CN1357042A - 白介素-17相关哺乳动物细胞因子、编码其的多核苷酸、应用 - Google Patents

白介素-17相关哺乳动物细胞因子、编码其的多核苷酸、应用 Download PDF

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J·F·巴赞
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Abstract

提供了来自哺乳动物的CTLA-8相关抗原、涉及其的试剂包括纯化蛋白、特异性抗体和编码所述抗原的核酸。也提供了使用所述试剂的方法和诊断试剂盒。

Description

白介素-17相关哺乳动物细胞因子、编码其的多核苷酸、应用
                     发明领域
本发明涉及在控制哺乳动物细胞(例如哺乳动物免疫系统细胞)生理学、发育和分化中起作用的蛋白质相关的组合物。具体地说,本发明提供核酸、蛋白质、抗体以及调节各种细胞类型(包括造血细胞)的细胞生理学、发育、分化或功能的模拟物(mimetics)。
                     发明背景
脊椎动物的免疫系统由许多器官和几种不同的细胞类型组成。两种主要的细胞类型包括骨髓谱系和淋巴谱系。在淋巴样细胞谱系中有B细胞和T细胞,B细胞最初被鉴定为在胎肝或成体骨髓中分化,而T细胞最初被鉴定为在胸腺中分化。参见例如Paul(编辑,1998)Fundamental Immunology(第4版)Raven Press,New York。
在发生免疫应答或细胞分化的许多方面,称为细胞因子的可溶性蛋白在调节细胞相互作用方面起关键作用。这些细胞因子明显地以许多方式介导细胞活性。已经表明,它们在许多情况下调节造血干细胞的增殖、生长和分化为各种各样的构成负责免疫应答的谱系的祖细胞(progenitor)。
然而,仍未完全鉴定出在这些成熟途径中由不同发育阶段的细胞表达的细胞分子。此外,不太了解诱导、支持或调节这些细胞的各种生理学、发育或增殖状态的信号分子的作用和作用机制。清楚的是,免疫系统及其对各种胁迫的应答与医学例如传染病、癌症相关应答以及治疗反应、变应性反应和移植排斥反应有关。参见例如Thorn等,Harrison’s Principles of Internal Medicine McGraw/Hill,New York。
医学在很大程度上依赖于在实现对环境因子的生理学应答不足或不当的治疗中免疫系统的适当募集或抑制。然而,对免疫系统是如何调节或分化缺乏了解已经阻碍了人们有利地调节对生物攻击的正常防御机制的能力。因此,仍不能控制特征为相关细胞的发育或生理学调节异常或不当的医学病症。特定细胞因子的发现和表征将有助于开发对各式各样的变性性病症或影响免疫系统、造血细胞以及其它细胞类型的其它病症的疗法。本发明提供了这些问题中的某些问题和许多其它问题的解决方法。
                         发明概述
本发明部分基于编码表现出与名为CTLA-8的细胞因子有显著序列相似性的各种细胞因子样蛋白的cDNA克隆的发现。
本发明包括:编码本发明蛋白的分离的基因;所述编码的蛋白的变体,例如天然序列的突变物(突变蛋白)、物种变体和等位基因变体;融合蛋白;化学模拟物;抗体;和其它结构或功能类似物。也提供了这些不同核酸或蛋白组合物的各种应用。
在某些核酸实施方案中,本发明提供包含以下序列的分离的或重组的多核苷酸:a)来自哺乳动物IL-173的序列,它:编码SEQ ID NO:6、8、10或12的至少8个连续氨基酸;编码至少两个不同的SEQ IDNO:6、8、10或12的至少5个连续氨基酸的区段;或包含一个或多个SEQ ID NO:5、7、9或11的至少21个连续核苷酸的区段;b)来自哺乳动物IL-174的序列,它:编码SEQ ID NO:14、16或18的至少8个连续氨基酸;编码至少两个不同的SEQ ID NO:14、16或18的至少5个连续氨基酸的区段;或包含一个或多个SEQ ID NO:14、16或18的至少21个连续核苷酸的区段;c)来自哺乳动物IL-176的序列,它:编码SEQ ID NO:28的至少8个连续氨基酸;编码至少两个不同的SEQ ID NO:28的至少5个连续氨基酸的区段;或包含一个或多个SEQ ID NO:27的至少21个连续核苷酸的区段;d)来自哺乳动物IL-177的序列,它:编码SEQ ID NO:30的至少8个连续氨基酸;编码至少两个不同的SEQ ID NO:30的至少5个连续氨基酸的区段;或包含一个或多个SEQ ID NO:29的至少21个连续核苷酸的区段。其它实施方案包括表达载体中的这种多核苷酸,包含序列:a)(IL-173)它:编码SEQ ID NO:6、8、10或12的至少12个连续氨基酸;编码至少两个不同的SEQ ID NO:6、8、10或12的至少7个和10个连续氨基酸的区段;或包含SEQ ID NO:5、7、9或11的至少27个连续核苷酸;b)(IL-174)它:编码SEQ ID NO:14、16或18的至少12个连续氨基酸;编码至少两个不同的SEQ ID NO:14、16或18的至少7个和10个连续氨基酸的区段;或包含SEQ ID NO:13、15或17的至少27个连续核苷酸;c)(IL-176)它:编码SEQ ID NO:28的至少12个连续氨基酸;编码至少两个不同的SEQ ID NO:28的至少7个和10个连续氨基酸的区段;或包含SEQ ID NO:27的至少27个连续核苷酸;或d)(IL-177)它:编码SEQ ID NO:30的至少12个连续氨基酸;编码至少两个不同的SEQ ID NO:30的至少7个和10个连续氨基酸的区段;或包含SEQ ID NO:29的至少27个连续核苷酸。某些实施方案包括那些多核苷酸:a)(IL-173)它:编码SEQ ID NO:6、8、10或12的至少16个连续氨基酸残基;编码至少两个不同的SEQ ID NO:6、8、10或12的至少10个和13个连续氨基酸残基的区段;包含SEQ IDNO:5、7、9或11的至少33个连续核苷酸;或包含SEQ ID NO:5、7、9或11的整个成熟编码部分;b)(IL-174)它:编码SEQ ID NO:14、16或18的至少16个连续氨基酸残基;编码至少两个不同的SEQID NO:14、16或18的至少10个和13个连续氨基酸残基的区段;包含SEQ ID NO:13、15或17的至少33个连续核苷酸;或包含SEQ IDNO:13、15或17的整个成熟编码部分;c)(IL-176)它:编码SEQ IDNO:28的至少16个连续氨基酸;编码至少两个不同的SEQ ID NO;28的至少10个和14个连续氨基酸残基的区段;包含SEQ ID NO:27的至少33个连续核苷酸;或包含SEQ ID NO:27的整个成熟编码部分;或d)(IL-177)它:编码SEQ ID NO:30的至少16个连续氨基酸;编码至少两个不同的SEQ ID NO:30的至少10个和14个连续氨基酸残基的区段;包含SEQ ID NO:29的至少33个连续核苷酸;或包含SEQ IDNO:29的整个成熟编码部分。
提供各种方法,例如制备以下物质的方法:a)多肽,所述方法包括表达所述表达载体,由此产生所述多肽;b)双链体核酸,所述方法包括使一种所述多核苷酸与一种互补核酸接触,由此导致所述双链体核酸的产生;或c)一种所述多核苷酸,所述方法包括用PCR法进行扩增。
另一方面,本发明提供在至少55℃和低于400mM盐的严格洗涤条件与下述多核苷酸杂交的分离的或重组的多核苷酸:a)所述的(IL-173)多核苷酸,它由SEQ ID NO:5、7、9或11的编码部分组成;b)所述的(IL-174)多核苷酸,它由SEQ ID NO:13、15或17的编码部分组成;所述的(IL-176)多核苷酸,它由SEQ ID NO:27的编码部分组成;或d)所述的(IL-177)多核苷酸,它由SEQ ID NO:29的编码部分组成。其它实施方案包括这样的所述多核苷酸:a)其中所述洗涤条件为至少65℃和低于300mM盐;或b)它包含以下编码部分的至少50个连续核苷酸:SEQ ID NO:5、7、9或11(IL-173)的编码部分;或SEQ IDNO:13、15或17(IL-174)的编码部分;或SEQ ID NO:27(IL-176)的编码部分;或SEQ ID NO:29(IL-177)的编码部分。
提供某些试剂盒,所述试剂盒例如包含一种所述多核苷酸和:a)应用所述多核苷酸进行检测的说明;b)处理所述多核苷酸或所述试剂盒的其它试剂的说明;或c)a和b两者。
也提供各种细胞,所述细胞例如为含有所述表达载体的细胞,其中所述细胞是:原核生物细胞;真核生物细胞;细菌细胞;酵母细胞;昆虫细胞;哺乳动物细胞;小鼠细胞、灵长类动物细胞;或人细胞。
多肽实施方案包括例如分离的或重组的抗原性多肽:a)(IL-173)包含至少:i)一个来自SEQ ID NO:6、8、10或12的8个相同连续氨基酸的区段;或ii)两个不同的来自SEQ ID NO:6、8、10或12的至少5个连续氨基酸的区段;b)(IL-174)包含至少:i)一个来自SEQID NO:14、16或18的8个相同连续氨基酸的区段;或ii)两个不同的来自SEQ ID NO:14、16或18的至少5个连续氨基酸的区段;c)(IL-176)包含至少:i)一个来自SEQ ID NO:28的8个相同连续氨基酸的区段;或ii)两个不同的来自SEQ ID NO:28的至少5个连续氨基酸的区段;或d)(IL-177)包含至少:i)一个来自SEQ ID NO:30的8个相同连续氨基酸的区段;或ii)两个不同的来自SEQ ID NO:30的至少5个连续氨基酸的区段。另外的实施方案包括这样一种所述的多肽,其中:a)所述8个相同连续氨基酸的区段是至少14个连续氨基酸;或b)所述至少5个连续氨基酸的区段中的一个区段包含至少7个连续氨基酸。其它实施方案包括一种所述多肽,其中:A)(IL-173)所述多肽:a)包含SEQ ID NO:6、8、10或12的成熟序列;b)选择性地与针对成熟SEQ ID NO:6、8、10或12的免疫原产生的多克隆抗体结合;c)包含多个不同的SEQ ID NO:6、8、10或12的10个连续氨基酸的多肽区段;d)是SEQ ID NO:6、8、10或12的天然等位基因变体;e)其长度至少为30个氨基酸;或f)呈现出至少两个非重叠表位,所述表位对成熟SEQ ID NO:6、8、10或12具有选择性;B)(IL-174)所述多肽:a)包含成熟SEQ ID NO:14、16或18;b)选择性地与针对成熟SEQ ID NO:14、16或18的免疫原产生的多克隆抗体结合;c)包含多个不同的SEQ ID NO:14、16或18的10个连续氨基酸的多肽区段;d)其长度至少为30个氨基酸;或e)呈现出至少两个非重叠表位,所述表位对成熟SEQ ID NO:14、16或18具有选择性;或D)(IL-176)所述多肽:a)包含SEQ ID NO:28;b)选择性地与针对SEQ IDNO:28的免疫原产生的多克隆抗体结合;c)包含多个不同的SEQ IDNO:28的10个连续氨基酸的多肽区段;d)其长度至少为30个氨基酸;或e)呈现出至少两个非重叠表位,所述表位对SEQ ID NO:28的灵长类蛋白具有选择性;或D)(IL-177)所述多肽:a)包含SEQ ID NO:30;b)选择性地与针对SEQ ID NO:30的免疫原产生的多克隆抗体结合;c)包含多个不同的SEQ ID NO:30的10个连续氨基酸的多肽区段;d)其长度至少为30个氨基酸;或e)呈现出至少两个非重叠表位,所述表位对SEQ ID NO:30的灵长类蛋白具有选择性。各种其它实施方案包括这样一种所述多肽,所述多肽:a)是一种无菌组合物;b)没有被糖基化;c)是变性的;d)是合成多肽;e)连接于固相支持体;f)是具有检测标记或纯化标记的融合蛋白;g)是天然序列的5重或更少重的置换体;或h)是天然序列的缺失变体或插入变体。
也提供应用所述多肽的方法,例如:a)以标记多肽,所述方法包括用放射性标记来标记所述多肽;b)从混合物中的其它多肽中分离所述多肽,所述方法包括将所述混合物在层析基质上进行层析分离,由此分离所述多肽;c)以鉴定选择性地与所述多肽结合的化合物,所述方法包括将所述化合物与所述多肽在合适条件下温育,由此使得所述化合物结合于所述多肽;或d)以将所述多肽缀合于一种基质,所述方法包括用反应性试剂将所述多肽衍生化,并将所述多肽缀合于所述基质。
也提供选择性地与这样一种所述多肽结合的抗体,包括包含抗体的抗原结合部分的结合化合物,其中所述多肽:a)(IL-173)包含SEQID NO:6、8、10或12的成熟多肽;b)(IL-174)包含SEQ ID NO:14、16或18;c)(IL-176)包含SEQ ID NO:28;或d)(IL-177)包含SEQ ID NO:30。某些实施方案包括这样的结合化合物,其中所述抗体是针对下述多肽产生的多克隆抗体,所述多肽为:a)(IL-173)SEQID NO:6、8、10或12;b)(IL-174)SEQ ID NO:14、16或18;c)(IL-176)SEQ ID NO:28;或d)(IL-177)SEQ ID NO:30。其它实施方案包括这样的所述结合化合物,其中所述:a)抗体:i)为免疫选择的;ii)结合于变性蛋白;或iii)表现出与所述多肽的Kd至少为30mM;或b)所述结合化合物:i)连接至固相支持体,包括珠粒或塑料膜;ii)在无菌组合物中;或iii)被可检测地标记,包括放射性标记或荧光标记。
提供例如产生抗原:抗体复合物的方法,所述方法包括使包含来自SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、28或30的序列的多肽与一种所述结合化合物在允许所述复合物形成的条件下接触。最好是,所述结合化合物是抗体,而所述多肽是生物样品。
提供试剂盒,所述试剂盒例如包含一种所述结合化合物和:a)SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、28或30的多肽;b)应用所述结合化合物进行检测的说明;或c)处理所述结合化合物或所述试剂盒的其它试剂的说明。
提供抗体与SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、28或30的蛋白结合的选择性的评价方法,所述方法包括使一种所述抗体与所述蛋白接触以及与另一种细胞因子接触;并且比较所述抗体与所述蛋白以及与所述细胞因子的结合。
                   优选实施方案的详细描述I.一般描述
本发明提供编码表现出细胞因子特征性结构特征的各种哺乳动物蛋白的DNA序列,所述细胞因子尤其涉及名为CTLA-8的细胞因子(也称为IL-17)。已经描述了CTLA-8的大鼠形式、小鼠形式、人形式和病毒同系物,它们的序列可得自GenBank。参见Rouvier等(1993)J.Immunol.150:5445-5456;Yao等(1995)Immunity 3:811-821;Yao等(1995)J.Immunol.155:5483-5486;和Kennedy等(1996)J.Interferon andCytokine Res.16:611-617。CTLA-8具有涉及关节炎、肾移植排斥、肿瘤发生能力、病毒-宿主相互作用和先天免疫的活性;并且看来表现出与IL-6类似的某些调节功能。参见PubMed(IL-17的检索);Chabaud等(1998)J.Immnunol.63:139-148;Amin等(1998)Curr.Opin.Rheumatol.10:263-268;Van Kooten等(1998)J.Am.Soc.Nephrol.9:1526-1534;Fossiez等(1998)Int.Rev.Immunol.16:541-551;Knappe等(1998)J.Virol.72:5797-5801;Seow(1998)Vet.Immuno.Immunopathol.63:139-48;和Teunissen等(1998)J.Invest.Dermatol.111:645-649。关于通过NFΚB转录因子发送信号的一篇报道提及一个先天免疫中利用的信号途径。Shalom-Barak等(1998)J.Biol.Chem.273:27467-27473。
所述新介绍的cDNA序列表现出为编码细胞因子、生长因子和癌基因的mRNA的特征的各种特性。因为IL-17是这一新识别的与TGF-β相关的细胞因子家族中的第一个成员,所以申请人已经给家族IL-170指定了新成员IL-172、IL-173、IL-174、IL-176、IL-177;和IL-171和IL-175。预测该家族的折叠方式是细胞因子TGF-β家族的折叠方式。细胞因子TGF-β和IL-170家族共享胱氨酸结(cystine knot)基序的共同特征,其特征在于特定间隔的半胱氨酸残基。参见例如Sun和Davies(1995)Ann.Rev.Biophys.Biomolec.Struct.24:269-291;McDonald等(1993)Cell 73:421-424;和Isaacs(1995)Curr.Op.Struct.Biol.5:391-395。特别是,所述结构提示有许多保守的半胱氨酸,所述半胱氨酸对应于人IL-172(SEQ ID NO:2)中于位置101、103、143、156和158的半胱氨酸,并以所述位置编号。第一个半胱氨酸对应于表7中人IL-172(SEQ ID NOL 2)va119的位置。第四个半胱氨酸对应于小鼠IL-172(SEQ ID NO:4)的cys141;人IL-173(SEQ ID NO:6)的cys119;小鼠IL-174(SEQ ID NO:16)的cys104;和人IL-171(SEQ IDNO:21)的cys50。二硫键应该是半胱氨酸2与5;和3与6;以及1与4。所述折叠相似性的功能重要性提示IL-170家族形成二聚体。因此,IL-170二聚体可能一起结合两个细胞表面受体,信号转导将通过该受体发生。
这些新蛋白被命名为CTLA-8相关蛋白,或一般称为IL-170蛋白。所述天然蛋白应该能够介导导致靶细胞中生物应答或生理应答的各种生理应答,例如细胞因子发送信号的特征性的那些应答。初步研究已经将编码该蛋白的信息定位至造血细胞的各种细胞系。已经将编码原始CTLA-8(IL-17)抗原的基因作图至小鼠染色体1A和人染色体2q31。鼠类CTLA-8最初由Rouvier等克隆((1993)J.Immunol.150:5445-5456)。已将人IL-173作图至染色体13q11。蛋白在其它哺乳动物物种中的相似序列应该也能够得到。
当用滑膜细胞培养时,纯化CTLA-8也能够诱导从这些细胞分泌IL-6。加入针对人CTLA-8产生的中和抗体时,这种诱导被逆转。内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞和癌细胞也表现出对用CTLA-8处理而应答。这一数据提示,CTLA-8可能牵涉到炎性纤维变性,例如银屑病、硬皮病、肺纤维变性或肝硬化。CTLA-8也可能引起癌或其它癌细胞增生,因为IL-6常常充当这类细胞的生长因子。因此,所述新发现的其它相关家族成员可能具有相似或相关的生物活性。
以下的描述举例说明涉及鼠类或人IL-170蛋白,但同样可应用于来自其它物种的相关实施方案。II.核酸
表1-6公开了各种新IL-170家族成员序列的核苷酸序列和氨基酸序列。所述核苷酸序列和相关试剂可用于构建用DNA克隆,所述DNA克隆可用于在两个方向上延伸所述克隆的全长序列或侧翼序列的测定、表达IL-170多肽,或例如从另一天然来源分离同源基因。通常,所述序列将可用于从小鼠分离其它基因,例如等位基因变异体,而相似的方法将可应用于从其它物种分离基因,例如从温血动物如鸟类和哺乳动物中分离基因。交叉杂交将允许分离出来自其它物种的基因。应该可利用许多不同的方法来从其它来源成功地分离出合适的核酸克隆。表1:编码灵长类、例如人IL-172多肽的核苷酸序列和预测的氨基酸序列。也可以将互补核酸序列应用于许多目的。显示了预测的信号切割位点,但所述信号切割位点可能是其两侧的几个残基;推定的糖基化位点位于残基55-57。SEQ IDNO:1和2。ATG GAC TGG CCT CAC AAC CTG CTG TTT CTT CTT ACC ATT TCC ATC TTC        48Met Asp Trp Pro His Asn Leu Leu Phe Leu Leu Thr Ile Ser Ile Phe-20                 -15             -10                      -5CTG GGG CTG GGC CAG CCC AGG AGC CCC AAA AGC AAG AGG AAG GGG CAA        96Leu Gly Leu Gly Gln Pro Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg Lys Gly Gln
              1               5                  10GGG CGG CCT GGG CCC CTG GTC CCT GGC CCT CAC CAG GTG CCA CTG GAC        144Gly Arg Pro Gly Pro Leu Val Pro Gly Pro His Gln Val Pro Leu Asp
     15                  20                  25CTG GTG TCA CGG ATG AAA CCG TAT GCC CGC ATG GAG GAG TAT GAG AGG        192Leu Val Ser Arg Met Lys Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg
 30                  35                  40AAC ATC GAG GAG ATG GTG GCC CAG CTG AGG AAC AGC TCA GAG CTG GCC        240Asn Ile Glu Glu Met Val Ala Gln Leu Arg Asn Ser Ser Glu Leu Ala45                   50                  55                  60CAG AGA AAG TGT GAG GTC AAC TTG CAG CTG TGG ATG TCC AAC AAG AGG        288Gln Arg Lys Cys Glu Val Asn Leu Gln Leu Trp Met Ser Asn Lys Arg
             65                  70                  75AGC CTG TCT CCC TGG GGC TAC AGC ATC AAC CAC GAC CCC AGC CGT ATC        336Ser Leu Ser Pro Trp Gly Tyr Ser Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Ile
         80                  85                  90CCC GTG GAC CTG CCG GAG GCA CGG TGC CTG TGT CTG GGC TGT GTG AAC        384Pro Val Asp Leu Pro Glu Ala Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn
     95                 100                 105CCC TTC ACC ATG CAG GAG GAC CGC AGC ATG GTG AGC GTG CCG GTG TTC        432Pro Phe Thr Met Gln Glu Asp Arg Ser Met Val Ser Val Pro Val Phe
110                 115                 120AGC CAG GTT CCT GTG CGC CGC CGC CTC TGC CCG CCA CCG CCC CGC ACA        480Ser Gln Val Pro Val Arg Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr125                 130                 135                 140GGG CCT TGC CGC CAG CGC GCA GTC ATG GAG ACC ATC GCT GTG GGC TGC        528Gly Pro Cys Arg Gln Arg Ala Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys
            145                 150                 155ACC TGC ATC TTC TGA                                                    543Thr Cys Ile Phe
        160MDWPHNLLFLLTISIFLGLG QPRSPKSKRKGQGRPGPLVPGPHQVPLDLVSRMKPYARMEEYERNIEEMVAQLRNSSELAQRKCEVNLQLWMSNKRSLSPWGYSINHDPSRIPVDLPEARCLCLGCVNPFTMQEDRSMVSVPVFSQVPVRRRLCPPPPRTGPCRQRAVMETIAVGCTCIF
特别感兴趣的区段包括例如始于或终止于以下位置的那些区段:ghn1、Val19、pro20、pro22、lys34、pro35、leu78、ser79、glu98、ala99、phe110、thr111、cys143或arg144。编码啮齿动物、例如小鼠IL-172多肽的核苷酸序列和预测的氨基酸序列。也可以将互补核酸序列应用于许多目的。显示了预测的信号切割位点,但所述信号切割位点可能是其两侧的几个残基;推定的糖基化位点位于残基53-55。SEQ ID NO:3和4。ATG GAC TGG CCG CAC AGC CTG CTC TTC CTC CTG GCC ATC TCC ATC TTC         48Met Asp Trp Pro His Ser Leu Leu Phe Leu Leu Ala Ile Ser Ile Phe-22     -20                 -15                 -10CTG GCG CCA AGC CAC CCC CGG AAC ACC AAA GGC AAA AGA AAA GGG CAA         96Leu Ala Pro Ser His Pro Arg Asn Thr Lys Gly Lys Arg Lys Gly Gln
 -5                   1               5                  10GGG AGG CCC AGT CCC TTG GCC CCT GGG CCT CAT CAG GTG CCG CTG GAC         144Gly Arg Pro Ser Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Gln Val Pro Leu Asp
             15                  20                  25CTG GTG TCT CGA GTA AAG CCC TAC GCT CGA ATG GAA GAG TAT GAG CGG         192Leu Val Ser Arg Val Lys Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg
         30                  35                  40AAC CTT GGG GAG ATG GTG GCC CAG CTG AGG AAC AGC TCC GAG CCA GCC         240Asn Leu Gly Glu Met Val Ala Gln Leu Arg Asn Ser Ser Glu Pro Ala
     45                  50                  55AAG AAG AAA TGT GAA GTC AAT CTA CAG CTG TGG TTG TCC AAC AAG AGG         288Lys Lys Lys Cys Glu Val Asn Leu Gln Leu Trp Leu Ser Asn Lys Arg
 60                  65                  70AGC CTG TCC CCA TGG GGC TAC AGC ATC AAC CAC GAC CCC AGC CGC ATC         336Ser Leu Ser Pro Trp Gly Tyr Ser Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Ile75                  80                  85                  90CCT GCG GAC TTG CCC GAG GCG CGG TGC CTA TGT TTG GGT TGC GTG AAT         384Pro Ala Asp Leu Pro Glu Ala Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn
             95                 100                 105CCC TTC ACC ATG CAG GAG GAC CGT AGC ATG GTG AGC GTG CCA GTG TTC         432Pro Phe Thr Met Gln Glu Asp Arg Ser Met Val Ser Val Pro Val Phe
        110                 115                 120AGC CAG GTG CCG GTG CGC CGC CGC CTC TGT CCT CAA CCT CCT CGC CCT         480Ser Gln Val Pro Val Arg Arg Arg Leu Cys Pro Gln Pro Pro Arg Pro
    125                 130                 135GGG CCC TGC CGC CAG CGT GTC GTC ATG GAG ACC ATC GCT GTG GGT TGC         528Gly Pro Cys Arg Gln Arg Val Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys
140                 145                 150ACC TGC ATC TTC TGA                                                     543Thr Cys Ile Phe155MDWPHSLLFLLAISIFLAPSHP RNTKGKRKGQGRPSPLAPGPHQVPLDLVSRVKPYARMEEYERNLGEMVAQLRNSSEPAKKKCEVNLQLWLSNKRSLSPWGYSINHDPSRIPADLPEARCLCLGCVNPFTMQEDRSMVSVPVFSQVPVRRRLCPQPPRPGPCRQRVVMETIAVGCTCIF
特别感兴趣的区段包括例如始于或终止于以下位置的那些区段:arg1、ala17、pro18、pro20、his21、lys32、pro33、leu76、ser77、glu96、ala97、phe108、thr109、cys141或arg142。表2:编码灵长类、例如人IL-173多肽的核苷酸序列和预测的氨基酸序列。也可以将互补核酸序列应用于许多目的。SEQ ID NO:5和6。TGC GCG GAC CGG CCG GAG GAG CTA CTG GAG CAG CTG TAC GGG CGC CTG          48Cys Ala Asp Arg Pro Glu Glu Leu Leu Glu Gln Leu Tyr Gly Arg Leu1               5                  10                  15GCG GCC GGC GTG CTC AGT GCC TTC CAC CAC ACG CTG CAG CTG GGG CCG          96Ala Ala Gly Val Leu Ser Ala Phe His His Thr Leu Gln Leu Gly Pro
         20                  25                  30CGT GAG CAG GCG CGC AAC GCG AGC TGC CCG GCA GGG GGC AGG CCC GCC          144Arg Glu Gln Ala Arg Asn Ala Ser Cys Pro Ala Gly Gly Arg Pro Ala
     35                  40                  45GAC CGC CGC TTC CGG ACG CCC ACC AAC CTG CGC AGC GTG TCG CCC TGG          192Asp Arg Arg Phe Arg Thr Pro Thr Asn Leu Arg Ser Val Ser Pro Trp
 50                  55                  60GCC TAC AGA ATC TCC TAC GAC CCG GCG AGG TAC CCC AGG TAC CTG CCT          240Ala Tyr Arg Ile Ser Tyr Asp Pro Ala Arg Tyr Pro Arg Tyr Leu Pro65                  70                  75                  80GAA GCC TAC TGC CTG TGC CGG GGC TGC CTG ACC GGG CTG TTC GGC GAG          288Glu Ala Tyr Cys Leu Cys Arg Gly Cys Leu Thr Gly Leu Phe Gly Glu
             85                  90                  95GAG GAC GTG CGC TTC CGC AGC GCC CCT GTC TAC ATG CCC ACC GTC GTC          336Glu Asp Val Arg Phe Arg Ser Ala Pro Val Tyr Met Pro Thr Val Val
        100                 105                 110CTG CGC CGC ACC CCC GCC TGC GCC GGC GGC CGT TCC GTC TAC ACC GAG          384Leu Arg Arg Thr Pro Ala Cys Ala Gly Gly Arg Ser Val Tyr Thr Glu
    115                 120                 125GCC TAC GTC ACC ATC CCC GTG GGC TGC ACC TGC GTC CCC GAG CCG GAG          432Ala Tyr Val Thr Ile Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Pro Glu Pro Glu
130                 135                 140AAG GAC GCA GAC AGC ATC AAC T                                            454Lys Asp Ala Asp Ser Ile Asn145                 150CADRPEELLEQLYGRLAAGVLSAFHHTLQLGPREQARNASCPAGGRPADRRFRTPTNLRSVSPWAYRISYDPARYPRYLPEAYCLCRGCLTGLFGEEDVRFRSAPVYMPTVVLRRTPACAGGRSVYTEAYVTIPVGCTCVPEPEKDADSIN补充的编码灵长类、例如人IL-173多肽的核苷酸序列和预测的氨基酸序列。也可以将互补核酸序列应用于许多目的。SEQ ID NO:7和8。gcccgggcag gtggcgacct cgctcagtcg gcttctcggt ccaagtcccc gggtctgg   58atg ctg gta gcc ggc ttc ctg ctg gcg ctg ccg ccg agc tgg gcc gcg   106Met Leu Val Ala Gly Phe Leu Leu Ala Leu Pro Pro Ser Trp Ala Ala
    -15                 -10                 -5ggc gcc ccg agg gcg ggc agg cgc ccc gcg cgg ccg cgg ggc tgc gcg   154Gly Ala Pro Arg Ala Gly Arg Arg Pro Ala Arg Pro Arg Gly Cys Ala-1   1               5                  10                  15gac cgg ccg gag gag cta ctg gag cag ctg tac ggg cgc ctg gcg gcc   202Asp Arg Pro Glu Glu Leu Leu Glu Gln Leu Tyr Gly Arg Leu Ala Ala
             20                  25                  30ggc gtg ctc agt gcc ttc cac cac acg ctg cag ctg ggg ccg cgt gag   250Gly Val Leu Ser Ala Phe His His Thr Leu Gln Leu Gly Pro Arg Glu
         35                  40                  45cag gcg cgc aac gcg agc tgc ccg gca ggg ggc agg ccc gcc gac cgc   298Gln Ala Arg Asn Ala Ser Cys Pro Ala Gly Gly Arg Pro Ala Asp Arg
     50                  55                  60cgc ttc cgg ccg ccc acc aac ctg cgc agc gtg tcg ccc tgg gcc tac   346Arg Phe Arg Pro Pro Thr Asn Leu Arg Ser Val Ser Pro Trp Ala Tyr
 65                  70                  75aga atc tcc tac gac ccg gcg agg tac ccc agg tac ctg cct gaa gcc   394Arg Ile Ser Tyr Asp Pro Ala Arg Tyr Pro Arg Tyr Leu Pro Glu Ala80                  85                  90                  95tac tgc ctg tgc cgg ggc tgc ctg acc ggg ctg ttc ggc gag gag gac   442Tyr Cys Leu Cys Arg Gly Cys Leu Thr Gly Leu Phe Gly Glu Glu Asp
            100                 105                 110gtg cgc ttc cgc agc gcc cct gtc tac atg ccc acc gtc gtc ctg cgc   490Val Arg Phe Arg Ser Ala Pro Val Tyr Met Pro Thr Val Val Leu Arg
        115                 120                 125cgc acc ccc gcc tgc gcc ggc ggc cgt tcc gtc tac acc gag gcc tac   538Arg Thr Pro Ala Cys Ala Gly Gly Arg Ser Val Tyr Thr Glu Ala Tyr
    130                 135                 140gtc acc atc ccc gtg ggc tgc acc tgc gtc ccc gag ccg gag aag gac   586Val Thr Ile Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Pro Glu Pro Glu Lys Asp
