치에 상응하며, 마우스의 IL-174 (서열번호 16)의 cys104의 위치에 상응하고, 인간의 IL-171 (서열번호 21)의 cys50의 위치에 상응한다. 디설파이드 결합은 시스테인 2와 5, 시스테인 3과 6, 및 시스테인 1과 4의 결합일 것이다. 상기한 접힘 유사성(fold similarity)이 기능상 갖는 중요성은, 상기한 IL-170 군에 있어서 다이머 (dimer) 형성을 의미한다. 이 결과, IL-170 다이머는 2개의 세포 표면 수용체를 결합시킴으로써, 신호 전달이 이루어지게 된다.
이러한 새로운 단백질은 CTLA-8와 관련된 단백질 또는 일반적으로 IL-170- 단백질로 지칭되고 있다. 상기 천연 단백질은, 예를 들면, 표적 세포에서의 사이토카인 신호전달로 특징되는 생물학적 또는 생리학적 반응을 초래하게 되는 다양한 생리 반응을 매개할 수 있을 것이다. 초기 연구에서는, 조혈성 세포의 다양한 세포 라인에서 상기 단백질을 코딩하는 메시지의 위치를 결정하였다. 마우스 염색체 1A 및 인간 염색체 2q31에 본래의 CTLA-8 (IL-17) 항원을 코딩하는 유전자가 있는 것으로 맵핑되었다. 쥐의 CTLA-8의 클로닝은 Rouvier 등에 의해 최초로 수행되었다 {참조: Rouvier 등 (1993)J.Immunol.150:5445-5456}. 인간의 IL-173은 염색체 13q11에 맵핑되었다. 또한, 다른 종류의 포유 동물 종에서의 상기 단백질과 유사한 서열이 입수가능할 것이다.
정제된 CTLA-8을 활막 세포와 함께 배양시키는 경우, 정제된 CTLA-8은 활막 세포로부터 IL-6의 방출을 유도할 수 있다. 인간의 CTLA-8를 중성화시키는 항체를 첨가하게 되면, 이러한 유도 반응의 역반응이 일어난다. 또한, 내피 세포, 상피 세포, 섬유아세포 및 암 세포는 CTLA-8을 이용한 치료에 반응을 나타낸다. 이러한 데이터를 통해, CTLA-8은 염증성 섬유조직증식 (inflammatory fibrosis), 예를 들면 건선, 경피증, 폐 섬유조직증식 또는 경변 (cirrhosis)과 관련되어 있을 수 있음을 알 수 있다. 또한, CTLA-8은, IL-6가 종종 암종(carcinoma) 또는 기타의 암 세포에 대한 성장 인자로서 작용할 정도로, 이러한 세포들의 증식을 유발시킬 수 있다. 이와 같이, 상기한 새로이 발견된 기타의 다른 관련된 군의 구성원들은, 유사 또는 관련된 생물학적 활성을 가지는 것 같다.
아래 기술된 내용은, 예를 들면 쥐 또는 인간의 IL-170 단백질에 관한 것이지만, 기타의 다른 종과 관련된 양태에서도 이와 유사하게 적용될 수 있다.
II. 핵산
하기 표 1 내지 6에서는, 다양한 종류의 새로운 IL-170 군에 속하는 구성원의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 개시하고 있다. 아래에 기술되어 있는 뉴클레오티드 서열 및 이와 관련된 시약(reagent)은, 전체 서열 또는 인접한(flanking) 서열의 확정을 위해 양 방향으로 DNA 클론을 확장시키거나, IL-170 폴리뉴클레오티드를 발현시키거나, 예를 들면 다른 천연 공급원으로부터 상동 유전자 (homologous gene)를 분리시키기에 유용한 DNA 클론을 작제하는 데에 유용하다. 통상적으로, 이러한 서열은, 마우스에서 유래한 기타의 다른 유전자 (예를 들면, 대립형질 변이체)를 분리시키는 데에 유용할 것이며, 이와 유사한 공정을 이용하여 기타의 다른 종 (예를 들면, 새 및 포유 동물과 같은 온혈 동물)에서 유래하는 유전자를 분리할 수 있을 것이다. 교차 혼성화 방법 (cross hybridization)을 이용하여, 기타의 다른 종에서 유래하는 유전자를 분리할 수 있을 것이다. 많은 상이한 방법을 사용하여, 기타 다른 공급원으로부터 유래하는 적합한 핵산 클론을 성공적으로 분리할 수 있을 것이다.
[표 1]
영장류 (예를 들면, 인간)의 IL-172의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 예상되는 아미노산 서열 (서열번호 1 및 2){여기서, 여러 가지 목적에 따라 상보적인 핵산 서열을 사용할 수 있으며; 예상되는 시그널 절단 부위 (signal cleavage site)가 표시되어 있으나, 양편 중 어느 한 편에 위치한 수 개의 잔기일 수 있고; 글리코실레이션 부위로 생각되는 부위는 잔기 55-57이다}
특히 주목을 받는 분절로는, 예를 들면, gln1, val19, pro20, pro22, lys34, pro35, leu78, ser79, glu98, ala99, phe110, thr111, cys143 또는 arg144로 시작하거나 종료되는 분절이 포함된다.
설치류 (예를 들면, 마우스)의 IL-172의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 예상되는 아미노산 서열 (서열번호 3 및 4){여기서, 여러 가지 목적에 따라 상보적인 핵산 서열을 사용할 수 있으며; 예상되는 시그널 절단 부위 (signal cleavage site)가 표시되어 있으나, 양편 중 어느 한 편에 위치한 수 개의 잔기일수 있고; 글리코실레이션 부위로 생각되는 부위는 잔기 53-55이다}
특히 주목을 받는 분절로는, 예를 들면, arg1, ala17, pro18, pro20, his21, lys32, pro33, leu76, ser77, glu96, ala97, phe108, thr109, cys141 또는 arg142로 시작하거나 종료되는 분절이 포함된다.
[표 2]
영장류 (예를 들면, 인간)의 IL-173의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 예상되는 아미노산 서열 (서열번호 5 및 6){여기서, 여러 가지 목적에 따라 상보적인 핵산 서열을 사용할 수 있다}
영장류 (예를 들면, 인간)의 IL-173의 폴리펩티드를 코딩하는 보충적인 뉴클레오티드 서열 및 예상되는 아미노산 서열 (서열번호 7 및 8){여기서, 여러 가지 목적에 따라 상보적인 핵산 서열을 사용할 수 있다}
중요한 것으로 예상되는 모티프로는, 예를 들면, 잔기 50-53, 66-69, 72-75 및 113-116의 cAMP PK 부위; 잔기 82-84 및 166-168의 Ca 인산화 부위; 잔기 57-61 및 164-166의 미리스톨 부위 (myristoly site); 잔기 50, 53, 72, 75, 80, 82, 113 및 116의 인산화 부위가 포함된다.
설치류 (예를 들면, 마우스)의 IL-173의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 예상되는 아미노산 서열 (서열번호 9 및 10){여기서, 여러 가지 목적에 따라 상보적인 핵산 서열을 사용할 수 있다}
설치류 (예를 들면, 마우스)의 IL-173의 폴리펩티드를 코딩하는 보충적인 뉴클레오티드 서열 및 예상되는 아미노산 서열 (서열번호 11 및 12){여기서, 여러 가지 목적에 따라 상보적인 핵산 서열을 사용할 수 있다}
중요한 것으로 예상되는 모티프로는, 예를 들면, 잔기 50-53, 66-69, 72-75 및 113-116의 cAMP PK 부위; 잔기 82-84, 159-161 및 166-168의 Ca 인산화 부위; 잔기 57-61 및 101-105의 미리스톨 부위 (myristoly site); 잔기 51-53 및 164-166의 N-글리코실레이션 부위; 잔기 50, 53, 72, 75, 80, 82, 113 및 116의 인산화 부위; 잔기 4-6의 PKC 인산화 부위가 포함된다.
[표 3]
영장류 (예를 들면, 인간)의 IL-174의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 예상되는 아미노산 서열 (서열번호 13 및 14){여기서, 여러 가지 목적에
따라 상보적인 핵산 서열을 사용할 수 있다}
중요한 것으로 예상되는 모티프로는, 예를 들면, 잔기 21-24, 53-56 및 95-98의 cAMP PK 부위; 잔기 15-17, 16-18 및 45-47의 Ca 인산화 부위; 잔기 12-16, 115-119 및 118-122의 미리스톨 부위 (myristoly site); 잔기 104-107의 N-글리코실레이션 부위; 잔기 21, 23, 43, 53, 56, 95, 98 및 131의 인산화 부위; 잔기 41-43 및 119-121의 PKC 인산화 부위; 95-102의 티로신 카이네이즈 부위가 포함된다.
설치류 (예를 들면, 마우스)의 IL-174의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 예상되는 아미노산 서열 (서열번호 15 및 16){여기서, 여러 가지 목적에 따라 상보적인 핵산 서열을 사용할 수 있다}
설치류 (예를 들면, 마우스)의 IL-174의 폴리펩티드를 코딩하는 보충적인 뉴클레오티드 서열 및 예상되는 아미노산 서열 (서열번호 17 및 18){여기서, 여러
가지 목적에 따라 상보적인 핵산 서열을 사용할 수 있다}
중요한 것으로 예상되는 모티프로는, 예를 들면, 잔기 29-32 및 61-64의 cAMP PK 부위; 잔기 18-20, 53-55 및 67-69의 Ca 인산화 부위; 잔기 123-127의 미리스톨 부위 (myristoly site); 잔기 112-114의 N-글리코실레이션 부위; 잔기 29, 31, 51, 53, 61, 64, 139 및 141의 인산화 부위; 잔기 2-4, 49-51 및 127-129의 PKC 인산화 부위가 포함된다.
[표 4]
IUPAC 코드하에서의 영장류 (예를 들면, 인간)의 IL-171을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열번호 19){여기서, 여러 가지 목적에 따라 상보적인 핵산 서열을 사용할 수 있다}
PATENTIN-해독 가능한 cDNA 및 폴리펩티드 서열 (서열번호 20 및 21)
영장류 (예를 들면, 인간)의 IL-171을 코딩하는 보충적인 뉴클레오티드 서열 (서열번호 22 및 23){여기서, 여러 가지 목적에 따라 상보적인 핵산 서열을 사용
할 수 있다}
[표 5]
IUPAC 코드하에서의 영장류 (예를 들면, 인간)의 IL-175를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열번호 24){여기서, 여러 가지 목적에 따라 상보적인 핵산 서열을 사용할 수 있다}
PATENTIN-해독 가능한 cDNA 및 폴리펩티드 서열 (서열번호 25 및 26)
{여기서, 예상되는 시그널 절단 부위 (signal cleavage site)가 표시되어 있으나, 양편 중 어느 한 편에 위치한 수 개의 잔기일 수 있고; 글리코실레이션 부위로 생각되는 부위는 잔기 53-55이다}
특히 주목을 받는 분절로는, 예를 들면, arg1, cys17, pro18, pro19, val20, thr49, ser50, arg69, pro70로 시작하거나 종료하는 분절 및 사용가능한 상기 서열의 말단부가 포함된다.
[표 6]
영장류 (예를 들면, 인간)의 IL-176을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열번호 27 및 28){여기서, 여러 가지 목적에 따라 상보적인 핵산 서열을 사용할 수 있다}
영장류 (예를 들면, 인간)의 IL-177을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열번호 29 및 30){여기서, 여러 가지 목적에 따라 상보적인 핵산 서열을 사용할 수 있
다}
[표 7]
다양한 CTLA-8/IL-170 군의 구성원의 배열
{하기에서, 랫트의 CTLA-8 서열은 서열번호 31 (참조: GB L13839, 293329/30), 마우스의 CTLA-8 서열은 서열번호 32 (참조: GB 1469917/8), 인간의 CTLA-8 서열은 서열번호 33 (참조: GB U32659, 115222/3), 및 헤르페스 사이미리 (Herpes Saimiri) 바이러스 ORF13은 서열번호 34 (참조: GB Y13183, 2370235);CLUSTAL X (1.64b) 멀티플 서열 배열}
특히 주목을 받는 분절로는, 예를 들면, 상기한 다른 군의 구성원과 함께 기재된 IL-172 또는 IL-175의 분절에 상응하는 단편이 포함된다.
정제된 단백질 또는 폴리펩티드는, 상기한 바와 같이, 표준 방법으로 항체를 생성시키는 데에 유용하다. 합성 펩티드 또는 정제된 단백질을 면역 시스템에 도입시켜 특정 결합 조성물 (예를 들면, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체)를 생성시킬 수 있다 {참조: 예를 들면, Coligan (1991)Current Protocols in Immunoloy, Wiley/Greene; Harlow 및 Lane (1989)Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press}.
예를 들면, 상기한 특정 결합 조성물은 IL-170 단백질을 발현하는 세포 라인으로부터 제조한 발현 라이브러리를 스크리닝하는 데에 유용할 수 있다. 이러한 스크리닝은, 표면-발현된 단백질을 표준 염색시키거나 패닝 (panning)시켜 수행할 수 있다. 또한, 세포내 발현 물질의 스크리닝은, 다양한 염색 공정 또는 면역형광 공정을 이용하여 수행될 수도 있다. 상기한 결합 조성물은, 상기 단백질을 발현하는 세포를 친화 정제 (affinity purification)시키거나 분리 (sorting out)시키는 데에 사용할 수 있다.
본 발명에서는, 생물학적 활성을 가지는 IL-170 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 DNA 또는 이의 단편의 용도를 포함한다. 또한, 본 발명에서는, 소정의 생물학적 활성을 가지는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하고, 적합한 조건하에서 본원에서 기술한 DNA 서열과 함께 혼성화할 수 있는, 분리된 또는 재조합 DNA를 포함한다. 상기한 생물학적 활성 단백질 또는 폴리펩티드는, 천연의 항원 또는 이의 단편일 수 있으며, 상기 표 1 내지 6에 기재된 아미노산 서열을 가진다.또한, 본 발명에서는, IL-170 단백질과 상동성을 가지거나 IL-170 단백질을 코딩하는 cDNA를 프로브로 사용하여 분리시킨 단백질을 코딩하는, 분리된 또는 재조합 DNA 또는 이의 단편의 용도를 포함한다. 상기한 분리된 DNA는, 5' 및 3' 플랭크 (flank)에 조절 서열 (예를 들면, 프로모터, 인헨서, 폴리-A 첨가 신호 등)을 가질 수 있다.
"분리된 (isolated)" 핵산은, 기원하는 종으로부터의 천연 서열에 본래 수반되는 기타의 성분 (예를 들면, 리보좀, 폴리머라제 및 인접한 게놈 서열)과 실제적으로 분리된 핵산 (예를 들면, RNA, DNA 또는 혼합된 폴리머)을 의미한다. 상기 용어는, 천연 환경으로부터 회수한 핵산 서열을 포함하며, 재조합 또는 클로닝된 DNA 분리물과 화학적으로 합성된 유사체 또는 이종 시스템 (heterologous system)에 의해 생합성된 유사체를 포함한다. 실질적으로 순수한 분자에는, 상기 분자의 분리된 형태가 포함된다. 이와 달리, 소정의 정제된 종은, 재조합 발현 시스템에서 숙주 성분으로부터 분리될 수 있다. 이러한 핵산의 상동체(homology)의 크기는, 대개 큰 벡터 (예를 들면, 수십 kB 미만, 통상적으로 수 kB 미만, 바람직하게는 2 내지 6kB) 보다 작을 것이다.
소정의 분리된 핵산은, 일반적으로, 동형(homogeneous) 조성물 분자일 것이나, 소정의 양태에서는 약간의 이형성을 가진다. 이러한 이형성 (heterogeneity)은, 통상적으로, 목적하는 생물학적 기능 또는 활성에 중요하지 않은 부위 또는 폴리머 말단부에서 발견된다.
"재조합" 핵산은, 이러한 핵산의 제조 방법 또는 구조에 의해 정의된다. 제조 방법면에 있어서, 예를 들면, 재조합 핵산 기술 (예를 들면, 통상적으로 분별 또는 제조와 같은 뉴클레오티드 서열에 대한 인간의 조작을 포함)을 사용하는 공정에 의해 제조된 생성물을 의미한다. 또는, 천연 상태에서는 서로 연속되어 있지 않은 2개의 단편을 융합시키는 것을 포함하여 소정의 서열을 생성시켜 제조된 핵산일 수 있으나, 천연 생성물 (예를 들면, 자연 상태에서 발생하는 돌연변이)은 제외된다. 따라서, 예를 들면, 어떠한 합성 올리고뉴클레오티드 공정을 사용하여 유도된 서열을 포함하는 핵산도 포함되며, 소정의 세포를 비-자연 발생 벡터로 형질변환시켜 제조된 생성물도 포함된다. 이러한 방법은, 통상적으로 서열-인식 부위를 도입 또는 제거하는 동안, 소정의 코돈을 동일한 또는 보존된 아미노산을 코딩하는 반복 코돈 (redundant codon)으로 대치시키기 위해 자주 사용된다. 또는, 목적하는 기능을 갖는 핵산 단편을 결합시켜, 통상적으로 사용가능한 천연 형태에서는 발견되지 않는 목적하는 복합 기능을 포함하는 단일 유전체 (single genetic entity)를 생성시킨다. 제한효소 인식 부위가 종종 이러한 인위적인 조작의 표적이 되지만, 기타의 다른 부위-특이적 표적 (예를 들면, 프로모터, DNA 복제 부위, 조절 서열, 통제 서열) 또는 유용한 특성들을 포함시킬 수 있다. 재조합 폴리펩티드 (예를 들면, 융합 폴리펩티드)에 있어서도, 이와 유사한 개념이 사용된다. 특히, 유전부호 중복성 (genetic code redundancy)에 의해 이러한 항원 단편과 유사한 폴리펩티드를 코딩하는 합성 핵산 및 여러 다양한 상이한 종 변이체에서 유래하는 융합 서열이 포함된다.
핵산에 있어서 중요한 "단편(fragment)"은, 적어도 약 17개,일반적으로는(generally) 적어도 20개, 보다 일반적으로는 적어도 23개, 보통으로는 (ordinarily)는 적어도 26개, 보다 보통으로는 적어도 29개, 종종 (often) 적어도 32개, 보다 종종 적어도 35개, 통상적으로는 (typically) 적어도 38개, 보다 통상적으로는 41개, 대개 (usually) 적어도 44개, 보다 대개 적어도 47개, 바람직하게는 (preferably) 적어도 50개, 보다 바람직하게는 적어도 53개, 특히 바람직하게는 적어도 56개 이상의 연속된 뉴클레오티드 분절 (segment)을 의미한다. 상기한 단편은 어느 위치에서도 종결부 (termini)를 가질 수 있으나, 특히 구조 도메인 (structural domain) 사이의 경계부에 가질 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서는, 특정 길이를 갖는 다수의 상이한 (예를 들면, 비-중첩) 분절을 포함하는 폴리뉴클레오티드 (또는 폴리펩티드)를 제공한다. 상기 "다수 (plurality)"는, 통상적으로 적어도 2, 보다 통상적으로는 적어도 3, 바람직하게는 5, 7 이상을 의미한다. 본원에는 길이 하한치가 제공되어 있으나, 다양한 크기의 보다 긴 길이 (예를 들면, 하나는 길이 7이고 둘은 길이 12)도 적합할 수 있다.