145                 150                 155gca gac agc atc aac tcc agc atc gac aaa cag ggc gcc aag ctc ctg   634Ala Asp Ser Ile Asn Ser Ser Ile Asp Lys Gln Gly Ala Lys Leu Leu160                 165                 170                 175ctg ggc ccc aac gac gcg ccc gct ggc ccc tgaggccggt cctgccccgg     684Leu Gly Pro Asn Asp Ala Pro Ala Gly Pro
            180                 185gaggtctccc cggcccgcat cccgaggcgc ccaagctgga gccgcctgga gggctcggtc 744ggcgacctct gaagagagtg caccgagcaa accaagtgcc ggagcaccag cgccgccttt 804ccatggagac tcgtaagcag cttcatctga cacgggcatc cctggcttgc ttttagctac 864aagcaagcag cgtggctgga agctgatggg aaacgacccg gcacgggcat cctgtgtgcg 924gcccgcatgg agggtttgga aaagttcacg gaggctccct gaggagcctc tcagatcggc 984tgctgcgggt gcagggcgtg actcaccgct gggtgcttgc caaagagata gggacgcata 1044tgctttttaa agcaatctaa aaataataat aagtatagcg actatatacc tacttttaaa 1104atcaactgtt ttgaatagag gcagagctat tttatattat caaatgagag ctactctgtt 1164acatttctta acatataaac atcgtttttt acttcttctg gtagaatttt ttaaagcata 1224attggaatcc ttggataaat tttgtagctg gtacactctg gcctgggtct ctgaattcag 1284cctgtcaccg atggctgact gatgaaatgg acacgtctca tctgacccac tcttccttcc 1344actgaaggtc ttcacgggcc tccaggcctc gtgccgaatt c                     1385MLVAGFLLALPPSWAAGAPRAGRRPARPRGCADRPEELLEQLYGRLAAGVLSAFHHTLQLGPREQARNASCPAGGRPADRRFRPPTNLRSVSPWAYRISYDPARYPRYLPEAYCLCRGCLTGLFGEEDVRFRSAPVYMPTVVLRRTPACAGGRSVYTEAYVTIPVGCTCVPEPEKDADSINSSIDKQGAKLLLGPNDAPAGP
预测的重要基序包括:例如cAMP PK,位于50-53、66-69、72-75和113-116;CaPhos,位于82-84和166-168;肉豆蔻酰位点,位于57-61和164-166;磷酸化位点,位于50、53、72、75、80、82、113和116。编码啮齿动物、例如小鼠IL-173多肽的核苷酸序列和预测的氨基酸序列。也可以将互补核酸序列应用于许多目的。SEQ ID NO:9和10。TTT CCG AGA TAC CTG CCC GAA GCC TAC TGC CTG TGC CGA GGC TGT CTG        48Phe Pro Arg Tyr Leu Pro Glu Ala Tyr Cys Leu Cys Arg Gly Cys Leu1               5                  10                  15ACC GGG CTC TAC GGT GAG GAG GAC TTC CGC TTT CGC AGC GCA CCC GTC        96Thr Gly Leu Tyr Gly Glu Glu Asp Phe Arg Phe Arg Ser Ala Pro Val
         20                  25                  30TTC TCT CCG GCG GTG GTG CTG CGG CGC ACG GCG GCC T                      133Phe Ser Pro Ala Val Val Leu Arg Arg Thr Ala Ala
     35                  40FPRYLPEAYCLCRGCLTGLYGEEDFRFRSAPVFSPAVVLRRTAA补充的编码啮齿动物、例如小鼠IL-173多肽的核苷酸序列和预测的氨基酸序列。也可以将互补核酸序列应用于许多目的。SEQ ID NO:11和12。atg ttg ggg aca ctg gtc tgg atg ctc ctc gtc ggc ttc ctg ctg gca   48Met Leu Gly Thr Leu Val Trp Met Leu Leu Val Gly Phe Leu Leu Ala
            -20                 -15                 -10ctg gcg ccg ggc cgc gcg gcg ggc gcg ctg agg acc ggg agg cgc ccg   96Leu Ala Pro Gly Arg Ala Ala Gly Ala Leu Arg Thr Gly Arg Arg Pro
        -5               -1   1               5gcg cgg ccg cgg gac tgc gcg gac cgg cca gag gag ctc ctg gag cag   144Ala Arg Pro Arg Asp Cys Ala Asp Arg Pro Glu Glu Leu Leu Glu Gln
 10                  15                  20ctg tac ggg cgg ctg gcg gcc ggc gtg ctc agc gcc ttc cac cac acg   192Leu Tyr Gly Arg Leu Ala Ala Gly Val Leu Ser Ala Phe His His Thr25                  30                  35                  40ctg cag ctc ggg ccg cgc gag cag gcg cgc aat gcc agc tgc ccg gcc   240Leu Gln Leu Gly Pro Arg Glu Gln Ala Arg Asn Ala Ser Cys Pro Ala
             45                  50                  55ggg ggc agg gcc gcc gac cgc cgc ttc cgg cca ccc acc aac ctg cgc   288Gly Gly Arg Ala Ala Asp Arg Arg Phe Arg Pro Pro Thr Asn Leu Arg
         60                  65                  70agc gtg tcg ccc tgg gcg tac agg att tcc tac gac cct gct cgc ttt   336Ser Val Ser Pro Trp Ala Tyr Arg Ile Ser Tyr Asp Pro Ala Arg Phe
     75                  80                  85ccg agg tac ctg ccc gaa gcc tac tgc ctg tgc cga ggc tgc ctg acc   384Pro Arg Tyr Leu Pro Glu Ala Tyr Cys Leu Cys Arg Gly Cys Leu Thr
 90                  95                 100ggg ctc tac ggg gag gag gac ttc cgc ttt cgc agc aca ccc gtc ttc   432Gly Leu Tyr Gly Glu Glu Asp Phe Arg Phe Arg Ser Thr Pro Val Phe105                 110                 115                 120tct cca gcc gtg gtg ctg cgg cgc aca gcg gcc tgc gcg ggc ggc cgc   480Ser Pro Ala Val Val Leu Arg Arg Thr Ala Ala Cys Ala Gly Gly Arg
            125                 130                 135tct gtg tac gcc gaa cac tac atc acc atc ccg gtg ggc tgc acc tgc   528Ser Val Tyr Ala Glu His Tyr Ile Thr Ile Pro Val Gly Cys Thr Cys
        140                 145                 150gtg ccc gag ccg gac aag tcc gcg gac agt gcg aac tcc agc atg gac   576Val Pro Glu Pro Asp Lys Ser Ala Asp Ser Ala Asn Ser Ser Met Asp
    155                 160                 165aag ctg ctg ctg ggg ccc gcc gac agg cct gcg ggg cgc tgatgccggg    625Lys Leu Leu Leu Gly Pro Ala Asp Arg Pro Ala Gly Arg
170                 175                 180gactgcccgc catggcccag cttcctgcat gcatcaggtc ccctggccct gacaaaaccc 685accccatgat ccctggccgc tgcctaattt ttccaaaagg acagctacat aagctttaaa 745tatatttttc aaagtagaca ctacatatct acaactattt tgaatagtgg cagaaactat 805tttcatatta gtaatttaga gcaagcatgt tgtttttaaa cttctttgat atacaagcac 865atcacacaca tcccgttttc ctctagtagg attcttgagt gcataattgt agtgctcaga 925tgaacttcct tctgctgcac tgtgccctgt ccctgagtct ctcctgtggc ccaagcttac 985taaggtgata atgagtgctc cggatctggg cacctaaggt ctccaggtcc ctggagaggg 1045agggatgtgg gggggctagg aaccaagcgc ccctttgttc tttagcttat ggatggtctt 1105aactttataa agattaaagt ttttggtgtt attctttc                         1143MLGTLVWMLLVGFLLALAPGRAAGALRTGRRPARPRDCADRPEELLEQLYGRLAAGVLSAFHHTLQLGPREQARNASCPAGGRAADRRFRPPTNLRSVSPWAYRISYDPARFPRYLPEAYCLCRGCLTGLYGEEDFRFRSTPVFSPAVVLRRTAACAGGRSVYAEHYITIPVGCTCVPEPDKSADSANSSMDKLLLGPADRPAGR.
预测的重要基序包括:例如cAMP PK位点,位于50-53、66-69、72-75和113-116;钙磷酸化位点,位于82-84、159-161和166-168;肉豆蔻酰位点,位于57-61和101-105;N-糖基位点,位于51-53和164-166;磷酸化位点,位于50、53、72、71、80、82、113和116;和PKC磷酸化位点,位于4-6。表3:编码灵长类、例如人IL-174多肽的核苷酸序列和预测的氨基酸序列。也可以将互补核酸序列应用于许多目的。SEQ ID NO:13和14。tgagtgtgca gtgccagc atg tac cag gtg gtt gca ttc ttg gca atg gtc   51
                Met Tyr Gln Val Val Ala Phe Leu Ala Met Val
                    -15                 -10atg gga acc cac acc tac agc cac tgg ccc agc tgc tgc ccc agc aaa   99Met Gly Thr His Thr Tyr Ser His Trp Pro Ser Cys Cys Pro Ser Lys-5              -1   1               5                  10ggg cag gac acc tct gag gag ctg ctg agg tgg agc act gtg cct gtg   147Gly Gln Asp Thr Ser Glu Glu Leu Leu Arg Trp Ser Thr Val Pro Val
         15                  20                  25cct ccc cta gag cct gct agg ccc aac cgc cac cca gag tcc tgt agg   195Pro Pro Leu Glu Pro Ala Arg Pro Asn Arg His Pro Glu Ser Cys Arg
     30                  35                  40gcc agt gaa gat gga ccc ctc aac agc agg gcc atc tcc ccc tgg aga   243Ala Ser Glu Asp Gly Pro Leu Asn Ser Arg Ala Ile Ser Pro Trp Arg
 45                  50                  55tat gag ttg gac aga gac ttg aac cgg ctc ccc cag gac ctg tac cac   291Tyr Glu Leu Asp Arg Asp Leu Asn Arg Leu Pro Gln Asp Leu Tyr His60                  65                  70                  75gcc cgt tgc ctg tgc ccg cac tgc gtc agc cta cag aca ggc tcc cac   339Ala Arg Cys Leu Cys Pro His Cys Val Ser Leu Gln Thr Gly Ser His
             80                  85                  90atg gac ccc cgg ggc aac tcg gag ctg ctc tac cac aac cag act gtc   387Met Asp Pro Arg Gly Asn Ser Glu Leu Leu Tyr His Asn Gln Thr Val
         95                 100                 105ttc tac cgg cgg cca tgc cat ggc gag aag ggc acc cac aag ggc tac   435Phe Tyr Arg Arg Pro Cys His Gly Glu Lys Gly Thr His Lys Gly Tyr
    110                 115                 120tgc ctg gag cgc agg ctg tac cgt gtt tcc tta gct tgt gtg tgt gtg   483Cys Leu Glu Arg Arg Leu Tyr Arg Val Ser Leu Ala Cys Val Cys Val
125                 130                 135cgg ccc cgt gtg atg ggc tag                                       504Arg Pro Arg Val Met Gly140                 145MYQVVAFLAMVMGTHTYSHWPSCCPSKGQDTSEELLRWSTVPVPPLEPARPNRHPESCRASEDQPLNSRAISPWRYELDRDLNRLPQDLYHARCLCPHCVSLQTGSHMDPRGNSELLYHNQTVFYRRPCHGEKGTHKGYCLERRLYRVSLACVCVRPRVMG
预测的重要基序包括:例如cAMP PK位点,位于21-24、53-56和95-98;钙磷酸化位点,位于15-17、16-18和45-47;肉豆蔻酰位点,位于12-16、115-119和118-122;N-糖基位点,位于104-107;磷酸化位点,位于21、23、43、53、56、95、98和131;PKC磷酸化位点,位于41-43和119-121;和酪氨酸激酶位点,位于95-102。编码啮齿动物、例如小鼠IL-174多肽的核苷酸序列和预测的氨基酸序列。也可以将互补核酸序列应用于许多目的。SEQ ID NO:15和16。CGG CAC AGG CGG CAC AAA GCC CGG AGA GTG GCT GAA GTG GAG CTC TGC         48Arg His Arg Arg His Lys Ala Arg Arg Val Ala Glu Val Glu Leu Cys1               5                  10                  15ATC TGT ATC CCC CCC AGA GCC TCT GAG CCA CAC CCA CCA CGC AGA ATC         96Ile Cys Ile Pro Pro Arg Ala Ser Glu Pro His Pro Pro Arg Arg Ile
         20                  25                  30CTG CAG GGC CAG CAA GGA TGG CCT CTC AAC AGC AGG GCC ATC TCT CCT         144Leu Gln Gly Gln Gln Gly Trp Pro Leu Asn Ser Arg Ala Ile Ser Pro
     35                  40                  45TGG AGC TAT GAG TTG GAC AGG GAC TTG AAT CGG GTC CCC CAG GAC TGG         192Trp Ser Tyr Glu Leu Asp Arg Asp Leu Asn Arg Val Pro Gln Asp Trp
 50                  55                  60TAC CAC GCT CGA TGC CTG TGC CCA CAC TGC GTC ACG CTA CAG ACA GGC         240Tyr His Ala Arg Cys Leu Cys Pro His Cys Val Thr Leu Gln Thr Gly65                  70                  75                  80TCC CAC ATG GAC CCG CTG GGC AAC TCC GTC CCA CTT TAC CAC AAC CAG         288Ser His Met Asp Pro Leu Gly Asn Ser Val Pro Leu Tyr His Asn Gln
             85                  90                  95ACG GTC TTC TAC CGG CGG CCA TGC ATG GCG AGG AAG GTA CCC ATC GCC         336Thr Val Phe Tyr Arg Arg Pro Cys Met Ala Arg Lys Val Pro Ile Ala
        100                 105                 110GCT ACT GCT TGG AGC GCA GGT CTA CCG AGT CTC CTT GGC TTG TGT GTG         384Ala Thr Ala Trp Ser Ala Gly Leu Pro Ser Leu Leu Gly Leu Cys Val
    115                 120                 125TGT GCG GCC CCG GGT CAT GGC TTA GTC ATG CTC ACC ATC TGC CTG AGG         432Cys Ala Ala Pro Gly His Gly Leu Val Met Leu Thr Ile Cys Leu Arg
130                 135                 140TGAATGCCGG GTGGGAGAGA GGGCCAGGTG TACATCACCT GCCAATGCGG GCCGGGTTCA       492AGCCTGCAAA GCCTACCTGA AGCAGCAGGT CCCGGGACAG GATGGAGACT TGGGGAGAAA       552TCTGACTTTT GCACTTTTTG GAGCATTTTG GGAAGAGCAG GTTCGCTTGT GCTGTAGAGA       612TGCTGTTG                                                                620RHRRHKARRVAEVELCICIPPRASEPHPPRRILQGQQGWPLNSRAISPWSYELDRDLNRVPQDWYHARCLCPHCVTLQTGSHMDPLGNSVPLYHNQTVFYRRPCMARKVPIAATAWSAGLPSLLGLCVCAAPGHGLVMLTICLR补充的编码啮齿动物、例如小鼠IL-174多肽的核苷酸序列和预测的氨基酸序列。也可以将互补核酸序列应用于许多目的。SEQ ID NO:17和18。atg tac cag gct gtt gca ttc ttg gca atg atc gtg gga acc cac acc   48Met Tyr Gln Ala Val Ala Phe Leu Ala Met Ile Val Gly Thr His Thr
-15                 -10                  -5              -1gtc agc ttg cgg atc cag gag ggc tgc agt cac ttg ccc agc tgc tgc   96Val Ser Leu Arg Ile Gln Glu Gly Cys Ser His Leu Pro Ser Cys Cys1               5                  10                  15ccc agc aaa gag caa gaa ccc ccg gag gag tgg ctg aag tgg agc tct   144Pro Ser Lys Glu Gln Glu Pro Pro Glu Glu Trp Leu Lys Trp Ser Ser
         20                  25                  30gca tct gtg tcc ccc cca gag cct ctg agc cac acc cac cac gca gaa   192Ala Ser Val Ser Pro Pro Glu Pro Leu Ser His Thr His His Ala Glu
     35                  40                  45tcc tgc agg gcc agc aag gat ggc ccc ctc aac agc agg gcc atc tct   240Ser Cys Arg Ala Ser Lys Asp Gly Pro Leu Asn Ser Arg Ala Ile Ser
 50                  55                  60cct tgg agc tat gag ttg gac agg gac ttg aat cgg gtc ccc cag gac   288Pro Trp Ser Tyr Glu Leu Asp Arg Asp Leu Asn Arg Val Pro Gln Asp65                  70                  75                  80ctg tac cac gct cga tgc ctg tgc cca cac tgc gtc agc cta cag aca   336Leu Tyr His Ala Arg Cys Leu Cys Pro His Cys Val Ser Leu Gln Thr
             85                  90                  95ggc tcc cac atg gac ccg ctg ggc aac tcc gtc cca ctt tac cac aac   384Gly Ser His Met Asp Pro Leu Gly Asn Ser Val Pro Leu Tyr His Asn
        100                 105                 110cag acg gtc ttc tac cgg cgg cca tgc cat ggt gag gaa ggt acc cat   432Gln Thr Val Phe Tyr Arg Arg Pro Cys His Gly Glu Glu Gly Thr His
    115                 120                 125cgc cgc tac tgc ttg gag cgc agg ctc tac cga gtc tcc ttg gct tgt   480Arg Arg Tyr Cys Leu Glu Arg Arg Leu Tyr Arg Val Ser Leu Ala Cys
130                 135                 140gtg tgt gtg cgg ccc cgg gtc atg gct tagtcatgct caccacctgc         527Val Cys Val Arg Pro Arg Val Met Ala145                 150ctgaggctga tgcccggttg ggagagaggg ccaggtgtac aatcaccttg ccaatgcggg 587ccgggttcaa gccctccaaa gccctacctg aagcagcagg ctcccgggac aagatggagg 647acttggggag aaactctgac ttttgcactt tttggaagca cttttgggaa ggagcaggtt 707ccgcttgtgc tgctagagga tgctgttgtg gcatttctac tcaggaacgg actccaaagg 767cctgctgacc ctggaagcca tactcctggc tcctttcccc tgaatccccc aactcctggc 827acaggcactt tctccacctc tccccctttg ccttttgttg tgtttgtttg tgcatgccaa 887ctctgcgtgc agccaggtgt aattgccttg aaggatggtt ctgaggtgaa agctgttatc 947gaaagtgaag agatttatcc aaataaacat ctgtgttt                         985MYQAVAFLAMIVGTHTVSLRIQEGCSHLPSCCPSKEQEPPEEWLKWSSASVSPPEPLSHTHHAESCRASKDGPLNSRAISPWSYELDRDLNRVPQDLYHARCLCPHCVSLQTGSHMDPLGNSVPLYHNQTVEYRRPCHGEEGTHRRYCLERRLYRVSLACVCVRPRVMA
预测的重要基序包括:例如cAMP PK位点,位于29-32和61-64;钙磷酸化位点,位于18-20、53-55和67-69;肉豆蔻酰位点,位于123-127;N-糖基化位点,位于112-114;和磷酸化位点,位于29、31、51、53、61、64、139和141;和PKC磷酸化位点,位于2-4、49-51和127-129。表4:编码灵长类、例如人IL-171的按照IUPAC代码的核苷酸序列。也可以将互补核酸序列应用于许多目的。SEQ ID NO:19。GACACGGATG  AGGACCGCTA  TCCACAGAAG  CTGGCCTTCG  CCGAGTGCCT  GTGCAGAGGC             60TGTATCGATG  CACGGACGGG  CCGCGAGACA  GCTGCGCTCA  ACTCCGTGCG  GCTGCTCCAG             120AGCCTGCTGG  TGCTGCGCCG  CCGGCCCTGC  TCCCGCGACG  GCTCGGGGCT  CCCCACACCT             180GGGGCCTTTG  CCTTCCACAC  CGAGTTCATC  CACGTCCCCG  TCGGCTGCAC  CTGCGTGCTG             240CCCCGTTCAA  GTGTGACCGC  CAAGGCCGTG  GGGCCCTTAG  NTGACACCGT  GTGCTCCCCA             300GAGGGACCCC  TATTTATGGG  AATTATGGTA  TTATATGCTT  CCCACATACT  TGGGGCTGGC             360ATCCCGNGCT  GAGACAGCCC  CCTGTTCTAT  TCAGCTATAT  GGGGAGAAGA  GTAGACTTTC             420AGCTAAGTGA  AAAGTGNAAC  GTGCTGACTG  TCTGCTGTCG  TNCTACTNAT  GCTAGCCCGA             480GTGTTCACTC  TGAGCCTGTT  AAATATAGGC  GGTTATGTAC  C                                  521SEQ ID NO:20和21是PATENTIN可翻译cDNA序列和多肽序列:GAC ACG GAT GAG GAC CGC TAT CCA CAG AAG CTG GCC TTC GCC GAG TGC        48Asp Thr Asp Glu Asp Arg Tyr Pro Gln Lys Leu Ala Phe Ala Glu Cys1               5                  10                  15CTG TGC AGA GGC TGT ATC GAT GCA CGG ACG GGC CGC GAG ACA GCT GCG        96Leu Cys Arg Gly Cys Ile Asp Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala Ala
         20                  25                  30CTC AAC TCC GTG CGG CTG CTC CAG AGC CTG CTG GTG CTG CGC CGC CGG        144Leu Asn Ser Val Arg Leu Leu Gln Ser Leu Leu Val Leu Arg Arg Arg
     35                  40                  45CCC TGC TCC CGC GAC GGC TCG GGG CTC CCC ACA CCT GGG GCC TTT GCC        192Pro Cys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe Ala
 50                  55                  60TTC CAC ACC GAG TTC ATC CAC GTC CCC GTC GGC TGC ACC TGC GTG CTG        240Phe His Thr Glu Phe Ile His Val Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Leu65                  70                  75                  80CCC CGT TCA AGT GTG ACC GCC AAG GCC GTG GGG CCC TTA GnT GAC ACC        288Pro Arg Ser Ser Val Thr Ala Lys Ala Val Gly Pro Leu Xaa Asp Thr
             85                  90                  95GTG TGC TCC CCA GAG GGA CCC CTA TTT ATG GGA ATT ATG GTA TTA TAT        336Val Cys Ser Pro Glu Gly Pro Leu Phe Met Gly Ile Met Val Leu Tyr
        100                 105                 110GCT TCC CAC ATA CTT GGG GCT GGC ATC CCG nGC TGAGACAGCC CCCTGTTCTA      389Ala Ser His Ile Leu Gly Ala Gly Ile Pro Xaa
    115                 120TTCAGCTATA TGGGGAGAAG AGTAGACTTT CAGCTAAGTG AAAAGTGCAA CGTGCTGACT      449GTCTGCTGTC GTCCTACTCA TGCTAGCCCG AGTGTTCACT CTGAGCCTGT TAAATATAGG      509CGGTTATGTA CC                                                          521DTDEDRYPQKLAFAECLCRGCIDARTGRETAALNSVRLLQSLLVLRRRPCSRDGSGLPTPGAFAFHTEFIHVPVGCTCVLPRSSVTAKAVGPLXDTVCSPEGPLFMGIMVLYASHILGAGIPX补充的编码灵长类、例如人IL-171的核苷酸序列。也可以将互补核酸序列应用于许多目的。SEQ ID NO:22和23。gtgtggcctc aggtataaga gcggctgctg ccaggtgcat ggccaggtgc acctgtggga 60ttgccgccag gtgtgcaggc cgctccaagc ccagcctgcc ccgctgccgc cacc atg   117
                                                        Metacg ctc ctc ccc ggc ctc ctg ttt ctg acc tgg ctg cac aca tgc ctg   165Thr Leu Leu Pro Gly Leu Leu Phe Leu Thr Trp Leu His Thr Cys Leu
-15                 -10                  -5              -1gcc cac cat gac ccc tcc ctc agg ggg cac ccc cac agt cac ggt acc   213Ala His His Asp Pro Ser Leu Arg Gly His Pro His Ser His Gly Thr1               5                  10                  15cca cac tgc tac tcg gct gag gaa ctg ccc ctc ggc cag gcc ccc cca   261Pro His Cys Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Pro Leu Gly Gln Ala Pro Pro
         20                  25                  30cac ctg ctg gct cga ggt gcc aag tgg ggg cag gct ttg cct gta gcc   309His Leu Leu Ala Arg Gly Ala Lys Trp Gly Gln Ala Leu Pro Val Ala
     35                  40                  45ctg gtg tcc agc ctg gag gca gca agc cac agg ggg agg cac gag agg   357Leu Val Ser Ser Leu Glu Ala Ala Ser His Arg Gly Arg His Glu Arg
 50                  55                  60ccc tca gct acg acc cag tgc ccg gtg ctg cgg ccg gag gag gtg ttg   405Pro Ser Ala Thr Thr Gln Cys Pro Val Leu Arg Pro Glu Glu Val Leu65                  70                  75                  80gag gca gac acc cac cag cgc tcc atc tca ccc tgg aga tac cgt gtg   453Glu Ala Asp Thr His Gln Arg Ser Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Arg Val
             85                  90                  95gac acg gat gag gac cgc tat cca cag aag ctg gcc ttc gcc gag tgc   501Asp Thr Asp Glu Asp Arg Tyr Pro Gln Lys Leu Ala Phe Ala Glu Cys
        100                 105                 110ctg tgc aga ggc tgt atc gat gca cgg acg ggc cgc gag aca gct gcg   549Leu Cys Arg Gly Cys Ile Asp Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala Ala
    115                 120                 125ctc aac tcc gtg cgg ctg ctc cag agc ctg ctg gtg ctg cgc cgc cgg   597Leu Asn Ser Val Arg Leu Leu Gln Ser Leu Leu Val Leu Arg Arg Arg
130                 135                 140ccc tgc tcc cgc gac ggc tcg ggg ctc ccc aca cct ggg gcc ttt gcc   645Pro Cys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe Ala145                 150                 155                 160ttc cac acc gag ttc atc cac gtc ccc gtc ggc tgc acc tgc gtg ctg   693Phe His Thr Glu Phe Ile His Val Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Leu