IL-170을 코딩하는 DNA는, 관련된 또는 상동 단백질을 코딩하는 유전자, mRNA 및 cDNA 종과 상이한 종의 상동 단백질을 코딩하는 DNA를 동정하는 데에 특히 유용할 것이다. 영장류를 포함하여 기타의 다른 종의 동물 중에 상동성 단백질이 존재할 수 있다. 다양한 CTLA-8 단백질이 상동성을 나타낼 것이며, 이들은 본 발명에 포함된다. 하지만, 상기한 항원과 진화상 관련성이 보다 먼 단백질이 충분한 정도의 상동성을 가지는 경우, 상기한 서열을 사용하여 적합한 조건하에서 용이하게 분리할 수 있다. 영장류 CTLA-8 단백질이 특히 중요하다.
또한, 본 발명에서는, 상기 분리된 DNA와 일치하거나 상동성이 큰 DNA 서열을 갖는 재조합 DNA 분자 및 단편을 포함한다. 특히, 이러한 서열은, 종종 전사, 번역 및 DNA 복제를 통제하는 DNA 단편과 작동가능하게 연결될 것이다. 또는, 게놈성 서열 (예를 들면, 인트론 포함)에서 유래하는 재조합 클론은 형질전환 연구 (예를 들면, 형질전환 세포 및 기관) 및 유전자 치료에 유용할 것이다{참조: 예를 들면, Goodnow (1992) "Transgenic Animals" in Riott (ed.)Encyclopedia of ImmunologyAcademic Press, San Diego, pp.1502-1504; Travis (1992)Science256:1392-1394; Kuhn 등 (1991)Science254: 707-710; Capecchi (1989)Science244:1288; Robertson (ed. 1987)Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical ApproachIRL Press, Oxford; Rosenberg (1992)J.Clinical Oncology10:180-199; Cournoyer 및 Caskey (1993)Ann.Rev.Immunol.11:297-329}.
상동 핵산 서열과 비교해 보면, 유사성이 매우 크다. 핵산에서의 상동성과 관련한 표준은, 서열 비교에 의한 당업계에서 일반적으로 수용되고 있는 상동성 측정 또는 혼성화 조건에 따른 방법이다. 혼성화 조건에 대해서는 아래에서 자세히 기술한다.
핵산 서열 비교에 있어서 실질적인 상동성 (substantial homology)은, 비교하는 경우, 적합한 뉴클레오티드의 첨가 또는 결손으로 상기 분절 또는 이의 상보적인 스트랜드가 최적으로 배열되는 경우, 적어도 약 50%, 일반적으로는(generally) 적어도 56%, 보다 일반적으로는 적어도 59%,보통으로는(ordinarily) 적어도 62%, 보다 보통으로는 적어도 65%, 종종 (often) 적어도 68%, 보다 종종 적어도 71%, 통상적으로 (typically) 적어도 74%, 보다 통상적으로는 적어도 77%, 대개 (usually) 적어도 80%, 보다 대개 적어도 약 85%, 바람직하게는 (preferably) 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95% 내지 98% 이상, 특정 양태에서는 약 99% 이상의 뉴클레오티드가 일치하는 것을 의미한다. 또는, 통상적으로 상기 표 2, 3 또는 6에서 유래된 서열을 사용하여, 상기 분절이 선택적인 혼성화 조건하에서 소정의 스트랜드 또는 이의 상보적인 스트랜드와 혼성화되는 경우, 실질적인 상동성이 존재한다. 대개, 적어도 약 14개의 일련의 뉴클레오티드에 있어서 적어도 약 55%의 상동성, 바람직하게는 적어도 약 65%의 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 약 75%의 상동성, 가장 바람직하게는 적어도 약 90%의 상동성이 있는 경우, 선택적으로 혼성화 (selective hybridization)가 일어난다 {참조: Kanehisa (1984)Nuc.Acids Res.12:203-213}. 상동성을 비교하는 길이는, 상기한 것보다 더 길 수 있으며, 소정의 양태에서는 적어도 약 17개의 뉴클레오티드, 대개(usually) 적어도 약 20개의 뉴클레오티드, 보다 대개 적어도 약 24개의 뉴클레오티드, 통상적으로 (typically) 적어도 약 28개의 뉴클레오티드, 보다 통상적으로 적어도 약 40개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 약 50개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 적어도 약 75 내지 100개 이상의 뉴클레오티드에 걸쳐 이루어진다.
혼성화에서의 상동성을 언급함에 있어서, 스트린전트 조건 (stringent condition)은 통상적으로 혼성화 반응에 있어서 통제되는 조건인 염, 온도, 유기용매 및 기타의 파라미터가 복합된 스트린전트 조건이다. 스트린전트 온도 조건에는, 대개 (usually) 약 30℃를 초과하는 온도, 보다 대개 약 37℃를 초과하는 온도, 통상적으로는 (typically) 약 45℃를 초과하는 온도, 보다 통상적으로는 약 55℃를 초과하는 온도, 바람직하게는 (preferably) 약 65℃를 초과하는 온도, 보다 바람직하게는 약 70℃를 초과하는 온도가 포함된다. 스트린전트 염 조건에는, 보통 (ordinarily) 약 1000mM 미만, 대개 약 500mM 미만, 보다 대개 약 400mM 미만, 통상적으로는 약 300mM 미만, 바람직하게는 약 200mM 미만, 보다 바람직하게는 약 150mM 미만이 포함된다. 하지만, 하나의 파라미터를 측정하는 것보다 파라미터의 결합이 더 중요하다 {참조: 예를 들면, Wetmur 및 Davidson (1968)J.Mol.Biol.31:349-370}. 스트린전트 조건하에서 혼성화시키는 경우, 배경 (background)에 비해 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 3 내지 5배 이상의 배경을 보이게 된다.
서열을 비교하기 위한 대체적인 방법으로는, 통상적으로 소정의 서열을 기준 서열 (reference sequence)로 하여 테스트 서열과 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하여, 테스트 서열과 기준 서열을 컴퓨터에 입력시키고나서, 후속 좌표 (coordinate)를 지정하고, 필요한 경우, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 그리고나서, 지정된 프로그램 파라미터에 근거하여, 상기한 서열 알고리즘이 기준 서열에 대한 테스트 서열의 상동성 %를 계산한다.
서열 비교를 위해, Smith 및 Waterman의 로컬 상동성 알고리즘 {참조: 1981,Adv.Appl.Math.2:482}, Needleman 및 Wunsch의 상동성 배열 알고리즘 {참조:1970,J.Mol.Biol.48:443}, Pearson 및 Lipman의 유사성 검색 {참조: 1988,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA85:2444}, 상기한 알고리즘의 컴퓨터 실행 {참조: GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지, 제네틱스 컴퓨터 그룹, 575 사이언스 드라이브, 매디슨, 위스콘신주} 또는 시각에 의한 검사 {참조: 상기한 Ausubel 등}를 통해, 서열을 광학적으로 배열(optical alignment)시킬 수 있다.
유용한 알고리즘의 한 예로는 PILEUP가 있다. PILEUP는 프로그레시브 쌍 배열 (progressive, pairwise alignment)을 사용하여 관련된 서열 그룹으로부터 다수의 서열 배열을 만들어 관련성 및 서열 일치 %를 보여준다. 또한, PILEUP는 상기 배열을 생성시키는 데에 사용되는 클러스터링 관계 (clustering relationship)을 보여주는 트리(tree) 또는 역트리형도 (dendogram)를 작성한다. PILEUP는 Feng 및 Doolittle {참조: 1987,J.Mol.Evol.35:351-360}의 프로그레시브 배열을 단순화시킨 것이다. 사용된 방법은 Higgins 및 Scharp의 방법{참조: 1989,CABIOS5:151-153}과 유사하다. 상기 프로그램은 최대 300개의 서열까지 배열할 수 있으며, 각 서열의 최대 뉴클레오티드 또는 아미노산의 길이는 5,000이다. 상기한 다수 배열 공정은, 우선, 2개의 가장 유사한 서열을 쌍으로 배열하여 2개의 배열된 서열 클러스터를 생성시킨다. 그리고나서, 이러한 클러스터를 배열된 서열 중에서 그 다음으로 가장 관련성이 높은 서열 또는 클러스터에 배열시킨다. 2개의 개개 서열을 쌍으로 배열하여 단순하게 연장시켜, 2개의 서열 클러스터를 배열시킨다. 최종 배열은, 일련의 프로그레시브 쌍 배열을 통해 이루어진다. 특정 서열 및 서열 비교부위에 대한 아미노산 또는 뉴클레오티드 좌표를 지정하고, 프로그램 파라미터를 지정하여, 상기 프로그램을 작동시킨다. 예를 들면, 기준 서열을 기타의 테스트 서열과 비교하여, 아래의 파라미터를 사용하여 서열 일치 관계 %를 결정할 수 있다: 디폴트 갭 가중값 (default gap weight, 3.00), 디폴트 갭 길이 가중값 (default gap length weight, 0.10) 및 가중 말단 갭 (weighted end gap).
서열 일치 % 및 서열 유사성을 측정하는 데에 유용한 다른 알고리즘의 예로는 Altschul 등의 BLAST 알고리즘 {참조: 1990,J.Mol.Biol.215:403-410}이 있다. 생물 기술 정보 국립 센터{참조: http:www.ncbi.nlm.nih.gov/}를 통해 BLAST 분석을 위한 소프트웨어를 공개적으로 입수할 수 있다. 상기 알고리즘은, 질의 서열 (query sequence) 에 있어서 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써, 데이터베이스 서열 중에 동일한 길이의 단어로 배열된 경우에 소정의 양 (+)의 임계치 T와 부합 (match)하거나 만족 (satisfy)하는, 하이 스코어링 서열 쌍 (high scoring sequence pair, HSP)을 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃 단어 스코어 임계치 (neighborhood word score threshold)를 의미한다 {참조: Altschul 등, 상기한 바와 동일}. 이러한 초기의 이웃 단어 히트 (neighborhood word hit)는, 이를 함유하는 보다 긴 HSP를 검색하기 위한 시드 (seed)로 작용한다. 그리고 나서, 이러한 단어 히트는, 누적 배열 스코어 (cumulative alignment score)가 증가할 수 있는 한, 각 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 아래의 경우에 각 방향으로의 상기한 단어 히트의 연장은 종료된다: i) 누적 배열 스코어가 가능한 최대값보다 X 만큼 떨어진 경우, ii) 하나 이상의 네가티브-스코어링 잔기 배열 (negative-scoringresidue alignment)로 인해, 누적 스코어가 0 이하로 내려가는 경우, 또는 iii) 서열의 말단부 둘 중 하나에 도달한 경우. 상기한 BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 상기 배열의 민감성 및 속도를 결정한다. 상기한 BLAST 프로그램에서는 디폴트로서 단어 길이 (wordlength, W) 11, BLOSUM 62 스코어링 매트릭스 {참조: Henikoff 및 Henikoff (1989) Proc.Nat'l Acad.Sci. USA 89:10915}, 배열 (B) 50, 기대치 (E) 10, M=5, N=4 및 양 스트랜드의 비교를 사용한다.
서열 일치 %를 계산하는 것 이외에도, BLAST 알고리즘은 2개의 서열간의 유사성을 통계적으로 분석한다 {참조: 예를 들면, Karlin 및 Altschul (1993)Proc.Nat'l Acad. Sci. USA90:5873-5787}. BLAST 알고리즘으로 수행되는 유사성 측정 중의 하나는 최소 가능성 합 (the smallest sum probability, P(N))으로서, 이는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열간 정합 (match)이 일어날 가능성을 표시해준다. 예를 들면, 테스트 핵산과 기준 핵산을 비교한 결과 최소 가능성 합이 약 0.1 미만인 경우, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만인 경우, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 테스트 핵산이 기준 서열과 유사하다고 간주된다.
소정의 폴리펩티드의 2가지의 뉴클레오티드 서열이 실질적으로 일치한다는 것을 보여주는 것으로는, 상술한 바와 같이, 제1 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 폴리펩티드가 제2 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응하는 경우이다. 따라서, 예를 들면, 2가지의 폴리펩티드가 보존적인 치환(conservative substitution)에서만 차이가 있는 경우, 통상적으로 소정의 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드와 실질적으로 일치하는 것이다. 2가지의 뉴클레오티드가 실질적으로 일치한다는 것을 보여주는 또 다른 것으로는, 상술한 바와 같이, 이러한 2가지의 분자가 서로 스트린전트 조건하에서 혼성화하는 경우이다.
기타의 다른 포유류 종에서 유래하는 CTLA-8 유사 단백질은, 표 1 내지 7에 도시된 바와 같이, 매우 관련성이 큰 종 (예를 들면, 인간)의 종-교차 혼성화 (cross species hybridization)에 의해 클로닝 및 분리될 수 있다. 관련성이 먼 종 사이에는 상동성이 상대적으로 낮을 수 있으므로, 상대적으로 종 사이에 관련성이 큰 종과 혼성화시키는 것이 바람직하다. 이와 달리, 종 특이성 (species specificity)이 보다 작은 항체 제조물은 발현 클로닝 방법에 유용할 수 있다.
III. 정제된 IL-170 단백질
영장류 (예를 들면, 인간) 및 설치류 (예를 들면, 마우스)의 IL-173 폴리펩티드 예상 서열은 상기 표 2에 기재되어 있다. 이와 유사하게, 표 3에서는, 영장류 (예를 들면, 인간)의 IL-174의 서열 (서열번호 14) 및 설치류 (예를 들면, 쥐)의 IL-174의 서열이 기재되어 있다. 이러한 펩티드 서열로 펩티드를 제조하여, 이러한 분절을 인식하는 항체를 생성할 수 있다.
본원에서의 용어 "영장류의 IL-170 단백질" 및 "설치류의 IL-170 단백질"은, 단백질의 범위내에서 사용되는 경우, 표 1 내지 7의 지정된 아미노산 서열을 가지는 단백질 또는 이러한 단백질의 주요 단편을 포함한다. 또한, 상기 용어는, IL-170 단백질-특정 결합 성분과 유사한 생물학적 활성을 보이거나 이러한 성분과 상호작용하는 영장류- 또는 설치류-유래 폴리펩티드를 의미하기도 한다. 이러한 결합 성분 (예를 들면, 항체)은, 통상적으로 IL-170 단백질과 고친화력 {예를 들면,적어도 약 100nM, 대개 약 30nM 이상, 바람직하게는 약 10nM 이상, 보다 바람직하게는 약 3nM 이상}을 가지고 결합한다. 랫트 또는 인간 이외의 다른 포유류 종 (예를 들면, 마우스, 영장류) 및 헤르페스 바이러스 게놈 (예를 들면, ORF13)에서, 상동 단백질이 종종 발견된다. 또한, 비-포유류 종들도 구조적 또는 기능적으로 연관된 유전자 및 단백질을 가지고 있을 것이다.
본원에서의 용어 "폴리펩티드"는, 주요 단편(fragment) 또는 분절 (segment)을 포함하며, 일련의 아미노산 잔기가 적어도 약 8개, 일반적으로는 (generally) 적어도 10개, 보다 일반적으로는 적어도 12개, 종종 (often) 적어도 14개, 보다 종종 적어도 16개, 통상적으로는 (typically) 적어도 18개, 보다 통상적으로는 적어도 20개, 대개 (usually) 적어도 22개, 보다 대개 적어도 24개, 바람직하게는 적어도 26개, 보다 바람직하게는 적어도 28개, 특히 바람직한 양태에서는 적어도 약 30개 이상인 것을 포함한다. 상기 분절의 특정 말단부는 상기 단백질내에서 어떠한 조합일 것이며, 바람직하게는 구조 도메인을 포함한다.
본원에서의 용어 "결합 조성물 (binding composition)"은, IL-170 단백질과 특이적으로 결합하는 분자 (예를 들면, 리간드-수용체 형태로 반응하는 항체-항원 상호작용) 또는 화합물 (예를 들면, 공유적 또는 비공유적으로 발생하는 천연 상태에서 생리적으로 관련되어 있는 단백질-단백질 상호작용과 같이, IL-170 단백질과 특이적으로 결합되는 단백질)을 의미한다. 상기 분자는 폴리머 또는 화학 시약일 수 있다. 리간드-수용체 상호작용에 있어서, IL-170 단백질이 리간드인지 수용체인 지에 대해서는 암시되어 있지 않지만, 이러한 상호작용은 이와 유사한 특이성 (예를 들면, 특이적 친화성)을 보인다. 기능적 유사체는, 구조적으로 변형된 단백질이거나, 예를 들면, 적합한 결합 결정기 (binding determinant)와 상호작용하는 분자 외형을 가진 완전히 관련성이 없는 분자일 수 있다. 상기 단백질은, 소정의 수용체의 효능제 또는 길항제로서 작용할 수 있다 {참조: 예를 들면, Goodman 등 (eds.1990)Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics(8th ed.), Pergamon Press}.
소정의 폴리펩티드 또는 단편의 용해도는 환경 및 폴리펩티드 자신에 따라 달라진다. 온도, 전해질 환경, 폴리펩티드의 크기와 분자 특성 및 용매의 특성 등의 여러 가지 파라미터들이 폴리펩티드의 용해도에 영향을 미친다. 통상적으로, 폴리펩티드가 사용되는 온도는 약 4℃ 내지 약 65℃ 사이이다. 대개(usually) 사용되는 온도는 약 18℃보다 높고, 보다 대개 사용되는 온도는 약 22℃보다 높다. 진단 목적으로 사용되는 경우, 상기 온도는 대개 실온 정도이거나 이보다 더 높을 수 있으나, 검정 대상 성분의 변성 온도 (denaturation temperature) 미만이다. 치료 목적으로 사용되는 경우, 상기 온도는 대개 체온 (통상적으로, 인간의 경우에는 약 37℃)이며, 특정 상황하에서는 원위치(in situ) 또는 시험관내에서 상기 온도는 상승 또는 하강될 수 있다.
전해질은 원위치에서의 생리학적 상태와 대개 유사하게 되지만, 잇점이 있는 소정의 경우에는 이온 강도를 더 높이거나 낮출 수 있다. 실제 이온은, 예를 들면, 생리 또는 분석에서 사용되는 표준 버퍼와 일치하도록 변형될 수 있다.
폴리펩티드의 크기 및 구조는, 일반적으로는 실질적으로 안정한 상태에 있어야 하며, 대개 변성된 상태에 있어서는 안된다. 상기한 폴리펩티드는, 예를 들면 용해도를 부여해주는 다른 폴리펩티드와 4차 구조로 결합되거나, 천연적인 지질 이중층 상호작용과 유사한 방식으로 지질 또는 세정제와 결합될 수 있다.
상기한 용매는, 대개, 생물학적 활성을 보호하기 위해 사용되는 형태의 생물학적으로 적합한 버퍼이며, 생리학적 용매와 유사하다. 상기한 용매의 pH는, 대개 중성 pH를 가지며, 통상적으로는 약 5 내지 10 사이이며, 바람직하게는 약 7.5이다. 소정의 경우에는 세정제를 첨가하는 데, 통상적으로는 경미한 강도의 비-변성 세정제 (예를 들면, CHS 또는 CHAPS) 또는 상기 항원의 구조적 또는 생리적 특성을 크게 해치지 않는 정도의 낮은 농도로 첨가한다.