            165                 170                 175ccc cgt tca gtg tgaccgccga ggccgtgggg cccctagact ggacacgtgt       745Pro Arg Ser Val
        180gctccccaga gggcaccccc tatttatgtg tatttattgg tatttatatg cctcccccaa 805cactaccctt ggggtctggg cattccccgt gtctggagga cagcccccca ctgttctcct 865catctccagc ctcagtagtt gggggtagaa ggagctcagc acctcttcca gcccttaaag 925ctgcagaaaa ggtgtcacac ggctgcctgt accttggctc cctgtcctgc tcccggcttc 985ccttacccta tcactggcct caggcccccg caggctgcct cttcccaacc tccttggaag 1045tacccctgtt tcttaaacaa ttatttaagt gtacgtgtat tattaaactg atgaacacat 1105cc                                                                1107MTLLPGLLFLTWLHTCLAHHDPSLRGHPHSHGTPHCYSAEELPLGQAPPHLLARGAKWGQALPVALVSSLEAASHRGRHERPSATTQCPVLRPEEVLEADTHQRSISPWRYRVDTDEDRYPQKLAFAECLCRGCIDARTGRETAALNSVRLLQSLLVLRRRPCSRDGSGLPTPGAFAFHTEFIHVPVGCTCVLPRSV表5:编码灵长类、例如人IL-175序列的按照IUPAC代码的核苷酸序列。也可以将互补核酸序列应用于许多目的。SEO ID NO:24。GAGAAAGAGC  TTCCTGCACA  AAGTAAGCCA  CCAGCGCAAC  ATGACAGTGA  AGACCCTGCA           60TGGCCCAGCC  ATGGTCAAGT  ACTTGCTGCT  GTCGATATTG  GGGCTTGCCT  TTCTGAGTGA           120GGCGGCAGCT  CGGAAAATCC  CCAAAGTAGG  ACATACTTTT  TTCCAAAAGC  CTGAGAGTTG           180CCCGCCTGTG  CCAGGAGGTA  GTATGAAGCT  TGACATTGGC  ATCATCAATG  AAAACCAGCG           240CGTTTCCATG  TCACGTAACA  TCGAGAGCCG  CTCCACCTCC  CCCTGGAATT  ACACTGTCAC           300TTGGGACCCC  AACCGGTACC  CCTCGAAGTT  GTACAGGC C  AAGTGTAGGA  ACTTGGGCTG           360TATCAATGCT  CAAGGAAAGG  AAGACATCTN  CATGAATTCC  GTC                              403SEQ ID NO:25和26是PATENTIN可翻译cDNA序列和多肽序列。显示了预测的信号切割位点,但所述信号切割位点也可以是两侧的几个残基;推定的糖基化位点位于53-55:GAGAAAGAGC TTCCTGCACA AAGTAAGCCA CCAGCGCAAC ATGACAGTGA AGACCCTGCA      60TGGCCCAGCC ATG GTC AAG TAC TTG CTG CTG TCG ATA TTG GGG CTT GCC         109
       Met Val Lys Tyr Leu Leu Leu Ser Ile Leu Gly Leu Ala
       -20                 -15                 -10TTT CTG AGT GAG GCG GCA GCT CGG AAA ATC CCC AAA GTA GGA CAT ACT        157Phe Leu Ser Glu Ala Ala Ala Arg Lys Ile Pro Lys Val Gly His Thr
     -5                   1               5TTT TTC CAA AAG CCT GAG AGT TGC CCG CCT GTG CCA GGA GGT AGT ATG        205Phe Phe Gln Lys Pro Glu Ser Cys Pro Pro Val Pro Gly Gly Ser Met10                  15                  20                  25AAG CTT GAC ATT GGC ATC ATC AAT GAA AAC CAG CGC GTT TCC ATG TCA        253Lys Leu Asp Ile Gly Ile Ile Asn Glu Asn Gln Arg Val Ser Met Ser
             30                  35                  40CGT AAC ATC GAG AGC CGC TCC ACC TCC CCC TGG AAT TAC ACT GTC ACT        301Arg Asn Ile Glu Ser Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Tyr Thr Val Thr
         45                  50                  55TGG GAC CCC AAC CGG TAC CCC TCG AAG TTG TAC AGG CCC AAG TGT AGG        349Trp Asp Pro Asn Arg Tyr Pro Ser Lys Leu Tyr Arg Pro Lys Cys Arg
     60                  65                  70AAC TTG GGC TGT ATC AAT GCT CAA GGA AAG GAA GAC ATC TCC ATG AAT        397Asn Leu Gly Cys Ile Asn Ala Gln Gly Lys Glu Asp Ile Ser Met Asn
 75                  80                  85TCC GTC                                                                403Ser Val90MVKYLLLSILGLAFLSEAAARKIPKVGHTFFQKPESCPPVPGGSMKLDIGIINENQRVSMSRNIESRSTSPWNYTVTWDPNRYPSKLYRPKCRNLGCINAQGKEDIXMNSV
特别感兴趣的区段包括例如始于或终止于以下位置的那些区段:arg1、cys17、pro18、pro19、va120、thr49、ser50、arg69、pro70和所述可利用序列的末端。表6:编码灵长类、例如人IL-176的核苷酸序列。也可以将互补核酸序列应用于许多目的。SEQ ID NO:27和28。tc gtg ccg tat ctt ttt aaa aaa att att ctt cac ttt ttt gcc tcc     47Val Pro Tyr Leu Phe Lys Lys Ile Ile Leu His Phe Phe Ala Ser
 1               5                  10                  15tat tac ttg tta ggg aga ccc aat ggt agt ttt att cct tgg gga tac    95Tyr Tyr Leu Leu Gly Arg Pro Asn Gly Ser Phe Ile Pro Trp Gly Tyr
             20                  25                  30ata gta aat act tca tta aag tcg agt aca gaa ttt gat gaa aag tgt    143Ile Val Asn Thr Ser Leu Lys Sar Ser Thr Glu Phe Asp Glu Lys Cys
         35                  40                  45gga tgt gtg gga tgt act gcc gcc ttc aga agt cca cac act gcc tgg    191Gly Cys Val Gly Cys Thr Ala Ala Phe Arg Ser Pro His Thr Ala Trp
     50                  55                  60agg gag aga act gct gtt tat tca ctg att aag cat ttg ctg tgt acc    239Arg Glu Arg Thr Ala Val Tyr Ser Leu I1e Lys His Leu Leu Cys Thr
 65                  70                  75aac tac ttt tca tgt ctt atc tta att Gtc ata aca gtc att            281Asn Tyr Phe Ser Cys Leu Ile Leu Ile Leu Ile Thr Val Ile80                  85                  90tgatatttta aaaaacccca gaaatctgag aaagagataa agtggtttgc tcaaggttat  341agaacagact accatgtgtt gtatttcaga ttttaattca tgtttgtctg attttaagtt  401ttgttcgctt gccagggtac cccacaaaaa tgccaggcag ggcattttca tgatgcactt  461gagatacctg aaatgacagg gtagcatcac acctgagagg ggtaaaggat gggaacctac  521cttccatggc cgctgcttgg cagtctcttg ctgcatgcta gcagagccac tgtatatgtg  581ccgaggctct gagaattaac tgcttaaaga actgccttct ggagggagaa gagcacaaga  641tcacaattaa ccatatacac atcttactgt gcgaggtcat tgagcaatac aggagggatt  701ttatacattt tagcaactat cttcaaaacc tgagctatag ttgtattctg cccccttcct  761ctgggcaaaa gtgtaaaagt ttg                                          784VPYLFKKIILHFFASYYLLGRPNGSFIPWGYIVNTSLKSSTEFDEKCGCVGCTAAFRSPHTAWRERTAVYSLIKHLLCTNYFSCLILILITVI编码灵长类、例如人IL-177的核苷酸序列。也可以将互补核酸序列应用于许多目的。SEQ ID NO:29和30。gtg act gta ttg tgg gga cag gaa gca caa att ccc atg tgg atc act   48Val Thr Val Leu Trp Gly Gln Glu Ala Gln Ile Pro Met Trp Ile Thr1               5                  10                  15agg aga gat aat aag tgg ggt cat ttc acc cct tgg tcc cct gct tcc   96Arg Arg Asp Asn Lys Trp Gly His Phe Thr Pro Trp Ser Pro Ala Ser
         20                  25                  30aga ccc aaa gag gcc tac atg gca ttg tgc ttc ctt ctt agt tgt agg   144Arg Pro Lys Glu Ala Tyr Met Ala Leu Cys Phe Leu Leu Ser Cys Arg
     35                  40                  45agg tgt gag ata caa tca ttt gcc tct gac ttt gag ggt tgg tcc       189Arg Cys Glu Ile Gln Ser Phe Ala Ser Asp Phe Glu Gly Trp Ser
 50                  55                  60tagcatgccc ctgaccagta gccccttaaa tacttcattg atatggaagg tctctgaatc 249ttcgtgggct taatctacca ctctctgaag ttcttatgtc tttcaaaggc ctctaaaatc 309tctgccatgt cttgctcatc cagttgttag catgatgtca ttgatacagt ggactttgga 369atctaagtgg ggagacactg gtaagtgacc aattacttca cctgtggtgt gcaagccaga 429tcaggaagcc tctacctgca cgacaacaca t                                460VTVLWGQEAQIPMWITRRDNKWGHFTPWSPASRPKEAYMALCFLLSCRRCEIQSFASDFEGWS表7:各种CTLA-8/IL-170家族成员的序列对比。大鼠CTLA-8序列是SEQ ID NO:31(参见GB L13839;293329/30);小鼠CTLA-8序列是SEQ ID NO:32(参见GB1469917/8);人CTLA-8是SEQ ID NO:33(参见GB U32659;115222/3);和鼠猴疱疹病毒(Herpes Saimiri virus)的ORF13是SEQ ID NO:34(参见GB Y13183;2370235)。CLUSTAL X(1.64b)多序列序列对比IL-74_Mu       ---------MYQAVAFLAMIVGTHTVSLRI----QEGCSHLPSCCPSKEQEPPEEWLKWSIL-74_Hu       ---------MYQVVAFLAMVMGTHTY---------S---HWPSCCPSKGQDTSEELLRWSIL-72_Hu       ------MDWPHNLLFLLTISIFLGLGQPRSPKSKRKGQGRPGPLVPGPHQVPLDLVSRMKIL-72_Mu       ------MDWPHSLLFLLAISIFLAPSHPRNTKGKRKGQGRPSPLAPGPHQVPLDLVSRVKIL-73_Mu       --MLGTLVWMLLVGFLLALAPGRAAGALRT--GRRP--ARPRDCADRPEELLEQLYGRLAIL-73_Hu       ---------MLVAGFLLALPPSWAAGAPRA--GRRP--ARPRGCADRPEELLEQLYGRLAIL-17_Hu       --MTPGKTSLVSLLLLLSLEAIVKAGITIP---------RNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLIL-17_Hs       --MTFRKTSLV-LLLLLSIDCIVKSEITSA---------QTPRCLAANN-SFPRSVMVTLIL-17_Rt       --------MCLMLLLLLNLEATVKAAVLIP---------QSSVCPNAEANNFLQNVKVNLIL-17_Mu       -----------MLLLLLSLAATVKAAAIIP---------QSSACPNTEAKDFLQNVKVNLIL-75_Hu       -------MVKYLLLSILGLAFLSEAAARKIPKVGHTFFQKPESCPPVPGGSMKLDIGIINIL-71_Hu       MTLLPGLLFLTWLHTCLAHHDPSLRGHPHSHGTPHCYSAEELPLGQAPPHLLARGAKWGQ
                           *                      *IL-74_Mu       S---------ASVSPP-EPLSHTHHAES---CRASKD-GPLNSRAISPWSYELDRDLNRVIL-74_Hu       T---------VPVPPL-EPARPNRHPES---CRASED-GPLNSRAISPWRYELDRKLNRLIL-72_Hu       P-YARMEEYERNIEEMVAQLRNSSELAQ-RKCEVNLQLWMSNKRSLSPWGYSINHDPSRIIL-72_Mu       P-YARMEEYERNLGEMVAQLRNSSEPAK-KKCEVNLQLWLSNKRSLSPWGYSINHDPSRIIL-73_Mu       AGVLSAFHHTLQLGPR-EQARNASCPAGGRAADRRFR-PPTNLRSVSPWAYRISYDPARFIL-73_Hu       AGVLSAFHHTLQLGPR-EQARNASCPAGGRPADRRFR-PPTNLRSVSPWAYRISYDPARYIL-17_Hu       N------------------IHNRNTNTN-----P-KRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYIL-17_Hs       S------------------IRNWNTSS--------KRASDYYNRSTSPWTLHRNEDQDRYIL-17_Rt       K------------------VINSLSSKA-----SSRRPSDYLNRSTSPWTLSRNEDPDRYIL-17_Mu       K------------------VFNSLGAKV-----SSRRPSDYLNRSTSPWTLHRNEDPDRYIL-75_Hu       E------------------N--QRVSMS--------R--NIESRSTSPWNYTVTWDPNRYIL-71_Hu       ALPVALVSSLEAASHRGRHERPSATTQCPVLRPEEVLEADTHQRSISPWRYRVDTDEDRY
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           *  :  * *    *:             *  :      . :IL-74_Mu       RLYR-VSLACVCVRPRVMA--------------------------IL-74_Hu       RLYR-VSLACVCVRPRVMG--------------------------IL-72_Hu       AVMETIAVGCTCIF-------------------------------IL-72_Mu       VVMETIAVGCTCIF-------------------------------IL-73_Mu       EHYITIPVGCTCVPEPDKSADSANSSMDK----LLLGPADRPAGRIL-73_Hu       EAYVTIPVGCTCVPEPEKDADSINSSIDKQGAKLLLGPNDAPAGPIL-17_Hu       LEKILVSVGCTCVTPIVHHVA------------------------IL-17_Hs       LEKMLVTVGCTCVTPIVHNVD------------------------IL-17_Rt       VEKMLVGVGCTCVSSIVRHAS------------------------IL-17_Mu       VEKMLVGVGCTCVASIVRQAA------------------------IL-75_Hu       LEKVLVTVGCTCVTPVIHHVQ------------------------IL-71_Hu       TEFIHVPVGCTCVLPRSV---------------------------
                : :.*.*:
特别感兴趣的区段包括例如对应于上述IL-172或IL-175区段以及所述其它家族成员的那些区段。
纯化的蛋白或多肽可用于通过标准方法产生抗体,如上所述。可以将合成肽或纯化蛋白呈递给免疫系统,以产生特异性结合组合物,例如单克隆抗体或多克隆抗体。参见例如Coligan(1991)CurrentProtocols in Immunology Wiley/Greene;和Harlow和Lane(1989)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press。
例如,所述特异性结合组合物可以用来筛选由表达IL-170蛋白的细胞系制备的表达文库。所述筛选可以是表面表达的蛋白的标准染色,或通过淘选。可以通过各种染色或免疫荧光方法,进行胞内表达的筛选。结合组合物可以用来亲和纯化或分选出表达所述蛋白的细胞。
本发明考虑了编码相应的生物活性IL-170蛋白或多肽的分离的DNA或片段的应用。另外,本发明包括编码生物活性蛋白或多肽、并且能够在合适条件下与本文所述DNA序列杂交的分离或重组的DNA。所述生物活性蛋白或多肽可以是完整的抗原或片段,并具有公开于表1-6中的氨基酸序列。此外,本发明包括其编码的蛋白表现出与IL-170蛋白同源、或利用编码IL-170蛋白的cDNA作为探针而分离出来的分离或重组的DNA或其片段的应用。所述分离的DNA可以在5’侧翼和3’侧翼具有各自相应的调节序列,例如启动子、增强子、poly-A添加信号和其它序列。
“分离的”核酸是与天然伴随天然序列的其它组分(例如核糖体、聚合酶和来自起源物种的侧翼基因组序列)基本上分离的核酸,例如RNA、DNA或混合聚合物。该术语包括已经从其天然存在的环境中取出的核酸序列,包括重组的或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。大致纯的分子包括分离形式的所述分子。另一方面,可以将从来自重组表达系统的宿主组分中分离纯化的种类。这样的核酸的同源性大小通常低于大载体,例如低于数十个kB,通常低于几个kB,优选范围为2-6kB。
分离的核酸一般是分子的同种组合物,但在某些实施方案中,将含有少量异质性。这种异质性通常发现于所述聚合物末端或对于所需生物功能或活性不重要的部分。
“重组的”核酸根据或者其生产方法或者其结构定义。对于其生产方法,例如应用一种方法生产的产物,所述方法是应用重组核酸技术,例如涉及在所述核苷酸序列中人的干涉,通常为选择或生产。或者,它可以是用以下方法制备的核酸:产生包含天然相互不相邻的两种片段的融合体的序列,但是指排除天然产物,例如天然存在的突变体。因此,例如,包括用任何非天然存在的载体转化细胞而制备的产物,同样包括包含用任何合成寡核苷酸方法所衍生序列的核酸。通常进行这样一种方法,以用编码同一种氨基酸或保守的氨基酸的丰余密码子取代一个密码子,同时通常引入或去除一个序列识别位点。或者,进行该方法,以将所需功能的核酸区段连接在一起,以产生包括所需功能组合的单一的遗传实体,其中所述功能组合是未在通常可得到的天然形式中发现的组合。限制性酶的识别位点常常是这类人工操作的靶,但可以通过设计,加入其它位点特异性靶,例如启动子、DNA复制位点、调节序列、控制序列或其它有用的特征。相似的概念将用于重组(例如融合)多肽。具体包括:合成的核酸,它由于遗传密码的丰余性而编码与这些抗原片段相似的多肽;和来自各种不同物种变体的序列的融合体。
在核酸方面,有效“片段”是一连续的区段,它至少为大约17个核苷酸,一般至少为20个核苷酸,更一般至少为23个核苷酸,普通的是至少26个核苷酸,更普通的是至少29个核苷酸,常常至少为32个核苷酸,更常常是至少35个核苷酸,典型的是至少38个核苷酸,更典型的是至少41个核苷酸,通常至少为44个核苷酸,更通常至少47个核苷酸,优选至少为50个核苷酸,更优选至少为53个核苷酸,在特别优选的实施方案中,将至少为56个或更多个核苷酸。所述片段可以在任何位置具有末端,但尤其是在结构域之间的边界具有末端。
在其它实施方案中,本发明提供包含多个不同的(例如非重叠的)特定长度区段的多核苷酸(或多肽)。通常,所述多个将至少是2个,更通常至少是3个,优选是5个、7个或甚至更多个。虽然提供了最小长度,但各种大小的较长的长度也是合适的,例如1个长度为7个的片段以及2个长度为12个的区段。
编码IL-170蛋白的DNA将尤其可用来鉴定编码相关或同源蛋白的基因、mRNA和cDNA种类,以及鉴定编码来自不同物种的同源蛋白的DNA。在包括灵长类在内的其它物种中可能有同系物。各种CTLA-8蛋白应该是同源的,包括于此中。然而,如果这些序列的同源性足够大,则在合适条件下采用这些序列,甚至可以容易地分离与所述抗原的进化关系更遥远的蛋白。对灵长类CTLA-8蛋白特别感兴趣。
本发明还包括其DNA序列与本文所述的分离DNA相同或高度同源的重组DNA分子和片段。特别是,通常将所述序列有效(operably)连接于控制转录、翻译和DNA复制的DNA区段。另一方面,衍生自基因组序列(例如含有内含子)的重组克隆,将可用于转基因研究,包括例如转基因细胞和生物,也可以用于基因治疗。参见例如Goodnow(1992)“转基因动物”,Roitt(编辑)Encyclopedia of Immunology,Academic Press,San Diego,第1502-1504页;Travis(1992)Science256:1392-1394;Kuhn等(1991)Science 254:707-710;Capecchi(1989)Science 244:1288;Robertson(1987)(编辑)Teratocarcinomas andEmbryonic Stem Cells:A Practical Approach,IRL Press,Oxford;Rosenberg(1992)J.Clinical Oncology 10:180-199;和Cournoyer和Caskey(1993)Ann.Rev.Immunol.11:297-329。
同源核酸序列在对比时,表现出显著的相似性。核酸中同源性的标准也是本领域通过序列对比或基于杂交条件而通常使用的同源性的度量。以下更详细地描述所述杂交条件。
在核酸序列比较方面,大致同源性是指当对比时,或者所述区段或者其互补链,在通过适当的核苷酸插入或缺失进行最佳对比时,至少大约50%的核苷酸相同,相同的核苷酸一般至少占56%,更一般至少占59%,经常至少占62%,更通常至少占65%,常常至少占68%,更常常至少占71%,典型的至少占74%,更典型的至少占77%,通常至少占80%,更通常至少占约85%,优选至少占约90%,更优选至少占约95%至98%或更多,而在特定实施方案中,高达大约99%或更多的核苷酸相同。另一方面,当所述区段在选择性杂交条件下与一条链或其互补链杂交时,存在着大致同源性,所述的一条链一般使用衍生自表2、3或6的序列。通常,当在一段至少大约14个核苷酸的序列中有至少大约55%同源性时,将发生选择性杂交,优选同源性至少为大约65%,更优选至少为大约75%,最优选至少为大约90%。参见Kanehisa(1984)Nuc.Acids Res.12:203-213。同源性比较的长度如上所述,可以为更长的序列段,在某些实施方案中为一段至少为大约17个核苷酸的序列,一般至少为大约20个核苷酸,更一般至少为24个核苷酸,通常至少为大约28个核苷酸,更通常至少为大约40个核苷酸,优选至少为大约50个核苷酸,更优选至少为大约75-100个或更多的核苷酸。
就杂交方面的同源性而论,严格条件将是通常在杂交反应中的盐、温度、有机溶剂和其它参数的严格性的组合条件,它们通常是受控制的。严格性温度条件通常包括超过大约30℃的温度,更通常为超过大约37℃的温度,典型的是超过大约45℃的温度,更典型的是超过大约55℃的温度,优选为超过大约65℃的温度,而更优选为超过大约70℃的温度。严格性的盐条件一般低于大约1000mM,通常低于大约500mM,更通常低于大约400mM,典型的低于大约300mM,优选低于大约200mM,而更优选低于大约150mM。然而,参数的组合比任何单个参数的测量值更为重要。参见例如,Wetmur和Davidson(1968)J.Mol.Biol.31:349-370。在严格条件下杂交得到的背景应该是超过背景至少2倍,最好至少3-5倍或更高。
另一方面,对于序列比较,通常一个序列充当参比序列,将测试序列与其比较。当使用一种序列比较算法时,将测试序列和参比序列输入计算机,必要时指定亚序列坐标,并且指定序列运算规则程序的参数。然后,该序列比较算法根据指定的程序参数,计算测试序列相对于参比序列的序列同一性百分率。
可以用如下进行用于比较的序列的光学序列对比(opticalalignment):例如用Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法、用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性序列对比算法、通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 85:2444的相似性方法的检索、通过计算机实现这些算法(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)、或通过目测检查(一般参见Ausubel等,见上文)。
有用的算法的一个实例是PILEUP。PILEUP采用渐进的成对序列对比,产生来自一组相关序列的一个多重序列对比,以显示关系和序列同一性的百分率。它也绘出一个树(tree)或枝叉图(dendogram),显示用来产生所述序列对比的成簇关系。PILEUP采用Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evol.35:351-360的渐进序列对比法的简化方法。所用的方法类似于Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5:151-153描述的方法。该程序可以对多达300个序列进行序列对比,每个序列的最大长度为5,000个核苷酸或氨基酸。多重序列对比法以两个最相似的序列的成对序列对比开始,产生一组(a cluster of)两个对比的序列。然后将该组与下一个最相关的序列或下一组对比的序列进行序列对比。通过简单地延伸两个单独序列的成对序列对比,将两组序列进行序列对比。通过一系列渐进的成对序列对比,得到最后的序列对比。通过指定序列比较区的特定序列及其氨基酸或核苷酸坐标,并且指定该程序的参数,运行该程序。例如,可以将参比序列与其它测试序列比较,以采用以下参数测定序列同一性关系的百分率:默认间隙加权值(3.00)、默认间隙长度加权值(0.10)和加权的末端间隙。
适用于测定序列同一性和序列相似性百分率的算法的另一实例是BLAST算法,在Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中有描述。公众可从国家生物技术信息中心(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/)得到进行BLAST分析的软件。该算法包括首先通过在查询序列中鉴别长度为W的短字(short Words),而鉴别高计分序列对(HSP),当与一数据库序列中相同长度的字进行序列对比时,它们或者匹配或者满足某些阳性值的阈值计分T。T称为相邻字计分阈值(Altschul等,见上文)。这些起始的相邻字命中(word hit)用作种子,起始搜寻以寻找含所述字命中的较长的HSP。然后,只要可以增加累积的序列对比计分,则所述字命中在两个方向上沿每个序列延伸。在以下情况下,每个方向上所述字命中的延伸停止:由于来自其最大得到的数值的数量X,累积的序列对比计分下降;由于一个或多个负计分的残基序列对比的累积,累积计分转为零或零以下;或达到两个序列之一的末端。BLAST算法的参数W、T和X决定该序列对比的灵敏度和速度。BLAST程序使用时,默认字长(W)为11,BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Na’l Acad.Sci.USA 89:10915)序列对比(B)为50,期望值(E)为10,M=5,N=4,并且比较两条链。
除计算序列同一性百分率外,BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计学分析(参见例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 90:5873-5787)。BLAST算法提供的相似性的一种测量是最小和概率(P(N)),这提供偶然发生两个核苷酸序列或氨基酸序列之间匹配概率的指标。例如,如果在测试核酸与参比核酸的比较中,最小和概率低于大约0.1,更优选低于大约0.01,最优选低于大约0.001时,认为该核酸与参比序列相似。
两个多肽的核酸序列大致相同的再一指标是:如以下所述,使第一种核酸编码的多肽与第二种核酸编码的多肽免疫交叉反应。因此,例如在一种多肽与第二种多肽仅由于保守取代而不同时,这两种多肽通常大致相同。两个核酸序列大致相同的另一指标是:所述两种分子在严格条件下相互杂交,如下所述。
通过如表1-7中公开的密切相关物种(例如人)的交叉物种杂交,可以克隆并分离来自其它哺乳动物物种的CTLA-8样蛋白。在远缘物种之间的同源性可能相对低,因此最好是相对密切相关的物种的杂交。或者,表现出物种特异性较低的抗体制备物的制备,可用于表达克隆方法。III.纯化的IL-170蛋白
灵长类(例如人)和啮齿动物(例如小鼠)IL-173多肽序列的预测序列示于表2。同样,在表3中提供灵长类(例如人)IL-174序列,并指定为SEQ ID NO:14。啮齿动物(例如小鼠)IL-174也描述于表3中。所述肽序列使得能够制备肽以产生识别这类区段的抗体。
当用于蛋白质方面时,本文所用的术语“灵长类IL-170蛋白”和“啮齿动物IL-170蛋白”将包括具有表1-7中所示指定氨基酸序列的蛋白质、或这种蛋白的有效片段(significant fragment)。它也指表现出相似生物功能或与IL-170蛋白特异性结合组分相互作用的灵长类或啮齿动物衍生多肽。这些结合组分(例如抗体)通常以高亲和性与IL-170蛋白结合,所述亲和性例如以至少约100nM,通常优于约30nM,优选优于约10nM,更优选优于约3nM。同源蛋白可能发现于非大鼠或人类的哺乳动物物种(例如小鼠、灵长类)和疱疹病毒基因组(例如ORF13)中。非哺乳动物物种也应该具有结构或功能相关的基因和蛋白。
本文所用的术语“多肽”包括有效片段或区段,包括一段至少约8个氨基酸,一般至少10个氨基酸,更一般至少12个氨基酸,通常至少14个氨基酸,更通常至少16个氨基酸,通常至少18个氨基酸,更通常至少20个氨基酸,常常至少22个氨基酸,更常常至少24个氨基酸,优选至少26个氨基酸,更优选至少28个氨基酸,在特别优选的实施方案中,为至少约30个或更多个氨基酸的氨基酸残基。这种区段的具体末端将以任何组合位于所述蛋白中,优选包括结构域。
术语“结合组合物”是例如以配体-受体型方式、抗体-抗原相互作用特异性地与IL-170蛋白结合的分子,或者是化合物,例如在天然生理学相关蛋白-蛋白相互作用中或者共价或者非共价地与IL-170蛋白特异性结合的蛋白。所示分子可以是聚合物或化学试剂。除了所述相互作用表现出相似的特异性,例如特定亲和性以外,不代表暗示IL-170蛋白是否是配体-受体相互作用的配体或是受体。功能类似物可以是具有结构修饰的蛋白质,或它可以是例如具有与所述合适结合决定簇相互作用的分子形状的完全不相关的分子。所述蛋白可以用作受体的激动剂或拮抗剂,参见例如Goodman等(编辑,1990)Goodman &Gilman’s:The Parmacological Bases of Therapeutics(第8版)PergamonPress。
多肽或片段的溶解性取决于环境和所述多肽。许多参数影响多肽的溶解性,包括温度、电解质环境、所述多肽的大小和分子特征以及溶剂的性质。通常,使用所述多肽的温度范围为约4℃至约65℃。所述使用温度通常高于约18℃,更通常高于约22℃。对于诊断目的,所述温度通常约为室温或更温暖,但低于该测定中组分的变性温度。对于治疗目的,所述温度通常为体温,对于人类而言通常为约37℃,尽管在某些情况下该温度可以在原位或体外升高或降低。
所述电解质通常接近原位生理条件,但在有利的情况下可以将其修改至较高或较低的离子强度。可以修改实际的离子,例如以符合生理学方面或分析方面所用的标准缓冲液。
所述多肽的大小和结构应该一般处于大致稳定的状态,通常不是变性状态。所述多肽可以在四级结构中与其它多肽缔合例如以提供溶解性,或以接近天然脂质双层相互作用的方式与脂质或去垢剂缔合。
所述溶剂通常是用于保存生物活性的类型的生物相容缓冲液,通常接近生理溶剂。所述溶剂通常具有中性pH,常常为约5至10之间,优选约7.5。在某些情况下,将加入去垢剂,通常为温和的非变性去垢剂,例如CHS或CHAPS,或去垢剂的浓度足够低,以免显著破坏所述抗原的结构或生理特性。
溶解性反映在以斯韦柏单位测量的沉降作用,斯韦柏单位是在特定条件分子沉降速度的度量。沉降速度的测定传统上在分析型超速离心机中进行,但现在通常在标准超速离心机中进行。参见Freifelder(1982)Physical Biochemistry(第2版),W.H.Freeman;和Cantor和Schimmel(1980)Biophysical Chemistry,第1-3部分,W.H.Freeman &Co.,San Francisco。作为粗略测量,将含有推定可溶性多肽的样品在标准满容量(full-sized)超速离心机中以约50K rpm离心约10分钟,可溶性分子保留在上清液中。可溶性粒子或多肽通常低于约30S,更通常低于约15S,常常低于约10S,更常常低于约6S,而在具体实施方案中,优选低于约4S,更优选低于约3S。IV.制备IL-170蛋白;模拟物
通过化学合成、筛选cDNA文库,或通过筛选由各式各样的细胞系或组织样品制备的基因组文库,可以获得编码所述IL-170蛋白或其片段的DNA。
该DNA可以在各种各样的宿主细胞中表达,以合成全长蛋白或片段,所述蛋白或片段可以再例如用来产生多克隆抗体或单克隆抗体;用于结合研究;用来构建和表达修饰的分子;和用于结构/功能研究。可以将每种抗原或其片段在用合适的表达载体转化或转染的宿主细胞中表达。可以将这些分子大致纯化,以除衍生自所述重组宿主的所述分子以外,不含蛋白或细胞污染物,因此这些分子当与药学上可接受的载体和/或稀释剂结合时,尤其可用于药用组合物。所述抗原或其部分可以作为具有其它蛋白的融合体表达。
表达载体通常是自主复制型DNA或RNA构成物,它们含有所需抗原基因或其片段,所述基因或片段通常有效连接于在合适宿主细胞中被识别的合适的遗传控制元件。这些控制元件能够实现在合适宿主中的表达。实现表达所必需的控制元件的具体类型将取决于所使用的最终宿主细胞。一般而言,所述遗传控制元件可以包括原核生物启动子系统或真核生物启动子表达控制系统,并且通常包括转录启动子和任选的控制转录开始的操纵基因、提高mRNA表达水平的转录增强子、编码合适的核糖体结合位点的序列、以及终止转录和翻译的序列。表达载体也通常含有允许所述载体独立于宿主细胞进行复制的复制起点。扩增载体拷贝数的方法也是已知的,参见例如Kaufman等(1985)Molec.and Cell.Biol.5:1750-1759。
本发明的载体含有编码IL-170蛋白或其片段的DNA,所述DNA通常编码生物活性多肽。所述DNA可以处于病毒启动子的控制之下,并且可以编码选择标记。本发明还设想了这样的表达载体应用,所述表达载体能够在原核生物宿主或真核生物宿主中表达编码IL-170蛋白的真核cDNA,其中所述载体与所述宿主相容,并且其中将编码所述抗原的真核生物cDNA插入所述载体中,以使含有所述载体的宿主的生长表达所述cDNA。通常,表达载体设计用于在其宿主细胞中稳定复制,或设计用于扩增以大大增加每个细胞中所需基因的总拷贝数。不必总是要求表达载体在宿主细胞中复制,例如,用不含有被宿主细胞识别的复制起点的载体,在各种宿主中实现瞬时表达所述抗原或其片段是可能的。应用引起IL-170蛋白基因或其片段通过重组整合到宿主DNA中,或整合控制内源基因表达的启动子也是可能的。
本文所用的载体包括质粒、病毒、噬菌体、整合型DNA片段和能够将DNA片段整合入宿主基因组中的其它载体。表达载体是含有影响有效连接的基因表达的遗传控制元件的特化载体。质粒是最常用形式的载体,但起同等功能作用的所有其它形式以及本领域已知或将已知的载体均适用于本文中。参见例如Pouwels等(1985和增补本)Cloning Vectors:A Laboratory Manuial.Elsevier,N.Y.;和Rodriquez等(编辑,1988)Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and TheirUses,Buttersworth,Boston,MA.
转化的细胞包括已经用含有IL-170基因、通常是利用重组DNA技术构建的载体转化或转染的细胞,最好是哺乳动物细胞。转化的宿主细胞通常表达所述抗原或其片段,但对于克隆、扩增和操作其DNA的目的,不必表达所述蛋白。本发明还设想了在营养培养基中培养转化的细胞,因此允许所述蛋白在培养物中积累。可以或者从培养物或者从培养基中回收所述蛋白。
对于本发明的目的,当DNA序列在功能上相互相关时,将它们有效地连接。例如,如果DNA作为前蛋白表达或参与将所述多肽导向细胞膜或指导分泌所述多肽,则将前序列(presequence)或分泌前导序列的DNA有效地连接至所述多肽。如果启动子控制所述多肽的转录,则将该启动子有效地连接至编码序列;如果将核糖体结合位点定位以允许翻译,则将核糖体结合位点有效地连接至编码序列。通常,有效地连接是指邻接的并且符合读框,然而,诸如阻抑物基因的某些遗传元件不是邻近连接的,但仍结合于操纵基因序列,进而控制表达。
合适的宿主细胞包括原核生物细胞、低等真核生物细胞和高等真核生物细胞。原核生物包括革兰氏阴性生物和革兰氏阳性生物,例如大肠杆菌和枯草杆菌。低等真核生物包括酵母,例如酿酒酵母(S.cerevisiae)和毕赤酵母属(Pichia);和网柄菌属(Dictyostelium)。高等真核生物包括来自动物细胞的确立组织培养细胞系,它们可以来源于非哺乳动物(例如昆虫细胞和鸟类)和哺乳动物(例如人类、灵长类和啮齿动物)。
原核宿主-载体系统包括各种各样的用于不同物种的载体。如本文所用的,从种属上说,将大肠杆菌及其载体用来包括用于其它原核生物中的等同载体。用于扩增DNA的代表性载体是pBR322或许多其衍生物。可以用来表达所述IL-170蛋白或其片段的载体包括但不限于诸如含有以下启动子的载体:lac启动子(pUC系列)、trp启动子(pBR322-trp)、Ipp启动子(pIN系列)、λpP或pR启动子(pOTS)或杂种启动子,例如ptac(pDR540)。参见Brosius等(1988)“使用λ-、trp-、lac-和Ipp衍生启动子的表达载体”,Rodriguez和Denhardt(编辑)Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Buttersworth,Boston,第10章,第205-236页。
低等真核生物例如酵母和网柄菌属可以用编码IL-170蛋白的载体转化。对于本发明的目的,最常用的低等真核生物宿主是面包酵母,即酿酒酵母。从种属上说,用其代表低等真核生物,尽管也可利用许多其它菌株和物种。酵母载体通常包含复制起点(除非是整合型的)、选择基因、启动子、编码所需蛋白或其片段的DNA、以及翻译终止、聚腺苷酸化和转录终止的序列。合适的酵母表达载体包含诸如3-磷酸甘油激酶的组成型启动子和各种其它糖酵解酶基因启动子或诸如乙醇脱氢酶2启动子或金属硫蛋白启动子的诱导型启动子。合适的载体包括以下类型的衍生物:自主复制低拷贝数类型(例如YRp系列)、自主复制高拷贝数类型(例如YEp系列);整合型(例如YIp系列)或微型染色体(例如YCp系列)。
高等真核生物组织培养细胞是用于表达功能活性IL-170蛋白的优选的宿主细胞。原则上,许多高等真核生物组织培养细胞系无论是来自无脊椎动物还是来自脊椎动物,都是有效的,例如昆虫杆状病毒表达系统。然而,最好是哺乳动物细胞,因为可以进行共翻译加工和翻译后加工。这类细胞的转化或转染以及繁殖已经成为常规方法。有用细胞系的实例包括HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、幼龄大鼠肾(BRK)细胞系、昆虫细胞系、鸟类细胞系和猴(COS)细胞系。用于这类细胞系的表达载体通常包括复制起点、启动子、翻译起始位点、RNA剪接位点(如果使用基因组DNA)、聚腺苷酸化位点和转录终止位点。这些载体也通常含有选择基因或扩增基因。合适的表达载体可以是携带例如衍生自诸如以下来源的启动子的质粒、病毒或反转录病毒:、腺病毒、SV40、细小病毒、痘苗病毒或巨细胞病毒。合适表达载体的代表性实例包括pCDNA1;pCD,参见Okayama等(1985)Mol.Cell Biol.5:1136-1142;pMClneo poly-A,参见Thomas等(1987)Cell 51:503-512;和杆状病毒载体,例如pAC 373或pAC 610,参见O’Reilly等(1992)Baculovirus Expression Vectors:A Laboratory ManualFreeman and Co.,CRC Press,Boca Raton,Fla。
通常希望在提供特定或限定糖基化模式的系统中表达IL-170蛋白多肽。在这种情况下,通常的模式将是由所述表达系统天然提供的。然而,通过将所述多肽、例如未糖基化形式的多肽暴露于引入异源表达系统的合适糖基化蛋白,将可修饰所述模式。例如,所述IL-170蛋白基因可以与一种或多种编码哺乳动物糖基化酶或其它糖基化酶的基因一起共转化。利用该方法,在原核生物细胞或其它细胞中将可得到或接近某些哺乳动物糖基化模式。
可以将所述IL-170蛋白或其片段工程化,以经磷脂酰肌醇(PI)连接于细胞膜上,但可以通过用磷脂酰肌醇切割酶(例如磷脂酰肌醇磷脂酶-C)处理将其从膜上除去。这释放出生物活性形式的所述抗原,并允许通过蛋白化学的标准方法进行纯化。参见例如Low(1989)Biochim.Biophys.Acta 988:427-454;Tse等(1985)Science 230:1003-1008;和Brunner等(1991)J.Cell Biol.114:1275-1283。
由于已经表征了所述IL-170蛋白,因此通过合成肽的常规方法可以制备其片段或衍生物。这些方法包括例如在以下文献中描述的方法:Stewart和Young(1984)Solid Phase Peptide Synthesis,PierceChemical Co.,Rockford,IL;Bodanszky和Bodanszky(1984)The Practiceof Peptide Synthesis,Springer-Verlag,New York;和Bodanszky(1984)The Principles of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,New York。例如,可以使用叠氮化物法、酰基氯法、酸酐法、混合酐法、活性酯法(例如,对硝基苯酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯或氰基甲酯)、碳二咪唑(carbodiimidazole)法、氧化还原法或二环己基碳二亚胺(DCCD)/加成法。固相合成和溶液相合成均可应用于上述方法。
按照通常用于肽合成的上述方法,一般或者通过所谓的分步法,或者通过将肽片段偶联至末端氨基酸,适当地制备所述IL-170蛋白、片段或衍生物,所述分步法包括在将氨基酸一个接一个顺序缩合至末端氨基酸上。通常保护在偶联反应中未使用的氨基,以防止在不正确的位置上偶联。
如果采用固相合成,则将C末端氨基酸通过其羧基连接于不溶性载体或支持体上。所述不溶性载体并不特别受限制,只要它具有与反应性羧基结合的能力。这类不溶性载体的实例包括卤代甲基树脂(例如氯甲基树脂或溴甲基树脂)、羟甲基树脂、酚树脂、叔烷氧羰基-酰肼树脂等。
通过将氨基受保护的氨基酸的活化羧基与先前形成的肽或链的反应性氨基缩合,顺序连接所述氨基受保护的氨基酸,以逐步合成所述肽。在合成完整的序列后,从不溶性载体上切下所述肽,以产生所述肽。Merrifield等(1963)J.Am.Chem.Soc.85:2149-2156全面地描述了这种固相法。
可以通过肽分离方法,例如通过提取、沉淀、电泳和各种形式的层析等,从反应混合物中分离并纯化所制备的蛋白及其片段。本发明的IL-170蛋白根据其所需用途,可以以不同纯度获得。利用本文公开的蛋白纯化技术,或在免疫吸附亲和层析中应用本文所述的抗体,可以完成纯化。首先将所述抗体连接于固相支持体上,然后使所连接的抗体与合适来源细胞的溶解裂解液、表达所述蛋白的其它细胞的裂解液或由于DNA技术而产生所述IL-170蛋白的细胞的裂解液或上清液接触,进行这种免疫吸附亲和层析,参见下文。V.物理变体
本发明也包括与所述IL-170蛋白的氨基酸序列具有大致氨基酸序列同源性的蛋白或肽。所述变体包括物种变体或等位基因变体。
通过使残基匹配最优化,必要时,根据需要引入间隙,确定氨基酸序列的同源性或序列同一性。当将保守取代考虑为匹配时,序列同源性或同一性会有变化。保守取代通常包括以下组内的取代:甘氨酸、丙氨酸;缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸;天冬氨酸、谷氨酸;天冬酰胺、谷氨酰胺;丝氨酸、苏氨酸;赖氨酸、精氨酸;和苯丙氨酸、酪氨酸。同源的氨基酸序列通常计划包括每种相应蛋白质序列中的天然等位基因变异和种间变异。典型的同源蛋白或肽与所述IL-170蛋白的氨基酸序列的同源性将从25-100%(如果可以引入间隙)至50-100%(如果包括保守取代)。同源性测量结果将至少为大约35%,一般至少为40%,更一般至少为45%,常常至少为50%,更常常至少为55%,典型的至少为60%,更典型的至少为65%,通常至少为70%,更通常至少为75%,优选至少为80%,而更优选至少为80%,在特别优选的实施方案中,至少为85%或更高。也参见Needleham等(1970)J.Mol.Biol.48:443-453;Sankoff等,(1983)Time Warps,String Edits,and Macromolecules:The Theory and Practice of Sequence Comparsion的第1章,Addison-Wesley,Reading,MA;和IntelliGenetics(Mountain View,CA)的软件包;和the University of Wisconsin Genetics Computer Group(Madison,WI)的软件包。
通过核苷酸置换、核苷酸缺失、核苷酸插入和核苷酸序列段倒位,可以容易地修饰编码IL-170蛋白的分离的DNA。这些修饰产生编码这些抗原、其衍生物或具有相似生理活性、免疫原性或抗原性的蛋白质的新的DNA序列。这些修饰的序列可以用来产生突变抗原,或增强表达。增强的表达可以包括基因扩增、转录增加、翻译增加和其它机制。这样的突变IL-170蛋白衍生物包括所述相应蛋白或其片段的预定突变或定点突变。“突变IL-170蛋白”包括这样的多肽,它们在其它方面属于以上提出的鼠类IL-170或人IL-170蛋白的同源性定义内,但其氨基酸序列或者由于缺失、置换,或者由于插入,而不同于自然界中发现的IL-170蛋白的氨基酸序列。特别是,“定点突变IL-170蛋白”一般包括这样的蛋白,它们与具有来自表1-6的序列具有显著同源性、并且与那些序列共享各种生物活性(例如抗原性或免疫原性)的蛋白,在优选实施方案中,含有所公开序列的大部分。相似的概念适用于不同的IL-170蛋白,特别是在各种温血动物(例如哺乳动物和鸟类)中发现的那些IL-170蛋白。如上所述,强调的是,这些描述一般是指包括所有的IL-170蛋白,但不限于具体讨论的小鼠实施方案。
虽然定点突变位点是预定的,但突变体不必是定点的。可以通过制备氨基酸插入或缺失,进行IL-170蛋白的诱变。可以产生置换、缺失、插入或任何组合,以得到最终的构成物。插入包括氨基末端或羧基末端融合。可以于靶密码子进行随机诱变,然后对所表达的突变体筛选所需活性。于序列已知的DNA中预定位点制备置换突变的方法是本领域众所周知,例如通过M13引物诱变或聚合酶链式反应(PCR)技术。也参见例如Sambrook等(1989)和Ausubel等(1987和增补本)。
通常,所述DNA中的突变不应该将编码序列置于读框之外,最好不产生可能杂交产生例如环或发夹的mRNA二级结构的互补区。
本发明也提供重组蛋白,例如采用来自这些蛋白的区段的异源融合蛋白。异源融合蛋白是天然情况下通常不以同一方式融合的蛋白或区段的融合体。因此,免疫球蛋白与IL-170多肽的融合产物是具有以典型肽键融合的序列的连续蛋白分子,它们通常作为单一翻译产物而制备,并且表现出得自各个源肽的特性。相似的概念适用于异源核酸序列。
另外,可以组合源自其它蛋白的相似的功能域而制备新的构成物。例如,抗原结合区段或其它区段可以在不同的新融合多肽或片段之间“交换”。参见例如Cunningham等(1989)Science 243:1330-1336;和O’Dowd等(1988)J.Biol.Chem.263:15985-15992。因此,表现出新的特异性组合的新嵌合多肽将产生于生物相关结构域和其它功能结构域的功能结合。
由Beaucage和Carruthers(1981)Tetra.Letts.22:1859-1862描述的亚磷酰胺法将产生合适的合成DNA片段。或者通过合成互补链并使所述链在合适的条件下相互退火,或者通过用DNA聚合酶与合适的引物序列,加入互补链(例如PCR技术),通常可获得双链片段。VI.功能变异体
可以由于抑制(例如通过竞争性抑制)所述抗原与其天然结合配偶体的结合,导致阻断对IL-170的生理反应。因此,本发明的体外测定通常使用分离的蛋白、来自表达重组膜结合IL-170蛋白的细胞的膜、包含结合区段的可溶性片段、或连接至固相基质的片段。这些测定也将使得可以对或者结合区段突变和修饰、或者蛋白突变和修饰(例如类似物)的效应进行诊断性测定。
本发明也设想使用竞争性药物筛选测定,例如其中针对抗原或结合配偶体片段的中和抗体与测试化合物竞争与所述蛋白的结合。以这种方式,可以利用所述抗体检测享有所述蛋白的一个或多个抗原结合位点的任何多肽的存在,并且也可以利用所述抗体占据在其它情况下可能与结合配偶体相互作用的该蛋白上的结合位点。
另外,针对所述IL-170蛋白和含有高亲和性受体结合位点的所述抗原的可溶性片段的中和抗体,可以用来抑制组织(例如经历异常生理学的组织)中的抗原功能。
所述IL-170抗原的“衍生物”包括氨基酸序列突变体、糖基化变体、以及与其它化学部分的共价或聚集缀合物。通过采用本领域熟知的方法将官能团(functionality)连接至在所述IL-170氨基酸侧链或于N末端或C末端发现的基团上,可以制备共价衍生物。这些衍生物可以包括但不限于羧基末端或含羧基侧链残基的脂族酯或酰胺、含羟基残基的O-酰基衍生物、以及氨基末端氨基酸或含氨基残基(例如赖氨酸或精氨酸)的N-酰基衍生物。酰基选自烷基部分(包括C3-C18正烷基)的基团,由此形成烷酰基、芳酰基种类。当免疫原部分是半抗原时,与载体蛋白共价结合可能是重要的。
具体地说,糖基化改变包括例如通过在多肽合成和加工期间、或在进一步加工步骤中修饰多肽糖基化模式而产生的糖基化改变。完成这一步特别优选的方法是通过将所述多肽暴露于得自正常提供这种加工的细胞的糖基化酶,例如哺乳动物糖基化酶。也设想了去糖基化酶。也包括具有相同一级氨基酸序列、具有其它微小修饰的形式,所述微小修饰包括磷酸化氨基酸残基,例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸。
主要一组衍生物是所述IL-170蛋白或其片段与其它蛋白或多肽的共价缀合物。这些衍生物可以在重组培养物中合成,例如N末端融合体或C末端融合体,或利用本领域已知在通过反应性侧基交联蛋白中有用的试剂来合成。用交联剂衍生的优选的抗原衍生位点位于游离氨基、糖部分和半胱氨酸残基。
也提供所述IL-170蛋白和其它同源或异源蛋白之间的融合多肽。同源多肽可以是不同表面标记之间的融合体,产生例如表现出受体结合特异性的杂种蛋白。同样,可以构建可能表现出所述衍生蛋白特性或活性组合的异源融合体。典型的实例是报道多肽(例如荧光素酶)与抗原区段或结构域(例如受体结合区段)的融合体,使得可以容易地确定所述融合抗原的存在或位置。参见例如Dull等的美国专利第4,859,609号。其它基因融合配偶体包括细菌β-半乳糖苷酶、trpE、A蛋白、β-内酰胺酶、α淀粉酶、乙醇脱氢酶和酵母α交配因子。参见例如Godowski等(1988)Science 241:812-816。
由Beaucage和Carruthers(1981)Tetra.Letts.22:1859-1862描述的亚磷酰胺法将产生合适的合成DNA片段。或者通过合成互补链并使所述链在合适的条件下相互退火,或者通过用DNA聚合酶与合适的引物序列,加入互补链,通常可获得双链片段。
这样的多肽也可以具有已被化学修饰的氨基酸残基,所述化学修饰通过磷酸化、磺化、生物素化或加入或除去其它部分、特别是分子形状类似于磷酸基团的那些部分而进行的。在某些实施方案中,所述修饰将是有用的标记试剂,或者用作纯化靶,例如亲和配体。
融合蛋白通常通过或者重组核酸法或通过合成多肽法制备。用于核酸操作和表达的技术全面描述于例如Sambrook等(1989)MolecularCloning:A Laboratory Manual(第2版),第1-3卷,Cold Spring HarborLaboratory。用于多肽合成的技术描述于例如Merrifield(1963)J.Amer.Chem.Soc.85:2149-2156;Merrifield(1986)Science 232:341-347;和Atherton等(1989)Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press,Oxford。
本发明也设想使用非氨基酸序列改变或糖基化改变的所述IL-170蛋白的衍生物。这类衍生物可以包括与化学部分的共价或聚集结合。这些衍生物一般分为三类:(1)盐,(2)侧链和末端残基共价修饰,和(3)吸附复合物,例如与细胞膜的吸附复合物。这样的共价或聚集衍生物可用作免疫原、免疫测定中的试剂,或用于诸如亲和纯化抗原或其它结合蛋白的纯化方法中。例如,通过用本领域熟知的方法将IL-170抗原共价结合于诸如溴化氰活化的Sepharose的固相支持体,或通过或不通过戊二醛交联吸附至聚烯烃表面上,可以将IL-170抗原固定化,以用于抗IL-170蛋白抗体或其受体或其它结合配偶体的测定或纯化。所述IL-170抗原也可以用可检测基团标记,例如用氯胺T法放射性碘标记、共价连接于稀土螯合物、或缀合于另一荧光部分,以用于诊断测定。通过固定化抗体或结合配偶体,可以实现IL-170蛋白的纯化。
本发明的溶解的IL-170抗原或片段可以用作免疫原,用于产生对所述蛋白或其片段特异性的抗血清或抗体。纯化的抗原可以用来筛选通过用各种形式的含所述蛋白的不纯制剂免疫而制备的单克隆抗体或结合片段。特别是,术语“抗体”也包括天然抗体的抗原结合片段。纯化的IL-170蛋白也可以用作试剂,以检测对存在水平提高的所述蛋白或含所述抗原的细胞片段应答而产生的任何抗体,所述蛋白或含所述抗原的细胞片段可以是异常或特定的生理学病症或疾病病症是诊断指标(diagnostic)。另外,抗原片段也可以用作产生下文马上要描述的本发明抗体的免疫原。例如,本发明考虑了针对表1-6中所示核苷酸序列编码的氨基酸序列或含有所述序列的蛋白的片段而产生的抗体。特别是,本发明考虑了对预测位于脂双层之外的特定片段具有结合亲和性的抗体或针对所述特定片段产生的抗体。
本发明考虑了另外的密切相关物种变体的分离。DNA印迹分析确立相似的遗传实体存在于其它哺乳动物(例如大鼠和人类)中。可能所述IL-170蛋白广布于物种变体中,其中所述物种例如为啮齿动物、兔形目动物、食肉动物、偶蹄类、奇蹄目和灵长类。
本发明也提供分离一组相关抗原的方法,其中所述相关抗原在结构、表达和功能方面既表现出不同,又表现出相似性。不同物种变体的分离和表征,将大大促进所述抗原的许多生理效应的阐明。特别是,本发明提供用于鉴别不同物种中另外的同源遗传实体的有用探针。
所述分离的基因将使得可以转化缺乏相应IL-170蛋白表达的细胞,例如缺乏相应抗原并表现出阴性背景活性的或者物种类型或者细胞。转化基因的表达将允许分离具有限定的或单一的物种变体的抗原性纯的细胞系。该方法将提供对IL-170蛋白的生理效应更灵敏的检测和鉴别。可以分离并使用亚细胞片段,例如胞质片段或膜片段。
采用现代分子生物学标准技术,特别是在比较相关类别的成员时,解剖影响由所述蛋白提供的各种生理或分化功能的关键结构元件是可能的。参见例如在Cunningham等(1989)Science 243:1339-1336中描述的同系物扫描诱变技术;和O’Dowd等(1988)J.Biol.Chem.263:15985-15992和Lechleiter等(1990)EMBO J.9:4381-4390中所用的方法。
特别是,可以在物种变体之间置换功能结构域或区段,以确定在结合配偶体亲和性和特异性方面以及信号转导方面哪些结构特征是重要的。将使用一系列不同变体来筛选表现出与结合配偶体的不同物种变体相互作用的组合特性的分子。
在某些情况下抗原内化可以发生,以及胞内组分和参与相互作用的蛋白“胞外”区段之间的相互作用可以发生。通过诱变或直接生化方法(例如交联法或亲和法),可以鉴别IL-170与其它胞内组分相互作用的特定区段。也可应用采用晶体学方法或其它物理方法进行的结构分析。生物功能机制的进一步研究,将包括可以通过亲和法或遗传学方法(例如互补分析突变体)研究可分离的结合组分。
我们将继续IL-170蛋白表达和控制的进一步研究。与所述抗原连接的控制元件可以表现出差别发育、组织特异性或其它表达模式。对例如控制元件的遗传区上游或下游很感兴趣。
所述抗原的结构研究将导致设计出新的变异体,特别是对结合配偶体表现出激动剂或拮抗剂特性的类似物。这可以与先前描述的筛选方法结合,以分离表现出所需活性谱的变体。
在其它细胞类型中的表达通常导致特定抗原的糖基化差异。根据非氨基酸序列的结构差异,不同的物种变体可以表现出不同的功能。差别修饰可能负责差别功能,使得所述效应阐明现在成为可能。
因此,本发明提供与抗原-结合配偶体相互作用相关的重要试剂。虽然上述说明主要集中于鼠类IL-170和人IL-170蛋白,但本领域技术人员将立即认识到,本发明包括其它抗原,例如小鼠和其它哺乳动物物种变体或等位基因变体以及它们的变体。VII.抗体
可以产生针对其天然存在形式和其重组形式的各种IL-170蛋白(包括物种变异体或等位基因变异体)及其片段的抗体。另外,可以产生针对或者活性形式或者无活性形式的IL-170蛋白抗体。也考虑了抗独特型抗体。
通过用所述抗原预定片段与免疫原性蛋白的缀合物免疫动物,可以产生针对所述片段的抗体,包括结合片段和单链形式的抗体。由分泌所需抗体的细胞制备单克隆抗体。这些抗体可以根据与正常或缺陷的IL-170蛋白的结合进行筛选,或根据例如通过结合配偶体介导的激动剂或拮抗剂活性进行筛选。这些单克隆抗体通常以至少约1mM的KD结合,其结合KD更通常至少约300μM,典型的至少约10μM,更典型至少约30μM,优选至少约10μM,更优选至少约3μM或更好。
通常在免疫测定中确定与针对限定的免疫原(例如由成熟SEQ IDNO:8的氨基酸序列或其片段组成的免疫原或由SEQ ID NO:7的核酸产生的多肽)而产生的抗体(例如多克隆抗体)特异性结合或特异性免疫反应的IL-170多肽。包括在本发明范围内的是本文描述的那些核酸序列,包括功能变体,所述核酸序列编码与针对本文在结构和功能上限定的原型IL-173、IL-174、IL-176或IL-177多肽产生的多克隆抗体选择性结合的多肽。所述免疫测定通常应用针对例如SEQ ID NO:8的蛋白产生的多克隆抗血清。选择这种抗血清以对合适的其它IL-170家族成员(最好来自相同物种)具有低交叉反应性,并且在用于所述免疫测定之前,通过免疫吸附除去任何这样的交叉反应性。可以分离并表征合适的选择性血清制剂。
为了产生用于免疫测定的抗血清,按照本文所述分离所述蛋白,例如SEQ ID NO:8的蛋白。例如,可以在哺乳动物细胞系中产生重组蛋白。采用标准佐剂,例如弗氏佐剂,以及利用标准小鼠免疫方案(参见Harlow和Lane),用SEQ ID NO:8的蛋白免疫合适的宿主,例如近交品系的小鼠,例如Balb/c。另一方面,可以将衍生自本文所公开序列的基本上全长的合成肽用作免疫原。收集多克隆血清,并在免疫测定中,例如在具有固定于固相支持体上的免疫原的固相免疫测定中,测定针对所述免疫原蛋白的效价。选择效价为104或更高的多克隆抗血清,并采用竞争性结合免疫测定,例如Harlow和Lane(参见上文)在第570-573页中描述的那些测定,测试其针对其它IL-170家族成员(例如IL-171、IL-172或IL-175)的交叉反应性。在该测定中结合所述靶最好使用至少两种IL-170家族成员。这些IL-170家族成员可以作为重组蛋白产生,并用本文描述的标准分子生物学和蛋白化学技术进行分离。因此,可以鉴定并产生对IL-170家族成员亚组具有所需选择性或特异性的抗体制剂。
竞争性结合形式的免疫测定可以用于交叉反应性的测定。例如,可以将成熟SEQ ID NO:8的蛋白固定于固相支持体上。加入该测定中的蛋白与所述抗血清竞争与所述固定化抗原的结合。将上述蛋白与抗血清竞争与固定化蛋白结合的能力与SEQ ID NO:8的蛋白相比。采用标准计算法计算上述蛋白的交叉反应性百分比。选择并合并与每种以上所列蛋白的交叉反应性低于10%的那些抗血清。然后通过用以上所列蛋白进行免疫吸附,从合并的抗血清中除去交叉反应性抗体。
然后将经免疫吸附并合并的抗血清用于如上所述的竞争性结合免疫测定中,以将第二种蛋白与所述免疫原蛋白进行比较。为了进行这种比较,在宽范围的浓度下分别分析所述两种蛋白,并测定抑制抗血清与固定化蛋白结合的50%所需的每种蛋白量。如果第二种蛋白的需要量低于所述蛋白(例如SEQ ID NO:8的蛋白)的需要量的两倍,则所述第二种蛋白被认为是与针对所述免疫原产生的抗体特异性地结合。
本发明的抗体包括抗原结合片段可能具有重大的诊断或治疗价值。它们可能是与结合配偶体结合并抑制抗原结合或抑制抗原引发生物反应的能力的有效的拮抗剂。它们也可以用作非中性抗体,并可以偶联于毒素或放射性核素,使得当所述抗体结合于所述抗原时,杀伤例如在表面上表达所述抗原的细胞。此外,这些抗体可以或者直接或者借助接头间接缀合于药物或其它治疗剂,可以实现药物导向。
本发明的抗体也可用于诊断应用。作为捕获抗体或非中和抗体,可以筛选其结合所述抗原、而不抑制配偶体结合的能力。作为中和抗体,它们可以用于竞争性结合测定。它们也可用于检测或定量测定IL-170蛋白或其结合配偶体。参见例如Chan(编辑1987)Immunoassav:A Practical Guide.Academic Press,Orlando,Fla;和Ngo(编辑1988)Nonisotopic Immunoassay,Plenum Press,NY;和Price和Newman(编辑1991)Principles and Practice of Immunoassay,Stockton Press,NY;。
可以将抗原片段连接至其它物质上,特别是连接至多肽,作为待用作免疫原的融合多肽或共价连接多肽。抗原及其片段可以融合或共价连接至多种免疫原,诸如匙孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、破伤风类毒素等。关于制备多克隆抗血浆的方法的描述,参见Microbiology,Hoeber Medical Division,Harper和Row,1969;Landsteiner(1962)Specificity of Serological Reactions,Dover Publications,New York;和Williams等(1967)Methods in Immunology and Immunochemistry,第1卷,Academic Press,New York。典型的方法包括用抗原超免疫动物。然后在重复免疫后不久,收集该动物的血液,并分离γ球蛋白。
在某些情况下,最好从各种哺乳动物宿主制备单克隆抗体,所述哺乳动物宿主诸如小鼠、啮齿动物、灵长类、人类等。在例如Stites等(编辑)Basic and Clinical Immunology,(第4版),Lange MedicalPublications,Los Altos,CA和其中引用的参考文献;Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,CSH Press;Goding(1986)Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(第2版),Academic Press,New York中;和特别是在Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495-497中(该文献讨论了产生单克隆抗体的一种方法),可以找到制备这类单克隆抗体的技术的描述。总而言之,该方法包括给动物注射免疫原。然后处死该动物并从其脾脏中取出细胞,然后将所述细胞与骨髓瘤细胞融合。结果是杂种细胞或“杂交瘤”,它能够在体外繁殖。然后筛选杂交瘤群体,以分离各个克隆,每种所述克隆分泌抗所述免疫原的单一抗体种类。以该方式,所获得的各个抗体种类是来自所述免疫动物、对在免疫原性物质上识别的特定位点应答产生的无限增殖化的或克隆的单一B细胞的产物。
其它合适的技术涉及将淋巴细胞体外暴露于抗原多肽,或者暴露于噬菌体或相似载体中抗体文库的选择。参见Huse等(1989)“在噬菌体λ中产生免疫球蛋白所有组成组分的大联合文库”,Science246:1275-1281;和Ward等(1989)Nature 341:544-456。本发明的多肽和抗体可以经修饰或不修饰而使用,包括嵌合抗体或人源化抗体。通常通过或者共价或者非共价连接提供可检测信号的物质,来标记所述多肽和抗体。种类繁多的标记和缀合技术是已知的,并且在科学文献和专利文献中进行了广泛的报道。合适的标记包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光部分、化学发光部分、磁性粒子等。指出这类标记用途的专利包括美国专利第3,817,837;3,850,752;3,939,350;3,996,345;4,277,437;4,275,149;和4,366,241号。也可以产生重组免疫球蛋白,参见Cabilly的美国专利第4,816,567号。
本发明的抗体也可以用于分离所述蛋白的亲和层析。当将所述抗体连接至固相支持体(例如粒子,诸如琼脂糖、Sephadex等)时,可以制备柱子,其中可以使细胞裂解液通过该柱,将该柱洗涤,然后增加温和变性剂的浓度,由此将释放所纯化的IL-170蛋白。
也可以用所述抗体,根据特定表达产物筛选表达文库。通常,用于这种方法中的抗体用允许通过抗体结合容易地检测出抗原存在的部分来标记。
针对每种IL-170蛋白产生的抗体也可以用来产生抗独特型抗体。这些抗体可用于检测或诊断与所述相应抗原表达相关的各种免疫学病症。VIII.用途
本发明提供将应用于本文其它地方描述的诊断应用的试剂,所述描述例如关于生理异常或发育异常的一般描述,或以下关于诊断试剂盒的描述。
本发明也提供具有重大治疗价值的试剂。所述IL-170(天然存在的或重组的)、其片段及其抗体与被鉴定为对IL-170蛋白具有结合亲和性的化合物,应该可用作治疗与异常生理学(包括异常增生)或发育相关的病症,例如癌症或变性性病症。通过采用本文提供的组合物进行适当的治疗性治疗,可以对异常增生、再生、变性和萎缩进行调节。例如,与异常表达或IL-170抗原的异常信号相关的疾病或紊乱应该是所述蛋白的激动剂或拮抗剂的靶。
已知在通过RNA印迹分析表现出具有IL-170抗原mRNA的细胞类型中的其它异常发育性病症。参见Berkow(编辑)The Merck Manualof Diagnosis and Therapy,Merck & Co.,Rahway,N.J.;和Thorn等,Harrison’s Principles of Internal Medicine,McGraw-Hill,N.Y.。这些问题可能对利用本文提供的组合物的预防或治疗敏感。
可以纯化与IL-170结合的重组抗体,然后将其给予患者。可以例如在常规药学上可接受的载体或稀释剂(例如免疫原性佐剂)中,将这些试剂联合另外的活性或惰性组分以及生理上无毒的稳定剂和赋形剂,用于治疗用途。可以将这些组合物过滤除菌,将这些组合物通过在剂量管制瓶中冻干或贮存于稳定化水性制剂中,以剂量形式放置。本发明也设想了包括非补体结合形式在内的抗体或其结合片段的应用。
可以进行用IL-170筛选结合配偶体或对IL-170抗原具有结合亲和性的化合物,包括相关组分的分离。然后,可以利用后续的生物测定,确定所述化合物是否具有内在生物活性,并且是否由此因为阻断所述抗原活性而为激动剂剂或拮抗剂。本发明还设想了抗IL-170蛋白抗体作为拮抗剂的治疗用途。该方法应该对于其它IL-170蛋白的物种变体特别有用。
有效治疗必需的试剂量将取决于许多不同因素,包括给药方法、靶部位、所述患者的生理状况和给予的其它药物。因此,应该确定治疗剂量,以优化安全性和效力。通常,体外所用的剂量可以在原位给予这些试剂的用量方面提供有用的指南。治疗特定疾病的有效量的动物测试将提供进一步的人类剂量的预测性指标。例如在Gilman等(编辑1990)Goodman and Gilman’s:The Pharmacological Bases ofTherapeutics,第8版,Pergamon Press;和Remington’s PharmaceuticalSciences,第17版,(1990),Mack Publishing Co.,Easton,Penn中,描述了各种考虑。其中以及下文讨论了给药方法,例如经口、静脉内、腹膜内或肌内给药、透皮扩散和其它给药方法。也参见Langer(1990)Science 249:1527-1533。药学上可接受的载体将包括水、盐水、缓冲液和例如在Merck Index,Merck & Co.,Rahway,New Jersey中描述的其它化合物。通常预计具有合适载体的剂量范围为低于1mM浓度的量,通常低于约10μM浓度,常常低于约100nM,优选低于约10pM(皮摩尔浓度),最优选低于约1fM(费摩尔浓度)。缓释制剂或缓释装置通常用于持续给药。
IL-170蛋白、其片段、其抗体或抗体片段、拮抗剂和激动剂,可以直接给予待治疗宿主,或根据所述化合物的大小,可能最好在给予它们之前,将它们缀合于诸如卵清蛋白或血清白蛋白的载体蛋白。治疗制剂可以以任何常规剂量制剂给予。尽管可能单独给予所述活性组分,但最好将其作为药用制剂给予。制剂通常包含至少一种以上定义的活性组分与其一种或更多种可接受的载体。在与其它组分相容并且对所述患者无害的意义上,每种载体应该是药学上和生理上可接受的。制剂包括适用于经口、直肠、鼻或胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)给药的制剂。所述制剂可以方便地以单位剂型给予,并且可以用药学领域熟知的任何方法制备。参见例如Gilman等(编辑1990)Goodman and Gilman’s:The Pharmacological Bases of Therapeutics,第8版,Pergamon Press,Parrytown,NY;Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版,(1990),Mack Publishing Co.,Easton,Penn.;Avis等(编辑1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,第2版,Dekker,NY;Lieberman等(编辑1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,第2版,Dekker,NY;和Lieberman等(编辑1990)Pharmaceutical DosageForms:Disperse Systems Dekker,NY。本发明的疗法可以与其它治疗剂联合,或结合其它治疗剂使用,其它治疗剂包括细胞因子、试剂。
天然存在形式和重组形式的本发明IL-170蛋白在能够筛选对所述蛋白有结合活性的化合物的试剂盒和测定方法中特别有用。最近数年已经开发了几种自动测定方法,以便使得可以在短时间内筛选数万种化合物。参见例如Fodor等(1991)Science 251:767-773,该文献描述了用于通过在固相支持体上合成的多种限定聚合物测试结合亲和性的方法。如本发明提供的大量纯化、可溶性IL-170蛋白的可得性,可以大大促进合适测定的开发。
本发明在通过在多种药物筛选技术中任一种中应用重组抗原筛选化合物方面特别有用。在筛选特异性配体中使用重组蛋白的优点包括:(a)来自特定来源的所述抗原的可更新来源的改进;(b)每个细胞抗原分子数潜在地更大,在测定中产生的信号与噪声之比更好;和(c)物种变体特异性(理论上产生更高的生物特异性和疾病特异性)。所述纯化的蛋白可以在多种测定中测试,通常在体外测定中测试,评估生物相关的反应。参见例如Coligan Current Protocols in Immunology;Hood等Immunology Benjamin/Cummings;Paul(编辑)FundamentalImmunology;和Methods in Enzymology Academic Press。
一种药物筛选方法利用表达所述IL-170抗原的重组DNA分子稳定转化的真核或原核宿主细胞。可以分离表达与其它功能等同抗原分离的抗原的细胞。或者活细胞形式或者固定形式的这种细胞可以用于标准的蛋白-蛋白结合测定。也参见Parce等(1989)Science 246:243-247;和Owicki等(1990)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 87:4007-4011,所述文献描述了测定细胞反应的灵敏方法。在所述细胞(IL-170蛋白来源)与标记结合配偶体或者对该配体具有已知结合亲和性的抗体(例如125I抗体)以及正在测定与所述结合组合物的结合亲和性的试验样品接触并一起温育时,竞争性测定特别有用。然后分离结合的和游离的标记结合组合物,以评价抗原结合程度。结合的试验化合物的量与标记受体与所述已知来源的结合量成反比。可以使用多种技术中的任一种,将结合的抗原与游离抗原分离,以评价结合程度。这种分离步骤可能通常涉及诸如以下的一种方法:粘附到滤膜上,然后洗涤;粘附到塑料上,然后洗涤;或将细胞膜离心。也可以用活细胞筛选药物对IL-170蛋白介导的功能的效应,例如第二信使水平,即Ca++;细胞增殖;肌醇磷酸库改变;和其它效应。某些检测方法便于消除分离步骤,例如亲近敏感性检测系统。钙敏感染料可用来利用荧光计或荧光细胞分类装置检测Ca++水平。
另一种方法利用来自转化的真核生物或原核生物宿主细胞的膜作为所述IL-170蛋白源。用指导膜结合IL-170蛋白(例如工程膜结合形式)的表达的DNA载体稳定转化这些细胞。实质上,能够由所述细胞制备所述膜,并将其用于任何受体/配体类型的结合测定,例如上述的竞争性测定。
再一种方法是利用来自转化真核生物或原核生物宿主细胞的溶解的、未纯化的或溶解的纯化IL-170蛋白。这可供用于“分子”结合测定,优点是特异性提高,能够自动进行,并且是药物测试高通量的。
用于药物筛选的另一技术涉及一种方法,该方法提供对IL-170具有合适结合亲和性的化合物的高通量筛选,该方法详细描述于1984年9月13日公开的Geysen的欧洲专利申请84/03564。首先,在例如塑料钉或某些其它合适表面的固体基质上合成大量的不同小肽试验化合物,参见Fodor等(1991)。然后,使所有钉与溶解的未纯化或溶解的纯化IL-170结合组合物反应,然后洗涤。下一步涉及测定结合的结合组合物。
合理的药物设计也可以基于所述IL-170蛋白或其它效应物或类似物的分子形状的结构研究。效应物可以是对抗原结合应答而介导其它功能的其它蛋白,或为正常与所述抗原相互作用的其它蛋白。用于确定哪些位点与特定的其它蛋白相互作用的一种方法是物理结构测定,例如X射线晶体学或二维NMR技术。这些将为哪些氨基酸残基形成分子接触区提供指南。关于蛋白结构测定的详细描述,参见例如Blundell和Johnson(1976)Protein Crystallography,Academic Press,NewYork。