용해도는, 특정 상황하에서 소정의 분자의 침강 속도를 측정한 값인 Svedberg 유닛으로 측정된 침강으로 알 수 있다. 침강 속도의 측정은 분석용 초원심 분리기에서 통상적으로 수행되었으며, 현재는 표준 초원심 분리기에서 수행되고 있다 {참조: Freidfelder (1982)Physical Biochemistry(2d ed.), W.H. Freeman; Cantor 및 Schimmel (1980)Biophysical Chemistry, parts 1-3, W.H.Freeman & Co., San Francisco}. 용해성 폴리펩티드로 생각되는 폴리펩티드를 함유한 샘플을 표준 완전 크기 초원심 분리기내에서 약 50k rpm으로 약 10분간 회전시키면, 용해성 분자는 상청액에 존재할 것이다. 용해성 입자 또는 폴리펩티드는, 통상적으로 (typically) 약 30S 미만, 보다 통상적으로는 약 15S 미만, 대개 (usually) 약 10S 미만, 보다 대개 약 6S 미만, 특히 바람직하게는 약 4S 미만, 보다 바람직하게는 약 3S 미만일 것이다.
IV. IL-170 단백질의 제조; 미메틱스 (Mimetics)
IL-170 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 DNA는, 화학 합성, cDNA 라이브러리 스크리닝 또는 다양한 세포 라인 또는 조직 샘플로부터 제조한 게놈 라이브러리를 스크리닝하여 수득될 수 있다.
이러한 DNA는 다양한 숙주 세포내에서 발현되어 전장 단백질 또는 이의 단편을 합성한 후, 예를 들면, 결합 연구, 변형된 분자의 작제와 발현 및 구조/기능 연구에 사용하기 위해 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 제조하는 데에 사용될 수 있다. 각 항원 또는 이의 단편은, 적합한 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포내에서 발현될 수 있다. 상기 분자는, 상기 재조합 숙주에서 유래된 것을 제외하고는, 단백질 또는 세포 오염물이 없을 정도로 실질적으로 정제될 수 있으므로, 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제와 함께 배합된 경우에 약제학적 조성물에 특히 유용하게 사용될 수 있다. 상기 항원 또는 이의 일부분은, 기타의 다른 단백질과 함께 융합된 단백질로서 발현될 수 있다.
통상적으로, 발현 벡터는, 적합한 숙주 세포 중에서 인식되는 적합한 유전 조절 성분과 대개 작동가능하게 결합된, 목적하는 항원 유전자 또는 이의 단편을 함유하는 자가-복제 DNA 또는 RNA 작제물이다. 이러한 조절 성분들은, 적합한 숙주내에서의 발현 능력을 보유하고 있다. 발현을 수행하기 위해 필요한 특정 유형의 조절 성분들은, 사용되는 최종 숙주 세포에 의존한다. 일반적으로, 상기한 유전 조절 성분은 원핵생물 프로모터 시스템 또는 진핵생물 프로모터 발현 조절 시스템을 포함할 수 있으며, 통상적으로는 전사 프로모터, 전사의 시작을 조절하는 임의적인 오퍼레이터, mRNA 발현 수준을 증가시키기 위한 전사 인헨서 및 전사 및 번역을 종결시키는 서열을 포함한다. 또한, 발현 벡터는 숙주 세포와 별개로 복제할 수 있는 복제 시발점을 대개 함유한다. 벡터의 카피 수 (copy number)를 증폭시키는 방법은 이미 공지되어 있다 {참조: 예를 들면, Kaufman 등 (1985)Molec. and Cell. Biol.5:1750-1759}.
본 발명의 벡터는, IL-170 단백질을 코딩하는 DNA 또는 통상적으로 생물학적 활성 폴리펩티드를 코딩하는 이의 단편을 포함한다. 상기 DNA는 바이러스 프로모터의 통제하에 있을 수 있으며, 선별 마커 (selection marker)를 코딩할 수 있다. 또한, 본 발명에서는, 원핵생물 또는 진핵생물 숙주내에서 IL-170 단백질을 코딩하는 진핵생물 cDNA를 발현시킬 수 있는 상기 발현 벡터의 용도를 포함한다. 이 때, 상기 벡터는 상기 숙주와 공존가능하고 (compatible), 상기 항원을 코딩하는 진핵생물 cDNA는 벡터내에 삽입되어 이러한 벡터를 함유하는 숙주가 증식하는 경우에 상기 cDNA를 발현하게 된다. 대개, 발현 벡터는, 숙주 세포내에서 안정되게 복제되도록 설계되거나, 숙주 세포당 목적하는 유전자의 총 카피 수를 크게 증가시킬 수 있도록 증폭되도록 설계된다. 발현 벡터가 항상 숙주 세포내에서 복제될 필요는 없다. 예를 들면, 숙주 세포에 의해 인식되는 복제 시발점을 함유하지 않는 벡터를 사용하는 다양한 숙주내에서, 상기 항원 또는 이의 단편을 일시적으로 발현시킬 수 있다. 또한, IL-170 단백질의 유전자 또는 이의 단편이 숙주 DNA에 재조합 방법으로 혼입되는 것을 유발하는 벡터를 사용하거나, 내인성 유전자의 발현을 통제하는 프로모터를 혼입시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는, 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 혼입가능한 DNA 단편 및 소정의 DNA 단편을 숙주의 게놈에 혼입시킬 수 있는 기타의 비히클을 포함한다. 발현 벡터는, 작동가능하게 결합된 유전자를 발현시키는 유전 조절 성분을 함유하는 특수화된 벡터이다. 플라스미드가 가장 널리 이용되는 형태의 벡터이지만, 이와 동등한 기능을 수행하고 당업계에 공지되어 있는 모든 다른 형태의 벡터들도 사용하기에 적합하다 {참조: 예를 들면, Pouwels 등 (1985 및 보충자료)Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y.; Rodriquez 등 (eds. 1988) Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, MA}.
"형질전환된 세포"는, 통상적으로 재조합 DNA 기술을 이용하여 작제된, IL-170 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포 (바람직하게는, 포유동물 세포)를 포함한다. 형질전환된 숙주 세포는 상기한 항원 또는 이의 단편을 대개 발현하지만, 상기 DNA의 클로닝, 증폭 및 조작을 위해서는 상기 단백질을 발현시킬 필요는 없다. 또한, 본 발명에서는, 영양 배지내에서 상기 형질전환된 세포를 배양시켜 상기 단백질이 배양물내에 축적되도록 하는 방법을 포함한다. 상기 단백질은, 배양물 또는 배양 배지로부터 회수시킬 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, DNA 서열이 서로 기능적으로 관련될 경우, 이러한 DNA 서열은 작동가능하게 결합된다. 예를 들면, 전서열 (presequence) 또는 분비성 리더(secretory leader)에 해당하는 DNA는, 프레-단백질 (preprotein)로서 발현되거나 소정의 폴리펩티드를 세포막으로 보내거나 방출시키는 데에 관여하는 경우,이러한 폴리펩티드에 작동가능하게 결합된다. 프로모터는, 상기 폴리펩티드의 전사를 조절하는 경우, 코딩 서열에 작동가능하게 결합된다. 리보솜-결합 부위는, 번역이 수행될 수 있도록 위치하는 경우, 코딩 서열에 작동가능하게 결합된다. 대개, "작동가능하게 결합된"은 연속적인 것을 의미하나, 판독 프레임에 있어서 리프레서 유전자와 같은 소정의 유전 성분은 연속적으로 결합되어 있지 않으나, 오퍼레이터 서열에 결합되어 발현을 조절한다.
적합한 숙주 세포에는, 원핵생물, 하등 진핵생물 및 고등 진핵생물이 포함된다. 원핵생물에는 그램 음성 및 그램 양성 생물체 (예를 들면, E.coli 및 B.subtilis)가 포함된다. 하등 진핵생물에는 효모 (예를 들면, S.cerevisiae 및 Pichia) 및 Dictyostelium 속에 속하는 종이 포함된다. 고등 진핵생물에는 비-포유류 기원 (예를 들면, 곤충 세포 및 조류) 및 포유류 기원 (예를 들면, 인간, 영장류 및 설치류)의 동물 세포에서 기원한 확립되어 있는 조직 배양 세포 라인이 포함된다.
원핵생물 숙주-벡터 시스템에는, 여러 다양한 종에 대한 벡터가 포함된다. 본원에서 사용되고 있는 바와 같이, E.coli 및 이의 벡터는 기타의 다른 원핵생물에서 사용되는 이와 균등한 벡터를 포함하는 속 개념으로(generically) 사용된다. DNA를 증폭시키기 위해 사용되는 대표적인 벡터로는 pBR322 또는 여러 가지의 이의 유도체가 있다. 상기한 IL-170 단백질 또는 이의 단편을 발현시키는 데에 사용될 수 있는 벡터에는, lac 프로모터를 함유하는 벡터 (pUC-시리즈); trp 프로모터를 함유하는 벡터 (pBR322-trp); Ipp 프로모터를 함유하는 벡터 (pIN-시리즈); 람다-pP 또는 pR 프로모터를 함유하는 벡터 (pOTS); 또는 ptac와 같은 혼성 프로모터를 함유하는 벡터 (pDR540)가 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다 {참조: Brosius 등, (1988) "Expression Vectors Employing Lamda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", in Rodriguez 및 Denhardt (eds.)Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, Chapter 10, pp.205-236}.
하등 진핵생물 (예를 들면, 효모 및 Dictyostelium)은, IL-170 단백질을 코딩하는 벡터로 형질전환될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 가장 통상적으로 사용되는 하등 진핵생물 숙주는 제빵 효모인 사카로마이세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae)이다. 수많은 기타의 다른 균주 및 종이 사용될 수 있으나, 상기 효모를 하등 진핵생물을 속 개념으로 대표하는 것으로 사용한다. 효모 벡터는, 통상적으로 복제 시발점 (혼입 형태가 아닌 경우), 선별 유전자, 프로모터, 목적하는 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 DNA, 및 번역 종결 서열, 폴리아데닐화 서열 및 전사 종결 서열로 대개 이루어져 있다. 효모에 있어서 적합한 발현 벡터에는, 3-포스포글리세레이트 카이네이즈 및 기타의 다른 글루코스 분해 효소 유전자 프로모터와 같은 구성 프로모터 (constitutive promoter)이거나, 알코올 디하이드로게나제-2 프로모터 또는 메탈로티오닌 프로모터와 같은 유도성 프로모터 (inducible promoter)가 포함된다. 적합한 벡터에는, 하기 유형의 유도체가 포함된다: 적은 카피 수의 자가 복제형 (예를 들면, YRp-시리즈), 많은 카피 수의 자가 복제형 (예를 들면, YEp-시리즈), 혼입형 (예를 들면, YIp-시리즈) 또는 소염색체형 (mini-chromosome, 예를 들면 YCp-시리즈)이 포함된다.
고등 진핵생물 조직 배양 세포는, 기능적으로 활성을 나타내는 IL-170 단백질을 발현시키는 데에 바람직한 숙주 세포이다. 원칙상, 예를 들면 곤충의 바쿨로바이러스 (baculovirus) 발현 시스템과 같이, 무척수 또는 척수 동물로부터 유래하는 많은 고등 진핵생물 조직 배양 세포 라인이 작동가능하다. 하지만, 번역과 동시 및 번역 후에 프로세싱을 함에 있어서, 포유동물 세포가 바람직하다. 상기 세포의 형질전환 또는 형질감염 및 증식은 통상적인 공정이다. 유용한 세포 라인의 예로는, Hela 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 라인, 새끼 랫트 신장 (BRK) 세포 라인, 곤충 세포 라인, 조류 세포 라인 및 원숭이 (COS) 세포 라인이 포함된다. 이러한 세포 라인에 대한 발현 벡터에는, 복제 시발점, 프로모터, 번역 개시 부위, RNA 스플라이싱 부위 (게놈 DNA가 사용되는 경우), 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결 부위가 대개 포함된다. 또한, 이러한 벡터는 대개 선별 유전자 또는 증폭 유전자를 포함한다. 적합한 발현 벡터는, 예를 들면 아데노바이러스, SV40, 파르보바이러스, 박시니아 바이러스 또는 사이토메갈로바이러스 등에서 유래한 프로모터를 함유하는 플라스미드, 바이러스 또는 레트로바이러스일 수 있다. 적합한 발현 벡터의 대표적인 예로는, pCDNA1; pCD {참조: Okayama 등 (1985)Mol.Cell Biol.5:1136-1142}; pMC1neo Poly-A {참조: Thomas 등 (1987)Cell51:503-512}; 및 pAC 373 또는 pAC 610과 같은 바쿨로바이러스 벡터 {참조: O'Reilly 등 (1992)Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory ManualFreeman and Co., CRC Press, Boca Raton, Fla.}가 포함된다.
특이적 또는 정의된 글리코실화 패턴을 제공하는 소정의 시스템내에서 IL-170 단백질 폴리펩티드를 발현시키는 것이 종종 바람직하다. 이러한 경우, 상기 발현 시스템에 의해 통상적인 패턴이 자연 발생될 것이다. 하지만, 상기 패턴은, 이형(heterologous) 발현 시스템에 도입된 적합한 글리코실화-단백질에 상기 폴리펩티드 (예를 들면, 비-글리코실화된 형태)를 노출시켜 변형시킬 수 있을 것이다. 예를 들면, 상기 IL-170 단백질의 유전자는, 포유동물 또는 기타의 글리코실화 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자와 함께 공-형질전환(co-transformation)될 수 있다. 이러한 방법을 사용하여, 원핵생물 또는 기타의 세포내에서 소정의 포유동물 글리코실화 패턴을 얻거나 이와 유사하게 될 수 있다.
상기한 IL-170 단백질 또는 이의 단편을 조작하여 세포막에 결합된 포스파티딜 이노시톨 (PI)에 부착시킬 수 있으나, 포스파티딜 이노시톨-절단 효소 (예를 들면, 포스파티딜 이노시톨 포스포리파제-C)로 처리하여 막으로부터 제거할 수 있다. 이로 인해, 생물학적 활성 형태의 항원이 방출되어, 단백질 화학 분야에서 사용되는 표준 공정으로 정제할 수 있다 {참조: 예를 들면, Low (1989)Biochim. Biophys. Acta988:427-454; Tse 등 (1985)Science230:1003-1008; Brunner 등 (1991)J.Cell Biol.114:1275-1283}.
IL-170 단백질의 특성은 이미 밝혀졌으므로, 이의 단편 또는 유도체는 통상적인 펩티드 합성 공정을 이용하여 제조할 수 있다. 이러한 공정에는 아래 문헌에 기재된 공정이 포함된다 {참조: Stewart 및 Young, (1984)Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky 및 Bodanszky (1984)The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York; Bodanszky (1984)The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York}. 예를 들면, 아지드 공정, 산 염화물 공정, 산 무수물 공정, 혼합 무수물 공정, 활성 에스테르 공정 (예를 들면, p-니트로페닐 에스테르, N-하이드록시숙신이미드 에스테르 또는 시아노메틸 에스테르), 카보디이미다졸 공정, 산화 환원 반응, 또는 디사이클로헥실카보디이미드 (DCCD)/첨가 공정이 사용될 수 있다. 고체상 및 용액상 합성법 모두가 상기 공정에 적용가능하다.
상기한 IL-170 단백질, 이의 단편 또는 이의 유도체는, 일반적으로, 아미노산 서열 하나씩 소정의 아미노산을 말단부 아미노산에 축합시키는 것을 포함하여 소위 단계별 공정에 의해, 또는 펩티드 단편을 말단부 아미노산에 커플링시킴으로써, 펩티드 합성에 통상적으로 사용되는 상기 공정에 따라 적합하게 제조된다. 상기 커플링 반응에 사용되지 않은 아미노 그룹은 통상적으로 보호되어, 적합하지 않은 부위에서의 커플링 발생을 방지한다.
고체상 합성법을 사용하는 경우, C 말단부 아미노산은 카복실 그룹을 통해 불용성 담체 또는 지지부에 결합된다. 이러한 불용성 담체는, 반응성 카복실 그룹에 대해 결합 능력을 가지는 한, 특별히 제한되지는 않는다. 이러한 불용성 담체의 예로는, 할로메틸 수지 (예를 들면, 클로로메틸 수지 또는 브로모메틸 수지), 하이드록시메틸 수지, 페놀 수지, 3차 알킬옥시카보닐-히드라진 수지 등이 포함된다.
아미노 그룹-보호된 아미노산은, 한 단계씩 펩티드를 합성하기 위해, 자신의활성화된 카복실 그룹과 이미 형성되어 있는 펩티드 또는 사슬의 반응성 아미노 그룹의 축합 반응을 통해 서열에 결합된다. 완전한 서열을 합성한 후, 불용성 담체로부터 제거하여 상기 펩티드를 제조한다. 이러한 고체상 방법에 대해서는 일반적으로 아래의 문헌에 기재되어 있다 {참조: Merrifield 등 (1963)J.Am.Chem.Soc.85:2149-2156}.
이렇게 제조된 단백질 및 이의 단편은, 펩티드 분리 방법 (예를 들면, 추출, 침강, 전기 영동 및 여러 형태의 크로마토그래피 등)에 의해 반응 혼합물로부터 분리 및 정제할 수 있다. 본 발명의 IL-170 단백질은, 목적하는 용도에 따라 순도의 정도를 달리하여 수득할 수 있다. 본원에 기재된 단백질 정제 기술 또는 면역흡수 친화성 크로마토그래피에서의 항체를 사용하여 정제할 수 있다. 아래에 기재된 바와 같이, 상기한 면역흡수 친화성 크로마토그래피 (immunoabsorbant affinity chromatography)는, 항체를 고형 지지물에 결합시킨 후; 결합된 항체를 적합한 공급원 세포의 용해물, 상기 단백질을 발현하는 기타의 세포의 용해물, 하기의 DNA 기법의 결과로 IL-170 단백질을 생성하는 세포의 용해물 또는 상층액과 접촉시켜 수행된다.
V. 물리적 변수
또한, 본 발명에서는, IL-170 단백질의 아미노산 서열과 실질적인 (substantial) 아미노산 서열 상동성을 가지는 단백질 또는 펩티드를 포함한다.
아미노산 서열 상동성 또는 서열 일치성은 잔기 매치 (residue match)를 최적화함으로써, 필요한 경우에는 갭(gap)을 삽입함으로써, 결정된다. 이는, 보존적인 치환을 매치로 간주하는 경우에는 변한다. 통상적으로, 보존적인 치환 (conservative substitution)은 하기 그룹에 속하는 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 라이신, 아르기닌; 페닐알라닌, 티로신. 통상적으로, 아미노산 상동 서열은, 상응하는 각 단백질 서열에서의 자연적인 대립 형질 (allelic) 및 종간(interspecies) 변화를 포함하는 것을 의미한다. 통상적인 상동 단백질 또는 펩티드는, 상기한 IL-170 단백질의 아미노산 서열과 25-100% (갭을 삽입할 수 있는 경우) 내지 50-100% (보존적인 치환이 포함된 경우)의 상동성을 가질 것이다. 상동성 측정치는, 적어도 약 35%, 일반적으로(generally) 적어도 40%, 보다 일반적으로 적어도 45%, 종종 (often) 적어도 50%, 보다 종종 적어도 55%, 통상적으로 (typically) 적어도 60%, 보다 통상적으로 적어도 65%, 대개 (usually) 적어도 70%, 보다 대개 적어도 75%, 바람직하게는 (preferably) 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 특히 바람직하게는 적어도 85% 이상이다 {참조: Needleham 등 (1970)J.Mol.Biol.48:443-453; Sankoff 등 (1983) Chapter one in Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence ComparisonAddison-Wesley, Reading, MA; 캘리포니아 마운틴뷰 소재의 IntelliGenetics사의 소프트웨어 패키지; 위스콘신 매디슨 소재의 the University of Wisconsin Genetics Computer Group}.