可以将纯化的IL-107蛋白直接包被到板上,用于上述药物筛选技术。然而,可以用这些配体的非中和性抗体作为捕获抗体,以将所述相应的配体固定到固相支持体上。IX.试剂盒
本发明也设想了IL-170蛋白、其片段、肽和它们的融合产物在用于检测结合组合物存在的多种诊断试剂盒和方法中的用途。通常,所述试剂盒会具有含或者特定IL-170肽或基因区段或者识别一种或另一种(例如抗原片段或抗体)的试剂的区室。
用于测定试验化合物对IL-170蛋白的结合亲和性的试剂盒通常包含:一种试验化合物;一种标记化合物,例如对所述抗原具有已知结合亲和性的一种抗体;一种IL-170蛋白源(天然存在的或重组的);和用于将结合的标记化合物与游离标记化合物分离的工具,例如用于将该抗原固定化的固相。一旦筛选出化合物,则可以在本领域熟知的合适的生物测定中评估对该抗原具有合适结合亲和性的那些化合物,以测定它们是否表现出与天然抗原相似的生物活性。重组IL-170蛋白多肽的可得性也提供了很好确定的校准这类测定的标准。
用于测定样品中例如IL-170蛋白浓度的优选试剂盒通常包含:一种标记化合物,例如对所述抗原具有已知结合亲和性的抗体;一种抗原源(天然存在的或重组的)和一种将结合标记化合物与游离标记化合物分离的工具,例如用于将所述IL-170蛋白固定化的固相。通常提供含试剂的区室和说明。
用于测定样品中IL-170蛋白浓度的一种方法通常包括以下步骤:(1)由包含膜结合IL-170蛋白源的样品制备膜;(2)洗涤所述膜并将其悬浮于缓冲液中;(3)通过将所述膜在已经加入合适去垢剂的培养基中温育,溶解所述抗原;(4)调节所述溶解的抗原的去垢剂浓度;(5)使所述稀释液与放射标记的抗体接触并一起温育,以形成复合物;(6)回收所述复合物,例如通过聚乙烯亚胺处理的滤膜过滤来回收;和(7)测定所回收的复合物的放射性。
包括抗原结合片段在内的所述IL-170蛋白或片段的特异性抗体,可用于检测水平提高的IL-170蛋白和/或其片段存在的诊断应用。这类诊断测定可以使用裂解液、活细胞、固定细胞、免疫荧光、细胞培养物、体液,还可以涉及血清中与所述蛋白相关的抗原的检测等。诊断测定可以是均相(在游离试剂和蛋白-蛋白复合物之间无分离步骤)或异相的(有分离步骤)。存在各种商业测定,诸如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(ELA)、酶倍增免疫测定(enzyme-multiplied immunoassay)技术(EMIT)、底物标记荧光免疫测定(SLFIA)等。例如可以通过用标记的并识别抗IL-170蛋白或其特定片段的抗体的第二抗体,利用未标记抗体。在文献中也已经在多方面讨论了相似的测定。参见例如Harlow和Lane(1988)Antibodies:A LaboratoryManual,CSH。
抗独特型抗体可以相似地用来诊断抗IL-170蛋白的抗体的存在,这样可以诊断各种异常状态。例如,IL-170蛋白的超量产生可能导致产生可能是异常生理状况诊断标志的各种免疫反应,所述异常生理状况特别是增生性细胞病症(诸如癌症)或异常分化。
通常,用于诊断测定的试剂在试剂盒中供应,以便使该测定的灵敏度最佳化。对于本发明,根据该测定的性质,提供所述方案和所述标记,所述标记或者标记或未标记的抗体,或者标记的IL-170蛋白。这通常与其它添加剂结合,所述添加剂诸如缓冲液、稳定剂、信号产生必需的物质,诸如酶的底物等。所述试剂盒最好也含有正确使用和使用后正确处理内容物的说明。所述试剂盒通常具有每种有用试剂的区室。当所述试剂可以在水性介质中重建,提供进行该测定的合适试剂浓度时,所述试剂最好是作为干燥的冻干粉提供。
所述药物筛选和所述诊断测定的任一上述组分可以不经修饰而使用,或可以以多种方式进行修饰。例如,通过共价或非共价结合直接或间接提供可检测信号的部分,可以达到标记。在这些测定中的任一种中,可以或者直接或间接地标记所述抗原、试验化合物、IL-170蛋白或其抗体。直接标记的可能性包括标记基团:诸如125I的放射标记;酶(美国专利第3,645,090号),诸如过氧化物酶和碱性磷酸酶;和能够监测荧光强度、波长移动或荧光偏振方面变化的荧光标记(美国专利第3,940,475号)。间接标记的可能性包括将一种组分生物素化,然后结合于偶联至一种上述标记基团的抗生物素蛋白。
也有分离结合抗原与游离抗原、或者分离结合试验化合物与游离试验化合物的许多方法。可以将所述IL-170蛋白固定于各种基质上,然后进行洗涤。合适的基质包括诸如ELISA板的塑料、滤膜和珠粒。将所述IL-170蛋白固定到基质上的方法包括但不限于直接粘附至塑料、应用捕获抗体、化学偶联和生物素-抗生物素蛋白。该途径中的最后一步涉及通过几种方法中的任一种来沉淀蛋白-蛋白复合物,所述方法包括利用例如有机溶剂(例如聚乙二醇)或盐(例如硫酸铵)的那些方法。其它合适的分离技术包括但不限于Rattle等(1984)Clin.Chem.30:1457-1461中描述的荧光抗体可磁化微粒法、以及美国专利第4,659,678号中描述的双抗体磁粒子分离法。
在所述文献中已经广泛报道了用于将蛋白或其片段交联于各种标记的方法,在此不需要详细讨论。这些技术中的许多技术涉及或者通过碳二亚胺或者活性酯来应用活化羧基,形成肽键;通过巯基与活化卤素(诸如氯乙酰)或活化烯烃(诸如马来酰亚胺)反应形成硫醚,以用于连接等。融合蛋白也可应用于这些应用中。
本发明的另一诊断方面涉及应用取自IL-170蛋白序列的寡核苷酸序列或多核苷酸序列。这些序列可以用作探针,以检测怀疑患有异常病症(例如癌症或发育问题)患者样品中抗原信息的水平。RNA和DNA核苷酸序列的制备、所述序列的标记和所述序列的优选大小在所述文献中有大量的描述和讨论。通常,寡核苷酸探针应该具有至少约14个核苷酸,通常至少约18个核苷酸,所述多核苷酸探针可以多至数千碱基。可以采用各种标记,最常用的标记是放射性核素,特别是32P。然而,也可以使用其它技术,例如采用生物素修饰的核苷酸以用于引入多核苷酸中。然后所述生物素用作与抗生物素蛋白或抗体结合的位点,所述抗生物素蛋白或抗体可以用各种各样的标记来标记,所述标记例如放射性核素、荧光剂、酶等。另一方面,可以使用识别特定双链体的抗体,所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体、DNA-RNA杂种双链体或DNA-蛋白双链体。所述抗体进而又可以被标记,并且进行所述测定,其中所述双链体结合于表面上,使得当所述表面上形成双链体时,可以检测到结合于所述双链体的抗体的存在。可以以任何常规技术,例如核酸杂交、正和负筛选、重组探测、杂交体释放翻译(HRT)和杂交体扣留翻译(HART),进行针对所述新反义RNA的探针的应用。这也包括扩增技术,例如聚合酶链式反应(PCR)。另一种方法利用:例如反义核酸,包括引入双链RNA(dsRNA)以遗传干扰基因功能,如例如描述于Misquitta等(1999)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 96:1451-1456;和/或核酶,以阻断特定IL-170 mRNA的翻译。应用反义方法以抑制基因的体外翻译是本领域众所周知的。Marcus-Sakura(1988)Anal.Biochem.172:289;Akhtar(编辑1995)DeliveryStrategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics CRC Press,Inc.。
也设想了也测试其它标记定性或定量存在的诊断试剂盒。诊断或预后可能取决于用作标记的多种指标的组合。因此,试剂盒可以测试标记的组合。参见例如Viallet等(1989)Progress in Growth Factor Res.1:89-97。
参考以下实施例可最好地理解本发明的广大范围,所述实施例不是用来将本发明限制于具体的实施方案。
                        实施例I.通用方法
在Maniatis等(1982)Molecular Cloning:A Laboratory Manual ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Press;Sambrook等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版)第1-3卷,CSH Press,NY;Ausubel等,Biology Greene Publishing Associates,Brooklyn,NY;或Ausubel等(1987和增补本)Current Protocols in Molecular BiologyGreene/Wiley,New York;Innis等(编辑1990)PCR Protocols:A Guide toMethods and Applications Academic Press,N.Y.;和Kohler等(1995)Quantitation of mRNA by Polymerase Chain Reaction Springer-Verlag,Berlin中,描述或引用的许多所述标准方法。用于蛋白纯化的方法包括诸如硫酸铵沉淀、柱层析、电泳、离心、结晶的方法和其它方法。参见例如Ausubel等(1987和定期增补本);Deutscher(1990)“蛋白纯化指南”,载于Methods in Enzymology第182卷和该系列中的其它卷;和例如Pharmacia,Piscataway,N.J.或Bio-Rad,Richmond,CA的生产商关于蛋白纯化产品使用的文献。与重组技术结合,使得可以与合适区段融合,例如与FLAG序列或可以通过蛋白酶可去除序列融合的相当序列融合。参见例如Hochuli(1989)Chemische Industrie 12:69-70;Hochuli(1990)“用金属螯合吸收剂纯化重组蛋白”,载于Setlow(编辑)GeneticEngineering,Principle and Methods 12:87-98,Plenum Press,N.Y.;和Crowe等(1992)QIAexpress:The High Level Expression & ProteinPurification System QUIAGEN,Inc.,Chatsworth,CA。
通过引用也结合到本文中的是涉及IL-171和IL-175细胞因子的相似的专利申请,所述申请的代理律师登记号为DX0918P,在同该专利申请的同一日期申请。
例如在Hertzenberg等(编辑1996)Weir’s Handbook of ExperimentalImmnology第1-4卷,Blackwell Science;Coligan(1991)CurrentProtocols in Immunology Wiley/Greene,NY;和Methods in Enzymology第70、73、74、84、92、93、108、116、121、132、150、162和163卷中,描述了标准免疫学技术。例如在Thomson(编辑1998)The Cytokine Handbook(第3版)Academic Press,San Diego;Mire-Sluis和Thorpe(1998)Cytokines Academic Press,San Diego;Metcalf和Nicola(1995)The Hematopoietic Colony Stimulating Factors CambridgeUniversity Press;以及Aggarwal和Gutterman(1991)Human CytokinesBlackwell Pub.中,描述了细胞因子测定。
血管生物活性的测定是本领域熟知的。它们包括肿瘤或其它组织(例如动脉平滑肌)增生(参见例如Koyoma等(1996)Cell 87:1069-1078)、单核细胞粘着于血管上皮(参见McEvoy等(1997)J.Exp.Med.185:2069-2077)等中的血管生成活性和血管抑制(angiostatic)活性。也参见Ross(1993)Nature 362:801-809;Rekhter和Gordon(1995)Am.J.Pathol.147:668-677;Thyberg等(1990)Atherosclerosis 10:966-990;和Gumbiner(1996)Cell 84:345-357。
例如在Wouterlood(编辑1995)Neuroscience Protocols modules 10,Elsevier;Methods in Neurosciences Academic Press;和NeuromethodsHumana Press,Totowa,NJ中,描述了用于神经细胞生物活性的测定。例如在Meisami(编辑)Handbook of Human Growth and DevelopmentalBiology CRC Press;和Chrispeels(编辑)Molecular Techniques andApproaches in Developmental Biology Interscience中,描述了发育系统的方法学。
例如采用可得到软件程序,包括得自GCG (U.Wisconsin)和GenBank来源的软件程序,进行计算机序列分析。也可以利用例如来自GenBank和其它的公共序列数据库。
可用于IL-170的许多技术可以应用于这些新实体,如例如在USSN中描述的,其中每种技术通过引用结合到本文中以用于所有目的。
在Melamed等(1990)Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss,Inc.,New York,NY;Shapiro(1988)Practical Flow Cytometry Liss,New York,NY;和Robinson等(1993)Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss,New York,NY中,描述了FACS分析。II.编码IL-170蛋白的DNA克隆的分离
在Rouvier等(1993)J.Immunol.150:5445-5456中描述了鼠类CTLA-8的分离。相似的方法可用于分离所述IL-173、IL-174、IL-176和IL-177以及所述IL-171、IL-172和IL-175的物种对应物。所述IL-170信息源
用合适的探针筛选高水平信息表达的各种细胞系。根据所述合适的IL-170信息的表达水平,选择合适的细胞系。IL-170编码克隆的分离
用标准PCR技术,从基因组文库或cDNA文库、或mRNA中扩增IL-170基因序列。获得人基因组文库或cDNA文库,并用合适的cDNA或合成探针进行筛选。可以制备PCR引物。例如从所提供的序列中,选择合适的引物,并分离全长克隆。可以制备各种长度且可能具有序列差异的引物的各种组合。可以用所述全长克隆作为杂交探针,以用严格性杂交条件或严格性较低的杂交条件筛选其它同系物基因。
在另一种方法中,用寡核苷酸筛选文库。结合聚合酶链式反应(PCR)技术,将合适方向的合成寡核苷酸用作引物,以从文库中选择正确的克隆。III.IL-170蛋白的生化表征
将IL-170蛋白在异源细胞中表达,所述IL-170蛋白例如为天然形式或在羧基末端表现出FLAG肽的重组形式。参见例如Crowe等(1992)QIAexpress:The High Level Expression and Protein Purification SystemQIAGEN,Inc.Chatsworth,CA;和Hopp等(1988)Bio/Technology6:1204-1210。将这两种形式分别引入表达载体中,例如pME18S或pEE12,随后将其转染到合适的细胞中,例如COS-7或NSO细胞。在补充10%胎牛血清的RPMI培养基中将电穿孔细胞培养例如48小时。然后将细胞与35S-Met和35S-Cys一起温育,以便标记细胞蛋白。在SDS-PAGE上还原条件下的所述蛋白的比较应该表明,用全长克隆转染的细胞应该分泌合适大小(例如约15,000道尔顿)的多肽。用内切糖苷酶处理将证明是否有N-糖基化形式。IV.IL-170的大规模生产、纯化
对于生物测定,例如用在补充1%Nutridoma HU (BoehringerMannheim,Mannheim,德国)的RPMI培养基中生长的转染的COS-7细胞,大量生产哺乳动物IL-170,并随后将其纯化。纯化可以使用利用抗体的亲和层析,或例如利用抗体的蛋白纯化技术,以测定分离特性。
为了产生大量的天然蛋白,可以按照Celltech开发的方法(Slough,Berkshire,UK;国际专利申请WO86/05807、WO87/04462、WO89/01036和WO89/10404),制备NSO细胞的稳定转化体。
通常,使1升含有人IL-173或IL-173-FLAG的上清液通过例如60ml移植至螯合型Sepharose Fast Flow基质(Pharmacia,Upsalla,瑞士)的Zn++离子柱上。用10倍体积结合缓冲液(His结合缓冲液试剂盒,Novagen,Madison,WI)洗涤后,用20-100mM咪唑梯度洗脱出由所述金属离子保留的蛋白。采用抗FLAG单克隆抗体M2(Eastman Kodak,New Haven,CT),通过斑点印迹法测定所洗脱出的部分中人IL-173-FLAG的含量,而通过非还原性SDS-PAGE的银染,评价人IL-173的含量。然后将含所述IL-170的部分合并,并对PBS透析,然后或者用于生物测定中,或者进一步纯化,例如通过DEAE柱上的离子交换HPLC纯化。可以在SUPERDEX G-75 HRD30柱(Pharmacia Uppsala,瑞士)上进行第三步的凝胶过滤层析。可以例如通过银染的SDS-PAGE评估纯化。V.抗IL-173抗体的制备
在第0天,用例如在弗氏完全佐剂中乳化的1ml纯化的人IL-173FLAG腹膜内免疫近交Balb/c小鼠,并在第15天和第22天用在弗氏不完全佐剂中乳化的1ml纯化的人IL-173 FLAG免疫近交Balb/c小鼠。小鼠以静脉内给予的0.5ml纯化的人IL-173加强。
收集多克隆抗血清。可以将血清纯化为抗体。可以将所述抗体进一步加工,例如加工为Fab、Fab2、Fv或相似的片段。
用例如非分泌性骨髓瘤细胞系SP2/0-Ag8,并用聚乙二醇1000(Sigma,St.Louis,MO)作为融合剂,产生杂交瘤。将杂交瘤细胞置于96孔Falcon组织培养板(Becton Dickinson,NJ)中,并用补充80μg/ml庆大霉素、2mM谷氨酰胺、10%马血清(Gobco,Gaithersburg,MD)、1%ADCM(CRTS,Lyon,法国)、10-5M重氮丝氨酸(Sigma,St.Louis,MO)和5×10-5M次黄嘌呤的DMEM F12(Gibco,Gaithersburg,MD)饲喂杂交瘤细胞。利用丙酮固定的人IL-173转染的COS-7细胞,通过免疫细胞化学(ICC)以及用从COS-7上清液中纯化的人IL-173-FLAG作为包被抗原,通过ELISA,筛选产生抗人IL-173抗体的杂交瘤上清液。将等份的阳性细胞克隆扩增6天,并将其深低温保存,以及将其在15天之前已经接受姥鲛烷(2,6,10,14-四甲基十五烷,Sigma,St.Louis,MO)腹膜内注射的姥鲛烷处理的Balb/c小鼠的腹水中繁殖。通常,腹膜内给予1ml PBS中的约105杂交瘤细胞,10天后,从每只小鼠收集腹水。
将腹水离心后,通过硫酸铵沉淀和在用20mM Tris pH 8.0平衡的Zephyr-D硅柱(IBF Sepracor)上的离子交换层析,分离抗体部分。用NaCl梯度(范围为0-1 M NaCl)洗脱蛋白。收集2ml部分,并通过ELISA测试抗IL-173抗体的存在。将含有特异性抗IL-173活性的部分合并、透析和冷冻。可以用过氧化物酶标记等份的所述纯化单克隆抗体。
可以将多克隆或单克隆的抗体制剂交叉吸附、消耗或混合,以产生表现出所需选择性和特异性组合的试剂。可以将限定的特定抗原固定至固相基质上,用来选择性地消耗或根据所需的结合能力进行选择。VI.人IL-173的定量
在IL-173特异性抗体中,选择合适的克隆分离物,以采用夹层技术定量测定人IL-173的水平。将纯化的抗体在包被缓冲液(碳酸缓冲液pH 9.6,15mM Na2CO3、35mM NaHCO3)中以例如2μg/ml稀释。将这种稀释溶液于室温下过夜包被到96孔ELISA板(ImmunoplateMaxisorp F96 certified,NUNC,丹麦)的各孔上。然后例如用由磷酸缓冲盐溶液和0.05%吐温20(Technicon Diagnositics,USA)组成的洗涤缓冲液进行人工洗涤所述板。将110μl在TBS-B-T缓冲液[20mM Tris、150mM NaCl、1%BSA(Sigma,St.Louis,MO)和0.05%吐温20]中稀释的纯化人CTLA-8加入各孔中。于37℃温育3小时后,将所述板洗涤1次。将100μl在TBS-B-T缓冲液中稀释至5μg/ml的过氧化物酶标记的Ab加入各孔中,并于37℃温育2小时。然后在洗涤缓冲液中将各孔洗涤3次。将100μl在柠檬酸/磷酸缓冲液中稀释至1mg/ml的过氧化物酶底物2,2’连氮基-双(3-乙基苯并thiazoine-6-磺酸)(ABTS)加入各孔中,并读出405nm下的比色反应读数。VII.IL-170基因的分布
从来源于得自癫痫患者脑前额皮质cDNA文库的序列中,鉴定出人IL-173。从来自耳蜗、大脑、小脑、眼、肺和肾的cDNA文库中得到大鼠IL-173。再者,所述基因看来是相当罕见的,这提示所述表达分布可能是高度受限制的。
从来源于得自小鼠胚胎的cDNA文库的序列中,鉴定出小鼠IL-174。该基因看来是相当罕见的,这提示所述表达分布可能是高度受限制的。
从来源于程序性细胞死亡T细胞的序列中,鉴定出人IL-171。该基因看来是相当罕见的,这提示所述表达分布可能是高度受限制的。
从来源于人胎儿心、肝和脾、胸腺、胸腺肿瘤和全胎儿的序列中,鉴定出人IL-172。从来源于小鼠胚胎、乳腺和混合器官的序列中得到小鼠IL-172。这两种基因看来是相当罕见的,这提示它们的表达分布可能是高度受限制的。
从来源于12小时硫尿嘧啶活化的T细胞的序列中,鉴定出人IL-175。该基因看来是相当罕见的,这提示所述表达分布可能是高度受限制的。VIII.IL-170基因的染色体作图
使用编码合适IL-170基因的分离的cDNA。染色体作图是一种标准技术。参见例如BIOS Laboratories(New Haven,CT)和采用一组小鼠体细胞杂种和PCR的方法。
人IL-173作图至人染色体13q11。IX.IL-170同系物的分离
使用结合组合物(例如抗体)筛选由表达IL-170蛋白的细胞系制备的表达文库。用标准染色技术,对胞内或表面表达的抗原进行检测或分类,或通过淘选筛选表面表达的转化细胞。用各种染色方法或免疫荧光方法,进行胞内表达的筛选。也参见MeMahan等(1991)EMBO J.10:2821-2832。
可应用相似的方法来分离或者物种变体或者等位基因变体。采用基于来自一个物种作为探针的全长分离物或片段、或来自合适物种的全长分离物或片段的交叉物种杂交,分离物种变体。X.IL-170受体的分离
可使用用于筛选有表达潜在IL-170受体的细胞系制备的表达文库的方法。如上所述产生标记的IL-170配体。用标准染色技术来检测表面表达的受体或将其分类,或通过淘选筛选表面表达的转化细胞。也参见McMahan等(1991)EMBO J.10:2821-2832。
例如,在第0天,用1ml/室10ng/ml纤联蛋白的PBS于室温下预包被2室permanox玻片30分钟。用PBS冲洗1次。然后,以2-3×105细胞/室将COS细胞平板接种到1.5ml生长培养基中。于37℃温育过夜。
对于每种样品,在第1天,制备0.5ml含66μg/ml DEAE-葡聚糖、66μM氯喹和4μg DNA的无血清DME溶液。对于每组,制备例如huIL-170-FLAG cDNA的1和1/200稀释度的阳性对照以及一个阴性模拟。用无血清DME冲洗细胞。加入所述DNA溶液,并于37℃温育5小时。除去培养基,并加入0.5ml 10%DMSO的DME达2.5分钟。除去DME并用DME洗涤1次。加入1.5ml生长培养基并温育过夜。
第2天,更换培养基。第3天或第4天,将细胞固定并染色。用Hank缓冲盐溶液(HBSS)冲洗所述细胞2次,并在4%低聚甲醛(PFA)/葡萄糖中固定5分钟。用HBSS洗涤3次。在除去所有液体后,将玻片贮藏于-80℃。对于每个室,如下进行0.5ml的温育。加入HBSS/皂苷(0.1%)和32μl/ml 1M NaN3达20分钟。然后用HBSS/皂苷洗涤细胞1次。将可溶性抗体加入细胞中并温育30分钟。用HBSS/皂苷洗涤细胞2次。加入第二抗体,例如Vector抗小鼠抗体的1/200稀释液并温育30分钟。制备ELISA溶液,例如Vector Elite ABC辣根过氧化物酶溶液,并预温育30分钟。每2.5ml HBSS/皂苷使用例如1滴溶液A(抗生物素蛋白)和1溶液B(生物素)。用HBSS/皂苷将细胞洗涤2次。加入ABC HRP溶液,并温育30分钟。用HBSS洗涤细胞2次,第二次洗涤2分钟,这将细胞封闭。然后加入Vector二氨基苯甲酸(DAB)达5-10分钟。每5ml玻璃蒸馏水使用2滴缓冲液加上4滴DAB加上2滴H2O2。小心地除去室,并在水中冲洗玻片。风干数分钟,然后加入1滴Crystal Mount并加上盖玻片。于85-90℃烘烤5分钟。
另一方面,用所标记的配体来亲和纯化或分选出表达所述受体的细胞。参见例如Sambrook等或Ausubel等。
本文引用的所有参考文献均通过引用结合到本文中,其程度与具体和单独地表明每个单独的出版物或专利申请通过引用结合到本文中的程度一样。
可以对本发明进行许多修改和变化,而不偏离本发明的精神和范围,这对于本领域技术人员是显而易见的。提供本文描述的具体实施方案仅仅是举例说明,本发明仅受所附权利要求书的条款以及这些权利要求赋予的相当物的全部范围的限制。
序列表SEQ ID NO:1是灵长类IL-172核酸序列。SEQ ID NO:2是灵长类IL-172多肽序列。SEQ ID NO:3是鼠类IL-172核酸序列。SEQ ID NO:4是鼠类IL-172多肽序列。SEQ ID NO:5是灵长类IL-173核酸序列。SEQ ID NO:6是灵长类IL-173多肽序列。SEQ ID NO:7是补充的灵长类IL-173核酸序列。SEQ ID NO:8是补充的灵长类IL-173多肽序列。SEQ ID NO:9是鼠类IL-173核酸序列。SEQ ID NO:10是鼠类IL-173多肽序列。SEQ ID NO:11是补充的鼠类IL-173核酸序列。SEQ ID NO:12是补充的鼠类IL-173多肽序列。SEQ ID NO:13是灵长类IL-174核酸序列。SEQ ID NO:14是灵长类IL-174多肽序列。SEQ ID NO:15是鼠类IL-174核酸序列。SEQ ID NO:16是鼠类IL-174多肽序列。SEQ ID NO:17是补充的鼠类IL-174核酸序列。SEQ ID NO:18是补充的鼠类IL-174多肽序列。SEQ ID NO:19是灵长类IL-171 IUPAC核酸序列。SEQ ID NO:20是灵长类IL-171核酸序列。SEQ ID NO:21是灵长类IL-171多肽序列。SEQ ID NO:22是补充的灵长类IL-171核酸序列。SEQ ID NO:23是补充的灵长类IL-171多肽序列。SEQ ID NO:24是灵长类IL-175 IUPAC核酸序列。SEQ ID NO:25是灵长类IL-175核酸序列。SEQ ID NO:26是灵长类IL-175多肽序列。SEQ ID NO:27是灵长类IL-176核酸序列。SEQ ID NO:28是灵长类IL-176多肽序列。SEQ ID NO:29是灵长类IL-177核酸序列。SEQ ID NO:30是灵长类IL-177多肽序列。SEQ ID NO:31是大鼠CTLA-8多肽序列。SEQ ID NO:32是小鼠CTLA-8多肽序列。SEQ ID NO:33是灵长类CTLA-8多肽序列。SEQID NO:34是病毒CTLA-8多肽序列。<110>Schering Corporation<120>纯化的哺乳动物细胞因子;相关试剂和方法<130>DX0917K<140><141><150>USSN 09/228,822<151>1999-01-11<160>34<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>543<212>DNA<213>灵长类<220><221>CDS<222>(1)..(540)<220><221>成熟肽<222>(61)..(540)<400>1atg gac tgg cct cac aac ctg ctg ttt ctt ctt acc att tcc atc ttc   48Met Asp Trp Pro His Asn Leu Leu Phe Leu Leu Thr Ile Ser Ile Phe-20                 -15                 -10                  -5ctg ggg ctg ggc cag ccc agg agc ccc aaa agc aag agg aag ggg caa   96Leu Gly Leu Gly Gln Pro Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg Lys Gly Gln
         -1   1               5                  10ggg cgg cct ggg ccc ctg gtc cct ggc cct cac cag gtg cca ctg gac   144Gly Arg Pro Gly Pro Leu Val Pro Gly Pro His Gln Val Pro Leu Asp
     15                  20                  25ctg gtg tca cgg atg aaa ccg tat gcc cgc atg gag gag tat gag agg   192Leu Val Ser Arg Met Lys Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg
 30                  35                  40aac atc gag gag atg gtg gcc cag ctg agg aac agc tca gag ctg gcc   240Asn Ile Glu Glu Met Val Ala Gln Leu Arg Asn Ser Ser Glu Leu Ala45                  50                  55                  60cag aga aag tgt gag gtc aac ttg cag ctg tgg atg tcc aac aag agg   288Gln Arg Lys Cys Glu Val Asn Leu Gln Leu Trp Met Ser Asn Lys Arg
             65                  70                  75agc ctg tct ccc tgg ggc tac agc atc aac cac gac ccc agc cgt atc   336Ser Leu Ser Pro Trp Gly Tyr Ser Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Ile
         80                  85                  90ccc gtg gac ctg ccg gag gca cgg tgc ctg tgt ctg ggc tgt gtg aac   384Pro Val Asp Leu Pro Glu Ala Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn
     95                 100                 105ccc ttc acc atg cag gag gac cgc agc atg gtg agc gtg ccg gtg ttc  432Pro Phe Thr Met Gln Glu Asp Arg Ser Met Val Ser Val Pro Val Phe
110                 115                 120agc cag gtt cct gtg cgc cgc cgc ctc tgc ccg cca ccg ccc cgc aca  480Ser Gln Val Pro Val Arg Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr125                 130                 135                 140ggg cct tgc cgc cag cgc gca gtc atg gag acc atc gct gtg ggc tgc  528Gly Pro Cys Arg Gln Arg Ala Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys
            145                 150                 155acc tgc atc ttc tga                                              543Thr Cys Ile Phe
        160<210>2<211>180<212>PRT<213>灵长类<400>2Met Asp Trp Pro His Asn Leu Leu Phe Leu Leu Thr Ile Ser Ile Phe-20                 -15                 -10                  -5Leu Gly Leu Gly Gln Pro Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg Lys Gly Gln
         -1   1               5                  10Gly Arg Pro Gly Pro Leu Val Pro Gly Pro His Gln Val Pro Leu Asp
     15                  20                  25Leu Val Ser Arg Met Lys Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg
 30                  35                  40Asn Ile Glu Glu Met Val Ala Gln Leu Arg Asn Ser Ser Glu Leu Ala45                  50                  55                  60Gln Arg Lys Cys Glu Val Asn Leu Gln Leu Trp Met Ser Asn Lys Arg
             65                  70                  75Ser Leu Ser Pro Trp Gly Tyr Ser Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Ile
         80                  85                  90Pro Val Asp Leu Pro Glu Ala Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn
     95                 100                 105Pro Phe Thr Met Gln Glu Asp Arg Ser Met Val Ser Val Pro Val Phe
110                 115                 120Ser Gln Val Pro Val Arg Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr125                 130                 135                 140Gly Pro Cys Arg Gln Arg Ala Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys
            145                 150                 155Thr Cys Ile Phe
        160<210>3<211>543<212>DNA<213>啮齿动物<220><221>CDS<222>(1)..(540)<220><221>成熟肽<222>(67)..(540)<400>3atg gac tgg ccg cac agc ctg ctc ttc ctc ctg gcc atc tcc atc ttc   48Met Asp Trp Pro His Ser Leu Leu Phe Leu Leu Ala Ile Ser Ile Phe
    -20                 -15                 -10ctg gcg cca agc cac ccc cgg aac acc aaa ggc aaa aga aaa ggg caa   96Leu Ala Pro Ser His Pro Arg Asn Thr Lys Gly Lys Arg Lys Gly Gln
 -5              -1   1               5                  10ggg agg ccc agt ccc ttg gcc cct ggg cct cat cag gtg ccg ctg gac   144Gly Arg Pro Ser Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Gln Val Pro Leu Asp
             15                  20                  25ctg gtg tct cga gta aag ccc tac gct cga atg gaa gag tat gag cgg   192Leu Val Ser Arg Val Lys Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg
         30                  35                  40aac ctt ggg gag atg gtg gcc cag ctg agg aac agc tcc gag cca gcc   240Asn Leu Gly Glu Met Val Ala Gln Leu Arg Asn Ser Ser Glu Pro Ala
     45                  50                  55aag aag aaa tgt gaa gtc aat cta cag ctg tgg ttg tcc aac aag agg   288Lys Lys Lys Cys Glu Val Asn Leu Gln Leu Trp Leu Ser Asn Lys Arg
 60                  65                  70agc ctg tcc cca tgg ggc tac agc atc aac cac gac ccc agc cgc atc   336Ser Leu Ser Pro Trp Gly Tyr Ser Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Ile75                  80                  85                  90cct gcg gac ttg ccc gag gcg cgg tgc cta tgt ttg ggt tgc gtg aat   384Pro Ala Asp Leu Pro Glu Ala Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn
             95                 100                 105ccc ttc acc atg cag gag gac cgt agc atg gtg agc gtg cca gtg ttc   432Pro Phe Thr Met Gln Glu Asp Arg Ser Met Val Ser Val Pro Val Phe
        110                 115                 120agc cag gtg ccg gtg cgc cgc cgc ctc tgt cct caa cct cct cgc cct   480Ser Gln Val Pro Val Arg Arg Arg Leu Cys Pro Gln Pro Pro Arg Pro
    125                 130                 135ggg ccc tgc cgc cag cgt gtc gtc atg gag acc atc gct gtg ggt tgc   528Gly Pro Cys Arg Gln Arg Val Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys
140                 145                 150acc tgc atc ttc tga                                               543Thr Cys Ile Phe155<210>4<211>180<212>PRT<213>啮齿动物<400>4Met Asp Trp Pro His Ser Leu Leu Phe Leu Leu Ala Ile Ser Ile Phe
    -20                 -15                 -10Leu Ala Pro Ser His Pro Arg Asn Thr Lys Gly Lys Arg Lys Gly Gln
 -5              -1   1               5                  10Gly Arg Pro Ser Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Gln Val Pro Leu Asp
             15                  20                  25Leu Val Ser Arg Val Lys Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg
         30                  35                  40Asn Leu Gly Glu Met Val Ala Gln Leu Arg Asn Ser Ser Glu Pro Ala
     45                  50                  55Lys Lys Lys Cys Glu Val Asn Leu Gln Leu Trp Leu Ser Asn Lys Arg
 60                  65                  70Ser Leu Ser Pro Trp Gly Tyr Ser Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Ile75                  80                  85                  90Pro Ala Asp Leu Pro Glu Ala Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn
             95                 100                 105Pro Phe Thr Met Gln Glu Asp Arg Ser Met Val Ser Val Pro Val Phe
        110                 115                 120Ser Gln Val Pro Val Arg Arg Arg Leu Cys Pro Gln Pro Pro Arg Pro
    125                 130                 135Gly Pro Cys Arg Gln Arg Val Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys
140                 145                 150Thr Cys Ile Phe155<210>5<211>454<212>DNA<213>灵长类<220><221>CDS<222>(1)..(453)<400>5tgc gcg gac cgg ccg gag gag cta ctg gag cag ctg tac ggg cgc ctg  48Cys Ala Asp Arg Pro Glu Glu Leu Leu Glu Gln Leu Tyr Gly Arg Leu1               5                  10                  15gcg gcc ggc gtg ctc agt gcc ttc cac cac acg ctg cag ctg ggg ccg  96Ala Ala Gly Val Leu Ser Ala Phe His His Thr Leu Gln Leu Gly Pro
         20                  25                  30cgt gag cag gcg cgc aac gcg agc tgc ccg gca ggg ggc agg ccc gcc  144Arg Glu Gln Ala Arg Asn Ala Ser Cys Pro Ala Gly Gly Arg Pro Ala
     35                  40                  45gac cgc cgc ttc cgg acg ccc acc aac ctg cgc agc gtg tcg ccc tgg  192Asp Arg Arg Phe Arg Thr Pro Thr Asn Leu Arg Ser Val Ser Pro Trp
 50                  55                  60gcc tac aga atc tcc tac gac ccg gcg agg tac ccc agg tac ctg cct   240Ala Tyr Arg Ile Ser Tyr Asp Pro Ala Arg Tyr Pro Arg Tyr Leu Pro65                  70                  75                  80gaa gcc tac tgc ctg tgc cgg ggc tgc ctg acc ggg ctg ttc ggc gag   288Glu Ala Tyr Cys Leu Cys Arg Gly Cys Leu Thr Gly Leu Phe Gly Glu
             85                  90                  95gag gac gtg cgc ttc cgc agc gcc cct gtc tac atg ccc acc gtc gtc   336Glu Asp Val Arg Phe Arg Ser Ala Pro Val Tyr Met Pro Thr Val Val
        100                 105                 110ctg cgc cgc acc ccc gcc tgc gcc ggc ggc cgt tcc gtc tac acc gag   384Leu Arg Arg Thr Pro Ala Cys Ala Gly Gly Arg Ser Val Tyr Thr Glu
    115                 120                 125gcc tac gtc acc atc ccc gtg ggc tgc acc tgc gtc ccc gag ccg gag   432Ala Tyr Val Thr Ile Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Pro Glu Pro Glu
130                 135                 140aag gac gca gac agc atc aac t                                     454Lys Asp Ala Asp Ser Ile Asn145                 150<210>6<211>151<212>PRT<213>灵长类<400>6Cys Ala Asp Arg Pro Glu Glu Leu Leu Glu Gln Leu Tyr Gly Arg Leu1               5                  10                  15Ala Ala Gly Val Leu Ser Ala Phe His His Thr Leu Gln Leu Gly Pro
         20                  25                  30Arg Glu Gln Ala Arg Asn Ala Ser Cys Pro Ala Gly Gly Arg Pro Ala
     35                  40                  45Asp Arg Arg Phe Arg Thr Pro Thr Asn Leu Arg Ser Val Ser Pro Trp
 50                  55                  60Ala Tyr Arg Ile Ser Tyr Asp Pro Ala Arg Tyr Pro Arg Tyr Leu Pro65                  70                  75                  80Glu Ala Tyr Cys Leu Cys Arg Gly Cys Leu Thr Gly Leu Phe Gly Glu
             85                  90                  95Glu Asp Val Arg Phe Arg Ser Ala Pro Val Tyr Met Pro Thr Val Val
        100                 105                 110Leu Arg Arg Thr Pro Ala Cys Ala Gly Gly Arg Ser Val Tyr Thr Glu
    115                 120                 125Ala Tyr Val Thr Ile Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Pro Glu Pro Glu
130                 135                 140Lys Asp Ala Asp Ser Ile Asn145                 150<210>7<211>1385<212>DNA<213>灵长类<220><221>CDS<222>(59)..(664)<220><221>成熟肽<222>(110)..(664)<400>7gcccgggcag gtggcgacct cgctcagtcg gcttctcggt ccaagtcccc gggtctgg   58atg ctg gta gcc ggc ttc ctg ctg gcg ctg ccg ccg agc tgg gcc gcg   106Met Leu Val Ala Gly Phe Leu Leu Ala Leu Pro Pro Ser Trp Ala Ala
    -15                 -10                  -5ggc gcc ccg agg gcg ggc agg cgc ccc gcg cgg ccg cgg ggc tgc gcg   154Gly Ala Pro Arg Ala Gly Arg Arg Pro Ala Arg Pro Arg Gly Cys Ala-1   1               5                  10                  15gac cgg ccg gag gag cta ctg gag cag ctg tac ggg cgc ctg gcg gcc   202Asp Arg Pro Glu Glu Leu Leu Glu Gln Leu Tyr Gly Arg Leu Ala Ala
             20                  25                  30ggc gtg ctc agt gcc ttc cac cac acg ctg cag ctg ggg ccg cgt gag   250Gly Val Leu Ser Ala Phe His His Thr Leu Gln Leu Gly Pro Arg Glu
         35                  40                  45cag gcg cgc aac gcg agc tgc ccg gca ggg ggc agg ccc gcc gac cgc   298Gln Ala Arg Asn Ala Ser Cys Pro Ala Gly Gly Arg Pro Ala Asp Arg
     50                  55                  60cgc ttc cgg ccg ccc acc aac ctg cgc agc gtg tcg ccc tgg gcc tac   346Arg Phe Arg Pro Pro Thr Asn Leu Arg Ser Val Ser Pro Trp Ala Tyr
 65                  70                  75aga atc tcc tac gac ccg gcg agg tac ccc agg tac ctg cct gaa gcc   394Arg Ile Ser Tyr Asp Pro Ala Arg Tyr Pro Arg Tyr Leu Pro Glu Ala80                  85                  90                  95tac tgc ctg tgc cgg ggc tgc ctg acc ggg ctg ttc ggc gag gag gac   442Tyr Cys Leu Cys Arg Gly Cys Leu Thr Gly Leu Phe Gly Glu Glu Asp
            100                 105                 110gtg cgc ttc cgc agc gcc cct gtc tac atg ccc acc gtc gtc ctg cgc   490Val Arg Phe Arg Ser Ala Pro Val Tyr Met Pro Thr Val Val Leu Arg
        115                 120                 125cgc acc ccc gcc tgc gcc ggc ggc cgt tcc gtc tac acc gag gcc tac   538Arg Thr Pro Ala Cys Ala GIy Gly Arg Ser Val Tyr Thr Glu Ala Tyr
    130                 135                 140gtc acc atc ccc gtg ggc tgc acc tgc gtc ccc gag ccg gag aag gac   586Val Thr Ile Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Pro Glu Pro Glu Lys Asp
145                 150                 155gca gac agc atc aac tcc agc atc gac aaa cag ggc gcc aag ctc ctg   634Ala Asp Ser Ile Asn Ser Ser Ile Asp Lys Gln Gly Ala Lys Leu Leu160                 165                 170                 175ctg ggc ccc aac gac gcg ccc gct ggc ccc tgaggccggt cctgccccgg     684Leu Gly Pro Asn Asp Ala Pro Ala Gly Pro
        180                     185gaggtctccc cggcccgcat cccgaggcgc ccaagctgga gccgcctgga gggctcggtc 744ggcgacctct gaagagagtg caccgagcaa accaagtgcc ggagcaccag cgccgccttt 804ccatggagac tcgtaagcag cttcatctga cacgggcatc cctggcttgc ttttagctac 864aagcaagcag cgtggctgga agctgatggg aaacgacccg gcacgggcat cctgtgtgcg 924gcccgcatgg agggtttgga aaagttcacg gaggctccct gaggagcctc tcagatcggc 984tgctgcgggt gcagggcgtg actcaccgct gggtgcttgc caaagagata gggacgcata 1044tgctttttaa agcaatctaa aaataataat aagtatagcg actatatacc tacttttaaa 1104atcaactgtt ttgaatagag gcagagctat tttatattat caaatgagag ctactctgtt 1164acatttctta acatataaac atcgtttttt acttcttctg gtagaatttt ttaaagcata 1224attggaatcc ttggataaat tttgtagctg gtacactctg gcctgggtct ctgaattcag 1284cctgtcaccg atggctgact gatgaaatgg acacgtctca tctgacccac tcttccttcc 1344actgaaggtc ttcacgggcc tccaggcctc gtgccgaatt c                     1385<210>8<211>202<212>PRT<213>灵长类<400>8Met Leu Val Ala Gly Phe Leu Leu Ala Leu Pro Pro Ser Trp Ala Ala
    -15                 -10                  -5Gly Ala Pro Arg Ala Gly Arg Arg Pro Ala Arg Pro Arg Gly Cys Ala-1   1               5                  10                  15Asp Arg Pro Glu Glu Leu Leu Glu Gln Leu Tyr Gly Arg Leu Ala Ala
             20                  25                  30Gly Val Leu Ser Ala Phe His His Thr Leu Gln Leu Gly Pro Arg Glu
         35                  40                  45Gln Ala Arg Asn Ala Ser Cys Pro Ala Gly Gly Arg Pro Ala Asp Arg
     50                  55                  60Arg Phe Arg Pro Pro Thr Asn Leu Arg Ser Val Ser Pro Trp Ala Tyr
 65                  70                  75Arg Ile Ser Tyr Asp Pro Ala Arg Tyr Pro Arg Tyr Leu Pro Glu Ala80                  85                  90                  95Tyr Cys Leu Cys Arg Gly Cys Leu Thr Gly Leu Phe Gly Glu Glu Asp
            100                 105                 110Val Arg Phe Arg Ser Ala Pro Val Tyr Met Pro Thr Val Val Leu Arg
        115                 120                 125Arg Thr Pro Ala Cys Ala Gly Gly Arg Ser Val Tyr Thr Glu Ala Tyr
    130                 135                 140Val Thr Ile Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Pro Glu Pro Glu Lys Asp
145                 150                 155Ala Asp Ser Ile Asn Ser Ser Ile Asp Lys Gln Gly Ala Lys Leu Leu160                 165                 170                175Leu Gly Pro Asn Asp Ala Pro Ala Gly Pro
            180                 185<210>9<211>133<212>DNA<213>啮齿动物<220><221>CDS<222>(1)..(132)<400>9ttt ccg aga tac ctg ccc gaa gcc tac tgc ctg tgc cga ggc tgt ctg  48Phe Pro Arg Tyr Leu Pro Glu Ala Tyr Cys Leu Cys Arg Gly Cys Leu1               5                  10                  15acc ggg ctc tac ggt gag gag gac ttc cgc ttt cgc agc gca ccc gtc  96Thr Gly Leu Tyr Gly Glu Glu Asp Phe Arg Phe Arg Ser Ala Pro Val
         20                  25                  30ttc tct ccg gcg gtg gtg ctg cgg cgc acg gcg gcc t                133Phe Ser Pro Ala Val Val Leu Arg Arg Thr Ala Ala
     35                  40<210>10<211>44<212>PRT<213>啮齿动物<400>10Phe Pro Arg Tyr Leu Pro Glu Ala Tyr Cys Leu Cys Arg Gly Cys Leu1               5                  10                  15Thr Gly Leu Tyr Gly Glu Glu Asp Phe Arg Phe Arg Ser Ala Pro Val
         20                  25                  30Phe Ser Pro Ala Val Val Leu Arg Arg Thr Ala Ala
     35                  40<210>11<211>1143<212>DNA<213>啮齿动物<220><221>CDS<222>(1)..(615)<220><221>成熟肽<222>(73)..(615)<400>11atg ttg ggg aca ctg gtc tgg atg ctc ctc gtc ggc ttc ctg ctg gca   48Met Leu Gly Thr Leu Val Trp Met Leu Leu Val Gly Phe Leu Leu Ala
            -20                 -15                 -10ctg gcg ccg ggc cgc gcg gcg ggc gcg ctg agg acc ggg agg cgc ccg   96Leu Ala Pro Gly Arg Ala Ala Gly Ala Leu Arg Thr Gly Arg Arg Pro
         -5              -1   1               5gcg cgg ccg cgg gac tgc gcg gac cgg cca gag gag ctc ctg gag cag   144Ala Arg Pro Arg Asp Cys Ala Asp Arg Pro Glu Glu Leu Leu Glu Gln
 10                  15                  20ctg tac ggg cgg ctg gcg gcc ggc gtg ctc agc gcc ttc cac cac acg   192Leu Tyr Gly Arg Leu Ala Ala Gly Val Leu Ser Ala Phe His His Thr25                  30                  35                  40ctg cag ctc ggg ccg cgc gag cag gcg cgc aat gcc agc tgc ccg gcc   240Leu Gln Leu Gly Pro Arg Glu Gln Ala Arg Asn Ala Ser Cys Pro Ala
             45                  50                  55ggg ggc agg gcc gcc gac cgc cgc ttc cgg cca ccc acc aac ctg cgc   288Gly Gly Arg Ala Ala Asp Arg Arg Phe Arg Pro Pro Thr Asn Leu Arg
         60                  65                  70agc gtg tcg ccc tgg gcg tac agg att tcc tac gac cct gct cgc ttt   336Ser Val Ser Pro Trp Ala Tyr Arg Ile Ser Tyr Asp Pro Ala Arg Phe
     75                  80                  85ccg agg tac ctg ccc gaa gcc tac tgc ctg tgc cga ggc tgc ctg acc   384Pro Arg Tyr Leu Pro Glu Ala Tyr Cys Leu Cys Arg Gly Cys Leu Thr
 90                  95                 100ggg ctc tac ggg gag gag gac ttc cgc ttt cgc agc aca ccc gtc ttc   432Gly Leu Tyr Gly Glu Glu Asp Phe Arg Phe Arg Ser Thr Pro Val Phe105                 110                     115             120tct cca gcc gtg gtg ctg cgg cgc aca gcg gcc tgc gcg ggc ggc cgc   480Ser Pro Ala Val Val Leu Arg Arg Thr Ala Ala Cys Ala Gly Gly Arg
            125                 130                 135tct gtg tac gcc gaa cac tac atc acc atc ccg gtg ggc tgc acc tgc   528Ser Val Tyr Ala Glu His Tyr Ile Thr Ile Pro Val Gly Cys Thr Cys
        140                 145                 150gtg ccc gag ccg gac aag tcc gcg gac agt gcg aac tcc agc atg gac   576Val Pro Glu Pro Asp Lys Ser Ala Asp Ser Ala Asn Ser Ser Met Asp
    155                 160                 165aag ctg ctg ctg ggg ccc gcc gac agg cct gcg ggg cgc tgatgccggg    625Lys Leu Leu Leu Gly Pro Ala Asp Arg Pro Ala Gly Arg
170                 175                 180gactgcccgc catggcccag cttcctgcat gcatcaggtc ccctggccct gacaaaaccc 685accccatgat ccctggccgc tgcctaattt ttccaaaagg acagctacat aagctttaaa 745tatatttttc aaagtagaca ctacatatct acaactattt tgaatagtgg cagaaactat 805tttcatatta gtaatttaga gcaagcatgt tgtttttaaa cttctttgat atacaagcac 865atcacacaca tcccgttttc ctctagtagg attcttgagt gcataattgt agtgctcaga 925tgaacttcct tctgctgcac tgtgccctgt ccctgagtct ctcctgtggc ccaagcttac 985taaggtgata atgagtgctc cggatctggg cacctaaggt ctccaggtcc ctggagaggg 1045agggatgtgg gggggctagg aaccaagcgc ccctttgttc tttagcttat ggatggtctt 1105aactttataa agattaaagt ttttggtgtt attctttc                         1143<210>12<211>205<212>PRT<213>啮齿动物<400>12Met Leu Gly Thr Leu Val Trp Met Leu Leu Val Gly Phe Leu Leu Ala
            -20                 -15                 -10Leu Ala Pro Gly Arg Ala Ala Gly Ala Leu Arg Thr Gly Arg Arg Pro
         -5              -1   1               5Ala Arg Pro Arg Asp Cys Ala Asp Arg Pro Glu Glu Leu Leu Glu Gln
 10                  15                  20Leu Tyr Gly Arg Leu Ala Ala Gly Val Leu Ser Ala Phe His His Thr25                  30                  35                  40Leu Gln Leu Gly Pro Arg Glu Gln Ala Arg Asn Ala Ser Cys Pro Ala
             45                  50                  55Gly Gly Arg Ala Ala Asp Arg Arg Phe Arg Pro Pro Thr Asn Leu Arg
         60                  65                  70Ser Val Ser Pro Trp Ala Tyr Arg Ile Ser Tyr Asp Pro Ala Arg Phe
     75                  80                  85Pro Arg Tyr Leu Pro Glu Ala Tyr Cys Leu Cys Arg Gly Cys Leu Thr
 90                  95                 100Gly Leu Tyr Gly Glu Glu Asp Phe Arg Phe Arg Ser Thr Pro Val Phe105                 110                 115                 120Ser Pro Ala Val Val Leu Arg Arg Thr Ala Ala Cys Ala Gly Gly Arg
            125                 130                 135Ser Val Tyr Ala Glu His Tyr Ile Thr Ile Pro Val Gly Cys Thr Cys
        140                 145                 150Val Pro Glu Pro Asp Lys Ser Ala Asp Ser Ala Asn Ser Ser Met Asp
    155                 160                 165Lys Leu Leu Leu Gly Pro Ala Asp Arg Pro Ala Gly Arg
170                 175                 180<210>13<211>504<212>DNA<213>灵长类<220><221>CDS<222>(19)..(501)<220><221>成熟肽<222>(67)..(501)<400>13tgagtgtgca gtgccagc atg tac cag gtg gtt gca ttc ttg gca atg gtc   51
                Met Tyr Gln Val Val Ala Phe Leu Ala Met Val
                    -15                 -10atg gga acc cac acc tac agc cac tgg ccc agc tgc tgc ccc agc aaa   99Met Gly Thr His Thr Tyr Ser His Trp Pro Ser Cys Cys Pro Ser Lys-5              -1   1               5                  10ggg cag gac acc tct gag gag ctg ctg agg tgg agc act gtg cct gtg   147Gly Gln Asp Thr Ser Glu Glu Leu Leu Arg Trp Ser Thr Val Pro Val
         15                  20                  25cct ccc cta gag cct gct agg ccc aac cgc cac cca gag tcc tgt agg   195Pro Pro Leu Glu Pro Ala Arg Pro Asn Arg His Pro Glu Ser Cys Arg
     30                  35                  40gcc agt gaa gat gga ccc ctc aac agc agg gcc atc tcc ccc tgg aga   243Ala Ser Glu Asp Gly Pro Leu Asn Ser Arg Ala Ile Ser Pro Trp Arg