IL-170 단백질을 코딩하는 분리된 DNA는, 뉴클레오티드 치환, 뉴클레오티드 결손, 뉴클레오티드 삽입 및 일련의 뉴클레오티드의 역전에 의해 용이하게 변형될수 있다. 이러한 변형으로 인해, 유사한 생리 활성, 면역원 활성 또는 항원성 활성을 가지는 항원, 유도체 또는 단백질을 코딩하는 새로운 DNA 서열을 수득하게 된다. 이러한 변형된 서열은, 발현을 증가시키거나 돌연변이 항원을 생성시키는 데에 사용될 수 있다. 발현의 증가에는, 유전자 증폭, 전사 증가, 번역 증가 및 기타의 메카니즘이 관련될 수 있다. 상기와 같은 돌연변이 IL-170 단백질 유도체에는, IL-170 단백질 또는 이의 단편의 예정된 (predetermined) 또는 부위-특이적인 (site-specific) 돌연변이체를 포함한다. "돌연변이 IL-170 단백질"은, 상기한 쥐 또는 인간의 IL-170 단백질의 상동성 정의 내에 부합하지만, 결손, 치환 또는 삽입에 의해 자연 상태에서 발견되는 IL-170 단백질과는 상이한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 특히, "부위-특이적 돌연변이 IL-170 단백질"은, 일반적으로, 표 1 내지 6의 서열을 갖는 상응하는 단백질과 상당한 정도의 상동성을 가지며, 다양한 생물학적 활성 (예를 들면, 항원성 또는 면역원성)을 공유하는 단백질을 포함하며, 바람직한 양태에서는 상기한 서열의 대부분을 포함한다. 상기와 유사한 개념이 상이한 IL-170 단백질 (특히, 포유류 및 조류와 같은 다양한 온혈 동물에서 발견되는 IL-170 단백질)의 경우에 적용된다. 상기한 바와 같이, 일반적으로 본원의 상세한 설명의 내용은 모든 IL-170 단백질을 포함하는 것을 의미하며, 특정 기술되어 있는 마우스와 관련된 양태에만 한정되는 것은 아니다.
부위-특이적 돌연변이 부위가 예정되어 있는(predetermined) 경우라 할지라도, 돌연변이체가 부위-특이적일 필요는 없다. IL-170 단백질의 돌연변이는, 아미노산 삽입 또는 결손을 통해 이루어질 수 있다. 치환, 결손, 삽입 또는 이들의 결합으로 인해 최종 작제물이 생성될 수 있다. 삽입에는, 아미노- 또는 카복시-말단 융합이 포함된다. 무작위 돌연변이는 표적 코돈에서 수행될 수 있으며, 그리고나서 발현된 돌연변이체 중에서 목적하는 활성을 가지는 돌연변이체를 스크리닝할 수 있다. 공지된 서열을 갖는 DNA에 있어서 예정된 부위에 치환 돌연변이를 시키는 방법은, 예를 들면 M13 프라이머 돌연변이 또는 PCR 기법 등과 같이 당업계에 잘 알려져 있다 {참조: Sambrook 등 (1989) 및 Ausubel 등 (1987 및 추후 보충자료)}.
통상, DNA내에서의 돌연변이는, 판독 프레임 (reading frame)을 벗어난 부위에 코딩 서열을 배치시켜서는 안 되며, 바람직하게는 혼성화하여 2차 mRNA 구조 (예를 들면, 루프 또는 헤어핀)를 생성할 수 있는 상보적인 부위를 생성하지 않는다.
또한, 본 발명에서는, 이러한 단백질의 분절 (segment)을 이용한 이형 융합 단백질 (heterologous fusion protein)과 같은 재조합 단백질을 제공한다. 이형 융합 단백질은, 동일한 방식으로는 자연 상태에서 통상적으로 융합되지 않는 단백질 또는 이의 분절의 융합체이다. 따라서, 면역글로불린과 IL-170 폴리펩티드의 융합 생성물은, 각각의 공급원 펩티드에서 유래한 특성을 가지며 단일 번역 생성물로 제조된, 통상적인 펩티드 결합으로 융합된 서열을 가진 연속적인 단백질 분자이다. 이와 유사한 개념이 이형 핵산 서열에도 적용된다.
게다가, 기타의 다른 단백질에서 유래한 유사한 기능을 가지는 도메인을 결합하여 새로운 작제물을 제조할 수 있다. 예를 들면, 항원-결합 또는 기타의 분절은, 상이한 새로운 융합 폴리펩티드 또는 단편 사이에서 교환 (swap)될 수 있다 {참조: 예를 들면, Cunningham 등 (1989)Science243:1330-1336; O'Dowd 등 (1988)J.Biol.Chem.263:15985-15992}. 따라서, 생물학적으로 관련성이 있는 도메인과 기타의 기능성 도메인간의 기능적인 연관에 의해 새로운 결합된 형태의 특이성을 나타내는 키메라 폴리펩티드가 생성될 것이다.
Beaucage 및 Carruthers (1981) {참조:Tetra.Letts.22:1859-1862}가 기술하고 있는 포스포르아미디트 방법에 의해 적합한 합성 DNA 단편을 제조할 수 있을 것이다. 종종, 상보적인 스트랜드를 합성한 후에 상기 스트랜드와 적합한 조건하에서 어닐링시키거나, 적합한 프라이머 서열과 함께 DNA 폴리머라제를 사용하여 상보적인 스트랜드를 첨가함으로써 (예를 들면, PCR 방법), 이중 스트랜드 단편을 수득하게 된다.
VI. 기능성 변이체
IL-170 단백질에 대한 억제 또는 생리 반응의 원인은, 상기 항원의 자연 상태의 결합 상대와의 결합의 억제 (예를 들면, 경쟁적인 억제) 일 수 있다. 따라서, 본 발명의 시험관내 분석에서는, 분리된 단백질, 막-연관된 재조합 IL-170 단백질을 발현하는 세포에서 유래한 막, 결합 분절 (segment)을 포함하는 가용성 단편 또는 고체상 기질에 부착된 단편을 사용할 것이다. 또한, 이러한 분석으로 인해, 분절 돌연변이 및 변형의 효과 또는 단백질 돌연변이 및 변형 (예를 들면, 유사체)의 효과를 진단 측정할 수 있을 것이다.
또한, 본 발명은, 예를 들면 항원 또는 결합 상대 단편에 대한 중성화 항체가 테스트 화합물과 결합 경쟁을 하는, 경쟁적인 약제 스크리닝 분석(competitivedrug screening assay)에 사용하는 용도를 포함한다. 이 방식으로, 상기 항체는 상기 단백질의 하나 이상의 항원성 결합 부위를 공유하는 폴리펩티드의 존재 여부를 검출하는 데에 사용될 수 있으며, 그렇지 않으면 결합 상대와 상호 작용할 수 있는 단백질 상의 결합 부위를 차지하는 데에 사용될 수 있다.
게다가, IL-170 단백질 및 고친화성 수용체 결합 부위를 가진 이의 가용성 단편에 대한 중성화 항체는, 조직 (예를 들면, 비정상적인 생리 현상을 나타내는 조직)에서의 항원 기능을 억제하는 데에 사용될 수 있다.
IL-170 항원의 "유도체"는, 아미노산 서열 돌연변이, 글리코실화 변이체, 및 다른 화학적 잔기와의 공유 또는 응집 컨쥬게이트를 포함한다. 공유 유도체는, 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의해, IL-170 아미노산 측쇄내 N 말단 또는 C 말단에서 발견되는 그룹에 기능적으로 연관시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 유도체는, 카복실 말단 또는 카복실 측쇄를 함유하는 잔기의 지방족 에스테르 또는 아미드, 수산화기-함유 잔기의 O-아실 유도체, 아미노 말단 아미노산 또는 아미노 그룹-함유 잔기 (예를 들면, 라이신 또는 아르기닌)의 N-아실 유도체를 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 아실 그룹은, C3 내지 C18 정상적인 알킬을 함유하는 알킬 잔기 그룹 (따라서, 알카노일 아로일 종을 형성)으로부터 선택된다. 면역원성 잔기가 헵텐 (hepten)인 경우, 담체 단백질에 공유적으로 부착되는 것이 중요할 수 있다.
특히, 예를 들면, 소정의 폴리펩티드의 합성 및 처리 과정 중에 또는 추가의 처리 단계에서 글리코실화 패턴을 변형시킴으로써 이루어지는, 글리코실화 변형 방법이 포함된다. 이를 수행하는 특히 바람직한 수단은, 정상적으로 상기한 처리 공정을 제공하는 세포에서 유래한 글리코실화 효소 (예를 들면, 포유류 글리코실화 효소)에 상기 폴리펩티드를 노출시키는 것이다. 또한, 탈-글리코실화 효소 (deglycosylation enzyme)도 포함된다. 게다가, 인산화된 아미노산 잔기 (예를 들면, 포스포티로신, 포스포세린 또는 포스포트레오닌)를 포함하여, 기타의 경미하게 변형된 1차 아미노산 서열도 포함된다.
주요 유도체 그룹은, IL-170 단백질 또는 이의 단편과 기타의 단백질 또는 폴리펩티드의 공유 컨쥬게이트이다. 이러한 유도체는, N- 또는 C-말단 융합과 같은 재조합 배양물내에서 합성될 수 있으며, 반응성 측면 그룹을 통한 단백질의 상호 연관(cross-linkage)에 유용한 것으로 알려져 있는 상호 연관 제제를 사용하여 합성할 수 있다. 바람직하게는, 상호 연관 제제를 갖는 항원 유도 부위는 자유 아미노 그룹, 카보하이드레이트 잔기 및 시스테인 잔기에 위치한다.
또한, 본 발명에서는 IL-170 단백질 및 기타의 상동 또는 이형 단백질 간의 융합 폴리펩티드를 제공한다. 상동 폴리펩티드는 상이한 표면 마커 사이의 융합체일 수 있으며, 이로 인해, 예를 들면, 수용체 결합 특이성을 발현하는 하이브리드 단백질을 생성할 수 있다. 이와 유사하게, 상기한 유도체 단백질의 특성 또는 활성이 결합된 이형 융합체가 작제될 수 있다. 통상적인 예로는, 소정의 항원의 분절 또는 도메인 (예를 들면, 수용체-결합 분절)과 리포터 폴리펩티드 (예를 들면, 루시페라제)의 융합체가 있는 데, 이러한 융합 항원의 존재 여부 및 위치는 용이하게 측정될 수 있다 {참조: 예를 들면, Dull 등, 미합중국 특허 제4,859,609호}.기타의 유전자 융합 대상으로는, 박테리아의 β-갈락토시데이즈, trpE, 단백질 A, β-락타메이즈, 알파 아밀라제, 알코올 디하이드로게나제 및 효모의 알파 메이팅 인자 (alpha mating factor)가 포함된다 {참조: 예를 들면, Godowski 등 (1988)Science241:812-816}.
Beaucage 및 Carruthers (1981)이 기술한 포스포르아미디트 방법 {참조:Tetra.Letts.22:1859-1862}을 사용하는 경우, 적합한 합성 DNA 단편을 제조할 수 있을 것이다. 종종, 상보적인 스트랜드를 합성한 후에 상기 스트랜드와 적합한 조건하에서 어닐링시키거나, 적합한 프라이머 서열과 함께 DNA 폴리머라제를 사용하여 상보적인 스트랜드를 첨가함으로써 (예를 들면, PCR 방법), 이중 스트랜드 단편을 수득하게 된다.
또한, 이러한 폴리펩티드는, 인산화, 설폰화, 비오티닐화 또는 기타 잔기의 첨가 또는 제거에 의해 화학적으로 변형된 아미노산 잔기 (특히, 포스페이트 그룹과 유사한 분자 형태를 가지는 아미노산 잔기)를 가진다. 소정의 양태에서는, 이러한 변형은 유용한 표지 시약으로서 사용될 수 있으며, 정제 표적 (예를 들면, 친화성 리간드)으로서 작용하기도 한다.
통상적으로, 융합 단백질은, 재조합 핵산 기술 또는 합성 폴리펩티드 기술에의해 제조될 수 있다. 핵산 조작 및 발현 기술에 대해서는, 예를 들면 하기 참조 문헌에 기재되어 있다 {참조: Sambrook 등 (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d ed.), Vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory}. 폴리펩티드 합성 기술에 대해서는, 예를 들면 하기 참조 문헌에 기재되어 있다 {참조:Merrifield (1963)J.Amer.Chem.Soc.85:2149-2156; Merrifield (1986)Science232:341-347; Atherton 등 (1989)Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press Oxford}.
또한, 본 발명은 아미노산 서열에서의 변이 또는 글리코실화 이외의 IL-170 단백질 유도체의 이용을 포함한다. 이러한 유도체는, 화학적 잔기와의 공유 또는 응집 결합을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이러한 유도체는 다음 3가지의 클래스로 구분된다: (1) 염, (2) 측쇄 및 말단 잔기의 공유 변형, 및 (3) 세포막 등과의 흡수 복합체 (adsorption complex). 상기한 공유 또는 응집 유도체는, 면역원, 면역검정 시약 또는 항원이나 기타의 결합 단백질의 친화성 정제와 같은 정제 방법에서의 시약으로 사용하기에 유용하다. 예를 들면, 항-IL-170 단백질 항체 또는 이의 수용체나 기타의 결합 상대의 분석 또는 정제에 사용하기 위해, 고형 지지체 (예를 들면, 시아노겐 브로마이드-활성화 세팔로즈)에 공유 결합하거나, 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의하거나, 글루타르알데히드 상호 연관 존재 또는 부존재하에서 폴리올레핀 표면에 흡수되어, IL-170 항원은 고착시킬 수 있다. 또한, IL-170 항원은 표지-가능한 그룹으로 표지될 수 있는 데, 예를 들면 진단 분석에 사용하기 위해 클로르아민 T 공정을 사용하여 방사성 요오드화시키거나, 희토 킬레이트 (rare earth chelate)에 공유 결합시키거나, 다른 형광 잔기에 컨쥬게이션시킬 수 있다. 고정된 항체 또는 결합 대상을 이용하여, IL-170 단백질을 정제할 수 있다.
본 발명의 용해된 IL-170 항원 또는 이의 단편은, 본 발명의 용해된 IL-170 항원 또는 이의 단편에 특이적인 항체 또는 항혈청을 생산하기 위한 면역원으로서사용할 수 있다. 정제된 항원은, 상기 단백질을 함유하는 불순한 여러 형태의 제제로 면역 반응시켜 제조한 모노클로날 항체 또는 결합 단편을 스크리닝하는 데에 사용할 수 있다. 특히, 용어 "항체"는 자연 상태의 항체 중의 항원-결합 단편을 포함한다. 또한, 정제된 IL-170 단백질은, IL-170 단백질 또는 이를 함유하는 세포 단편의 발현 수준이 증가함에 따라 생성되는 항체를 감지하는 시약으로서 사용하여, 비정상적이거나 특이적인 생리 또는 질환 상태를 진단할 수 있다. 게다가, 항원 단편은, 아래에 기술되어 있는 바와 같이, 면역원으로 작용하여 본 발명의 항체를 생성하는 데에 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서는 표 1 내지 6의 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 아미노산 서열 또는 이를 함유하는 단백질 단편에 대한 항체를 포함한다. 특히, 본 발명에서는 지질 이중막 밖에 위치하는 것으로 예상되는 특이적인 단편에 대한 항체 또는 이러한 단편에 결합 친화성을 가지는 항체를 포함한다.
본 발명에서는, 추가로 관련성이 큰 종 변이체(species variant)의 분리를 포함한다. 서던 블랏 분석을 통해, 유사한 유전자 엔타이티(genetic entity)가 기타 포유류 (예를 들면, 랫트 및 인간)에 존재함을 확인하였다. IL-170 단백질은 종 변이체 (예를 들면, 설치류, 토끼, 육식동물, 우제류, 기제류 및 영장류) 에 널리 분포되어 있는 것 같다.
또한, 본 발명에서는, 구조, 발현 및 기능상 특이성 및 유사성을 나타내는 관련 항원 그룹을 분리하는 수단을 제공한다. 상이한 종 변이체의 분리 및 특성화에 의해, 상기 항원의 많은 생리 효과를 규명하는 속도가 크게 빨라질 것이다. 특히, 본 발명에서는, 상이한 종에서의 추가의 상동성 유전자 엔타이티를 동정하는 유용한 프로브를 제공한다.
분리된 유전자를 이용하여, IL-170 단백질이 발현되지 않는 세포 (예를 들면, 상응하는 항원을 가지고 있지 않아 네가티브 배경 활성을 보이는 형태의 종 또는 세포)를 형질 전환시킬 수 있다. 형질전환된 유전자를 발현시켜, 정의된 또는 단일 종 변이체를 가진 항원적으로 순수한 세포 라인을 분리할 수 있을 것이다. 이러한 방법을 사용하게 되면, IL-170 단백질의 생리 효과를 보다 민감하게 감지 및 분별할 수 있다. 서브-세포 단편 (예를 들면, 세포 원형질 또는 막 단편)을 분리 및 사용할 수 있다.
현대 분자 생물학에서 사용하는 (특히, 관련된 클래스 구성원들간의 비교에 사용하는) 표준 기법을 이용하여, 상기 단백질이 제공하는 다양한 생리 또는 분화 기능을 발휘하는 주요 구조 성분을 해부 (dissection)할 수 있다 {참조: 예를 들면, 상동체-스캐닝 돌연변이형성 기법 - Cunningham 등 (1989)Science243:1339-1336; O'Dowd 등 (1988)J.Biol.Chem.263:15985-15992; Lechleiter 등 (1990)EMBO J.9:4381-4390}.
특히, 기능성 도메인 또는 분절은 종 변이체 간에 치환되어, 결합 대상의 친화성 및 특이성과 신호 전달에 있어서 어떠한 구조적 특성이 중요한 것인지를 결정할 수 있다. 상이한 변이체를 분석하여, 결합 대상의 상이한 종 변이체와의 상호 작용 특성을 나타내는 분자를 스크리닝할 수 있다.
항원 내재화 (antigen internalization)은 특정 상황하에서 발생할 수 있으며, 상호 작용에 관여하는 단백질의 세포내 성분과 세포외 분절 간에 상호 작용이 일어날 수 있다. 기타의 세포내 성분과 상호작용하는 IL-170 단백질의 특정 분절의 동정은, 돌연변이 형성 또는 직접적인 생화학적 수단 (예를 들면, 상호 연관 또는 친화성 방법)에 의해 이루어질 수 있다. 결정 또는 기타의 물리적인 방법을 이용한 구조 분석을 사용할 수도 있다. 생물학적 기능의 메카니즘에 대한 추가적인 분석에는, 친화성 방법 또는 유전학적인 수단 (예를 들면, 돌연변이체의 상보성 분석)에 의해 분리 가능한 관련 성분의 조사가 포함된다.
IL-170 단백질의 발현 및 조절에 대한 추가 연구가 이루어질 것이다. 상기 항원과 관련한 조절 성분들은, 차별적인 분화, 조직 특이성 또는 기타의 발현 양태를 나타낼 것이다. 업-스트림 또는 다운-스트림 유전 부위 (예를 들면, 조절 성분)가 관심을 갖는 부위이다.
상기 항원의 구조에 관한 연구를 통해, 새로운 변이체, 특히 결합 상대에 대한 효능제 또는 길항제 특성을 나타내는 유사체를 설계하게 될 것이다. 이는 상술한 스크리닝 방법과 결합되어, 목적하는 활성 스펙트럼을 나타내는 변이체를 분리하는 데에 사용될 수 있을 것이다.
기타의 다른 유형의 세포에서 발현됨으로 인해, 소정의 항원에서의 글리코실화에 차이가 종종 있을 것이다. 다양한 종 변이체들은, 아미노산 서열 이외의 구조적인 차이에 기초하여 차별적인 기능을 나타낼 수 있다. 기능의 차이의 원인이 변형의 차이에 있을 수 있으며, 현재 이러한 효과를 규명할 수 있다.
따라서, 본 발명에서는, 항원-결합 상대간의 상호 작용에 관련된 중요 제제를 제공한다. 상기한 내용은 주로 쥐 및 인간의 IL-170 단백질에 초점을 맞춘 것이지만, 당업자라면 본 발명은 기타의 다른 항원 (예를 들면, 마우스 및 기타 포유류 종) 또는 이의 변이체 및 대립형질 변이체를 포함함을 인식할 것이다.
VII. 항체
자연 상태에서 발견되는 형태 및 재조합 형태의 다양한 IL-170 단백질 (종 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함) 또는 이의 단편에 대한 항체를 생성시킬 수 있다. 또한, 활성 형태 또는 비활성 형태의 IL-170 단백질에 대한 항체를 생성시킬 수 있다. 또한, 항-이디오타입 항체도 포함된다.
면역원 단백질과 상기 항원의 미리 예정된(predetermined) 단편의 컨쥬게이트를 동물에 면역 접종시킴으로써, 상기 항원의 미리 예정된(predetermined) 단편에 대한 항체 (결합 단편 및 단일 쇄 형태를 포함)를 생성시킬 수 있다. 목적하는 항체를 방출하는 세포로부터 모노클로날 항체가 제조된다. 이러한 항체에 대해, 정상적인 또는 결함있는 IL-170 단백질에 대한 결합 여부 또는 길항 활성이나 효능 활성 여부 (예를 들면, 결합 상대를 통해 중재되는 활성)에 따라 스크리닝할 수 있다. 상기 모노클로날 항체의 결합 KD는, 대개(usually) 적어도 약 1mM, 보다 대개 적어도 약 300μM, 통상적으로(typically) 적어도 약 10μM, 보다 통상적으로 적어도 약 30μM, 바람직하게는(preferably) 적어도 약 10μM, 보다 바람직하게는 적어도 약 3μM 이상이다.
지정된 면역원 (예를 들면, 서열번호 8의 성숙한 아미노산 서열 또는 이의단편이거나 서열번호 7의 핵산으로부터 생성되는 폴리펩티드로 이루어진 면역원)에 대해 생성된 항체 (예를 들면, 폴리클로날 항체)와 특이적으로 결합하거나 특이적으로 면역 반응하는 IL-170 폴리펩티드는, 통상적으로 면역 검정 (immunoassay)으로 결정된다. 앞에서 정의한 구조 및 기능을 갖는 IL-173, IL-174, IL-176 또는 IL-177 원형 폴리펩티드에 대해 생성된 폴리클로날 항체에 선택적으로 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 상기한 핵산 서열 (기능상 변이체를 포함)은 본 발명의 범위내에 포함된다. 통상적으로, 상기한 면역 검정은, 예를 들면 서열번호 8의 단백질에 대해 생성된 폴리클로날 항혈청을 사용한다. 이러한 항혈청을 사용하여, 기타의 적합한 IL-170 군 구성원 (바람직하게는, 동일한 종에서 유래)에 대해 낮은 교차 반응성 (crossreactivity)을 갖는 것을 선택하고, 이렇게 선택된 교차 반응성을 갖는 것은 면역 검정에 사용하기 이전에 면역 흡수 (immunoabsorption)시켜 제거한다. 적합한 선별 혈청 제제를 분리 및 특성화한다.
면역 검정에서 사용하기 위한 항혈청을 제조하기 위해, 상기 단백질 (예를 들면, 서열번호 8의 단백질)을 본원에서 기재한 바와 같이 분리한다. 예를 들면, 포유류 세포 라인에서 재조합 단백질을 생성할 수 있다. 표준 보조제 (예를 들면, Freund의 보조제) 및 마우스 표준 면역 프로토콜 (참조: Harlow 및 Lane)을 사용하여, 서열번호 8의 단백질로 적합한 숙주 (예를 들면, Balb/c와 같은 마우스 근친교배주)를 면역반응시킨다. 이와 달리, 상기한 서열로부터 유래되는 실질적으로 전장 길이의 합성 펩티드를 면역원으로서 사용할 수 있다. 폴리클로날 혈청을 수집한 후, 면역 검정 (예를 들면, 고체 지지체 상에 상기 면역원을 고정시킨 고체상면역 검정)에서 상기 면역원 단백질에 대한 역가를 구한다. 역가(titer)가 104이상인 폴리클로날 항혈청을 선택한 후, Harlow 및 Lane (상기 참조, pp.570-573)이 기술한 것과 같은 결합 경쟁 면역 검정 (competitive binding immunoassay)을 이용하여, 기타의 IL-170 군 구성원 (예를 들면, IL-171, IL-172 또는 IL-175)에 대한 교차 반응성을 테스트한다. 바람직하게는, 적어도 2가지의 IL-170 군 구성원이 표적 물질과 함께 상기 측정에 사용된다. 이러한 IL-170 단백질 군 구성원은, 재조합 단백질의 형태로 생성되어, 본원에 기재된 분자 생물학 및 단백질 화학 표준 기법을 사용하여 분리할 수 있다. 따라서, IL-170 군 구성원의 서브세트에 대해 목적하는 선택성 또는 특이성을 가지는 항체 제제를 동정 또는 제조할 수 있다.
상기한 결합 경쟁 포맷의 면역 검정은 교차반응성 측정에 사용될 수 있다. 예를 들면, 서열번호 8의 성숙 단백질을 고형 지지체에 부착시킬 수 있다. 상기 검정에 첨가시킨 단백질은 상기 항혈청과 부착되어 있는 항원과 결합 경쟁을 한다. 부착된 단백질과의 결합을 위해 상기 혈청과 경쟁할 수 있는 상기 단백질의 능력을 서열번호 8의 단백질과 비교한다. 상기 단백질의 교차반응성 (%)을 표준 계산방법으로 계산한다. 상기 나열한 각각의 단백질과의 교차 반응성이 10% 미만인 항혈청을 선택한 후 수집한다. 그리고 나서, 상기 나열된 단백질을 면역 흡수 (immunoabsorption)시켜 수집된 항혈청으로부터 교차반응-항체를 제거한다.
그리고 나서, 면역 흡수 및 수집된 항혈청을 상기한 결합 경쟁 면역 검정에 사용하여, 면역원 단백질과 제2 단백질을 비교한다. 이러한 비교를 위해, 상기한2가지의 단백질을 각각 광범위한 농도에서 검정을 하고, 상기 항혈청의 부착된 단백질에 대한 결합을 50% 억제하는 데 필요한 각 단백질의 양을 측정한다. 제2 단백질의 필요한 양이 상기 단백질 (예를 들면, 서열번호 8의 단백질)의 필요량의 2배 미만인 경우, 제2 단백질은 상기 면역원에 대해 생성된 항체에 특이적으로 결합하는 것으로 간주한다.
본 발명의 항체 (항원-결합 단편을 포함)는 진단용 또는 치료용으로서 가치가 클 수 있다. 이러한 항체는, 결합 대상과 결합하여 항원 결합을 억제하거나 항원이 생물학적 반응을 나타내는 능력을 억제하는 길항제로서 작용할 수 있다. 또한, 이러한 항체는, 비-중성화 항체로서 유용할 수 있으며, 톡신 (toxin) 또는 방사핵종 (radionuclide)과 커플링하여 항원과 결합하는 경우 이를 발현하는 세포 (예를 들면, 세포표면에서 발현하는 세포)를 살해한다. 또한, 이러한 항체는, 직접 또는 링커 (linker)를 통해 간접적인 방법으로 약제 또는 기타의 치료 제제와 컨쥬게이션될 수 있으며, 약제 타게팅을 수행할 수도 있다.
또한, 본 발명의 항체는 진단용으로도 유용할 수 있다. 이러한 항체는, 포획 또는 비-중성화 항체로서 결합 대상에 의한 결합을 억제함이 없이 항원에 결합하는 능력을 가진 항체를 스크리닝할 수 있다. 중성화 항체 (neutralizing antibody)로서의 본 발명의 항체는, 결합 경쟁 검정에 유용할 수 있다. 이러한 항체는 IL-170 단백질 또는 이의 결합 대상을 검출하거나 정량화하는 데에 유용할 수 있다 {참조: 예를 들면, Chan (ed. 1987)Immunoassay: A Practical GuideAcademic Press, Orlando, Fla; Ngo (ed. 1988)Nonisotopic ImmunoassayPlenumPress, NY; Price 및 Newman (ed. 1991)Principles and Practice of ImmunoassayStockton Press, NY}.
항원 단편은 기타의 물질, 특히 면역원으로 사용되는 융합된 또는 공유 결합된 폴리펩티드로서의 폴리펩티드와 결합될 수 있다. 항원 및 이의 단편은, 다양한 면역원 (예를 들면, 키홀 림펫 헤모시아닌, 소 혈청 알부민, 테타누스 독소 등)에 융합되거나 공유 결합될 수 있다 {참조: 폴리클로날 항혈청의 제조 방법에 대한 기재 부분을 참조 -Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962)Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, New York; Williams 등 (1967)Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol.1, Academic Press, New York}. 통상적인 방법에는, 소정의 동물을 항원으로 과면역 (hyperimmunization)시키는 것을 포함한다. 그리고 나서, 상기 반복된 면역 직후에 상기 동물의 혈액을 채취한 후, 감마 글로불린을 분리한다.
소정의 경우에는, 다양한 포유류 숙주 (예를 들면, 마우스, 설치류, 영장류, 인간 등)로부터 모노클로날 항체를 제조하는 것이 바람직하다. 이러한 모노클로날 항체를 제조하는 방법은, 모노클로날 항체의 제조 방법을 논의하고 있는 하기 참조 문헌에서 찾을 수 있을 것이다 {참조: 예를 들면, Stites 등, (eds.)Basic and Clinical Immunology(4th ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA; Harlow 및 Lane (1988)Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986)Monoclonal Antibodies: Principles and Practice(2d ed.) Academic Press, New York; Kohler 및 Milstein (1975),Nature256: 495-497}. 상기 방법을 요약하면, 소정의 면역원을 소정의 동물에게 주사한다. 그리고 나서, 이 동물을 죽인 후 비장 세포 수집하고 나서, 골수종 세포 (myeloma cell)와 융합시킨다. 이 결과, 시험관내에서 복제가능한 하이브리드 세포 (즉, 하이브리도마)가 생성된다. 하이브리도마 집단을 스크리닝하여, 상기 면역원에 대해 단일 항체 종을 방출하는 개개의 클론을 분리한다. 이러한 방법으로 수득한 각각의 항체 종은, 면역원 물질 상의 특정 부위를 인식 및 반응하여 생성된 면역 동물의 단일 클론성 및 불멸의 B 세포 생성물이다.
기타의 다른 적합한 기법들은, 림프구를 시험관내에서 상기 항원성 폴리펩티드 내지 파지 또는 이와 유사한 벡터내의 항체 라이브러리 선별체에 노출시키는 것을 포함한다 {참조: Huse 등 (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda,"Science246:1275-1281; Ward 등 (1989)Nature341:544-546}. 본 발명의 폴리펩티드 및 항체는 변형 또는 변형없이 (키메라 항체 또는 인간화된 항체를 포함) 사용할 수 있다. 종종, 검출가능한 신호를 제공하는 물질과 공유적 또는 비공유적으로 결합시켜 상기한 폴리펩티드 및 항체를 표지시킨다. 다양한 표지 및 컨쥬게이션 기법들이 과학 및 특허 문헌을 통해 광범위하게 공지 및 보고되고 있다. 적합한 표지로는, 방사핵종, 효소, 기질, 보조 인자, 억제제, 형광 잔기, 화학발광 잔기, 자기 입자 등이 포함된다. 이러한 표지를 이용하는 것에 대해 기재하고 있는 특허로는, 미합중국 특허 제3,817,837호, 3,850,752호, 3,939,350호, 3,996,345호, 제4,277,437호, 제4,275,149호 및 제4,366,241호가 포함된다. 또한, 재조합 면역 글로불린도 제조될 수 있다 {참조: Cabilly, 미합중국 특허 제4,816,567호}.
또한, 본 발명의 항체는 상기 단백질을 분리하기 위한 친화성 크로마토그래피에 사용될 수 있다. 이 칼럼에서는, 항체가 고형 지지체 (예를 들면, 수크로즈, 세파덱스 등의 입자)에 결합되고, 소정의 세포 용해물을 통과시킨 후에 세척하고 나서 경미한 분해제 (denaturant)의 농도를 증가시킴으로써, 정제된 IL-170 단백질이 방출된다.
또한, 상기한 항체는 발현 라이브러리를 스크리닝하여 특정 발현 생성물을 수집하는 데에 사용할 수 있다. 대개, 이러한 공정에 사용되는 항체는, 항체 결합에 의해 항원 존재 여부를 용이하게 감지할 수 있게 해주는 잔기로 표지시킨다.
각 IL-170 단백질에 대해 생성된 항체는 항-이디오타입 항체를 생성하는 데에 유용할 수 있다. 이러한 항체는, 각 항원의 발현과 관련된 다양한 면역학적 상태를 검출 또는 진단하는 데에 유용할 것이다.
VIII. 용도
본 발명에서는, 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 생리학적 또는 발생학적 비정상 상태에 대한 진단용으로 사용되는 시약 (reagent) 또는 진단용 킷트를 제공한다.
또한, 본 발명에서는, 치료학적으로 가치가 큰 시약을 제공한다. 상기한 (자연 발생 또는 재조합) IL-170 단백질, 이의 단편, 이의 항체 및 상기한 (자연 발생 또는 재조합) IL-170 단백질에 대해 결합 친화성을 갖는 것으로 확인된 화합물은, 비정상적인 생리 또는 발생과 관련한 상태 (암과 같은 비정상적인 증식 또는퇴행성 상태를 포함)의 치료에 유용할 것이다. 비정상적인 증식, 재생, 퇴행 및 위축은, 본원에서 제공하는 조성물을 사용하는 적합한 치료 방법에 의해 조절될 수 있다. 예를 들면, IL-170 항원에 의한 비정상적인 발현 또는 시그널링과 관련된 질환은, 상기 단백질의 길항제 또는 효능제의 표적이 될 가능성이 높다.
노던 블랏 분석에 의해 IL-170 항원의 mRNA를 보유하는 것으로 나타난 세포 유형에서 기타의 다른 비정상적인 발생 상태가 있는 것으로 알려져 있다 {참조: Berkow (ed.)The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N.J.; Thorn 등,Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, N.Y.}.
IL-170에 결합하는 재조합 항체를 정제하여 환자에게 투여할 수 있다. 이러한 시약은, 추가의 활성 또는 비활성 제제 (예를 들면, 면역원성 보조제와 같은 통상적으로 사용하는 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제, 및 생리학적 접종 안정화제 및 부형제)와 결합하여 치료용으로 사용할 수 있다. 이러한 배합물은, 멸균 여과시킨 후, 안정화된 수성 제제내에 저장하거나 투여 바이알내에 동결건조시켜 투여형에 넣을 수 있다. 또한, 본 발명에서는, 보체-결합 (complement-binding)하지 않은 형태를 포함한 항체 또는 이의 결합 단편의 용도를 포함한다.
관련된 성분을 분리하는 것을 포함하여, IL-170을 사용하여 결합 대상 또는 결합 친화성을 갖는 화합물을 스크리닝할 수 있다. 그리고 나서, 생물학적 검정을 수행하여, 이러한 화합물에 내재한 생물 활성을 가지는 지 여부를 확인할 수 있으며, 상기 항원의 활성을 억제한다는 점에 있어서 길항제 또는 효능제일 수 있다.또한, 본 발명에서는, IL-170 단백질에 대한 항체를 길항제로서 사용하는 치료 용도를 포함한다. 특히, 이러한 접근 방법은, 기타의 IL-170 단백질의 종 변이체에서도 유용하다.
효과적인 치료에 필요한 시약의 양은, 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리 상태 및 기타의 투여 약물 등의 여러 인자에 따라 달라질 것이다. 따라서, 치료양은 안전성 및 효능을 최적화하도록 적정하여야 한다. 통상적으로, 시험관 내에서의 투여량은, 원위치 투여 (in situ administration)에 유용한 양을 결정하는 데에 유용한 기준이 될 수 있다. 특정 질환에 대한 효과적인 치료양을 결정하기 위한 동물 테스트를 통해, 인간에 대한 투여량을 예측한다. 여러 가지의 고려 사항에 대해 하기 문헌에 기재되어 있다 {참조: Gilman 등 (eds.1990)Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press;Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.}. 투여 방법, 예를 들면, 경구 투여, 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 경피 확산투여 등에 대해서는 본원 및 하기 문헌에 기재되어 있다 {참조: Langer (1990)Science249:1527-1533}. 약제학적으로 허용가능한 담체에는 물, 염수, 버퍼 및 문헌{참조: 예를 들면,Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey}에 기재된 기타의 화합물이 포함된다. 투여량은, 적합한 담체와 함께, 일반적으로 (ordinarily) 1mM 미만, 통상적으로 (typically) 약 10μM 미만, 대개 (usually) 약 100nM 미만, 바람직하게는 (preferably) 약 10pM 미만, 가장 바람직하게는 약 1fM 미만이다. 종종, 서방형 제제 또는 서방형 장치를 사용하여 계속적으로 투여한다.
IL-170 단백질, 이의 단편, 이의 항체 또는 이의 단편, 효능제 및 길항제를 치료할 숙주에 투여할 수 있으며, 또는 상기한 화합물의 크기에 따라 담체 단백질 (예를 들면, 난알부민 또는 혈청 알부민)과 컨쥬게이션시켜 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 치료 제형을 통상적으로 사용하는 투여 제형으로 투여할 수 있다. 활성 성분만을 투여할 수 있지만, 약제학적 제형 형태로 투여하는 것이 바람직하다. 통상적으로, 제형은 상기한 하나 이상의 활성 성분 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함한다. 각 담체는, 다른 성분과 병용가능해야 하며 환자에게 피해를 주지 않아야 한다는 점에 있어서 약제학적 및 생리학적으로 허용가능해야 한다. 제형에는, 경구 투여, 직장 투여, 비강 투여 또는 비경구 투여 (경피 투여, 근육내 투여, 정맥내 투여 및 진피 투여를 포함)에 적합한 제형이 포함된다. 이러한 제형은 단위 투여 형태로 용이하게 제조될 수 있으며, 약제학 분야에서 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 제조될 수 있다 {참조: 예를 들면, Gilman 등 (eds.1990)Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed.,Pergamon Press, Parrytown, NY;Remington's Pharmacuetical Sciences, 17th ed. (1990) Mack Publishing Co., Easton, Penn.; Avis 등, (eds. 1993)Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications2nd ed., Dekker, NY; Lieberman 등 (eds. 1990)Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets2nd ed., Dekker, NY; Lieberman 등 (eds. 1990)Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse SystemsDekker, NY}. 본 발명의 치료 방법은, 기타의 치료 시약 (사이토카인을 포함)과 배합하거나 관련시켜사용할 수 있다.