 45                  50                  55tat gag ttg gac aga gac ttg aac cgg ctc ccc cag gac ctg tac cac   291Tyr Glu Leu Asp Arg Asp Leu Asn Arg Leu Pro Gln Asp Leu Tyr His60                  65                  70                  75gcc cgt tgc ctg tgc ccg cac tgc gtc agc cta cag aca ggc tcc cac   339Ala Arg Cys Leu Cys Pro His Cys Val Ser Leu Gln Thr Gly Ser His
             80                 85                   90atg gac ccc cgg ggc aac tcg gag ctg ctc tac cac aac cag act gtc   387Met Asp Pro Arg Gly Asn Ser Glu Leu Leu Tyr His Asn Gln Thr Val
         95                 100                 105ttc tac cgg cgg cca tgc cat ggc gag aag ggc acc cac aag ggc tac   435Phe Tyr Arg Arg Pro Cys His Gly Glu Lys Gly Thr His Lys Gly Tyr
    110                 115                 120tgc ctg gag cgc agg ctg tac cgt gtt tcc tta gct tgt gtg tgt gtg   483Cys Leu Glu Arg Arg Leu Tyr Arg Val Ser Leu Ala Cys Val Cys Val
125                 130                 135cgg ccc cgt gtg atg ggc tag                                       504Arg Pro Arg Val Met Gly140                 145<210>14<211>161<212>PRT<213>灵长类<400>14Met Tyr Gln Val Val Ala Phe Leu Ala Met Val Met Gly Thr His Thr
-15                 -10                  -5              -1Tyr Ser His Trp Pro Ser Cys Cys Pro Ser Lys Gly Gln Asp Thr Ser1               5                  10                  15Glu Glu Leu Leu Arg Trp Ser Thr Val Pro Val Pro Pro Leu Glu Pro
         20                  25                  30Ala Arg Pro Asn Arg His Pro Glu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asp Gly
     35                  40                  45Pro Leu Asn Ser Arg Ala Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Glu Leu Asp Arg
 50                  55                  60Asp Leu Asn Arg Leu Pro Gln Asp Leu Tyr His Ala Arg Cys Leu Cys65                  70                  75                  80Pro His Cys Val Ser Leu Gln Thr Gly Ser His Met Asp Pro Arg Gly
             85                  90                  95Asn Ser Glu Leu Leu Tyr His Asn Gln Thr Val Phe Tyr Arg Arg Pro
        100                 105                 110Cys His Gly Glu Lys Gly Thr His Lys Gly Tyr Cys Leu Glu Arg Arg
    115                 120                 125Leu Tyr Arg Val Ser Leu Ala Cys Val Cys Val Arg Pro Arg Val Met
130                 135                 140Gly145<210>15<211>620<212>DNA<213>啮齿动物<220><221>CDS<222>(1)..(432)<400>15cgg cac agg cgg cac aaa gcc cgg aga gtg gct gaa gtg gag ctc tgc   48Arg His Arg Arg His Lys Ala Arg Arg Val Ala Glu Val Glu Leu Cys1               5                  10                  15atc tgt atc ccc ccc aga gcc tct gag cca cac cca cca cgc aga atc   96Ile Cys Ile Pro Pro Arg Ala Ser Glu Pro His Pro Pro Arg Arg Ile
         20                  25                  30ctg cag ggc cag caa gga tgg cct ctc aac agc agg gcc atc tct cct   144Leu Gln Gly Gln Gln Gly Trp Pro Leu Asn Ser Arg Ala Ile Ser Pro
     35                  40                  45tgg agc tat gag ttg gac agg gac ttg aat cgg gtc ccc cag gac tgg   192Trp Ser Tyr Glu Leu Asp Arg Asp Leu Asn Arg Val Pro Gln Asp Trp
 50                  55                  60tac cac gct cga tgc ctg tgc cca cac tgc gtc acg cta cag aca ggc   240Tyr His Ala Arg Cys Leu Cys Pro His Cys Val Thr Leu Gln Thr Gly65                  70                  75                  80tcc cac atg gac ccg ctg ggc aac tcc gtc cca ctt tac cac aac cag   288Ser His Met Asp Pro Leu Gly Asn Ser Val Pro Leu Tyr His Asn Gln
             85                  90                  95acg gtc ttc tac cgg cgg cca tgc atg gcg agg aag gta ccc atc gcc   336Thr Val Phe Tyr Arg Arg Pro Cys Met Ala Arg Lys Val Pro Ile Ala
        100                 105                 110gct act gct tgg agc gca ggt cta ccg agt ctc ctt ggc ttg tgt gtg   384Ala Thr Ala Trp Ser Ala Gly Leu Pro Ser Leu Leu Gly Leu Cys Val
    115                 120                 125tgt gcg gcc ccg ggt cat ggc tta gtc atg ctc acc atc tgc ctg agg   432Cys Ala Ala Pro Gly His Gly Leu Val Met Leu Thr Ile Cys Leu Arg
130                 135                 140tgaatgccgg gtgggagaga gggccaggtg tacatcacct gccaatgcgg gccgggttca 492agcctgcaaa gcctacctga agcagcaggt cccgggacag gatggagact tggggagaaa 552tctgactttt gcactttttg gagcattttg ggaagagcag gttcgcttgt gctgtagaga 612tgctgttg                                                          620<210>16<211>144<212>PRT<213>啮齿动物<400>16Arg His Arg Arg His Lys Ala Arg Arg Val Ala Glu Val Glu Leu Cys1               5                  10                  15Ile Cys Ile Pro Pro Arg Ala Ser Glu Pro His Pro Pro Arg Arg Ile
         20                  25                  30Leu Gln Gly Gln Gln Gly Trp Pro Leu Asn Ser Arg Ala Ile Ser Pro
     35                  40                  45Trp Ser Tyr Glu Leu Asp Arg Asp Leu Asn Arg Val Pro Gln Asp Trp
 50                  55                  60Tyr His Ala Arg Cys Leu Cys Pro His Cys Val Thr Leu Gln Thr Gly65                  70                  75                  80Ser His Met Asp Pro Leu Gly Asn Ser Val Pro Leu Tyr His Asn Gln
             85                  90                  95Thr Val Phe Tyr Arg Arg Pro Cys Met Ala Arg Lys Val Pro Ile Ala
        100                 105                 110Ala Thr Ala Trp Ser Ala Gly Leu Pro Ser Leu Leu Gly Leu Cys Val
    115                 120                 125Cys Ala Ala Pro Gly His Gly Leu Val Met Leu Thr Ile Cys Leu Arg
130                 135                 140<210>17<211>985<212>DNA<213>啮齿动物<220><221>CDS<222>(1)..(507)<220><221>成熟肽<222>(49)..(507)<400>17atg tac cag gct gtt gca ttc ttg gca atg atc gtg gga acc cac acc   48Met Tyr Gln Ala Val Ala Phe Leu Ala Met Ile Val Gly Thr His Thr
-15                 -10                  -5              -1gtc agc ttg cgg atc cag gag ggc tgc agt cac ttg ccc agc tgc tgc   96Val Ser Leu Arg Ile Gln Glu Gly Cys Ser His Leu Pro Ser Cys Cys1               5                  10                  15ccc agc aaa gag caa gaa ccc ccg gag gag tgg ctg aag tgg agc tct   144Pro Ser Lys Glu Gln Glu Pro Pro Glu Glu Trp Leu Lys Trp Ser Ser
         20                  25                  30gca tct gtg tcc ccc cca gag cct ctg agc cac acc cac cac gca gaa   192Ala Ser Val Ser Pro Pro Glu Pro Leu Ser His Thr His His Ala Glu
     35                  40                  45tcc tgc agg gcc agc aag gat ggc ccc ctc aac agc agg gcc atc tct   240Ser Cys Arg Ala Ser Lys Asp Gly Pro Leu Asn Ser Arg Ala Ile Ser
 50                  55                  60cct tgg agc tat gag ttg gac agg gac ttg aat cgg gtc ccc cag gac   288Pro Trp Ser Tyr Glu Leu Asp Arg Asp Leu Asn Arg Val Pro Gln Asp65                  70                  75                  80ctg tac cac gct cga tgc ctg tgc cca cac tgc gtc agc cta cag aca   336Leu Tyr His Ala Arg Cys Leu Cys Pro His Cys Val Ser Leu Gln Thr
             85                  90                  95ggc tcc cac atg gac ccg ctg ggc aac tcc gtc cca ctt tac cac aac   384Gly Ser His Met Asp Pro Leu Gly Asn Ser Val Pro Leu Tyr His Asn
        100                 105                 110cag acg gtc ttc tac cgg cgg cca tgc cat ggt gag gaa ggt acc cat   432Gln Thr Val Phe Tyr Arg Arg Pro Cys His Gly Glu Glu Gly Thr His
    115                 120                 125cgc cgc tac tgc ttg gag cgc agg ctc tac cga gtc tcc ttg gct tgt   480Arg Arg Tyr Cys Leu Glu Arg Arg Leu Tyr Arg Val Ser Leu Ala Cys
130                 135                 140gtg tgt gtg cgg ccc cgg gtc atg gct tagtcatgct caccacctgc         527Val Cys Val Arg Pro Arg Val Met Ala145                 150ctgaggctga tgcccggttg ggagagaggg ccaggtgtac aatcaccttg ccaatgcggg 587ccgggttcaa gccctccaaa gccctacctg aagcagcagg ctcccgggac aagatggagg 647acttggggag aaactctgac ttttgcactt tttggaagca cttttgggaa ggagcaggtt 707ccgcttgtgc tgctagagga tgctgttgtg gcatttctac tcaggaacgg actccaaagg 767cctgctgacc ctggaagcca tactcctggc tcctttcccc tgaatccccc aactcctggc 827acaggcactt tctccacctc tccccctttg ccttttgttg tgtttgtttg tgcatgccaa 887ctctgcgtgc agccaggtgt aattgccttg aaggatggtt ctgaggtgaa agctgttatc 947gaaagtgaag agatttatcc aaataaacat ctgtgttt                        985<210>18<211>169<212>PRT<213>啮齿动物<400>18Met Tyr Gln Ala Val Ala Phe Leu Ala Met Ile Val Gly Thr His Thr
-15                 -10                  -5              -1Val Ser Leu Arg Ile Gln Glu Gly Cys Ser His Leu Pro Ser Cys Cys1               5                  10                  15Pro Ser Lys Glu Gln Glu Pro Pro Glu Glu Trp Leu Lys Trp Ser Ser
         20                  25                  30Ala Ser Val Ser Pro Pro Glu Pro Leu Ser His Thr His His Ala Glu
     35                  40                  45Ser Cys Arg Ala Ser Lys Asp Gly Pro Leu Asn Ser Arg Ala Ile Ser
 50                  55                  60Pro Trp Ser Tyr Glu Leu Asp Arg Asp Leu Asn Arg Val Pro Gln Asp65                  70                  75                  80Leu Tyr His Ala Arg Cys Leu Cys Pro His Cys Val Ser Leu Gln Thr
             85                  90                  95Gly Ser His Met Asp Pro Leu Gly Asn Ser Val Pro Leu Tyr His Asn
        100                 105                 110Gln Thr Val Phe Tyr Arg Arg Pro Cys His Gly Glu Glu Gly Thr His
    115                 120                 125Arg Arg Tyr Cys Leu Glu Arg Arg Leu Tyr Arg Val Ser Leu Ala Cys
130                 135                 140Val Cys Val Arg Pro Arg Val Met Ala145                 150<210>19<211>521<212>DNA<213>灵长类<220><221>misc_feature<222>(1)..(521)<223>注释=“n可以是a、c、g或t”<400>19gacacggatg aggaccgcta tccacagaag ctggccttcg ccgagtgcct gtgcagaggc 60tgtatcgatg cacggacggg ccgcgagaca gctgcgctca actccgtgcg gctgctccag 120agcctgctgg tgctgcgccg ccggccctgc tcccgcgacg gctcggggct ccccacacct 180ggggcctttg ccttccacac cgagttcatc cacgtccccg tcggctgcac ctgcgtgctg 240ccccgttcaa gtgtgaccgc caaggccgtg gggcccttag ntgacaccgt gtgctcccca 300gagggacccc tatttatggg aattatggta ttatatgctt cccacatact tggggctggc 360atcccgngct gagacagccc cctgttctat tcagctatat ggggagaaga gtagactttc 420agctaagtga aaagtgnaac gtgctgactg tctgctgtcg tnctactnat gctagcccga 480gtgttcactc tgagcctgtt aaatataggc ggttatgtac c                     521<210>20<211>521<212>DNA<213>灵长类<220><221>CDS<222>(1)..(369)<220><221>misc_feature<222>(281)<223>注释=“核苷酸281、367、437、462和468是指示的c;每个可以或者是a、g或t;
 翻译的氨基酸取决于遗传密码”<400>20gac acg gat gag gac cgc tat cca cag aag ctg gcc ttc gcc gag tgc   48Asp Thr Asp Glu Asp Arg Tyr Pro Gln Lys Leu Ala Phe Ala Glu Cys1               5                  10                  15ctg tgc aga ggc tgt atc gat gca cgg acg ggc cgc gag aca gct gcg   96Leu Cys Arg Gly Cys Ile Asp Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala Ala
         20                  25                  30ctc aac tcc gtg cgg ctg ctc cag agc ctg ctg gtg ctg cgc cgc cgg   144Leu Asn Ser Val Arg Leu Leu Gln Ser Leu Leu Val Leu Arg Arg Arg
     35                  40                  45ccc tgc tcc cgc gac ggc tcg ggg ctc ccc aca cct ggg gcc ttt gcc   192Pro Cys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe Ala
 50                  55                  60ttc cac acc gag ttc atc cac gtc ccc gtc ggc tgc acc tgc gtg ctg   240Phe His Thr Glu Phe Ile His Val Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Leu65                  70                  75                  80ccc cgt tca agt gtg acc gcc aag gcc gtg ggg ccc tta gct gac acc   288Pro Arg Ser Ser Val Thr Ala Lys Ala Val Gly Pro Leu Ala Asp Thr
             85                  90                  95gtg tgc tcc cca gag gga ccc cta ttt atg gga att atg gta tta tat   336Val Cys Ser Pro Glu Gly Pro Leu Phe Met Gly Ile Met Val Leu Tyr
        100                 105                 110gct tcc cac ata ctt ggg gct ggc atc ccg cgc tgagacagcc ccctgttcta 389Ala Ser His Ile Leu Gly Ala Gly Ile Pro Arg
    115                 120ttcagctata tggggagaag agtagacttt cagctaagtg aaaagtgcaa cgtgctgact 449gtctgctgtc gtcctactca tgctagcccg agtgttcact ctgagcctgt taaatatagg 509cggttatgta cc                                                     521<210>21<211>123<212>PRT<213>灵长类<400>21Asp Thr Asp Glu Asp Arg Tyr Pro Gln Lys Leu Ala Phe Ala Glu Cys1               5                  10                  15Leu Cys Arg Gly Cys Ile Asp Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala Ala
         20                  25                  30Leu Asn Ser Val Arg Leu Leu Gln Ser Leu Leu Val Leu Arg Arg Arg
     35                  40                  45Pro Cys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe Ala
 50                  55                  60Phe His Thr Glu Phe Ile His Val Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Leu65                  70                  75                  80Pro Arg Ser Ser Val Thr Ala Lys Ala Val Gly Pro Leu Ala Asp Thr
             85                  90                  95Val Cys Ser Pro Glu Gly Pro Leu Phe Met Gly Ile Met Val Leu Tyr
        100                 105                110Ala Ser His Ile Leu Gly Ala Gly Ile Pro Arg
    115                 120<210>22<211>1107<212>DNA<213>灵长类<220><221>CDS<222>(115)..(705)<220><221>成熟肽<222>(166)..(705)<400>22gtgtggcctc aggtataaga gcggctgctg ccaggtgcat ggccaggtgc acctgtggga 60ttgccgccag gtgtgcaggc cgctccaagc ccagcctgcc ccgctgccgc cacc atg   117
                                                        Metacg ctc ctc ccc ggc ctc ctg ttt ctg acc tgg ctg cac aca tgc ctg   165Thr Leu Leu Pro Gly Leu Leu Phe Leu Thr Trp Leu His Thr Cys Leu
-15                 -10                  -5              -1gcc cac cat gac ccc tcc ctc agg ggg cac ccc cac agt cac ggt acc   213Ala His His Asp Pro Ser Leu Arg Gly His Pro His Ser His Gly Thr1               5                  10                  15cca cac tgc tac tcg gct gag gaa ctg ccc ctc ggc cag gcc ccc cca   261Pro His Cys Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Pro Leu Gly Gln Ala Pro Pro
         20                  25                  30cac ctg ctg gct cga ggt gcc aag tgg ggg cag gct ttg cct gta gcc   309His Leu Leu Ala Arg Gly Ala Lys Trp Gly Gln Ala Leu Pro Val Ala
     35                  40                  45ctg gtg tcc agc ctg gag gca gca agc cac agg ggg agg cac gag agg   357Leu Val Ser Ser Leu Glu Ala Ala Ser His Arg Gly Arg His Glu Arg
 50                  55                  60ccc tca gct acg acc cag tgc ccg gtg ctg cgg ccg gag gag gtg ttg   405Pro Ser Ala Thr Thr Gln Cys Pro Val Leu Arg Pro Glu Glu Val Leu65                  70                  75                  80gag gca gac acc cac cag cgc tcc atc tca ccc tgg aga tac cgt gtg   453Glu Ala Asp Thr His Gln Arg Ser Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Arg Val
             85                  90                  95gac acg gat gag gac cgc tat cca cag aag ctg gcc ttc gcc gag tgc   501Asp Thr Asp Glu Asp Arg Tyr Pro Gln Lys Leu Ala Phe Ala Glu Cys
        100                 105                 110ctg tgc aga ggc tgt atc gat gca cgg acg ggc cgc gag aca gct gcg   549Leu Cys Arg Gly Cys Ile Asp Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala Ala
    115                 120                 125ctc aac tcc gtg cgg ctg ctc cag agc ctg ctg gtg ctg cgc cgc cgg   597Leu Asn Ser Val Arg Leu Leu Gln Ser Leu Leu Val Leu Arg Arg Arg
130                 135                 140ccc tgc tcc cgc gac ggc tcg ggg ctc ccc aca cct ggg gcc ttt gcc   645Pro Cys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe Ala145                 150                 155                 160ttc cac acc gag ttc atc cac gtc ccc gtc ggc tgc acc tgc gtg ctg   693Phe His Thr Glu Phe Ile His Val Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Leu
            165                 170                 175ccc cgt tca gtg tgaccgccga ggccgtgggg cccctagact ggacacgtgt       745Pro Arg Ser Val
        180gctccccaga gggcaccccc tatttatgtg tatttattgg tatttatatg cctcccccaa 805cactaccctt ggggtctggg cattccccgt gtctggagga cagcccccca ctgttctcct 865catctccagc ctcagtagtt gggggtagaa ggagctcagc acctcttcca gcccttaaag 925ctgcagaaaa ggtgtcacac ggctgcctgt accttggctc cctgtcctgc tcccggcttc 985ccttacccta tcactggcct caggcccccg caggctgcct cttcccaacc tccttggaag 1045tacccctgtt tcttaaacaa ttatttaagt gtacgtgtat tattaaactg atgaacacat 1105cc                                                                1107<210>23<211>197<212>PRT<213>灵长类<400>23Met Thr Leu Leu Pro Gly Leu Leu Phe Leu Thr Trp Leu His Thr Cys
    -15                 -10                  -5Leu Ala His His Asp Pro Ser Leu Arg Gly His Pro His Ser His Gly-1   1               5                  10                  15Thr Pro His Cys Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Pro Leu Gly Gln Ala Pro
             20                  25                  30Pro His Leu Leu Ala Arg Gly Ala Lys Trp Gly Gln Ala Leu Pro Val
         35                  40                  45Ala Leu Val Ser Ser Leu Glu Ala Ala Ser His Arg Gly Arg His Glu
     50                  55                  60Arg Pro Ser Ala Thr Thr Gln Cys Pro Val Leu Arg Pro Glu Glu Val
 65                  70                  75Leu Glu Ala Asp Thr His Gln Arg Ser Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Arg80                  85                  90                  95Val Asp Thr Asp Glu Asp Arg Tyr Pro Gln Lys Leu Ala Phe Ala Glu
            100                 105                 110Cys Leu Cys Arg Gly Cys Ile Asp Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala
        115                 120                 125Ala Leu Asn Ser Val Arg Leu Leu Gln Ser Leu Leu Val Leu Arg Arg
    130                 135                 140Arg Pro Cys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe
145                 150                 155Ala Phe His Thr Glu Phe Ile His Val Pro Val Gly Cys Thr Cys Val160                 165                 170                 175Leu Pro Arg Ser Val
            180<210>24<211>403<212>DNA<213>灵长类<220><221>misc_feature<222>(1)..(403)<223>注释=“n可以是a、c、g或t”<400>24gagaaagagc ttcctgcaca aagtaagcca ccagcgcaac atgacagtga agaccctgca 60tggcccagcc atggtcaagt acttgctgct gtcgatattg gggcttgcct ttctgagtga 120ggcggcagct cggaaaatcc ccaaagtagg acatactttt ttccaaaagc ctgagagttg 180cccgcctgtg ccaggaggta gtatgaagct tgacattggc atcatcaatg aaaaccagcg 240cgtttccatg tcacgtaaca tcgagagccg ctccacctcc ccctggaatt acactgtcac 300ttgggacccc aaccggtacc cctcgaagtt gtacaggccc aagtgtagga acttgggctg 360tatcaatgct caaggaaagg aagacatctn catgaattcc gtc                   403<210>25<211>403<212>DNA<213>灵长类<220><221>CDS<222>(71)..(403)<220><221>成熟肽<222>(131)..(403)<220><221>misc_feature<222>(1)..(403)<223>注释=“n可以是a、c、g或t;翻译的氨基酸取决于遗传密码”<400>25gagaaagagc ttcctgcaca aagtaagcca ccagcgcaac atgacagtga agaccctgca 60tggcccagcc atg gtc aag tac ttg ctg ctg tcg ata ttg ggg ctt gcc    109
       Met Val Lys Tyr Leu Leu Leu Ser Ile Leu Gly Leu Ala
       -20                 -15                 -10ttt ctg agt gag gcg gca gct cgg aaa atc ccc aaa gta gga cat act   157Phe Leu Ser Glu Ala Ala Ala Arg Lys Ile Pro Lys Val Gly His Thr
     -5          -1   1                   5ttt ttc caa aag cct gag agt tgc ccg cct gtg cca gga ggt agt atg   205Phe Phe Gln Lys Pro Glu Ser Cys Pro Pro Val Pro Gly Gly Ser Met10                  15                  20                  25aag ctt gac att ggc atc atc aat gaa aac cag cgc gtt tcc atg tca   253Lys Leu Asp Ile Gly Ile Ile Asn Glu Asn Gln Arg Val Ser Met Ser
             30                  35                  40cgt aac atc gag agc cgc tcc acc tcc ccc tgg aet tac act gtc act   301Arg Asn Ile Glu Ser Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Tyr Thr Val Thr
         45                  50                  55tgg gac ccc aac cgg tac ccc tcg aag ttg tac agg ccc aag tgt agg   349Trp Asp Pro Asn Arg Tyr Pro Ser Lys Leu Tyr Arg Pro Lys Cys Arg
     60                  65                  70aac ttg ggc tgt atc aat gct caa gga aag gaa gac atc tnc atg aat   397Asn Leu Gly Cys Ile Asn Ala Gln Gly Lys Glu Asp Ile Xaa Met Asn
 75                  80                  85tcc gtc                                                           403Ser Val90<210>26<211>111<212>PRT<213>灵长类<400>26Met Val Lys Tyr Leu Leu Leu Ser Ile Leu Gly Leu Ala Phe Leu Ser-20                 -15                 -10                  -5Glu Ala Ala Ala Arg Lys Ile Pro Lys Val Gly His Thr Phe Phe Gln
         -1   1               5                  10Lys Pro Glu Ser Cys Pro Pro Val Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Asp
     15                  20                  25Ile Gly Ile Ile Asn Glu Asn Gln Arg Val Ser Met Ser Arg Asn Ile
 30                  35                  40Glu Ser Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Tyr Thr Val Thr Trp Asp Pro45                  50                  55                  60Asn Arg Tyr Pro Ser Lys Leu Tyr Arg Pro Lys Cys Arg Asn Leu Gly
             65                  70                  75Cys Ile Asn Ala Gln Gly Lys Glu Asp Ile Xaa Met Asn Ser Val
         80                  85                  90<210>27<211>784<212>DNA<213>灵长类<220><221>CDS<222>(3)..(281)<400>27tc gtg ccg tat ctt ttt aaa aaa att att ctt cac ttt ttt gcc tcc    47Val Pro Tyr Leu Phe Lys Lys Ile Ile Leu His Phe Phe Ala Ser
 1               5                  10                  15tat tac ttg tta ggg aga ccc aat ggt agt ttt att cct tgg gga tac   95Tyr Tyr Leu Leu Gly Arg Pro Asn Gly Ser Phe Ile Pro Trp Gly Tyr
             20                  25                  30ata gta aat act tca tta aag tcg agt aca gaa ttt gat gaa aag tgt   143Ile Val Asn Thr Ser Leu Lys Ser Ser Thr Glu Phe Asp Glu Lys Cys
         35                  40                  45gga tgt gtg gga tgt act gcc gcc ttc aga agt cca cac act gcc tgg   191Gly Cys Val Gly Cys Thr Ala Ala Phe Arg Ser Pro His Thr Ala Trp
     50                  55                  60agg gag aga act gct gtt tat tca ctg att aag cat ttg ctg tgt acc   239Arg Glu Arg Thr Ala Val Tyr Ser Leu Ile Lys His Leu Leu Cys Thr
 65                  70                  75aac tac ttt tca tgt ctt atc tta att ctc ata aca gtc att           281Asn Tyr Phe Ser Cys Leu Ile Leu Ile Leu Ile Thr Val Ile80                  85                  90tgatatttta aaaaacccca gaaatctgag aaagagataa agtggtttgc tcaaggttat 341agaacagact accatgtgtt gtatttcaga ttttaattca tgtttgtctg attttaagtt 401ttgttcgctt gccagggtac cccacaaaaa tgccaggcag ggcattttca tgatgcactt 461gagatacctg aaatgacagg gtagcatcac acctgagagg ggtaaaggat gggaacctac 521cttccatggc cgctgcttgg cagtctcttg ctgcatgcta gcagagccac tgtatatgtg 581ccgaggctct gagaattaac tgcttaaaga actgccttct ggagggagaa gagcacaaga 641tcacaattaa ccatatacac atcttactgt gcgaggtcat tgagcaatac aggagggatt 701ttatacattt tagcaactat cttcaaaacc tgagctatag ttgtattctg cccccttcct 761ctgggcaaaa gtgtaaaagt ttg                                         784<210>28<211>93<212>PRT<213>灵长类<400>28Val Pro Tyr Leu Phe Lys Lys Ile Ile Leu His Phe Phe Ala Ser Tyr1               5                  10                  15Tyr Leu Leu Gly Arg Pro Asn Gly Ser Phe Ile Pro Trp Gly Tyr Ile
         20                  25                  30Val Asn Thr Ser Leu Lys Ser Ser Thr Glu Phe Asp Glu Lys Cys Gly
     35                  40                  45Cys Val Gly Cys Thr Ala Ala Phe Arg Ser Pro His Thr Ala Trp Arg
 50                  55                  60Glu Arg Thr Ala Val Tyr Ser Leu Ile Lys His Leu Leu Cys Thr Asn65                  70                  75                  80Tyr Phe Ser Cys Leu Ile Leu Ile Leu Ile Thr Val Ile
             85                  90<210>29<211>460<212>DNA<213>灵长类<220><221>CDS<222>(1)..(189)<400>29gtg act gta ttg tgg gga cag gaa gca caa att ccc atg tgg atc act   48Val Thr Val Leu Trp Gly Gln Glu Ala Gln Ile Pro Met Trp Ile Thr1               5                  10                  15agg aga gat aat aag tgg ggt cat ttc acc cct tgg tcc cct gct tcc   96Arg Arg Asp Asn Lys Trp Gly His Phe Thr Pro Trp Ser Pro Ala Ser
         20                  25                  30aga ccc aaa gag gcc tac atg gca ttg tgc ttc ctt ctt agt tgt agg   144Arg Pro Lys Glu Ala Tyr Met Ala Leu Cys Phe Leu Leu Ser Cys Arg
     35                  40                  45agg tgt gag ata caa tca ttt gcc tct gac ttt gag ggt tgg tcc       189Arg Cys Glu Ile Gln Ser Phe Ala Ser Asp Phe Glu Gly Trp Ser
 50                  55                  60tagcatgccc ctgaccagta gccccttaaa tacttcattg atatggaagg tctctgaatc 249ttcgtgggct taatctacca ctctctgaag ttcttatgtc tttcaaaggc ctctaaaatc 309tctgccatgt cttgctcatc cagttgttag catgatgtca ttgatacagt ggactttgga 369atctaagtgg ggagacactg gtaagtgacc aattacttca cctgtggtgt gcaagccaga 429tcaggaagcc tctacctgca cgacaacaca t                                460<210>30<211>63<212>PRT<213>灵长类<400>30Val Thr Val Leu Trp Gly Gln Glu Ala Gln Ile Pro Met Trp Ile Thr1               5                  10                  15Arg Arg Asp Asn Lys Trp Gly His Phe Thr Pro Trp Ser Pro Ala Ser
         20                  25                  30Arg Pro Lys Glu Ala Tyr Met Ala Leu Cys Phe Leu Leu Ser Cys Arg
     35                  40                  45Arg Cys Glu Ile Gln Ser Phe Ala Ser Asp Phe Glu Gly Trp Ser
 50                  55                  60<210>31<211>150<212>PRT<213>啮齿动物<400>31Met Cys Leu Met Leu Leu Leu Leu Leu Asn Leu Glu Ala Thr Val Lys1               5                  10                  15Ala Ala Val Leu Ile Pro Gln Ser Ser Val Cys Pro Asn Ala Glu Ala
         20                  25                  30Asn Asn Phe Leu Gln Asn Val Lys Val Asn Leu Lys Val Ile Asn Ser
     35                  40                  45Leu Ser Ser Lys Ala Ser Ser Arg Arg Pro Ser Asp Tyr Leu Asn Arg
 50                  55                  60Ser Thr Ser Pro Trp Thr Leu Ser Arg Asn Glu Asp Pro Asp Arg Tyr65                  70                  75                  80Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Gln Cys Arg His Gln Arg Cys Val Asn
             85                  90                  95Ala Glu Gly Lys Leu Asp His His Met Asn Ser Val Leu Ile Gln Gln
        100                 105                 110Glu Ile Leu Val Leu Lys Arg Glu Pro Glu Lys Cys Pro Phe Thr Phe
    115                 120                 125Arg Val Glu Lys Met Leu Val Gly Val Gly Cys Thr Cys Val Ser Ser
130                 135                 140Ile Val Arg His Ala Ser145                 150<210>32<211>147<212>PRT<213>啮齿动物<400>32Met Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ala Ala Thr Val Lys Ala Ala Ala1               5                  10                  15Ile Ile Pro Gln Ser Ser Ala Cys Pro Asn Thr Glu Ala Lys Asp Phe
         20                  25                  30Leu Gln Asn Val Lys Val Asn Leu Lys Val Phe Asn Ser Leu Gly Ala
     35                  40                  45Lys Val Ser Ser Arg Arg Pro Ser Asp Tyr Leu Asn Arg Ser Thr Ser
 50                  55                  60Pro Trp Thr Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Asp Arg Tyr Pro Ser Val65                  70                  75                  80Ile Trp Glu Ala Gln Cys Arg His Gln Arg Cys Val Asn Ala Glu Gly
             85                  90                  95Lys Leu Asp His His Met Asn Ser Val Leu Ile Gln Gln Glu Ile Leu
        100                 105                 110Val Leu Lys Arg Glu Pro Glu Ser Cys Pro Phe Thr Phe Arg Val Glu
    115                 120                 125Lys Met Leu Val Gly Val Gly Cys Thr Cys Val Ala Ser Ile Val Arg
130                 135                 140Gln Ala Ala145<210>33<211>155<212>PRT<213>灵长类<400>33Met Thr Pro Gly Lys Thr Ser Leu Val Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ser1               5                  10                  15Leu Glu Ala Ile Val Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly
         20                  25                  30Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn
     35                  40                  45Leu Asn Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser
 50                  55                  60Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu65                  70                  75                  80Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His
             85                  90                  95Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser
        100                 105                 110Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His
    115                 120                 125Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys
130                 135                 140Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala145                 150                 155<210>34<211>151<212>PRT<213>病毒<400>34Met Thr Phe Arg Lys Thr Ser Leu Val Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ile1               5                  10                  15Asp Cys Ile Val Lys Ser Glu Ile Thr Ser Ala Gln Thr Pro Arg Cys
         20                  25                  30Leu Ala Ala Asn Asn Set Phe Pro Arg Ser Val Met Val Thr Leu Ser
     35                  40                  45Ile Arg Asn Trp Asn Thr Ser Ser Lys Arg Ala Ser Asp Tyr Tyr Asn
 50                  55                  60Arg Ser Thr Ser Pro Trp Thr Leu His Arg Asn Glu Asp Gln Asp Arg65                  70                  75                  80Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg Tyr Leu Gly Cys Val
             85                  90                  95Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln
        100                 105                 110Gln Glu Ile Leu Val Val Arg Lys Gly His Gln Pro Cys Pro Asn Ser
    115                 120                 125Phe Arg Leu Glu Lys Met Leu Val Thr Val Gly Cys Thr Cys Val Thr
130                 135                 140Pro Ile Val His Asn Val Asp145                 150

Claims (20)

1.分离的或重组的多核苷酸,包含选自以下的序列:a)哺乳动物IL-173序列,它:i)编码成熟SEQ ID NO:6、8、10或12的至少8个连续氨基酸;ii)编码至少两个不同的成熟SEQ ID NO:6、8、10或12的至少5个连续氨基酸的区段;或iii)包含一个或多个SEQ ID NO:5、7、9或11的至少21个连
续核苷酸的区段;b)哺乳动物IL-174序列,它:i)编码成熟SEQ ID NO:14、16或18的至少8个连续氨基酸;ii)编码至少两个不同的成熟SEQ ID NO:14、16或18的至少5个连续氨基酸的区段;或iii)包含一个或多个SEQ ID NO:14、16或18的至少21个连续
核苷酸的区段;c)哺乳动物IL-176序列,它:i)编码成熟SEQ ID NO:28的至少8个连续氨基酸;ii)编码至少两个不同的成熟SEQ ID NO:28的至少5个连续氨基酸的区段;或iii)包含一个或多个SEQ ID NO:27的至少21个连续核苷酸的区
段;d)哺乳动物IL-177的序列,它:i)编码成熟SEQ ID NO:30的至少8个连续氨基酸;ii)编码至少两个不同的成熟SEQ ID NO:30的至少5个连续氨基酸的区段;或iii)包含一个或多个SEQ ID NO:29的至少21个连续核苷酸的区
段。
2.表达载体中的权利要求1的多核苷酸,包含选自以下的一种序列:
a)IL-173序列,它:
i)编码SEQ ID NO:6、8、10或12的至少12个连续氨基酸;
ii)编码至少两个不同的SEQ ID NO:6、8、10或12的至少7
   个和10个连续氨基酸的区段;或
iii)包含SEQ ID NO:5、7、9或11的至少27个连续核苷酸;
b)IL-174序列,它:
i)编码SEQ ID NO:14、16或18的至少12个连续氨基酸;
ii)编码至少两个不同的SEQ ID NO:14、16或18的至少7个
   和10个连续氨基酸的区段;或
iii)包含SEQ ID NO:13、15或17的至少27个连续核苷酸;
c)IL-176序列,它:
i)编码SEQ ID NO:28的至少12个连续氨基酸;
ii)编码至少两个不同的SEQ ID NO:28的至少7个和10个连续
   氨基酸的区段;或
iii)包含SEQ ID NO:27的至少27个连续核苷酸;
d)IL-177序列,它:
i)编码SEQ ID NO:30的至少12个连续氨基酸;
ii)编码至少两个不同的SEQ ID NO:30的至少7个和10个连续
   氨基酸的区段;或
iii)包含SEQ ID NO:29的至少27个连续核苷酸。
3.选自以下的权利要求2的多核苷酸:
a)IL-173序列,它:
i)编码成熟SEQ ID NO:6、8、10或12的至少16个连续氨
  基酸残基;
ii)编码至少两个不同的成熟SEQ ID NO:6、8、10或12的至
   少10个和13个连续氨基酸残基的区段;iii)包含SEQ ID NO:5、7、9或11的至少33个连续核苷酸;
或iv)包含SEQ ID NO:5、7、9或11的整个成熟编码部分;b)IL-174序列,它:i)编码成熟SEQ ID NO:14、16或18的至少16个连续氨基酸残基;ii)编码至少两个不同的成熟SEQ ID NO:14、16或18的至少10个和13个连续氨基酸残基的区段;iii)包含SEQ ID NO:13、15或17的至少33个连续核苷酸;或iv)包含SEQ ID NO:13、15或17的整个成熟编码部分;c)IL-176序列,它:i)编码成熟SEQ ID NO:28的至少16个连续氨基酸;ii)编码至少两个不同的成熟SEQ ID NO:28的至少10个和14个连续氨基酸残基的区段;iii)包含SEQ ID NO:27的至少33个连续核苷酸;或iv)包含SEQ ID NO:27的整个成熟编码部分;d)IL-177序列,它:i)编码成熟SEQ ID NO:30的至少16个连续氨基酸;ii)编码至少两个不同的成熟SEQ ID NO:30的至少10个和14个连续氨基酸残基的区段;iii)包含SEQ ID NO:29的至少33个连续核苷酸;或iv)包含SEQ ID NO:29的整个成熟编码部分。
4.制备以下物质的方法:a)多肽,所述方法包括表达权利要求2的所述表达载体,由此产生所述多肽;b)双链体核酸,所述方法包括使权利要求2的多核苷酸与一种互补核酸接触,由此导致所述双链体核酸的产生;或c)权利要求2的多核苷酸,所述方法包括用PCR法进行扩增。
5.分离的或重组的多核苷酸,它在至少55℃和低于400nM盐的严格性洗涤条件下与以下的多核苷酸杂交:
a)权利要求3的IL-173多核苷酸,它由SEQ ID NO:5、7、9或11的成熟编码部分组成;
b)权利要求3的IL-174多核苷酸,它由SEQ ID NO:13、15或17的成熟编码部分组成;
c)权利要求3的IL-176多核苷酸,它由SEQ ID NO:27的成熟编码部分组成;或
d)权利要求3的IL-177多核苷酸,它由SEQ ID NO:29的成熟编码部分组成。
6.权利要求5的多核苷酸:
a)其中所述洗涤条件为至少65℃和低于300mM盐;或
b)它包含以下成熟编码部分的至少50个连续核苷酸:
i)SEQ ID NO:5、7、9或11(IL-173);
ii)SEQ ID NO:13、15或17(IL-174);
ii)SEQ ID NO:27(IL-176);或
iv)SEQ ID NO:29(IL-177)。
7.试剂盒,包含权利要求6的所述多核苷酸和:
a)应用所述多核苷酸进行检测的说明;
b)处理所述多核苷酸或所述试剂盒的其它试剂的说明;或
c)a和b两者。
8.含有权利要求3的所述表达载体的细胞,其中所述细胞是:
a)原核生物细胞;
b)真核生物细胞;
c)细菌细胞;
d)酵母细胞;
e)昆虫细胞;
f)哺乳动物细胞;
g)小鼠细胞;
h)灵长类动物细胞;或
i)人细胞。
9.分离的或重组的抗原性多肽:
a)(IL-173)包含至少:
i)一个来自SEQ ID NO:6、8、10或12的成熟编码部分的8个相同连续氨基酸的区段;或
ii)两个不同的来自SEQ ID NO:6、8、10或12的成熟编码部分的至少5个连续氨基酸的区段;或
b)(IL-174)包含至少:
i)一个来自SEQ ID NO:14、16或18的成熟编码部分的8个相同连续氨基酸的区段;或
ii)两个不同的来自SEQ ID NO:14、16或18的成熟编码部分的至少5个连续氨基酸的区段;
c)(IL-176)包含至少:
i)一个来自SEQ ID NO:28的成熟编码部分的8个相同连续氨基酸的区段;或
ii)两个不同的来自SEQ ID NO:28的成熟编码部分的至少5个连续氨基酸的区段;
d)(IL-177)包含至少:
i)一个来自SEQ ID NO:30的成熟编码部分的8个相同连续氨基酸的区段;或
ii)两个不同的来自SEQ ID NO:30的成熟编码部分的至少5个连续氨基酸的区段。
10.权利要求9的多肽,其中:
a)所述8个相同连续氨基酸的区段是至少14的连续氨基酸;或
b)所述至少5个连续氨基酸的区段中的一个区段包含至少7个连续氨基酸。
11.权利要求9的多肽,其中:
A)(IL-173)所述多肽:
a)包含SEQ ID NO:6、8、10或12;
b)选择性地与针对成熟SEQ ID NO:6、8、10或12的免疫原产生的多克隆抗体结合;
c)包含多个不同的成熟SEQ ID NO:6、8、10或12的10个连续氨基酸的多肽区段;
d)是SEQ ID NO:8或12的天然等位基因变体;
e)其长度至少为30个氨基酸;或
f)呈现出至少两个非重叠表位,所述表位对成熟SEQ ID NO:6、8、10或12具有选择性;
B)(IL-174)所述多肽:
a)包含成熟SEQ ID NO:14、16或18;
b)选择性地与针对成熟SEQ ID NO:14、16或18的免疫原产生的多克隆抗体结合;
c)包含多个不同的成熟SEQ ID NO:14、16或18的10个连续氨基酸的多肽区段;
d)是SEQ ID NO:14或18的天然等位基因变体;
e)其长度至少为30个氨基酸;或
f)呈现出至少两个非重叠表位,所述表位对成熟SEQ ID NO:14、16或18的灵长类蛋白具有选择性;
C)(IL-176)所述多肽:
a)包含SEQ ID NO:28的成熟序列;
b)选择性地与针对成熟SEQ ID NO:28的免疫原产生的多克隆抗体结合;
c)包含多个不同的成熟SEQ ID NO:28的10个连续氨基酸的多肽区段;
d)是SEQ ID NO:28的天然等位基因变体;
e)其长度至少为30个氨基酸;或
f)呈现出至少两个非重叠表位,所述表位对成熟SEQ ID NO:28具有选择性;或
D)(IL-177)所述多肽:
a)包含SEQ ID NO:30的成熟序列;
b)选择性地与针对成熟SEQ ID NO:30的免疫原产生的多克隆抗体结合;
c)包含多个不同的成熟SEQ ID NO:30的10个连续氨基酸的多肽区段;
d)是SEQ ID NO:30的天然等位基因变体;
e)其长度至少为30个氨基酸;或
f)呈现出至少两个非重叠表位,所述表位对成熟SEQ ID NO:30具有选择性。
12.权利要求11的多肽,所述多肽:
a)在无菌组合物中;
b)没有被糖基化;
c)是变性的;
d)是合成多肽;
e)连接于固相支持体;
f)是具有检测标记或纯化标记的融合蛋白;
g)是天然序列的5重或更少重的置换体;或
h)是天然序列的缺失变体或插入变体。
13.应用权利要求9的所述多肽的方法:
a)以标记所述多肽,包括用放射性标记来标记所述多肽;
b)从混合物中的其它多肽中分离所述多肽,包括将所述混合物在层析基质上进行层析分离,由此分离所述多肽;
c)以鉴定选择性地与所述多肽结合的化合物,包括将所述化合物与所述多肽在合适条件下温育,由此使得所述化合物结合于所述多肽;或
d)以将所述多肽缀合于一种基质,包括用反应性试剂将所述多肽衍生化,并将所述多肽缀合于所述基质。
14.结合化合物,包含来自选择性与权利要求11的所述多肽结合的抗体的抗原结合部分,其中所述多肽:
a)(IL-173)包含成熟SEQ ID NO:6、8、10或12;或
b)(IL-174)包含成熟SEQ ID NO:14、16或18;
c)(IL-176)包含成熟SEQ ID NO:28;或
d)(IL-177)包含成熟SEQ ID NO:30。
15.权利要求14的结合化合物,其中所述抗体是针对下述多肽产生的多克隆抗体:
a)(IL-173)SEQ ID NO:6、8、10或12;或
b)(IL-174)SEQ ID NO:14、16或18;
c)(IL-176)SEQ ID NO:28;或
d)(IL-177)SEQ ID NO:30。
16.权利要求14的结合化合物,其中所述:
a)抗体:
i)为免疫选择的;
ii)结合于变性蛋白;或
iii)表现出与所述多肽的Kd至少为30mM;或
b)所述结合化合物:
i)连接至固相支持体,包括珠粒或塑料膜;
ii)在无菌组合物中;或
iii)被可检测地标记,包括放射性标记或荧光标记。
17.产生抗原:抗体复合物的方法,所述方法包括使包含来自SEQID NO:6、8、10、12、14、16、18、28或30的序列的多肽与权利要求14的结合化合物在允许所述复合物形成的条件下接触。
18.权利要求17的方法,其中所述结合化合物是抗体,而所述多肽是生物样品。
19.试剂盒,包含权利要求14的所述结合化合物和:
a)成熟SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、28或30的多肽;
b)应用所述结合化合物进行检测的说明;或
c)处理所述结合化合物或所述试剂盒的其它试剂的说明。
20.抗体与成熟SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、28或30的蛋白结合的选择性的评价方法,所述方法包括使所述抗体与所述蛋白接触以及与另一种细胞因子接触;并且比较所述抗体与所述蛋白以及与所述细胞因子的结合。
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