특히, 본 발명의 자연 발생 및 재조합 IL-170 단백질은, 이 단백질에 결합 활성을 갖는 화합물을 스크리닝할 수 있는 킷트 및 분석 방법에 유용하다. 최근에 몇몇 자동 분석 방법이 개발되어 단기간에 수만 가지의 화합물을 스크리닝할 수 있다. 예를 들면, Fodor 등 {참조: 1991,Science251:767-773}의 문헌에서는, 고형 기질상에 합성된 다수의 정의된 폴리머에 의해 결합 친화성을 테스트하는 수단을 기재하고 있다. 다량의 정제된 가용성 IL-170 단백질이 본 발명에 의해 제공됨으로 인해, 적합한 분석 방법의 개발이 크게 촉진될 수 있다.
특히, 본 발명은 다양한 약제 스크리닝 기법에서 재조합 항원을 사용하여 화합물을 스크리닝하는 데에 유용하다. 특정 리간드를 스크리닝하기 위해 소정의 재조합 단백질을 사용하는 장점은, (a) 특정 공급원으로부터의 상기 항원의 재생 공급원이 향상되고, (b) 세포당 매우 큰 항원 분자수로 인해, 분석시 신호-노이즈 비율 (signal to noise ratio)이 양호하며, (c) 종 변이체 특이성 (이론상으로는, 더 큰 생물학적 및 질환 특이성을 보임)이 포함된다. 이렇게 정제된 단백질은 생물학적으로 관련성이 있는 반응을 평가하는 다수의 분석 (통상적으로, 시험관내 분석)에서 테스트될 수 있다 {참조: 예를 들면, ColiganCurrent Protocols in Immunology; Hood 등,ImmunologyBenjamin/Cummings; Paul (ed.)Fundamental Immunology; Methods in EnzymologyAcademic Press}.
약제 스크리닝 방법 중 하나에서는, 상기한 IL-170 항원을 발현하는 재조합 DNA 분자로 안정하게 형질전환시킨 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 사용한다. 기능적으로 균등한 기타 항원으로부터 분리함에 있어서, 소정의 항원을 발현하는 세포를 분리할 수 있다. 생존가능형 또는 고정형의 이러한 세포를 단백질-단백질 표준 결합 분석에 사용할 수 있다 {참조: 세포 반응을 검출하기 위한 민감한 방법에 관한 기재- Parce 등 (1989)Science246:243-247; Owicki 등 (1990)Proc.Nat'l Acad.Sci. USA87:4007-4011}. 특히, 상기 세포 (IL-170 단백질의 공급원)를 표지된 결합 대상 또는 상기 리간드에 결합 친화성을 가지는 것으로 알려져 있는 항체와 접촉 및인큐베이션시키고, 소정의 테스트 표본의 상기 결합 조성물에 대한 결합 친화성을 측정하는, 경쟁 분석 (competitive assay)이 유용하다. 부착된 및 부착되지 않고 자유로운 표지-결합 조성물을 분리하여 항원 결합도를 분석한다. 부착된 테스트 화합물의 양은, 상기 알고 있는 공급원에 표지된 수용체가 결합된 양과 반비례한다. 수많은 기법 중 하나를 사용하여 부착된 항원과 자유 항원을 분리하여 결합도를 평가한다. 통상적으로, 이러한 분리 단계는 필터에 부착시킨 후 세척하고나서 플라스틱에 부착시킨 후에 세척하거나 세포막의 원심분리와 같은 공정을 포함한다. 또한, 생존가능한 세포를 사용하여 IL-170 단백질-매개된 기능 (예를 들면, 2차 메신저 Ca++수준, 세포 증식, 이노시톨 포스페이트 풀 변화 등)에 대한 약제의 효과를 스크리닝할 수 있다. 인접 민감성 검출 시스템 (proximity sensitive detection system)과 같은 몇몇 검출 방법을 통해, 분리 단계를 제거할 수 있다. 형광 미터기 또는 형광 세포 분리 장치를 이용하여 Ca++수준을 검출하는 데에 칼슘 민감성 염료가 유용할 것이다.
다른 방법에서는 형질전환된 진핵 또는 원핵 숙주 세포막을 IL-170 단백질의 공급원으로 이용한다. 이러한 세포들은, 막-관련 IL-170 단백질 (예를 들면, 조작된 막 부착형)의 발현을 유도하는 DNA 벡터로 안정하게 형질전환된다. 기본적으로, 이러한 막은 상기 세포로부터 제조되고 수용체/리간드 형태 결합 분석 (예를 들면, 상기한 경쟁 분석 검정)에서 사용된다.
또 다른 방법에서는, 형질전환된 진핵 또는 원핵 숙주 세포로부터의 용해되고 정제되지 않은 또는 정제된 IL-170 단백질을 이용한다. 이 방법을 통해, 증가된 특이성, 자동화 능력 및 다량 약제 테스트(high drug test throughput)라는 장점을 가진 "분자 결합 검정"이 가능하다.
약제 스크리닝에 사용되는 다른 기법에서는, IL-170에 대한 적합한 결합 친화성을 가지는 화합물을 다량 스크리닝할 수 있으며 유럽특허출원 제84/03564호 (공개일: 1984년 9월 13일)에 상세히 기재되어 있는 방법을 포함한다. 우선, 다수의 상이한 작은 펩티드 테스트 화합물을 고형 기질 (예를 들면, 플라스틱 핀 또는 기타의 적합한 표면: 참조 - Fodor 등, 1991)상에서 합성한다. 그리고 나서, 모든 핀을 용해되고 정제되지 않은 또는 정제된 IL-170 결합 조성물과 반응시킨 후, 세척한다. 후속 단계에서는 부착된 결합 조성물을 검출하는 것을 포함한다.
또한, IL-170 단백질 및 기타의 주효인자 (effector) 또는 유사체의 분자 형태에 대한 구조 연구에 기초하여 합리적으로 설계할 수 있다. 주효인자는 항원 결합에 반응하여 기타의 기능을 매개하는 다른 화합물이거나, 상기 항원과 정상적으로 상호작용하는 다른 단백질일 수 있다. 소정의 다른 단백질과 상호작용하는 부위를 결정하는 한 방법은 물리적인 구조를 결정 (예를 들면, X선 결정법 또는 2차구조 NMR 기법)하는 것이다. 이는, 어느 아미노산 잔기가 접촉 부위 분자를 형성하는 지에 대한 지침이 될 것이다. 단백질 구조 결정에 대한 상세한 내용은 하기 문헌을 참조하라 {참조: 예를 들면, Blundell 및 Johnson (1976)Protein Crystallography, Academic Press, New York}.
정제된 IL-170 단백질을 플레이트상에 직접 코팅시켜 상기한 약제 스크리닝 기법에 사용할 수 있다. 하지만, 상기 리간드에 대한 비-중성화 항체는 포획 항체 (capture antibody)로 사용되어 고형상에 리간드를 부착시킬 수 있다.
IX. 킷트
또한, 본 발명에서는, IL-170 단백질, 이의 단편, 펩티드 및 융합 생성물을 다양한 진단 킷트에 사용하는 용도 및 결합 조성물의 존재여부를 검출하는 방법을 제공한다. 통상적으로, 본 발명의 킷트는, 예를 들면 항원 단편 또는 항체를 인식하는 시약이나 정의된 IL-170 펩티드 또는 유전자 분절을 함유하는 구획을 가진다.
통상적으로, 소정의 테스트 화합물의 IL-170 단백질에 대한 결합 친화도를 측정하는 데 사용하는 킷트는, 테스트 화합물; 표지된 화합물 (예를 들면, 상기 항원에 대한 공지된 결합 친화도를 가진 항체); IL-170 단백질 (천연 또는 재조합) 의 공급원; 및 자유 표지-화합물과 부착된 표지-화합물을 분리하는 수단 (예를 들면, 상기 항원을 부동화시키는 고체상)을 포함한다. 화합물을 스크리닝하여, 상기 항원에 대한 적합한 결합 친화도를 가지고 있는 화합물을 당해분야에 잘 알려져 있는 적합한 생물 검정에서 평가하여 상기한 자연 상태의 항원에 대한 유사한 생물활성을 보이는 지 여부를 확인할 수 있다. 또한, 재조합 IL-170 단백질 폴리펩티드가 사용가능함으로써, 상기 검정을 측정하는 데 사용되는 잘 정의된 표준을 정할 수 있다.
예를 들면, 표본내의 IL-170 단백질의 농도를 측정하는 바람직한 킷트는, 통상적으로, 상기 항원에 대한 공지된 결합 친화도를 가지는 표지된 화합물 (예를 들면, 항체); 항원 (천연 또는 재조합) 공급원; 및 자유 표지-화합물과 부착된 표지-화합물을 분리하는 수단 (예를 들면, IL-170 단백질을 부동화시키는 고체상)을 포함한다. 대개, 시약을 함유하는 구획 및 지시사항이 제공된다.
통상적으로, 표본내의 IL-170 단백질의 농도를 측정하는 한 방법에서는, 하기의 단계들을 포함한다:
(1) 막-부착된 IL-170 단백질 공급원을 포함하는 표본으로부터 막을 제조하는 단계;
(2) 상기 막을 세척한 후, 버퍼 내에 현탁시키는 단계;
(3) 적합한 세척제가 첨가된 배양 매체내에서 상기 막을 인큐베이션시켜, 상기 항원을 가용화시키는 단계;
(4) 상기 가용화된 항원의 세척제 농도를 조정하는 단계;
(5) 상기 희석물을 방사선-표지된 항체와 접촉 및 배양시켜 착체를 형성시키는 단계;
(6) 상기 착체를 회수하는 단계 (예를 들면, 폴리에틸렌이민-처리된 필터를 통해 여과); 및
(7) 회수된 착체의 방사선 활성도를 측정하는 단계.
IL-170 단백질 또는 이의 단편에 대해 특이적인 항체 (항원 결합 단편을 포함)는, IL-170 단백질 및/또는 이의 단편의 수준이 상승되었는 지를 검출하는 진단용으로 유용하다. 이러한 진단 분석에서는, 용해물, 살아있는 세포, 고정된 세포, 면역 형광물, 세포 배양물, 체액을 포함할 수 있으며, 혈청내의 상기 단백질과 관련된 항원 등을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 진단 분석은, 동종 분석 (자유 시약과 단백질-단백질 착체간의 분리 단계가 결여) 또는 이종 분석 (분리 단계를 포함)일 수 있다. 방사선면역검정 (RIA), 효소-연관 면역흡착 검정 (ELISA), 효소 면역검정 (EIA), 효소-다중 면역검정 기법 (EMIT), 기질-표지된 형광 면역검정 (SLFIA) 등의 여러 가지 분석방법이 사용 가능하다. 예를 들면, IL-170 단백질 또는 이의 특정 단편에 대한 항체를 인식하는 표지된 제2 항체를 이용함으로써, 표지되지 않은 항체를 사용할 수 있다. 또한, 이와 유사한 분석방법이 문헌에 광범위하게 기재되어 있다 {참조: 예를 들면, Harlow 및 Lane (1988)Antibodies: A Laboratory Manual, CSH}.
유사하게, 항-이디오타입 항체는, IL-170 단백질에 대한 항체의 존재여부를 진단하는 데에 사용될 수 있는 용도를 가질 수 있으며, 여러 다양한 비정상적인 상태의 존재여부를 진단하는 데에도 사용될 수 있다. 예를 들면, IL-170 단백질의 과생산이 존재하는 경우, 비정상적인 생리 상태 (특히, 암 또는 비정상적인 분화와 같은 세포 증식 상태)를 진단할 수 있는 다양한 면역 반응이 발생한다.
종종, 진단 분석용 시약이, 진단 분석의 민감도를 최적화시키기 위해 킷트내에 공급된다. 본 발명의 목적을 위해, 분석의 성질에 따라, 프로토콜 및 표지된 또는 표지되지 않은 항체, 또는 표지된 IL-170 단백질이 제공된다. 대개, 이는 버퍼, 안정화제, 신호 생성에 필요한 물질 (예를 들면, 효소용 기질) 등과 같은 기타의 첨가제와 함께 한다. 바람직하게는, 상기 킷트는 적합한 사용 및 사용후 내용물의 폐기를 위한 지시사항을 포함하고 있다. 통상적으로, 상기 킷트는 사용되는 시약 각각에 대한 구획을 가지고 있다. 바람직하게는, 상기 시약은 동결 건조된 분말형태로 제공되며, 상기 분석을 시행하는 데에 사용되는 시약의 적합한 농도를 제공해주는 수성 매체내에 재구성될 수 있다.
상기한 약제 스크리닝 및 진단 분석에 있어서의 구성요소 중 어느 것이라도 변형없이 사용할 수 있으며, 여러 방법으로 변형될 수도 있다. 예를 들면, 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 제공하는 잔기를 공유 또는 비공유적으로 결합시킴으로써 표지시킬 수 있다. 이러한 분석방법에서는, 항원, 테스트 화합물, IL-170 단백질 또는 이의 항체를 직접적 또는 간접적으로 표지시킬 수 있다. 직접적으로 표지시키는 방법에서는,125I 과 같은 방사선 표지, 퍼옥시데이즈 및 알칼린 포스파타제와 같은 효소 (미합중국 특허 제3,645,090호), 및 형광 강도, 파장 이동 또는 형광 극성의 변화를 모니터링할 수 있는 형광 표지 (미합중국 특허 제3,940,475호)와 같은 표지 그룹을 포함한다. 간접적으로 표지시키는 방법에서는, 하나의 구성요소를 비오틴화시킨 후 상기한 표지 그룹 중 하나에 커플링된 아비딘에 결합시키는 것을 포함한다.
또한, 부착된 항원과 자유 항원 또는 부착된 테스트 화합물과 자유 테스트 화합물을 분리하는 수많은 방법이 있다. IL-170 단백질을 다양한 매트릭스상에 부착시킨 후 세척할 수 있다. 적합한 매트릭스로는, ELISA 플래이트와 같은 플라스틱, 필터 및 비드가 포함된다. IL-170 단백질을 매트릭스에 고착시키는 방법에는, 플라스틱에 직접 부착시키는 방법, 포획 단백질을 이용하는 방법, 화학적인 커플링을 이용하는 방법 및 비오틴-아비딘을 사용하는 방법이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다. 이 방법에 있어서 최종 단계에서는, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜과 같은 유기 용매 또는 암모늄 설페이트와 같은 염을 사용하는 방법을 이용하여 단백질-단백질 착체를 침전시키는 것을 포함된다. 기타의 다른 분리 기법으로는, Rattle 등의 문헌 {참조: 1984,Clin.Chem.30:1457-1461}에 기재된 플루오레세인 항체-자기화가능한 입자 방법 및 미합중국 특허 제4,659,678호에 기재된 이중 항체 자기 입자 분리방법이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.
단백질 또는 이의 단편을 다양한 표지에 결합시키는 방법에 대해서는 문헌을 통해 광범위하게 보고되어 왔으므로, 본원에서는 이에 대한 상세한 설명은 필요하지 않다. 많은 기법들에서는, 펩티드 결합을 형성시키기 위해 카보디이미드 또는 활성 에스테르를 사용하여 활성화된 카복실 그룹의 사용을 포함한다. 이때, 결합등을 위해 클로로아세틸과 같은 활성화된 할로겐 또는 말레이미드와 같은 활성화된 올레핀과 머캅토 그룹을 반응시켜 티오에테르를 형성한다. 또한, 융합 단백질도 상기 용도에 사용될 수 있을 것이다.
진단에 사용되는 본 발명의 다른 양태에서는, IL-170 단백질 서열로부터 유래한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 이용하는 것을 포함한다. 이러한 서열은, 비정상적인 상태 (예를 들면, 암 또는 발생상의 문제점)를 가지고 있는 것으로 의심되는 환자에서 추출한 표본내의 항원 메시지 수준을 검출하는 프로브로서 사용될 수 있다. RNA 및 DNA 뉴클레오티드 서열의 제조, 이러한 서열의 표지화 및 이러한 서열의 바람직한 크기에 대해서는 문헌에 충분히 기재되어 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브의 크기는, 정상적으로는 (normally) 적어도 약 14개의 뉴클레오티드, 대개 (usually) 적어도 약 18개의 뉴클레오티드이다. 폴리뉴클레오티드 프로브의 크기는 수 kb에 이를 수 있다. 여러 다양한 표지가 사용될 수 있으나, 가장 통상적으로 사용되는 것은 방사선 뉴클레오티드이며, 특히32P이다. 그러나, 비오틴-변형된 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드에 도입하는 것과 같은 기타의 다른 기법도 사용할 수 있다. 그리고 나서, 상기 비오틴은, 여러 다양한 표지 (예를 들면, 방사선 뉴클레오티드, 형광물질, 효소 등)로 표지될 수 있는 아비딘 또는 항체에 결합하는 부위로서 작용한다. 이와 달리, DNA 듀플렉스, RNA 듀플렉스, DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스 또는 DNA-단백질 듀플렉스를 포함한 특정의 듀플렉스를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 이러한 항체를 표지화시키고, 상기 듀플렉스가 소정의 표면에 부착된 후, 듀플렉스가 표면에 형성되면 듀플렉스에 부착된 항체의 존재여부를 검출할 수 있는 분석방법을 수행할 수 있다. 핵산 혼성화 방법, (+) 및 (-) 스크리닝 방법, 재조합 프로브 방법, 하이브리드 방출 번역방법 (HRT) 및 하이브리드 포획 번역방법 (HART)과 같은 통상의 방법에서, 신규한 안티센스 RNA에 대한 프로브를 사용할 수 있다. 또한, 폴리머라제 쇄 반응 (PCR)과 같은 증폭 방법도 포함된다. 또 다른 방법에서는, 예를 들면, Misquitta 등의 문헌 {참조: 1999,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA96:1451-1456}에 기재된 이중쇄 RNA (dsRNA)를 첨가하여 유전자 기능을 유전적으로 간섭하는 안티센스 핵산 방법, 및/또는 소정의 IL-170 mRNA의 번역을 차단하는 리보자임을 사용한다. 유전자의 시험관내 번역을 억제하기 위해 안티센스를 사용하는 방법은 이미 당업계에서는 잘 알려져 있다 {참조: Marcus-Sakura (1988)Anal.Biochem.172:289; Akhtar (ed.1995)Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide TherapeuticsCRC Press, Inc.}.
또한, 본 발명에서는 기타의 마커의 존재에 대해 정성적 또는 정량적으로 테스트하는 진단 킷트를 제공한다. 진단 또는 예후 (prognosis)는, 마커로서 사용되는 여러 표지를 복합적으로 검토하여 이루어진다. 따라서, 킷트는 여러 마커를 복합하여 테스트한다 {참조: 예를 들면, Viallet 등 (1989)Progress in Growth Factor Res.1:89-97}.
본 발명의 범위는, 아래의 실시예를 통해 더 잘 이해될 것이며, 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
I. 일반적인 방법
몇몇 표준 방법들이 이미 기술되어 있거나 인용되고 있다 {참조: 예를 들면, Maniatis 등 (1982)Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harber Press; Sambrook 등 (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2nd ed.), vols.1-3, CSH Press, NY; Ausubel 등,Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; Ausubel 등 (1987 및 추후자료)Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York; Innis 등 (eds.1990)PCR Protocols: A Guide to Methods and ApplicationsAcademic Press, N.Y; Kohler 등 (1995)Quantitation of mRNA by Polymerase Chain ReactionSpring-Verlag, Berlin}. 단백질 정제 방법에는, 암모늄 설페이트 침전법, 칼럼 크로마토그래피법, 전기영동법, 원심분리법, 결정화법 등이 포함된다 {참조: 예를 들면, Ausubel 등 (1987 및 정기자료); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification" inMethods in Enzymology, vol.182, 및 본 시리즈의 다른 책; 예를 들면, Pharmacia (뉴저지 피스카타웨이 소재) 또는 Bio-Rad (캘리포니아 리치몬드 소재) 의 단백질 정제물 사용에 대한 제조사의 지침}. 재조합 기법을 함께 사용함으로써, 예를 들면, 단백질 분해효소-제거가능한 서열을 통해 융합될 수 있는 FLAG 서열 또는 이의 균등물에 적합한 분절을 융합시킬 수 있다 {참조: 예를 들면, Hochuli (1989)Chemische Industrie12:69-70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" in Setlow (ed.)Genetic Engineering, Principle and Methods12:87-98, Plenum Press, N.Y.; Crowe 등 (1992)QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification SystemQUIAGEN Inc., Chatsworth, CA}.
또한, 본원과 동일자로 출원된 IL-171 및 IL-175 사이토카인에 관한 유사한특허출원 (대리인 사건번호 DX0918P)이 본원에 참조문헌으로 포함된다.
표준 면역 기법들이 이미 기재되어 있다 {참조: 예를 들면, Hertzenberg 등 (eds.1996)Weir's Handbook of Experimental Immunologyvols.1-4, Blackwell Science; Coligan (1991)Current Protocols in ImmunologyWiley/Greene, NY;Methods in Enzymologyvols. 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162 및 163}. 사이토카인 분석법들이 이미 기재되어 있다 {참조: 예를 들면, Thomsom (ed.1998)The Cytokine Handbook(3d ed.) Academic Press, San Diego; Mire-Sluis 및 Thorpe (1998)CytokinesAcademic Press, San Diego; Metcalf 및 Nicola (1995)The Hematopoietic Colony Stimulation FactorsCambridge University Press; Aggarwal 및 Gutterman (1991)Human CytokinesBlackwell Pub.}.
혈관 생물활성에 관한 분석법은 당업계에 이미 잘 알려져 있다. 이러한 분석법에서는, 종양 또는 기타 조직에서의 안지오제네시스 및 안지오스타시스 활성 (예를 들면, 동맥 평활근 증식) {참조: 예를 들면, Koyoma 등 (1996)Cell87:1069-1078}, 모노사이트의 혈관내피에의 부착 {참조: McEvoy 등 (1997)J.Exp.Med.185:2069-2077} 등을 분석한다 {참조: Ross (1993)Nature362:801-809; Rekhter 및 Gordon (1995)Am.J.Pathol.147:668-677; Thyberg 등 (1990)Atherosclerosis10:966-990; Gumbiner (1996)Cell84:345-357}.
신경세포의 생물학적 활성에 대한 분석법에 대해서 이미 기술되어 있다 {참조: 예를 들면, Wouterlood (ed.1995)Neuroscience Protocolsmodules 10,Elsevier;Methods in NeurosciencesAcademic Press;NeuromethodsHumana Press, Totowa, NJ}. 발생 시스템에 관한 방법에 대해서 이미 기술되어 있다 {참조: 예를 들면, Meisami (ed.)Handbook of Human Growth and Developmental BiologyCRC Press; Chrispeels (ed.)Molecular Techniques and Approaches in Developmental BiologyInterscience}.
예를 들면, GCG (U.Wisconsin) 및 GenBank 공급원을 포함한 시판되고 있는 소프트웨어 프로그램을 사용하여 컴퓨터 서열 분석이 수행되고 있다. 또한, GenBank 등의 공공 서열 데이터베이스도 사용하였다.
IL-170에 사용가능한 기법들 중 많은 것들이, 본원에서 참조문헌으로 기재되어 있는, 예를 들면, USSN에 기재된 새로운 엔타이티에도 적용할 수 있을 것이다.
FACS 분석법에 대해 이미 기재되어 있다 {참조: Melamed 등 (1990)Flow Cytometry and SortingWiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988)Practical Flow CytometryLiss, New York, NY; Robinson 등 (1993)Handbook of Flow Cytometry MethodsWiley-Liss, New York, NY}.
II. IL-170 단백질을 코딩하는 DNA 클론의 분리
쥐의 CTLA-8의 분리에 대해서는 문헌에 기재되어 있다 {참조: Rouvier 등 (1993)J.Immunol.150:5445-5456}. 대응하는 종(species counterpart)의 IL-171, IL-172, IL-175 및 IL-173, IL-174, IL-176, IL-177을 분리하는 유사한 방법도 사용가능하다.
IL-170 메시지 공급원
고수준의 메시지 발현을 위한 적합한 프로브를 사용하여 다양한 세포 라인을 스크리닝한다. 적합한 IL-170 메시지의 발현 수준에 기초하여, 적합한 세포 라인을 선별한다.
IL-170 단백질을 코딩하는 클론의 분리
표준 PCR 기법을 사용하여, 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리 또는 mRNA로부터 IL-170 유전자 서열을 증폭한다. 소정의 인간 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 수득한 후, 적합한 cDNA 또는 합성 프로브를 사용하여 스크리닝한다. PCR 프라이머를 제조할 수 있다. 예를 들면, 제공된 상기 서열로부터 적합한 프라이머를 선별하고, 전장 길이의 클론을 분리한다. 다양한 길이 및 서열 차이가 있을 가능성이 있는 프라이머를 다양하게 조합하여 제조할 수 있다. 상기 전장 길이-클론을 스트린전트 이하의 혼성화 조건에서 혼성화 프로브로 사용하여, 기타의 상동 유전자를 스크리닝할 수 있다.
다른 방법에서는, 올리고뉴클레오티드를 사용하여 소정의 라이브러리를 스크리닝한다. PCR 기법과 함께, 적합한 오리엔테이션을 가진 합성 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여, 소정의 라이브러리로부터 정확한 클론을 선별한다.
III. IL-170 단백질의 생화학적 특성 규명
예를 들면, 카복시 말단에 FLAG 펩티드를 가지는 천연 또는 재조합 형태의 IL-170 단백질을 이형세포에서 발현시킨다 {참조: 예를 들면, Crowe 등 (1992)QIAexpress: The High Level Expression and Protein Purification SystemQIAGEN, Inc. Chatsworth, CA; Hopp 등 (1988)Bio/Technology6:1204-1210}. 상기 2가지형태를 발현 벡터 (예를 들면, pME18S 또는 pEE12)에 삽입한 후, 적합한 세포 (예를 들면, COS-7 또는 NSO 세포)에 형질감염시킨다. 전기천공된 세포를, 예를 들면 48시간 동안 10% 소태 혈청 (Fetal Calf Serum)을 함유한 RPMI 배지에서 배양시킨다. 그리고 나서, 이 세포를35S-Met 및35S-Cys와 함께 배양하여 세포 단백질을 표지시킨다. SDS-PAGE 상에서 환원 조건하에 상기 단백질을 비교함으로써, 전장길이의 클론으로 형질감염된 세포는 적합한 크기 (예를 들면, 약 15,000달톤)의 폴리펩티드를 방출하게 됨을 볼 수 있을 것이다. 엔도글리코시데이즈로 처리하면, N-글리코실화된 형태인 지를 확인할 수 있을 것이다.
IV. IL-170의 대규모 생산 및 정제
생물학적 분석을 위해, 예를 들면, 형질감염된 COS-7 세포를 1% 뉴트리도마 HU를 함유한 RPMI 배지(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)내에서 성장시킨 후 정제하여, 포유류의 IL-170을 대량으로 생산한다. 정제를 위해서는, 분리 특성을 결정하기 위해 항체를 이용하는 친화성 크로마토그래피 또는, 예를 들면, 항체를 이용하는 단백질 정제 기법을 사용할 수 있다.
천연 단백질을 대량으로 생산하기 위해, Celltech (Slough, Berkshire, UK; 국제특허출원 WO86/05807, WO87/04462, WO89/01036 및 WO89/10404)에서 개발한 방법을 사용하여 NSO 세포의 안정된 형질전환체를 제조할 수 있다.
통상적으로, 인간의 IL-173 또는 IL-173-FLAG를 함유하는 상층액 1L를, 예를 들면, 킬레이팅 세파로즈 패스트 플로우 매트릭스 (Pharmacia, Upsalla, Sweden)에부착시킨 Zn++이온 칼럼 60ml 상을 지나게 한다. 결합 버퍼 (His-Bind Buffer kit, Novagen, Madison, WI) 10 volume으로 세척한 후, 상기 금속 이온에 의해 유지된 상기 단백질을 농도구배 20 내지 100mM 이미다졸로 용출시킨다. 이렇게 용출된 분획내의 인간 IL-173-FLAG의 함량은 항-FLAG 모노클로날 항체 M2 (Eastman Kodak, New Haven, CT)을 사용한 도트 블랏 (dot blot)으로 측정하는 반면; 인간 IL-173의 함량은, 예를 들면, 비-환원성 SDS-PAGE 실버 스테이닝으로 분석한다. 그리고 나서, 분획을 함유하는 상기 IL-170을 수집한 후, PBS에 대해 투석하여 생물학적 분석에 사용하거나, 예를 들면 DEAE 칼럼 상에서 음이온 교환 HPLC로 추가 정제한다. 겔 여과 크로마토그래피의 제3 단계가 SUPERDEX G-75 HRD30 칼럼 (Pharmacia Uppsala, Sweden) 상에서 수행될 수 있다. 실버 스테이닝된 SDS-PAGE 등으로 정제물을 분석할 수 있다.
V. IL-173에 대한 항체의 제조
근친교배된 Balb/c 마우스에 대해, 예를 들면, 제0일째에 Freund의 완전한 보조제로 에멀젼화시킨 정제된 인간 IL-173-FLAG 1ml를 복강을 통해 투여하여 면역시킨 후, 제15일째 및 제22일째에는 Freund의 불완전한 보조제로 에멀젼화시킨 정제된 인간 IL-173-FLAG 1ml를 복강을 통해 투여하여 면역시킨다. 이 마우스에 대해, 정제된 인간 IL-173 0.5ml를 정맥내 투여하여 면역반응을 촉진시킨다.
폴리클로날 항혈청을 수집한다. 이 혈청을 정제하여 항체를 수집할 수 있다. 이 항체를 추가 공정을 거쳐, 예를 들면, Fab, Fab2, Fv 또는 이와 유사한 단편을 생성할 수 있다.
예를 들면, 비-방출 골수종 세포 라인 SP2/O-Ag8 및 융합제로서의 폴리에틸렌 글리콜 1000 (Sigma, St.Louis, MO)을 사용하여 하이브리도마를 제조한다. 하이브리도마 세포를 96-웰 팔콘 조직 배양 플래이트 (Becton Dickinson, NJ)에 위치시킨 후, 젠타마이신 80㎍/ml, 글루타민 2mM, 말 혈청 10% (Gibco, Gaithersburg, MD), 1% ADCM (CRTS, Lyon, France), 10-5M 아자세린 (Sigma, St.Louis, MO) 및 5×10-5M 하이포크산틴을 함유한 DMEM F12 (Gibco, Gaithersburg, MD)를 투여한다. 아세톤-고정된 인간 IL-173으로 형질감염된 COS-7 세포를 사용한 면역세포화학법 (ICC) 및 코팅 항원으로서 COS-7 상층액으로부터 정제된 인간 IL-173-FLAG를 사용하는 ELISA를 통해, 하이브리도마 상층액을 스크리닝하여 인간 IL-173에 대한 항체를 생산하는 것을 수집한다. 일정 분량의 파지티브 세포 클론을 6일간 성장시키고, 냉동 보존하며, 15일전에 복강 주사한 프리스테인 (2,6,10,14-테라메틸펜타데칸, Sigma, St.Louis, MO)-치료한 Balb/c 마우스의 복수 (ascites)내에서 증식시킨다. 통상적으로, PBS 1ml 당 약 105개의 하이브리도마 세포를 복강 투여한 후, 10일 후에 각 마우스의 복수를 수집한다.
복수(ascites)를 원심분리한 후, 트리스 20mM pH 8.0으로 평형을 이룬 젠피르-D 실리슘 칼럼 (IBF 세프라코르) 상에서 암모늄 설페이트 침전물 및 음이온 교환 크로마토그래피로 항체 분획을 분리한다. NaCl 구배 (NaCl 0 내지 1M)를 이용하여 단백질을 용출시킨다. 분획 2ml를 수집한 후, 항-IL-173 항체의 존재 여부를ELISA로 테스트한다. 특정 항-IL-173 활성을 가지고 있는 분획을 수집, 투석 및 동결시킨다. 일정 분량의 정제된 모노클로날 항체를 퍼옥시데이즈로 표지시킬 수 있다.
폴리클로날 또는 모노클로날 항체 제조물을 교차 흡수, 제거 또는 배합하여, 목적하는 선택성 및 특이성을 나타내는 시약을 생성할 수 있다. 정의된 특정 항원을 고형 매트릭스에 부착시켜 목적하는 결합 능력을 선택적으로 제거하거나 선별하는 데에 사용할 수 있다.
VI. 인간 IL-173의 정량화
IL-173에 특이한 항체 중에서 적합한 클론 분리물을 선별하여, 샌드위치 분석법을 이용하여 인간 IL-173의 수준을 정량화한다. 정제된 항체를, 예를 들면, 코팅 버퍼 (카보네이트 버퍼, pH 9.6, 15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3) 중 2㎍/ml에서 희석시킨다. 이렇게 희석된 용액을 실온에서 밤새 96-웰 ELISA 플래이트 (인증된 Immunoplate Maxisorp F96, NUNC, Denmark)의 웰에 코팅시킨다. 그리고 나서, 이 플래이트를, 예를 들면, PBS (Phosphated Buffered Saline) 및 0.05% 트윈 20 (Technicon Diagnositics, USA)로 이루어진 세척 버퍼를 이용하여 수동 세척한다. TBS-B-T 버퍼 [20mM 트리스, 150mM NaCl, 1% BSA (Sigma, St.Louis, MO) 및 0.05% 트윈] 중에 희석된 정제된 인간 CTLA-8 (110㎕)를 각 웰에 첨가하였다. 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션시킨 후, 상기 플래이트를 다시 한번 더 세척한다. TBS-B-T 버퍼 5㎍/ml에 희석시킨 퍼옥시데이즈-표지된 Ab 100㎕를 각 웰에 첨가한 후, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시킨다. 그리고 나서, 이 웰을 세척 버퍼내에서 3회 세척한다. 시트레이트/포스페이트 버퍼 1mg/ml에 희석시킨 퍼옥시데이즈 기질, 2.2' 아지노비스 (3 에틸벤즈티아조인-6-설폰산) (ABTS) 100㎕를 각 웰에 첨가한 후, 비색 반응(colorimetric reaction)을 405nm에서 관찰한다.
VII. IL-170 유전자의 분포(distribution)
간질성 전뇌 피질의 cDNA 라이브러리에서 유래한 서열로부터 인간 IL-173을 확인하였다. 달팽이관, 뇌, 소뇌, 눈, 폐 및 신장의 cDNA 라이브러리로부터 랫트의 IL-173을 유도하였다. 또한, 상기 유전자가 매우 희귀한 것으로 보이는 데, 이는 발현 분포가 매우 제한되어 있다는 것을 암시한다.
마우스의 배아의 cDNA 라이브러리에서 유래한 서열로부터 마우스 IL-174를 확인하였다. 상기 유전자는 매우 희귀한 것으로 보이는 데, 이는 발현 분포가 매우 제한되어 있다는 것을 암시한다.
세포소멸 T 세포에서 유래한 서열로부터 인간 IL-171을 확인하였다. 상기 유전자는 매우 희귀한 것으로 보이는 데, 이는 발현 분포가 매우 제한되어 있다는 것을 암시한다.
인간의 태아의 심장, 간 및 비장, 흉선, 흉선 종양 및 총 태아에서 유래한 서열로부터 인간 IL-172를 확인하였다. 마우스의 배아, 유선 및 수집된 기관에서 유래한 서열로부터 마우스 IL-172를 확인하였다. 상기 2가지의 유전자 모두는 매우 희귀한 것으로 보이는 데, 이는 발현 분포가 매우 제한되어 있다는 것을 암시한다.
12시간 동안 티오우리딘으로 활성화된 T 세포에서 유래한 서열로부터 인간 IL-175를 확인하였다. 상기 유전자는 매우 희귀한 것으로 보이는 데, 이는 발현 분포가 매우 제한되어 있다는 것을 암시한다.
VIII. IL-170 유전자의 염색체 지도 작성
적합한 IL-170 유전자를 코딩하는 분리된 cDNA를 사용한다. 염색체 지도 작성은 표준 기법이다. 예를 들면, BIOS 래버러토리즈 (New Haven, CT) 및 PCR과 함께 마우스의 체세포 하이브리드 패널을 사용하는 방법을 참조하라.
인간의 IL-173 유전자는 인간의 염색체 13q11에 위치한다.
IX. IL-170 상동체의 분리
항체와 같은 결합 조성물을 사용하여, IL-170 단백질을 발현하는 세포 라인에서 제조한 발현 라이브러리를 스크리닝한다. 표준 염색 기법을 사용하여 세포내 또는 세포 표면에 발현된 항원을 검출 또는 분리하거나, 패닝 (panning)으로 형질전환된 세포를 발현하는 표면을 스크리닝한다. 여러 다양한 염색 또는 면역형광 공정을 통해, 세포내 발현을 스크리닝한다. 또한, McMahan 등의 문헌 {참조: 1991,EMBO J.10:2821-2832}을 참조하라.
종 변이체 또는 대립형질 변이체를 분리하는 데에 이와 유사한 방법을 사용할 수 있다. 종 변이체는, 프로브로서 소정의 종 또는 적합한 종으로부터 전장 길이의 분리물 또는 단편에 기초하여 종간 교차 혼성화 기법을 사용하여 분리한다.
X. IL-170의 수용체의 분리
강력한 IL-170 수용체를 발현하는 세포 라인으로부터 제조한 발현 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 사용할 수 있다. 상기한 바와 같이, 표지된 IL-170 리간드를 제조한다. 표준 염색 방법을 사용하여 세포 표면-발현된 수용체를 검출 또는 분리하거나, 형질전환된 세포를 발현하는 표면을 패닝으로 스크리닝한다. 또한, McMahan 등의 문헌 {참조: 1991,EMBO J.10:2821-2832}을 참조하라.
예를 들면, 제0일째, 실온에서 30분간 피브로넥틴 1ml/챔버, PBS 중 10ng/ml으로 2-챔버 퍼마녹스 슬라이드를 예비코팅한다. 그리고 나서, 성장 배지 1.5ml 중에 챔버 당 세포 2-3×105의 농도로 COS 세포를 플래이트에 위치시킨다. 37℃에서 밤새 인큐베이션시킨다.
제1일째, 각 표본에 대해, 혈청-부존재 DME 중의 DEAE-덱스트란 66㎍/ml, 클로로퀸 66μM 및 DNA 4㎍의 용액 0.5ml를 제조한다. 각 세트에 대한 포지티브 대조군, 예를 들면, 1 및 1/200로 희석시킨 huIL-170-FLAG cDNA의 포지티브 대조군 및 네가티브 모형 (mock)을 제조한다. 혈청-부존재 DME로 세포를 세정한다. 상기 DNA 용액을 첨가한 후, 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션시킨다. 상기 배지를 제거한 후, DME 중의 10% DMSO 0.5ml를 2.5분 동안 첨가한다. DME로 제거 및 1회 세척한다. 성장 배지 1.5ml를 첨가한 후, 밤새 인큐베이션시킨다.
제2일째, 상기 배지를 교환한다. 제3 또는 제4일째, 상기 세포를 고정 및 염색시킨다. 상기 세포를 HBSS (Hank's Buffered Saline Solution)으로 2회 세정한 후, 4% 파라포름알데히드(PFA)/글루코스 중에서 5분간 고정시킨다. HBSS로 3회 세척한다. 모든 액체를 제거한 후, 상기 슬라이드를 -80℃에서 저장할 수 있다.각 챔버에 있어서, 인큐베이션시킨 물질 0.5ml을 하기와 같이 처리한다. 1M NaN332㎕/ml 및 HBSS/사포닌 (0.1%)을 첨가한다. 그리고 나서, HBSS/사포닌으로 세포를 1회 세척한다. 가용성 항체를 세포에 첨가한 후, 30분간 인큐베이션시킨다. HBSS/사포닌으로 세포를 2회 세척한다. 1/200로 희석시킨 제2 항체 (예를 들면, 벡터 항-마우스 항체)를 첨가한 후, 30분간 인큐베이션시킨다. ELISA 용액 (예를 들면, 벡터 엘리트 ABC 고추냉이 퍼옥시데이즈 용액)을 제조한 후, 30분간 예비 인큐베이션시킨다. 예를 들면, HBSS/사포닌 2.5ml 당 용액 A (아비딘) 1 방울 및 용액 B (비오틴) 1 방울을 사용한다. HBSS/사포닌으로 세포를 2회 세척한다. ABC HRP 용액을 첨가한 후, 30분간 인큐베이션시킨다. HBSS로 세포를 2회 세척시킨 후, 2분간 2차로 세척하여 세포를 폐쇄시킨다. 그리고 나서, 벡터 디아미노벤조산 (DAB)을 5 내지 10분간 첨가한다. 유리 증류수 5ml 당 버퍼 2 방울, DAB 4 방울 및 H2O22 방울을 사용한다. 조심스럽게 챔버를 제거하고 나서, 슬라이드를 물에 넣어 세정한다. 수분간 공기-건조시킨 후, 크리스탈 마운트 1 방울 및 커버 슬립을 첨가한다. 85 내지 90℃에서 5분간 가열한다.
이와 달리, 표지된 리간드를 사용하여, 수용체를 발현하는 세포를 친화 정제 또는 분리한다 {참조: 예를 들면, Sambrook 등 또는 Ausubel 등}.
본원에서 인용한 모든 문헌들은, 개개의 문헌 또는 특허 출원서가 개별적 및 특이적으로 기재된 것과 동일한 정도로 참조문헌으로서 포함되어 있다.
본 발명의 범위로부터 벗어남이 없이 많은 변형 및 변이가 이루어질 수 있음은 당업자에게는 명백할 것이다. 본원에 기재된 특정 양태들은 예시를 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위는 하기 특허청구범위 및 이의 균등한 범위를 포함한다.

Claims (20)

  1. 하기 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 포함하는, 분리된 또는 재조합 폴리뉴클레오티드:
    (a) 성숙한 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 적어도 8개의 연속적인 아미노산을 코딩하거나,
    성숙한 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 적어도 5개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절을 코딩하거나,
    서열번호 5, 7, 9 또는 11의 적어도 21개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어진 하나 이상의 분절을 포함하는, 포유 동물의 IL-173의 서열;
    (b) 성숙한 서열번호 14, 16 또는 18의 적어도 8개의 연속적인 아미노산을 코딩하거나,
    성숙한 서열번호 14, 16 또는 18의 적어도 5개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절을 코딩하거나,
    서열번호 14, 16 또는 18의 적어도 21개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어진 하나 이상의 분절을 포함하는, 포유 동물의 IL-174의 서열;
    (c) 성숙한 서열번호 28의 적어도 8개의 연속적인 아미노산을 코딩하거나,
    성숙한 서열번호 28의 적어도 5개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절을 코딩하거나,
    서열번호 27의 적어도 21개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어진 하나 이상의 분절을 포함하는, 포유 동물의 IL-176의 서열; 및
    (d) 성숙한 서열번호 30의 적어도 8개의 연속적인 아미노산을 코딩하거나,
    성숙한 서열번호 30의 적어도 5개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절을 코딩하거나,
    서열번호 29의 적어도 21개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어진 하나 이상의 분절을 포함하는, 포유 동물의 IL-177의 서열.
  2. 제1항에 있어서, 하기 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 포함하는 발현 벡터 중의 폴리뉴클레오티드:
    (a) 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 적어도 12개의 연속적인 아미노산을 코딩하거나,
    서열번호 6, 8, 10 또는 12의 적어도 7개 및 10개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절을 코딩하거나,
    서열번호 5, 7, 9 또는 11의 적어도 27개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는, IL-173의 서열;
    (b) 서열번호 14, 16 또는 18의 적어도 12개의 연속적인 아미노산을 코딩하거나,
    서열번호 14, 16 또는 18의 적어도 7개 및 10개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절을 코딩하거나,
    서열번호 13, 15 또는 17의 적어도 27개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는, IL-174의 서열;
    (c) 서열번호 28의 적어도 12개의 연속적인 아미노산을 코딩하거나,
    서열번호 28의 적어도 7개 및 10개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절을 코딩하거나,
    서열번호 27의 적어도 27개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는, IL-176의 서열; 및
    (d) 서열번호 30의 적어도 12개의 연속적인 아미노산을 코딩하거나,
    서열번호 30의 적어도 7개 및 10개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절을 코딩하거나,
    서열번호 29의 적어도 27개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는, IL-177의 서열.
  3. 제2항에 있어서, 하기 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오티드:
    (a) 성숙한 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 적어도 16개의 연속적인 아미노산잔기를 코딩하거나,
    성숙한 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 적어도 10개 및 13개의 연속적인 아미노산 잔기로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절을 코딩하거나,
    서열번호 5, 7, 9 또는 11의 적어도 33개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하거나,
    서열번호 5, 7, 9 또는 11의 전체 성숙 코딩 부위를 포함하는, IL-173의 서열;
    (b) 성숙한 서열번호 14, 16 또는 18의 적어도 16개의 연속적인 아미노산 잔기를 코딩하거나,
    성숙한 서열번호 14, 16 또는 18의 적어도 10개 및 13개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절을 코딩하거나,
    서열번호 13, 15 또는 17의 적어도 33개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하거나,
    서열번호 13, 15 또는 17의 전체 성숙 코딩 부위를 포함하는, IL-174의 서열;
    (c) 성숙한 서열번호 28의 적어도 16개의 연속적인 아미노산을 코딩하거나,
    성숙한 서열번호 28의 적어도 10개 및 14개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절을 코딩하거나,
    서열번호 27의 적어도 33개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하거나,
    서열번호 27의 전체 성숙 코딩 부위를 포함하는, IL-176의 서열; 및
    (d) 성숙한 서열번호 30의 적어도 16개의 연속적인 아미노산을 코딩하거나,
    성숙한 서열번호 30의 적어도 10개 및 14개의 연속적인 아미노산 잔기로 이루어진 적어도 2개의 상이한 분절을 코딩하거나,
    서열번호 29의 적어도 33개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하거나,
    서열번호 29의 전체 성숙 코딩 부위를 포함하는, IL-177의 서열.
  4. (a) 제2항의 발현 벡터를 발현시켜 폴리펩티드를 생산하는 것을 포함하여, 폴리펩티드를 제조하는 방법;
    (b) 제2항의 폴리펩티드를 상보적인 핵산과 접촉시키는 것을 포함하여, 듀플렉스 핵산을 제조하는 방법; 또는
    (c) PCR 방법으로 증폭시키는 것을 포함하여, 제2항의 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  5. 55℃ 이상 및 400mM 미만의 염의 스트린전트 세척 조건하에서,
    (a) 서열번호 5, 7, 9 또는 11의 성숙 코딩 부위로 이루어진 제3항의 폴리뉴클레오티드 (IL-173);
    (b) 서열번호 13, 15 또는 17의 성숙 코딩 부위로 이루어진 제3항의 폴리뉴클레오티드 (IL-174);
    (c) 서열번호 27의 성숙 코딩 부위로 이루어진 제3항의 폴리뉴클레오티드 (IL-176) ; 또는
    (d) 서열번호 29의 성숙 코딩 부위로 이루어진 제3항의 폴리뉴클레오티드 (IL-177)와 혼성화되는, 분리한 또는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항에 있어서,
    (a) 상기한 세척 조건이 65℃ 이상이고 300mM 미만의 염이거나;
    (b) 서열번호 5, 7, 9 또는 11의 성숙 코딩 부위 (IL-173), 서열번호 13, 15 또는 17의 성숙 코딩 부위 (IL-174), 서열번호 27의 성숙 코딩 부위 (IL-176) 또는 서열번호 29의 성숙 코딩 부위 (IL-177)의 적어도 50개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항의 폴리뉴클레오티드; 및 (a) 검색용으로 제6항의 폴리뉴클레오티드를 사용하기 위한 지침 및/또는 (b) 제6항의 폴리뉴클레오티드 또는 기타의 킷트 시약을 제거하기 위한 지침을 포함하는 킷트.
  8. 제3항의 발현 벡터를 함유하는 것을 특징으로 하는, 원핵생물 세포, 진핵생물 세포, 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 포유류 세포, 마우스 세포, 영장류 세포 또는 인간 세포.
  9. (a) 적어도, i) 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 성숙 코딩 부위로부터 유래하는 8개의 일치하는 연속적인 아미노산으로 이루어진 하나의 분절, 또는 ii) 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 성숙 코딩 부위로부터 유래하는 적어도 5개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 2개의 상이한 분절을 포함하는, 분리된 또는 재조합 항원성 폴리펩티드 (IL-173);
    (b) 적어도, i) 서열번호 14, 16 또는 18의 성숙 코딩 부위로부터 유래하는 8개의 일치하는 연속적인 아미노산으로 이루어진 하나의 분절, 또는 ii) 서열번호14, 16 또는 18의 성숙 코딩 부위로부터 유래하는 적어도 5개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 2개의 상이한 분절을 포함하는, 분리된 또는 재조합 항원성 폴리펩티드 (IL-174);
    (c) 적어도, i) 서열번호 28의 성숙 코딩 부위로부터 유래하는 8개의 일치하는 연속적인 아미노산으로 이루어진 하나의 분절, 또는 ii) 서열번호 28의 성숙 코딩 부위로부터 유래하는 적어도 5개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 2개의 상이한 분절을 포함하는, 분리된 또는 재조합 항원성 폴리펩티드 (IL-176); 또는
    (d) 적어도, i) 서열번호 30의 성숙 코딩 부위로부터 유래하는 8개의 일치하는 연속적인 아미노산으로 이루어진 하나의 분절, 또는 ii) 서열번호 30의 성숙 코딩 부위로부터 유래하는 적어도 5개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 2개의 상이한 분절을 포함하는, 분리된 또는 재조합 항원성 폴리펩티드(IL-177).
  10. 제9항에 있어서,
    (a) 상기한 8개의 일치하는 연속적인 아미노산으로 이루어진 분절이, 적어도 14개의 연속적인 아미노산이거나;
    (b) 상기한 적어도 5개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 분절 중 하나의 분절이, 적어도 7개의 연속적인 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  11. 제9항에 있어서,
    (A) a) 서열번호 6, 8, 10 또는 12를 포함하거나, b) 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 성숙한 서열을 면역원으로 하여 생성된 폴리클로날 항체에 대해 선택적으로 결합하거나, c) 성숙한 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 10개의 연속적인 아미노산 서열로 이루어진 다수의 상이한 폴리펩티드 분절을 포함하거나, d) 서열번호 8 또는 12의 천연 대립형질 변이체이거나, e) 적어도 30개의 아미노산을 가지거나, f) 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 성숙한 서열에 대해 선택적인 적어도 2개의 비-중첩성 에피토프를 가지는, 폴리펩티드 (IL-173);
    (B) a) 서열번호 14, 16 또는 18의 성숙한 서열을 포함하거나, b) 서열번호 14, 16 또는 18의 성숙한 서열을 면역원으로 하여 생성된 폴리클로날 항체에 대해 선택적으로 결합하거나, c) 성숙한 서열번호 14, 16 또는 18의 10개의 연속적인 아미노산 서열로 이루어진 다수의 상이한 폴리펩티드 분절을 포함하거나, d) 서열번호 14 또는 18의 천연 대립형질 변이체이거나, e) 적어도 30개의 아미노산을 가지거나, f) 서열번호 14, 16 또는 18의 성숙한 서열의 영장류 단백질에 대해 선택적인 적어도 2개의 비-중첩성 에피토프를 가지는, 폴리펩티드 (IL-174);
    (C) a) 서열번호 28의 성숙한 서열을 포함하거나, b) 서열번호 28의 성숙한 서열을 면역원으로 하여 생성된 폴리클로날 항체에 대해 선택적으로 결합하거나, c) 성숙한 서열번호 28의 10개의 연속적인 아미노산 서열로 이루어진 다수의 상이한 폴리펩티드 분절을 포함하거나, d) 서열번호 28의 천연 대립형질 변이체이거나, e)적어도 30개의 아미노산을 가지거나, f) 서열번호 28의 성숙한 서열에 대해 선택적인 적어도 2개의 비-중첩성 에피토프를 가지는, 폴리펩티드 (IL-176); 또는
    (D) a) 서열번호 30의 성숙한 서열을 포함하거나, b) 서열번호 30의 성숙한 서열을 면역원으로 하여 생성된 폴리클로날 항체에 대해 선택적으로 결합하거나, c) 성숙한 서열번호 30의 10개의 연속적인 아미노산 서열로 이루어진 다수의 상이한 폴리펩티드 분절을 포함하거나, d) 서열번호 30의 천연 대립형질 변이체이거나, e) 적어도 30개의 아미노산을 가지거나, f) 성숙한 서열번호 30에 대해 선택적인 적어도 2개의 비-중첩성 에피토프를 가지는, 폴리펩티드 (IL-177)인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  12. 제11항에 있어서,
    a) 멸균성 조성물 중에 포함되거나;
    b) 글리코실화가 되어 있지 않거나;
    c) 변성되어 있거나;
    d) 합성 폴리펩티드이거나;
    e) 고형 기질에 부착되어 있거나;
    f) 검출용 또는 정제용 태그를 갖는 융합 단백질이거나;
    g) 천연 서열로부터 5-폴드 (fold) 이하로 치환된 변이체이거나;
    h) 천연 서열로부터 결손 또는 삽입된 변이체인 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드.
  13. 하기의 용도로 제9항의 폴리펩티드를 이용하는 방법:
    a) 제9항의 폴리펩티드를 방사성 표지로 표지시키는 것을 포함하여, 제9항의 폴리펩티드를 표지시키는 방법;
    b) 제9항의 폴리펩티드와 다른 폴리펩티드의 혼합물을 크로마토그래피 매트릭스 상에서 러닝시켜 제9항의 폴리펩티드를 분리하는 것을 포함하여, 제9항의 폴리펩티드와 다른 폴리펩티드의 혼합물 중에서 제9항의 폴리펩티드를 분리시키는 방법;
    c) 제9항의 폴리펩티드와의 결합을 유도하는 적합한 조건하에서 제9항의 폴리펩티드와 함께 인큐베이션시키는 것을 포함하여, 제9항의 폴리펩티드에 민감하게 결합하는 화합물을 동정하는 방법; 또는
    d) 제9항의 폴리펩티드를 반응성 시약으로 유도화시키고, 제9항의 폴리펩티드를 매트릭스에 컨쥬게이션시키는 것을 포함하여, 제9항의 폴리펩티드를 매트릭스에 컨쥬게이션시키는 방법.
  14. 하기의 제11항의 폴리펩티드에 선택적으로 결합하는 항체의 항원-결합 부위를 포함하는 결합 화합물:
    a) 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 성숙한 서열을 포함하는 폴리펩티드 (IL-173);
    b) 서열번호 14, 16 또는 18의 성숙한 서열을 포함하는 폴리펩티드 (IL-174);
    c) 서열번호 28의 성숙한 서열을 포함하는 폴리펩티드 (IL-176); 또는
    d) 서열번호 30의 성숙한 서열을 포함하는 폴리펩티드 (IL-177).
  15. 제14항에 있어서, 상기한 항체가 하기의 폴리펩티드에 대해 유도된 폴리클로날 항체인 것을 특징으로 하는 결합 화합물:
    a) 서열번호 6, 8, 10 또는 12의 폴리펩티드 (IL-173);
    b) 서열번호 14, 16 또는 18의 폴리펩티드 (IL-174);
    c) 서열번호 28의 폴리펩티드 (IL-176); 또는
    d) 서열번호 30의 폴리펩티드 (IL-177).
  16. 제14항에 있어서,
    a) 상기한 항체가, i) 면역 선택된 것이거나, ii) 변성된 단백질에 결합하거나, iii) 상기한 폴리펩티드에 대한 Kd가 적어도 30mM이거나;
    b) 상기한 결합-화합물이, i) 비드 또는 플라스틱 멤브레인을 포함한 고형 기질에 부착된 것이거나, ii) 멸균 조성물 중에 포함된 것이거나, iii) 방사성 표지 또는 형광 표지를 포함하여 검출가능하게 표지된 것을 특징으로 하는, 결합 화합물.
  17. 항원-항체 복합체가 형성될 수 있는 조건하에서, 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 28 또는 30의 서열을 포함하는 폴리펩티드와 제14항의 결합 화합물을 접촉시키는 것을 포함하여, 항원-항체 복합체를 제조하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기한 결합 화합물이 항체이고, 상기한 폴리펩티드는 생물학적 샘플 중에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제14항의 결합 화합물; 및 a) 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 28 또는 30의 성숙한 서열의 폴리펩티드, b) 검출용으로 제14항의 결합 화합물을 사용하기 위한 지침, 또는 c) 제14항의 결합 화합물 또는 기타의 킷트 시약을 제거하기 위한 지침을 포함하는, 킷트.
  20. 소정의 항체를 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 28 또는 30의 단백질 및 다른 사이토카인에 접촉시키고, 상기 단백질 및 사이토카인과 상기 항체와의 결합을 비교하는 것을 포함하여, 성숙한 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 28 또는 30의 단백질에 대한 소정의 항체의 결합 선택도를 평가하는 방법.
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